JP7193509B2 - 上位及び下位運動ニューロン機能並びに知覚の減衰を示す非ヒト動物 - Google Patents
上位及び下位運動ニューロン機能並びに知覚の減衰を示す非ヒト動物 Download PDFInfo
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Description
本願は、米国仮出願シリアル番号第62/133,909号(2015年3月16日出願)及び同第62/250,229号(2015年11月3日出願)の利益を主張し、それらのそれぞれの出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の正式なコピーは、2016年3月16日に作成され、かつ約685キロバイトのサイズを有する、ファイル名「2016-03-16-T0041WO01-SEQ-LIST ST25.txt」のASCII形式の配列表としてEFS-Web経由で電子的に提出され、かつ本明細書と同時に出願される。このASCII形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、かつ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、概ね、時間の経過とともに上位運動ニューロン、下位運動ニューロン、及び/又は知覚の減衰を現す非ヒト動物に関するものであり、この動物は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)のような運動ニューロン疾患など、神経変性疾患に有益なモデルを提供し得る。
ルー・ゲーリック病としても知られる筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、随意運動を担う脊髄、脳幹、及び皮質内の運動ニューロンの破壊がもたらす、致命的な神経変性病である。この疾病は臨床上、進行性筋衰弱及び萎縮症として現れ、発病から3~5年以内に麻痺及び死亡をもたらす。
特定の実施形態において、例えば、以下が提供される:
(項目1)
DR6タンパク質の細胞質ドメイン全体をコードする第1のヌクレオチド配列を欠いている、修飾された内因性DR6遺伝子座をゲノム内に含む、遺伝子組み換えされたげっ歯類。
(項目2)
前記修飾された内因性DR6遺伝子座が、成熟DR6タンパク質全体をコードする、第2のヌクレオチド配列を更に欠いている、項目1に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類。
(項目3)
前記修飾された内因性DR6遺伝子座が、膜貫通ドメイン及びレポータータンパク質のうちの少なくとも1つに操作可能に融合された機能性DR6シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む、項目1又は項目2に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類。
(項目4)
前記核酸配列が、前記膜貫通ドメインに操作可能に融合された前記機能性DR6シグナルペプチドをコードし、かつ、前記膜貫通が前記レポータータンパク質に操作可能に融合されている、項目3に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
(項目5)
前記機能性DR6シグナルペプチドが内因性DR6シグナルペプチドである、項目3又は項目4に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
(項目6)
前記膜貫通ドメインが内因性DR6膜貫通ドメインではない、項目3~5のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
(項目7)
前記膜貫通ドメインがROR1膜貫通ドメインである、項目3~6のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
(項目8)
前記レポータータンパク質がβガラクトシダーゼである、項目3~7のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
(項目9)
前記核酸配列が、内因性DR6転写制御配列に操作可能に連結される、項目3~8のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
(項目10)
前記遺伝子修飾されたげっ歯類が、前記修飾された内因性DR6遺伝子座に関してヘテロ接合型である、項目1~9のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
(項目11)
前記げっ歯類が運動ニューロンの機能障害を示す、項目1~10のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
(項目12)
前記運動ニューロンが上位運動ニューロン又は下位運動ニューロンである、項目11に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
(項目13)
前記げっ歯類が4週齢を超えるまで、前記運動ニューロンの機能障害が、盲検化主観的スコアリングアッセイ、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、及び体重測定において現れない、項目12に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
(項目14)
前記げっ歯類が、対照げっ歯類と比較して侵害受容の減少を示す、項目1~13のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
(項目15)
前記げっ歯類がラット又はマウスである、項目1に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
(項目16)
前記げっ歯類が、成熟したDR6タンパク質全体をコードする第1のヌクレオチド配列を欠いている、修飾された内因性DR6遺伝子座を含むマウスであり、
前記内因性マウスDR6遺伝子座が、少なくとも1つの内因性DR6転写制御配列に操作可能に連結され、β-ガラクトシダーゼに操作可能に融合されたROR1膜貫通ドメインに、操作可能に融合された内因性DR6シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む、項目15に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
(項目17)
前記マウスが、129系統、C57BL/6系統、及び混合型C57BL/6×129系統からなる群から選択される系統由来であり、前記マウスが、8~20週齢の間に対照野生型動物と比較して体重増加の低下を示す、項目16に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類。
(項目18)
項目1~17のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類由来の細胞又は組織。
(項目19)
前記細胞が運動ニューロン又は胚幹細胞である、項目18に記載の細胞又は組織。
(項目20)
項目1に記載の遺伝子修飾されたげっ歯類を作製する方法であって、前記げっ歯類の内因性DR6遺伝子座から、DR6細胞質ドメイン全体をコードする第1の内因性ヌクレオチド配列を欠失させる工程を含む、方法。
(項目21)
前記欠失させる工程が、全長かつ内因性の成熟したDR6タンパク質をコードする第2の内因性ヌクレオチド配列を、膜貫通ドメイン及び/又はレポーター遺伝子をコードする核酸配列に置き換えることを含み、前記核酸が、内因性DR6転写制御配列及びシグナルペプチド配列と操作可能に連結する、項目20に記載の方法。
(項目22)
対照運動ニューロン細胞と比較して酸化的ストレスの増加を示す、運動ニューロンの集団を作製する方法であって、項目1~17のいずれか一項に記載の前記げっ歯類から単離された内部細胞塊の胚幹細胞から胚様体を確立することと、前記胚様体を前記運動ニューロンの集団に分化させることと、を含む、方法。
(項目23)
運動ニューロン機能障害を調節するための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、
(a)そのゲノム内に、DR6細胞質ドメイン全体をコードする第1のヌクレオチド配列を欠いている、修飾された内因性DR6遺伝子座を含むげっ歯類に、候補薬剤を投与することであって、前記げっ歯類が運動ニューロン機能障害を発現する、ことと、
(b)試験対照げっ歯類と比較して、前記げっ歯類における前記運動ニューロン機能障害の少なくとも1つの症状に対する、前記候補薬剤の何らかの調節効果を決定することと、を含み、
前記試験対照げっ歯類と比較して、前記げっ歯類における前記運動ニューロン機能障害の前記少なくとも1つの症状に対する調節効果の存在が、前記候補薬剤が運動ニューロン機能障害を調節するのに有益であることを示す、方法。
(項目24)
前記修飾された内因性DR6遺伝子座が、成熟した内因性DR6タンパク質全体をコードする第2のヌクレオチド配列を更に欠いている、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記修飾された内因性DR6遺伝子座が、膜貫通ドメイン及びレポータータンパク質のうちの少なくとも1つに操作可能に融合された機能性DR6シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む、項目23又は項目24に記載の方法。
(項目26)
前記薬剤が、盲検化主観的ALS-TDI神経学的スコアリング、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、体重測定、又は疼痛刺激に反応するまでの潜時の決定による、前記症状の検知の前に投与される、項目23~25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記薬剤が、盲検化主観的ALS-TDI神経学的スコアリング、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、体重測定、又は疼痛刺激に反応するまでの潜時の決定のうちの1つ又は2つ以上による、前記症状の検知の後に投与される、項目23~26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記薬剤が2回以上の異なる時点で投与される、項目23~27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記少なくとも1つの症状が、前記げっ歯類と同一の系統を有するが、そのゲノム内に前記核酸を含まない対照げっ歯類と比較した、後弯症、異常後肢クラスピング、運動調整欠失、運動学習能力欠失、体重減少、及び知覚欠失から選択される、項目23~28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記少なくとも1つの症状が上位運動ニューロン機能障害の結果である、項目23~29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記少なくとも1つの症状が、振戦、痙性麻痺(硬直)、異常反射、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記少なくとも1つの症状が下位運動ニューロン機能障害の結果である、項目23~29のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記少なくとも1つの症状が、筋力低下及び衰弱、線維束性収縮、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記運動ニューロン機能障害の少なくとも1つの症状が、体重増加の低下である、項目23~33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記運動ニューロン機能障害の少なくとも1つの症状が、侵害受容の減少である、項目23~34のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
前記げっ歯類が、成熟したDR6タンパク質全体をコードする第1のヌクレオチド配列を欠いている、修飾された内因性DR6遺伝子座を含むマウスであり、
前記内因性マウスDR6遺伝子座が、少なくとも1つの内因性DR6転写制御配列に操作可能に連結され、β-ガラクトシダーゼに操作可能に融合されたROR1膜貫通ドメインに、操作可能に融合された内因性DR6シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む、項目23~35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記マウスが、129系統、C57BL/6系統、及び混合型C57BL/6×129系統からなる群から選択される系統由来のマウスである、項目36に記載の方法。
(項目38)
運動ニューロンにおける酸化的ストレスを軽減するための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、
(a)薬剤の存在下又は非存在下で、項目1に記載のげっ歯類由来の運動ニューロンを培養することと、
(b)前記薬剤が、前記げっ歯類由来であるが、前記薬剤非存在下で培養された対照運動ニューロンと比較したときに、前記運動ニューロンにおける酸化的ストレスを防止、抑制、及び/又は軽減するかどうかを決定することと、を含み、前記運動ニューロンにおける酸化的ストレスの防止、抑制、及び/又は軽減が、運動ニューロンにおける酸化的ストレスを軽減するための候補薬剤を示す、方法。
(項目39)
操作可能に連結され、5’から3’へ、DR6シグナルペプチドをコードする第1の核酸配列、膜貫通ドメインをコードする第2の核酸、レポーター遺伝子をコードする第3の核酸、及び/又は薬剤選択カセットをコードする第4の核酸を含む、核酸。
(項目40)
前記第1の核酸配列が、配列番号6に記述され、前記第2の核酸配列が配列番号7に記述され、前記第3の核酸配列が配列番号8に記述され、かつ/又は前記第4の核酸が配列番号3に記述される、項目39に記載の核酸配列。
(項目41)
第1の標的化アーム及び第2の標的化アームを更に含み、前記第1の標的化アームが前記第1、第2、及び/又は第3の核酸配列の5’であり、そこに操作可能に連結しており、前記第2の標的化アームが前記第1、第2、及び/又は第3の核酸配列の3’であり、そこに操作可能に連結しており、前記第1及び第2の標的化アームが、少なくとも1つの内因性非ヒト動物制御要素に操作可能に連結する、内因性非ヒト動物DR6遺伝子座への挿入用として前記核酸を標的化するものである、項目39又は項目40に記載の核酸。
(項目42)
前記非ヒト動物がげっ歯類である、項目41に記載の核酸。
(項目43)
前記げっ歯類がマウスである、項目42に記載の核酸配列。
(項目44)
前記核酸が配列番号5又は配列番号17に記述された配列を含む、項目43に記載の核酸配列。
(項目45)
項目39~44のいずれか一項に記載の前記核酸を含む、げっ歯類細胞。
(項目46)
前記げっ歯類細胞が胚幹細胞である、項目45に記載のげっ歯類細胞。
ルー・ゲーリック病とも呼ばれる筋萎縮性側索硬化症(「ALS」)は、毎年新しい症例が5,000件発生し、20,000人ものアメリカ人に影響を及ぼしている進行性の致命的な神経疾患である。この疾患は、運動ニューロン疾患として知られる疾患の分類に属する。随意運動を制御する脳及び脊髄内の特定の神経細胞が次第に縮退すると、ALSを発症する。脳及び脊髄の両方が、体内の筋へのメッセージを生み、送り届ける能力を失う。機能できない筋は、次第に萎縮し、単収縮を起こす。
用語「胚幹細胞」又は「ES細胞」は、胚内への導入後に発達中の胚の任意の組織に寄与することが可能である胚由来全能性又は多能性細胞を含む。用語「多能性細胞」には、複数の分化細胞のタイプへと発達する能力を有する未分化細胞が含まれる。
内因性DR6細胞質ドメインのいずれかの部分をコードするヌクレオチド配列を欠いている修飾されたDR6遺伝子座を含み、DR6シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、及び/又はレポータータンパク質をコードする核酸配列を更に含み得る、非ヒト動物、細胞、組織、及び胚が提供される。DR6発現を操作するための方法及び組成物が提供される。DR6を修飾することを目的とした標的組成物も提供される。DR6機能の調節に関連付けられた、運動ニューロン機能障害、例えばALSに似た表現型を示す、非ヒト動物、細胞、及び組織が提供される。以下の説明は、ある特定のDR6の調査に関連しているが、方法及び組成物は任意のDR6を用いて実施され得る。
非限定的な例として、欠失開始点は、挿入核酸が、内因性シグナル配列に操作可能に連結されることを可能にするように、第2のエキソンに設定され得る。図1は、DR6をコードする配列のすべて又はほとんどの標的欠失と、ROR1(受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1)遺伝子からの膜貫通ドメイン配列を含むカセット、β-ガラクトシダーゼをコードするE.coli lacZ遺伝子からの配列、及びG418耐性ES細胞コロニーの選択のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼを発現するカセット(neor)との置換と、の例を示す。表現型分析の前にCre媒介切除を可能にするLoxPリコンビナーゼ認識部位は、薬剤選択カセットに隣接する。
本明細書の別の個所に記載されるように、DR6遺伝子座の遺伝子修飾は、DR6遺伝子座又はその一部分を挿入核酸と置換すること、又はそこに挿入/付加することを含み得る。いくつかの場合、挿入核酸は、レポーター遺伝子を含む。一実施形態では、レポーター遺伝子は、内因性DR6プロモーターと操作可能に連結するDR6遺伝子座内に位置付けられる。このような修飾は、内因性DR6プロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子の発現を可能にする。あるいは、レポーター遺伝子は、内因性DR6プロモーターと操作可能に連結して配置されない。
内因性DR6遺伝子座の遺伝子修飾は、本明細書に提供される非ヒト動物における様々な表現型をもたらし得る。一実施形態では、内因性DR6遺伝子座の遺伝子修飾は、出生時に相対的に正常であるが、加齢時、例えば、生後1週間、生後2週間、生後3週間、生後4週間、生後5週間、生後6週間、生後7週間、生後8週間などでALSに似た症状を現す、非ヒト動物をもたらす。別の実施形態では、内因性DR6遺伝子座の遺伝子修飾は、1つ又は2つ以上の細胞型、例えば、ニューロン及び/若しくは膠細胞、並びに/又はその一部分、例えばミエリンの異常な機能をもたらす。ニューロンは、感覚ニューロン、運動ニューロン、及び介在ニューロンと一般に称されるその他すべてのニューロン型を含む。膠細胞は、星状膠細胞、乏突起神経膠細胞などを含む。
非ヒト動物、細胞、組織、又は胚内の内因性DR6遺伝子座を遺伝子修飾する方法を本明細書に提供する。一実施形態において、多能性細胞中のDR6遺伝子座を修飾するための方法が提供される。かかる方法は、(a)多能性細胞に、DR6遺伝子座で相同組み換えを起こし得る、5’及び3’ホモロジーアームに隣接する挿入核酸を含む標的化構築物を導入することと、(b)DR6遺伝子座で標的化された遺伝子修飾を含む、修飾された多能性細胞を同定することと、を含む。かかる方法では、遺伝子修飾は、DR6の機能欠失をもたらす。一実施形態では、多能性細胞はげっ歯類胚幹細胞である。別の実施形態では、多能性細胞はヒト線iPS細胞である。
本明細書には、本明細書に提供される遺伝子修飾された非ヒト動物、細胞、組織、又は胚を作製する方法に採用される、標的化ベクター又は標的化構築物が更に提供される。
「挿入核酸」又は「挿入ポリヌクレオチド」は、標的遺伝子座に組み込まれることが所望されるDNAのセグメントを含む。一実施形態では、挿入核酸は、対象となる1つ又は2つ以上のポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、挿入核酸は、1つ又は2つ以上の発現カセットを含むことができる。所与の発現カセットは、発現に影響を及ぼす様々な制御成分とともに、対象となるポリヌクレオチド、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、及び/又はレポーター遺伝子を含むことができる。
本明細書には、DR6遺伝子を標的化するための、本明細書に提供される標的ゲノム組み込み系に採用される様々な構成要素を含む、ポリヌクレオチド又は核酸分子が提供される(すなわち、ヌクレアーゼ剤、認識部位、挿入核酸、対象となるポリヌクレオチド、レポーター配列、標的化ベクター、選択マーカー、及びその他の構成要素)。
標的化ベクターは、真核、非ヒト、哺乳類、非ヒト哺乳類、ヒト、げっ歯類、マウス、ラット、又はハムスター核酸のDR6遺伝子座に、挿入核酸を導入するために採用される。標的化ベクターは、挿入核酸を含み、挿入核酸に隣接する5’及び3’ホモロジーアームを更に含む。挿入核酸に隣接するホモロジーアームは、真核、非ヒト、哺乳類、非ヒト哺乳類、ヒト、げっ歯類、マウス、ラット、又はハムスター核酸の標的DR6遺伝子座内の領域に対応する。参照を容易にするために、標的化されたゲノム遺伝子座内の対応する同系ゲノム領域は、「標的部位」と称される。例えば、標的化ベクターは、第1及び第2標的部位に相補的な第1及び第2ホモロジーアームに隣接する第1の挿入核酸を含み得る。したがって、それにより、標的化ベクターは、細胞のゲノム内のホモロジーアームと相補的標的部位との間で生じる相同組み換え事象を通じて、標的遺伝子核酸への挿入核酸の組み込みを補助する。
用語「大型標的化ベクター」又は「LTVEC」は、細胞中で相同標的化を実施するよう意図される他のアプローチによって典型的に使用されるものよりも大きい核酸配列に対応し、かつそれら由来である、及び/又は細胞中で相同組み換え標的化を実施するよう意図される他のアプローチによって典型的に使用されるものよりも大きい核酸配列を含む挿入ポリヌクレオチドを含む、ホモロジーアームを含む、大型標的化ベクターを含む。特定の実施形態では、LTVECのホモロジーアーム及び/又は挿入ポリヌクレオチドは、真核細胞のゲノム配列を含む。LTVECのサイズは、従来のアッセイ(例えばサザンブロッティング及びロングレンジ(例えば1kb~5kb)PCR)によるターゲッティングイベントのスクリーニングを行うにはあまりに大きい。LTVECの例としては、細菌人工染色体(BAC)、ヒト人工染色体、又は酵母人工染色体(YAC)由来のベクターが挙げられるがこれらに限定されない。LTVEC及びそれらを作製するための方法の非限定的な例は、例えば、米国特許第6,586,251号、同第6,596,541号、同第7,105,348号、及び国際公開第2002/036789号(PCT/US01/45375)に記載され、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
上記で概説したように、本明細書には、DR6遺伝子座の標的化された遺伝子修飾を可能にする方法及び組成物が提供される。付加的な標的化された遺伝子修飾が作製され得ることが、更に認識される。これらの標的化された遺伝子修飾を可能にするそのような系は、様々な構成成分を採用することができ、参照を容易にするために、本明細書において、用語「標的化されたゲノム組み込み系」は、一般的に、組み込み事象のために必要とされるすべての構成成分を含む(すなわち、様々なヌクレアーゼ剤、認識部位、挿入DNAポリヌクレオチド、標的化ベクター、標的ゲノム遺伝子座、及び対象となるポリヌクレオチド)。
本明細書に記載される様々な方法は、細胞中のDR6遺伝子座を修飾するためのゲノム遺伝子座標的化系を採用する。そのような細胞としては、大腸菌を含む細菌細胞などの原核細胞、又は酵母、昆虫、両生類、植物などの真核細胞、又はマウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、シカ細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、トリ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、フェレット細胞、霊長類(例えば、マーモセット、アカゲザル)細胞などが挙げられるがこれらに限定されない哺乳類細胞、及び家畜哺乳動物からの細胞、若しくは農業用哺乳動物からの細胞が挙げられる。いくつかの細胞は、非ヒト、特に、非ヒト哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、好適な遺伝学的に修飾可能な多能性細胞が容易に入手可能ではない哺乳動物に対して、例えば、Oct3/4、Sox2、KLF4、Myc、Nanog、LIN28、及びGlis1が挙げられるがこれらに限定されない、多能性誘導因子の組み合わせの体細胞への導入を介して、体細胞を多能性細胞に再プログラミングするために、他の方法が採用される。そのような方法では、細胞はまた、哺乳類細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、非ヒト細胞、げっ歯類、ラット、マウス、ハムスターからの細胞、線維芽細胞、又は任意の他の宿主細胞であってもよい。他の実施形態では、細胞は、多能性細胞、人工多能性幹(iPS)細胞、非ヒト胚性幹(ES)細胞である。そのような細胞としては、例えば、人工多能性幹(iPS)細胞を含む多能性細胞、ヒトiPS細胞、マウス胚性幹(ES)細胞、ラット胚性幹(ES)細胞、ヒト胚(ES)細胞、又は発達制限されたヒト前駆細胞、げっ歯類胚性幹(ES)細胞、マウス胚性幹(ES)細胞、若しくはラット胚性幹(ES)細胞が挙げられる。
本明細書には、ALSを治療、防止、及び/又は抑制するための候補薬剤を同定する方法も提供される。特異的な実施形態では、物質の抑制性効果は、DR6機能欠失を有し、出生時は表現型的に正常であり、生後8週間でALSに似た症状を現す動物に薬剤を投与することによって、生体内で決定される。
前述のように、マウスにおけるカスタム遺伝子突然変異の高速及び高スループットの生成を可能にする、VelociGene(登録商標)方法が採用された(Valenzuela,D.M.,et al.(2003b),Nat Biotechnol 21:652~659)。端的には、大型標的化ベクター(LTVEC)が、マウスbMQ(129S7/SvEv Brd-Hprt b-m2)又はRP23 BACライブラリー(Adams,D.J.,et al.(2005),Genomics 86:753~758)からのBACクローンを使用して生成された。lacZ/neorレポーター/選択カセット(図1)は、lacZ部分のβ-ガラクトシダーゼコード配列のアミノ末端部が、ROR1からの膜貫通ドメインを含むように修飾された点を除き、NIH KOMP(ワールドワイドウェブ(www)上のインターネットを介し、URL「www.velocigene.com/komp/detail/10020」で入手可能な配列)に使用されるZEN-Ub1カセットと同一であった。
N2F1マウスの表現型に関する試験を、6~8週齢で開始した。時限交配のため、膣栓の同定の朝を胎生0.5日目(E0.5)として割り当てた。DR6 KO及び野生型同腹子を、出生から、調査のために21~23℃(69~74F)及び湿度40~60%の中で1日12時間照明下で飼育したとき、約6~8週齢までに、様々な発達マイルストーン(ラント、ブリーシング、貌面及び肢部の異常、皮膚の色、姿勢、立ち直り、並びにアイ開口率)を観察した。すべての実験が6~9週齢で開始され、すべての動物処置が、Regeneron Pharmaceuticals Institutional Animal Care and Use Committeeに承認されたプロトコルに準拠して行われた。
約20週齢の8匹の野生型及び8匹のDR6ノックアウトマウスを、50mLの食塩水で、次いで、pH6.5のアセテートバッファ中4%のパラホルムアルデヒド(PFA)溶液50mLと、pH9.5のホウ酸バッファ中4%のPFA50mLとで灌流した。動物の灌流後、マウスの脳及び脊髄を採取し、それらが脱落するまで、ホウ酸バッファ中15%、次いで30%のスクロース溶液に入れた。その後、組織をOCTに埋め込み、2-メチルブタンを使用して凍結させた。
総mRNAを、約20週齢の10匹の野生型マウス及び7匹のDR6ノックアウトマウスの脳及び脊髄から採取した。次に、Taqman(登録商標)を使用したRT-PCRをこれらのmRNA試料に対して実施した。次に、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、神経成長因子受容体(NGFR)、コリンアセチルトランスフェラーゼ(Chat)、Mnxホメオボックス、NMDA型グルタミン酸受容体サブユニット3B(Grin3b)、及びグルタミン酸受容体2(Gria2)遺伝子を、試料中のβアクチンの発現によって正常化した。
遺伝子プロファイリングを、10週齢の野生型マウス(n=5匹の雄)、症状が出る前の10週齢のDR6-/-マウス(n=5匹の雄)、20週齢の野生型マウス(n=6匹の雄及び3匹の雌)、及び症状を示す20週齢のDR6-/-マウス(n=6匹の雄及び3匹の雌)の脳及び脊髄組織から抽出したRNAを用いて実施した。
CD3、B220、CD21及びCD2に対する抗体(すべて、BD Biosciences San Jose,CA又はeBioscience San Diego,CAから入手)を使用するフローサイトメトリー分析により、10及び20週齢の野生型マウス並びにDR-/-マウスから血液、骨髄、胸腺、及び脾臓組織を単離して表現型を求めた。また、20週齢の野生型マウス及びDR6-/-マウスから単離した血清中のサイトカイン及びケモカイン濃度を、Luminex Mouse Cytokine Magnetic 20-Plex Panelを用いて、FGF基準、GM--CSF、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-12(p40/p70)、IL-17、IP-10、KC、MCP-1、MIG、MIP-1α、TNF-α、及びVEGFの同時定量的測定の目的で評価した。
野生型(DR6+/+)又はヘテロ接合DR6+/-動物から内部細胞塊の胚幹細胞を単離し、胚幹細胞培地(ESM;DMEM+15%ウシ胎児血清+ペニシリン/ストレプトマイシン+グルタミン+非必須アミノ酸+ヌクレオシド+β-メルカプトエタノール+ピルビン酸ナトリウム+LIF)中で2日間培養し、胚様体(EB)の形成を可能にした。EBを分化培地(DM:Advanced DMEM/F12+Neurobasal培地+10%ノックアウト血清+ペニシリン/ストレプトマイシン+グルタミン+β-メルカプトエタノール)中で2日間培養し、DM及びレチノイン酸及びスムーズンドアゴニスト中で更に5日間培養して、運動ニューロンを得た。分離された運動ニューロンは、胚幹細胞由来の運動ニューロン培地(ESMIN;Neurobasal媒体+2%ウマ血清+B27+グルタミン+ペニシリン/ストレプトマイシン+β-メルカプトエタノール+10ng/mL GDNF、BDNF、CNTF)でめっきし、成熟させて、安定した運動ニューロン系を確立した。7日目に運動ニューロン数を決定し、安定した運動ニューロン系の確立から1日目及び7日目に酸化的ストレスを測定した。
対照動物の運動機能と、実施例1に記載されているようなDR6遺伝子修飾用のヘテロ接合マウス又はホモ接合マウスと、を、実施例2に記載されているような試験を用いて比較した。神経学的スコアは、図17Aで比較され、体重増加比較は図17Bに示され、ロータロッド試験比較は図17Cに示され、オープンフィールド測定は図17D~17Kに提供され、キャットウォーク測定は図17L~17Zに示されている。
20週齢のDR6遺伝子修飾の対照動物、及びマウスのヘテロ接合体又はホモ接合体の温痛覚を、48℃、52℃、又は55℃に維持した金属面上に動物を配置することによって試験した(IITC、Woodland Hills,CA)。温熱刺激に反応するまでの潜時(動物が後足をなめる又は(of)はじくまでに経過した時間として定義されている)を測定した。マウスが2つの侵害防御行動、後足をなめる行動又は後足を振る行動のいずれかを取るまで、マウスはプレート上に残された。
Claims (37)
- (i)全内因性DR6コード領域の、(ii)機能的DR6シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよびレポータータンパク質をコードする核酸配列を含む異種核酸での置換を含む、修飾された内因性DR6遺伝子座をゲノム内に含む、遺伝子組み換えされたげっ歯類であって、
前記機能的DR6シグナルペプチドが前記膜貫通ドメインに操作可能に融合され、
前記膜貫通ドメインが前記レポータータンパク質に操作可能に融合され、
前記核酸が内因性DR6転写調節配列に操作可能に連結され、
前記げっ歯類は、前記修飾された内因性DR6遺伝子座から内因性DR6ポリペプチドを発現せず、
前記げっ歯類は、前記修飾された内因性DR6遺伝子座から前記異種核酸を発現し、
前記げっ歯類は、
前記げっ歯類と同一の系統を有するが、前記修飾された内因性DR6遺伝子座を含まない対照げっ歯類と比較した(a)運動ニューロンの機能障害、及び/又は(b)侵害受容の減少、
を現す、げっ歯類。 - 対照げっ歯類と比較した運動ニューロンの機能障害及び/又は侵害受容の減少が、出生時には明らかでなく、8週齢以降に現れる、請求項1に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類。
- (a)前記機能的DR6シグナルペプチドがげっ歯類DR6シグナルペプチドである;
(b)前記膜貫通ドメインが内因性DR6膜貫通ドメインでない;
(c)前記膜貫通ドメインがROR1膜貫通ドメインである;及び/又は
(d)前記レポータータンパク質がβ-ガラクトシダーゼである、
請求項1に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類。 - 前記遺伝子組み換えされたげっ歯類が、前記修飾された内因性DR6遺伝子座について
ヘテロ接合型である、
請求項1~3のいずれか一項に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類。 - 前記げっ歯類が運動ニューロンの機能障害を示す場合、前記運動ニューロンが上位運動ニューロン又は下位運動ニューロンである、請求項1~4のいずれか一項に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類。
- 前記げっ歯類が4週齢を超えるまで、前記運動ニューロンの機能障害が、盲検化主観的神経学的スコアリングアッセイ、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、及び体重測定において現れない、請求項5に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類。
- 前記げっ歯類がラット又はマウスである、請求項1~6のいずれか一項に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類。
- 前記げっ歯類がマウスであり、そして、前記内因性マウスDR6遺伝子座が、少なくとも1つの内因性DR6転写調節配列に操作可能に連結された前記核酸配列を含み、前記核酸配列が、β-ガラクトシダーゼに操作可能に融合されたROR1膜貫通ドメインに操作可能に融合されたマウスDR6シグナルペプチドをコードする、請求項7に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類。
- 請求項1~8のいずれか一項に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類由来の細胞又は組織。
- 前記細胞が運動ニューロンまたは胚幹細胞である、請求項9に記載の細胞又は組織。
- (i)全内因性DR6コード領域の、(ii)機能的DR6シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよびレポータータンパク質をコードする核酸配列を含む異種核酸での置換を含む、修飾された内因性DR6遺伝子座をゲノム内に含む、遺伝子組み換えされたげっ歯類細胞であって、
前記核酸が内因性DR6プロモーターに操作可能に連結され、
前記修飾された内因性DR6遺伝子座が内因性DR6ポリペプチドをコードしない、げっ歯類細胞。 - (a)前記機能的DR6シグナルペプチドがげっ歯類DR6シグナルペプチドである;
(b)前記膜貫通ドメインが内因性DR6膜貫通ドメインでない;
(c)前記膜貫通ドメインがROR1膜貫通ドメインである;及び/又は
(d)前記レポータータンパク質がβ-ガラクトシダーゼである、
請求項11に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類細胞。 - 前記遺伝子組み換えされたげっ歯類細胞が、前記修飾された内因性DR6遺伝子座についてヘテロ接合型である、
請求項11または請求項12に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類細胞。 - 前記遺伝子組み換えされたげっ歯類細胞が遺伝子組み換えされたラット細胞又は遺伝子組み換えされたマウス細胞である、請求項11~13のいずれか一項に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類細胞。
- 前記遺伝子組み換えされたげっ歯類細胞が遺伝子組み換えされたマウス細胞であり、そして、前記内因性マウスDR6遺伝子座が、少なくとも1つの内因性DR6転写調節配列に操作可能に連結された前記核酸配列を含み、前記核酸配列が、β-ガラクトシダーゼに操作可能に融合されたROR1膜貫通ドメインに操作可能に融合されたマウスDR6シグナルペプチドをコードする、請求項14に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類細胞。
- 前記核酸配列が配列番号17に示される、請求項11~15のいずれか一項に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類細胞。
- 前記遺伝子組み換えされたげっ歯類細胞が胚幹細胞である、請求項11~16のいずれか一項に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類細胞。
- 前記遺伝子組み換えされたげっ歯類細胞が内部細胞塊の胚幹細胞である、請求項11~17のいずれか一項に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類細胞。
- 前記遺伝子組み換えされたげっ歯類細胞が運動ニューロンである、請求項11~16のいずれか一項に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類細胞。
- 請求項18に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類の内部細胞塊の胚幹細胞から発生した、げっ歯類胚葉体。
- 請求項20に記載のげっ歯類胚葉体から分化されたげっ歯類運動ニューロン。
- 請求項1に記載の遺伝子組み換えされたげっ歯類を作製する方法であって、
内因性DR6遺伝子座において、全長の内因性成熟DR6タンパク質をコードする内因性ヌクレオチド配列を、膜貫通ドメインおよびレポータータンパク質をコードする核酸配列を含む核酸によって置換する工程を含み、前記膜貫通ドメインが前記レポータータンパク質に操作可能に連結され、前記核酸が、内因性DR6転写調節及びシグナルペプチド配列と操作可能に連結されており、前記内因性DR6遺伝子座によってコードされるいかなるポリペプチドも、機能的DR6細胞質ドメインを欠く、方法。 - 対照運動ニューロンと比較して酸化的ストレスの増加を示す、運動ニューロンの集団を作製する方法であって、内部細胞塊の胚幹細胞から胚様体を確立することと、前記胚様体を前記運動ニューロンの集団に分化させることと、を含み、
前記内部細胞塊の胚幹細胞が、(i)全内因性DR6コード領域の、(ii)機能的DR6シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよびレポータータンパク質をコードする核酸配列を含む異種核酸での置換を含む、修飾された内因性DR6遺伝子座をゲノム内に含み、
前記核酸配列が内因性DR6プロモーターに操作可能に連結されており、
前記修飾された内因性DR6遺伝子座は、内因性DR6ポリペプチドをコードせず、
前記対照運動ニューロンは、対照げっ歯類由来のものであり、前記対照げっ歯類は、このげっ歯類と同一の系統を有するが前記修飾された内因性DR6遺伝子座を含まないものである、方法。 - 運動ニューロン機能障害を調節するための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、
(a)請求項1~8のいずれか一項に記載のげっ歯類又は請求項22に記載の方法に従って作製されたげっ歯類に、候補薬剤を投与することと、
(b)請求項1~8のいずれか一項に記載のげっ歯類又は請求項22に記載の方法に従って作製されたげっ歯類であって、前記候補薬剤を投与されていない試験対照げっ歯類と比較して、前記げっ歯類における前記運動ニューロン機能障害の少なくとも1つの症状に対する、前記候補薬剤の何らかの調節効果を決定することと、を含み、
前記試験対照げっ歯類と比較して、前記げっ歯類における前記運動ニューロン機能障害の前記少なくとも1つの症状に対する調節効果の存在が、前記候補薬剤が運動ニューロン機能障害を調節するのに有益であることを示す、方法。 - (a)前記薬剤が、盲検化主観的ALS-TDI神経学的スコアリング、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、体重測定、又は疼痛刺激に反応するまでの潜時の決定による、前記症状の検知の前に投与される、
(b)前記薬剤が、盲検化主観的ALS-TDI神経学的スコアリング、ロータロッド試験、キャットウォーク試験、オープンフィールド試験、体重測定、又は疼痛刺激に反応するまでの潜時の決定のうちの1つ又は2つ以上による、前記症状の検知の後に投与される、
(c)前記薬剤が2回以上の異なる時点で投与される、
(d)前記少なくとも1つの症状が、前記試験対照げっ歯類と比較した、後弯症、異常後肢クラスピング、運動調整欠失、運動学習能力欠失、体重減少、及び知覚欠失から選択される、
(e)前記少なくとも1つの症状が上位運動ニューロン機能障害の結果である、
(f)前記少なくとも1つの症状が下位運動ニューロン機能障害の結果である、
(g)前記運動ニューロン機能障害の少なくとも1つの症状が、体重増加の低下である、及び/又は
(h)前記運動ニューロン機能障害の少なくとも1つの症状が、侵害受容の減少である、
請求項24に記載の方法。 - (e)の前記少なくとも1つの症状が、振戦、痙性麻痺(硬直)、異常反射、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
- (f)の前記少なくとも1つの症状が、筋力低下及び衰弱、線維束性収縮、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
- 操作可能に連結され、5’から3’へ、DR6シグナルペプチドをコードする第1の核酸配列、膜貫通ドメインをコードする第2の核酸配列、及び、レポータータンパク質をコードする第3の核酸配列を含む、核酸であって、前記核酸は、成熟DR6ポリペプチドをコードしない、核酸。
- 前記核酸が、薬剤選択カセットをコードする第4の核酸配列を含む、請求項28に記載の核酸。
- 前記第4の核酸配列が配列番号3に記述される、請求項29に記載の核酸。
- (a)前記第1の核酸配列が、配列番号6に記述され、前記第2の核酸配列が配列番号7に記述され、かつ/又は前記第3の核酸配列が配列番号8に記述される;及び/又は
(b)第1の標的化アーム及び第2の標的化アームを更に含み、前記第1の標的化アームが前記第1、第2、及び/又は第3の核酸配列の5’側にあり、そこに操作可能に連結しており、前記第2の標的化アームが前記第1、第2、及び/又は第3の核酸配列の3’側にあり、そこに操作可能に連結しており、前記第1及び第2の標的化アームが、少なくとも1つの内因性非ヒト動物制御要素に操作可能に連結する、内因性非ヒト動物DR6遺伝子座への挿入用として前記核酸を標的化するものである、
請求項28~30のいずれか一項に記載の核酸。 - (a)前記非ヒト動物がげっ歯類である;又は
(b)前記非ヒト動物がマウスであり、前記核酸が配列番号5又は配列番号17に記述された配列を含む、
請求項31に記載の核酸。 - 前記非ヒト動物がマウスである、請求項31または32のいずれか一項に記載の核酸。
- 請求項28~33のいずれか一項に記載の前記核酸を含む、げっ歯類細胞。
- 前記げっ歯類細胞が胚幹細胞である、請求項34に記載のげっ歯類細胞。
- 前記げっ歯類細胞が運動ニューロンである、請求項34に記載のげっ歯類細胞。
- 運動ニューロンにおける酸化的ストレスを軽減するための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、
(a)薬剤の存在下又は非存在下で、請求項1~8のいずれか一項に記載のげっ歯類由来の運動ニューロン、または、請求項10、19、21および36のいずれか一項に記載の運動ニューロンを培養することと、
(b)前記薬剤が、前記げっ歯類由来であるが、前記薬剤非存在下で培養された対照運動ニューロンと比較したときに、前記運動ニューロンにおける酸化的ストレスを防止、抑制、及び/又は軽減するかどうかを決定することと、
を含み、前記運動ニューロンにおける酸化的ストレスの防止、抑制、及び/又は軽減が、運動ニューロンにおける酸化的ストレスを軽減するための候補薬剤を示す、方法。
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