KR100890999B1 - 여성 불임증 치료용 긴 펜트락신 ｐｔｘ３의 용도 - Google Patents

여성 불임증 치료용 긴 펜트락신 ｐｔｘ３의 용도 Download PDF

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Abstract

PTX3 유전자 또는 동등한 PTX3 활성이 여성의 수태에 필요하다. PTX3 활성의 조작은 여성의 수태를 조절할 것이다. 여성 불임증의 영향을 개선시키거나, 생식 능력을 원하는 대로 증가 또는 감소시키거나, 여성의 수태를 향상시키거나, 또는 이들을 병행할 수도 있다. 여성 수태에 작용하는 요법에 대한 필요성이 이에 의해 제기된다.
PTX3, 불임증

Description

여성 불임증 치료용 긴 펜트락신 ＰＴＸ３의 용도{USE OF LONG PENTRAXIN PTX3 FOR TREATING FEMALE INFERTILITY}
본 발명은 여성의 수태를 위한 PTX3 활성의 필요에 관한 것이다. PTX3 활성을 감소시키는 유전자 변이로 인해 여성 불임이 발생한다.
펜트락신은 단백질의 상과이며, 환상의 다량체 구조를 특징으로 한다(1). 전형적인 짧은 펜트락신 C-반응성 단백질(CRP) 및 혈청 아밀로이드 P 성분(SAP)은 각각 인간 및 마우스에서 급성기 단백질이며, 염증 매개체에 반응하여 간에서 생성되고; 특히 이들은 인터류킨-6에 의해 직접 유도된다(2-3).
긴 펜트락신은 상기 전형적인 짧은 펜트락신과 유사성을 공유하지만, 또한 게놈 구성, 염색체 국소화, 세포 출처, 유도 자극 및 인식된 리간드에 의해 C-말단 펜트락신 영역에 커플링된 관련이 없는 긴 N-말단 영역의 존재가 다르다. 긴 펜트락신 3(PTX3)은 내피 세포에서 인터류킨-1(IL-1) 유도성 유전자(4)로서 및 섬유아세포에서 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 유도성 유전자로서 동정된 첫 번째 긴 펜트락신이다. PTX3는 또한 1 차 염증 매개체(LPS, IL-1, TNFα)에 의해 자극 시 대 식세포 및 다른 세포 유형 및 조직에 의해 생산된다(6-8). PTX3는 C-말단 203-아미노산 펜트락신-유사 영역 및 N-말단 178-아미노산 비 관련 영역으로 이루어진다. 분비 시 글리코실화된 PTX3 프로토머(45 kDa)들은 회합하여 10 내지 20 개의 다량체들을 형성한다(9). PTX3는 전형적인 펜트락신 리간드들, 예를 들어 포스포에타놀아민, 포스포콜린, 고 피루베이트 아가로스, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 또는 젤라틴에는 결합하지 않는다. 대조적으로, PTX3는 상기 펜트락신 영역에 의해 C1q에 높은 친화도로 특이적으로 결합한다(9). PTX3 혈장 수준은 정상적인 상태에서는 매우 낮지만(≤2 ng/㎖) 감염을 포함하여 여러 병리 상태들에서는 증가한다(10 내지 100 ng/㎖)(10).
PTX3 이후에 클로닝된 다른 긴 펜트락신들로는 정자 첨단체에서 발현되는 기니 피그 아펙신(11,12), 제노푸스 라에비스로부터의 XL-PXN1(13), 래트 신경세포 펜트락신 1(NP1)(14), 인간 NP1 및 NP2(15,16), 마우스 NP1 및 NP2(15), Narp(17), 및 추정적인 통합 막 펜트락신인 신경세포 펜트락신 수용체(NRP)가 있다. 긴 펜트락신의 생체 내 기능은 명확하게 규명되지 않았다.
PTX3는 2 개의 구성 영역들, 즉 임의의 공지된 분자와 관계가 없는 N-말단 영역 및 짧은 펜트락신과 유사한 C-말단 영역, 예를 들어 C-반응성 단백질(CRP)로 이루어진다(Breviario et al., J. Biol. Chem. 267:22190-22197, 1992). 인간 PTX3(hPTX3)와 마우스 PTX3(mPTX3)간에 상당한 정도의 유사성이 발견되었다. 인간과 쥐 PTX3 유전자간의 일치 정도는 82%이며, 보존적 치환을 고려한다면 90%에 달한다(Introna M., et al., Blood 87:1862-1872, (1996)). 상기 유전자들은 같 은(syntenic) 염색체 위치들에 위치한다. hPTX3와 mPTX3 서열간의 고도의 유사성은 진화하는 동안 펜트락신이 고도로 보존되었다는 표시이다(Pepys & Baltz, Adv. Immunol., 34:141-212, 1983). 펜트락신에 대한 고찰을 위해 문헌[H. Gewurz et al, Current Opinion in Immunology, 1995, 7:54-64]을 참조하시오.
WO99/32516에는 감염성 질환, 염증 및 암의 치료를 위한 PTX3의 용도가 개시되어 있다.
US 5,767,252에는 펜트락신 계열에 속하는 신경 세포의 성장 인자가 개시되어 있다.
WO02/36151에는 자가면역 병리상태의 예방 및 치료용 약물의 제조를 위한 PTX3의 용도가 개시되어 있다.
상기의 내용과 대조적으로, 태아 줄기 세포에서 동종 재조합에 의해 생산된, PTX3 유전자 좌가 유전자 변경된 마우스에 대한 연구 및 그의 효과는 여성의 수태에 PTX3 활성이 관련이 있음을 밝혀내었다.
본 발명의 목적은 PTX3 활성을 조작하여 여성의 수태를 조절하는 것이다. 여성 불임에 대한 효과가 개선되거나, 생식 능력을 원하는 대로 증가 또는 감소시키거나, 여성의 수태가 향상되거나, 혹은 이들이 병행될 수 있다. 체외 수정과 같은 다른 처리들은 침습적인 과정과 복잡한 기술을 요한다. 여성의 수태에 작용하는 요법들에 대한 필요성이 그 때문에 제기된다. 기타의 이점들 및 특징들이 하기에 논의되거나, 본 명세서로부터 자명해질 것이다.
약학 조성물, 그의 사용 및 제조 방법, 및 추가의 목적들이 하기에 개시된 다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 여성 생식 능력에 작용하기에 충분한 양의 PTX 활성 변화 약제를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다. PTX3 활성이 필요하다는 발견을 생식 결함이 있는 여성 환자 또는 동물에 대한 치료 또는 상기 여성의 생식 능력에 대한 진단으로서 이용할 수 있다.
상기와 같은 약제들의 예로는 PTX3 유전자에 상응하는 폴리뉴클레오티드, 상기에 의해 암호화되는 PTX3 단백질에 상응하는 폴리펩티드, 및 PTX3 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 기타의 것들이 있다. 여기에는 본 원에 나열된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열, 그의 동족체, 돌연변이 또는 다형성을 함유하는 것들, 및 이에 대한 다른 변체들(예를 들어 부분-길이 올리고뉴클레오티드 및 올리고펩티드)이 포함된다. 하나 이상의 PTX3 부분과 이종 부분(폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)간의 하이브리드는 각각 키메릭 유전자 또는 융합 단백질 변체로서 고려된다. 유전자 벡터를 사용하여 하나 이상의 PTX3 부분을 숙주 내로 왕복 운반하거나 또는 숙주에서 전사 및/또는 번역에 의해 또는 적어도 부분적으로 정제된 성분들을 사용하여 하나 이상의 PTX3 부분을 발현시킬 수 있다. 활성화제(예를 들어 인터류킨-6, NF-kB, 수용체 작용물질) 또는 억제제(예를 들어 항체, IkB, 수용체 길항물질)를 또한 PTX3 활성을 조절하는 약제로서 사용할 수 있다. 상기 약제는 인간 또는 비인간 동물(예를 들어 포유동물)로부터 유래할 수 있다.
대상자는 여성 환자이거나 동물일 수 있다. 상기 조성물은 전신 투여에 적합하거나 또는 국소 투여(즉 여성 생식기 내부 또는 그 주변)에 적합할 수 있다. 상기 조성물을 불임증을 치료하는데 또는 피임제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 여성 불임증의 치료 또는 여성 피임이 필요한 대상자에게 상기 대상자의 생식 능력을 각각 증가 또는 감소시키기에 충분한 양의 약학 조성물을 투여하는 방법을 제공하는 것이다.
여성 대상자에서 PTX3를 검출하는 것과 상기 량과 상기 대상자의 생식 능력을 상호 관련시키는 것이 본 발명의 추가적인 목적이다. 인간 PTX3 유전자 좌의 돌연변이를 염색체 3q24-q28에 대해 지도 작성하고; 상호 작용하는 유전자들의 돌연변이를 상기 PTX3 유전자 좌의 밖에서 지도 작성할 것이다. PTX3 변체의 기능을 공지된 PTX3 서열 또는 다른 펜트락신 서열과 비교; 폴딩, 글리코실화, 분비, 또는 다량체의 형성; 수용체 결합 또는 신호 전달; 생식 능력, 수태 또는 불임에 대한 효과; 또는 이들의 조합에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 추가의 목적은 PTX3 활성을 변화시키고 이에 의해 여성 생식 능력에 작용하는 하나 이상의 약제에 대한 선별과, 상기 과정에 의해 약제를 수득하는 것에 관한 것이다. 이러한 약제들에 대한 다수의 예를 개시한다.
본 발명의 더욱 또 다른 목적은 PTX3 활성이 감소되도록 유전자 변이시킨 포유동물 세포 및 비인간 포유동물을 제공하는 것이다. 이들은 생식 능력 결함(예를 들어 불임)에 대한 생체 내 및 생체 외 모델을 제공한다. 이들은 가능한 요법의 선별 또는 이에 대한 시험에 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 태양들은 하기 설명 및 청구의 범위, 및 이에 대한 일반화된 내용으로부터 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다.
도면 및 서열 목록에 대한 간단한 설명
도 1A 내지 1F는 PTX3 -/- 마우스의 난포 세포 더미의 비정상적인 형태를 예시한다. 난포 세포 더미를 hCG 처리 후 14 내지 16 시간 째에 회수하였다. 상기를 수집 후(A 및 B) 또는 4 시간 후(C 및 D)에 나타낸다. PTX3 +/+ 마우스(A 및 C)에서, 과립층 세포는 난모 세포 주변에 밀집되고 안정한 더미를 형성한다(화살표로 나타냄). PTX3 -/- 마우스(B 및 D)에서, 상기 세포는 난모세포에 느슨하게 회합되고 상기 더미는 4 시간 안에 완전히 사라졌다. PTX3 +/+(E) 및 PTX3 -/-(F) 마우스의 난소에 대한 조직 검사는 정상적인 전정 난포를 나타낸다.
도 2A 내지 2D는 난소 조직에서의 PTX3 mRNA 및 단백질 발현을 나타낸다. (A) 호르몬 유도된 과배란(PMS 처리에 이어 48 시간 후에 hCG 처리) 후 난소에서 PTX3 발현 동력학을 mRNA 수준으로 나타내었다. 난소들을 PMS 처리 후 0, 6, 16, 24 또는 48 시간째에 수집하고 이어서 hCG 처리 후 2, 6, 16, 24 또는 48 시간째에 수집하였다. 10 ㎍의 전체 RNA를 각 레인에 장진하였다. 상기 겔에 대한 에티디움 브로마이드 염색을 하부 패널에 나타낸다. (B) 난소의 원 위치 하이브리드화: 과립층 세포는 성숙한 난포에서만 PTX3 mRNA를 발현한다. (C) 난포 세포 더미(C.O.)에 의한 PTX3 발현, 난포 세포 더미 세포(C.O. 세포)와 난모세포를 웨스턴 블럿팅에 의해 검출하였다. 난포 세포 더미를 4 개의 PTX3 +/+ 및 PTX3 -/- 과배 란된 암컷으로부터 회수하고; 난포 세포 더미 세포와 난모세포를 각각 7 마리 및 14 마리의 PTX3 +/+ 과배란된 암컷으로부터 수득하였다. (D) PTX3 -/-(하부 패널) 및 PTX3 +/+(상부 패널) 마우스로부터의 난포 세포 더미에 대한 상 콘트라스트(우측 패널)와 면역형광분석(좌측 패널)이 예시된다.
인간 cDNA 및 그의 번역된 개방 판독 프레임(각각 서열식별번호: 1-2), 마우스 cDNA 및 그의 번역된 개방 판독 프레임(각각 서열식별번호: 3-4), 인간 및 마우스 상부 조절 영역(각각 서열식별번호: 5-6) 및 PCR 프라이머(서열식별번호: 7-10)에 대한 서열들을 서열 목록에 나타낸다. 인간과 마우스 아미노산 서열들에 대한 정렬은 381 개의 잔기 중 312 개가 일치하고(82%) 351 개의 잔기는 적어도 유사함(92%)을 나타낸다. 상기 두 유전자는 모두 3 개의 엑손을 함유하며; 첫 번째 것은 43 개 아미노산 잔기를 암호화하고, 두 번째 것은 공지된 서열 동기와 높은 유사성이 없는 135 개 아미노산 잔기를 암호화하고, 세 번째 것은 펜트락신과 유사한 203 개 아미노산 잔기를 암호화한다. 펜트락신 유사 영역은 162와 254 번 위치에 2 개의 Cys 잔기 및 일치하는 "펜트락신-유사" 서열 His-Xaa-Cys-Xaa-Ser/Thr-Trp-Xaa-Ser(서열식별번호: 11)을 포함한다.
PTX3 핵산의 전부 또는 일부에 상응하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어 전사물 또는 유전자)(돌연변이체 및 그의 다른 변체 포함)를 PTX3 활성(예를 들어 PTX3 폴리펩티드의 생체 내 또는 생체 외 발현)을 증가시키거나, 유전자 결함(예를 들어 형질감염, 감염)을 보충 또는 보정하거나, PTX3 활성을 감소시키거나(예를 들어 안티센스, 리보자임, siRNA), 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출하는데 사용할 수 있다. 유사하게, PTX3 단백질에 상응하는 폴리펩티드(돌연변이체 및 그의 다른 변체 포함)를 PTX3 활성(작용적인 경우)을 제공하고; 억제성 항체, 작용물질 및 길항물질을 생산하고; 결합 분석에 의해 상호작용하는 단백질들(예를 들어 항체, 수용체 작용물질 또는 길항물질)을 동정, 단리 또는 검출하는데 직접 사용할 수 있다.
천연 PTX3는 글리코실화되어 있다(203 번 위치에서 잠재적인 N-결합된 글리코실화 부위). 다량체성 PTX3 복합체는 겔 여과에서 약 900 kDa의 상대 분자량으로 용출되었다. 상기는 비 변성 및 비 환원 조건 하의 겔 전기영동에서, 540 내지 600 kDa 범위에서 2 개의 작은 밴드와 함께 약 440 kDa(예를 들어 약 45 kDa 프로토머들의 9- 또는 10 량체)의 우세 밴드로서 이동하였다. 환상 2 색성 분석은 PTX3가 주로 약간의 α-나선 구조를 갖는 β-시트 구조를 함유함을 가리켰다. PTX3 폴리펩티드 또는 그의 복합체를 PTX3 유전자 산물에 대한 결합 분자(예를 들어 항체, 천연 또는 비 천연 펩티드 유사물질)를 통해 간접적으로 동정, 단리 또는 검출할 수 있다.
생식 능력에 작용하는데 유용한 후보 화합물들은 전형적인 PTX3 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 상호작용하여 진단 또는 치료 방법을 제공하는 그의 능력이 선별될 수 있다. 이러한 산물들을 분석(예를 들어 진단) 또는 치료에 사용할 수 있으며; 편의상, 이들을 분석 키트로서 또는 제약 형태로 패키징한다. C1q 에 대한 결합은 특이적이며 7.4x10-8 M의 Kd로 포화가 가능하다(하나의 PTX3 프로토머는 하나의 C1q 수용체에 결합하였다). 동력학적 분석은 2.6x105 M-1s-1의 Kon과 4x10-4s-1의 Koff의 산정을 도출시킨다. C1q 결합에 대한 리간드는 PTX3의 펜트락신 유사 영역이며, 이때 다량체화가 결합에 필요하다(추정 상 분자 내 시스테인 결합을 통해서). PTX3에 대한 다른 수용체들을 특성화할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은 하이브리드 PTX3 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어 전사 키메라 또는 번역 융합이다. 전사 키메라에서, 이종 유전자의 적어도 전사 조절 부분이 PTX3 폴리뉴클레오티드에 연결되거나, 또는 한편으로 PTX3 유전자의 전사 조절 부분이 적어도 이종 폴리뉴클레오티드에 연결된다. PTX3 폴리펩티드의 판독 프레임과 적어도 이종 아미노산 영역을 번역 융합을 위해 일치되게 결합시킨다. 정보제공인자 또는 선택성 마커를 상기 이종 부분 또는 영역으로서 사용하는 경우, PTX3 기능에 대한 돌연변이 PTX3 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 영향을 쉽게 분석할 수 있다. 특히, 전사 키메라를 사용하여 PTX3 유전자의 조절된 프로모터를 국소화시킬 수 있고 번역 융합을 사용하여 PTX3 단백질을 세포에 국소화시킬 수 있다. 예를 들어, PTX3로부터의 전사 조절 부분, 리간드 결합 영역, 또는 다량체화 영역들을 하이브리드 분자에 포함시킬 수 있다.
"PTX3"는 자연에서 발견되는 인간과 마우스 유전자 및 단백질, 변이체 및 다형태, 및 이들의 다양한 형태(예를 들어 자연에서 발견되지 않는 변이체 및 동족 체)뿐만 아니라 이들의 동족체를 지칭한다. PTX3의 화학적 구조는 천연 또는 비 천연 공유 결합에 의해 연결되는 천연 또는 비 천연 뉴클레오티드들의 중합체(즉 폴리뉴클레오티드) 또는 천연 또는 비 천연 공유 결합에 의해 연결되는 천연 또는 비 천연 아미노산들의 중합체(즉, 폴리펩티드)일 수 있다. 천연 및 비 천연 뉴클레오티드 및 아미노산들에 대한 비 제한적인 목록에 대해서 WIPO 표준 ST.25(1998)의 표 1 내지 4를 참조하시오.
"변이체"는 보다 활성이거나 덜 활성인 하나 이상의 기능, 변화되거나 존재하지 않는 기존의 기능, 천연적으로 존재하지 않는 새로운 기능을 갖거나 또는 이들이 겸비된 PTX3 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드이다. "다형태"는 유전자 변화되었지만 상기 변화가 반드시 기능 상 결과를 갖지는 않는 PTX3 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드이다. "동족체"는 상이한 화학 구조를 갖지만, 천연 유전자 또는 단백질에 비해 실질적으로 동등한 기능을 갖는 PTX3 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드이다. PTX3 기능을 본 원에 상세히 개시한다. 변이체, 다형태 및 동족체를 유전자 공학 또는 화학 합성에 의해 제조할 수 있으나, 비 천연 뉴클레오티드, 아미노산 또는 결합의 경우 화학 합성이 바람직하다.
"올리고뉴클레오티드" 및 "올리고펩티드"는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 짧은 버전이다(예를 들어 30, 60, 90 또는 180 미만의 뉴클레오티드 또는 아미노산). 이들은 본 원에 개시된 PTX3 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 단편일 수 있다. 일반적으로, 이들은 화학 합성에 의해 제조될 수 있으나, 보다 긴 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 절단이 또한 사용될 수도 있다. 전기 영동 및/ 또는 역상 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 짧은 생성물들의 정제에 적합한 생화학적 기법이다.
PTX3 유전자를 엄격한 하이브리드화, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 경우 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50 ℃ 또는 70 ℃; 50 염기 이상의 폴리뉴클레오티드의 경우 500 mM NaHPO4 pH 7.2, 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 1% 소 혈청 알부민(BSA), 1 mM EDTA, 45 ℃ 또는 65 ℃를 사용하여 동정할 수 있다. PTX3 단백질을 엄격한 결합, 예를 들어 50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, 0.05% TWEEN 20 계면활성제, 1% BSA, 실온을 사용하고 탐침으로서 항체 또는 다른 결합 단백질을 사용하여 동정할 수 있다. 세척 조건을 염 농도와 온도를 신호 대 소음 비가 특정한 하이브리드화 또는 결합에 충분하도록 조절함으로써 변화시킬 수 있다. 상기와 같은 단리 방법으로, 각각 공지된 PTX3 핵산 또는 단백질을 검출하는 탐침을 사용하여 미지의 PTX3-관련 핵산 또는 단백질을 동정할 수 있다. 예를 들어, 핵산 또는 단백질의 혼합물을 하나 이상의 물리적, 화학적 및/또는 생물학적 성질에 의해 분리시키고, 이어서 PTX3 핵산 또는 단백질의 존재 또는 부재를 상기 탐침의 특이적인 결합에 의해 탐지할 수 있다. 상기 탐침을 또한 공지된 PTX3 유전자 또는 단백질의 존재 또는 부재의 탐지, 또는 이전의 미지의 PTX3 유전자 또는 단백질을 동정하는데 사용할 수 있다. 차단 및 세척 조건을 변화시켜 표적 특이적이고/이거나 배경을 감소시키는 단백질 결합 신호 또는 핵산 하이브리드화를 얻을 수 있다.
"단리된" 산물은 그의 세포 기원(예를 들어 인간, 다른 포유동물, 세균, 효모) 또는 제조원으로부터 적어도 부분적으로 정제된다. 예를 들어, 세포 기원의 용해물에 비해, 상기 단리된 산물은 다른 화학적으로 유사한 용질(예를 들어 폴리뉴클레오티드의 경우 전체 핵산 또는 폴리펩티드의 경우 전체 단백질)로부터 50%, 75%, 90%, 95% 또는 98% 이상 정제된다. 뉴클레오티드 또는 아미노산의 화학적으로 합성된 중합체의 경우, 순도를 조기 종결되거나 차단된 산물과의 비교에 의해 측정하며, 실용 상 상기 순도를 정제 없이 단리된 것으로서 간주할 수 있다. 정제를 생화학적 기법, 예를 들어 세포 분할, 원심분리, 크로마토그래피, 전기영동, 침전, 특이적 결합 또는 이들의 조합에 의해 수행할 수 있다. 일반적으로는, 용매(예를 들어 물) 및 작용 상 불활성인 화학물질(예를 들어 염 및 완충액)은 순도 측정 시 무시된다. 종종 클로닝을 사용하여 목적하는 산물을 단리한다. 따라서, 약학 조성물은 PTX3 활성의 전부는 아니지만 대부분에 기여하는 약제를 포함할 수 있다.
"이종"의 의미는 상황에 따라 변한다. 예를 들어, 이종 뉴클레오티드 부분들을 연결하여 키메라를 형성함은 상기 부분들이 자연에서 대응 직선적으로 발견되지 않음을 의미한다(예를 들어 인간 비-PTX3 전사 조절 부분에 연결된 인간-유래된 PTX3 폴리뉴클레오티드). 또 다른 예는 인간에서 대응 직선적으로 발견되지 않는 아미노산 영역들의 융합이다(예를 들어 인간 비-PTX3 다량체화 영역에 결합된 인간-유래된 PTX3 폴리펩티드). 인간으로부터 유래된 것과 동물로부터 유래된 또 다른 것의, 뉴클레오티드 부분들의 연결 또는 아미노산 영역들의 결합은 이들이 상 이한 종들로부터 유래되었으므로 이종이다. 추가의 예에서, 벡터 또는 발현 구조물의 이종 숙주 세포 내로의 형질감염 또는 이종 비인간 유기체의 유전자 도입은 상기 벡터 또는 발현 구조물이 천연 세포 또는 유기체의 게놈에서 발견되지 않음을 의미한다. "재조합" 산물은 재조합 폴리뉴클레오티드에 대한 이종 부분들의 연결 또는 재조합 폴리뉴클레이토드에 대한 이종 영역들의 융합의 결과이다. 재조합은 정제된 효소들에 의해 생체 외에서 또는 배양 세포에서 생체 내에서 유전자 가공될 수 있다.
본 발명의 하나의 태양에 따라, PTX3 유전자 및 그의 전사물에 특이적으로 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA)를 탐침 또는 프라이머로서 사용할 수 있다. 상기와 같은 폴리뉴클레오티드는 전체 유전자 또는 전사된 메시지(예를 들어 파지미드, 플라스미드, 벡테리오파지, 코스미드, 효모 인공 염색체 또는 YAC, 세균 인공 염색체 또는 BAC, 또는 다른 벡터), N-말단 "PTX3-특이" 또는 C-말단 "펜트락신-유사" 영역, 엑손 또는 특정 암호화 부분, 또는 PTX3 유전자 또는 그의 전사물에 특이적이지만 오직 동일한 부분만을 함유하는 보다 짧은 길이의 서열을 포함하는 전체 길이일 수 있다. 탐침은 그의 표적과 안정하게 결합하여 PTX3 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 특이적인 하이브리드화 신호를 생산하는 반면, 프라이머는 중합 또는 연결의 반복적인 주기가 또한 특이적인 증폭 신호를 생산할 것이므로 그의 표적과 덜 안정하게 결합할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 15, 30, 45, 60, 90, 120, 240, 360, 480, 600, 720, 1200, 2400, 5000, 10k, 20k, 40k, 100k, 250k 또는 500k 이상의 뉴클레 오티드 길이(그의 중간 범위들 포함)일 수 있다.
전형적으로는, 뉴클레오티드 서열은 존재할 수 있는 임의의 결실 또는 삽입을 제외하고 서열식별번호: 1 또는 3의 암호화 부분에 비해 85% 정도로 적은 서열 일치성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 일치성을 나타낼 수 있으며 여전히 관련이 있는 것으로 간주된다. 아미노산 서열은 서열식별번호: 2 또는 4에 비해 90% 정도로 적은 서열 일치성과 관련이 있는 것으로 간주된다. 그러나 95% 이상의 서열 일치성이 바람직하며 98% 이상의 서열 일치성이 보다 바람직하다.
서열이 많은 틈들의 도입 없이 정렬될 수 있는 경우 복잡한 수리적 연산의 사용이 필요하지 않다. 그러나 상기와 같은 연산은 당해 분야에 공지되어 있으며, 상업적인 소프트웨어 패키지에서 디폴트 매개변수들을 사용하여 실행된다. 문헌[Doolittle, Of URFS and ORFS, University Science Books, 1986; Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991] 및 상기 중에 인용된 참고문헌들을 참조하시오. 한 쌍의 서열들간의 일치율을 BESTFIT 컴퓨터 프로그램에서 실행되는 연산에 의해 계산할 수 있다(Smith and Waterman, J. Mol. Biol., 147:195-197, 1981; Pearson, Genomics, 11:635-650, 1991). 서열 차이를 계산하는 또 다른 연산이 신속한 데이터베이스 탐색에 적합하며 BLAST 컴퓨터 프로그램에서 실행되었다(Altschul et al., Nucl. Acids Res., 25:3389-3402, 1997).
보존적인 아미노산 치환(예를 들어 Glu/Asp, Val/Ile, Ser/Thr, Arg/Lys 또는 Gln/Asn 쌍)을 또한 비교 시 고려할 수 있는데, 그 이유는 이들 아미노산 잔기 쌍의 화학적 유사성이 많은 경우에 기능 상 등가를 생성시키는 것으로 예상되기 때 문이다. 폴리펩티드의 생물학적 기능을 보존할 것으로 예상되는 아미노산 치환은 치환된 아미노산 잔기의 화학적 특성, 예를 들어 소수성, 친수성, 측쇄 전하 또는 크기를 보존할 것이다. 기능 상 등가 또는 생물학적 기능의 보존을 본 원에 개시된 구조 측정 및 생물학적 분석 방법에 의해 평가할 수 있다. 따라서 아미노산 서열들은 2 개의 폴리펩티드들 사이에 90% 정도로 적은 서열 유사성으로 관련이 있는 것으로 간주되지만; 95% 이상의 서열 유사성이 바람직하며 98% 이상의 서열 유사성이 가장 바람직하다.
고유 뉴클레오티드 서열에 사용되는 코돈들은 숙주의 코돈 선호를 채택함으로써 이종 숙주에서의 번역에 적합할 수 있다. 이는 폴리펩티드의 화학 구조의 실질적인 변화 없이 상기 이종 숙주에 대한 번역기구를 제공할 것이다.
PTX3 폴리펩티드 및 그의 변체(즉, 결실, 영역 혼합 또는 중복, 삽입, 치환 또는 이들의 조합)가 또한 구조-기능 관계(예를 들어 알라닌 스캐닝, 보존적 또는 비 보존적 아미노산 치환), 예를 들어 PTX3 단백질의 폴딩 및 가공, PTX3 프로모터의 분비 및 다량체의 형성, 수용체에 대한 리간드 결합, 신호 전달, 또는 이들의 조합을 측정하는데 유용하다. 문헌[Wells, Bio/Technology, 13:647-651, 1995] 및 미국 특허 제 5,534,617 호를 참조하시오. PTX3를 사용하는 랜덤 돌연변이 또는 유전자 혼합에 의한 유도 진화를 사용하여 선택 기준에 따라 새롭고 개선된 기능들을 획득할 수 있다. 변이체, 다형태 및 동족체 PTX3 폴리펩티드는 적합한 변이체, 다형태 및 동족체 PTX3 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. PTX3의 구조-활성 관계를 내생 PTX3와 함께 또는 상기 없이 숙주 세포에서 형질감염된 발 현 구조물에 의해 생산된 변형 폴리펩티드를 사용하여 연구(즉, SAR 연구)할 수 있다. 따라서, PTX3 폴리펩티드의 분리된 영역들에서의 돌연변이는 단백질 기능에서 활성의 감소 또는 심지어 증가와 관련이 있을 수도 있다.
PTX3 뉴클레오티드 서열을 사용하여 하나 이상의 이종 펩티드 영역(예를 들어 친화성 또는 에피토프 태그)을 갖는 융합 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 올리고펩티드는 PTX3-특이 항체의 에피토프 지도화 및 특이 항체의 생산에 유용하다. 폴리펩티드는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 이상의 아미노산 길이(그의 중간 범위들도 포함)일 수 있다. 올리고펩티드를 특정한 결합 쌍(예를 들어 항체-디곡시제닌/합텐/펩티드, 비오틴-아비딘/스트렙트아비딘, 글루타치온 S 트랜스퍼라제-글루타치온, 말토오즈 결합 단백질-말토오즈, 단백질 A 또는 G/면역글로불린, 폴리히스티딘-니켈)의 하나의 친화성 태그에 결합시킬 수 있다. 완전한 길이의 PTX3 폴리펩티드(예를 들어 서열식별번호: 2 또는 4) 또는 보다 짧은 단편(예를 들어 N-말단 또는 C-말단 영역)이 생성될 수 있으며; 임의로 이종 펩티드 영역이 포함될 수 있다. PTX3 폴리펩티드를 화학적 수단에 의해 합성하거나, 천연 공급원으로부터 정제하거나, 형질감염된 숙주 세포에서 합성하거나 또는 이들을 병행할 수 있다.
PTX3 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부를 사용하여 PTX3 발현을 감시하고. PTX3 서열을 측정하고/하거나 PTX3 변체를 탐지할 수 있다. 본 발명은 또한 하이브리드화 탐침 및 증폭 프라이머(예를 들어 폴리머라제 쇄 반응, 연결 쇄 반응, 다른 등온 증폭 반응)를 제공한다. 한 쌍의 상기와 같은 프라이머들을 RT-PCR 분석 에 사용하여 세포 내의 PTX3 전사 풍부성을 정량화할 수 있다. 증폭 프라이머는 길이가 15 내지 30 뉴클레오티드(바람직하게는 약 25 뉴클레오티드)일 수 있으며, 센스 또는 안티센스 가닥에 어닐링되고(바람직하게는 상기 쌍은 각 가닥에 상보적일 것이다) 서열식별번호: 1, 3 및 5-6 또는 그의 상보물 내 어느 곳이든 3' 단부에서 종결될 수 있다. 따라서, 본 발명은 세포 내에서 같은 기원의 RNA와 DNA를 정량화하기 위해 PTX3 프라이머 및 다른 올리고뉴클레오티드를 개발 및 이용하는데 유용할 것이다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 결합은 용액 중에서 또는 기질 상에서 일어날 수 있다. 분석 포맷은 결합되지 않은 것으로부터 결합된 것을 분리시킬 필요가 있을 수도 혹은 그렇지 않을 수도 있다. 검출 가능한 신호들은 직접 또는 간접적이며, 결합된 복합체의 임의의 부분에 부착되거나, 경쟁적으로 우열을 가리거나, 증폭되거나 또는 이들이 병행될 수도 있다. 차단 또는 세척 단계를 삽입하여 감도 및/또는 특이성을 개선시킬 수도 있다. 결합 전, 후 또는 도중에 기질에 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 상호작용 단백질 또는 결합 분자를 부착시킨 결과 부착되지 않은 종들이 포착된다. 상기와 같은 고정화는 세척 조건 하에서 기질에 안정하게 부착될 것이다. 미국 특허 제 5,143,854 호 및 5,412,087 호를 참조하시오.
유전자 발현의 변화는 전사 개시, 전사물 안정성, 전사물의 단백질 산물로의 번역, 단백질 안정성, 당단백질 가공, 폴딩 또는 분비 속도, 또는 이들의 조합에 영향을 미침으로써 나타날 수 있다. 유전자, 전사물 또는 폴리펩티드를 또한 생 체 외 전사, 생체 외 번역, 노던 하이브리드화, 핵산 하이브리드화, 역전사-폴리머라제 쇄 반응(RT-PCR), 런-온 전사, 서던 하이브리드화, 대사 단백질 표지화, 항체 결합, 면역침강(IP), 효소 결합된 면역흡수 분석(ELISA), 방사능면역분석(RIA), 형광 표지화 또는 조직화학적 염색, 현미경검사 및 디지털 상 분석, 및 형광 활성화된 세포 분석 또는 분류와 같은 기법에 의해 분석할 수 있다.
산물이 용이하게 분석되는 정보제공 유전자 또는 선택성 마커 유전자를 편리한 검출을 위해 사용할 수 있다. 정보제공 유전자의 예로는 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제(LacZ), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), β-글루코로니다제(GUS), 루시페라제(LUC), 녹색 및 적색 형광 단백질(각각 GFP 및 RFP), 양고추냉이 페록시다제(HRP), β-락타마제 및 이들의 유도체(예를 들어 청색 EBFP, 청록색 ECFP, 황-녹색 EYFP, 탈안정화된 GFP 변체, 안정화된 GFP 변체, 또는 클론테크(Clontech)에 의해 LIVING COLORS 형광 단백질로서 판매되는 융합 변체)가 있다. 정보제공 유전자는 바람직하게는 색원체, 형광 또는 발광 신호에 의해 분석되는 같은 기원의 기질을 사용할 것이다. 한편으로, 분석 산물을 이종 에피토프(예를 들어 FLAG, MYC, SV40 T 항원, 글루타치온 트랜스퍼라제, 폴리히스티딘, 말토오즈 결합 단백질)로 태그 처리할 수 있으며, 이를 위해 같은 기원의 항체 또는 친화성 수지를 이용할 수 있다. 내성을 부여하는 선택성 마커 유전자가 존재하는 약물의 예는 암피실린, 제네티신/가나마이신/네오마이신, 하이그로마이신, 퓨로마이신 및 테트라사이클린이다. 대사 효소(예를 들어 디하이드로폴레이트 리덕타제, HSV-1 티미딘 키나제)를 감수성 숙주 세포 또는 영양 요구체에 선택성 마커로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 메토트렉세이트는 DHFR 선택성 마커에 결합된 폴리뉴클레오티드의 복사 수를 증가시킬 수 있고 그란사이클로비어는 바이러스성 티미딘 키나제 선택성 마커를 음성적으로 선택할 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드 링커에 연결시키거나 특정한 결합 쌍(예를 들어 항체-디곡시제닌/합텐/펩티드 에피토프, 비오틴-아비딘/스트렙트아비딘, 글루타치온 S 트랜스퍼라제 또는 GST-글루타치온, 렉틴-당, 말토오즈 결합 단백질-말토오즈, 폴리히스티딘-니켈, 단백질 A/G-면역글로불린) 중 하나의 구성원에 결합시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 결합 구성원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 연결에 의해 결합시킬 수 있다. 폴리펩티드를 상기와 같은 연결 또는 결합된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 융합을 생성시킴으로써, 또는 한편으로 화학적 가교결합에 의한 결합 구성원 상의 반응성 잔기에 직접 화학 결합시킴으로써 상기 특정한 결합 쌍 중 하나의 구성원에 결합시킬 수 있다. 상기와 같은 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 친화성 시약으로서 사용하여 발현 벡터의 단백질 산물 또는 전사물의 특이적 결합을 포함하는 상호작용을 확인, 단리 및 탐지할 수 있다. 상기 전사물 또는 단백질 산물의 친화성 결합 전 또는 후에, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 부착된 구성원을 그의 같은 기원의 결합 구성원에 결합시킬 수도 있다. 이는 용액 중의 또는 지지체에 고정화된 복합체를 생성시킬 수 있다. 프로테아제 인식 부위(예를 들어 엔테로키나제, 인자 Xa, ICE, 세크레타제, 트롬빈의 경우)를 인접하는 영역들 사이에 포함시켜 상기 영역들을 분리시키고/시키거나 단백질 활성을 불활성화시키는 부위 특이적 단백질 분해를 허용 할 수도 있다.
탐침 및 프라이머를 사용하여 PTX3 유전자 또는 그의 변체를 동정할 수 있다. 예를 들어 본 발명에서 동정된 인간 PTX3 유전자에 특이적인 탐침 또는 프라이머를 사용하여 상기 유전자의 존재 또는 부재를 탐지하고 이에 의해 상기 유전자의 공급원이 각각 존재하는지 또는 부재하는지를 추정할 수 있다. PTX3 유전자에서 유전자 다형성 및 돌연변이를 탐침의 중간 부분 또는 프라이머의 3'-단부에 잠재적으로 부정합된 염기(들)를 위치시켜 상기 위치에서의 표적의 서열이 각각 염기에 상보적인지 또는 아닌지에 따라 상기 탐침 또는 프라이머의 그의 표적에의 결합을 안정화 또는 탈안정화시킴으로써 명확하게 탐지할 수 있다.
유전자 다형성 및 돌연변이를 또한 제한 단편(RFLP), 뉴클레아제-보호된 단편(예를 들어 S1 뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제 I, 리보뉴클레아제 A, H 또는 T1), 또는 증폭된 산물의 길이의 변화에 의해 탐지할 수 있다. 복잡한 유전자 핑거프린트에 대해서, 각 성분들에 대한 동정은 필요하지 않은데, 그 이유는 나란한 가시적인 비교로 차이를 쉽게 검출할 수도 있기 때문이다(예를 들어 RAPD). 차이를 또한 각각 겔 전기영동 또는 등전압 초점 맞추기에 의한 PTX3 단백질의 분자량(MW) 또는 등전점(pl)의 변화에 의해 탐지할 수 있다.
PTX3 단백질의 존재를 인간 또는 동물 체액 또는 조직에서 PTX3 활성의 지표로서 사용할 수 있다. 상기 체액은 혈액, 혈액 산물(예를 들어 혈장, 혈청), 세척물, 타액 등일 수 있다. 전형적인 조직은 상피(예를 들어 폐) 또는 점막(예를 들어 구강, 질)의 조직이지만, 감염은 전신적일 수 있으며 또한 다른 조직 유형도 포함한다. 신호를 고형 조직에 대해서, 분산되거나 균질화된 조직상에서, 용액(예를 들어 희석되거나 희석되지 않은 체액, 세척물) 중에서, 또는 세포 도말 표본 또는 접촉 프렙 상에서 원 위치에서 탐지할 수 있다. 수정될 수 있는 난모세포를 PTX3 발현에 의해 선택할 수 있다.
셔틀 또는 발현 벡터의 제작
셔틀 또는 발현 벡터는 데옥시리보핵산(DNA) 및/또는 리보핵산(RNA)의 화학적 형태인 재조합 폴리뉴클레오티드이다. 상기 벡터의 물리적 형태는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있으며; 그의 형태는 선형이거나 환상일 수 있다. 상기 벡터는 바람직하게는 이중 가닥의 데옥시리보핵산(dsDNA)이거나 또는 세포에 도입 후(예를 들어 레트로바이러스의 프로바이러스로서의 숙주 게놈 내로의 삽입)에 dsDNA로 전환된다. 상기 벡터는 포유동물, 곤충, 식물 또는 진균 유전자 또는 바이러스(예를 들어 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 세포확대 바이러스, 계두 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 몰로니 백혈병 바이러스, 마우스 유방 종양 바이러스, 라우스 육종 바이러스, SV40 바이러스, 우두 바이러스)로부터의 하나 이상의 부분들뿐만 아니라 유전자 조작에 적합한 부분들(예를 들어 선택성 마커, 제한 엔도뉴클레아제의 경우 다수개의 인식 부위를 갖는 링커, 생체 외 전사의 경우 프로모터, 생체 외 복제의 경우 프라이머 어닐링 부위)을 포함할 수 있다. 상기 벡터는 담체 중의 단백질 및 다른 핵산과 회합되거나(예를 들어 바이러스 입자로 패키징되거나) 또는 화학물질(예를 들어 양이온 중합체)과 축합되 어 세포 또는 조직 내로의 입장을 표적화할 수 있다. 벡터 폴리뉴클레오티드의 선택 및 이를 여성 생식계(예를 들어 자궁내막, 난소)에 도입시키는 방법은 당해 분야의 기술 내에 있다.
발현 벡터는 유전자 발현을 위한 조절 부분(예를 들어 프로모터, 증진인자, 침묵인자, 접목된 공여체 또는 수용체 부위, 폴리아데닐화 신호, 세포 국소화 서열)을 추가로 포함할 수도 있다. 상이한 수준의 전사를 약제(예를 들어 테트라사이클린/tetR 또는 FK506/FKBP)에 반응하는 조질 시스템과 함께 상기 약제를 사용하여 성취할 수 있다. 상기 벡터는 발현된 부분 내에 하나 이상의 접목된 공여체 및 수용체 부분, 즉 번역의 개시를 위한 발현된 부분의 코작(Kozak) 일치 서열 상부; 및 발현된 부분의 하부, 번역의 종결을 보장하기 위한 3 개의 전방 판독 프레임 중 다수개의 정지 코돈, 하나 이상의 mRNA 퇴화 신호, 전사 신호의 종결, 폴리아데닐화 신호 및 3'-절단 신호를 추가로 포함할 수 있다. 인트론(예를 들어 cDNA로부터의 암호화 부분)을 함유하지 않는 발현된 부분들의 경우, 한 쌍의 접목된 공여체 및 수용체 부위가 바람직할 수도, 하지 않을 수도 있다. 그러나, 오직 유도 조건 하에서만 하부 영역들 중 하나 이상을 발현시키고자 하는 경우 mRNA 퇴화 신호(들)를 포함하는 것이 유용할 것이다.
셔틀 벡터는 숙주 게놈에 통합된 벡터의 복제를 허용하는, 또는 자율적인 복제 에피솜으로서의 복제 기원(ARS)을 추가로 포함할 수도 있다. 중심립 및 말단 소립 서열을 또한 각각 염색체 분리 및 염색체 단부의 보호를 위해서 포함시킬 수도 있다. 숙주 게놈 내로의 랜덤하거나 표적화된 통합이 보다 더 벡터를 유지시 킬 듯 하나, 에피솜은 선택적인 압력에 의해 유지되거나 또는 한편으로 벡터가 오직 일시적으로만 존재하는 용도에 바람직할 수 있다.
벡터는 셔틀벡터와 발현벡터 모두일 수 있다.
발현된 부분은 임의의 관심 유전자로부터 유래할 수 있으며 프로모터에 대해서 어느 한 배향으로 제공된다. 안티센스 배향으로 발현된 부분은 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 siRNA의 제조에 유용할 것이다. 상기 유전자는 숙주 세포 또는 유기체, 그의 동일한 종들로부터 유래하거나 새로 구상될 수 있다. PTX3와 기능을 공유할 수 있는 유전자 영역(들)과의 융합을 분석하여 상기 기능을 부여하거나 다기능 융합 단백질을 제공하는 영역(들)을 규명할 수 있다. 융합을 또한 에피토프 태그(예를 들어 GFP, GST, HA, MYC)를 사용하여 수행할 수 있다. 일부 유전자는 또 다른 전사물을 생산하거나, 동종다량체 또는 이종다량체로서 회합되는 서브유닛을 암호화하거나, 또는 프로테아제 절단에 의해 활성화되는 프로펩티드들을 생산한다. 상기 발현된 부분은 번역 융합을 암호화할 수 있으며; 폴리펩티드를 암호화하는 부분들의 개방 판독 프레임과 하나 이상의 이종 영역을 일치되게 연결시킬 수 있다. 정보제공 인자 또는 선택성 마커를 상기 이종 영역으로서 사용하는 경우, 상기 융합 단백질의 발현을 쉽게 분석하거나 국소화시킬 수 있다. 상기 이종 영역은 친화성 또는 에피토프 태그일 수 있다.
후보 화합물들에 대한 선별
본 발명의 다른 태양들은 화학적 또는 유전자 화합물, 그의 유도체, 및 불임 증의 치료 또는 피임에 유효한 상기 화합물들을 포함하는 조성물이다. 치료가 필요한 대상자에게 투여되는 양, 그의 제형 및 전달 시기 및 경로는 수태를 감소시키거나, 생식 능력을 증가 또는 감소시키거나, 또는 수태를 향상시키기에 유효하다. 상기와 같은 양, 제형, 및 약물 전달 시기와 경로의 측정은 당해 분야의 기술 내에 있다.
선별 방법은 후보 화합물을 유기체에 투여하거나 후보 화합물을 세포와 배양시키고 이어서 유전자 발현의 조절 여부를 측정함을 포함할 수 있다. 상기와 같은 조절은 수태 또는 불임증과 관련이 있거나 또는 이를 야기시킬 수 있는 변화를 부분적으로 또는 완전히 보상하는 활성의 증가 또는 감소일 수 있다. 유전자 발현은 전사 개시 또는 연장률; 전사물의 안정성; 번역 개시 또는 연장률, 단백질의 안정성; 단백질 가공, 폴딩 또는 분비율; 활성 형태의 단백질의 비율; 다량체의 형성; 수용체에의 결합; 또는 이들의 조합 수준에서 증가되거나 감소될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제 5,071,773 호 및 제 5,262,300 호를 참조하시오. 고-재로 처리량의 선별 분석이 가능하다(예를 들어 비교 프로세싱 및/또는 로봇 공학을 이용함으로써).
선별 방법은 후보 화합물을 정보제공 인자 구조물을 함유하는 세포와 배양하고(이때 상기 정보제공 인자 구조물은 분석 가능한 산물을 암호화하는 하부 유전자에 시스 형태로 공유 결합된 PTX3의 전사 조절 부분을 포함한다); 상기 분석 가능한 산물의 생산을 측정함을 포함할 수 있다. PTX3 유전자의 상부 부분을 갖는 키메라 또는 개시 ATG 코돈과의 프레임 내 번역 융합을 사용하여 상기 전사 조절 부 분을 제공할 수 있다. 예를 들어, 서열식별번호: 5 또는 6의 임의의 부분을 사용할 수 있다. 분석 가능한 산물의 생산을 증가시키는 후보 화합물이 유전자 발현을 활성화시키는 약제로서 동정될 것인 반면, 분석 가능한 산물의 생산을 감소시키는 후보 화합물은 유전자 발현을 억제하는 약제로서 동정될 것이다. 예를 들어 미국 특허 제 5,849,493 호 및 제 5,863,733 호를 참조하시오.
PTX3 전사의 조절(예를 들어 전사 조절 부분 및 같은 기원의 전사 인자)이 마우스와 인간 유전자에 대해 특성화되었다(Altmeyer et al., J. Biol. Chem., 270:25584-25590, 1995; Basile et al., J. Biol. Chem., 272:8172-8178, 1997). PTX3 전사는 특정 세포 유형에 특이적이다. PTX3 전사의 사이토카인 자극에 대한 반응성은 NFkB 및 IkB 전사 인자뿐만 아니라 세포-특이성 인자와의 상호작용을 통해 매개되는 듯 하다.
선별 방법은 후보 화합물의 존재 또는 부재 하에서 정보제공 인자 구조물(전사 조절 부분을 포함한다)로부터의 생체 외 전사를 측정하고 이어서 전사가 상기 후보 화합물의 존재에 의해 변경되었는지를 측정함을 포함할 수 있다. 생체 외 전사는 세포-비 함유 추출물, 상기 세포의 부분 정제된 분획, 정제된 전사 인자 또는 RNA 폴리머라제, 또는 이들의 조합을 사용하여 분석할 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제 5,453,362; 5,534,410; 5,563,036; 5,637,686; 5,708,158; 및 5,710,025 호를 참조하시오.
생체 내 전사 또는 번역 활성을 측정하기 위한 기법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 핵 런-온 분석을 사용하여 정보제공 유전자의 전사를 측정할 수 있다. 상기 정보제공 유전자의 번역은 번역 산물의 활성을 측정함으로써 측정할 수 있다. 정보제공 유전자의 활성은 폴리뉴클레오티드 산물(예를 들어 RT-PCR 또는 전사물)의 전사, 폴리펩티드 산물의 번역(예를 들어 단백질의 면역분석), 및 정보제공 인자 단백질 자체의 생물 활성 중 하나 이상을 측정함으로써 측정할 수 있다.
이어서 PTX3 유전자 발현 또는 단백질 활성을 감소시키거나 증가시키는 화합물을 생식 능력, 수태 감소 또는 수태 향상에 대한 그의 능력에 대해 분석할 수 있다.
에피토프-태그 처리된 PTX3 단백질 또는 PTX3 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 다량체 또는 다른 PTX3-함유 복합체를 친화성 정제할 수 있다. 후보 화합물을 상기 복합체의 풍부성(즉 복합체의 정상 상태 수준), 회합 속도, 분비 또는 생물 활성을 감소시키는 그의 능력에 대해 선별할 수 있다. 예를 들어 PTX3 단백질과 그의 수용체간의 결합을 향상 또는 억제하는 화합물을 동정할 수 있다. PTX3 단백질을 상술한 바와 같이 기질에 부착시킬 수 있다. 후보 화합물을 적어도 부분 정제된 형태 또는 조 혼합물로서의 복합체의 하나 이상의 다른 성분의 존재 하에서 고정화된 PTX3 단백질과 배양시킨다. 더욱이, 상기 복합체의 하나 이상의 성분을 기질에 부착시키고 후보 화합물을 적어도 부분 정제된 형태 또는 조 혼합물로서의 복합체의 추가적인 성분과 함께 또는 상기 성분 없이 PTX3 단백질의 존재 하에서 상기 고정화된 성분과 배양시킬 수 있다. 결합 조건들에 대한 예를 하기에 나타낸다. 배양 후에, 모든 비 결합 성분들을 세척시켜 상기 기질에 결합 된 복합체의 하나 이상의 성분들을 남길 수 있다. PTX3 단백질을 포함하는 복합체의 형성은 또한 용액 중에서 일어날 수 있으며 이때 상기 PTX3-함유 복합체를 고정화시키거나 고정화시키지 않을 수도 있다. 환원은 PTX3 다량체를 분해시키는 가역적인 반응이다. 이어서 상기 복합체의 각 성분들의 양을 상기 복합체를 다른 단백질들로부터 세척 및 분리시킨 후에(예를 들어 이종 분석), 또는 분리 없이(예를 들어 동종 분석) 정량화할 수 있다. 예를 들어 상기를 면역학적 분석, 예를 들어 ELISA, RIA 또는 웨스턴 블럿팅을 사용하여 측정할 수 있다. 복합체 형성은 형성 후에 차폐되는 에피토프 또는 형성에 의존하는 에피토프에 대한 항체의 결합에 의해 측정할 수 있다. 복합체를 상기 복합체의 하나 이상의 성분을 기질에 결합시킴으로써 형성 전 또는 후에 고정화시킬 수 있다. 기질에 대한 복합체의 결합을 근접 탐지, 예를 들어 SPA 또는 BiaCore에 의해 분리 없이 측정할 수 있다. 상기 복합체의 하나 이상의 결합된 성분의 양을 후보 화합물과 함께 및 상기 없이 측정한다. 바람직한 화합물은 PTX3 풍부성, 회합, 분비, 다량체 형성, 생물 활성 또는 이들의 조합을 증가 또는 감소시키는 것이다.
치료용 유전자 화합물
활성화를 PTX3 활성을 갖는 단백질을 암호화하거나 PTX3 활성을 상향조절하는 발현된 부분(예를 들어 PTX3 유전자의 완전 길이의 암호화 부분 또는 작용성 부분; 그의 과형태 변이체, 동족체, 종 분화 또는 중복 복사; 급성기 유도인자; PTX3 유전자에 작용하는 양성 전사 인자) 또는 PTX3 활성의 억제를 경감시키는(예를 들 어 PTX3 유전자의 음성 조절인자의 발현을 적어도 부분적으로 억제함) 단백질을 암호화하는 발현된 부분을 함유하는 발현 벡터를 유도함으로써 성취할 수 있다. 전사 또는 번역의 과발현뿐만 아니라 단백질 기능을 과발현시키는 것은 유전자 활성화에 보다 직접적인 접근방법이다. 한편으로, 하부의 발현된 부분은 게놈 중의 좌 내로의 동종 재조합을 지시할 수 있으며 이에 의해 상기 유전자의 내생 전사 조절 부분을 발현 카세트 또는 특정한 유전자 변이로 대체할 수 있다.
발현 벡터를 예를 들어 하나 이상의 화학물질(예를 들어 인산 칼슘, DEAE-덱스트란, 지질, 중합체), 입자총법(biolistics), 일렉트로포레이션, 노출된 DNA 기술, 미세주입, 또는 바이러스 감염을 사용하는 형질감염 또는 유전자 도입에 의해 숙주 세포 또는 비인간 동물 내로 도입시킬 수 있다. 상기 도입된 발현 벡터를 상기 세포 또는 동물의 숙주 게놈에 통합시키거나 에피솜으로서 유지시킬 수 있다. 지질 담체를 제조하기 위한 다수의 중성 및 하전된 지질, 스테롤 및 다른 인지질들이 공지되어 있다. 예를 들어, 중성 지질은 디올레오일 포스파티딜콜린(DOPC) 및 디올레오일 포스파티딜 에탄올아민(DOPE)이고; 음이온성 지질은 디올레오일 포스파티딜 세린(DOPS)이고; 양이온성 지질은 디올레오일 트리메틸 암모늄 프로판(DOTAP), 디옥타데실디아미도글리실 스페르민(DOGS), 디올레오일 트리메틸 암모늄(DOTMA) 및 1,3-디올레오일옥시-2-(6-카복시스페르밀)-프로필아미드 테트라아세테이트(DOSPER)이다. 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)을 혼입시켜 전달 효능 및/또는 안정성을 개선시킬 수 있다. FUGENE 6, LIPOFECTAMINE, LIPOFECTIN, DMRIE-C, TRANSFECTAM, CELLFECTIN, PFX-1, PFX-2, PFX-3, PFX-4, PFX-5, PFX-6, PFX-7, PFX-8, TRANSFAST, TFX-10, TFX-20, TFX-50 및 LIPOTAXI 지질이 적합한 제형이다. 중합체는 양이온성 덴드리머, 폴리아미드, 폴리아미도아민, 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리리신, 또는 이들의 조합일 수 있으며; 한편으로, 중합체성 물질을 나노입자 또는 미세입자로 성형시킬 수 있다. 노출된 DNA 기술에서, 벡터(대개 플라스미드로서)를 세포 또는 조직에 전달하며, 여기에서 상기 벡터는 상기가 상기 세포 또는 조직 내로 도입되기 전에 축합되도록 화학적 형질감염제(예를 들어 지질, 중합체)의 사용 없이 숙주 게놈내로 통합될 수도 또는 되지 않을 수도 있다.
동물, 곤충, 진균 또는 세균 세포를 형질 감염시킬 수 있으며; 유전자 도입을 비인간 동물에 대해 사용할 수 있다. 유전자로부터의 동종 부분을 사용하여 숙주 게놈 내의 특정 유전자 좌에의 통합을 지시하고 이에 의해 상기 좌에서 상기 유전자의 발현을 조절(예를 들어 PTX3 유전자 좌에서 프로모터가 없는 정보제공 인자 또는 선택성 마커의 동종 재조합)하거나, 또는 PTX3의 딴 곳 사본을 삽입할 수도 있다. 폴리펩티드를 또한 세포 추출물을 사용하여 생체 외에서 생산하거나 또는 유전자 조작된 세포를 사용하여 생체 내에서 생산할 수도 있다.
상기 발현 벡터를 하향 조절되거나 또는 완전히 결손된 유전자의 기능을 부분 결손 유전자의 보충 기능으로 대체시키거나, 또는 상기 유전자의 활성에 필적하는 기능으로 대체시키는데 사용할 수 있다. 따라서, 숙주의 같은 기원 유전자 활성은 새로운 형태, 저형태, 과형태 또는 통상적일 수 있다. 기능의 대체 또는 보충은 상기 논의된 방법에 의해 수행될 수 있으며 유전자 조작된 세포 또는 유기체 가 하부 부분의 높거나 낮은 발현을 위해 선택될 수 있다(예를 들어 전사되거나 번역된 산물의 양 또는 상기 어느 한 산물의 생물학적 기능을 평가하기 위해). 상기 발현된 하부 부분과 새로운 형태, 과형태 또는 통상적인 유전자간의 경쟁이 다량체성 단백질 복합체 중에 존재하는 합성적 상호작용으로 인해 수행될 수 있다. 한편으로, 기능을 세포 내적으로 억제하는 음성 조절인자 또는 단쇄 항체를 상기 발현 벡터의 하부 부분에 의해 암호화할 수 있다. 따라서, PTX3 활성의 적어도 부분적인 억제는 안티센스, 리보자임 또는 RNA 간섭 기술에 의해 성취될 수 있으며, 이때 상기 발현 벡터는 변경되지 않은 안티센스 분자에 상응하는 하부 부분, 리보자임, 또는 PTX3 뉴클레오티드 서열의 일부에 상응하는 siRNA 분자를 함유한다.
이어서 PTX3 유전자 발현 또는 단백질 활성을 증가 또는 감소시키는 화합물을 생식 능력, 수태의 감소 또는 수태의 향상에 대한 그의 효과에 대해 분석할 수 있다.
안티센스 폴리뉴클레오티드는 유전자의 mRNA 전사물에의 하이브리드화 또는 상기와 같은 전사물의 분해에 의해 번역을 직접적으로 차단함으로써 작용할 수 있다. 상기 안티센스 분자는 발현 벡터에서 프로모터의 하부 부분으로서 안티센스 배향으로 유전자의 하나 이상의 작용성 부분을 사용하여 재조합적으로 제조할 수 있다. 화학적으로 변경된 염기 또는 결합을 사용하여 분해를 감소시키거나 또는 신체 중의 반감기를 증가시킴으로써 안티센스 폴리뉴클레오티드를 안정화시킬 수 있다(예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 펩티드 핵산). 상기 안 티센스 분자의 서열은 번역 개시 부위(예를 들어 표적 뉴클레오티드 서열의 -10 내지 +10)에 상보적일 수 있다.
리보자임은 RNA 전사물 또는 게놈의 특이적인 절단을 촉진한다. 작용 기전은 상보성 세포 또는 바이러스 RNA로의 서열-특이적인 하이브리드화에 이어서 엔도뉴클레오분해성 절단을 수반한다. 억제는 리보뉴클레아제 H 활성에 의존적일 수도 그렇지 않을 수도 있다. 리보자임은 표적 RNA에 상보성인 하나 이상의 서열뿐만 아니라 RNA 절단에 기여하는 촉매 서열(예를 들어 망치머리형, 머리핀형, 도끼머리형 동기)을 포함한다. 예를 들어 대상 RNA 내의 잠재적인 리보자임 절단 부위들을 먼저 상기 대상 RNA를 하기 트리뉴클레오티드 서열, 즉 GUA, GUU 및 GUC를 포함하는 리보자임 절단 부위에 대해 스캐닝함으로써 동정한다. 일단 동정되었으면, 상기 절단 부위를 함유하는 대상 RNA의 부분에 상응하는 약 15 내지 약 20 리보뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드를 후보 올리고뉴클레오티드 서열을 부적합하게 만들 수 있는 예견되는 구조 특징, 예를 들어 2 차 구조에 대해서 평가할 수 있다. 이어서 후보 서열의 적합성을 하이브리드화하고 표적 RNA를 절단하는 능력에 의해 평가할 수 있다. 상기 리보자임은 재조합적으로 생산되거나 또는 화학 합성될 수 있다.
siRNA는 RNA 간섭(RNAi)을 매개하는 20 내지 25 염기쌍 이상의 이중 가닥 RNA를 지칭한다. 표적 RNA에 상응하는 중복 siRNA를 상기 가닥들의 분리 전사, 상대 극성을 갖는 한 쌍의 프로모터로부터의 커플링된 전사, 또는 적어도 부분적으로 자기 상보성인 서열을 갖는 단일 RNA 가닥의 어닐링에 의해 형성시킬 수 있다. 한편으로, 약 21 내지 약 23 염기쌍 이상의 중복된 올리고리보뉴클레오티드를 화학적으로 합성(예를 들어 2 개의 리보뉴클레오티드의 3' 돌출부를 갖는 21 개 리보뉴클레오티드들의 중복)할 수 있으며, 이때 변경된 염기에 의한 일부의 치환은 허용된다. 그러나 상기 siRNA 서열 중심의 부정합은 간섭을 제거한다. RNA 간섭에 의해 표적화된 부분은 바람직하게는 유전자의 암호화 부분으로서 전사되어야 한다. 간섭은 21 내지 23 염기 부위에서 표적 RNA를 따로 절단하는 세포 인자(예를 들어 리보뉴클레아제 III)에 따라 변하는 듯 하며; 상기 절단 부위의 위치는 유도 siRNA의 3' 단부보다는 5' 단부에 의해 한정되는 듯 하다. 소량의 siRNA에 의한 시동은 RNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의한 증폭 후에 간섭을 촉발시킬 수 있다.
PTX3에 특이적인 항체를 억제 또는 탐지에 사용할 수 있다. 다클론 또는 단클론 항체를 동물(예를 들어 병아리, 햄스터, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 말)을 항원으로 면역시킴으로써 제조하고 임의로 상기 또는 관련 항원에 대해 친화성 정제할 수 있다. 항원은 고유 단백질, 단백질 분해 또는 유전자 공학에 의해 제조된 단편, 융합 단백질, 또는 항체에 의해 결합된 하나 이상의 에피토프를 포함하는 생체 외 번역되거나 합성된 단백질일 수 있다. 항체 단편을 단백질 분해성 절단 또는 유전자 공학에 의해 제조할 수 있으며; 인간화된 항체 및 단쇄 항체를 구조 분자에 항체의 항원 결합 영역으로부터의 서열을 이식함으로써 제조할 수 있다. 다른 결합 분자(예를 들어 리간드-수용체 결합의 작용물질 또는 길항물질)를 항원과 특이적으로 결합하는 구성원에 대한 조합적 라이브러리(예를 들어 파지 표시 라이브러리)의 선별에 의해 제조할 수 있다. 항원은 유전자 또는 그의 단편(들)에 의해 암호화되는 완전 길이 단백질일 수 있다. 상기 항체는 PTX3에 특이적이거나 또는 상기 항체에 의해 인식된 에피토프가 상이한 종들간에 얼마나 잘 보존되는 가에 따라 다른 펜트락신과 교차 반응할 수도 있다. 예를 들어 미국 특허 제 5,403,484; 5,723,286; 5,733,743; 5,747,334; 및 5,871,974 호를 참조하시오.
PTX3-특이적인 결합제(예를 들어 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드)를 PTX3 핵산 또는 단백질의 검출에 진단적으로 사용하거나 또는 PTX3 활성(예를 들어 전사, 번역, 가공, 분비, 수용체 결합)의 억제를 위한 치료에 사용할 수 있다. 특히, PTX3 전사 및 수용체에 대한 PTX3 결합에 작용하는 약제들이 바람직하다.
본 발명의 화합물 또는 그의 유도체를 약물로서 사용하거나 또는 본 원에 개시된 하나 이상의 용도에 따라 약학 조성물을 제형화하는데 사용할 수 있다.
따라서 본 발명의 목적은 여성 대상자에서 생식 능력을 증가시키기 위한 약물의 제조를 위한 재조합 인간 PTX3의 용도이다.
본 발명의 추가의 목적은 생식 능력의 증가가 필요한 여성 대상자의 치료를 위한 인간 PTX3 cDNA 함유 바이러스 또는 플라스미드 벡터의 용도이다.
본 발명의 추가의 목적은 인간 여성에서 생식 능력에 대한 진단 마커로서 PTX3 단백질의 용도이다.
본 발명의 추가의 목적은 여성 대상자의 생식 능력에 작용하는 능력을 평가하기 위한 약학적 화합물의 선별을 위한 표적 단백질로서 PTX3의 용도이다.
본 발명의 화합물을 배양액 중의 세포에 생체 외에서, 체내의 세포에 생체 내에서, 또는 대상자의 외부에서 세포에 생체 외에서(이어서 동일한 대상자 또는 또 다른 대상자의 체내로 복귀시킬 수도 있다) 투여할 수 있다. 상기 대상자는 가임기의 여성이며; 임신하기를 원하거나 또는 임신할 위험이 있다.
화합물 또는 그의 유도체를 약물 또는 다른 약학 조성물의 제조에 사용할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 대상자에게 전달하는데 유용한 성분을 추가로 포함하는 조성물의 용도는 당해 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 조성물에 대한 상기와 같은 담체 및 다른 성분들의 첨가는 당해 분야의 기술 수준내에 있다.
약학 조성물을 여성 생식계(예를 들어 자궁내막, 난소)에 직접 적용하기에 적합하거나 장 또는 혈액 순환을 통해 통과시키기에 적합한 제형으로서 투여할 수 있다. 한편으로, 약학 조성물을 배양 배지에 가할 수도 있다. 유효 화합물 이외에, 상기와 같은 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 및 투여를 용이하게 하고/하거나 흡수를 향상시키는 것으로 공지된 다른 성분들을 함유할 수 있다. 상기 조성물을 단일 용량으로 또는 상이한 시점에서 투여되는 수회 용량으로 투여할 수 있다.
약학 조성물을 임의의 공지된 경로에 의해 투여할 수 있다. 예로서, 상기 조성물을 점막, 폐, 국소 또는 다른 국한되거나 전신적인 경로(예를 들어 장 및 비 경구)에 의해 투여할 수 있다. 특히, 유효량의 PTX3 활성을 생식계 또는 그 주변에서 달성하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 국소 적용, 생식기 부근에서의 이식, 또는 질좌약의 사용을 수반할 수 있다. "비경구"란 용어는 피하, 피내, 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 경막 내 및 다른 주사 또는 주입 기법을 비 제한적으로 포 함한다.
투여 량 및 시기, 제형 및 경로에 대한 적합한 선택은 대상자에서 유리한 반응(즉 효능)을 성취하고 과도한 독성이나 다른 유해성을 피할(즉 안전성) 목적에 따라 이루어질 수 있다. 따라서, "유효한"은 목적하는 효과, 예를 들어 생식 능력에 영향을 미치고, 수태를 향상시키거나 감소시키는 효과를 달성하는데 통상적인 조작 조건을 수반하도록 하는 선택을 지칭한다.
여성 대상자에게 하루에 한 번 투여되는 환 제형이 편리한 투여 스케줄이다. 한편으로, 유효 용량을 2일 마다, 1 주일에 한번, 또는 한달에 한번 투여할 수 있다. 약학 조성물 중의 유효 성분의 용량 수준을 또한 대상자에서 화합물 또는 그의 유도체의 일시적이거나 지속적인 농도를 달성하고 목적하는 치료 반응이 발생하도록 변화시킬 수 있다. 그러나, 목적하는 치료 효과를 성취하는데 필요한 것보다 낮은 수준에서 용량을 시작하여 상기 목적하는 효과가 성취될 때까지 상기 용량을 점차적으로 증가시키는 것도 또한 당해 분야의 기술 내에 있다.
여성 대상자의 생식 주기(예를 들어 월경)에 대해 투여 시간을 정할 수 있다. 실용적인 문제로서, 생식에서 체온 또는 호르몬 수준을 배란 및 월경과 같은 사건에 대한 대용물로서 사용할 수도 있다.
투여되는 화합물의 양은 예를 들어 상기 화합물의 생물활성 및 생체 적합성(예를 들어 체내 반감기, 안정성 및 대사); 상기 화합물의 화학적 성질(예를 들어 분자량, 소수성 및 용해도), 투여 경로 및 스케줄; 등과 같은 인자에 따라 변한다. 임의의 특정 대상자에 대해 성취되는 특정한 용량 수준이 다양한 인자들, 예를 들 어 연령, 건강, 병력, 체중, 하나 이상의 다른 약물들과의 조합 및 질병의 중증도에 따라 변할 것임은 물론이다.
"치료"란 용어는 특히 환자에서 하나 이상의 불임 증상을 감소 또는 경감시킴을 지칭한다. 주어진 대상자에 대해서, 증상의 개선, 악화, 퇴보 또는 진행을 객관적 또는 주관적 척도에 의해 결정할 수 있다. 치료는 또한 다른 기존의 치료 방식 및 약제(예를 들어 과배란)와의 병행을 포함할 수 있다. 따라서, 병행 치료를 실시할 수도 있다.
PTX3 유전자에 대해 유전자 변경된 이형접합성 암컷 및 수컷 마이스는 정상이고 번식력이 있다. 이들끼리만 사육하여 멘델 도수로 예견된 수의 동종접합성이 제로인 마우스들을 얻었다. 그러나, 동종접합성 암컷과 수컷(PTX3 -/-)간의 사육은 전혀 번식력이 없다. 사육 결과는 동종접합성 수컷들은 야생형(PTX3 +/+) 또는 이형접합성(PTX3 +/-) 암컷과 교배 시 정상적인 번식력이 있는 반면, PTX3 -/- 암컷은 수컷 유전자형과 관계없이 항상 번식력이 없음을 나타내었다. 교배 실험은 4 일의 기간 동안 자발적인 교배 후 또는 과배란 후에 교미 회수에 있어서 PTX3 -/-와 PTX3 +/+간에 차이가 없었음을 지적하였다(표 1). 자발적으로 배란된 난의 수(표 1)(PTX3 +/-에서 마우스 당 평균 7 개, n=4, 및 PTX3 -/- 마우스에서 마우스 당 7.8 개, n=8) 또는 호르몬 유도 배란된 난의 수(PTX3 +/-에서 마우스 당 평균 35 개, n=9, 및 PTX3 -/- 마우스에서 마우스 당 27 개, n=18)는 +/+와 -/- 마 우스에서 필적할만하였다. 데이터는 4 회 수행된 실험들 중 전형적인 하나의 실험으로부터 얻었다. 난모세포 및 투명띠 형태는 정상이었으며, PTX3 -/-와 PTX3 +/+ 마우스 모두로부터 인간 융모막 고나도트로핀(hCG) 처리 후 16 시간 째에 수득한 난모세포의 약 50%에서 첫 번째 극체가 관찰되었다(표 1). 상기 데이터는 배란 및 난모세포 성숙은 정상이며 이들이 불임의 원인은 아님을 나타낸다. 대조적으로, 과립층 세포가 난모세포에 느슨하게 회합되고 대뇌 부챗살을 형성하지 않았으므로, PTX3 -/- 마우스의 난관으로부터 수거된 난포 세포 더미의 형태적 이상(도 1B 및 1D)이 일관되게 관찰되었다. PTX3 -/- 유도된 더미는 생체 외에서 불안정하였고 과립층 세포는 수거 후(hCG 후 14 내지 16 시간째, 또는 자연 교배 후 0.5 일째) 단시간(PTX3 -/-에서 15 내지 60 분 대 PTX3 +/+ 더미에서 수 시간)내에 난모세포로부터 자발적으로 탈착되어 급속히 난모세포를 노출시켰다.
PTX3 -/- 마우스에서 정상적인 교배 회수 및 배란
PTX3 +/+ PTX3 -/- P 값
교배 회수
자발적(a)
제 1 일 4/9 2/10 NS
제 2 일 2/5 2/8 NS
제 3 일 2/3 2/5 NS
과배란 후 4/4 8/8 NS
배란
자발적(b):
마우스 배란 4/4 5/5 NS
마우스 당 난 7 7.8 -#
과배란 후:
마우스 배란 5/5 6/6 NS
마우스 당 난 37.8 33.3 -
배란된 난 중의 극체의 존재(c) 53/98 (54%) 54/109 (49%) NS -
(a) 암컷을 수컷과 4 일의 기간 동안 수용시키고 매일 플러그의 존재를 검사하였다. (b) 배란을 플러그가 있는 암컷에서 분석하였다. (c) 첫 번째 극체의 존재를 HCG 처리 후 15 시간 째에 회수된 난모세포에서 평가하였다. NS, 피셔의 정확한 시험에 의해 대조용 PTX3 +/+ 마우스로부터 현저한 차이가 없음(p<0.05) # 숫자는 PTX3 +/+ 또는 PTX3 -/- 마우스로부터 모은 샘플을 지칭한다. 유사한 차이의 부족이 5 내지 7 마리의 마우스를 사용한 4 회의 실험에서 관찰되었다.
임신 여부 및 임신 중단 시기를 이해하기 위해서, 접합자와 배아를 자발적이거나 호르몬 유도된 배란 후 교배한 후에 상이한 시점에서 수거하였다. 생존 가능한 정자가 결함 마우스의 난관에서 발견된다 하더라도, 생체 내에서 2 세포기(1.5 일)(표 2)로 발달한 난모세포도 2 개의 전핵을 갖는(0.5 일) 난모세포도 전혀 관찰되지 않았다. 불임의 원인(들)을 추가로 확인하기 위해서, PTX3 +/+ 주머니배를 PTX3 -/- 거짓임신 암컷으로 옮겼으나, 정상적인 임신과 전달이 관찰되었다. 이는 이식과 후속 과정에서의 결함을 배제시킨다.
PTX3 -/- 마우스에서 수정
수정 PTX3 +/+ PTX3 -/- P 값
생체 내
전체에 대해 수정된 난(a)
자발적 배란: 17/28(60%) 0/39(0%) <0.0001#
과배란 후: 81/162(50%) 0/192(0%) <0.0001
생체 외
투명띠 제거 후(b) 21/27(77%) 21/31(68%) NS+
완전한 난포세포 더미 사용(c) 79/189(41.8%) 68/169(40%) NS
(a) 배아를 2 세포기에서 성교 후 1.5 일째에 수거하였다. (b) 융합을 인공수정 후 4 시간째에 염색 전달 기법에 의해 평가하였다. (c) 2 세포 배아를 인공수정 후 당일에 카운트하였다. # 피셔의 정확한 시험 NS, 대조용 PTX3 +/+ 마우스로부터 현저한 차이가 없음(p<0.05).
PTX3 -/- 난모세포가 수정될 수 있는지를 평가하기 위해서, 생체 외 수정(IVF)을 다 자란 수컷의 야생형 정자를 사용하여 수행하여 PTX3 +/+ 또는 PTX3 -/- 난모세포를 인공수정시켰다(표 2). IVF를 먼저 투명띠가 없는 난모세포를 사용하여 수행하고 DNA-특이적인 형광색소 Hoechst 33258로 염색하여 융합을 관찰하였다. 이러한 조건 하에서, PTX3 -/- 난모세포 혈장막에 대한 정상적인 정자의 결합, 및 PTX3 +/+(77%) 및 PTX3 -/-(68%) 난모세포의 정자와의 필적할만한 융합 능력을 관찰하였다(표 2). 상기 결과는 정자-난 결합과 융합이 PTX3의 부재 하에서 일어날 수 있음을 제시하였다. hCG 처리 후 13 내지 15 시간 째에 수거한 완전한 더미를 인공 수정시키고 PTX3 -/- 난모세포의 수정과 2 세포기로의 진행을 PTX3 +/+ 난모세포와 필적할만한 빈도로 관찰하였다(표 2). 상기 데이터는 난모세포의 질이 PTX3 결손 마우스에서 정상임을 입증한다. 난포세포 더미가 생체 내에서는 중요한 역할을 하지만 생체 외 수정에서는 그렇지 못하므로, 상기 결과는 상기 더미의 이상이 PTX3 -/- 암컷의 불임에 근원적으로 잠재하고 있음을 시사한다.
난소 조직에서 PTX3 mRNA의 발현을 노던 블럿팅과 원 위치 하이브리드화에 의해 조사하였다. 호르몬 유도된 과배란 후에, PTX3 mRNA 발현(전체 조직에서 노던 블럿팅에 의해 평가됨)을 hCG 처리 후 2 시간째에 시작하여 배란 후 수 시간까지 배란 전 팽창에 상응하는 12 내지 14 시간까지 지속시킨다(도 2A 참조)(20). 과립층 세포를 난포세포 더미의 히아루로니다제 처리 및 난모세포 발현된 PTX3 전사물로부터의 분리에 의해 수득하였다.
과배란 부재 하의 정상적인 조건 하에서의 발현을 원 위치 하이브리드화에 의해 조사하였다. 비 처리된 암컷의 기관에 대한 원 위치 하이브리드화(도 2B)는 난모세포에서 전사의 증거 없이 성숙한 난포의 과립층 세포에 한정된 난소에서 PTX3 mRNA의 발현을 입증하였다.
이어서 난소 조직에서 PTX3 단백질 발현을 분석하였다. 웨스턴 블럿팅은 PTX3가 면역 반응성이 제거된 난모세포로부터 더미 세포를 분리시키는 히아루로니다제 처리로 인해 PTX3 +/+ 더미(특히 세포 외 기질)와 회합함을 가리켰다(도 2C). 호르몬 유도된 과배란(hCG 후 13 내지 15 시간) 후에 수거된 PTX3 +/+ 및 -/- 난포세포 더미에 대한 면역형광분석은 PTX3의 세포간 기질 더미와의 회합을 입증하였다(도 2D).
상기 데이터는 PTX3 결손에 의해 야기된 불임이 PTX3 결손이 생식, 교배에서 배란, 이식 및 임신의 다른 단계들에 영향을 미치지 않으므로 난모세포 수정의 결여에 기인함을 제시한다. PTX3 전사물은 전적으로 성숙한 난포의 과립층 세포에 의해서 뿐만 아니라 난모세포에 의해서가 아닌 분리된 과립층 세포에 의해서 정상 난소에서 발현된다. PTX3 mRNA 발현이 호르몬 유도된 과배란에 이어서 전체 난소 조직에서 유도된다. 최종적으로, PTX3 단백질이 추정 상 과립층 세포에 의해 생산된 단리된 더미의 세포 외 기질에서 동정되었다. PTX3 -/- 마우스에 대한 분석은 불임의 결정소로서 비정상적인 난포세포 더미를 동정하였다. PTX3 -/- 암컷의 난포세포 더미는 형태 이상을 나타내었다. 상기는 잘 한정된 대뇌부챗살이 결여되었으며, 생체 외 배양 시 난모세포로부터 급속히 탈착되었다. PTX3 결손 더미의 "허약성"은 상기 특유의 기질에서 PTX3의 구성 역할 또는 기질 분해의 조절 기전의 변경에 영향을 미칠 수 있다. 상기 결과는 PTX3를 수태에서 중요한 역할을 하는 난포세포 더미의 세포 외 기질에 대한 새로운 구성성분으로서 동정한다. 상기 난포세포 더미는 생체 외에서는 필수적이지는 않지만 생체 내 수정에서 중요한 역할을 한다. 따라서, 상기 난포세포 더미의 이상은 PTX3 -/- 암컷 마우스의 불임에 관여하는 듯 하다.
물질 및 방법
PTX3 -/- 마우스의 제조
마우스 PTX3 유전자의 엑손 1 내지 2를 포함하는 8.5 kb의 게놈 DNA 단편을 사용하여 IRES-LacZ 카세트를 통합시킨 다음 첫 번째 암호화 ATG의 하부 71 bp 위치에서 엑손 1중의 pWH9 플라스미드로부터의 PGK-네오마이신 내성 유전자를 통합시켰다. ES 세포의 배양, 선택 및 동정 방법들을 개시된 바와 같이 수행하였다(20). 5 개의 독립적으로 표적화된 R1 ES 세포 클론들을 탐침 A(두번 째 인트론에서 EcoRI/EcoRV 750 pb 단편)를 사용하여 서던 블럿 하이브리드화에 의해 동정하였다. 랜덤한 통합이 탐침 B(네오마이신 내성 유전자로부터)를 사용하여 탐지되었다는 증거는 없었다. 2 개의 ES 세포 클론을 C57BI/6 낭포에 주입하였다. 마우스의 유전자형 제조를 위해서, 꼬리 생검으로부터 유도된 DNA를 각각 야생형 또는 표적화된 대립 유전자를 탐지하는 2 개의 프라이머 세트(프라이머 세트 1: 5'-AGCAATGCACCTCCCTGCGAT-3', 서열식별번호: 7; 5'-TCCTCGGTGGGATGAAGTCCA-3', 서열식별번호: 8; 프라이머 세트 2: 5'-CTGCTCTTTACTGAAGGCTC-3', 서열식별번호: 9; 5'-TCCTCGGTGGGATGAAGTCCA-3, 서열식별번호: 10)를 사용하는 폴리머라제 쇄 반응에 의해 증폭시켰다. 표현형 분석을 독립적인 클론들로부터 유래된 2 개의 주에 대해서 수행하였으며, 결과를 혼합된 129Sv-C57BI/6 및 129Sv 동종 번식된 유전자 배경에서 확인하였다. PTX3 +/+ 마우스는 찰스 리버(Charles River, Calco, Italy)로부터 수득한 129Sv-C57BI/6 PTX3 -/- 한배새끼이거나 또는 129Sv 또는 C57BI/6 마우스였다.
동물과 그의 보호에 관한 절차는 국가(4D.L. N.116, G.U., suppl. 40, 18-2-1992) 및 국제법과 정책(EEC Council Directive 86/609, OJ L 358, 1, 12-12-1987; 실험 동물의 보호 및 사용에 관한 NIH 지침, U.S. National Research Council, 1996)의 승낙에 따른 제도적인 지침에 따랐다. 사용되는 동물의 수와 그들의 희생을 최소화하기 위해 모든 노력을 다하였다.
PTX3 mRNA 및 단백질
RNA를 세포로부터 추출하고 TRIZOL 시약(GIBCO BRL)을 사용하여 정제하였다. 노던 블럿팅, 탐침 표지화 및 하이브리드화(결합 및 세척) 조건은 개시된 바와 같이 수행하였다(21).
원 위치 하이브리드화: 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 액체 질소에서 동결시킨 야생형 및 PTX3 -/- 난소로부터 회수된 냉동미세절단 섹션(13 ㎛)을 사용하여 상술한 바와 같이 원 위치 하이브리드화를 수행하였다(22). 간략히, 프로테이나제 K 및 0.2N HCl로 투과성으로 만든 슬라이드들을 65 ℃에서 밤새 스트라타진(Stratagene) RNA 전사 키트를 사용하여 PTX3 cDNA 함유 벡터(pBluescript)로부터 제조된 방사능-표지된 리보탐침과 함께 배양하였다. 후속적으로, 시편들을 포름아미드 함유 완충액으로 세척하고, 공기 건조시키고, 사진 유화액에 침지시키고 10 일 이상동안 어두운 상자에서 4 ℃에서 배양하였다. 전개시킨 후에, 상기 슬라이드들을 2 ㎍/㎖의 Heochst 33258 염료 용액으로 대조 염색하였다. 웨스턴 블럿 분석을 위해서 과배란된 암컷으로부터 수거된 완전한 난포세포 더미, 과립층 세포 또는 난모세포로부터 수득된 전 세포 추출물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Page)에 의해 분리시키고, 니트로셀룰로즈 필터(Hybond ECL, Amersham) 상으로 전기블럿팅시키고, 정제된 비오티닐화된 항-쥐 PTX3 다클론 햄스터 혈청(1 ㎍/㎖)에 이어서 스트렙트아비딘-HRP(BIOSPA, Italy)로 표지하였다. 표지된 단백질을 향상된 화학발광(ECL, Amersham)에 의해 검출하였다.
난모세포 및 배아 수거, 생체 외 수정 및 배아 전달
난포세포 더미, 접합체 및 배아를 자연 교배 후 처리되지 않은 암컷의 난관 또는 자궁으로부터 회수하였다(20). 과배란을 48 시간 후에 5 단위의 임신한 암컷 혈청(PMS, Folligon, Intervet)과 5 단위의 인간 융모막 고나도트로핀(hCG, Corulon, Intervet)으로 처리하여 유도하였다. 난포세포 더미를 교배 후 상이한 시점에서 또는 hCG 처리 후 13 내지 15 시간 째에 수거하였다. 과립층 세포 및 난모세포를 히아루로니다제 처리에 의해 분리시켰다(20).
과배란된 암컷으로부터 수득한 난의 생체 외 수정(IVF)을 개시된 바와 같이(20) 완전한 난포세포 더미를 사용하여 수행하거나 또는 M16 배지(Sigma) 중의 1 ㎍/㎖의 Hoechst 염료로 염색한 투명띠가 없는 난(20)과 BDF 수컷으로부터의 정자를 사용하여 수행하였다. 수정 및 정자-난 융합을 완전한 난포세포 더미의 인공수정 후 당일에 2 세포기 배아를 카운트하고 투명띠가 없는 난의 인공수정 후 4 시간째에 형광 수정 정자를 갖는 난을 카운트함으로써 평가하였다.
배아 전달을 2.5 일 거짓임신성 PTX3 -/- 암컷의 자궁에 이식한 3.5 일 PTX3 +/+ 낭포를 사용하여 상술한 바와 같이 수행하였다(20).
참고문헌
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청구의 범위 및 그의 법적인 등가물의 범위 내에 있는 모든 변경 및 치환은 본 발명의 범위 내에 포함된다. "포함하는"을 사용하는 청구항은 청구의 범위 내에 있는 다른 요소들의 포함을 허용한다, 즉 본 발명을 또한 "필수적으로 이루어진"이란 구(즉 청구의 범위 내에 있는 다른 요소들이 본 발명의 실시에 실질적으로 영향을 미치지 않는 경우 상기 요소들의 포함을 허용함) 및 "포함하는"이란 용어 대신에 "이루어지는"이란 구(즉 본 발명과 통상적으로 관련이 있는 불순물 또는 불합리한 활성 이외에 청구의 범위에 나열된 요소들만을 허용함)를 사용하여 상기와 같은 청구항에 의해 개시한다.
삭제
본 명세서에 개시된 요소가 청구의 범위에 명백히 인용되지 않는 한 청구된 발명의 제한으로서 해석되어서는 안됨은 물론이다. 따라서, 청구의 범위는 상기 청구의 범위에 씌어있는 명세서로부터 제한 대신에 허여된 법적 보호 범위를 결정하는 기준이다.
대조적으로, 종래 기술은 본 발명으로부터 청구된 발명이 예견되거나 또는 신규성을 훼손하는 특정 실시태양들의 범위까지 명백히 제외된다. 특정 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 속을 청구의 범위에 인용할 수 있으나, 단 고유 핵산 또는 단백질(예를 들어 서열 목록에 제공되지 않은 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드를 갖는)은 제외된다. 예를 들어, 유전자 코드의 퇴행을 사용하여 서열식별번호: 2(그러나 서열식별번호: 1은 아니다)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다. 유사하게, 기능 상 동등하지만 서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 중 하나 이상의 변화에 의해 마우스 및/또는 인간 단백질과 동일하지 않은(예를 들어 90% 이상 일치함) PTX3 폴리펩티드를 제공할 수 있다.
본 발명이 본 발명의 진의 또는 필수적인 특징들로부터 이탈됨 없이 다른 특정한 형태로 실행될 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다. 개시된 실시태양들은 본 발명에 대해 제공된 법적 보호의 범위가 본 명세서에 의해서라기 보다는 첨부된 청구의 범위에 의해 지시될 것이므로 제한적인 것이 아니라, 단지 예시적인 것으로서 간주되어야 한다.
삭제
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tttttccccc agcttttttt 420 ccccattcta ggttacccag ttgtactgtg ttgtttgtca taggccgggt gaggtggctc 480 acgtctgtaa tcctagcaat ttgggaggcg aaggcgggtg gatcgcctga ggtcaggagt 540 tcgagaccag cctggctaac atggtgaaac cctgtctcta ctaaaaatac aaaaattaac 600 tgggtgtggt ggcgggtgcc tgtaattcca gctacttggg aagctgaggt aggagaatcg 660 cttgaaccca ggatgcggag gttgcagtga gccgagatca caccattgca ctccagcctg 720 ggcaacaaga gcgaaattca gtctcaaaaa aaaaaattat ctataaaagt ataggtgcaa 780 ctcctcaagt attaaagaca agatagctcg gattggactt gactttcaga gccataacta 840 ttcttaatat gttggtttat cttggaatca gaccattttc agtttcaacc tgtaaaacag 900 tgtacaaagg aaacatggaa agttttctat atataaaggg ttgtgaaata ataacagctc 960 acagaaaatg ctgaaatgat gatttgcttc agtaccctct gaaatttctc ccctaccacc 1020 cctccttcat ccccattgct atcaattcaa attacaacag ctaattctca ggagaacagt 1080 agaagcccag tttctctcct ctttcccctc tgaccctcct ccaattaatc tgactgcagc 1140 gtaaaccttt gcggtttaat attgtgcaac ttccacattt ccctcgctct cccacccagc 1200 cccctccccc accaaattca ggggaactcc cgttaccgca gtgccaccag cattactcat 1260 tcatccccat tcaggctttc ctcagcattt attaaggact ctctgctcca gcctctcact 1320 ctcactctcc tccgctcaaa ctcagctcac ttgagagtct cctcccgcca gctgtggaaa 1380 gaactttgcg tctctccagc aatgcatctc cttgcgattc tgttttgtgc tctctggtct 1440 gcagtgttgg ccgagaactc ggatcattat catctcatgt atgtgaattt ggacaacgaa 1500 atagacaatg gactccatcc cactgaggac c 1531 <210> 6 <211> 2708 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> promoter <222> (1)..(1373) <300> <301> Altmeyer, et al. <302> Promoter Structure and Transcriptional Activation <303> Journal of Biological Chemistry <304> 270 <305> 43 <306> 15584-15590 <307> 1995-10-27 <308> U33842 <309> 1995-10-27 <400> 6 atcccagagg ctctctgtac tggcattagg acctcacagc accacatcag gtttcttaat 60 gtggactcta gaaactgaac tcgagcccac agccttagga gaaaagcacc ttacaaagct 120 gtggctccac actgcccttt aaacaatatc gtattgtctc atattgccat cgctttctga 180 tggctttaac ggtttcaaac ataccctgtc tttagccgtg atctcaaata agtgaagctc 240 ttgagcaggg gcctgatgcc ttttgacttt gtgttgattc atgcttatga tgccctgttc 300 cctccgtgtc tagctatgtt taactgtgga ttcaattttt attggtgggt ggattggtac 360 atgcatgtgc attccagatg cgtgagggca ctcaggccag gaaagccact catgagtctc 420 tgtcaggagc agaggaattt acctatggaa atccaagagc agccttctga gaggcctggc 480 ctgagggtag tacccctccc atcatgatca ggatgtgact ggtaaccctc cccctccatc 540 tcctttgtat attggagact tgtatcagct caggggtatc ctctgggagt ggttccctct 600 agatctgtgt agttttttag atcttgcttt atttggagtt tattctcatg ttttaatttt 660 ttatcactat tattatgact tatcaacacc tatctaggta cttttcactg ggggaggggg 720 caggttttac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acagtcacta 780 atgtaaaatt taaaacaggg accttgatag gatatgtcca agaataccca agcaccctaa 840 agccactata ttcccgccct cactttcctg ttttactggg ttttgaccca gccatactgt 900 gttttttagt tgctccacca gaggagtcaa gactagttag tcaagattga cttctagagt 960 cataaaaatt cttaatgggt tattttggag tcacggaatc attttctata gcttggtctt 1020 gagaaagtat ccaaaggaaa agtgaaaaaa aaaagttttc cataacttca ggggttgtgg 1080 agtaatgaaa gctcacacca aatgccaaaa tgataattcg ccctgtacct ctgtgctcct 1140 caccccccaa agcgctagca cttcaggtta cagcaactaa tcctcagggg caccagaaaa 1200 gtccagcttc cctccccttc tccccctgac tcgcctctaa ttaatctgcc tgcagtgtgg 1260 acctcggtgg tttaacattg tgcaacctct tcagctccct tgccctccca cccaaccccc 1320 tcccccaaat ccaggggaac tccctcgcgc tgtgccaccg acattagtca ttcatccgct 1380 catgctttgg agcgtttatt aagggcttca ctcctgcctc acactatctc tcccgggctc 1440 aaactcggat cactgtagag tctcgcttct tcccctgcgg gtgcgaagca aatttcggct 1500 ctccagcaat gcacctccct gcgatcctgc tttgtgctct ctggtctgca gtagtggctg 1560 agacctcgga tgactacgag ctcatgtatg tgaatttgga caacgaaata gacaatggac 1620 ttcatcccac cgaggaccgt aagttcattt ttaactctct cagcgtatca aaactacata 1680 actcacttct gggggggcgc gattaacata attaacatag atagccaatg aagcaagcta 1740 aaattatact ttatttgtga aagcaaggac tgggggaaaa aaggaaagca aggaaatatc 1800 tgagaaaagc cagaggtttt aaattatttt tgtaacattt atgatgagtt aagttatacg 1860 aaatctttaa ctgtttttag ctatattaat ggcattttct cagttagttt aacatgtcta 1920 taaagaatag tctgtgtcat ctttgagttt acacgcacgc tgttttcaga gctatcctta 1980 gaaggagagc gttgctgggg acaggctgaa acttggagtc accaagagtg caacccatgg 2040 ccacccagga caagctgata acacttgtgt gtgtcctgcg ttctagccac gccatgcgac 2100 tgcgcccagg agcactcgga gtgggacaag ctgttcatca tgctggagaa ctcgcagatg 2160 cgggagggca tgctgttgca ggccaccgac gacgtcctcc gtggagagct gcagcggctg 2220 cggtcagagc tgggccggct ggcgggcggc atggcgaggc cgtgcgcagc cggtggcccc 2280 gcagacgcca ggctggtgcg ggcgctggag ccgctgctgc aggagagccg tgacgcgagc 2340 ctcaggctgg cgcgcctgga ggacgcggag gcgcggcgac ccgaggcgac agtgcctggc 2400 ctaggcgctg tgctggagga actgcggcgg acgcgctccg acctgagcgc cgtgcagagc 2460 tgggtcgccc accactggct gcccgcaggt aagcccacgg tcggctctgt ccctagaggc 2520 aagcttttgt gggaccctca cactcagagc cccagtactt ttcataggca cactcacaga 2580 gctcacacca cgccaggcag ctcattgcct tttaaaagta tttccaagcc cgaggaaccc 2640 aaaagaaaaa aacgaggatt taaaccatca gtctggaagt tgacgtcaga ggttcctgat 2700 accggatc 2708 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 7 agcaatgcac ctccctgcga t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 8 tcctcggtgg gatgaagtcc a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 9 ctgctcttta ctgaaggctc 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 10 tcctcggtgg gatgaagtcc a 21 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus "pentraxin-like" sequence <400> 11 His Xaa Cys Xaa Xaa Trp Xaa Ser 1 5

Claims (17)

  1. 서열번호:1로 표시되는 재조합 인간 PTX3를 코딩하는 유전자를 포함하는, 여성의 생식능력을 증가시키기 위한 약학 조성물.
  2. 서열번호:1로 표시되는 인간 PTX3 cDNA를 포함하는 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 포함하는, 여성의 생식능력을 증가시키기 위한 약학 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 약학 조성물이 전신 또는 국부 투여될 수 있는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. PTX3 활성을 변화시키는 서열번호:2의 PTX3 폴리펩티드 또는 서열번호:1의 PTX3 폴리뉴클레오티드 중에서 선택되는 약제를 포함하는, 여성의 생식능력을 증가시키기 위한 약학 조성물.
  8. 삭제
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 약제는 인간에서 유래한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 약학 조성물이 전신 또는 국부 투여될 수 있는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 약제는 여성에 있어 서열번호:1의 내생적 (endogenous) PTX3 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 여성의 생식능력을 증가시키기 위한 약학 조성물.
  12. 삭제
  13. 제 7 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 여성의 불임을 치료하기 위한 약학 조성물.
  14. 삭제
  15. 생식능력에 작용하는 화합물의 선별방법에 있어서,
    (a) 후보 약제의 라이브러리를 제공하는 단계,
    (b) 상기 약제의 존재 하에서 서열번호:1로 표시되는 PTX3 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호:2로 표시되는 PTX3 폴리펩티드의 활성을 결정하는 단계,
    (c) 상기 PTX3 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 활성을 변화시킬 수 있는 능력에 의해서 최소한 하나의 약제를 선택하는 단계, 및
    (d) 상기 선택된 약제가 여성의 생식능력에 작용을 하는지 확인하는 단계
    를 포함하는 생식능력에 작용하는 화합물의 선별방법.
  16. 삭제
  17. 삭제
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