ES2784643T3 - Modelo de cerdo para la diabetes - Google Patents

Modelo de cerdo para la diabetes Download PDF

Info

Publication number
ES2784643T3
ES2784643T3 ES15770441T ES15770441T ES2784643T3 ES 2784643 T3 ES2784643 T3 ES 2784643T3 ES 15770441 T ES15770441 T ES 15770441T ES 15770441 T ES15770441 T ES 15770441T ES 2784643 T3 ES2784643 T3 ES 2784643T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
pig
seq
transgenic
transgenic pig
iapp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES15770441T
Other languages
English (en)
Inventor
Lars Bolund
Yonglun Luo
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aarhus Universitet
Original Assignee
Aarhus Universitet
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aarhus Universitet filed Critical Aarhus Universitet
Application granted granted Critical
Publication of ES2784643T3 publication Critical patent/ES2784643T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
    • C12N15/8778—Swine embryos
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/108—Swine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0362—Animal model for lipid/glucose metabolism, e.g. obesity, type-2 diabetes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

Un cerdo transgénico que comprende un gen de polipéptido amiloide de los islotes (IAPP) mutado humano o parte del mismo, y que muestra al menos un fenotipo asociado a la diabetes mellitus tipo 2.

Description

DESCRIPCIÓN
Modelo de cerdo para la diabetes
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un cerdo transgénico que comprende un gen de IAPP mutado humano y muestra un fenotipo asociado a la diabetes mellitus tipo 2. La invención también se refiere a un blastoquiste, un embrión, un feto, una célula donante y/o un núcleo celular transgénicos derivados de dicho cerdo transgénico. La invención se refiere además al uso del cerdo transgénico como un sistema modelo para el estudio de la terapia, el tratamiento y/o la prevención de la diabetes mellitus tipo 2.
Antecedentes de la invención
La diabetes es un grupo complejo de enfermedades con una variedad de causas. Las personas con diabetes tienen altos niveles de glucosa, a lo que también se conoce como altos niveles de azúcar en sangre o hiperglucemia. La diabetes es un trastorno del metabolismo que se desarrolla cuando el cuerpo no produce suficiente insulina o no es capaz de usar efectivamente la insulina, o ambos casos. La insulina se produce en el páncreas, un órgano situado detrás del estómago. El páncreas contiene grupos de células llamados islotes. Las células beta dentro de los islotes producen insulina, la cual se libera en la sangre.
La diabetes tipo 1 es causada por una falta de insulina debido a la destrucción de células productoras de insulina en el páncreas. En la diabetes tipo 1, una enfermedad autoinmune, el sistema inmunitario del cuerpo ataca y destruye las células beta. Normalmente, el sistema inmunitario protege al cuerpo de las infecciones mediante la identificación y la destrucción de bacterias, virus y otras sustancias extrañas potencialmente dañinas. Sin embargo, en las enfermedades autoinmunes, el sistema inmunitario ataca a las células propias del cuerpo. En la diabetes tipo 1, la destrucción de las células beta puede tener lugar durante varios años, pero los síntomas de la enfermedad suelen desarrollarse en un período corto de tiempo.
La diabetes mellitus tipo 2 (DM2) es un trastorno complejo y heterogéneo que involucra muchos factores de riesgo fisiológicos y factores de susceptibilidad genética. Desde hace tiempo, se ha observado que los seres humanos, los primates no humanos y los gatos son susceptibles al desarrollo espontáneo de DM2, caracterizada por depósitos amiloides de los islotes, mientras que la DM2 espontánea es rara en roedores y cerdos. Una hipótesis es que la formación de amiloides de los islotes del polipéptido amiloide de los islotes (IAPP) es un factor patógeno para la degeneración y la apoptosis de las células p, lo que provoca gradualmente DM2 (Matveyenko y Butler, 2006, ILAR J 47(3): 225-33). El principal componente amiloide de los islotes está formado por fibrillas del IAPP, un polipéptido monomérico de 37 aminoácidos sintetizado por las células p pancreáticas. Los residuos 20 a 29 del IAPP son la región más crítica para las propiedades amiloidogénicas (Westermark y col., 1990, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 87(13).: 5036­ 40). En los seres humanos, los monos y los gatos, el IAPP es propenso a formar agregados amiloides tóxicos, mientras que el IAPP de los roedores y los cerdos es más refractario a la formación de amiloides (Zhang y col., 2011, FEBS Lett 585(1): 71-7). Además, se ha hallado que una variante susceptibilidad del gen del IAPP humano (S20G) se asocia a la aparición temprana de la diabetes tipo 2 (DM2) en poblaciones asiáticas (Morita y col., 2011).
Los modelos animales, tales como los de roedores, conejos, perros, gatos, cerdos y primates, han sido ampliamente usados en la investigación de la DM2, en la investigación de la patogénesis de la enfermedad y la prueba de prevenciones y terapias. Con los avances en las tecnologías transgénicas, se han generado muchos ratones recombinantes completos y ratones recombinantes condicionales para la investigación de la diabetes. Recientemente, se han generado ratas recombinantes para el gen con nucleasas Zinc-Finger (ZFNs) para la investigación de la diabetes (Geurts y col., 2009, Science 325(5939): 433). Sin embargo, los roedores son todavía considerados como inadecuados para reflejar la patogénesis de la DM2 en los seres humanos. Por consiguiente, la mayoría de las investigaciones clínicas y traslacionales, incluyendo las pruebas de estrategias de prevención y fármacos, requiere de grandes modelos animales, tales como los de cerdos.
Se han creado varios modelos de ratón que expresan el IAPP humano (hIAPP) para estudiar la patogénesis de la DM2 asociada al IAPP. Estos ratones transgénicos hIAPP fueron generados mediante el direccionamiento del IAPP a las células p pancreáticas usando el promotor de insulina de rata 2 (RIP2) (Couce y col., 1996, Diabetes 45(8): 1094-101; Janson y col., 1996, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 93(14): 7283-8). La DM2 de aparición espontánea se observó en ratones homocigotos de hIAPP. Sin embargo, los ratones hemicigotos de hIAPP no desarrollan diabetes, a menos que tengan antecedentes de obesidad o sean tratados con la hormona de crecimiento. En los ratones de hIAPP diabéticos, se observaron varios fenotipos patológicos de los islotes, como los depósitos amiloides intra y extracelulares, el aumento de la apoptosis de células p y la disminución de la masa de células p. En base a los estudios de modelos de ratón de hIAPP, se sugiere que la expresión de hIAPP dependiente de la dosis es un factor crítico para la toxicidad de las células p y la patogénesis de la DM2 (Matveyenko y Butler, 2006, ILAR J 47(3): 225-33). Adicionalmente, un estudio realizado por Hiddinga y col. halló que la expresión fisiológica de hIAPPWT y hIAPPS20G en ratones C57BI/6 produce intolerancia leve a la glucosa con una secreción inadecuadamente normal de insulina (Hiddinga y col., 2012, Journal of Diabetes Investigation 3(2): 138-147).
Se generó un modelo de ratas transgénicas para el IAPP humano (ratas de HIP) para el estudio de la patogénesis de la DM2 asociada a la formación de amiloides de los islotes (Butler y col., 2004, Diabetes 53(6): 1509-16). De manera similar a los ratones de hIAPP, el procedimiento patogénico dependía de la dosis de la expresión de hIAPP y la rata de HIP homocigota desarrolló diabetes entre los 5 y los 10 meses de edad, mostrando amiloides de los islotes y un déficit de aproximadamente el 60% en la masa de células p. Por consiguiente, tanto el modelo de ratones como el de ratas de hIAPP diabéticas desarrolló la patología de islote relacionada con aquella que se observa en los seres humanos. Sin embargo, los modelos de hIAPP de roedores no pueden abordar plenamente el procedimiento patogénico de la DM2 asociada a la formación de amiloides de los islotes por la agregación de IAPP. Aunque se informó que la patología de IAPP induce la resistencia a la insulina, esta última resistencia no se observó en los modelos de IAPP de roedores.
Una debilidad principal de los modelos de IAPP de ratón o rata es que estos modelos animales todavía expresan su propio gen de IAPP. Estudios anteriores han demostrado que la presencia de ningún agregado de péptido de IAPP (por ejemplo, el péptido IAPP porcino) puede retrasar/impedir la formación de amiloides. Esto sugiere que la discrepancia de los fenotipos diabéticos observados en los modelos de IAPP de roedores anteriores pueden deberse a efectos compensatorios y/o de antiagregación del IAPP endógeno. Por consiguiente, los nuevos modelos animales generados por la sustitución dirigida del gen de IAPP endógeno (desactivado) con forma amiloidogénica de hIAPP (activado) deben representar un mejor modelo para estudiar el rol del IAPP en la patología de los islotes de los pacientes con DM2.
Los cerdos han sido favorecidos como un modelo animal para la DM2 debido a las similitudes anatómicas y fisiológicas del páncreas y los islotes de cerdo y de seres humanos. Se han generado varios modelos de cerdo de diabetes inducida químicamente mediante la administración de estreptozotocina. Lo más importante es que la generación de cerdos transgénicos (GM) para la investigación de la diabetes ahora se ha hecho posible por medio de la clonación en función de la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT). El primer modelo de cerdo GM para la DM2 era un cerdo transgénico que expresaba una forma mutante dominante y negativa del receptor del polipéptido insulinotrópico dependiente de la glucosa (GIP; GIPRdn) en las células pancreáticas. El mismo se generó en el laboratorio de Eckhard Wolf en Munich (Renner y col., 2010, Diabetes 59(5): 1228-38 y EP2077330). De manera similar a los ratones GIPRdn, los cerdos GIPRdn exhibieron una reducción de la tolerancia a la glucosa oral significativa y una reducción en la proliferación de células p a la edad de 11 semanas. En los cerdos GIPRdn, con el aumento de la edad, se observó el deterioro del control de la glucosa y la reducción de la masa de células p (Renner y col., 2010, Diabetes 59(5): 1228-38). Otro modelo de cerdo GM de diabetes exitoso fue el de un cerdo transgénico que expresaba un gen mutante del factor 1a nuclear de hepatocitos dominante y negativo (HNF1AP291fsinsC). Los cerdos HNF1AP291fsinsC desarrollaron diabetes a la edad de 20 a 196 días, caracterizada por un nivel de glucosa en sangre no en ayunas superior a los 200 mg/dl, así como también islotes Langerhans pequeños y formados de manera irregular (Umeyama y col., 2009, Transgenic Res 18(5): 697-706 y US2009271882). El modelado exitoso de la diabetes humana en los cerdos GIPRdn y HNF1AP291fsinsC ha proporcionado una prueba de concepto para el desarrollo futuro de otros modelos de cerdos GM para la enfermedad humana.
Resumen de la invención
Un objeto principal de la presente invención es proporcionar un modelo animal que se pueda usar para el estudio de la diabetes mellitus tipo 2. El modelo animal presentado en esta invención es un cerdo transgénico que tiene un gen de polipéptido amiloide de los islotes (IAPP) mutado humado.
En un aspecto, la presente descripción se refiere a un cerdo transgénico que comprende un gen de polipéptido amiloide de los islotes (IAPP) mutado, o parte del mismo, y que presenta al menos un fenotipo asociado a la diabetes.
En una realización preferida, el gen de IAPP mutado es un gen de IAPP mutado humano o parte del mismo. En una realización particular de la misma, dicho gen de IAPP mutado humano, dicho gen de IAPP mutado comprende una mutación que resulta en la sustitución de aminoácidos S20G.
Se prefiere que el cerdo transgénico, como se describe en esta invención, no exprese un gen de IAPP de cerdo. En particular, se prefiere que el cerdo transgénico no exprese un gen de IAPP de cerdo endógeno. Más específicamente, se prefiere que dicho gen de IAPP de cerdo endógeno haya sido eliminado.
El cerdo transgénico de la presente invención puede ser cualquier cerdo. En una realización preferida de la presente invención, el cerdo transgénico es un mini cerdo. En otra realización, el cerdo transgénico es un cerdo endogámico. El cerdo transgénico proporcionado por la presente invención presenta al menos un fenotipo asociado a, o relacionado con, la diabetes mellitus tipo 2. Se prefiere que el cerdo transgénico muestre niveles de glucosa más altos, niveles de glucagón más altos, niveles de insulina más bajos y/o niveles de péptido C más bajos, en comparación con un cerdo de control. Se prefiere que dicho cerdo de control no comprenda un gen de IAPP mutado.
En una realización, dicho nivel de glucosa aumenta en al menos un 10%, en comparación con un cerdo de control, donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal. En otra realización, dicho nivel de glucagón aumenta en al menos un 10%, en comparación con un cerdo de control, y donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal. En incluso otra realización, dicho nivel de insulina disminuye en al menos un 10%, en comparación con un cerdo de control, y donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal. En una realización adicional, dicho nivel de péptido C disminuye en al menos un 10%, en comparación con un cerdo de control, y donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal.
Se prefiere que el cerdo transgénico, como se describe en esta invención, muestre hiperglucemia. Por consiguiente, en una realización, el menos un fenotipo es la hiperglucemia. En otra realización, el cerdo transgénico muestra una degeneración de células p. Por consiguiente, en otra realización, el menos un fenotipo es la degeneración de células p.
En una realización, el cerdo transgénico, como se describe en esta invención, muestra un fenotipo seleccionado de entre el grupo que consiste en ceguera, inflamación, infección y deformación de órganos. Por consiguiente, en una realización adicional, dicho al menos un fenotipo se selecciona de entre el grupo que consiste en ceguera, inflamación, infección y deformación de órganos.
La presente invención también se refiere a un blastoquiste, un embrión, un feto una célula donante y/o núcleos celulares transgénicos que derivan de un cerdo transgénico según la presente invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para producir el cerdo transgénico, como se describe en esta invención, comprendiendo dicho procedimiento:
i. producir un ovocito que tiene una zona pelúcida parcialmente modificada,
ii. separar el ovocito en al menos dos partes, obteniendo un ovocito que tiene un núcleo y al menos un citoplasto, iii. producir una célula donante que comprende un gen de IAPP mutado o parte del mismo,
iv. fusionar al menos un citoplasto con la célula donante o el núcleo celular rodeado de membrana,
v. obtener un embrión reconstruido,
vi. activar el embrión reconstruido para formar un embrión, cultivar dicho embrión y
vii. transferir dicho embrión cultivado a un mamífero huésped,
donde el embrión se desarrolla en un cerdo transgénico.
Se aprecia que dicho procedimiento no involucra una etapa quirúrgica. En una realización preferida, la célula donante comprende un gen de IAPP mutado, en el que el gen de IAPP mutado es un gen de IAPP mutado humano. En particular, dicho gen de IAPP mutado comprende una mutación S20G. Adicionalmente se prefiere que la célula donante no exprese n gen de IAPP de cerdo endógeno. En una realización específica, el gen de IAPP de cerdo endógeno ha sido eliminado.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de un cerdo transgénico como un sistema modelo para estudiar la terapia, el tratamiento y/o la prevención de la diabetes mellitus tipo 2.
Los cerdos también se pueden usar para identificar compuestos adecuados para la terapia, el tratamiento y/o la prevención de la diabetes. Dicho procedimiento preferentemente comprende las siguientes etapas
(i) proporcionar un cerdo transgénico según la presente invención,
(ii) proporcionar un compuesto a probar,
(iii) administrar dicho compuesto a dicho cerdo transgénico,
(iv) determinar el nivel de insulina, el nivel de glucosa y/o el nivel de glucagón de dicho cerdo transgénico, determinando así el efecto de dicho compuesto en el nivel de insulina, el nivel de glucosa, el nivel de glucagón y/o el nivel de péptido C de dicho cerdo transgénico.
También se proporciona un procedimiento para el estudio de la terapia, el tratamiento y/o la prevención de la diabetes mediante la aplicación del cerdo transgénico según la presente descripción.
En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para el estudio de la terapia, el tratamiento y/o la prevención de la diabetes que comprende las etapas de
i. proporcionar un cerdo transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16,
ii. proporcionar un compuesto a probar,
iii. administrar dicho compuesto a dicho cerdo transgénico,
iv. determinar los factores de riesgo asociados a la diabetes, como el nivel de insulina, el nivel de glucosa y/o el nivel de glucagón de dicho cerdo transgénico,
determinando así el efecto de dicho compuesto en el nivel de insulina, el nivel de glucosa, el nivel de glucagón y/o el nivel de péptido C de dicho cerdo transgénico.
Descripción de los dibujos
Figura 1. Representación esquemática de la construcción de desactivación de pIAPP/activación de hIAPP (pIAPPKO;hIAPPKI). RIP: promotor de insulina de rata; PGK: promotor de fosfoglicerato quinasa I; Neo: fabricante de resistencia a la neomicina; EGFP: proteína fluorescente verde potenciada; pA: señal de poli A; HR: recombinación homóloga.
Figura 2. Generación y validación de las TALEN de plAPP. (A) Ilustración de los dos pares de TALEN de pIAPP. Las secuencias resaltadas en azul son sitios diana de TALEN. (B) Ensayo basado en T7E1 de la eficiencia de escisión mediado por TALEN. El primer par de TALEN (TALEN1) tiene la más alta eficiencia, de alrededor del 5%, y fue seleccionado para el direccionamiento del gen.
Figura 3. Generación de cerdos HIP mediante HMC (clonación manual). (A) Se llevaron a cabo tres transferencias de HMC. Se obtuvo un total de cinco cerdos HIP (3 nacidos muertos y 2 nacidos vivos) de un total de 233 embriones. (b) Foto de los cerdos HIP 609 y 610. (c) Peso de nacimiento de los cerdos HIP. (d) Tasa de crecimiento de HIP 609 y HIP 610. (e y f) Genotipado de los cerdos HIP mediante PCR y transferencia de Southern. Los cebadores y las sondas de transferencia de Southern se indican en la figura ilustrada. Se halló que e1HIP 609 estaba desactivado en un alelo y activado con el IAPP humano en el otro alelo.
Figura 4. Curso de tiempo de las mediciones de glucosa en sangre total y el peso corporal en algunos cerdos HIP. (A) Medición de glucosa en sangre total durante tres meses. (B) Medición del peso corporal para los tres primeros meses. (C) Medición de glucosa en sangre en ayunas y no en ayunas en cerdos HIP de 44 días de edad. Se detectó glucosa en las muestras de orina de dos cerdos HIP (HIP 543 y HIP 544).
Figura 5. Caracterización de los cerdos HIP. Se recolectaron muestras de plasma de 8 a 9 cerdos HIP y 8 cerdos de control de tipo salvaje sin un gen de IAPP mutado a la edad de 1,2 y 3 meses. Se determinaron los niveles de glucosa, fructosamina (FRA), glucagón, insulina y péptido C. (A) El nivel promedio de glucosa aumenta en los cerdos HIP a la edad de 1,2 y 3 meses, en comparación con los cerdos de control. (B) El nivel promedio de fructosamina aumenta en los cerdos HIP a los 3 meses, en comparación con los cerdos de control. (C) El nivel promedio de glucagón aumenta en los cerdos HIP, en comparación con los cerdos de control. (D) El nivel promedio de insulina disminuye en los cerdos HIP, en comparación con los cerdos de control. (E) El nivel promedio de péptido C disminuye en los cerdos HIP, en comparación con los cerdos de control. El nivel promedio de péptido C, en la mayoría de los cerdos HIP fue demasiado bajo como para ser medido desde la edad de 2 meses. Para la ilustración, estos resultados se representaron por debajo del nivel cero.
Figura 6. La modificación HIP suprime el nivel de hormona del péptido en el plasma. Curso de los niveles de glucosa en el plasma (a), fructosamina (b), glucagón (c), insulina (d) y péptido C (e) a partir de la edad de 1 mes hasta la edad de 9 meses. Para el estudio del curso del tiempo, se usaron ocho cerdos HIP (cuadro negro) y ocho cerdos de control de la misma edad (cuadro blanco). Los cerdos HIP elegibles para cada punto de tiempo fueron los cerdos 7, 8, 8, 6, 5 y 5 para la edad de 1, 2, 3, 5, 7 y 9 meses, respectivamente. Los asteriscos representan un valor estadísticamente significativo (p < 0,05, ANOVA) entre el cerdo HIP y el control, en el punto de tiempo correspondiente.
Descripción detallada de la invención
Está dentro del alcance de la presente invención proporcionar un modelo animal que pueda usarse para el estudio de la diabetes mellitus tipo 2. El modelo animal presentado en esta invención es un cerdo transgénico que tiene un gen de IAPP mutado humano. Estos cerdos transgénicos muestran fenotipos que se asemejan a los fenotipos observados en la diabetes humana. Los cerdos transgénicos que tienen un gen de IAPP mutado humano como se presenta en esta invención, por lo tanto, representan un modelo animal ideal para el estudio de diabetes mellitus tipo 2 humana.
Por consiguiente, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un cerdo transgénico que comprende un gen de polipéptido amiloide de los islotes (IAPP) mutado humano, o parte del mismo, y que muestra al menos un fenotipo asociado a la diabetes mellitus tipo 2.
El término "cerdo transgénico", como se usa en esta invención, se refiere a un cerdo que comprende un gen extraño o una secuencia genética modificada. Este gen puede estar presente en un plásmido. Sin embargo, se prefiere que el gen extraño esté insertado en el genoma del cerdo. También se prefiere que el gen se exprese, es decir, que el cerdo exprese la proteína codificada por el gen extraño. En la presente invención, el gen extraño o modificado sea un gen de IAPP mutado.
Se apreciará que la invención no comprende los procedimientos de modificación de la identidad genética de los cerdos de una manera, la cual probablemente cause sufrimiento a los animales sin ningún beneficio médico para el hombre o el animal, o animales, como resultado de dichos procedimientos.
Los procedimientos para producir el cerdo transgénico descritos en esta invención no necesitan abarcar una etapa quirúrgica efectuada en el cerdo.
El gen de IAPP
El cerdo transgénico de la presente descripción comprende un gen de polipéptido amiloide de los islotes (IAPP) mutado. El polipéptido amiloide de los islotes, también llamado amilina, es producido por las células p pancreáticas y es secretado en paralelo con insulina. En humanos, el polipéptido amiloide de los islotes es secretado conjuntamente con insulina desde las células p del páncreas en la relación de aproximadamente 100:1. Por ejemplo, en humanos, monos y gatos, el IAPP tiene una tendencia a agregarse y formar agregados amiloides tóxicos. La agregación parece ser tóxica, por ejemplo, llevando a la degeneración de las células p y la diabetes. El IAPP de roedores y cerdos, por ejemplo, es más refractario a la formación de agregados amiloides. Por consiguiente, en una realización preferida, el gen de polipéptido amiloide de los islotes (IAPP) mutado es de un organismo donde el gen de IAPP tiene una tendencia a formar agregados amiloides.
En la presente invención, el gen de IAPP mutado es un gen de IAPP mutado humano o parte del mismo. El gen de IAPP humano (SEQ ID NO:1) codifica una proteína de residuos de 89 aminoácidos (SEQ ID NO:4), que consiste en un péptido señal de 22 aminoácidos y un propéptido de 67 aminoácidos también conocido como proIAPP, proamilina o proteína de proislote (SEQ ID NO:5). Cuando se libera de los péptidos señal, la proamilina sufre modificaciones postraslacionales, incluyendo la escisión de la proteasa para producir la amilina biológicamente activa que consiste en 37 aminoácidos (SEQ ID NO:6).
La secuencia de nucleótidos del gen de IAPP humano de tipo salvaje que codifica el 89 amino péptido residuos de ácido tiene SEQ ID NO:1.
Por lo tanto, en una realización, el cerdo transgénico de la presente invención comprende un gen de IAPP mutado humano que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1, tal como, por ejemplo, al menos el 75% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1, tal como al menos el 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1, tal como, por ejemplo, al menos el 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1, tal como al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1, tal como al menos el 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1, tal como, por ejemplo, al menos el 97% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1 o tal como al menos el 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1 o parte del mismo.
La secuencia de nucleótidos del gen de IAPP de tipo salvaje humano que codifica la proteína de proamilina de 67 aminoácidos tiene la SEQ ID NO:2.
Por consiguiente, el cerdo transgénico de la presente invención comprende un gen de IAPP mutado humano que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2, tal como, por ejemplo, al menos el 75% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2, tal como al menos el 80% de secuencia de identidad con la SEQ ID NO:2, tal como, por ejemplo, al menos el 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2, como al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2, como al menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2, tal como, por ejemplo, al menos el 97% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2 o tal como al menos el 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2 o parte del mismo.
La secuencia de nucleótidos del gen de IAPP de tipo salvaje humano que codifica la proteína de amilina de 37 aminoácidos tiene la SEQ ID NO:3.
Por consiguiente, en otra realización, el cerdo transgénico de la presente invención comprende un gen de IAPP mutado humano que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia de la SEQ ID NO:3, tal como, por ejemplo, al menos el 75% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3, tal como al menos el 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3, tal como, por ejemplo, al menos el 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3, tal como al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3, tal como al menos el 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3, tal como, por ejemplo, al menos el 97% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3 o tal como al menos el 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3 o parte del mismo.
El cerdo transgénico de la presente invención puede comprender un gen de IAPP mutado humano que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1, la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:3, tal como, por ejemplo, al menos el 75% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1, la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:3, tal como al menos el 80% de secuencia de identidad con la SEQ ID NO:1, la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:3, tal como, por ejemplo, al menos el 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:3, tal como al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1, la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:3, tal como al menos el 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1, la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:3, tal como, por ejemplo, al menos el 97% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1, la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:3, o tal como al menos el 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1, la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:3 o parte del mismo.
El gen de IAPP mutado puede comprender una o más mutaciones. El gen de IAPP comprende al menos una mutación. En una realización preferida, el gen de IAPP comprende una mutación. En otra realización, el gen de IAPP comprende dos mutaciones. El gen de IAPP también puede comprender 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mutaciones.
La mutación puede ser cualquier tipo de mutación. En una realización, la al menos una mutación es una deleción de uno o más nucleótidos, tales como, por ejemplo, al menos 1 nucleótido, tal como al menos 2 nucleótidos, al menos 3 nucleótidos, tal como, por ejemplo, al menos 4 nucleótidos, tal como al menos 5 nucleótidos, al menos 6 nucleótidos, tales como, por ejemplo, al menos 7 nucleótidos, tal como al menos 8 nucleótidos, al menos 9 nucleótidos, tal como, por ejemplo, al menos 10 nucleótidos, tales como al menos 11 nucleótidos, al menos 12 nucleótidos, tal como, por ejemplo, al menos 13 nucleótidos, tal como al menos 14 nucleótidos, al menos 15 nucleótidos o tal como, por ejemplo, al menos 20 nucleótidos.
En otra realización, la al menos una mutación es una inserción de uno o más nucleótidos, tal como, por ejemplo, al menos 1 nucleótido, tal como al menos 2 nucleótidos, al menos 3 nucleótidos, tal como, por ejemplo, al menos 4 nucleótidos, tal como al menos 5 nucleótidos, al menos 6 nucleótidos, tal como, por ejemplo, al menos 7 nucleótidos, tal como al menos 8 nucleótidos, al menos 9 nucleótidos, tal como, por ejemplo, al menos 10 nucleótidos, tal como al menos 11 nucleótidos, al menos 12 nucleótidos, tal como, por ejemplo, al menos 13 nucleótidos, tal como al menos 14 nucleótidos, al menos 15 nucleótidos o tal como, por ejemplo, al menos 20 nucleótidos.
En una realización preferida, la al menos una mutación es una mutación puntual. En una mutación puntual, un único nucleótido se intercambia por otro. La mutación puntual puede ser una mutación A>G, una mutación A>C, una mutación A>T, una mutación T>G, una mutación T>C, una mutación T>A, una mutación G>T, una mutación G>C, una mutación G>A, una mutación C>G, una mutación C>T o una mutación C>A. Una mutación A>G significa que la adenina es sustituida por guanina. En una realización más preferida, la mutación puntual es una mutación sin sentido en el que se cambia un solo nucleótido, dando como resultado un codón que codifica para un aminoácido diferente. Por consiguiente, en una realización preferida, el polinucleótido aislado según la presente invención comprende al menos una mutación que da como resultado una sustitución de aminoácidos.
En una realización particular, el polinucleótido aislado según la presente invención comprende una mutación que da como resultado la sustitución de aminoácidos S20G. La S20G significa que la serina en la posición de aminoácido 20 de la SEQ ID NO: 9 (amilina activa) ha sido sustituido con glicina. En la SEQ ID NO:8 el residuo de serina correspondiente se encuentra en la posición de aminoácido 30, mientras que en la SEQ ID NO:7 el residuo de serina correspondiente se encuentra en la posición de aminoácido 51.
Por consiguiente, en una realización preferida, el cerdo transgénico comprende un gen de IAPP mutado humano que comprende una mutación que da como resultado la sustitución de aminoácidos S20G, donde la serina en la posición de aminoácido 20 de la proteína de amilina de 37 aminoácidos es sustituida por glicina. El codón 157AGC posicionado en los nucleótidos 157 a 159 de la SEQ ID NO:1, el codón 91AGC posicionado en los nucleótidos 91 a 93 de la SEQ ID NO:2 y el codón 58AGC posicionado en los nucleótidos 58 a 60 de la SEQ ID NO:3 codifican dicha serina.
Los codones de glicina son GGT, GGC, GGA o GGG. Por consiguiente, se prefiere que el codón AGC que codifica la serina 20 de la amilina de tipo salvaje humana se sustituya por GGT, GGC, GGA o GGG.
En una realización preferida, el gen de IAPP mutado humano comprende la mutación A157G donde la adenina en la posición 157 de la SEQ ID NO:1 se sustituye por guanina. La secuencia que comprende la mutación A157AG es la SEQ ID NO: 4.
Por consiguiente, el cerdo transgénico de la presente invención comprende un gen de IAPP mutado humano que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, tal como, por ejemplo, al menos el 75% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, tal como al menos el 80% de secuencia de identidad con la SEQ ID NO:4, tal como, por ejemplo, al menos el 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, como al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, como al menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, tal como, por ejemplo, al menos el 97% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4 o tal como al menos el 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4 o parte del mismo.
En la realización preferida, el gen de IAPP mutado humano comprende la mutación A91G donde la adenina en la posición 91 de la SEQ ID NO:1 es sustituida por guanina. La secuencia que comprende la mutación A91G es la SEQ ID NO: 5.
Por consiguiente, el cerdo transgénico de la presente invención comprende un gen de IAPP mutado humano que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5, tal como, por ejemplo, al menos el 75% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5, tal como al menos el 80% de secuencia de identidad con la SEQ ID NO:5, tal como, por ejemplo, al menos el 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5, como al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5, como al menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5, tal como, por ejemplo, al menos el 97% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5 o tal como al menos el 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5 o parte del mismo.
En una realización preferida, el gen de IAPP mutado humano comprende la mutación 58A>G donde la adenina en la posición 58 de la sEq ID NO:1 se sustituye por guanina. La secuencia que comprende la mutación 58A>G es la SEQ ID NO: 6.
Por consiguiente, el cerdo transgénico de la presente invención comprende un gen de IAPP mutado humano que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6, tal como, por ejemplo, al menos el 75% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6, tal como al menos el 80% de secuencia de identidad con la SEQ ID NO:6, tal como, por ejemplo, al menos el 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6, como al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6, como al menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6, tal como, por ejemplo, al menos el 97% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6 o tal como al menos el 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6 o parte del mismo.
En una realización, el cerdo transgénico de la presente invención comprende un gen de IAPP mutado humano que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia de la SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:6, tal como, por ejemplo, al menos el 75% de identidad de secuencia de la SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:6, tal como al menos el 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:6, tal como, por ejemplo, al menos el 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:6, tal como al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:6, tal como al menos el 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:6, tal como, por ejemplo, al menos el 97% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:6 o tal como al menos el 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:6 o parte del mismo.
Se prefiere que el cerdo transgénico exprese un gen de IAPP mutado humano. Por consiguiente, se prefiere que el cerdo transgénico exprese la proteína codificada por el gen de IAPP mutado humano.
La proteína humana prolAPP y el péptido señal codificados por la SEQ ID NO:1 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7, la proteína humana proIAPP codificada por la SEQ ID NO:2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ IDE NO: 8 y la amilina de la proteína IAPP humana codificada por la SEQ ID NO:3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9.
Por consiguiente, en una realización preferida, el cerdo transgénico, como se describe en esta invención expresa una proteína mutada de IAPP mutada que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7, la SEQ Id NO: 8 o la SEQ ID NO: 9 tal como al menos el 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9, tal como, por ejemplo, al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9, tal como al menos el 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9, tal como al menos el 97% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9, tal como, por ejemplo, al menos el 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9 o tal como al menos el 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9 o parte del mismo.
El péptido de señal y la proteína mutada de IAPP humana que comprende la mutación S20G como se describió anteriormente tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:10, la proteína mutada prolAPP humana que comprende la mutación S20G tiene la SEQ ID NO:11, mientras que la proteína mutada de amilina humana que comprende la mutación S20G tiene la SEQ ID NO:11.
Por consiguiente, en una realización preferida, el cerdo transgénico, como se describió en esta invención expresa la proteína mutada de IAPP humana que tiene una mutación S20G y tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID No: 11 o la SEQ ID NO: 12 tal como al menos el 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12, tal como, por ejemplo, al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12, tal como al menos el 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12, tal como al menos el 97% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12, tal como, por ejemplo, al menos el 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12 o como al menos el 99% de la identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12 o parte del mismo.
En una realización específica, el cerdo transgénico expresa la proteína de IAPP humana que comprende la S20G y tiene la SEQ ID NO:10, la SEQ ID NO:11 y/o la SEQ ID NO:12.
En una realización de la presente invención, el cerdo transgénico no expresa un polipéptido amiloide de los islotes de cerdo funcional. El cerdo transgénico puede comprender, por ejemplo, una o más mutaciones en el gen de IAPP endógeno que llevan a la expresión de una proteína disfuncional. El término "endógeno" se usa en esta invención para especificar un gen particular presente de forma natural en el genoma de una célula diana particular (por ejemplo, células de un cerdo). En una realización, el gen de IAPP de cerdo endógeno comprende una o más mutaciones que inhiben o suprimen la expresión del gen. En una realización preferida, el cerdo transgénico no expresa un gen de IAPP de cerdo. En otra realización preferida, el cerdo transgénico no expresa un gen de IAPP de cerdo endógeno. En una realización específica, el gen de IAPP de cerdo endógeno ha sido inactivado.
El gen de IAPP mutado humano puede insertarse en el genoma porcino usando técnicas de clonación tradicionales conocidas por el experto en la materia. En una realización, el gen de IAPP mutado puede dirigirse a una región específica en el genoma porcino mediante la recombinación homóloga de una construcción de direccionamiento. En una realización preferida, se usa una estrategia de activación en la que el gen de IAPP mutado se inserta en el genoma del cerdo.
La recombinación homóloga ocurre entre dos moléculas de ADN homólogas. También se le llama cruce de ADN. Mediante la recombinación homóloga, un segmento de ADN puede sustituir a otro segmento de ADN con una secuencia similar. El procedimiento involucra la ruptura y la reunión de las regiones homólogas de ADN, lo cual es mediado por enzimas especializadas tales como, por ejemplo, las recombinasas específicas de sitio. La técnica permite sustituir un alelo con una construcción de ingeniería sin afectar cualquier otro locus en el genoma. Usando la recombinación homóloga, es posible dirigir la inserción de un transgén a un locus conocido específico del genoma de la célula huésped. Conociendo la secuencia de ADN del locus diana, es posible sustituir cualquier gen con una construcción de ADN transgénico, sustituyendo o eliminando así la secuencia diana. Usando este procedimiento, un gen puede ser eliminado y sustituido por otro gen, el cual se activa a continuación. Este procedimiento se conoce como "activación genética", que permite el direccionamiento específico de genes aprovechando la recombinación homóloga.
En una realización preferida de la presente invención, el gen de IAPP de cerdo endógeno ha sido desactivado. Por lo tanto, una realización específica de la presente invención se refiere a un cerdo transgénico que comprende un gen de IAPP mutado humano que ha sido activado y donde el gen de IAPP endógeno ha sido desactivado. En particular, se prefiere que el gen de IAPP endógeno sea sustituido por el gen de IAPP mutado humano (véase la Figura 1).
En una realización, un vector o una construcción de direccionamiento de ADN que comprende sitios de reconocimiento de nucleasas de efector de tipo activador de la transcripción (TALEN) se usa para la desactivación y la activación del gen (Proc Natl Acad Sci EE.UU. 23 de octubre de 2012;109(43):17382-7). Esto se ejemplifica en el Ejemplo 1 que demuestra el uso de un vector de plAPP-TALEN (SEQ ID NO:13) para la desactivación del gen de IAPP de cerdo y la activación del gen e IAPP humano.
En algunas realizaciones, sólo una modificación genética se introduce en el genoma. En otras realizaciones, sin embargo, el genoma puede modificarse en más de un sitio. Por ejemplo, el cerdo transgénico puede comprender un gen de IAPP mutado en combinación con otra mutación de genes relacionados con la diabetes. Por ejemplo, las mutaciones en el receptor de polipéptido insulinotrópico dependiente de la glucosa (GIP) y las mutaciones en el gen muíante del factor 1a nuclear de hepatocitos (HNF1AP291fsinsC) son conocidas por estar asociadas a la diabetes. Por lo tanto, en una realización, el cerdo transgénico comprende un gen de IAPP mutado y un gen mutado del receptor GIP. En otra realización, el cerdo transgénico comprende un gen de IAPP mutado y un gen mutado del factor 1a nuclear de hepatocitos. En incluso otra realización, el cerdo transgénico comprende un gen de IAPP mutado y un gen mutado Cry1 (Cry1 Cys414Ala antimórfico; PLoS ONE Vol. 8, No. 10 (2013) e76098).
Cerdos
La presente invención se refiere a un cerdo transgénico que comprende un gen mutado de polipéptido amiloide de los islotes (IAPP) humano o parte del mismo y muestra al menos un fenotipo asociado a la diabetes mellitus tipo 2. El cerdo transgénico de la presente invención puede ser cualquier cerdo.
El cerdo es genéticamente cercano a los humanos en comparación con, por ejemplo, los roedores. Además, el cerdo ha sido ampliamente usado en investigaciones biomédicas, debido a las similitudes entre la fisiología humana y la porcina (Douglas, 1972; Book & Bustad, 1974).
En una realización, el cerdo transgénico es un cerdo salvaje. En otra realización, el cerdo transgénico es el cerdo doméstico, Sus scrofa. En esta invención, se describe el S. domesticus. En incluso otra realización, la invención se refiere a los mini cerdos, así como también a los cerdos endogámicos. Los cerdos transgénicos descritos en esta invención se seleccionan de entre el grupo que consiste en Landrace, Yorkshire, Hampshire, Duroc, Meishan chino, Berkshire y Pietrain, tal como el grupo que consiste en Landrace, Yorkshire, Hampshire y Duroc, por ejemplo, el grupo que consiste en Landrace, Duroc y Meishan chino, tal como el grupo que consiste en Berkshire, Pietrain, Landrace y Meishan chino, por ejemplo, el grupo que consiste en Landrace y Meishan chino. En una realización, el cerdo no es un mini cerdo. En otra realización, el cerdo transgénico de la presente invención es un cerdo endogámico.
Debido a su tamaño y peso de alrededor de 200 kg, el cerdo doméstico no se maneja fácilmente en un entorno de laboratorio. Por consiguiente, en una realización preferida de la presente invención, el cerdo transgénico es un mini cerdo. Los mini cerdos descritos en esta invención se seleccionan de entre el grupo que consiste en Goettingen, Yucatán, Bama Xiang Zhu, Wuzhishan y Xi Shuang Banna.
Los cerdos de la presente invención también incluyen la descendencia del cerdo transgénico que comprende un gen mutado de polipéptido amiloide de los islotes (IAPP) humano. En una realización, el cerdo transgénico de la presente invención es generado mediante clonación. Los cerdos clonados que comprenden el gen de IAPP mutado humano pueden usarse como animales de cría. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a la descendencia de los cerdos clonados. La descendencia puede tener diferentes genotipos, en comparación con los cerdos clonados, y ser heterocigotos con respecto al gen de IAPP mutado. Por consiguiente, en una realización, el cerdo transgénico es heterocigótico con respecto al gen mutado de polipéptido amiloide de los islotes (IAPP) humano. En otra realización, el cerdo transgénico es homocigoto con respecto al gen mutado de polipéptido amiloide de los islotes (IAPP).
La presente invención también se refiere a un blastoquiste, un embrión, un feto, una célula donante y/o un núcleo celular transgénicos derivados del cerdo transgénico, como se describe en esta invención.
Además, la presente invención se refiere a una célula o una línea celular transgénicas de un cerdo transgénico de la presente invención. Preferentemente, la célula o la línea celular transgénicas se obtienen de una célula germinal y/o una célula somática de dicho cerdo transgénico.
Fenotipos
El cerdo transgénico de la presente invención muestra al menos un fenotipo asociado a la diabetes mellitus tipo 2. Por consiguiente, el cerdo transgénico puede mostrar cualquier fenotipo que está relacionado con la diabetes mellitus tipo 2. Una causa común de la diabetes es la incapacidad de las células beta del páncreas de producir suficiente insulina para impedir una hiperglucemia. El tipo 1 es generalmente debido a la destrucción autoinmune de las células beta pancreáticas. El sello distintivo de tipo 2 es la resistencia a la insulina en todo el tejido. Inicialmente, las células beta pancreáticas intentarán compensar la resistencia a la insulina mediante el aumento de la producción de insulina. Como resultado, debido a la agotadora actividad de producir insulina, la diabetes mellitus tupo 2 a veces también progresa a la pérdida de la función de las células beta. La diabetes gestacional es similar a la diabetes mellitus tipo 2, en que involucra la resistencia a la insulina. En la diabetes gestacional, las hormonas del embarazo causan resistencia a la insulina en mujeres genéticamente predispuestas a desarrollar esta condición.
La resistencia a la insulina y la diabetes tipo 2 se asocian a una serie de condiciones clínicas graves. Las condiciones asociadas a la resistencia a la insulina y/o la diabetes incluyen aterosclerosis, arteriosclerosis, arteriosclerosis, hipertensión, trastornos cardiovasculares, diabetes mellitus tipo 2, retinopatía, neuropatía, nefropatía, microangiopatía, macroangiopatía, hiperglucemia, hipercolesterolemia, hiperinsulinemia, hiperlipidemia, sobrepeso, obesidad visceral, dislipidemia, resistencia a la insulina, alteración de la tolerancia a la glucosa oral, glucosa alterada en ayunas, síndrome metabólico, síndrome de ovario poliquístico, hígado graso (esteatosis hepática), isquemia, enfermedad cardiaca isquémica, accidente cerebrovascular trombótico, ictus hemorrágico, isquemia de las extremidades y/o claudicación. Se pretende que cada uno de los trastornos o condiciones especificadas anteriormente sea una realización individual. La diabetes tipo 2 y la resistencia a la insulina también se asocian a una mayor incidencia del síndrome metabólico. El síndrome metabólico es un grupo de factores de riesgo metabólicos en una persona. Estos factores de riesgo incluyen sobrepeso/obesidad, hipertensión/trastornos cardiovasculares, diabetes mellitus tipo 2 y dislipidemia. Por consiguiente, se pretende que el término "síndrome metabólico", según la presente invención, comprenda esos factores de riesgo. A veces, se hace referencia al síndrome metabólico como el síndrome metabólico X, el síndrome X, el síndrome de resistencia a la insulina, el síndrome de Reaven o el síndrome obstructivo congénito de las vías respiratorias (CHAOS). Como es evidente a partir de lo anterior, los factores de riesgo individuales involucrados en el síndrome metabólico también pueden constituir una condición clínica individual asociada a la diabetes tipo 2.
En una realización, el cerdo transgénico muestra al menos un fenotipo asociado a la diabetes tipo 2.
En una realización, el cerdo transgénico tiene diabetes tipo 2.
En general, los síntomas o fenotipos de la diabetes sin tratar incluyen: pérdida de peso, poliuria (micción frecuente), polidipsia (aumento de la sed) y polifagia (aumento del hambre). Por consiguiente, en una realización, el cerdo transgénico muestra al menos un fenotipo seleccionado de entre el grupo que consiste en pérdida de peso, poliuria y polifagia.
Las complicaciones microvasculares primarias de la diabetes incluyen daño en los ojos, los riñones y los nervios. El daño en los ojos, conocido como retinopatía diabética, es causado por el daño en los vasos sanguíneos de la retina del ojo, y puede resultar en una pérdida gradual de la visión y potencialmente ceguera. El daño a los riñones, conocido como retinopatía diabética, puede llevar a la cicatrización del tejido, la pérdida de proteína en la orina y finalmente la enfermedad renal crónica, a veces requiere diálisis o un trasplante de riñón. El daño a los nervios del cuerpo, conocido como neuropatía diabética, es la complicación más común de la diabetes. Los síntomas pueden incluir entumecimiento, hormigueo, dolor y una alteración de la sensación de dolor, que puede llevar a daños en la piel. Pueden producirse problemas de pie relacionados con la diabetes (como las úlceras diabéticas en los pies) y pueden ser difíciles de tratar y, en ocasiones, requieren una amputación. Adicionalmente, la neuropatía diabética proximal causa la pérdida de masa muscular y debilidad.
Por consiguiente, en otra realización, el cerdo transgénico muestra al menos un fenotipo seleccionado de entre el grupo que consiste en daño en los ojos, nefropatía diabética, neuropatía diabética, pérdida de proteínas en orina, daño en la piel, úlceras diabéticas en los pies y pérdida de masa muscular.
En una realización preferida, el cerdo transgénico muestra al menos un fenotipo seleccionado de entre el grupo que consiste en ceguera, inflamación, infección y deformación de los órganos.
La degeneración de las células p es la causa principal de la diabetes mellitus tipo I. Además, el curso clínico de la diabetes tipo 2 se caracteriza por una disminución progresiva de la masa y la función de las células p. Las células p constituyen el tipo predominante de células en los islotes del páncreas y que son responsables de la secreción de insulina. Por lo tanto, la degeneración de las células p se asocia a una disminución en la secreción de insulina. En otra realización preferida de la presente invención, el al menos un fenotipo mostrado por el cerdo transgénico es la degeneración de las células beta. La degeneración de las células p puede determinarse, por ejemplo, mediante la evaluación de la masa de células beta en una muestra de tejido pancreático.
En una realización preferida el al menos un fenotipo mostrado por el cerdo transgénico es la intolerancia a la glucosa o la hiperglucemia. La intolerancia a la glucosa es un término general para condiciones metabólicas que resultan en niveles de glucosa en sangre más altos de lo normal, es decir, hiperglucemia. La hiperglucemia, tal como se usa en esta invención, es una condición en la que una cantidad excesiva de glucosa circula en el plasma sanguíneo.
La intolerancia glucosa incluye a cualquier persona que tenga ya sea glucemia basal alterada (IFG) o tolerancia alterada a la glucosa (IGT).
Los fenotipos asociados a la diabetes también se pueden detectar como niveles anormales de glucosa, glucagón, insulina y/o péptido C del cerdo transgénico.
La insulina es la hormona principal que regula la absorción de la glucosa de la sangre en la mayoría de las células del cuerpo, especialmente del hígado, los músculos y el tejido adiposo. Por lo tanto, la deficiencia de insulina o la insensibilidad de sus receptores juega un papel central en todas las formas de diabetes. La insulina juega un papel fundamental en el equilibrio de los niveles de glucosa en el cuerpo. La insulina puede inhibir la descomposición del glucógeno o el procedimiento de la gluconeogénesis, puede estimular el transporte de glucosa a las células adiposas y musculares, y puede estimular el almacenamiento de la glucosa en la forma de glucógeno. El péptido C, que también es conocido como péptido de conexión, conecta la cadena A de la insulina a su cadena B en la molécula de proinsulina. El péptido C es secretado junto con la insulina y normalmente se secreta en cantidades equimolares a la insulina. La insulina es liberada a la sangre a través de las células p, que se encuentran en los islotes de Langerhans en el páncreas, en respuesta al aumento de los niveles de glucosa en sangre, por lo general, después de comer. La insulina se usa en alrededor de dos tercios de las células del cuerpo para absorber la glucosa de la sangre para su uso como combustible, para la conversión a otras moléculas necesarias o para su almacenamiento. Los niveles de glucosa más bajos resultan en una disminución de la liberación de insulina desde las células p y en la descomposición del glucógeno en glucosa. Este procedimiento es controlado principalmente por la hormona glucagón, que actúa de manera opuesta a la insulina.
Si la cantidad de insulina disponible es insuficiente, si las células no responden bien a los efectos de la insulina (insensibilidad a la insulina o resistencia a la insulina), o si la insulina en sí misma es defectuosa, entonces la glucosa no será absorbida adecuadamente por las células del cuerpo que la requieran, y no se almacenará adecuadamente en el hígado ni en los músculos. El efecto neto es la persistencia de altos niveles de glucosa en sangre, una pobre síntesis de proteína, así como también otros trastornos metabólicos.
Por consiguiente, los niveles altos de glucosa y de glucagón y los niveles bajos de insulina y/o de péptido C se asocian normalmente a la diabetes.
Los niveles de glucosa, glucagón, insulina y/o péptido C pueden determinarse, por ejemplo, mediante la medición de la concentración de glucosa, glucagón, insulina y/o péptido C en una muestra de orina o de plasma del cerdo. En una realización preferida, los valores obtenidos, es decir, los niveles medidos de glucosa, glucagón, insulina y/o péptido C se comparan con los niveles de glucosa, glucagón, insulina y/o péptido C en un cerdo de control. Se prefiere que el cerdo de control no comprenda un gen de IAPP mutado. En una realización preferida, el cerdo de control es un cerdo de tipo salvaje. Se aprecia que el cerdo de control sea de la misma raza que el cerdo transgénico.
En una realización, el cerdo transgénico muestra niveles de glucosa más altos, niveles de glucagón más altos, niveles de insulina más bajos y/o niveles de péptido C más bajos, en comparación con un cerdo de control.
Por consiguiente, en una realización preferida, el cerdo transgénico muestra niveles de glucosa más altos, en comparación con un cerdo de control. El término "nivel de glucosa", como se usa en esta invención, se refiere al nivel de glucosa en sangre o el nivel de glucosa en el plasma del cerdo. Por consiguiente, el nivel de glucosa es la concentración de glucosa en la sangre o en el plasma del cerdo. El nivel de glucosa de los cerdos depende de la dieta que reciben los cerdos. Los cerdos que recibieron una dieta normal mostrarán, por ejemplo, niveles de glucosa más altos que los cerdos en ayunas.
Por consiguiente, en una realización, el cerdo transgénico muestra niveles de glucosa más altos, en comparación con un cerdo de control, y donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal. Se prefiere que el cerdo transgénico y el cerdo de control reciban la misma dieta y que los niveles de glucosa en sangre se midan en los mismos puntos de tiempo después de una comida.
En una realización, el nivel de glucosa del cerdo transgénico aumenta en al menos el 5%, tal como, por ejemplo, al menos el 15%, tal como al menos el 20%, tal como, por ejemplo, al menos el 30%, al menos el 40%, tal como, al menos, el 50%, tal como, por ejemplo, al menos el 60%, tal como al menos el 70%, tal como, por ejemplo, al menos el 80% o tal como al menos el 100%, en comparación con un cerdo de control, y donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal.
En una realización preferida, el nivel de glucosa del cerdo transgénico aumenta en al menos el 10%, en comparación con un cerdo de control, y donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal.
En incluso otra realización preferida de la presente invención, el cerdo transgénico descrito en esta invención muestra niveles de glucagón más altos, en comparación con un cerdo de control. El término "nivel de glucagón", como se usa en esta invención, hace referencia al nivel de glucagón en sangre o en el plasma del cerdo. Por consiguiente, el nivel de glucagón es la concentración de glucagón en la sangre o en el plasma del cerdo. El nivel de glucagón de los cerdos depende de la dieta que reciban los cerdos. Los cerdos que reciben una dieta normal, por ejemplo, mostrarán niveles de glucagón más altos que los cerdos en ayunas.
Por consiguiente, en una realización, el cerdo transgénico muestra niveles de glucagón más altos, en comparación con un cerdo de control, y donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal.
En una realización, el nivel de glucagón del cerdo transgénico aumenta en al menos el 5%, tal como, por ejemplo, al menos el 15%, tal como al menos el 20%, tal como, por ejemplo, al menos el 30%, al menos el 40%, tal como al menos el 50%, tal como, por ejemplo, al menos el 60%, tal como al menos el 70%, tal como, por ejemplo, al menos el 80% o tal como al menos el 100%, en comparación con un cerdo de control, y donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal.
En una realización preferida, el nivel de glucagón en el cerdo transgénico aumenta en al menos el 10%, en comparación con un cerdo de control, y donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal.
En otra realización preferida de la presente invención, el cerdo transgénico descrito en esta invención muestra niveles más bajos de insulina, en comparación con un cerdo de control. El término "nivel de insulina", tal como se usa en esta invención, hace referencia a la concentración de insulina en la sangre o en el plasma del cerdo. El nivel de insulina de los cerdos depende de la dieta que reciban los mismos. Los cerdos que reciben una dieta normal mostrarán, por ejemplo, niveles más altos de insulina que los cerdos que reciben una dieta con ayuno (véase la Figura 4C).
Por consiguiente, en una realización, el cerdo transgénico muestra niveles más bajos de insulina, en comparación con un cerdo de control, y donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal.
En una realización, el nivel de insulina del cerdo transgénico disminuye en al menos el 5%, tal como, por ejemplo, al menos el 15%, tal como al menos el 20%, tal como, por ejemplo, al menos el 30%, al menos 40%, tal como al menos el 50%, tal como, por ejemplo, al menos el 60%, tal como al menos el 70%, tal como, por ejemplo, al menos el 80% o tal como al menos el 100%, en comparación con un cerdo de control, y donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal.
En una realización preferida, el nivel de insulina del cerdo transgénico disminuye en al menos el 10%, en comparación con un cerdo de control, y donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal.
En otra realización preferida de la presente invención, el cerdo transgénico como se describe en esta invención muestra niveles más bajos de péptido C, en comparación con un cerdo de control.
El término "nivel de péptido C", como se usa en esta invención, hace referencia a la concentración de péptido C en la sangre o en el plasma del cerdo. El nivel de péptido C de los cerdos depende de la dieta que reciban los cerdos. Los cerdos que reciben una dieta normal mostrarán, por ejemplo, niveles de péptido C más altos que los cerdos en ayunas. Por consiguiente, en una realización, el cerdo transgénico muestra niveles más bajos de péptido C, en comparación con un cerdo de control, y donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal.
En una realización, el nivel de péptido C del cerdo transgénico disminuye en al menos el 5%, tal como, por ejemplo, al menos el 15%, tal como al menos el 20%, tal como, por ejemplo, al menos el 30%, al menos el 40%, tal como al menos el 50%, tal como, por ejemplo, al menos el 60%, tal como al menos el 70%, tal como, por ejemplo, al menos el 80% o tal como al menos el 100%, en comparación con un cerdo de control, y donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal.
En una realización preferida, el nivel de péptido C del cerdo transgénico disminuye en al menos el 10%, en comparación con un cerdo de control, y donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal.
Se prefiere que los cerdos transgénicos y los cerdos de control reciban la misma dieta y que los niveles de glucosa, insulina, péptido C y/o glucagón en sangre se midan en los mismos puntos de tiempo después de una comida. En una realización preferida, el cerdo transgénico y el cerdo de control tienen la misma edad.
Procedimiento para la producción del cerdo transgénico
El cerdo transgénico de la presente invención puede producirse usando cualquier técnica en la que se transfiera material genético modificado desde una célula donante a una célula huésped, tal como un ovocito enucleado. Existe una serie de técnicas, como la introducción de material genético de una célula somática transgénica en un ovocito enucleado, por ejemplo, mediante microinyección o por transferencia nuclear.
En una realización de la presente invención, el cerdo transgénico se puede obtener mediante la transferencia nuclear de células somáticas. La transferencia nuclear de células somáticas se refiere a la transferencia del núcleo de una célula somática (cuerpo) o de una célula somática a un óvulo (ovocito) al que se le ha eliminado su propio núcleo (ha sido desnucleado o enucleado).
Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para producir el cerdo transgénico, como se describe en esta invención, comprendiendo dicho procedimiento:
i. producir un ovocito que tiene una zona pelúcida parcialmente modificada,
ii. separar el ovocito en al menos dos partes, obteniendo un ovocito que tiene un núcleo y al menos un citoplasto, iii. producir una célula donante que comprende un gen de IAPP mutado o parte del mismo,
iv. fusionar al menos un citoplasto con la célula donante o el núcleo celular rodeado de membrana,
v. obtener un embrión reconstruido,
vi. activar el embrión reconstruido para formar un embrión, cultivar dicho embrión y
vii. transferir dicho embrión cultivado a un mamífero huésped,
donde el embrión se desarrolla en un cerdo transgénico.
Se aprecia que los procedimientos para la producción del cerdo transgénico, como se describen en esta invención, no abarcan una etapa quirúrgica efectuada en el cerdo.
El gen de IAPP mutado humano es como se define en cualquier otra parte de esta invención. En una realización preferida de la misma, el gen de IAPP mutado humano comprende una mutación S20G.
En una realización preferida, la célula donante no expresa un gen de IAPP de cerdo. En otra realización preferida, la célula donante no expresa un gen de IAPP de cerdo endógeno. En otra realización preferida, el gen de IAPp de cerdo ha sido desactivado.
En otra realización, el ovocito de ii) puede separarse en al menos tres partes, obteniendo al menos dos citoplastos. En una realización, el ovocito se separa en dos partes, obteniendo un citoplasto. En otra realización, el ovocito se separa en tres partes, obteniendo dos citoplastos.
Ovocito
El término "ovocito", según la presente invención, significa una célula reproductora hembra inmadura, una que no ha completado el procedimiento de maduración para formar un óvulo (gameto). En la presente invención, un ovocito enucleado es la célula receptora en el procedimiento de transferencia nuclear.
Los ovocitos según la presente invención se aíslan de los oviductos y/o los ovarios de un cerdo. Normalmente, los ovocitos se recuperan de cerdos fallecidos, aunque también pueden aislarse de los oviductos y/o los ovarios de cerdos vivos. En una realización, los ovocitos se aíslan mediante procedimientos de recuperación del oviducto o procedimientos de recuperación transvaginal. En una realización preferida, los ovocitos se aíslan mediante aspiración. Los ovocitos típicamente maduran en una variedad de medios conocidos para un experto en la materia antes de la enucleación. Los ovocitos también se pueden aislar de los ovarios de un animal recientemente sacrificado o cuando el ovario ha sido congelado y/o descongelado. Preferentemente, los ovocitos están recién aislados de los oviductos. Los ovocitos o citoplastos también pueden criopreservarse antes de su uso. Si bien los expertos en la materia apreciarán que se prefieren los ovocitos maduros y recientemente aislados, también se apreciará que es posible criopreservar los ovocitos después de la cosecha o después de la maduración. Si se usan ovocitos criopreservados, a continuación, primero estos deben descongelarse antes de colocar los ovocitos en el medio de maduración. Los procedimientos para descongelar materiales criopreservados, de modo tal que estén activos después del procedimiento de descongelamiento, son bien conocidos para los expertos en la materia. Sin embargo, en general, la criopreservación de ovocitos y citoplastos es un procedimiento muy exigente, y es especialmente difícil en cerdos, debido a la fragilidad general antes mencionada de los ovocitos y los citoplastos de cerdo, así como también debido al alto contenido de lípidos, el cual los hace muy sensibles al daño por el frío (es decir, la lesión que se produce entre 15 y 5°C durante el procedimiento de enfriamiento y entibiamiento).
En otra realización, los ovocitos maduros (metafase II) que han sido madurados in vivo, pueden cosecharse y usarse en los procedimientos de transferencia nuclear descritos en esta invención. Esencialmente, los ovocitos maduros de la metafase II se cosechan quirúrgicamente ya sea de cerdos superovulados o no, de 35 a 48 horas más allá del inicio del estro o después de la inyección de gonadotropina coriónica humana (hCG) o una hormona similar.
Cuando los ovocitos han sido cultivados in vitro, las células del cumulus que rodean a los ovocitos in vivo y hayan podido acumularse se pueden eliminar, a fin de proporcionar ovocitos que estén en una etapa más adecuada de la maduración para la enucleación. Las células de cumulus pueden eliminarse mediante pipeteo o agitación con vórtex, por ejemplo, en presencia de hialuronidasa, en el intervalo del 0,1 al 5%, tal como en el intervalo del 0,2 al 5%, por ejemplo, en el intervalo del 0,5 al 5%, tal como en el intervalo del 0,2 al 3%, por ejemplo, en el intervalo del 0,5 al 3%, tal como en el intervalo del 0,5 al 2%, por ejemplo, en el intervalo del 0,5 al 1%, tal como el 0,5%.
La primera etapa en los procedimientos preferidos involucra el aislamiento de un ovocito receptor de un cerdo adecuado. En este sentido, el ovocito se puede obtener de cualquier fuente de cerdo y en cualquier etapa de maduración.
Se ha informado que la etapa de maduración del ovocito en la enucleación y la transferencia nuclear es de importancia para el éxito de los procedimientos de transferencia nuclear. Los ovocitos inmaduros (profase I) de los ovarios de cerdo a menudo se cosechan mediante aspiración. A fin de emplear técnicas, como las de ingeniería genética, la transferencia nuclear y la clonación, dichos ovocitos cosechados se maduran preferentemente in vitro antes de que las células de ovocitos puedan usarse como células receptoras para la transferencia nuclear.
Preferentemente, la clonación exitosa de embriones de cerdo usa el ovocito de la etapa de metafase II como el ovocito receptor porque se cree que, en esta etapa de maduración, el ovocito puede ser, o es, suficientemente activado para tratar el núcleo introducido como si fuera un espermatozoide fertilizante. Sin embargo, la presente invención se refiere a cualquier etapa de maduración del ovocito que es adecuada para llevar a cabo la transferencia nuclear de células somáticas, embriones, blastoquistes y/o cerdos transgénicos que pueden obtenerse mediante el procedimiento de la transferencia nuclear de células somáticas de la presente invención.
Por lo general, la maduración in vitro de los ovocitos tiene lugar en un medio de maduración hasta que el ovocito haya alcanzado la etapa de la metafase II o haya extruido el primer cuerpo polar. El tiempo necesario para que un ovocito inmaduro alcance la maduración se llama período de maduración.
En una realización preferida de la presente invención, el ovocito es de una cerda o una cerda joven, preferentemente de una cerda.
Tanto el donante (una célula somática o el núcleo de una célula somática) como el receptor (el citoplasto) involucrado en el procedimiento de transferencia nuclear de células según la presente invención son cerdos. Del mismo modo, los embriones reconstruidos pueden ser implantados en un cerdo según la presente invención. En esta invención, se describen los diferentes cerdos adecuados como donante, receptor o madre de acogida.
El cerdo donante según la presente invención puede ser femenino o masculino. La edad del cerdo puede ser cualquiera, tal como un adulto o, por ejemplo, un feto.
Embrión
Según la presente invención, un embrión reconstruido (es decir, un solo embrión celular) contiene el material genético de la célula donante. Posteriormente, el embrión reconstruido se divide progresivamente en un embrión multicelular después de la aparición de la mitosis. In vitro, el inicio de la mitosis se induce típicamente mediante la activación, como se describe en esta invención.
En la presente invención, el término "embrión" también se refiere a los embriones reconstruidos, que son embriones formados después del procedimiento de transferencia nuclear, después de la aparición de la mitosis mediante la activación. Los embriones reconstruidos se cultivan in vitro.
Cuando el embrión contiene alrededor de 12 a 16 células, se le llama "mórula". Posteriormente, el embrión se divide adicionalmente y se forman muchas células, con una cavidad quística llena de fluido dentro de su centro, la cavidad blastocelo. En esta etapa, el embrión se llama "blastoquiste". La etapa de desarrollo del ovocito "fertilizado" en el momento en que está listo para el implante; formado a partir de la mórula y compuesto de una masa interior de células, una cavidad interna y una capa externa de células, a las que se denomina células trofectodermales.
El blastoquiste según la presente invención puede implantarse en el útero de un mamífero huésped, en particular, un cerdo, preferentemente un mini cerdo, y continúa creciendo en un feto y, a continuación, en un animal.
En los procedimientos proporcionados en esta invención para producir mamíferos no humanos transgénicos o transgénicos, para clonar un mamífero no humano, para cultivar un embrión reconstruido y/o para criopreservar un embrión de cerdo, el embrión debe cultivarse in vitro. Por ejemplo, el embrión puede cultivarse en un cultivo secuencial. Se apreciará que el embrión puede ser un embrión normal o un embrión reconstruido, como se define en otra parteen esta invención.
Citoplasto
A citoplasto es un ovocito o una parte de un ovocito a la que se le ha eliminado el núcleo. En un procedimiento preferido de la invención, el núcleo de un ovocito se sustituye con una célula donante, que comprende un gen de IAPP mutado, como se define en esta invención.
Células donantes
Con el término "célula donante" de la presente invención, se hace referencia a una o varias células somáticas derivadas de la línea germinal. La célula donante comprende un gen de IAPP mutado. El gen de IAPP mutado de la célula donante es como se define en otra parte de esta invención.
Mediante el término "célula somática" de la presente invención, se hace referencia a cualquier célula (corporal) de un animal en cualquier etapa de desarrollo. Por ejemplo, las células somáticas pueden originarse a partir de un tejido fetal, neonatal o adulto. Las células somáticas especialmente preferidas son las de origen fetal o neonatal. Sin embargo, también se pueden usar las células de una línea germinal. Según la presente invención, una célula donante es una célula somática. En otra realización de la presente invención, la célula donante es una célula derivada de una línea de células germinales.
En una realización, las células somáticas se seleccionan de entre el grupo que consiste en células epiteliales, células neurales, células epidérmicas, queratinocitos, células hematopoyéticas, melanocitos, condrocitos, linfocitos (linfocitos B y T), eritrocitos, macrófagos, monocitos, células mononucleares, fibroblastos, células del músculo cardíaco y otras células musculares. En una realización preferida, la célula donante es una célula de fibroblasto.
Estas pueden obtenerse a partir de diferentes órganos, por ejemplo: piel, pulmón, páncreas, hígado, estómago, intestino, corazón, órganos reproductivos, la vejiga, el riñón, la uretra y otros órganos urinarios.
En esta invención, se describen los cerdos de los cuales pueden derivarse las células somáticas. Una realización preferida de la invención es el uso de células somáticas procedentes de la misma especie que el ovocito receptor (citoplasto).
Preferentemente, las células somáticas son células de fibroblastos. El fibroblasto puede obtenerse de fetos, lechones recién nacidos y animales adultos. Además, los fibroblastos pueden propagarse fácilmente in vitro. Más preferentemente, las células somáticas son fibroblastos cultivados in vitro de origen fetal o neonatal.
En una realización preferida, se modifican las células somáticas. En incluso otra realización preferida adicional de la presente invención, las células somáticas son preferentemente de origen fetal o neonatal o, por ejemplo, de adultos. Un aspecto de la presente invención se refiere a una célula donante modificada y/o un núcleo de células derivadas del modelo de cerdo modificado, como se describe en esta invención, y/o una célula donante modificada y/o un núcleo celular que comprende un gen de IAPP. Se aprecia que la célula donante modificada puede ser cualquier tipo de tejido, como se describe en otra parte de esta invención.
Las células donantes pueden ser transgénicas, mediante cualquier procedimiento estándar conocido en la técnica. La modificación genética puede ser una modificación del ADN genómico mediante deleción, inserción, duplicación y/u otras formas de mutación, incluyendo la mutación puntual. La modificación puede hacerse en secuencias de codificación y/o en secuencias que no son de codificación.
En la presente invención, un gen de IAPP mutado se inserta en el genoma de la célula donante. Por consiguiente, las construcciones de ADN para la inserción comprenden un gen de IAPP mutado. El gen de IAPP es como se describe en cualquier otra parte de esta invención.
Las técnicas adecuadas para la modificación genética de células de mamífero, tales como fibroblastos, incluyen técnicas tales como la adición de genes mediante recombinación no homóloga, la sustitución de genes mediante recombinación homóloga y la edición de genes. Esto puede incluir el uso de la inserción retroviral, la transferencia de transposón y/o técnicas de cromosomas artificiales. La recombinación de ADN no homólogo puede llevarse a cabo, por ejemplo, como se describe en Kragh y col. (2004) Reprod. Fert. Dev. 16:290 o Kragh y col. (2004) Reprod. Fert.
Dev. 16:315, la transferencia de genes en base al transposón puede efectuarse como se describe en Izsvak y col. (1997) Cell 91:501. La sustitución de genes mediante recombinación homóloga involucrar, por ejemplo, las técnicas descritas por Urnow y col. (2005) Nature 435:646. Las técnicas para la edición de genes se han descrito en Andersen y col. (2002) J. Mol. Med. 80:770, Liu y col. (2002) Gene Ther. 9:118 y Sorensen y col. (2005) J. Mol. Med. 83:39. En una realización preferida, la célula donante es transgénica mediante la integración aleatoria de los genes descritos en esta invención en el genoma de la célula donante.
Uso del cerdo transgénico
Los cerdos transgénicos según la presente invención constituyen un sistema modelo altamente adecuado para la diabetes mellitus tipo 2, porque, como se describe en esta invención, exhiben las características claves de la diabetes, como, por ejemplo, la alteración de la secreción de insulina y los niveles altos de glucosa en sangre.
El estudio de la diabetes puede involucrar la determinación de la masa de células beta, el nivel de insulina, el nivel de péptido C, el nivel de glucosa y/o el nivel de glucagón de dicho cerdo. La masa de células beta, el nivel de insulina, el nivel de péptido C, el nivel de glucosa y/o el nivel de glucagón de dicho cerdo se pueden determinar a diferentes edades de los cerdos, tal como, por ejemplo, a una edad de 1, 2, 3 o 4 semanas, al mes, a los 2, 3 o 6 meses y/o al año. La masa de células beta, el nivel de insulina, los niveles de péptido C y/o el nivel de glucagón de dicho cerdo pueden determinarse en diferentes puntos de tiempo, como, por ejemplo, a diario, dos veces por semana, de manera semanal, cada dos semanas, mensualmente o cada dos meses.
Por consiguiente, el cerdo transgénico de la presente invención se puede usar como un sistema modelo para la patogénesis de la diabetes mellitus y para el estudio de la aparición, el desarrollo y el progreso de la diabetes.
El cerdo transgénico de la presente invención también se puede usar como un modelo para estudiar los tratamientos y/o la prevención de la diabetes mellitus tipo 2. Por consiguiente, un aspecto adicional de la presente descripción se refiere al uso del cerdo transgénico como un sistema modelo para estudiar la terapia, el tratamiento y/o la prevención de la diabetes. Por la presente, los cerdos se pueden usar para identificar medios y procedimientos adecuados para la terapia, el tratamiento y/o la prevención de la diabetes.
Los cerdos también se pueden usar para identificar compuestos adecuados para la terapia, el tratamiento y/o la prevención de la diabetes. Dicho procedimiento preferentemente comprende las siguientes etapas
(i) proporcionar un cerdo transgénico según la presente invención,
(ii) proporcionar un compuesto a probar,
(iii) administrar dicho compuesto a dicho cerdo transgénico,
(iv) determinar los factores de riesgo asociados a la diabetes, como el nivel de insulina, el nivel de glucosa y/o el nivel de glucagón de dicho cerdo transgénico,
determinando así el efecto de dicho compuesto en el nivel de insulina, el nivel de glucosa, el nivel de glucagón y/o el nivel de péptido C de dicho cerdo transgénico.
El nivel de insulina, el nivel de glucosa y/o el nivel de glucagón pueden determinarse como se describe en otra parte de esta invención.
Preferentemente, dicho compuesto es capaz de mejorar la secreción de insulina y/o disminuir los niveles de glucosa y glucagón.
Las vías de administración preferidas de un compuesto son la oral, la nasal, la subcutánea, la intracutánea, la parenteral, la transdérmica, la tópica, la intravenosa, la intraarterial, la intramuscular, la intraperitoneal o las combinaciones de las mismas.
El cerdo transgénico de la presente invención también se puede usar como un modelo para el estudio del trasplante de células p. Por consiguiente, una realización adicional de la presente descripción se refiere al uso del cerdo transgénico como un sistema modelo para la terapia, el tratamiento y/o la prevención de la diabetes, donde dicha terapia o tratamiento involucra el trasplante de células p de un cerdo donante a dicho cerdo transgénico.
Las células p se pueden aislar de páncreas donantes y, posteriormente, se pueden trasplantar al cerdo transgénico. Un aspecto adicional de la presente descripción se refiere a un procedimiento para estudiar la diabetes mediante la aplicación del cerdo transgénico, como se describe en esta invención.
Otro aspecto se refiere a un procedimiento para el estudio de la terapia, el tratamiento y/o la prevención de la diabetes que comprende las etapas de
i. proporcionar un cerdo transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16,
ii. proporcionar un compuesto a probar,
iii. administrar dicho compuesto a dicho cerdo transgénico,
iv. determinar los factores de riesgo asociados a la diabetes, como el nivel de insulina, el nivel de glucosa y/o el nivel de glucagón de dicho cerdo transgénico,
determinando así el efecto de dicho compuesto en el nivel de insulina, el nivel de glucosa, el nivel de glucagón y/o el nivel de péptido C de dicho cerdo transgénico.
Ejemplos
Materiales y procedimientos
Células
Para el direccionamiento génico, se usaron fibroblastos porcinos primarios de cerdos enanos Gottingen. Las células se cultivaron en DMEM suplementado con un 15% de FBS, 1/100 P/S y 1/100 glutamina. El FGF humano (5ng/ml) se complementó cuando las células estaban en el medio de selección (G418, 1 pg/ml).
Construcciones
La construcción de direccionamiento del cerdo HIP y las TALEN, que se ilustran en la Figura 1, se generaron mediante una PCR y un montaje de portón dorado. Las secuencias dirigidas de TALEN se proporcionan en la Tabla 1.
Transfección y Selección
Todas las transfecciones se efectuaron con el conjunto Nucleofection X. Tres días después de la transfección (2 días después de la división en 96 placas de pocillos), se seleccionaron las células con G418 (1 mg/ml) durante 2 semanas, con un cambio de medio cada 3 a 4 días. Después de la selección, los clones celulares resistentes a G418 se trataron con tripsina y 1/3 fue transferido a placas de 96 pocillos de PCR para la detección por PCR; 1/3 se cultivó en placas de 96 pocillos de cultivo celular, recubiertas con gelatina, para el análisis de transferencia de Southern; 1/3 se cultivó en placas de 96 pocillos recubiertas con gelatina para el congelamiento, y estas células se usaron posteriormente como células donantes nucleares para la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT).
Recolección de ovocitos y maduración in vitro
Excepto donde se indique lo contrario, todos los productos químicos para el trabajo embriológico se obtuvieron de Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, EE.UU.). Los complejos de cumulus y ovocitos (COC) se aspiraron de folículos de 2 a 6 mm de ovarios de cerdas derivadas del matadero y se maduraron en grupos de 50 en 400 II en un medio de maduración in vitro (IVM) que consistente en TCM-199 tamponado con bicarbonato (GIBCO BRL, EE.UU.), suplementado con 10% (v/v) de suero de ganado (CS), 10% (v/v) de fluido folicular de cerdo, 10 IU/ml de gonadotropina coriónica equina y 5 IU/ml de gonadotropina coriónica humana (Suigonan Vet; Skovlunde, Dinamarca) en el sistema de incubación submarina (SIS) durante 41 a 44 h.
Clonación manual y cultivo de embriones
Los COC fueron tratados con 1 mg/ml de hialuronidasa y se pipetearon vigorosamente para eliminar las células del cumulus unidas a la zona pelúcida. Las zonas pelúcidas de los ovocitos se digirieron parcialmente con 3,3 mg/ml de solución de pronasa disuelta en T33 (T por el tamponado con Hepes TCM199, GIBCO BRL, EE.UU., mientras que el número se refiere a la concentración de CS, que en este caso es del 33%) durante 20 s, lo cual fue seguido de un lavado rápido en gotas T2 y T20. Los ovocitos con zonas pelúcidas distendidas y ablandadas se alinearon en gotas T2 gotas suplementadas con 2,5 pg/ml de citocalasina B. Con una pipeta de vidrio finamente extraída y pulida al fuego, los ovocitos se rotaron para localizar el cuerpo polar. La bisección orientada se efectuó manualmente con cuchillas de seccionamiento ultra filosas (AB Technology, Pullman, WA, EE.UU.) bajo un microscopio estereoscópico. Menos de la mitad del citoplasma cerca del cuerpo polar se eliminó del citoplasto putativo restante. Los fibroblastos (5D1) se tripsinizaron y se resuspendieron en 20 pl de T2. La fusión se efectuó en dos etapas, donde la segunda etapa incluía la iniciación de la activación. Para la primera etapa, el 50% de los citoplastos disponibles se transfirieron a 1 mg/ml de fitohemaglutinina (PHA; ICN Pharmaceuticals, Girraween, Australia) disuelta en T0 durante 3 s, y, a continuación, cada uno de ellos se dejó caer rápidamente sobre una sola célula de fibroblastos. Después de la unión, los pares de citoplastos y fibroblastos se equilibraron en un medio de fusión (manitol 0,3 M y 0,01% de alcohol de polivinilo; PVA) durante 10 s y se transfieren a una cámara de fusión (cámara de fusión de 0,5 mm, BTX MicroSlide, modelo 450; BTX, San Diego, CA, EE.UU.). Usando CA de 0,06 kV/cm y 700 kHz, los pares se alinearon con el hilo de la cámara de fusión con las células somáticas más alejados del hilo. A continuación, los mismos se fusionaron con un pulso de CC de 2,0 kV/cm para 9 ps. Después del pulso de CC, los pares se eliminaron cuidadosamente desde el hilo, se transfirieron a gotas T10 y se incubaron adicionalmente para observar si se había producido la fusión. Aproximadamente 1 h después de la primera fusión, cada par se fusionó con otro citoplasto en un medio de activación (0,3 M manitol, 0,1 mM MgSÜ4, 0,5 mM CaCl2 y 0,1% de PVA). Mediante el uso de un AC de 0,06 kV/cm y 700 kHz, un par fusionado y uno citoplasto se alinearon a un hilo de la cámara de fusión, con pares fusionados en contacto con el hilo. Un solo pulso de CC de 0,86 kV/cm se aplicó durante 80 ps. Tras observar la fusión en las gotas T10, los embriones reconstruidos se transfirieron a PZM-3 suplementado con 5 pg/ml de citocalasina B y 10 pg/ml de cicloheximida. Después de una incubación de 4 h a 38,5°C en un 5% de CO2 , un 5% de O2 y un 90% de N2 con la humedad máxima, los embriones se lavaron tres veces y se cultivaron en PZM-3 (Yoshioka K y col., (2002), Biol Reprod 66:112-119) usando el pocillo del sistema de pocillos (Vajta G y col., (2000), Mol Reprod Dev 55:256-264).
Transferencia de embrión
Los blastoquistes frescos D5 y D6 fueron transferidos quirúrgicamente en ambos cuernos uterinos de cerdas Landrace danesas el cuarto día posterior al destete. El embarazo fue diagnosticado por ultrasonografía el día 21 y confirmado cada dos semanas. El parto fue inducido con una inyección de prostaglandina, en los casos en que la cerda no mostraba signos de parto tan tarde como el día 121. Todos los animales fueron alojados y atendidos en estricta conformidad con las propuestas de investigación con animales, las cuales son revisadas por el Instituto Danés de Ciencias Agrícolas y el Centro Danés de Bioética y Evaluación de Riesgos. Se obtuvo el permiso experimental del Comité de Ética Animal danés.
Ejemplo 1: Generación de los cerdos HIP.
Los cerdos de IAPP humano (cerdos HIP) comprenden un gen mutado de IAAP que comprende la mutación S20G, tal como se describe en otra parte de esta invención. Se generó una construcción de direccionamiento de cerdo HIP (SEQ ID NO: 13), como se ilustra en la Figura 1. La estrategia combina una desactivación de pIAPP completa con activación de hIAPP dirigida (pIAPPKO; hIAPPKI) usando TALEN de plAPP junto con la construcción de direccionamiento. Un par de TALEN con la eficiencia de escisión de aproximadamente el 5%, medida con el ensayo de T7E1 (Figura 2), crearon rupturas bicatenarias de ADN en el intrón 2 del gen de pIAPP para mejorar la eficiencia de direccionamiento mediante recombinación homóloga (HR). La construcción de direccionamiento se diseñó de manera tal que permitiese sustituir, tras la recombinación homóloga, el gen de pIAPP endógeno por un transgén, donde la expresión de hIAPP está regulada por el promotor de insulina de rata 2 (RIP2). El transgén también lleva un casete de selección de antibióticos que, después de su uso, puede eliminarse mediante la recombinasa Cre.
Transfectamos fibroblastos primarios porcinos (mini cerdos Gottingen) con la construcción de direccionamiento y los vectores TALEN de plAPP. Se hallaron clones celulares dirigidos mediante detección por PCR de los clones celulares seleccionados debido a la resistencia a los antibióticos (geneticina, G418). Se seleccionaron y agruparon 24 clones unicelulares, que son pIAPPKO;hIAPPKI. Las células agrupadas se usaron como donantes nucleares para generar los cerdos clonados mediante HMC.
En la primera ronda de HMC, se generó un total de 5 cerdos HIP, 2 nacidos vivos y 3 nacidos muertos de tres transferencias. Se confirmó que uno de los cerdos HIP nacidos vivos carecía de los genes de IAPP porcinos endógenos y que transportaba una copia del gen de IAPP humano (S20G) (cerdo HIP 609 en la Figura 3). Los fibroblastos de este cerdo HIP 609 se usaron como células donantes nucleares para generar más cerdos HIP (un procedimiento llamado reclonación). De cinco transferencias, se generó un total de 27 cerdos HIP nacidos vivos con el genotipo correcto.
Ejemplo 2: Caracterización y validación de la DM2 en los cerdos HIP
En los cerdos HIP, se observaron muchos fenotipos anormales, tales como ceguera, inflamación, infección y malformaciones de órganos de menor importancia. El peso corporal y la glucosa en sangre total se monitorizaron en los cerdos HIP de manera semanal en el primer mes y, en lo sucesivo, cada dos semanas. Algunos cerdos HIP fueron ganando peso bien, mientras que otros no prosperaron. Se sacrificaron los cerdos que habían perdido peso y que mostraban signos de sufrimiento. En los cerdos HIP, se monitorizó la glucosa en sangre de manera semanal durante el primer mes y después cada dos semanas. Se observaron niveles de glucosa altos, aunque fluctuantes, en todos los cerdos HIP. Después del destete, la glucosa en sangre en los cerdos HIP fue cada vez más normal debido la dieta estricta que recibían cada día (Figura 4). Nuestros datos de los primeros meses muestran que estos cerdos HIP tienen niveles significativamente más altos de glucagón y niveles de péptido C más bajos, en comparación con los cerdos de control, lo que sugiere que la modificación genética que introdujimos en los cerdos ya había tenido efectos en los cerdos jóvenes (Figura 5). Los cerdos se inseminarán tan pronto como llegan a la madurez sexual.
Se determinaron los niveles de glucosa, fructosamina (FRA), glucagón, insulina y péptido C (Figura 5). La Figura 5A ilustra que el nivel de glucosa promedio aumenta en los cerdos HIP a la edad de 1,2 y 3 meses, en comparación con los cerdos de control. La figura 5A ilustra que el nivel promedio de fructosamina aumenta en los cerdos HIP a los 3 meses, en comparación con los cerdos de control, mientras que la Figura 5C demuestra que el nivel promedio de glucagón aumenta en los cerdos HIP, cuando se los compara con los cerdos de control. La Figura 5D demuestra que, en los cerdos HIP, se reduce el nivel promedio de insulina, en comparación con los cerdos de control, y la Figura 5E muestra que el nivel promedio de péptido C disminuye en los cerdos HIP, cuando se los compara con los cerdos de control. El nivel promedio de péptido C, en la mayoría de los cerdos HIP fue demasiado bajo como para ser medido desde la edad de 2 meses. Para la ilustración, estos resultados se representaron por debajo del nivel cero (Figura 5E). Además, se determinaron los niveles sin ayuno de glucosa, fructosamina, glucagón, insulina y péptido C en todos los cerdos HIP heterocigotos del compuesto F0 (IAPPS20G/IAPPKO) a la edad de 1, 2, 3, 5, 7 y 9 meses y se compararon con los niveles de los cerdos de tipo salvaje correspondientes. Todos los cerdos fueron alimentados con una dieta normal.
Como se muestra la figura 1, el nivel de glucosa en los cerdos HIP fue estadística y significativamente más alto en los cerdos HIP a la edad de 1 y 7 meses. El nivel de fructosamina en el plasma, las proteínas séricas glicosiladas, fue significativamente mayor en los cerdos de control que en los cerdos HIP a la edad de 1, 7, y 9 meses. Esto podría ser debido al bajo nivel de albúmina en el plasma en los cerdos HIP (datos no mostrados). El glucagón es una hormona que eleva el nivel de glucosa en sangre. Se observó un alto nivel de glucagón variable en los cerdos HIP, con un nivel significativamente mayor a la edad de 1, 3, y 7 mes meses, en comparación con los cerdos control. Además, se midieron las dos hormonas peptídicas, la insulina y el péptido C. Estas hormonas actúan reduciendo el nivel de glucosa en sangre. En los cerdos HIP, se halló un bajo nivel de insulina a la edad de 2 y 9 meses. Lo más sorprendente fue que hallamos que el nivel de péptido C en la mayoría de los cerdos HIP fue demasiado bajo como para ser detectado, lo que indica un defecto en la producción o secreción de péptido C en los cerdos HIP.
Los resultados demuestran que la modificación genética del gen de IAPP ha afectado a las funciones pancreáticas normales en los cerdos HIP.
Conclusión
En conclusión, se ha generado un modelo porcino innovador (cerdos HIP) con una fuerte susceptibilidad hacia la diabetes. El cerdo HIP es carece del gen de IAPP porcino endógeno, y comprende el gen de IAPP humano que tiene la mutación S20G, tal como se describe en otra parte de esta invención. Los datos demuestran que la disfunción pancreática ya se desarrolla en cerdos HIP muy pequeños.
SECUENCIAS SEQ ID NO:1
Secuencia de nucleótidos de IAPP humano, que codifica un péptido de 89 aminoácidos (péptido señal de 22 aminoácidos proamilina de 67 aminoácidos).
AT GGGCAT CCT GAAGCT GCAAGT ATTT CT CATT GTGCT CT CT GTT GCATT G AACCA T CT GAAAG CTACACCCATT GAAAGT CAT CAGGT G G AAAAG CG G AAATG CAACACT GCCAC AT G TG CAACG CAG CG CCT G G CAAATTTTTT AGTT CATT CCaGCAAC AACTT TGGT G CCATT CT CT CAT CT ACCAACG T GGGAT CCAAT ACAT AT GGCAAG AG G AAT GCAGTAGAG G TTTTAAAG AG AG AG CCACTG AATTACTTG CCCCTTTAG SEQ ID NO:2
Secuencia de nucleótidos de IAPP humano, que codifica la proamilina de 67 aminoácidos.
ACACCCATT GAAAGT CAT CAG G TG G AAAAG CG G AAAT GCAACACT G CCACAT GT G
C AACG CAG CG CCTG G CAAATTTTTTAG TTCATTCCaG CAACAACTTTG G TG CCATT
CT CT CAT CT ACCAACG T G G G ATCCAAT ACATATG G CAAG AG G AAT GCAGT AGAGG TTTT AAAGAG AG AGCCACT G AATT ACTT GCCCCTTT AG SEQ ID NO:3
Secuencia de nucleótidos de IAPP humano, que codifica el péptido de amilina de 37 aminoácidos.
AAAT GCAACACT GCCACAT GT GCAACGCAGCGCCT GGCAAATTTTTT AGTT CATT C
CaGCAACAACTTT GGT GCCATT CT CT CAT CT ACCAACGTGGGAT CC AAT ACAT AT
SEQ ID NO:4
Secuencia de nucleótidos de IAPP humano, que codifica un péptido de 89 aminoácidos (péptido señal de 22 aminoácidos proamilina de 67 aminoácidos) y que comprende una mutación A157G (subrayada y en negrita).
AT G G G C AT CCT G AAG CT G C AAG T ATTT CT CATT G TG C T CT CT G TT G CATT G AAC C A T CT G AAAG CT A C A C C C A TT G AAAG T CAT C AG G T GG AAAAG C G G AAAT G C AAC AC T G C C A C A TG TG C A A C G C A G C G C C TG G C A A A TTTTTTA G TTC A TTC C gG C A A C A A C TT TG G TG C C A TT CT CT C AT CT A C C A A C G T G G G ATC C AAT A C A T AT GG CAAG AG G AAT G CAG T A G A G G TTTT AAA G A G A G A G C C AC T G AATT AC TT G C C C C TTT AG SEQ ID NO:5
Secuencia de nucleótidos de IAPP humano, que codifica la proamilina de 67 aminoácidos y que comprende una mutación A91G (subrayada y en negrita).
A C A C C C A T T G A A A G T C A T C A G G T G G A A A A G C G G A A A T G C A A C A C T G C C A C A T GT G C AAC G C A G C G CCT G G C A A A T T T T T T A G T T C A TT C C gG C A A C A A C T T T G G TG C C ATT C TC T C A T C T A C C A A C G T GG G AT CC A A T A C A T AT G G C A A G AG G A A T G C A G T A G A G G TTTT A A A G A G A G A G C C A C T G A A TT A C T T G C C C C TTT AG SEQ ID NO:6
Secuencia de nucleótidos de IAPP humano que codifica el péptido de amilina de 37 aminoácidos y que comprende una mutación A58G (subrayada y en negrita).
A A A T G C A A C A C T G C C A C A T G T G C A A C G C A G C G C C T G G C A A A T T T T T T A G T T C A T T C
C gG C A A C A A C T T T G G T G C C A T T CT CT C AT C T A C C A A C G T G GG A T CC A A T A C A T A T SEQ ID NO:7
Secuencia de aminoácidos de IAPP humano (péptido señal de 22 aminoácidos proamilina de 67 aminoácidos).
G ILK LQ V F L IV L S V A L N H L K A T P IE S H Q V E K R K C N T A T C A T Q R L A N F L V H S S N N F G A IL S S T N V G S N T Y G K R N A V E V L K R E P L N Y L P L
SEQ ID NO:8
Secuencia de aminoácidos de proamilina humana.
P IE S H Q V E K R K C N T A T C A T Q R L A N F L V H S S N N F G A IL S S T N V G S N T Y G K R N A V E V L K R E P L N Y L P L SEQ ID NO:9
Secuencia de aminoácidos de la amilina humana
KC N TATC ATQ RLANFLVHSSNNFG AILSSTNVG SNTY SEQ ID NO:10
Secuencia de aminoácidos de IAPP humano (péptido señal de 22 aminoácidos proamilina de 67 aminoácidos) que comprende la mutación S20G (indicada en negrita).
G IL K L Q V F L IV L S V A L N H L K A T P IE S H Q V E K R K C N T A T C A T Q R L A N F L V H S G N N F G A IL S S T N V G S N T Y G K R N A V E V L K R E P L N Y L P L SEQ ID NO:11
Secuencia de aminoácidos de proamilina humana que comprende la mutación S20G (subrayada en negrita).
P IESHQVEKRKCNTATCATQRLANFLVHSGNNFGAI LSSTNVGSNTYGKRNAVEVLKR EPLNYLPL SEQ ID NO:12
Secuencia de aminoácidos de la amilina humana que comprende la mutación S20G (indicada en negrita) KCNTATCATQRLANFLVHSGNNFGAILSSTNVGSNTY SEQ ID NO:13
Secuencia de nucleótidos de la construcción de direccionamiento de cerdo HIP, la cual comprende el gen mutado de IAPP humano con una mutación S20G. La secuencia de hIAPP se muestra en negrita y la mutación S20G está subrayada.
C C T G C A G G C A G C T G C G C G C T C G C T C G C T C A C T G A G G C C G C C C G G G C A A A G C C C G G G C G T C G G G C G A C C TTT G G T C G C C C G G C C T C AG T G AG C G A G C G A G C G C G C A G A G A G G G A G T G G C C A A C T C C A T C A C T A G G G G T T C C T G C G G C C G C T C T G T A C A G G A CAAG A T AT G AG A G T A T A T AC C AT A A G G TTT CAC AT G AATT C TT A A A A T AC TT AC T CT T AG C A AAG A C AC A G A T AAT G A A G T A C T C C C C A T A C A A A A T A A A T A C A TT GAG A T AA AAT C TA C TG C A TTTT G C C T C A A A TT A C A TA T AT CC AC T G GC AT CT G G A C G TT G AAT G A A G C TT C AT A C C T C TT GT CC A C TTT AT A A TT A A C C T A A A TTT A A C T A A T A TTTT G GT TC C TG T A G A G C T G A A A A T G AAAAC ATTT C T CT AG A G TT C C T A A T AAT C C G C A A A A G GC AAT G TT AT A A TT C TG TA T C AATTT CC A G G G CT ATT G T GAG A G C G C A C T G AAAC A A A A G G T C AT AC A A A C A T A C G G A A T T AAC A T A A A T A A A TTA A C G C A A A T A A A TT C T GA G A T G TT A C A A TT G A A A T G AATT A TTT A A C C T G G TT A T C AC TT CT G AC TT AT C C AT AA T A TTT CT AT G C A G TT A T T CCG G G TG G C T G CGT A A T A TG G T G AC T A TT AAT AC C ATT G A C A T A A A A A G C C T T T T G G TTTT A A C A C C T A A C C C A A T C CT A T C AG T A A A A C TG C T G AAAG CAT AG G A A C C AAG CAG G G G T AT AAG A A C A T G GT A A T C TT CAT GT A T T T AT G CT AAG A G T AAT A G A A T T C C C A C C C TA C A A T AG T CAG AG T A C C T G A A C A G G A A TTT G A TT C C C TT G AG A A T T T AT AAT A T CT G AC A TTT CT CTT A A C A C T C TT G A TT CAAG AT CT C C AAG A A C TT A A C A G A A A T T AAC A TTG G T C ATT CT GT G T G AAAT G T GT AG G A A G T G AAT AT CT ATTTTTTT AATT CAG CAAGTT CCAG GTT ACTT ATT AGTTT ACATT CT AAAT C CTTTTTT AAAAAAATT G G G AAAT AG ATT C AC AAAT ATTTT AAAAAAT AG AAG AC AA AG AT ATTTTT AATT ATT ATTTT CTG G AAT AT ATT CT G AATTT C C AAAG AAAG G ATT GT ACTG G G AAATT C AAC AAGT G AATT C G AG CTCGGTACCCGGGGATCCCC C AAC C AC T CCAAGT G G AG GCT GAG AAAG GTTTT GT AG CTG GGT AGAGT ATGT ACT AAGAG AT G G AG AC AG CTGGCTCT G AG CTCT G AAG C AAG C AC CTCTTATG G AG AGTT G CT G AC CTT C AG GT G C AAAT CT AAG AT ACT AC AG GAG AAT AC AC C AT G G G G CTT CAG C C C A GTTGACTCCCGAGTGGGCTATGGGTTTGTGGAAGGAGAGATAGAAGAGAAGGGA CCTTTCTTCTTGAATTCTGCTTTCCTTCTACCTCTGAGGGTGAGCTGGGGTCTCAG CT G AG GT GAG GACACAG CT AT CAGT G GG AACT GT G AAACAACAGTT CAAG G GACA AAGTTACTAGGTCCCCCAACAACTGCAGCCTCCTGGGGAATGATGTGGAAAAATG CT C AG C C AAG GAC AAAG AAG GCCT CACCCT CT CT GAGACAAT GTCCCCTGCTGTG AACT G GTT C AT CAG G C C AC C CAG GAG C C C CT ATT AAG ACT CT AATT AC C CT AAG G CT AAGT AGAGGT GTT GTT GT CCAAT GAGCACTTT CTGCAGACCT AGCACCAGGCA AGTGTTTGGAAACTGCAGCTTCAGCCCCTCTGGCCATCTGCTGATCCACCCTTAA TG G G AC AAAC AG C AAAGT C C AG G G GT CAG GGGGGGGGTG CTTT G G ACT AT AAAG CTAGTGGGGATTCAGTAACCCCCTCTAAAGCTTGATGGGGCTGAGAACTTCAGGG T G AGTTT G GG G ACC CTT GATT GTT CTTT CTTTTT CG CT ATT GT AAAATT CAT GTT AT ATGGAGGGGG C AAAGTTTT CAG G GTGTT GTTT AG AAT G G G AAG AT GTCCCTTGTA T CACCAT GGACCCT CAT GAT AATTTT GTTT CTTT CACTTT CT ACT CT GTT GACAACC ATT GT CT C CT CTT ATTTT CTTTT CATTTT CTGT AACTTTTT C GTT AAACTTT AGCTT G CATTT GT AACGAATTTTT AAATT CACTTTT GTTT ATTT GT CAGATT GT AAGT ACTTT C T CT AAT CACTTTTTTTT CAAG GC AAT CAG GGT AT ATT AT ATT GT ACTT CAGCACAGT TTT AGAG AACAATT GTT AT AATT AAAT GAT AAG GT AG AAT ATTT CT GCAT AT AAATT C TGGCTGGCGT GGAAAT ATT CTT ATTGGT AG AAAC AACT ACAT CCTGGT CAT CAT CC TG C CTTT CT CTTT ATG GTT AC AAT GAT AT AC ACT GTTT G AG AT GAG GAT AAAAT ACT CT GAGT CCAAACCGGGCCCCT CT GCT AACCAT GTT CATGCCTT CTT CT CTTT CCTA CAG CTCCTGGG C AAC GT GCTGGTTGTTGTGCTGTCT CAT CATTTT G G C AAAG AATT CACCAT GAAGTT CCT ATT CT CT AGAAAGT AT AGGAACTT CGGCATCCTGAAGCTG CAAGTATTTCTCATTGTGCTCTCTGTTGCATTGAACCATCTGAAAGCTACACCCA TTGAAAGTCATCAGGTGGAAAAGCGGAAATGCAACACTGCCACATGTGCAACG CAGCGCCTGGCAAATTTTTTAGTTCATTCCqGCAACAACTTTGGTGCCATTCTCT CATCTACCAACGTGGGATCCAATACATATGGCAAGAGGAATGCAGTAGAGGTTT T AAAG AGAG AGCCACT G AATT ACTT GCCCCTTT AG AAG G G CGAAT AACGT G CTA AAG G G AAC AAAAG CT G GAG CTC C AC C G C G GAT AACTT C GTAT AG CAT ACATT AT A CGAAGTTATCGCGCCCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGG AGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTG GCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGT GGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCC CCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGT CTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGC AGCGGCCAATAGCAGCTTTGGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAG GGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGC CCGAAGGTCCTCCGGAAGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGC CGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCAATATGGG ATCGGCCATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGA GAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGC CGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCT GTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGG CCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAA GGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACC TTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATAC GCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGA G C AC G TACTC G G AT G G AAG CCGGTCTTGT C AAT C AG G AT G AT CTG G AC G AAG AG CATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCC CGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCAT GGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGC G G AT C G CTAT C AG G AC AT AG CGTTGGCTACCCGT G AT ATT G CT G AAG AG CTTG G C GGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCG CAGCGCAT CGCCTT CT AT CGCCTT CTT GACGAGTT CTT CT GAGAT AT CGT CGACG AT AT C AT AACTT C GTAT AG C AT AC ATT AT AC G AAGTT ATT G AATT C CTG C AG C C C G GGGGATCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTT GGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTT TTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAG GGGT CTTT CCCCT CTCGCCAAAGGAAT GCAAGGT CT GTT GAAT GT CGT GAAGGAA GCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCA GGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGT GTAT AAG AT AC AC CTG C AAAG G C G G C AC AAC C C C AGT G C C AC GTTGT G AGTT G G A TAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAA GGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCAC AT G CTTT AC AT GT GTTT AGTCGAGGTT AAAAAAAC GT CTAGGCCCCCC G AAC C AC G G G G AC GT G GTTTT C CTTT G AAAAAC AC G AT G AT AAT ATG G C C AC AG AAGTT C CTA TT CttcaaataGTAT AGGAACTT CACCAT GGTGCACGTGGAT CCAAAAAAGAAGAGAA AG GT AG AT C C AAAAAAG AAG AG AAAG GTAG ATC C AAAAAAG AAG AG AAAG GT ACA CGTGTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCT GGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGG GCGAGGGCGATGC C AC CTAC G G C AAG CT G AC C CT G AAG TT C AT CTG C AC C AC C G GCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGC AGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGC C AT G C C C G AAG GCTACGTC C AG G AG C G C AC C ATCTTCTT C AAG G AC G AC G G CAA CTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCAT C G AG CT G AAG G G C AT C G ACTT C AAG G AG G AC G G C AAC AT C CTG G G G C AC AAG CT G G AGT AC AACT AC AAC AG C C AC AAC GT CTATAT C AT G G C C G AC AAG C AG AAG AAC G G C AT C AAG GT G AACTT C AAG AT C C G C C AC AAC AT C G AG G AC G G C AG C GTG C AG CTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTG CCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAG AAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTC GGCATGGACGAGCT GT ACAAGT AAAGGT CAACGCACCT CT AAAGTT CTT ATT GCTT T AT GT AT AAAT AC CCT AGT GATTT CCTGTAT AATTT AACAGT AC CTTTTT CATTT CT A AAGT GAAT AT GT GAAT CT GT GT GT CCCAT GTTT GCT GCCAGT ACAT GT AAACT GTT GTG CT G AG AATT GTTTT AAATTT AAT ACT AAT C AAG AT C C CTT AAT AAAAAG G C AAA GT CTTT ACAAAT GAAAT ATT CTT CCT GT AGATTTTT ATTT AAAAAAAAAAAAACATTT T AAAAAGT CATTT ATTTTTT CCT GT AT ATTT AT GACCT GAGTTTT CCAACAAAGGAG GAAAT G GTTGTT GG CAACTT G GT AAACT GT AAACAGCT AAT AGT AAAGTT AT G AT G CT G AAC ATT AG AAAAT C AG C AATT ATT AGT AC C CTTG AT AAG C AAT CT CTTTT G C AT T CAATTT AT GAAAT G AGAT AAAAT GTT GTTT AAAAAAAAT AAAG ACT G CTCCT G ACT CAGT C AAAAT ATTTTTT AAAACT CT G GTTTTT GTT GT ACTT G CT G AT ACT AAG AGTTT ACTT AAAAAT AT AAAAC C CAATTT G C GTC C AT G AG GATTT C ACT GT GTTT C AT C AAC AGTG G G CTTTT ATT AAAT G TATATG C CTTTT ATTCT ATTT AAGT G G CTTT C AG C AAA T CTTT GT CAT ATTTTT AT ACAG AGT G CTGT ACCAGC AAGT ACAACAAAAAAG CAAAA AC AAC AAACTTT AT AATTT G GT AAT CTT AAG G C AT ACTT C AT AAG G G G AAATTTTT A TGT ATTT AT ACAT AAAT AC C CT AGT GATTT CCTGTTACTAT G AAACTT ATT C C AAC C AG G AG ACTT G AG AAG G AAAG AAG CT ATT AC CTT G AT AAAAT AG GTATT AAT AGT AG AT ATT ATT CT AAAGTTT ATT CATT AAAATT ATT AT CAAAGT GAAACGT GAACAAAAT C AG AATT ATTT CCT C AGTT G AT ATT CCT AG G C CAGT AG GAAT CT AAGT AT AT G AAC CT TG G G AAT AC G AG ACT G C C ATG G AGT G C C C C AAAT ACTTT C C CTG GTTT CTC AT AAT T ACCTT GT GAAAT AAT AAT GAGCTTTT CTTT ATT G AT AT AACT GGAGAT AGCAACAG T AAGTTTT G GTG G CT AATTT C AT C C C AT CTTTT CT C ATT GTATCT AC C ATG CTT G AA AT CAT AG GT ACCCTT G G AT AAT CTT C CAAAT ACTT AT GT ACAT GCT ACAAATT AT AT TTT ATT G AAGTTTT AGAAACACAAAT GATT CTT CT AT CT CCCAT GTTGCAAT ACAGA GT C AG G AC AAAT AATTT ATT AATT AAT ACTGT GTTT AAAATTT CTAGGGCCCTT AAA AAAAAAG AC AAAG G G AGTT C C CAT C GTG G CT C AG C AG AAAC AAAT C AG ACT G G C A T C CAT G AG G AAG C AG GTTCCATCCCTGG CTTT GCT C AGT G G GTT C AG G AT CTG G C GTTGCTGT G AG CTGTTG GGT AG ATT G CAG ACAT G G CT CAG AT CT G ACATT G CT GT GGCTGTGGTGTAGGCTGGCGGCTACAGCTCTGATTTGACCCCTAGTCTGGGAAT G G C CAT ATG C CAT GGGTGTCGCCCTT AAAAAAAAAG AAAAG AAAAC AACT AG AAAT TCTCCT GAT CATT GT GAGAT GACATT CT GCAAT AAGCCT CAT ACTT CGCT GAGGGG TT GAAT AT CATT ACCT CAT GAAAT AT GCTT AGAT AAAG AAT ACCTTTTGGTT AAGAG T AG AAAAG C CTAT G AGT CT AAAG CTC CTT AG GCT G AGT G C AG AG AG AG CTTTT CAT G C AAAGT AG AAT ATTTT CTTTTT CT AAC CATT ATC C C CT C AC CCTCTGGG C ATTT AC ACCCAGGTT CT ACT CAAAT GCCACATT CTGCAAGGAACTT GT CT GAACTT ACAT AG ATTTTT ATCTAT ATTTT CT G AC AC CAG TTT ATT CAG ACAT G C G G C C G C AG G AAC C C CTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCC GGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAG CGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTAC G CAT CTGTGCGGT ATTT C AC AC CGCATACGT C AAAG C AAC CATAGTACGCGCCCT GTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCT ACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCG CCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTT C C G ATTT AGT G CTTT AC G G C AC CTC G AC C C C AAAAAACTT G ATTT G G GT GAT G GTT C AC GT AGT G G G C CAT C G C C CT GAT AG AC G GTTTTT C G C C CTTT G AC GTT G G AGTC CACGTT CTTTAAT AGTGGACT CTT GTT CCAAACT GGAACAACACT CAACCCT AT CT C G G G CT ATT CTTTT G ATTT AT AAG G G ATTTT G C C G ATTT C G G C CT ATT G GTT AAAAA AT G AG CT G ATTT AAC AAAAATTT AAC G C G AATTTT AAC AAAAT ATT AAC GTTT ACAA TTTT ATG GTG C ACT CT C AGT AC AAT CTG CTCT GAT G C C G CAT AGTT AAG C CAG C C C CGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCA TCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTT CACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTT AT AGGTT AAT GT CAT GAT AAT AAT GGTTT CTT AGACGT CAGGT GGCACTTTT CGGG GAAAT GTG C G C G G AAC C C CT ATTT GTTT ATTTTT CT AAAT ACATT CAAAT ATGTATC CGCT CAT GAGACAAT AACCCT GAT AAATGCTT CAAT AAT ATT GAAAAAGGAAGAGT AT G AGT ATT C AAC ATTT CCGTGTCGCCCTT ATT C C CTTTTTT G C G G C ATTTT G C CTT CCT GTTTTTGCT CACCCAGAAACG CT GGT GAAAGT AAAAGATGCT GAAGAT CAGTT G G GTG C AC GAGTGGGTT AC AT C G AACT G G ATCT C AAC AG C G GT AAG AT C CTT G AG AGTTTT C G C C C C G AAG AAC GTTTT C CAAT GAT G AG C ACTTTT AAAGTT CTG CTATG TGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCAT ACACT ATT CT CAG AAT G ACTT G GTT G AGT ACT CACC AGT CACAG AAAAGC AT CTT A C G GAT G G CAT G AC AGT AAG AG AATT AT G C AGT G CTG C CAT AAC CAT G AGT GAT AA CACTGCGGC C AACTT ACTTCT G AC AAC G ATC G G AG G AC C G AAG G AG CT AAC C G C TTTTTT G C AC AAC AT G G G G G AT CAT GT AACT C G C CTT GAT CGTTGGGAACCG G AG CT GAAT GAAGCCAT ACCAAACGACGAGCGT GACACCACGAT GCCTGT AGCAAT GG CAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAA C AATT AAT AG ACT G G ATG G AG G C G G AT AAAGTT G CAG G AC C ACTT CTGCGCTCGG CCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTC TCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTT ATCT AC AC GACGGGGAGTCAGGCAACTATGGAT G AAC G AAAT AG AC AG AT C G CTG AGAT AG GT GC CT CACT G ATT AAG CATT GGT AACT GT C AG AC CAAGTTT ACT CAT AT AT ACTTT AG ATT G ATTT AAAACTT C ATTTTT AATTT AAAAG GAT CTAG GT GAAGAT C C TTTTT GAT AAT CT CAT GACCAAAAT CCCTT AACGT GAGTTTT CGTTCCACT GAGCGT C AG AC C C C GT AG AAAAG AT C AAAG G ATCTTCTT G AG AT C CTTTTTTT CTGCGCGTA ATCTGCTGCTTG C AAAC AAAAAAAC C AC CGCT AC CAG C G GTG GTTT GTTTGCCGG ATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGAT ACCAAAT ACT GT CCTT CT AGT GT AGCCGT AGTT AGGCCACCACTT CAAGAACT CT G TAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAG TGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAG GCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCG AACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACG CTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAAC AGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCC T GT CGGGTTT CGCCACCT CT GACTT GAGCGT CGATTTTT GT GATGCT CGT CAGGG GGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCC TTTT G CTG G C CTTTT G CT C AC AT GT

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un cerdo transgénico que comprende un gen de polipéptido amiloide de los islotes (IAPP) mutado humano o parte del mismo, y que muestra al menos un fenotipo asociado a la diabetes mellitus tipo 2.
2. El cerdo transgénico según la reivindicación 1, donde dicho gen de IAPP mutado comprende una mutación que resulta en la sustitución de aminoácidos S20G.
3. El cerdo transgénico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho cerdo transgénico no expresa un gen de IAPP de cerdo endógeno.
4. El cerdo transgénico según la reivindicación 3, donde dicho gen de IAPP de cerdo endógeno ha sido desactivado.
5. El cerdo transgénico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho cerdo transgénico es un mini cerdo.
6. El cerdo transgénico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho cerdo transgénico es un cerdo endogámico.
7. El cerdo transgénico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho cerdo transgénico muestra niveles de glucosa más altos, niveles de glucagón más altos, niveles de insulina más bajos y/o niveles de péptido C más bajos, en comparación con un cerdo de control.
8. El cerdo transgénico según la reivindicación 7, donde dicho nivel de glucosa y/o dicho nivel de glucagón aumenta(n) en al menos el 10%, en comparación con un cerdo de control, y donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal.
9. El cerdo transgénico según la reivindicación 7, donde dicho nivel de insulina y/o dicho nivel de péptido C disminuye(n) en al menos el 10%, en comparación con un cerdo de control, y donde dicho cerdo transgénico y dicho cerdo de control reciben una dieta normal.
10. El cerdo transgénico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho al menos un fenotipo es la hiperglucemia y/o la degeneración de células p y/o donde dicho al menos un fenotipo se selecciona de entre el grupo que consiste de ceguera, inflamación, infección y deformación de órganos.
11. Un blastoquiste, un embrión, un feto, una célula donante y/o un núcleo celular transgénicos derivados del cerdo transgénico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
12.Un procedimiento para producir el cerdo transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, comprendiendo dicho procedimiento:
i. producir un ovocito que tiene una zona pelúcida parcialmente modificada,
ii. separar el ovocito en al menos dos partes, obteniendo un ovocito que tiene un núcleo y al menos un citoplasto, iii. producir una célula donante que comprende un gen de IAPP mutado o parte del mismo,
iv. fusionar al menos un citoplasto con la célula donante o el núcleo celular rodeado de membrana,
v. obtener un embrión reconstruido,
vi. activar el embrión reconstruido para formar un embrión, cultivar dicho embrión y
vii. transferir dicho embrión cultivado a un mamífero huésped,
donde el embrión se desarrolla en un cerdo transgénico.
13. El procedimiento según la reivindicación 12, donde dicho procedimiento no involucra una etapa quirúrgica.
14. El uso del cerdo transgénico, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, como un sistema modelo para estudiar la terapia, el tratamiento y/o la prevención de la diabetes mellitus tipo 2.
ES15770441T 2014-08-28 2015-08-28 Modelo de cerdo para la diabetes Active ES2784643T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA201470518 2014-08-28
PCT/DK2015/050253 WO2016029919A1 (en) 2014-08-28 2015-08-28 Pig model for diabetes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2784643T3 true ES2784643T3 (es) 2020-09-29

Family

ID=54196744

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15770441T Active ES2784643T3 (es) 2014-08-28 2015-08-28 Modelo de cerdo para la diabetes

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10729112B2 (es)
EP (1) EP3185678B1 (es)
DK (1) DK3185678T3 (es)
ES (1) ES2784643T3 (es)
WO (1) WO2016029919A1 (es)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11246299B2 (en) 2015-03-04 2022-02-15 Pormedtec Co., Ltd. Disease model pig exhibiting stable phenotype, and production method thereof
US11278013B2 (en) 2019-04-26 2022-03-22 Usher 2020 Foundation Large animal model for developing therapeutic agents to treat impaired ophthalmic function in usher syndrome

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6187991B1 (en) * 1995-05-23 2001-02-13 Pfizer Inc Transgenic animal models for type II diabetes mellitus
JP2007502614A (ja) 2003-08-18 2007-02-15 ベタゲノン・エイビー 新規な２型糖尿病動物モデル
JP2007082454A (ja) * 2005-09-21 2007-04-05 Bios Ikagaku Kenkyusho:Kk 糖尿病発症トランスジェニックブタ及びその作出方法
EP2077329A1 (en) * 2008-01-04 2009-07-08 MWM Biomodels GmbH Transgenic pig with altered incretin function
AR091482A1 (es) * 2012-06-21 2015-02-04 Recombinetics Inc Celulas modificadas geneticamente y metodos par su obtencion
US10183978B2 (en) * 2013-01-27 2019-01-22 Exemplar Genetics, Llc Animal models of duchenne muscular dystrophy

Also Published As

Publication number Publication date
US20170231204A1 (en) 2017-08-17
US10729112B2 (en) 2020-08-04
WO2016029919A1 (en) 2016-03-03
DK3185678T3 (da) 2020-04-27
EP3185678A1 (en) 2017-07-05
EP3185678B1 (en) 2020-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
sang Lee et al. Production of transgenic cloned piglets from genetically transformed fetal fibroblasts selected by green fluorescent protein
US20180084767A1 (en) Animal models for cardiomyopathy
Cho et al. Serial cloning of pigs by somatic cell nuclear transfer: restoration of phenotypic normality during serial cloning
Haueter et al. Genetic vasectomy—Overexpression of Prm1‐EGFP fusion protein in elongating spermatids causes dominant male sterility in mice
Crispo et al. Embryo development, fetal growth and postnatal phenotype of eGFP lambs generated by lentiviral transgenesis
KR102631856B1 (ko) 변형된 cd163 유전자를 갖는 병원균-내성 동물
JP7193509B2 (ja) 上位及び下位運動ニューロン機能並びに知覚の減衰を示す非ヒト動物
Sper et al. Generation of a stable transgenic swine model expressing a porcine histone 2B-eGFP fusion protein for cell tracking and chromosome dynamics studies
JP5817955B2 (ja) 血友病ａモデルブタの作出
ES2784643T3 (es) Modelo de cerdo para la diabetes
US20100122356A1 (en) Pig model for psoriasis
Gong et al. Aberrant expression of imprinted genes and their regulatory network in cloned cattle
Cacioppo et al. Generation and characterization of an endothelin‐2 iCre mouse
WO2005107447A2 (en) Methods for the production of improved live stocks and disease models for therapeutic research
HUT72839A (en) Transgenic animals as a model for metabolic bone diseases
KR101588474B1 (ko) 영장류 동물의 초기 배아에의 외래 유전자 도입법 및 상기 도입법을 포함하는 트랜스제닉 영장류 동물을 작출하는 방법
ES2948817B2 (es) Modelo animal deficiente en factor v
KR20210005074A (ko) 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지 태아를 보호하는 방법
KR101174493B1 (ko) 생쥐 피이에이15 유전자가 과발현된 전임상 당뇨질환 모델 형질전환 돼지 및 그의 생산방법
RU2778405C2 (ru) Способы защиты плодов свиней от инфицирования вирусом
JPH11155420A (ja) トランスジェニック動物
GB2617296A (en) Transgenic animal having modified myostatin gene
Li et al. Associated technologies for genome editing
Chung Disruption of the HMGA2 Gene in Swine Reduces Growth
Quadalti Modelling Leigh Syndrome in pigs.