KR20110089185A - 신경계 세포의 생존을 촉진하기 위한 ｄｒ６ 및 ｐ７５ 길항제의 용도 - Google Patents

신경계 세포의 생존을 촉진하기 위한 ｄｒ６ 및 ｐ７５ 길항제의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 계열의 구성원인 사망 수용체-6(DR6) 단백질에 관한 것이며, 본 발명에 이르러 신경계의 세포에서 세포자멸사를 조절하는데 중요한 것으로 밝혀졌다. 또한, p75는 DR6에 대한 리간드인 것이 밝혀졌다. 그 결과, 본 발명은 DR6 및/또는 p75 길항제를 사용하여 DR6 및 p75의 상호작용을 억제하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본원에 기술된 방법은 임의로 p75 길항제와 함께, DR6 길항제를 사용하여 신경계의 세포의 생존을 촉진하는 방법, 및 임의로, p75 길항제와 함께 DR6 길항제를 투여하여 신경변성 상태를 치료하는 방법을 포함한다.

Description

신경계 세포의 생존을 촉진하기 위한 ＤＲ６ 및 Ｐ７５ 길항제의 용도{Use of DR6 and P75 antagonists to promote survival of cells of the nervous system}
본 발명은 신경생물학, 신경학 및 약리학에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 임의로 p75 길항제와 함께, 사망 수용체-6(Death Receptor-6: DR6) 길항제를 사용하여 신경계의 세포의 생존을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 임의로 p75 길항제와 함께, DR6 길항제를 투여하여 신경변성 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 DR6 및/또는 p75 길항제를 사용하여 DR6 및 p75의 상호작용을 방지하는 방법에 관한 것이다.
세포자멸사(즉, 프로그램화된 세포 사망)은 급성 및 만성 손상 둘다를 포함하는 신경계의 다수 질병에서 중요한 역활을 하는 것으로 입증되어 있다. 예를 들어, 세포자멸사의 역할은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 운동신경세포병[예를 들면, 또한 ALS 또는 루게릭병(Lou Gehrig's disease)으로 불리는 근육위축가쪽경화증], 다발경화증, 신경세포 외상 및 대뇌 허혈(예를 들면, 뇌졸중)에서 입증되어 왔다.
많은 연구가 세포자멸사의 분자 메커니즘을 이해하는 것에 관한 것이며, 이들 연구들은 사망 수용체라고 불리는 수용체 계열의 발견을 이끌었다. 세포질성 사망 도메인으로 특징지워지는 8개의 사망 수용체가 지금까지 확인되어 왔다. 사망 수용체는 2개의 상이한 계열로 그룹화되어 왔다. 제1 계열의 구성원은 사망을 유도하는 시그날링 복합체(DISC)이며, 이는 세포자멸사 시그날링을 촉진한다. 제2 계열의 구성원은 상이한 세트의 분자를 보충하여 세포자멸사 시그날로 변환시킨다. 흥미롭게도, 제2 계열의 구성원은 또한 세포 생존 시그날로 변환한다.
사망 수용체 6(DR6)은 제2 계열의 사망 수용체의 구성원이다. DR6은 광범위하게 발현되지만 상이한 세포 유형에서 차등적으로 작용하는 것으로 여겨진다. DR6 mRNA는 심장, 뇌, 태반, 췌장, 림프절, 가슴샘 및 전립샘 조직에서 관측되어 왔다. 보다 낮은 수준이 골격근, 신장 및 고환을 포함하는 다른 세포 유형에서 관측되었지만, 성인 간 또는 어떠한 조혈 기원의 세포주에서 발현은 이전에는 거의 또는 전혀 관측되지 않았다. 흥미롭게도, DR6은 시험한 세포의 소세트에서만 세포자멸사를 유도할 수 있는 것으로 관측되었다. 예를 들면, HeLa S3 자궁경부 암종 세포에서 DR6의 과발현은 사망-도메인-의존적 방식으로 세포자멸사를 초래하였다[참조: Pan et al. FEBS 431:351-356 (1998)]. 또한, 키콜리브(Nikoleav) 등은 문헌[참조: Nature 457:981-990 (2009)]에서, 베타-아밀로이드 전구체 단백질(APP)이 DR6 리간드임을 입증하였고 DR6에 대한 APP 단편의 결합이 신경세포 세포체 및 액손(axon)의 변성을 개시한다고 제안하였다. 대조적으로, DR6은 MCF7(인간 유방 샘암종 세포주) 세포에서 세포 사망을 유도하지 않았다[참조: Pan et al . FEBS 431:351-356 (1998)]. DR6 발현 및 시그날링에 대한 세포 반응을 구분하는 특징은 아직 확인되어 있지 않다.
세포자멸사를 특이적으로 조절할 수 있는 약물은, 예를 들면, 신경세포가 다른 세포 유형보다 재생하는 능력이 거의 없을 수 있기 때문에 신경세포성 세포 사망을 포함하는 질병을 치료하는데 유용할 수 있다. 그러나, 현재 이용가능한 항-세포자멸사 약물은 특이성 및 선택성이 낮으며, 그 결과, 바람직하지 않은 부작용을 생산한다. 이러한 부작용은 예를 들면, 요구되는 작용 부위에 대해 항-세포자멸사 약물을 특이적으로 표적화시켜 감소시키거나 피할 수 있다. 달리는, 세포 유형의 특수한 소세트에서 특이적으로 작용하는 DR6와 같은 사망 수용체의 특성화는 보다 특이적인 치료학적 효과를 제공하기 위한 가능성을 갖는다.
발명의 요약
본 발명은, DR6는 신경계 세포에서 세포자살을 특이적으로 유도할 수 있고 p75는 DR6에 대해 리간드라는 발견을 기초로 한다. 항-DR6 항체를 포함하는 DR6 및 p75의 길항제는 DR6과 p75의 상호작용을 억제할 수 있고 신경계 세포의 사멸을 억제할 수 있다는 것을 또한 발견했다. 따라서, DR6 및/또는 p75의 길항제는 치료에 유용할 수 있고, 여기서, DR6 발현 또는 활성의 조절은 유익하다.
본 명세서에 기재된 발견을 기초로, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 기재되어 있는데, 상기 항체는 신경계 세포의 생존을 증진시킨다. DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 또한 기재되어 있고, 여기서 상기 항체는 희돌기아교세포의 증식, 분화 또는 생존을 증진한다. DR6 항체는 또한 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서 상기 항체는 수초화를 증진한다. 일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6의 p75에의 결합을 억제한다. 일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6의 p75에의 결합을 억제하지만, DR6의 베타-아밀로이드 전구체 단백질 (APP)에의 결합을 억제하지 않는다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 M50-H01, M51-H09, M53-E04, M53-F04, M62-B02, M63-E10, M66-B03, M67-G02, M72-F03, 및 M73-C04로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 Fab 항체 단편, 또는 1P1D6.3, 1P2F2.1, 및 1P5D10.2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체와 동일한 DR6 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 여기서, 상기 항체 또는 이의 단편은, M50-H01, M51-H09, M53-E04, M53-F04, M62-B02, M63-E10, M66-B03, M67-G02, M72-F03, 및 M73-C04로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 Fab 항체 단편, 또는 1P1D6.3, 1P2F2.1, 및 1P5D10.2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체가 DR6에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 여기서, 상기 항체 또는 이의 단편은, M50-H01, M51-H09, M53-E04, M53-F04, M62-B02, M63-E10, M66-B03, M67-G02, M72-F03, 및 M73-C04로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모노클로날 Fab 항체 단편, 또는 1P1D6.3, 1P2F2.1, 및 1P5D10.2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체의 도메인과 동일한 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 중쇄 가변 영역(VH)는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:117, 및 SEQ ID NO:127로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 경쇄 가변 영역(VL)은 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:102 SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:122, 및 SEQ ID NO:132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 VH는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:117, 및 SEQ ID NO:127로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 아미노산 서열과, 20개 이하의 보존성 아미노산 치환을 제외하고 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 VL은 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:102 SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:122, 및 SEQ ID NO:132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 아미노산 서열과, 20개 이하의 보존성 아미노산 치환을 제외하고 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 VH는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:117, 및 SEQ ID NO:127로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 VL은 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:102 SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:122, 및 SEQ ID NO:132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 VH 및 VL은 각각, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:17 및 SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:27 및 SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:37 및 SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:47 및 SEQ ID NO:52; SEQ ID NO:57 및 SEQ ID NO:62; SEQ ID NO:67 및 SEQ ID NO:72; SEQ ID NO:77 및 SEQ ID NO:82; SEQ ID NO:87 및 SEQ ID NO:92; SEQ ID NO:97 및 SEQ ID NO:102; SEQ ID NO:107 및 SEQ ID NO:112; SEQ ID NO117 및 SEQ ID NO:122; 및 SEQ ID NO:127 및 SEQ ID NO:132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 VH 및 VL은 각각, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:17 및 SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:27 및 SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:37 및 SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:47 및 SEQ ID NO:52; SEQ ID NO:57 및 SEQ ID NO:62; SEQ ID NO:67 및 SEQ ID NO:72; SEQ ID NO:77 및 SEQ ID NO:82; SEQ ID NO:87 및 SEQ ID NO:92; SEQ ID NO:97 및 SEQ ID NO:102; SEQ ID NO:107 및 SEQ ID NO:112; SEQ ID NO117 및 SEQ ID NO:122; 및 SEQ ID NO:127 및 SEQ ID NO:132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 아미노산 서열과, 20개 이하의 보존성 아미노산 치환을 제외하고 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 VH 및 VL은 각각, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:17 및 SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:27 및 SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:37 및 SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:47 및 SEQ ID NO:52; SEQ ID NO:57 및 SEQ ID NO:62; SEQ ID NO:67 및 SEQ ID NO:72; SEQ ID NO:77 및 SEQ ID NO:82; SEQ ID NO:87 및 SEQ ID NO:92; SEQ ID NO:97 및 SEQ ID NO:102; SEQ ID NO:107 및 SEQ ID NO:112; SEQ ID NO117 및 SEQ ID NO:122; 및 SEQ ID NO:127 및 SEQ ID NO:132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 VH는 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 118, 및 SEQ ID NO: 128로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VH-CDR1 아미노산 서열과, 2개 이하의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 카밧 중쇄 상보성 결정 영역-1 (VH-CDR1) 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구체예에서, VH-CDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 118, 및 SEQ ID NO: 128로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 VH는 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119 및 SEQ ID NO: 129로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VH-CDR2 아미노산 서열과, 4개 이하의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 카밧 중쇄 상보성 결정 영역-2 (VH-CDR2) 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구체예에서, VH-CDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119 및 SEQ ID NO: 129로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 VH는 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120 및 SEQ ID NO:130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VH-CDR3 아미노산 서열과, 4개 이하의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 카밧 중쇄 상보성 결정 영역-3 (VH-CDR3) 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구체예에서, VH-CDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120 및 SEQ ID NO:130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 VL은 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 123 및 SEQ ID NO: 133으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VL-CDR1 아미노산 서열과, 4개 이하의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 카밧 경쇄 상보성 결정 영역-1 (VL-CDR1) 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구체예에서, VL-CDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 123 및 SEQ ID NO: 133로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 VL은 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 124, 및 SEQ ID NO: 134로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VL-CDR2 아미노산 서열과, 2개 이하의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 카밧 경쇄 상보성 결정 영역-2 (VL-CDR2) 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구체예에서, VL-CDR2 아미노산 서열은SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 124, 및 SEQ ID NO: 134로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 VL은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 125, 및 SEQ ID NO: 135로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VL-CDR3 아미노산 서열과, 4개 이하의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 카밧 경쇄 상보성 결정 영역-3 (VL-CDR3) 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구체예에서, VL-CDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 125, 및 SEQ ID NO: 135로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 VH는 적어도 하나의 VH-CDR들에서 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 제외하고 SEQ ID NO: 8, 9, 및 10; SEQ ID NO: 18, 19, 및 20; SEQ ID NO: 28, 29, 및 30; SEQ ID NO: 38, 39, 및 40; SEQ ID NO: 48, 49, 및 50; SEQ ID NO: 58, 59, 및 60; SEQ ID NO: 68, 69, 및 70; SEQ ID NO: 78, 79, 및 80; SEQ ID NO: 88, 89, 및 90; SEQ ID NO: 98, 99, 및 100; SEQ ID NO: 108, 109, 및 110; SEQ ID NO: 118, 119, 및 120; 및 SEQ ID NO: 128, 129, 및 130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 VH는 SEQ ID NO: 8, 9, 및 10; SEQ ID NO: 18, 19, 및 20; SEQ ID NO: 28, 29, 및 30; SEQ ID NO: 38, 39, 및 40; SEQ ID NO: 48, 49, 및 50; SEQ ID NO: 58, 59, 및 60; SEQ ID NO: 68, 69, 및 70; SEQ ID NO: 78, 79, 및 80; SEQ ID NO: 88, 89, 및 90; SEQ ID NO: 98, 99, 및 100; SEQ ID NO: 108, 109, 및 110; SEQ ID NO: 118, 119, 및 120; 및 SEQ ID NO: 128, 129, 및 130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 VL은 적어도 하나의 VL-CDR들에서 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 제외하고 SEQ ID NO: 13, 14, 및 15; SEQ ID NO: 23, 24, 및 25; SEQ ID NO: 33, 34, 및 35; SEQ ID NO: 43, 44, 및 45; SEQ ID NO: 53, 54, 및 55; SEQ ID NO: 63, 64, 및 65; SEQ ID NO: 73, 74, 및 75; SEQ ID NO: 83, 84, 및 85; SEQ ID NO: 93, 94, 및 95; SEQ ID NO: 103, 104, 및 105; SEQ ID NO: 113, 114, 및 115; SEQ ID NO: 123, 124, 및 125; 및 SEQ ID NO: 133, 134, 및 135로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편이고, 여기서 항체 또는 이의 단편의 VL은 SEQ ID NO: 13, 14, 및 15; SEQ ID NO: 23, 24, 및 25; SEQ ID NO: 33, 34, 및 35; SEQ ID NO: 43, 44, 및 45; SEQ ID NO: 53, 54, 및 55; SEQ ID NO: 63, 64, 및 65; SEQ ID NO: 73, 74, 및 75; SEQ ID NO: 83, 84, 및 85; SEQ ID NO: 93, 94, 및 95; SEQ ID NO: 103, 104, 및 105; SEQ ID NO: 113, 114, 및 115; SEQ ID NO: 123, 124, 및 125; 및 SEQ ID NO: 133, 134, 및 135로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
상기 기재된 항체 또는 이의 단편의 다양한 구체예에서, VH 골격 영역 및/또는 VL 골격 영역은 5개 이하의 아미노산 치환을 제외하고 인간이다.
일부 구체예에서, 상기 기재된 항체 또는 이의 단편은 선형 에피토프 또는 비-선형 배좌 에피토프에 결합한다.
일부 구체예에서, 상기 기재된 항체 또는 이의 단편은 다가이고, 적어도 2개의 중쇄 및 적어도 2개의 경쇄를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 기재된 항체 또는 이의 단편은 다중특이적. 추가 구체예에서, 상기 기재된 항체 또는 이의 단편은 이중특이적이다.
상기 기재된 항체 또는 이의 단편의 다양한 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 쥣과이다. 추가 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 1P1D6.3, 1P2F2.1, 및 1P5D10.2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모노클로날 항체로부터이다.
상기 기재된 항체 또는 이의 단편의 다양한 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 완전 인간이다. 추가 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 M50-H01, M51-H09, M53-E04, M53-F04, M62-B02, M63-E10, M66-B03, M67-G02, M72-F03, 및 M73-C04로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모노클로날 Fab 항체 단편으로부터이다.
다양한 구체예에서, 상기 기재된 항체 또는 이의 단편은 인간화된다.
다양한 구체예에서, 상기 기재된 항체 또는 이의 단편은 키메라이다.
다양한 구체예에서, 상기 기재된 항체 또는 이의 단편은 1급화된다.
다양한 구체예에서, 상기 기재된 항체 또는 이의 단편은 완전 인간이다.
어떤 구체예에서, 상기 기재된 항체 또는 이의 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)2 단편, 또는 Fv 단편이다. 어떤 구체예에서, 상기 기재된 항체는 단일 사슬 항체이다. 어떤 구체예에서, 항체 또는 이의 단편은 폴리머에 콘쥬게이트된다. 어떤 구체예에서, 상기 폴리머는 폴리알킬렌 글리콜이다. 추가 구체예에서, 상기 폴리알킬렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다.
어떤 구체예에서, 상기 기재된 항체 또는 이의 단편은 인간 카파 불변 영역 및 인간 람다 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 불변 영역을 포함한다.
어떤 구체예에서, 상기 기재된 항체 또는 이의 단편은 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편을 포함한다. 추가 구체예에서, 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편은 인간 IgG4, IgG4 agly, IgG1, 및 IgG1agly로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 상기 기재된 항체 또는 이의 단편은 상기 참조 모노클로날 항체에 대한 KD 미만인 해리상수 (KD)를 특징으로 하는 친화도로, DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 또는 DR6 변이체 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 추가 구체예에서, 해리상수 (KD)는 5×10-2 M, 10-2 M, 5×10-3 M, 10-3 M, 5×10-4 M, 10-4 M, 5×10-5 M, 10-5 M, 5×10-6 M, 10-6 M, 5×10-7 M, 10-7 M, 5×10-8 M, 10-8 M, 5×10-9 M, 10-9 M, 5×10-10 M, 10-10 M, 5×10-11 M, 10-11 M, 5×10-12 M, 10-12 M, 5×10-13 M, 10-13 M, 5×10-14 M, 10-14 M, 5×10-15 M, 또는 10-15 M 이하이다.
일부 구체예에서, 위에서 기술한 항체 또는 이의 단편은 쥐(murine) DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 대한 인간 DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 우선적으로 결합한다.
또한, 본원에 기술된 방법은 일반적으로 신경계의 세포의 생존을 촉진하고 세포자멸사를 예방하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 상기 세포를 DR6 길항제와 접촉시킴을 포함하여, 신경계의 세포의 생존을 촉진하는 방법을 포함한다. 일부 특수 구체예에서, 신경계 세포의 세포는 뇌 세포, 척수 세포, 또는 이러한 세포로부터 기원한 세포주와 같은 중추신경계의 세포이다. 일부 구체예에서, 중추신경계의 세포는 피질 신경세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포 또는 별아교세포, 또는 이러한 세포로부터 기원한 세포주이다. 일부 구체예에서, 신경계의 세포는 신경세포, 예를 들면, 피질 신경세포, 운동 신경세포 및 후근신경절(DRG) 신경세포 또는 이러한 세포로부터 기원한 세포주이다. 일부 구체예에서, 세포는 미세아교세포 및 큰아교세포 또는 이러한 세포로부터 기원한 세포주를 포함하는 아교 세포이다. 큰아교세포의 예는 별아교세포, 희소돌기아교세포, 뇌실막세포 및 방사 아교 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 희소돌기아교세포 전구체 세포 또는 이러한 세포로부터 기원한 세포주와 같은 이들 세포의 전구체이다. 일부 구체예에서, 신경계의 세포는 말초신경계 세포이다. 일부 구체예에서, 말초신경계 세포는 후근신경절 신경세포, 슈반 세포(schwann cell), 또는 이러한 세포로부터 기원한 세포주이다.
본원에 기술된 방법은 또한 희소돌기아교세포 세포 또는 희소돌기아교세포 전구체 세포를 DR6 길항제와 접촉시킴을 포함하여 희소돌기아교세포 증식, 분화 또는 생존을 촉진시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 치료학적 유효량의 DR6 길항제를 투여함을 포함하여, 희소돌기아교세포 사망 또는 분화의 결여와 관련된 상태를 치료하는 방법이다.
본원에 기술된 방법은 또한 신경세포 세포 및 희소돌기아교세포 또는 희소돌기아교세포 전구체 세포의 혼합물을 DR6 길항제와 접촉시킴을 포함하여, 수초형성을 촉진하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 치료학적 유효량의 DR6 길항제를 투여함을 포함하여, 수초형성장애 또는 탈수초와 관련된 상태를 치료하는 방법이다.
상기 방법은 또한 일반적으로 신경계 세포의 사망과 관련된 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 유효량의 DR6 길항제를 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함을 포함하여, 신경계 세포의 사망과 관련된 상태를 치료하는 방법이다. 일부 특수한 구체예에서, 신경계 세포의 사망과 관련된 상태는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 운동신경세포병 (예를 들면, 또한 ALS 또는 루게릭병으로 불리는 근육위축가쪽경화증), 다발경화증, 신경세포 외상 또는 대뇌 허혈(예를 들면, 뇌졸중)일 수 있다. 일부 특수 구체예에서, 상태는 신경병성 통증이다.
본원에 기술된 방법은 또한 DR6 폴리펩타이드 및/또는 p75 폴리펩타이드를 p75에 대한 DR6의 결합이 억제되는 조건하에 DR6 길항제와 접촉시킴을 포함하여, p75에 대한 DR6의 결합을 억제하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법의 각종 구체예에서, DR6 길항제는 신경계의 세포의 생존을 음성적으로 조절하기 위해 DR6의 능력을 방해하는 특정 분자일 수 있다. 특정 구체예에서, DR6 길항제는 가용성 DR6 폴리펩타이드, DR6 길항제 화합물, DR6 길항제 항체 또는 이의 단편, DR6 길항제 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, RNA 간섭), DR6 아프타머(aptamer), 또는 2개 이상의 DR6 길항제의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
특정 구체예에서, DR6 길항제 폴리펩타이드는 가용성 DR6 폴리펩타이드이다. 본원에 기술된 특정의 가용성 DR6 폴리펩타이드는 DR6 세포외 도메인 또는 하나 이상의, DR6 TNFR과 유사한 시스테인이 풍부한 모티프(motif)를 포함하는 가용성 DR6 폴리펩타이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 가용성 DR6 폴리펩타이드는 하나 이상의 DR6 TNFR과 유사한 시스테인이 풍부한 모티프, 막관통 도메인, 사망 도메인 또는 세포질성 도메인을 결여하고 있다. 일부 구체예에서, DR6 길항제 폴리펩타이드는 서열 번호: 2의 아미노산 1 내지 349번(DR6); 서열 번호: 2의 40 내지 349번; 또는 서열 번호: 2의 41 내지 349번을 포함한다.
일부 구체예에서, 가용성 DR6 길항제는 비-DR6-이종 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드이다. 일부 구체예에서, 비-DR6 이종 폴리펩타이드는 면역글로불린 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 혈청 알부민 폴리펩타이드, 표적화 폴리펩타이드, 수용체 폴리펩타이드, 리포터 폴리펩타이드, 및 정제-촉진 폴리펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 일부 구체예에서, 항체 Ig 폴리펩타이드는 힌지(hinge) 및 Fc 폴리펩타이드이다.
대체 구체예에서, DR6 길항제는 위에서 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 단편이다. 다른 구체예에서, DR6 길항제는 하나 이상의 (i) DR6 세포외 도메인, 및 (ii) DR6 TNFR과 유사한 시스테인이 풍부한 모티프를 포함하는 DR6 폴리펩타이드에 결합하는 항체 또는 이의 단편이다. 또한, DR6 길항제 항체 또는 이의 단편은 본원에 기술된 바와 같은 DR6 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드내 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. DR6 길항제는 또한 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 2개 이상의 항체 또는 이의 단편의 조합일 수 있다.
다른 구체예에서, DR6 길항제는 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 아프타머, 리보자임, 소 간섭(small interfering) RNA(siRNA), 또는 소-헤파린 RNA(shRNA)와 같은 DR6 길항제 폴리뉴클레오타이드이다.
추가의 구체예에서, DR6 길항제는 DR6 아프타머이다. DR6 아프타머는 DR6에 결합하여 신경계 세포 생존을 촉진하거나 세포 세포자멸사를 방지하는 소 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드이다.
상기 방법의 일부 구체예에서, DR6 길항제는 피검자에게 (a) 신경계 세포내로 발현 조절 서열과의 작동가능한 연합을 통해 DR6 길항제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 도입시키는 단계; 및 (b) 상기 DR6 길항제의 발현을 허용하는 단계를 포함하는 방법으로 투여된다. 일부 구체예에서, 신경계 세포는 포유동물내에 존재하며 상기 도입 단계는, (a) 상기 포유동물에게 발현 조절 서열과의 작동가능한 연합을 통해 DR6 길항제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 투여함을 포함한다. 일부 구체예에서, 배양된 숙주 세포는 치료될 포유동물로부터 기원한다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 또는 신경계 세포내로 형질감염, 전기천공(electroporation), 바이러스 형질도입 또는 직접적인 미세주입을 통해 도입된다.
특정 구체예에서, DR6 길항제는 질병, 질환 또는 손상 부위에서 또는 부위 근처에서 포유동물에게 투여될 수 있는 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터로서 투여된다. 특정 구체예에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 엔테로바이러스 벡터, 페스티바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터[예를 들면, 엡슈타인 바르 바이러스 벡터(Epstein Barr viral vector), 또는 헤르페스 단성 바이러스 벡터(herpes simplex viral vector)], 파포바바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터(예를 들면, 박시니아 바이러스 벡터) 및 파르보바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택된 바이러스 벡터이다. 일부 구체예에서, 벡터는 국소 투여, 안구내 투여 및 비경구 투여(예를 들면, 정맥내, 동맥내, 근육내, 심장내, 피하, 피내, 경막내, 복강내)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 경로로 투여된다.
본원에 기술된 방법에 따라, DR6 길항제는 p75 길항제와 함께 사용될 수 있다. p75 길항제는 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
본원에 기술된 방법은 또한 p75 폴리펩타이드 및/또는 DR6 폴리펩타이드를 p75 길항제와 p75에 대한 DR6의 결합이 억제되는 조건하에서 접촉시킴을 포함하여, p75에 대한 DR6의 결합을 억제하는 방법을 포함한다. p75 길항제는 (i) p75 길항제 화합물; (ii) p75 길항제 폴리펩타이드; (iii) p75 길항제 항체 또는 이의 단편; (iv) p75 길항제 폴리뉴클레오타이드; (v) p75 아프타머; 또는 (vi) 2개 이상의 상기 p75 길항제의 조합일 수 있다.
도 1a 내지 1d - DR6는 발달동안 조절되며 CNS내에서 발현된다. 그래프는 DR6 정량적 PCR의 결과를 나타낸다. E18, P1, P7, P14, P21 및 성체 랫트 뇌(도 1a) 및 척수(도 1b)로부터의 DR6 mRNA 수준을 E18에서 DR6 mRNA 수준/DR6 mRNA 수준의 비로 나타낸다. 피질(CX), 해마(HP), 선조체(ST), 중뇌(MB), 소뇌(CB) 및 척수(SC)내에서 단백질 발현은 항-DR6 항체를 사용하는 웨스턴 블롯(웨스턴 블롯)을 기초로 하였다(도 1c). 희소돌기아교세포 전구체 세포(OPC), 피질 신경세포, 미세아교세포 및 별아교세포로부터의 DR6 및 GAPDH의 RT-PCR(도 1d).
도 2a 내지 2b - DR6은 희소돌기아교세포내에서 발현된다. A2B5, O4 및 MBP 양성 희소돌기아교세포의 분해물로부터의 DR6 및 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)의 RT-PCR(도 2a). DR6 RT-PCR을 음성 대조군 (-RT DR6)으로서 RT 효소의 부재하에 수행하였다. 웨스턴 블롯은 A2B5, O4, 및 MBP-양성 희소돌기아교세포내에서 DR6의 발현을 나타낸다(도 2b).
도 3 - DR6은 알츠하이머병에서 조절된다. 그래프는 알츠하이머병 뇌 및 대조군 뇌에서 DR6 mRNA 수준의 정량적 PCR을 나타낸다. 수준은 알츠하이머병 뇌 mRNA 수준/평균 대조군 뇌 mRNA 수준의 비로 나타낸다.
도 4 - DR6는 신경세포 손상에 대한 반응시 조절된다. 그래프는 축삭절단한 대조군 신경세포 및 신경세포에서 DR6 mRNA 수준의 정량적 PCR을 나타낸다. DR6 mRNA 수준은 축삭절단 시료내 mRNA 수준/대조군 시료내 mRNA 수준의 비로 나타낸다.
도 5a 내지 5d - DR6의 과발현은 신경세포 사망을 유발한다. FL-DR6을 발현하는 렌티바이러스로 감염된 피질 신경세포 및 대조군 피질 신경세포의 영상(도 5a). 그래프는 처리되지 않은 세포, 완전한 길이의 DR6(DR6-FL) 렌티바이러스, 우세한 음성 DR6(DR6-DN) 렌티바이러스 및 GFP 렌티바이러스로 감염된 세포에서 수행된 세포 생존능에 대한 XTT 검정에서 측정한 흡광도를 묘사한다(도 5b). 그래프는처리되지 않은 세포, DR6-FL, DR6-DN 및 GFP 렌티바이러스 감염된 세포에서 카스파제-3 활성에 대한 검정시 측정한 유리 로다민을 묘사한다(도 5c). 항-활성화된 카스파제-3, 항-βIII-투불린 및 항-GFP 항체로 프로빙한(probed) DR6-FL, DR6-DN 및 GFP 렌티바이러스 감염된 세포의 웨스턴 블롯(도 5d).
도 6a 내지 6b - DR6의 과발현은 OPC의 사망을 유도한다. 그래프는 DR6-FL, DR6-DN 또는 GFP 렌티바이러스로 감염된 세포에서 세포독성 퍼센트를 묘사한다(도 6a). 그래프는 로테논으로 처리한 세포 및 DR6-FL, DR6-DN 또는 GFP 렌티바이러스로 감염시킨 세포상에서 XTT 검정시 측정한 흡광도를 묘사한다(도 6b). 그래프는 DR6-FL, DR6-DN 또는 GFP 렌티바이러스로 감염시킨 세포에서 세포 생존능에 대한 LDH 검정시 측정한 흡광도를 묘사한다(도 6c).
도 7a 내지 7b - DR6 시그날링 경로의 차단은 희소돌기아교세포 생존 및 분화를 촉진시킨다. 항-MBP, 항-MOG, 항-GFP 및 항-β-액틴 항체로 프로빙한 DR6 FL 및 DR6 DN 감염된 희소돌기아교세포로부터의 세포 분해물의 웨스턴 블롯(도 7a). ELISA는 DR6 FL 및 DR6 DN 감염된 희소돌기아교세포에서 CNPase의 수준을 측정한다(도 7b).
도 8a 내지 8b - 가용성 DR6은 유도하는 신경세포 세포 사망으로부터 완전한 길이의 DR6를 차단한다. 대조군 인간 Fc로 처리한(상부 패널), FL-DR6로 감염시키고 대조군 인간-Fc로 처리한(중간 패널) 및 FL-DR6으로 감염시키고 DR6-Fc로 처리한(하부 패널) 배양된 E18 대뇌 피질 신경세포의 시간 경과 영상(도 8a). 그래프는 DR6-Fc 또는 대조군 Fc로 처리한 후 생존하는 세포의 수를 묘사한다(도 8b).
도 9a 내지 9b - 가용성 DR6는 노화된 DRG 신경세포 생존 및 DR6-FL을 발현하는 신경세포내 신경돌기 증식(outgrowth)을 촉진한다. 그래프는 DR6-Fc로 처리하거나, 대조군 Fc로 처리하거나, 또는 처리하지 않은 후 신경세포 생성 과정을 묘사한다(도 9a). 그래프는 DR6-Fc로 처리하거나, 대조군 Fc로 처리하거나, 또는 처리하지 않은 후 신경세포를 생성하는 거대 및 복합한 과정을 묘사한다(도 9b).
도 10a 내지 10b - DR6 유도된 신경세포 사망은 DR6-Fc에 의해 억제된다. 0, 1, 3, 10 또는 30㎍/ml의 재조합체 가용성 DR6(DR6 Fc)를 함유하는 배지 속에서 항온처리한 처리되지 않은 세포 및 DR6-FL 렌티바이러스 감염된 세포의 웨스턴 블롯을 항-활성화된 카스파제-3, 항-GFP 및 항-β-액틴 항체로 프로빙하였다(도 10a). 그래프는 DR6-Fc로 처리한 배양물 속에서 활성화된 카스파제-3의 수준을 묘사한다(도 10b).
도 11a 내지 11d - DR6 RNAi는 신경세포 생존을 촉진한다. 그래프는 DR6 또는 대조군 siRNA로 처리한 세포에서 LDH 검정으로 측정한 세포독성 퍼센트를 묘사한다(도 11a). 그래프는 DR6 또는 대조군 siRNA에 노출되고 증가하는 농도의 Abeta42(도 11b), 글루타메이트(도 11c) 또는 TNF 알파(도 11d)로 처리한 세포상에서 XTT 검정시 측정한 세포 독성 퍼센트를 묘사한다.
도 12a 내지 12b - DR6 siRNA는 희소돌기아교세포 분화를 촉진한다. 대조군 siRNA 또는 DR6 siRNA로 처리한 희소돌기아교세포의 분해물로부터 DR6 및 GAPDH의 RT-PCR(도 12a). DR6 RT-PCR 반응을 또한 음성 대조군으로서 RT 효소의 부재하에 수행하였다(DR6-RT). DR6 siRNA 또는 대조군 siRNA 처리한 세포의 웨스턴 블롯을 항-MBP, 항-MOG 및 항-β-액틴 항체로 프로빙하였다(도 12b).
도 13a 내지 13c - 항-DR6 항체는 랫트, 마우스 및 인간 DR6에 결합한다. 그래프는 랫트(도 13a), 인간(도 13b) 또는 마우스 DR6(도 13c)로 형질감염된 293T 세포로부터 생산된 DR6에 결합하는 항-DR6 항체(1D10, 2F2 및 5D10)의 능력을 평가하기 위해 수행한 FACS 분석을 묘사한다.
도 14a 내지 14c - 항-DR6 항체에 의한 DR6의 차단은 희소돌기아교세포 분화를 촉진하고 세포자멸사를 억제한다. 그래프는 항-DR6 항체로 처리한 희소돌기아교세포 배양물에서 카스파제 3 활성 퍼센트를 묘사한다(도 14a). 그래프는 항-DR6 항체로 처리한 희소돌기아교세포 배양물에서 MBP+ 세포 퍼센트를 묘사한다(도 14b). 항-DR6 항체로 처리하고 토끼 항-분해된 카스파제-3(1:1000, 세포 시그날링), 마우스 항-MBP 항체(SMI 94 및 SMI 99, 1:4000, Convance) 및 토끼 항-β-액틴 항체(1:2000, Sigma)로 프로빙한 세포 배양물의 웨스턴 블롯(도 14c).
도 15 - 항-DR6 항체에 의한 DR6의 차단은 공-배양물에서 희소돌기아교세포/DRG 수초형성을 촉진한다. 항-DR6 항체로 처리하고 마우스 항-MBP 항체(SMI 94 및 SMI 99, 1:4000, Convance), 마우스 항-MOG 항체(1:500) 및 토끼 항-β-액틴 항체(1:2000, Sigma)로 프로빙한 희소돌기아교세포 및 DRG 신경세포의 공-배양물의 웨스턴 블롯.
도 16a 내지 16b - 항-DR6 항체에 의한 DR6의 차단은 랫트 뇌 단면 배양물에서 재수초형성을 촉진한다. 생활성 지질 리소포스파티딜콜린(LPC) 및 항-DR6 항체(도 16a)로 처리하지 않은 및 처리한 후 p17 뇌 단면의 영상. 그래프는 생활성 지질 리소포스파티딜콜린(LPC) 및 항-DR6 항체로 처리하지 않은 후 및 처리한 후 흑색 금 염색 강도(black gold staining intensity)를 차단함을 묘사한다(도 16b).
도 17a 내지 17b - 항-DR6 항체는 랫트 EAE 모델에서 기능적 회수를 촉진한다. 그래프는 MOG를 주사한지 14일째에 시작하여 2주 동안 주당 2회 발생하는 항-DR6 항체로 처리한 MOG 유도된 EAE 랫트에서 EAE 점수(EAE 질병의 기능적 회복으로 측정)를 묘사한다. EAE 점수는 EAE 질병의 기능적 회복으로 측정하였다. 그래프는 대조군 또는 항-DR6 항체로 처리한 랫트 EAE 모델에서 신경 전도 속도를 묘사한다.
도 18a 내지 18b - 림프세포 및 전혈 세포 수는 EAE 랫트에서 항-DR6 항체 치료에 영향받지 않는다. 그래프는 EAE 연구 말기(32일 째)에 측정한 총 림프세포 수(도 18a) 및 전혈 세포 수(도 18b)를 묘사한다.
도 19 - DR6 항체는 EAE 랫트에서 척수내로의 T-세포 침윤을 억제한다. 그래프는 EAE 마우스에서 T 세포 침윤을 가시화하기 위한 항-CD4 항체를 사용하는 척수 조직의 IHC 염색의 결과를 묘사한다. 염색은 EAE 연구 말기에 수행하였다.
도 20a 내지 20c - TNF는 신경세포 사망을 촉진하고 DR6을 상향조절한다. 그래프는 TNFα를 사용한 처리 후 세포자멸사 세포의 퍼센트를 묘사한다(도 20a). 그래프는 TNFα를 사용한 처리 후 세포(DAPI+)의 총 수에 대한 세포자멸사 세포의 %를 묘사한다(도 20b). 그래프는 TNFα를 사용한 처리 후 세포(DAPI+)의 총 수당 DR6+ 세포의 %를 묘사한다(도 20c).
도 21a 내지 21d - TNFα는 DR6을 상향 조절하고 NFkB 시그날링을 통해 신경세포 사망을 유도한다. TNFα로 18 및 24시간 동안 처리하고 항-DR6, 항-NFκB, 항-IκBα 및 항-β-액틴 항체로 프로빙한 피질 신경세포의 웨스턴 블롯(도 21a). 그래프는 TNFα를 사용한 처리 후 DR6의 정량적 양을 묘사한다(도 21b). 그래프는 TNFα를 사용한 처리 후 NFκB의 정량적 양을 묘사한다(도 21c). 그래프는 TNFα를 사용한 처리 후 IκBα의 정량적 양을 묘사한다(도 21d).
도 22a 내지 22d - DR6 RNAi는 신경세포에서 NFκB 발현을 감소시킨다. 그래프는 DR6 RNAi 및 대조군 RNAi로 처리한 후 및 처리하지 않은 후 DR6 mRNA 수준을 묘사한다(도 22a). TNFα로 처리하고 DR6 RNAi로 추가로 처리하며 항-NFκB, 항-IκBα 및 항-β-액틴 항체로 프로빙한 피질 신경세포의 웨스턴 블롯(도 22b). 그래프는 DR6 RNAi로 처리한 후 및 처리하지 않은 후 NFκB의 정량적 양을 묘사한다(도 22c). 그래프는 DR6 RNAi로 처리한 후 및 처리하지 않은 후 IκBα의 정량적 양을 묘사한다(도 22d).
도 23a 내지 23b - 항-DR6 항체는 슈반 세포 수초형성을 촉진한다. 웨스턴 블롯은 항-DR6 또는 대조군 항체로 처리한 후 슈반 세포 및 DRG 신경세포 공-배양물에서 MBP 및 베타-액틴 수준을 나타낸다(도 23a). 막대 그래프는 공-배양물 속에서 베타-액틴 수준과 비교하여 MBP 수준의 정량화를 묘사한다(도 23b).
도 24 - DR6 및 포스포릴화된-AKT의 수준은 역으로 관련된다. 웨스턴 블롯은 배양된 랫트 피질 신경세포에서 DR6, p-AKT, AKT 및 β-액틴 수준을 나타낸다.
도 25 - DR6 및 p75는 상호작용한다. 웨스턴 블롯은 DR6, p75, 및 TrkA (음성 대조군) 단백질의 조합을 재조합체적으로 발현하는 세포로부터의 DR6의 면역침전으로부터 수득되는 DR6 및 p75 단백질 수준을 나타낸다(도 25a). 막대 그래프는 DR6 또는 pV90(음성 대조군)을 재조합체적으로 발현하는 세포의 표면에 대한 p75의 결합의 정량화를 묘사한다(도 25c). 웨스턴 블롯은 인간 태아 척수 분리물로부터의 DR6의 면역침전으로부터 수득되는 DR6 및 p75 단백질 수준을 나타낸다(도 25b).
도 26 - DR6 및 p75를 마우스 뇌 속에서 공-발현시킨다. 막대 그래프는 마우스 뇌의 각종 영역에서 DR6 및 p75 mRNA 수준의 정량화를 나타낸다.
도 27 - DR6 항체 5D10은 DR6 및 p75의 상호작용을 차단한다. 웨스턴 블롯은 항-DR6 항체 2A9 및 5D10로 면역침전하는 p75 및 DR6 단백질을 나타낸다(도 27a). 상은 대조군 벡터 또는 p75를 암호화하는 벡터로 형질감염시키고 알칼리성 포스파타제-DR6 단독, 또는 항-DR6 항체와 조합된 알칼리성 포스파타제-DR6에 노출시킨 CHO 세포를 나타낸다(도 27b).
도 28 - DR6-p75 상호작용을 차단하는 항체는 DR6의 Cys3/Cys4 도메인에 결합한다. 막대 그래프는 재조합체 DR6 결실 돌연변이체의 발현 수준을 나타낸다(도 28a). 웨스턴 블롯은 항-myc 항체(양성 대조군), 항-DR6 항체 5D10, 및 항-DR6 항체 2A9를 사용하여 면역침전시키는 myc-DR6 융합 단백질의 양을 나타낸다(도 28b). 막대 그래프는 DR6 결실 단백질과 항-DR6 항체 5D10, 2A9, 1D6, 2F2, 및 A4A의 상호작용의 정량화를 나타낸다(도 28c). MOPC-21은 마우스 모노클로날 대조군 항체를 나타낸다.
도 29 - DR6의 Cys3/Cys4 영역은 p75에 대한 결합에 중요하다. 웨스턴 블롯은 DR6와 함께 면역침전하는 DR6 결실 단백질 및 p75 단백질의 양을 나타낸다.
도 30 - 항-DR6 항체 5D10 및 M53E04는 인간 DR6에 결합한다. 그래프는 인간 및 랫트 DR6에 결합하기 위한 항-DR6 항체의 능력을 평가하기 위해 수행된 FACS 분석을 묘사한다. 항-myc 항체 9E10 염색 결과는 인간 및 랫트 DR6 단백질 발현을 나타낸다.
도 31 - 항-DR6 항체에 의한 DR6의 차단은 공-배양물에서 희소돌기아교세포/DRG 수초형성을 촉진한다. 항-DR6 항체(M53E04 및 5D10), 항-LINGO-1 항체(Li81), 및 대조군 항체로 처리되고 항-MBP 항체, 항-MOG 항체, 및 항-β-액틴 항체로 프로빙한 희소돌기아교세포 및 DRG 신경세포의 공-배양물의 웨스턴 블롯.
발명의 상세한 설명
정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당해 분야의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 대립이 있는 경우, 이러한 정의를 포함하는 본원이 조절할 것이다. 내용으로 달리 요구하지 않는 한, 단수 용어는 다수를 포함하며 다수 용어는 단수를 포함한다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허 및 기타 참조는 각각의 개개 공보 또는 특허원이 특이적으로 및 개별적으로 참조문헌으로 인용되는 것으로 나타낸 바와 같이 모든 목적으로 이의 전문이 참조로 혼입된다.
본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질들이 본원에 기술된 방법을 실시하거나 시험하는데 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 다음에 기술되어 있다. 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 기술된 항체 및 방법의 다른 특징 및 장점은 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다.
본 발명을 추가로 정의하기 위해, 다음 용어들 및 정의들이 제공된다.
용어 하나의("a" 또는 "an") 실체는 이러한 실체 하나 이상; 예를 들면, "면역글로불린 분자"는 하나 이상의 면역글로불린 분자를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 하나("a" 또는 "an"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐, 용어 "포함하다" 또는 이러한 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 특정의 인용된 정수 또는 정수들의 그룹을 포함하나 특정의 다른 정수 또는 정수들의 그룹을 배제하지는 않음을 나타낸다.
본원에 사용된 것으로서, 본원 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐 사용된 용어 "로 이루어진(단수)" 또는 "로 이루어진(복수)" 또는 "로 이루어지는"과 같은 변형은 특정의 인용된 정수 또는 정수들의 그룹을 포함하나, 명시된 방법, 구조 또는 조성물에 가해진 추가의 정수 또는 정수들의 그룹이 없음을 나타낸다.
본원에 사용된 것으로서, 본원 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐 사용된 용어 "로 필수적으로 이루어진(단수)", 또는 "로 필수적으로 이루어진(복수)" 또는 "로 필수적으로 이루어지는"과 같은 변형은 특정이 인용된 정수 또는 정수들의 그룹을 포함하며, 명시된 방법, 구조 또는 조성물의 기본 또는 신규 특성을 물질적으로 변화시키지 않는 특정의 인용된 정수 또는 정수들의 그룹을 임의로 포함함을 나타낸다.
본원에 사용된 것으로서, "치료학적 유효량"은 바람직한 치료학적 결과를 달성하기에 필수적인 용량 및 기간 동안에 효과적인 양을 말한다. 치료학적 결과는, 예를 들면, 증상의 약화, 연장된 생존, 개선된 운동능 등일 수 있다. "치료학적 유효량"은 바람직한 치료학적 결과중 어느 하나 또는 다수의 바람직한 치료학적 결과의 특정 조합을 달성할 수 있다. 치료학적 결과는 "치유"되는 것을 요구하지 않는다.
본원에 사용된 것으로서, "예방학적 유효량"은 바람직한 예방학적 결과를 달성하기에 필요한 용량 및 기간 동안에 효과적인 양을 말한다. 대표적으로, 예방학적 투여량은 질병의 조기 단계 이전에 또는 당해 단계에서 피검자에서 사용되며, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량 미만일 것이다.
본원에 사용된 것으로서, "폴리뉴클레오타이드"는 해독되지 않은 5' 및 3' 서열, 암호화 서열, 및 핵산 서열의 단편, 에피토프, 도메인, 및 변이체를 포함하는 완전한 길이의 cDNA 서열의 뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 특정의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄 및 이본쇄 영역의 혼합물인 DNA, 일본쇄 및 이본쇄 영역의 혼합물인 일본쇄 및 이본쇄 RNA 및 일본쇄이거나, 보다 대표적으로는 이본쇄이거나, 일본쇄 및 이본쇄 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 구성될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘다를 포함하는 삼본쇄 영역으로 구성될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 하나 이상의 변형된 염기 또는 안정성 또는 다른 이유로 변형된 DNA 또는 RNA 골격을 함유할 수 있다. "변형된" 염기는 예를 들면, 트리틸화된 염기 및 이노신과 같은 특별한 염기를 포함한다. DNA 및 RNA에 대해 다양한 변형을 가할 수 있으며; 따라서, "폴리뉴클레오타이드"는 화학적으로, 효소적으로, 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다.
폴리펩타이드는 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합, 즉, 펩타이드 이소스테레스(isosteres)에 의해 서로 결합된 아미노산으로 구성될 수 있으며, 20개 유전자를 암호화한 아미노산 이외의 아미노산(예를 들면, 천연적으로 존재하지 않는 아미노산)을 함유할 수 있다. 본원에 기술된 폴리펩타이드는 해독후 프로세싱과 같은 천연 과정, 또는 당해 분야에 잘 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 기본 교재 및 보다 상세한 논문, 및 또한 방대한 조사 문헌에 잘 기술되어 있다. 변형은 펩타이드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카복실 말단을 포함하는 폴리펩타이드내 어디에서도 발생할 수 있다. 동일한 유형의 변형이, 제공된 폴리펩타이드내 몇개 부위에서 동일하거나 변화하는 정도로 존재할 수 있음은 인지될 것이다. 또한, 제공된 폴리펩타이드는 많은 유형의 변형을 함유할 수 있다. 폴리펩타이드는 예를 들면, 유비퀴틴화(ubiquitination)의 결과로서 측쇄될 수 있고, 측쇄와 함께 또는 측쇄의 부재하에서 환형일 수 있다. 환형, 측쇄 및 측쇄 환형 폴리펩타이드는 해독후 천연 과정으로부터 수득될 수 있거나 합성 방법으로 제조될 수 있다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 잔기(heme moiety)의 공유 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 교차 결합, 환형화, 이황화물 결합 형성, 탈메틸화, 공유 교차결합의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카복실화, 글리코실화, GPI 앵커(anchor) 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백분해성 프로세싱, 포스포릴화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아르기닐화와 같이 단백질에 대한 아미노산의 전달-RNA 매개된 첨가, 및 유비퀴틴화를 포함한다[참조: 예를 들면, Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)].
사망 수용체-6(DR6) 길항제를 언급하는 경우 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"는 신경계 세포 생존을 촉진하는 특정의 길항제 분자를 포함한다. 가용성 DR6 폴리펩타이드는 DR6 단백분해 단편, 결실 단편 및 특히, 동물에게 전달되는 경우 작용 부위에 보다 용이하게 도달하는 단편을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드 단편은 또한 선형 및 3-차원 에피토프를 포함하는, 천연의 폴리펩타이드의 항원성 또는 면역원성 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드의 특정 부위를 포함한다. 가용성 DR6 폴리펩타이드는 위에서 기술한 단편을 포함하는 변이체 DR6 영역, 및 또한 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인하여 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 변이체는 대립유전자 변이체와 같이 천연적으로 존재할 수 있다. "대립유전자 변이체"는 유기체의 염색체상에서 제공된 유전자위치를 점유하는 유전자의 대체 형태로 의도된다[참조: Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)]. 천연적으로 존재하지 않는 변이체는 당해 분야에 공지된 돌연변이유발 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 가용성 DR6 폴리펩타이드는 보존적인 또는 비-보존적인 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. DR6 길항제는 또한 유도체 분자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 가용성 DR6 폴리펩타이드는, 변경되어 천연의 폴리펩타이드상에서 발견되지 않은 추가의 특징을 나타내는 DR6 영역을 포함할 수 있다. 이의 예는 융합 단백질 및 단백질 접합체를 포함한다.
"폴리펩타이드 단편"은 DR6 폴리펩타이드의 짧은 아미노산 서열을 말한다. 단백질 단편은 "독립(free-standing)"될 수 있거나 이의 단편이 영역의 일부를 형성하는 보다 큰 폴리펩타이드내에 포함될 수 있다. 폴리펩타이드 단편의 대표적인 예는, 예를 들면, 길이가 약 5개의 아미노산, 약 10개의 아미노산, 약 15개의 아미노산, 약 20개의 아미노산, 약 30개의 아미노산, 약 40개의 아미노산, 약 50개의 아미노산, 약 60개의 아미노산, 약 70개의 아미노산, 약 80개의 아미노산, 약 90개의 아미노산, 및 약 100개의 아미노산인 단편을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "항원 결합 분자"("ABM")는 이의 가장 광범위한 의미에서 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 말한다. 당해 분야의 숙련가에 의해 성숙한 항체의 단편은 항원에 특이적으로 결합할 수 있음이 이해된다. 따라서, 상기 용어가 본원에 사용되는 경우 항원 결합 분자는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 성숙한 항체의 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. ABM은 고정 영역(constant region)을 함유할 필요가 없다. 특수 구체예에서, 하나 이상의 고정 영역(들)이 존재하는 경우, 고정 영역은 인간 면역글로불린 고정 영역에 대해 실질적으로, 예를 들면, 적어도 약 85 내지 90%, 또는 약 95% 또는 이상 동일하다. ABM은 당가공되어 항체 의존적 세포의 세포독성을 향상시킬 수 있다.
항체 또는 면역글로불린. 하나의 구체예에서, 본원에 기술된 치료 방법에 사용하기 위한 DR6 길항제는 "항체" 또는 "면역글로불린" 분자, 또는 이의 면역특이적인 단편, 예를 들면, 천연적으로 존재하는 항체 또는 면역글로불린 분자 또는 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하는 가공된 항체 분자 또는 단편이다. 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 항체 또는 면역글로불린은 모노클로날, 폴리클로날 및 다중특이적인(예를 들면, 이특이적인) 항체 및 또한 Fc 영역을 가지고 결합 특이성을 보유하는 항체 단편, 및 면역글로불린의 Fc 영역과 동등한 영역을 포함하고 결합 특이성을 보유하는 융합 단백질을 포함하는 전체 항체 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, VH 단편, VL 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, 미니보디(minibody), 디아보디(diabody), 트리아보디(triabody), 및 테트라보디(tetrabody)를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 결합 특이성을 보유하는 항체 단편이다[참조: 예를 들면, Hudson and Souriau, Nature Med. 9: 129-134 (2003)]. 인간화된, 영장류화된 및 키메라 항체도 또한 포함된다.
하기에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구별될 수 있는 폴리펩타이드의 5개의 광범위한 부류를 포함한다. 비록 5개의 모든 부류가 기술된 방법에서 명확하게 유용하다고 해도, 다음 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 부류에 관한 것일 것이다. IgG와 관련하여, 표준 면역글로불린 분자는, 분자량이 대략 23,000 달톤인 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드, 및 분자량이 53,000 내지 70,000인 2개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 4개의 쇄는 대표적으로 "Y" 구조로 이황화물 결합에 의해 결합되어 있으며, 여기서, 경쇄는 "Y"의 입(mouth)에서 출발하여 가변 영역 전체를 통해 연속되는 중쇄를 묶는다.
경쇄 및 중쇄는 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 분할된다. 용어 "고정" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 부위 둘다의 가변 도메인은 항원 인지 및 특이성을 결정하는 것으로 인식될 것이다. 역으로, 경쇄(CL) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 고정 도메인은 분비, 태반경유 이동성, Fc 수용체 결합, 상보체 결합 등과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. 통상적으로 고정 영역 도메인이 항원 결합 부위 또는 항체의 아미노-말단으로부터 보다 멀어질수록 고정 영역 도메인의 번호매김은 증가한다. N-말단 부위는 가변 영역이고 C-말단 부위는 고정 영역이며; CH3 및 CL 도메인은 실제로 중쇄 및 경쇄의 카복시 말단을 각각 포함한다.
경쇄는 카파 또는 람다(κ,λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 분류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합할 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유결합되며, 2개의 중쇄의 "테일(tail)" 부위는, 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전적으로 가공된 숙주 세포에 의해 생성되는 경우 공유결합성 이황화물 결합 또는 비-공유결합에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 형태의 분지된 끝에서의 N-말단으로부터 각각의 쇄의 하단에서의 C-말단에 이른다. 당해 분야의 숙련가들은, 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론(γ,μ,α,δ,ε)과 이들 중 일부 소부류(예를 들면, γ1 내지 γ4)로 분류됨을 인지할 것이다. 이는 항체의 "부류"를 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로 각각 결정하는 상기 쇄의 특성이다. 면역글로불린 소부류(아형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 등은 잘 특성화되어 있으며 기능적 특수성을 부여하는 것으로 공지되어 있다. 이들 부류 및 동형 각각의 변형된 버젼은 본 기재내용의 측면에서 당해 분야의 숙련가에게 용이하게 인식될 수 있으며, 따라서, 본 발명의 영역내에 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 가변 영역은, 항체가 항원상의 에피토프를 선택적으로 인지하여 특이적으로 결합하도록 한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인은 결합하여 3차원 항원 결합 부위를 정의하는 가변 영역을 형성한다. 이러한 4차 항체 구조는 Y의 각각의 아암(arm)의 끝에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 보다 상세하게는, 항원 결합 부위는 각각의 VH 및 VL 쇄 상의 3개의 상보성 결정 영역(CDR)으로 정의된다. 일부 예에서, 예를 들면, 카멜리드(camelid) 종으로부터 기원하거나 카멜리드 면역글로불린을 기초로 가공한 특정한 면역글로불린 분자는 경쇄없이 중쇄로만 이루어질 수 있다[참조: 예를 들면, Hamers Casterman et al ., Nature 363:446 448 (1993)].
천연적으로 존재하는 항체에서, 각각의 항원 결합 도메인에 존재하는 6개의 상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은, 항체가 수성 환경에서 자체의 3차원 형태를 보증하므로 항원 결합 도메인을 형성하기 위해 특이적으로 위치하는 아미노산의 짧은 비-연속적인 서열이다. "골격" 영역으로 언급되는, 항원 결합 도메인내 아미노산의 나머지는 분자간 가변성을 거의 나타내지 않는다. 골격 영역은 크게 β-시이트(sheet) 구조 및, 연결되어 일부 경우에 β-시이트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 골격 영역은 쇄간, 비-공유결합성 상호작용에 의해 정확한 배향으로 CDR을 위치시키기 위해 제공되는 스캐폴드(scaffold)를 형성하도록 작용한다. 위치된 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원상의 에피토프에 상보성인 표면을 정의한다. 이러한 상보성 표면은 항체의 이의 인지 에피토프에 대한 비-공유결합성 결합을 촉진한다. CDR 및 골격 영역 각각을 포함하는 아미노산은 상세히 정의되어 있으므로[참조: "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); and Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987), 이들은 전문이 참조로 본원에서 인용된다], 당해 분야의 숙련가에 의해 특정의 제공된 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대해 용이하게 확인될 수 있다.
당해 분야에서 사용되고/되거나 허용되는 용어의 정의가 2개 이상 존재하는 경우에, 본원에 사용된 정의가 반대로 정확하게 기술되어 있지 않는 한 이러한 의미 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 구체적인 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘다의 가변 영역내에서 발견된 비-연속적인 항원 결합 부위를 기술하기 위한 용어 "상보성 결정 영역"("CDR")의 사용이다. 당해 특수 영역은 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Kabat et al ., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) and by Chothia et al ., J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987)]에 기술되어 있으며, 여기서, 상기 정의는 서로에 대해 비교하는 경우 아미노산 잔기의 중첩 또는 소세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR에 대해 언급하기 위한 하나의 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용된 용어의 영역내에 있는 것으로 의도된다. 상기 인용된 참조문헌 각각에 정의된 것으로서 CDR을 포함하는 적절한 아미노산을 비교로서 하기 표 1에 나타낸다. 특수 CDR을 포함하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 변할 것이다. 당해 분야의 숙련가들은, 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 제공한 특수 CDR을 포함하는 잔기가 어떤 것인지 통상적으로 측정할 수 있다.
Figure pct00001
카바트(Kabat) 등은 또한 어떠한 항체에도 적용될 수 있는 가변 도메인 서열에 대한 번호매김 시스템을 정의하였다. 당해 분야의 숙련가는 "카바트 번호매김"의 상기 시스템을 서열 자체를 능가하는 어떠한 실험적 데이타에 의존하지 않고, 특정의 가변 도메인 서열에 정확하게 지정할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "카바트 번호매김"은 문헌[참조: Kabat et al., U.S. Dept. of Health 및 Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 설정된 번호매김 시스템을 말한다. 달리 명시하지 않는 한, C35 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 이의 유도체내 특수 아미노산 잔기 위치의 번호매김에 대한 참조는 카바트 번호매김 시스템에 따른다.
그러나, 카멜리드 종에서, VHH로 언급된 중쇄 가변 영역은 전체 CDR을 형성한다. 카멜리드 VHH 가변 영역과 통상의 항체(VH)로부터 기원한 것들 사이의 주요 차이는 (a) VHH내 상응하는 영역과 비교하여 VH의 경쇄 접촉 표면내 보다 소수성인 아미노산, (b) VHH내 보다 긴 CDR3, 및 (c) VHH내 CDR1과 CDR3 사이의 이황화물 결합의 빈번한 발생을 포함한다.
하나의 구체예에서, 항원 결합 분자는 항체 분자의 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자로부터의 적어도 2개의 CDR을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자로부터 적어도 3개의 CDR을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자로부터 적어도 4개의 CDR을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자로부터 적어도 5개의 CDR을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자로부터 적어도 6개의 CDR을 포함한다. 본 항원 결합 분자에 포함될 수 있는 적어도 하나의 CDR을 포함하는 예시적인 항체 분자는 당해 분야에 공지되어 있고 예시적인 분자는 본원에 기술되어 있다
본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 항체 또는 이의 면역특이적인 단편은 폴리클로날, 모노클로날, 다중특이적인, 인간, 인간화된, 영장류화된(primatized), 또는 키메라 항체, 일본쇄 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들면, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fv, 일본쇄 Fv(scFv), 일본쇄 항체, 이황화물-결합된 Fv(sdFv), VL 또는 VH 도메인 중 어느 하나를 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 및 항-개체특이적(항-Id) 항체(예를 들면, 본원에 기술된 결합 분자에 대한 항-Id 항체 포함)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. ScFv 분자는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 미국 특허 제5,892,019호에 기술되어 있다. 면역글로불린 또는 항체 분자는 특정 유형(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 면역글로불린 분자의 부류(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 소부류일 수 있다.
일본쇄 항체를 포함하는, 항체 단편은 가변 영역(들) 단독 또는, 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인의 전체 또는 일부와 함께 포함할 수 있다. 항원-결합 단편은 또한 가변 영역(s)과 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인의 특정 조합을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 진단학적 및 치료학적 방법에 사용하기 위한 항체 또는 이의 면역특이적인 단편은 조류 및 포유동물을 포함하는 특정의 동물 기원으로부터의 것일 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는 인간, 쥐, 당나귀, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 라마, 말, 또는 닭 항체이다. 또 다른 구체예에서, 가변 영역은 기원이 콘드릭토이드(condricthoid)(예를 들면, 상어로부터)일 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하며 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 기원하거나 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대한 유전자삽입성인 동물로부터 기원하며 상기 및 예를 들면, 쿠케를라파티(Kucherlapati) 등의 미국 특허 제5,939,598호에 기술된 바와 같은 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 항체를 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "중쇄 부위"는 면역글로불린 중쇄로부터 기원한 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 부위를 포함하는 폴리펩타이드는 CH1 도메인, 힌지(예를 들면, 상부, 중간 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편 중의 적어도 하나를 포함한다. 예를 들면, 결합 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄, 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩타이드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 또한, 결합 폴리펩타이드는 CH2 도메인의 적어도 일부(예를 들면, CH2 도메인 모두 또는 일부)를 결실할 수 있다. 위에 설정한 바와 같이, 당해 분야의 숙련가에 의해서 이들 도메인(예를 들면, 중쇄 부위)은 천연적으로 존재하는 면역글로불린 분자로부터 아미노산 서열에 있어서 변하도록 변형될 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 사용하기 위한 DR6 길항제 항체 또는 면역특이적인 이의 단편, 다합체의 하나의 폴리펩타이드 쇄의 중쇄 부위는 다합체의 제2 폴리펩타이드 쇄상의 것들과 동일하다. 달리는, 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 중쇄 부위-함유 단량체는 동일하지 않다. 예를 들면, 각각의 단량체는 예를 들면, 이특이적인 항체를 형성하는 상이한 표적 결합 부위를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 결합 폴리펩타이드의 중쇄 부위는 상이한 면역글로불린 분자로부터 기원할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드의 중쇄 부위는 IgG1 분자로부터 기원한 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 기원한 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중쇄 부위는 부분적으로 IgG1 분자로부터 기원하고, 부분적으로 IgG3 분자로부터 기원한 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중쇄 부위는 부분적으로 IgG1 분자로부터, 및 부분적으로 IgG4 분자로부터 기원한 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "경쇄 부위"는 면역글로불린 경쇄로부터 기원한 아미노산 서열을 포함한다. 대표적으로, 경쇄 부위는 VL 또는 CL 도메인 중의 적어도 하나를 포함한다.
면역글로불린(예를 들면, 면역글로불린 중쇄 부위 또는 경쇄 부위)으로부터 기원한 폴리펩타이드의 비-천연 변이체를 암호화하는 분리된 핵산 분자는 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 첨가 또는 결실을 면역글로불린의 뉴클레오타이드 서열내로 도입시켜 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실이 암호화된 단백질내로 도입되도록 함으로써 생성할 수 있다. 돌연변이체는 부위-지시된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발과 같은 표준 기술로 도입할 수 있다. 예를 들면, 보존적 아미노산 치환을 하나 이상의 비-필수적인 아미노산 잔기에서 수행한다.
본원에 기술된 치료 방법에서 사용하기 위한 항체 또는 이의 면역특이적인 단편을 또한 폴리펩타이드에 대한 이들의 결합 친화성 측면에서 기술하거나 구체화할 수 있다. 예를 들면, 결합 친화성은 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, 또는 10-15 M 미만의 Kd 또는 해리 상수를 가진 것들을 포함한다.
본원에 기술된 치료 방법에 사용하기 위한 항체 또는 이의 면역특이적인 단편은 본원에 기술된 DR6의 길항제로서 작용한다. 예를 들면, 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 항체는 DR6 폴리펩타이드의 억제 활성을 차단하거나 억제하는 길항제로서 작용할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "키메라 항체"는, 면역반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 수득되거나 이로부터 기원하고 고정 영역(이는 완전하거나, 부분적이거나 또는 변형될 수 있다)이 제2 종으로부터 수득된 특정 항체를 의미하기 위해 유지될 것이다. 특정 구체예에서, 표적 결합 영역 또는 부위는 비-인간 공급원(예를 들면, 마우스 또는 영장류)로부터 기원할 것이며 고정 영역은 인간이다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "가공된 항체"는, 중쇄 및 경쇄 또는 둘다에서 가변 도메인이 공지된 특이성의 항체로부터의 하나 이상의 CDR의 적어도 부분적인 치환 및, 경우에 따라 부분적인 골격 영역 치환 및 서열 변화에 의해 변경된다. CDR이, 골격 영역이 기원하는 항체와 동일한 부류 또는 심지어 소부류의 항체로부터 기원할 수 있다고 해도, CDR은 상이한 부류의 항체 및/또는 상이한 종으로부터의 항체로부터 기원할 것임은 예측된다. 공지된 특이성의 비-인간 항체로부터 하나 이상의 "공여체" CDR이 인간 중쇄 또는 경쇄 골격 영역내로 이식된 가공된 항체는 본원에서 "인간화된 항체"로 언급된다. 일부 경우에, CDR 모두를 공여체 가변 영역으로부터의 완전한 CDR로 치환하여 하나의 가변 도메인의 항원 결합 능력을 다른 것으로 이전시킬 필요는 없다. 오히려, 일부 경우에, 표적 결합 부위의 활성을 유지하는데 필수적인 잔기들을 이전시키는 것만이 필수적이다. 제공된 설명은 미국 특허 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,762호, 및 제6,180,370호에 기술되어 있으며, 이는 통상의 실험에 의해 또는 기능적 가공되거나 인간화된 항체를 수득하기 위한 시행착오 시험에 의해 당해 분야의 숙련가의 권한내에 있을 것이다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 '인간화된'은 모 분자의 항원-결합 특성을 보유하거나 실질적으로 보유하지만 인간에 있어서 거의 면역원성이 아닌 비-인간 항원-결합 분자, 예를 들면, 쥐 항체로부터 기원한 항원-결합 분자를 나타내는데 사용된다. 이는 (a) 전체의 비-인간 가변 도메인을 인간 고정 영역상에 이식하여 키메라 항체를 생성하는 방법, (b) 비-인간 CDR 만을 주용한 골격 잔기를 보유하거나 보유하지 않은 인간 골격 및 고정 영역(예를 들면, 우수한 항원 결합 친화성 또는 항체 기능을 보유하는데 중요한 것들) 위에 이식하는 방법, 또는 (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 이들을 표면 잔기의 치환에 의해 인간-유사 단면으로 "클로오킹(cloaking)"하는 방법을 포함하는 각종 방법으로 달성할 수 있다. 이러한 방법은, 모두 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Jones et al., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)]에 기재되어 있다. 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 각각에는 3개의 상보성 결정 영역, 또는 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)이 일반적으로 존재하며, 이들은 항체: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 각각에 4개의 골격 소영역(즉, FR1, FR2, FR3, 및 FR4)으로 플랭킹되어 있다. 인간화된 항체의 논의는 특히 둘다 이의 전문이 본원에 참조로 인용된, 미국 특허 제6,632,927호, 및 미국 특허공개공보 제2003/0175269호에서 찾을 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 2개 이상의 성분 또는 성분들을 화학적 접합 또는 재조합체 수단을 포함하는 어떠한 수단에 의해서 함께 결합시킴을 의미한다. "골격내 융합"은 2개 이상의 개방 판독 프레인(ORF)을 결합시켜 원래의 ORF의 정확한 개방 프레임을 유지하는 방식으로 연속된 보다 긴 ORF를 형성하는 것을 말한다. 따라서, 수득되는 재조합체 융합 단백질은 원래의 ORF에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 상응하는 2개 이상의 분절(당해 분절은 천연에서 일반적으로 이렇게 결합하지 않는다)을 함유하는 단일 단백질이다. 개방 프레임이 융합된 분절 전체에서 이와 같이 연속적으로 제조되지만, 분절은 예를 들면, 프레임내 링커 서열에 의해 물리적으로 또는 부분적으로 분리될 수 있다.
폴리펩타이드의 내용에서, "선형 서열" 또는 "서열"은 서열내에서 서로 이웃인 잔기가 폴리펩타이드의 원시 구조내에서 연속적인 아미노에서 카복실 말단 방향으로 폴리펩타이드내 아미노산의 순서이다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "발현"은, 유전자가 생화학물질, 예를 들면, RNA 또는 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 말한다. 상기 방법은 유전자 녹다운(knockdown), 및 일시적인 발현 및 안정한 발현을 포함하나, 이에 한정되지 않는 세포내에서 유전자의 기능적 존재의 특정 징후를 포함한다. 이는 전령 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 소 헤파린 RNA(shRNA), 소 간섭 RNA(siRNA) 또는 특정의 다른 RNA 생성물내로의 유전자의 전사 및, 이러한 mRNA의 폴리펩타이드(들)내로의 해독을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 최종의 목적한 생성물이 생화학물질인 경우, 발현은 생화화학물질 및 특정의 전구체의 생성을 포함한다.
"피검자" 또는 "개인" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 이로부터 진단, 예후 또는 치료가 요구되는 특정 피검자, 특히, 포유동물 피검자를 의미한다. 포유동물 피검자는 인간, 사육 동물, 농장 동물, 동물원 동물, 운동경기 동물, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 소, 암소와 같은 애완 동물; 유인원, 원숭이, 오랑우탄 및 침팬지와 같은 영장류; 개 및 늑대와 같은 개과; 고양이, 사자 및 호랑이와 같은 고양이과; 말, 당나귀 및 지브라와 같은 말류; 암소, 돼지 및 양과 같은 식용 동물; 사슴 및 기린과 같은 유제류; 곰 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예에서, 포유동물은 인간 피검자이다.
용어 "RNA 간섭" 또는 "RNAi"는 siRNA에 의한 유전자 발현의 사일런싱(silencing) 또는 감소를 말한다. 이는 사일런싱된 유전자의 서열에 대한 이의 이중(duplex) 영역내 동종인 siRNA에 의해 개시된 동물 및 식물내 서열-특이적인, 전사-후 유전자 사일런싱의 방법이다. 유전자는 유기체에 대해 내인성 또는 외인성일 수 있고 염색체내로 통합되어 존재하거나 게놈내로 통합되지 않은 형질감염 벡터내에 존재할 수 있다. 상기 유전자의 발현은 완전히 또는 부분적으로 억제된다. RNAi는 또한 표적 RNA의 기능을 억제하는 것으로 고려될 수 있으며; 표적 RNA의 기능은 완전하거나 부분적일 수 있다.
사망 수용체-6(DR6/TNFRSF21)
DR6이 신경세포 및 희소돌기아교세포 전구체 세포를 포함하는 신경계의 세포내에서 발현되며 DR6이 이들 세포내에서 세포 사망을 유도할 수 있다는 것은 밝혀져 있다.
DR6은 655개 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드이다. 특정 구체예에서, 인간 폴리펩타이드는 서열 번호: 1(수탁 번호: NM_ 014452)의 뉴클레오타이드를 포함하는 mRNA에 의해 암호화되어 있다. 특정 구체예에서, 인간 DR6 폴리펩타이드 서열은 서열 번호: 2(수탁 번호: O75509)의 아미노산을 포함한다. 마우스 DR6은 655개 아미노산 폴리펩타이드이다. 특정 구체예에서, 마우스 DR6은 서열 번호: 3(수탁 번호: NM_178589)의 뉴클레오타이드를 포함하는 mRNA에 의해 암호화된다. 특정 구체예에서, 마우스 DR6 폴리펩타이드 서열은 서열 번호: 4(수탁 번호: NP_848704)의 아미노산 서열을 포함한다.
표 2는 서열 번호: 2의 서열을 기초로 아미노산 잔기 번호에 따른 DR6 도메인 및 다른 영역을 나열한다. 당해 분야의 숙련가는, 하기 나열한 도메인의 개시 및 종결 잔기가 사용된 컴퓨터 모델링 프로그램, 도메인, 소수 서열 변이 등을 측정하는데 사용된 방법에 따라 변할수 있음을 인지할 것이다.
Figure pct00002
P75/TNR16
p75 뉴트로트로핀 수용체는 DR6에 대한 리간드이다. 또한 종양 괴사 인자 수용체 상과계열 구성원 16(TNR16 또는 TNFRSF16) 또는 신경 성장 인자 수용체(NGFR)로 공지된 P75는 427개 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드이다. 인간 폴리펩타이드 서열은 수탁번호 NP_002498(서열 번호: 165)이고 핵산 서열은 수탁 번호 NM_002507(서열 번호: 166)이다. DR6 단백질과 같은 p75 단백질은 4개의 TNFR 시스테인이 풍부한 모티프, 막관통 영역, 및 사망 도메인을 함유하는 세포내 영역을 포함한다. p75가 NGF, BDNF, NT-3, 및 NT-4에 결합할 수 있는 저 친화성 수용체임은 이미 입증되어 있다[참조: Mi et al. Nat. Neuroscience 7:221-228 (2004)]. 또한, p75는 LINGO-1/Nogo-66 수용체 시그날링 경로의 성분이며 신경세포의 생존 및 사망을 매개할 수 있다. Id.
DR6 및 p75의 길항제를 사용하는 방법
하나의 구체예에서, 상기 방법은 상기 세포를 DR6 길항제와 접촉시킴을 포함하여 신경계의 세포의 생존을 촉진하는 방법이다. 또 다른 구체예는 희소돌기아교세포 세포 또는 희소돌기아교세포 전구체 세포를 DR6 길항제와 접촉시킴을 포함하여, 희소돌기아교세포 증식, 분화 또는 생존을 촉진하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예는 신경 세포 및 희소돌기아교세포 또는 희소돌기아교세포 전구체 세포의 혼합물을 DR6 길항제와 접촉시킴을 포함하여, 수초화를 촉진시키는 방법을 제공한다. 여전히 또 다른 구체예는 DR6 폴리펩타이드 및/또는 p75 폴리펩타이드를 DR6 길항제와 p75에 대한 DR6의 결합이 억제되는 조건하에 접촉시킴을 포함하여, DR6 및 p75의 결합을 억제하는 방법을 제공한다. 유사하게, 본원에 기술된 방법은 또한 DR6 폴리펩타이드 및/또는 p75 폴리펩타이드를 p75 길항제와 접촉시킴을 포함하여, p75에 대한 DR6의 결합을 억제하는 방법을 포함한다.
DR6 길항제는 DR6 길항제 폴리펩타이드, DR6 길항제 화합물, DR6 항체, DR6 길항제 폴리뉴클레오타이드, DR6 아프타머 또는 2개 이상의 DR6 길항제의 조합일 수 있다. 추가의 구체예는 치료학적 유효량의 DR6 길항제를 투여함을 포함하여, 신경계의 세포의 사망과 관련된 상태를 치료하는 방법을 포함한다.
p75 길항제는 p75 길항제 폴리펩타이드, p75 길항제 화합물, p75 항체, p75 길항제 폴리뉴클레오타이드, p75 아프타머, 또는 2개 이상의 p75 길항제의 조합일 수 있다. 추가의 구체예는 치료학적 유효량의 DR6 길항제를 p75 길항제와 함께 투여함을 포함하여, 신경계의 세포의 사망과 관련된 상태를 치료하는 방법을 포함한다.
일부 특수 구체예에서, 신경계 세포의 사망과 관련된 상태는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 운동신경세포병 (예를 들면, 또한 ALS 또는 루게릭병으로 명명되는 근육위축가쪽경화증), 다발경화증, 신경세포 외상 또는 대뇌 허혈 (예를 들면, 뇌졸중)일 수 있다. 다른 구체예는 치료학적 유효량의 DR6 길항제를 투여함을 포함하여, 신경세포 변성의 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
신경계의 세포는 중추신경계의 세포(또는 "CNS 세포" 및 말초 신경계의 세포(또는 "PNS 세포) 둘다를 포함한다. CNS 세포는 뇌내의 세포 및 척수내 세포, 및 이러한 세포로부터 기원한 세포주를 포함한다. PNS 세포는 예를 들면, 후근신경절 신경세포, 슈반 세포, 운동 신경세포 및 이러한 세포로부터 기원한 세포주를 포함한다. 신경계의 세포는 피질 신경세포, 운동 신경세포, 후근신경절(DRG) 신경세포 및 이러한 세포로부터 기원한 세포주와 같은 신경세포를 포함한다. 신경의 세포는 또한 신경세포 지지 세포 또는 미세아교세포 및 큰아교세포와 같은 아교 세포 및 이러한 세포로부터 기원한 세포주를 포함한다. 큰아교세포의 예는 또한 별아교세포, 희소돌기아교세포, 뇌실막세포 및 방사 아교 세포를 포함한다. 신경계의 세포는 또한 희소돌기아교세포 전구체 세포와 같은 상기 세포의 전구체 및 이러한 세포로부터 기원한 세포주를 포함한다.
DR6 길항제 폴리펩타이드
본원에서 사용될 DR6 길항제는 천연적으로 존재하는 DR6의 생물학적 기능을 차단하거나, 억제하거나 간섭하는 폴리펩타이드를 포함한다. 구체적으로, 가용성 DR6 폴리펩타이드는 가용성 DR6 폴리펩타이드의 단편, 변이체, 또는 이의 유도체를 포함한다. 상기 표 1은 인간 DR6 폴리펩타이드의 각종 도메인을 기술하고 있다. 유사한 도메인 구조는 다른 종의 DR6 폴리펩타이드, 예를 들면, 마우스 또는 랫트 DR6에 대해 유추될 수 있다. 가용성 DR6 폴리펩타이드는 통상적으로 DR6 폴리펩타이드의 막관통 도메인을 결여하며, 임의로 DR6 폴리펩타이드의 막관통 도메인을 결여한다. 예를 들면, 특정의 가용성 인간 DR6 폴리펩타이드는 인간 DR6의 막관통 도메인을 포함하는, 서열 번호: 2의 아미노산 351 내지 367번을 결여한다. 다른 가용성 인간 DR6 폴리펩타이드는 막관통 도메인 및 세포내 도메인(서열 번호: 2의 아미노산 350 내지 655번) 둘다를 결여한다. 추가로, 특정의 가용성 DR6 폴리펩타이드는 DR6 폴리펩타이드의 TNFR와 유사한 시스테인이 풍부한 모티프 및/또는 전체 세포외 도메인(서열 번호: 2의 40 내지 349번, 서열 번호: 2의 40 내지 350번, 서열 번호: 2의 41 내지 349번 또는 서열 번호: 2의 41 내지 350번 아미노산에 상응) 중의 하나 이상을 포함한다. 당해 분야의 숙련가가 인식할 수 있는 바와 같이, DR6의 전체 세포외 도메인은 세포외 도메인 폴리펩타이드의 C-말단 또는 N-말단 끝의 추가의 또는 보다 적은 아미노산을 포함할 수 있다. 가용성 길항제 DR6 폴리펩타이드는 시그날 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 사용하기 위한 추가 가용성 DR6 폴리펩타이드는 비제한적으로, SEQ ID NO:2의 아미노산 1 - 40; SEQ ID NO:2의 1 - 41; SEQ ID NO:2의 65 - 105; SEQ ID NO:2의 106 - 145; SEQ ID NO:2의 146 - 185; 및 SEQ ID NO:2의 186 - 212를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 이루어진 가용성 DR6 폴리펩타이드; 또는 그와 같은 폴리펩타이드의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다.
또한, 본 명세서에 기재된 방법에 사용하기 위한 가용성 DR6 폴리펩타이드는 비제한적으로, SEQ ID NO:2의 아미노산 1 - 40; SEQ ID NO:2의 1 - 41; SEQ ID NO:2의 1 - 64; SEQ ID NO:2의 1 - 105; SEQ ID NO:2의 1 - 145; SEQ ID NO:2의 1 - 185; SEQ ID NO:2의 1 - 212; SEQ ID NO:2의 1 - 349를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 이루어진 가용성 DR6 폴리펩타이드; 또는 그와 같은 폴리펩타이드의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다.
또한, 본 명세서에 기재된 방법에 사용하기 위한 가용성 DR6 폴리펩타이드는 비제한적으로, 아미노산 SEQ ID NO:2의 41 - 64; SEQ ID NO:2의 41 - 105; SEQ ID NO:2의 41 - 145; SEQ ID NO:2의 41 - 185; SEQ ID NO:2의 41 - 212; SEQ ID NO:2의 41 - 349; SEQ ID NO:2의 41 - 350; SEQ ID NO:2의 42 - 64; SEQ ID NO:2의 42 - 105; SEQ ID NO:2의 42 - 145; SEQ ID NO:2의 42 - 185; SEQ ID NO:2의 42 - 212; SEQ ID NO:2의 42 - 349; 및 SEQ ID NO:2의 42 - 350를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 이루어진 DR6 폴리펩타이드; 또는 그와 같은 폴리펩타이드의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법에 사용하기 위한 추가 가용성 DR6 폴리펩타이드는 비제한적으로, SEQ ID NO:2의 아미노산 65 - 105; SEQ ID NO:2의 65 - 212; SEQ ID NO:2의 65 - 349; SEQ ID NO:2의 106 - 145; SEQ ID NO:2의 106 - 212; SEQ ID NO:2의 106 - 349; SEQ ID NO:2의 146 - 185; SEQ ID NO:2의 146 - 212; SEQ ID NO:2의 146 - 349; SEQ ID NO:2의 186 - 212; SEQ ID NO:2의 186 - 349; 및 SEQ ID NO:2의 213 - 349를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 이루어진 가용성 DR6 폴리펩타이드; 또는 그와 같은 폴리펩타이드의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다.
변이체 DR6 폴리펩타이드는 또한 상응하는 야생형 폴리펩타이드로부터 서열에 있어 변할 수 있다. 특히, 특정 아미노산 치환이 DR6 생물학적 활성의 주목할만한 손실없이 DR6 서열내로 도입될 수 있다. 예시적인 구체예에서, 변이체 DR6 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고/하거나 서열 번호: 2의 41 내지 349번 아미노산 또는 서열 번호: 4의 동등한 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 참조 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4의 어떠한 제공된 단편과는 서열에 있어 상이한 변이체 DR6 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 치환(보존적 또는 비-보존적), 하나 이상의 결실, 및/또는 하나 이상의 삽입을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 가용성 DR6 폴리펩타이드는 예를 들면, 포유동물에서 신경세포 및 OPC와 같은 신경세포 시스템의 세포의 생존을 촉진한다.
가용성 DR6 폴리펩타이드는 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4의 적어도 6개, 예를 들면, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 100개 이상의 아미노산의 단편을 포함할 수 있다. 또한, 가용성 또는 우세한 음성 DR6 폴리펩타이드는 적어도 하나, 예를 들면, 5개, 10개, 15개 또는 20개의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4의 참조 DR6 폴리펩타이드에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일한 가용성 DR6 폴리펩타이드의 상응하는 단편이 또한 고려된다.
"DR6 참조 아미노산 서열," 또는 "참조 아미노산 서열"은 어떠한 아미노산 치환도 도입되지 않은 구체적인 서열을 의미한다. 당해 분야의 숙련가가 이해하는 바와 같이, 치환이 없는 경우, "분리된 폴리펩타이드"는 참조 아미노산 서열에 대해 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
보존적 치환은 다음 그룹내의 치환을 포함한다: 발린, 알라닌 및 글리신; 루이신, 발린, 및 이소루이신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴 및 글루타민; 세린, 시스테인, 및 트레오닌; 라이신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 타이로신. 비-극성 소수성 아미노산은 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성으로 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 위에서 언급한 극성, 염기성 또는 산성 그룹 중 하나의 구성원의 동일한 그룹의 다른 구성원에 의한 어떠한 치환도 보존적 치환으로 고려될 수 있다.
비-보존적 치환은 (i) 전기 양성 측쇄를 갖는 잔기(예를 들면, Arg, His 또는 Lys)가 음성 잔기(예를 들면, Glu 또는 Asp)에 대해 또는 이러한 잔기로 치환되거나, (ii) 친수성 잔기(예를 들면, Ser 또는 Thr)가 소수성 잔기(예를 들면, Ala, Leu, Ile, Phe 또는 Val)에 대해 또는 이러한 잔기로 치환되거나, (iii) 시스테인 또는 프롤린이 어떠한 다른 잔기에 대해 또는 이러한 잔기로 치환되거나, (iv) 거대한 소수성 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기(예를 들면, Val, Ile, Phe 또는 Trp)가 유사한 측쇄를 갖는 잔기(예를 들면, Ala, Ser) 또는 측쇄가 없는 잔기(예를 들면, Gly)에 대해 또는 이러한 잔기에 의해 치환된 것들을 포함한다.
당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 2개의 폴리펩타이드 사이의 "서열 동질성"은 하나의 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 제2 폴리펩타이드의 서열과 비교함으로써 측정한다. 본원에 논의한 바와 같이, 어떠한 특수 폴리펩타이드가 다른 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한지의 여부는 당해 분야에 공지된 방법 및 BESTFIT 프로그램(Wisconsin Sequence Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 컴퓨터 프로그램/소프트웨어를 사용하여 측정할 수 있다. BESTFIT는 2개의 서열 사이에 상동성의 가장 우수한 분절을 발견하기 위해, 스미쓰(Smith) 및 워터만(Waterman)의 국소 상동성 알고리즘[Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]을 사용한다. BESTFIT 또는 어떠한 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하여 특수 서열이, 예를 들면, 본원에 기술된 참조 서열에 대해 95% 동일한지를 측정하는 경우, 매개변수는 물론 동질성의 퍼센트가 참조 폴리펩타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산되고 참조 서열내 아미노산의 총 수의 5% 이하의 상동성내 갭(gap)이 허용되도록 설정된다.
당해 분야의 숙련가에 의해 잘 이해되는 바와 같이, 상기 나열된 것들과 같은 DR6 단편은, 길이가 예를 들면 DR6 도메인 영역의 대안의 예측을 기준으로 하여 한쪽 말단에서 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산(또는 보다 더 긴 또는 보다 더 짧은)까지 변할 수 있다. 또한, 상기 나열된 단편의 어느 것도 또한 N-말단에서 분비성 시그날 펩타이드, 예를 들면, 서열 번호: 2의 아미노산 1 내지 40 또는 아미노산 1 내지 41번을 추가로 포함할 수 있다. 본원의 특정한 곳에 기술된 것들과 같은 다른 분비성 시그날 펩타이드도 또한 사용할 수 있다. 서열 번호: 2, 서열 번호: 4에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일한 가용성 DR6 폴리펩타이드의 상응하는 단편, 또는 본원에 기술된 이의 단편 또한 고려된다.
본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 가용성 DR6 폴리펩타이드는 2개 이상의 가용성 DR6 폴리펩타이드의 특정 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 가용성 DR6 폴리펩타이드 이합체가 단독이합체 또는 이종이합체로서 고려된다. 본원에 기술된 2개 이상의 가용성 DR6 폴리펩타이드는 직접 연결될 수 있거나 적합한 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다. 이러한 펩타이드 링커는 본원의 특정한 곳에 기술되어 있다.
본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 가용성 DR6 폴리펩타이드는 환형일 수 있다. 가용성 DR6 폴리펩타이드의 환형화(cyclization)는 선형 펩타이드의 구조적 자유를 감소시켜 더 구조적으로 구속된 분자를 생성한다. 펩타이드 환화의 많은 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 펩타이드의 N-말단 및 C-말단 아미노산 잔기 사이의 아미드 결합의 형성에 의한 "골격(backbone) 대 골격". "골격 대 골격" 환형화 방법은 2개의 ω-티오 아미노산 잔기(예를 들면, 시스테인, 호모시스테인) 사이의 이황화물 브릿지의 형성을 포함한다. 본원에 기술된 특정의 가용성 DR6 펩타이드는 펩타이드의 N- 및 C-말단상의 변형을 포함하여 환형 DR6 폴리펩타이드를 형성한다. 이러한 변형은 시스테인 잔기, 아세틸화된 시스테인 잔기, NH2 잔기 및 바이오틴을 가진 시스테인 잔기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 펩타이드 환형화의 다른 방법은 본원에 이의 전문이 참조로 인용된 문헌[참조: Li & Roller. Curr. Top. Med. Chem. 3:325-341 (2002)]에 기술되어 있다.
본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 환형 DR6 폴리펩타이드는 C1LSPX9X10X11C2 (서열 번호: 5)(여기서, X1는 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 글루탐산, 또는 아스파라긴이고, X2는 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 글루탐산, 또는 아스파라긴이며, X3은 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 글루탐산, 또는 아스파라긴이고, C1은 임의로, 부착된 환형화를 촉진시키는 잔기(예를 들면, 아세틸 그룹 또는 바이오틴)을 가지고 C2는 임의로, 부착된 환형화를 촉진시키는 잔기(예를 들면, NH2 잔기)를 갖는다]를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구체예에서, DR6 길항제 폴리펩타이드는 p75에 대한 DR6의 결합을 억제한다. 일부 구체예에서, DR6 길항제 폴리펩타이드는 p75에 대한 DR6의 결합을 억제하지만 APP에 대한 DR6 결합을 방지하지 않는다.
DR6 길항제 화합물
본원에 기술된 방법에서 DR6 길항제는 길항제 화합물의 부재하에서 DR6의 활성과 비교하여 DR6의 활성을 억제하거나 감소시키는 어떠한 화학적 또는 합성 화합물도 포함한다. DR6 길항제 화합물은 p75에 대한 DR6의 결합을 억제하는 것일 수 있다. DR6 길항제 화합물은 또한 p75에 대한 DR6의 결합을 억제하지만 APP에 대한 DR6의 결합을 방지하지 않는 것일 수 있다.
당해 분야의 숙련가들은 예를 들면 본원에 또한 기술된 검정을 사용하여 신경계 세포 생존을 변형시키는 화합물에 대해 스크리닝함으로써 본원에 기술된 방법에 유용할 수 있는 DR6 길항제 화합물을 스크리닝하고 시험하는 방법을 알고 있다.
DR6 항체 또는 이의 면역특이적인 단편
본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 DR6 길항제는 또한 DR6 활성의 길항제인, DR-특이적인 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. 예를 들면, 신경세포에서 발현된 것으로서, DR6에 대한 DR6 항원 결합 분자 또는 DR6 항체의 결합은 세포자멸사를 억제하거나 세포 생존을 촉진한다.
특정 구체예에서, 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체이며, 여기서, 항체는 신경계의 세포의 생존을 촉진한다. 특정 구체예에서, 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체이며, 여기서, 항체는 희소돌기아교세포의 증식, 분화 또는 생존을 촉진한다. 특정 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체 또는 이의 유도체이며, 여기서, 항체는 수초형성을 촉진한다. 다른 구체예에서, DR6 항체는 p75에 대한 DR6의 결합을 억제하는 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체 또는 이의 유도체이다. 다른 구체예에서, DR6 항체는 p75에 대한 DR6의 결합을 억제하지만 APP에 대한 DR6의 결합을 방지하지 않는 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체 또는 이의 유도체이다.
DR6 항체는 Fab 발현 라이브러리, 항-개체특이형(항-Id) 항체(예를 들면, 본원에 기술된 항체에 대한 항-Id 항체) 및 상기 어느 것의 에피토프-결합 단편에 의해 생산된 폴리클로날, 모노클로날, 다중특이적, 인간, 인간화된 또는 키메라 항체, 일본쇄 항체, scFv, 디아보디(diabody), 트리아보디(triabody), 테트라보디(tetrabody), 미니보디(minibody), 도메인-결실된 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부위, 즉, 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 말한다. 면역글로불린 분자는 특정 유형(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들면, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 면역글로불린 분자의 소부류일 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 사용하기 위한 어떤 DR6 길항제 항체는 특정 DR6 폴리펩타이드 단편 또는 도메인, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 DR6 폴리펩타이드, 단편, 변이체, 또는 유도체에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다. 그와 같은 DR6 폴리펩타이드 단편은 비제한적으로, DR6의 하나 이상 TNFR 같은 시스테인 풍부 모티프를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 DR6 폴리펩타이드를 포함한다. 그와 같은 단편은 예를 들어, SEQ ID NO:2의 아미노산 65 - 105; SEQ ID NO:2의 106 - 145; SEQ ID NO:2의 146 - 185; SEQ ID NO:2의 186 - 212; SEQ ID NO:2의 65 - 145; SEQ ID NO:2의 65 - 185; SEQ ID NO:2의 65 - 212; SEQ ID NO:2의 106 - 185; SEQ ID NO:2의 106 - 212; 및 SEQ ID NO:2의 146 - 212를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단편을 포함한다. 그와 같은 단편은 또한 SEQ ID NO:2의 아미노산 134-189; SEQ ID NO:2의 168-189; 및 SEQ ID NO:2의 134-168을 포함한다. SEQ ID NO:2의 아미노산 65 - 105; SEQ ID NO:2의 106 - 145; SEQ ID NO:2의 146 - 185; SEQ ID NO:2의 186 - 212; SEQ ID NO:2의 65 - 145; SEQ ID NO:2의 65 - 185; SEQ ID NO:2의 65 - 212; SEQ ID NO:2의 106 - 185; SEQ ID NO:2의 106 - 212; SEQ ID NO:2의 146 - 212; SEQ ID NO:2의 134-189; SEQ ID NO:2의 168-189; 및 SEQ ID NO:2의 134-168과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 변이체 DR6 폴리펩타이드의 상응하는 단편이 또한 고려된다. 일부 구체예에서, DR6 항체, 항원 결합 단편, 그의 변이체, 또는 유도체는 DR6와 작용하기 위해 DR6의 Cys3 및 Cys4 영역 모두를 필요로 한다.
다른 구체예에서, 항체는 DR6의 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체, 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 이의 유도체이며, 여기서, 에피토프는 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4의 적어도 약 4 내지 5개의 아미노산, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4의 적어도 7개, 적어도 9개 또는 적어도 약 15 내지 약 30개 아미노산을 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어진다. 기술된 바와 같이, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4의 제공된 에피토프의 아미노산은 연속 또는 선형일 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없다. 특정 구체예에서, DR6의 적어도 하나의 에피토프는 예를 들면, IgG Fc 영역에 융합된, 세포의 표면상에 발현된 것으로서 또는 가용성 단편으로서 DR6의 세포외 도메인에 의해 형성된 비-선형 에피토프를 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어진다. 따라서, 특정 구체예에서 DR6의 적어도 하나의 에피토프는 서열 번호: 2, 또는 서열 번호: 4의 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 약 15 내지 약 30, 또는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 연속적인 또는 비-연속적인 아미노산을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어지며, 여기서, 비-연속 아미노산은 단백질 폴딩(folding)을 통해 에피토프를 형성한다.
다른 구체예에서, 항체는 DR6의 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체이며, 여기서, 에피토프는 위에서 기술한 바와 같이 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4의 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 연속적인 또는 비-연속적인 아미노산, 및 단백질을 변형시키는 추가의 잔기를 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어지며, 예를 들어, 탄수화물 잔기가 포함됨으로써 DR6 항체가 단백질의 변형되지 않은 버젼에 대해서보다 변형된 표적 단백질에 대해 더 높은 친화성으로 결합할 수 있다. 달리는, DR6 항체는 표적 단백질의 전혀 변형되지 않은 버전에 결합하지 않는다.
특정 국면에서, 항체는 DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 또는 DR6 변이체 폴리펩타이드에 대해, 제공된 참조 모노클로날 항체에 대한 해리 상수(KD) 미만의 KD에 의해 특징화된 친화성으로, 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체이다.
특정 구체예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 위에서 기술한 DR6 또는 단편 또는 변이체의 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는데, 즉 관련되지 않거나 무작위적인 에피토프에 결합하는 것 보다 더 용이하게 이러한 에피토프에 결합하고; 위에서 기술한 DR6 또는 단편 또는 변이체의 적어도 하나의 에피토프에 우선적으로 결합하는데, 즉, 관련되거나, 유사하거나, 동종이거나 유사한 에피토프에 결합하는 것보다 더 용이하게 이러한 에피토프에 결합하거나; 위에서 기술한 DR6 또는 단편 또는 변이체의 특정 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 자체 결합하는 참조 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하거나; 또는 위에서 기술한 DR6 또는 단편 또는 변이체의 적어도 하나의 에피토프에 대해 약 5 x 10-2 M, 약 10-2 M, 약 5 x 10-3 M, 약 10-3 M, 약 5 x 10-4 M, 약 10-4 M, 약 5 x 10-5 M, 약 10-5 M, 약 5 x 10-6 M, 약 10-6 M, 약 5 x 10-7 M, 약 10-7 M, 약 5 x 10-8 M, 약 10-8 M, 약 5 x 10-9 M, 약 10-9 M, 약 5 x 10-10 M, 약 10-10 M, 약 5 x 10-11 M, 약 10-11 M, 약 5 x 10-12 M, 약 10-12 M, 약 5 x 10-13 M, 약 10-13 M, 약 5 x 10-14 M, 약 10-14 M, 약 5 x 10-15 M, 또는 약 10-15 M 미만의 해리 상수 KD로 특징화된 친화성으로 결합한다. 특수 국면에서, 항체 또는 이의 단편은 쥐 DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 대해 인간 DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 우선적으로 결합한다. 또 다른 특수 국면에서, 항체 또는 이의 단편은 하나 이상의 DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 예를 들면, 하나 이상의 포유동물 DR6 폴리펩타이드에 우선적으로 결합한다.
항체 결합 해리 상수의 내용에 사용된 것으로서, 용어 "약"은 항체 친화성을 측정하는데 사용된 방법에서 고유한 변화도를 허용한다. 예를 들면, 사용된 기기장치의 정밀도, 측정된 시료의 수를 기준으로 한 표준 오차, 및 라운딩 오차에 따라, 용어 "약 10-2 M"은 예를 들면, 0.05 M 내지 0.005 M을 포함할 수 있다.
특수 구체예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체에 5 X 10-2 초-1, 10-2 초-1, 5 X l0-3 초-1 또는 l0-3 초-1 이하의 오프율[off rate: k(off)]로 결합한다. 달리는, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체에 5 X 10-4 초-1, 10-4 초-1, 5 X 10-5 초-1, 또는 10-5 초-1 5 X 10-6 초-1, 10-6 초-1, 5 X 10-7 초-1 또는 10-7 초-1 이상의 오프율(k(off))로 결합한다.
다른 구체예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체에 103 M-1 초-1, 5 X 103 M-1 초-1, 104 M-1 초-1 또는 5 X 104 M-1 초-1의 온 율[on rate: (k(on)]로 결합한다. 달리는, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체에 105 M-1 초-1, 5 X 105 M-1 초-1, 106 M-1 초-1, 또는 5 X 106 M-1 초-1 또는 107 M-1 초-1이상의 온 율(k(on))로 결합한다
하나의 구체예에서, DR6 항체는, 특정의 모노클로날 항체, 및 이의 단편, 변이체 및 유도체의 적어도 항원-결합 도메인이 표 3 및 4에 나타나 있는 DR6 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 포함한다. 표 3은 파아지 디스플레이 라이브러리(phase display library)로부터 확인된 인간 항-DR6 Fab 영역을 나열한다. 표 4는 하이브리도마로부터 기원한 마우스 항-DR6 항체를 나열한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
본원에 사용된 것으로서, 용어 "항원 결합 도메인"은 항원상의 에피토프(DR6의 에피토프)에 특이적으로 결합한다. 항체의 항원 결합 도메인은 통상적으로 면역글로불린 중쇄 가변 영역의 적어도 일부 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 상기 가변 영역에 의해 형성된 결합 부위는 항체의 특이성을 결정한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체이며, 여기서, DR6 항체는 M50-H01, M51-H09, M53-E04, M53-F04, M62-B02, M63-E10, M66-B03, M67-G02, M72-F03, 및 M73-C04로 이루어진 그룹 중에서 선택된 참조 모노클로날 Fab 항체 단편, 또는 1P1D6.3, 1P2F2.1, 및 1P5D10.2로 이루어진 그룹 중에서 선택된 참조 모노클로날 항체와 동일한 DR6 에피토프에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체이고, 여기서 DR6 항체는 M50-H01, M51-H09, M53-E04, M53-F04, M62-B02, M63-E10, M66-B03, M67-G02, M72-F03 및 M73-C04로 이루어진 그룹 중에서 선택된 참조 모노클로날 Fab 항체 단편, 또는 DR6에 대한 결합으로부터 1P1D6.3, 1P2F2.1, 및 1P5D10.2로 이루어진 그룹 중에서 선택된 참조 모노클로날 항체를 경쟁적으로 억제한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체이고, 여기서, DR6 항체는 M50-H01, M51-H09, M53-E04, M53-F04, M62-B02, M63-E10, M66-B03, M67-G02, M72-F03, 및 M73-C04로 이루어진 그룹 중에서 선택된 모노클로날 Fab 항체 단편 또는 1P1D6.3, 1P2F2.1, 및 1P5D10.2로 이루어진 그룹 중에서 선택된 참조 모노클로날 항체의 것과 동일한 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 2007년 12월 21일자로 출원된 국제 공개공보 제WO2008/080045호에 기술바와 같은 3F4.48, 4B6.9.7 또는 1E5.57로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항체가 아니다. 일부 구체예에서, DR6 항체는 DR6에 대한 3F4.48, 4B6.9.7 또는 1E5.57의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항체가 아니다.
일부 구체예에서, DR6 항체는 길항제 항체이다.
항체의 제조 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있고 본원에 기술되어 있다. 시그날 서열이 없는 완전한 길이의 DR6의 또는 이에 대한 각종 단편에 대한 항체가 생산되면, 항체 또는 항원 결합 단편이 결합하는 DR6의 아미노산 또는 에피토프를 측정하는 것은 본원에 기술된 바와 같이 및 당해 분야에 공지된 방법[예를 들면, 이중 항체-샌드위치 ELISA(double antibody-sandwich ELISA); "Chapter 11 - Immunology," Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel et al., v.2, John Wiley & Sons, Inc. (1996)에 기술됨]으로 측정할 수 있다. 추가의 에피토프 맵핑 프로토콜은, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Morris, G. Epitope Mapping Protocols, New Jersey: Humana Press (1996)]에서 찾을 수 있다. 에피토프 맵핑은 또한 시판되는 수단[예를 들면, ProtoPROBE, Inc.(위스콘신 밀와우키 소재)]로 수행할 수 있다.
또한, DR6의 특정 부위에 결합하는 생산된 항체를 이후에 DR6의 길항제로서 작용하는, 예를 들면, 신경계의 세포의 생존을 촉진하고, 신경계의 신경세포의 사멸과 관련된 상태를 치료하며, 신경계의 세포의 세포자멸사를 예방하는 이들의 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. 항체는 실시예에 상세히 기술된 방법에 따라서 이들 및 다른 특성에 대해 스크리닝할 수 있다. 본원에 기술된 항체의 다른 기능은 본원의 실시예에 기술된 다른 검정을 사용하여 시험할 수 있다.
하나의 구체예에서, 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 DR6 길항제는 항체 분자, 또는 이의 면역특이적인 단편이다. 달리 구체적으로 나타내지 않는 한, 본원에 기술된 바와 같이 항체에 대해 참조하여 "이의 단편"은 면역특이적인 단편, 즉, 항원-특이적인 단편을 말한다.
하나의 구체예에서, 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 결합 분자 또는 항원 결합 분자는 합성 고정 영역을 포함하며, 여기서, 하나 이상의 도메인은 부분적으로 또는 전체적으로 결실("도메인-결실된 항체")이다. 본원에 기술된 특정 방법은 DR6 길항제 항체, 또는 이의 면역특이적인 단편을 투여함을 포함하며, 여기서, 하나 이상의 고정 영역 도메인의 적어도 하나의 분획은 거의 동일한 면역원성이 전체 또는 변경되지 않은 항체와 비교하여 결실되거나 또한 달리 변경됨으로써 감소된 효과인자 기능, 비-공유결합적으로 이합체화되는 능력, 작용 부위에 국재화하는 증가된 능력, 감소된 혈청 반감기, 또는 증가된 혈청 반감기와 같은 바람직한 생화학적 특성을 제공한다. 예를 들면, 본원에 기술된 치료 방법에서 사용하기 위한 특정의 항체는 면역글로불린 중쇄와 유사한 폴리펩타이드 쇄를 포함하지만 하나 이상의 중쇄 도메인의 적어도 일부를 결여하고 있는 도메인 결실된 항체이다.
특정 구체예에서, 상용성 변형된 항체는, 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 결실된 작제물 또는 변이체(△CH2 작제물)를 포함할 것이다. 다른 구체예에서, 짧은 연결 펩타이드는 결실된 도메인으로 치환되어 가변 영역에 대해 굴곡성 및 자유 운동성을 제공할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는, 이러한 작제물이 항체의 물질대사율에 있어서 CH2 도메인의 조절 특성으로 인하여 특정 환경하에서 바람직할 수 있음을 인지할 것이다. 도메인 결실된 작제물은 IgG1 인간 고정 도메인을 암호화하는 벡터(예를 들면, Biogen IDEC Incorporated로부터)를 사용하여 유도될 수 있다(참조: 예를 들면, WO 02/060955A2 및 WO02/096948A2). 상기 예시적인 벡터를 가공하여 CH2 도메인을 결실시키고 도메인 결실된 IgG1 고정 영역을 발현하는 합성 벡터를 제공하였다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 변형된 항체는 미니보디이다. 미니보디는 당해 분야에 기술된 방법(참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,837,821호 또는 제WO 94/09817A1호)을 사용하여 제조할 수 있다.
하나의 구체예에서, 본원에 기술된 치료 방법에 사용하기 위한 DR6 길항제 항체 또는 이의 단편은, 이것이 단량체성 소단위들 사이의 연합을 허용하는 한 약간의 또는 심지어 단일 아미노산의 결실 또는 치환을 갖는 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 부위내 단일 아미노산의 돌연변이는 Fc 결합을 실질적으로 감소시키기에 충분하므로 이에 의해 의도된 작용 부위에 대한 국재화를 증가시킬 수 있다. 유사하게, 조절될 효과인자 기능(예를 들면, 상보체 결합)을 조절하는 하나 이상의 고정 영역 도메인의 일부를 단순히 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 고정 영역의 이러한 부분적 결실은 항체의 선택된 특성(혈청 반감기)를 개선시킬 수 있는 반면 완전한 피검자 고정 영역 도메인과 관련된 다른 바람직한 기능을 남긴다. 또한, 위에서 암시한 바와 같이, 기재된 항체의 고정 영역은 수득되는 작제물의 프로파일을 향상시키는 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 합성될 수 있다. 이와 관련하여, 보존된 결합 부위(예를 들면, Fc 결합)에 의해 제공된 활성을 파괴하는 한편 변형된 항체의 구조 및 면역원성 프로파일을 실질적으로 유지시키는 것이 가능할 수 있다. 여전히 다른 구체예는 효과인자 기능과 같은 바람직한 특성을 향상시키거나 추가의 세포독소 또는 탄수화물 부착을 제공하기 위해 고정 영역에 하나 이상의 아미노산을 첨가하는 것을 포함한다. 이러한 구체예에서, 선택된 고정 영역 도메인으로부터 기원한 특수 서열을 삽입하거나 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
본원에 기술된 치료학적 방법에서 사용하기 위한 특정의 DR6 길항제 항체 또는 이의 면역특이적인 단편에서, Fc 부위는 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 돌연변이시킴으로써 효과인자 기능을 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 고정 영역의 변형을 사용하여 증가된 항원 특이성 또는 항체 굴곡성으로 인한 향성된 국재화를 허용하는 이황화물 연결 또는 올리고사카라이드 잔기를 변형시킬 수 있다. 수득되는 생리학적 프로파일, 생체이용률 및 변형의 다른 생화학적 효과는 과도한 실험없이도 잘 공지된 면역학적 기술을 사용하여 용이하게 측정하고 정량화할 수 있다.
본원에 기술된 방법은 또한 DR6 폴리펩타이드에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편인, 본원에 기술된 항체 분자의 변이체(유도체 포함)(예를 들면, VH 영역 및/또는 VL 영역)을 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어진 항체의 용도를 제공한다. 아미노산 치환을 초래하는 부위-지시된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발을 포함하나, 이에 한정되지 않는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 표준 기술을 사용하여 결합 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열내 돌연변이를 도입시킬 수 있다. 각종 구체예에서, 변이체(유도체 포함)는 참조 VH 영역, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL 영역, VLCDR1, VLCDR2, 또는 VLCDR3에 대해 50개 미만의 아미노산 치환, 40개 미만의 아미노산 치환, 30개 미만의 아미노산 치환, 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 암호화한다. "보존적 아미노산 치환"은, 아미노산 잔기가 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당해 분야에 정의되어 있다. 이들 계열은 염기성 측쇄(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들면, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄(예를 들면, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다. 달리는, 돌연변이를 포화 돌연변이유발과 같은 암호화 서열 모두 또는 일부와 함께 무작위로 도입시키고, 수득되는 돌연변이체를 생물학적 활성에 대해 스크리닝하여 활성을 보유하는 돌연변이체를 확인할 수 있다.
예를 들면, 항체 분자의 골격 영역내에서만 또는 CDR 영역내에서만 돌연변이를 도입시키는 것이 가능하다. 도입된 돌연변이는 사일런트(silent) 또는 중성 미스센스(missense) 돌연변이일 수 있으며, 즉, 항원에 결합하는 항체의 능력에 있어서 효과를 갖지 않거나 거의 가지지 않을 수 있다. 이러한 유형의 돌연변이는 코돈 용도를 최적화시키거나, 하이브리도마의 항체 생산을 개선시키는데 유용할 수 있다. 달리는, 비-중성 미스센스 돌연변이는 항원에 결합하는 항체의 능력을 변경시킬 수 있다. 대부분의 사일런트 및 중성 미스센스 돌연변이의 위치는 골격 영역내일 수 있는 반면, 절대적인 요건이 아니라고 해도 대부분의 비-중성 미스센스 돌연변이의 위치는 CDR내에 있을 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 항원 결합 활성에 있어서의 변경 또는 결합 활성에 있어서의 변경(예를 들면, 항원 결합 활성에 있어서의 개선 또는 항체 특이성에 있어서의 변화)이 없는 것과 같은 바람직한 특성을 가진 돌연변이체 분자를 설계하여 시험할 수 있다. 돌연변이유발에 이어서, 암호화된 단백질을 통상적으로 발현시켜 암호화된 단백질의 기능 및/또는 생물학적 활성을 본원에 기술된 기술을 사용하거나 당해 분야에 공지된 통상적인 변형 기술로 측정할 수 있다.
하나의 구체예에서, 항체는 이특이적인 결합 분자, 결합 폴리펩타이드, 또는 항체, 예를 들면, 이특이적인 항체, 미니보디, 도메인 결실된 항체, 또는 하나 이상의 에피토프, 예를 들면, 하나 이상의 항원 또는 동일한 항원상의 하나 이상의 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 융합 단백질이다. 하나의 구체예에서, 이특이적 항체는 DR6상의 하나 이상의 에피토프에 대해 특이적인 하나 이상의 결합 도메인을 갖는다. 이특이적인 항체는 DR6의 에피토프에 대해 특이적인 2개의 표적 결합 도메인 및 제2 표적에 대해 특이적인 2개의 표적 결합 도메인을 갖는 4가 항체일 수 있다. 따라서, 4가 이특이적인 항체는 각각의 특이성에 대해 2가일 수 있다.
본원에 기술된 진단 및 치료학적 방법에 사용하기 위한 항체 또는 이의 면역원성 단편의 변형된 형태는 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 전체 전구체 또는 모 항체로부터 제조할 수 있다. 예시적인 기술은 본원에 보다 상세히 논의된다.
본원에 기술된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 DR6 길항제 항체 또는 이의 면역특이적인 단편은 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 제조하거나 제작할 수 있다. 특정 구체예에서, 항체 분자 또는 이의 단편은 "재조합적으로 생산", 즉 재조합체 DNA 기술을 사용하여 생산된다. 항체 분자 또는 이의 단편을 제조하기 위한 예시적인 기술은 본원에 또한 보다 상세히 논의되어 있다.
본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 DR6 길항제 항체 또는 이의 단편은 당해 분야에 공지된 어떠한 적합한 방법으로도 생성할 수 있다.
폴리클로날 항체는 당해 분야에 잘 공지된 각종 과정으로 생산할 수 있다. 예를 들어, DR6 면역특이적인 단편은 토끼, 마우스, 랫트 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 각종 숙주 동물에게 투여하여 항원에 대해 특이적인 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청의 생산을 유도할 수 있다. 각종의 항원보강제를 사용하여 숙주 종에 따라 면역학적 반응을 증가시킬 수 있으며, 프루언드(Freund's)(완전 및 불완전), 수산화알루미늄과 같은 무기물 겔, 라이소레시틴과 같은 표면 활성 물질, 플루로닉 폴리올, 다가음이온, 펩타이드, 오일 유액, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀, 및 BCG[카메트 개랭간균(bacille Calmette-Guerin)] 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)과 같은 강력하게 유용한 인간 항원보강제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 당해 보강제는 또한 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합체 및 파아지 디스플레이 기술 또는 이의 조합의 사용을 포함하는 당해 분야에 공지된 광범위한 각종 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 예를 들면, 문헌[참조: Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981)](상기 참조 문헌은 이의 전문이 참조로 인용된다)에 교시되고 당해 분야에 공지된 것들을 포함하는 하이브리도마 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 한정되지 않는다. 용어 "모노클로날 항체"는 특정의 진핵세포, 원핵 세포 또는 파아지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 기원한 항체를 말하며 이것을 생산하는 방법이 아니다. 따라서, 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 한정되지 않는다. 모노클로날 항체는 하이브리도마 및 재조합체 및 파아지 디스플레이 기술의 사용을 포함하는 당해 분야에 공지된 광범위한 각종 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
당해 분야에 인지된 프로토콜을 사용하여, 하나의 예에서, 항체는 관련 항원(예를 들면, 정제된 DR6 항원 또는 이러한 항원을 포함하는 세포 또는 세포 추출물) 및 항원보강제를 다수 피하 또는 복강내 주사함으로써 포유동물에서 생성시킨다. 이러한 면역화는 통상적으로 활성화된 비장세포 또는 림프세포로부터 항원-반응성 항체의 생산을 포함하는 면역 반응을 유발한다. 수득되는 항체를 동물의 혈청으로부터 수거하여 폴리클로날 제제를 제공할 수 있지만, 비장, 림프절 또는 말초 혈액으로부터 개개의 림프세포를 분리하여 모노클로날 항체(MAb)의 균질한 제제를 제공하는 것이 흔히 바람직하다. 특정의 특수 구체예에서, 림프세포는 비장으로부터 수득된다.
이러한 잘 공지된 방법[참조: Kohler et al ., Nature 256:495 (1975)]에서 항원이 주사된 포유동물로부터 비교적 짧은-일생의 또는 사망하는 림프세포를 영구 종양 세포주(예를 들면, 흑색종 세포주)와 융합시킴으로써 둘 다 영구적이고 B 세포의 유전적으로 암호화된 항체를 생산할 수 있는 하이브리드 세포 또는 "하이브리도마"를 생산한다. 수득되는 하이브리드는 선택하고, 희석하며, 단일 항체를 형성시키기 위한 특수 유전자를 포함하는 각각의 개개 균주와 함께 재성장시켜 단일 유전 균주로 격리시킨다. 이들은 바람직한 항원에 대해 균질한 항체를 생산하며, 이들의 순수한 유전적 퍼센트와 관련하여 "모노클로날"로 명명된다.
전형적으로, 이렇게 제조된 하이브리도마를 종균접종하고 융합되지 않은 모 흑색종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 속에서 성장시킨다. 당해 분야의 숙련가는, 하이브리도마의 형성, 선택 및 성장을 위한 시약, 세포주 및 배지가 다수의 공급원으로부터 상업적으로 이용가능하며 표준화된 프로토콜이 잘 확립되어 있음을 인지할 것이다. 일반적으로, 하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 목적한 항원에 대한 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정된다. 특정 구체예에서, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전, 방사면역검정(RIA) 또는 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA)와 같은 시험관내 검정으로 측정한다. 목적한 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 희석 과정을 제한함으로써 아클로닝(subcloning)하여 표준 방법[참조: Goding, Monoclonal Antiodies: Principles 및 Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)]으로 성장시킬 수 있다. 아클론에 의해 분비된 모노클로날 항체가 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터, 예를 들면, 단백질-A, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상의 정제 과정으로 분리할 수 있다.
특수 에피토프를 인지하는 항체 단편은 공지된 기술로 생성시킬 수 있다. 예를 들면, Fab 및 F(ab')2 단편을 파파인(Fab 단편을 생산하기 위함) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 생산하기 위함)과 같은 효소를 사용하여 면역글로불린 분자 분자의 단백분해적 분해로 생산할 수 있다. F(ab')2 단편은 중쇄의 가변 영역, 경쇄 고정 영역 및 CH1 도메인을 함유한다.
당해 분야의 숙련가들은 또한, 항체 또는 항체 단편(예를 들면, 항원 결합 부위)를 암호화하는 DNA가 또한 항체 파아지 라이브러리로부터 기원할 수 있음을 인지할 것이다. 특히, 이러한 파아지는 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들면, 인간 또는 쥐)로부터 발현된 항원-결합 도메인을 표시하기 위해 이용될 수 있다. 목적한 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파아지는 항원을 사용하여, 예를 들면, 고체 표면 또는 비드(bead)에 결합하거나 포획된 항원 또는 표지된 항원을 사용하여 선택하거나 확인할 수 있다. 상기 방법에 사용된 파아지는 통상적으로 파아지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 이황화물 안정화된 Fv 항체 도메인과 함께 파아지로부터 발현된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함하는 필라멘트성 파아지이다. 예시적인 방법은 예를 들면, 이의 각각이 본원에 참조로 인용된 문헌[참조; EP 제368 684 B1호; 미국 특허 제5,969,108호, Hoogenboom, H.R. and Chames, Imminol . Today 21:371 (2000); Nagy et al . Nat . Med. 8:801 (2002); Huie et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98:2682 (2001); Lui et al., J. Mol . Biol . 315:1063 (2002)]에 기재되어 있다. 수개의 공보[예를 들면, Marks et al ., Bio / Technology 10:779-783 (1992)]는 대형 파아지 라이브러리를 작제하기 위한 전략으로서 쇄 셔플링(chain shuffling) 및 또한 조합적 형질감염 및 생체내 재조합에 의해 고 친화성 인간 항체의 생산을 기술하고 있다. 또 다른 구체예에서, 리보소옴 디스플레이를 사용하여 디스플레이 플랫폼으로서 박테리오파아지를 교체하는데 사용할 수 있다[참조: 예를 들면, Hanes et al., Nat . Biotechnol. 18:1287 (2000); Wilson et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98:3750 (2001); 또는 Irving et al., J. Imminol . Methods 248:31 (2001)]. 여전히 다른 구체예에서, 세포 표면 아리브러리를 항체에 대해 스크리닝할 수 있다[참조: Boder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10701 (2000); Daugherty et al., J. Immonol. Methods 243:211 (2000)]. 이러한 과정은 모노클로날 항체의 분리 및 후속적인 클로닝을 위한 전통적인 하이브리도마 기술에 대한 대안을 제공한다.
파아지 디스플레이 방법에서, 기능적 항체 도메인은 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 수반하는 파아지 입자의 표면에 나타난다. 특히, VH 및 VL 영역을 암호화하는 DNA 서열은 동물 cDNA 라이브러리(예를 들면, 림프종 조직의 인간 또는 쥐 cDNA 라이브러리 또는 합성 cDNA 라이브러리로부터 증폭된다. 특정 구체예에서, VH 및 VL 영역을 암호화하는 DNA는 scFv 링커에 의해 PCR로 함께 결합되어 파아지미드 벡터(예를 들면, p CANTAB 6 또는 pComb 3 HSS)내로 클로닝된다. 벡터는 이. 콜라이(E. coli)내에서 전기천공되고 이. 콜라이는 헬퍼 파아지로 감염된다. 상기 방법에 사용된 파아지는 통상적으로 fd 및 M13을 포함하는 필라멘트성 파아지이고, VH 또는 VL 영역은 일반적으로 파아지 유전자 III 또는 유전자 VIII에 재조합체적으로 융합된다. 목적한 항원(즉, DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편)에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파아지는 항원, 예를 들면, 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 사용하여 선택하거나 확인할 수 있다.
항체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 파아지 디스플레이 방법의 추가의 예는 문헌[참조: 이들 각각의 전문이 본원에 참조로 인용된, Brinkman et al., J. Imminol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur . J. Immunol . 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187:9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT 특허원 제PCT/GB91/01134호; PCT 공보 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 특허 제5,698,426호; 제5,223,409호; 제5,403,484호; 제5,580,717호; 제5,427,908호; 제5,750,753호; 제5,821,047호; 제5,571,698호; 제5,427,908호; 제5,516,637호; 제5,780,225호; 제5,658,727호; 제5,733,743호 및 제5,969,108호]에 기술된 것들을 포함한다.
상기 참조 문헌에 기술된 바와 같이, 파아지 선택 후에, 파아지로부터의 영역을 암호화하는 항체를 분리하여 인간 항체, 또는 특정의 다른 바람직한 항원 결합 단편을 생성하는데 사용하고, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 세균을 포함하는 특정의 바람직한 숙주내에서 발현시킬 수 있다. 예를 들면, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생산하기 위한 기술은 또한 문헌[참조: PCT 공보 WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); 및 Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); 및 Better et al., Science 240:1041-1043 (1988)](상기 참조 문헌은 이의 전문이 참조로 인용되어 있다)에 기술된 것과 같이 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 이용할 수 있다.
다른 구체예에서, 목적한 모노클로날 항체를 암호화하는 DNA는 통상의 과정(예를 들면, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써)을 사용하여 용이하게 분리하고 서열분석할 수 있다. 특정 구체예에서, 분리되고 아클로닝된 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로서 제공된다. 분리되면, DNA를 달리는 면역글로불린을 생산하지 않는 이. 콜라이 세포, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포 또는 흑색종 세포와 같은 원핵 또는 진핵 숙주 세포내로 형질감염시킨 발현 세포내로 위치시킬 수 있다. 보다 특히, 분리된 DNA(이는 본원에 기술된 바와 같이 합성될 수 있다)를 사용하여 본원에 참조로 혼입된, 1995년 1월 25일자로 출원된 뉴만(Newman) 등의 미국 특허 제5,658,570호에 기술된 바와 같이 항체 제조를 위한 고정 및 가변 영역 서열을 클로닝할 수 있다. 필수적으로, 이는 선택된 세포로부터 RNA의 추출, cDNA로의 전환, 및 Ig 특이적인 프라이머를 사용한 PCR에 의한 증폭을 내포한다. 당해 목적을 위한 적합한 프라이머는 또한 미국 특허 제5,658,570호에 기술되어 있다. 하기에 보다 상세히 논의될 바와 같이, 목적한 항체를 발현하는 형질전환된 세포는 비교적 다량으로 성장시켜 면역글로불린의 임상 및 시판 공급물을 제공할 수 있다.
특수 구체예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 당해 분야에 잘 공지된 방법, 예를 들면, 서열 초가변성의 영역을 측정하기 위해 공지된 아미노산 서열에 대해 다른 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 비교함으로써 상보성 결정 영역(CDR)의 서열을 확인하기 위해 검사할 수 있다. 통상의 재조합체 DNA 기술을 사용하여, 하나 이상의 CDR을 골격 영역내에, 예를 들면 인간 골격 영역내에 삽입하여 비-인간 항체를 인간화할 수 있다. 골격 영역은 천연적으로 존재하는 또는 콘센서스 골격 영역, 예를 들면, 인간 골격 영역[참조: 인간 골격 영역의 목록의 경우 Chothia et al., J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998)]일 수 있다. 특정 구체예에서, 골격 영역 및 CDR의 조합에 의해 생성된 폴리뉴클레오타이드는 목적한 폴리펩타이드의 적어도 하나의 에피토프, 예를 들면, DR6에 특이적으로 결합하는 항체를 암호화한다. 추가의 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 예를 들면, 이의 항원에 대한 항체의 결합을 개선시키기 위해 골격 영역내에서 수행할 수 있다. 또한, 이러한 방법을 사용하여 하나 이상의 쇄내 이황화물 결합을 결여하는 항체 분자를 생성시키기 위해 쇄내 이황화물 결합에 관여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 결실 또는 아미노산 치환을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 다른 변형도 고려되며 당해 분야의 기술내에 있다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 치료방법에서 사용하기 위한 DR6 길항제 항체 또는 이의 면역특이적인 단편은 치료될 동물, 예를 들면, 인간에서 유해한 면역 반응을 이끌어내지 않을 것이다. 하나의 구체예에서, 본원에 기술된 치료 방법에서 사용하기 위한 DR6 길항제 항체 또는 이의 면역특이적인 단편을 변형시켜 당해분야에 인지된 기술을 사용하여 이들의 면역원성을 감소시킨다. 예를 들면, 항체는 인간화되거나, 영장류화되거나, 탈면역화되거나 또는 키메라 항체가 될 수 있다. 이러한 유형의 항체는 모 항체의 항원-결합 특성을 보유하거나 실질적으로 보유하지만, 인간에서 거의 면역원성이 아닌, 비-인간 항체, 통상적으로 쥐 또는 영장류 항체로부터 기원한다. 이는 (a) 전체의 비-인간 가변 도메인을 인간 고정 영역에 이식하여 키메라 항체를 생성시키거나; (b) 하나 이상의 비-인간 상보성 결정 영역(CDR)의 적어도 일부를 중요한 골격 잔기가 있거나 없는 인간 골격 및 고정 영역내로 이식하거나; 또는 (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만 표면 잔기의 치환에 의해 이들을 인간-유사 단면으로 "클로오킹(cloaking)"함을 포함하는 각종 방법으로 달성할 수 있다. 이러한 방법은, 이들 문헌 모두가 전문이 참조로 본원에 인용된 문헌[참조: Morrison et　al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et　al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994), 및 미국 특허 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,762호, 및 제6,190,370호]에 기재되어 있다.
탈-면역화는 또한 항체의 면역원성을 감소시키는데 사용할 수 있다. 본원에 사용한 것으로서, 용어 "탈-면역화"는 T 세포 에피토프를 변형시키기 위한 항체의 변경을 포함한다(참조: 예를 들면, WO9852976A1, WO0034317A2). 예를 들면, 출발 항체로부터의 VH 및 VL 서열을 분석하고 인간 T 세포 에피토프를 서열내 상보성-결정 인자(CDR) 및 다른 주요 잔기와 관련하여 에피토프의 국재화를 나타내는 각각의 V 영역으로부터 "맵(map)"할 수 있다. T 세포 에피토프 맵으로부터 개개의 T 세포 에피토프를 분석하여 최종 항체의 활성을 변경시키는 위험이 낮는 대안의 아미노산 치환을 확인할 수 있다. 대안의 VH 및 VL 서열의 범위는 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 설계하며 이들 서열은 후속적으로 결합 폴리펩타이드, 예를 들면, 본원에 기술된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 DR6 길항제 항체 또는 이의 면역특이적인 단편의 범위내로 혼입한 후, 기능에 대해 시험한다. 전형적으로, 12 내지 24개의 변이체 항체가 생성되어 시험된다. 이후에, 변형된 V 및 인간 C 영역을 포함하는 완전한 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현 벡터내로 클로닝하고 이후의 플라스미드를 전체 항체의 생산을 위한 세포주내로 도입한다. 이후에, 항체를 적절한 생화학적 및 생물학적 검정에서 비교하고, 최적의 변이체를 확인한다.
키메라 항체는, 쥐 모노클로날 항체 및 인간 면역글로불린 고정 영역으로부터 기원한 가변 영역을 갖는 항체와 같이, 항체의 상이한 부위가 상이한 동물 종으로부터 기원한 분자이다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985), Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); 미국 특허 제 5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제4,816397호]. 인간화된 항체는 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 골격 영역을 갖는 목적한 항원을 결합시키는 비-인간 종 항체로부터의 항체 분자이다. 종종, 인간 골격 영역내 골격 잔기는 CDR 공여체 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환되어 항원 결합을 변경, 예를 들면, 개선시킬 것이다. 이러한 골격 치환은 당해 분야에 잘 공지되 방법에 의해, 예를 들면, 특수 위치에서 특별한 골격 잔기를 확인하기 위한 항원 결합 및 서열 비교에 중요한 골격 잔기를 확인하기 위해 CDR 및 골격 잔기의 상호작용을 모델링함으로써 확인한다[참조: 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 Queen 등의 미국 특허 제5,585,089호; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)]. 항체는 예를 들면, CDR-이식(EP 239,400; PCT 공보 WO 91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호), 베니어링(veneering) 또는 재표면화(resurfacing)[참조: EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)), 및 쇄 셔플링(미국 특허 제5,565,332호)을 포함하는 당해 분야에 공지된 각종의 기술을 사용하여 인간화시킬 수 있다.
재조합체 항체를 생성하기 위한 여전히 또 다른 고 효율적인 수단은 문헌[참조: Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992)]에 기재되어 있다. 구체적으로, 상기 기술은 당나귀 가변 도메인 및 인간 고정 서열을 함유하는 영장류화된 항체의 생성을 초래한다. 상기 문헌은 본원에 이의 전문이 참조로 인용된다. 더우기, 상기 기술은 또한 이들 각각이 본원에 참조로 인용된 공동 양도된 미국 특허 제5,658,570호, 제5,693,780호 및 제5,756,096호에 기술되어 있다.
완전한 인간 항체는 인간 환자의 치료학적 치료에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 기원한 항체 라이브러리를 사용하여 상기 기술된 파아지 디스플레이 방법을 포함하는 당해 분야에 공지된 각종 방법으로 제조할 수 있다(참조: 또한 이들 각각의 전문이 본원에 참조로 인용된, 미국 특허 제 4,444,887호 및 제4,716,111호; 및 PCT 공보 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741).
인간 항체는 또한 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없으나, 내인성 면역글로불린을 생산할 수 없는 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 유전자삽입 마우스를 사용하여 생산할 수 있다(참조: 예를 들면, 이의 각각이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제6,075,181호, 제5,939,598호, 제5,591,669호 및 제5,589,369호). 예를 들면, 키메라 및 배아-주 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 초래하는 것으로 기술되어 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 마우스 배아 줄기 세포내로 무작위로 또는 동종 재조합에 의해 도입시킬 수 있다. 달리는, 인간 가변 영역, 고정 영역, 및 다양성 영역을 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 외에 마우스 배아 줄기 세포내로 도입시킬 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 동종 재조합에 의해 인간 면역글로불린 유전자 부위의 도입과는 별도로 또는 이와 동시에 비-기능성이 되도록 할 수 있다. 특히, JH 영역의 동종접합성 결실은 내인성 항체 생산을 방지한다. 변형된 배아 줄기 세포는 확장시키고 배반포내로 미세주사하여 키메라 마우스를 생산한다. 이후에, 키메라 마우스를 번식시켜 인간 항체를 발현하는 동형접합성 새끼를 생산한다. 유전자삽입 마우스는 선택된 항원, 예를 들면, 목적한 표적 폴리펩타이드 모두 또는 일부를 사용하여 정상 양식으로 면역화시킨다. 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체는 면역화된, 유전자삽입 마우스로부터 통상의 하이브리도마 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 유전자삽입 마우스가 지닌 인간 면역글로불린 이식유전자를 B-세포 분화 동안 재배열하고, 후속적으로 부류 스위칭(class switching) 및 체세포 돌연변이시킨다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여 치료학적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산할 수 있다. 인간 항체를 생산하기 위한 이러한 기술의 개관을 위해서는, 문헌[참조: Lonberg and Huszar Int . Rev . Immunol . 13:65-93 (1995)]을 참조한다. 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 상기 기술 및 이러한 항체를 생산하기 위한 프로토콜의 상세한 논의에 대해서는 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌, 예를 들면, PCT 공보 WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; 미국 특허 제5,413,923호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,569,825호; 제5,661,016호; 제5,545,806호; 제5,814,318호; 및 제5,939,598호를 참조한다. 또한, 제조회사[예를 들면, Abgenix, Inc.(캘리포니아 프리몬트 소재) 및 GenPharm(캘리포니아 산 조세 소재)]를 참여시켜 위에서 기술한 것과 유사한 기술을 사용하여 선택된 항원에 대해 지시된 인간 항체를 제공할 수 있다.
SCID 마우스를 사용하여 인간 항체를 생성하는 또 다른 방법은 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,811,524호에 기재되어 있다. 이들 인간 항체와 관련된 유전 물질은 또한 본원에 기술된 바와 같이 분리하여 조작하는 것이 인지될 것이다.
선택된 에피토프를 인지하는 완전한 인간 항체는 "안내된 선택(guided selection)"으로 언급된 기술을 사용하여 생성할 수 있다. 이러한 시도에서 선택된 비-인간 모노클로날 항체, 예를 들면, 마우스 항체를 사용하여 동일한 에피토프를 인지하는 완전한 인간 항체의 선택을 안내한다[참조: Jespers et al., Bio/Technology 12:899-903 (1988)]. 또한, 예를 들면, VHCDR3 만이 변하지 않는 무작위적 라이브러리로부터의 선택을 기재하고 있는 미국 특허 제5,565,332호를 참조한다.
대안적으로, 일본쇄 항체의 생산을 기술하는 기술[참조: 미국 특허 제4,694,778호; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc . Natl . Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); 및 Ward et al., Nature 334:544-554 (1989)]을 사용할 수 있다. 일본쇄 항체는 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 아미노산 브릿지를 통해 연결시켜 형성시킴으로써 일본쇄 항체를 수득한다. 이. 콜라이 내에서 기능적 Fv 단편의 조립을 위한 기술을 또한 사용할 수 있다[참조: Skerra et al., Science 242:1038-1041 (1988)]. 일본쇄 Fv 및 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 기술의 예는 문헌[참조: 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,258,498호; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); 및 Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993)]에 기술된 것들을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 림프세포는 미세조작 및 분리된 다양한 유전자에 의해 선택할 수 있다. 예를 들면, 말초 혈액 단핵 세포를 면역화된 포유동물로부터 분리하여 시험관내에서 약 7일 동안 배양할 수 있다. 배양물을 스크리닝 범주를 충족하는 특이적인 IgG에 대해 스크리닝할 수 있다. 양성 웰(positive well)로부터의 세포를 분리할 수 있다. 개개의 Ig를 생산하는 B 세포를 FACS에 의해 또는 이들을 상보체-매개된 용혈성 플라크 검정에서 확인함으로써 분리할 수 있다. Ig를 생성하는 B 세포를 튜브 내로 미세조작하고 VH 및 VL 유전자를 예를 들면, RT-PCR을 사용하여 증폭시킬 수 있다. VH 및 VL 유전자는 항체 발현 벡터내로 클로닝하여 발현을 위한 세포(예를 들면, 진핵세포 또는 원핵세포 세포)내로 형질감염시킬 수 있다.
대안적으로, 항체를 생산하는 세포주를 선택하여 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 기술을 사용하여 배양할 수 있다. 이러한 기술은 각종 실험실 매뉴얼 및 주요 공보에 기술되어 있다. 이와 관련하여, 하기 기술된 바와 같은 방법에서 사용하기에 적합한 기술은 보충물을 포함하여, 본원에 이의 전문이 참조로 인용된 문헌(참조: Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991)]에 기술되어 있다.
본원에 기재된 치료학적 방법에 사용하기 위한 항체는 항체의 합성을 위해 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 특히, 본원에 기술된 바와 같은 화학적 합성 또는 재조합체 발현 기술에 의해 생산할 수 있다.
항원 결합 DNA 서열의 대립형질, 변이체 및 돌연변이를 본원에 기술된 방법에 사용할 수 있다는 것을 추가로 인식할 것이다.
하나의 구체예에서, 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA를 역 전사효소 및 DNA 폴리머라제를 익히 공지된 방법에 따라 사용하여 동시에 또는 별도로 제조할 수 있다. PCR은 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열을 기초로 하여 컨센서스 고정 영역 프라이머에 의해 또는 추가의 특이적인 프라이머에 의해 개시할 수 있다. 상기 논의한 바와 같이, PCR을 또한 사용하여 항체 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 클론을 분리할 수 있다. 이 경우에 라이브러리는 컨센서스 프라이머 또는, 마우스 고정 영역 프로브와 같은 보다 큰 동종 프로브로 스크리닝할 수 있다.
DNA, 전형적으로 플라스미드 DNA는 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 세포로부터 분리하고, 제한 맵핑하고 예를 들면, 재조합체 DNA 기술과 관련하여 앞서의 참조 문헌에 상세히 기술된 표준의 잘 공지된 기술에 따라 서열분석할 수 있다. 물론, DNA는 분리 방법 또는 후속적인 분석 동안 어느 시점에서도 합성될 수 있다.
항체, 또는 이의 단편, 유도체 또는 유사체, 예를 들면, DR6 길항제인 항체의 중쇄 또는 경쇄의 재조합체 발현은 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터의 작제를 필요로 한다. 항체 분자 또는 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 이의 부위(예를 들면, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 함유)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 수득되면, 항체 분자의 생산을 위한 벡터를 당해 분야에 익히 공지된 기술을 사용하여 재조합체 DNA 기술로 생산할 수 있다. 따라서, 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 발현함으로써 단백질을 제조하는 방법은 본원에 기술되어 있다. 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지된 방법을 사용하여 항체를 암호화하는 서열 및 적절한 전사 및 해독 제어 시그날을 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 당해 방법은 예를 들면, 시험관내 재조합체 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 유전 재조합을 포함한다. 또한 프로모터에 작동적으로 연결된, 항체 분자 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터도 또한 고려된다. 이러한 벡터는 항체 분자의 고정 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(참조: 예를 들면, PCT 공보 WO 86/05807; PCT 공보 WO 89/01036; 및 미국 특허 제5,122,464) 및 항체의 가변 도메인을 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위한 이러한 벡터내로 클로닝할 수 있다.
발현 벡터는 통상의 기술로 숙주 세포로 형질감염시킨 후 형질감염된 세포를 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 항체를 제조하는 통상의 기술로 배양한다. 따라서, 이종 프로모터에 작동적으로 연결된, 항체, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본원에 기술되어 있다. 이본쇄 항체의 발현을 위한 특정 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 둘다를 암호화하는 벡터는 하기 기술된 바와 같이 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포내에서 공-발현될 수 있다.
각종의 숙주-발현 벡터 시스템을 사용하여 본원에서 또한 기술된 방법에 사용하기 위한 항체 분자를 발현시킬 수 있다.
숙주 세포는 2개의 발현 벡터, 즉 중쇄 기원한 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 벡터 및 경쇄 기원한 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 벡터로 동시-형질감염될 수 있다. 2개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 동등한 발현이 가능하도록 하는 동일한 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 달리는, 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘다를 암호화하는 단일 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 상황에서, 경쇄는 유리하게는 중쇄 앞에 위치함으로써 과도한 독성 유리된 중쇄를 피한다[참조: Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)]. 중쇄 및 경쇄에 대한 암호화 서열은 cDNA 또는 게놈성 DNA를 포함할 수 있다.
항체 분자가 재조합적으로 발현되면, 이는 면역글로불린 분자의 정제를 위한 당해 분야에 공지된 어떠한 방법, 예를 들면, 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 특히 단백질 A 다음의 특이적 항원에 대한 친화성에 의한 친화성, 및 크기 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등적 용해도, 또는 단백질의 정제를 위한 다른 어떠한 표준 기술에 의해서도 정제할 수 있다. 달리는, 항체의 친화성을 증가시키는 방법은 미국 특허 공개공보 제US 2002 0123057 A1호에 기재되어 있다.
또한, 하기 보다 상세히 기술된 바와 같이, 본원에 기술된 DR6 항체 또는 항체 단편 중 어느 것도 하나 이상의 중합체에 접합(공유결합)시킬 수 있다. 하나의 특수 구체예에서, 특수 에피토프, 예를 들면, Fab, F(ab')2, Fv 단편 또는 일본쇄 항체를 인지하는 항체 단편을 중합체에 접합시킬 수 있다. 이러한 접합에 적합한 중합체의 예는 폴리펩타이드, 당 중합체 및 폴리알킬렌 글리콜 쇄(하기에 보다 상세히 기술된 바와 같음)를 포함한다. 일반적으로 사용된 중합체의 부류는 폴리알킬렌 글리콜이다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 가장 흔히 사용된다. PEG 잔기, 예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 PEG 중합체를 DR6 항체 또는 이의 단편에 접합시켜 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. PEG 잔기는 비-항원성이고 필수적으로 생물학적으로 불활성이다. 사용된 PEG 잔기는 측쇄 또는 직쇄일 수 있다.
DR6 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드는 DR6 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
하나의 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 분리된 폴리뉴클레오타이드이며, 여기서, 중쇄 가변 영역의 적어도 하나의 CDR 또는 중쇄 가변 영역의 적어도 2개의 VH-CDR은 본원에 기재된 모노클로날 DR6 항체로부터의 참조 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2, 또는 VH-CDR3 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 달리는, VH의 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 영역은 본원에 기술된 모노클로날 DR6 항체로부터의 참조 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서, 당해 구체예에 따라서, 중쇄 가변 영역은 표 5에 나타낸 폴리펩타이드와 관련하여 VH-CDR1, VH-CDR2, 또는 VH-CDR3 폴리펩타이드 서열을 갖는다.
또 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 이것으로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어진 분리된 폴리뉴클레오타이드이며, 여기서, 경쇄 가변 영역의 적어도 하나의 VL-CDR 또는 경쇄 가변 영역의 적어도 2개의 VL-CDR은 본원에 기술된 모노클로날 DR6 항체로부터의 참조 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2, 또는 VL-CDR3 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 달리는, VL의 VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 영역은 본원에 기술된 모노클로날 DR6로부터의 참조 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서, 당해 구체예에 따라서 경쇄 가변 영역은 표 5에 나타낸 폴리펩타이드 서열과 관련하여 VL-CDR1, VL-CDR2, 또는 VL-CDR3 폴리펩타이드 서열을 갖는다.
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당해 분야에 공지된 바와 같이, 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 사이의 "서열 동질성"은 하나의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 아미노산 또는 핵산 서열을 제2의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 서열과 비교함으로써 측정한다. 본원에서 논의되는 경우, 특정의 폴리펩타이드가 또 다른 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한지의 여부는 BESTFIT 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)과 같이, 그러나 이에 한정되지 않는 컴퓨터 프로그램/소프트웨어 및 방법을 사용하여 측정할 수 있다. BESTFIT는 스미쓰(Smith) 및 워터만(Waterman)[참조: Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘을 사용하여 2개 서열 사이의 상동성의 가장 우수한 분절을 찾는다. BESTFIT 또는 특정의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하여 특수 서열이 참조 서열에 대해, 예를 들면, 95% 동일한지의 여부를 측정하는 경우, 매개변수는 물론, 동일성의 비율이 참조 폴리펩타이드 서열의 완전한 길이에 걸쳐 계산되고, 참조 서열내 아미노산의 총 수의 5% 이하의 상동성에 있어서의 갭이 허용되도록 설정한다.
특정 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 VH를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다. 특정 구체예에서, VH 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 이에 의해 암호화된 아미노산 서열의 변경없이 변경된다. 예를 들어, 서열은 제공된 종에서 개선된 코돈 용도를 위해 변경됨으로써 스플라이스 부위를 제거하거나 제한 효소 부위를 제거할 수 있다. 상기와 같은 서열 최적화는 실시예에 기술되어 있으며 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있고 통상적으로 수행된다.
또 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는, VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 영역이 표 5에 나타낸 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 그룹과 동일한 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 핵산을 포함하거나, 당해 핵산으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 분리된 폴리뉴클레오타이드이다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 VH를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 항체 VH 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드이고, 여기서, VH 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8, 9, 및 10; SEQ ID NO: 18, 19, 및 20; SEQ ID NO: 28, 29, 및 30; SEQ ID NO: 38, 39, 및 40; SEQ ID NO: 48, 49, 및 50; SEQ ID NO: 58, 59, 및 60; SEQ ID NO: 68, 69, 및 70; SEQ ID NO: 78, 79, 및 80; SEQ ID NO: 88, 89, 및 90; SEQ ID NO: 98, 99, 및 100; SEQ ID NO: 108, 109, 및 110; SEQ ID NO: 118, 119, 및 120; 및 SEQ ID NO: 128, 129, 및 130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, VH-CDR3를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 결합한다.
어떤 구체예에서, 상기 기재된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상에 의해 암호화된 VH를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 M50-H01, M51-H09, M53-E04, M53-F04, M62-B02, M63-E10, M66-B03, M67-G02, M72-F03, 및 M73-C04로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 Fab 항체 단편, 또는 1P1D6.3, 1P2F2.1, 및 1P5D10.2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체와 동일한 DR6 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하고, 또는 그와 같은 모노클로날 항체 또는 단편이 DR6에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 것이다.
어떤 구체예에서, 상기 기재된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상에 의해 암호화된 VH를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 5×10-2 M, 10-2 M, 5×10-3 M, 10-3 M, 5×10-4 M, 10-4 M, 5×10-5 M, 10-5 M, 5×10-6 M, 10-6 M, 5×10-7 M, 10-7 M, 5×10-8 M, 10-8 M, 5×10-9 M, 10-9 M, 5×10-10 M, 10-10 M, 5×10-11 M, 10-11 M, 5×10-12 M, 10-12 M, 5×10-13 M, 10-13 M, 5×10-14 M, 10-14 M, 5×10-15 M, 또는 10-15 M 초과인 해리상수 (KD)를 특징으로 하는 친환도로, DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 또는 DR6 변이체 폴리펩타이드에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
어떤 구체예에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 VL을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
또 다른 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 면역글루불린 경쇄 가변 영역(VL)를 암호화하는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드이고, 여기서, 상기 VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 영역은 표 5에 보여진 VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 그룹과 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는다. 어떤 구체예에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 VL을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
추가 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 면역글루불린 경쇄 가변 영역(VL)를 암호화하는 핵산를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드이고, 여기서, 상기 VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 영역은 표 5에 보여진 VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 그룹을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 어떤 구체예에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 VL을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 항체 VL 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드이고, 여기서, 상기 VL 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 13, 14, 및 15; SEQ ID NO: 23, 24, 및 25; SEQ ID NO: 33, 34, 및 35; SEQ ID NO: 43, 44, 및 45; SEQ ID NO: 53, 54, 및 55; SEQ ID NO: 63, 64, 및 65; SEQ ID NO: 73, 74, 및 75; SEQ ID NO: 83, 84, 및 85; SEQ ID NO: 93, 94, 및 95; SEQ ID NO: 103, 104, 및 105; SEQ ID NO: 113, 114, 및 115; SEQ ID NO: 123, 124, 및 125; 및 SEQ ID NO: 133, 134, 및 135로 이루어진 그룹으로부터 선택된VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 상기 VL-CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 결합한다.
어떤 구체예에서, 상기 기재된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상에 의해 암호화된 VL을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 M50-H01, M51-H09, M53-E04, M53-F04, M62-B02, M63-E10, M66-B03, M67-G02, M72-F03, 및 M73-C04로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 Fab 항체 단편, 또는 1P1D6.3, 1P2F2.1, 및 1P5D10.2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체와 동일한 DR6 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하고, 또는 그와 같은 모노클로날 항체 또는 단편이 DR6에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 것이다.
어떤 구체예에서, 상기 기재된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상에 의해 암호화된 VL을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 5×10-2 M, 10-2 M, 5×10-3 M, 10-3 M, 5×10-4 M, 10-4 M, 5×10-5 M, 10-5 M, 5×10-6 M, 10-6 M, 5×10-7 M, 10-7 M, 5×10-8 M, 10-8 M, 5×10-9 M, 10-9 M, 5×10-10 M, 10-10 M, 5×10-11 M, 10-11 M, 5×10-12 M, 10-12 M, 5×10-13 M, 10-13 M, 5×10-14 M, 10-14 M, 5×10-15 M, 또는 10-15 M 이하의 해리상수 (KD)를 특징으로 하는 친화도로, DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 또는 DR6 변이체 폴리펩타이드에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
추가 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117 및 127로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VH 폴리펩타이드 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 95% 또는 100% 동일한 VH를 암호화하는 핵산를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 어떤 구체예에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 VH를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
또 다른 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117 및 127로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드 서열을 갖는 VH를 암호화하는 핵산 서열를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 어떤 구체예에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 VH를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
추가 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 및 126로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 핵산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 95% 또는 100% 동일한 VH 암호화 핵산를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 어떤 구체예에서, 그와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 VH를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
또 다른 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 VH를 암호화하는 핵산 서열를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 여기서, 상기 VH의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117 및 127로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 VH를 암호화하는 핵산 서열를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 여기서, 상기 핵산의 서열은 SEQ ID NO: 6, 16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 및 126로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 어떤 구체예에서, 그와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 VH를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
어떤 구체예에서, 상기 기재된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상에 의해 암호화된 VH를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 M50-H01, M51-H09, M53-E04, M53-F04, M62-B02, M63-E10, M66-B03, M67-G02, M72-F03, 및 M73-C04로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 Fab 항체 단편, 또는 1P1D6.3, 1P2F2.1, 및 1P5D10.2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체와 동일한 DR6 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하고, 또는 그와 같은 모노클로날 항체 또는 단편에 DR6에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 것이고, 또는 그와 같은 모노클로날 항체가 DR6에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 것이다.
어떤 구체예에서, 상기 기재된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상에 의해 암호화된 VH를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 5×10-2 M, 10-2 M, 5×10-3 M, 10-3 M, 5×10-4 M, 10-4 M, 5×10-5 M, 10-5 M, 5×10-6 M, 10-6 M, 5×10-7 M, 10-7 M, 5×10-8 M, 10-8 M, 5×10-9 M, 10-9 M, 5×10-10 M, 10-10 M, 5×10-11 M, 10-11 M, 5×10-12 M, 10-12 M, 5×10-13 M, 10-13 M, 5×10-14 M, 10-14 M, 5×10-15 M, 또는 10-15 M 이하의 해리상수 (KD)를 특징으로 하는 친화도로, DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 또는 DR6 변이체 폴리펩타이드에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
추가 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122 및 132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 참조 VL 폴리펩타이드 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 95% 또는 100% 동일한 VL을 암호화하는 핵산를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 추가 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 및 131로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 핵산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 95% 또는 100% 동일한 VL 암호화 핵산를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 어떤 구체예에서, 그와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 VL을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
또 다른 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122 및 132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드 서열을 갖는 VL을 암호화하는 핵산 서열를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 VL을 암호화하는 핵산 서열를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 여기서, 상기 핵산의 서열은 SEQ ID NO: 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 및 131로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 어떤 구체예에서, 그와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 VL을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
어떤 구체예에서, 상기 기재된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상에 의해 암호화된 VL을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 M50-H01, M51-H09, M53-E04, M53-F04, M62-B02, M63-E10, M66-B03, M67-G02, M72-F03, 및 M73-C04로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 Fab 항체 단편, 또는 1P1D6.3, 1P2F2.1, 및 1P5D10.2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체와 동일한 DR6 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하고, 또는 그와 같은 모노클로날 항체 또는 단편이 DR6에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 것이다.
어떤 구체예에서, 상기 기재된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상에 의해 암호화된 VL을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 5×10-2 M, 10-2 M, 5×10-3 M, 10-3 M, 5×10-4 M, 10-4 M, 5×10-5 M, 10-5 M, 5×10-6 M, 10-6 M, 5×10-7 M, 10-7 M, 5×10-8 M, 10-8 M, 5×10-9 M, 10-9 M, 5×10-10 M, 10-10 M, 5×10-11 M, 10-11 M, 5×10-12 M, 10-12 M, 5×10-13 M, 10-13 M, 5×10-14 M, 10-14 M, 5×10-15 M, 또는 10-15 M 이하의 해리상수 (KD)를 특징으로 하는 친화도로, DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 또는 DR6 변이체 폴리펩타이드에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
상기 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드는 암호화된 폴리펩타이드, 본 명세서에 기재된 항체 불변 영역, 또는 본 명세서에 기재된 다른 이종 폴리펩타이드의 분비를 이끌기 위해 예, 신호 펩타이드를 암호화하는 추가 핵산을 또한 포함할 수 있다.
또한, 본 명세서에 상세히 기재되어 있는 바와 같이, 조성물은 상기 기재된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 포함한다. 하나의 구체예에서, 조성물은 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 본 명세서에 기재된 VH 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 본 명세서에 기재된 VL 폴리펩타이드를 암호화한다. 구체적으로, 조성물은 VH 폴리뉴클레오티드, 및 VL 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어지며, 여기서 상기 VH 폴리뉴클레오티드 및 VL 폴리뉴클레오티드는 각각, SEQ ID NO: 7 및 12, 17 및 22, 27 및 32, 37 및 42, 47 및 52, 57 및 62, 67 및 72, 77 및 82, 87 및 92, 97 및 102, 107 및 112, 117 및 122 및 127 및 132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VH 및 VL 폴리펩타이드 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 95% 또는 100% 동일한 폴리펩타이드를 암호화한다. 또는 대안으로, 조성물은 SEQ ID NO: 6 및 11, 16 및 21, 26 및 31, 36 및 41, 46 및 51, 56 및 61, 66 및 71, 76 및 81, 86 및 91, 96 및 101, 106 및 111, 116 및 121, 및 126 및 131로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VL 및 VL 핵산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 95% 또는 100% 동일한 VH 폴리뉴클레오티드, 및 VL 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다. 어떤 구체예에서, 그와 같은 조성물 중 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 VH 및 VL을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드는 또한 본원의 어느 곳에 기술된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드의 단편을 포함한다. 본원에 기술된 융합체 폴리뉴클레오타이드, Fab 단편, 및 기타 유도체를 암호화하는 추가의 폴리뉴클레오타이드가 또한 고려된다.
폴리뉴클레오타이드는 당해 분야에 공지된 어떠한 방법으로도 생산하거나 제조할 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오타이드 서열이 공지되어 있는 경우, 당해 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드로부터 조립할 수 있으며[예를 들면, 문헌: Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)에 기술된 바와 같음], 이는 요약하면 항체를 암호화하는 서열의 일부를 함유하는 중첩 올리고뉴클레오타이드의 합성, 당해 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 및 연결, 및 이후의 PCR에 의한 당해 연결된 올리고뉴클레오타이드의 증폭을 포함한다.
대안적으로, DR6 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 적합한 공급원으로부터의 핵산으로부터 생산될 수 있다. 특수 항체를 암호화하는 핵산을 함유하는 클론은 이용가능하지 않지만, 항체 분자의 서열이 공지되어 있는 경우, 항체를 암호화하는 핵산을 화학적으로 합성하거나 적합한 공급원(예를 들면, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 이로부터 생성된 cDNA 라이브러리, 또는 항체를 발현하기 위해 선택된 하이브리도마 세포와 같은 항체 또는 다른 DR6 항체를 발현하는 특정 조직 또는 세포로부터 분리한, 폴리 A+ RNA와 같은 핵산)으로부터 서열의 3' 및 5' 말단에 하이브리드화할 수 있는 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해서 또는 예를 들면, 항체 또는 다른 DR6 항체를 암호화하는 cDNA 라이브러리로부터의 cDNA 클론을 확인하기 위한 특수 유전자 서열에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용한 클로닝에 의해 수득할 수 있다. PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 당해 분야에 익히 공지된 특정 방법을 사용하여 복제가능한 클로닝 벡터내로 클로닝시킬 수 있다.
DR6 항체의 뉴클레오타이드 서열 및 상응하는 아미노산 서열, 또는, 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체가 측정되면, 이의 뉴클레오타이드 서열을 뉴클레오타이드 서열의 조작을 위해 당해 분야에 잘 공지된 방법, 예를 들면, 재조합체 DNA 기술, 부위 지시된 돌연변이유발, PCR 등(참조: 예를 들면, 이들 둘다의 전문이 본원에 참조로 인용된 Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) 및 Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998)]을 사용하여 조작함으로써 예를 들면, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 생성하기 위한 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성할 수 있다.
DR6 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 특정의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드의 성분으로 구성될수 있다. 예를 들어, DR6 항체, 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 이의 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄 및 이본쇄 DNA, 일본쇄 및 이본쇄 영역의 혼합물인 DNA, 일본쇄 및 이본쇄 RNA, 및 일본쇄 및 이본쇄 영역의 혼합물인 RNA, 일본쇄 또는 전형적으로 이본쇄 또는, 일본쇄 및 이본쇄 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 구성될 수 있다. 또한, DR6 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA 또는, RNA 및 DNA 둘다를 포함하는 삼본쇄 영역으로 구성될 수 있다. DR6 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 하나 이상의 변형된 염기 또는, 안정성 또는 기타 이유로 변형된 DNA 또는 RNA 골격을 함유할 수 있다. "변형된" 염기는 예를 들면, 트리틸화된 염기 및 이노신과 같은 특수 염기를 포함한다. 각종의 변형이 DNA 및 RNA에 대해 이루어질 수 있으므로; "폴리뉴클레오타이드"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다.
면역글로불린(예를 들면, 면역글로불린 중쇄 부위 또는 경쇄 부위)으로부터 기원한 폴리펩타이드의 비-천연 변이체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 첨가 또는 결실을 면역글로불린의 뉴클레오타이드 서열내로 도입시킴으로써 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실이 암호화된 단백질내로 도입되도록 할 수 있다. 돌연변이는 부위-지시된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발과 같은 표준 기술에 의해 도입시킬 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 하나 이상의 비-필수적인 아미노산 잔기에서 이루어질 수 있다.
DR6 항체 폴리펩타이드
DR6 항체를 제조하는 분리된 폴리펩타이드, 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 본원에 기술되어 있다. DR6 항체는 폴리펩타이드, 예를 들면, 면역글로불린 분자로부터 기원한 DR6-특이적인 항원 결합 영역을 암호화하는 아미노산 서열을 포함한다. 지정된 단백질 "로부터 기원한" 아미노산 서열 또는 폴리펩타이드는 특정의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 말한다. 특정의 경우에, 특수한 출발 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열로부터 기원한 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 출발 서열 또는 이의 부위(여기서, 상기 부위는 적어도 10 내지 20개 아미노산, 적어도 20 내지 30개 아미노산, 적어도 30 내지 50개 아미노산으로 이루어진다)의 것과 본질적으로 동일하거나 또는 기타 경우에 출발 서열에 있어 이의 기원을 갖는 것으로 당해 분야의 숙련가에게 확인가능한 아미노산 서열을 갖는다.
하나의 구체예에서, 폴리펩타이드는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하거나, 당해 가변 영역으로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어진 분리된 폴리펩타이드일 수 있으며, 여기서, 중쇄 가변 영역의 VH-CDR의 적어도 하나 또는 중쇄 가변 영역의 VH-CDR의 적어도 2개는 본원에 기재된 모노클로날 DR6 항체로부터의 참조 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 또는 VH-CDR3 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 달리는, VH의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역은 본원에 기술된 모노클로날 DR6 항체로부터의 참조 중쇄 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서, 당해 구체예에 따라서 중쇄 가변 영역은 상기 표 5에 나타낸 그룹과 관련된 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 폴리펩타이드 서열을 갖는다. 표 5가 카바트 시스템에 의해 정의된 VH-CDR을 나타내지만, 다른 CDR 정의, 예를 들면, 초티아 시스템(Chothia system)에 의해 정의된 VH-CDR이 또한 기술된다. 특정 구체예에서, VH를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
또 다른 구체예에서, 폴리펩타이드는, VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역이 표 5에 나타낸 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 그룹과 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하거나, 당해 가변 영역으로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어진 분리된 폴리펩타이드일 수 있다. 특정 구체예에서, VH를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
또 다른 구체예에서, 폴리펩타이드는, VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역이 표 5에 나타낸 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 그룹에 대해, 특정의 하나의 VH-CDR내 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 아미노산 치환을 제외하고는 동일한 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하거나, 당해 가변 영역으로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 분리된 폴리펩타이드일 수 있다. 보다 큰 CDR, 예를 들면, VH-CDR-3에서, VH-CDR을 포함하는 VH는 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 한, CDR에서 추가의 치환이 이루어질 수 있다. 특정 구체예에서, 아미노산 치환은 보존적이다. 특정 구체예에서, VH를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 면역글루불린 중쇄 가변 영역(VH)를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리펩타이드일 수 있고, 여기서, 상기 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역은 상기 적어도 하나의 VH-CDR들에서 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 치환을 제외하고 SEQ ID NO: 8, 9, 및 10; SEQ ID NO: 18, 19, 및 20; SEQ ID NO: 28, 29, 및 30; SEQ ID NO: 38, 39, 및 40; SEQ ID NO: 48, 49, 및 50; SEQ ID NO: 58, 59, 및 60; SEQ ID NO: 68, 69, 및 70; SEQ ID NO: 78, 79, 및 80; SEQ ID NO: 88, 89, 및 90; SEQ ID NO: 98, 99, 및 100; SEQ ID NO: 108, 109, 및 110; SEQ ID NO: 118, 119, 및 120; 및 SEQ ID NO: 128, 129 및 130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 면역글루불린 중쇄 가변 영역(VH)를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리펩타이드일 수 있고, 여기서, 상기 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역은 SEQ ID NO: 8, 9, 및 10; SEQ ID NO: 18, 19, 및 20; SEQ ID NO: 28, 29, 및 30; SEQ ID NO: 38, 39, 및 40; SEQ ID NO: 48, 49, 및 50; SEQ ID NO: 58, 59, 및 60; SEQ ID NO: 68, 69, 및 70; SEQ ID NO: 78, 79, 및 80; SEQ ID NO: 88, 89, 및 90; SEQ ID NO: 98, 99, 및 100; SEQ ID NO: 108, 109, 및 110; SEQ ID NO: 118, 119, 및 120; 및 SEQ ID NO: 128, 129 및 130로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드 서열을 갖는다.
추가 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 및 127로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VH 폴리펩타이드 아미노산 서열과, 적어도 80%, 85%, 90% 95% 또는 100% 동일한 VH 폴리펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리펩타이드일 수 있다. 어떤 구체예에서, VH 폴리펩타이드를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
또 다른 측면에서, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 7, 17, 27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 및 127로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH 폴리펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리펩타이드일 수 있다. 어떤 구체예에서, VH 폴리펩타이드를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
어떤 구체예에서, 상기 기재된 VH 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 M50-H01, M51-H09, M53-E04, M53-F04, M62-B02, M63-E10, M66-B03, M67-G02, M72-F03, 및 M73-C04로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 Fab 항체 단편, 또는 1P1D6.3, 1P2F2.1, 및 1P5D10.2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체와 동일한 DR6 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하고, 또는 그와 같은 모노클로날 항체 또는 단편이 DR6에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 것이다.
어떤 구체예에서, 상기 기재된 VH 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 5×10-2 M, 10-2 M, 5×10-3 M, 10-3 M, 5×10-4 M, 10-4 M, 5×10-5 M, 10-5 M, 5×10-6 M, 10-6 M, 5×10-7 M, 10-7 M, 5×10-8 M, 10-8 M, 5×10-9 M, 10-9 M, 5×10-10 M, 10-10 M, 5×10-11 M, 10-11 M, 5×10-12 M, 10-12 M, 5×10-13 M, 10-13 M, 5×10-14 M, 10-14 M, 5×10-15 M, 또는 10-15 M 이하의 해리상수 (KD)를 특징으로 하는 친화도로, DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 또는 DR6 변이체 폴리펩타이드에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
또 다른 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 면역글루불린 경쇄 가변 영역(VL)를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리펩타이드일 수 있고, 여기서, 경쇄 가변 영역의 VL-CDR 중 적어도 하나 또는 경쇄 가변 영역의 VL-CDR 중 적어도 2개는 본 명세서에 개시된 모노클로날 DR6 항체로부터 참조 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 또는 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 대안으로, VL의 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역은 본 명세서에 개시된 모노클로날 DR6 항체로부터 참조 경쇄 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하다. 따라서, 이 구체예에 따라, 경쇄 가변 영역은 상기 표 5에 보여진 폴리펩타이드에 관련된 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 폴리펩타이드 서열을 갖는다. 표 5가 카밧 시스템(Kabat system)에 의해 정의된 VL-CDR을 보여주지만, 다른 CDR 정의, 예, 코티아 시스템(Chothia system)에 의해 정의된 VL-CDR이 또한 기재되어 있다. 어떤 구체예에서, VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
또 다른 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 면역글루불린 경쇄 가변 영역(VL)를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리펩타이드일 수 있고, 여기서, 상기 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역은 표 5에 보여진 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 그룹와 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는다. 어떤 구체예에서, VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
또 다른 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 면역글루불린 중쇄 가변 영역(VL)를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리펩타이드일 수 있고, 여기서, 상기 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역은 임의의 하나의 VL-CDR 에서 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환을 제외하고 표 5에 보여진 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 그룹과 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖는다. 더 큰 CDR에서, 추가 치환은, VL-CDR를 포함하는 VL이 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 한, VL-CDR에서 만들어 질 수 있다. 어떤 구체예에서, 아미노산 치환은 보존성이다. 어떤 구체예에서, VL을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 면역글루불린 중쇄 가변 영역(VL)를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리펩타이드일 수 있고, 여기서, 상기 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역은 상기 적어도 하나의 VL-CDR들에서 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 치환을 제외하고 SEQ ID NO: 13, 14, 및 15; SEQ ID NO: 23, 24, 및 25; SEQ ID NO: 33, 34, 및 35; SEQ ID NO: 43, 44, 및 45; SEQ ID NO: 53, 54, 및 55; SEQ ID NO: 63, 64, 및 65; SEQ ID NO: 73, 74, 및 75; SEQ ID NO: 83, 84, 및 85; SEQ ID NO: 93, 94, 및 95; SEQ ID NO: 103, 104, 및 105; SEQ ID NO: 113, 114 및 115; SEQ ID NO: 123, 124, 및 125; 및 SEQ ID NO: 133, 134 및 135로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 면역글루불린 중쇄 가변 영역(VL)를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리펩타이드일 수 있고, 여기서, 상기 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 영역은 SEQ ID NO: 13, 14, 및 15; SEQ ID NO: 23, 24, 및 25; SEQ ID NO: 33, 34, 및 35; SEQ ID NO: 43, 44, 및 45; SEQ ID NO: 53, 54, 및 55; SEQ ID NO: 63, 64, 및 65; SEQ ID NO: 73, 74, 및 75; SEQ ID NO: 83, 84, 및 85; SEQ ID NO: 93, 94, 및 95; SEQ ID NO: 103, 104, 및 105; SEQ ID NO: 113, 114 및 115; SEQ ID NO: 123, 124, 및 125; 및 SEQ ID NO: 133, 134 및 135로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드 서열을 갖는다.
추가 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 및 132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VL 폴리펩타이드 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 95% 또는 100% 동일한 VL 폴리펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리펩타이드일 수 있다. 어떤 구체예에서, VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
또 다른 측면에서, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 및 132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VL 폴리펩타이드를 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 단리된 폴리펩타이드일 수 있다. 어떤 구체예에서, VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
어떤 구체예에서, 상기 기재된 VL 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 M50-H01, M51-H09, M53-E04, M53-F04, M62-B02, M63-E10, M66-B03, M67-G02, M72-F03, 및 M73-C04로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 Fab 항체 단편, 또는 1P1D6.3, 1P2F2.1, 및 1P5D10.2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체와 동일한 DR6 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하고, 또는 그와 같은 모노클로날 항체 또는 단편이 DR6에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 것이다.
어떤 구체예에서, 상기 기재된 VL 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 5×10-2 M, 10-2 M, 5×10-3 M, 10-3 M, 5×10-4 M, 10-4 M, 5×10-5 M, 10-5 M, 5×106 M, 10-6 M, 5×10-7 M, 10-7 M, 5×10-8 M, 10-8 M, 5×10-9 M, 10-9 M, 5×10-10 M, 10-10 M, 5×10-11 M, 10-11 M, 5×10-12 M, 10-12 M, 5×10-13 M, 10-13 M, 5×10-14 M, 10-14 M, 5×10-15 M, 또는 10-15 M 이하의 해리상수 (KD)를 특징으로 하는 친화도로, DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 또는 DR6 변이체 폴리펩타이드에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 VH 폴리펩타이드, 및 VL 폴리펩타이드를 포함하고, 그 폴리펩타이드로 본질적으로 이루어지거나, 그 폴리펩타이드로 이루어지고, 여기서, 상기 VH 폴리펩타이드 및 VL 폴리펩타이드 각각은 SEQ ID NO: 7 및 12, 17 및 22, 27 및 32, 37 및 42, 47 및 52, 57 및 62, 67 및 72, 77 및 82, 87 및 92, 97 및 102, 107 및 112, 117 및 122 및 127 및 132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VH 및 VL 폴리펩타이드 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 95% 또는 100% 동일하다. 어떤 구체예에서, 이들 VH 및 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편은 DR6에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
위에서 기술한 특정의 폴리펩타이드는 추가의 폴리펩타이드, 예를 들면, 암호화된 폴리펩타이드의 직접 분비에 대한 시그날 펩타이드, 본원에 기술된 바와 같은 항체 고정 영역 또는 본원에 기술된 바와 같은 기타 이종 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드는 본원의 도처에 기술한 바와 같은 폴리펩타이드 단편을 포함한다. 또한, 폴리펩타이드는 본원에 기술된 바와 같은, 융합 폴리펩타이드, Fab 단편, 및 기타 유도체를 포함한다.
또한, 본원의 도체에 보다 상세히 기술된 바와 같이, 본 조성물은 위에서 기술된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 포함한다.
본원에 기술된 DR6 항체 폴리펩타이드를 변형시킴으로써 당해 폴리펩타이드가, 이것이 기원한 천연적으로 존재하는 결합 폴리펩타이드로부터의 아미노산 서열에 있어서 변할 수 있음을 당해 분야의 숙련가는 이해할 것이다. 예를 들면, 지정된 단백질로부터 기원한 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 유사할 수 있거나, 예를 들면, 출발 서열에 대해 특정 동질성 퍼센트를 가질 수 있는데, 예를 들면, 이는 출발 서열에 대해 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일할 수 있다.
그외에도, "비-필수적인" 아미노산 영역에서 보존적 치환 또는 변화를 가져오는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 이룰 수 있다. 예를 들면, 지정된 단백질로부터 기원한 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은, 하나 이상의 개개의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 이상의 개개의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 제외하고는 출발 서열과 동일할 수 있다. 지정된 단백질로부터 기원한 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 하나 이상의 개개의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 이상의 개개의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 제외하고는 출발 서열과 동일할 수 있다. 다른 구체예에서, 지정된 단백질로부터 기원한 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 2 이하, 3 이하, 4 이하, 5 이하, 6 이하, 7 이하, 8 이하, 9 이하, 10 이하, 15 이하, 또는 20 이하의 개개의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 제외하고는 출발 서열과 동일할 수 있다. 특정 구체예에서, 지정된 단백질로부터 기원한 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 출발 서열에 대하여 1 내지 5개, 1 내지 10개, 1 내지 15개, 또는 1 내지 20개의 개개의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 가진다.
특정의 DR6 항체 폴리펩타이드는 인간 아미노산 서열로부터 기원한 아미노산 서열을 포함하거나, 당해 서열로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어진다. 그러나, 특정의 DR6 항체 폴리펩타이드는 다른 포유동물 종으로부터 기원한 하나 이상의 연속된 아미노산을 포함한다. 예를 들면, DR6 항체는 영장류 중쇄 부위, 힌지 부위, 또는 항원 결합 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 하나 이상의 쥐-기원한 아미노산은 비-쥐 항체 폴리펩타이드, 예를 들면, DR6 항체의 항원 결합 부위내에 존재할 수 있다. 다른 예에서, DR6 항체의 항원 결합 부위는 완전한 쥐이다. 특정의 치료학적 적용에서, DR6-특이적인 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유사체는 항체가 투여되는 동물내에서 면역원성이 아니도록 지정된다.
특정 구체예에서, DR6 항체 폴리펩타이드는 항체와 일반적으로 관련되지 않는 아미노산 서열 또는 하나 이상의 잔기를 포함한다. 예시적인 변형은 하기에 보다 상세히 기술되어 있다. 예를 들면, 일본쇄 fv 항체 단편은 굴곡성 링커 서열을 포함할 수 있거나 변형되어 기능성 잔기(예를 들면, PEG, 약물, 독소 또는 표지)를 가할 수 있다.
DR6 항체 폴리펩타이드는 융합 단백질을 포함하거나, 당해 단백질로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어질 수 있다. 융합 단백질은 적어도 하나의 표적 부위, 및 적어도 하나의 이종 부위, 즉, 자연에서 천연적으로 연결되지 않는 부위를 갖는 면역글로불린 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 분자이다. 아미노산 서열은 일반적으로 융합 폴리펩타이드내에서 함께 존재하는 별개의 단백질로 존재할 수 있거나 이는 일반적으로 동일한 서열내에 존재할 수 있지만 융합 폴리펩타이드내에 새로운 정렬로 위치한다. 융합 단백질은 예를 들면, 화학적 합성에 의해, 또는 펩타이드 영역이 바람직한 관계롤 암호화된 폴리뉴클레오타이드를 생성하여 해독함으로써 생성될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 적용된 것으로서 용어 "이종"은, 이것이 비교되는 실체의 나머지의 것으로부터의 명백한 실체로부터 기원한다. 예를 들어, 본원에 사용된 것으로서, DR6 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유사체에 융합될 "이종 폴리펩타이드"는 동일한 종의 비-면역글로불린 폴리펩타이드, 또는 상이한 종의 면역글로불린 또는 비-면역글로불린 폴리펩타이드로부터 기원한다.
"보존적 아미노산 치환"은, 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 염기성 측쇄(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들면, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄 (예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄(예를 들면, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하여, 당해 분야에 정의되어 있다. 따라서, 면역글로불린 폴리펩타이드내 비필수적인 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 계열로부터의 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 다른 구체예에서, 아미노산의 스트링(string)은 측쇄 계열 구성원의 순서 및/또는 조성에 있어서 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 치환될 수 있다.
대안적으로, 또 다른 구체예에서, 돌연변이는 포화 돌연변이유발에 의한 것과 같은 면역글로불린 암호화 서열의 모두 또는 일부와 함께 무작위적으로 도입될 수 있으며, 수득되는 돌연변이체는 본원에 기재된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 DR6 항체내로 도입되어 목적한 항원, 예를 들면, DR6에 결합하는 이들의 능력을 스크리닝할 수 있다.
융합 폴리펩타이드 및 항체
본원에 기술된 치료 방법에서 사용하기 위한 DR6 폴리펩타이드 및 항체는 또한 N- 또는 C-말단에서 이종 폴리펩타이드에 재조합작으로 추가로 융합시킬 수 있다. 예를 들면, DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체는 이종 폴리펩타이드, 약물, 방사핵종, 또는 독소와 같은 효과인자 분자 및 검출 검정에서 표지와 같이 유용한 분자에 재조합적으로 융합시키거나 접합시킬 수 있다(참조: 예를 들면, PCT 공보 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 미국 특허 제5,314,995호; 및 EP 제396,387호).
본원에 기술된 치료 방법에서 사용하기 위한 DR6 길항제 폴리펩타이드 및 항체는 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합에 의해 서로 결합된 아미노산, 즉, 펩타이드 이소스테레(isostere)로 구성될 수 있으며 20개 이상의 유전자-암호화된 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다.
DR6 길항제는 DR6 기능을 억제하는 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체 융합체를 포함하거나, 당해 융합체로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어진 융합 단백질을 포함한다. 특정 구체예에서, DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체가 융합된 이종 폴리펩타이드는 기능에 유용하거나 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체를 표적화하는데 유용하다. 특정 구체예에서, 가용성 DR6 길항제 폴리펩타이드, 예를 들면, 세포외 도메인(서열 번호: 2의 아미노산 1 내지 349번 또는 41 내지 349번에 상응)을 포함하는 DR6 폴리펩타이드, 또는 본원에 기술된 특정의 다른 가용성 DR6 폴리펩타이드 단편, 변이체 또는 유도체를 이종 폴리펩타이드 잔기에 융합시켜 DR6 길항제 융합 폴리펩타이드를 형성한다. DR6 길항제 융합 단백질 및 항체는 각종 목표, 예를 들면, 증가된 혈청 반감기, 개선된 생체이용율, 특수 기관 또는 조직 유형에 대한 생체내 표적화, 개선된 재조합체 발현 효능, 개선된 숙주 세포 분비, 정제 용이성 및 보다 높은 항원항체결합력을 달성하는데 사용될 수 있다. 달성될 목표(들)에 따라, 이종 잔기는 불활성이거나 생물학적으로 활성일 수 있다. 또한, 이는 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체에 안정하게 융합되도록 또는 시험관내 또는 생체내에서 분해가능하도록 선택될 수 있다. 이러한 다른 목표를 달성하기 위한 이종 잔기는 당해 분야에 공지되어 있다.
DR6 길항제 융합 폴리펩타이드 또는 항체의 발현에 대한 대안으로서, 선택된 이종 잔기를 예비형성시켜 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체에 화학적으로 접합시킬 수 있다. 대부분의 경우에서, 선택된 이종 잔기는, DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체에 융합되거나 접합되는 것에 상관없이 유사하게 기능할 것이다. 따라서, 이종 아미노산 서열의 다음 논의에서, 달리 나타내지 않는 한, 이종 서열은 융합 단백질의 형태 또는 화학적 접합체로서 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체에 결합될 수 있다.
DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체와 같은 약리학적으로 활성인 폴리펩타이드는 흔히 신속한 생체내 청소율을 나타내며, 체내에서 치료학적으로 효과적인 농도를 달성하기 위해 큰 것을 필요로 한다. 또한, 약 60 kDa 보다 작은 폴리펩타이드는 때때로 신독성을 초래하는 사구체 여과를 겪는다. DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체와 같은 비교적 작은 폴리펩타이드의 융합 또는 접합을 사용하여 이러한 신독성의 위험을 감소시키거나 피할 수 있다. 치료학적 폴리펩타이드의 생체내 안정성, 즉, 혈청 반감기를 증가시키기 위한 각종의 이종 아미노산 서열, 즉, 폴리펩타이드 잔기 또는 "담체"가 공지되어 있다.
이의 긴 반감기로 인하여, 광범위한 생체내 분포, 및 효소적 또는 면역확적 기능, 필수적으로 완전한 길이의 인간 혈청 알부민(HSA), 또는 HSA 단편의 결여가 일반적으로 이종 잔기로서 사용된다. 문헌[참조: Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1904-08 (1992) 및 Syed et al., Blood 89:3243-52 (1997)]에 교시된 것과 같은 물질 및 방법의 적용을 통해서, HSA는 DR6 잔기에 의해 약리학적 활성을 나타내면서 현저히 증가된 생체내 안정성, 예를 들면, 10배 내지 100배 더 높은 DR6 길항제 융합체 폴리펩타이드 또는 항체 또는 폴리펩타이드/항체 접합체를 형성하는데 사용될 수 있다. HSA의 C-말단은 DR6 폴리펩타이드의 N-말단에 융합될 수 있다. HSA는 천연적으로 분비된 단백질이므로, HSA 시그날 서열은, 융합 단백질이 진핵 세포, 예를 들면, 포유동물, 발현 시스템내에서 생산되는 경우 세포 배양 배지내로 가용성 DR6 융합 단백질의 분비를 수득하도록 이용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체는 또한 표적화 잔기를 포함한다. 표적화 잔기는 신체의 특정 부위, 예를 들면, 뇌 또는 이의 구획에 대해 국재화를 지시하는 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체는 뇌 표적화 잔기에 부착되거나 융합된다. 뇌 표적화 잔기는 공유결합적으로(예를 들면, 직접적인, 해독 융합체, 또는 직접적으로 또는 임의로 분해될 수 있는 스페이서 분자를 통해 화학적 연결로) 또는 비-공유적으로(예를 들면, 아비딘, 바이오틴, 단백질 A, IgG 등과 같은 가역적인 상호작용을 통해) 부착된다. 다른 구체예에서, 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체는 하나 이상의 뇌 표적화 잔기에 부착된다. 추가의 구체예에서, 뇌 표적화 잔기는 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 다수의 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체에 부착된다.
DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체와 관련된 뇌 표적화 잔기는 이러한 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체의 뇌 전달을 향상시킨다. 단백질 또는 치료제에 융합되는 경우 혈액 뇌 장벽(BBB)을 통해 단백질 또는 치료제를 전달하는 다수의 폴리펩타이드가 기술되어 있다. 비-제한적 실시예는 단일 도메인 항체 FC5[참조; Abulrob et al. (2005) J. Neurochem. 95, 1201-1214]; mAB 83-14, 인간 인슐린 수용체에 대한 모노클로날 항체[참조: Pardridge et al. (1995) Pharmacol. Res. 12, 807-816]; 인간 트랜스페린 수용체(hTfR)에 대한 B2, B6 및 B8 펩타이드 결합[참조; Xia et al. (2000) J. Virol. 74, 11359-11366]; 트랜스페린 수용체에 대한 OX26 모노클로날 항체[참조: Pardridge et al. (1991) J. Pharmacol. Exp. Ther. 259, 66-70]; 및 미국 특허 제6,306,365호의 서열 번호: 1 내지 18번을 포함한다. 상기 참조 문헌의 내용은 이의 전문이 본원에 참조로 인용되어 있다.
DR6 길항제 길항제 조성물의 향상된 뇌 전달은 당해 분야에 잘 확립된 다수의 수단으로 측정한다. 예를 들면, 뇌 표적화 잔기에 연결된 방사활성적으로, 효소적으로 또는 형광성으로 표지된 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체의 동물에로의 투여; 뇌 국재화의 측정; 및 국재화와, 뇌 표적화 잔기와 관련되지 않은 동등하게 방사활성적으로 표지된 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체의 비교. 향상된 표적화를 측정하는 다른 수단은 상기 참조문헌에 기술되어 있다.
시그날 서열은 세포질세망의 막을 통과하는 단백질의 수송을 개시하는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이다. 면역융합체를 작제하는데 유용한 시그날 서열은 항체 경쇄 시그날 서열, 예를 들면, 항체 14.18[참조: Gillies et al ., J. Immunol . Meth . 125:191-202 (1989)], 항체 중쇄 시그날 서열, 예를 들면, MOPC141 항체 중쇄 시그날 서열[참조; Sakano et al ., Nature 286:5774 (1980)]를 포함한다. 달리는, 다른 시그날 서열을 사용할 수 있다[참조: 예를 들면, Watson, Nucl . Acids Res . 12:5145 (1984)]. 시그날 펩타이드는 일반적으로 시그날 펩티다제에 의해 세포질세망의 내강내에서 분해된다. 이는 Fc 영역 및 DR6 폴리펩타이드를 함유하는 면역융합체 단백질의 분비를 초래한다.
일부 구체예에서, DNA 서열은 분비 카세트와 DR6 폴리펩타이드 사이의 단백분해 분해 부위를 암호화할 수 있다. 이러한 분해 부위는 예를 들면, 암호화된 융합 단백질의 단백분해성 분해를 위해 제공됨으로써 표적 단백질로부터 Fc 도메인을 분리할 수 있다. 유용한 단백분해성 분해 부위는 트립신, 플라스민, 트롬빈, 인자 Xa, 또는 엔테로키나제 K와 같은 단백분해성 효소에 의해 인지된 아미노산 서열을 포함한다.
분비 카세트는 복제가능한 발현 벡터내로 혼입될 수 있다. 유용한 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파아지미드, 코스미드 등을 포함한다. 예시적인 발현 벡터는, 임뮤노푸신(immunofusin) DNA의 전사가 인간 사이토메갈로바이러스의 인핸서 및 프로모터의 제어하에 있는 pdC이다[참조: 예를 들면, Lo et al ., Biochim . Biophys. Acta 1088:712 (1991); 및 Lo et al ., Protein Engineering 11:495-500 (1998)]. 적절한 숙주 세포는 DR6 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 사용하여 형질전환시키거나 형질감염시키고 DR6 폴리펩타이드의 발현 및 분비에 사용할 수 있다. 통상저으로 사용되는 숙주 세포는 영구적인 하이브리도마 세포, 흑색종 세포, 293 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, Hela 세포, 및 COS 세포를 포함한다.
하나의 구체예에서, DR6 폴리펩타이드는 힌지 및 Fc 영역, 즉, Ig 중쇄 고정 영역의 C-말단 부위에 융합된다. DR6-Fc 융합체의 강력한 장점은 가용성, 생체내 안정성 및 다중원자가, 예를 들면, 이합체화를 포함한다. 사용된 Fc 영역은 IgA, IgD, 또는 IgG Fc 영역(힌지-CH2-CH3)일 수 있다. 달리는, 이는 IgE 또는 IgM Fc 영역(힌지- CH2- CH3-CH4)일 수 있다. IgG Fc 영역, 예를 들면, IgG1 Fc 영역 또는 IgG4 Fc 영역이 일반적으로 사용된다. 하나의 구체예에서, IgG Fc를 화학적으로 정의하는 파파인 분해 부위(즉, 카바트 시스템에 따라 114번이 될 중쇄 고정 영역의 첫번째 잔기를 취하는, 216번 잔기)의 바로 상부의 힌지 영역, 또는 다른 면역글로불린의 유사한 부위내에서 시작하는 서열을 융합에 사용한다. 융합이 이루어지는 정확한 부위는 중요하지 않으며; 특수 부위는 잘 공지되어 있고 분자의 생물학적 활성, 분비 또는 결합 특성을 최적화하기 위해 선택할 수 있다. Fc 융합체를 암호화하는 DNA를 작제하고 발현하기 위한 물질 및 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 과도한 실험없이 DR6 융합체를 수득하는데 적용될 수 있다. 본원에 기술된 일부 방법은 카폰(Capon) 등의 미국 특허 제5,428,130호 및 제5,565,335호에 기술된 것들과 같은 DR6 융합 단백질을 사용한다.
일부 구체예에서, 완전히 온전한, 야생형 Fc 영역은 본원에 기술된 방법에 사용된 Fc 융합 단백질내에서 필수적이지 않고 바람직하지 않을 수 있는 효과인자 기능을 나타낸다. 따라서, 특정의 결합 부위를 분비 카세트의 작제 동안 Fc 영역으로부터 제거할 수 있다. 예를 들면, 경쇄를 사용한 공발현이 불필요한 경우, 중쇄 결합 단백질, Bip[참조: Hendershot et al ., Immunol . Today 8:111-14 (1987)]에 대한 결합 부위를 IgE의 Fc 영역의 CH2 도메인으로부터 결실시킴으로써, 이러한 부위가 임뮤노퓨신(immunofusin)의 효율적인 분비를 방해하지 않도록 하다. IgM에 존재하는 것들과 같은 막관통 도메인 서열이 또한 일반적으로 제거된다.
특정 구체예에서, IgG1 Fc 영역이 사용된다. 달리는, 면역글로불린 감마(감마-2, 감마-3 및 감마-4)의 기타 아류의 Fc 영역을 발현 카세트에 사용할 수 있다. 면역글로불린 감마-1의 IgG1 Fc 영역은 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역 중 적어도 일부분을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 감마-1의 Fc 영역은 CH2-결실된-Fc이며, 이는 힌지 영역 및 CH3 영역 중 일부를 포함하지만, CH2 영역을 포함하지 않는다. CH2-결실된-Fc는 문헌[참조: Gillies et al., Hum . Antibod . Hybridomas 1:47 (1990)]에 기술되어 있다. 일부 구체예에서, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM 중 하나의 Fc 영역이 사용된다.
DR6-Fc 융합 단백질은 몇가지 상이한 구조로 작제될 수 있다. 하나의 구조에서, DR6 폴리펩타이드의 C-말단은 Fc 힌지 잔기의 N-말단에 직접 융합된다. 약간 상이한 구조에서, 짧은 폴리펩타이드, 예를 들면, 2 내지 10개의 아미노산이 DR6 잔기의 N-말단 및 Fc 잔기의 C-말단 사이의 융합체내로 혼입된다. 이러한 링커는 일부 환경에서 생물학적 활성을 개선시킬 수 있는 구조적 굴곡성을 제공한다. 힌지 영역의 충분한 일부분이 Fc 잔기내에 보유되는 경우, DR6-Fc 융합체를 이합체화됨으로써 2가 분자를 형성할 것이다. 단량체성 Fc 융합체의 동종 집단은 일특이적인 2가 이합체를 수득할 것이다. 특이성이 상이한 2개의 단량체성 Fc 융합체의 혼합물은 이특이적인, 2가 이합체를 생성할 것이다.
가용성 DR6 폴리펩타이드는 이종 펩타이드에 융합되어 가용성 DR6 잔기의 정제 또는 확인을 촉진할 수 있다. 예를 들면, 히스티딘 태그를 가용성 DR6 폴리펩타이드에 융합시켜 상업적으로 이용가능한 크로마토그래피 매질을 사용한 정제를 촉진시킬 수 있다.
"링커" 서열은 융합 단백질내 2개의 폴리펩타이드 암호화 영역을 분리하는 일련의 하나 이상의 아미노산이다. 대표적인 링커는 적어도 5개의 아미노산을 포함한다. 추가의 링커는 적어도 10개 또는 적어도 15개의 아미노산을 포함한다. 특정 구체예에서, 펩타이드 링커의 아미노산은, 링커가 친수성이도록 선택된다. 링커 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(G4S)3(서열 번호: 136)는 충분한 굴곡성을 제공하므로, 많은 항체에 광범위하게 적용가능하다. 다른 링커는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (G4S)2(서열 번호: 137), Glu Ser Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (서열 번호: 138), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr (서열 번호: 139), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gln (서열 번호: 140), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp (서열 번호: 141), Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly (서열 번호: 142), Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser Leu Asp (서열 번호: 143), 및 Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Glu Leu Ala Phe Arg Ser Leu Asp (서열 번호: 144)를 포함한다. 보다 짧은 링커의 예는 상기 링커의 단편을 포함하며, 보다 긴 링커의 예는 상기 링커의 조합, 상기 링커의 단편의 조합, 및 상기 링커의 단편과 상기 링커의 조합을 포함한다.
DR6 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 태그에 융합될 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "폴리펩타이드 태그"는 DR6 폴리펩타이드에 부착하거나, 연결되거나, 결합시키는데 사용될 수 있고 DR6 폴리펩타이드를 확인하거나, 정제하거나, 농축시키거나 분리하는데 사용될 수 있는 아미노산의 특정 서열을 의미하는 것으로 의도된다. DR6 폴리펩타이드에 대한 폴리펩타이드 태그의 부착은 예를 들면, (a) 폴리펩타이드 태그를 암호화하는 핵산 서열, 및 (b) DR6 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 작제함으로써 발생시킬 수 있다. 예시적인 폴리펩타이드 태그는, 예를 들면, 후-해독적으로 변형될 수 있는 아미노산 서열, 예를 들면, 바이오티닐화되는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 예시적인 폴리펩타이드 태그는 예를 들면, 항체(또는 이의 단편) 또는 다른 특수 결합 시약을 인지하고/하거나 이에 의해 결합될 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 항체(또는 이의 단편) 또는 다른 특수 결합 시약에 의해 인지될 수 있는 폴리펩타이드 태그는 예를 들면, 당해 분야에 "에피토프 태그"로 공지된 것들을 포함한다. 에피토프 태그는 천연 또는 인공의 에피토프 태그일 수 있다. 천연 및 인공의 에피토프 태그는 예를 들어, FLAG, 스트렙(Strep), 또는 폴리-히스티딘 펩타이드와 같은 인공 에피토프를 포함하여, 당해 분야에 공지되어 있다. FLAG 펩타이드는 서열 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(서열 번호: 145) 또는 Asp-Tyr-Lys-Asp-Glu-Asp-Asp-Lys(서열 번호: 146)[참조: Einhauer, A. 및 Jungbauer, A., J. Biochem. Biophys. Methods 49:1-3:455-465 (2001)]을 포함한다. 스트렙 에피토프는 서열 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(서열 번호: 147)를 갖는다. VSV-G 에피토프가 또한 사용될 수 있으며 서열 Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys(서열 번호: 148)을 갖는다. 다른 인공 에피토프는 6개의 히스티딘 잔기(His-His-His-His-His-His)(서열 번호: 149)를 갖는 폴리-His 서열이다. 천연적으로 존재하는 에피토프는 모노클로날 항체 12CA5에 의해 인지된 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 서열 Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg(서열 번호: 150)[참조: Murray et al., Anal. Biochem. 229:170-179 (1995)] 및 모노클로날 항체 9E10에 의해 인지된 인간 c-myc(Myc)로부터의 11개 아미노산 서열(Glu-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-Asn) (서열 번호: 151)[참조; Manstein et al., Gene 162:129-134 (1995)]를 포함한다. 다른 유용한 에피토프는 모노클로날 항체 YL 1/2에 의해 인지된 트리펩타이드 Glu-Glu-Phe이다[참조: Stammers et al. FEBS Lett. 283:298-302(1991)].
특정 구체예에서, DR6 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 태그는 결합시키는 아미노산 서열을 통해 연결시킬 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "결합시키는 아미노산 서열"은 하나 이상의 프로테아제에 의해 인식되고/되거나 분해될 수 있는 아미노산 서열일 수 있다. 하나 이상의 프로테아제에 의해 인식되고/되거나 분해될 수 있는 아미노산 서열은 당해 분야에 공지되어 있다. 예시적인 아미노산 서열은 다음 프로테아제에 의해 인식되는 것들이다: 인자 VIIa, 인자 IXa, 인자 Xa, APC, t-PA, u-PA, 트립신, 키모트립신, 엔테로키나제, 펩신, 카텝신 B,H,L,S,D, 카텝신 G, 레닌, 안지오텐신 전환 효소, 매트릭스 메탈로프로테아제(콜라게나제, 스트로멜라이신, 겔라티나제), 대식구 엘라스타제, Cir, 및 Cis. 앞서의 프로테아제에 의해 인식되는 아미노산 서열은 당해 분야에 공지되어 있다. 특정 프로테아제에 의해 인식된 예시적인 서열은 예를 들면, 미국 특허 제5,811,252호에서 찾을 수 있다.
일부 방법에서, 가용성 DR6 융합 작제물은 세균내에서 가용성 DR6 잔기의 생산을 향상시키는데 사용된다. 이러한 작제물에서, 일반적으로 고 수준에서 발현되고/되거나 분비된 세균 단백질은 가용성 DR6 폴리펩타이드의 N-말단 융합 파트너로서 사용된다[참조: 예를 들면, Smith et al., Gene 67:31 (1988); Hopp et al., Bio기술 6:1204 (1988); La Vallie et al ., Biotechnology 11:187 (1993)].
적합한 융합 파트너의 아미노 및 카복시 말단에서 가용성 DR6 잔기를 융합시킴으로써, 가용성 DR6 폴리펩타이드의 2가 또는 4가 형태를 수득할 수 있다. 예를 들면, 가용성 DR6 잔기는 Ig 잔기의 아미노 및 카복시 말단에 융합시켜 2개의 가용성 DR6 잔기를 함유하는 2가의 단량체성 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 이들 단량체 2개가 이합체화되는 경우, Ig 잔기로 인해, 가용성 DR6 단백질의 4가 형태가 수득된다. 이러한 다가 형태는 표적에 대한 증가된 결합 친화성을 달성하는데 사용될 수 있다. 가용성 DR6의 다가 형태는 가용성 DR6 잔기를 동시에 위치시켜 콘카타머(concatamer)를 형성할 수 있으며, 이는 단독으로 사용되거나 Ig 또는 HSA와 같은 융합 파트너에 융합될 수 있다.
DR6 길항제 접합체
본원에 기술된 치료 방법에 사용하기 위한 DR6 길항제 폴리펩타이드 및 항체는 변형된, 즉, 특정 유형의 분자의 공유결합성 부착에 의해 변형됨으로써 공유결합성 부착이 DR6의 생물학적 기능을 억제하는 것으로부터 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체를 방지하지 않도록 하는 유도체를 포함한다. 예를 들어, 그러나 제한하지 않고, DR6 길항제 폴리펩타이드 및 항체는 예를 들면, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 포스필화, 포스포릴화, 아미드화, 유도체화에 의해, 공지된 보호/차단 그룹, 단백분해성 분해, 세포성 리간드 또는 기타 단백질에 대한 연결 등에 의해 변형될 수 있다. 특정의 다수의 화학적 변형은 특수한 화학적 분해, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신의 대사성 합성 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 공지된 기술에 의해 수행할 수 있다. 또한, 유도체는 하나 이상의 비-고전적 아미노산을 함유할 수 있다.
DR6 길항제 폴리펩타이드 및 항체는 해독후 프로세싱과 같은 천연 과정에 의해, 또는 당해 분야에 잘 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형은 기본서 및 보다 상세한 논문, 및 또한 방대한 조사 문헌에 잘 기술되어 있다. 변형은 펩타이드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카복실 말단을 포함하는 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체의 어느 곳, 또는 탄수화물과 같은 잔기 상에서 일어날 수 있다. 동일한 유형의 변형이 제공된 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체내 수개 부위에서 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 또한, 제공된 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체는 많은 유형의 변형을 함유할 수 있다. DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체는 예를 들면, 유비퀴틴화(ubiquitination)의 결과로서 측쇄될 수 있고, 이들은 측쇄가 있거나 없는 환형일 수 있다. 환형의, 측쇄된, 및 측쇄된 환형의 DR6 길항제 폴리펩타이드 및 항체는 해독후 천연 과정으로부터 생성될 수 있거나 합성 방법으로 제조할 수 있다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 잔기의 공유 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 교차-결합, 환형화, 이황화물 결합 형성, 탈메틸화, 공유결합성 가요결합의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카복실화, 글리코실화, GPI 앵커(anchor) 형성, 하이드록실화, 요오딘화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백분해성 프로세싱, 포스포릴화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아르기닐화와 같은 단백질에 대한 전달-RNA 매개된 아미노산의 첨가, 및 유비퀴틴화를 포함한다[참조: 예를 들면, Proteins - Structure and Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)].
상응하는 아미노-반응성 그룹 및 티올-반응성 그룹을 함유하는 특정의 다수의 교차-링커를 사용하여 DR6 길항제 폴리펩타이드를 이종 융합체 파트너에 결합시킬 수 있다. 적합한 링커의 예는 티올-반응성 말레이미드, 예를 들면, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, 및 GMBS를 삽입시키는 아민 반응성 교차-링커를 포함한다. 다른 적합한 링커는 티올-반응성 할로아세테이트 그룹, 예를 들면, SBAP, SIA, SIAB를 삽입한다. 설프하이드릴 그룹과 반응하여 환원성 결합을 생산하기 위한 보호되거나 보호되지 않은 티올을 제공하는 링커는 SPDP, SMPT, SATA, 및 SATP를 포함한다. 이러한 시약은 시판되고 있다(예를 들면, Pierce Chemicals).
접합은 혈청 알부민상에서 가용성 DR6 폴리펩타이드의 N-말단 또는 티올 잔기를 포함하지 않아야 한다. 예를 들면, 가용성 DR6-알부민 융합체는 유전 공학 기술을 사용하여 수득할 수 있으며, 여기서, 가용성 DR6 잔기는 N-말단, C-말단 또는 이들 둘 다에서 혈청 알부민 유전자에 융합된다.
가용성 DR6 폴리펩타이드 또는 DR6 항체는 폴리펩타이드 또는 항체일 수 있으며, 여기서, 하나 이상의 중합체는 DR6 폴리펩타이드 또는 항체에 접합(공유결합됨)된다. 이러한 접합에 적합한 중합체의 예는 폴리펩타이드(위에서 논의한 바와 같음), 당 중합체 및 폴리알킬렌 글리콜 쇄를 포함한다. 대표적으로, 그러나 필수적이지는 않게, 중합체는 가용성, 안정성 또는 생체이용성 중의 하나 이상을 개선시킬 목적으로 가용성 DR6 폴리펩타이드 또는 DR6 항체에 접합된다.
DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체에 대한 접합에 일반적으로 사용된 중합체의 부류는 폴리알킬렌 글리콜이다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 가장 흔히 사용된다. PEG 잔기, 예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 PEG 중합체가 각각의 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체에 접합되어 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체 단독과 비교하여, 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. PEG 잔기는 비-항원성이며 필수적으로 생물학적 불활성이다. PEG 잔기는 측쇄되거나 측쇄되지 않을 수 있다.
DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체에 부착된 PEG 잔기의 수 및 개개의 PEG 쇄의 분자량은 변할 수 있다. 일반적으로, 중합체의 분자량이 높을 수록, 폴리펩타이드에 부착된 중합체 쇄가 더 적다. 일반적으로, DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체에 부착된 총 중합체 질량은 20 kDa 내지 40 kDa이다. 따라서, 하나의 중합체 쇄가 부착되면, 쇄의 분자량은 일반적으로 20 내지 40 kDa이다. 2개의 쇄가 부착된 경우, 각각의 쇄의 분자량은 일반적으로 10 내지 20 kDa이다. 3개의 쇄가 부착된 경우, 분자량은 일반적으로 7 내지 14 kDa이다.
중합체, 예를 들면, PEG는 폴리펩타이드 상에 어떠한 적합한 노출된 반응성 그룹을 통해 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체에 결합될 수 있다. 노출된 반응성 그룹(들)은 예를 들면, 내부 라이신 잔기의 N-말단 아미노 그룹 또는 엡실론 아미드 그룹, 또는 이들 둘다일 수 있다. 활성화된 중합체는 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체 상의 특정의 유리 아미노 그룹에서 반응하여 공유결합될 수 있다. DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체(이용가능한 경우)의 유리 카복실산 그룹, 적합하게 활성화된 카보닐 그룹, 하이드록실, 구아니딜, 이미다졸, 산화된 탄수화물 잔기 및 머캅토 그룹은 중합체 부착을 위한 반응성 그룹으로서 사용될 수 있다.
접합 반응에서, 폴리펩타이드 농도에 따라 폴리펩타이드 몰 당 약 1.0 내지 약 10 몰의 활성화된 중합체가 통상적으로 사용된다. 일반적으로, 선택된 비는 반응을 최대화하지만 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체의 바람직한 약리학적 활성을 손상시킬 수 있는 부반응(흔히 비-특이적인)을 최소화시키는 것 사이의 균형을 나타낸다. 특정 구체예에서, DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체의 생물학적 활성(예를 들면, 본원에 기술되거나 당해 분야에 공지된 특정의 검정에서 입증된 것으로서)의 적어도 50%가 유지된다. 추가의 구체예에서, 거의 100%가 유지된다.
중합체는 통상적인 화학을 사용하여 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체에 접합시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리알킬렌 글리콜 잔기는 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체의 라이신 엡실론 아미노 그룹에 커플링시킬 수 있다. 라이신 측쇄에 대한 연결은 PEG 석신이미딜 석시네이트(SS-PEG) 및 석신이미딜 프로피오네이트(SPA-PEG)와 같은 N-하이드록실석신이미드(NHS) 활성 에스테르를 사용하여 수행할 수 있다. 적합한 폴리알킬렌 글리콜 잔기는 예를 들면, 카복시메틸-NHS 및 노르루이신-NHS, SC를 포함한다. 이들 시약은 시판된다. 추가의 아민-반응성 PEG 링커가 석신이미딜 잔기 대신에 치환될 수 있다. 이는 예를 들면, 이소시아네이트, 니트로페닐카보네이트(PNP), 에폭사이드, 벤조트리아졸 카보네이트, SC-PEG, 트레실레이트, 알데하이드, 에폭사이드, 카보닐이미다졸, 및 PNP 카보네이트를 포함한다. 조건을 일반적으로 최적화하여 반응의 선택성 및 정도를 최대화한다. 반응 조건의 이러한 최대화는 당해 분야의 숙련가내에 있다.
페길화(PEGylation)는 당해 분야에 공지된 어떠한 페길화 반응에 의해서도 수행할 수 있다[참조: 예를 들면, Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992), 및 유럽 특허원 제EP0154316호 및 제EP0401384호]. 페길화는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 사용하여 수행할 수 있다.
아실화에 의한 페길화는 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜의 활성 에스테르 유도체를 반응시킴을 포함한다. 특정의 반응성 PEG 분자를 페길화에 사용할 수 있다. N-하이드록시석신이미드(NHS)로 에스테르화된 PEG는 흔히 사용된 활성화된 PEG 에스테르이다. 본원에 사용된 것으로서, "아실화"는 PEG:아미드, 카바메이트, 우레탄 등과 같은 치료학적 단백질과 수용성 중합체 사이의 다음 결합 유형을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(참조: 예를 들면, Bioconjugate Chem. 5:133-140, 1994). 반응성 매개변수는 일반적으로 가용성 DR6 폴리펩타이드를 손상시키거나 불활성화시키는 온도, 용매 및 pH 조건을 피하도록 선택된다.
일반적으로, 연결하는 결합은 아미드이며, 통상적으로 수득되는 생성물의 적어도 95%는 모노-, 디- 또는 트리-페길화된다. 그러나, 보다 높은 정도의 페길화를 가진 일부 종은 사용된 특수 반응 조건에 따른 양으로 형성될 수 있다. 임의로, 정제된 페길화된 종은 혼합물, 특히 반응하지 않은 종으로부터 예를 들면, 투석, 염석, 한외여과, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 소수성 교환 크로마토그래피 및 전기영동을 포함하는 통상의 정제 방법에 의해 분리된다.
알킬화에 의한 페길화는 일반적으로 PEG의 말단 알데하이드 유도체를 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체와 환원제의 존재하에서 반응시킴을 포함한다. 또한, DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체, 즉, 모노-페길화된 단백질의 N-말단 아미노 그룹에서만 실질적으로 페길화를 용이하게 할 반응 조건을 조작할 수 있다. 모노-페길화 또는 폴리-페길화의 경우에, PET 그룹은 전형적으로 -CH2-NH- 그룹을 통해 단백질에 부착된다. -CH2- 그룹에 대한 특수한 참조로, 이러한 유형의 결합은 "알킬" 연결로 공지되어 있다.
N-말단적으로 표적화된 모노-페길화된 생성물을 생산하기 위한 환원적 알킬화를 통한 유도체화는 유도체화에 이용가능한 상이한 유형의 주요 아미노 그룹(N-말단에 대한 라이신)의 차등적인 반응성을 활용한다. 반응은 라이신 잔기의 엡실론-아미노 그룹과 단백질의 N-말단 아미노 그룹 사이의 pKa 차이의 장점을 취하도록 하는 pH에서 수행된다. 이러한 선택적인 유도체화에 의해, 알데하이드와 같은 반응성 그룹을 함유하는 수용성 중합체의 단백질에 대한 부착을 조절하며: 중합체와의 접합은 주로 단백질의 N-말단에서 일어나며 라이신 측쇄 아미노 그룹과 같은 다른 반응성 그룹의 상당한 변형은 일어나지 않는다.
아실화 및 알킬화 시도 둘 다에서 사용된 중합체 분자는 수용성 중합체 중에서 선택된다. 선택된 중합체는 통상적으로 아실화를 위한 반응성 에스테르 또는 알킬화용 알데하이드와 같은 단일의 반응성 그룹을 가지도록 변형됨으로써 중합도는 본 방법에서 제공되는 바와 같이 조절될 수 있다. 예시적인 반응성 PEG 할데하이드는 수용성인 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드, 또는 이의 모노 C1-C10 알콕시 또는 아릴옥시 유도체이다(참조: 예를 들면, Harris et al., 미국 특허 제5,252,714호). 중합체는 측쇄 또는 직쇄일 수 있다. 아실화 반응을 위해, 선택된 중합체(들)은 통상적으로 단일의 반응성 에스테르 그룹을 갖는다. 환원적 알킬화를 위해, 선택된 중합체(들)은 통상적으로 단일의 반응성 알데하이드 그룹을 갖는다. 일반적으로, 수용성 중합체는 일반적으로 포유동물 재조합체 발현 시스템에 의해 보다 편리하게 제조되므로, 천연적으로 존재하는 글리코실 잔기로부터 선택되지 않을 것이다.
페길화된 가용성 DR6 폴리펩타이드 또는 항체를 제조하는 방법은 (a) DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체를 폴리에틸렌 글리콜(예: PEG의 반응성 에스테르 또는 알데하이드 유도체)과, 분자가 하나 이상의 PEG 그룹에 부착되도록 하는 조건하에서 반응시키는 단계, 및 (b) 반응 생성물(들)을 수득하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 아실화 반응을 위한 최적의 반응 조건은 공지된 매개변수 및 바람직한 결과를 기준으로 개별적으로 측정될 것이다. 예를 들면, 단백질에 대한 PEG의 보다 높은 비는 일반적으로 폴리-페길화된 생성물의 보다 큰 퍼센트가 더 커지도록 한다.
모노-중합체/가용성 DR6 폴리펩타이드 또는 DR6 항체의 실질적으로 균질한 집단을 생산하기 위한 환원적 알킬화는 (a) 가용성 DR6 단백질 또는 폴리펩타이드를 반응성 PEG 분자와 환원적 알킬화 조건하에 폴리펩타이드 또는 항체의 N-말단 아미노 그룹의 선택적인 변형을 허용하기에 적합한 pH에서 반응시키는 단계; 및 (b) 반응성 생성물(들)을 수득하는 단계를 일반적으로 포함한다.
모노-중합체/가용성 DR6 폴리펩타이드 또는 DR6 항체의 실질적으로 균질한 집단을 위한, 환원적 알킬화 반응 조건은 폴리펩타이드 또는 항체의 N-말단에 대한 수용성 중합체 잔기의 선택적인 부착을 허용하는 것들이다. 이러한 반응 조건은 일반적으로 라이신 측쇄 아미노 그룹과 N-말단 아미노 그룹 사이의 pKa 차이를 제공한다. 본원에 기술된 목적을 위해, pH는 일반적으로 3 내지 9, 전형적으로 3 내지 6의 범위이다.
가용성 DR6 폴리펩타이드 또는 항체는 태그(tag), 예를 들면, 단백분해에 의해 후속적으로 방출될 수 있는 잔기를 포함할 수 있다. 따라서, 라이신 잔기는 라이신과 N-말단 둘다와 반응할 트라우트 시약(Traut's reagent)(Pierce)과 같은 저-분자량 링커로 변형시킨 His-태그를 먼저 반응시킨 후 His 태그를 방출함으로써 선택적으로 변형시킬 수 있다. 이후에, 폴리펩타이드는 말레이미드 그룹, 비닐설폰 그룹, 할로아세테이트 그룹 또는 유리되거나 보호된 SH와 같은 티올-반응성 헤드 그룹을 함유하는 PEG로 선택적으로 변형시킬 수 있는 유리된 SH 그룹을 함유할 것이다.
트라우트 시약은 PEG 부착에 대해 특이적인 부위를 설정할 특정의 링커로 치환시킬 수 있다. 예를 들어, 트라우트 시약은 SPDP, SMPT, SATA, 또는 SATP (Pierce)로 치환시킬 수 있다. 유사하게, 단백질을 말레이미드(예를 들면, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, 또는 GMBS), 할로아세테이트 그룹(SBAP, SIA, SIAB), 또는 비닐설폰 그룹을 삽입하는 아민-반응성 링커와 반응시키고 수득되는 생성물을 유리된 SH를 함유하는 PEG와 반응시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 폴리알킬렌 글리콜 잔기는 DR6 길항제 폴리펩타이드 또는 항체의 시스테인 그룹에 커플링된다. 커플링은 예를 들면, 말레이미드 그룹, 비닐설폰 그룹, 할로아세테이트 그룹 또는 티올 그룹을 사용하여 수행할 수 있다.
임의로, 가용성 DR6 폴리펩타이드 또는 항체는 불안정한 결합을 통해 폴리에틸렌-글리콜 잔기에 접합된다. 불안정한 결합은 예를 들면, 생화학적 가수분해, 단백분해 또는 설프하이드릴 분해로 분해될 수 있다. 예를 들면, 결합은 생체내(생리학적) 조건하에서 분해될 수 있다.
반응은, 반응성 그룹이 N-말단에서 알파 아미노 그룹 위에 있는 경우, 생물학적으로 활성인 물질을 불활성 중합체와, 일반적으로 약 pH 5 내지 8, 예를 들면, pH 5, 6, 7, 또는 8에서 반응시키기 위해 사용된 어떠한 적합한 방법으로도 수행할 수 있다. 일반적으로, 상기 방법은 활성화된 중합체를 제조한 후 단백질을 활성화된 중합체와 반응시켜 제형에 적합한 가용성 단백질을 생산함을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 폴리펩타이드는 DR6 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 이의 유도체, 및 이종 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질이다. 항체가 융합되는 이종 폴리펩타이드는 기능에 유용하거나 DR6 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 표적화하는데 유용하다. 하나의 구체예에서, 융합 단백질은 항체 또는 이의 단편 또는 변이체의 특정의 하나 이상의 VH 영역의 아미노산 서열 또는 항체의 특정의 하나 이상의 VL 영역의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나, 당해 폴리펩타이드로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어진다. 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 진단 및 치료 방법에서 사용하기 위한 융합 단백질은 DE6-특이적인 항체, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체의 1, 2 또는 3개의 VH-CDR의 아미노산 서열, 또는 DR6-특이적 항체, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체의 1, 2 또는 3개의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드, 및 이종 폴리펩타이드 서열을 포함하거나, 당해 서열로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어진다. 하나의 구체예에서, 융합 단백질은 DR6-특이적인 항체, 또는 이의 단편, 유도체 또는 변이체의 VH-CDR3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 및 이종 폴리펩타이드 서열을 포함하며, 상기 융합 단백질은 DR6의 적어도 하나의 에피토프와 특이적으로 결합한다. 또 다른 구체예에서, 상기 융합 단백질은 DR6-특이적인 항체의 적어도 하나의 VH 영역의 아미노산 서열 및 DR6-특이적인 항체 또는 이의 단편, 유도체 또는 변이체의 적어도 하나의 VL 영역의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 및 이종 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 하나의 구체예에서, 융합 단백질의 VH 및 VL 영역은 DR6의 적어도 하나의 에피토피에 특이적으로 결합하는 단일 공급원 항체(또는 scFv 또는 Fab 단편)에 상응한다. 여전히 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 진단 및 치료 방법에서 사용하기 위한 융합 단백질은 DR6-특이적인 항체의 특정의 1, 2, 3개 이상의 VH CDR의 아미노산 서열 및 DR6-특이적인 항체, 또는 이의 단편 또는 변이체의 특정의 1, 2, 3개 이상의 VH CDR의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 이종 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, VH-CDR(들) 또는 VL-CDR(들) 중 2, 3, 4, 5, 6개 이상은 단일 공급원 항체(또는 scFv 또는 Fab 단편)에 상응한다. 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 또한 고려된다.
DR6 폴리뉴클레오타이드 길항제
특수 구체예는 신경계 세포를 DR6 폴리뉴클레오타이드 길항제와 접촉시켜 상기 세포 생존을 촉진시키는 방법을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 길항제는 DR6-길항제 폴리펩타이드를 암호화하는 특정의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 길항제는 또한 DR6를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 핵산 분자일 수 있다. DR6 폴리뉴클레오타이드 길항제는 DR6(녹다운)의 발현을 방지한다. 특정 구체예에서, DR6 폴리뉴클레오타이드 길항제는 신경계 세포 생존을 촉진하거나 신경계 세포 세포자멸사를 억제한다. DR6 폴리뉴클레오타이드 길항제는 안티센스 분자, 리보자임, siRNA, shRNA 및 RNAi를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 전형적으로, 이러한 결합 분자는 동물에게 별도로 투여되지만[참조: O'Connor, J. Neurochem . 56:560 (1991)], 이러한 결합 분자는 또한 숙주 세포에 의해 흡수되어 생체내에서 발현된 폴리뉴클레오타이드로부터 생체내에서 발현된다[참조: 또한 Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)].
RNAi는 표적화된 mRNA의 발현을 방해하는 RNA의 발현을 말한다. 구체적으로, RNAi는 특정 mRNA(예를 들면, DR6)와 siRNA(짧은 간섭 RNA)를 통해 상호작용함으로써 표적화된 유전자를 사일런싱한다. ds RNA 복합체는 이후에 세포에 의한 분해에 대해 표적화된다. 추가의 RNAi 분자는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA); 또한 짧은 간섭 헤어핀을 포함한다. shRNA 분자는 루프에 의해 연결된 표적 유전자로부터의 센스 및 안티센스 서열을 함유한다. shRNA는 핵으로부터 세포질내로 수송되며, 이는 mRNA와 함게 분해된다. Pol III 또는 U6 프로모터는 RNAi용 RNA를 발현하는데 사용할 수 있다.
RNAi는 이들의 "표적" mRNA에 대해 서열-특이적인 상동성을 가진 이본쇄 RNA(dsRNA) 분자에 의해 매개된다(참조: Caplen et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:9742-9747, 2001). 드로소필라(Drosophila ) 세포-유리된 분해물에서의 생화학적 연구는, RNA-의존성 유전자 사일런싱의 매개인자가 21 내지 25개 뉴클레오타이드 "작은 간섭" RNA 이본체(siRNA)임을 나타낸다. 따라서, siRNA 분자는 본원에 기술된 방법에서 유리하게 사용된다. siRNA는 DICER(참조: Bernstein et al., Nature 409:363-366, 2001)로서 공지된 RNase에 의한 dsRNA의 프로세싱으로부터 기원한다. siRNA 이본체 생성물은 RISC(RNA 유도된 사일런싱 복합체)라고 불리우는 다중-단백질 siRNA 복합체로 보충된다. 어떠한 특수 이론에 얽메이지 않고, RISC는 표적 mRNA로 안내되며, 여기서 siRNA 이본체는 서열 특이적으로 상호작용하여 촉매작용 방식으로 분해를 매개한다(참조: Bernstein et al., Nature 409:363-366, 2001; Boutla et al., Curr Biol 11:1776-1780, 2001).
RNAi는 비-제한적 예로서 신경세포(참조; Krichevsky et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:11926-11929, 2002)를 포함하는 포유동물 세포에서 유전자 기능을 분석하고 필수 유전자를 확인하는데 사용되어 왔다(참조: Elbashir et al., Methods 26:199-213, 2002; Harborth et al., J Cell Sci 114:4557-4565, 2001). RNAi는 또한 파필로바이러스(poliovirus)(참조: Gitlin et al., Nature 418:379-380, 2002) 및 HIV (참조: Capodici et al., J Immunol 169:5196-5201, 2002)를 포함하나 이에 한정되지 않는 바이러스의 감염, 복제 및/또는 성장을 억제하거나 차단하고, 종양유전자(예를 들면, bcr-abl 유전자; Scherr et al., Blood Sep 26 epub ahead of print, 2002)의 발현을 감소시키는 것과 같은 치료학적 모델로 평가되고 있다. RNAi는 포유동물(마우스) 및 양서류[크세노푸스(Xenopus)] 배아(참조: 각각, Calegari et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:14236-14240, 2002; 및 Zhou, et al., Nucleic Acids Res 30:1664-1669, 2002), 및 생후 마우스(참조: Lewis et al., Nat Genet 32:107-108, 2002)에서 유전자 발현을 조절하고, 성인 유전자삽입 마우스(참조: McCaffrey et al., Nature 418:38-39, 2002)에서 이식유전자 발현을 감소시키기 위해 사용되어 왔다. 세포 배양물 및 생체내에서 siRNA의 효능 및 특이성을 측정하는 방법은 기술되어 있다[참조: 예를 들면, Bertrand et al., Biochem Biophys Res Commun 296:1000-1004, 2002; Lassus et al., Sci STKE 2002(147):PL13, 2002; 및 Leirdal et al., Biochem Biophys Res Commun 295:744-748, 2002].
siRNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는 RNAi를 매개하는 분자는 화학적 합성(참조: Hohjoh, FEBS Lett 521:195-199, 2002), dsRNA의 가수분해(참조: Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002), T7 RNA 폴리머라제를 사용한 시험관내 전사(참조: Donzeet et al., Nucleic Acids Res 30:e46, 2002; Yu et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052, 2002), 및 이. 콜라이(E. coli) RNase III와 같은 뉴클레아제를 사용한 이본쇄 RNA의 가수분해(참조: Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002)에 의해 시험관내에서 생산될 수 있다.
siRNA 분자는 또한 2개의 올리고뉴클레오타이드를 서로 어닐링 시켜 형성될 수 있으며, 전형적으로 이본쇄 부위 및 일본쇄 부위 둘다를 포함하는 다음 구조식을 갖는다:
Figure pct00006
N, X 및 Y는 뉴클레오타이드이고; X는 Y에 대한 수소 결합이며; ":"는 2개의 염기들 사이의 수소 결합을 나타내고; x는 1 내지 약 100의 값을 갖는 자연수이며; m 및 n은 독립적으로 0 내지 약 100의 값을 갖는 전체 정수이다. 일부 구체예에서, N, X 및 Y는 독립적으로 A, G, C 및 T 또는 U이다. 비-천연적으로 발생하는 염기 및 뉴클레오타이드가 특히 합성 siRNA(즉, 2개의 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 생성물)의 경우에 존재할 수 있다. 이본쇄된 중심 단면은 "코어"로 불리우며 측정 단위로서 염기쌍(bp)을 가지고; 일본쇄 부위는 측정 단위로서 뉴클레오타이드(nt)를 갖는 오버행(overhang)이다. 나타낸 오버행은 3' 오버행이나, 5' 오버행을 갖는 분자로 또한 고려된다. 또한 오버행이 없는 siRNA 분자(즉, m = 0 및 n = 0), 및 코어의 항쪽 면에 오버행이 있으나 다른 쪽은 없는(예를 들면, m = 0 및 n > 1, 또는 반대) 것들도 또한 고려된다.
초기에, RNAi 기술은 포유동물 시스템에 용이하게 적용가능한 것으로 여겨지지 않았다. 이는, 포유동물에서, dsRNA가 dsRNA-활성화된 단백질 키나제(PKR)를 활성화시켜 세포자멸사 캐스캐이드(apoptotic cascade) 및 세포 사망을 초래하기 때문이다(참조: Der et al , Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:3279-3283, 1997). 또한, dsRNA가 포유동물 세포내에서 interfeDR6 캐스캐이드를 활성화시키며, 이는 또한 변경된 세포 생리학을 이끌 수 있음이 오랫동안 공지되어 왔다(참조; Colby et al, Annu. Rev. Microbiol. 25:333, 1971; Kleinschmidt et al., Annu. Rev. Biochem. 41:517, 1972; Lampson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58L782, 1967; Lomniczi et al., J. Gen. Virol. 8:55, 1970; 및 Younger et al., J. Bacteriol. 92:862, 1966). 그러나, PKR 및 interfeDR6 캐스태이드의 dsRNA-매개된 활성화는 약 30개 염기쌍보다 긴 dsRNA를 필요로 한다. 대조적으로, 길이가 30개 미만인 염기쌍은 포유동물 세포내에서 RNAi를 유발하는 것으로 입증되었다(참조: Caplen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9742-9747, 2001). 따라서, 보다 긴 dsRNA 분자와 관련된 바람직하지 않은 비-특이적인 효과가 보다 긴 dsRNA가 실질적으로 유리된 짧은 RNA를 제조함으로써 피해질 수 있음이 예측된다.
siRNA에 관한 참조: Bernstein et al., Nature 409:363-366, 2001; Boutla et al., Curr Biol 11:1776-1780, 2001; Cullen, Nat Immunol . 3:597-599, 2002; Caplen et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:9742-9747, 2001; Hamilton et al., Science 286:950-952, 1999; Nagase et al., DNA Res. 6:63-70, 1999; Napoli et al., Plant Cell 2:279-289, 1990; Nicholson et al., Mamm. Genome 13:67-73, 2002; Parrish et al., Mol Cell 6:1077-1087, 2000; Romano et al., Mol Microbiol 6:3343-3353, 1992; Tabara et al., Cell 99:123-132, 1999; 및 Tuschl, Chembiochem. 2:239-245, 2001.
파디슨(Paddison) 등(참조: Genes & Dev . 16:948-958, 2002)은 RNAi를 수행하기 위한 수단으로서 헤어핀내로 폴딩된 작은 RNA 분자를 사용하였다. 따라서, 이러한 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 분자는 또한 본원에 기술된 방법에 유리하게 사용된다. 기능적 shRNA의 스템(Stem) 및 루프의 길이는 변하며; 스템 길이는 약 25 내지 약 30 nt 중의 임의의 범위일 수 있고, 루프 크기는 사일런싱 활성에 영향을 미치지 않으면서 4 내지 약 25 nt의 범위일 수 있다. 어떠한 특수 이론에 얽메이려고 하는 것은 아니며, 이들 shRNA는 DICER RNase의 dsRNA 생성물과 유사하고, 어떠한 경우에도 특수 유전자의 발현을 억제하기 위한 동일한 능력을 가진다. shRNA는 렌티바이러스 벡터(예를 들면, pLL3.7)로부터 발현될 수 있다.
안티센스 기술을 사용하여 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해, 또는 삼중-나선 형성을 통해 유전자 발현을 조절할 수 있다. 안티센스 기술은 예를 들면, 문헌[참조: Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)]에 논의되어 있다. 삼중 나선 형성은 예를 들면, 문헌[참조: Lee et al., Nucleic Acids Research 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); and Dervan et al., Science 251:1300 (1991)]에 논의되어 있다. 상기 방법들은 상보성 DNA 또는 RNA에 대한 폴리뉴클레오타이드의 결합을 기본으로 한다.
예를 들면, DR6를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 5' 암호화 부위를 사용하여 길이가 약 10 내지 40개 염기쌍인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드를 설계할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오타이드는 전사에 관여하는 유전자의 영역에 상보성이도록 설계함으로써 표적 단백질의 전사 및 생산을 방지한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드는 생체내에서 mRNA에 하이브리드화하여 mRNA가 표적 폴리펩타이드로 해독되는 것을 차단한다.
하나의 구체예에서, DR6 유전자에 대해 특이적인 안티센스 핵산은 외인성 서열로부터 전사에 의해 세포내로 생산된다. 예를 들어, 벡터 또는 이이 부위는 전사되어 안티센스 핵산(RNA)를 생산한다. 이러한 벡터는, 이것이 전사되어 목적한 안티센스 RNA를 생산할 수 있는 한, 에피소옴내에 잔류하거나 염색체로 통합될 수 있다. 이러한 벡터는 당해분야에서 표준 재조합체 DNA 기술 방법으로 작제할 수 있다. 벡터는 척추동물 세포내에서 복제 및 발현에 사용된, 당해 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타의 것들일 수 있다. 안티센스 분자의 발현은 척추동물, 예를 들면, 본원의 도처에 기술된 것들과 같은 인간 세포내에서 작용하는 것으로 당해 분야에 공지된 임의의 프로모터에 의해 이루어질 수 있다.
안티센스 분자의 절대적인 상보성은 요구되지 않는다. DR6를 암호화하는 RNA의 적어도 하나의 부위에 대해 상보성인 서열은, RNA와 하이브리드화될 수 있기에 충분한 상보성을 가져서, 안정한 이본체; 또는 삼본체를 형성하는 서열을 의미한다. 하이브리드화하는 능력은 상보성 정도 및 안티센스 핵산의 길이 둘다에 의존할 것이다. 일반적으로, 하이브리드화하는 핵산이 길 수록, 이것이 함유하여 여전히 안정한 이본체(또는 가능한 경우 삼본체)를 형성할 수 있는 염기 미스매치가 더 커진다. 당해 분야의 숙련가는 하이브리드화된 복합체의 융점을 측정하기 위한 표준 방법을 사용함으로써 미스매치의 내성도를 추정할 수 있다.
전령 RNA의 5' 말단, 예를 들면, AUG 개시 코돈까지 및 이를 포함하는 5' 해독되지 않는 서열에 대해 상보성인 올리고뉴클레오타이드는 해독을 억제하는데 있어 가장 효율적으로 작업해야 한다. 그러나, mRNA의 3' 해독되지 않은 서열에 대해 상보성인 서열은 mRNA의 해독을 억제하는데 있어 또한 효과적인 것으로 밝혀졌다[참조: 일반적으로, Wagner, R., Nature 372:333-335 (1994)]. 따라서, 5'- 또는 3'-해독되지 않은, 비-암호화 영역에 대해 상보성인 올리고뉴클레오타이드를 안티센스 시도에서 사용하여 DR6의 해독을 억제할 수 있다. mRNA의 5' 해독되지 않은 영역에 대해 상보성인 올리고뉴클레오타이드는 AUG 출발 코돈의 상보체를 포함하여야 한다. mRNA 암호화 영역에 대해 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 거의 효율적이지 않은 해독 억제제이지만 본원에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있다. 안티센스 핵산은 통상적으로, 길이가 적어도 6개의 뉴클레오타이드이며, 예를 들면, 길이가 6 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 범위인 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 특수한 국면에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 10개 뉴클레오타이드, 적어도 17개 뉴클레오타이드, 적어도 25개 뉴클레오타이드 또는 적어도 50개 뉴클레오타이드이다.
본원에 기술된 치료학적 방법에 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄 또는 이본쇄인, DNA 또는 RNA 또는 이의 키메라 혼합물 또는 유도체 또는 변형된 버젼일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 염기 잔기, 당 잔기 또는 포스페이트 골격에서 변형되어, 예를 들면 분자의 안정성, 하이브리드화 등을 개선시킬 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 펩타이드(예를 들면, 생체내에서 숙주 세포 수용체를 표적화시키기 위한)와 같은 다른 부가된 그룹, 또는 세포 막을 통과하는 수송을 촉진시키는 제제[참조: 예를 들면, Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556 (1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652 (1987); 1988년 12월 15일자로 공개된 PCT 공보 WO88/09810] 또는 혈액-뇌 장벽(참조: 예를 들면, 1988년 4월 25일자로 공개된 PCT 공보 WO89/10134); 하이브리드화-개시된(triggered) 분해제(참조: 예를 들면, Krol et al., BioTechniques 6:958-976 (1988)) 또는 인터컬레이팅제(intercalating agent)(참조: 예를 들면, Zon, Pharm. Res . 5:539-549(1988)]를 포함할 수 있다. 이러한 목적으로, 올리고뉴클레오타이드는 다른 분자, 예를 들면, 펩타이드, 하이브리드화 개시된 교차-결합제, 수송제, 하이브리드화-개시된 분해제 등에 접합시킬 수 있다.
본원에 기재된 치료학적 방법에 사용하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카복시하이드록실메틸) 우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N-6-이소펜틸아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N-6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N-6-이소펜틸아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 와이부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 5-메틸-2-티오우라실, 3(3-아미노-3-N2-카복시프로필) 우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노푸린과 같은 적어도 하나의 변형된 염기 잔기를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 기술된 치료학적 방법에 사용하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 아라비노즈, 2-플루오로아라비노즈, 크실룰로즈 및 헥소즈를 포함하나, 이에 한정되지 않는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 변형된 당 잔기를 포함할 수 있다.
여전히 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 치료학적 방법에 사용하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에티트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미도티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포르디아미데이트, 메틸포스포네이트, 알킬 포스포트리에스테르 및 이의 포름아세탈 또는 유사체과 같지만, 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 변형된 포스페이트 골격을 포함한다.
여전히 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 치료학적 방법에 사용하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 α-방향족 올리고뉴클레오타이드이다. α-방향족 올리고뉴클레오타이드는 일반적인 위치와는 반대로, 쇄가 서로 평행하게 위치하는 상보성 RNA와 특수한 이본쇄 하이브리드를 형성한다[참조: Gautier et al., Nucl . Acids Res . 15:6625-6641(1987)]. 올리고뉴클레오타이드는 2'-0-메틸리보뉴클레오타이드[참조: Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15:6131-6148(1987)], 또는 키메라 RNA-DNA 유사체[참조: Inoue et al., FEBS Lett. 215:327-330(1987)]이다.
폴리뉴클레오타이드는 당해 분야에 공지된 표준 방법, 예를 들면, 자동화된 DNA 합성기(Biosearch, Applied Biosystems 등으로부터 시판되는 것과 같은) 합성기를 사용하여 합성할 수 있다. 예로서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드는 문헌[참조: Stein et al., Nucl . Acids Res . 16:3209 (1988)]의 방법으로 합성할 수 있고, 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드는 조절된 공극 유리 중합체 지지체 등을 사용하여 제조할 수 있다[참조: Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451(1988)].
본원에 기술된 치료학적 방법에 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드 조성물은 촉매적 RNA, 또는 리보자임을 포함한다[참조: 예를 들면, 1990년 10월 4일자로 공개된 PCT 국제 공보 WO 90/11364; Sarver et al., Science 247:1222-1225 (1990)]. 햄머헤드(Hammerhead) 리보자임은 표적 mRNA와 함께 상보성 염기 쌍을 형성하는 영역을 플랭킹함으로써 해석된 위치에서 mRNA를 분해한다. 표적 mRNA가 2개의 염기: 5'-UG-3'의 서열을 갖는 것이 유일한 요건이다. 햄머헤드 리보자임의 작제 및 생산은 당해 분야에 익히 공지되어 있고 문헌[참조: Haseloff and Gerlach, Nature 334:585-591 (1988)]에 보다 상세히 기술되어 있다. 특정 구체예에서, 리보자임을 가공하여 분해 인식 부위가 표적 mRNA의 5' 말단 근처에 위치하도록, 즉, 비-기능성 mRNA 전사체의 효능을 증가시키고 세포내 축적을 최소화시킨다.
안티센스 시도에서와 같이, 본원에 기재된 진단 및 치료학적 방법에서 사용하기 위한 리보자임은 변형된 올리고뉴클레오타이드(예를 들면, 안정성, 표적화 등을 개선시키기 위한 것)로 구성될 수 있으며 생체내에서 DR6를 발현하는 세포로 전달될 수 있다. 리보자임을 암호화하는 DNA 작제물은 안티센스 암호화 DNA의 도입을 위해 위에서 기술된 바와 동일한 방식으로 세포내로 도입될 수 있다. 한가지 전달 방법은 예를 들면, pol III 또는 pol II 프로모터와 같은 stDR6g 구성적 또는 유도성 프로모터의 제어하에 리보자임을 "암호화"하는 DNA 작제물을 사용함을 포함함으로써, 형질감염된 세포는 내인성 DR6 전령을 파괴하고 해독을 억제하기에 충분한 양의 리보자임을 생산할 것이다. 안티센스 분자와는 달리 리보자임은 촉매성이므로, 보다 적은 세포내 농도가 효능을 위해 요구된다.
DR6 아프타머(aptamer) 길항제
또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 DR6 길항제는 아프타머이다. 아프타머는 유일한 서열, 목적한 표적(예를 들면, 폴리펩타이드)에 특이적으로 결합하는 특성을 가지며, 주어진 표적의 특이적인 리간드인 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 뉴클레오타이드 아프타머는 DR6에 결합하는 이본쇄 DNA 및 일본쇄 RNA 분자를 포함한다. 특정 구체예에서, DR6 아프타머 길항제는 희소돌기아교세포의 증식, 분화 또는 생존을 촉진하거나; 신경세포의 희소돌기아교세포-매개된 수초화를 촉진하거나; 또는 예를 들면, 포유동물에서 탈수초화를 방지한다.
핵산 아프타머는 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 대수적 증가에 의한 리간드의 전신계적 진화(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: SELEX) 방법을 사용하여 선택된다. SELEX는 본원에 이의 전문이 참조로 인용된 미국 특허 제5,475,096호, 제5,580,737호, 제5,567,588호, 제5,707,796호, 제5,763,177호, 제6,011,577호, 및 제6,699,843호에 기술된 바와 같은 표적 분자에 대한 고도의 특이적 결합을 사용한 핵산 분자의 시험관내 진화를 위한 방법이다. 아프타머를 확인하기 위한 또 다른 스크리닝 방법은 미국 특허 제5,270,163호(또한 본원에 참조로 인용됨)에 기술되어 있다. SELEX 방법은 각종의 2-차원 및 3-차원 구조를 형성하기 위한 핵산의 능력, 및 또한 단량체성 또는 중합체성인지 여부에 상관없이, 다른 핵산 분자 및 폴리펩타이드를 포함하는 사실상 임의의 화학적 화합물과 함께 리간드(특이적인 결합 쌍 형성)로서 작용하기 위한 뉴클레오타이드 단량체내에서 이용가능한 화학적 다능성을 기초로 한다. 어떠한 크기 또는 조성의 분자도 표적으로 제공될 수 있다.
SELEX 방법은 후보물 올리고뉴클레오타이드의 혼합물로부터의 선택 및 동일한 일반적인 선택 계획을 사용한 결합, 분배 및 증폭의 단계별 반복을 포함함으로써 목적한 결합 친화성 및 선택성을 달성한다. 무작위적인 서열의 분절을 포함할 수 있는, 핵산의 혼합물로부터 시작하여, SELEX 방법은 혼합물을 표적과 결합을 용이하게 하는 조건하에서 접촉시키는 단계; 표적 분자에 특이적으로 결합한 핵산으로부터 결합하지 않은 핵산을 분배하는 단계; 핵산-표적 복합체를 해리시키는 단계; 핵산-표적 복합체로부터 해리된 핵산을 증폭시켜 핵산의 리간드가 풍부한 혼합물을 수득하는 단계를 포함한다. 결합, 분배, 해리 및 증폭 단계를 표적 분자에 대한 고도로 특이적인 고 친화성 핵산을 수득하기에 바람직한 다수의 주기로 반복한다.
뉴클레오타이드 아프타머는 예를 들면, 세포내 시그날링 및 수송 경로를 나누기 위한 진단 도구 또는 특수 억제제로서 사용될 수 있다[참조: James, Curr . Opin. Pharmacol . 1:540-546 (2001)]. 뉴클레오타이드 아프타머의 고 친화성 및 특이성은 이들을 약물 발견의 우수한 후보물이 되도록 한다. 예를 들면, 독소 리신(toxin ricin)에 대한 아프타머 길항제를 분리하였으며 이는 나노몰 범위의 IC50 값을 갖는다[참조: Hesselberth JR et al ., J Biol Chem 275:4937-4942 (2000)]. 뉴클레오타이드 아프타머는 또한 감염성 질병, 악성 암 및 바이러스 표면 단백질에 대해 사용되어 세포 감염성을 감소시킬 수 있다.
본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 뉴클레오타이드 아프타머는 다른 폴리뉴클레오타이드에 대해 본원에 기술된 바와 같이 변형(예를 들면, 골격 또는 염기를 변형시키거나 펩타이드에 접합시킴으로써)시킬 수 있다.
DR6의 단백질 구조를 사용하여, SELEX 방법을 이용한 DR6 상에서 작용하는 아프타머의 스크리닝은 DR6-매개된 방법을 억제하는 아프타머의 확인을 허용한다.
본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 폴리펩타이드 아프타머는 DR6에 결합함으로써 이의 작용을 차단하는 이들의 능력에 대해 선택된 무작위적인 펩타이드이다. 폴리펩타이드 아프타머는 단백질 스캐폴드에 대해 양쪽 말단에 부착된 짧은 가변성 펩타이드 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 이본쇄 구조적 제약은 항체의 것과 비교가능한 수준으로 펩타이드 아프타머의 결합 친화성을 크게 증가시킨다(나노몰 범위)[참조: 예를 들면, Hoppe-Seyler F et al ., J Mol Med 78(8):426-430 (2000)]. 짧은 가변 펩타이드의 길이는 전형적으로 약 10 내지 20개 아미노산이고, 스캐폴드는 우수한 가용성 및 조밀성(compacity) 특성을 갖는 특정 단백질일 수 있다. 스캐폴드 단백질의 하나의 비-제한적인 예는 세균 단백질 티오레독신-A이다[참조: 예를 들면, Cohen BA et al., PNAS 95(24): 14272-14277 (1998)].
폴리펩타이드 아프타머는 단백질 기능의 우세한 억제제로서 작용하는 펩타이드 또는 소 폴리펩타이드이다. 펩타이드 아프타머는 표적 단백질에 특이적으로 결합하여 이들의 기능성 능력을 차단한다[참조: Kolonin et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 14,266-14,271]. 표적 단백질에 대해 고 친화성 및 특이성으로 결합하는 펩타이드 아프타머는 당해 분야에 공지된 각종 기술로 분리할 수 있다. 펩타이드 아프타머는 효모 2개-하이브리드 스크리닝[참조: Xu, C.W., et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:12,473-12,478] 또는 리보소옴 디스플레이[참조: Hanes et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:4937-4942]에 의해 무작위적인 펩타이드 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 이들은 또한 파아지 라이브러리[참조: Hoogenboom, H.R., et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20]로부터 분리되거나 화학적으로 생성된 펩타이드 라이브러리일 수 있다. 또한, 폴리펩타이드 아프타머는 리간드 조절된 펩타이드 아프타머(Ligand Regulated Peptide Aptamers: LiRPA)의 선택을 사용하여 선택할 수 있다[참조: 예를 들면, 본원에 참조로 인용된 Binkowski BF et al ., (2005) Chem & Biol 12(7): 847-855]. 펩타이드 아프타머가 합성되는 어려운 수단이 이의 사용을 폴리뉴클레오타이드 아프타머보다 더 복잡하게 하지만, 이들은 제한되지 않은 화학적 다양성을 가진다. 폴리뉴클레오타이드 아프타머는 단지 4개의 뉴클레오타이드 염기를 이용하므로 제한되는 반면, 펩타이드 아프타머는 훨씬 더-확장된 레퍼토리(즉, 20개 아미노산)을 가질 수 있다.
본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 펩타이드 아프타머는 본원의 도처에 다른 폴리펩타이드에 대해 기술된 바와 같이 변형(예를 들면, 중합체에 접합되거나 단백질에 융합)될 수 있다.
P75 길항제
본원에 기술된 방법에 따라 사용될 p75의 길항제는 예를 들면, (i) p75 길항제 화합물; (ii) p75 길항제 폴리펩타이드; (iii) p75 길항제 항체 또는 이의 단편; (iv) -75 길항제 폴리뉴클레오타이드; (v) p75 아프타머; 및 (vi) 2개 이상의 상기 p75 길항제의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, p75 길항제는 p75와 DR6의 상호작용을 억제한다.
P75 길항제는 당해 분야에 공지되어 있으며, 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 p75 및 DR6의 상호작용을 억제하는 시험 p75 길항제를 스크리닝하고 시험하는 방법을 알 것이다. 예를 들면, p75의 사이클릭 데카펩타이드 길항제는, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Turner et al. J. Neuroscience Research 78: 193-199 (2004)]에 기술되어 있다.
벡터 및 숙주 세포
숙주-발현 시스템은, 목적한 암호화 서열이 생산되어 후속적으로 정제되는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오타이드 암호화 서열로 형질전환되거나 형질감염된 경우, 반응계내에서 DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 항체를 발현할 수 있는 세포도 나타낸다. 이들은 DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합체 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균[예를 들면, 이. 콜라이, 비, 서브틸리스(B. subtilis)]; DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합체 효모 발현 벡터로 형질전환된 호모[예를 들면, 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia)]; DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합체 바이러스 발현 벡터(예를 들면, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합체 플라스미드 발현 벡터(예를 들면, Ti 플라스미드)로 형질전환되거나, 재조합체 바이러스 발현 벡터[예를 들면, 카울리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus), CaMV; 담배 모자이크 바이러스(tobacco mosaic virus), TMV]로 감염된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 기원한 프로모터(예를 들면, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 기원한 프로모터(예를 들면, 아데노바이러스 레이트 프로모터; 박시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합체 발현 작제물을 지닌 포유동물 세포 시스템(예를 들면, COS, CHO, BLK, 293, 3T3 세포)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 전체 재조합체 항체 분자의 발현을 위한 에스케리키아 콜라이와 같은 세균 세포, 또는 진핵 세포를 재조합체 DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 항체 분자의 발현에 사용한다. 예를 들면, 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 인터미디에이트 얼리 유전자 프로모터(major intermediate early gene promoter) 성분과 같은 벡터와 함께, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유동물 세포는 DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다[참조: Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)].
세균 시스템에서, 다수의 발현 벡터를 발현되는 DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 항체 분자에 대해 의도된 용도에 의존하여 유리하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 다량의 이러한 단백질이 생산되는 경우, DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 항체 분자의 약제학적 조성물의 생성을 위해, 용이하게 정제되는 높은 수준의 융합 단백질 생성물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는, DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 항체를 암호화하는 서열이 lacZ 암호화 영역과 함께 프레임내(in frame)로 개별적으로 결합되어 융합 단백질이 생산되도록 할 수 있는 이. 콜라이 발현 벡터 pUR278[참조: Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)]; pIN 벡터[참조: Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)] 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. pGEX 벡터를 또한 사용하여 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외부 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며 매트릭스 글루타티온-아가로즈 비드에 대한 흡착 및 결합에 이은 유리 글루타티온의 존재하에서의 용출에 의해 분해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 분해 부위를 포함하도록 설계함으로써 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 잔기로부터 방출될 수 있도록 한다.
곤충 시스템에서, 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵다면체형성 바이러스(AcNPV)를 전형적으로 벡터로서 사용하여 외부 유전자를 발현시킨다. 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda ) 세포내에서 성장한다. DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 항체 암호화 서열을 바이러스의 비-필수 영역(예를 들면, 폴리헤드린 유전자)내로 개별적으로 클로닝시키고 AcNPV 프로모터(예를 들면, 폴리헤드린 프로모터)의 제어하에 위치시킬 수 있다.
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-계 발현 시스템을 이용할 수 있다. 아데노바이러스를 발현 벡터로 사용하는 경우, DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 목적한 항체를 암호화하는 서열을 아데노바이러스 전사/해독 조절 복합체, 예를 들면, 레이트 프로모터 및 3부(tripartite) 리더 서열에 결합시킬 수 있다. 이후에, 당해 키메라 유전자를 아데노바이러스 게놈내에 시험관내 또는 생체내 재조합으로 삽입시킬 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역(예를 들면, 영역 E1 또는 E3)내 삽입은 감염된 숙주내에서 DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 항체 분자를 발현할 수 있고 생존성인 재조합체 바이러스를 초래할 것이다[참조: 예를 들면, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984)]. 특수 개시 시그날은 또한 삽입된 항체 암호화 서열의 효율적인 해독에 필요할 수 있다. 이들 시그날은 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함한다. 또한, 개시 코돈은 바람직한 암호화 서열의 판독 프레임과 상내에 존재하여 전체 삽입체의 해독을 보증하여야 한다. 이들 외인성 해독 조절 시그날 및 개시 코돈은 천연 및 합성 둘다의 다양한 기원일 수 있다. 발현 효능은 적절한 전사 인핸서 성분, 전사 터미네이트 등을 포함시켜 향상시킬 수 있다[참조: Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)].
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 바람직한 특수 양식으로 유전자 생성물을 변형시키고 프로세싱하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형(예를 들면, 글리코실화) 및 프로세싱(예를 들면, 분해)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 해독 후 프로세싱 및 변형을 위한 특징적으로 특수한 메카니즘을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택하여 발현된 외부 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보증할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 유전자 생성물의 주요 전사, 글리코실화 및 포스포릴화의 적절한 프로세싱을 위한 세포 기구를 지닌 진핵 숙주 세포를 사용할 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포는 CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, 및 특히, 예를 들면, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D와 같은 유방암 세포주, 및 예를 들면, CRL7030 및 Hs578Bst와 같은 포유동물 선 세포주를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
재조합체 단백질의 장기간의, 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 전형적으로 사용된다. 예를 들면, DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주를 가공할 수 있다. 바이러스 복제 오리진을 함유하는 발현 벡터를 사용하기 보다는, 숙주 세포를 적절한 발현 조절 성분(예를 들면, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 터미네이터, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택 마커로 조절된 DNA로 형질전환시킬 수 있다. 외부 DNA이 도입에 이어서, 가공된 세포를 강화된 배지 속에서 1 내지 2일 동안 성장하도록 한 후 선택 배지에 대해 스위치(switch)할 수 있다. 재조합체 플라스미드내 선택 마커는 선택에 대한 내성을 부여하며 세포가 플라스미드를 자체의 염색체내로 안정하게 통합하여 성장함으로써 궁극적으로 클로닝되어 세포주내로 확장될 수 있는 병소를 형성하도록 한다. 당해 방법은 DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주를 가공하는데 유리하게 사용될 수 있다.
tk-, hgprt- 또는 aprt-세포 각각에 사용될 수 있는, 헤르페스 단성 바이러스 티미딘 키나제[참조: Wigler et al., Cell 11:223 (1977)], 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제[참조: Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)], 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(참조: Lowy et al., Cell 22:817 1980) 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 선택 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항대사물질 내성을 다음 유전자에 대한 선택 기준으로 사용할 수 있다: 메토트렉세이트에 대해 내성을 부여하는, dhfr[참조; Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)]; 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt[참조: Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)]; 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo[참조: Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann . Rev . Pharmacol . Toxicol . 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann . Rev . Biochem . 62:191-217 (1993); TIB TECH 11(5):155-215 (May, 1993)]; 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro[참조: Santerre et al., Gene 30:147 (1984)]. 사용될 수 있는 재조합체 DNA 기술의 당해 분야에 일반적으로 공지된 방법은, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Prolocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)]에 기술되어 있다.
DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 항체의 발현 수준은 벡터 증폭으로 증가시킬 수 있다[고찰을 위한 참조: Bebbington and Hentschel, The use of Vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mannalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987)]. DR6 및/또는 p75 길항제 폴리펩타이드 또는 항체를 발현하는 벡터 시스템내 마커가 증폭가능한 경우, 숙주 세포의 배양물 속에 존재하는 억제제의 수준에 있어서의 증가는 마커 유전자의 카피의 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체 또는 다른 폴리펩타이드 유전자와 관련되므로, 항체 또는 다른 폴리펩타이드의 생산을 또한 증가시킬 것이다[참조: Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)].
DR6 및/또는 p75 길항제, 예를 들면, 가용성 폴리펩타이드, 항체, 길항제 폴리뉴클레오타이드, 또는 아프타머를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 사용하여 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 길항제를 생산할 수 있다. 이러한 핵산이 작동적으로 연결된 벡터 및 발현 조절 서열의 선택은 목적한 기능적 특성, 예를 들면, 단백질 발현, 및 형질전환될 숙주 세포에 의존한다.
작동적으로 연결된 암호화 서열의 발현을 조절하는데 유용한 발현 조절 성분은 당해 분야에 공지되어 있다. 이의 예는 유도성 프로모터, 구성적 프로모터, 분비 시그날 및 다른 조절 성분을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 유도성 프로모터를 사용하는 경우, 이는 예를 들면, 숙주 세포 배지 속에서 영양소 상태를 변화시키거나 온도를 변화시킴으로써 조절할 수 있다.
벡터는 원핵세포 레플리콘(replicon), 즉, 세균 숙주 세포내에서 재조합체 DNA 분자의 자가 복제 및 유지를 염색체-외적으로 지시하는 능력을 가진 DNA 서열을 포함할 수 있다. 이러한 레플리콘은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 또한, 원핵세포 레플리콘을 포함하는 벡터는 또한 이의 발현이 약물 내성과 같은 검출가능한 마커를 부여하는 유전자를 포함할 수 있다. 세균 약물-내성 유전자의 예는 암피실린 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 것들이다.
원핵세포 레플리콘을 포함하는 벡터는 또한 세균 숙주 세포내에서 암호화 유전자 서열의 발현을 지시하기 위한 원핵세포 또는 박테리오파아지 프로모터를 포함할 수 있다. 세균 숙주와 혼용성인 프로모터 서열이, 발현된 DNA 분절의 삽입을 위한 편리한 제한 부위를 함유하는 플라스미드 벡터내에 전형적으로 제공된다. 이러한 플라스미드 벡터의 예는 pUC8, pUC9, pBR322 및 pBR329(BioRad), pPL 및 pKK223 (Pharmacia)이다. 특정의 적합한 원핵세포 숙주를 사용하여 본원에 기술된 방법에 사용된 단백질을 암호화하는 재조합체 DNA 분자를 발현시킬 수 있다.
본원에 기술된 목적을 위해, 다수의 발현 벡터 시스템을 사용할 수 있다. 예를 들면, 하나의 부류의 벡터는 소 파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 박시니아 바이러스, 바쿨로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 기원한 DNA 성분을 이용한다. 다른 것들은 내부 리보소옴 결합 부위를 가진 다시스트론성 시스템(polycistronic system)의 사용을 포함한다. 또한, DNA를 자체의 염색체내로 통합시킨 세포는 형질감염된 숙주 세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 마커를 도입시켜 선택할 수 있다. 마커는 영양요구성 숙주에게 원시영양체(prototrophy), 살생제 내성(예를 들면, 항생제), 또는 구리와 같은 중금속에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 발현될 DNA 서열내에 직접 연결시키거나 공형질전환에 의해 동일한 세포내로 도입시킬 수 있다. 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo) 유전자가 선택가능한 마커 유전자의 예이다[참조: Southern et al., J. Mol. Anal. Genet. 1:327-341 (1982)]. 추가의 성분이 또한 mRNA의 최적의 합성을 위해 요구될 수 있다. 이들 성분들은 시그날 서열, 스플라이스 시그날, 및 또한 전사 프로모터, 인핸서 및 종결 시그날을 포함할 수 있다.
하나의 구체예에서, NEOSPLA(미국 특허 제6,159,730호)로 언급된, 업자(Biogen IDEC, Inc.) 소유의 발현 벡터를 사용할 수 있다. 당해 벡터는 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서, 마우스 베타 글로빈 주요 프로모터, SV40 복제 오리진, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 엑손 1 및 엑손 2, 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자 및 리더 서열을 함유한다. 당해 벡터는 CHO 세포내에서 형질감염에 이어 G418 함유 배지내 선택 및 메토트렉세이트 증폭시 매우 높은 수준의 발현을 초래하는 것으로 밝혀졌다. 물론, 진핵 세포내에서 발현을 유발할 수 있는 어떠한 발현 벡터도 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예는 플라스미드 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, 및 pZeoSV2 (캘리포니아 샌디에고 소재의 Invitrogen에서 시판), 및 플라스미드 pCI (위스콘신 매디슨 소재의 Promega에서 시판)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가의 진핵세포 발현 벡터는 당해 분야에 공지되어 있으며 시판되고 있다. 전형적으로 이러한 벡터는 목적한 DNA 분절의 삽입을 위해 편리한 제한 부위를 함유한다. 예시적인 벡터는 pSVL 및 pKSV-10(Pharmacia), pBPV-1, pml2d(International Biotechnologies), pTDT1(ATCC 31255), 레트로바이러스 발현 벡터 pMIG 및 pLL3.7, 아데노바이러스 셔틀 벡터 pDC315, 및 AAV 벡터를 포함한다. 다른 예시적인 벡터 시스템은 예를 들면, 미국 특허 제6,413,777호에 기재되어 있다.
일반적으로, 적합하게 높은 수준의 길항제를 발현하는 것들에 대한 다수의 형질전환된 세포는, 예를 들면, 로보트 시스템(robotic system)으로 수행할 수 있는 정규 실험이다.
포유동물 숙주 세포 발현을 위해 흔히 사용된 조절 서열은 포유동물 세포내에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 성분, 예를 들면, 레트로바이러스 LTR, 사이토메갈로바이러스(CMV)(예: CMV 프로모터/인핸서), 아데노바이러스[예를 들면, 아데노바이러스 주요 레이트 프로모터(adenovirus major late promoter: AdmlP)], 폴리오마 및 천연의 면역글로불린 및 액틴 프로모터와 같은 강력한 포유동물 프로모터를 포함한다. 바이러스 조절 성분 및 이의 서열의 추가의 설명에 대해서는 예를 들면, 스틴스키(Stinski)의 미국 특허 제5,168,062호; 벨(Bell)의, 미국 특허 제4,510,245호; 및 샤프너(Schaffner)의, 미국 특허 제4,968,615호를 참조한다.
재조합체 발현 벡터는 숙주 세포내에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들면, 복제 오리진) 및 선택가능한 마커 유전자를 수반할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는, 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다(참조: 예를 들면, 악셀(Axel)의 미국 특허 제4,399,216호; 제4,634,665호 및 제5,179,017호). 예를 들면, 대표적으로 선택가능한 마커 유전자는 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을, 벡터가 도입된 숙주 세포상에 부여한다. 흔히 사용된 선택가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭을 가진 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위해) 및 neo 유전자(G418 선택을 위해)를 포함한다.
DR6 및/또는 p75 길항제를 암호화하는 벡터를 적합한 숙주 세포의 형질전환에 사용할 수 있다. 형질전환은 어떠한 적합한 방법에 의해서도 이룰 수 있다. 외인성 DNA를 포유동물 세포내로 도입시키는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 덱스트란-매개된 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌-매개된 형질감염, 엽록소 융합, 전기천공, 리포좀내에 폴리뉴클레오타이드(들)의 피막형성, 및 핵내로의 DNA의 직접적인 미세주사를 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포내로 도입될 수 있다.
본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 DR6 및/또는 p75 길항제의 발현용 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예시적인 진핵세포 숙주 세포는 효모 및 포유동물 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(ATCC 수탁 번호 제CCL61호), NIH 스위스 마우스 배아 세포 NIH-3T3(ATCC 수탁번호 제CRL1658호), 및 새끼 햄스터 신장 세포(BHK)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 유용한 진핵 숙주 세포는 곤충 세포 및 식물 세포를 포함한다. 예시적인 원핵세포 숙주 세포는 이. 콜라이 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)이다.
숙주 세포의 형질전환은 사용된 벡터 및 숙주 세포에 적합한 통상의 방법으로 달성할 수 있다. 원핵 숙주 세포의 형질전환을 위해, 전기영동 및 염 처리 방법을 사용할 수 있다[참조: Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110-14 (1972)]. 척추동물 세포의 형질전환을 위해, 전기천공, 양이온성 지질 또는 염 처리 방법을 사용할 수 있다[참조: 예를 들면, Graham et al., Virology 52:456-467 (1973); Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1373-76 (1979)].
특정 구체예에서, 단백질 발현에 사용된 숙주 세포주는 포유동물 기원이며; 당해 분야의 숙련가는 발현될 목적한 유전자 생성물에 가장 적합한 특수 숙주 세포주를 측정하기 위한 능력이 입증되어 있다. 예시적인 숙주 세포주는 NSO, SP2 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예를 들면, Hep G2), A549 세포 DG44 및 DUXB11(차이니즈 햄스터 난소 세포주, DHFR 마이너스), HELA(인간 자궁경부 암종), CVI(원숭이 신장세포주), COS(CVI와 SV40 T 항원의 유도체), R1610(차이니즈 햄스터 섬유모세포) BALBC/3T3(마우스 섬유모세포), HAK(햄스터 신장 세포주), SP2/O(마우스 흑색종), P3x63-Ag3.653(마우스 흑색종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프세포) 및 293(인간 신장)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 숙주 세포주는 공급업자, 아메리칸 티슈 컬쳐 컬렉션(American Tissue Culture Collection) 또는 공개된 문헌으로부터 이용가능하다.
생산 세포주로부터 폴리펩타이드의 발현은 공지된 기술을 사용하여 향상시킬 수 있다. 예를 들면, 글루탐산 신테타제(GS) 시스템이 특정 조건하에서 발현을 향상시키기 위해 일반적으로 사용된다(참조: 유럽 특허 제0 216 846호, 제0 256 055호, 및 제0 323 997호 및 유럽 특허원 제89303964.4호).
유전자 치료요법
DR6 및/또는 p75 길항제는 포유동물, 예를 들면, 인간 환자내에서 희소돌기아교세포의 생존, 증식 및 분화의 촉진 또는 신경세포의 수초화의 촉진이 치료학적으로 유리할 수 있는 신경계 질병, 질환 또는 손상의 치료에 대한 유전자-치료요법 시도를 사용하여 생체내에서 생산할 수 있다. 이는 적합한 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된 적합한 DR6 및/또는 p75 길항제를 암호화하는 핵산의 투여를 포함한다. 일반적으로, 이들 서열들은 바이러스 벡터내로 혼입된다. 이러한 유전자 치료요법용으로 적합한 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 엔테로바이러스 벡터, 페스티바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 엡슈타인 바르 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 박시니아 바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 및 헤르페스 단성 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는 복제-결함성 바이러스 벡터일 수 있다. 자체의 E1 유전자 또는 E3 유전자내 결실이 있는 아데노바이러스 벡터가 전형적으로 사용된다. 아데노바이러스 벡터가 사용되는 경우, 당해 벡터는 대개 선택가능한 마커 유전자를 갖지 않는다.
약제학적 조성물
본원에 기술된 방법에 사용된 DR6 및/또는 p75 길항제는 인간을 포함한 포유동물에 투여하기 위한 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 본원에 기술된 방법에 사용된 약제학적 조성물은 예를 들면, 이온 교환제, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 포스페이트와 같은 완충제 물질, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화된 야채 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 프로타민 설페이트과 같은 염 또는 전해질, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로즈-계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-차단 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모 지방(wool fat)을 포함하는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본원에 기술된 방법에 사용된 조성물은 어떠한 적합한 방법으로도, 예를 들면, 비경구적으로, 심실내로, 경구적으로, 흡입 분무에 의해, 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 볼내로, 질내로 또는 이식된 저장기를 통해 투여될 수 있다. 본원에 기술된 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근육내, 동맥내, 윤활막내, 흉골내, 난포막내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 앞서 기술한 바와 같이, 본원에 기술된 방법에 사용된 DR6 및/또는 p75 길항제는 신경계내에서 작용하여 신경계 세포의 생존을 촉진하고 세포자멸사를 방지한다. 따라서, 본원에 기술된 특정 방법에서, DR6 및/또는 p75 길항제는, 이들이 혈액-뇌 장벽을 투과하는 방식으로 투여된다. 이러한 통과는 DR6 및/또는 p75 길항제 분자 자체에서 고유한 생리학적-화학적 특성으로부터, 약제학적 조성물내 다른 성분, 또는 침, 캐뉼라 또는 혈액-뇌 장벽을 파괴하는 외과 장치와 같은 기계적 장치의 사용으로부터 초래될 수 있다. DR6 및/또는 p75 길항제가 혈액-뇌 장벽을 고유하게 통과하지 않는 분자, 예를 들면, 통과를 촉진하는 잔기에 대한 융합체인 경우, 적합한 투여 경로는 예를 들면, 경막내 또는 두개내, 예를 들면, MS의 만성 병변내로 직접 투여하는 것이다. DR6 및/또는 p75 길항제가 혈액-뇌 장벽을 고유하게 통과하는 분자인 경우, 투여 경로는 하기 기술된 각종 경로 중의 하나 이상에 의해 수행될 수 있다.
본원에 기술된 조성물의 멸균 주사가능한 형태는 수성 또는 유지성 현탁액일 수 있다. 이들 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하는 당해 분야에 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균, 주사가능한 제제는 또한 예를 들면, 1,3-부탄디올중 현탁액과 같은 무-독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균, 주사가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매중에는 물, 링거액(Ringer's solution) 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균, 고정 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해서, 합성의 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함하는 어떠한 배합 고정 오일을 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 버젼에서 올리브 오일 또는 캐스터 오일과 같은 천연의 약제학적으로 허용되는 오일에서와 같이, 주사가능한 제제에서 유용하다. 이들 오일 용액 또는 현탁액은 또한 유액 및 현탁액을 포함하는 약제학적으로 허용되는 용량형의 제형에서 일반적으로 사용되는 카복시메틸 셀룰로즈 또는 유사한 현탁화제와 같은 장쇄 알코올 희석제 또는 분산제를 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 고체, 액체 또는 다른 용량형의 제조시 일반적으로 사용되는 트윈, 스판(Span) 및 다른 유화제 또는 생체이용성 증진제와 같은 다른 일반적으로 사용되는 표면활성제를 또한 제형의 목적을 위해 사용할 수 있다.
비경구 제형은 단일 볼내 투여량, 주입 또는 로딩 볼내 투여량(loading bolus dose)에 이은 유지 투여량일 수 있다. 이들 조성물은 특수한 고정되거나 가변성인 간격, 예를 들면, 1일에 1회, 또는 "필요할 경우" 기준으로 투여될 수 있다.
본원에 기술된 방법에서 사용된 특정의 약제학적 조성물은 예를 들면, 캅셀, 정제, 수성 현탁제 또는 액제를 포함하는 허용되는 용량 형태로 경구 투여할 수 있다. 특정의 약제학적 조성물은 또한 비강 에어로졸 또는 흡입으로 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 생체이용성을 향상시키기 위한 벤질 알코올 또는 다른 적합한 방부제, 흡수 촉진제, 및/또는 다른 통상의 가용화제 또는 분산제를 사용하여, 염수 중 용액으로서 제조할 수 있다.
단일 용량형을 생산하기 위해 담체 물질과 합할 수 있는 DR6 및/또는 p75 길항제의 양은 치료된 숙주, 사용된 길항제의 유형 및 특수 투여 방식에 따라 변할 것이다. 조성물은 단일 투여량, 다중 투여량으로서 또는 주입시 확립된 기간에 걸쳐서 투여될 수 있다. 용량 섭생은 또한 최적의 바람직한 반응(예를 들면, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공하도록 조절될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기술된 방법은 DR6 및/또는 p75 길항제의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"을 사용한다. 이러한 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양은 개인의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양은 또한, 특정의 독성 또는 유해한 효과보다 치료학적으로 유익한 효과가 더 커지는 양이다.
특정의 특수 환자에 대해 특수 용량 및 치료 섭생은 사용된 특수 DR6 및/또는 p75 길항제, 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이, 및 투여 횟수, 배설속도, 약물 조합 및 치료하는 특수 질병의 중증도를 포함하는 각종 인자에 의존할 것이다. 의학적 보호자에 의한 이러한 인자들의 판단은 당해 분야의 통상의 기술내에 있다. 상기 양은 또한 치료되는 개개 환자, 투여 경로, 제형 유형, 사용된 화합물의 특징, 질병의 중증도, 및 바람직한 효과에 의존할 것이다. 사용된 양은 당해 분야에 잘 공지된 약리학적 및 약력학적 원리에 의해 결정될 수 있다.
본원에 기술된 방법에서, DR6 및/또는 p75 길항제는 일반적으로 신경계, 뇌심실내, 또는 경막내, 예를 들면, 만성 병변내로 직접 투여된다. 본원에 기술된 방법에 따른 투여용 조성물은, 0.001 내지 10 mg/체중 kg/일 용량의 DR6 및/또는 p75 길항제가 투여되도록 제형화될 수 있다. 일부 구체예에서, 용량은 0.01 내지 1.0 mg/체중 kg/일이다. 일부 구체예에서, 용량은 0.001 내지 0.5 mg/체중 kg/일이다.
DR6 및/또는 p75 길항제 항체를 사용한 치료를 위해, 용량은 예를 들면, 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 및 보다 일반적으로 0.01 내지 5 mg/숙주 체중 kg(예를 들면, 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1mg/kg, 2 mg/kg 등)의 범위일 수 있다. 예를 들면, 용량은 1 mg/체중 kg 또는 10 mg/체중 kg 또는 1 내지 10 mg/kg의 범위, 예를 들면, 적어도 1 mg/kg일 수 있다. 상기 범위내 중간 투여량을 또한 사용할 수 있다. 피검자는 이러한 투여량을 매일, 격일로, 매주 또는 경험적 분석으로 측정한 특정의 다른 계획에 따라서 투여할 수 있다. 예시적인 치료는 연장된 기간, 예를 들면, 적어도 6개월에 걸쳐 다수 투여량의 투여를 포함한다. 추가의 예시적인 치료 섭생은 매 격주당 1회 또는 1개월당 1회 또는 매 3 내지 6개월당 1회를 포함한다. 예시적인 용량 계획은 연속된 일로 1 내지 10 mg/kg 또는 15 mg/kg, 격일로 30 mg/kg 또는 매주 60 mg/kg을 포함한다. 일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2회 이상의 모노클로날 항체를 동시에 투여하며, 여기서, 투여된 각각의 항체의 용량은 나타낸 범위내에 속한다.
특정 구체예에서, 피검자는 DR6 및/또는 p75 길항제 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 핵산 분자로 치료할 수 있다. 핵산의 투여량은 환자당 약 10 ng 내지 1 g, 100 ng 내지 100 mg, 1 mg 내지 10 mg, 또는 30 내지 300 mg의 DNA 범위이다. 감염성 바이러스 벡터에 대한 투여량은 투여량당 10 내지 100 이상의 비리온(virion)으로 변한다.
보충적 활성 화합물을 또한 본원에 기술된 방법에 사용된 조성물내로 혼입시킬 수 있다. 예를 들면, 가용성 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 공제형화하고/하거나 공투여할 수 있다.
전달 방법은 조절된 방출 시스템의 삽입 또는 수용액의 볼내 주사를 포함하는, 선택된 표적 조직에 대한 DR6 및/또는 p75 길항제용의 어떠한 적합한 전달 방법도 포함한다. 방출 조절된 이식물의 사용은 반복된 주사에 대한 요구도를 감소시킨다.
본원에 기술된 DR6 및/또는 p75 길항제는 뇌내로 직접 주입될 수 있다. 화합물의 직접적인 뇌 주입용의 각종 이식물이 공지되어 있으며 신경계 질환으로 고생하는 인간 환자에게 치료학적 화합물을 전달하는데 효과적이다. 이들은 뇌내로, 펌프, 정위적으로 이식된(stereotactically implanted), 일시적인 간질 카테터, 영구적인 두개내 카테터 이식물, 및 외과적으로 이식된 이식물을 사용한 뇌내로의 만성 주입을 포함한다[참조: 예를 들면, Gill et al., supra; Scharfen et al., "High Activity Iodine-125 Interstitial Implant For Gliomas", Int . J. Radiation Oncology Biol . Phys . 24(4):583-591 (1992); Gaspar et al., "Permanent 125I Implants for Recurrent Malignant Gliomas", Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 43(5):977-982 (1999); chapter 66, pages 577-580, Bellezza et al., "Stereotactic Interstitial Brachytherapy", in Gildenberg et al., Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery, McGraw-Hill (1998); and Brem et al., "The Safety of Interstitial Chemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in the Treatment of Newly Diagnosed Malignant Gliomas: Phase I Trial", J. Neuro-Oncology 26:111-23 (1995)].
조성물은 화합물의 적합한 전달 또는 지지체 시스템으로서 작용하는 생혼화성 담체 물질 속에 분산된 DR6 및/또는 p75 길항제를 또한 포함할 수 있다. 지연된 방출 담체의 적합한 예는 좌제 또는 캅셀제와 같은 성형품의 형태인 반투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 이식가능하거나 미세캅셀의 지속 방출 매트릭스는 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,319호; EP 58,481), L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체[참조: Sidman et al., Biopolymers 22:547-56 (1985)]; 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 에틸렌 비닐 아세테이트[참조: Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)] 또는 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산(EP 133,988)을 포함한다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, DR6 및/또는 p75 길항제는 뇌의 적절한 영역내로 직접 주입함으로써 환자에게 투여된다[참조: 예를 들면, Gill et al., Nature Med. 9: 589-95 (2003)]. 다른 기술도 이용가능하며 DR6 및/또는 p75 길항제를 투여하기 위해 적용될 수 있다. 예를 들면, 카테터 또는 이식물의 정위 설치는 라이헤르트-문딘저 단위(Riechert-Mundinger unit) 및 ZD[자모라노-우조브니(Zamorano-Dujovny)] 다중목적 국재화 단위를 사용하여 달성할 수 있다. 120 ml의 옴니파크(omnipaque), 350 mg 요오딘/ml를 주사하고, 2 mm 단면 두께를 사용하는 조영-향상된 전산화단층촬영법(CT) 스캔은 3차원적인 다면 치료 계획[three-dimensional multiplanar treatment planning: STP, Fischer, 독일 프라이부르크 소재)을 허용할 수 있다. 상기 장치는 선명한 표적 구조를 위한 CT 및 MRI 표적 정보와 병합된, 자기 공명 영상 연구를 기초로 한 계획을 허용한다.
GE CT 스캐너(General Electric Company, Milwaukee, WI) 및 또한 브라운-로버트-웰즈(Brown-Roberts-Wells: BRW) 정위 시스템(Radionics, Burlington, MA)과 함께 사용하도록 변형된 렉셀 정위 시스템(Leksell stereotactic system)(Downs Surgical, Inc., Decatur, GA)을 당해 목적을 위해 사용할 수 있다. 따라서, 이식날 아침에, BRW 정위 프레임의 고리 모양의 기본 환을 환자의 두개골에 부착시킬 수 있다. 일련의 CT 단면을 기본 판에 고정된 흑연 막대 로컬라이저 프레임이 있는 영역(표적 조직)을 통해 3mm 간격으로 수득할 수 있다. 컴퓨터화된 치료 계획 프로그램을 VAX 11/780 컴퓨터(Digital Equipment Corporation, Maynard, Mass.) 상에서 흑연 막대 영상의 CT 조정을 사용하여 수행하여 CT 공간과 BRW 공간 사이를 맵핑한다.
본원에 기술된 증가된 세포 사망과 관련된 신경계 질환의 치료 방법은 시험관내에서 및 이후에, 인간에서 사용하기 전에 바람직한 치료학적 또는 예방학적 활성에 대해 허용가능한 동물 모델에서 생체내 시험한다. 유전자삽입 동물을 포함하는 적합한 동물 모델은 당해 분야의 숙련가들에게 잘 공지될 것이다. 예를 들면, DR6 및/또는 p75 길항제의 생존 효과를 입증하기 위한 시험관내 검정은 본원에 기술되어 있다. 세포자멸사에 대한 DR6 및/또는 p75 길항제의 효과는 실시예에 기술된 바와 같이 시험관내에서 시험할 수 있다. 최종적으로, 생체내 시험은 DR6 및/또는 p75 길항제를 발현하는 유전자삽입 동물을 창조하거나 DR6 및/또는 p75 길항제를 본원에 기술된 바와 같은 모델에서 마우스 또는 랫트에게 투여함으로써 수행할 수 있다.
본 명세서에 기재된 실시는, 달리 지적되지 않으면, 본 기술분야의 범위 내인 세포생물학, 세포 배양, 분자생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 종래의 기술을 이용한다. 그와 같은 기술은 하기 문헌에서 충분히 설명된다. 참조, 예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set), J. Sambrook, D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); Genes VIII, B. Lewin, Prentice Hall (2003); PCR Primer, C.W. Dieffenbach and G.S. Dveksler, CSHL Press (2003); DNA Cloning, D. N. Glover ed., Volumes I and II (1985); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (Methods in Molecular Biology), P. Herdewijn (Ed.), Humana Press (2004); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th edition, R. I. Freshney, Wiley-Liss (2000); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait (Ed.), (1984); Mullis et al. U.S. Pat. No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Nucleic Acid Hybridization, M. L. M. Anderson, Springer (1999); Animal Cell Culture and Technology, 2nd edition, M. Butler, BIOS Scientific Publishers (2004); Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (Practical Approach Series), J. Woodward, Irl Pr (1992); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins (Eds.) (1984); Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); A Practical Guide To Molecular Cloning, 3rd edition, B. Perbal, John Wiley & Sons Inc. (1988); the treatise, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155, Wu et al. (Eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer and Walker, (Eds.), Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell (Eds.), (1986); Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques (4 Volume Set), 1st edition, I. Lefkovits, Academic Press (1997); Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002); and in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989).
항체 공학의 일반적인 원리는 하기에 나타나 있다: Antibody Engineering: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), B.L. Lo (Ed.), Humana Press (2003); Antibody engineering, R. Kontermann and S. Dubel (Eds.), Springer Verlag (2001); Antibody Engineering, 2nd edition, C.A.K. Borrebaeck (Ed.), Oxford Univ. Press (1995). 단백질 공학의 일반적인 원리는 하기에 나타나 있다: Protein Engineering, A Practical Approach, Rickwood, D., et al. (Eds.), IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng. (1995). 항체 및 항체 합텐 결합의 일반적인 원리는 하기에 나타나 있다: Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Nisonoff, A., Molecular Immunology, 2nd edition, Sinauer Associates, Sunderland, MA (1984); and Steward, M.W., Antibodies, Their Structure and Function, Chapman and Hall, New York, NY (1984). 추가로, 본 기술분야에 공지되어 있고 구체적인 기재되어 있지 않은 면역학에서의 표준 방법은 일반적으로 하기에 따른다: Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al. (Eds.), Immunochemical Protocols (Methods in Molecular Biology), 2nd edition, J. D. Pound (Ed.), Humana Press (1998), Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th edition, D. M. Weir (Ed.), Blackwell Publishers (1996), Methods in Cellular Immunology, 2nd edition, R. Fernandez-Botran, CRC Press (2001); Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) and Mishell and Shiigi (Eds.), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., New York (1980).
면역학의 일반적인 원리를 나타내는 표준 참조 작업은 하기를 포함한다: Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein, J.; Kuby Immunology, 4th edition, R. A. Goldsby, et al., H. Freeman & Co. (2000); Basic and Clinical Immunology, M. Peakman, et al., Churchill Livingstone (1997); Immunology, 6th edition, I. Roitt, et al., Mosby, London (2001); Cellular and Molecular Immunology, 5th edition; A.K. Abbas, A.H. Lichtman, Elsevier - Health Sciences Division (2005); Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques (4 Volume Set), 1st edition, I. Lefkovits, Academic Press (1997) Immunology, 5th edition, R.A. Goldsby, et al., W. H. Freeman (2002); Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, 3rd Edition, J.W. Goding, Academic Press (1996); Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Kennett, R., et al. (Eds.), Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York (1980); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology" in Burden, R., et al. (Eds.), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Elsevere, Amsterdam (1984).
본원에 인용된 모든 참조 문헌 뿐만 아니라, 상기 인용된 참조 문헌들 모두는 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1
DR6는 신경계에서 발현된다
성체 마우스 대뇌 피질 및 랫트 척수를 DR6 단백질의 발현에 대해 시험하였다. 조직 단면을 우선 1% 트리톤 X-100(Sigma)을 함유하는 PBS로 30분 동안 침투시킨 후 차단 용액(0.1% 트리톤 X-100 및 10% 정상 염소 혈청(NGS)을 함유하는 PBS) 속에서 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 주요 항체 표지를 위해, 단면을 토끼 항-DR6(Santa Cruz, sc-13106, 1:200) 및 마우스 항-신경세포성 제III 부류 β-투불린(Covance, MMS-435P, 1:500)을 함유하는 차단 배지 속에서 4℃로 밤새 항온처리하였다. PBS로 3회 세정한 후, 단면을 알렉사(Alexa) 594 항-토끼 항체(Invitrogen) (1:500)를 함유하는 5% NGS-PBS 속에서 실온으로 1시간 동안 항온처리하였다. 결과는, DR6 및 신경세포성 제III 부류 β-투불린의 공국재화를 나타내며, 이는, DR6가 신경세포 속에서 발현됨을 나타낸다(데이타는 나타내지 않음).
신경계에서 DR6의 역활을 이해하기 위하여, DR6 mRNA 발현 수준을 평가하여, 이것이 역 전사(RT-PCR) 후에 정량적인 실시간 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 랫트 뇌 조직을 통해 발전적으로 조절되었는지를 측정하였다. mRNA를 배아기 18일째(E18), 출생후 1일(P1), 7일(P7), 14일(P14), 및 21일(P21) 째 및 성체 시기로부터 취한 전체 뇌 및 척수 균질물로부터 추출하였다. 모든 mRNA를 절대적인 RNA 미니프렙 키트(Absolutely RNA miniprep kit)를 사용하여 제조업자의 지시(Stratagene)에 따라 추출하였다. 이후에, 정제된 RNA(High Capacity cDNA Archive Kit, Applied Biosystems)를 사용하여 DR6의 cDNA를 생성하였다. 정량적 실시간 PCR(Q-PCR), 및 태크만 유전자 발현 시스템(TaqMan Gene Expression system)(Mx3000P)을 위한 주형으로 제공된 cDNA를 사용하여 MGB 프로브를 가진 Mm00446361_m1 예비혼합된 프라이머 세트를 사용하여 DR6를 정량화하였다. 도 1a 및 1b에서 알 수 있는 바와 같이, DR6 발현 수준은 E18에서 낮고, 출생 후 7일 또는 14일째에 최고이며, 이후 성숙후 뇌 및 척수 둘다에서 보다 낮은 수준에 이른다. 발달 전사 프로파일은 항-DR6 항체를 사용하는 웨스턴 블롯을 기초로 하는 단백질 발현 프로파일과 일치하였다((도 1C). 인간 및 랫트 뇌 조직 단면의 면역조직화학적 염색은, DR6이 βIII-투불린 신경세포 마커와의 공국재화를 기초로 한 인간 및 랫트 신경세포 둘다에서 발현됨을 나타내었다(데이타는 나타내지 않음).
또한, 수개의 다른 세포 유형을 DR6 mRNA의 발현에 대해 시험하였다. mRNA를 P2 희소돌기아교세포 후대 세포(OPC), E18 피질 신경세포, P2 미세아교세포 및 P42 대뇌 피질 별아교세포의 정제된 배양물로부터 추출하였다. 모든 mRNA를 절대적인 RNA 미니프렙 키트를 사용하여 제조업자(Stratagene)의 지시에 따라 추출하였다. 이후에, 정제된 RNA(High Capacity cDNA Archive Kit, Applied Biosystems)를 사용하여 DR6 및 대조군으로서 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)의 cDNA를 생성시켰다. 도 1D는, DR6이 시험한 모든 4개의 세포 유형에서 발현됨을 나타낸다.
DR6의 발현은 희소돌기아교세포 계통에서 일시적으로 조절된다. 3회의 상이한 시도를 사용하여 희소돌기아교세포에서 DR6 발현을 시험하였다. 우선, 반-정량적 RT-PCR을 수행하여 희소돌기아교세포의 정제된 집단의 3개의 상이한 단계(A2B5, O4 및 MBP)로부터의 mRNA 수준을 측정하였다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, DR6 mRNA를 A2B5+, O4+ 및 MBP+ 희소돌기아교세포에서 발견된 mRNA 수준과 동일한 희소돌기아교세포 계통의 모든 단계를 통해 검출하였다. 둘째로, 웨스턴 블롯을 수행하여 희소돌기아교세포의 3개의 상이한 단계에서 DR6 단백질 수준을 측정하였다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, DR6 단백질은 희소돌기아교세포의 3개의 상이한 단계에서 검출가능하다. 흥미롭게도, 이는 조기 후대 A2B5보다 예비-수초화(O4+) 희소돌기아교세포 단계에서 5배 더 크고 성숙한 희소돌기아교세포(MBP 양성)보다 10배 더 크며, 이는 예비수초화(premyelinizating) 희소돌기아교세포가 우세한 DR6 발현 세포임을 나타낸다. 셋째로, 희소돌기아교세포에서 DR6 단백질의 존재는 면역조직화학을 사용하여 확인함으로써 A2B5+, O4+ 및 MBP+ 희소돌기아교세포가 항-DR6 항체로 표지되었음을 확인하였다(데이타는 나타내지 않음). 다시, O4 양성 세포는 MBP 양성 세포보다 훨씬 더 강력한 형광성 염색을 나타내며, 이는 성숙한 희소돌기아교세포보다 예비수초화 단계(O4 양성)에서 더 큰 DR6 발현을 제안한다. 경쟁적인 DR6-Fc를 첨가시킴으로써 항-DR6 항체의 예비-흡수는 시그날을 완전히 제거하였다.
실시예 2
DR6는 알츠하이머 병의 환자의 뇌에서 과발현된다.
알츠하이머병 환자의 뇌에서 DR6 mRNA의 수준을 또한 시험하였다. 정량적 실시간 PCR을 알츠하이머병을 가진 4명의 상이한 공여자로부터의 6개의 일시-동결된(snap-frozen) 뇌 조직을 사용하여 수행하였다. 이들 결과를 신경학적 질병이 없는 2명의 공여자로부터의 3개의 뇌 조직 블록을 사용하여 수득한 결과와 비교하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, DR6은 알츠하이머병 시료(4명의 개개의 공여자로부터의 2개의 전두엽, 1개의 측두엽, 1 대뇌기저핵 및 2개의 특정되지 않은 영역)에서 1.2- 내지 1.8-배 높게 발현된다(도 3). 상향조절된 DR6가 신경세포 특이적인지를 측정하기 위해, 면역조직화학 염색을 수행하였다. αβ 아밀로이드 플라크의 중심에서의 세포는 DR6 양성이다. 플라크 근처의 세포는 DR6 염색보다 상당히 더 밝으며, 이는 높은 수준의 DR6 발현을 제안한다. mRNA 추출, cDNA 생산 및 Q-PCR을 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다.
실시예 3
DR6는 축삭절단후 상향조절된다.
DR6 mRNA 및 단백질 수준에서 축삭절단의 효과를 또한 시험하였다. 당해 실험을 위해, 배아 DRG 신경세포를 앞서 기술한 바와 같이 제조하였다[참조: Mi et al., Nat. Neurosci. 8:745-51 (2005)]. 요약하면, DRG를 우선 2주령의 E16 스프라그 다울리 랫트(Sprague Dawley rat)(Charles River)로부터 해부하고 0.25% 트립신/EDTA(Invitrogen) 속에서 37℃로 30분 동안 항온처리하였다. 20% 태아 송아지 혈청(Invitrogen)을 함유하는 동일한 용적의 DMEM (Invitrogen)을 이후에 분해 화합물에 가하여 반응을 중지시켰다. 실온에서 5분 동안 1,000rpm에서 회전시킨 후 수집한 세포 펠렛을 큰 단편이 가시적이지 않을 때까지 플라스틱 피펫을 온화하게 통과시켜 기계적으로 해리시켰다. 약 1x105개의 DRG 신경세포를 100㎍/ml 폴리-D-라이신(Sigma)으로 피복한 4웰 챔버-슬라이드(LabTek)의 각각의 웰 중심에 스폿팅(spotting)하였다. 세포가 성장 배지[B27 보충물(Invitrogen) 및 100 ng/ml 신경 성장 인자(BD Biosciences)를 함유하는 신경기본(Neurobasal) 배지] 속에서 37℃에서 5% CO2와 함께 습윤화된 공기 속에서 부착하도록 하였다. 다음날 아침에, 배지를 신선한 성장 배지로 교체하고 세포를 20μM의 플루오로데옥시우리딘으로 3일 동안 처리하여 증식성 아교 세포를 제거하였다. 이후에, 배양물을 성장 배지 속에서 37℃로 5% CO2와 함께 습윤화된 공기 속에서 매 3 내지 4일마다 신선한 배지로 교환하면서 유지시켰다.
이들 배양된 축삭(axon)을 면도날로 잘라낸 후 손상된지 0, 24 및 48시간 후에, mRNA를 절대적 RNA 미니프렙 키트를 사용하여 제조업자의 지시(Stratagene)에 따라 추출하였다. 도 4에 나타낸 바와 같은 정량화는, DR6 mRNA 수준이 대조군인 손상되지 않은 축삭 배양물과 비교하여 축삭절단 24 및 48시간 후 둘다에서 높았음을 나타내었다.
mRNA 추출, cDNA 생산 및 Q-PCR은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다.
실시예 4
DR6는 척수 손상 후 병변 부위에서 운동 신경세포를 상향조절한다.
척수 손상 모델을 창조하기 위해, 랫트 척수의 등 이등분을 문헌[참조: Ji et al., Mol Cell Neurosci. 33: 311-20 (2006)]에 기술된 바와 같이 수행하였다. 척수 조직을 고정시키고 항-DR6 항체를 사용하여 염색하였다. 상당히 보다 높은 수준의 DR6 양성 운동 신경세포가 손상되지 않은 랫트보다 척수 손상이 있는 랫트에서 검출되었다.
실시예 5
DR6의 과발현은 신경세포 사망을 유도한다.
세포 배양
세포 배양물 속에서 성장시킨 대뇌 피질 신경세포를 DR6을 발현하는 렌티바이러스로 감염시키고 세포 사멸에 있어서의 효과를 시험하였다. 대뇌 피질 신경세포를 E18 스프라그 다울리 랫트(Charles River)로부터 제조하였다. 요약하면, E18 랫트 배아로부터의 대뇌 피질을 해부하여, 잘게 썰고 0.25% 트립신/EDTA (Invitrogen) 속에서 37℃에서 10분 동안 항온처리하였다. 세포를 60㎍/ml DNase I(Sigma) 및 10% 태아 송아지 혈청(Invitrogen)을 첨가한 후 연마하여 반응을 중지시켰다. 1,000 rpm에서 실온으로 5분 동안 회전시켜 수집한 세포 펠렛을 큰 단편이 가시적이지 않을 때까지 플라스틱 피펫을 통해 온화하게 통과시켜 기계적으로 해리시켰다. 조직 배양 플레이트(Costar)의 모든 표면을 100 ㎍/ml 폴리-D-라이신(Sigma)으로 피복한 후 세포 종균배양하였다. 상이한 실험 설정을 위한 플레이팅 밀도는 다음과 같다: 웨스턴 블롯의 경우 1x106/12개 웰 플레이트의 웰, 시간-경과 영상화의 경우 1x105 /24개 웰 플레이트의 웰 및, LDH 검정, 균질성 카스파제 검정 및 Q-PCR 분석의 경우 2x104 /96 웰 플레이트의 웰. 세포를 B27 보충물(Invitrogen)을 함유하는 신경기초 배지 속에서 37℃로 5% CO2와 함게 습윤화된 공기 속에서 매 3 내지 4일마다 신선한 배지로 교환하면서 유지시켰다.
단백질 발현 작제물
완전한 길이의 DR6(아미노산 1 내지 655번)를 암호화하는 DNA를 HRST-IRESeGFP 렌티바이러스 벡터의 Not I 부위내로 삽입하였다. 렌티바이러스내 완전한 길이의 인간 DR6의 서열을 수득하며 이는 서열 번호: 154의 서열이다. 서열 번호: 154의 뉴클레오타이드 124 내지 153번은 단백질 발현을 점검하는데 사용되는 Myc 태그를 암호화한다. 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호: 155의 서열의 완전한 길이의 Myc-태그된 인간 DR6 폴리펩타이드를 암호화한다. 서열 번호: 155의 아미노산 42 내지 51번은 Myc 태그이다.
우세한 음성 DR6을 암호화하는 DNA(아미노산 1 내지 370번)을 HRST-IRESeGFP 렌티바이러스 벡터의 Not I 부위내로 삽입하였다. 렌티바이러스내 우세한 음성 DR6의 서열은 서열 번호: 156로 제공된다. 서열 번호: 156의 뉴클레오타이드 124 내지 153번은 단백질 발현을 점검하는데 사용된 Myc 태그를 암호화한다. 우세한 음성 인간 DR6 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 서열은 서열 번호: 157로 제공된다. 서열 번호: 157의 아미노산 42 내지 51번은 Myc 태그이다.
감염
수득되는 플라스미드 및 GFP 대조군 플라스미드를 293 세포내로 형질감염시켜 앞서 기술한 바와 같이 렌티바이러스를 생산하고[참조: Rubinson et al. Nat. Genet. 33:401-6 (2003)], 피질 신경세포를 렌티바이러스로 1의 다중 감염도(mutiplicity of infection: MOI)에서 감염시켰다. FL-DR6의 자궁외 발현은 92시간 후 대조군 감염시킨 세포와 비교한 세포 형태학 및 세포 수(도 5a)에 의해 가시화되는 바와 같이 피질 신경세포 세포자멸사를 유도하였다.
DR6 유도된 세포 사망은 모든 살아있는 세포의 미토콘드리아 활성을 모니터하는 평행 배양물에서 XTT 검정으로 추가로 입증하였다. XTT 검정은 미토콘드리아 활성을 측정함으로써 세포 수를 측정하기 위한 비색 방법이다. FL-DR6 감염된 피질 신경세포는 XTT 판독에서 2배 감소를 나타내었으며, 이는 DR6 과발현 유도된 신경세포 사망에 의해 유발된 세포 수에 있어서의 상당한 감소를 반영한다(도 5B). 사망 도메인(DD)이 세포 사망에 필요한지를 측정하기 위해, DD를 함유하지 않는 우세한 음성 DR6 렌티바이러스(DN-DR6)를 감염에 의해 피질 신경세포내로 도입하였다. 도 5B에 나타낸 바와 같이, DN-DR6은 배양된 신경세포에서 세포자멸사를 유도하는데 실패하였으며, 이는, DR6 사망 도메인이 이의 신경세포 사망 유도에 필수적임을 제안한다.
세포자멸사의 주요 매개인자인 카스파제-3에 대한 DR6의 효과를 또한 분석하였다. 피질 신경세포를 위에서 기술한 바와 같이 형질감염시키고, 세포 분해물을 감염시킨지 48시간 후에 수집하였다. 형광계 균질성 카스파제 검정 키트(fluorometric homogenous caspase assay kit)(Roche, 03005372001)를 사용하여 카스파제-3 활성을 측정하였다. 세포를 감염 후 48시간 째에 검정하였다. 도 5C에 나타낸 바와 같이, 유리된 로다민 수준은 감염되지 않은 세포, GFP 대조군 렌티바이러스로 감염시킨 세포 또는 우세한 음성 DR6 렌티바이러스로 감염시킨 세포와 비교하여 완전한 길이의 DR6 렌티바이러스로 감염시킨 후 2배 증가하였다. 이는, 우세한 음성 DR6가 아닌, DR6가 카스파제-3의 활성을 증가시킴을 나타낸다.
이들 결과는 웨스턴 블롯으로 확인되었다. 세포 분해물을 PAGE에 적용시키고 분리된 단백질을 항-DR6 항체(Santa Cruz)로 프로빙하였다. 도 5D에 나타낸 바와 같이, 활성 카스파제-3 수준은 우세한 음성 DR6 렌티바이러스 또는 GFP 대조군 렌티바이러스로 감염시킨 세포보다 완전한 길이의 DR6 렌티바이러스로 감염된 세포에서 더 높았다. 대조적으로, 대조군 단백질(βIII-투불린)의 수준은 3개의 감염 모두에서 유사하였다. 각각의 감염의 효능을 각각의 감염에서 렌티바이러스 벡터에 의해 생산된 GFP의 유사한 수준으로 입증된 것으로서 비교가능하였다(참조: 도 5D).
이들 결과 각각은, DR6가 피질 신경세포내에서 세포 사망을 유도할 수 있음을 제안한다.
실시예 6
DR6-FL 과발현은 OPC의 사망을 유도한다.
희소돌기아교세포 전구체 세포(OPC)의 생존능에 대한 DR6의 효과를 또한 실험하였다. 당해 실험에서, 풍부한 희소돌기아교세포의 배양물을 앞서 기술한 바와 같이 제조하였다[참조: Mi et al., Nat. Neurosci. 8:745-51 (2005)]. 요약하면, P2 스프라그 다울리 랫트(Charles River)의 전뇌를 해부하고, 잘게 썰어 0.01% 트립신(Sigma) 및 10 ㎍/ml DNase(Sigma) 속에서 37℃로 15분 동안 항온처리하였다. 해부된 세포를 100 ㎍/ml 폴리-D-라이신 T75 조직 배양 플라스크 속에 플레이팅하고 37℃에서 10일 동안 20% 태아 송아지 혈청(Invitrogen)을 함유하는 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM) 속에서 성장시켰다. 풍부한 희소돌기아교세포 후대세포를 수득하기 위해, 플라스크를 200 rpm에서 37℃로 밤새 진탕하여 95% 순도의 집단을 생성시켰다. 이후에, 희소돌기아교세포 후대 세포를 2x104/96웰 플레이트의 웰로 플레이팅하고 10 ng/ml 혈소판-기원한 성장 인자(PDGFAA) 및 10 ng/ml 섬유모세포 성장 인자(FGF)를 함유하는 DMEM (Invitrogen) 속에 37℃로 5% CO2와 함께 습윤화된 공기 속에 유지시켰다.
이후에, OPC를 실시예 5에 기술된 바와 같은 GFP, 완전한 길이의 DR6 및 우세한 음성 DR6 렌티바이러스로 형질감염시키고, 형질감염 48시간 후에, 사망 세포(dying cell)의 수를 평가하였다. 처리되지 않은 세포 및 2% 트리톤 X-100으로 처리한 세포를 또한 각각 음성 및 양성 대조군으로서 실험하였다. 우선, 세포를 상 대조 현미경을 사용하여 가시화하고, 세포의 총 수 및 또한 사명 세포의 수를 계수하였다. 사망 세포의 퍼센트를 도 6a에 그래프적으로 나타낸다. 완전한 길이의 DR6 렌티바이러스에 의한 감염은 우세한 음성 DR6 렌티바이러스 또는 GFP 렌티바이러스로 감염된 세포와 비교하여 사망 세포의 퍼센트에 있어서 상당한 증가를 초래하였다.
OPC의 생존능에 대한 DR6의 효과를 또한 XTT 및 LDH 검정을 사용하여 평가하였다. XTT 검정은 실시예 5에 기술된 바와 같이 수행하였다. 세포를 양성 대조군으로서, 로테논, NADH 억제제로 처리하였다. 도 6B에 나타낸 바와 같이, 우세한 음성 DR6 렌티바이러스 또는 GFP 렌티바이러스로 감염시킨 세포는 유사한 수준의 세포 생존능을 나타내었다. 대조적으로, 로테논으로 처리하거나 완전한 길이의 DR6 렌티바이러스로 감염시킨 세포는 세포 생존능의 상당히 더 낮은 수준을 나타내었다.
유사한 결과가 LDH 검정을 사용하여 수득되었다. LDH는 세포 분해시 방출되는 효소이므로, LDH 활성에 대한 비색 검정을 사용하여 세포 손상을 측정할 수 있다. LDH 검정은 세포독성 검출 키트(LDH, Roche, 11644793001)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 수행하였다. 결과는 도 6C에 그래프적으로 나타내었으며 완전한 길이의 DR6 렌티바이러스를 사용한 OPC의 감염이 우세한 음성 DR6 렌티바이러스 또는 GFP 렌티바이러스를 사용한 감염과 비교하여 상당히 더 높은 세포독성을 초래함을 나타낸다.
이들 실험 각각은, 완전한 길이의 DR6가 피질 신경세포 외에도, OPC에서 세포 사망을 유도할 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 7
DR6 시그날링 경로의 차단은 희소돌기아교세포 생존 및 분화를 촉진한다.
희소돌기아교세포 생존은 이들의 말단 분화에 중요하므로, 희소돌기아교세포 생존, 분화 및 수초화를 촉진시키는 DR6 길항제의 능력을 평가하였다. 상기 목적에 맞춰, DR6-DN(사망 도메인의 결실)을 사용하여 희소돌기아교세포에서 DR6 기능을 차단하였다. 도 7a에 나타낸 바와 같이, DR6 DN으로 감염된 세포는 마우스 항-MBP 항체(SMI 94 및 SMI 99, 1:4000, Convance), 마우스 항-MOG 항체(1:500) 및 토끼 항-베타 액틴 항체(1:2000, Sigma)를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정한 5배 더 높은 수준의 MBP+ 세포 및 보다 높은 MBP 및 MOG 단백질을 나타내었다(도 7a). 렌티바이러스에 의한 세포 감염은 GFP 단백질 공발현 마커의 웨스턴 블롯 검출로 확인하였다(도 7a). 또한, CNPase 검정(도 7B)을 수행하여 미성숙 및 성숙 희소돌기아교세포 둘다에 대한 마커인, CNPase의 수준을 ELISA 포맷으로 측정하였다. 도 7B에 나타낸 바와 같이, DR6 FL 감염된 희소돌기아교세포의 배양물은 대조군과 비교하여 감소된 CNPase 활성을 나타내었다. 대조적으로, DR6 DN을 사용한 DR6 시그날링 경로의 차단은 CNPase 활성을 증가시켰다(도 7B). 이들 데이타는, 내인성 DR6가 희소돌기아교세포 생존 및 분화를 음성적으로 조절한다는 사항을 뒷받침한다.
실시예 8
DR6 유도된 신경세포 사망은 DR6-Fc에 의해 역전된다.
피질 신경세포를 실시예 5에 기술된 바와 같이 완전한 길이의 DR6 렌티바이러스로 감염시켰다. 그러나, 이들 세포는 증가하는 양의 재조합체 가용성 DR6로 보충된 배지 속에서 항온처리하였다. 재조합체 가용성 DR6는 DR6의 아미노산 1 내지 349번을 Fc 서열에 융합시켜 생산하였다. 서열 번호: 158의 뉴클레오타이드 서열을 당해 실험에 사용하였다. 서열 번호: 158의 뉴클레오타이드 1 내지 1047번은 DR6 아미노산을 암호화하고, 서열 번호: 158의 뉴클레오타이드 1051 내지 1731번은 Fc 아미노산을 암호화한다. 서열 번호: 158의 뉴클레오타이드 1048 내지 1050은 암호화 과정으로 인해 삽입되었다.
가용성 DR6 폴리펩타이드의 서열은 서열 번호: 159로 제공된다. 서열 번호: 159의 아미노산 1 내지 349번은 DR6 아미노산이다. 서열 번호: 159의 아미노산 351 내지 576번은 Fc 아미노산이고, 아미노산 350번은 클로닝 과정으로 인하여 삽입된 아미노산이다.
가용성 DR6 암호화 서열을 렌티 바이러스 벡터내로 삽입한 후 293 세포로부터 재조합체 가용성 DR6을 생산하고 정제하는데 사용하였다. FL-DR6을 발현하는 신경세포상에서 DR6-Fc의 생존 효과를 직접 모니터하기 위해, 시간-경과 영상을 수득하였다. DR6-Fc의 존재하에서, FL-DR6은 피질 신경세포 사망을 유도하는데 실패하였다(도 8a 및 8b).
DRG 신경세포상에서 가용성 DR6의 효과를 또한 실험하였다. DRG 신경세포를 우선 성체 스플라그 다울리 랫트(Charles River)로부터 해부하고 0.25% 트립신/EDTA(Invitrogen) 속에서 37℃로 30분 동안 항온처리하였다. 이후에, 20% 태아 송아지 혈청(Invitrogen)을 함유하는 DMEM(Invitrogen)의 동일 용적을 분해 혼합물에 가하여 반응을 중지시켰다. 세포 펠렛을 1,000 rpm에서 실온으로 5분 동안 회전시킨 후 수집하고 큰 단편이 가시화되지 않을 때까지 플라스틱 피펫을 통해 온화하게 통과시켜 기계적으로 해리시켰다. 약 1x105 DRG 신경세포를 100 ㎍/ml 폴리-D-라이신(Sigma)이 피복된 4 웰 챔버-슬라이드(LabTek)의 각각의 웰의 중심에 스폿팅하였다. 세포를 성장 배지[B27 보충물(Invitrogen) 및 100 ng/ml 신경 성장 인자(BD Biosciences)를 함유하는 신경기본 배지] 속에서 37℃로 5% CO2와 습윤화된 공기 속에서 부착되도록 하였다. 다음날 아침, 신선한 성장 배지로 교체하고, 세포를 20μM의 플루오로데옥시우리딘으로 3일 동안 처리하여 증식하는 아교 세포를 제거하였다. 이후에, 배양물을 성장 배지 속에서 37℃에서 5% CO2와의 습윤화된 공기 속에서 매 3 내지 4일마다 신선한 배지로 교환하면서 유지시켰다. 배양한 지 7일 후, DRG를 대조군 Fc 또는 가용성 DR6-Fc로 3일 동안 처리하였다. DRG를 4% 파라포름알데하이드로 고정시킨 후 마우스 항-신경세포 제III 부류 β-투불린(Covance, MMS-435P, 1:500)으로 염색하였다. 가용성 DR6-Fc는 신경세포 생성 과정의 총 수를 증가시켰다. 또한, 크고 복잡한 과정을 사용한 신경세포의 수는 가용성 DR6-Fc로 처리하는 경우 증가하였다(도 9a 및 9b).
또 다른 실험에서, 피질 신경세포를 0, 1, 3, 10 또는 30 ㎍/ml 가용성 DR6 단백질을 함유하는 배지 속에서 배양하였다. 48시간 후, 세포 분해물을 수집하고, 활성화된 카스파제-3 단백질의 수준을 토끼 항-분해된 카스파제-3 항체(91:1000; 세포 시그날링)로 측정하였다. 도 10a에 나타낸 바와 같이, 활성화된 카스파제-3은 감염되지 않은 세포에서 검출되지 않았으나, 완전한 길이의 DR6 렌티바이러스로 감염된 세포는 높은 수준의 활성화된 카스파제-3를 나타내었다. 그러나, 활성화된 카스파제-3의 수준은, 감염된 세포를 가용성 DR6을 함유하는 배지 속에서 항온처리하는 경우 감소하였다(도 10a 및 10b). 세포 분해물을 또한 항-GFP 및 항-β-액틴 항체로 프로빙하여 세포 분해물의 감염 효능 및 양 및 품질을 각각 조절하였다. 상기 데이타는, DR6 발현의 차단이 신경세포 생존 및 축삭 통합성을 촉진한다는 생각을 지지한다.
실시예 9
알츠하이머병의 동물 모델에서 세포 사망에 대한 DR6-Fc의 효과
생체내 DR6-Fc의 효과를 알츠하이머병의 마우스 모델, 예를 들면, 잭슨 래보러토리즈(Jackson laboratories)(Bar Harbor, ME)(Stock #04462)로부터의 APPswe/PS-1△E9 마우스[참조: Park et al ., J. Neurosci 26:1386-1395 (2006)]를 사용하여 연구하였다.
마우스를 몇개의 처리 그룹으로 나눈다. 제1 그룹은 정상 대조군으로서 제공한다. 각각의 추가의 그룹은 DR6-Fc로, 예를 들면, 뇌내 주사 또는 전신계적 투여로 처리한다. 투여된 양은 각각의 처리 그룹에 대해 변한다. 예를 들면, 그룹에 1일당 1, 10, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400 또는 500 ㎍/kg을 제공할 수 있다. 투여는 1회 투여일 수 있거나 명시된 기간동안 반복적으로 행해질 수 있다. 투여는 알츠하이머 증상이 발병하지 전에 수행함으로써 증상 발달의 지연 또는 결여가 성공적인 예방 및/또는 치료의 지표가 되도록 할 수 있다. 달리는, 투여를 증상의 발병 후(즉, 7개월령)에 시작함으로써 증상에 있어서의 증가의 감소 또는 결여가 성공적인 치료의 지표가 되도록 할 수 있다.
치료 효능은 살아있는 마우스에서, 예를 들면, 물 마우스 속에서 처리된 마우스 및 처리되지 않은 마우스를 비교함으로써 증상적으로 평가할 수 있다. 효능은 또한 희생시킨 마우스로부터의 뇌 조직과 같은 조직의 분자적, 생화학적 및 조직학적 분석으로 평가할 수 있다. 예를 들면, 뇌의 소정의 크기 및 영역내 세포자멸사 세포, 예를 들면, 피질 신경세포의 수를 처리된 마우스와 처리되지않은 마우스에서 비교할 수 있다. 세포자멸사 세포의 수는 예를 들면, TUNEL(TdT-매개된 dUTP Nick-End 표지화) 검정 또는 항-PARP(폴리(ADP-리보스)폴리머라제) 염색을 포함하는 당해 분야에 공지된 특정의 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 또한, 뇌의 소정의 크기 및 영역내에서 생존하는 피질 신경세포의 총 수를 처리된 마우스와 처리되지 않은 마우스에서 비교할 수 있다.
실시예 10
ALS의 동물 모델에서 세포 사망에 대한 DR6-Fc의 효과
생체내 DR6-Fc의 효과를 근육위축가쪽경화증(ALS)의 동물 모델, 예를 들면, 돌연변이체 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD1)를 발현하는 마우스, 랫트, 파리 또는 벌레를 사용하여 연구할 수 있다.
예를 들면, 돌연변이체 SOD1(G37R)을 발현하는 마우스를 DR6-Fc로 비경구 투여, 피하 투여 등과 같은 특정의 투여 유형으로 처리한다. 투여량 및 시간은 변할 수 있다. 투여는 ALS 증상의 발병 전(즉, 7 내지 9개월령)에 수행함으로써 증상의 발달의 지연 또는 결여가 성공적인 예방 및/또는 치료의 지표가 되도록 할 수 있다. 또한, 투여를 증상의 발병 후에 시작함으로써, 증상에 있어서의 증가의 감소 또는 결여가 성공적인 치료의 지표가 되도록 할 수 있다.
치료 효능은 예를 들면, 처리된 마우스와 처리되지 않은 마우스의 근육 강도 또는 수명을 비교함으로써 전신계적으로 평가할 수 있다. 효능은 또한 희생시킨 마우스로부터의 운동 신경세포의 단면과 같은, 조직의 분자적, 생화학적 및 조직학적 분석으로 평가할 수 있다. 예를 들면, 척수를 따라 소정의 위치로부터 세포자멸사 세포, 예를 들면, 운동 신경세포의 수를 처리된 마우스와 처리되지 않은 마우스에서 비교할 수 있다. 세포자멸사 세포의 수는 예를 들면, TUNEL(TdT-매개된 dUTP Nick-End 표지화) 검정 또는 항-PARP(폴리(ADP-리보스)폴리머라제) 염색을 포함하는, 당해 분야에서 특정의 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 또한, 척수의 소정의 크기 및 영역내 생존하는 운동 신경세포의 총 수를 처리된 마우스와 처리되지 않은 마우스에서 비교할 수 있다.
실시예 11
DR6 RNAi는 신경세포 생존을 촉진한다
신생피질 신경세포를 배아 18 랫트로부터 제거하고, 및 3백만개 세포를 200 nM DR6 siRNA 또는 스크램블 대조군(scramble control) siRNA로 랫트 신경세포 뉴클레오펙터(Nucleofector) 키트(Amaxa Inc.)를 사용하여 형질감염시켰다. DR6 siRNA는 업자(Dharmacon)로부터 수득한 4개 siRNA의 혼합물이었다. 4개의 siRNA의 서열은: AGAAACGGCUCCUUUAUUA(서열 번호: 160), GGAAGGACAUCUAUCAGUU(서열 번호: 161), GGCCGAUGAUUGAGAGAUU(서열 번호: 162), GCAGUUGGAAACAGACAAA(서열 번호: 163)이었다. 대조군 siRNA의 서열은: GGUGACAUGAUCGACAGCCAU(서열 번호: 164)이었다.
형질감염된 세포를 하나의 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 6일 동안 배양하였다. 7일째에, 배양물 배지(100 μl)의 1/2을 제거하고 상이한 농도의 글루타메이트, Aβ42 또는 TNFα를 함유하는 100μl의 신선한 신경기본 배지로 교체하였다. 3개의 배양물을 각각의 처리 조건에 대해 설정하였다. 배양물을 24시간 동안 처리하였다. 100μl의 상층액을 각각의 웰로부터 제거하고, LDH 검정을 세포독성 키트(LDH 세포독성 검출 키트, Clontech Laboratories, Inc.)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 수행하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, RNAi를 사용한 DR6의 녹다운은 신생피질 신경세포 생존을 촉진한다. 또한, DR6 발현의 감소는 Aβ42, 글루타메이트, 및 TNFα 유도된 신경세포 세포독성을 약화시킨다. 상기 데이타는 또한, RNAi를 사용한 DR6 발현의 차단이 신경세포 생존을 촉진하고 신경세포 사망을 방지함을 제안한다.
실시예 12
siRNA에 의한 DR6 시그날링 경로의 차단은 희소돌기아교세포 분화를 촉진한다.
희소돌기아교세포 생존, 분화 및 수초화에 있어서 DR6 RNAi에 의한 DR6 길항작용의 효과를 또한 평가하였다. 이들 실험에서, A2B5 세포를 DR6 RNAi 또는 대조군 RNAi로 형질감염시켰다. 세포를 수거하고 분해물의 1/2을 RT-PCR에 대해 사용하고 15% 아가로즈 겔로 분석하였다. 세포 분해물의 나머지를 MBP 및 MOG 웨스턴에 사용하였다. 도 12a 내지 12b에 나타낸 바와 같이, DR6 RNAi에 노출시킨 세포는 MBP+ 세포의 2배 더 높은 수준을 나타내었고, 보다 높은 MBP 및 MOG 단백질 수준이 웨스턴 블롯 분석으로 입증되었다(도 12b). 렌티바이러스에 의한 세포 감염은 GFP 단백질 공-발현 마커의 웨스턴 블롯 검출로 확인하였다. 이들 데이타는, 내인성 DR6이 희소돌기아교세포 생존 및 분화를 음성적으로 조절한다는 사항을 추가로 뒷받침한다.
실시예 13
파아지-디스플레이 유도된 Fab 항체의 생성
재조합체 인간 DR6 엑토도메인을 사용하여 3.5 x 1010의 유일한 클론[Nat Biotechnol. 2005 Mar;23(3):344-8]을 함유하는 인간 미가공 파아지미드 Fab 라이브러리를 스크리닝하는데 사용하였다. 바이오티닐화된 AP-DR6 단백질을 스트렙타비딘-피복된 자기 비드 상에서 포획한 후 파아지 라이브러리와 함께 항온처리하였다. 선택을 AP-p75에 있어서 고갈과 함께 앞에서 기술한 바와 같이 수행하여 AP 특이적인 결합제를 제거하였다[참조: Nat Biotechnol. 2005 Mar;23(3):344-8]. 3라운드의 패닝 후, 479 bp 유전자 III 절단단(stump)을 MluI 분해로 제거하고, 벡터를 TG1 세포내에서 가용성 Fab 발현을 위해 재연결하였다. 2496 클론의 ELISA 분석으로 49개의 유일한 서열을 함유하는 212개 양성 클론을 수득하였다. 유일한 클론을 정제하고 결합을 단일 농도에서 재조합체 인간 DR6 엑토도메인에 대해 ELISA로 및 또한 완전한 길이의 인간 DR6로 일시 형질감염시킨 293E 세포상에서 FACS로 재확인하였다. 24개의 유일한 클론을 당해 분석으로부터 추가의 특성화를 위해 선택하였다. 24개 Fab를 다중 농도에서 ELISA로 인간 DR6-Fc 상에서 시험하여 AP-DR6 융합 단백질에 대한 DR6 엑토도메인의 특이성을 확인하고, FACS로 완전한 길이의 인간 DR6-293E 세포, 완전한 길이의 랫트 DR6-293E 세포, 및 형질감염되지 않은 293E 세포상에서 시험하여 종 특이적인 교차-반응을 점검하였다. 특이성 및 교차-반응성 데이타를 기초로 하여, 10개의 Fab를 선택하였다.
실시예 14
쥐 항-인간 DR6 모노클로날 항체 가변 도메인의 클로닝
쥐 하이브리도마 세포로부터의 총 세포 RNA를 퀴아겐(Qiagen) RNeasy 미니 키트를 사용하여 제조업자의 추천된 프로토콜에 따라 제조하였다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 cDNA를 RT-PCR에 의해 총 세포성 RNA로부터, 제1 쇄 cDNA의 프라이밍을 위한 무작위적인 육합체(hexamer)를 사용하여 클로닝하였다. 완전한 시그날 서열을 가진 쥐 면역글로불란 가변 도메인의 PCR 증폭을 위해, 다중 쥐 면역글로불린 유전자 계열 시그날 서열에 하이브리드화하는 변형의 전방 프라이머 및 쥐 고정 도메인의 5' 말단에 대해 특이적인 단일의 역 프라이머의 콕테일을 사용하였다. PCR 생성물을 겔-정제하고 제조업자(Invitrogen)의 pCR2.1TOPO 벡터내로 이들의 TOPO 클로닝 키트를 사용하여 제조업자의 추천된 프로토콜에 따라 아클로닝(subcloning)하였다. 다중의 독립된 아클론으로부터의 삽입체를 서열분석하여 컨센서스 서열을 확립하였다. 유추된 성숙한 면역글로불린 N-말단은 하이브리도마로부터의 정제된 면역글로불린의 에드만 분해(Edman degradation)로 측정한 것과 동일하였다. 특수 소그룹에 대한 지정은 카바트 데이타베이스로부터의 컨센서스 면역글로불린 가변 도메인 서열을 사용한 BLAST 분석을 기초로 한다. CDR을 카바트 정의를 사용하여 지정한다.
서열 번호: 107로 아래에 나타낸 것은, CDR(카바트 정의)이 밑줄쳐진 1P1D6.3 성숙한 중쇄 가변 도메인 단백질 서열이다:
1 QVQLQQSGTE LARPGASVKL SCKASGYTFT DYYLNWMKQG TGQGLEWIGE
51 IYPGGDHTYY NEKFKGKATL TADKSSNTAF MQLSSLTSED SAVYFCTRGV
101 IKWGQGTLVT VSL
상기한 것은 쥐 소그룹 II(A) 중쇄이다. 1P1D6.3 중쇄 가변 도메인(pYL466으로부터)의 DNA 서열은 서열 번호: 106으로 제공된다.
서열 번호: 112로 아래에 나타낸 것은, CDR이 밑줄쳐진 1P1D6.3 성숙한 경쇄 가변 도메인 단백질 서열이다:
1 DILMTQSPPS MSVSLGDTVS ITCHASQGIS SNIGWLQQKP GKSFKGLIYH
51 GSTLEDGVPS RFSGSGSGAE FSLTISSLES EDFADYYCVQ YAQFPYTFGG
101 GTKLEIK
상기한 것은 쥐 소그룹 V 카파 경쇄이다. 성숙한 경쇄 가변 도메인(pYL469로부터)의 DNA 서열은 서열 번호: 111로 제공된다.
서열 번호: 117로 아래에 나타낸 것은 하기 CDR이 밑줄쳐진, 성숙한 1P2F2.1 중쇄 가변 도메인 단백질 서열이다:
1 QVQLQQSGPE VARPGASVKL SCKASGYTFT DYYLNWVKQR TGQGLEWIGE
51 IYPGNNHTYY NEKFKGKATL TADNSSSTAY LQFSSLTSED SAVYFCTRGV
101 IKWGQGTLVT VSV
상기한 것은 쥐 소그룹 II(A) 중쇄이다. CDR2내 강력한 N-연결된 글리코실화 부위는 상기한 바와 같이 이중으로 밑줄쳐서 나타낸다. 1P2F2.1 중쇄 가변 도메인(pYL467로부터)의 DNA 서열은 서열 번호: 116으로서 제공된다.
1P1D6.3 및 1P2F2.1의 중쇄는 단백질 수준에서 89.4% 동질성과, 동일한 CDR1 및 CDR3 서열을 공유하면서 관련되어 있다. IgBLAST 분석은, 이것이 동일한 재조합 현상으로부터 기원하였음을 제안한다. 하기 나타낸 것은 1P1D6.3(상부) 및 1P2F2.1(하부)의 중쇄의 정렬이다:
1 QVQLQQSGTELARPGASVKLSCKASGYTFTDYYLNWMKQGTGQGLEWIGE 50
|||||||| |.|||||||||||||||||||||||||.|| ||||||||||
1 QVQLQQSGPEVARPGASVKLSCKASGYTFTDYYLNWVKQRTGQGLEWIGE 50
. . . . .
51 IYPGGDHTYYNEKFKGKATLTADKSSNTAFMQLSSLTSEDSAVYFCTRGV 100
|||| .||||||||||||||||| ||.||::| |||||||||||||||||
51 IYPGNNHTYYNEKFKGKATLTADNSSSTAYLQFSSLTSEDSAVYFCTRGV 100
.
101 IKWGQGTLVTVSL 113 (서열 번호: 107)
||||||||||||.
101 IKWGQGTLVTVSV 113 (서열 번호: 117)
서열 번호: 122로 아래에 나타낸 것은, CDR이 밑줄쳐진 1P2F2.1 성숙한 경쇄 가변 도메인 단백질 서열이다:
1 DILMTQSPSS MSVSLGDTVS ITCHASQGIR NSIGWLQQKP GKSFKGLIYH
51 ATTLEDGVPS RFTGSGSGAD FSLTISSLES EDFADYYCVQ YAQFPYTFGG
101 GTKLEIK
상기한 것은 쥐 소그룹 V 카파 경쇄이다. 성숙한 경쇄 가변 도메인(pYL470로부터)의 DNA 서열은 서열 번호: 121로 제공된다.
1P1D6.3 및 1P2F2.1의 경쇄는 단백질 수준에서 92.5%와, 동일한 CDR3 서열을 공유하며 관련되어 있다. IgBLAST 분석은, 이것이 동일한 재조합 현상으로부터 기원하였음을 제안한다. 하기 나타낸 것은 1P1D6.3(상부) 및 1P2F2.1(하부)의 경쇄의 정렬이다:
1 DILMTQSPPSMSVSLGDTVSITCHASQGISSNIGWLQQKPGKSFKGLIYH 50
|||||||| |||||||||||||||||||| .||||||||||||||||||
1 DILMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHASQGIRNSIGWLQQKPGKSFKGLIYH 50
. . . . .
51 GSTLEDGVPSRFSGSGSGAEFSLTISSLESEDFADYYCVQYAQFPYTFGG 100
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51 ATTLEDGVPSRFTGSGSGADFSLTISSLESEDFADYYCVQYAQFPYTFGG 100
101 GTKLEIK 107 (서열 번호: 112)
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101 GTKLEIK 107 (서열 번호: 122)
서열 번호: 127로 아래에 나타낸 것은, CDR이 밑줄쳐져 있는 성숙한 1P5D10.2 중쇄 가변 도메인 단백질 서열이다:
1 EVQLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS DYYMYWVRQT PEKRLEWVAT
51 ISDGGLYTYY QDSVKGRFTI SRDNAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCARED
101 DYDGDFYTMD YWGQGTSVTV SS
상기한 것은 쥐 소그룹 III(D) 중쇄이다. 1P5D10.2 중쇄 가변 도메인(pYL468로부터)의 DNA 서열은 서열 번호: 126으로 제공된다.
서열 번호: 132로 아래에 나타낸 것은, CDR이 밑줄쳐져 있는 1P5D10.2 성숙한 경쇄 가변 도메인 단백질 서열이다:
1 QIVLTQSPAI MSASPGEKVT ITCSASSSVS YMHWFQQKPG TSPKLWIYST
51 SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQR SSYPLTFGAG
101 TKLELK
상기한 것은 쥐 소그룹 VI 카파 경쇄이다. 성숙한 1P5D10.2 경쇄 가변 도메인(pYL471로부터)의 DNA 서열은 서열 번호: 131로 제공된다.
실시예 15
항-DR6 항체는 랫트, 마우스 및 인간 DR6에 결합한다.
6백만개의 HEK293 세포를 완전한 길이의 인간, 랫트, 또는 마우스 DR6을 암호화하는 10㎍의 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후, 200μL의 PBS, 1% BSA, 0.1% NaN3 (FACS 완충액)중 약 50,000개 세포를 분석하였다. 세포를 펠렛화하고 FACS 완충액 중 항-DR6 항체의 150μL의 일련 희석물 속에 재현탁시켰다. 시료를 1시간 동안 얼음 위에서 때때로 진탕하면서 항온처리한 후 3회 세척하였다. 결합된 DR6 항체를 PE-표지된 염소 F(ab)2 항-인간 Fab(Dyax Fab의 경우) 또는 항-마우스 IgG 특이적인 항체(모노클로날 항체의 경우)(Jackson Labs)로 가시화하였다. 도 13에 나타낸 결과는, 5D10 및 1E6 항체 각각이 인간, 랫트, 및 마우스 DR6에 결합함을 입증한다. 5D10 및 M53E04를 사용한 결합 검정의 결과는 도 30에 나타낸다.
실시예 16
항-DR6 항체에 의한 DR6의 차단은 희소돌기아교세포 분화를 촉진하고 세포자멸사를 억제한다.
희소돌기아교세포 생존에 있어서 DR6 기능의 역활을 추가로 입증하기 위해, 항-DR6 항체를 사용하여 희소돌기아교세포 배양물 속에서 DR6 작용을 차단하였다. 도 14a 및 14b에 나타낸 바와 같이, 항-DR6 항체 처리는 카스파제 3+ 세포를 약 3배 감소시키고(도 14a) 및 MBP+ 세포를 10배 증가시켰다(도 14b). 이들 결과는, 웨스턴 블롯 분석에 의해 입증되었으며(도 14c), 여기서, 항-DR6 항체는 카스파제 3 생산을 약 3배 감소시켰다. 대조적으로, MBP 단백질 생산의 10배 증가는 항-DR6 항체로 처리한 세포 배양물에서 관측되었다(도 14c). DR6 항체 M53E04 및 5D10을 사용한 희소돌기아교세포-DRG 공-배양 검정의 결과는 도 31에 나타내며 양성 대조군으로서 항-LINGO-1 항체 Li81를 사용하여 수득한 결과와 비교한다.
실시예 17
항-DR6 항체에 의한 DR6의 차단은 공-배양물내 희소돌기아교세포/DRG 수초화를 촉진한다
DR6의 차단이 수초화를 촉진한다는 가설을 시험하기 위하여, 랫트 주요 희소돌기아교세포 및 DRG 신경세포의 공-배양물을 사용하여 수초화에 있어서 항-DR6 항체의 효과를 추정하였다. 이러한 공-배양물은 항-DR6 항체의 첨가에 의해 크게 향상된 수초화의 낮은 기본 수준을 일반적으로 나타낸다. 공배양물을 렌티바이러스로 세포당 2의 다중감염도(2 MOI)로 감염시켰다. 항-DR6 항체를 10일 동안 처리하여 MBP+ 수초화된 축삭의 존재에 의해 입증되는 바와 같이 풍부한 축삭 수초화, 즉 대조군 Ig 처리된 세포 배양물 보다 10배 더 높은 축삭 수초화를 초래하였다. 마우스 항-MBP 항체(SMI 94 및 SMI 99, 1:4000, Convance), 마우스 항-MOG 항체 (1:500), 및 토끼 항-베타 액틴 항체(1:2000, Sigma)를 사용한 웨스턴 블롯 분석은, 항-DR6 항체가 용량 의존적 방식으로 수초화를 촉진하며, 공배양물에 첨가된 항-DR6 항체의 보다 높은 농도, 보다 높은 수준의 MBP 및 MOG 단백질이 생산되었음을 입증한다(도 15). 상기 연구는, DR6 기능의 차단이 희소돌기아교세포 생존, 분화 및 수초화를 촉진시킴을 입증한다.
실시예 18
항-DR6 항체에 의한 DR6의 차단은 랫트 뇌 단면 배양물에서 재수초화를 촉진한다.
뇌 단면 배양 시스템은 탈수초화의 병리학 및 재수초화의 메카니즘의 분석을 위한 강력한 시험관내 모델을 제공한다. P17 뇌 단면을 생활성 지질, 리소포스파티딜콜린(LPC)으로 3일 처리하면 수초화의 검은색 금 염색의 부재로 가시화되는 바와 같이 신속하고 거의-완전한 탈수초화를 초래한다(도 16a). LPC 제거 후 4일 동안 항-DR6 항체에 대한 노출은 15배 보다 더 검은 금 염색을 초래한 방면, 대조군 항체 처리는 효과를 가지지 않았다(도 16a 및 16b). 본 발명자들은 다음에, 재수초화가 성숙한 LPC 유도된 탈수초화 모델에서 생체내 달성될 수 있는지를 측정하였다. LPC를 9주령의 어린 성체(250 gm) 랫트 척수의 등 컬럼내로 0일째에 주사한 후 3일 후에 항-DR6 항체를 투여하였다. 다음에, LPC 유도된 병변 및 재수초화의 정도를 검은색 금 염색으로 측정하였다. 수초화된 백색 물질은 검은색 금 염색된 단면에서 암적색으로 나타나고 탈수초화된 병변은 담적색 또는 백색으로 나타난다. 대조군 항체-처리된 동물(n=3)로부터의 단면은 강력한 탈수초화 부위를 갖는 큰 변변을 나타낸 반면, 실질적으로 보다 적은 병변이 LPC 주사 7일 후 항-DR6 처리된 그룹(n=3)에서 명백하였다. 항-DR6-처리된 병변 및 대조군 병변의 검은색 금 염색 패턴은 상이하였다. 항-DR6 처리된 병변에서, 레이스-유사 구조가 탈수초화의 병변 지표 전체에 존재하였다. 병변 조각 배양물 및 생체내 라이소레시틴 연구 둘다는, 항-DR6 항체에 의한 DR6 기능의 차단이 탈수초화를 촉진함을 입증하였다.
실시예 19
항-DR6 항체는 랫트 EAE 모델에서 기능적 회복을 촉진한다.
성체 9-주령의 브라운 노르웨이 랫트(Brown Norway rat)(150 g)를 이소플로우린으로 마취한 후 꼬리의 기저에 CFA(완전 프루언트 항원보강제, Chondrex Inc.) 및 100μl의 DPBS (MP Biomedicals, LCC) 중 랫트 MOG (아미노산 1 내지 125번)의 N-말단 서열에 상응하는 100μl의 100 ㎍ 재조합체 랫트 MOG를 함유하는 200μl의 콕테일 용액을 주사하였다. 동물은 주사 후 10 내지 15일째에 EAE의 신호를 발현하였다. MOG 유도 후, 각각의 동물을 운동 기능을 기초로 한 거동 시험으로 평가하였다. EAE 점수를 탈수초화에 대한 대용의 임상 계량법으로 사용하였다. 랫트를 매일 EAE의 임상 신호에 대해 점수를 매겼다. 신호는 다음과 같이 점수매겨졌다: 등급 0.5, 꼬리의 근접 마비; 등급 1, 완전한 꼬리 마비: 등급 1.5, 꼬리의 마비 및 약한 사지 마비: 등급 2.0, 단독의 심각한 뒷다리 마비: 등급 2.5, 양쪽 뒷다리 마비: 등급 3.0, 완전한 양쪽 뒷다리 마비: 등급 3.5, 완전한 양쪽 뒷다리 마비 및 하나의 앞다리 마비: 및 등급 4, 완전한 마비(사지마비), 빈사 상태, 또는 사망. 면역화 15일 후, 랫트를 무작위적으로 2 그룹 중 하나에 지정하였다. 랫트의 하나의 그룹(n=10)에게는 이소형(isotype) 대조군 항체를 주사하고, 다른 그룹(n=10)에는 DR6 항체를 주사하였다. 랫트에게 1주에 2회 6 mg/kg으로 총 5회 처리로 주사하였다. EAE 점수를 매일 측정하고, 통계적 유의성을 쌍을 이루지 않은 t-시험[양측 검정(two-tailed)]을 사용하여 평가하였다. 도 17a에 나타낸 바와 같이, DR6 항체 처리된 랫트에서 EAE 점수는 대조군 동물과 비교하여 상당히 더 낮았다. 전기생리학적 기록을 위해, 면역화 40일 후, 운동 잠재력(MEP)을 자기 피질 자극(Magstim)으로 유도하고 장딴지근육(Cadwell)으로부터 기록하였다. 첫번째 발생, 일반적으로 음성의, 편향을 피질 MEP 잠복기로 취하였다. 도 17b에 나타낸 바와 같이, DR6-처리된 랫트는 급속한 신경 전도 속도를 나타내었다.
실시예 20
림프세포 수는 항-DR6 항체로 처리된 EAE 랫트에서 영향받지 않는다.
EAE는 면역 및 신경학적 성분들 둘다를 포함하므로, 탈수초화용 복합 모델이다. 항-DR6 항체를 사용한 처리가 림프세포에 영향을 미치는지를 측정하기 위하여, MOG 면역화 40일 후, 말초 혈액을 항-DR6 항체 또는 대조군 항체로 처리한 EAE 랫트의 안면 정맥으로부터 취하였다. 총 전혈 세포 및 소세트 수를 헤마베트(Hemavet)를 사용하여 측정하였다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 전체 백혈구 세포내에서 총 림프세포 수 및 림프세포 퍼센트는 대조군과 항-DR6 항체 처리된 동물 사이에서 상당한 차이를 나타내지 않았다.
실시예 21
항-DR6 항체는 EAE 랫트에서 척수내로 T-세포 침윤을 억제한다.
항-DR6 항체가 CNS내로의 T 세포 침윤에 영향을 미치는지 측정하기 위하여, EAE 랫트를 CO2로 마취시킨 후, MOG 면역화 6주 후 0.1 M 인산염 완충액으로 주입하였다. 척수의 요추 영역을 해부하고 4% 파라포름알데하이드로 밤새 4℃에서 고정시킨 후 0.1M PBS 속에서 25% 슈크로즈 속에 항온처리하였다. 15μM의 횡측 및 종측의 동결된 단면[라이카 박절기(Leica microtome)]으로 절단하고 표준 형광성 면역조직화학을 항-CD4 항체(BD Pharmingen)를 사용하여 수행하였다. 영상을 라이카 형광 현미경(Leica fluorescence microscopy)하에 취하여 오펜랩(Openlab)을 사용하여 분석하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 항-DR6 항체의 전신계적 투여는 EAE 랫트의 척수내로 T 세포의 침윤을 상당히 감소시켰으며, 이는, 감소된 T 세포 침윤이 항-DR6 처리된 동물에서 EAE 증상의 감소된 중증도(보다 낮은 EAE 점수)를 적어도 부분적으로 설명함을 제안한다.
실시예 22
TNF알파는 NFκb를 통해 신경세포 사망을 촉진한다.
TNF는 종양 세포내에서 DR6 발현을 유도하여 NF-κB, 카스파제-3 경로를 활성화시킴으로써 세포자멸사를 활성화시키고 Iκb 단백질 수준을 하향조절하였다. TNF알파가 피질 신경세포내에서 DR6 발현을 유도하는지를 측정하기 위하여, 신경세포를 TNF알파를 사용한 처리에 24시간 노출시키고, 면역조직화학 염색을 수행하였다. 결과는, DR6 발현이 상당히 증가되었음을 입증하였다. TNF알파는 신경세포 사망을 유도하였으며 DR6 양성 세포와 잘 상호관련되었다(도 20a 내지 20c). 상기 연구는 웨스턴 블롯으로 확인되었다(도 21a). TNF알파를 사용한 처리는 처리 24시간 후 DR6 발현에 있어서 2배 증가를 유도하였으며, 이는 또한 10배의 NF-κB 증가 및 2배의 Iκb 단백질 하향 조절과 상관관계가 있다(도 21a 내지 21d). DR6 RNAi 형질감염된 신경세포는 DR6 및 NFκb 수준에 있어서 2배 감소를 나타내었다(도 22b 및 22c). 대조적으로, DR6 RNAi 형질감염된 신경세포는 증가된(2배) Iκb 단백질 발현을 나타내었다(도 22a 내지 22d). (사용된 대조군 및 DR6 siRNA는 실시예 11에 기술한 바와 같다). 상기 데이타는, DR6 상향 조절이 NFκb 발현과 상관관계가 있으며 Iκb 발현과는 역으로 상관관계가 있음을 제안한다.
실시예 23
DR6 길항제는 DRG 축삭의 스완(schwann) 세포 수초화를 촉진한다
DR6 길항제가 스완 세포에 영향을 미치는지를 측정하기 위하여, 스완 세포 및 DR6 신경세포 공배양물에 대한 항-DR6 항체의 효과를 실험하였다. 당해 실험에서, E16 랫트로부터의 DRG 신경세포를 신경기본 배지 + B27 및 NGF가 들어있는 4 웰 슬라이드에 플레이팅(50,000/웰)하였다. 7일 후, DRG 세포를 신경기본 배지 + B27 및 NGF (100 ng/ml)로 추가로 7 내지 10일 동안 처리하였다. 이후에, 정제된 스완 세포(50,000/웰)을 B27 및 100 ng/ml NGF이 들어있는 신경기본 배지 중 DRG 신경세포 (50,000/웰)에 가하였다. 배지를 매주 교환하였다. 공배양물을 수거하고 10일 후에 MBP 단백질에 대해 IHC 또는 웨스턴 블롯으로 검정하였다. IHC 염색 및 웨스턴 블롯(도 23) 둘다는 대조군 항체로 처리한 배양물과 비교하여 항-DR6 항체로 처리한 배양물에서 증가된 수준의 MBP 단백질을 나타내었다. 당해 데이타는, DR6 길항제가 신경세포의 스완 세포 수초화를 촉진함을 나타낸다.
실시예 24
DR6은 세포자멸사 피질 신경세포에서 상향조절된다.
신생피질 신경세포에서 DR6 발현을 실험하기 위해, 신경세포를 우선 E18 스프라그 다울리 랫트(Charles River)로부터 분리하였다. 요약하면, E18 랫트 배아로부터의 대뇌 피질을 해부하고, 잘게 썰어 0.25% 트립신/EDTA(Invitrogen) 속에서 37℃로 10분 동안 항온처리하였다. 이후에, 세포를 20 ㎍/ml DNase I(Sigma) 및 10% 태아 송아지 혈청(Invitrogen)을 가한 후 연마하여 반응을 중지시켰다. 세포 펠렛을 수집한 후 큰 단편이 가시적이지 않을 때까지 플라스틱 피펫을 통해 온화하게 통과시켜 기계적으로 해리시켰다. 세포를 100 ㎍/ml 폴리-D-라이신(Sigma)으로 4x104 세포/웰로 예비-피복시킨 8-웰 슬라이드 챔버(NUNC) 속에서 플레이팅하였다. 세포를 B27 상층액(Invitrogen)을 함유하는 신경기본 배지 속에서 37℃로 5% CO2와 습윤화된 공기 속에서 매 3 내지 4일 동안 신선한 배지를 교환하면서 유지시켰다. 세포를 3주 동안 배양하고 PBS 속에서 4% 파라포름알데하이드로 30분 동안 고정시켰다. PBS로 3회 세척한 후, 세포를 1% 트리톤 X-100(PBST, Sigma)을 함유하는 PBS로 30분 동안 침투시킨 후 차단 용액[0.1% 트리톤 X-100 및 10% 정상 염소 혈청(NGS)을 함유하는 PBS] 중에서 30분 동안 실온에서 항온처리하였다. 주요 표지화를 위해, 이후에 세포를 토끼 항-DR6(Santa Cruz, sc-13106, 1:200) 및 마우스 항-신경세포 제III 부류 β 투불린(Covance, MMS-435P, 1:500)을 함유하는 차단 배지 속에서 4℃로 밤새 항온처리하였다. 3회 PBST 세정 후, 세포를 알렉사(Alexa) 594 항-토끼 IgG (1:500) 및 알렉사 488 항-마우스 IgG(1:500) 제2 항체를 함유하는 5% NGS-PBS 속에서 실온으로 1시간 동안 암실 속에서 항온처리하였다. 3회 PBST 세척 후, 세포를 DAPI 시약(Invitrogen)이 있는 안티페이드(antifade)와 함께 올려놓고 형광 현미경하에 관측하였다. 핵 농축에 의해 나타난 세포자멸사는 배양물 에서 3주 후 피질 신경세포속에서 가시적이었다. DR6의 수준을 세포자멸사 및 비-세포자멸사 신경세포에서 가시적이었다. DR6의 수준을 세포자멸사 신경세포 및 비-세포자멸사 신경세포에서 비교하였다. DR6 발현의 발현 수준은 비-세포사멸사 신경세포와 비교하여 세포자멸사 신경세포에서 상향조절되었다. 이들 결과는, DR6 발현에 있어서의 증가가 노화된 신경세포 세포자멸사에 기여할 수 있음을 제안한다.
실시예 25
DR6 길항제는 축삭 통합성을 촉진한다.
신생피질 신경세포의 축삭 통합성에 있어서 DR6 길항제의 효과를 실험하기 위하여, 신경세포를 E18 스프라그 다울리 랫트(Charles River)로부터 분리하여 B27 보충물(Invitrogen)을 함유하는 신경기본 배지 속에서 37℃로 5% CO2와의 습윤 공기 속에서 실시예 24에 기술된 바와 같이 배양하였다. 배양 7일 후, 세포를 β-아밀로이드(응집된 Aβ-42)로 (50 ㎍/ml)의 농도에서 및 10 ㎍/ml 가용성 DR6-Fc 또는 10 ㎍/ml 가용성 대조군 항체로 처리하였다. 48시간 후, 신경세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정시킨 후 마우스 항-신경세포 제III 부류 β-투불린(Covance, MMS-435P, 1:500)으로 실시예 24에 기술된 바와 같이 염색하였다. β-아밀로이드를 사용한 처리는 처리하지 않은 대조군과 비교하여 신경세포 세포 사망 및 축삭 변성을 유도하였다. 그러나, 가용성 DR6-Fc 처리는 β-아밀로이드 유도된 축삭 변성 및 신경 세포 사망을 상당히 감소시켰다. 가용성 DR6-Fc 처리는 또한 신경세포의 증가된 생존 및, 축색 변성 형태의 전형인 감소된 축삭 비딩(axon beading)을 유도하였다. 이들 결과는, DR6 길항제가 신생피질 신경세포에서 β-아밀로이드의 음성 효과를 약화시킴을 제안한다.
실시예 26
DR6 및 AKT 발현은 역으로 관련된다.
포스포릴화된 AKT(포스포-AKT)는 잘 공지된 생존 시그날이다. 따라서, DR6와 포스포-AKT 수준의 관계를 신생피질 신경세포에서 실험하였다. 이들 실험에서, 신생피질 신경세포를 위에서 기술한 바와 같이 분리하였다. 배양한지 3, 7, 14, 및 20일 후, 신생피질 신경세포를 80μl의 분해 완충액(50mM HEPES, pH 7.5, 150mM NaCl, 1.5mM MgCl2, 1mM EGTA, 1% 트리톤 X-100, 및 10% 글리세롤) 속에서 30분 동안 4℃로 분해하였다. 14,000xg에서 15분 동안 원심분리한 후, 상층액을 램믈리 시료 완충액(Laemmli sample buffer) 속에서 비등시키고, 4 내지 20% SDS-PAGE에 적용시키고, 토끼 항-포스포-AKT 항체(1:500, 세포 시그날링), 토끼 항-AKT 항체(1:1000, 세포 시그날링), 염소 항-DR6 항체(1:1000, Santa Cruz), 및 토끼 항-베타 액틴 항체(1:2000, Sigma)를 사용한 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 주요 항체를 항-토끼 IgG-HRP(1:5000) 및 항-염소 IgG-HRP(1:5000, Bio-Rad)로 가시화하였다. DR6의 발현 수준은 7일 배양시 높았으며 20일 배양시 낮았다(도 24). 대조적으로, 포스포-AKT의 수준은 7일째에 낮았고 20일째에 높았다(도 24). DR6와 포스포-AKT 수준의 역 상관관계는, DR6가 AKT 시그날링 경로를 통해 세포 사망을 유도할 수 있었음을 제안한다.
실시예 27
DR6 및 p75는 복합체를 형성한다.
p75가 DR6와 상호작용할 수 있는지를 측정하기 위하여, (i) DR6, p75, 및 TrkA, (ii) DR6 및 TrkA, (iii) p75 및 TrkA, 및 (iv) DR6 및 p75를 발현하는 재조합체 세포주를 생성하였다. 당해 실험에서, 인간 TrkA를 성숙한 TrkA 단백질(아미노산 34 내지 796번)의 N-말단에 융합된 Flag 태그와 함께 발현시켰다. 랫트 p75를 성숙한 p75 단백질(아미노산 30 내지 431번)의 N-말단에 융합된 His 태그와 함게 발현시키고, 인간 DR6를 성숙한 DR6 단백질(아미노산 32 내지 655번)의 N-말단에 융합된 Myc 태그와 함께 발현시켰다. DR6는 세포 분해물로부터 Myc 항체를 사용하여 면역침전시키고, 시료중 DR6 및 p75의 수준을 평가하였다. 웨스턴 블롯(도 25a)은, p75가 TrkA의 존재 또는 부재하에서 DR6와 공-면역침전되었음을 나타낸다.
또한, DR6 또는 음성 대조군 벡터(pV90)를 암호화하는 벡터를 함유하는 세포를 p75에 대한 결합에 대해 검정하였다. 알칼리성 포스파타제-p75 단백질을 세포에 가하고 세포 표면 결합을 측정하였다. 결과는 25b에 나타낸다.
유사한 결과를 BioChain®로부터 수득한 인간 태아 척수로부터 수득한 시료를 사용하여 수득하였다. 면역침전 실험은, p75가 DR6와 함게 공-침전됨을 입증하였다(도 25c).
이 데이타는 DR6 및 P75가 세포 배양 검정과 인간 시료, 둘 모두에서 복합체를 형성함을 입증한다.
실시예 28
DR6 및 p75 중첩의 발현 패턴
DR6 및 p75 mRNA의 발현 수준을 공공의 이용가능한 기관(the Allen Institute for Brain Science)에 의해 이용가능하도록 된 database mouse.brain-map.org로부터 수득하였다. DR6 및 p75 둘다는 뇌의 각종 영역에서 고도로 발현되었으며, 발현 수준은 잘 관련되었다(도 26). 이들 결과는, DR6 및 p75가 공국재화되며, 이에 따라, 생체내에서 함께 상호작용하고 기능할 수 있음을 제안한다.
실시예 29
DR6 항체는 DR6와 p75의 상호작용을 차단한다.
DR6 항체가 DR6와 p75의 상호작용을 차단하는지를 측정하기 위해서, 재조합체 DR6을 세포로부터 2A9 항-DR6 항체 또는 5D10 항-DR6 항체를 사용하여 면역침전시켰다. 웨스턴 분석은, 항-DR6 항체 둘다가 DR6 단백질을 파괴할 수 있지만, p75만은, 2A9 항체가 사용되는 경우 DR6와 공면역침전되었음을 입증하였다(도 27a). 따라서, 5D10 DR6 항체는 DR6와 p75의 상호작용을 방해하였다.
DR6와 p75의 상호작용을 방해하는 5D10의 능력은 또한 기능적 검정으로 확인하였다. 당해 검정에서, 대조군 벡터 또는 p75를 암호화하는 벡터를 함유하는 CHO 세포를 알칼리성 포스파타제-DR6와 함께 항온처리하고 결합에 대해 평가하였다. 고 수준의 세포 표면 결합은, p75를 발현하는 세포를 DR6와 함께 항온처리하는 경우 관측되었다. 그러나, 5D10의 첨가는 p75를 발현하는 세포에 대한 결합으로부터 DR6을 방지하였다(도 27b). 이들 결과는, DR6 항체 5D10이 p75에 대한 DR6의 결합을 방해할 수 있고 세포 생존을 촉진함을 나타낸다.
실시예 30
DR6의 TNFR-Cys 반복물 3 및 4는 DR6-p75 상호작용을 방해하는 항체에 결합한다
DR6-p75 상호작용을 방해하는 DR6 항체에 결합하는 DR6의 도메인을 확인하기 위해서, DR6 결실 작제물을 발현하는 세포를 창조하였다. 결실 작제물을 Myc로 태그하였다. 시험한 작제물은 서열 번호: 2(#123)의 아미노산 168 내지 189번; 서열 번호: 2(#124)의 아미노산 134 내지 168번; 서열 번호: 2(#134)의 아미노산 109 내지 131번; 서열 번호: 2(#234)의 아미노산 49 내지 108번; 서열 번호: 2(#12)의 아미노산 133 내지 189번; 서열 번호: 2(#34)의 아미노산 49 내지 131번; 및 서열 번호: 2(#23)의 아미노산 49 내지 108번 및 168 내지 189번의 결실을 포함하였다.
FACS 분석을 사용하여 각각의 결실 작제물이 세포내에서 발현되었는지를 입증하였다(도 28a). 이후에, 재조합체 세포로부터 수득한 시료를 항-Myc 항체 또는 항-DR6 항체와 함께 면역침전시켰다. 면역침전물을 p75 단백질에 대해 웨스턴으로 검정하며, 결과는, 항체 5D10이 DR6의 Cys3 및 Cys4 도메인(아미노산 133 내지 189번)에 결합합을 나타내었다(도 28b). 항체 2A9는 DR6의 Cys1 도메인(아미노산 49 내지 131번)에 결합한다(도 28b). DR6 결실 작제물에 대한 DR6 항체의 패널의 결합을 또한 검정하였다(도 28c). 상기 결과는, 5D10 및 4A4가 DR6의 Cys3 및 Cys4 도메인에 결합하며, 2A9, 1D6, 및 2F2가 DR6의 Cys1 도메인에 결합함을 입증하였다.
실시예 31
DR6의 TNFR-Cys 반복물 3 및 4는 p75에 결합한다.
p75에 결합하는 DR6의 도메인을 확인하기 위하여, 실시예 30에 기술된 DR6 결실 작제물을 발현하는 세포를 p75에 대한 결합에 대해 검정하였다. 재조합체 세포를 p75와 함께 항온처리한 후, 세포 분해물을 항-Myc 항체를 사용하여 면역침전시켰다. p75의 수준을 웨스턴으로 평가하며, 결과는, DR6의 Cys3 및 Cys4 도메인(아미노산 133 내지 189번)의 결실이 p75와 상호작용하기 위한 DR6의 감소된 능력을 초래함을 입증하였다.
본 발명은 본 발명의 개개의 국면, 및 본 발명의 영역내에 있는 기능적으로 동등한 특정 조성물 또는 방법의 하나의 설명으로서 의도되는 기술된 구체적인 구체예에 의해 영역에서 한정되지 않는다. 실제로, 본원에 나타내고 기술된 것들 외에 본 발명의 각종 변형은 앞서의 기술 및 첨부된 도면으로부터 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 특허청구범위의 영역내에 있는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허원은, 각각의 개개 공보 또는 특허원이 참조문헌으로 혼입되는 것으로 상세하게 및 개별적으로 나타낸 경우와 동일한 정도로 참조로 본원에서 혼입된다.
발명의 요약 및 요약서 단락이 아닌 상세한 설명 단락은 특허청구범위를 해석하기 위해 사용되는 것으로 의도되는 것으로 인식되어야 한다. 발명의 요약 및 요약서 단락은 발명자(들)에 의해 고려되는 것으로서 본 발명의 모든 예시적인 구체예가 아닌 하나 이상의 구체예를 나타낼 수 있으므로, 본 발명 및 첨부된 특허청구범위를 어떠한 방식으로든 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Biogen Idec MA Inc. Mi, Sha Rhodes, Kenneth J. Pepinsky, R. Blake <120> Use of DR6 and P75 Antagonists to Promote Survival of Cells of the Nervous System <130> 2159.165PC01/EJH/CLD <140> PCT/US09/65755 <141> 2009-11-24 <150> 61/117,917 <151> 2008-11-25 <160> 166 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3660 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gccaccacgt gtgtccctgc gcccggtggc caccgactca gtccctcgcc gaccagtctg 60 ggcagcggag gagggtggtt ggcagtggct ggaagcttcg ctatgggaag ttgttccttt 120 gctctctcgc gcccagtcct cctccctggt tctcctcagc cgctgtcgga ggagagcacc 180 cggagacgcg ggctgcagtc gcggcggctt ctccccgcct gggcggccgc gccgctgggc 240 aggtgctgag cgcccctaga gcctcccttg ccgcctccct cctctgcccg gccgcagcag 300 tgcacatggg gtgttggagg tagatgggct cccggcccgg gaggcggcgg tggatgcggc 360 gctgggcaga agcagccgcc gattccagct gccccgcgcg ccccgggcgc ccctgcgagt 420 ccccggttca gccatgggga cctctccgag cagcagcacc gccctcgcct cctgcagccg 480 catcgcccgc cgagccacag ccacgatgat cgcgggctcc cttctcctgc ttggattcct 540 tagcaccacc acagctcagc cagaacagaa ggcctcgaat ctcattggca cataccgcca 600 tgttgaccgt 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Thr Tyr Val Ser Glu His Cys 65 70 75 80 Thr Asn Thr Ser Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys Pro Val Gly Thr Phe 85 90 95 Thr Arg His Glu Asn Gly Ile Glu Lys Cys His Asp Cys Ser Gln Pro 100 105 110 Cys Pro Trp Pro Met Ile Glu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Leu Thr Asp 115 120 125 Arg Glu Cys Thr Cys Pro Pro Gly Met Phe Gln Ser Asn Ala Thr Cys 130 135 140 Ala Pro His Thr Val Cys Pro Val Gly Trp Gly Val Arg Lys Lys Gly 145 150 155 160 Thr Glu Thr Glu Asp Val Arg Cys Lys Gln Cys Ala Arg Gly Thr Phe 165 170 175 Ser Asp Val Pro Ser Ser Val Met Lys Cys Lys Ala Tyr Thr Asp Cys 180 185 190 Leu Ser Gln Asn Leu Val Val Ile Lys Pro Gly Thr Lys Glu Thr Asp 195 200 205 Asn Val Cys Gly Thr Leu Pro Ser Phe Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ser 210 215 220 Pro Gly Thr Ala Ile Phe Pro Arg Pro Glu His Met Glu Thr His Glu 225 230 235 240 Val Pro Ser Ser Thr Tyr Val Pro Lys Gly Met Asn Ser Thr Glu Ser 245 250 255 Asn Ser Ser Ala Ser Val Arg Pro Lys Val Leu Ser Ser Ile Gln Glu 260 265 270 Gly Thr Val Pro Asp Asn Thr Ser Ser Ala Arg 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tcgcggctag ccctgctctc tggttctccg cagccgctgt cgttggagag caccgggagg 180 cgcgggttgc gagcgcgcct gcttctcacc gcccgggcgc cagcgcccct gggcaggtgc 240 tgagcgcctt tcggagcctc ccctgctgcc tccctcttcc gcctgggtgc ctggctgctg 300 cagtgcacat gggctgctgg aggtagatgg gctcaccgcc cgtgaggcgg cggtggatgc 360 ggcgctgggc agaaacagcc accaattcca gctgccgtgg ggccgagcgc cccgggcgcc 420 gctgcgagcc ccgagctcgg ccatggggac ccgggcaagc agcatcaccg ccctcgcctc 480 ttgcagccgc accgccggcc aagtcggagc cacgatggtc gccggctctc ttctcctgct 540 tggattcctc agcaccatca cagctcaacc agaacaaaag actctgagtc tccctggcac 600 ctaccgccat gttgaccgta ccactggcca ggtgctaacc tgcgacaagt gcccagcagg 660 aacgtacgtc tccgagcact gtaccaacat gagcctgcga gtctgcagca gctgccccgc 720 ggggaccttt accaggcacg agaacggcat agagagatgc catgactgta gtcagccatg 780 tccatggccg atgattgaga gattaccttg tgctgccttg actgaccgag agtgcatctg 840 cccacctgga atgtatcagt ctaatggtac ctgcgctccc catacagtgt gccccgtggg 900 ctggggtgtg cggaagaaag ggacagagaa tgaagatgtg cgctgtaagc agtgcgctcg 960 gggtaccttc 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tgctcagtcg tcagactcta atgcaaaggt ggacgtcggc tgcctttgcg 3540 tgggcgggct tagtggtgag gaactgatat cagaaaaaaa atgccttcaa gtatactaat 3600 ttattaataa atattaggtg tttgtt 3626 <210> 4 <211> 655 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Gly Thr Arg Ala Ser Ser Ile Thr Ala Leu Ala Ser Cys Ser Arg 1 5 10 15 Thr Ala Gly Gln Val Gly Ala Thr Met Val Ala Gly Ser Leu Leu Leu 20 25 30 Leu Gly Phe Leu Ser Thr Ile Thr Ala Gln Pro Glu Gln Lys Thr Leu 35 40 45 Ser Leu Pro Gly Thr Tyr Arg His Val Asp Arg Thr Thr Gly Gln Val 50 55 60 Leu Thr Cys Asp Lys Cys Pro Ala Gly Thr Tyr Val Ser Glu His Cys 65 70 75 80 Thr Asn Met Ser Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys Pro Ala Gly Thr Phe 85 90 95 Thr Arg His Glu Asn Gly Ile Glu Arg Cys His Asp Cys Ser Gln Pro 100 105 110 Cys Pro Trp Pro Met Ile Glu Arg Leu Pro Cys Ala Ala Leu Thr Asp 115 120 125 Arg Glu Cys Ile Cys Pro Pro Gly Met Tyr Gln Ser Asn Gly Thr Cys 130 135 140 Ala Pro His Thr Val Cys Pro Val Gly Trp Gly Val Arg Lys Lys Gly 145 150 155 160 Thr Glu Asn Glu Asp Val Arg 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ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagattgg 300 cacggtggtg gtgcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcaagc 357 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> M50-H01 variable heavy chain <400> 7 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Pro Ser Gly Gly His Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Trp His Gly Gly Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M50-H01 VH CDR1 <400> 8 Asp Tyr Pro Met Met 1 5 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> M50-H01 VH CDR2 <400> 9 Arg Ile Ser Pro Ser Gly Gly His 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gcagcctgac atctgaggac tctgctgtct atttctgtac aagaggggtg 300 attaagtggg gccaagggac tctggtcact gtctctgta 339 <210> 117 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1P2F2.1 variable heavy chain <400> 117 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Asn Asn His Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Asn Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Val Ile Lys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Val <210> 118 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1P2F2.1 VH CDR1 <400> 118 Asp Tyr Tyr Leu Asn 1 5 <210> 119 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1P2F2.1 VH CDR2 <400> 119 Glu Ile Tyr Pro Gly Asn Asn His Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys 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<400> 150 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ile Glu Gly Arg 1 5 10 <210> 151 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-MYC epitope <400> 151 Glu Gln Lys Leu Leu Ser Glu Glu Asp Leu Asn 1 5 10 <210> 152 <211> 200 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(200) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> misc_feature <222> (2)..(200) <223> nucleotide may be missing <400> 152 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 200 <210> 153 <211> 200 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(200) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> misc_feature <222> (2)..(200) <223> nucleotide may be missing <400> 153 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 200 <210> 154 <211> 1998 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human DR6 with Myc tag <400> 154 atggggacct ctccgagcag cagcaccgcc ctcgcctcct gcagccgcat cgcccgccga 60 gccacagcca cgatgatcgc gggctccctt ctcctgcttg gattccttag caccaccaca 120 gctgagcaga agctgatctc agaggaggac ctgcagccag aacagaaggc ctcgaatctc 180 attggcacat accgccatgt tgaccgtgcc accggccagg tgctaacctg tgacaagtgt 240 ccagcaggaa cctatgtctc tgagcattgt accaacacaa gcctgcgcgt ctgcagcagt 300 tgccctgtgg ggacctttac caggcatgag aatggcatag agaaatgcca tgactgtagt 360 cagccatgcc catggccaat gattgagaaa ttaccttgtg ctgccttgac tgaccgagaa 420 tgcacttgcc cacctggcat gttccagtct aacgctacct gtgcccccca tacggtgtgt 480 cctgtgggtt ggggtgtgcg gaagaaaggg acagagactg aggatgtgcg gtgtaagcag 540 tgtgctcggg gtaccttctc agatgtgcct tctagtgtga tgaaatgcaa agcatacaca 600 gactgtctga 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negative DR6 with Myc tag <400> 156 atggggacct ctccgagcag cagcaccgcc ctcgcctcct gcagccgcat cgcccgccga 60 gccacagcca cgatgatcgc gggctccctt ctcctgcttg gattccttag caccaccaca 120 gctgagcaga agctgatctc agaggaggac ctgcagccag aacagaaggc ctcgaatctc 180 attggcacat accgccatgt tgaccgtgcc accggccagg tgctaacctg tgacaagtgt 240 ccagcaggaa cctatgtctc tgagcattgt accaacacaa gcctgcgcgt ctgcagcagt 300 tgccctgtgg ggacctttac caggcatgag aatggcatag agaaatgcca tgactgtagt 360 cagccatgcc catggccaat gattgagaaa ttaccttgtg ctgccttgac tgaccgagaa 420 tgcacttgcc cacctggcat gttccagtct aacgctacct gtgcccccca tacggtgtgt 480 cctgtgggtt ggggtgtgcg gaagaaaggg acagagactg aggatgtgcg gtgtaagcag 540 tgtgctcggg gtaccttctc agatgtgcct tctagtgtga tgaaatgcaa agcatacaca 600 gactgtctga gtcagaacct ggtggtgatc aagccgggga ccaaggagac agacaacgtc 660 tgtggcacac tcccgtcctt ctccagctcc acctcacctt cccctggcac agccatcttt 720 ccacgccctg agcacatgga aacccatgaa gtcccttcct ccacttatgt tcccaaaggc 780 atgaactcaa cagaatccaa ctcttctgcc tctgttagac caaaggtact gagtagcatc 840 caggaaggga cagtccctga caacacaagc tcagcaaggg ggaaggaaga cgtgaacaag 900 accctcccaa accttcaggt agtcaaccac cagcaaggcc cccaccacag acacatcctg 960 aagctgctgc cgtccatgga ggccactggg ggcgagaagt ccagcacgcc catcaagggc 1020 cccaagaggg gacatcctag acagaaccta cacaagcatt ttgacatcaa tgagcatttg 1080 ccctggatga ttgtgctttt cctgctgctg gtgcttgtgg tgattgtggt gtgcagtatc 1140 tag 1143 <210> 157 <211> 380 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dominant negative DR6 with Myc tag <400> 157 Met Gly Thr Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ala Leu Ala Ser Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ile Ala Arg Arg Ala Thr Ala Thr Met Ile Ala Gly Ser Leu Leu Leu 20 25 30 Leu Gly Phe Leu Ser Thr Thr Thr Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu 35 40 45 Glu Asp Leu Gln Pro Glu Gln Lys Ala Ser Asn Leu Ile Gly Thr Tyr 50 55 60 Arg His Val Asp Arg Ala Thr Gly Gln Val Leu Thr Cys Asp Lys Cys 65 70 75 80 Pro Ala Gly Thr Tyr Val Ser Glu His Cys Thr Asn Thr Ser Leu Arg 85 90 95 Val Cys Ser Ser Cys Pro Val Gly Thr Phe Thr Arg His Glu Asn Gly 100 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gtaccttctc agatgtgcct 540 tctagtgtga tgaaatgcaa agcatacaca gactgtctga gtcagaacct ggtggtgatc 600 aagccgggga ccaaggagac agacaacgtc tgtggcacac tcccgtcctt ctccagctcc 660 acctcacctt cccctggcac agccatcttt ccacgccctg agcacatgga aacccatgaa 720 gtcccttcct ccacttatgt tcccaaaggc atgaactcaa cagaatccaa ctcttctgcc 780 tctgttagac caaaggtact gagtagcatc caggaaggga cagtccctga caacacaagc 840 tcagcaaggg ggaaggaaga cgtgaacaag accctcccaa accttcaggt agtcaaccac 900 cagcaaggcc cccaccacag acacatcctg aagctgctgc cgtccatgga ggccactggg 960 ggcgagaagt ccagcacgcc catcaagggc cccaagaggg gacatcctag acagaaccta 1020 cacaagcatt ttgacatcaa tgagcatgtc gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 1080 gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 1140 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 1200 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1260 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1320 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1380 cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1440 ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1500 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1560 tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1620 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1680 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctcccgggtg a 1731 <210> 159 <211> 576 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> soluble DR6: Fc <400> 159 Met Gly Thr Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ala Leu Ala Ser Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ile Ala Arg Arg Ala Thr Ala Thr Met Ile Ala Gly Ser Leu Leu Leu 20 25 30 Leu Gly Phe Leu Ser Thr Thr Thr Ala Gln Pro Glu Gln Lys Ala Ser 35 40 45 Asn Leu Ile Gly Thr Tyr Arg His Val Asp Arg Ala Thr Gly Gln Val 50 55 60 Leu Thr Cys Asp Lys Cys Pro Ala Gly Thr Tyr Val Ser Glu His Cys 65 70 75 80 Thr Asn Thr Ser Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys Pro Val Gly Thr Phe 85 90 95 Thr Arg His Glu Asn Gly Ile Glu 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Pro Ser Met Glu Ala Thr Gly 305 310 315 320 Gly Glu Lys Ser Ser Thr Pro Ile Lys Gly Pro Lys Arg Gly His Pro 325 330 335 Arg Gln Asn Leu His Lys His Phe Asp Ile Asn Glu His Val Asp Lys 340 345 350 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 355 360 365 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 370 375 380 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 385 390 395 400 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 405 410 415 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 420 425 430 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 435 440 445 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 450 455 460 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 465 470 475 480 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 485 490 495 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 500 505 510 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 515 520 525 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 530 535 540 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 545 550 555 560 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 565 570 575 <210> 160 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR6 siRNA <400> 160 agaaacggcu ccuuuauua 19 <210> 161 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR6 siRNA <400> 161 ggaaggacau cuaucaguu 19 <210> 162 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR6 siRNA <400> 162 ggccgaugau ugagagauu 19 <210> 163 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR6 siRNA <400> 163 gcaguuggaa acagacaaa 19 <210> 164 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control siRNA <400> 164 ggugacauga ucgacagcca u 21 <210> 165 <211> 427 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 165 Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys 20 25 30 Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn 35 40 45 Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys 50 55 60 Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr 65 70 75 80 Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser 85 90 95 Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly 100 105 110 Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys 115 120 125 Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr 130 135 140 Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His 145 150 155 160 Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln 165 170 175 Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro 180 185 190 Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr 195 200 205 Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile 210 215 220 Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln 225 230 235 240 Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile Pro Val Tyr Cys 245 250 255 Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe 260 265 270 Lys Arg Trp Asn Ser Cys Lys Gln Asn Lys Gln Gly Ala Asn Ser Arg 275 280 285 Pro Val Asn Gln Thr Pro Pro Pro Glu Gly Glu Lys Leu His Ser Asp 290 295 300 Ser Gly Ile Ser Val Asp Ser Gln Ser Leu His Asp Gln Gln Pro His 305 310 315 320 Thr Gln Thr Ala Ser Gly Gln Ala Leu Lys Gly Asp Gly Gly Leu Tyr 325 330 335 Ser Ser Leu Pro Pro Ala Lys Arg Glu Glu Val Glu Lys Leu Leu Asn 340 345 350 Gly Ser Ala Gly Asp Thr Trp Arg His Leu Ala Gly Glu Leu Gly Tyr 355 360 365 Gln Pro Glu His Ile Asp Ser Phe Thr His Glu Ala Cys Pro Val Arg 370 375 380 Ala Leu Leu Ala Ser Trp Ala Thr Gln Asp Ser Ala Thr Leu Asp Ala 385 390 395 400 Leu Leu Ala Ala Leu Arg Arg Ile Gln Arg Ala Asp Leu Val Glu Ser 405 410 415 Leu Cys Ser Glu Ser Thr Ala Thr Ser Pro Val 420 425 <210> 166 <211> 3421 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 166 agagcgagcc gagccgcggc cagctccggc gggcaggggg ggcgctggag cgcagcgcag 60 cgcagcccca tcagtccgca aagcggaccg agctggaagt cgagcgctgc cgcgggaggc 120 gggcgatggg ggcaggtgcc accggccgcg ccatggacgg gccgcgcctg ctgctgttgc 180 tgcttctggg ggtgtccctt ggaggtgcca aggaggcatg ccccacaggc ctgtacacac 240 acagcggtga gtgctgcaaa gcctgcaacc tgggcgaggg tgtggcccag ccttgtggag 300 ccaaccagac cgtgtgtgag ccctgcctgg acagcgtgac gttctccgac gtggtgagcg 360 cgaccgagcc gtgcaagccg tgcaccgagt gcgtggggct ccagagcatg tcggcgccgt 420 gcgtggaggc cgacgacgcc gtgtgccgct gcgcctacgg ctactaccag gatgagacga 480 ctgggcgctg cgaggcgtgc cgcgtgtgcg aggcgggctc gggcctcgtg ttctcctgcc 540 aggacaagca gaacaccgtg tgcgaggagt gccccgacgg cacgtattcc gacgaggcca 600 accacgtgga cccgtgcctg ccctgcaccg tgtgcgagga caccgagcgc cagctccgcg 660 agtgcacacg ctgggccgac gccgagtgcg aggagatccc tggccgttgg attacacggt 720 ccacaccccc agagggctcg gacagcacag cccccagcac ccaggagcct gaggcacctc 780 cagaacaaga cctcatagcc agcacggtgg caggtgtggt gaccacagtg atgggcagct 840 cccagcccgt ggtgacccga ggcaccaccg acaacctcat ccctgtctat tgctccatcc 900 tggctgctgt ggttgtgggc cttgtggcct acatagcctt caagaggtgg aacagctgca 960 agcagaacaa gcaaggagcc aacagccggc cagtgaacca gacgccccca ccagagggag 1020 aaaaactcca cagcgacagt ggcatctccg tggacagcca gagcctgcat gaccagcagc 1080 cccacacgca gacagcctcg ggccaggccc tcaagggtga cggaggcctc tacagcagcc 1140 tgcccccagc caagcgggag gaggtggaga agcttctcaa cggctctgcg ggggacacct 1200 ggcggcacct ggcgggcgag ctgggctacc agcccgagca catagactcc tttacccatg 1260 aggcctgccc cgttcgcgcc ctgcttgcaa gctgggccac ccaggacagc gccacactgg 1320 acgccctcct ggccgccctg cgccgcatcc agcgagccga cctcgtggag agtctgtgca 1380 gtgagtccac tgccacatcc ccggtgtgag cccaaccggg gagcccccgc cccgccccac 1440 attccgacaa ccgatgctcc agccaacccc tgtggagccc gcacccccac cctttggggg 1500 gggcccgcct ggcagaactg agctcctctg ggcaggacct cagagtccag gccccaaaac 1560 cacagccctg tcagtgcagc ccgtgtggcc ccttcacttc tgaccacact tcctgtccag 1620 agagagaagt gcccctgctg cctccccaac cctgcccctg ccccgtcacc atctcaggcc 1680 acctgccccc ttctcccaca ctgctaggtg ggccagcccc tcccaccaca gcaggtgtca 1740 tatatggggg gccaacacca gggatggtac tagggggaag tgacaaggcc ccagagactc 1800 agagggagga atcgaggaac cagagccatg gactctacac tgtgaacttg gggaacaagg 1860 gtggcatccc agtggcctca accctccctc agcccctctt gccccccacc ccagcctaag 1920 atgaagagga tcggaggctt gtcagagctg ggaggggttt tcgaagctca gcccaccccc 1980 ctcattttgg atataggtca gtgaggccca gggagaggcc atgattcgcc caaagccaga 2040 cagcaacggg gaggccaagt gcaggctggc accgccttct ctaaatgagg ggcctcaggt 2100 ttgcctgagg gcgaggggag ggtggcaggt gaccttctgg gaaatggctt gaagccaagt 2160 cagctttgcc ttccacgctg tctccagacc cccacccctt ccccactgcc tgcccacccg 2220 tggagatggg atgcttgcct agggcctggt ccatgatgga gtcaggtttg gggttcgtgg 2280 aaagggtgct gcttccctct gcctgtccct ctcaggcatg cctgtgtgac atcagtggca 2340 tggctccagt ctgctgccct ccatcccgac atggacccgg agctaacact ggcccctaga 2400 atcagcctag gggtcaggga ccaaggaccc ctcaccttgc aacacacaga cacacgcaca 2460 cacacacaca ggaggagaaa tctcactttt ctccatgagt tttttctctt gggctgagac 2520 tggatactgc ccggggcagc tgccagagaa gcatcggagg gaattgaggt ctgctcggcc 2580 gtcttcactc gcccccgggt ttggcgggcc aaggactgcc gaccgaggct ggagctggcg 2640 tctgtcttca agggcttaca cgtggaggaa tgctccccca tcctcccctt ccctgcaaac 2700 atggggttgg ctgggcccag aaggttgtga tgaagaaaag tgggccagtg tgggaatgcg 2760 gcaagaagga attgacttcg actgtgacct gtggggattt ctcccagctc tagacaaccc 2820 tgcaaaggac tgttttttcc tgagcttggc cagaaggggg ccatgaggcc tcagtggact 2880 ttccaccccc tccctggcct gttctgtttt gcctgaagtt ggagtgagtg tggctcccct 2940 ctatttagca tgacaagccc caggcaggct gtgcgctgac aaccaccgct ccccagccca 3000 gggttccccc agccctgtgg aagggactag gagcactgta gtaaatggca attctttgac 3060 ctcaacctgt gatgagggga ggaaactcac ctgctggccc ctcacctggg cacctgggga 3120 gtgggacaga gtctgggtgt atttattttc ctccccagca ggtggggagg gggtttgggg 3180 gcttgcaagt atgttttagc atgtgtttgg ttctggggcc cctttttact ccccttgagc 3240 tgagatggaa cccttttggc ccccgagctg ggggccatga gctccagacc cccagcaacc 3300 ctcctatcac ctcccctcct tgcctcctgt gtaatcattt cttgggccct cctgaaactt 3360 acacacaaaa cgttaagtga tgaacattaa atagcaaaga aagaaaaata aaaaaaaaaa 3420 a 3421

Claims (132)

  1. 항체는 신경계 세포의 생존을 증진할 수 있는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 항체는 희돌기아교세포의 증식, 분화 또는 생존을 증진할 수 있는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 항체는 수초화를 증진할 수 있는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. M50-H01, M51-H09, M53-E04, M53-F04, M62-B02, M63-E10, M66-B03, M67-G02, M72-F03, 및 M73-C04로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 Fab 항체 단편, 또는 1P1D6.3, 1P2F2.1, 및 1P5D10.2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체와 동일한 DR6 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 항체 또는 이의 단편은, M50-H01, M51-H09, M53-E04, M53-F04, M62-B02, M63-E10, M66-B03, M67-G02, M72-F03, 및 M73-C04로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 Fab 항체 단편, 또는 1P1D6.3, 1P2F2.1, 및 1P5D10.2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체가 DR6에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 항체 또는 이의 단편은 M50-H01, M51-H09, M53-E04, M53-F04, M62-B02, M63-E10, M66-B03, M67-G02, M72-F03, 및 M73-C04로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모노클로날 Fab 항체 단편, 또는 1P1D6.3, 1P2F2.1, 및 1P5D10.2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 모노클로날 항체의 도메인과 동일한 항원 결합 도메인을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 항체 또는 이의 단편의 중쇄 가변 영역(VH)는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:117, 및 SEQ ID NO:127로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  8. 항체 또는 이의 단편의 경쇄 가변 영역(VL)은 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:102 SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:122, 및 SEQ ID NO:132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  9. 항체 또는 이의 단편의 VH는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:117, 및 SEQ ID NO:127로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 아미노산 서열과, 20개 이하의 보존성 아미노산 치환을 제외하고 동일한 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  10. 항체 또는 이의 단편의 VL은 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:102 SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:122, 및 SEQ ID NO:132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 아미노산 서열과, 20개 이하의 보존성 아미노산 치환을 제외하고 동일한 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  11. 항체 또는 이의 단편의 VH는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:117, 및 SEQ ID NO:127로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  12. 항체 또는 이의 단편의 VL은 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:102 SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:122, 및 SEQ ID NO:132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  13. 항체 또는 이의 단편의 VH 및 VL은 각각, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:17 및 SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:27 및 SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:37 및 SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:47 및 SEQ ID NO:52; SEQ ID NO:57 및 SEQ ID NO:62; SEQ ID NO:67 및 SEQ ID NO:72; SEQ ID NO:77 및 SEQ ID NO:82; SEQ ID NO:87 및 SEQ ID NO:92; SEQ ID NO:97 및 SEQ ID NO:102; SEQ ID NO:107 및 SEQ ID NO:112; SEQ ID NO117 및 SEQ ID NO:122; 및 SEQ ID NO:127 및 SEQ ID NO:132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  14. 항체 또는 이의 단편의 VH 및 VL은 각각, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:17 및 SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:27 및 SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:37 및 SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:47 및 SEQ ID NO:52; SEQ ID NO:57 및 SEQ ID NO:62; SEQ ID NO:67 및 SEQ ID NO:72; SEQ ID NO:77 및 SEQ ID NO:82; SEQ ID NO:87 및 SEQ ID NO:92; SEQ ID NO:97 및 SEQ ID NO:102; SEQ ID NO:107 및 SEQ ID NO:112; SEQ ID NO117 및 SEQ ID NO:122; 및 SEQ ID NO:127 및 SEQ ID NO:132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 아미노산 서열과, 20개 이하의 보존성 아미노산 치환을 제외하고 동일한 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  15. 항체 또는 이의 단편의 VH 및 VL은 각각, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:17 및 SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:27 및 SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:37 및 SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:47 및 SEQ ID NO:52; SEQ ID NO:57 및 SEQ ID NO:62; SEQ ID NO:67 및 SEQ ID NO:72; SEQ ID NO:77 및 SEQ ID NO:82; SEQ ID NO:87 및 SEQ ID NO:92; SEQ ID NO:97 및 SEQ ID NO:102; SEQ ID NO:107 및 SEQ ID NO:112; SEQ ID NO117 및 SEQ ID NO:122; 및 SEQ ID NO:127 및 SEQ ID NO:132로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  16. 항체 또는 이의 단편의 VH는 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 118, 및 SEQ ID NO: 128로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VH-CDR1 아미노산 서열과, 2개 이하의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 카밧(Kabat) 중쇄 상보성 결정 영역-1 (VH-CDR1) 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  17. 제16항에 있어서, 상기 VH-CDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 118, 및 SEQ ID NO: 128로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단리된 항체 또는 이의 단편.
  18. 항체 또는 이의 단편의 VH는 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119 및 SEQ ID NO: 129로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VH-CDR2 아미노산 서열과, 4개 이하의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 카밧 중쇄 상보성 결정 영역-2 (VH-CDR2) 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  19. 제18항에 있어서, 상기 VH-CDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119 및 SEQ ID NO: 129로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단리된 항체 또는 이의 단편.
  20. 항체 또는 이의 단편의 VH는 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120 및 SEQ ID NO:130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VH-CDR3 아미노산 서열과, 4개 이하의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 카밧 중쇄 상보성 결정 영역-3 (VH-CDR3) 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  21. 제20항에 있어서, 상기 VH-CDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120 및 SEQ ID NO:130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단리된 항체 또는 이의 단편.
  22. 항체 또는 이의 단편의 VL은 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 123 및 SEQ ID NO: 133으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VL-CDR1 아미노산 서열과, 4개 이하의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 카밧 경쇄 상보성 결정 영역-1 (VL-CDR1) 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  23. 제22항에 있어서, 상기 VL-CDR1 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 123 및 SEQ ID NO: 133로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단리된 항체 또는 이의 단편.
  24. 항체 또는 이의 단편의 VL은 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 124, 및 SEQ ID NO: 134로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VL-CDR2 아미노산 서열과, 2개 이하의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 카밧 경쇄 상보성 결정 영역-2 (VL-CDR2) 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  25. 제24항에 있어서, 상기 VL-CDR2 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 124, 및 SEQ ID NO: 134로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단리된 항체 또는 이의 단편.
  26. 항체 또는 이의 단편의 VL은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 125, 및 SEQ ID NO: 135로 이루어진 그룹으로부터 선택된 참조 VL-CDR3 아미노산 서열과, 4개 이하의 아미노산 치환을 제외하고 동일한 카밧 경쇄 상보성 결정 영역-3 (VL-CDR3) 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  27. 제26항에 있어서, 상기 VL-CDR3 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 125, 및 SEQ ID NO: 135로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단리된 항체 또는 이의 단편.
  28. 항체 또는 이의 단편의 VH는 적어도 하나의 VH-CDR들에서 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 제외하고 SEQ ID NO: 8, 9, 및 10; SEQ ID NO: 18, 19, 및 20; SEQ ID NO: 28, 29, 및 30; SEQ ID NO: 38, 39, 및 40; SEQ ID NO: 48, 49, 및 50; SEQ ID NO: 58, 59, 및 60; SEQ ID NO: 68, 69, 및 70; SEQ ID NO: 78, 79, 및 80; SEQ ID NO: 88, 89, 및 90; SEQ ID NO: 98, 99, 및 100; SEQ ID NO: 108, 109, 및 110; SEQ ID NO: 118, 119, 및 120; 및 SEQ ID NO: 128, 129, 및 130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  29. 항체 또는 이의 단편의 VH는 SEQ ID NO: 8, 9, 및 10; SEQ ID NO: 18, 19, 및 20; SEQ ID NO: 28, 29, 및 30; SEQ ID NO: 38, 39, 및 40; SEQ ID NO: 48, 49, 및 50; SEQ ID NO: 58, 59, 및 60; SEQ ID NO: 68, 69, 및 70; SEQ ID NO: 78, 79, 및 80; SEQ ID NO: 88, 89, 및 90; SEQ ID NO: 98, 99, 및 100; SEQ ID NO: 108, 109, 및 110; SEQ ID NO: 118, 119, 및 120; 및 SEQ ID NO: 128, 129, 및 130으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  30. 항체 또는 이의 단편의 VL은 적어도 하나의 VL-CDR들에서 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 제외하고 SEQ ID NO: 13, 14, 및 15; SEQ ID NO: 23, 24, 및 25; SEQ ID NO: 33, 34, 및 35; SEQ ID NO: 43, 44, 및 45; SEQ ID NO: 53, 54, 및 55; SEQ ID NO: 63, 64, 및 65; SEQ ID NO: 73, 74, 및 75; SEQ ID NO: 83, 84, 및 85; SEQ ID NO: 93, 94, 및 95; SEQ ID NO: 103, 104, 및 105; SEQ ID NO: 113, 114, 및 115; SEQ ID NO: 123, 124, 및 125; 및 SEQ ID NO: 133, 134, 및 135로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 단편.
  31. 항체 또는 이의 단편의 VL은 SEQ ID NO: 13, 14, 및 15; SEQ ID NO: 23, 24, 및 25; SEQ ID NO: 33, 34, 및 35; SEQ ID NO: 43, 44, 및 45; SEQ ID NO: 53, 54, 및 55; SEQ ID NO: 63, 64, 및 65; SEQ ID NO: 73, 74, 및 75; SEQ ID NO: 83, 84, 및 85; SEQ ID NO: 93, 94, 및 95; SEQ ID NO: 103, 104, 및 105; SEQ ID NO: 113, 114, 및 115; SEQ ID NO: 123, 124, 및 125; 및 SEQ ID NO: 133, 134, 및 135로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함하는, DR6 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체 또는 이의 단편.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 VH 골격 영역은 5개 이하의 아미노산 치환을 제외하고 인간인, 단리된 항체 또는 단편.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 VL 골격 영역은 5개 이하의 아미노산 치환을 제외하고 인간인, 단리된 항체 또는 단편.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, DR6 폴리펩타이드의 선형 에피토프에 결합하는, 단리된 항체 또는 단편.
  35. 제1항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, DR6 폴리펩타이드인 경우 비선형 배좌(conformational) 에피토프에 결합하는, 단리된 항체 또는 단편.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 다가이고, 적어도 2개의 중쇄 및 적어도 2개의 경쇄를 포함하는, 단리된 항체 또는 단편.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 다중특이적인, 단리된 항체 또는 단편.
  38. 제37항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 이중특이적인, 단리된 항체 또는 단편.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 이중특이적인, 단리된 항체 또는 단편.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 있어서, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 그 기원이 쥣과인, 단리된 항체 또는 단편.
  41. 제40항에 있어서, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 1P1D6.3, 1P2F2.1, 및 1P5D10.2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모노클로날 항체로부터 유도되는, 단리된 항체 또는 단편.
  42. 제1항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 있어서, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 그 기원이 완전 인간인, 단리된 항체 또는 단편.
  43. 제42항에 있어서, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 M14-H06, M15-E10, M16-C07, M23-F10, 및 M80-B03 M50-H01, M51-H09, M53-E04, M53-F04, M62-B02, M63-E10, M66-B03, M67-G02, M72-F03, 및 M73-C04로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모노클로날 Fab 항체 단편으로부터 유도되는, 단리된 항체 또는 단편.
  44. 제1항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인간화된, 단리된 항체 또는 단편.
  45. 제1항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 있어서, 키메라인, 단리된 항체 또는 단편.
  46. 제1항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1급화된, 단리된 항체 또는 단편.
  47. 제1항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 있어서, 완전 인간인, 단리된 항체 또는 단편.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 하나의 항에 있어서, Fab 단편인, 단리된 항체 또는 단편.
  49. 제1항 내지 제47항 중 어느 하나의 항에 있어서, Fab' 단편인, 단리된 항체 또는 단편.
  50. 제1항 내지 제47항 중 어느 하나의 항에 있어서, F(ab)2 단편인, 단리된 항체 또는 단편.
  51. 제1항 내지 제47항 중 어느 하나의 항에 있어서, Fv 단편인, 단리된 항체 또는 단편.
  52. 제1항 내지 제47항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단일 사슬 항체인, 단리된 항체 또는 단편.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 폴리머에 콘쥬게이트된, 단리된 항체 또는 단편.
  54. 제53항에 있어서, 상기 폴리머는 폴리알킬렌 글리콜인, 단리된 항체 또는 단편.
  55. 제54항에 있어서, 상기 폴리알킬렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인, 단리된 항체 또는 단편.
  56. 제1항 내지 제49항 및 제52항 내지 제55항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인간 카파 불변 영역 및 인간 람다 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 불변 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 단편.
  57. 제1항 내지 제49항 및 제52항 내지 제55항 중 어느 하나의 항에 있어서, 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편을 포함하는, 단리된 항체 또는 단편.
  58. 제57항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편은 인간 IgG4, IgG4 agly, IgG1 및 IgG1 agly로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 단리된 항체 또는 단편.
  59. 제4항 내지 제58항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 참조 모노클로날 항체에 대한 해리상수 (KD) 미만의 KD를 특징으로 하는 친화도로 DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 또는 DR6 변이체 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는, 단리된 항체 또는 단편.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 하나의 항에 있어서, 5×10-2 M, 10-2 M, 5×10-3 M, 10-3 M, 5×10-4 M, 10-4 M, 5×10-5 M, 10-5 M, 5×10-6 M, 10-6 M, 5×10-7 M, 10-7 M, 5×10-8 M, 10-8 M, 5×10-9 M, 10-9 M, 5×10-10 M, 10-10 M, 5×10-11 M, 10-11 M, 5×10-12 M, 10-12 M, 5×10-13 M, 10-13 M, 5×10-14 M, 10-14 M, 5×10-15 M, 또는 10-15 M 이하의 해리상수 (KD)를 특징으로 하는 친화도로 DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 또는 DR6 변이체 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는, 단리된 항체 또는 단편.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 하나의 항에 있어서, 쥣과 DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 대해 인간 DR6 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 우선적으로 결합할 수 있는, 단리된 항체 또는 단편.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 하나의 항에 있어서, DR6의 p75에의 결합을 억제하는, 단리된 항체 또는 단편.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 하나의 항에 있어서, DR6의 APP에의 결합을 방지하지 못하는, 단리된 항체 또는 단편.
  64. 신경계 세포를 DR6 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 세포의 생존의 증진 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포이고, 상기 접촉은 치료적 유효량의 DR6 길항제를 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  66. 치료적 유효량의 DR6 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 신경계 세포의 사멸과 연관된 상태의 치료 방법.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 신경계 세포는 중추신경계 (CNS) 세포인 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 CNS 세포는 피질 뉴우런, 운동 뉴우런, 희돌기아교세포, 미세아교세포 및 성상세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법.
  69. 제64항 내지 제66항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 신경계 세포는 말초신경계 (PNS) 세포인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 PNS 세포는 뒤뿌리신경절 (DRG) 뉴우런 및 슈반(Schwann) 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법.
  71. 제64항 내지 제66항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 신경계 세포는 뉴우런인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 뉴우런은 피질 뉴우런, DRG 뉴우런 또는 운동 뉴우런인 방법.
  73. 제64항 내지 제66항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 신경계 세포는 아교세포인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 아교세포는 희돌기아교 전구 세포 (OPCs), 슈반(Schwann) 세포, 성상세포 및 미세아교세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법.
  75. 희돌기아교세포 또는 희돌기아교 전구 세포를 DR6 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 희돌기아교세포 증식, 분화 또는 생존의 증진 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포이고, 상기 접촉은 유효량의 DR6 길항제를 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  77. 치료적 유효량의 DR6 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 희돌기아교세포 사멸과 연관되거나 분화가 없는 상태의 치료 방법.
  78. 신경세포와 아교세포의 혼합물을 DR6 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 수초화의 증진 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 아교세포는 희돌기아교세포 또는 희돌기아교 전구 세포인 방법.
  80. 제78항에 있어서 상기 아교세포는 슈반(Schwann) 세포인 방법.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 신경세포 및 상기 아교세포는 포유동물 세포이고, 상기 접촉은 유효량의 DR6 길항제를 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  82. 치료적 유효량의 DR6 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 수초형성부전 또는 탈수초화와 연관된 상태의 치료 방법.
  83. DR6의 p75에의 결합이 억제되는 조건 하에서 DR6 폴리펩타이드 및/또는 p75 폴리펩타이드를 DR6 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, DR6의 p75에의 결합의 억제 방법.
  84. 제64항 내지 제83항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 DR6 길항제는 가용성 DR6 폴리펩타이드인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 가용성 DR6 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 DR6 영역을 포함하는 방법:
    (ⅰ) DR6 TNFR 같은 시스테인 풍부 도메인 또는 단편, 이의 변이체 또는 유도체,
    (ⅱ) DR6 세포외 도메인 또는 단편, 이의 변이체 또는 유도체,
    (ⅲ) DR6 세포질 도메인 또는 단편, 이의 변이체 또는 유도체,
    (ⅳ) DR6 막통과 도메인 또는 단편, 이의 변이체 또는 유도체,
    (ⅴ) DR6 사멸 도메인 또는 단편, 이의 변이체 또는 유도체, 및
    (ⅵ) (ⅰ) - (ⅴ)의 상기 DR6 도메인 또는 단편, 이의 변이체 또는 유도체 중 적어도 2개의 조합.
  86. 제84항에 있어서, 상기 가용성 DR6 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나 DR6 영역이 없는 방법:
    (ⅰ) DR6 TNFR 같은 시스테인 풍부 도메인,
    (ⅱ) DR6 세포외 도메인,
    (ⅲ) DR6 세포질 도메인,
    (ⅳ) DR6 막통과 도메인,
    (ⅴ) DR6 사멸 도메인, 및
    (ⅵ) (ⅰ) - (ⅴ)의 상기 DR6 도메인 중 적어도 2개의 조합.
  87. 제84항에 있어서, 상기 가용성 DR6 폴리펩타이드는 DR6 막통과 도메인 및 DR6 세포질 도메인이 없는 방법.
  88. 제84항에 있어서, 상기 가용성 DR6 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드 단편을 포함하는 방법:
    (ⅰ) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 - 40;
    (ⅱ) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 - 64;
    (ⅲ) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 - 105;
    (ⅳ) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 - 145;
    (ⅴ) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 - 185;
    (ⅵ) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 - 212;
    (ⅶ) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 - 349;
    (ⅷ) SEQ ID NO:2의 아미노산 42 - 64;
    (ⅸ) SEQ ID NO:2의 아미노산 42 - 105;
    (ⅹ) SEQ ID NO:2의 아미노산 42 - 145;
    (xi) SEQ ID NO:2의 아미노산 42 - 185;
    (xⅱ) SEQ ID NO:2의 아미노산 42 - 212;
    (xⅲ) SEQ ID NO:2의 아미노산 42 - 349;
    (xⅳ) SEQ ID NO:2의 아미노산 65 - 212;
    (xⅴ) SEQ ID NO:2의 아미노산 65 - 349;
    (xⅵ) SEQ ID NO:2의 아미노산 65 - 105;
    (xⅶ) SEQ ID NO:2의 아미노산 106 - 145;
    (xⅷ) SEQ ID NO:2의 아미노산 146 - 185;
    (xⅸ) SEQ ID NO:2의 아미노산 186 - 212;
    (xx) SEQ ID NO:2의 아미노산 106 - 212;
    (xxi) SEQ ID NO:2의 아미노산 106 - 349;
    (xxⅱ) SEQ ID NO:2의 아미노산 146 - 212;
    (xxⅲ) SEQ ID NO:2의 아미노산 146 - 349;
    (xxⅳ) SEQ ID NO:2의 아미노산 213 - 349;
    (xxⅴ) 임의의 상기 폴리펩타이드 단편의 변이체 또는 유도체; 및
    (xxⅵ) 임의의 상기 폴리펩타이드 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 중 적어도 2개의 조합.
  89. 제84항에 있어서, 상기 가용성 DR6 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 - 349 또는 아미노산 41 - 349 또는 아미노산 42 - 349를 포함하는 방법.
  90. 제84항 내지 제89항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 가용성 DR6 폴리펩타이드는 DR6 TNFR 같은 시스테인 풍부 모티프 또는 단편, 이의 변이체 또는 유도체를 포함하는 방법.
  91. 제84항 내지 제90항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 가용성 DR6 폴리펩타이드는 비-DR6 잔기를 추가로 포함하는 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 비-DR6 잔기는 상기 가용성 DR6 폴리펩타이드에 융합된 이종 폴리펩타이드인 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 이종 폴리펩타이드는 면역글루불린 단편, 혈청 알부민, 표적 단백질, 리포터(reporter) 단백질, 및 정제용이 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 이종 폴리펩타이드는 면역글루불린 단편인 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 면역글루불린 단편은 힌지(hinge) 및 Fc 영역을 포함하는 방법.
  96. 제91항 내지 제95항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 가용성 DR6 폴리펩타이드는 폴리머에 콘쥬게이트되는 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 폴리머는 폴리알킬렌 글리콜, 당(sugar) 폴리머, 및 폴리펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 폴리머는 폴리알킬렌 글리콜인 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 폴리알킬렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 가용성 DR6 폴리펩타이드는 1, 2, 3 또는 4개의 폴리머에 콘쥬게이트되는 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 폴리머의 총 분자량은 5,000 Da - 100,000 Da인 방법.
  102. 제64항 내지 제83항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 DR6 길항제는 DR6 항체, 또는 이의 단편을 포함하는 방법.
  103. 제102항에 있어서, 상기 DR6 항체, 또는 이의 단편은 제1항 내지 제63항 중 어느 하나의 항의 항체 또는 이의 단편인 방법.
  104. 제102항에 있어서, 상기 DR6 항체 또는 이의 단편은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드 단편으로 본질적으로 이루어진 에피토프에 특이적으로 결합하는 방법:
    (ⅰ) SEQ ID NO:2의 아미노산 65 - 105;
    (ⅱ) SEQ ID NO:2의 아미노산 106 - 145;
    (ⅲ) SEQ ID NO:2의 아미노산 146 - 185;
    (ⅳ) SEQ ID NO:2의 아미노산 186 - 212;
    (ⅴ) SEQ ID NO:2의 아미노산 65 - 145;
    (ⅵ) SEQ ID NO:2의 아미노산 65 - 185;
    (ⅶ) SEQ ID NO:2의 아미노산 65 - 212;
    (ⅷ) SEQ ID NO:2의 아미노산 106 - 185;
    (ⅸ) SEQ ID NO:2의 아미노산 106 - 212;
    (ⅹ) SEQ ID NO:2의 아미노산 134-189;
    (xi) SEQ ID NO:2의 아미노산 134-168;
    (xⅱ) SEQ ID NO:2의 아미노산 168-189;
    (xⅲ) SEQ ID NO:2의 아미노산 146 - 212;
    (xⅳ) 임의의 상기 폴리펩타이드 단편의 변이체 또는 유도체; 및
    (xⅴ) 임의의 상기 폴리펩타이드 단편 또는 이의 변이체 또는 유도체 중 2개 이상의 조합.
  105. 제64항 내지 제83항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 DR6 길항제는 DR6 길항제 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  106. 제105항에 있어서, 상기 DR6 길항제 폴리뉴클레오티드는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법:
    (ⅰ) 안티센스 폴리뉴클레오티드;
    (ⅱ) 리보자임;
    (ⅲ) 짧은 간섭 RNA (siRNA); 및
    (ⅳ) 짧은 헤어핀 RNA (shRNA).
  107. 제106항에 있어서, 상기 DR6 길항제 폴리뉴클레오티드는 DR6 mRNA에 대해 상보적인 적어도 10개의 염기를 포함하는 안티센스 폴리뉴클레오티드인 방법.
  108. 제107항에 있어서, 상기 DR6 길항제 폴리뉴클레오티드는 리보자임인 방법.
  109. 제105항에 있어서, 상기 DR6 길항제 폴리뉴클레오티드는 siRNA인 방법.
  110. 제109항에 있어서, 상기 siRNA는 AGAAACGGCUCCUUUAUUA (SEQ ID NO:160), GGAAGGACAUCUAUCAGUU (SEQ ID NO:161), GGCCGAUGAUUGAGAGAUU (SEQ ID NO:162), GCAGUUGGAAACAGACAAA (SEQ ID NO:163)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 방법.
  111. 제106항에 있어서, 상기 DR6 길항제 폴리뉴클레오티드는 shRNA인 방법.
  112. 제64항 내지 제83항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 LINGO-1 길항제는 압타머(aptamer)인 방법.
  113. 제64항, 제65항, 제67항 내지 제76항 또는 제78항 내지 제83항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 접촉은 (a) 발현 조절 서열과의 작동가능 연관을 통해 상기 DR6 길항제를 암호화하는 상기 세포 폴리뉴클레오티드에 도입하고, (b) 상기 DR6 길항제를 발현시키는 것을 포함하는 방법.
  114. 제113항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법에 의해 상기 세포에 도입되는 방법:
    (a) 트랜스펙션(transfection);
    (b) 전기천공;
    (c) 형질도입; 및
    (d) 직접 현미주사(microinjection).
  115. 제113항 또는 제114항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터로서 투여되는 방법.
  116. 제115항에 있어서, 상기 발현 벡터는 바이러스 벡터인 방법.
  117. 제116항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 엔테로바이러스 벡터, 페스티바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 및 파보바이러스 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법.
  118. 제117항에 있어서, 상기 헤르페스바이러스 벡터는 단순 포진 바이러스 벡터 및 엡스타인바 (Epstein Barr) 바이러스 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법.
  119. 제117항에 있어서, 상기 폭스바이러스 벡터는 우두(vaccinia) 바이러스 벡터인 방법.
  120. 제117항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터는 pLL3.7인 방법.
  121. 제117항에 있어서, 상기 파보바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스 (AAV) 벡터인 방법.
  122. 제66항 내지 제74항, 제77항, 제81항 또는 제82항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 DR6 길항제는 국부 투여, 안내 투여, 유리체내(intravitreal) 투여, 비경구 투여, 수막강내(intrathecal) 투여, 경막(subdural) 투여, 피하 투여로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로에 의해 또는 캡슐 임플란트를 통해 투여되는 방법.
  123. 제65항, 제76항, 또는 제81항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 포유동물은 중추신경계 세포의 사멸과 연관된 상태로 진단되었거나 그 상태를 갖는 것으로 의심되는 방법.
  124. 제66항 또는 제123항에 있어서, 상기 상태는 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, 운동 뉴우런 질환 (예, 근위축성 측삭경화증), 다발성 경화증, 외상성 신경증 및 뇌 허혈 (예, 뇌졸중)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법.
  125. 제66항에 있어서, 상기 세포는 슈반 세포이고, 상태는 신경병증 통증인 방법.
  126. 제81항에 있어서, 상기 포유동물은 신경병증 통증으로 진단되었거나 그 통증을 갖는 것으로 의심되는 방법.
  127. 제82항에 있어서, 상기 상태는 신경병증 통증인 방법.
  128. 제64항 내지 제127항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 DR6 길항제는 p75 길항제와 조합하여 사용되는 방법.
  129. 제128항에 있어서, 상기 DR6 길항제 및 p75 길항제가 동시에 사용되는 방법.
  130. 제128항에 있어서, 상기 DR6 길항제 및 p75 길항제가 순차로 사용되는 방법.
  131. DR6의 p75에의 결합이 억제되는 조건 하에서 p75 폴리펩타이드 또는 DR6 폴리펩타이드를 p75 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, DR6의 p75에의 결합의 억제 방법.
  132. 제131항에 있어서, 상기 p75 길항제는 (ⅰ) p75 길항제 화합물; (ⅱ) p75 길항제 폴리펩타이드; (ⅲ) p75 길항제 항체 또는 이의 단편; (ⅳ) p75 길항제 폴리뉴클레오티드; (ⅴ) p75 압타머; 및 (ⅵ) 상기 p75 길항제 중 2개 이상의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법.

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