ES2261714T3 - Uso de la pentraxina larga ptx3 para tratar la infertilidad femenina. - Google Patents
Uso de la pentraxina larga ptx3 para tratar la infertilidad femenina.Info
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Abstract
Uso de la PTX3 humana recombinante para preparar un medicamento para incrementar la capacidad reproductora en un sujeto hembra con un defecto en la reproducción.
Description
Uso de la pentraxina larga PTX3 para tratar la
infertilidad femenina.
Esta invención se refiere al requerimiento de la
actividad de la PXT3 para la infertilidad femenina. Una mutación
genética que reduce la actividad de la PTX3 da como resultado
esterilidad femenina.
Las pentraxinas son una superfamilia de
proteínas, que se caracteriza por una estructura multimérica cíclica
[1]. La proteína C - reactiva (CRP) y componente P amiloide de suero
de las pentraxinas cortas clásicas son proteínas de fase aguda en el
hombre y ratón respectivamente, producidas en el hígado en respuesta
a mediadores inflamatorios; in particular, están inducidas
directamente por la interleuquina - 6 [2 - 3].
Las pentraxinas largas comparten similitudes con
las pentraxinas cortas clásicas, pero difieren por la presencia de
un dominio N-terminal largo no relacionado acoplado
al dominio de pentraxina terminal, así como por la organización
genómica, localización cromosómica, y ligandos reconocidos. La
pentraxina larga (PTX3) es la primera pentraxina larga identificada
como un gen inducible por la interleuquina - 1 (IL - 1) en células
endoteliales [4] y un gen inducible del factor \alpha de necrosis
tumoral (TNF\alpha) en fibroblastos [5]. La PTX3 también está
producida por macrófagos y otros tipos de células y tejidos tras la
estimulación con mediadores inflamatorios primarios (LPS, IL - 1,
TNF\alpha) [6 - 8]. La PTX3 consta de un dominio de tipo
pentraxina de 203 aminoácidos C - terminal y un dominio no
relacionado de 178 aminoácidos N-terminales. Cuando
se secretan, los protómeros de la PTX3 (45 kDa) se juntan para
formar 10 - multímeros [9]. La PTX3 no se une a ligandos de
pentraxina clásicos tales como fosfoetanolamina, fosfocolina,
piruvato azarosa alto, colágeno IV, fibronectina, o gelatina. Por el
contrario, la PTX3 se une específicamente con alta afinidad a C1q
mediante el dominio pentraxina [9]. Los niveles en plasma de la PTX3
son muy bajos en condiciones normales (\leq 2 ng/ml) pero se
incrementan en varias afecciones patológicas (10 - 100 ng/ml)
incluyendo infecciones [10].
Otras pentraxinas largas clonadas después de la
de la PTX3 incluyen la apexina de cobaya [11, 12] que se expresa en
el acrosoma de esperma XL-PXN1 de Xenopus
lavéis [13], pentraxina 1 neuronal de rata (NP1) [14], NP1 y NP2
humanas [15, 16], NP1 y NP2 de ratón [15], Narp [17], y receptor de
pentraxina neuronal (NRO), pentraxina de membrana integral supuesta
[18 - 19]. La función in vivo de las pentraxinas largas no
se ha definido inequívocamente.
La PXT3 consta de dos dominios estructurales: un
dominio N-terminal no relacionado con cualquier
molécula conocida y un dominio C-terminal similar a
las pentraxinas cortas tales como proteína C - reactiva (Breviario y
col., J. Biol. Chem., 267: 22190 - 22197, 1992). Una similitud
sustancial se ha encontrado entre la PTX3 humana (h PTX3) y la PTX3
de ratón (m PTX3). El grado de identidad entre los genes de la s
PTX3 humana y murina es 82% y alcanza el 90% si se consideran
sustituciones conservadoras (Introna y col., Blood, 87: 1862 - 1872,
1996). Los genes se localizan en las localizaciones cromosómicas
sinténicas. El alto grado de similitud entre las secuencias de h
PXT3 y m PTX3 es un signo del alto grado de conservación de
pentraxinas durante la evolución (Pepys y Baltz, Adv. Immunol., 34:
141 - 212, 1983). Las pentraxinas están revisadas por Gewurz y col.
(Curr. Opin. Immunol., 7: 54 - 64, 1995).
El documento WO 9/32516 describe el uso de la
PTX3 para el tratamiento terapéutico de cáncer, inflamación, y
enfermedades infecciosas.
La patente de Estados Unidos Nº 5.767.252
describe un factor de crecimiento para células neuronales que
pertenecen a la familia de la pentraxina.
El documento WO 02/36151 describe el uso de la
PTX3 para la preparación de medicamento para la prevención y
tratamiento de patologías autoinmunes.
Varani, S., y col.; Mol. Endocrinol., 2002, Jun;
16 (6): 1154 - 67 reseñan que las hembras con inactivación de la
pentraxina 3 son subfértiles, mostrando un papel importante en la
interacción cúmulo - ovocito en el período preovulatorio como una
proteína cadena abajo en la cascada de traducción de señal de
GDF-9.
En contraste con lo anterior, el estudio de
ratones genéticamente modificados en su locus genético de la PTX3,
que se producían por la recombinación homóloga en las células del
tronco embrionario, y los efectos de los mismos ha revelado la
implicación de la PTX3 en la fertilidad femenina.
Un objeto de la invención es el uso la PTX3
humana recombinante para un medicamento para incrementar la
fertilidad femenina. Los efectos de la esterilidad femenina se puede
mejorar, la capacidad reproductora se puede aumentar o disminuir
según se desee, la fertilidad femenina se puede potenciar, o las
combinaciones de los mismos. Otros tratamientos tales como la
fertilización in vitro requieren procedimientos invasivos y
tecnología complicada. Por lo tanto se dirige a la necesidad de
terapias que afectan a la fertilidad femenina. Se describen más
adelante otras ventajas y mejoras, o sería evidente a partir de la
descripción en esta memoria descriptiva.
Las composiciones farmacéuticas, procedimientos
para usar y prepararas, y objetivos adicionales se describen más
adelante.
Un objeto de la invención es proporcionar un
medicamento que está comprendido por la PTX3 humana recombinante en
una cantidad suficiente para incrementar la capacidad reproductora
en una hembra sujeto con un defecto en la reproducción. El
descubrimiento de que se requiere la actividad de la PTX3 se puede
usar como terapia de una paciente o animal hembra con un defecto en
la reproducción o APRA la diagnosis de su capacidad para
repro-
ducirse.
ducirse.
El sujeto puede ser un paciente o animal hembra.
La composición puede ser adecuada para la administración sistémica o
adaptada para la administración local (es decir, dentro o alrededor
de un órgano reproductor femenino). La composición se puede usar
para tratar la esterilidad.
Otro objeto de la invención es proporcionar
procedimientos de administración de al composición farmacéutica a un
sujeto en necesidad de tal tratamiento para la esterilidad femenina
en una cantidad para incrementar la capacidad reproductora del
sujeto.
La detección de la PTX3 en un sujeto hembra y la
correlación de esta cantidad con su capacidad reproductora es un
objeto adicional de la invención. Las mutaciones en el locus
genético de la PTX3 se encontraría el el cromosoma 3p24 - q28; las
mutaciones en los genes que interactúan se encontrarían fuera del
locus genético de la PTX3. La función de una variante de la PTX3 se
puede determinar por comparación con secuencias de la PTX3 conocidas
u otras secuencias de pentraxinas; plegamiento, glicosilación,
secreción, o formación de multímeros; unión de receptor o
transducción de la señal; efecto en la capacidad reproductora,
fertilidad, o esterilidad; o las combinaciones de los mismos.
Los aspectos adicionales de la invención serán
evidentes para los expertos en la técnica a partir de la siguiente
descripción y reivindicaciones, y la generalización de los
mismos.
Las figuras 1A - 1F ilustran la morfología
anormal de cúmulos oóforos de ratones PTX3 -/-. Los cúmulos oóforos
se recuperaron 14 - 16 horas después del tratamiento de hCG. Se
muestran después de la recogida (A y B) o 4 horas más tarde (C y D).
En ratones PTX3 -/- (A y C), las células de la granulosa forman un
cúmulo compacto y estable alrededor del ovocito (flecha da mettere).
En ratones PTX3 -/- ratones (B y D), están escasamente asociados al
ovocito y el cúmulo ha desaparecido completamente en 4 horas. El
examen histológico de los ovarios de PTX3 +/+ (E) y ratones PTX3
-/- (F) muestra folículos antrales normales.
Las figuras 2A - 2D muestran ARNm de la PTX3 y
la expresión de proteína en tejido de ovarios. (A) Cinética de la
expresión de la PTX3 en ovarios después de la superovulación
inducida hormonalmente (tratamiento con PMS seguido 48 horas después
de tratamiento con hCG) se mostraron al nivel de ARNm. Se recogieron
los ovarios a las 0, 6, 16, 24 ó 48 horas después de tratamiento con
PMS y después 2, 6, 16, 24 ó 48 horas después de tratamiento con
hCG. Se cargaron 10 \muh de ARN total en cada carril. La tinción
con bromuro de etidio del gel se muestra en el panel inferior. (B)
Hibridación in situ del ovario: célula de la granulosa
expresa ARNm de PTX3 solamente en folículos maduros. (C) Expresión
de PTX3 por cúmulos oóforos (C. O.), células de cúmulos oóforos
(células C. O.), y ovocitos se detectó mediante transferencia de
Western. Los cúmulos oóforos se recuperaron de hembras superovuladas
PTX3 +/+ y PTX3 -/-; las células y ovocitos de cúmulos oóforos se
obtuvieron de 7 y 14 hembras superovuladas PTX3 +/+,
respectivamente. (D). Se ilustran los análisis de contraste de fase
(paneles de la derecha) e inmunofluorescencia (panel de la
izquierda) de cúmulos oóforos de ratones PTX3 -/- (paneles
inferiores) y PTX3 +/+.
Las secuencias de ADNc humano y su fase abierta
de lectura traducida (SEQ ID números 1 - 2 respectivamente), un ADN
c de ratón y su fase abierta de lectura traducida (SEQ ID números 3
- 4 respectivamente), regiones reguladoras cadena arriba humanas y
de ratón (SEQ ID números 5 - 6 respectivamente), y cebadores de la
PCR (SEQ ID números 7 - 10) se muestran en el listado de
secuencias. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos humanas
y de ratón respectivamente muestra que 312 de 381 residuos son
idénticos (82%) y 351 son al menos similares (92%). Ambos genes
contienen tres exones: el primero codifica 43 residuos de
aminoácidos, el segundo codifica 135 residuos de aminoácidos sin
alta similitud a los motivos de secuencia conocidos, y el tercero
codifica 203 residuos de aminoácidos con similitud a pentraxinas. Un
dominio de tipo pentraxina incluye dos residuos Cys en las
posiciones 162 y 254 y una secuencia de consenso de "tipo
pentraxina" His - Xaa _ Cys - Xaa - Ser-/Thr - Trp - Xaa - Ser
(SEQ ID Nº 11).
La PTX3 nativa se glicosila (sitio glicosilación
potencial unido a N en la posición 203). Un complejo de la PTX3
multimérico eluía en filtración de gel con un eso molecular relativo
de aproximadamente 900 kDa. Migraba en electroforesis de gel en
condiciones no desnaturalizantes y no reductoras como una banda
predominante de aproximadamente 440kDa (por ejemplo, 9- ó 10 meros
de aproximadamente 45 kDa protómeros) con dos bandas secundarias en
el intervalo de 540 - 600 kDa. El análisis de dicroísmo circular
indicaba que la PTX3 contenía principalmente estructura de hojas
\beta con alguna estructura de hélice \alpha. Se puede
identificar, aislar o detectar indirectamente el polipéptido de la
PTX3 o un complejo del mismo mediante una molécula de enlace (por
ejemplo, anticuerpo, péptido natural o no natural mimético) para el
producto génico de la PTX3.
El polipéptido de la PTX3 y sus variantes (es
decir, supresión, mezcla de dominios o duplicación, inserción,
sustitución, o las combinaciones de los mismos) también son útiles
para determinar las relaciones estructura - función (por ejemplo,
barrido de alanina, sustitución conservadora o no conservadora de
aminoácidos). Por ejemplo, plegamiento y procesamiento de proteína
de la PTX3, secreción del promotor de la PTX3 y formación de
multímeros, unión de ligando a receptor, transducción de señal, o
las combinaciones de los mismos. Véase Wells (Bio/Technology, 13:
647 - 651, 1995) y la patente de Estados Unidos Nº 5.534.617. La
evolución dirigida por mutagénesis al azar de mezcla de genes usando
la PTX3 se puede usar para adquirir funciones nuevas y mejoradas de
acuerdo con criterios de selección. Los polipéptidos de la PTX3
mutantes, polimórficos y análogos están codificados por
polinucleótidos de la PTX3 mutantes, polimórficos y análogos. Se
pueden estudiar las relaciones estructura actividad de la PTX3 (es
decir, estudios SAR) usando polipéptidos variantes producidos por
una construcción de expresión transfectada en una célula huésped con
o sin PTX3 exógena. De este modo, las mutaciones en dominios
discretos del polipéptido de la PTX3 pueden estar asociados a la
disminución e incluso disminución de la actividad en la función de
la proteína.
Una secuencia de nucleótidos de la PTX3 se puede
usar para producir un polipéptido de fusión con al menos un dominio
de péptido heterólogo (por ejemplo, una marca de afinidad o de
epítope). El oligopéptido es útil para producir anticuerpo
específico y el mapeo del epítope del anticuerpo específico de la
PTX3. un polipéptido puede ser al menos 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45,
50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, o más aminoácidos de longitud
(incluyendo los intervalos intermedios de los mismos). El
oligopéptido se puede conjugar a una marca de afinidad de un par de
unión específica (por ejemplo, anticuerpo -
digoxigenina/hapteno/péptido, biotina - avidita/estreptavidina,
glutation S trasnferasa - glutation, proteína de unión a maltosa -
maltosa, proteína A o G/inmunoglobulina, polihistidina - níquel).
Cualquier polipéptido de la PTX3 de longitud completa (por ejemplo,
SEQ ID Nº 2 ó 4) o un fragmento más corto (por ejemplo, dominio
N-terminal o C-terminal) se puede
producir; opcionalmente incluyendo un dominio de péptido heterólogo.
El polipéptido de la PTX3 se puede sintetizar mediante medios
químicos, fuentes purificadas o naturales, sintetizadas en células
huéspedes transfectadas, o las combinaciones de los mismos.
La secuencia de nucleótidos de la PTX3 o una
porción de la misma se puede usar para controlar la expresión de la
PTX3, para determinar la secuencia de la PTX3, y/o para detectar
variantes de la PTX3. La invención también proporciona sondas de
hibridación y cebadores de amplificación (por ejemplo, reacción en
cadena de la polimerasa, reacción en cadena de ligamiento, otras
reacciones de amplificación isotérmica). Se puede usar un par de
tales cebadores para ensayos de RT - PCR con el fin de cuantificar
la abundancia de transcripción de la PTX3 dentro de las células. Los
cebadores de amplificación pueden estar entre 15 y 30 nucleótidos de
longitud (preferiblemente aproximadamente 25 nucleótidos),
hibridación a cualquier hebra de polaridad positiva o de polaridad
opuesta (preferiblemente el par será complementario a cada hebra), t
terminar en el extremo 3' en cualquier lugar dentro de las SEQ ID
Números 1, 3 y 5 - 6 o sus complementos. Por lo tanto, esta
invención será útil para el desarrollo y utilización de cebadores de
la PTX3 y otros oligonucleótidos para cuantificar ARN y ADN afines
dentro de las células.
La unión de polinucleótidos o polipéptidos puede
tener lugar en solución o en un sustrato. El formato de ensayo puede
o no puede requerir la separación de unido de no unido. Las señales
detectables pueden ser directas o indirectas, unidas a cualquier
parte de un complejo unido, medido de forma competitiva,
amplificado, o las combinaciones de los mismos. Una etapa de bloqueo
o lavado se puede interponer para mejorar la sensibilidad y/o
especificidad. La unión de un polinucleótido o polipéptido, proteína
de interacción, o molécula de unión a un sustrato antes, después o
durante la unión da como resultado la captura de una especie no
unida. Tal inmovilización estará establemente unida al sustrato en
condiciones de lavado, véanse las patentes de Estados Unidos
5.143.854 y 5.412.087.
Los cambios en al expresión génica se pueden
manifestar en al célula afectando el inicio transcripcional,
estabilidad de transcripción, traducción de la transcripción en el
producto proteico, estabilidad de las proteínas, procesamiento de
glicoproteínas, velocidad de plegamiento o secreción, o las
combinaciones de los mismos. El gen, transcripción, o polipéptido
también se puede ensayar mediante técnicas tales como transcripción
in vitro; hibridación de Northern, hibridación de ácido
nucleico, reacción en cadena de la polimerasa de transcripción
inversa (RT - PCR), desarrollo de la transcripción, hibridación de
Southern, marcado de proteína metabólica, unión de anticuerpos,
inmunoprecipitación (IP), ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas
(ELISA), radioinmunoensayo (RIA), marcado fluorescente o tinción
histoquímica, microscopía y análisis de imagen digital, y análisis o
aislamiento de células activadas por fluorescencia.
Un gen marcador indicador o seleccionable cuyo
producto se ensaya fácilmente se puede usar para la detección
conveniente. Los genes indicadores incluyen, por ejemplo, fosfatasa
alcalina, \beta-galactosidas (LacZ), cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT), \betaglucuronidasa (GUS), luciferasa
(LUC), proteínas fluoerescentes verdes y rojas (GFP y RFP,
respectivamente), peroxidasa de rábano picante (HRP),
\beta-lactamasa, y los derivados de los mismos
(por ejemplo EBFP azul, ECFP cian, EYFP amarillo - verde, variantes
de GFP desestabilizado, o variantes de fusión vendidas como
proteínas fluorescentes de colores vivos por Clontech). Los genes
indicadores usarían sustratos afines que se ensayan preferiblemente
mediante una señal cromógena, fluorescente, o luminiscente. Como
alternativa, el producto de ensayo se puede marcar con un epítope
ehterólogo (por ejemplo, FLAG, MYC, antígeno SV40 T, glutation
transferasa, polihistidina, proteína de unión a maltosa) para los
que están disponibles anticuerpos afines o resinas de afinidad. Los
ejemplos de fármacos para los que genes marcadores seleccionables,
que confieren resistencia existen son ampicilina,
geneticina/kanamicina/neomicina, higromicina, puromicina, y
tetraciclina. Una enzima metabólica (por ejemplo, la dihidrofolato
reductasa, HSV-1 timidina quinasa) se puede usar
como un marcador seleccionable en células hospedadoras sensibles o
auxotrofas. Por ejemplo, el metotrexato puede incrementar el número
de copias de un polinucleótido unido a un marcador seleccionable
DHFR o ganciclovir puede seleccionar de manera negativo un marcador
seleccionable de timidina quinasa viral.
Un polinucleótido puede estar ligado a un
oligonucleótido de engarce o conjugado a un miembro de un par de
unión específica (por ejemplo, anticuerpo -
digoxigenina/hapteno/epítope peptídico, biotina - avidita 7
estreptavidina, glutation S transferasa o GST - glutation, lecitina
- azúcar, proteína - maltosa de unión a maltosa, polihistidina -
níquel, proteína A/G - inmunoglobulina). El polinucleótido puede
estar conjugado mediante ligamiento de una secuencia de nucleótidos
que codifica el miembro de unión. Un polipéptido se puede unir a un
miembro del par de unión específica produciendo la fusión
codificada por tal polinucleótido ligado o conjugado o, como
alternativa, mediante enlace químico directo a un resto reactivo
sobre el miembro de unión mediante reticulación química. Tales
polinucleótidos y polipéptidos se pueden usar como un reactivo de
afinidad para identificar, aislar, y detectar interacciones que
implican la unión específica de una transcripción o producto
proteico del vector de expresión. Antes o después de la unión por
afinidad del producto de transcripción o proteico, el miembro unido
al polinucleótido o polipéptido se puede unir a su miembro de unión
afín. Esto puede producir un complejo en solución o inmovilizarse a
un soporte. Un sitio de reconocimiento de proteasa (por ejemplo,
para enteroquinasa, Factor Xa, ICE, secretasas, trombina) se puede
incluir entre los dominios adjuntos que permiten la proteolisis
específica del sitio que separa aquellos dominios y/o inactiva la
actividad de las proteínas.
Se pueden usar sondas y cebadores para
identificar un gen de la PTX3 o una variante del mismo. Por ejemplo,
una sonda o cebador específico de un gen de la PTX3 humano
identificado en esta memoria descriptiva se puede usar para detectar
la presencia o ausencia del gen, y por lo tanto presume que la
fuente del gen esté presente o ausente, respectivamente. Los
polimorfismos y mutaciones genéticas en el gen de la PTX3 se puede
detectar específicamente posicionando una (s) base (s)
potencialmente no emparejadas en la parte media de una sonda o el
extremo 3' de un cebador para estabilizar o desestabilizar la unión
de la sonda o cebador a su diana dependiendo de si la secuencia de
la diana en esa posición es complementaria a la base o no,
respectivamente.
Los polimorfismos y mutaciones genéticas también
se pueden detectar por un cambio en la longitud de un fragmento de
restricción (RFLP), fragmento protegido de nucleasa (por ejemplo,
nucleasa S1, desoxirribonucleasa I, ribonucleasa A, H o T1), o un
producto amplificado. Para las huellas dactilares genéticas
complicadas, la identificación de cada componente puede no ser
necesario debido a que una comparación visual uno al lado del otro
podría fácilmente detectar las diferencias (por ejemplo, RAPD). Las
diferencias también se pueden detectar mediante cambios en el peso
molecular (PM) o punto isoeléctrico (pI) de la proteína de la PTX3
mediante electroforesis en gel o localización isoeléctrica,
respectivamente.
La presencia de la proteína de la PTX3 se puede
usar como una indicación de la actividad de la PTX3 en fluidos o
tejidos humanos o animales. El fluido puede ser de sangre, producto
sanguíneo (por ejemplo, plasma, suero), lavado, esputo, o similar.
Los tejidos ejemplares son aquellos del epitelio (por ejemplo,
pulmón) o mucosa (por ejemplo, boca, vagina), aunque la infección
puede ser sistémica o implicar otros tipos de tejidos también. La
señal se puede detectar in situ para tejido sólido, sobre
tejido dispersado u homogeneizado, en solución (por ejemplo, fluido
corporal diluido o no diluido, lacado), o sobre una mancha celular o
preparación de toque. Los ovocitos que se pueden fertilizar se
pueden seleccionar mediante la expresión de la PTX3.
Un vector de transferencia o de expresión es un
polinucleótido recombinante que está en forma química o bien ácido
desoxirribonucleico (ADN) y/o ácido ribonucleico (ARN). La forma
física del vector puede ser de cadena sencilla o de cadena doble; su
topología puede ser lineal o circular. El vector es preferiblemente
una ácido desoxirribonucleico de cadena doble (ADN sd) o se
convierte en un ADN después de la introducción en una célula (por
ejemplo, inserción de un retrovirus en un genoma huésped como un
provirus). El vector puede incluir una o más regiones de un gen de
mamífero, insecto, planta o de hongo o un virus (por ejemplo,
adenovirus, virus asociado a adeno, citomegalovirus, virus de la
viruela aviar, virus herpes simples, lentivirus, virus de leucemia
de Molones, virus de tumor mamario de ratón, virus de sarcoma de
Rous, virus SV40, virus de vaccinia), así como regiones adecuadas
para manipulación genética (por ejemplo, marcador seleccionable,
engarce con sitios de reconocimiento múltiples para endonucleasas de
restricción, promotor de una transcripción in vitro, sitios
de hibridación de cebadores para la replicación in vitro). El
vector puede estar asociado a proteínas y otros ácidos nucleicos en
un vehículo (por ejemplo, empaquetado en una partícula viral) o
condensado o un compuesto químico (por ejemplo, polímero catiónico)
a una entrada diana en una célula o tejido. La elección de
polinucleótidos del vector y los procedimientos para introducirlos
en el sistema reproductor femenino (por ejemplo, endometrio,
ovario) está dentro de la práctica en la técnica.
Un vector de expresión puede comprender
adicionalmente una región reguladora para la expresión génica (por
ejemplo, promotor, potenciador, silenciador, sitio dador de ayuste o
aceptor, señal de poliadenilación, secuencia de localización
celular). Diferentes niveles de transcripción se puede lograr usando
un agente con un sistema regulador que responde
El anticuerpo específico para la PTX3 se puede
usar para la inhibición o detección. Los anticuerpos policlonales o
monoclonales se pueden preparar mediante la inmunización de animales
(por ejemplo, pollo, hámster, ratón, rata, conejo, cabra, caballo)
con antígeno, y opcionalmente afinidad purificado contra el mismo
antígeno o relacionado. El antígeno puede ser una proteína nativa,
fragmento hecho por proteolisis o ingeniaría genética, proteína de
fusión, o traducido in vitro o proteína sintetizada que
incluye al menos uno o más epítopes unidos por el anticuerpo. Los
fragmentos de anticuerpo se pueden preparar mediante escisión
proteolítica o ingeniaría genética; anticuerpo humanizado o
anticuerpo de una sola cadena se puede preparar transplantando
secuencias de dominios de unión de antígeno de un anticuerpo a
moléculas del marco conservado. Otras moléculas de unión (por
ejemplo, agonistas o antagonistas o unión ligando - receptor) se
pueden preparar seleccionando una genoteca combinatoria para un
miembro que específicamente se une a antígeno (por ejemplo, genoteca
de visualización de fago). El antígeno puede ser una proteína de
longitud completa codificada por el gen o fragmento (s) del mismo.
El anticuerpo puede ser específico para la PTX3 o puede reaccionar
de manera cruzada con otras pentraxinas dependiendo de cómo de bien
el epítope reconocido por el anticuerpo se conserva entre las
especies diferentes. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados
Unidos Números 5.403.484; 5.723.286; 5.733.743; 5.747.334; y
5.871.974.
Los agentes de unión específica a la PTX3 (por
ejemplo, polinucleótidos, polipéptidos) se pueden usar de manera
diagnóstica para detectar ácido nucleico o proteína de la PTX3, o
para tratamiento para inhibir la actividad de la PTX3 (por ejemplo,
transcripción, traducción, procesamiento, secreción, unión al
receptor). En particular, los agentes que afectan a la transcripción
de la PTX3 y unión de la PTX3 a un receptor son deseables.
Los compuestos de la invención o derivados de
los mismos se pueden usar como un medicamento o usarse para formular
una composición farmacéutica con uno o más de las utilidades
descritas en esta memoria descriptiva.
Por lo tanto es un objeto de la presente
invención el uso de la PTX3 humana recombinante para preparar un
medicamento para incrementar la capacidad reproductora en un sujeto
hembra con un defecto en la reproducción.
Un objeto adicional de la presente invención es
un procedimiento para la determinación de la capacidad reproductora
en una hembra humana que comprende la detección de la presencia de
la proteína de la PTX3 como marcador diagnóstico que afecta a la
capacidad reproductora en un sujeto hembra.
Los compuestos de la presente invención se
pueden administrar in vitro a células en cultivo, in
vivo a células en el cuerpo, o ex vivo a células en el
exterior de un sujeto que después puede regresar al cuerpo del mismo
o diferente sujeto. El sujeto es una hembra de edad reproductora;
desea estar embarazada.
Los compuestos o derivados de los mismos se
pueden usar por lo tanto para producir un medicamento u otras
composiciones farmacéuticas. El uso de composiciones que comprenden
adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable y
composiciones que además comprenden componentes útiles para
distribuir la composición a un sujeto se conocen en la técnica. La
adición de tales vehículos y otros compuestos a la composición de la
invención está también dentro del nivel de práctica en la
técnica.
Una composición farmacéutica se puede
administrar como una formulación que está adaptada para la
aplicación directa al sistema reproductor de la hembra (por ejemplo,
endometrio, ovario) o adecuado para el paso a través del intestino o
circulación de la sangre. Como alternativa, las composiciones
farmacéuticas se pueden añadir al medio de cultivo. Además del
compuesto activo, tales composiciones pueden contener vehículos
farmacéuticamente aceptables y otros ingredientes conocidos para
facilitar la administración y/o incrementar la ingesta. La
composición se puede administrar en una sola dosis o en dosis
múltiples que se administran en momentos diferentes.
Las composiciones farmacéuticas de pueden
administrar mediante una vía conocida. A modo de ejemplo, la
composición se puede administrar mediante una vía mucosal, pulmonar,
tópica, u otra localizada o sistémica (por ejemplo, entérica o
parenteral). En particular, se puede desear el lograr una cantidad
eficaz de la actividad de la PTX3 en o alrededor del sistema
reproductor. Esto -implicar el uso de aplicación local, implante
cerca de un órgano reproductor, un supositorio vaginal. El término
"parenteral" incluye subcutánea, intradérmica, intramuscular,
intravenosa, intraarterial, intratecal, y otras técnicas inyección
o de infusión, sin limitación.
Las elecciones adecuadas en cantidades y
programación de dosis, formulación, y vías de administración se
pueden realizar con los objetivos de lograr una respuesta favorable
en el sujeto (es decir, eficacia), y evitando la toxicidad excesiva
u otro perjuicio a él (es decir, seguridad). Por lo tanto,
"eficaz" se refiera a tales elecciones que implican
manipulación rutinaria de las condiciones para lograr un efecto
deseado: por ejemplo, que afecte a la capacidad reproductora,
potenciación de la reproductividad, o reducción de la
fertilidad.
Un bolo de una formulación administrado a un
sujeto hembra una vez al día es un programa de dosificación
conveniente. Como alternativa, se puede administrar una dosis eficaz
cada otro día, una vez a la semana, o una vez al mes. Los niveles de
dosificación de ingredientes activos en una composición farmacéutica
también se puede variar de manera que se logre una concentración
transitoria o sostenida del compuesto o derivado del mismo en un
sujeto y para dar como resultado la respuesta terapéutica deseada.
Pero está también dentro de la práctica en la técnica comenzar con
dosis a niveles inferiores que requieran lograr el efecto
terapéutico deseado y gradualmente incrementar la dosificación hasta
que se logra el efecto deseado.
La dosificación puede ser programada con
relación al ciclo reproductor del sujeto hembra (por ejemplo,
menstruación). Como una materia práctica, la temperatura del cuerpo
o niveles hormonales se pueden usar como sustitutos de episodios
similares a la ovulación y menstruación en la reproducción.
La cantidad de compuesto administrado depende de
factores tales como, por ejemplo, bioactividad y biodisponibilidad
del compuesto (por ejemplo en el cuerpo, estabilidad, y
metabolismo); propiedades químicas del compuesto (por ejemplo, peso
molecular, hidrofobicidad, y solubilidad); vía y programación de
administración; y similares. También se entenderá que el nivel de
dosis específica a lograr para cualquier sujeto particular puede
depender de una diversidad de factores, incluyendo edad, salud,
historial médico, peso, combinación con uno o más fármacos
diferentes, o la gravedad de la enfermedad.
El término "tratamiento" se refiere a,
entre otros, la reducción o alivio de uno o más síntomas de
esterilidad en un sujeto afectado. Para un sujeto dado, al mejora en
un síntoma, su empeoramiento, regresión, o progresión se puede
determinar mediante una medición objetiva o subjetiva. El
tratamiento también puede implicar la combinación con otros modos
existentes de tratamiento y agentes (por ejemplo, superovulación).
De este modo, se puede practicar el tratamiento de combinación.
Ratones hembras y machos heterocigóticos
genéticamente modificados para el gen de la PTX3 son normales y
fértiles. La reproducción entre sí produjo el número predicho de
ratones inválidos homocigóticos con una frecuencia mendeliana. Sin
embargo, la reproducción entre hembras y machos homocigóticos (PTX3
-/-) es completamente infértil. Los resultados de la reproducción
indicaron que los machos homocigóticos son normalmente fértiles
cuando se aparean con hembras (PTX3 +/+) o heterocigotos (PTX3 +/-)
de tipo salvaje, mientras que las hembras PTX3 -/- son siempre
infértiles, independientemente del genotipo del macho. Los
experimentos de apareamiento indicaron que no existían diferencias
entre hembras PTX3 -/- y PTX3 +/+ en la frecuencia de tampones de
copulación después de apareamiento espontáneo durante un período de
cuatro días o después de la superovulación (tabla 1). El número de
huevos ovulados espontáneamente (tabla 1) (media de 7 por ratón, n =
4, en PTX3 +/- y 7,8 por ratón, n = 8, en ratones PTX3 -/-) o huevos
ovulados inducidos hormonalmente (media de 35 por ratón, n = 9 en
PTX3 +/- y 27 por ratón, n = 18 en ratones PTX3 -/-) era comparable
en ratones +/+ y -/-. Los datos son de un experimento representativo
de cuatro realizados. La morfología de los ovocitos y zona pellucida
eran normales y se observaron los primeros cuerpos polares en
aproximadamente el 50% de los ovocitos obtenidos 16 horas después de
tratamiento con gonadotropina coriónica humana (hCG) de ratones
tanto PTX3 +/+ como PTX3 -/- (tabla 1). Estos datos indican que la
ovulación y maduración de ovocitos son normales y no son la causa de
infertilidad. Por el contrario, se observaron de manera consistente
anormalidades morfológicas de los cúmulos oóforos recogidos del
oviducto de ratones PTX3 -/- (figuras 1 B y 1 D), ya que las células
de la granulosa estaban escasamente asociadas a los ovocitos y no
forman la corona radiata. Los cúmulos derivados de la PTX3 -/- eran
inestables in vitro y las células de la granulosa se
desprendían espontáneamente de los ovocitos en un corto tiempo (15 -
60 minutos en cúmulos PTX3 -/- frente a varias horas en PTX3 +/+)
después de la recogida (14 - 16 horas después de hCG, o el día 0,5
después de apareamiento natural), que conduce rápidamente al despojo
de ovocitos.
| PTX3 | PTX3 | valor | |
| +/+ | -/- | de P | |
| Frecuencia de apareamiento | |||
| Espontánea (a) | |||
| Día primero | 4/9 | 2/10 | NS |
| Día segundo | 2/5 | 2/8 | NS |
| Día tercero | 2/3 | 2/5 | NS |
| Después de superovulación | 4/4 | 8/8 | NS |
| Ovulación | |||
| Espontánea (b): ovulación de ratones | 4/4 | 5/5 | NS |
| \hskip2.3cm huevos por ratón | 7 | 7,8 | - # |
| Después de la ovulación: ovulación de ratones | 5/5 | 6/6 | NS |
| \hskip3.6cm huevos por ratón | 37,8 | 33,3 | - |
| Presencia de cuerpo polar en | 53/98 | 54/109 | NS |
| huevos ovulados (c) | (54%) | (49%) | - |
| (a) \begin{minipage}[t]{150mm}Se alojaron las hembras con los machos durante un período de cuatro días y se comprobaron diariamente para evaluar la presencia de tampones\end{minipage} | |||
| (b) La ovulación se analizó en hembras con tampones. | |||
| (c) \begin{minipage}[t]{150mm}La presencia del primer cuerpo polar se determinó en ovocitos recuperados 15 horas después de tratamiento con hCG\end{minipage} | |||
| NS, \begin{minipage}[t]{150mm}diferencia no significativa (p < 0,05) del los ratones PTX3 +/+ control mediante ensayo exacto de Fischer.\end{minipage} | |||
| # \begin{minipage}[t]{150mm}Números se refiere a muestras reunidas de ratones PTX3 +/+ y PTX3 -/-. Una falta similar de diferencia se observó en cuatro experimentos con 5 - 7 ratones.\end{minipage} |
Para entender si y cuando se interrumpió el
embarazo, se recogieron cigotos y embriones en momentos diferentes
después de apareamiento después de la ovulación espontánea o
inducida hormonalmente. No se observó el desarrollo de ningún
ovocito a la fase de dos células in vivo (día 1,5) tabla 2)
no ovocitos con dos pronúcleo (día 0,5), incluso si se encontrara
esperma viable en el oviducto de ratones deficientes- Para
identificar adicionalmente la (s) causa (s) de infertilidad,
blastocitos PTX3 +/+ se transfirieron a hembras seudo embarazadas
PTX3 -/-, pero normalmente se observaron embarazo y parto. Esto
excluye defectos en el implante y procedimientos posteriores.
| Fertilización | PTX3 | PTX3 | valor |
| +/+ | -/- | de P | |
| In vivo | |||
| Huevos fertilizados sobre el total (a) | |||
| Ovulación espontánea | 17/28 | 0/39 | < 0,0001 # |
| (60%) | (0%) | ||
| Después de superovulación | 81/162 | 0/192 | < 0,0001 |
| (50%) | (0%) | ||
| In vitro | |||
| Después de la retirada de la zona pellucida (b) | 21/27 | 21/31 | NS ^{+} |
| (77%) | (68%) | ||
| Usando cúmulos oóforos intactos (c) | 79/189 | 68/169 | NS |
| (41,8%) | (40%) | ||
| (a) Se recogieron embriones a los 1,5 días después del coito, en la fase de dos células. | |||
| (b) La fusión se determinó mediante la técnica de transferencia e fase 4 horas después de la inseminación. | |||
| (c) Los embriones de dos células se contaron el día después de la inseminación. | |||
| # \, Ensayo exacto de Fisher | |||
| NS, diferencia no significativa (p < 0,05) de los ratones PTX3 +/+ control mediante ensayo exacto de Fischer. |
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar si se podían fertilizar ovocitos
PTX3 -/-, se realizó la fertilización in vitro (IVF) usando
esperma de tipo salvaje de machos adultos para inseminar ovocitos
PTX3 +/+ o PTX3 -/- (Tabla 2). La IVF se llevó a cabo primero con
ovocitos sin la zona pellucida y se tiñeron con el fluorocromo
específico de ADN Hoetch 33258 para observar la fusión. Bajo estas
condiciones, se observaron la unión de esperma normal a membrana de
plasma de ovocitos PTX3 -/- y la capacidad de fusión comparable de
ovocitos PTX3 +/+ o PTX3 -/- (68%) con esperma (tabla 2). Estos
resultados sugirieron que la unión y fusión de esperma - huevo se
puede producir en al ausencia de la PTX3. Los cúmulos intactos
recogidos 13 - 15 horas después del tratamiento con hCG se
inseminaron y se observaron la fertilización de ovocitos PTX3 -/-
progresión a la fase de dos células (Tabla 2). Estos datos confirman
que la calidad del ovocito es normal en ratones deficientes en la
PTX3. ya que los cúmulos oóforos juegan un papel crítico en para la
fertilización in vivo, pero no in vitro, estos
resultados sugieren que anormalidades en el cúmulo son la razón
fundamental de la infertilidad de hembras PTX3 -/-.
La expresión de ARNn de PTX3 en tejidos e ovario
se han investigado mediante transferencia de Northern e hibridación
in situ. Después de la superovulación inducida hormonalmente,
la expresión de ARNm de la PTX3 (determinada mediante transferencia
de Northern en tejido entero) comienza 2 horas después de
tratamiento con hCG y dura hasta 12 - 14 horas (véase la figura 2
A), correspondiente a la expansión preovuladora hasta unas pocas
horas después de la ovulación [20]. Las células de la granulosa
obtenidas mediante tratamiento con hialuronidasa de cúmulos oóforos
y la separación se ovocitos expresaba transcripciones de la
PTX3.
La expresión en condiciones normales en ausencia
de superovulación se investigó mediante hibridación in situ.
La hibridación in situ de órganos de hembras no tratadas
(figura 2 B) confirmó la expresión de ARNm de la PTX3 en el ovario,
confinada a células de la granulosa de folículos maduros, sin
evidencia de transcripción en ovocitos.
Después se analizó la expresión de la proteína
de la PTX3 en tejidos de ovarios. La transferencia de Western indicó
que la PTX3 estaba asociada a cúmulos de PTX3 +/+ (en particular con
matriz extracelular) debido a que el tratamiento con hialuronidasa,
que separa células de cúmulos de ovocitos, abolían la reactividad
inmune (Figura 2 C). El análisis de inmunofluoerescencia de cúmulos
oóforos PTX3 +/+ y -/- recogidos después de la superovulación
inducida hormonalmente (13 - 15 horas después de hCG) confirmó la
asociación de PTX3 con la matriz intracelular de cúmulos (Figura 2
D).
Estos datos sugieren que al esterilidad causada
por deficiencia en PTX3 se debe a una falta de fertilización de
ovocitos, ya que la deficiencia de la PTX3 no afecta a otras etapas
de la reproducción, a partir del apareamiento a ovulación, implante
y embarazo. Las transcripciones de la PTX3 se expresan en el ovario
normal exclusivamente por las células de la granulosa de folículos
maduros, así como mediante células de la granulosa separadas, pero
no por ovocitos. La expresión del ARNm de la PTX3 está inducida en
tejidos ováricos totales después de la superovulación inducida
hormonalmente. Por último, la proteína de la PTX3 se ha identificado
en la matriz extracelular aislada de cúmulos, presumiblemente
producidos por células de la granulosa. El análisis de ratones PTX3
-/- ha identificado un cúmulo oóforo anormal como determinante de
infertilidad. Los cúmulos oóforos de hembras PTX3 -/- mostraron
anormalidades morfológicas. Carecen de una corona radiata bien
definida y, tras el cultivo in vivo, rápidamente se
desprenden de los ovocitos. La "fragilidad" de los cúmulos
deficientes en PTX3 puede reflejar un papel estructural en esta
matriz peculiar o una alteración en los mecanismos reguladores de la
disolución de la matriz. Estos resultados identifican la PTX3 como
un constituyente novedoso de la matriz extracelular del cúmulo
oóforo, jugando un papel clave en la fertilidad. El cúmulo oóforo,
aunque no es esencial in vitro, juega un papel calve para la
fertilización in vivo. Por lo tanto, las anormalidades del
cúmulo oóforo están probablemente implicadas en al infertilidad de
ratones hembra PTX3 -/-.
Un fragmento de ADN genómico de 8,5 kb que
abarca exones 1 a 2 del gen de la PTX3 de ratón se usó para integrar
el módulo IRES - LacZ seguido del gen de resistencia a PGK -
neomicina del plásmido pWH9 en el exón 1 en la localización 71 pares
de bases cadena debajo de la primera ATG de codificación. Los
procedimientos para el cultivo, selección, e identificación de
células ES se realizaron como se he descrito [20]. Se identificaron
cinco clones de células R1 ES independientemente dirigidos mediante
hibridación de transferencia de Southern, usando la sonda A (el
fragmento de 750 pares de bases EcoRI/EcoRV en el segundo intrón).
No se detectó evidencia de integración a leatoria con al sonda B (a
partir del gen de resistencia a neomicina). Se inyectaron dos clones
de células ES en blastocistos C57BI/6. Para determinar el genotipo
de ratones, el DNA dericado de biopsias de cola se amplificó
mediante reacción en cadean de la polimerasa con dos conjuntos de
cebadores:
que detectó el alelo de tipo
salvaje o dirigido, respectivamente. El análisis fenotípico se
realizó sobre las dos líneas derivadas de clones independientes, y
los resultados se confirmaron en un fondo genético mixto
129Sv-C57BI/6 y procreado 129Sv. Los ratones PTX3
+/+ eran compañeros de camada de 129Sv-C57BI/6 PTX3
-/-, o ratones 129Sv o C57BI/6 obtenidos de Charles River, Calco,
Italia.
Los procedimientos que implican animales y su
cuidado se conforman con directrices institucionales en conformidad
con las políticas y leyes nacionales (4D.L N.116, GU., supl. 40, 18
- 2 - 1992) e internacionales (EEC Council Directive 86/609, OJL
358, 1. 12 - 12 - 1987; NIH Guide for the Care and Use of Laboratory
Animals, U. S. National Research Council, 1996). Todos los esfuerzos
se hicieron para minimizar el número de animales usados y su
sufrimiento.
Se extrajo ARN de células y se purificó usando
reactivo TRIZOL (GIBCO BRL). Las condiciones de transferencia de
Northern, marcado de sondas, e hibridación (unión y lavado) se
realizaron como se describe en [2].
Hibridación in situ: Secciones congelados
(13 \mum) recuperadas de ovarios PTX3 -/- y de tipo salvaje
fijadas con 4% de paraformaldehído y congeladas en nitrógeno líquido
se utilizaron para realizar la hibridación in situ tal y como
se ha descrito [22]. Las muestras se permeabilizaron brevemente con
proteinasa K y HCL 0,2 N, se incubaron a 65ºC durante toda una noche
con una ribosonda marcada radiactivamente preparada a partir de ADNc
de la PTX3 que contiene el vector (pBluesript) usando un kit de
transcripción de ARN de Stratagene. Posteriormente, se lavaron las
muestras con tampón que contiene formamida, se secaron al aire, se
sumergieron en emulsión fotográfica y se incubaron a 4ºC en una
cámara oscura durante al menos 10 días. Después del revelado, los
portaobjetos se tiñeron por contraste de fase con una solución de 2
\mug/ml de tinte Hoetchst 33258. Para el análisis de transferencia
de Western, extractos de células totales obtenidos de cúmulos
oóforos intactos, células de cúmulo, u ovocitos recogidos de hembras
superovuladas se separaron mediante electroforesis en gel SDS -
poliacrilamida (Page), electrotransfirieron en filtros de
nitrocelulosa (Hybond ECL, Amersham), y se marcaron con un suero de
hámster policlonal de PTX3 antimurino biotinilado (1 \mug/ml)
seguido de estreptavidina - HRP (BIOSPA, Italia). Las proteínas
marcadas se detectaron mediante quimioluminiscencia potenciada (ECL,
Amersham).
Cúmulos oóforos, cigotos, y embriones de
recuperaron del oviducto o útero de hembras no tratadas después del
apareamiento natural [20]. Se indujo superovulación mediante
tratamiento con 5 unidades de suero de yegua embarazada (PMS,
Folligon, Intervet) y con 5 unidades de gonadotropina coriónica
humana (hCG, Corulon, Intervet) 48 horas más tarde. Se recogieron
cúmulos oóforos en momentos diferentes después del apareamiento o 13
- 15 horas después de tratamiento con hCG. Se separaron células de
cúmulo y ovocitos mediante tratamiento con hialurodinasa [20].
La fertilización in vitro (IVF) de huevos
obtenida a partir de hembras superovuladas se realizó con cúmulos
oóforos intactos como se ha descrito [20] o con huevos sin zona
pellucida [20] teñidos con 1 \mug/ml de tinte Hoetchst en medio
M16 (Sigma) [23] y esperma de machos BDF. La fertilización y fusión
de esperma - huevo se determinó mediante conteo de embriones en fase
de dos células el día después de la inseminación de cúmulos oóforos
intactos y contando los huevos con esperma de fertilización
fluorescente 4 horas después de al inseminación de los huevos sin
zona pellucida.
La transferencia de embriones se realizó como se
ha descrito [20], usando blastocitos de PTX3 +/+ de 3,5 días
implantados en el útero de hembras de PTX3 -/- de 2,5 días.
1. Emsley et al., Structure of
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\vskip1.000000\baselineskip
Todas las modificaciones y sustituciones que
están dentro del significado de las reivindicaciones y el intervalo
de sus equivalentes legales están abarcados dentro de su alcance.
Una reivindicación que usa "comprendiendo" permite al inclusión
de otros elementos que están dentro del alcance de la
reivindicación; la invención también se describe mediante tales
reivindicaciones usando la frase de transición "constituido
esencialmente por" (es decir, permitiendo al inclusión de otros
elementos que están dentro del alcance de al reivindicación si no
afectan materialmente la operación de la invención) y la transición
"constituida por" (es decir, permitiendo solamente los
elementos enumerados en al reivindicación distinta de las impurezas
o actividades sin trascendencia que están asociadas de manera
ordinaria con la invención) en lugar del término
"comprendiendo". Cualquiera de las tres transiciones de pueden
usar para reivindicar la invención.
Se debe entender que un elemento descrito en
esta memoria descriptiva no se debe considerar como limitación de la
invención reivindicada salvo que se indique explícitamente en las
reivindicaciones. De este modo, las reivindicaciones son la base
para determinar el alcance de la protección legal garantizada en
lugar de una limitación de la memoria descriptiva que se lee en las
reivindicaciones.
En contradicción la técnica anterior se excluye
explícitamente de al invención hasta el grado de realizaciones
específicas que anticiparían la invención reivindicada o destruirían
la novedad. En ciertas realizaciones, el género de polinucleótidos o
polipéptidos se puede indicar en las reivindicaciones con la
condición de que los ácidos nucleicos p proteínas nativos se
excluyan (por ejemplo, teniendo una secuencia de nucleótidos o
aminoácidos que no se proporciona en el listado de secuencias). Por
ejemplo, la degeneración del código genético se puede usar para
proporcionar un polinucleótido que tiene una secuencia de
nucleótidos que codifica SEQ ID Nº 2, pero que no es la SEQ ID Nº 1.
De manera similar, un polipéptido de la PTX3 se puede proporcionar
que sea funcionalmente equivalente pero no idéntico a la proteína de
ratón y/o humana (por ejemplo, al menos 90% idéntica) cambiando uno
o más de los residuos de aminoácidos de la SEQ ID Nº 2.
Debe ser evidente para los expertos en al
técnica que al invención que la invención se debe realizar en otras
formas específicas sin salirse de su espíritu o características
esenciales. Las realizaciones descritas se deben considerar
solamente como ilustrativas, no restrictiva, debido a que el alcance
de la protección legal proporcionada por la invención será indicada
por las reivindicaciones anexas mejor que por esta memoria
descriptiva.
<110> Sigma-Tau Industrio
Farmaceutiche Riunito S.P.A.
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Pentaxina PTX3 larga y esterilidad
femenina
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<130>
012-ST-00-US
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<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
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<150> US 60/309,472
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-08-03
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1837
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Breviario et al
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Genes inducibles por interleuquina -
1 en células endoteliales
\vskip0.400000\baselineskip
<303> Journal of Biological Chemistry
\vskip0.400000\baselineskip
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1993-07-29
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 381
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> Péptido señal
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<222> (1)..(17)
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<223> Homo sapiens
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<221> MAT_PEPTIDE
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<222> (18)..(381)
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<300>
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<301> Breviario et al
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Genes inducibles por interleuquina –
1 en células endoteliales
\vskip0.400000\baselineskip
<303> Journal of Biological Chemistry
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<304> 267
\vskip0.400000\baselineskip
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1993-07-29
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<210> 3
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<211> 1841
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<212> ADN
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<213> Mus musculus
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<300>
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<301> Introna et al
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<302> Clonación de PTX3 de ratón
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<303> Sangre
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<304> 87
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<305> 5
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<306> 1862-1872
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1996-03-01
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<308> X83601
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1996-01-10
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 381
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
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<221> Péptido señal
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<222> (1)..(17)
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<223>
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<221> MAT_Péptido
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<222> (18)..(381)
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<300>
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<301> Introna et al
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<302> Clonación de PTX3 de ratón
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<303> Sangre
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<304> 87
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<305> 5
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1996-03-01
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1996-01-10
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 1531
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> Promotor
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<222> (1)..(1317)
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<223>
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<220>
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<221> Unión_Proteína
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<222> (12228)..(1231)
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<223> NF-KB
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<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Basile et al
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<302> Caracterización del promotor para la
pentaxina larga PTX3 humana
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<400> 5
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 6
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<211> 2708
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<212> ADN
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<213> Mus musculus
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1373)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
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<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Altmeyer et al
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Estructura del promotor y activación
transcripcional
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<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de aligonucleótido
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipagcaatgcac ctccctgcga t
\hfill21
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<210> 8
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de aligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctcggtgg gatgaagtcc a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de aligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgctcttta ctgaaggctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de aligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctcggtgg gatgaagtcc a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de consenso "de tipo
pentraxina"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_Característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_Característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cualquier aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_Característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ser o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_Característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Xaa Cys Xaa Xaa Trp Xaa Ser}
Claims (5)
1. Uso de la PTX3 humana recombinante para
preparar un medicamento para incrementar la capacidad reproductora
en un sujeto hembra con un defecto en la reproducción.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1,
en la que dicho sujeto es un paciente o un animal hembra.
3. Uso de acuerdo con las reivindicaciones
1 - 2 en el que el medicamento se va a administrar de manera
sistémica.
4. Uso de acuerdo con al reivindicación 1-
2 en el que el medicamento se va a administrar localmente.
5. Un procedimiento para la determinación
de la capacidad reproductora en una hembra humana que comprende la
detección de la presencia de la proteína de la PTX3 como marcador de
diagnóstico en fluidos o tejidos extraídos de dicho ser humano.
Applications Claiming Priority (2)
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