KR20020092917A - 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물 - Google Patents
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Abstract
멕신 트랜스제닉 동물에 의한, 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물이 제공되었다. 멕신유전자에 의한 트랜스제닉 마우스는, 메산기움기질영역의 확대와 면역복합체의 침착 및 메산기움세포의 증가를 동반하는 전형적인 메산기움세포 증식성 신장염 증상을 나타냈다. 본 발명의 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물은, 만성 사구체질환의 병태해석이나 치료약 스크리닝에 유용하다.
Description
기술분야
본 발명은, 트랜스제닉 동물에 의한 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물에 관한 것이다.
배경기술
메산기움세포(mesangial cell)는, 신사구체의 구조 및 기능의 유지에 중심적인 역할을 하고 있다. 또한 메산기움세포는, 각종 신장염에 있어서도 중심적인 병태생리학적 의의를 갖는다. 예를 들면 메산기움세포의 증식 및 세포외 메산기움기질(extracellular mesangial matrix)의 축적은, 만성 사구체신장염(chronic glomerulonephritis)이나 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy)과 같은 여러 사구체질환 환자의 사구체경화증의 중요한 병리소견이다.
일반적으로 병태의 해석을 진행하는데 있어서, 모델 동물이 하는 역할을 크다. 예를 들면, c-myc 암유전자가 도입된 트랜스제닉 마우스(미국특허 5087571)는, 백혈병의 모델 동물로서 병태해명에 크게 공헌했다. 메산기움세포의 증식병상을 나타내는 모델 동물이 실현되면, 여러 사구체질환의 모델이 되는 것을 예측할 수 있지만, 현실적으로 이러한 모델 동물은 알려져 있지 않다.
인간의 만성 사구체신장염은, 신부전에 이르는 진행성 사구체병변의 커다란 원인이 되고 있어, 그 동물 모델을 이용한 병인의 해명이 기다려지고 있다. 메산기움세포 증식성 신장염 모델의 제공은, 메산기움세포의 생물학적 성질의 해명, 메산기움세포에 관련된 질환의 원인구명, 더 나아가서는, 메산기움세포에 관련된 질환의 치료약의 탐색이나 검정에 있어서 중요한 실험재료가 될 수 있다.
메산기움세포의 마커로서는, 래트에서는 Thy1 항원이 알려져 있다. 그러나 이 유전자는 메산기움세포 특이적이지 않은데다가, 또한 인간에서는 메산기움세포에는 별현하고 있지 않다(Miyata T. et al., Immunology(1989); 67: 531-533; Miyata T. et al., Immunology(1990); 69: 391-395). 또한, 메산기움세포는 활성화되면 α평활근 액틴(α-smooth muscle actin)을 발현하는 것이 알려져 있지만, 이 유전자도 메산기움세포 특이적이지 않다. 따라서, 이들 유전자를 토대로 트랜스제닉 동물을 제작하더라도, 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물은 얻어지지 않는 것으로 추측된다.
지금까지, 일반적으로는 마우스에 있어서의 신장질환 모델의 제작은 어려운 것으로 되어 있었다. 따라서, 종종 기저막에 대한 항체(항 GBM 항체)를 투여하는 신장염 모델이 사용되어 왔다. 그러나 이 모델은 개체간의 증상의 발현레벨에 차가 생기기 쉽고, 또한 래트에 비해 현저한 병변을 얻기 어려운 등의 문제가 있었다.
최근들어, Johnson 그룹은 항사구체항체의 투여에 의한 신장질환 모델 동물을 보고했다. 그들의 신장질환 모델 동물은, 중독한 사구체장애를 나타내고, 사구체반월(glomerular crescent)의 형성을 나타낸다. 그러나, 이들 병태는 모두 인간에 있어서의 급속 진행성 사구체신장염에 상응하고 있다고 생각할 수 있다(Ophascharoensuk et al. Kidney Int 54, 416, 1998). 이 때문에, 보다 인간 만성 사구체신장염에 가까운 병태를 나타내는 모델 동물의 실현이 기다려지고 있었다.
이러한 요구에 응하기 위해, 최근에는 유전자조작에 의한 모델 동물의 제작이 시도되고 있다. 예를 들면, SV40에 의한 것(MacKay et al. Kidney Int 32, 827, 1987)이나 성장호르몬에 의한 것(Doi et al. Am J Pathol137, 541, 1990)이 유명하지만, 이들은 사구체경화가 주된 병변으로 사구체에 있어서의 증식성 변화가 부족하다. 인터루킨-6(interleukin-6 gene)의 유전자를 도입한 트랜스제닉 마우스가 신부전을 나타내는 것도 알려져 있지만, 주된 병변은 사구체경화와 뇨세관간질장애이다(Fattori et al. Blood 83, 2570, 1994). 또한, 레닌(renin)과 안지오텐신(angiotensin)의 유전자를 도입한 트랜스제닉 마우스(Tsukuba hypertensive mice)는, 사구체경화를 나타내는 것이 알려져 있다(Shimokama et al. Virchows Arch 432, 169, 1998). 그러나 이 장애는 고혈압증상에 의해 초래되는 것으로, 역시 인간에 있어서의 사구체장애의 모델 동물로는 될 수 없다. 이와 같이, 메산기움세포의 증식이나 메산기움기질의 확대(expansion)를 동반하는, 인간의 사구체질환의 모델로 될 수 있는 트랜스제닉 동물은 알려져 있지 않다. 종래의 트랜스제닉 마우스에 있어서의 신장병변(renal disorders)은, 종종 다른 목적으로 도입된 유전자의 영향에 의해, 소위 우연한 산물로서 발견된 것이 많다. 따라서, 인간의 사구체질환의 모델 동물을 얻기 위해, 어떠한 유전자를 사용해야 하는지를 나타내는 보고는 없었다고 할 수 있다.
또한 본 발명자는, 먼저 메산기움세포에 특이적으로 발현하고 있는 단백질로서 멕신을 보고하고 있다(J. Clin. Invest, 1998 Aug 15, 120:4, 828-36). 그러나, 이 단백질을 코드하는 DNA를 도입함으로써 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물을 얻을 수 있는 것은 알려져 있지 않다.
발명의 개시
본 발명은, 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물과, 그 제작방법의 제공을 과제로 한다. 또한, 본 발명에 의해 얻을 수 있는 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물을 사용한 치료약의 스크리닝방법을 제공하는 것도, 본 발명의 과제이다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명자는 멕신과 그것을 코드하는 DNA에 착안했다. 멕신은, 메산기움세포에 특이적으로 발현하는 유전자에 의해 코드되는 단백질이다(J. Clin. Invest, 1998 Aug 15, 120:4, 828-36). 인간 ·멕신, 또는 래트나 마우스에 있어서의 그 호모로그는, 본 발명자에 의해 이미 그 구조가 명확해져, 특허출원되어 있다(WO 99/15652). 그러나 멕신의 과잉발현이 메산기움세포에 어떠한 영향을 주는 것인가에 대해서는 명확해져 있지 않았다. 본 발명자는, 멕신을 코드하는 DNA의 도입에 의해 제작된 트랜스제닉 마우스가, 전형적인 신장 메산기움세포 증식성 신장염의 증상을 나타내는 것을 확인했다. 즉, 약 35-40주령을 맞이한 상기 트랜스제닉 마우스의 신장 사구체조직에서는, 메산기움세포를 주체로 하는 저명한세포증식, 메산기움기질의 확대 및 면역글로불린이나 보체(complement)로 된 면역복합체의 침착항진(increased deposition)이 인정되어, 분절성의 경화(segmental sclerosis)에 빠져 있는 것이 관찰되었다. 이 관찰결과를 토대로, 멕신을 코드하는 DNA의 도입에 의해, 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물로서 유용한 트랜스제닉 동물을 제작할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성했다. 즉, 본 발명은, 아래의 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물, 이 모델 동물의 제작방법과 용도에 관한 것이다.
[1] 인간 ·멕신, 또는 인간 ·멕신과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 외래성 DNA를 신장 메산기움세포에 있어서 발현하는 트랜스제닉 비인간 동물인 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물.
[2] [1]에 있어서, 인간 ·멕신을 코드하는 DNA가, 서열번호:1의 염기서열의 코드영역으로 된 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물.
[3] [1]에 있어서, 비인간 동물이 마우스인 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물.
[4] 인간 ·멕신, 또는 인간 ·멕신과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 DNA와, 이 DNA를 동물의 신장 메산기움세포에 있어서 발현시킬 수 있는 프로모터를 포함하는 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물제작용 재조합 유전자(transgene).
[5] 다음의 공정을 포함하는, 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물의 제작방법.
a) 동물의 수정란에 [4]의 재조합 유전자를 도입하는 공정
b) 공정 a)의 수정란으로부터 발생한 초대 트랜스제닉 동물 중 도입한 외래유전자를 보유한 개체를 선택하는 공정
[6] [5]에 있어서, 더욱이 다음의 공정 c) 및 d)를 포함하는 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물의 제작방법.
c) 공정 b)에서 선택한 개체와 정상동물을 교배시켜 외래성 유전자를 헤테로로 보유하는 F1 동물을 얻는 공정
d) 공정 c)에서 얻은 F1 동물끼리를 교배시켜 외래성 유전자를 호모로 보유하는 F2 동물을 얻는 공정
[7] 다음의 공정을 포함하는, 메산기움세포 증식성 신장염에 대한 후보화합물의 치료효과를 평가하는 방법.
a) [1]의 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물에 후보화합물을 투여하는 공정,
b) 상기 모델 동물에 있어서의 신장염 증상의 변화를 관찰하는 공정
[8] 다음의 공정을 포함하는, 메산기움세포 증식성 신장염 치료용 화합물을 스크리닝하는 방법.
a) [1]의 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물에 후보화합물을 투여하는 공정,
b) 상기 모델 동물에 있어서의 신장염 증상의 변화를 관찰하는 공정
c) 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물의 신장염 증상을 완화하는 화합물을 선택하는 공정
[9] [8]의 스크리닝방법에 의해 얻을 수 있는 화합물을 주성분으로 포함하는, 메산기움세포 증식성 신장염의 치료 및/또는 예방용 의약조성물.
또한 본 발명은, 인간 ·멕신, 또는 인간 ·멕신과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 DNA와, 이 DNA를 동물의 신장 메산기움세포에 있어서 발현시킬 수 있는 프로모터를 포함하는 재조합 유전자의, 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물의 제작에 있어서의 사용에 관한 것이다.
본 발명에 의한 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물은, 공지의 트랜스제닉 동물의 제작방법에 의해 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서의 메산기움세포 증식성 신장염이란, 신장 메산기움세포의 증식과 메산기움기질의 확대를 동반하는 신장질환을 의미한다. 이러한 신장질환에는, 예를 들면 IgA 신증, 막성 증식성 사구체신장염, SLE(systemic lupus erythematosus)신증, 당뇨병성 신증, 또는 저온글로불린(cryoglobulin)신증 등이 알려져 있다. 트랜스제닉 동물은, 예를 들면 「발생 공학실험 매뉴얼」(Nomura T. edit. Katsuki M. edit. Kodansha (1989))이나, 「신생화학실험강좌 ·동물실험법」(일본생화학회편, 동경화학동인, 1991년) 등에 따라 제작된다. 아래에, 일반적인 트랜스제닉 동물의 제작 프로토콜에 따라 기술한다.
본 발명에 있어서, 인간 ·멕신이란, 서열번호:1에 나타내는 염기서열을 가지는 DNA에 의해 코드되는 단백질이다. 그 추정 아미노산서열을, 서열번호:2에 나타낸다. 본 발명의 트랜스제닉 동물은, 인간 ·멕신 뿐 아니라, 인간 ·멕신과 생물학적으로 동등한 기능을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 도입한 것인 것일 수 있다. 이러한 단백질로서는, 예를 들면 다른 종에 있어서의 멕신의 호모로그를 나타낼 수 있다. 멕신의 호모로그에는, 예를 들면 래트 ·멕신, 그리고 마우스 ·멕신의 구조가 본 발명자에 의해 명백해져 있다. 래트 ·멕신의 염기서열 및 아미노산서열을 서열번호:3 및 서열번호:4에, 그리고 마우스 ·멕신의 염기서열 및 아미노산서열을 서열번호:5 및 서열번호:6에 나타낸다.
또한, 일반적으로, 진핵생물의 유전자는 인간 인터페론 유전자(interferon gene)로 알려져 있는 바와 같이 다형현상(polymorphism)을 나타내는 것이 많다. 이 다형현상에 의해, 아미노산서열에 1개 또는 그 이상의 아미노산의 치환이 생기더라도, 통상 단백질의 활성은 유지된다. 또한 일반적으로, 1개 또는 여러개의 아미노산의 개변에서는, 단백질의 활성은 유지되는 경우가 많은 것이 알려져 있다. 따라서, 서열번호:2, 서열번호:4 및 서열번호:6 중 어느 하나에 나타내어지는 아미노산서열을 인공적으로 개변한 아미노산서열로 된 단백질을 코드하는 유전자는, 상기 단백질이 신장 메산기움세포 증식성 신장염을 초래하는 한, 모두 본 발명에 이용할 수 있다. 이하, 인간, 래트 또는 마우스에 유래하는 멕신과, 그 생물학적으로 동등한 기능을 갖는 단백질을 총칭하여 멕신류라고 기재한다. 또한 멕신류로서 마우스에 유래하는 멕신을 코드하는 DNA를 마우스에 도입하는 경우에도, 인위적으로 도입한 마우스에 유래하는 DNA는 외래성 DNA이다. 그러나, 본 발명에 의한 트랜스제닉 동물을 메산기움세포 증식성 신장염의 모델 동물로서, 인간에 있어서의 치료제에 유용한 화합물의 스크리닝을 행하기에는, 인간 ·멕신의 DNA를 사용하는 것이 유리하다. 트랜스제닉 동물의 체내에서 인간 ·멕신에 대한 영향을, 보다 충실하게 반영할 수 있을 가능성을 기대할 수 있기 때문이다.
또한, 아미노산에 대한 코돈은 그 자체 공지로서, 그 선택도 임의이더라도좋고, 예를 들면 이용하는 숙주의 코돈 사용빈도를 고려하여 일반적인 방법에 따라 결정할 수 있다[Grantham, R. et al. Nucleic Acids Res. 9, r43 (1981)]. 따라서, 코돈의 축중을 고려하여, DNA를 적절히 개변한 것도 또한 본 발명의 DNA에 포함된다. 더욱이, 이들 핵산서열의 코돈의 일부개변은, 일반적인 방법에 따라, 목적으로 하는 개변을 코드하는 합성 올리고뉴클레오티드로 된 프라이머를 이용한 부위 특이적 변위도입법(site-specific mutagenesis) [Mark, D. F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 5662 (1984)] 등에 따를 수 있다.
더욱이, 서열번호:1, 서열번호:3 및 서열번호:5 중 어느 하나에 기재의 염기서열을 포함하는 DNA와 하이브리다이즈할 수 있고, 또한 그 DNA에 의해 코드되는 단백질이 신장 메산기움세포 증식성 신장염을 초래하는 한, 그 DNA는 본 발명에 의한 DNA에 포함된다. 스트린젠트한 조건하에서 특정서열에 하이브리다이즈할 수 있는 서열은, 특정서열이 코드하는 단백질과 유사한 활성을 가지는 것이 많다고 생각된다. 스트린젠트한 조건이란, 세척을 위한 조건으로서 통상 「1×SSC, 0.1% SDS, 37℃」정도, 보다 엄격한 조건으로서는 「0.5×SSC, 0.1% SDS, 42℃」정도, 더욱 엄격한 조건으로서 「0.1×SSC, 0.1% SDS, 55℃」정도를 나타낼 수 있다. 더하여, 본 발명에 있어서의 멕신류를 코드하는 DNA는, 트랜스제닉 동물에 신장 메산기움세포 증식성 신장염을 초래하는 한, 그 단편을 이용하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서 트랜스제닉 동물의 제작에 사용되는 멕신류를 코드하는 DNA는, 본 명세서에 개시한 염기서열을 토대로 공지의 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 메산기움세포의 cDNA 라이브러리를 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5에 나타낸 염기서열로 된 DNA를 프로브로 하여 스크리닝함으로써, 멕신류를 코드하는 cDNA의 단리가 가능하다. 또한 이 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, 서열번호:1, 서열번호:3 또는 서열번호:5에 나타낸 염기서열을 토대로 설정한 프라이머를 사용하여 PCR을 행함으로써, 멕신류를 코드하는 DNA를 증폭할 수 있다. 증폭생성물은, 공지의 방법을 토대로 클로닝한다.
멕신류를 코드하는 DNA는, 이 유전자를 도입할 동물의 세포에 있어서 발현 가능한 프로모터에 연결한 재조합 유전자 구조(transgene construct)로 하는 것이 유리하다. 본 발명의 재조합 유전자 구조는, 적당한 숙주를 이용하여 클로닝 가능한 벡터에, 상기 멕신류를 코드하는 DNA와, 그 상류에 프로모터를 삽입하여, 클로닝함으로써 구축할 수 있다. 본 발명에 이용할 수 있는 프로모터로서는, 마우스나 래트 등, 폭 넓은 척추동물에서 외래유전자의 발현을 유도할 수 있는 닭 β액틴 ·프로모터를 나타낼 수 있다.
또한, 외래유전자의 발현을 증강하기 위해, 엔헨서를 조합시킬 수 있다. 예를 들면, CMV에 유래하는 엔헨서는, 포유동물에 있어서의 외래유전자의 발현을 증강하는 것이 알려져 있다.
이들 유전자로부터 구성되는 재조합 유전자 구조의 구축에 있어서, 엔헨서와 프로모터를 구비하고, 더욱이 하류에 외래유전자 삽입용 멀티클로닝사이트를 배치한 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 구조를 가지는 벡터는, 예를 들면 pCAGGS(Niwa H, Yamamura K and Miyazaki J (1991) Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108, 193-200.) 등을 토대로실시예에 나타내는 방법에 의해 구축할 수 있다. 이 벡터는, 멀티클로닝사이트의 하류에 토끼β글로빈 ·터미네이터(rabbit β-globin terminator)가 배치되어 있어, 삽입된 외래유전자의 발현효율의 향상에 공헌한다.
적당한 제한효소에 의해 상기 벡터로부터 잘라낸 재조합 유전자 구조는, 충분히 정제되어 트랜스제닉 동물의 제작에 사용된다. 트랜스제닉 동물은, 미수정란, 수정란, 정자 및 그 시원세포(primordial germ cells)를 포함하는 배아세포 등에, 상기 구조를 도입함으로써 제작된다. 구조를 도입하는 세포로서는, 비인간 포유동물의 발생에 있어서의 배발생의 단계, 보다 구체적으로는 단세포 또는 수정란세포의 단계에서, 통상 8세포기 이전의 것이 이용된다. 구조의 도입방법으로서는, 인산칼슘법(calcium phosphate), 전기펄스법(electroporation), 리포펙션법 (lipofection), 응집법(aggregation), 마이크로인젝션법 (microinjection), 파티클건법(particle gun), DEAE-덱스트란법(DEAE-dextran) 등이 공지이다. 더욱이, 이렇게 하여 얻어진 형질전환세포를 상술한 배아세포와 융합시킴으로써 트랜스제닉 동물을 제작하는 것도 가능하다.
구조를 도입하는 세포는, 트랜스제닉 동물의 제작이 가능한 모든 비인간 척추동물에 유래하는 세포일 수 있다. 구체적으로는, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 토끼, 염소, 양, 돼지, 소, 개, 또는 고양이 등의 세포를 이용할 수 있다. 예를 들면 마우스에 있어서는, 배란유발제를 투여한 암컷 마우스에 정상인 수컷 마우스를 교배시킴으로써, 구조의 도입이 가능한 수정란을 회수할 수 있다. 마우스 수정란에서는, 일반적으로 웅성 전핵으로의 마이크로인젝션에 의해 구조가 도입된다.구조를 도입한 세포는, 체외에서의 하룻밤 정도의 배양 후, 도입에 성공했다고 생각되는 것이 대리모의 난관에 이식되어, 트랜스제닉 키메라동물이 탄생한다. 대리모에는, 정관을 절단한 수컷과 교배시켜 가임신상태로 한 암컷(pseudopregnant females)가 이용된다.
태어난 트랜스제닉 키메라동물은, 그 체세포의 유전자를 해석함으로써, 게놈에 외래유전자(멕신류를 코드하는 DNA)가 삽입(integration)되어 있는 것을 확인한 후, F1 동물의 탄생을 위해 정상인 동물과 교배시킨다. 이 때, 바람직하게는, 보다 많은 카피수를 가지는 개체를 선택하도록 한다. 일반적으로 구조로서 도입한 외래성 DNA는, 게놈의 동일한 부분에 복수 카피가 직렬로 삽입된다. 통상은 이 삽입 카피수가 많을 수록, 다량의 유전자 발현으로 연결되어, 보다 명료한 발현형을 기대할 수 있기 때문이다. 체세포 게놈에 있어서, 외래유전자(멕신류를 코드하는 DNA)가 바른 방향으로 삽입되어 있는 것은, 구조에 특이적인 프라이머를 사용한 PCR에 의해 확인할 수 있다. 또한, 도트 블롯법(dot blot)에 의해, 카피수의 상대적인 비교가 가능하다.
이 교배의 결과 탄생하는 F1 동물 중에서, 체세포에 외래유전자(멕신류를 코드하는 DNA)를 구비하는 것은, 헤테로자이고트(heterozygote)이면서 생식세포에 외래유전자(멕신류를 코드하는 DNA)를 전달할 수 있는 트랜스제닉 동물이다. 따라서, F1 동물 중에서 체세포에 외래유전자(멕신류를 코드하는 DNA)를 보유하는 것을 선택하여, 이들을 양친으로 하는 F2 동물을 탄생시킬 수 있다면, 외래유전자(멕신류를 코드하는 DAN)를 호모로 보유하는 호모자이고트 동물(homozygote animal)이 F2동물로서 얻어진다.
본 발명의 신장 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물에는, 메산기움세포에서 외래성 멕신류의 DNA를 발현하는 것인 한, 이들 트랜스제닉 동물 중 어느 하나의 세대이더라도, 이용할 수 있다. 예를 들면, 멕신류의 DNA를 헤테로로 보유하는 트랜스제닉 동물이더라도, 이 외래성 멕신류가 메산기움세포에서 발현하면, 신장 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물로서 유용하다.
또한 본 발명에 있어서는, 외래성 멕신류의 DNA를, 적어도 메산기움세포에서 발현시킬 수 있으면, 신장 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물로 할 수 있다. 따라서, 외래성 멕신류의 DNA를, 반드시 신장 특이적으로 발현시키지 않더라도 좋다. 예를 들면 실시예에 나타내는 바와 같이, 인간 멕신을 전신성으로 발현하는 트랜스제닉 마우스이더라도, 뚜렷한 신장 메산기움세포 증식성 신장염 증상을 얻을 수 있다.
트랜스제닉 동물이 신장 메산기움세포 증식성 신장염의 증상을 나타내고 있는 것은, 다음과 같은 지표를 관찰함으로써 확인할 수 있다. 예를 들면, 신장조직의 PAS 염색에 의해, 메산기움세포수나 메산기움기질의 면적을 관찰하여, 증식성 사구체신장염의 정도를 스코어화 할 수 있다. 구체적으로는, 다음과 같은 병리소견이, 본 발명의 트랜스제닉 동물에 전형적인 소견으로서 예시된다. 즉, 약 35-40주령(week of age)을 맞이한 본 발명에 의한 트랜스제닉 마우스의 신사구체조직에서는, 메산기움세포를 주체로 하는 뚜렷한 세포증식, 메산기움기질의 확대 및 보체, 면역글로불린으로 된 면역복합체의 침착이 인정되고, 분절성 경화에 빠져 있는 것이 관찰된다.
본 발명의 트랜스제닉 동물에 의한 신장 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물은, 메산기움 및 사구체 내피세포영역의 세포증식과 세포외기질의 축적을 만성 진행성으로 나타내, 명확한 신장 메산기움세포 증식성 신장염의 증상을 갖는다. 또한, 신장염 유발제의 주사나 수술 등, 다른 방법에 의해 제작한 모델 동물에 비해, 모델 동물을 조제하기 위한 수고를 들이지 않고, 균일한 개체를 다수 공급할 수 있는 점에서도 우수하다. 따라서, 본 발명의 모델 동물은, 신장 메산기움세포 증식성 신장염의 병태해명이나, 치료약 개발을 위한 대규모 약제 스크리닝에 유용하다.
본 발명의 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물을 이용하여, 메산기움세포 증식성 신장염에 대한 후보화합물의 치료효과를 평가할 수 있다. 본 발명에 의한 평가방법은, 아래의 공정에 의해 실시된다.
a) 본 발명에 의한 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물에 후보화합물을 투여하는 공정,
b) 상기 모델 동물에 있어서의 신장염 증상의 변화를 관찰하는 공정
또한 본 발명의 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물을 이용하여, 메산기움세포 증식성 신장염 치료용 화합물의 스크리닝을 실시할 수 있다. 본 발명에 의한 스크리닝방법은, 다음의 공정에 의해 실시된다.
a) 본 발명에 의한 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물에 후보화합물을 투여하는 공정,
b) 상기 모델 동물에 있어서의 신장염 증상의 변화를 관찰하는 공정
c) 후보화합물을 투여한 모델 동물의 신장염 증상을 완화하는 화합물을 선택하는 공정
본 발명의 평가방법, 또는 스크리닝방법에 있어서, 신장염 증상은, 신장조직의 병리소견, 또는, 멕신류의 발현레벨을 조정하는 활성을 기대하는 경우에는, 메산기움세포에 있어서의 멕신류의 mRNA나 단백질 레벨의 측정결과를 지표로 하여 유효성의 평가를 행할 수 있다. 신장조직의 병리소견은, 예를 들면 실시예에 나타내는 바와 같은 스코어화 방법에 의해, 그 레벨을 비교할 수 있다. 한편, mRNA는, 서열번호: 1 등에 기재된 멕신류를 코드하는 DNA의 염기서열을 토대로 설정된 프로브나 프라이머를 사용하여, 공지의 방법에 따라 측정할 수 있다. 또한 멕신류의 단백질 레벨의 측정은, 서열번호: 2의 아미노산서열로 된 단백질에 대한 항체를 사용한 이뮤노어세이(immunoassay)에 의해 평가할 수 있다.
따라서, 후보화합물의 투여 전후에, 이들 지표의 관찰결과를 비교함으로써, 후보화합물의 치료약으로서의 유효성을 평가할 수 있다. 또한, 동일한 계통의 트랜스제닉 동물을 사용하면, 동물 사이에서 이들 지표의 관찰결과를 비교함으로써, 후보화합물 사이의 유효성을 비교하는 것도 가능하다.
본 발명의 스크리닝에 사용하는 후보화합물로서는, 예를 들면, 천연 또는 합성화합물, 각종 유기화합물, 천연 또는 합성된 당류, 단백질, 펩티드, 유전자 라이브러리의 발현산물, 세포추출물, 또는 균체성분 등을 들 수 있다. 이 밖에, 멕신류의 발현을 제어하는 안티센스 핵산이나, 멕신류의 활성제어가 기대되는 항멕신류 항체를 후보화합물로 하는 것도 가능하다. 이들 후보화합물은, 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물에, 경구적으로, 또는 비경구적으로 투여된다.
본 발명의 스크리닝방법에 의해 선택된 후보화합물은, 더욱이 안전성이나 안정성 등을 시험한 후에, 메산기움세포 증식성 신장염을 위한 치료용 및/또는 예방용 의약조성물의 주성분으로 할 수 있다. 본 발명의 의약조성물은, 공지의 약제학적 제조법에 의해 제제화하여 투여할 수 있다. 또 주성분인 화합물 자체를 직접 투여하는 것도 가능하다. 제제화하는 경우는, 예를 들면, 약제로서 일반적으로 사용되는 매체 또는 담체와 적절히 조합시켜 투여할 수 있다.
또한, 상기 화합물이 DNA에 의해 코드될 수 있는 것이라면, 상기 DNA를 유전자 치료용 벡터에 삽입하여, 유전자치료를 행하는 것도 생각할 수 있다. 투여는, 예를 들면, 동맥내 주사, 정맥내 주사, 비강내 투여, 기관지내 투여, 근육내 투여, 피하투여, 경구투여, 환부로의 직접 투여 등의 방법으로 행할 수 있다. 투여량은, 환자의 체중, 연령, 건강도, 또는 투여방법 등의 조건에 따라 변동되지만, 당업자라면 적절히 적당한 투여량을 선택할 수 있다.
즉, 예를 들면 본 발명의 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물에 있어서, 신장염 증상의 완화효과를, 여러 투여량 사이에서 비교함으로써 유효농도가 결정된다. 그리고, 상기와 같은 각 투여 루트에 의해, 메산기움세포에 있어서의 투여화합물의 농도가 그 유효농도에 도달하는 투여량을 경험적으로 결정한다. 일반적인 투여형태에 있어서는, 유효성분이 전신에 분포하는 것으로 가정하여, 체중 1 kg 당 투여량을 결정한다. 실험동물에 있어서의 약물동태의 해석결과를 토대로 신장 이행성이 높다고 생각되는 화합물이라면, 투여량을 보다 낮게 설정할 수 있다.
본 발명의 의약조성물은, 결정된 투여량과 투여형태를 고려하여, 매체나 담체와 배합된다. 필요한 투여량을 달성할 수 있도록 유효성분을 배합하는 것은, 당업자가 통상 행하고 있다. 본 발명에 의한 의약조성물의 투여량은, 체중 1 kg 당 통상 1 ㎍-10 mg, 보다 일반적으로는 10 ㎍-1 mg으로 할 수 있다. 또한, 주사제의 경우는 경구투여의 100분의 1 정도를 투여량의 기준으로 할 수 있다. 더욱이 특수한 제제설계를 행함으로써, 투여량을 조정할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 의약조성물은, 적당한 담체에 보유함으로써 서방화제제로 하는 것도 가능하지만, 이러한 제제에 있어서는, 높은 혈중 농도를 유지할 수 있기 때문에, 배합량을 낮게 설정할 수 있다.
본 발명의 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물에는, 치료나 예방에 사용할 수 있는 화합물의 스크리닝 이외에도, 다음과 같은 용도에 유용하다. 먼저, 식이요법으로 대표되는 생활습관 개선의 지침을 검토하기 위한 재료로 할 수 있다. 또한, 인간의 사구체신장염과 병리상이 매우 유사하기 때문에, 신장염의 병태해석에 사용할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 트랜스제닉 마우스가 약 35-40주령에서 사구체신장염의 증상을 자연 발증하는 것을 이용하여, 사구체신장염의 발증에 있어서의 유전적 소인과 환경인자의 관련성을 명확하게 하기 위한 실험재료로서도 유용하다.
도면의 간단한 설명
도1은, 재조합 유전자 구조의 구축도를 나타내는 도이다. A는 pBsCAG-2의 구조를 나타낸다. B는 pBsCAG2/Megsin 및 난(egg)으로의 마이크로인젝션에 사용한 DNA 단편의 구조를 나타낸다.
도2는, 트랜스제닉 마우스의 신장 메산기움세포에 있어서의 인간 ·멕신유전자의 발현을 해석한 노던 블롯(northern blot analysis)의 결과를 나타내는 사진이다. 레인 1, 3이 레인 2, 4의 비트랜스제닉 동복자(littermates), 레인 2 및 4가 트랜스제닉 마우스, 레인 5는 야생형인 것이다. 각 레인의 트랜스제닉 마우스의 계통은, 아래에 나타내는 바와 같다. 레인 1, 2는, 계통 A, 레인 3, 4는 계통 B, 레인 5는 야생형.
도3은, 트랜스제닉 마우스의 신장조직에 있어서의 인간 ·멕신단백질의 발현을 항인간 멕신펩티드항체를 사용한 이뮤노블롯 해석(immunoblot analysis)결과를 나타내는 사진이다. 레인 1은 대장균에서 발현시킨 말토오스 결합 단백질 ·멕신융합단백질(양성 대조), 레인 2 및 4는 야생형 마우스의 신장, 레인 3 및 5는 트랜스제닉 마우스(각각 계통 A 및 B)의 신장에 대한 결과이다.
도4는, F1 세대 트랜스제닉 마우스(a) 및 야생형 마우스(b)의 신장에 있어서 인간 ·멕신유전자 산물을 항인간 멕신펩티드항체를 사용한 면역조직염색 (immunohistochemist)에 의해 검출한 결과를 나타내는 사진이다. 배율은 16배(삽입도에 대해서는 50배).
도5는, 정상 마우스 및 메산기움세포 증식성 신장염 모델 마우스의 신장의 PAS 염색상을 나타내는 사진이다. 「Wild type littermate」는 야생형, 「Megsin Tg/+」는 멕신 트랜스제닉 마우스(「헤테로」)의 신장절편이다.
도6은, 사구체의 크기(a) 및 사구체 당 메산기움세포의 수(b)를, 야생형 마우스 25마리 및 트랜스제닉 마우스 19마리에 대해 측정한 결과를 나타내는 도이다. 트랜스제닉 마우스에 대한 측정값 중,
(open circle)은 야생형 마우스의 평균값 + 2SD라고 하는 기준 이하의 것을 나타내고,
(close circle)은 이 기준을 초과하는 것을 나타낸다.
도7은, 면역글로불린(IgA, IgG, IgM)이나 보체로 된 면역복합체의 사구체 메산기움영역으로의 침착을 40주령째의 F1 세대 트랜스제닉 마우스(a) 및 야생형 마우스(b)에 대해서 면역형광염색에 의해 관찰한 사진이다. 배율은 50배.
도8은, 40주령째의 F1 세대 트랜스제닉 마우스(a) 및 야생형 마우스(b)에 있어서의 면역복합체의 사구체 메산기움영역으로의 침착을 전자현미경으로 관찰한 사진이다. 배율은 2500배.
도9는, 트랜스제닉 마우스의 각 조직에 있어서의 인간 멕신 mRNA의 발현을 해석한 노던 블롯의 결과를 나타내는 사진이다. 위에서부터 순서대로, 신장, 심장, 간장, 그리고 폐의 결과를 나타낸다. 각 조직의 사진은, 레인 1이 야생형, 레인 2가 트랜스제닉 마우스(계통 A), 레인 3이 트랜스제닉 마우스(계통 B)의 결과이다. 상단이 노던 블롯의 결과, 하단이 RNA 전기영동 후의 에티디움 브로마이드 염색(ethidium bromide staining) 사진이다.
도10은, 트랜스제닉 마우스 및 야생형 마우스의 신장조직의 면역조직염색법에 의한 관찰결과를 나타내는 사진이다. 위에서부터 순서대로, 항I형콜라겐항체(anti-type I collagen antibody), 항피브로넥틴항체(anti-fibronectin antibody), 항라미닌항체(anti-laminin antibody), 그리고 항IV형 콜라겐항체(anti-type IV collagen antibody)에 의한 염색결과를 나타낸다. 사진 우측의 열이 트랜스제닉 마우스(계통 A)의 결과이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하 본 발명을 실시예로서 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 그 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 재조합 유전자 구조
CMV의 엔헨서(CMV enhancer)와 닭β액틴 ·프로모터(chicken β-actin promoter)의 하이브리드인 CAG 프로모터의 제어하에 인간 ·멕신 cDNA를 발현하는 발현벡터를 아래와 같이 구축했다. 먼저, 인간 ·멕신의 개시코돈 직전의 염기서열을 Kozak 서열(GCCGCC)에 치환하기 위해, 센스 프라이머(B44F: 5'-ATGGATCCGCCGCCATGGCCTCCCTTGCTGCAGCAAATGCAGAG-3'/서열번호: 7) 및 안티센스 프라이머(H30-R: 5'-TATCCTGAGGCAGTGTTAACATGAAG-3'/서열번호: 8)를 사용하여, 인간 ·멕신 cDNA를 포함하는 플라스미드(pUC-MEGSIN)(WO 99/15652)를 주형으로 PCR을 행하여, 개시코돈 직전이 Kozak 서열에 치환된 인간 ·멕신 cDNA의 5'단편을 증폭했다. pUC-MEGSIN을 제한효소 BamHI 및 HpaI로 절단하여, 멕신 cDNA의 개시코돈을 포함하는 약 180 bp의 단편을 제거하고, PCR로 얻어진 단편을 삽입하여, Kozak 서열에 치환된 인간 ·멕신 cDNA를 가지는 플라스미드를 구축했다.
대장균 JM109에 형질전환하여 클로닝한 후, 플라스미드를 제한효소 BamHI 및 HindIII로 절단하여, 얻어진 멕신 전장을 포함하는 1.2 kb의 단편을 정제하고, TaKaRa Blunting Kit(TaKaRa)를 사용하여 평활말단화했다. pBsCAG-2(Kawarabayashi, T, Shoji M, Sato M, Sasaki A, Ho L, Eckman CB, Prada C-M, Younkin SG, Kobayashi T, Tada N, Matsubara E, Iizuka T, Harigaya Y, Kasai K and Hirai S (1996) Accumulation of b-amyloid fibrils in pancreas of transgenic mice. Neurobiol. Aging 17, 215-222)를 EcoRI에 의해 절단하여 직쇄로 한 후, 동일하게 말단을 평활화하여, 알칼리포스파타아제(TaKaRa)에 의해 탈인산화처리를 행했다. 이 플라스미드에 상기의 1.2 kb의 단편을 라이게이션(ligation)하여 재조합 플라스미드를 제작하고, 대장균 JM109에 형질전환하여 클로닝했다. 삽입된 인간 MEGSIN cDNA의 방향성이 닭β액틴 프로모터(chicken β-actin promoter)와 동일한 클론을 시퀀싱에 의해 선발하여, 이 재조합 플라스미드를 pBsCAG2Megsin으로 했다(도1B). 또한, pBsCAG-2는, pCAGGS(Niwa H, Yamamura K and Miyazaki J (1991) Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108, 193-200., CMV 엔헨서 및 닭β액틴 ·프로모터 및 토끼β글로빈 ·터미네이터를 가지는 포유동물세포 발현벡터)의 SalI-PstI 단편을 플라스미드벡터 pBluescript(등록상표)II SK(-)(Stratagene사)의 SalI-PstI 부위에 삽입하여 제작되었다(도1A).
pBsCAG2Megsin을 제한효소 ScaI, SalI 및 NotI로 절단하여, 아가로우즈겔 전기영동 후, 멕신 cDNA를 포함하는 약 3.4 kb의 단편을 잘라내 회수하여, 트랜스제닉 마우스의 제작에 사용했다(도1B).
[실시예 2] 트랜스제닉 마우스의 제작
인젝션 3일 전 저녁에 PMSG(pregnant mare's serum gonadotropin)를 8-20주령의 암컷 마우스(C57BL/6과 C3H의 F1)에 복강투여하고, 그 2일 후의 저녁에 hCG(인간 태반성 고나도트로핀)를 복강투여했다. 이에 이어, 8-20주령의 수컷 마우스(C57BL/6)를 한마리 씩 우리에 넣어 교배를 개시했다. 교배 다음날 오전중에 질전(vaginal plug)의 검사를 행하여, 질전이 확인 가능했던 암컷 마우스를 경추탈구(dislocation of cervical vertebrae)에 의해 도살후, 수란관을 단리하여, 히알루로니다아제(hyaluronidase)를 첨가한 Whitten 배양액에 옮겼다. 실체 현미경하에서 난을 배출시켜, 수정란의 분리 ·세척을 행했다.
미분간섭장치 부착 (Nomarski defferential contrast attachment) 도립현미경에, 머니퓰레이터(manipulator)를 조합시킨 시스템을 사용하여, 구멍 뚫린 슬라이드 글래스 상의 배양액적에 5-30개의 수정란을 이동하여, 하나의 수정란 당 약 2,000 카피의 상기에서 조제한 DNA 단편을 포함하는 2 pl의 DNA 용액을 웅성 전핵에 마이크로인젝션했다. DNA 주입이 종료된 난은, 난관에 이식할 때까지 배양했다. 이식부위는 배의 발생단계에서 달라, 1-2 세포기의 배는 난관내로, 8세포기-배반포기의 배는 자궁내로 이식했다.
배이식조작에 앞서, 레시피언트 암컷(recipient female mice)의 황체의 활성화처리를 행해, 가임신을 유도시켰다. 즉, 발정 전기의 암컷을 정관결찰한 수컷과불임교미시켰다. 이식배의 출산예정일은, 레시피언트 암컷의 질전이 붙은 날을 첫째날로 하여, 20일째로 하여 계산했다. 난관내로 이식하는 경우는, 1세포기 및 2세포기 배 모두, 넴부탈(Nembutal) 마취하에서 가임신 첫째날의 레시피언트 마우스의 난관내에 실체 현미경하에서 이식했다. 한쪽 난관 당 10개 정도의 배를 이식했다. 자궁내에 이식하는 경우는, 체외배양에 의해 상실배기에서 배반포기까지 발생시킨 배를, 넴부탈 마취하의 가임신을 유도해 둔 레시피언트 마우스의 자궁내에 이식했다. 레시피언트 마우스의 가임신 일령은 배의 일령 보다도 1일 짧게 계산했다. 외견으로부터 한 배의 새끼(litter)의 수를 판단하여, 한 배의 새끼의 수가 5마리 이상으로 예상된 경우는 자연분만, 4마리 이하이면 제왕절개를 행했다. 태어난 마우스는, 생후 3-4주 사이에 부모로부터 떼어, 암수를 나눠 사육했다.
[실시예 3] 트랜스제닉 마우스의 선택
생후 4주령 이후에 꼬리의 일부를 절단하여, 키트(Qiagen tissue kit; Qiagen사)를 사용하여 게놈 DNA를 추출했다. 이것을 주형으로 하여, 도입유전자 단편의 PCR에 의한 증폭을 행했다. 증폭에는, CMV-F1 프라이머(5'-GTC GAC ATT GAT TAT TGA CTA G-3'/서열번호: 9)와 CMV-R1 프라이머(5'-CCA TAA GGT CAT GTA CTG-3'/서열번호:10), β-gl-3 프라이머(5'-CTT CTG GCG TGT GAC CGG CG-3'/서열번호: 11)와 hM2-2 프라이머(5'-ATC GAA TTC TGA GAT CAT AAT CCC TGT GGG ATG C-3'/서열번호: 12) 및 hM8-1 프라이머(5'-TTA TTC AGT GGC AAA GTT TCT TGC CCT TGA-3'/서열번호: 13)와 β-globin R 프라이머(5'-TCG AGG GAT CTT CAT AAG AGA AGA G-3'/서열번호: 14)의 3쌍의 프라이머를 사용하여, 3쌍의 프라이머에 의한 모든 PCR에서 증폭산물이 얻어지는 개체를 선별했다. 얻어진 F0 세대 6개체(수컷 3개체, 암컷 3개체)를, 정상개체(C57BL/6N Jcl)와 교배시켜 F1 세대를 얻고, 더욱이 헤테로의 F1 끼리를 서로 교배하여 F2를 얻었다.
[실시예 4] 인간 ·멕신유전자의 발현해석(1) 노던 블롯 해석
인간 ·멕신유전자의 노던 블롯 해석을, 아래와 같이 하여 행했다. 인간 ·멕신유전자를 인서트로서 포함하는 벡터 pBsCAG-2의 BglII/BamHI 단편을 랜덤 DNA 라벨링에 의해 RI 표지하여, 프로브로 했다. 이 단편은 벡터의 폴리 A 시그날 근처에 상당한다. 마우스의 신장 메산기움세포로부터 추출한 전체 RNA(10 ㎍)를, 2.2M 포름아미드를 포함하는 1% 아가로우즈겔로 분리하여, 니트로셀룰로오스 필터로 전사했다. 필터를 Rapid Hyb 용액(Amersham사, Arlington Heights, IL)중에서 하이브리다이즈시켰다. 하이브리다이즈 후에, 55℃에서 0.1 ×SSPE/0.1% SDS라고 하는 최종 스트린젠시로 세척했다. 실험에 사용한 마우스는, 트랜스제닉 마우스로서 A1-14(키메라) 및 F1-18(F1)을, 또 정상 마우스(비트랜스제닉 마우스)로서 A1-11(A1-14의 동복자) 및 F1-19(F1)의 4마리이다. 음성 대조(N.C.)에는 형질전환하지 않은 정상 마우스(C57BL/6)를 사용했다.
얻어진 결과를 도2에 나타냈다. 트랜스제닉 마우스의 신장 메산기움 세포에 있어서, 외래유전자인 인간 ·멕신유전자가 발현하고 있는 것을 확인할 수 있었다(레인 2 및 4).
[실시예 5] 항인간 ·멕신항체의 제조 ·정제
다른 세르핀 패밀리(serpin family)와의 상동성이 낮고, 또한 친수성을 갖는 영역을 면역원으로서 이용하여, 멕신단백질에 대한 폴리클로날항체를 제조했다. 구체적으로는, 인간 ·멕신을 구성하는 아미노산서열(서열번호: 2)로부터, 다음의 아미노산서열을 면역원으로서 선택했다.
N 말단으로부터의 위치: 72-86
아미노산서열: SQSGLQSQLKRVFSD
서열번호: 15
펩티드명: P2
상기 아미노산서열의 N 말단에 C를 부가한 펩티드를, 자동합성장치 모델 432A(Perkin Elmer, Foster City, CA)로 합성했다. 합성 펩티드는 역상 HPLC로 정제후, 동결 건조하여, 면역 및 면역학적 특이성의 확인을 위한 경합실험에 사용했다.
합성 펩티드와 소 티로글로불린(bovine thyroglobulin)(Sigma사제)을 N-(6-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드(N-(6-maleimidocaproyloxy)succinimide)(동인화학연구소제)를 사용하여 결합시켜, 0.85% NaCl 용액으로 투석후, 아쥬반트(Difco제)와 충분히 혼화하고 유화시켜, 토끼 피하에 투여했다. 초회면역(20 ㎍/마리)후 3주일 후에 2회째(50 ㎍/마리)의 면역을 행하고, 이후 2주일 마다 4회 면역(50,100, 200 ㎍/마리)을 행했다. 아쥬반트는 초회만 프로인드 완전 아쥬반트로, 2회째 이후는 프로인드 불완전 아쥬반트를 사용했다. 41일 후, 55일 후, 채혈로 얻은 혈청이 합성 펩티드와 반응하는 것을 확인하기 위해, 혈청의 항체가를 효소면역측정법(ELISA)에 의해 평가했다. 항원 50 ng/웰을 고상화한 96웰 플레이트에 연속적으로 희석한 항혈청을 각 웰에 100 μL 가하여 1차반응을 행하고, 세척 후, 2차반응으로서 HRP 결합 염소 항토끼 IgG(Cappel사제)를 반응시켰다. 세척 후, 기질로서 오르토페닐렌디아민(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)을 사용하여 발색시켜 흡광도 492 nm로 측정하여, 항체가가 상승하고 있는 것을 확인했다.
멕신단백질의 합성 펩티드 P2에 대한 폴리클로날항체는, 공지의 방법(세포공학별책 실험프로토콜 시리즈 항펩티드항체 실험프로토콜, 슈쥰사)에 따라 이뮤노 어피니티 크로마토그래피(immunoaffinity chromatography)에 의해 정제했다. 조작은, 다음과 같다. 합성 펩티드를 FMP(2-fluoro-1-methylpyridinium toluene-4-sulfonate) 활성화 셀룰로파인(Cellulofine)(생화학공업제)에 고정화하여, 어피니티 컬럼을 제작했다. 항체는, 멕신단백질을 면역하여 항체가가 상승한 토끼 혈청을 PBS(-)로 희석한 후, 펩티드컬럼을 사용하여 어피니티 정제했다. 얻어진 정제항체는 웨스턴 블롯(Western blotting)에 의해 멕신단백질 융합단백질과 반응하는 것을 확인하고, 멕신단백질에 특이적인 것을 증명했다.
[실시예 6] 인간 ·멕신유전자의 발현해석(2) 이뮤노 블롯 해석
인간 ·멕신단백질의 이뮤노 블롯 해석을, 아래와 같이 하여 행했다. 신장조직(10 mg)을 샘플 버퍼(0.35M 트리스-HCl(pH 6.8), 10% SDS, 36% 글리세롤, 5% β-메르캅토에탄올, 0.012% 브로모페놀블루) 100 ㎕ 중에서 호모지나이즈(homogenize)하여, 5000 g으로 15분간 원심했다. 상청중의 단백질을 5분간 끓여 변성시키고, 10% 아크릴아미드겔상에서 SDS-PAGE에 의해 분리한 후, 전기영동적으로 폴리플루오르화비닐리덴막(Bio Rad Laboratories, Hercules, CA)으로 이동했다. 이 막을 0.5% Tween 20, 2% 소혈청 알부민을 포함하는 인산완충생리식염수에 의해 4℃에서 하룻밤 블로킹하여, 토끼 항인간 ·멕신 IgG(10 ㎍/ml)와 인큐베이트했다. 이어서, 이 막을 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS로 세척한 후, 1:5000으로 희석한 알칼리포스파타아제 표지 염소 항토끼 IgG(Cappel사, Durham, NC)와 인큐베이트하여, p-니트로 블루 염화테트라졸륨(p-nitro blue tetrazolium chloride)/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴인산(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)용액(Bio Rad Laboratories)으로 발색시켰다. 양성 대조로서, 대장균에서 발현시킨 말토오스 결합단백질 ·멕신융합단백질(MBP-멕신)을 사용했다.
도3에 나타내는 바와 같이, 트랜스제닉 마우스의 신장에 있어서 인간 ·멕신단백질이 발현하고 있는 것을 확인할 수 있었다(레인 3 및 5).
[실시예 7] 인간 ·멕신유전자의 발현해석(3) 면역조직염색(이뮤노 히스토케미스트)
트랜스제닉 마우스로부터 신장조직을 채취했다. 신장조직은, 동결조직 포매제(O. C. T. compound, Tissue Tek Miles 사, Elkhart, IN)에 포매하여, 드라이아이스/아세톤으로 순간적으로 동결했다. 이 동결 포매조직으로부터 4 ㎛의 동결절편을 제작했다. 이 동결절편을 4%의 탈지우유(skim milk)에 의해 실온에서 60분간 블로킹한 후, 토끼 항인간 ·멕신 IgG(10 ㎍/ml), 또는 1:200으로 희석한 플루오레세인이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate ; FITC)표지 염소 항마우스 IgG, IgA, IgM, 또는 C3 항체(Cappel사) 중 어느 하나와 4℃에서 하룻밤 인큐베이트했다. 이어서, 1:50으로 희석한 퍼옥시다아제 표지 돼지 항토끼항체(Dako사, Glostrup, Denmark)와 실온에서 20분간 인큐베이트하여, 0.03%의 과산화수소수를 함유하는 3,3'-디아미노벤지딘용액으로 발색시켰다. 그 후, 헤마톡실린(hematoxylin)에 의한 대비염색을 행했다.
트랜스제닉 마우스의 신장조직에 대해 면역조직염색한 현미경사진(Carl Zeiss(New York, NY)제 Zeiss Ortholux 9902)를 도4에 나타낸다. 도로부터 명확한 바와 같이, 트랜스제닉 마우스의 신장에서는 멕신단백질이 일률적으로 발현하고 있는 것이 확인되었다.
[실시예 8] 멕신 ·트랜스제닉 마우스의 병리해석(1) PAS 염색에 의한 관찰과 정량화
실시예 3에서 얻어진 F1 세대의 트랜스제닉 마우스의 병리해석을 행했다. 이들 마우스는 외견상, 정상 마우스에 비해 명확한 변화는 보이지 않았다. 또한, 행동도 정상 마우스와 차이는 인정되지 않았다. 또한, 부검에 의해서도, 신장(후술)이외에 뚜렷한 변화는 보이지 않았다. 주요 장기의 조직절편(HE 염색)의 관찰에 의해서도, 신장 이외에 특히 이상은 보이지 않았다.
각 트랜스제닉 마우스 신장의 PAS 염색에 의해, 메산기움기질의 면적 및 메산기움세포수 변화 등의 해석을 행했다. F1(헤테로) 개체에서는, 10주째까지 뚜렷한 변화는 없었지만, 36-40주째에 걸쳐 메산기움세포를 주체로 한 세포증식, 메산기움기질의 확대가 인정되고, 증식성 신장염상이 관찰되었다. 이 때의 신장의 PAS 염색상을 도5에 나타낸다. 사구체 비대, 메산기움세포의 증가, 메산기움기질의 확대를 포함하는, 메산기움세포 증식성 신장염의 전형적인 소견이 보였다.
이들 관찰결과를 아래와 같이 정량화했다. PAS 염색상을 3CCD 카메라(Olympus, Tokyo, Japan)로 스캔하여, 사구체 전체의 크기와 사구체 당 메산기움세포의 수를 소프트웨어: Image Grabber PCI(Fuji Film, Tokyo, Japan) 및 Mac Aspect(Mitani, Tokyo, Japan)에 의해 측정했다. 사구체의 크기는 사구체를 형성하는 모세혈관의 겉영역(outer region)을 둘러싸서 생기는 영역의 면적으로서 정의했다. 피질 중층부에 존재하는 20개의 사구체를 동정하여, 측정했다. 20개 미만의 사구체 밖에 포함하지 않는 절편은 측정에 사용하지 않았다. 측정자에 따라 측정값에 편차가 생기는 것을 피하기 위해, 20개의 사구체 중, 최대 및 최소의 것을 측정에서 제외했다. 즉, 절편마다 18개의 사구체를 측정하여, 측정값을 평균값 ±표준편차(SD)로 나타냈다. 유의한 차를 평가하기 위해, 분산분석(ANOVA)을 행했다. 그 결과로서, 만일, 유의한 차가 인정되었다면, Scheffe의 t-테스트를 행하여, 트랜스제닉 마우스 및 야생형 마우스 각각에 대해 얻어진 결과를 비교했다.
야생형 마우스 25마리에 대해 측정을 행하고, 트랜스제닉 마우스의 측정값이 야생형 마우스의 평균값 + 2SD 이하인 경우에는 정상인 것으로 간주했다. 이 기준에 따르면, 생후 20주째의 F1(헤테로) 트랜스제닉 마우스에서는, 14마리 중, 3마리가 변화를 나타냈지만, 40주째에서는, 19마리 중, 11마리(57.9%)에 대해 사구체의 크기가 증가하고, 12마리(63.2%)에 대해서 사구체세포의 수가 증가했다(도6). 합쳐서, 14마리(73.0%)가 조직학적으로 사구체의 이상을 나타냈다. 이러한 질환의 중독도(severity) 및 침투율(penetrance)은 성별에 상관 없이 일정했다. 또한, 지금까지 조사한 다른 기관, 예를 들면, 뇌, 심장, 폐, 비장, 간장, 위, 장, 정소 및 자궁에 있어서는 병리학적인 변화는 검출되지 않았다. 야생형 마우스에서는, 40주째에 메산기움기질의 확대를 나타낸 1마리를 제외하고, 병리학적인 변화는 관찰되지 않았다.
[실시예 9] 멕신 ·트랜스제닉 마우스의 병리해석(2) 면역복합체 침착의 관찰
신장이 이상을 나타내게 되는 40주령째의 트랜스제닉 마우스(F1 세대)에 있어서, 면역글로불린(IgA, IgG, IgM)이나 보체로 된 면역복합체의 사구체메산기움영역으로의 침착이 동일한 주령의 야생형 마우스의 경우에 비해 현저히 증대하는 것이 면역형광염색에 의해 나타내어졌다(도7).
상기의 조직에 대해 전자현미경에 의한 해석을 행했다. 신장조직을, 2% 글루타르알데히드를 포함하는 0.1M 인산나트륨완충액 중에 2시간 담궈 고정하고, 더욱이 2% 사초산오스미늄(osminum tetroxide)으로 후고정했다. 고정한 신장조직을 에탄올로 탈수하여, 최종적으로 Epon 812(TAAB, England) 중에 포매했다. 이 시료로부터 잘라낸 초박 절편을 초산우라닐(uranyl acetate)로 염색하고, 아세톤으로 처리한 후, 전자현미경(JEM-1200EX, JEOL, Tokyo, Japan)으로 해석했다.
그 결과, 비트랜스제닉 마우스에서는 메산기움영역에 있어서의 고전자밀도의 침착물이 소수 관찰될 뿐이었던 것에 비해, 트랜스제닉 마우스에서는 고전자밀도의 침착물은 현저히 증가하고 있고, 그 크기는 100~1000 nm에 달했다(도8). 트랜스제닉 마우스의 메산기움영역에 있어서의 이상은 메산기움세포수의 증가 및 메산기움기질의 확대에 의한 것이었다. 병리적인 이상은 메산기움영역에 한정되어 있어, 모세혈관 내피는 모두 정상적인 외관을 나타내고, 내피세포의 유창성(有窓性, fenestration)은 유지되어 있었다. 사구체상피세포는 족돌기(foot process)의 정삭적인 형태적 특징을 유지하고 있고, 흠집이 없었다. 피질 뇨세관도 정상적인 외관을 나타냈다. 단핵백혈구, 또는 다형핵백혈구의 침윤은 검출되지 않았다.
[실시예 10] 노던 블롯 분석에 의한 트랜스제닉 마우스 각종 장기에 있어서의 인간 멕신발현의 확인
전체 RNA를 ISOGEN(Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan)을 사용하여, 동결신장이나 각종 조직으로부터 신속하게 단리했다. RNA 20 ㎍을 1% 아가로우즈 포름알데히드겔상에서 전기영동하여, 나일론멤브렌(GeneScreen Plus™)에 캐필러리 트랜스퍼(capillary transfer)했다. 전사한 RNA는,32P 표지한 도입 인간 멕신유전자와하이브리다이즈시켜, 오토라디오그래피(autoradiography) 전에 0.1% 도데실 황산나트륨(SDS)을 포함하는 0.2 ×SSC로 세척했다.
노던 블롯 분석으로부터, 트랜스제닉 마우스에 있어서 인간 멕신 mRNA의 과잉발현이 확인되었다(도9). 도입유전자는 모든 조직에서 발현하고 있었지만, 특히 신장 및 심장에 있어서 강한 발현이 보였다. 트랜스제닉 마우스에 있어서의 인간 멕신 cDNA의 발현은, 착상 전단계에서 시작되어, 40주령 후까지 계속되었다.
[실시예 11] 면역조직 화학분석에 의한 IV형 콜라겐 및 라미닌(laminin) 축적의 확인
확대된 기질의 성분을 동정하기 위해, 아래의 항체를 사용하여, 동결절편에 면역조직염색법(Nangaku, M. et al., J. Am. Soc. Nephrol. 10, 2323-2331, 1999)을 시행했다. IV형 콜라겐과 I형 콜라겐은, 각각, 염소 항IV형 콜라겐 ·폴리클로날항체 및 염소 항I형 콜라겐 ·폴리클로날항체(Southern Biotechnology. Birmingham, AL)로 동정했다. 피브로넥틴은 토끼 항피브로넥틴항체(Chemicon)로 확인했다.
상기의 세포외 메산기움기질 성분에 대한 항체를 사용하여 신장부분을 염색한 결과를 표10에 나타냈다. 야생형 및 트랜스제닉 마우스 양쪽에서, I형 콜라겐의 축적은 관찰되지 않았다. 트랜스제닉 마우스에서는, 사구체에 있어서, IV형 콜라겐 및 라미닌의 축적을 나타냈다. 대조적으로 트랜스제닉 마우스에서는, 피브로넥틴의 양이 야생형 마우스와 비교하여 보다 적었다. 즉, 증대한 메산기움기질은 IV형 콜라겐 및 라미닌으로 구성되어 있는 것이 명백해졌다.
정상인 상태에서는 멕신은 사구체 메산기움영역에 국재하지만, 트랜스제닉 마우스에 있어서는 모든 조직에 있어서 멕신의 발현이 보였다. 이것은, 유전자도입에 사용한 프로모터가, 조직 특이성이 없는 것이었던 것에 의한 것으로 생각된다. 면역조직학적인 검토에 의하면, 신장의 메산기움영역 이외의 영역을 포함하는, 숙주동물의 전신에 있어서의 멕신의 존재가 관찰되었다. 그러나, 멕신의 과잉발현에 의한 영향은 메산기움에 국한되어 있었다. 이 사실은, 메산기움에 국재하고 있는 멕신의 표적 분자(멕신 ·리간드)의 존재를 시사하는 점에서, 매우 흥미롭다. 즉, 멕신의 활성 발현에는, 이 영역에만 존재하는 리간드의 존재가 필요한 것을 생각할 수 있다. 어떤 경우에도, 메산기움에 있어서의 멕신의 강제발현에 의해, 메산기움증식성 신장염의 전형적인 병태가 초래되는 것이 명백해졌다.
이상의 결과가 나타내는 바와 같이, 인간 멕신유전자 도입 트랜스제닉 마우스에서는, 메산기움기질의 확대와 메산기움세포의 증가가 관찰되었다. 메산기움기질의 확대는, IV형 콜라겐과 라미닌에 의한 것이었다. 또한 장애를 받은 사구체에는, 면역글로불린과 보체를 포함하는 면역복합체가 집적하고 있었다.
멕신의 강제발현에 의해, 병태를 보다 충실하게 반영한 메산기움의 손상이 초래되었다. 이들의 결과는, 멕신 트랜스제닉 마우스가, 신장기능의 유지와, 메산기움 손상의 진행을 조절 가능한 약제연구의 모델로서 이용할 수 있는 것을 증명하고 있다. 또한 본 발명의 메산기움증식성 신장염 모델 동물을 통해, 멕신을 토대로 인간 사구체질환의 병태를 이해할 수 있을 가능성이 있다.
산업상이용가능성
본 발명에 의해, 멕신유전자의 도입에 의한 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물이 제공되었다. 본 발명의 트랜스제닉 동물에 특징적인 병리상으로서는, 메산기움 및 사구체 내피세포영역의 세포증식과 세포외기질의 축적을 만성 진행성으로 나타내는 점을 들 수 있다. 이러한 병리소견은, 본 발명의 모델 동물이 보다 인간의 만성 사구체신장염에 가까운 병태를 나타내고 있는 것을 증명하고 있다. 따라서, 만성 사구체신장염의 원인해명에 도움이 될 것으로 생각된다. 이러한 병리소견은 종래의 모델 동물에서는 확인되지 않았던 것이다.
본 발명의 모델 동물을 사용하여, 메산기움세포 증식성 신장염의 발증 메카니즘이나 병태의 해석이 가능해진다. 또한, 본 발명의 모델 동물은, 메산기움세포 증식성 신장염의 치료약의 개발이나 스크리닝, 더 나아가서는 약제의 검정 등을 위해 유용하다.
본 발명의 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물은, 트랜스제닉 동물이기 때문에, 균일성이 높은 모델동물을 용이하게, 또한 다량으로 공급할 수 있는 것으로부터, 정밀도가 높은 실험을 가능하게 하는 것이다. 또한, 본 발명의 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물에 의해, 메산기움기질영역의 확대, 메산기움세포의 증가, 그리고 면역복합체의 침착을 동반하는 전형적인 메산기움세포 증식성 신장염의 소견이 인정되었다. 특히, 이러한 실제의 병태에 충실한 모델 동물이 제공된 본 발명의 의의는, 매우 크다.
Claims (9)
- 인간 ·멕신, 또는 인간 ·멕신과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 외래성 DNA를 신장 메산기움세포에 있어서 발현하는 트랜스제닉 비인간 동물인 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물.
- 제1항에 있어서, 인간 ·멕신을 코드하는 DNA가, 서열번호: 1의 염기서열의 코드영역으로 된 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물.
- 제1항에 있어서, 비인간 동물이 마우스인 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물.
- 인간 ·멕신, 또는 인간 ·멕신과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 DNA와, 이 DNA를 동물의 신장 메산기움세포에 있어서 발현시킬 수 있는 프로모터를 포함하는 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물 제작용 재조합 유전자.
- 다음의 공정을 포함하는, 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물의 제작방법.a) 동물의 수정란에 제4항의 재조합 유전자를 도입하는 공정b) 공정 a)의 수정란으로부터 발생한 초대 트랜스제닉 동물 중 도입한 외래성 유전자를 보유한 개체를 선택하는 공정
- 제5항에 있어서, 더욱이 다음의 공정 c) 및 d)를 포함하는 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물의 제작방법.c) 공정 b)에서 선택한 개체와 정상 동물을 교배시켜 외래성 유전자를 헤테로로 보유하는 F1 동물을 얻는 공정d) 공정 c)에서 얻은 F1 동물끼리를 교배시켜 외래성 유전자를 호모로 보유하는 F2 동물을 얻는 공정
- 다음의 공정을 포함하는, 메산기움세포 증식성 신장염에 대한 후보화합물의 치료효과를 평가하는 방법.a) 제1항의 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물에 후보화합물을 투여하는 공정,b) 상기 모델 동물에 있어서의 신장염 증상의 변화를 관찰하는 공정
- 다음의 공정을 포함하는, 메산기움세포 증식성 신장염 치료용 화합물을 스크리닝하는 방법.a) 제1항의 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물에 후보화합물을 투여하는 공정,b) 상기 모델 동물에 있어서의 신장염 증상의 변화를 관찰하는 공정c) 메산기움세포 증식성 신장염 모델 동물의 신장염 증상을 완화하는 화합물을 선택하는 공정
- 제8항의 스크리닝방법에 의해 얻을 수 있는 화합물을 주성분으로 포함하는, 메산기움세포 증식성 신장염의 치료 및/또는 예방용 의약조성물.
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