CN1972707B

CN1972707B - 涉及脱髓鞘的疾病的治疗

Info

Publication number: CN1972707B
Application number: CN200580020998.0A
Authority: CN
Inventors: 米莎; R·布莱克·佩平斯凯; 约翰·麦克科伊
Original assignee: Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Than Ao Gen MA company
Priority date: 2004-06-24
Filing date: 2005-06-24
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2025-06-24
Also published as: SI1776136T1; CN1972707A

Abstract

本发明提供了通过给予Sp35拮抗剂治疗涉及脱髓鞘以及髓鞘功能不良的疾病、失调或损伤(包括多发性硬化)的方法。

Description

涉及脱髓鞘的疾病的治疗

技术领域

本发明涉及神经生物学、神经病学以及药理学。更具体的，本发明涉及通过给予Sp35拮抗剂来治疗脱髓鞘(demyelination)以及髓鞘功能不良(髓鞘形成障碍，dysmyelination)的疾病如多发性硬化症的方法。

背景技术

神经系统的许多疾病与脱髓鞘以及髓鞘功能不良相关，包括多发性硬化症(MS)、进行性多发性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、桥脑中央髓鞘溶解症(CPM)、Wallerian变性以及某些遗传性疾病例如脑自质肾上腺萎缩症、亚历山大病(Alexander’s disease)和Pelizaeus-Merzbacher病(PMZ)。在这些病症中，MS是最广泛的，影响全世界大约250万人。

MS开始时通常为复发缓和型的神经系统病变，随后发展为神经损害加重的慢性阶段。MS与局限于慢性损伤的髓鞘质、少突胶质细胞以及轴突的破坏相关。在MS中观察到的脱髓鞘并不总是永久性的，在该疾病的早期阶段也曾有髓鞘再生(再髓鞘化，remyelination)的记载。神经元的髓鞘再生需要少突胶质细胞。

对于MS，可获得各种疾病调节性治疗，包括使用皮质激素以及免疫调节剂如干扰素β。另外，由于少突胶质细胞和髓鞘形成在 MS中的中心作用，所以人们一直在努力开发一些疗法以增加少突胶质细胞的数量或增进髓鞘形成。参见例如Cohen等的美国专利第5,574,009号；Chang et al.，N.Engl.J.Med.346：165-73(2002).然而，现在仍然急需创造设计对于MS的其它疗法。

发明内容

本发明是基于这样的发现：即Sp35(在文献中，Sp35也被称为LINGO-1以及LRRN6)在少突胶质细胞中表达并且负向调节少突胶质细胞分化、存活以及轴突髓鞘形成。此外，Sp35的某些拮抗剂促进少突胶质细胞的存活、增生和分化以及神经元的髓鞘形成。基于这些发现，本发明总体上涉及通过给予Sp35拮抗剂来治疗与脱髓鞘或髓鞘功能不良相关的病症(例如多发性硬化症)的方法。

在某些具体实施方式中，本发明包括用于促进哺乳动物中少突胶质细胞增生、分化以及存活的方法，包括给予治疗有效量的Sp35拮抗剂。

在其它具体实施方式中，本发明包括用于促进哺乳动物中神经元的髓鞘形成的方法，包括给予治疗有效量的Sp35拮抗剂。在某些具体实施方式中，哺乳动物已经被诊断患有涉及脱髓鞘和髓鞘功能不良的疾病、失调、损伤或病症。在某些具体实施方式中，疾病、失调、损伤或病症选自由多发性硬化症(MS)、进行性多发性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、桥脑中央髓鞘溶解症(CPM)、脑白质肾上腺萎缩症、亚历山大病、Pelizaeus-Merzbacher病(PMZ)、球样细胞型脑白质营养不良(Krabbe氏病)、Wallerian变性、视神经炎、横贯性脊髓炎、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏症(Huntington’s disease)、Alzheimer病、帕金森病、脊髓损伤、创伤性脑损伤、放射后损伤、化疗的神经并发症、中风、急性缺血性视神经病变、维生素E缺乏、单纯维生素E缺乏综合征、AR、 Bassen-Kornzweig综合征、Marchiafava-Bignami综合征、异染性脑白质营养不良、三叉神经痛以及贝尔氏麻痹(Bell’s palsy)组成的组。

另外，本发明包括治疗哺乳动物中涉及破坏少突胶质细胞或髓鞘质的疾病、失调或损伤的方法，其包括(a)提供表达重组Sp35拮抗剂的培养宿主细胞；以及(b)将该宿主细胞在所述神经系统疾病、失调或损伤部位处或其附近导入哺乳动物。在部分具体实施方式中，所述疾病、失调或损伤选自由多发性硬化症(MS)、进行性多发性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、桥脑中央髓鞘溶解症(CPM)、脑白质肾上腺萎缩症、亚历山大病、Pelizaeus-Merzbacher病(PMZ)、球样细胞型脑白质营养不良(Krabbe氏病)以及Wallerian变性、视神经炎、横贯性脊髓炎、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏症、Alzheimer氏病、帕金森氏病、脊髓损伤、创伤性脑损伤、放射后损伤、化疗的神经并发症、中风、急性缺血性视神经病变、维生素E缺乏、单纯维生素E缺乏综合征、AR、Bassen-Kornzweig综合征、Marchiafava-Bignami综合征、异染性脑白质营养不良、三叉神经痛以及贝尔氏麻痹组成的组。在部分具体实施方式中，培养的宿主细胞来源于待治疗的哺乳动物。

本发明进一步的具体实施方式包括通过体内基因治疗来治疗涉及少突胶质细胞或髓鞘破坏的疾病、失调或损伤的方法，其包括在所述疾病、失调或损伤部位处或其附近向哺乳动物给予载体，其中该载体包含编码Sp35拮抗剂的核苷酸序列以使Sp35拮抗剂在哺乳动物中可从该核苷酸序列被表达，其量足以降低在损伤部位处或其附近的由神经元抑制的轴突延伸。在某些具体实施方式中，载体是病毒载体，其选自由腺病毒载体、甲病毒载体、肠道病毒载体、瘟疫病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、EBV载体(Epstein Barr Viral vector)、乳多空病毒载体、痘病毒载体、牛痘病毒载体以及单纯疱疹病毒载体组成的组。在部分具体实施方式中，疾病、失调或损伤选自由多发性硬化症(MS)、进行性多发性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、桥脑中央髓鞘溶解症(CPM)、脑白质肾上腺萎缩症、亚历山大病、Pelizaeus-Merzbacher病(PMZ)、球样细胞型脑白质营养不良(Krabbe氏病)以及Wallerian变性、视神经炎、横贯性脊髓炎、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏症、Alzheimer氏病、帕金森氏病、脊髓损伤、创伤性脑损伤、放射后损伤、化疗的神经并发症、中风、急性缺血性视神经病变、维生素E缺乏、单纯维生素E缺乏综合征、AR、Bassen-Kornzweig综合征、Marchiafava-Bignami综合征、异染性脑白质营养不良、三叉神经痛以及贝尔氏麻痹组成的组。在部分具体实施方式中，所述载体的给予途径选自由局部给予、眼内给予、非肠道给予、胸内(鞘膜内)给予、硬膜下给予以及皮下给予组成的组。

在上述方法的各种具体实施方式中，Sp35拮抗剂可以为干扰Sp35负向调节少突胶质细胞存活、增生和分化的能力以及神经髓鞘形成的能力的任何分子。在某些具体实施方式中，Sp35拮抗剂选自由可溶性Sp35多肽、Sp35抗体以及Sp35拮抗剂多核苷酸(例如RNA干扰)组成的组。

某些可溶性Sp35多肽包括但不限于缺乏跨膜结构域以及胞质结构域的Sp35多肽片段、变异体或其衍生物。可溶性Sp35多肽包括这样的多肽，其包括(i)Sp35富含亮氨酸重复(LRR)结构域，(ii)Sp35碱性区C-末端至LRR结构域，以及(iii)Sp35免疫球蛋白(Ig)结构域。在部分具体实施方式中，可溶性Sp35多肽缺乏Sp35Ig结构域、Sp35LRR结构域、跨膜结构域、以及胞质结构域。在部分具体实施方式中，可溶性Sp35多肽包含Sp35LRR结构域但缺乏Sp35Ig结构域、Sp35碱性区、跨膜结构域以及胞质结构域。在部分具体实施方式中，可溶性Sp35多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基34-532。

在部分具体实施方式中，Sp35拮抗剂通过推注(bolus injection)或慢性输注进行给予。在部分具体实施方式中，可溶性Sp35多肽直接被给予到中枢神经系统内。在部分具体实施方式中，可溶性Sp35多肽直接被给予到MS的慢性损伤中。

在部分具体实施方式中，Sp35拮抗剂是包含非Sp35部分的融合多肽。在部分具体实施方式中，非Sp35部分选自由抗体Ig部分、血清白蛋白部分、靶向部分、报道子部分以及促纯化部分组成的组。在部分具体实施方式中，抗体Ig部分是铰合部以及Fc部分。

在部分具体实施方式中，本发明的多肽和抗体轭合至聚合物。在部分具体实施方式中，该聚合物选自由聚亚烷基二醇、糖类聚合物以及多肽组成的组。在部分具体实施方式中，聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。在部分具体实施方式中，本发明的多肽和抗体轭合至1、2、3或4个聚合物上。在部分具体实施方式中，聚合物的总分子量为5,000Da～100,000Da。

附图说明

图1是全长人Sp35cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。

图2是全长人Sp35多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图3是编码全长小鼠Sp35多肽的序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：3)。

图4是全长小鼠Sp35多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

图5示出了Sp35(LINGO-1)在少突胶质细胞中表达。在P 13CG神经元(p13CGN)、少突胶质细胞以及星形胶质细胞培养物中的LINGO-1 mRNA表达的RT-PCR分析。分析了来自相同样品的GAPDH表达作为内对照。

图6A和6B示出了(A)来自RNAi感染的少突胶质细胞以及未感染的对照的Sp35mRNA表达的RT-PCR分析。β-肌动蛋白用作内部标准。(B)对在RNAi处理的培养物中的成熟少突胶质细胞进行定量。

图7示出了在不同形成阶段的少突胶质细胞中的Sp35(LINGO-1)mRNA表达。少突胶质细胞经诱导而分化，并且Sp35的定量通过RT-PCR完成。数据以GAPDH水平作为内部对照进行标准化。早期起源少突胶质细胞的(A2B5⁺)以及髓鞘形成前的少突胶质细胞(O4⁺)显示出Sp35mRNA的等同水平，但Sp35mRNA的水平在成熟少突胶质细胞(MBP⁺)中超过2倍。

图8示出了与用对照-Fc多肽处理相比，在用外源性LINGO-1-Fc处理后少突胶质细胞的剂量依赖性分化。通过将成熟少突胶质细胞(通过存在髓鞘片(myelin sheet)进行鉴定)的数量计算为全部O4⁺少突胶质细胞的百分比而对数据进行量化。对于每个样品，计数了约800个细胞。

图9示出了LINGO-1(Sp35)拮抗剂调节RhoA和Fyn。(A)当用蛋白质印迹法检测时，在用LINGO-1-Fc处理的少突胶质细胞中RhoA-GTP总数。(B)当用蛋白质印迹法检测时，在用慢病毒(携带FL-LINGO-1、DN-LINGO-1或对照质粒)感染的少突胶质细胞中的Fyn表达以及磷酸化(pFyn)，。

图10A示出了LINGO-1拮抗剂通过少突胶质细胞促进轴突髓鞘形成。对在用LINGO-1-Fc(10μg/ml)处理2周的共培养物中的髓鞘形成进行定量分析。对于每个样品，计数10个视野中的MBP⁺ 的染色的细胞。

图10B示出了用外源性LINGO-1-Fc和对照-Fc多肽处理四周的共培养物的蛋白质印迹，其中利用抗MBP抗体来检测MBP蛋白的存在。

图10C和10D示出了用LINGO-1-Fc(C)或对照-Fc(D)处理四周的共培养物的电镜分析。标明了郎维耶(Ranvier)结构的节点。刻度条，1.5μm。

图10E和10F示出了用FL-LINGO-1、DN-LINGO-1以及对照慢病毒感染两周的共培养物的髓鞘形成。通过免疫荧光计数MBP⁺ 细胞(E)。利用对血凝素标签的抗体对MBP和LINGO-1对来自用FL-LINGO-1、DN-LINGO-1以及对照慢病毒感染的培养物的蛋白质印迹进行分析(F)。

图10G示出了共培养物中的髓鞘形成，其中在共培养物中仅背根神经节细胞(DRG感染)或少突胶质细胞(oligo感染)或二者(均被感染)已感染FL-LINGO-1、DN-LINGO-1以及对照慢病毒。

图11A和B示出了电镜，其示出了在来自P1小鼠的LINGO-1剔除型(knockout)以及野生型脊髓中的髓鞘化轴突纤维的(A)直观分析和(B)定量分析。分析了四个脊髓；对每个样品，计数了来自十个视野的髓鞘化轴突纤维。示出的数据是来自所有测定的平均值。

图12示出了如本文所述，铜试剂(Cuprizone)处理的小鼠被手术地注入Sp35-Fc(LINGO-1-Fc)或对照多肽。接受Sp35-Fc处理的动物表现出增加的成熟少突胶质细胞存活(基于CC1抗体染色)。

图13示出了在用Sp35-Fc(LINGO-1-Fc)或对照的NGF撤走处理后18小时，分化的PC12细胞的隧道测定(TUNEL assay)。Sp35-Fc处理的细胞发生较少的凋亡。

图14示出了用Sp35-Fc(LINGO-1)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)抑制剂zVAD或对照多肽处理的培养基去除NGF后18小时，在失去营养支持的分化PC12细胞的凋亡。用对照多肽处理的细胞表现出最多的细胞死亡。

图15示出了用外源性LINGO-1-Ig-Fc、突变LINGO-1-Ig-Fc(在456位的精氨酸变为组氨酸)、LINGO-1-Fc以及对照-Fc多肽处理的共培养物的蛋白质印迹，其中利用抗MBP的抗体来检测MBP蛋白的存在。

图16-示出了4种共培养物的蛋白质印迹，其中如实施例6中所述，共培养物用外源性LINGO-1-Ig环肽以及突变的LINGO-1-Ig环肽处理，其中利用抗MBP的抗体检测MBP蛋白的存在。

具体实施方式

定义

除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。如有冲突，以包括该定义的本申请为准。除非上下文另有要求，单数术语将包括复数而复数术语将包括单数。将本文中提及的所有出版物、专利以及其它参考文献的全部内容结合于此供参考，如同每个单独出版物或专利申请被特定地或单个地指明被结合于此供参考一样。

尽管类似或等同于本文中所描述的方法和材料可以用于本发明的实施和检测，但下文描述了合适的一些方法和材料。这些材料、方法以及实施例是用于说明的目的而不用于限制本发明。本发明的其它特征或优点根据详细描述以及权利要求书将变得显而易见。

为了进一步限定本发明，提供了以下术语以及定义。

应该注意，术语“一个”实体指的是一个或多个该实体；例如，“一个免疫球蛋白分子”应理解为表示一个或多个免疫球蛋白分子。因而，术语“一个”、“一个或多个”以及“至少一个”在本文中可相互交换使用。

在整个说明书和权利要求书中，词语“包括(comprise)”或其变形表明包括任何列出的整体或整体的组但不排除任何其它整体或其它整体的组。

如在本文中使用的，“治疗有效量”指的是以必要的剂量和时间以有效达到期望的治疗结果的量。治疗结果可以是例如症状的减轻、延长的存活、改善的活动性等。治疗结果不一定是“治愈”。

如在本文中使用的，“预防有效量”指的是以必要的剂量和时间以有效达到期望的预防结果的量。通常，由于预防剂量用于在疾病前或在其较早阶段的患者，所以预防有效量少于治疗有效量。

如在本文中使用的，“多核苷酸”可含有全长cDNA序列的核苷酸序列，包括未翻译的5’和3’序列、编码序列以及核酸序列的片段、抗原决定基(表位，epitope)、结构域以及变异体。多核苷酸可以由任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸构成，其可以为未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可以由单链和双链DNA、为单链和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA、为单链和双链区的混合物的RNA、包括DNA和RNA(其可以为单链或更典型的为双链或单链与双链区的混合物)的杂交分子构成。另外，多核苷酸可以由包含RNA或DNA或者包括二者的三链区域构成。多核苷酸还可以包括一个或多个修饰的碱基或者包括用于稳定性或其它原因被修饰的DNA或RNA主链。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基以及不常见的碱基例如肌苷。对DNA和RNA可以作各种各样的修饰；因此“多核苷酸”涵盖化学、酶促或代谢地进行修饰的形式。

在本发明中，多肽可以由彼此之间通过肽键或修饰的肽键相连的氨基酸构成，即肽同构体，并且可以含有除了20个基因编码的氨基酸之外的氨基酸(例如非天然存在的氨基酸)。本发明的多肽可以通过天然方法如翻译后加工，或通过本领域熟知的化学修饰技术加以修饰。这样的修饰在教科书、较详尽的专题著作以及大量的研究文献中均有详尽描述。修饰可以发生在多肽的任何位置，包括肽主链、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。应该理解，在给定多肽的若干位点处，同种类型的修饰可以以相同或不同的程度存在。同样，给定多肽可以含有多种类型的修饰。例如由于泛素化的多肽可以是支链的，并且多肽还可以是环状的，具有或不具有支链。环状、支化或支化环状多肽可以由翻译后天然方法或者可以通过合成方法形成。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂或脂衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐(酯)的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚形体形成、羟基化、碘化、甲基化、十四烷酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、消旋作用、硒化(selenylation)、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸加成到蛋白质上如精氨酸化以及泛素化。(参见例如Proteins-Structure And MolecularProperties，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pgs.1-12(1983)；Seifter et al.，MethEnzymol 182：626-646(1990)；Rattan et al.，Ann NY Acad Sci 663：48-62(1992).)

当提及本发明的Sp35拮抗剂时，术语“片段”、“变异体”、“衍生物”以及“类似物”包括任何保留至少部分抑制Sp35活性的能力的拮抗剂分子。如本文中描述的，Sp35拮抗剂可以包括但不限于其片段、变异体或衍生物分子，只要Sp35拮抗剂仍然发挥其功能。本发明的可溶性Sp35多肽可以包括Sp35的蛋白水解片段、缺失片段，尤其是当递送至动物时更易于到达作用位点的那些片段。多肽片段进一步包括多肽的任何部分，其包含天然多肽的抗原决定基或免疫原决定基，包括线性以及三维抗原决定基。本发明的可溶性Sp35多肽可以包括变异性Sp35区域，包括如上所述的片段，并且还包括具有由于氨基酸替代、缺失或插入而导致改变的氨基酸序列的多肽。变异体可以天然存在，例如等位基因变异体。通过“等位基因变异体”表示占据生物体染色体上给定位点的可替换形式的基因。Genes II，Lewin，B.，ed.，John Wiley & Sons，New York(1985)。非天然存在的变异体可通过本领域已知的致突变技术来生成。可溶性Sp35多肽可以包括保守或非保守的氨基酸替代、缺失或加成。本发明的Sp35拮抗剂还可以包括衍生分子。例如，本发明的可溶性Sp35多肽可以包括已被改变的Sp35区域，以便显示出在天然多肽中不存在的其它特征。实例包括融合蛋白以及蛋白轭合物。

在本发明中，“多肽片段”指的是Sp35多肽的较短氨基酸序列。蛋白片段可以为“游离的”或者包含在较大多肽(其片段形成一部分区域)之内。本发明多肽片段的代表性实例包括，例如包含约5个氨基酸的片段、约10个氨基酸的片段、约15个氨基酸的片段、约20个氨基酸的片段、约30个氨基酸的片段、约40个氨基酸的片段、约50个氨基酸的片段、约60个氨基酸的片段、约70个氨基酸的片段、约80个氨基酸的片段、约90个氨基酸的片段、以及约100个氨基酸的片段。

抗体或免疫球蛋白。在一个具体实施方式中，用于本文披露的治疗方法中的Sp35拮抗剂是“抗体”或“免疫球蛋白”分子或其免疫特异性片段，例如天然存在的抗体或免疫球蛋白分子或者设计的抗体分子或以类似于抗体分子的方式结合抗原的片段。本文中术语“抗体”和“免疫球蛋白”可互换使用。抗体或免疫球蛋白包括至少重链的可变结构域，并且通常包括至少重链和轻链的可变结构域。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构相对良好被理解，参见例如Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring HarboLaboratory Press，2nd ed.1988).

如将在下文中更详细讨论的，术语“免疫球蛋白”包括在生化上可区分的5大类多肽。很清楚，所有这5类均在本发明的范围内，下面的讨论一般涉及IgG类免疫球蛋白分子。至于IgG，一种标准免疫球蛋白分子包括两条相同的分子量约23,000道尔顿的轻链多肽，以及两条相同的分子量53,000-70,000道尔顿的重链多肽。这四条链通常通过二硫键相互连接成“Y”构型，其中轻链托住重链，其从“Y”的口开始并延续通过可变区。

轻链和重链均被分成结构同源性区和功能性同源性区。术语“不变(稳定)的”以及“可变的”是功能上的使用。在这点上，应当理解，轻链(V_L)和重链(V_H)部分的可变结构域确定抗原识别和特异性。相反，轻链(C_L)和重链(C_H1、C_H2、或C_H3)的不变结构域赋予重要的生物学性能如分泌、经胎盘的活动性(transplacentalmobility)、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，当恒定区结构域距抗体的抗原结合位点或氨基-末端越远，则其编号越大。N-末端部分是可变区而C-末端是恒定区；C_H3和C_L结构域实际上分别包括重链和轻链的羧基末端。

轻链分为κ或λ两类。每个重链可以与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链以共价键彼此结合，当免疫球蛋白由杂种细胞、B细胞或遗传设计的宿主细胞生成时，两条重链的“尾”部通过共价二硫键或非共价键彼此结合。在重链中，氨基酸序列从在Y构型的叉状末端处的N-末端延伸至每条链底部的C-末端。本领域的技术人员将理解，重链分为γ、μ、α、δ或ε，其中可以分一些亚类(例如γ1-γ4)。正是重链的性质决定抗体的“类别”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁ 等被良好地表征并且已知赋予功能特化。根据本披露，对于技术人员来说这些种类以及同种型中的每一种的修饰型均易于分辨，因此属于本发明的范围。

如上面指出的，可变区使得抗体选择性地识别并特异性地结合抗原上的抗原决定基，也就是说，抗体的V_L结构域和V_H结构域结合形成可变区，其限定三维抗原结合位点。这种四级抗体结构形成的存在于所述Y的每条臂的末端处的抗原结合位点。更具体的，抗原结合位点由在每条V_H和V_L链上的三个互补决定区(CDR)限定。在部分情形下，例如起源于骆驼种系(camelid)种或基于骆驼种系免疫球蛋白设计的某些免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以仅由重链组成，而没有轻链。参见例如Hamers-Casterman et al.，Nature 363：446-448(1993).

在天然存在的抗体中，存在于每个抗原结合结构域的6个“互补性决定区”或“CDR”是较短而非连续性的氨基酸序列，其当抗体在水性环境中呈现其三维结构时被特异性放置以形成抗原结合结构域。在抗原结合结构域中的氨基酸的剩余部分称为“构架(framework)”区，显示出较少的分子间可变性。构架区很大程度上采用β-片构型；并且CDR形成环，其连接β-片结构，在某些情况下可形成β-片结构的一部分。因此，构架区用来形成支架结构(scaffold)，其提供用于通过链间非共价相互作用以正确方向定位CDR。由定位的CDR形成的抗原结合结构域限定互补于在免疫反应性抗原上的抗原决定基的表面。这种互补性表面促进抗体非共价结合于其同源抗原决定基(cognate epitope)。对于任何给定的重链或轻链可变区，分别包括CDR和所述构架区的氨基酸可以很容易由本领域的普通技术人员鉴定，这是因为其已经被精确定义(参见″Sequences ofProteins of Immunological Interest，″Kabat，E.，et al.，U.S.Department ofHealth and Human Services，(1983)；and Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987)，which are incorporated herein by reference in theirentireties).

然而在camelid种中，重链可变区(称为V_HH)形成整个CDR。Camelid V_HH可变区与起源于传统抗体(V_H)的那些可变区之间的主要差异包括(a)与V_HH中的相应区域相比，在V_H的轻链接触表面中含有更多的疏水性氨基酸，(b)在V_HH中CDR3较长，以及(c)V_HH中在CDR1与CDR3之间频繁形成二硫键。

在一个具体实施方式中，本发明的抗原结合分子包括抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一个具体实施方式中，本发明的抗原结合分子包括来自一个或多个抗体分子的至少两个CDR。在另一个具体实施方式中，本发明的抗原结合分子包括来自一个或多个抗体分子的至少三个CDR。在另一个具体实施方式中，本发明的抗原结合分子包括来自一个或多个抗体分子的至少四个CDR。在另一个具体实施方式中，本发明的抗原结合分子包括来自一个或多个抗体分子的至少五个CDR。在另一个具体实施方式中，本发明的抗原结合分子包括来自一个或多个抗体分子的至少六个CDR。包括至少一个可被包含于主体抗原结合分子的CDR的示例性抗体分子在本领域中是已知的，并且本文中描述了示例性分子。

用于本发明所述方法的抗体或其免疫特异性片段包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化(humanized)、灵长类化或嵌合抗体、单链抗体、抗原决定基结合片段例如Fab、Fab’以及F(ab’)2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包括V_L或V_H结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段、以及抗个体基因型(anti-Id)抗体(包括例如对本文中披露的结合分子的anti-Id抗体)。scFv分子在本领域中已知，并且描述在例如美国专利第5,892,019号中。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以为免疫球蛋白分子的任何型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA以及IgY)、类(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁以及IgA₂)或亚类。

抗体片段(包括单链抗体)可以只包括可变区或者包括连同有以下的全部或部分：铰链区(hinge region)、C_H1、C_H2以及C_H3结构域。同样包括在本发明中的是抗原结合片段(同样包括可变区与铰链区、C_H1、C_H2以及C_H3结构域的任何组合)。用于本文中披露的诊断和治疗方法的抗体或其免疫特异性片段可以来自于任何来源，其包括鸟类和哺乳动物。优选地，该抗体是人、鼠、驴、兔、羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马、或鸡抗体。在另一个具体实施方式中，可变区可以为来源(例如来自于鲨鱼)中的condricthoid。如在本文中使用的，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体以及包括从人免疫球蛋白文库或从转了一种或多种人免疫球蛋白并且不表达内源性免疫球蛋白的转基因动物中分离的抗体，如下文以及例如Kucherlapati等的美国专利第5,939,598号所描述的。

如在本文中使用的，术语“重链部分”包括来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包括下列中的至少一个：C_H1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、C_H2结构域、C_H3结构域或其变异体或片段。例如，用于本发明的结合多肽可以包括含有C_H1结构域的多肽链；含有C_H1结构域、铰链结构域的至少一部分以及C_H2结构域的多肽链；含有C_H1结构域以及C_H3结构域的多肽链；含有C_H1结构域、铰链结构域的至少一部分以及C_H3结构域的多肽链；或者含有C_H1结构域、铰链结构域的至少一部分、C_H2结构域以及C_H3结构域的多肽链。在另一个具体实施方式中，本发明的多肽包括含有C_H3结构域的多肽链。另外，用于本发明的结合多肽可以缺乏C_H2结构域的至少一部分(例如C_H2结构域的全部或部分)；如上面所阐明的，本领域的普通技术人员应当理解，这些结构域(例如重链部分)可以被修饰以使其在来自天然存在的免疫球蛋白分子的氨基酸序列中发生变化。

在用于本文披露的治疗方法的某些Sp35拮抗剂抗体或其免疫特异性片段中，聚合物的一条多肽链的重链部分与在聚合物的另一条多肽链上的重链部分相同。可替换地，用于本发明方法的含重链部分的单体不是相同的。例如，每个单体可以包括不同的靶结合位点，形成例如双特异性抗体。

用于本文披露的诊断和治疗方法的结合多肽的重链部分可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可以包含来源于IgG₁分子的C_H1结构域以及来源于IgG₃分子的铰链区。在另一个实施例中，重链部分可包括(部分)来源于IgG₁分子、以及(部分)来源于IgG₃分子的铰链区。在另一个实施例中，重链部分可包括(部分)来源于IgG₁分子以及(部分)来源于IgG₄分子的嵌合铰链区。

如在本文中使用的，术语“轻链部分”包括来源于免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选地，轻链部分包括V_L或C_L结构域中的至少一个。

编码来源于免疫球蛋白(例如免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的多肽非天然变异体的孤立(isolated)核酸分子可通过将一个或多个核苷酸替代、加成或缺失引入该免疫球蛋白的核苷酸序列中以便将一个或多个氨基酸替代、加成或缺失导入该编码的蛋白中加以形成。突变可以通过标准技术导入，如点定向突变以及PCR介导的致突变。优选地，在一个或多个非必需氨基酸残基处形成保守性氨基酸替代。

用于本文披露的治疗方法的抗体或其免疫特异性片段还可根据其对本发明的多肽的亲合性进行描述或说明。优选的结合亲合力包括这样的亲合力，其解离常数小于5x10^-2M，10^-2M，5×10^-3M，10^-3M，5×10^-4M，10^-4M，5×10^-5M，10^-5M，5×10^-6M，10^-6M，5×10^-7M，10^-7M，5×10^-8M，10^-8M，5×10^-9M，10^-9M，5×10^-10M，10^-10M，5×10^-11M，10^-11M，5×10^-12M，10^-12M，5×10^-13M，10^-13 M，5×10^-14M，10^-14M，5×10^-15M，or10^-15M。

用于本文披露的治疗方法的抗体或其免疫特异性片段用作本文描述的Sp35的拮抗剂。例如，用于本发明的方法的抗体可起拮抗剂的作用，阻断或抑制Sp35多肽的压制活性。

如在本文中使用的，术语“嵌合抗体”的意思是指任何抗体，其中免疫反应区或位点获自或来源于第一物种，而恒定区(其可以为完整、部分或根据本发明修饰的)获自第二物种。在优选具体实施方式中，该靶结合区或位点来自于非人类来源(例如小鼠或灵长类)而恒定区来源于人。

如在本文中使用的，术语“设计的抗体”指这样的抗体，其中在重链或轻链或二者中的可变区通过一个或多个CDR(来自已知特异性的抗体)的至少部分替换以及(如有必要)通过部分构架区替换和序列变化加以改变。尽管CDR可以来源于与构架区起源的抗体同类或者甚至亚类的抗体，但是可以想象，CDR来源于不同种类的抗体，并且优选来源于不同物种的抗体。其中来自已知特异性的非人类抗体的一个或多个“供体”CDR被接枝到人重链或轻链构架区中的设计抗体，在本文中被称为“人源化抗体”。可以无需用来自供体可变区的完整CDR来替换该CDR的全部以将一个可变结构域的抗原结合能力转移到另一个可变结构域。相反，可以只需要转移那些对于保持靶结合位点的活性所必需的残基。在例如美国专利第5,585,089、5,693,761、5,693,762/以及6,180,370号中给出了解释，其应该在本领域技术人员能力范围，通过实施常规实验或者通过试错法试验来获得功能设计或人源化抗体。

如在本文中使用的，术语“键接的”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语指的是无论通过哪种方法(包括化学轭合或重组方法)将两个或多个元件或组分结合在一起。“符合读框的融合(框内融合，in-frame fusion)”指的是两个或多个开放读框(ORF)，以保持初始ORF的正确读框的方式结合而形成一个连续的更长的ORF。因此，得到的重组融合蛋白是含有两个或多个片段的单个蛋白，其中所述片段对应于由初始ORF(其片段不是如天然中正常结合的)编码的多肽。尽管这样可使读框在整个融合片段变得连续，但该片段可通过例如符合读框的连接子序列被物理或空间地分开。

在多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”是多肽中在氨基至羧基末端方向的氨基酸顺序，其中在序列中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中是连续的。

如在本文中使用的术语“表达”指的是一个过程，通过该过程基因产生生物化学的例如RNA或多肽。该过程包括细胞内功能性存在的基因的任何表现形式，包括但不限于基因击倒(knockdown)以及瞬时表达和稳定表达。其包括但不限于将该基因转录到信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或者任何其它RNA产物中以及将这样的mRNA翻译成多肽。如果最终期望的产物是生物化学的，则表达包括生物化学前体以及任何前体的形成。

用“受试者”或“个体”或“动物”或“病人”或“哺乳动物”指代任何受试者，特别是希望对其作出诊断、预诊断或治疗的哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于人、家养动物、农场动物、动物园动物、观赏动物、宠物动物如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、公牛、母牛；灵长类如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物如狗和狼；猫科动物如猫、狮和虎；马科动物如马、驴和斑马；食用动物如母牛、猪以及绵羊；有蹄动物如鹿和长颈鹿；啮齿类动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠等等。在某些具体实施方式中，所述哺乳动物是人受试者。

术语“RNA干扰”或“RNAi”指的是压制或减少通过siRNA的基因表达。其是动物和植物中序列特异性的转录后基因压制过程，其由双链区与该压制的基因的序列同源的siRNA启动。所述基因对于生物体可以是内源或外源性的，存在于并入的染色体中或存在于未并入的基因组的转染载体中。该基因的表达被完全或部分抑制。RNAi也被认为抑制靶RNA的功能；靶RNA的功能可以是完全或部分的。

Sp35(LINGO-1/LRRN6)

本发明基于这样的发现：即Sp35的拮抗剂通过促进少突胶质细胞的存活、增生和分化而增加其数量。另外，发明人已发现Sp35的拮抗剂促进神经元的髓鞘形成。在不打算受限于理论的情况下，好像由Sp35拮抗剂产生的促髓鞘形成活性与对少突胶质细胞增生的效应是分开的。

天然存在的人Sp35是糖基化的神经系统特异性蛋白，其由614个氨基酸组成(图1；SEQ ID NO：2)。人Sp35多肽含有LRR结构域，其由14个富亮氨酸重复(包括N-和C-末端帽)、Ig结构域、跨膜区以及胞质结构域组成(图2)。胞质内结构域含有正则酪氨酸磷酸化位点。另外，天然存在的Sp35蛋白含有信号序列、在LRRCT与Ig结构域之间的短碱性区、以及在Ig结构域与胞质结构域之间的跨膜区(图2)。人Sp35基因含有选择性的翻译起始密码子，以使6个另外的氨基酸(MQVSKR；SEQ ID NO：5)可以存在或不存在于Sp35信号序列的N-末端。基于图1中的序列，根据氨基酸残基数，表1列出了Sp35结构域以及其它区域。

表1

结构域或区	起始残基	终端残基
			信号序列	1	33或35
LRRNT	34或36	64
			LRR	66	89
LRR	90	113
			LRR	114	137
LRR	138	161
			LRR	162	185
LRR	186	209
			LRR	210	233
LRR	234	257
			LRR	258	281
LRR	282	305
			LRR	306	329
LRR	330	353
			LRRCT	363	414or416
碱性	415or417	424
			Ig	419	493
连接序列	494	551
			跨膜	552	576
胞质	577	614

已经研究了Sp35在人类和大鼠中的组织分布和发育表达。已经在实验动物(大鼠)模型中研究了Sp35生物学。大鼠Sp35的表达局限于神经系统神经元以及脑部少突胶质细胞，如通过RNA印迹和免疫组化染色所确定的。大鼠Sp35 mRNA表达水平受发育调节，出生后不久(即大约出生后第一天)达到峰值。在大鼠脊髓横断面损伤模型中，在损伤部位处Sp35被正调节(up-regulated)，如通过RT-PCR所确定的。另外，已表明Sp35与Nogo66受体(Nogo受体)相互作用。参见例如国际专利申请第PCT/US2004/00832号。然而，Nogo受体-1在少突胶质细胞上不表达，并且Sp35对少突胶质细胞生物学的任何影响必须通过Nogo受体非依赖性途径产生。利用Sp35拮抗剂的治疗方法

本发明的一个具体实施方式提供了用于治疗与髓鞘功能不良或脱髓鞘相关的疾病、失调或损伤，例如患这样的疾病的动物中的多发性硬化症的方法，该方法包括、基本上或由以下步骤组成：给予动物有效量的Sp35拮抗剂，其选自由可溶性Sp35多肽、Sp35抗体、以及Sp35拮抗剂多核苷酸组成的组。

另外，本发明涉及用于促进哺乳动物中神经元髓鞘形成的方法，其包括、基本上由或由以下步骤组成：给予治疗有效量的Sp35拮抗剂，其选自由可溶性Sp35多肽、Sp35抗体、以及Sp35拮抗剂多核苷酸组成的组。

本发明的另一个具体实施方式提供了用于治疗与少突胶质细胞死亡或缺乏分化相关的疾病、失调或损伤，例如患这样的疾病的动物中的多发性硬化症、Pelizaeus Merzbacher病或球样细胞型脑白质营养不良(Karbbe氏病)的方法，所述方法包括、基本上由或由以下步骤组成：给予动物有效量的Sp35拮抗剂，其选自由可溶性Sp35多肽、Sp35抗体以及Sp35拮抗剂多核苷酸组成的组。

本发明的另一个方面包括用于促进哺乳动物中少突胶质细胞的增生、分化以及存活的方法，该方法包括、基本上由或由以下步骤组成：给予治疗有效量的Sp35拮抗剂，其选自由可溶性Sp35多肽、Sp35抗体以及Sp35拮抗剂多核苷酸组成的组。

用于本文披露的治疗方法中的Sp35拮抗剂例如可溶性Sp35多肽、Sp35抗体或Sp35拮抗剂多核苷酸可以被制成并用作治疗剂，其终止、降低、防止或抑制Sp35通过少突胶质细胞的负调节神经元髓鞘形成的能力。另外，用于本文披露的治疗方法中的Sp35拮抗剂可以被制备并用作治疗剂，其终止、降低、防止或抑制Sp35负调节少突胶质细胞分化、增生以及存活的能力。

本发明的其它具体实施方式包括诱导少突胶质细胞增生或存活以治疗涉及少突胶质细胞或髓鞘的破坏的疾病、失调或损伤的方法，其包括在疾病、失调或损伤部位或其附近给予哺乳动物以足以降低轴突延伸抑制和促进髓鞘形成的量。

在本发明的方法中，Sp35拮抗剂可以通过直接给予病人可溶性Sp35多肽、Sp35抗体或Sp35拮抗剂多核苷酸进行给予。可替换地，Sp35拮抗剂可以通过产生特异性Sp35拮抗剂的表达载体进行给予。在本发明的某些具体实施方式中，Sp35拮抗剂以治疗方法进行给予，该治疗方法包括：(1)用表达Sp35拮抗剂的核酸例如载体转化或转染可移植的宿主细胞；以及(2)将转化的宿主细胞在疾病、失调或损伤部位移植入哺乳动物中。例如，转化的宿主细胞可以在MS慢性病变(chronic lesion)部位被移植。在本发明的部分具体实施方式中，可移植的宿主细胞从哺乳动物中取出、短暂培养、用编码Sp35拮抗剂的独立核酸转化或转染、再移植回从其取出的同一哺乳动物中。所述细胞可以但不要求，从与其被移植的相同部位取出。这样的具体实施方式，有时称为生物体外基因治疗，可在一定的时间内提供局限于作用部位的连续的Sp35拮抗剂供应。

可通过本发明的方法治疗或改善的疾病或失调包括涉及哺乳动物神经元的髓鞘功能不良或脱髓鞘的疾病、失调或损伤。具体地，其中围绕神经元的髓鞘缺失、不完整、未正确形成或变质的疾病或失调。这样的疾病包括但不限于多发性硬化症(MS)，其包括MS的复发好转、继发进展和原发进展形式；进行性多发性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、桥脑中央髓鞘溶解症(CPM)、脑白质肾上腺萎缩症、亚历山大病、Pelizaeus-Merzbacher病(PMZ)、球样细胞型脑白质营养不良(Krabbe氏病)、Wallerian变性、视神经炎以及横贯性脊髓炎。

可通过本发明的方法治疗或改善的疾病或失调包括涉及少突胶质细胞死亡或增生缺失或分化缺失的疾病、失调或损伤。这样的疾病包括但不限于多发性硬化症(MS)、进行性多发性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、桥脑中央髓鞘溶解症(CPM)、脑白质肾上腺萎缩症、亚历山大病、Pelizaeus-Merzbacher病(PMZ)、球样细胞型脑白质营养不良(Krabbe氏病)以及Wallerian变性。

可通过本发明的方法治疗或改善的疾病或失调包括神经变性疾病或失调。这样的疾病包括但不限于肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿氏症、Alzheimer病以及帕金森病。

可通过本发明的方法治疗或改善的其它疾病或失调的实例包括但不限于脊髓损伤、慢性脊髓病或神经根型颈椎病、创伤性脑损伤、运动神经元病、轴突剪断(axonal shearing)、挫伤、瘫痪、放射后损伤或化疗的其它神经并发症、中风、大的腔隙、中到大血管栓塞、leukoariaosis、急性缺血性视神经病变、维生素E缺乏(单纯缺乏综合征、AR、Bassen-Kornzweig综合征)、B12、B6(维生素B6-糙皮病)、硫胺素、叶酸、烟酸缺乏、Marchiafava-Bignami综合征、异染性脑白质营养不良、三叉神经痛、贝尔氏麻痹或者需要轴突再生、髓鞘再生或者少突胶质细胞存活或分化/增生的任何神经损伤。

可溶性Sp35多肽

本发明的Sp35拮抗剂包括那些阻断、抑制或干扰天然存在的Sp35的生物功能的多肽。特别地，本发明的可溶性Sp35多肽包括可溶性Sp35多肽的片段、变异体或其衍生物。上面的表1描述了Sp35多肽的各个结构域。可溶性Sp35多肽缺乏Sp35多肽的胞内和跨膜结构域。例如，某些可溶性Sp35多肽缺乏包含Sp35跨膜结构域的氨基酸552-576和/或包含Sp35胞内结构域的氨基酸577-614。另外，某些可溶性Sp35多肽包含Sp35多肽的LRR结构域、Ig结构域、碱性区和/或整个胞外结构域(对应于SEQ ID NO：2的氨基酸34-532)。如本领域的技术人员理解的，Sp35的整个胞外结构域可以包括在该胞外结构域多肽的C-末端或N-末端上的另外的氨基酸或少数氨基酸。同样地，用于本发明所述方法的可溶性Sp35多肽包括但不限于这样的Sp35多肽，其包括、基本上由或由以下组成：SEQ ID NO：2的41-525位；SEQ ID NO：2的40-526位；SEQ ID NO：2的39-527位；SEQ ID NO：2的38-528位；SEQ ID NO：2的37-529位；SEQ ID NO：2的36-530位；SEQ ID NO：2的35-531位；SEQ ID NO：2的34-531位；SEQ ID NO：2的46-520位；SEQ IDNO：2的45-521位；SEQ ID NO：2的44-522位；SEQ ID NO：2的43-523位；以及SEQ ID NO：2的42-524位氨基酸或者这样的多肽的片段、变异体或衍生物。Sp35多肽拮抗剂可以包括表1中所述的结构域的任何组合。

用于本发明方法中的另外的可溶性Sp35多肽包括但不限于这样的Sp35多肽，其包括、基本上由或由以下组成：SEQ ID NO：2的1-33位；SEQ ID NO：2的1-35位；SEQ ID NO：2的34-64位；SEQ ID NO：2的36-64位；SEQ ID NO：2的66-89位；SEQ ID NO：2的90-113位；SEQ ID NO：2的114-137位；SEQ ID NO：2的138-161位；SEQ ID NO：2的162-185位；SEQ ID NO：2的186-209位；SEQID NO：2的210-233位；SEQ ID NO：2的234-257位；SEQ ID NO：2的258-281位；SEQ ID NO：2的282-305位；SEQ ID NO：2的306-329位；SEQ ID NO：2的330-353位；SEQ ID NO：2的363-416位；SEQ ID NO：2的417-424位；SEQ ID NO：2的419-493位；SEQ ID NO：2的494-551位氨基酸或者这样的多肽的片段、变异体或衍生物。

用于本发明方法中的进一步的可溶性Sp35多肽包括但不限于这样的Sp35多肽，其包括、基本上由或由以下组成：SEQ ID NO：2的1-33位；SEQ ID NO：2的1-35位；SEQ ID NO：2的1-64位；SEQID NO：2的1-89位；SEQ ID NO：2的1-113位；SEQ ID NO：2的1-137位；SEQ ID NO：2的1-161位；SEQ ID NO：2的1-185位；SEQ ID NO：2的1-209位；SEQ ID NO：2的1-233位；SEQ ID NO：2的1-257位；SEQ ID NO：2的1-281位；SEQ ID NO：2的1-305位；SEQ ID NO：2的1-329位；SEQ ID NO：2的1-353位；SEQ IDNO：2的1-416位；SEQ ID NO：2的1-424位；SEQ ID NO：2的1-493位；SEQ ID NO：2的1-551位；SEQ ID NO：2的1-531位；SEQ IDNO：2的1-532位氨基酸或者这样的多肽的片段、变异体或衍生物。

用于本发明方法中的进一步的可溶性Sp35多肽包括但不限于这样的Sp35多肽，其包括、基本上由或由以下组成：SEQ ID NO：2的34-64位；SEQ ID NO：2的34-89位；SEQ ID NO：2的34-113位；SEQ ID NO：2的34-137位；SEQ ID NO：2的34-161位；SEQ IDNO：2的34-185位；SEQ ID NO：2的34-209位；SEQ ID NO：2的34-233位；SEQ ID NO：2的34-257位；SEQ ID NO：2的34-281位；SEQ ID NO：2的34-305位；SEQ ID NO：2的34-329位；SEQ ID NO：2的34-353位；SEQ ID NO：2的34-416位；SEQ ID NO：2的34-424位；SEQ ID NO：2的34-493位；以及SEQ ID NO：2的34-551位氨基酸或者这样的多肽的片段、变异体或衍生物。

用于本发明方法中的另外的可溶性Sp35多肽包括但不限于这样的Sp35多肽，其包括、基本上由或由以下组成：SEQ ID NO：2的34-530位；SEQ ID NO：2的34-531位；SEQ ID NO：2的34-532位；SEQ ID NO：2的34-533位；SEQ ID NO：2的34-534位；SEQ ID NO：2的34-535位；SEQ ID NO：2的34-536位；SEQ ID NO：2的34-537位；SEQ ID NO：2的34-538位；SEQ ID NO：2的34-539位；SEQ ID NO：2的30-532位；SEQ ID NO：2的31-532位；SEQ ID NO：2的32-532位；SEQ ID NO：2的33-532位；SEQ ID NO：2的34-532位；SEQ ID NO：2的35-532位；SEQ ID NO：2的36-532位；SEQ IDNO：2的30-531位；SEQ ID NO：2的31-531位；SEQ ID NO：2的32-531位；SEQ ID NO：2的33-531位；SEQ ID NO：2的34-531位；SEQ ID NO：2的35-531位；以及SEQ ID NO：2的36-531位氨基酸或者这样的多肽的片段、变异体或衍生物。

用于本发明方法中的进一步的可溶性Sp35多肽包括但不限于这样的Sp35多肽，其包括、基本上由或由以下组成：SEQ ID NO：2的36-64位；SEQ ID NO：2的36-89位；SEQ ID NO：2的36-113位；SEQ ID NO：2的36-137位；SEQ ID NO：2的36-161位；SEQ IDNO：2的36-185位；SEQ ID NO：2的36-209位；SEQ ID NO：2的36-233位；SEQ ID NO：2的36-257位；SEQ ID NO：2的36-281位；SEQ ID NO：2的36-305位；SEQ ID NO：2的36-329位；SEQ ID NO：2的36-353位；SEQ ID NO：2的36-416位；SEQ ID NO：2的36-424位；SEQ ID NO：2的36-493位；以及SEQ ID NO：2的36-551位氨基酸或者这样的多肽的片段、变异体或衍生物。

用于本发明方法中的另外的可溶性Sp35多肽包括但不限于这样的Sp35多肽，其包括、基本上由或由以下组成：SEQ ID NO：2的36-530位；SEQ ID NO：2的36-531位；SEQ ID NO：2的36-532位；SEQ ID NO：2的36-533位；SEQ ID NO：2的36-534位；SEQ IDNO：2的36-535位；SEQ ID NO：2的36-536位；SEQ ID NO：2的36-537位；SEQ ID NO：2的36-538位；以及SEQ ID NO：2的36-539位氨基酸；或者这样的多肽的片段、变异体或衍生物。

其它可溶性Sp35多肽、其片段、变异体或衍生物包括包含Sp35的Ig结构域的多肽。例如，Sp35多肽包括、基本上由或由以下组成：SEQ ID NO：2的417-493位；SEQ ID NO：2的417-494位；SEQID NO：2的417-495位；SEQ ID NO：2的417-496位；SEQ ID NO：2的417-497位；SEQ ID NO：2的417-498位；SEQ ID NO：2的417-499位；SEQ ID NO：2的417-500位；SEQ ID NO：2的417-492位；SEQ ID NO：2的417-491位；SEQ ID NO：2的412-493位；SEQID NO：2的413-493位；SEQ ID NO：2的414-493位；SEQ ID NO：2的415-493位；SEQ ID NO：2的416-493位；SEQ ID NO：2的411-493位；SEQ ID NO：2的410-493位；SEQ ID NO：2的410-494位；SEQ ID NO：2的411-494位；SEQ ID NO：2的412-494位；SEQID NO：2的413-494位；SEQ ID NO：2的414-494位；SEQ ID NO：2的415-494位；SEQ ID NO：2的416-494位；SEQ ID NO：2的417-494位；以及SEQ ID NO：2的418-494位氨基酸或者这样的多肽的片段、变异体或衍生物。

用于本发明方法的其它可溶性Sp35多肽包括这样的Sp35多肽，其包括、基本上由或由Sp35的Ig结构域的肽或者这样的多肽的片段、变异体或衍生物组成。特别地，多肽包括、基本上由或由以下组成的多肽：ITX₁X₂X₃(SEQ ID NO：6)、ACX₁X₂X₃(SEQ IDNO：7)、VCX₁X₂X₃(SEQ ID NO：8)以及SPX₁X₂X₃(SEQ ID NO：9)；其中X₁是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸或天门冬酰胺；X₂是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸或天门冬酰胺；以及X₃是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸或天门冬酰胺。例如，Sp35Ig结构域拮抗剂多肽包括这样的多肽，其包括、基本上由或由下列多肽序列组成：SPRKH(SEQ ID NO：10)，SPRKK(SEQ ID NO：11)，SPRKR(SEQ ID NO：12)，SPKKH(SEQ ID NO：13)，SPHKH(SEQ IDNO：14)，SPRRH(SEQ ID NO：15)，SPRHH(SEQ ID NO：16)，SPRRR(SEQ ID NO：17)，SPHHH(SEQ ID NO：18)SPKKK(SEQ ID NO：19)， LSPRKH(SEQ ID NO：61)，LSPRKK(SEQ ID NO：80)，LSPRKR(SEQ ID NO：81)，LSPKKH(SEQ ID NO：82)，LSPHKH(SEQ IDNO：83)，LSPRRH(SEQ ID NO：84)，LSPRHH(SEQ ID NO：85)，LSPRRR(SEQ ID NO：86)，LSPHHH(SEQ ID NO：87)LSPKKK(SEQID NO：88)，WLSPRKH(SEQ ID NO：89)，WLSPRKK(SEQ IDNO：90)，WLSPRKR(SEQ ID NO：91)，WLSPKKH(SEQ ID NO：92)，WLSPHKH(SEQ ID NO：93)，WLSPRRH(SEQ ID NO：94)，WLSPRHH(SEQ ID NO：95)，WLSPRRR(SEQ ID NO：96)，WLSPHHH(SEQ ID NO：97)WLSPKKK(SEQ ID NO：98)。这些可溶性Sp35多肽包括在Sp35的Ig结构域中的碱性“RKH环”(456-458位氨基酸的精氨酸-赖氨酸-组氨酸)。这种碱性三肽被认为对于可溶性Sp35拮抗剂多肽结合至本身的Sp35多肽来说很重要。其它的包括碱性三肽的可溶性Sp35多肽是ITPKRR(SEQ ID NO：20)，ACHHK(SEQ ID NO：21)以及VCHHK(SEQ ID NO：22)

用于本发明方法中的另外的可溶性Sp35多肽包括这样的Sp35多肽，其包括、基本上由或由Sp35的Ig结构域的肽或这样的多肽的片段、变异体或衍生物组成。特别地，包括、基本上由或由下列多肽序列组成的多肽：X₄X₅RKH(SEQ ID NO：23)，X₄X₅RRR(SEQ IDNO：24)，X₄X₅KKK(SEQ ID NO：25)，X₄X₅HHH(SEQ ID NO：26)，X₄X₅RKK(SEQ ID NO：27)，X₄X₅RKR(SEQ ID NO：28)，X₄X₅KKH(SEQ IDNO：29)，X₄X₅HKH(SEQ ID NO：30)，X₄X₅RRH(SEQ ID NO：31)以及X₄X₅RHH(SEQ ID NO：32)，其中X₄是任何氨基酸以及X₅是任何氨基酸。

在其它具体实施方式中，用于本发明方法中的可溶性Sp35多肽包括这样的Sp35多肽，其包括、基本上由或由Sp35的Ig结构域的肽或这样的多肽的片段、变异体或衍生物组成。特别地，包括、基本上由或由下列多肽序列组成的多肽：ITX₆X₇X₈(SEQ ID NO：68)，ACX₆X₇X₈(SEQ ID NO：69)，VCX₆X₇X₈(SEQ ID NO：70)以及SPX₆X₇X₈(SEQ ID NO：71)，其中X₆是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸或天门冬酰胺；X7是任何氨基酸以及X₈是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、或天门冬酰胺。例如，Sp35Ig结构域拮抗剂多肽包括这样的多肽，其包括、基本上由或由下列多肽序列组成：SPRLH(SEQ ID NO：72)。

在本发明的其它具体实施方式中，用于本发明方法的可溶性Sp35多肽包括这样的Sp35多肽，其包括、基本上由或由含在Sp35的Ig结构域中的452-458位氨基酸的多肽或其衍生物(其中452位氨基酸是色氨酸或苯丙氨酸残基)组成。

用于本发明方法的其它可溶性Sp35多肽包括这样的Sp35多肽，其包括、基本上由或由Sp35的碱性结构域的肽组成。特别地，包括、基本上由或由下列多肽序列组成的多肽：RRARIRDRK(SEQID NO：33)、KKVKVKEKR(SEQ ID NO：34)、RRLRLRDRK(SEQID NO：35)、RRGRGRDRK(SEQ ID NO：36)以及RRIRARDRK(SEQ ID NO：37)。

各种示例性可溶性Sp35多肽以及对于实施本发明的用于获得这些分子的方法和材料在下面进行描述和/或可以在例如国际专利申请第PCT/US2004/008323号中找到，其全部内容结合于此供参考。

用于本发明方法的可溶性Sp35多肽可以是环状的。可溶性Sp35多肽的环化降低了线性肽的构象自由度并形成结构更加受限的分子。肽环化的许多方法在本领域中是已知的。例如，通过在肽的N-末端和C-末端氨基酸残基之间形成酰胺键的“主链-主链(backbone to backbone)”环化。该“主链-主链”环化方法包括在两个ω-硫代氨基酸残基(例如：半胱氨酸、高半胱氨酸)之间形成二硫桥。本发明的某些可溶性Sp35肽包括在肽的N-末端和C-末端上修饰以形成环Sp35多肽。这样的修饰包括但不限于半胱氨酸残基、乙酰化的半胱氨酸残基、具有NH₂部分和生物素的半胱氨酸残基。肽环化的其它方法描述在Li & Roller.Curr.Top.Med.Chem.3：325-341(2002)中，其全部内容结合于此供参考。

本文中描述的用于本发明方法的环状Sp35多肽包括但不限于C₁LSPX₉X₁₀X₁₁C₂(SEQ ID NO：99)，其中X₉是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸或天门冬酰胺，X₁₀是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸或天门冬酰胺，以及X₁₁是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸或天门冬酰胺，C₁任选地连接有促进环化的部分(例如乙酰基或生物素)，并且C₂任选地连接有促进环化的部分(例如NH₂部分)。

本文中描述的可溶性Sp35多肽可以具有各种改变如替代、插入或缺失。例如，替代包括但不限于下列替代：在SEQ ID NO：2的Sp35多肽第6位的缬氨酸替代为蛋氨酸；在SEQ ID NO：2的Sp35多肽第294位的丝氨酸替代为甘氨酸；在SEQ ID NO：2的Sp35多肽第348位的缬氨酸替代为丙氨酸；在Sp35多肽第419位的精氨酸替代为组氨酸；在第456位的精氨酸替代为谷氨酸；以及在SEQID NO：2的第458位的组氨酸替代为缬氨酸；

至少与本文描述的SEQ ID NO：2的多肽70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的可溶性Sp35多肽的相应片段也属于本发明考虑范围。

如本领域已知的，两个多肽之间的“序列同一性”可通过比较一个多肽的氨基酸序列与另一个多肽的序列进行确定。当在本文中讨论时，任何特定多肽是否至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％与另一个多肽相同，可以利用本领域已知的方法和计算机程序/软件来确定，诸如但不限于BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 forUnix，Genetics Computer Group，University Research Park，575ScienceDrive，Madison，WI 53711)。BESTFIT利用Smith和Waterman的局部同源性计算法，见Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)，以寻找两个序列之间同源性最佳的片段。当利用BESTFIT或任何其它序列比对程序确定一个特定序列是否，例如，95％等同于根据本发明的对照序列时，当然将设定参数以使相对于全长的对照多肽序列计算同一性的百分数，并且允许达对照序列中的氨基酸总数的5％的同源性差异。

用于本发明方法的可溶性Sp35多肽可以包括两种或多种可溶性Sp35多肽的任何组合。

抗体或其免疫特异性片段

用于本发明方法的Sp35拮抗剂还包括Sp35特异性抗体或抗原结合片段、变异体或衍生物，其为Sp35活性的拮抗剂。例如，某些Sp35抗体结合于如在少突胶质细胞上表达的Sp35阻断少突胶质细胞生长或分化的抑制，或阻断CNS神经元的脱髓鞘或髓鞘功能不良。

用于本发明方法的某些拮抗剂抗体特异性或优先结合于特定Sp35多肽片段或结构域。这样的Sp35多肽片段包括但不限于这样的Sp35多肽，其包括、基本上由或由SEQ ID NO：2的34-532、34-417、34-425、34-493、66-532、66-417(LRR结构域)、66-426、66-493、66-532、417-532、417-525(Sp35碱性区域)、417-424(Sp35碱性区域)、417-493、417-532、419-493(Sp35Ig区)或425-532位氨基酸，或者与SEQ ID NO：2的34-532、34-417、34-425、34-493、66-532、66-417、66-426、66-493、66-532、417-532、417-525(Sp35碱性区域)、417-493、417-532、419-493(Sp35Ig区)、或425-532位氨基酸的至少70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的Sp35变异多肽。

本发明的某些Sp35特异性抗体或者其抗原结合片段、变异体或衍生物结合的其它Sp35肽片段包括但不限于那些片段，其包括、基本上由或由Sp35的一个或多个富亮氨酸重复(LRR)所组成。这样的片段包括例如这样的片段，其包括、基本上由或由SEQ IDNO：2的66-89、66-113、66-137、90-113、114-137、138-161、162-185、186-209、210-233、234-257、258-281、282-305、306-329、或330-353位氨基酸。与SEQ ID NO：2的66-89、66-113、90-113、114-137、138-161、162-185、186-209、210-233、234-257、258-281、282-305、306-329、或330-353位氨基酸的至少70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的变异Sp35多肽的相应片段也属于本发明考虑的范围。

本发明的某些抗体或者其抗原结合片段、变异体或衍生物结合的其它Sp35肽片段包括但不限于那些片段，其包括、基本上由或由在Sp35的LRR侧翼的一个或多个富半胱氨酸区组成。这样的片段包括例如其包括、基本上由或由SEQ ID NO：2的34-64位氨基酸(区侧翼的N-末端LRR(LRRNT))组成的片段，或者包括、基本上由或由SEQ ID NO：2的363-416位氨基酸(区侧翼的C-末端LRR (LRRCT))组成的片段。与SEQ ID NO：2的34-64以及363-416位氨基酸的至少70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的变异Sp35多肽的相应片段也在本发明考虑的范围。

在其它具体实施方式中，本发明包括的抗体或者其抗原结合片段、变异体或衍生物特异性或优先结合于Sp35的至少一个抗原决定基，其中抗原决定基包括、基本上由或由SEQ ID NO：2的至少约4-5个氨基酸，SEQ ID NO：2的至少7个、至少9个或在至少约15个至30个之间的氨基酸组成。所述的SEQ ID NO：2的给定抗原决定基的氨基酸可以但不一定是连续或线性的。在某些具体实施方式中，Sp35的至少一个抗原决定基包括、基本上由或由Sp35的胞外结构域形成的非线性抗原决定基组成，其中Sp35在细胞表面上或以可溶性片段例如融合于IgG Fc区来表达。因此，在某些具体实施方式中，Sp35的至少一个抗原决定基包括、基本上由或由SEQ IDNO：2的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、在约15和约30个之间，或者至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个连续或非连续氨基酸(其通过蛋白折叠形成抗原决定基)组成。

在其它具体实施方式中，本发明包括抗体或者其抗原结合片段、变异体或衍生物，其特异性或优先结合于Sp35的至少一个抗原决定基，其中，除了如上所述SEQ ID NO：2的1、2、3、4、5、6个或更多连续或不连续的氨基酸之外，所述抗原决定基包括、基本上由或由另外的部分组成，该另外的部分修饰蛋白质，例如糖类部分可以包括在内，以使相比于该蛋白的未修饰形式，Sp35抗体以较高亲合力结合于修饰的靶蛋白。可替换地，Sp35抗体从不结合靶蛋白的未修饰形式。

在某些具体实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变异体或衍生物特异性结合于上述的Sp35或者片段或变异体的至少一个抗原决定基，即相比于结合于不相关或随机的抗原决定基，其可以更易于结合于这样的抗原决定基；优先结合于上述Sp35或者片段或变异体的至少一个抗原决定基，即相比于结合于相关、类似、同源或相似的抗原决定基，其可以更易于结合于这样的抗原决定基；竞争性抑制本身可特异性或优先结合于述Sp35或者片段或变异体的某个抗原决定基的对照抗体的结合；或者结合于上述Sp35或者片段或变异体的至少一个抗原决定基，其亲合力的特征在于解离常数K_D小于约5×10^-2M、约10^-2M、约5×10^-3M、约10^-3M、约5×10^-4M、约10^-4M、约5×10^-5M、约10^-5M、约5×10^-6M、约10^-6M、约5×10^-7M、约10^-7M、约5×10^-8M、约10^-8M、约5×10^-9M、约10^-9M、约5×10^-10M、约10^-10M、约5×10^-11M、约10^-11M、约5×10^-12M、约10^-12M、约5×10^-13M、约10^-13M、约5×10^-14M、约10^-14M、约5×10^-15M、或约10^-15M。在一个特定方面，相对于鼠Sp35多肽或其片段，抗体或其片段优先结合于人Sp35多肽或其片段。

如在抗体结合解离常数的上下文中使用的，术语“约”允许用来测定抗体亲合力的方法中存在变差的程度。例如，根据所使用仪器的精确度，基于测定的样品数量的标准误差以及舍入误差，术语“约10^-2M”可以包括例如0.05M-0.005M。

在特定具体实施方式中，本发明的抗体或者其抗原结合片段、变异体或衍生物特异性结合Sp35多肽或者其片段或变异体，其解离速率(k(off))小于或等于5×10^-2/秒、10^-2/秒、5×10^-3/秒或10^-3/秒。可替换地，本发明的抗体或者其抗原结合片段、变异体或衍生物特异性结合Sp35多肽或者其片段或变异体，其解离速率(off rate)(k(off))小于或等于5×10^-2秒^-1、10^-2秒^-1、5×10^-3秒^-1或10^-3秒^-1。可替换地，本发明的抗体或者其抗原结合片段、变异体或衍生物特异性结合Sp35多肽或者其片段或变异体，其解离速率(k(off))小于或等于5×10^-4秒^-1、10^-4秒^-1、5×10^-5秒^-1或10^-5秒^-1、5×10^-6秒^-1、10^-6秒^-1、5×10^-7秒^-1或10^-7秒^-1。

在其它具体实施方式中，本发明的抗体或者其抗原结合片段、变异体或衍生物特异性结合Sp35多肽或者其片段或变异体，其结合速率(on rate)(k(on))大于或等于10³M^-1秒^-1、5×10³M^-1秒^-1、10⁴M^-1秒^-1或5×10⁴M^-1秒^-1。可替换地，本发明的抗体或者其抗原结合片段、变异体或衍生物特异性结合Sp35多肽或者其片段或变异体，其结合速率(k(on))大于或等于10⁵M^-1秒^-1、5×10⁵M^-1秒^-1、10⁶M^-1秒^-1或5×10⁶M^-1秒^-1或10⁷M^-1秒^-1。

在一个具体实施方式中，用于本发明方法的Sp35拮抗剂是抗体分子或其免疫特异性片段。除非特别指出，如在本文中提到抗体时使用的“其片段”指的是免疫特异性片段，即抗原特异性片段。在一个具体实施方式中，本发明的抗体是双特异性结合分子、结合多肽或者抗体例如双特异性抗体、小型体(minibody)、结构域缺失的抗体、或具有对一个以上的抗原决定基(例如一个以上的抗原或同一抗原上的一个以上的抗原决定基)的结合特异性的融合蛋白。在一个具体实施方式中，双特异性抗体具有对Sp35上的至少一个抗原决定基特异性的至少一个结合结构域。双特异性抗体可以是四价抗体，其具有两个对Sp35的抗原决定基特异性的靶结合结构域以及两个对另一个靶特异性的靶结合结构域。因此，四价双特异性抗体对于每种特异性可以是二价的。

在本发明的某些具体实施方式中，包括给予Sp35拮抗剂抗体或其免疫特异性片段，其中一个或多个恒定区结构域中的至少一部分缺失或以其它方式被改变以便提供希望的生物化学特性，如与未改变但具有几乎相同的免疫原性的抗体整体进行比较时，减少的效应子功能、非共价二聚的能力、提高的定位于肿瘤部位的能力、减少的血清半衰期、或提高的血清半衰期。例如，用于本文所述治疗方法的某些抗体是结构域缺失的抗体，其包括类似于免疫球蛋白重链的多肽链，但缺乏一个或多个重链结构域的至少一部分。例如，在某些抗体中，修饰抗体的恒定区的一个完整结构域缺失，例如C_H2结构域的全部或部分缺失。

在用于本文所描述的治疗方法的某些Sp35拮抗剂抗体或其免疫特异性片段中，Fc部分可以利用本领域中已知技术被突变以降低效应子功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它方式)可以减少循环性修饰抗体的Fc受体结合，从而提高肿瘤定位。在其它情况下，可以是根据本发明的恒定区修饰调节补体结合并因此降低血清半衰期以及轭合的细胞毒素的非特异性结合。恒定区的其它修饰可用来修饰二硫键连接或者低聚糖部分，其由于提高的抗原特异性或抗体灵活性允许增强定位。得到的生理外形、生物利用度或修饰的其它生化效应如肿瘤定位、生物分布以及血清半衰期，可以利用熟知的免疫学技术而无须过度试验而易于被测定和量化。

用于本文披露的诊断和治疗方法中的抗体或其免疫特异性片段的修饰形式可以利用本领域已知的技术由整个前体或亲代抗体制成。本文中详细讨论了示例性的技术。

在某些具体实施方式中，用于本文披露的治疗方法中的Sp35拮抗剂抗体或其免疫特异性片段的可变区和恒定区全都是人源的。完全人源的抗体可以利用本领域中已知的技术以及本文中描述的技术进行制备。例如，对特定抗原的完全人源抗体可以通过将抗原给予至转基因动物加以制备，其中转基因动物被修饰以产生对抗原性攻击反应的抗体，但其内源性座位(loci)已丧失能力。可用来制备这样的抗体的示例性技术描述在美国专利第6,150,584、6,458,592、6,420,140号中。其它技术在本领域是已知的。同样地，完全人源抗体可以通过各种显示技术例如噬菌体显示系统或其它病毒显示系统来制备，如在本文其它地方更加详细描述的。

用于本文披露的诊断和治疗方法中的Sp35拮抗剂抗体或其免疫特异性片段可以利用本领域中已知的技术来制备或生产。在某些具体实施方式中，抗体分子或其片段是“重组生产的”，即利用重组DNA技术进行生产。用于制备抗体分子或其片段的示例性技术在本文其它地方更加详细地进行讨论。

用于本文披露的治疗方法中的Sp35拮抗剂抗体或其免疫特异性片段包括经过修饰的衍生物，例如通过将任何类型的分子共价连接至抗体以使共价连接不阻碍抗体特异性结合于其同源抗原决定基。例如但不限于，抗体衍生物包括经过修饰的抗体，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化(pegylation)、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护或阻断基团的衍生化、蛋白水解性切割、键合至细胞配体或其它蛋白等。大量化学修饰中的任何一种可以通过已知技术实现，其包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢性合成等。另外，该衍生物可以含有一种或多种非经典的氨基酸。

在优选的具体实施方式中，用于本文披露的治疗方法中的Sp35拮抗剂抗体或其免疫特异性片段不会在待治疗的动物(例如人)中引起有害性免疫反应。在一个具体实施方式中，用于本文披露的治疗方法中的Sp35拮抗剂抗体或其免疫特异性片段可利用本领域已知的技术进行修饰以降低其免疫原性。例如，可以将抗体人源化、灵长源化或去免疫化，或者制备嵌合抗体。这些类型的抗体来源于非人源抗体，典型的是鼠或灵长类抗体，其保留或基本保留亲代抗体的抗原结合特性，但在人上免疫原性较低。这可以通过各种方法获得，其包括(a)将整个非人源可变结构域移植到人源恒定区以产生嵌合抗体；(b)将一个或多个非人源补体决定区(CDR)中的至少一部分移植到人源构架和恒定区上，具有或不具有关键性构架区残基的保持力；或者(c)移植整个非人源可变结构域，但通过替换表面残基而用人类似部分将其“掩藏”。这以的方法披露在Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-6855(1984)；Morrisonet al.，Adv.Immunol.44：65-92(1988)；Verhoeyen et al.，Science239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.31：169-217(1994)，以及美国专利第5,585,089、5,693,761、5,693,762、和6,190,370号中，其全部内容结合于此供参考。

去免疫化也可以被用来降低抗体的免疫原性。如在本文中使用的，术语“去免疫化”包括改变抗体以修饰T细胞抗原决定基(参见例如WO9852976A1、WO0034317A2)。例如，分析来自起始抗体的V_H和V_L序列，并且来自每个V区的人T细胞抗原决定基“图谱”显示出与补体决定区(CDR)相关的抗原决定基以及序列内的其它关键残基的位置。对来自T细胞抗原决定基图谱的单个T细胞抗原决定基进行分析以便鉴定以较低改变最终抗体活性的风险的可替换氨基酸替代。设计了一系列包括氨基酸替换的组合的可替换V_H 和V_L序列，随后将这些序列并入一系列结合多肽中，例如用于本文披露的诊断和治疗方法中的Sp35拮抗剂抗体或其免疫特异性片段，接着检测这些多肽的功能。通常，生成和检测了在12-24个之间的变异抗体，然后将包含修饰的V区域和人C区域的完整重链和轻链基因克隆到表达载体中，并将得到的质粒导入细胞系用于生产完整抗体。然后将抗体在适当的生化和生物学分析中加以比较，并鉴定最佳的变异体。

用于本文方法中的Sp35拮抗剂抗体或其片段可通过本领域中已知的任何恰当方法生成。多克隆抗体可利用本领域熟知的各种工艺加以制备。例如，Sp35免疫特异性片段可以给予各种宿主动物包括但不限于兔、小鼠、大鼠等以诱导生产含对抗原特异性的多克隆抗体的血清。根据宿主种属，各种佐剂可用来提高免疫反应，包括但不限于弗氏(Freund’s)(完全和不完全)、矿物凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、聚醚多元醇(pluronic polyols)、多聚阴离子、肽、油状乳液、钥孔嘁血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)、二硝基酚以及潜在有用的人佐剂如BCG(卡介苗，bacille Calmette-Guerin)以及短棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)。这样的佐剂在本领域中也是熟知的。

单克隆抗体可利用本领域已知的各种技术进行制备，包括利用杂种细胞、重组以及噬菌体显示技术或者其组合。例如单克隆抗体可利用杂种细胞技术而产生，其包括本领域中已知的技术以及在Harlow et al.，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.(1988)；Hammerling et al.，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell HybridomasElsevier，N.Y.，563-681(1981)中教导的技术(所述参考文献的全部内容结合于此供参考)。如在本文中使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂种细胞技术制备的抗体。术语“单克隆抗体”指的是来源于单个克隆的抗体，单个克隆包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是指制备单克隆抗体所使用的方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂种细胞技术制备的抗体。单克隆抗体可利用各种本领域已知的技术制备，包括利用杂种细胞以及重组和噬菌体显示技术。

利用本领域已知的方案，在一个实施例中，通过多次皮下或腹膜内注射相关抗原(例如纯化的Sp35抗原或者包含这样的抗原的细胞或细胞提取物)以及佐剂而在哺乳动物中培养抗体。通常，这种免疫作用引起这样的免疫反应，其包括从激活的脾细胞或淋巴细胞制备抗原反应性抗体。尽管得到的抗体可从动物血清收集以提供多克隆制制品，但常常希望从脾、淋巴结或外围血液分离单个淋巴细胞以提供单克隆抗体(MAb)的同源制品。优选地，淋巴结从脾获得。

在这种熟知的工艺中(Kohler et al.，Nature 256：495(1975))，将来自于已注射抗原的哺乳动物的相对较短寿命的(或必死的)淋巴细胞与无限生长分化的肿瘤细胞系(例如骨髓瘤细胞系)进行融合，从而产生杂交细胞或“杂种细胞”，其既是无限生长分化的又能够产生B细胞的遗传编码抗体。得到的杂交体通过选取、稀释、以及用包含用于形成单一抗体的特异性基因的每一种单株再生长而分离成单一遗传株。它们产生抗体，其对预期抗原是同种的，并且当提及其纯遗传来源时将其称为“单克隆体”。

将这样制备的杂种细胞接种并生长于合适的培养基中，该培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。本领域的技术人员将理解，用于杂种细胞的形成、筛选以及生长的试剂、细胞系和培养基可从各种来源商业购得，并且已经建立了标准化的方案。通常，对杂种细胞在其中生长的培养基进行测定以生产对希望抗原的单克隆抗体。优选地，由杂种细胞(杂种瘤，hybridoma)产生的单克隆抗体的结合特异性通过体外测定如免疫沉淀、放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行确定。在鉴定可产生希望特异性、亲合力和/或活性的抗体的杂种细胞后，该克隆体可通过限制性稀释步骤被亚克隆并通过标准方法进行生长(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，Academic Press，pp 59-103(1986))。进一步应该理解，可通过传统纯化工序例如蛋白质-A、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲合层析从培养基、腹水液或血清分离由亚克隆体分泌的单克隆抗体。

识别特异性抗原决定基的抗体片段可通过已知技术生成。例如，Fab和F(ab’)2片段可利用酶如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)，通过免疫球蛋白分子的蛋白水解性切割而产生。F(ab’)2片段含有可变区、轻链恒定区以及重链的C_H1结构域。

本领域的技术人员还将理解，编码抗体或抗体片段(例如抗原结合位点)的DNA还可以来源于抗体噬菌体文库。在一个特定方面，这样的噬菌体可以被用来显示从所有组成成分(repertoire)或组合性抗体文库(例如人或鼠)表达的抗原结合结构域。表达抗原结合结构域(可结合感兴趣的抗原)的噬菌体可利用抗原，例如利用标记的抗原、或者被结合或捕获于固态表面或珠子上的抗原进行选择或鉴定。用于这些方法中的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括从具有Fab、Fv的噬菌体表达的fd和M13结合结构域或重组地融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白的二硫化物稳定的Fv抗体结构域。示例性方法例如在EP368 684B1、美国专利第5,969,108号、Hoogenboom，H.R.and Chames，Immunol.Today 21：371(2000)；Nagy et al.Nat.Med.8：801(2002)；Huie et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：2682(2001)；Lui et al.，J.Mol.Biol.315：1063(2002)中列出，其均结合于此供参考。若干出版物(例如Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992))已经描述了通过链改组(chain shuffling)以及组合性感染和作为构建大型噬菌体文库策略的体内重组而产生高亲合力人抗体。在另一个具体实施方式中，核糖体显示可用来代替噬菌体作为展示平台(参见例如Hanes et al.，Nat.Biotechnol.18：1287(2000)；Wilson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：3750(2001)；or Irving et al.，J.Immunol.Methods 248：31(2001))。在又一个具体实施方式中，细胞表面文库可用于筛选抗体(Boder et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：10701(2000)；Daugherty et al.，J.Immunol.Methods 243：211 (2000))。这样的工序提供了用于单克隆抗体分离以及随后的克隆的传统杂种细胞技术的替代技术。

在噬菌体显示方法中，功能性抗体结构域在携带编码噬菌体颗粒的多肽序列的该噬菌体颗粒表面上被展示。特别的，编码V_H和V_L区域的DNA序列从动物cDNA文库(例如：人或鼠淋巴组织的cDNA文库)或者合成的cDNA文库被扩增。在某些具体实施方式中，编码V_H和V_L区域的DNA利用scFv连接子通过PCR连接在一起并克隆到噬菌粒载体中(例如，pCANTAB 6或pComb 3HSS)。该载体在大肠杆菌中被电穿孔并且该大肠杆菌用辅助噬菌体感染。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体包括fd和M13，并且V_H或V_L区域通常被重组地融合于噬菌体基因III或基因VIII。表达可结合感兴趣抗原(即Sp35多肽或其片段)的抗原结合结构域的噬菌体可利用抗原，例如利用标记的抗原或被结合或捕获于固态表面或珠子上的抗原进行选择或鉴定。

可用来制备抗体的噬菌体展示方法的其它实例包括在Brinkman et al.，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames et al.，J.Immunol. Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough et al.，Eur.J.Immnunol.24：952-958(1994)；Persic etal.，Gene 187：9-18(1997)；Burton et al.，Advances in Immunology 57：191-280(1994)；PCT申请第PCT/GB91/01134号、pCT公开第WO90/02809、WO91/10737、WO92/01047、WO92/18619、WO93/11236、WO95/15982、WO95/20401号；以及美国专利第5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,6375,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108号中披露的方法，其中全部内容均结合于此供参考。

如在上述参考文献中描述的，在噬菌体选择后，来自该噬菌体的抗体编码区可以被分离并用来生成整个抗体(包括人抗体)或者其它希望的抗原结合片段，并且被表达在任何希望的宿主中，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。例如，用来重组地产生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术也可以被采用，其中利用本领域中已知的方法例如那些在PCT公开第WO92/22324号；Mullinax et al.，BioTechniques 12(6)：864-869(1992)；以及Sawai et al.，AJRI 34：26-34(1995)；and Better et al.，Science 240：1041-1043(1998)中披露的方法(其全部内容结合于此供参考)。

可以用来产生单链Fvs以及抗体的技术的实例包括那些在美国专利第4,946,778和5,258,498号；Huston et al.，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu etal.，PNAS 90：7995-7999(1993)；and Skerra et al.，Science 240：1038-1040(1998)中描述的技术。对于一些应用，包括人类抗体的体内应用以及体外检测分析，可以优选使用嵌合、人源化或人抗体。嵌合抗体是这样的分子，其中抗体的不同部分来源于不同动物种属，如具有来源于鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白的恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法在本领域中是已知的，参见例如Morriso，Science 229：1202(1985)；Oi et al.，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies et al.，J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；美国专利第5,807,715、4,816,567和4,816,397号，其全部内容结合于此供参考。人源化抗体是来自于非人种属抗体(其结合希望抗原)的抗体分子，具有一个或多个来自于非人种属的补体决定区(CDR)以及来自于人免疫球蛋白分子的构架区。经常地，在人构架区中的构架残基常常由来自CDR供体抗体的相应残基所替代以改变、优选提高抗原结合。这些构架替代可通过本领域中熟知的方法来鉴定，例如通过将CDR与构架残基的相互作用进行建模以鉴定构架残基(其对于抗原结合很重要)，以及通过序列比较以鉴定在特定位置的非常见构架残基 (参见例如Queen等的美国专利第5,,585,089号；Riechmann et al.，Nature332：323(1988)，其全部内容结合于此作为参考)。抗体可利用本领域中已知的各种技术进行人源化，包括例如CDR移植(EP239,400、PCT公开第WO91/09967号、美国专利第5,225,539、5,530,101以及5,585,089号)、表面修饰或重新表面化(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka et al.，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska.et al.，PNAS 91：969-973(1994))，以及链改组(美国专利第5,565,332号)。

对于人类患者的治疗性治疗，完整的人抗体是特别期望的。人抗体可以通过本领域中已知的各种方法进行制备，包括上述噬菌体展示方法，其利用来源于人类免疫球蛋白序列的抗体文库。也参见美国专利第4,444,887和4,716,111号；以及PCT公开第WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735以及WO91/10741号；其全部内容均结合于此供参考。

人抗体还可以利用转基因小鼠来制备，其中转基因小鼠不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体可随机地或通过同源性重组而导入小鼠胚胎干细胞。可替环地，除了人重链和轻链基因，人可变区、恒定区以及多样化区也可以被导入小鼠胚胎干细胞。通过同源性重组，在导入人免疫球蛋白座位的情况下，可以分别或同时使鼠重链和轻链免疫球蛋白基因为非功能性的。特别地，JH区的同型缺失可阻止内源性抗体生成。将修饰的胚胎干细胞扩展并显微注入胚泡以产生嵌合小鼠。然后将嵌合小鼠加以繁殖以产生表达人抗体的同型后代。转基因小鼠以常规方式用选定抗原进行免疫，例如用希望的靶多肽的全部或部分。利用常规杂种细胞技术，可从该免疫的转基因小鼠获得针对所述抗原的单克隆抗体。由转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，随后发生类别转换和体细胞突变。因此，利用这样的技术，可以产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM、以及IgE抗体。对这种用于产生人抗体的技术的综述，参见Lonberg and Huszar Int.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。对这种用于产生人抗体和人单克隆抗体的技术以及用于产生这样的抗体的方案的详细论述，参见PCT公开第WO98/24893、WO96/34096、WO96/33735号以及美国专利第5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598号，其全部内容结合于此供参考。另外，诸如Abgenix、Inc.(Freemont，Calif)和Genpharm(San Jose，Calif)的公司可从事利用类似于上述的技术来提供针对所选抗原的人抗体。

识别选定抗原决定基的完整人抗体可利用称为“引导选择”的技术进行生成。在这种方式中，选定的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体被用来引导选择可识别相同抗原决定基的完全人抗体(Jespers et al.，Bio/Technology 12：899-903(1988))。也可参见美国专利第5,565,332号。

在另一个具体实施方式中，利用常规工艺(例如通过利用能够特异性结合于编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，编码期望的单克隆抗体的DNA可以很容易被分离和测序。分离和亚克隆的杂种细胞作为这样的DNA的优选来源。一旦分离，该DNA可被置于表达载体中，其随后被转染入原核或真核宿主细胞例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，否则这些细胞并不产生免疫球蛋白。更具体地，分离的DNA(如本文所述，其可以是合成的)可用来克隆用于制备抗体的恒定区和可变区序列，如在纽曼等的1995年1月25日提交的美国专利第5,658,570号中描述的，其内容结合于此供参考。实质上，这要求从选定细胞中提取RNA、转化成cDNA以及利用Ig特异性引物通过PCR进行扩增。用于该目的的合适引物也描述在美国专利第5,658,570号中。如下文将更详细讨论的，表达希望的抗体的转化细胞可以以相对较大数量进行培养，以提供免疫球蛋白的临床和商业供应。

在特定具体实施方式中，可通过本领域熟知的方法对重链和/或轻链可变结构域的氨基酸序列进行检查以鉴定补体决定区(CDR)的序列，例如通过比较其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列来确定序列高变区。利用常规重组DNA技术，一个或多个CDR可被插入构架区中，例如插入人构架区中以使非人抗体人源化。构架区可为天然存在或通用的构架区，并优选人构架区(人构架区的列表参见例如Chothia et al.，J.Mol.Biol.278：457-479(1998))。优选地，通过构架区和CDR组合生成的多核苷酸编码抗体，其特异性结合于希望多肽(例如Sp35)的至少一个抗原决定基。优选地，可在构架区内形成一个或多个氨基酸替代，并且优选地，该氨基酸替代增进抗体与其抗原的结合。另外，这样的方法可用来形成参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸替代或缺失，以生成缺失一个或多个链内二硫键的抗体分子。该多肽的其它改变包括在本发明的范围，并且也属于本领域技术人员的能力范围。

另外，可以使用那些开发用于产生“嵌合抗体”的技术(Morrison et al，Proc.Natl.Acad Sci.81：851-855(1984)；Neuberger et al.，Nature 312：604-608(1984)；Takeda et al.,Nature 314：452-454(1985))，其通过剪接来自具有适当抗原特异性的鼠抗体分子的基因以及来自具有适当生物学活性的人抗体分子的基因实现。如在本文中使用的，嵌合抗体是其中不同部分来源于不同动物种属的分子，如那些具有来源于鼠单克隆抗体的可变区以及人免疫球蛋白恒定区的抗体，如人源化抗体。

可替换地，描述用于产生单链抗体的技术(美国专利第4,694,778号、Bird，Science 242：423-442(1988)；Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；and Ward etal.，Nature 334：544-554(1989))可适于产生单链抗体。单链抗体通过借助于氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段形成，产生单链抗体。还可以采用那些用于在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的技术(Skerra et al.，Science 242：1038-1041(1988))

Sp35拮抗剂抗体也可以为在不能够产生内源性免疫球蛋白的转基因动物(例如小鼠)中生成的人抗体或相当于人抗体，(参见例如美国专利第6,075,181、5,939,598、5,591,669以及5,589,369号，其均结合于此供参考)。例如，已描述了在嵌合以及微生物种系突变小鼠中的抗体重链连接区的同型缺失，造成了内源性抗体生产的完全抑制。将人免疫球蛋白基因阵列转移到这样的种系突变小鼠，将由于抗原攻击而引起人抗体产生。另一种优选的利用SCID小鼠生成人抗体的方法披露在美国专利第5,811,524号中，其结合于此供参考。应该理解，与这些人抗体相关的遗传物质还可以如本文所述进行分离和处理。

另外一种效率极高的用于生成重组抗体的途径披露在Newman，Biotechnology 10：1455-1460(1992)中。特别地，这种技术导致形成含有猴可变结构域以及人恒定序列的灵长源化抗体。其全部内容结合于此供参考。此外，这种技术在共同受让的美国专利第5,658,570、5,693,780以及5,756,096号中也有描述，其均结合于此供参考。

在另一个具体实施方式中，可通过显微操作选择淋巴细胞并分离可变基因。例如，可从免疫的哺乳动物分离外围血单核细胞，并在体外培养约7天。筛选培养物以得到符合筛选标准的特异性IgG，可分离来自阳性孔的细胞。单个产生Ig的B细胞可通过FACS或通过在补体介导的溶血空斑试验中鉴定而分离。产生Ig的B细胞可显微注入管中，而V_H和V_L基因可利用RT-PCR进行扩增。V_H 和V_L基因可以被克隆入抗体表达载体中并转染到用于表达的细胞(例如真核或原核细胞)中。

可替换地，产生抗体的细胞系可利用技术人员所熟知的技术进行选择并培养。这样的技术在各种实验室手册以及一级出版物中有描述。在这个方面，如下文描述的适合用于本发明的技术描述在Current Protocols in Inmunology，Coligan et al.，Eds.，GreenPnblishing Associates and Wiley-Interscience，John Wiley and Sons，NewYork(1991)中，其全部内容结合于此供参考。

用于本文披露的治疗方法中的抗体可通过本领域已知的用于合成抗体的任何方法来产生，尤其是通过化学合成，或者优选通过如本文所述的重组表达技术。

应当进一步理解，本发明的范围进一步包括抗原结合DNA序列的全部等位基因、变异体或突变体。

如所熟知的，RNA可以通过标准技术如异硫氰酸胍提取和沉淀以及随后的离心或层析而从原始杂种细胞或从其它转化细胞中分离出来。理想的是，通过标准技术如oligo-dT纤维素上的层析从全部RNA中分离mRNA。合适的技术在本领域是熟知的。

在一个具体实施方式中，按照熟知的方法利用逆转录酶和DNA聚合酶，可同时或分开地制备编码抗体的轻链和重链的cDNA。PCR可利用通用引物启动或利用基于已公开的重链和轻链DNA以及氨基酸序列的更多特异性引物启动。如上所述，PCR还可用来分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆体。在这种情况下，文库可通过通用引物或者较大同源性探针如小鼠恒定区探针进行筛选。

DNA，通常是质粒DNA可利用本领域已知的技术从细胞中分离，并根据标准、熟知的技术进行限制性作图以及测序，该技术在关于重组DNA技术的前述文献中详细列出。当然，，DNA可根据本发明在分离工艺或随后的分析过程中的任何时间点进行合成。

抗体或者其片段、衍生物或类似物，例如为Sp35拮抗剂的抗体的重链或轻链的重组表达需要构建含有编码该抗体的多肽的表达载体。一旦已经获得本发明的编码抗体分子或者抗体重链或轻链或者其部分(优选含有重链或轻链的可变结构域)的多肽，则用于产生该抗体分子的载体可利用本领域熟知的技术通过重组DNA技术制备。因此，本文描述了用于通过表达多肽(其含有编码核苷酸序列的抗体)来制备蛋白的方法。本领域技术人员熟知的方法可以用来构建含有编码序列的抗体以及适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术以及体内遗传重组。因此，本发明提供了可复制载体，其包含编码本发明抗体分子或其重链或轻链、或重链或轻链可变结构域的核苷酸序列，并可操作地连接至启动子。这样的载体可以包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如PCT公开第WO86/05807WO89/01036号以及美国专利第5,122,464号)，并且抗体的可变结构域可以被克隆到这样的载体中用于表达整个重链或轻链。

通过传统技术将表达载体转移至宿主细胞，然后通过传统技术培养该转染细胞以产生用于本文所述方法的抗体。因此，本发明包括这样的的宿主细胞，其含有编码本发明的抗体或其重链或轻链的多肽，并可操作地连接至异源启动子。在优选的具体实施方式中，为了表达双链抗体，编码重链和轻链的载体可以在宿主细胞中共表达以表达整个免疫球蛋白分子，如下文详述的。

可利用各种宿主表达载体系统来表达用于本文所述方法的抗体分子。这样的宿主表达系统代表载体，编码感兴趣的序列可通过它产生并随后纯化；而且也代表细胞，其当用适当的核苷酸编码序列进行转化或转染时，其可以原位表达本发明的抗体分子。这些包括但不限于微生物如用重组噬菌体DNA、质粒DNA或者含有抗体编码序列的粘粒DNA载体转化的细菌(如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母菌(例如毕赤酵母菌(Saccharomyces，Pichia))；用含有抗体编码序列的病毒表达载体(例如杆状病毒(baculovirus))感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(cauliflowermosaic virus)、烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV))感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带含有来源于哺乳动物细胞(例如金属硫蛋白启动子)的基因组或哺乳动物病毒(例如腺病毒后期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BLK、293、3T3细胞)。优选地，细菌细胞如大肠杆菌，更优选地，真核细胞尤其是用于表达整个重组抗体分子的细胞被用于表达重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞如中华仓鼠卵巢细胞(CHO)，联合载体如来自人巨细胞病毒的主要中早期基因启动子因子，是用于抗体的有效表达系统(Foecking et al.，Gene 45：101(1986)；Cockett et al.，Bio/Technology 8：2(1990))。

在细菌系统中，大量表达载体可以根据希望用于表达的抗体分子的用途而有利地进行选择。例如，当为了生成抗体分子的药用组合物而要生产大量这样的蛋白时，指导易于纯化的表达高水平的融合蛋白产物的载体可以是理想的。这样的载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther et al.，EMBO J.2：1791(1983))，其中抗体编码序列可以单个地配合到具有lacZ编码区的载体读框中，以便产生融合蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，Nucleic AcidsRes.13：3101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))；等中。pGEX载体也可用来将外来多肽表达为带有谷光苷肽S转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这样的融合蛋白为可溶性的并且易于通过吸收并结合至基质谷光甘肽-琼脂糖珠子(matrixglutathione-agarose beads)及随后在游离谷光甘肽存在下的洗脱从溶解的细胞进行纯化。对pGEX载体进行设计以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，以使克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。

在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornica nuclear polyhedrosis cirus)(AcNPV)通常被用作表达外来基因的载体。该病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。抗体编码区可以单个地被克隆到病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)中并在AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下被放置。

在哺乳动物宿主细胞中，可利用大量基于病毒的表达系统。在将腺病毒用作表达载体的情况下，感兴趣的抗体编码序列可以结合至腺病毒转录/翻译控制复合体，例如后期启动子以及三联先导序列。然后通过体外或体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区(例如E1或E3区)将产生重组病毒，其是活的并且能够在感染的宿主中表达该抗体分子(参见例如(e.g.，see Logan & Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：355-359(1984))。特异性启动信号也可以需要用于有效翻译插入的抗体编码序列。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与希望的编码序列的读框同步以确保整个插入子的翻译。这些外源性翻译控制信号以及起始密码子可以为各种来源，可为天然和合成的。通过包括适当的转录增强因子、转录终止子等可增强表达下效率(参见Bittner et al.，Methods in Enzymol.153：51-544(1987))。

另外，可选择那些调节插入序列的表达或以希望的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白产物的这样的修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于蛋白功能可能非常重要。不同的宿主细胞对于蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰具有特性和特异机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保对表达的外来蛋白的正确修饰和加工。为此，可使用具有用于正确加工一级转录、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞手段的真核宿主细胞。这样的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38，并且尤其是乳腺癌细胞系例如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D，以及正常乳腺细胞系例如CRL7030以及Hs578Bst。

为了长期、高产率地生产重组蛋白，稳定表达是优选的。例如，可设计稳定表达抗体分子的细胞系。而不是利用含有病毒复制源的表达载体，宿主细胞可用由适当表达控制因子(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的DNA以及选择性标记物进行转化。在导入外来DNA后，可使设计的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转到选择培养基进行生长。重组质粒中的选择性标记物赋予对选择的抗性并允许细胞将质粒稳定地整合入其染色体中，并生长以形成转化灶(focus)，其随后可以被克隆并扩展到细胞系中。这种方法可有利地用来设计能稳定地表达抗体分子的细胞系。

可采用大量选择系统包括但不限于单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler et al.，Cell 11：223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska & Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202(1992))以及腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy et al.，Cell 22：817 1980)基因可分别应用于tk-、hgprt-或aprt细胞。同样，抗代谢产物抗性可用作选择下列基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨喋呤的抗性 (Wigler et al.，Natl.Acad.Sci.USA77：357(1980)；O′Hare et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；gpt，其赋予对麦考酚酸(mycophenoli acid)的抗性(Mulligan & Berg，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 78：2072(1981))；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性，Clinical Pharmacy12：488-505；Wu and Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；and Morgan andAnderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；，TIB TECH 11(5)：155-215(May，1993)；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre et al.，Gene 30：147(1984))。可使用的重组DNA技术的本领域熟知方法描述在Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，StocktonPress，NY(1990)；and in Chapters 12and 13，Dracopoli et al.(eds)，CurrentProlocols in Human Genetics，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin et al.，J.Mol.Biol.150：1(1981)中，其全部内容结合于此供参考。

可通过载体扩增来增加抗体分子的表达水平(评述参见Bebbington and Hentschel，The use ofvectors based on gene amplification for the eexpression of cloned genes inmammalian cells in DNA cloning，Academic Press，New York，Vol.3.(1987))。如果在表达抗体的载体系统中的标记物是可扩增的，则增加宿主细胞培养基中存在的抑制剂的水平将增加标记物基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体基因相关，因此抗体的生产也会增加(Crouse et al.，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))

宿主细胞可用本发明的两种表达载体共转染，第一个载体编码重链来源的多肽而第二个载体编码轻链来源的多肽。所述两个载体可以包含相同的可选择标记物，其能够使重链和轻链多肽等同表达。可替换地，可以采用既编码重链多肽又编码轻链多肽的单一载体。在这样的情况下，轻链有利地被置于重链之前，以避免过多的毒性游离重链(Proudfoot，Nature 322：52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197(1980))。用于重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。

一旦本发明的抗体分子已被重组地表达，则其可通过本领域已知的任何用于免疫球蛋白分子纯化的方法进行纯化，例如通过层析(例如离子交换、亲合性，尤其是通过用于在A蛋白之后对特定抗原的亲合性，以及分级柱层析)、离心、差异溶解或者通过任何其它用于蛋白纯化的标准技术。可替代地，在US2002 0123057 A1中披露了增加本发明的抗体亲合性的优选方法。

在一个具体实施方式中，用于本发明方法的结合分子或抗原结合分子包括合成的恒定区，其中一个或多个结构域部分或全部缺失(“结构域缺失的抗体”)。在某些具体实施方式中，相容性修饰的抗体将包括结构域缺失的构建体或变异体，其中去除了整个C_H2结构域(ΔC_H2构建体)。在其它具体实施方式中，短连接肽可以代替缺失的结构域以给可变区提供移动的灵活性和自由度。本领域技术人员将理解，这样的构建体是尤其优选地，这是由于C_H2结构域对抗体分解代谢速率的调节性能。

在某些具体实施方式中，用于本文所披露方法的修饰抗体是微抗体(minibody)。微抗体可利用在现有技术(参见例如美国专利第5,837,821号或者WO 94/09817A1)中描述的方法进行制备。

在另一个具体实施方式中，用于本文所披露方法的修饰抗体是本领域已知的C_H2结构域缺失抗体。结构域缺失的构建体可以利用编码人IgG1恒定结构域的载体(例如，来自Biogen IDECIncorporated)衍生得到(参见例如WO 02/060955A2以及WO02/096948A2)。这种示例性载体被设计而缺失C_H2结构域，并且提供表达结构域缺失的IgG1恒定区的合成载体。

在一个具体实施方式中，用于本文披露的治疗方法中的Sp35拮抗剂抗体或其片段包括的免疫球蛋白重链，其具有几个甚至单一氨基酸缺失或替代，只要其允许在单体亚单位之间关联。例如，在C_H2结构域的选定区域中单一氨基酸的突变可能足以显著减少Fc结合并因此增加肿瘤定位。类似地，可以理想地仅需要缺失这样的部分，其控制要被调节的效应子功能(例如补体结合)的一个或多个恒定区结构域。这样的恒定区的部分缺失可以改善选定的抗体特性(血清半衰期)，同时留下那些与受试者恒定区结构域紧密相关的其它希望的功能。此外，如上面间接提及的，所披露抗体的恒定区可以通过一个或多个氨基酸(其增强所得构建体的外形(profile))的突变来合成。在这个方面，有可能破坏由保守结合位点(例如Fc结合)提供的活性同时基本上保持修饰抗体的构型以及免疫原外形。而其它具体实施方式包括将一个或多个氨基酸加到恒定区，以增强期望的特性如效应子功能或者提供更多细胞毒素或糖类连接。在这样的具体实施方式中，可以理想地插入或复制起源于所选恒定区结构域的特定序列。

本发明还提供了抗体的用途，其包括、基本上由或者由本文描述的抗体分子(例如V_H区和/或V_L区)的变异体(包括衍生物)组成，其中抗体或其片段免疫特异性地结合于Sp35多肽。本领域技术人员已知的标准技术可用来将突变导入编码结合分子的核苷酸序列中，包括但不限于可导致氨基酸替代的定位突变以及PCR介导的突变。优选地，相对于参照V_H区、V_HCDR1、V_HCDR2、V_HCDR3、V_L区、V_LCDR1、V_LCDR2或V_LCDR3，变异体(包括衍生物)编码少于50个氨基酸替代、少于40个氨基酸替代、少于30个氨基酸替代、少于25个氨基酸替代、少于20个氨基酸替代、少于15个氨基酸替代、少于10个氨基酸替代、少于5个氨基酸替代、少于4个氨基酸替代、少于3个氨基酸替代或者少于2个氨基酸替代。“保守性氨基酸替代”这样一种替代，其中氨基酸残基由具有带相同电荷的侧链的氨基酸残基所取代。具有带相同电荷的侧链的氨基酸残基家族在本领域已经被定义。这些家族包括这样的氨基酸，其具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-支化侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。可替代地，突变可以沿着编码序列的全长或部分随机导入，如通过饱和化突变，并且对所得突变体进行生物活性筛选以鉴定保留活性的突变体。

例如，可能仅在读框区或仅在抗体分子的CDR区导入突变。导入的突变可以是沉默突变或中性错义突变，即对抗体结合抗原的能力没有影响或影响很小。这些类型的突变可以用于优化密码子用途或者改善杂种细胞的抗体生产。可替代地，非中性错义突变可以改变抗体结合抗原的能力。大多数沉默或中性错义突变的位置可能在构架区，同时大多数非中性错义突变可能在CDR，尽管这并不是绝对的要求。本领域技术人员能够设计并检测具有希望特性的突变分子，如抗原结合活性没有变化或结合活性有变化(例如抗原结合活性的提高或抗体特异性的改变)。突变之后，编码的蛋白可常规地被表达，并且可利用本文描述的技术或通过本领域已知的常规修饰技术来确定编码蛋白的功能和/或生物学活性。

融合蛋白以及轭合的多肽和抗体

用于本文披露的治疗方法中的Sp35多肽和抗体可以进一步在N-或C-末端被重组地融合至异源性多肽或者化学地轭合(包括共价和非共价轭合)于多肽或其它组分。例如，Sp35拮抗剂多肽或抗体可以重组地融合或轭合于在检测分析中作为标记物的分子以及效应子分子如异源多肽、药物、放射性核素或毒素。参见例如PCT公开第WO 92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624号；美国专利第5,314,995号以及欧洲专利第396,387号。

用于本文披露的治疗方法中的Sp35拮抗剂多肽和抗体包括经过修饰的衍生物，即通过任何类型的分子共价连接以使共价连接不阻止Sp35拮抗剂多肽或抗体抑制Sp35的生物学功能。例如但不限于，本发明的Sp35拮抗剂多肽和抗体可以通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、膦酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割、连接于细胞配体或其它蛋白等。多种化学修饰中的任何一种均可以通过已知技术，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢性合成等来实施。另外，衍生物可以包括一种或多种非经典的氨基酸。

用于本文披露的治疗方法中的Sp35拮抗剂多肽和抗体可以由通过肽键或修饰的肽键(即肽同型体)彼此结合的氨基酸组成，并且它们可以含有除了20个基因编码的氨基酸的氨基酸。Sp35拮抗剂多肽和抗体可由天然方法如翻译后加工而修饰，或通过本领域熟知的化学修饰技术进行修饰。这样的修饰在基础教材、较详尽的专作以及大篇幅的研究文献中均有详细描述。修饰可以发生于Sp35拮抗剂多肽或抗体的任何位置包括肽主链、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端或者诸如糖基的部分上。应该理解，在给定Sp35拮抗剂多肽或抗体的多个位点存在的同种类型修饰的程度可以相同或不同。同样，给定的Sp35拮抗剂多肽或抗体可以含有许多类型的修饰。Sp35拮抗剂多肽或抗体可以支化，例如由于泛素化而被支化；并且它们可以为环状，具有或没有支化。环状、分支或支化的环状Sp35拮抗剂多肽和抗体可以由天然翻译后加工所导致的或者可以通过合成方法而制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂或脂衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸酯(盐)的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形体形成、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、消旋作用、硒化、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸加成到蛋白质上如精氨酸化以及泛素化。(参见例如Proteins-Structure And Molecular Properties，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York 2nd Ed.，(1993)；Posttranslational Covalent Modification Of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pgs.1-12(1983)；Seifter et al.，Meth Enzymol182：626-646(1990)；Rattan et al.，Ann NY Acad Sci 663：48-62(1992)).

本发明还提供了融合蛋白，其包括、基本上由或者由抑制Sp35功能的Sp35拮抗剂多肽或抗体融合组成。优选地，Sp35拮抗剂多肽或抗体融合至其的异源多肽用于起Sp35拮抗剂多肽或抗体的作用或者靶向Sp35拮抗剂多肽或抗体。在本发明的某些具体实施方式中，可溶性Sp35拮抗剂多肽，例如包含LRR结构域、Ig结构域或者整个胞外结构域(对应于SEQ ID NO：2的34-532位氨基酸)的Sp35多肽被融合于异源性多肽部分而形成Sp35拮抗剂融合多肽。Sp35拮抗剂融合蛋白和抗体可用来实现多种目的，例如增长血清半衰期、提高生物可利用度、体内靶向特定器官或组织类型、提高重组表达有效性、改善宿主细胞分泌、易于纯化以及更高亲合力。根据待实现的目的，异源性部分可以为惰性或生物活性的。同样，在体外或体内其可加以选择以稳定地融合于Sp35拮抗剂多肽或抗体或者为可切割的。可实现这些其它目的的异源性部分在本领域中是已知的。

作为Sp35拮抗剂融合多肽或抗体表达的替换，选定的异源性部分可以预先形成并化学轭合于Sp35拮抗剂多肽或抗体。多数情况下，无论是否融合或轭合于Sp35拮抗剂多肽或抗体，选定的异源性部分可同样起作用。因此，下文论及异源性氨基酸序列时，除非另有指明，应当理解，异源性序列可以融合蛋白的形式或作为化学轭合物的形式结合至Sp35拮抗剂多肽或抗体。

药理活性的多肽如Sp35拮抗剂多肽或抗体常常表现出快速体内清除率，因此需要大剂量以在体内获得治疗有效的浓度。另外，小于约60kDa的多肽可以有效地经过肾小球过滤，其有时导致肾毒害。可采用相对较小的多肽如Sp35拮抗剂多肽或抗体的融合或轭合来降低或避免这样的肾毒性的危险。已知各种异源性氨基酸序列即多肽部分或“载体”可用于增加治疗性多肽的体内稳定性(即血清半衰期)。

由于其半衰期较长、体内分布较广以及缺乏酶促或免疫功能，基本上全长人血清白蛋白(HSA)、或HSA片段通常用作异源性部分。通过应用诸如教导在Yeh et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1904-08(1992)and Syed et al.，Blood 89：3243-52(1997)中的方法和材料，HSA可以用来形成Sp35拮抗剂融合多肽或抗体或者多肽/抗体轭合物，其通过Sp35部分显示药理活性，同时表现出显著增加的体内稳定性例如10倍-100倍或更高的稳定性。HSA的C-末端可以融合于可溶性Sp35部分的N-末端。由于HSA是天然分泌的蛋白，所以当融合蛋白在真核例如哺乳动物表达系统中生产时，则可利用HSA信号序列以实现将可溶性Sp35融合蛋白分泌到细胞培养基中。

信号序列是这样的多核苷酸，其编码启动蛋白跨内质网膜传输的氨基酸序列。用于构建免疫融合蛋白(immunofusin)的信号序列包括抗体轻链信号序列例如抗体14.18(Gillies et al.，J.Immunol.Meth.125：191-202(1989))、抗体重链信号序列例如MOPC141抗体重链信号序列(Sakano et al.，Nature 286：5774(1980))。可替换地，还可使用其它信号序列。参见例如Watson，Nucl.Acids Res.12：5145(1984)。信号肽通常在内质网腔内由信号肽酶切割。这导致含有Fc区和可溶性Sp35部分的免疫融合蛋白分泌。

在某些具体实施方式中，DNA序列可以编码在分泌盒与可溶性Sp35部分之间的蛋白水解性切割位点。这样的切割位点可以提供例如编码的融合蛋白的蛋白水解性切割，从而将Fc结构域与靶蛋白分开。有用的蛋白水解性切割位点包括由蛋白水解酶如胰蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、Xa因子或者肠激酶K识别的氨基酸序列。

所述分泌盒可以整合到可复制表达载体中。有用的载体包括线性核酸、质粒、噬菌粒、粘粒等。示例性表达载体是pdC，其中免疫融合蛋白DNA的转录被置于人巨细胞病毒增强子和启动子的控制之下。参见例如Lo et al.，Biochim.Biophys.Acta 1088：712(1991)；and Lo et al.，Protein Engineering11：495-500(1998)。适当的宿主细胞可用编码可溶性Sp35多肽的DNA进行转化或转染，并用于可溶性Sp35多肽的表达和分泌。通常使用的宿主细胞包括无限生长分化的杂种细胞、骨髓瘤细胞、293细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、Hela细胞以及COS细胞。

在一个具体实施方式中，可溶性Sp35多肽融合于铰链和Fc区，即Ig重链恒定区的C-末端。Sp35-Fc融合体的潜在优点包括可溶性、体内稳定性以及多价性例如形成二聚体。使用的Fc区可以为IgA、IgD或IgG Fc区(铰链区-C_H2-C_H3)。可替换地，其可以为IgE或IgM Fc区(铰链区-C_H2-C_H3-C_H4)。通常使用IgG Fc区，例如IgG₁ Fc区或IgG₄Fc区。在一个具体实施方式中，用于融合的是序列开始于铰链区、恰在化学上限定IgG Fc的木瓜蛋白酶切割位点的上游的序列(即216位残基，假定重链恒定区的第一个残基是根据Kabat系统的114位)，或者开始于其它免疫球蛋白类似位点的序列。形成融合的精确位点并不关键；特定位点是熟知的，并且可以选择以便优化分子的生物学活性、分泌或结合特性。用于构建和表达编码Fc融合蛋白的DNA的材料和方法在本领域中是已知的，并且可以无需过度试验即可采用以获得可溶性Sp35融合蛋白。本发明的部分具体实施方式采用Sp35融合蛋白如描述在Capon等的美国专利第5,428,130和5,565,335号中的那些。

完整的野生型Fc区显示出效应子功能，其通常在用于本发明方法的Fc融合蛋白中是不必要和不希望的。因此，通常在构建分泌盒的过程中，可将某些结合位点从Fc区缺失。例如，因其不必与轻链共表达，因此对于重链结合蛋白的结合位点Bip(Hendershot et al.，Immunol.Today 8：111-14(1987))从IgE的Fc区的C_H2结构域中缺失，使得这个位点不干扰免疫球蛋白的有效分泌。跨膜结构域序列如在IgM中存在的那些通常也被缺失。

最常使用的是IgG₁ Fc区。可替换地，免疫球蛋白γ的其它亚类(γ-2、γ-3和γ-4)的Fc区可用于分泌盒。免疫球蛋白γ-1的IgG₁ Fc区通常用于分泌盒中，并且包括至少部分铰链区、C_H2区以及C_H3区。在某些具体实施方式中，免疫球蛋白γ-1的Fc区是C_H2缺失的Fc，其包括铰链区的部分以及C_H3区，但不包括C_H2区。 C_H2缺失的Fc已由Gillies et al.，Hum.Antibod.Hybridomas 1：47(1990)描述。在部分具体实施方式中，使用IgA、IgD、IgE或IgM中任何一个的Fc区。

Sp35-Fc融合蛋白可以被构建为若干种不同的构型。在一个构型中，可溶性Sp35部分的C-末端直接融合于Fc铰链部分的N-末端。在一种稍微不同的构型中，短多肽例如2-10个氨基酸被并入在可溶性Sp35部分的N-末端与Fc部分的C-末端之间的融合体中。这样的连接物提供了构型的灵活性，其可以在某些情况下改善生物学活性。如果Fc部分内保留了铰链区的足够部分，则Sp35-Fc融合蛋白将二聚化，从而形成二价分子。同种群的单体Fc融合将产生单特异性的二价二聚体。两种单体Fc融合(其中每种均具有不同的特异性)的混合物将产生双特异性的二价二聚体。

含有相应氨基反应性基团和硫醇反应性基团的大量交联物中的任何一种均可用来将Sp35拮抗剂多肽连接于血清白蛋白。合适连接物的实例包括胺反应性交联剂，其插入硫醇反应性的马来酰亚胺，例如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS以及GMBS。其它合适连接剂插入硫醇反应性卤代乙酸酯机图例如SBAP、SIA、SIAB。可提供受保护或未受保护的硫醇用于与巯基反应以生成可还原键接的连接剂包括SPDP、SMPT、SATA以及SATP。这样的试剂现在已可商购获得(例如Pierce Chemicals)。

轭合不一定涉及可溶性Sp35多肽的N-末端或血清白蛋白上的硫醇部分。例如，可利用遗传设计技术来获得可溶性Sp35-白蛋白融合，其中可溶性Sp35部分在血清白蛋白的N-末端、C-末端或者两端融合。

可溶性Sp35多肽可融合于异源性肽以利于可溶性Sp35部分的纯化或鉴定。例如，组氨酸标签可融合于可溶性Sp35多肽以利于使用商业上可获得的层析介质进行纯化。

在本发明的部分具体实施方式中，可溶性Sp35融合构建体用来增强细菌中可溶性Sp35部分的生产。在这样的构建体中，通常以高水平表达和/或分泌的细菌蛋白被用作可溶性Sp35多肽的N-末端融合配体。参见例如Smith et al.，Gene 67：31(1988)；Hopp et al.，Biotechnology 6：1204(1988)；La Vallie et al.，Biotechnology 11：187(1993).

通过在合适融合配体的氨基末端和羧基末端融合可溶性Sp35部分，可以得到二价或四价形式的可溶性Sp35多肽。例如，可溶性Sp35部分可以融合于Ig部分的氨基末端和羧基末端以产生含有两个可溶性Sp35部分的二价单体多肽。一旦这些单体中的两个发生二聚化，借助于Ig部分，可获得四价形式的可溶性Sp35蛋白。这样的多价形式可用来实现对靶标的提高的结合亲合力。还可通过将可溶性Sp35部分串接放置以形成串联体而获得多价形式的可溶性Sp35部分，其中串联体可单独应用或者融合于融合伴侣如Ig或HAS加以应用。

轭合聚合物(不同于多肽)

本发明的某些具体实施方式涉及可溶性Sp35多肽或Sp35抗体，其中一个或多个聚合物被轭合(共价连接)于该Sp35多肽或抗体。适合于这样的轭合的聚合物的实例包括多肽(上述的)、糖聚合物以及聚亚烷基二醇链。通常但不是必须，聚合物被轭合于可溶性Sp35多肽或Sp35抗体用于改善下列中的一个或多个：溶解性、稳定性或生物可利用度。

通常用于轭合于Sp35拮抗剂多肽或抗体的聚合物种类是聚亚烷基二醇。聚乙二醇(PEG)是最经常使用的。PEG部分例如1、2、3、4、5个PEG聚合物可轭合于每个Sp35拮抗剂多肽或抗体以与Sp35拮抗剂多肽或抗体单独相比可增加血清半衰期。PEG部分是非抗原性的，并且基本上是生物惰性的。用于实施本发明的PEG部分可为分支或非分支的。

连接于Sp35拮抗剂多肽或抗体的PEG部分的数量以及单个PEG链的分子量可以不同。通常，聚合物分子量越高，连接于多肽的聚合物链就越少。通常，连接于Sp35拮抗剂多肽或抗体的整个聚合物质量为20kDa到40kDa。因此，如果连接了一条聚合物链，则链的分子量通常为20-40kDa。如果连接了两条链，则每条链的分子量通常为10-20kDa。如果连接了三条链，则分子量通常为7-14kDa。

聚合物例如PEG可以通过多肽上的任何合适、暴露的反应性基团而连接于Sp35拮抗剂多肽或抗体。该暴露的反应性基团可以为例如内部赖氨酸残基的N-末端氨基或ε氨基或二者。活化的聚合物可以在Sp35拮抗剂多肽或抗体上的任何游离氨基处反应并共价连接。Sp35拮抗剂多肽或抗体(如果可用)的游离羧基、适当活化的羰基、羟基、胍基、咪唑、氧化的糖部分以及巯基也可以用作用于聚合物连接的反应性基团。

在轭合反应中，根据多肽浓度，通常采用每摩尔的多肽约1.0到约10摩尔的活化聚合物。通常，所选比率表示在最大化反应与最小化副反应(常为非特定的)之间的平衡，其中副反应会削弱Sp35拮抗剂多肽或抗体的期望药理活性。优选地，至少保留Sp35拮抗剂多肽或抗体的50％的生物学活性(如在例如本文描述的或本领域已知的测定中所证实的)，并且最优选保留几乎100％的生物学活性。

利用常规化学技术，可将聚合物轭合于Sp35拮抗剂多肽或抗体。例如，聚亚烷基二醇部分可偶联于Sp35拮抗剂多肽或抗体的赖氨酸ε氨基。连接于赖氨酸侧链可通过N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活性酯如PEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS-PEG)以及琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA-PEG)来完成。合适的聚亚烷基二醇部分包括例如羧甲基-NHS以及正亮氨酸-NHS，SC。这些试剂可以商业购得。其它胺反应性PEG连接剂可代替琥珀酰亚胺基部分。这些包括例如异硫氰酸酯、硝基苯基碳酸酯(PNP)、环氧化物、碳酸苯并三唑、SC-PEG、三氟磺化乙烷(tresylate)、醛、环氧树脂、碳酰咪唑以及碳酸PNP。通常将条件优化以使反应的选择性和程度达到最大化。这样的反应条件的优化在本领域普通技术人员的能力范围之内。

可通过本领域已知的聚二乙醇化反应中的任何一种来实现聚二乙醇化，参见例如Focus on Growth Factors 3：4-10(1992)以及欧洲专利申请EP 0 154 316以及EP 0 401 384。可利用活性聚乙二醇分子(或类似的活性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来实现聚二乙醇化。

通过酰化的聚乙二醇化通常涉及反应聚乙二醇的活性酯衍生物。在聚乙二醇化中可采用任何活性PEG分子。酯化于N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的PEG常常是使用的活化PEG酯。如在本文中使用的，“酰化”包括但不限于治疗性蛋白与水溶性聚合物如PEG之间的下列类型的键接，例如：酰胺、氨基甲酸酯、脲等。参见例如Bioconiugate Chem.5：133-140，1994。通常选择反应参数以避免损害可溶性Sp35多肽或使其失活的温度、溶剂以及pH条件。

通常，连接键是酰胺，并且通常至少95％的所得产物是单、二或三聚乙二醇化。然而，某些具有较高程度聚乙二醇化的物种可以以取决于所使用的特定条件的量形成。可选地，纯的聚乙二醇化物种可通过常规纯化方法从混合物特别是未反应的物种中分离，包括例如透析、盐析、超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水性交换层析以及电泳。

利用烷基化反应的聚乙二醇化通常涉及在还原剂存在下使PEG的末端的醛衍生物与Sp35拮抗剂多肽或抗体发生反应。另外，可以调节反应条件以有利于基本上仅在Sp35拮抗剂多肽或抗体的N-末端氨基发生聚乙二醇化，即单聚乙二醇化蛋白。在单聚乙二醇化或多聚乙二醇化的情况下，PEG基团通常通过-C_H2-NH基连接到蛋白上。尤其优选-C_H2-基团，这种类型的键称为“烷基”键。

通过还原性烷化反应以产生N-末端靶向单-聚乙二醇化产物的衍生化可利用那些可用于衍生化的不同类型伯氨基(赖氨酸相对的N-末端)的差异反应性。进行反应的pH允许利用在赖氨酸残基的ε-氨基与蛋白的N-末端氨基之间的pKa差异。通过这样的选择性衍生化，可以控制含有诸如醛的活性基团的水溶性聚合物与蛋白的连接：与聚合物的轭合主要发生在蛋白的N-末端，并且未发生其它活性基团如赖氨酸侧链氨基的显著修饰。

用于酰化以及烷基化方法中的聚合物分子选自水溶性聚合物。所选聚合物通常被修饰以具有单一活性基团如用于酰化的活性酯或者用于烷基化的醛，以使聚合度可按照本发明提供的方法加以控制。示例性活性PEG醛是水稳定性的聚乙二醇丙醛或其C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(参见例如Harris et al.，U.S.Pat.No.5,252,714)。聚合物可以为分支或未分支的。对于酰化反应，所选择的聚合物通常具有单个活性酯基。对于还原性烷基化，所选择的聚合物通常具有单个活性醛基。通常，水溶性聚合物不从天然存在的糖基残基中选择，因其通常利用哺乳动物重组表达系统可更方便地加以制备。

用于制备聚乙二醇化的可溶性Sp35多肽或抗体的方法通常包括步骤(a)在一定条件下使Sp35拮抗剂多肽或抗体与聚乙二醇(如PEG的活性酯或醛衍生物)发生反应，从而该分子被连接于一个或多个PEG基团，以及(b)得到反应产物。通常，基于已知的参数和希望的结果，用于酰化反应的最佳反应条件视具体情况进行确定。例如，较大的PEG/蛋白比率通常得到更大百分比的的多聚乙二醇化产物。

用于产生基本上同种的单聚合物/可溶性Sp35多肽或Sp35抗体的还原性烷基化包括下列步骤：(a)在还原性烷基化条件下，使Sp35蛋白或多肽与活性聚乙二醇分子发生反应，反应的pH适于自动记录(pen-nit)该多肽或抗体的N-末端氨基的选择性修饰；以及(b)得到反应产物。

对于基本上同种的单聚合物/可溶性Sp35多肽或Sp35抗体，还原性烷基化反应条件为允许水溶性聚合物部分选择性连接于多肽或抗体的N-末端的条件。这样的反应条件通常提供在赖氨酸侧链氨基与N-末端氨基之间的pKa差异。对于本发明来说，pH通常在3-9的范围，典型的为3-6。

可溶性Sp35多肽或抗体可包括标签，例如随后可通过蛋白水解而释放的部分。因此，赖氨酸部分可以选择性修饰，其通过首先使经修饰的His标签与低分子量连接剂发生反应，该连接剂如既可与赖氨酸又可与N-末端反应的Traut’s试剂，然后释放His标签。然后多肽将含有一个游离的SH基团，其可用含有硫醇反应性头部基团如马来酰亚胺基、乙烯基砜基团、卤代乙酸酯基团或者游离的或受保护的SH的PEG进行选择性修饰。

Traut’s试剂可以用任何用于构建特异性PEG连接位点的连接剂所代替。例如，Traut’s试剂可以用SPDP、SMPT、SATA或者SATP 取代(Pierce)。类似的，可以使蛋白与氨基活性连接剂反应，其中连接剂插入马来酰亚胺(例如SMCC、AMAS、BMPS、MBS、EMCS、SMPB、SMPH、KMUS或者GMBS)、卤代乙酸酯基团(例如SBAP、SIA、SIAB)或者乙烯基砜基团，以及使得到的产物与含有游离SH的PEG进行反应。

在部分具体实施方式中，聚亚烷基二醇部分偶联于Sp35拮抗剂多肽或抗体的半胱氨酸基团。偶联可以利用例如马来酰亚胺基团、乙烯基砜基团、卤代乙酸酯基团或者硫醇基团来实现。

可选地，可溶性Sp35多肽或抗体通过不稳定键轭合于聚乙二醇部分。该不稳定键可以在例如生化水解、蛋白水解或巯基切割中被切割。例如，所述键可以在体内(生理性)条件下被切割。

如果活性基团位于N-末端的α氨基，则反应可通过任何恰当的用于使生物活性物质与惰性聚合物发生反应的方法来进行，通常在约pH 5-8，例如pH 5、6、7、8。通常该方法涉及制备活化的聚合物以及随后使蛋白与活化的聚合物进行反应以产生适于制剂的可溶性蛋白。

Sp35多核苷酸拮抗剂

特定具体实施方式包括治疗脱髓鞘或髓鞘功能不良失调的方法，包括给予有效量的Sp35多核苷酸拮抗剂，其含有特异性结合于编码Sp35的多核苷酸的核酸分子。Sp35多核苷酸拮抗剂阻止Sp35的表达(击倒)。Sp35多核苷酸拮抗剂包括但不限于反义分子、核酶、siRNA、shRNA以及RNAi。典型地，这样的结合分子分别给予动物(参见例如O’Connor，J.Neurochem.56：560(1991))，但这样的结合分子还可在体内由宿主细胞吸收并在体内表达的多核苷酸进行表达。还可参见 Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRCPress，Boca Raton，FL(1988)。

RNAi指的是一种可干扰靶向的mRNA表达的RNA表达。特别地，RNAi通过siRNA(短干扰性RNA)与特定mRNA(例如Sp35)相互作用而使靶向的基因沉默。然后，双链RNA(dsRNA)复合体由细胞靶向降解。其它RNAi分子包括短发夹RNA(shRNA)，也称为短干扰发夹。shRNA分子包含来自于通过环连接的靶基因的正义和反义序列。shRNA从胞核输送至胞浆，与mRNA一起降解。Pol III或U6启动子可用来表达用于RNAi的RNA。

RNAi由双链RNA(dsRNA)分子介导，dsRNA具有序列特异性与其“靶”mRNA(Caplen et al.，Proc Natl Acad Sci USA 98：9742-9747，2001)的同源性。在果蝇无细胞的溶胞液中进行的生化研究表明，RNA依赖性基因沉默的介导剂是21-25个核苷酸“小干扰”RNA双链体(siRNA)。因此，siRNA分子有利地用于本发明的方法。siRNA起源于通过称为DICER的RNA酶的dsRNA加工(Bernstein et al.，Nature 409：363-366，2001)。看起来siRNA双链体产物被吸收到名为RISC(RNA诱导的沉默复合体)的多蛋白siRNA复合体中。不希望任何特定理论限制，相信RISC被引导至靶mRNA，其中siRNA双链体作用于以催化方式特异性介导切割的序列(Bernstein et al.，Nature 409：363-366，2001；Boutla et al.,Curr Biol 11：1776-1780，2001).

RNAi已用于分析基因功能和鉴定哺乳动物细胞中的必要基因(Elbashir et al.，Methods 26：199-213，2002；Harborth et al.，J Cell Sci 114：4557-4565，2001)，所述细胞包括但不限于神经元(Krichevsky et al.，Proc Natl Acad Sci USA99：11926-11929，2002)。正在评价RNAi的治疗模式，如抑制或阻断病毒的感染、复制和/或生长，所述病毒包括但不限于脊髓灰质炎病毒(poliovirus)(Gitlin et al.，Nature 418：379-380，2002)知HIV(Capodici et al.，J Inmunol 169：5196-5201，2002)，以及降低致癌基因的表达(例如bcr-abl基因；Scherr etal.，Blood Sep 26epub ahead of print，2002)。RNAi已经用来调节哺乳动物(小鼠)和两栖动物(非洲蟾蜍)胚胎(分别见Calegari et al.，Proc Natl Acad Sci USA 99：14236-14240、2002；and Zhou，et al.，Nucleic Acids Res 30：1664-1669，2002)、以及出生后小鼠(Lewis et al.，Nat Genet 32：107-108，2002)中的基因表达，以及用来降低成年转基因小鼠中的转基因表达(McCaffrey et al.，Nature 418：38-39，2002)。已描述了用于确定细胞培养物和体内siRNA的效力以及特异性(参见例如Bertrand et al.，Biochem Biophys Res Commun 296：1000-1004，2002；Lassus et al.，Sci STKE2002(147)：PL13，2002；and Leirdal et al.，Biochem mophys Res Commun295：744-748，2002).

介导RNAi的分子(包括但不限于siRNA)可在体外通过化学合成(Hohjoh，FEBS Lett 521：195-199，2002)、dsRNA的水解(Yang et al.，Proc Natl Acad Sci USA 99：9942-9947，2002)、通过利用T7RNA聚合酶的体外转录(Donzeet etal.，Ncleic Acids Res 30：e46，2002；Yu et al.，Proc Natl Acad Sci USA99：6047-6052，2002)以及通过利用核酸酶如大肠杆菌RNA酶III的双链RNA水解(Yang et al.，Proc Natl Acad Sci USA 99：9942-9947，2002)产生

siRNA分子还可通过两个寡核苷酸彼此退火而形成，通常具有下列通式结构，其包括双链和单链部分：

|-m-| (突出端)

|-x-| (“核”)

5′-XXXXXXXXXXXXNNNNN-3′(SEQ ID NO：73)

：：：：：：：：：：：：

3′-NNNNNYYYYYYYYYYYY-5′(SEQ ID NO：74)

|-n-|(突出端)

其中N、X和Y是核苷酸；X与Y形成氢键；“：”表示两个碱基之间的氢键；x是一个自然数，其值在1到约100之间；而m和n是相互独立的整数，其值在0到约100之间。在部分具体实施方式中，N、X和Y是相互独立的A、G、C和T或U。非天然存在的碱基和核苷酸可以存在，特别是在合成的siRNA(即两个寡核苷酸退火的产物)中。双链中部称为“核”，并且具有作为测量单位的碱基对(bp)；单链部分是突出端(overhang)，具有作为测量单位的核苷酸(nt)。示出的突出端是3’突出端，但具有5’突出端的分子也在本发明的范围之内。不具有突出端(即m＝0且n＝0)的siRNA分子以及在核的一个侧面具有突出端而另一个侧面不具有突出端的分子(例如m＝0且n≥1；反之亦然)也在本发明的范围内。

最初，RNAi技术似乎不易于应用于哺乳动物系统，这是因为在哺乳动物中dsRNA激活dsRNA-激活的蛋白激酶(PKR)，导致调亡级联反应以及细胞死亡(Der et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：3279-3283，1997)。另外，很久以来已知dsRNA激活哺乳动物细胞中的干扰素级联反应，其也可以导致改变细胞生理学(Colby et al，Annu.Rev.Microbiol.25：333，1971；Kleinschmidt et al.，Annu.Rev.Biochem.41：517，1972；Lampson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 58L782，1967；Lomniczi etal..J.Gen.Virol.8：55，1970；and Younger et al.，J.Bacteriol.92：862，1966). 然而，dsRNA介导的PKR和干扰素级联反应的激活需要长于约30个碱基对的dsRNA。相反，长度小于30个碱基对的dsRNA已证实可在哺乳动物细胞中产生RNAi(Caplen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9742-9747，2001)。因此，希望可通过制备基本上游离于较长dsRNA的短RNA来避免与较长dsRNA分子相关的不希望的非特异性效应。

关于siRNA的参考文献：Bernstein et al.，Nature 409：363-366，2001；Boutla et al.，Curr Biol 11：1776-1780，2001；Cullen，Nat Immunol.3：597-599，2002；Caplen et al.，Proc Natl Acad Sci USA 98：9742-9747，2001；Hamilton et al.，Science 286：950-952，1999；Nagase et al.，DNA Res.6：63-70，1999；Napoli et al.，Plant Cell2：279-289，1990；Nicholson et al.，Mamm.Genome 13：67-73，2002；Parrish et al.，Mol Cell 6：1077-1087，2000；Romanoet al.，MolMicrobiol 6：3343-3353，1992；Tabara et al.，Cell 99：123-132，1999；and Tuschl，Chembiochem.2：239-245，2001.

Paddison等(Genes & Dev.16：948-958，2002)已经使用了折叠成发夹的小RNA分子作为实现RNAi的工具。因此，这样的短发夹RNA(shRNA)分子也可有利地用于本发明所述的方法。功能性shRNA的主干和环的长度可以变化；主干长度可变动于约25至约30nt的任何值，而环大小可变动于4至约25nt之间同时不影响沉默活性。尽管不希望受任何特定理论束缚，但可以相信这些shRNA类似于DICER RNA酶的dsRNA产物，而且在任何情况下，均具有相同的用于抑制特定基因表达的能力。

在本发明的部分具体实施方式中，shRNA由如实施例1所述的慢病毒载体(pLL3.7)所表达。

反义技术可以用来通过反义DNA或RNA或者通过三重螺旋链形成以控制基因表达。反义技术描述在例如Okano，J.Neurochem.56：560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRCPress，Boca Raton，FL(1988)中。三重螺旋链的形成描述在例如Lee et al.，Nucleic Acids Research 6：3073(1979)；Cooney et al.，Science 241：456(1988)；and Dervan et al.，Science 251：1300(1991)中。所述方法基于多核苷酸结合于互补性DNA或RNA。

例如，编码Sp35的多核苷酸的5’编码部分可用来设计长度为约10至40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被设计为互补于涉及转录的基因的区域，由此阻止转录和产生靶蛋白。反义RNA寡核苷酸在体内杂交于mRNA，并阻断mRNA分子翻译成靶多肽。

在一个具体实施方式中，通过从外源性序列转录而在细胞内产生特异于Sp35基因的反义核酸。例如，载体或其一部分经过转录，产生反义核酸(RNA)。这样的载体可保留游离或整合于染色体，只要其可被转录而产生需要的反义RNA。这样的载体可通过本领域标准化的重组DNA技术方法进行构建。载体可以为质粒、病毒或本领域中已知的其它载体，用于在脊椎动物细胞中的复制和表达。反义分子的表达可通过本领域已知的在脊椎动物(优选人类细胞)中发挥作用的任何启动子，如本文中它地方所述。

尽管优选反义分子的绝对互补性，但并非必要。互补于编码Sp35的RNA至少一部分的序列指的是这样一个序列，其具有足够的互补性而能够与该RNA杂交，形成稳定的双链体；或者形成可测定的三重螺旋体。杂交能力取决于互补程度以及反义核酸的长度。通常，杂交核酸越大，其含有的碱基错配会越多，但仍然形成稳定双链体(视具体情况可为三重螺旋体)。本领域技术人员可利用标准步骤测定杂交复合物的熔点而确定可接受程度的错配。

互补于信使RNA 5’末端(例如5’未翻译序列直至并包括AUG起始密码子)的寡核苷酸，在抑制翻译方面应该最有效。然而，互补于mRNA的3’未翻译序列的序列已表明在抑制mRNA翻译方面也有效。通常参见Wagner，R.，Nature 372：333-335(1994)。因此，互补于5’或3’未翻译、非编码区的寡核苷酸可用于反义途径以抑制Sp35的翻译。互补于mRNA的5’未翻译区的寡核苷酸应该包括AUG起始密码子的补体。互补于mRNA编码区的反义寡核苷酸是翻译的较低有效抑制剂，但可按照本发明使用。反义核酸长度应该至少为6个核苷酸，优选长度变动于6至约50个核苷酸的寡核苷酸。在特定方面，寡核苷酸为至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或者至少50个核苷酸。

用于本文披露的治疗方法中的多核苷酸可以为DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修饰的形式，可为单链或双链。寡核苷酸可以在碱基部分、糖部分或磷酸酯主链加以修饰，例如以改善所述分子的稳定性、杂交等。寡核苷酸可以包括其它附属部分如肽(例如用于靶向于体内宿主细胞受体)或促进输送跨越细胞膜(见例如Letsinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：6553-6556(1989)；Lemaitre et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.84：648-652(1987))；于1998年11月15日公开的PCT公开WO88/09810)或血脑屏障(参见例如1988年4月25日公开的第WO89/10134号PCT公开申请案)试剂、杂交启动的切割试剂(参见例如Krol et al.，BioTechniques 6：958-976(1988))或嵌入剂(参见例如Zon，Pharm.Res.5：539-549(1988))。为此，寡核苷酸可轭合于另一个分子例如肽、杂交启动的交联剂、转移剂、杂交启动的切割剂等。

用于本文披露的治疗方法中的反义寡核苷酸可包括至少一个修饰的碱基部分，其选自以下的组，其包括但不限于5氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基胺甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基胺甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N-6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N-6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲胺甲基尿嘧啶、5-甲氧胺甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5’甲氧羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N-6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-甲基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3(3-氨基-3-N2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、以及2，6-二氨基嘌呤。

用于本文披露的治疗方法中的反义寡核苷酸还可以包括至少一个修饰的糖部分，其选自以下的组，其包括但不限于阿拉伯糖、2-氟代阿拉伯糖、木酮糖以及己糖。

在又一个具体实施方式中，用于本文披露的治疗方法中的反义寡核苷酸包括至少一个修饰的磷酸酯主链，其选自以下的组，其包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸胺、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯、以及甲缩醛或其类似物。

在又一个具体实施方式中，用于本文披露的治疗方法中的反义寡核苷酸是α-端基(差向)异构寡核苷酸。α-端基异构寡核苷酸与互补RNA形成特异性双链杂交体，其中与通常情况相反的是，所述链彼此平行(Gautier et al.，Nucl.Acids Res.15：6625-6641(1987))。寡核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue et al.，Nucl.Acids Res.15：6131-6148(1987))，或嵌合性RNA-DNA类似物(Inoue et al.，FEBS Lett.215：327-330(1987))。

本发明的多核苷酸可利用本领域已知的标准方法合成，例如利用自动化DNA合成器(如可从Biosearch，Applied Biosystems等购得)。作为实例，硫代磷酸酯寡核苷酸可通过Stein et al.，Nucl.Acids Res.16：3209(1988)中的方法合成，甲基膦酸酯寡核苷酸可利用可控孔玻璃聚合物支持物来制备(Sarin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：7448-7451(1988))等

用于本文披露的治疗方法中的多核苷酸组合物进一步包括催化RNA或者核酶(参见例如1990年10月4日公开的PCT国际公开WO90/11364；Sarver et al.，Science 247：1222-1225(1990))。优选利用锤头核酶。锤头核酶在由与靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区所指定的位点切割mRNA。唯一要求的是靶mRNA具有下列两个碱基的序列：5’-UG-3’。锤头核酶的构建和生产在本领域是熟知的，并且在Haseloff and Gerlach，Nature 334：585-591(1988)中更充分的加以阐述。优选地，核酶被设计以使切割识别位点位于靶mRNA的5’末端附近，即以增加效率并将分子内非功能性mRNA转录本的堆积减少到最少。

如在反义方式中，用于本文披露的诊断和治疗方法的核酶可由修饰的寡核苷酸构成(例如，为了改善稳定性、靶向性等)，并且可以递送至体内表达Sp35的细胞。编码核酶的DNA构建体可以如上所述导入反义编码DNA的相同方式被导入细胞。优选的递送方法涉及到在强构建性启动子如pol III或pol II启动子的控制之下利用“编码”该核酶的DNA构建体，以使转染的细胞产生足够量的核酶以破坏内源性Sp35信息以及抑制翻译。与反义分子不同，由于核酶是催化性的，所以为了达到效用需要较低的细胞内浓度。

载体

包含编码Sp35拮抗剂的核酸的载体也可以用于生产用于本发明方法中的拮抗剂。载体和这样的核酸可操作地连接至其的表达控制序列的选择取决于所希望的功能性(例如蛋白表达)、以及待转化的宿主细胞。

对于调节可操作连接的编码序列的表达很有用的表达控制因子在本领域是已知的。实例包括但不限于诱导性启动子、构建性启动子、分泌信号、以及其它调节性因子。当使用诱导性启动子时，其例如可通过宿主细胞介质中的营养状况变化、或温度变化而被控制。

载体可包括原核复制子，即具有在细菌宿主细胞中引导自主复制并保持染色体外的重组DNA分子的能力的DNA序列。这样的复制子在本领域是熟知的。另外，包括原核复制子的载体还可以包括其表达赋予可检测标记如药物耐受性的基因。细菌药物抗性基因的实例为对氨苄青霉素(ampicilin)或四环素赋予抗性的那些基因。

包括原核复制子的载体也可包括原核或抗菌素启动子用于引导细菌宿主细胞中的编码基因序列的表达。与细菌宿主相容的启动子序列通常在含有用于便利待表达DNA片段插入的限制位点的质粒载体中提供。这样的质粒载体的实例为pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(BioRad)、pPL以及pKK223(Pharmacia)。任何合适的原核宿主可以用于表达编码用于本发明方法中的蛋白的重组DNA分子。

对于本发明来说，可以采用大量的表达载体系统。例如，一类载体利用DNA因子，其衍生自动物病毒如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录酶病毒(RSV，MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其它涉及具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的应用。另外，已将DNA并入其染色体中的细胞可以通过引入允许选择转染的宿主细胞的一个或多个标记物加以选择。标记物可以为自养宿主提供原营养、杀生剂抗性(例如抗生素)或对重金属如铜的耐受性。该可选择的标记基因可以或者直接连接至待表达的DNA序列、或者通过共转化引入到同一细胞中。新霉素磷酸转移酶(neo)基因是可选标记基因的一实例(Southern et al.，J.Mol.Anal.Genet.1：327-341(1982))。还可以需要其它因子用于mRNA的最佳合成。这些因子可以包括信号序列、剪接信号、以及转录启动子、增强子、和终止信号。

在一个具体实施方式中，可以使用Biogen IDEC，Inc.的称为NEOSPLA的所有表达载体(美国专利6,159,730)。这种载体含有细胞巨化病毒启动子/增强子、小鼠β球蛋白主启动子、SV40复制源、牛生长素多腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因以及前导序列。已发现这种载体导致在CHO细胞中转染的非常高水平的表达，接着是在含有介质的G418中的选择和氨甲喋呤扩增。当然，能够在真核细胞中引导表达的任何表达载体可以用于本发明。合适的载体的实例包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、PCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、以及质粒pCI(可获自Promega，Madison，WI)。另外的真核细胞表达载体在本领域是已知的并且可商业性获得。通常，这样载体含有用于插入希望的DNA片段的便利限制位点。示例性载体包括pSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1、pml2d(InternationalBiotechnologies)、pTDT1(ATCC 31255)、逆转录酶病毒表达载体 pMIG以及pLL3.7、腺病毒穿梭载体pDC315、以及AAV载体。其它示例性载体系统披露于例如美国专利6,413,777中。

通常，筛选大量用于适宜表达高水平的拮抗剂的转化细胞是常规实验，其可由例如机器人系统来完成。

经常使用的用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括在哺乳动物细胞中引导高水平的蛋白质表达的病毒因子，如衍生自逆转录酶病毒LTR、细胞巨化病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要后启动子(AdmlP))的启动子和增强子，多瘤和大哺乳动物启动子如本身的免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。对于病毒调节性因子及其序列的进一步描述，参见例如Stinski的美国专利第5,168,062号；Bell的美国专利第4,510,245号；以及Schaffner的美国专利第4,968,615号。

重组表达载体可以带有调节在宿主细胞(例如，复制源)和可选标记基因中载体的复制的序列。可选标记基因促进宿主细胞(载体已被引入其中)的选取(参见，例如Axel的美国专利第4,399,216、4,634,665以及5,179,017号)。例如，通常可选标记基因对在宿主细胞(载体已被引入其中)上的药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤赋予抗性。经常使用的可选标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)以及neo基因(用于G418选择)。

编码Sp35拮抗剂的载体可被用于合适宿主细胞的转化。可以通过任何合适的方法进行转化。用于将外源DNA引入哺乳动物细胞中的方法在本领域是熟知的并且包括葡聚糖介导转染、磷酸钙沉淀、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)介导转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体中的多核苷酸的囊化 (encapsulation)，并将DNA的显微注射导入细胞核中。另外，核酸分子可以通过病毒载体引入哺乳动物细胞中。

宿主细胞的转化可通过适合于采用载体和宿主细胞的传统方法来完成。对于原核宿主细胞的转化，可采用电穿孔和盐处理方法(Cohen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：2110-14(1972))。对于脊椎动物细胞的转化，可采用电穿孔、阳离子脂类或盐处理方法。参见例如Graham et al.，Virology 52：456-467(1973)；Wigler et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：1373-76(1979)。

用于蛋白质表达的宿主细胞系最有选为哺乳动物源；相信本领域的技术人员具有优先确定特定宿主细胞系(其最佳地适合于在其中待表达的所希望的基因产品)的能力。示范性宿主细胞系包括但不限于NSO、SP2细胞、幼年仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞DG44以及DUXB11(中华仓鼠卵巢系，没有DHFR)、HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾系)、COS(具有SV40 T抗原的CVI的衍生物)、R1610(中华仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)以及293(人肾)。宿主细胞系通常可从商业服务点、美国组织培养中心或从公开文献获得。

来自生产细胞系的多肽的表达可利用已知技术来增强。例如，谷酰胺合成酶(GS)系统通常在某种条件下用于增强表达。参见例如欧洲专利第0216 846、0 256 055、和0 323 997号以及欧洲专利申请第89303964.4号。

宿主细胞

用于表达用于本发明方法中的Sp35拮抗剂的宿主细胞可以是原核或真核细胞。示例性真核宿主细胞包括但不限于酵母细胞和哺乳动物细胞例如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞(ATCC登记号CCL61)、NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH-3T3(ATCC登记号CRL1658)、以及幼年仓鼠肾细胞(BHK)。其它有用的真核宿主细胞包括昆虫细胞以及植物细胞。示例性原核宿主细胞是大肠杆菌和链霉菌(Streptomyces)。

基因治疗

利用治疗神经系统疾病、失调或损伤的基因治疗方法(其中治疗性有益地增进少突细胞的存活、增生以及分化或增进神经元的髓鞘生成)，在哺乳动物(例如人类患者)体内可产生Sp35拮抗剂。这涉及给予合适的编码核酸(其可操作地连接至合适的表达控制序列)的Sp35拮抗剂。通常，这些序列被并入载体中。用于这样的基因治疗的合适病毒载体包括腺病毒载体、甲病毒载体、肠道病毒载体、瘟疫病毒、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、牛痘病毒载体、腺相关病毒载体以及单纯疱疹病毒载体。病毒载体可以是复制缺陷型病毒载体。通常使用在其E1基因或E3基因中具有缺失的腺病毒载体。当使用腺病毒载体时，该载体通常不具有可选标记基因。

药物组合物

在本发明方法中使用的Sp35拮抗剂可以被配制成药物组合物用于给予至哺乳动物，包括人。在本发明方法中使用的药物组合物包括药用载体(carrier)，其包括例如离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、水、盐或电解质如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、石蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇以及羊毛脂。在本发明方法中使用的组合物可以通过任何合适的方法给予，例如非肠道、心室内、口服、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻内、口腔、阴道或借助于移植库(implanted reservoir)进行给予。如在本发明中所使用的术语“非肠道”包括皮下、静脉内、肌内、动脉内、滑膜内(intra-synovial)、胸内(intrasternal)、鞘内、肝内、伤口内以及头颅内注射或灌注技术。如先前所描述的，在本发明方法中所使用的Sp35拮抗剂在神经系统中起作用以增进少突细胞的存活、增生和分化以及神经元的髓鞘生成。因此，在本发明的方法中，Sp35拮抗剂以这样的方式被给予，其中它们穿越血-脑屏障(blood-brain barrier)。这种穿越可由Sp35拮抗剂分子本身固有的物化性质所导致、由药物制剂中的其它成分所导致、或由使用机械装置如针、插管或手术器械来破坏血-脑屏障。在Sp35拮抗剂是本身不会穿越血-脑屏障的分子的情况下，例如融合至促进穿越的部分，合适的给予路径是例如鞘内或头颅内给予，例如直接给予到MS的慢性伤口内。在Sp35拮抗剂是本身可穿越血-脑屏障的分子的情况下，给予的路径可以是下述的各种路径中的一种或多种。

在本发明方法中所使用的组合物的无菌可注射剂型可以为含水或含油悬浮液。这些悬浮液可以利用合适的分散剂或润湿剂以及悬浮剂根据本领域已知技术制成。该无菌、可注射制剂还可以是在非毒性肠道外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌、可注射溶液或悬浮液，例如作为在1，3-丁二醇中的悬浮液。在可接受赋形剂和溶剂之中，可以被采用的是水、林格氏溶液、以及等渗氯化钠溶液。另外，无菌、固定油(不挥发性油，fixed oil)通常被用作溶剂或悬浮介质。这样，可以使用任何刺激性小的固定油，包括合成的单-或二-甘油酯。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物作为天然药用油在可注射的制剂中很有用，如橄榄油或蓖麻油，尤其是以其聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂如羧甲基纤维素或类似分散剂，其通常用于药用剂型(包括乳液和悬浮液)的制剂中。对于制剂来说，还可以使用其它通常使用的表面活性剂如吐温、司盘以及其它乳化剂或生物可用增强子，其通常用于制造药用固体、液体、或其它剂型。

非肠道制剂可以是单一推注剂量、注射液或加载推注剂量接着是维持剂量。这些组合物可以以特定固定的或可变间隔期例如每天一次或基于“根据需要”的间隔期加以给予。

在本发明方法中使用的某些药物组合物可以以可接受的剂型，例如胶囊剂、片剂、水性悬浮液或溶液口服给予。某些药物组合物也可以通过鼻内气雾剂或吸入进行给予。这样的组合物可以被制成在盐水中的溶液，采用苯甲醇或其它合适的防腐剂、吸收促进剂以增强生物可利用度、和/或其它传统稳定机或分散剂。

可以结合载体材料而制成单一剂型的Sp35拮抗剂的量根据所处理的宿主、所使用的拮抗剂的类型以及给药的具体方式而变化。该组合物可以作为单一剂量、多剂量或以注射液在确定的期间内进行给予。还可以调整剂量方案以提供最佳期望的响应(例如，治疗或预防响应)。

本发明的方法使用“治疗有效量”或“预防有效量”的Sp35拮抗剂。这样的治疗或预防有效量可以根据多种因素如个体的疾病状况、年龄、性别、以及体重而改变。治疗或预防有效量也可以是其中治疗有益效应大过毒害或有害效应的量。

对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所使用的特定Sp35拮抗剂、患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食、以及给药时间、排泄速率、药物组合和治疗的特定疾病的严重性。由医疗护理人员所判断的这样的因素属于本领域技术人员的能力范围。其量还将取决于待治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所使用的化合物的特性、疾病的严重性、以及所期望的效果。所使用的量可以通过本领域熟知的药理学和药物(代谢)动力学原理来确定。

在本发明的方法中，Sp35拮抗剂通常直接给予至神经系统、脑室内、或鞘内，例如给予至MS的慢性病变。可配制用于根据本发明方法给予的组合物以使给予的Sp35拮抗剂多肽的剂量为0.001～10mg/kg体重/天。在本发明的部分具体实施方式中，剂量为0.01～1.0mg/kg体重/天。在部分具体实施方式中，剂量为0.001～0.5mg/kg体重/天。

为了利用Sp35拮抗剂抗体进行治疗，剂量范围可在宿主重量的例如约0.0001～100mg/kg，并且更通常为0.01～5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)的范围内。例如，剂量可以为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1～10mg/kg的范围内，优选至少为1mg/kg。在上述范围内的中间剂量也属于本发明的范围。可以每天、交替数天、每周或由经验分析确定的任何其它时间给予受治疗者这样的剂量。示例性的治疗需要在较长时期内以多剂量给予，例如至少6个月的时间给予。另外的示例性治疗方案需要每两周或一个月或3至6个月给予一次。示例性的剂量时间表包括在连续的数天内的1～10mg/kg或15mg/kg、交替数天内30mg/kg或每周的60mg/kg。在一些方法中，同时给予具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体，在每一种情况下，给予的每一种抗体的剂量落在指定的范围内。

在确定的具体实施方式中，受治疗者可以用Sp35拮抗剂多肽编码的核酸分子治疗。对于每一患者核酸剂量的范围为约10ng～1g、100ng～100mg、1μg～10mg、或30～300μgDNA。用于感染的病毒载体的剂量变化于10～100病毒体/剂量、或更多病毒粒子/剂量。

还可以将辅助的活性化合物整合到用于本发明的方法的组合物中。例如，可溶性Sp35多肽或融合蛋白可以与一种或多种附加的治疗剂共配制和/或共给药。

本发明包含任何合适的用于将Sp35拮抗剂递送至所选靶组织的递送方法，包括水性溶液的推注注射或控释系统的移植。控释系统移植的使用减少了对重复注射的需要。

用于本发明的方法中的Sp35拮抗剂可以直接注入大脑。用于化合物的直接大脑灌注的各种移植是已知的，并且在将治疗化合物递送至患神经失调的人类患者方面是有效的。这些包括利用泵的慢性输注到大脑中、立体定位地移植(stereotactically implanted)、临时性组织间隙导管、永久头颅内导管移植、以及手术移植的生物可降解移植体。参见例如Gill etal.，supra；Scharfen et al.，“High Activity Iodine-125Interstitial Implant ForGliomas，”Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.24(4)：583-591(1992)；Gaspar et al.，“Permanent 125I Implants for Recurrent Malignant Gliomas，”Int.J.Radiation Oncology Biol. Phys.43(5)：977-982(1999)；chapter 66，pages 577-580，Bellezza et al.，“Stereotactic Interstitial Brachytherapy，”inGildenberg et al.，Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery，McGraw-Hill(1998)；and Brerm et al.，“The Safety of InterstitialChemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapyin the Treatment of Newly Diagno sed Malignant Gliomas：Phase I Trial，”J. Neuro-Oncology 26：111-23(1995)

组合物还可以包括分散在生物相容载体材料中的Sp35拮抗剂，该生物相容性载体材料起用于化合物的合适递送获支撑系统的作用。缓释载体的合适实例包括以成形制品形式的半可渗透性聚合物基质如栓剂或胶囊。可植入或微胶囊缓释基质包括生物聚酯(polyactide)(美国专利第3,773,319号；EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人.，Biopolymers 22：547-76(1985))；聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯基醋酸乙烯酯 (Langer et al.，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982))or poly-D-(-)-3hydroxybutyric acid(EP 133，988)。

在本发明的一些具体实施方式中，Sp35拮抗剂通过直接输注到大脑的合适区域而给予患者。参见例如Gill et al.，“Direct brain infusion of glial cell line-derivedneurotrophic factor in Parkinson disease，”Nature Med.9：589-95(2003)。可替换的技术是可获得的，并可以用来给予根据本发明的Sp35拮抗剂。例如，导管或移植体的立体定位放置可以利用Riechert-Mundinger装置和ZD(Zamorano-Dujovny)多用途定位装置来完成。对比增强的计算机化X线断层摄影术(CT)扫描、注射120ml的碘苯六醇三碘三酰苯(omnipaque)、350mg碘/ml，利用2mm切片厚度可以允许三维多面治疗设计(STP，Fischer，Freiburg，Germany)。这种装置允许在基于磁共振成像研究的基础上进行设计、合并CT和MRI靶信息用于清楚靶证实。

用于使用GE CT扫描仪(Downs Surgical，Inc.，Decatur，GA)以及Brown-Roberts-Wells(BRW)立体定位系统(Radionics，Burlington，MA)而改进的Leksell立体定位系统(Downs Surgical，Inc.，Decatur，GA)可以用于此目的。因此，在移植的早上，BRW立体定位构架的环形底座环可以被连接到患者的颅骨上。在3mm的间隔上可以获得连续的CT切片，尽管带有夹持在底座上的石墨棒定位器框架的(靶组织)区域。计算机化治疗设计程序可以利用在石墨棒图像的CT坐标以在CT空间与BRW空间之间绘图而在VAX 11/780计算机(Digital Equipment Corporation，Maynard，Mass.)上运行。

如本文所述的治疗脱髓鞘或髓鞘功能不良的方法通常在用于人之前，在体外然后在体内以可接受的动物模式对期望的治疗或预防活性进行检测。合适的动物模式包括转基因动物是本领域技术人员已知的。例如，本文描述了用来证明Sp35拮抗剂的分化和存活效应的体外测定。Sp35拮抗剂对轴突髓鞘形成的作用可如在实施例中所述在体外进行检测。最后，体内试验可通过生成表达Sp35拮抗剂的转基因小鼠来进行或通过将Sp35拮抗剂以本文所述的模式给予至小鼠或大鼠进行。

实施例

实施例1

涉及少突胶质细胞生物学的Sp35

通过若干发育阶段成熟的少突胶质细胞来自A2B5起源细胞(其表达A2B5)，分化成髓鞘形成前的少突胶质细胞(其表达O1和O4)，并最终分化成成熟的髓鞘化少突胶质细胞(其表达O1、O4和MBP)。因此，通过监测A2B5、O1、O4和MBP标记物的存在和不存在，可以确定给定细胞的发育阶段并评价Sp35-Fc在少突胶质细胞生物学中的作用。对于少突胶质细胞生物学的综述，参见例如Baumann and Pham-Dinh，Physiol.Rev.81：871-927(2001)。

抗O4、MBP和CNPase的单克隆抗体来自Sternberger单克隆体；对APC(克隆CC-1；ref.29)的抗体来自Calbiochem。其它抗体为βIII微管蛋白(Covance)、Sp35(Biogen Idec)、Fyn(Santa CruzBiotechnology)以及磷-Fyn(Biosource)。抗A2B5的单克隆抗体可获自Chemicon。

Sp35被表达在少突胶质细胞中

对Sp35在纯化大鼠P13 CG神经元、P2少突胶质细胞、以及P4星形细胞培养物中的表达在逆转录后通过聚合酶链反应(RT-PCR)加以分析。来自Ambion，Inc.的试剂盒根据生产商的说明用来从大鼠脑细胞中提取mRNA。利用正向引物5′AGAGACATGCGATTGGTGA3′(SEQ ID NO：38)，、以及反向引物5’AGAGATGTAGACGAGGTCATT3′(SEQ ID NO：39)实施的半定量的RT-PCR，其中引物在神经元中表现出高表达、在少突胶质细胞中表现处低表达、以及在星形细胞中的无表达(图5)。

Sp35在少突胶质细胞中的表达通过在衍生自成年大鼠的视神经的切片上的原位杂交得以证实。制备了大鼠视神经切片并如在Mi et al.，“Sp35is acomponent of the Nogo-66receptor/p75signaling complex，”Nat.Neurosci.7：221-28(2004)中所述进行加工，并利用Sp35编码序列的前500个核苷酸，用洋地黄素苷标记的Sp35反义或正义RNA进行探测。根据制造商的指示利用使用酪酰胺信号扩增试剂盒(AmershamBiosciences)和荧光抗洋地黄素苷轭合的抗体试剂盒(Perkin Elmer)对切片进行染色。对于原位结合和免疫荧光分析，该切片首先用洋地黄素苷标记的RNA探测，然后用抗体例如CC1抗体(Calbiochem；成熟少突胶质细胞的标记物)或抗-Sp35抗体进行探测。发明人观察到，杂交至反义Sp35探针的少突胶质细胞同样共染色有对CC1的抗体(数据未示出)。利用正义Sp35探针没有观察到特异性标记。在少突胶质细胞中的Sp35表达还通过来自P7大鼠皮层的侧脑室区的组织切片的免疫组织化学研究得以证实。大多数用CC1抗体标记的皮层细胞还用抗-Sp35抗体标记，数据未示出。相互作用的特异性通过具有Sp35-Fc的抗-Sp35抗体的前吸附得以证实(参见实施例2)，其消除了信号。

Sp35表达的Sp35-特异性RNAi击倒促进少突胶质细胞生长和分化

Sp35-特异性RNAi用来消除在少突胶质细胞前体细胞中的Sp35表达，以研究Sp35是如何有益于少突胶质细胞生长和分化的。50,000个A2B5少突胶质细胞前体细胞被感染带有慢病毒的Sp35-特异性RNAi序列或对照RNAi(制备如下)。

将鼠科动物和大鼠Sp35 DNA序列进行比较以找到同源性区域，从而用于小发夹RNA(shRNA)的替代。用于Sp35 RNAi的慢病毒表达的CH324通过退火少突胶质细胞LV1-035和LV1-036并结合到HpaI和XhoI消化的pLL3.7而加以构建。pLL3.7载体、另外的方法学和病毒生产被描述在Rubinson et al.，Nat.Genet.33，401-06(2003)中。Sp35 RNAi少突胶质细胞购自MWG并且具有以下序列：

LV1-035(正义少突胶质细胞)5’-

TGATCGTCATCCTGCTAGACTTCAAGAGAGTCT

AGCAGGATGACGATCTTTTTTC-3’(SEQ ID NO：40)以及

LV1-036(反义少突胶质细胞)5’-

TCGAGAAAAAAGATCGTCATCCTGCTAGACT

CTCTTGAAGTCTAGCAGGATGACGATCA-3’(SEQ ID NO：41).

除了用小写字母表示的核苷酸变化外，用相同的少突胶质细胞

序列设计对照RNAi：5′-

TGATCcTCATcCttCTAtACTTCAAGAGAGTgTAGCAGGATGAcGATCT

TTTTTCTCGA-3′(SEQ ID NO：42)和5′-

TCGAGAAAAAAGATCGTCATCCTGCTAGACTCTCTTGAAGTaTAGaA

GGATGACGATCA-3′.(SEQ ID NO：43)。

在产生慢病毒之前，来自pLL3.7的DNA或在pLL3.7中的替代shRNA以5∶1的比率，用鼠科动物Sp35-HA标记的质粒共转染到以6孔格式的CHO细胞中。通过来自经转染的CHO细胞溶解产物的Sp35-HA标签的蛋白质印迹以及通过制备自加倍孔的总RNA的RNA印迹来分析击倒(knockdown)。对印迹用Sp35 cDNA的片段进行探测。可以在转染后48小时进行测定。如所预期的，相对于对照经处理的细胞，在经CH324 RNAi处理的CHO细胞中的Sp35mRNA减少10倍，数据未示出。生成了如Rubinson等人所描述的带RNAi慢病毒的绿色荧光蛋白质(GFP)。在用对照或Sp35 RNAi处理的培养物中，大约80％的少突胶质细胞为GFP阳性。通过RNAi处理并不改变总细胞数目。为了量化RNAi对分化的影响，仅计数GFP表达的少突胶质细胞。

如由Conn，Meth.Neurosci.2：1-4(Academic Press；1990)所描述的，将富集少突胶质细胞的种群生长自具有以下修饰的雌性长埃文斯(Long Evans)P2小鼠。简要地，将前脑切开并放置在Hank’s缓冲盐溶液中(HBSS；invitrogen)。将组织切成1mm片段并在37℃下在0.01％胰蛋白酶和10μg/ml DNA酶中孵育15min。将离解的细胞铺展在聚-L-赖氨酸涂敷的T75组织培养瓶上并在37℃下在具有20％胎牛血清(invitrogen)的DMEM培养基中生长10天。通过在37℃、200rpm下摇动烧瓶过夜来收集少突胶质细胞前体(A2B5⁺)，得到95％纯度的种群。将培养物在具有FGF/PDGF(10ng/ml；Peprotech)的较高葡萄糖杜尔贝科修饰的伊各尔培养基(DMEM)中保持1周。除去FGF/PDGF使得A2B5⁺细胞在3-7天后分化成O4⁺髓鞘形成前的少突胶质细胞，以及在7-10天后分化成O4⁺和MBP⁺成熟少突胶质细胞。这些分化时期从形态变化上是很明显的：A2B5⁺细胞在形状上是双极的，O4⁺髓鞘形成前的少突胶质细胞具有较长且更多的分枝细胞突而MBP⁺成熟少突胶质细胞在这些细胞突之间包含髓鞘质片结构。

用含CH324 RNAi的慢病毒感染A2B5少突胶质细胞前体细胞。将所得细胞培养3天，并且计数O4阳性(用于少突胶质细胞分化的标记物)少突胶质细胞的数目。通过用Sp35 RNAi慢病毒感染降低了内源Sp35表达，并通过RT-PCT证实(图6A)。与对照感染的细胞相比，Sp35的降低导致更高程度分化的成熟少突胶质细胞，通过增加细胞突(cell process)的长度以及通过存在大量的髓鞘质片结构是明显的(数据未示出)。在表达Sp35 RNAi的细胞中，成熟的(O4-阳性)少突胶质细胞是对照培养中的3倍(图6B)。这些数据表明Sp35可以负调节少突胶质细胞分化。显性负性Sp35促进少突胶质细胞生长和分化。

发明人构建了表达野生型和显性-负性形式的Sp35的慢病毒载体。编码的大鼠全长Sp35的DNA序列(FL-Sp35，SEQ ID NO：2的34-614位氨基酸残基)通过PCR进行扩增，其中利用引物5’-GAGGATCTCGACGCGGCCGCATGGAGACAGACACACTCCTG-3’(SEQ ID NO：44)和5’-GGGGCGGAATTGGATCCTCACAGATCCTCTTCTGAGATGAG-3’(SEQ ID NO：45)，并在NotI和BamHI位点插入到HRST-IRESeGFP慢病毒载体中。类似地，编码显性负性Sp35的DNA序列(DN-Sp35，SEQ ID NO：2的34-581位氨基酸残基)通过PCR进行扩增，其中利用引物5’-GAGGATCTCGACGCGGCCGCATGGAGACAGACACACTCCTG-3’(SEQ ID NO：46)和5’-GATACGGATCCTCAGCCTTTGCCCCGGCTCCATAGAAACAGC-3’(SEQ ID NO：47)。FL-Sp35和DN-Sp35质粒被转染到293个细胞中以如下所述生产慢病毒，Rubinson et al.，“A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells，stemcells and transgenic mice by RNA interference，”Nat.Genet.33：401-06 (2003)。少突胶质细胞(如实施例4所述制备的)以2MOI/细胞用慢病毒感染并通过蛋白质印迹证实FL-Sp35和DN-Sp35的表达。

DN-Sp35促进少突胶质细胞分化，产生成熟少突胶质细胞数目的增加。相反，全长Sp35(FL-Sp35)的过表达具有相反的作用并抑制分化，与对照相比，通过成熟少突胶质细胞的数目的减少很明显(数据未示出)。

实施例2

Sp35-Fc融合蛋白的构建和纯化

通过将人类Sp35的胞外部分(1-532位残基)融合人IgG1的铰链和Fc区形成构建体以研究Sp35的生物学功能。编码人Sp35的部分序列通过从克隆227.2的PCR获得，其中利用正向引物5’-CAGCAGGTCGACGCGGCCGCATGCTGGCG GGGGGCGT-3’(SEQ IDNO：48)和反向引物5’-CAGCAGGTCGACCTCGCCCGGCTGGTTGGCCAACCAGCCGGGCGAGGTCGACCTCGAGG-3’(SEQ ID NO：49).

将平端PCR产物亚克隆入PCR SCRIPT AMP载体(Stratagene)的SrfI位点以生成PCR SCRIPT AMP-Sp35。SalI片段自PCRSCRIPT AMP-Sp35分离并亚克隆入PCRCAMP Ig载体(Stratagene载体PCR SCRIPT AMP的衍生物)。在PCRCAMP Ig载体中，铰合部和Fcγ序列被亚克隆作为NotI(3’)片段的SalI(5’)。SalI Sp35片段被亚克隆入PCRCAMP Ig载体的SalI位点，从而将符合读框的(in-frame)Sp35信号序列和胞外结构域(密码子1-532)用铰合部与编码人Ig1的铰链和Fc区的序列加以融合。鉴定了正确的分离物，并将包含Sp35Fc片段的NotI片段亚克隆入CHO表达载体，PV90 (Biogen Idec)的单个NotI克隆位点。所得的质粒通过DNA测序和指定的GT123得以证实。

表达Sp35-Fc融合蛋白的稳定细胞系由带有质粒GT123的CHO宿主细胞DG44的电穿孔形成。在存在10％透析血清和4mM谷氨酸盐的情况下，在α负型MEM中培养转染的CHO细胞以选择核苷酸非依赖性生长。转染后的14天，供给细胞新鲜培养基。为了筛选表达Sp35-Fc的细胞，将CHO细胞用藻红蛋白(PE)标记的山羊抗人类IgG(Jackson实验室)进行标记并在FACS Mo-Flo(Cytomation)中进行高速流动血细胞计数选分。选择表达最高水平Sp35-Fc的细胞。这些细胞在培养基中扩增7天，然后重新标记并重新选分。分离表达最高水平Sp35-Fc的细胞作为在96孔板中的单个克隆体。将这些克隆体生长两周，然后在FACS分析以检查表达水前，每天供给新鲜的培养介质。将表达最高水平Sp35-Fc的克隆体进行扩增，并建立冷冻细胞库。该细胞系适于在无血清培养介质BCM16的悬浮培养基中生长。由这些克隆体产生的Sp35-Fc的效价通过在37℃下生长该细胞系达4-5代(细胞)而被确定，然后使细胞生长达到50％最大细胞密度并在28℃下培养它们10-15天，直到活细胞密度下降到75％。此时，收获培养基，通过离心过滤清除细胞和碎片，通过使用抗人类Ig抗体(Jackson实验室)作为探针，用蛋白质印迹分析滴定培养基上清液用于分析Sp35-Fc水平。

从如下澄清的培养基中纯化Sp35-Fc融合蛋白：将9ml pH值为7.5的1M HEPES加入到900ml条件性培养基中。将该培养基在4℃在3小时内分批加载到3ml的A蛋白琼脂糖(AmershamBioscience)上。将树脂收集在1.5cm(I.D.)的柱中，并用3ml PBS洗涤4次、用4ml含800Mm NaCl的PBS洗涤2次，然后再次用3ml的PBS洗涤。用25mM pH值为2.8的NaH₂PO₄和100mM NaCl从所述柱洗提Sp35-Fc为1.5ml流分，并通过加入75μl pH值为8.6 的0.5M NaH₂PO₄进行中和。含峰值蛋白的流分通过在280nm处的吸收被鉴定，合并，并在1ml A蛋白柱上进一步纯化。在加载前，将NaCl加入到600mM pH值为7.5的HEPES至50mM。柱子用600μl pH值为7.5的10mM HEPES和1M NaCl洗涤2次，然后用1ml PBS洗涤。Sp35-Fc从柱子用含pH值为2.8的25mM NaH₂PO₄ 和100mM NaCl洗提，收集0.5ml流分，并通过加入25μl pH值为8.6的0.5M NaH₂PO₄进行中和。含峰值蛋白的流分通过在280nm处的吸收来碱性并合并。通过降低SDS-PAGE，Sp35-Fc蛋白迁移为具有90kDa的表观质量的单带(＞95％纯)。在未降低的条件下，蛋白质表现为具有大约180kDa表观质量的二聚体。等分经纯化的Sp35-Fc蛋白并在-70℃下贮存。

实施例3

外源性Sp35-Fc促进少突胶质细胞的存活/增生/分化

发明人通过以下方法在不同发育阶段评价了Sp35 mRNA在少突胶质细胞中的表达。如实施例1中所描述的，少突胶质细胞被诱导以分化，并利用Ambion试剂盒分离mRNA。Sp35 mRNA表达的量化根据生产商的说明利用

RT-PCR试剂盒(AppliedBiosystems)来完成，其中利用下列引物：5’-CTTTCCCCTTCGACATCAAGAC-3’(正向；SEQ ID NO：50)和5’-CAGCAGCACCAGGCAGAA-3’(反向；SEQ ID NO：51)；以及FAM标记的探针，5’-ATCGCCACCACCATGGGCTTCAT-3’(SEQ IDNO：52)来完成。将数据标准化至GAPDH水平作为内部对照。早期的起源少突胶质细胞(A2B5⁺)和髓鞘形成前的少突胶质细胞(O4⁺)显示出相同水平的Sp35mRNA，但是Sp35mRNA的水平在成熟少突胶质细胞(MBP⁺)超过2倍(图7)。

如实施例1所述制备的A2B5⁺少突胶质细胞用增大浓度的Sp35-Fc或对照-Fc处理3天(如实施例2所述制备Sp35-Fc)。为了评估分化，将A2B5⁺细胞固定在用10ng/ml CNTF和15nM三碘代-L-甲腺原氨酸补充的无FGF/PDGF的生长培养基的4孔载波片中，并立即用增大浓度的Sp35-Fc或对照-Fc进行处理。在48h(对于RNAi为72h)后，培养物用O4的抗体进行染色，并量化总O4⁺和成熟O4⁺少突胶质细胞的数目。以两次重复分析试样。Sp35-Fc以浓度依赖性方式促进A2B5⁺细胞分化成O4⁺细胞(图8)。

成熟少突胶质细胞具有约48～72小时的体外半衰期，同时细胞通常在72小时后出现细胞凋亡。当用Sp35-Fc(10μg/ml，5天)处理少突胶质细胞培养物时，与用对照-Fc处理的对照相比，发明人观察到成熟少突胶质显著增加的细胞存活率，其通过细胞生存力染色进行评价的。监测MBP表达作为成熟少突胶质细胞的标记物。与对照-Fc处理的细胞相比，通过细胞染色和利用抗-MBP抗体的蛋白质印迹，在Sp35-Fc处理的细胞中观察到MBP蛋白表达大约增加了3倍。

实施例4

Sp35拮抗剂调节RhoA和Fyn

涉及少突胶质细胞分化的控制的较强候选信号传导途径的是GTP酶的Rho家族。Rho GTP酶调节细胞形态，并且对于少突胶质细胞分化需要降低的RhoA-GTP量。参见Liang，X，et al.，J.Neurosci.24：7140-7149(2004)。为了确定Sp35信号是否通过RhoA途径，借助于蛋白质印迹分析，将用Sp35-Fc处理的少突胶质细胞溶胞产物中的Rho AGTP的水平与相应对照中的水平进行比较。在Sp35-Fc处理之后，可以看到Rho A-GTP的显著3倍降低(图9A)，表明Sp35功能的减弱可以通过下调Rho AGTP 来诱导少突胶质细胞分化，接着增加MBP表达。当用DN-Sp35或用Sp35RNAi处理少突胶质细胞时，观察到Rho AGTP量的类似降低(数据未示出)。

通过Fyn激酶调节RhoA GTP酶的活性，参见Liang，X，et al.，J.Neurosci.24：7140-7149(2004)。增加的Fyn表达和磷酸化与少突胶质细胞分化共相关。同上，还可以参见Osterhout，D.J.，et al.，J.Cell Biol.145：1209-1218(1999)。为了检测Sp35拮抗剂是否影响Fyn功能，直接通过蛋白质印迹分析检测Fyn表达和磷酸化。如实施例1所述的DN-Sp35处理导致Fyn蛋白和Fyn磷酸化增加2倍(图9B)。相反地，当分析表达FL-Sp35的细胞时，Fyn表达和磷酸化降低2倍(图9B)。

实施例5

Sp35-Fc促进体外髓鞘形成

Sp35在髓鞘形成中的作用在体外通过用Sp35-Fc处理背根神经节(DRG)神经元和少突胶质细胞的共培养物进行研究分析，并通过免疫组织化学法和电子显微镜检测髓鞘形成。对于这些研究，需要首先形成DRG神经元和少突胶质细胞的一级培养物。如在Plant et al.，J.Neurosci.22：6083-91(2002)中所述，培养雌性长埃文斯大鼠E14-E17胚胎背根神经节。切开的DRG固定在聚-L-赖氨酸涂敷的盖波片(100μg/ml)上两周，其中在第2～6天存在氟脱氧尿苷而第8～11天在含有1×B27、100ng/ml NGF(Invitrogen)的NLA培养基中。

如实施例1所述制备A2B5⁺少突胶质细胞，并通过胰蛋白酶化加以收获。

对于共培养物研究，在存在或不存在10μg/ml的Sp35-Fc的情况下，将A2B5⁺少突胶质细胞加入到DRG神经元悬滴培养基中。改变培养基(用B27和100ng/ml NGF补充的Neurobasal培养基)，并将新鲜的Sp35-Fc每3天加入到细胞。为了鉴别髓鞘形成的变化，通过免疫组织化学法染色(“IHC”)用抗-βIII微管蛋白抗体对2周培养物进行染色用于神经丝以鉴定轴突、或抗-MBP抗体以鉴定少突胶质细胞，并对4周培养物进行SDS-PAGE，接着进行蛋白质印迹分析以量化MBP。在所选实施例中，通过将2.5％的戊二醛(gluteraldehyde)直接加到盖片上来固定细胞用于电子显微镜研究。在两周培养物中的髓鞘化轴突通过计数衍生自单个MBP⁺少突胶质细胞的髓鞘化节间纤维束的数目加以量化。以两次重复形式分析样品。误差棒表示单个确定。使用单向方差分析确定所有研究中的P值。

在大鼠主要少突胶质细胞和背根神经节(DRG)神经元的培养物中，观察到低基量的髓鞘形成。相反，用Sp35-Fc处理2周，导致强壮轴突髓鞘形成，如通过存在MBP⁺髓鞘化轴突下是明显的，其以剂量依赖方式在Sp35-Fc处理的培养物中发育(图10A)。蛋白质印迹分析证实在Sp35-Fc处理的培养物中MBP的表达、髓鞘质的主要蛋白成分增加(图10B)。在存在Sp35-Fc的情况下通过共焦显微镜进一步证实髓鞘形成，其验证了MBP囊化了轴突(数据未示出)。在用Sp35-Fc处理的培养物中通过电子显微镜观察到了多个良好形成的节间以及极类似的朗维耶节(图10C)。在对照培养物中仅发现偶然的髓鞘化片段并且没有朗维耶节(图10D)。

利用DN-Sp35进一步证实了Sp35拮抗剂对轴突髓鞘形成的效应。当与对照比较时，DN-Sp35的表达增加髓鞘形成的MBP⁺细胞的总数目达5至10倍(图10E)。相反，与对照相比，FL-Sp35的过表达使髓鞘形成的MBP⁺细胞的数目减少2倍(图10E)。利用蛋白质印迹分析来定量培养物中的MBP。DN-Sp35产生MBP的10倍增加，而FL-Sp35引起MBP的2倍降低(图10F)。通过蛋白质印迹证实了培养物中FL-Sp35和DN-Sp35蛋白的表达(图10F)。这些研究进一步表明内源性Sp35抑制髓鞘形成，而Sp35的拮抗作用可以反转该抑制作用。

实施例6

Sp35的Ig结构域肽促进体外髓鞘形成

通过用Sp35 Ig肽处理背根神经节(DRG)神经元和少突胶质细胞的共培养物对含一部分Sp35 Ig结构域的若干个肽在体外进行分析，并如实施例5所述检测髓鞘形成。

对于共培养物研究，在存在或不存在10μg/ml Sp35-Ig-Fc(融合至Fc的Sp35的417-493位氨基酸)的情况下，将A2B5⁺少突胶质细胞加入到DRG神经元悬滴培养物中。改变培养基(用B27和100ng/ml NGF补充的Neurobasal培养基)，并将新鲜的Sp35-Ig-Fc每3天加入到细胞中。为了鉴定髓鞘形成的变化，通过免疫组织化学染色(“IHC”)用抗-βIII-微管蛋白抗体对2周培养物进行染色用于神经丝以鉴定轴突、或抗-MBP抗体以鉴定少突胶质细胞，并对4周的培养物进行SDS-PAGE，随后进行蛋白质印迹分析以量化MBP。

蛋白质印迹分析证实了MBP(髓鞘质的主要成分)的表达在Sp35-Ig-Fc处理的培养物中增加(图15)。在相同的测定中也检测测了突变的Sp35-Ig-Fc肽。当在456位的精氨酸和458位的组氨酸分别被突变为谷氨酸和缬氨酸时，与Sp35-Ig-Fc肽相比，该肽并不促进髓鞘形成(图15)。在456位的精氨酸是在Sp35的Ig结构域中的“RKH环”(456-458位的精氨酸-赖氨酸-组氨酸氨基酸)的一部分，并且被认为对于Sp35拮抗剂多肽结合很重要。在存在Sp35-Ig-Fc的情况下MBP蛋白的增加与存在Sp35-Fc分子的情况下MBP蛋白的增加相当(图15)。

还以实施例5所述的测定对含一部分Sp35-Ig结构域的环肽的促进髓鞘形成的能力进行了检测。Sp35肽LSPRKH(454-458位氨基酸)(SEQ ID NO：61)通过在N-末端上的半胱氨酸和C-末端上的半胱氨酸残基的加成而被环化。该肽用N-末端上的乙酰基(Ac)及其C-末端上的NH₂部分形成帽。另外，LSPRkH(SEQ ID NO：61)肽还通过在N-末端上的氨基酸接头GSGC和C-末端上的半胱氨酸残基-NH₂连接的生物素基团被合成和环化。如在蛋白质印迹示出的在经处理的培养物中，所得的环状Sp35肽Ac-CLSPRKHC(SEQ ID NO：66)以及生物素-GSGCLSPRKHC(SEQID NO：63)增加MBP(髓鞘质的主要蛋白质成分)的表达(图16)。其它环肽用作对照：生物素-GSGCLSPEKVC(SEQ ID NO：65)、生物素-GSGCKHSPLRC(SEQ ID NO：64)和Ac-CLSPEKVC(SEQ IDNO：67)。所有对照肽显示出在经处理的共培养物物中MBP没有增加(图16)。

这些研究进一步表明Sp35-Ig结构域的较小肽可用作Sp35拮抗剂以通过Sp35解除髓鞘形成抑制作用。

实施例7

DN-Sp35在DRG神经元和少突胶质细胞中起作用而促进髓鞘形成

与少突胶质细胞相比，发明人进行了试验以解释说明在DRG神经元中，Sp35对髓鞘形成过程的相对贡献。发明人用实施例1 中所描述的FL-Sp35和DN-Sp35慢病毒载体感染了DRG神经元、少突胶质细胞以及共培养物(如实施例5所述制备的)，并在两周后对髓鞘化MBP⁺细胞进行免疫组织化学染色。观察到在共培养物(其中两种细胞都表达DN-Sp35)中MBP水平增加2倍以及在共培养物(其中两种细胞都表达FL-Sp35)中MBP水平减少2倍(图10G)。

与对照(空载体)相比，在任一种或两种细胞类型中的FL-Sp35过表达显著降低髓鞘形成的基本水平。相反，与对照相比，在任一种或两种细胞类型中的FL-Sp35过表达使髓鞘形成的基本水平增加2至3倍(图10G)。外源添加的Sp35-Fc通过在任一种或两种细胞类型中的FL-Sp35过表达而反转髓鞘形成的抑制作用。另外，如果任一种细胞类型单独过表达DN-Sp35则外源性Sp35-Fc进一步增强髓鞘形成并且如果两种细胞类型过表达DN-Sp35则具有轻微的效应。这些研究表明在少突胶质细胞和DRG神经元中、或用Sp35-Fc蛋白处理的显性阴性Sp35蛋白的表达有助于有效髓鞘形成。

实施例8

Sp35剔除小鼠显示较早开始髓鞘形成

Sp35剔除小鼠用GFP/Neo(绿色荧光蛋白/新霉素)替代载体(其靶向编码Sp35的序列的整个、单个外显子)来产生，如由Schiemann et al.(Science 293：2111-2114(2001)所述。小鼠基因组129/SvJ DNA分离自λ基因组文库(Stratagene#946313)。14.6-kbEcoRV片段被亚克隆入pBSK⁺，然后在细菌中通过同源性重组被靶向以在起始ATG处插入eGFP Q40报告基因。最终的构建体缺失编码Sp35序列的单个外显子的全部1-1，841个核苷酸。这种构建体用于靶向在D3(129/Sv)胚胎干细胞中的Sp35基因座位。正确靶向的细胞通过EcoRI消化的胚胎干细胞DNA的DNA印迹法加以鉴定，并注入到C57B1/6胚泡以生成嵌合小鼠。嵌合体被杂交到C57B1/6小鼠以生成杂交起始小鼠。通过尾DNA的三种引物PCR来确定基因型。正向引物，5′-CTATCCAAGCACTGCCTGCTC-3′(SEQ ID NO：53)以及两种反向引物，5′-GAGTTCTAGCTCCTCCAGGTGTG-3′(SEQ ID NO：54)和5′-GATGCCCTTCAGCTCGATGCG-3′(SEQ ID NO：55)，在35个周期反应(94 1C 20s、65 1C 30s、72 1C 30s)中分别产生275-bp野生型和356-bp突变体等位基因产物。通过DNA印迹、RTPCR和RNA印迹分析完成Sp35基因缺失的确认。在野生型小鼠的RNA印迹和RT-PCR中检测到显著带(prominent band)，但是在剔除小鼠中完全缺乏这些带。杂合体的DNA印迹显示出野生型和修饰的Sp35等位基因。Sp35剔除小鼠似乎正常，没有明显的身体异常或行为改变、移动或繁殖力。杂交F1后代同窝出生者大小发生改变。

通过IHC对培养的来自Sp35剔除小鼠的少突胶质细胞的分化方面的潜在变化进行评估。与在来自野生型同窝出生者的培养物中的相比，在Sp35剔除中观察到更高程度分化的少突胶质细胞和较大百分比的成熟少突胶质细胞。由于在正常小鼠发育中髓鞘形成的开始通常出现在出生后第(P)5天，然后发明人通过电子显微镜检查了来自野生型和剔除小鼠的P1脊髓中的髓鞘形成。与体外培养一致，来自Sp35剔除小鼠的脊髓比它们的野生型同窝出生者含有更多髓鞘化轴突纤维(图11)。在剔除小鼠中在外围神经系统坐骨神经中没有检测到明显的变化，这表明髓鞘形成效应局限于CNS。

来自剔除小鼠的共培养的DRG和少突胶质细胞显示出更多的DRG和少突胶质细胞相互作用以及髓鞘形成。来自Sp35剔除小鼠的共培养的DRG和少突胶质细胞显示出更多的少突胶质细胞分化以及髓鞘形成。当通过电子显微镜分析来自剔除小鼠的脊髓组织时，与它们的野生型同窝出生者相比，新生的Sp35剔除小鼠(产后第1天(P1)和第6天(P6))显示出更多的髓鞘形成纤维。

过表达野生型Sp35的转基因小鼠还可以根据Hogan B.，Manipulating the Mouse Embryo.A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Press(1986)，pp.153-183的方法来形成。当通过电子显微镜检查过表达Sp35的转基因小鼠时，与它们的野生型同窝出生者相比，新生小鼠(产后第8天(P8))显示出更少的髓鞘形成纤维。

实施例9

Sp35-Fc促进体内少突胶质细胞存活和髓鞘形成

成年野生型C57B1/6雄性小鼠被供给铜试剂(cuprizone)(按重量计0.2％，与基本小鼠食物一起研碎)6周以诱导在胼胝体内脱髓鞘。在供给铜试剂的2、2.5和3周内，将Sp35-Fc立体定位地注射入脱髓鞘的胼胝体。以相同的时间间隔用不含Sp35-Fc的消毒培养基立体定位地注射对照小鼠。在供给铜试剂6周后，使小鼠返回到正常饮食2周、4周和6周(仅基本鼠食)以使髓鞘再生。

用克他命(80mg/kg体重)和甲苯噻嗪(10mg/kg体重)麻醉铜试剂处理的小鼠并放置在设计用于立体定位性手术的固定装置上(David Kopf Instruments)。打开头皮并将消毒的化合物(1μM，在1ml的HBSS中)用10ml Hamilton注射器单侧地注入野生型受体小鼠的急性脱髓鞘化胼胝体内，其中利用在1.7mm深度处至前囟的0.7mm后部和0.3mm侧部的立体定位性坐标(Messier et al.，Pharmacol.Biochem.Behav.63(2)：313-18(1999))。另外，用不含化合物的HBSS立体定位地注射对照受体小鼠。头骨的开口用明胶海绵填充，并用青霉素和链霉素(Gibco)擦洗该区域并缝合伤口。注射后，实验的每一周杀死小鼠并取出其脑并用于分子、生物化学和组织学分析处理。

利用抗-MBP蛋白抗体或luxol快速蓝，通过IHC，接受Sp35-Fc处理的动物显示出增加的成熟少突胶质细胞存活(基于CC1抗体染色，图12)和轴突髓鞘形成(数据未示出)。

实施例10

Sp35-转化细胞的体内移植

发明人还考查了Sp35在脊髓损害方面的生物学功能。发明人用表达Sp35的逆转录酶病毒或逆转录酶病毒对照感染皮质一级培养细胞(混合培养物)，用于递送至大鼠脊髓的损害脊髓中心(epicenter)。导入2×10⁶个细胞，并使大鼠在第10天死亡。将脊髓固定在4％的多聚甲醛中过夜，然后在70％的乙醇中脱水，接着用95％的乙醇脱水。将组织样品埋入到石蜡中。切片(10微米厚)用于免疫组织化学染色。发明人监测了在接受Sp35的受损大鼠中的少突胶质细胞存活和轴突髓鞘形成。发明人观察到在接受表达Sp35的细胞的动物中具有更多的少突胶质细胞和轴突髓鞘形成以及较少的轴突收缩。

用于这些实验的Sp35逆转录酶病毒构建体制备如下。将Sp35基因利用含XhoI 位点的引物5’-GATTACTCGAGATGCTGGCGGGGGGCGTGAGG-3′(SEQ ID NO：56)，和含有EcoRI位点的引物5′CGCGGGAATTCTCATATCATCTTCATGTTGAACTTG-3′(SEQ IDNO：57)进行PCR扩增。PCR产物用XhoI和EcoRI消化，然后配合到逆转录酶病毒载体pMIG(其含有IRES-GFP)内，其预先用XhoI和EcoRI切割。将新的载体命名为pMMC078。所有pMMC078 的分离物含有非有意的点突变，所以将pMMC078的两种分离物连接在一起。用XhoI和AccI切割pMMC078.6并用XhoI和AccI切割pMMC078.7。将这两个片段连接在一起以形成最终正确的质粒pMMC089。通过DNA测序确认插入物的DNA序列。如所述制备Sp35逆转录酶病毒。在转染前一天裂开293G细胞。利用8μg Sp35逆转录酶病毒DNA通过脂转染胺试剂(lipofectamine)(Invitrogen)转染5×10⁶个细胞。在转染92小时后，收获条件培养基。将该条件性培养基在5000g下离心10分钟，并将上清液用作Sp35逆转录酶病毒原料。将这种原料在4℃下储存1周或在-80℃下储存6个月。

实施例11

Sp35-Fc在体内脊髓损害(SCI)后促进神经元和少突胶质细胞存活

在成年雌性长埃文斯大鼠(190-210g；Charles River)中诱导脊髓损害。在T6/T7处实施背部半切片(dorsal hemisection)，完全中断主要向背中线和次要向背中线的脊髓纤维束(CST)成分。在自表面的1.8mm深度处用微解剖刀立体定位地横切该脊髓。在CST横切后，立即将胸内导管插入到在T7处的蛛网膜下空间内并连接至插入皮下空间内的引物微渗透泵(Alzet model 2004，Alza Corp.)。微渗透泵递送0.25μL/h的25μM Sp35-Fc融合蛋白或人类IgG(5mg/ml)或PBS(作为对照)。术后护理包括3天内每8-12小时的痛觉缺失(Buprenorphine/Buprenex，Reckitt Healthcare Ltd.，0.05mg/kg皮下地)以及术后7天的抗生素处理(安匹西林，BristolMyers Squibb，100mg/kg，皮下，每日两次)。在研究期间(4周)或直到功能恢复，每天手动压膀胱两次。在结束研究时，将小鼠麻醉并用肝素化的盐水穿心灌注，随后用4％的多聚甲醛(PFA)穿心灌注。取出脊髓，埋入石蜡中，并切成10μm切片用于组织分析。

为了量化在SCI后的编程性细胞死亡，在SCI后使动物3天或7天安乐死并用抗激活的-天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3抗体(Cell Signaling Technologies)和隧道染色(TUNEL staining)(Promega)进行染色。切片还可以用抗-NeuN抗体(Chemicon)和抗-CC1抗体(Calbiochem)进行染色以分别鉴定神经元和少突胶质细胞。

发明人观察到在SCI后3天在横切片位点的喙和尾部有大量隧道染色以及用神经元和少突胶质细胞共定位的激活的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3染色。在SCI后3天，在Sp35-Fc经处理的动物中，激活的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3阳性神经元和少突胶质细胞的数目比对照中明显小很多。此外，在SCI后4周，在围绕在Sp35-Fc处理的动物的切片部位的脊髓组织内存活更多的神经元和少突胶质细胞，其基于用抗-βIII-微管蛋白抗体(神经元存活)和抗-O4抗体(少突胶质细胞存活)染色的对照中。

实施例12

Sp35-Fc降低体内天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3激活和细胞死亡

在用5％胎牛血清、10％马血清、2mM谷酰胺、100U/ml青霉素和含200ng/ml NGF的100mg/ml链霉素补充的RPMI-1640培养基中分化PC12细胞(Neuroscreen)7天。对于试验，培养基用含Sp35-Fc的无NGF的培养基、作为阴性对照(0.1-10μM)的人类IgG、或作为阳性对照(0.1μM)的zVAD代替。在取消NGF后18小时，根据制造商的说明利用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3/7Glo试剂盒(Promega)量化激活的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3。在撤走NGF后42小时，根据制造商的说明利用细胞死亡检测ELISA试剂盒(Roche)量化程序性细胞死亡。

发明人观察到在从培养基中撤走NGF后18小时，0.1μMSp35-Fc降低被剥夺营养支持的分化PC12细胞的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3激活。Sp35-Fc对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活化的作用是剂量依赖性的，并且在较高剂量(1或10μM)下，其与天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂zVAD(0.1μM)的神经保护(neuroprotective)剂量一样有效(图14)。作为细胞死亡的另外检测，发明人利用TUNEL ELISA方法量化了细胞凋亡并发现在NGF撤走后42小时检测到Sp35-Fc显著降低细胞死亡(图13)。

尽管为了更清楚理解，已经通过图解说明和实施例的方式较详细地描述了本发明，但对于本领域的普通技术人员来说，在不背离所附权利要求书的精神和范围内，显而易见地可以根据本发明的教导进行某些变化和更改。

本文在说明书中提及的所有出版物和专利申请都以引用方式结合于此作为参考，其结合的程度与美国单个出版物或专利申请被具体和单个指明被结合于此作为参考是一样的。

Claims

1.一种用于促进少突胶质细胞的分化或存活的体外方法，包括使所述少突胶质细胞接触有效量的包含Sp35拮抗剂的组合物，其中所述Sp35拮抗剂选自由以下组成的组：

(i)包含Sp35的氨基酸34-532或417-493的可溶性Sp35多肽，其阻断、抑制或干扰天然存在的Sp35的生物功能；

(ii)Sp35抗体或其抗原结合片段，其拮抗Sp35活性，其中所述的Sp35抗体或其抗原结合片段与Sp35的至少一个抗原决定基结合，其结合力的特征在于解离常数K_D小于约5×10^-2M；

(iii)Sp35拮抗剂反义多核苷酸、小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)，其阻止Sp35的表达；以及

(iv)两种或多种所述Sp35拮抗剂的组合。

2.一种用于促进少突胶质细胞介导的神经元髓鞘形成的体外方法，包括使神经元和少突胶质细胞的混合物接触包含Sp35拮抗剂的组合物，其中所述Sp35拮抗剂选自由以下组成的组：

(iv)两种或多种所述Sp35拮抗剂的组合。

3.一种组合物在制备用于促进哺乳细胞中少突胶质细胞的分化或存活的药物中的应用，其中所述组合物包含Sp35拮抗剂，所述Sp35拮抗剂选自由以下组成的组：

(iv)两种或多种所述Sp35拮抗剂的组合。

4.一种组合物在制备用于治疗哺乳动物中与少突胶质细胞死亡或缺乏分化相关的疾病、失调或损伤的药物中的应用，其中所述组合物包含Sp35拮抗剂，所述Sp35拮抗剂选自由以下组成的组：

(iv)两种或多种Sp35拮抗剂的组合。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其中，所述Sp35拮抗剂包括可溶性Sp35多肽。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述可溶性Sp35多肽包括SEQ ID NO：2的34-532位氨基酸残基。

7.根据权利要求5所述的应用，其中，所述可溶性Sp35多肽包括SEQ ID NO：2的417-493位氨基酸残基。

8.根据权利要求5所述的应用，其中，所述可溶性Sp35多肽进一步包括异源性多肽。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述异源性多肽被融合至所述可溶性Sp35多肽。

10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述异源性多肽选自由抗体Ig多肽、血清白蛋白多肽、靶向多肽、报道多肽、一个或多个半胱氨酸残基以及促纯化多肽组成的组。

11.根据权利要求10所述的应用，其中，所述异源性多肽选自由免疫球蛋白Fc、人类血清白蛋白或其片断以及组氨酸标签组成的组。

12.根据权利要求5所述的应用，其中，所述可溶性Sp35多肽结合于聚合物。

13.根据权利要求12所述的应用，其中，所述聚合物选自由聚亚烷基二醇、糖聚合物、以及多肽组成的组。

14.根据权利要求13所述的应用，其中，所述聚合物是聚亚烷基二醇。

15.根据权利要求14所述的应用，其中，所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。

16.根据权利要求12所述的应用，其中，所述可溶性Sp35多肽结合于1、2、3或4个聚合物。

17.根据权利要求16所述的应用，其中，所述聚合物的总分子量为5,000Da到100,000Da。

18.根据权利要求3或4所述的应用，其中，所述Sp35拮抗剂包括Sp35抗体或其片段。

19.根据权利要求18所述的应用，其中所述的Sp35抗体或其片段阻断少突胶质细胞生长或分化的抑制。

20.根据权利要求18所述的应用，其中所述的Sp35抗体或其片段阻断CNS神经元的脱髓鞘或髓鞘功能不良。

21.根据权利要求3或4所述的应用，其中，所述Sp35拮抗剂包括Sp35拮抗剂多核苷酸。

22.根据权利要求21所述的应用，其中所述Sp35拮抗剂多核苷酸是反义多核苷酸，其包含至少10个互补于所述Sp35mRNA的编码部分的碱基。

23.根据权利要求3或4所述的应用，其中所述Sp35拮抗剂多核苷酸是shRNA。

24.根据权利要求23所述的应用，其中，所述shRNA包括以下的核苷酸序列：TGATCGTCAT CCTGCTAGAC TTCAAGAGAGTCTAGCAGGA TGACGATCTT TTTTC(SEQ ID NO：40)。

25.根据权利要求3或4所述的应用，其中，所述哺乳动物已经被诊断为患有疾病、失调或损伤。

26.根据权利要求25所述的应用，其中，所述疾病、失调、或损伤选自由多发性硬化症(MS)、进行性多发性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、桥脑中央髓鞘溶解症(CPM)、脑白质肾上腺萎缩症、亚历山大病、Pelizaeus-Merzbacher病、Wallerian变性、视神经炎、横贯性脊髓炎、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏症、Alzheimer氏病、帕金森氏病、脊髓损伤、创伤性脑损伤、放射后损伤、化疗的神经并发症、中风、急性缺血性视神经病变、维生素E缺乏、单纯维生素E缺乏综合征、AR、Bassen-Kornzweig综合征、Marchiafava-Bignami综合征、异染性脑白质营养不良、三叉神经痛、以及贝尔氏麻痹组成的组。

27.根据权利要求26所述的应用，其中，所述疾病、失调或损伤是多发性硬化症(MS)。

28.根据权利要求3或4所述的应用，其中将所述组合物配成制剂用于通过推注或慢性输注而给予所述哺乳动物。

29.根据权利要求28所述的应用，其中将所述组合物配成制剂用于直接给予到所述哺乳动物的中枢神经系统。

30.根据权利要求29所述的应用，其中将所述组合物配成制剂用于直接给予到所述哺乳动物的MS慢性病变。

31.根据权利要求3或4所述的应用，其中所述的组合物包括多核苷酸转染的少突胶质细胞，所述多核苷酸通过可操作连接于表达控制序列编码所述可溶性Sp35多肽或Sp35抗体或其片段或所述Sp35拮抗剂反义多核苷酸、小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)。

32.根据权利要求3或4所述的应用，其中所述的组合物包括多核苷酸，所述多核苷酸通过可操作连接于表达控制序列编码所述可溶性Sp35多肽或Sp35抗体或其片段或所述Sp35拮抗剂反义多核苷酸、小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)。

33.根据权利要求32所述的应用，其中，编码所述可溶性Sp35多肽或Sp35抗体或其片段或所述Sp35拮抗剂反义多核苷酸、小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)的所述多核苷酸在表达载体中。

34.根据权利要求33所述的应用，其中，所述表达载体是病毒载体。

35.根据权利要求32所述的应用，包括培养的包含所述多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸编码所述可溶性Sp35多肽或Sp35抗体或其片段或所述Sp35拮抗剂反义多核苷酸、小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)，其中所述培养的宿主细胞表达所述Sp35拮抗剂。

36.根据权利要求35所述的应用，其中，将所述培养的宿主细胞配成制剂用于在所述神经系统疾病、失调或损伤的部位处或其附近给予所述哺乳动物。

37.根据权利要求32所述的应用，其中，所述培养的宿主细胞来源于待治疗的哺乳动物。

38.根据权利要求34所述的应用，其中，所述病毒载体选自由腺病毒载体、甲病毒载体、肠道病毒载体、瘟疫病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、乳多空病毒载体以及痘病毒载体组成的组。

39.根据权利要求38所述的应用，其中，所述疱疹病毒载体选自由单纯疱疹病毒载体和EBV载体组成的组。

40.根据权利要求38所述的应用，其中，所述痘病毒载体是牛痘病毒载体。

41.根据权利要求34或38-40中任一项所述的应用，其中，将所述组合物配成制剂用于通过下述途径给予，其中所述途径选自由局部给予、眼内给予、非肠道给予、胸内给予、硬膜下给予以及皮下给予组成的组。

42.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述Sp35拮抗剂包括可溶性Sp35多肽。