JP6460483B2 - 腎疾患の予防または治療剤 - Google Patents
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Description
本発明者は、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
[1]AIMもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸を含有してなる、腎疾患の予防・治療剤;
[2]AIMの発現を誘導する薬剤またはAIMを安定化させる薬剤を含有してなる、腎疾患の予防・治療剤;
[3]腎疾患が急性腎不全、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、IgA腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症またはIgM腎症である前記[1]または[2]に記載の予防・治療剤;
[4]腎疾患が急性腎不全または慢性腎不全である前記[1]〜[3]のいずれか1つに記載の予防・治療剤;
[5]予防・治療の対象がヒトである前記[1]〜[4]のいずれか1つに記載の予防・治療剤;
[6]予防・治療の対象がネコである前記[1]〜[4]のいずれか1つに記載の予防・治療剤;
[7]AIMまたはその部分ペプチドが、ネコIgMと結合することを特徴とする、前記[6]に記載の予防・治療剤;
[8]ネコIgMと結合するAIMもしくはその部分ペプチドが、マウス由来AIMのSRCR3ドメインを含む、前記[7]に記載の予防・治療剤;
[9]AIM発現不全非ヒト哺乳動物に片側尿管結紮、一側性腎摘出後の一過性腎虚血再灌流または両側性の一過性腎虚血再灌流を行うことによって得られる動物を用いる、腎疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法;
[10]以下の工程を含むことを特徴とする、前記[9]に記載のスクリーニング方法
(1)片側尿管結紮、一側性腎摘出後の一過性腎虚血再灌流または両側性の一過性腎虚血再灌流を行う条件下、AIM発現不全非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
(2)被検物質を投与されたAIM発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程:
(i)壊死した尿細管細胞の蓄積と腎実質の線維化、
(ii)糸球体構造の崩壊と線維化、
(iii)腎臓における炎症性サイトカインの発現量、
(iv)腎臓におけるマクロファージの割合、
(v)BUN値、
(vi)生存率、
(3)被検物質非投与の場合と比較して、前記特性のいずれか一項目以上が改善される被検物質を選択する工程;
[11]腎疾患が急性腎不全、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、IgA腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症またはIgM腎症である前記[9]または[10]に記載のスクリーニング方法;
[12]AIM発現不全非ヒト哺乳動物に片側尿管結紮、一側性腎摘出後の一過性腎虚血再灌流または両側性の一過性腎虚血再灌流を行うことによって得られる動物を用いる、腎疾患予防・治療剤の予防・治療効果の評価方法;
[13]以下の工程を含むことを特徴とする、前記[12]に記載の評価方法
(1)片側尿管結紮、一側性腎摘出後の一過性腎虚血再灌流または両側性の一過性腎虚血再灌流を行う条件下、AIM発現不全非ヒト哺乳動物に腎疾患予防・治療剤を投与する工程、
(2)腎疾患予防・治療剤を投与されたAIM発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程:
(i)壊死した尿細管細胞の蓄積と腎実質の線維化、
(ii)糸球体構造の崩壊と線維化、
(iii)腎臓における炎症性サイトカインの発現量、
(iv)腎臓におけるマクロファージの割合、
(v)BUN値、
(vi)生存率、
(3)前記特性のいずれか一項目以上を腎疾患予防・治療剤非投与の場合と比較して、腎疾患予防・治療剤の効果を評価する工程;
[14]腎疾患が急性腎不全、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、IgA腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症またはIgM腎症である前記[12]または[13]に記載の評価方法;
[15]被検者の試料中のAIM濃度を測定することを含む、腎疾患患者の予後の予測方法;
[16]試料が血液または血清である、前記[15]に記載の予測方法;
[17]AIM濃度の測定方法が抗AIM抗体を用いた免疫学的方法である、前記[15]または[16]に記載の予測方法;
[18]腎疾患が急性腎不全、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、IgA腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症またはIgM腎症である前記[15]〜[17]のいずれか1つに記載の予測方法;
[19]被検者の試料中のAIM濃度を測定することを含む、急性腎不全の検査方法;
[20]試料が尿である、[19]に記載の検査方法;
[21]AIM濃度の測定方法が抗AIM抗体を用いた免疫学的方法である、[19]または[20]に記載の検査方法;
[22]以下の(a)または(b)を含む、腎疾患の診断または予後の予測キット:
(a)AIM遺伝子の転写産物とハイブリダイズし得る核酸プローブまたは核酸プライマー、および/または
(b)AIMに対する抗体;
[23]腎疾患が急性腎不全、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、IgA腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症またはIgM腎症である[22]に記載のキット;
[24]AIMもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸を対象に有効量投与することを含む、腎疾患の予防・治療方法;
[25]AIMの発現を誘導する薬剤またはAIMを安定化させる薬剤を対象に有効量投与することを含む、腎疾患の予防・治療方法;
[26]腎疾患が急性腎不全、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、IgA腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症またはIgM腎症である、前記[24]または[25]に記載の予防・治療方法;
[27]腎疾患が急性腎不全または慢性腎不全である、前記[24]〜[26]のいずれか1つに記載の予防・治療方法;
[28]予防・治療の対象がヒトである、前記[24]〜[27]のいずれか1つに記載の予防・治療方法;
[29]予防・治療の対象がネコである、前記[24]〜[27]のいずれか1つに記載の予防・治療方法;
[30]AIMまたはその部分ペプチドが、ネコIgMと結合することを特徴とする、前記[29]に記載の予防・治療方法;
[31]腎疾患の予防・治療に用いるための、AIMもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸;
[32]腎疾患が急性腎不全、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、IgA腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症またはIgM腎症である、前記[31]に記載のAIMもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸;
[33]腎疾患が急性腎不全または慢性腎不全である、前記[31]または[32]に記載のAIMもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸;
[34]予防・治療の対象がヒトである、前記[31]〜[33]のいずれか1つに記載のAIMもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸;
[35]予防・治療の対象がネコである、前記[31]〜[33]のいずれか1つに記載のAIMもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸;
[36]AIMまたはその部分ペプチドが、ネコIgMと結合することを特徴とする、前記[35]に記載のAIMもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸;
[37]腎疾患の予防・治療に用いるための、AIMの発現を誘導する薬剤またはAIMを安定化させる薬剤;
[38]腎疾患が急性腎不全、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、IgA腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症またはIgM腎症である、前記[37]に記載のAIMの発現を誘導する薬剤またはAIMを安定化させる薬剤;
[39]腎疾患が急性腎不全または慢性腎不全である、前記[37]または[38]に記載のAIMの発現を誘導する薬剤またはAIMを安定化させる薬剤;
[40]予防・治療の対象がヒトである、前記[37]〜[39]のいずれか1つに記載のAIMの発現を誘導する薬剤またはAIMを安定化させる薬剤;
[41]予防・治療の対象がネコである、前記[37]〜[39]のいずれか1つに記載のAIMの発現を誘導する薬剤またはAIMを安定化させる薬剤;
[42]AIMまたはその部分ペプチドが、ネコIgMと結合することを特徴とする、前記[41]に記載のAIMの発現を誘導する薬剤またはAIMを安定化させる薬剤;
[43]腎疾患の予防・治療剤を製造するための、AIMもしくはその部分ペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸またはAIMの発現を誘導する薬剤またはAIMを安定化させる薬剤の使用;
[44]腎疾患が急性腎不全、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、IgA腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症またはIgM腎症である、前記[43]に記載の使用。
[45]腎疾患が急性腎不全または慢性腎不全である、前記[43]または[44]に記載の使用;
[46]予防・治療の対象がヒトである、前記[43]〜[45]のいずれか1つに記載の使用;
[47]予防・治療の対象がネコである、前記[43]〜[45]のいずれか1つに記載の使用;
[48]AIMまたはその部分ペプチドが、ネコIgMと結合することを特徴とする、前記[47]に記載の使用;
を提供する。
本発明におけるAIMは、配列番号:2(ヒト由来AIM蛋白質のアミノ酸配列)または配列番号:4(ネコ由来AIM蛋白質のアミノ酸配列)で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。
AIMは、例えば、温血動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど)の免疫細胞であるマクロファージから単離・精製される蛋白質であってよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質であってもよいし、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;マトリクス=BLOSUM62;フィルタリング=OFF)にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム(version 2.0)に組み込まれている(Altschulら,Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))]、Needlemanら, J .Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている]、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version 2.0)に組み込まれている]、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている]等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
より好ましくは、配列番号:2または配列番号:4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号:2または配列番号:4で表されるアミノ酸配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
前記活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチルなどのC1-6アルキル基;例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3-8シクロアルキル基;例えば、フェニル、α-ナフチルなどのC6-12アリール基;例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル-C1-2アルキル基;α-ナフチルメチルなどのα-ナフチル-C1-2アルキル基などのC7-14アラルキル基;ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のAIMがC末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のAIMには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイルなどのC1-6アシル基など)で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基(例えば-OH、-SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など)が適当な保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイル基などのC1-6アシル基など)で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
AIMは、システインを多く含む3つのSRCR(Scavenger-Receptor Cysteine-Rich)ドメイン含んでいることから、それぞれのSRCRドメインを本発明の部分ペプチドとして使用できる。具体的には、例えば、配列番号:2で表されるアミノ酸配列のうち、SRCR1ドメイン(配列番号:2で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号24〜125)、SRCR2ドメイン(配列番号:2で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号138〜239)、SRCR3ドメイン(配列番号:2で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号244〜346)をそれぞれ含む部分アミノ酸配列やSRCRドメインの任意の組合せを含む部分アミノ酸配列を有するものなどが用いられる。また、配列番号:4で表されるアミノ酸配列のうち、SRCR1ドメイン(配列番号:4で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号24〜125)、SRCR2ドメイン(配列番号:4で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号139〜239)、SRCR3ドメイン(配列番号:4で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号244〜346)をそれぞれ含む部分アミノ酸配列やSRCRドメインの任意の組合せを含む部分アミノ酸配列を有するものなども用いられる。本発明の部分ペプチドは、上記の機能ドメインを含む限りそのサイズに特に制限はないが、好ましくは50個以上の部分アミノ酸配列を含むもの、より好ましくは100個以上の部分アミノ酸配列を含むもの、さらに好ましくは200個以上の部分アミノ酸配列を含むものが挙げられる。該部分アミノ酸配列は一個の連続した部分アミノ酸配列であってもよく、あるいは不連続な複数の部分アミノ酸配列が連結されたものであってもよい。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記したAIMと同様に、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。AIMを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の(1)および(2)に記載された方法に従って行われる。
(1)M. BodanszkyおよびM. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966年)
(2)SchroederおよびLuebke, The Peptide, Academic Press, New York(1965年)
上記方法で得られるAIMが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にAIMが塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
AIMまたはその部分ペプチドをコードするDNAとしては、ゲノムDNA、温血動物(例えば、ヒト、ウシ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、トリなど)のマクロファージ由来のcDNA、合成DNAなどが挙げられる。AIMまたはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAであれば、前記動物のあらゆる細胞[例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など]もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織[例えば、脳、脳の各部位(例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管(例、大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織(例、褐色脂肪組織、白色脂肪組織)、骨格筋など]より調製したゲノムDNA画分を鋳型として用い、Polymerase Chain Reaction(以下、「PCR法」と略称する)によって直接増幅することができ、AIMまたはその部分ペプチドをコードするcDNAであれば、マクロファージより調製した全RNAもしくはmRNA画分をそれぞれ鋳型として用い、PCR法およびReverse Transcriptase-PCR(以下、「RT-PCR法」と略称する)によって直接増幅することもできる。あるいは、AIMまたはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記したゲノムDNAおよび全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはPCR法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
配列番号:1または配列番号:3で表される塩基配列と実質的に同一な塩基配列を含むDNAとしては、例えば、配列番号:1で表される塩基配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上の相同性を有する塩基配列を含有し、前記したAIMと実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするDNAなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;フィルタリング=ON;マッチスコア=1;ミスマッチスコア=-3)にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、6×SSC(sodium chloride/sodium citrate)中45℃でのハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC/0.1%SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC13);動物細胞発現プラスミド(例:pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo);レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーター、RSV(ラウス肉腫ウイルス)プロモーター、MoMuLV(モロニーマウス白血病ウイルス)LTR、HSV-TK(単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ)プロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列(シグナルコドン)を、AIMまたはその部分ペプチドをコードするDNAの5’末端側に付加(またはネイティブなシグナルコドンと置換)してもよい。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合、PhoA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが;宿主が動物細胞である場合、インスリン・シグナル配列、α-インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12・DH1〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60巻, 160(1968)〕,エシェリヒア・コリJM103〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research),9巻,309(1981)〕,エシェリヒア・コリJA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology),120巻,517(1978)〕,エシェリヒア・コリHB101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー, 41巻, 459(1969)〕,エシェリヒア・コリC600〔ジェネティックス(Genetics), 39巻, 440(1954)〕などが用いられる。
エシェリヒア属菌は、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69巻, 2110(1972)やジーン(Gene), 17巻, 107(1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊8 新細胞工学実験プロトコール,263-267 (1995)(秀潤社発行)、ヴィロロジー(Virology),52巻,456(1973)に記載の方法に従って形質転換することができる。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔ミラー(Miller),ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experiments in Molecular Genetics),431−433,Cold Spring Harbor Laboratory,New York 1972〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β-インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約15〜約43℃で、約3〜約24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約5〜約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地(MEM)〔サイエンス(Science),122巻,501(1952)〕,ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)〔ヴィロロジー(Virology),8巻,396(1959)〕,RPMI1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション(The Journal of the American Medical Association),199巻,519(1967)〕,199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of the Society for the Biological Medicine),73巻,1(1950)〕などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6〜約8である。培養は、通常約30℃〜約40℃で、約15〜約60時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外にAIMを製造せしめることができる。
例えば、AIMまたはその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞の細胞質から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンX-100TMなどの界面活性剤を含んでいてもよい。また、AIMまたはその部分ペプチドが菌体(細胞)外に分泌される場合には、培養物から遠心分離またはろ過等により培養上清を分取するなどの方法が用いられる。
このようにして得られた可溶性画分、培養上清中に含まれるAIMまたはその部分ペプチドの単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法;透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法;イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法;アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法;逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法;等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法;などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
本発明におけるネコIgMと結合するAIMは、配列番号:4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含み、かつネコIgMと結合することができる蛋白質である。
そのような蛋白質は例えば、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質であってもよいし、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
具体的には、例えば、配列番号:4で表されるアミノ酸配列のうち、SRCR1ドメイン(配列番号:4で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号24〜125)、SRCR2ドメイン(配列番号:4で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号139〜239)、SRCR3ドメイン(配列番号:4で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号244〜346)をそれぞれ含む部分アミノ酸配列やSRCRドメインの任意の組合せを含む部分アミノ酸配列を有するものなども用いられる。上記の部分ペプチドは、上記の機能ドメインを含む限りそのサイズに特に制限はない。
配列番号:3で表される塩基配列と実質的に同一な塩基配列を含むDNAとしては、例えば、配列番号:3で表される塩基配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上の相同性を有する塩基配列を含有し、前記したAIMと実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするDNAなどが用いられる。「相同性」については、上記と同様であってよい。該DNAは、上記した方法と同様に調製される。
また、哺乳動物以外にもニワトリなどの鳥類を本発明で対象とする「非ヒト哺乳動物」と同様の目的に用いることができる。
ES細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊(ICM)に由来し、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞をいう。ICMの細胞は将来、胚本体を形成する細胞であり、生殖細胞を含むすべての組織の基になる幹細胞である。ES細胞としては、既に樹立された細胞株を用いてもよく、また、EvansとKaufmanの方法(ネイチャー(Nature)第292巻、154頁、1981年)に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスES細胞の場合、現在、一般的には129系マウス由来のES細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなES細胞を取得するなどの目的で、例えば、C57BL/6マウスやC57BL/6の採卵数の少なさをDBA/2との交雑により改善したBDF1マウス(C57BL/6とDBA/2とのF1)から樹立されるES細胞なども良好に用いることができる。BDF1マウスは、採卵数が多く、かつ卵が丈夫であるという利点に加えて、C57BL/6マウスを背景に持つので、これ由来のES細胞は疾患モデルマウスを作製したとき、C57BL/6マウスと戻し交雑することでその遺伝的背景をC57BL/6マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。ES細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman,ネイチャー(Nature)第292巻、154頁、1981年;G. R. Martin, プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)第78巻、7634頁、1981年;T. C. Doetschmanら,ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のターゲッティングベクターを導入されたES細胞を分化させて得られるAIM発現不全非ヒト哺乳動物細胞は、インビトロにおけるAIMの細胞生物学的検討において有用である。
AIMをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスDNAとしては、AIMをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスDNAであってもよい。
特に、AIMをコードするポリヌクレオチドの相補鎖の全塩基配列のうち、(a)翻訳阻害を指向したアンチセンスDNAの場合は、AIMのN末端部位をコードする部分の塩基配列(例えば、開始コドン付近の塩基配列など)の相補鎖と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアンチセンスDNAが、(b)RNaseHによるRNA分解を指向するアンチセンスDNAの場合は、イントロンを含むAIMをコードするポリヌクレオチドの全塩基配列の相補鎖と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアンチセンスDNAがそれぞれ好適である。
さらに、本発明のアンチセンスDNAは、AIMのmRNAもしくは初期転写産物とハイブリダイズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるAIMと結合して三重鎖(トリプレックス)を形成し、RNAの転写を阻害し得るものであってもよい。あるいはDNA:RNAハイブリッドを形成してRNaseHによる分解を誘導するものであってもよい。
通常、F0動物は相同染色体の一方にのみ導入DNAを有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のF0個体は相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に発現ベクターを有するホモ接合体を得るためには、F0動物と非トランスジェニック動物とを交雑してF1動物を作製し、相同染色体の一方にのみ導入DNAを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。1遺伝子座にのみ導入DNAが組み込まれていれば、得られるF2動物の1/4がホモ接合体となる。
(1)対照腎臓と比較して、尿管結紮または一過性腎虚血再灌流を行った腎臓において壊死した尿細管細胞が蓄積し、腎実質が線維化する、
(2)対照腎臓と比較して、尿管結紮または一過性腎虚血再灌流を行った腎臓において糸球体構造が崩壊し、糸球体が線維化する、
(3) 対照腎臓と比較して、尿管結紮または一過性腎虚血再灌流を行った腎臓において炎症性サイトカインの発現が亢進する、
(4) 対照腎臓と比較して、尿管結紮または一過性腎虚血再灌流を行った腎臓においてマクロファージの浸潤が亢進する、
(5)対照非ヒト哺乳動物と比較して、AIM発現不全非ヒト哺乳動物の血中BUN値が高い、
(6)対照非ヒト哺乳動物と比較して、AIM発現不全非ヒト哺乳動物の生存率が低い、
(7)AIM投与によって、前記(1)〜(6)が改善する、
を有する。これらの表現型は、従来公知のAIM KOマウスにおいては、少なくとも報告されていない。特に、尿管結石、上行性尿路感染症、あるいは腫瘍等による尿管の圧迫・閉塞を引金とした急性腎障害(急性腎不全)に伴う慢性的な腎障害、および、腫瘤、血栓、あるいは糖尿病、高血圧等による腎血管狭窄・閉塞による虚血性腎障害に伴う慢性的な腎障害の病態と近似したものであることは新たな発見である。
(2)対照腎臓と比較して、尿管結紮または一過性腎虚血再灌流を行った腎臓において糸球体構造が崩壊し、糸球体が線維化するとは、本発明のAIM発現不全非ヒト哺乳動物に片側尿管結紮、一側性腎摘出後の一過性腎虚血再灌流または両側性の一過性腎虚血再灌流を行うことによって、対照腎臓と比較して、尿管結紮または一過性腎虚血再灌流を行った腎臓において糸球体構造の崩壊と糸球体の線維化が認められることをいう。糸球体構造の崩壊は、例えば、腎組織片をヘマトキシリン・エオジン染色によって確認することができ、糸球体の線維化はAzan染色およびヘマトキシリン染色の同時染色によって確認することができる。後述する実施例においては、AIMノックアウトマウスでは、尿管結紮後14日目から正常腎臓と比べて有意な差が認められた。また、AIMノックアウトマウスでは、一過性腎虚血再灌流後7日目から正常腎臓と比べて有意な差が認められた。
(3) 対照腎臓と比較して、尿管結紮または一過性腎虚血再灌流を行った腎臓において炎症性サイトカインの発現が亢進するとは、本発明のAIM発現不全非ヒト哺乳動物に片側尿管結紮、一側性腎摘出後の一過性腎虚血再灌流または両側性の一過性腎虚血再灌流を行うことによって、対照腎臓と比較して、尿管結紮または一過性腎虚血再灌流を行った腎臓においてMCP-1、IL-1βおよびIL-6の発現が亢進することをいう。発現の亢進は、例えば、定量的RT-PCRやノーザンブロット法などによって確認することができる。後述する実施例においては、AIMノックアウトマウスでは、MCP-1およびIL-6は正常腎臓と比べて有意な差が認められ、IL-1βについても、発現が高い傾向が認められた。
(4) 対照腎臓と比較して、尿管結紮または一過性腎虚血再灌流を行った腎臓においてマクロファージの浸潤が亢進するとは、本発明のAIM発現不全非ヒト哺乳動物に片側尿管結紮、一側性腎摘出後の一過性腎虚血再灌流または両側性の一過性腎虚血再灌流を行うことによって、対照腎臓と比較して、尿管結紮または一過性腎虚血再灌流を行った腎臓においてマクロファージ(Mac-1陽性細胞)の数が多いことをいう。細胞数のカウントは、例えば、フローサイトメーターなどによってMac-1陽性細胞を識別することによって確認することができる。後述する実施例においては、AIMノックアウトマウスでは、正常腎臓と比べてマクロファージの割合が高いことが確認された。
(5)対照非ヒト哺乳動物と比較して、AIM発現不全非ヒト哺乳動の血中BUN値が高値であるとは、本発明のAIM発現不全非ヒト哺乳動物に片側尿管結紮、一側性腎摘出後の一過性腎虚血再灌流または両側性の一過性腎虚血再灌流を行うことによって、対照非ヒト哺乳動物と比較して、AIM発現不全非ヒト哺乳動の血中BUN値が高いことをいう。
(6)対照非ヒト哺乳動物と比較して、AIM発現不全非ヒト哺乳動物の生存率が低いとは、本発明のAIM発現不全非ヒト哺乳動物に片側尿管結紮、一側性腎摘出後の一過性腎虚血再灌流または両側性の一過性腎虚血再灌流を行うことによって、対照非ヒト哺乳動物と比較して、生存率が低くなることをいう。
(7)AIM投与によって、前記(1)〜(6)が改善するとは、本発明のAIM発現不全非ヒト哺乳動物に片側尿管結紮、一側性腎摘出後の一過性腎虚血再灌流または両側性の一過性腎虚血再灌流を行った後、AIM投与によってBUN値に有意な低下が認められることと、壊死した尿細管細胞の蓄積と糸球体構造の崩壊、またそれらに伴う腎実質および糸球体の線維化が、明瞭に改善すること、炎症性サイトカインの発現が低下すること、生存率が改善すること、マクロファージの浸潤を抑制することをいう。
(1)片側尿管結紮、一側性腎摘出後の一過性腎虚血再灌流または両側性の一過性腎虚血再灌流を行う条件下、AIM発現不全非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
(2)被検物質を投与されたAIM発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程:
(i)壊死した尿細管細胞の蓄積と腎実質の線維化、
(ii)糸球体構造の崩壊と線維化、
(iii)腎臓における炎症性サイトカインの発現量、
(iv)腎臓におけるマクロファージの割合、
(v)BUN値、
(vi)生存率、
(3)被検物質非投与の場合と比較して、前記特性のいずれか一項目以上が改善される被検物質を選択する工程。
(1)片側尿管結紮、一側性腎摘出後の一過性腎虚血再灌流または両側性の一過性腎虚血再灌流を行う条件下、AIM発現不全非ヒト哺乳動物に腎疾患予防・治療剤を投与する工程、
(2)腎疾患予防・治療剤を投与されたAIM発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程:
(i)壊死した尿細管細胞の蓄積と腎実質の線維化、
(ii)糸球体構造の崩壊と線維化、
(iii)腎臓における炎症性サイトカインの発現量、
(iv)腎臓におけるマクロファージの割合、
(v)BUN値、
(vi)生存率、
(3)前記特性のいずれか一項目以上を腎疾患予防・治療剤非投与の場合と比較して、腎疾患予防・治療剤の効果を評価する工程。
PCRにおいてプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、AIM遺伝子転写産物のセンス鎖(コード鎖)およびアンチセンス鎖(非コード鎖)とそれぞれ特異的にハイブリダイズすることができ、それらに挟まれるDNA断片を増幅し得るものであれば特に制限はなく、例えば、各々約15〜約100塩基、好ましくは各々約15〜約50塩基の長さを有し、約100bp〜1kbpのDNA断片を増幅するようにデザインされたオリゴDNAのセットが挙げられる。より具体的には、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、配列番号:1に示される塩基配列を含む核酸(センス鎖)とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、及び前記の塩基配列に相補的な塩基配列を含む核酸(アンチセンス鎖)とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸が挙げられる。ここでハイストリンジェントな条件とは前記と同義である。より好ましくは、配列番号:1に示される塩基配列と相補的な塩基配列を含む核酸、及び該核酸の塩基配列に相補的な塩基配列を含む核酸が挙げられる。
尚、AIMに対する抗体は、配列番号:2または配列番号:4に示されるアミノ酸配列と、同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列もしくは部分アミノ酸配列を含む蛋白質を感作抗原として、通常使用されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体作製技術に従って取得することができる。
(1)健常者および被験者の試料中のAIM濃度を測定する工程、
(2)健常者で測定されたAIM濃度と被験者で測定されたAIM濃度を比較する工程。
(1)健常者および被験者の試料中のAIM濃度を測定する工程、
(2)健常者で測定されたAIM濃度と被験者で測定されたAIM濃度を比較する工程。
(a)AIM遺伝子の転写産物とハイブリダイズし得る核酸プローブまたは核酸プライマー、および/または
(b)AIMに対する抗体
を含有してなる。該キットが2以上の上記核酸および/または抗体を含む場合、各核酸または抗体は互いにAIM遺伝子の塩基配列上の異なる部分を特異的に認識、またはAIM遺伝子の翻訳産物の異なるエピトープを特異的に認識し得るものである。
あるいは、該核酸は、適当な固相に固定化された状態で提供することもできる。固相としては、例えば、ガラス、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等が挙げられるが、これらに限定されない。また、固定化手段としては、予め核酸にアミノ基、アルデヒド基、SH基、ビオチンなどの官能基を導入しておき、一方、固相上にも該核酸と反応し得る官能基(例:アルデヒド基、アミノ基、SH基、ストレプトアビジンなど)を導入し、両官能基間の共有結合で固相と核酸を架橋したり、ポリアニオン性の核酸に対して、固相をポリカチオンコーティングして静電結合を利用して核酸を固定化するなどの方法が挙げられるが、これらに限定されない。
〔配列番号:1〕
ヒトAIMの塩基配列を示す。
〔配列番号:2〕
ヒトAIMのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:3〕
ネコAIMの塩基配列を示す。
〔配列番号:4〕
ネコAIMのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:5〕
ネコAIMの転写産物の相補的配列を示す。
〔配列番号:6〕
マウスAIMのアミノ酸配列を示す。
動物を用いた、多用される腎疾患モデルの一つに片側尿管結紮術(UUO)モデルがある。これは、片側の尿管を結紮することにより、結紮を施した腎実質の尿細管および糸球体が、徐々に壊死し、それに引き続き炎症や線維化が生じ、最終的にはその腎臓は機能不全となる。AIM欠損マウス(AIM-KO)と野生型マウス(WT)にそれぞれUUOを施術し、経過を観察した(n=6 for each)(図1A)。正常腎の構造はWT、AIM-KOとも全く差異はなかった。しかし、14日目のUUO腎において、線維を染色するAzan染色と、ヘマトキシリン染色を同時に行うと、WTでは線維化の広がりが見られるが、相当数の糸球体および尿細管は未だ正常構造を保ち、壊死に陥っていない尿細管も多くみられた。それに対してAIM-KOでは、壊死した尿細管細胞が広範囲に蓄積し、糸球体構造も破壊されており、腎実質の構造がもはや崩壊していた。観察した全てのマウスで同様の結果が得られた。
また同様に、AIM-KOとWTマウスにそれぞれUUOを施術し、14日目でHE、PAS、Azan染色によって腎臓を観察した(n=6 for each)(図1B)。WTでは線維化の広がりが見られるが、相当数の糸球体および尿細管は未だ正常構造を保っていた(HE、Azan染色)。一方AIM-KOでは、線維化が進行し、糸球体構造は破壊されており、腎実質の構造がもはや崩壊していた。PAS染色では、AIM-KOマウスで尿細管内外に壊死した細胞塊(PAS陽性)が広範囲に蓄積していた。観察した全てのマウスで同様の結果が得られた。
別の腎疾患モデルに一過性腎虚血再灌流(IR)モデルがある。一過性腎虚血再灌流では、あらかじめ一方の腎臓を摘出しておき、残った腎臓側の腎動脈を結紮し虚血にする。30分後結紮を解除し血流の再灌流を行うが、この一過性の虚血のために尿細管の壊死が軽度の線維化を伴い3日間程度進行し、それに伴い腎機能が悪化する。AIM欠損マウス(AIM-KO)と野生型マウス(WT)にそれぞれIRを施術し、経過を観察した(図2)。WTでは、腎機能の悪化後、壊死した細胞が除去され、壊死しなかった尿細管が急速に分裂し、14日後には、ほぼ正常の尿細管構造を回復した。それと並行して、腎機能も正常化した。ところが、AIM-KOでは、初期の尿細管のダメージの程度はWTと差異は見られないが、壊死した細胞の除去が進まず、壊死細胞が蓄積した。壊死細胞の除去が進行しないため、新しい尿細管細胞の分裂は抑制され、二次的な炎症や線維化が進行した。N=6で実験を行ったが、全てのマウスで同様の結果が得られた。すなわち、実施例1と実施例2の結果から、AIMがないと壊死した尿細管細胞が蓄積し、腎臓の構造・機能修復が著しく損なわれることが明らかとなった。
実施例2で行った一過性腎虚血再灌流(IR)を野生型マウス(WT)およびAIM欠損マウス(AIM-KO)に施し、術後の炎症性マクロファージの浸潤をマクロファージマーカーであるF4/80の免疫染色によって観察した(図3A)。術後3日目ではWTに比べAIM KOマウスでは、F4/80陽性のマクロファージの浸潤が明らかに亢進した。また、術後14日目でWTでは、マクロファージの浸潤は軽減したが、AIM KOマウスでは更に増悪した。このマクロファージ浸潤の経過に伴い、炎症性サイトカインの一つであるMCP-1の発現も同様にAIM KOマウス腎臓で有意に増加していることが、quantitative RT-PCRの実験により明らかになった(図3B)。N=6で実験を行ったが、全てのマウスで同様の結果が得られた。
AIM-KOマウスに実施例2で行ったIRを施し、腎機能が一過性に最も悪化する3日目、および4日目、7日目にそれぞれ組換えAIM(rAIM)またはPBSを100μg腹腔内投与し(n=6 for each)、経過を観察した(図4)。PBSを投与した群では、実施例2の結果と同様に、その後壊死細胞の蓄積や糸球体の破壊など進行し、腎機能(BUN値)も、3日目よりはある程度改善するものの正常値に復旧することはなく、後半徐々に悪化の傾向を見せた。しかし、rAIMを投与した群では、3日目のrAIM投与後にBUN値は有意に改善し、7日目には既に正常範囲に戻り、その後もさらに低下した。組織学的にも、7日目には壊死した尿細管細胞は除去されており、腎実質の構造も正常化した。すなわち、AIM投与は壊死細胞の除去を亢進させ、尿細管の再生を促し、腎機能を回復できることが明らかとなった。
AIM-KOマウスに実施例2で行ったIRを施し、術後rAIM (100μg)を静脈投与し、3、6、12時間後に腎臓の切片を抗AIM抗体で染色した。AIM投与後3時間で、尿細管の壊死部分にAIMが強く付着していることが確認された(図5上段:phase-contrastによる写真中、壊死巣をNで指している。図5下段:AIMシグナル(矢頭)は壊死巣と重なって観察された)。また、時間経過と共に、壊死巣部分は縮小し、12時間後にはほぼ痕跡程度しか確認されなかった。すなわち、AIMによるIR後の腎機能回復(実施例4)は、壊死巣にAIMが付着することによって、その除去を促し、それに伴い炎症の抑制ひいては組織再生が進行していたと考えられる。
一方の腎臓を摘出せず、両方の腎臓の腎動脈を結紮し虚血にする、両側性の一過性腎虚血再灌流(IR)を施した野生型マウス(WT)の尿をIR後1日目、7日目にELISA法によって検出した(図6)。通常状態のマウスの尿にはAIMはほとんど検出されなかった(IR前)が、腎障害が最も激しいIR後一日目では尿中に多量のAIMが検出された。腎障害の回復と共に尿中AIMは減少した(IR後7日目)。なお、IRによる腎障害時は排出される尿は希釈尿となるため、尿中AIM値は尿中クレアチニン値でnormalizationした。
WTおよびAIM-KOマウスに両側性のIRを施し、生存率をみた(n=8 each)(図7)。IR後7日目で、WTは80%以上生存している条件でAIM-KOは30%以下の生存率であり、死亡したマウスのほとんどはIR後3日目までに死亡していた。
WTおよびAIM-KOマウスに両側性のIRを施し、経時的にクリニカルスコアを解析した(図8)。クリニカルスコアは、動きの機敏さの欠如、目の混濁、尾における痛み刺激に対する反応性の低下、毛並の悪さ、についてそれぞれ加点(0:異常なし、1:軽度の症状有、2:中等度の症状有、3:重度の症状有)し、その合計をグラフ化した。WTではIR後一日目にスコアが最大値を示し徐々に軽減したが、AIM-KO ではスコアは高値のままであった。
WTおよびAIM-KOマウスに両側性のIRを施し、腎機能のマーカーであるBUNを継時的に計測した(n=8)(図9)。実施例8のクリニカルスコアと同様に、BUNはWTでは一日目がピークでその後低下するが、AIM-KOでは2日目まで上昇しその後も著明な低下は認められなかった。
WTおよびAIM-KOマウスに両側性のIRを施し、腎組織を継時的にPAS染色で解析した(図10)。実施例8のクリニカルスコアや実施例9のBUN値と同様に、腎機能障害は、WTでは一日目がピークでその後回復し、7日目には正常な尿細管構造とbrush border(冊子縁;矢頭)を持った近位尿細管上皮が再生した。しかしAIM-KOでは、障害は継続し、近位尿細管中にPAS陽性の死細胞塊が蓄積しており7日目に至っても除去されなかった。
図10で認められる近位尿細管中の上皮細胞の死細胞塊の面積を、1切片辺りの全面積に対する割合として算出することによって定量化した(n=3〜5)(図11)。実施例8〜10から得られる知見と同様の推移を示しており、AIM-KOでは死細胞塊の蓄積・残留が明らかであった。
WTおよびAIM-KOマウスに両側性のIRを施し、IR前およびIR後7日目の腎臓からRNAを抽出し、炎症性サイトカインであるIL-1βおよびIL-6について定量的RT-PCRで解析を行った(n=3 each)(図12)。両方のマーカーについてAIM-KOではWTに比べて高値であり、IRによる腎組織破壊に伴う炎症の遷延が示唆された。
WTおよびAIM-KOマウスに両側性のIRを施し、IR後7日目の腎臓をコラゲナーゼ処理したのちフローサイトメーターで解析することによって、マクロファージ(Mac-1陽性細胞)の割合を調べた(図13)。実施例12の結果と同様に、AIM-KOでは腎臓内のマクロファージの割合がWTに比べ高かった。それぞれ3匹のマウスについて解析を行い、同様の結果を得た。図13は、representative resultを提示している。
両側性のIRを施したWTマウスの腎臓連続切片について、PAS染色(左)と抗AIM抗体による免疫染色(右)を行った(図14)。多くの死細胞塊にAIM(白)が集積していることが認められた。
腎梗塞による急性腎不全で死亡したヒト患者の腎臓連続切片について、PAS染色(左)と抗AIM抗体による免疫染色(右)を行った(図15)。実施例14のIRマウス同様、多くの死細胞塊にAIM(白)が集積していることが認められる。
急性腎不全(AKI)で病院に搬送された患者および健常人を3名ずつ、また両側性のIRを施したWTマウス5匹について、IR前、IR1日後、および7日後の尿について、AIM濃度をELISAによって解析した(図16)。健常人の尿にはAIMはほとんど認められないが、AKI患者の尿には認められた。マウスにおいても、IR前には認められないが、腎障害が著しいIR1日後では有意な量のAIMが尿中に認められ、腎障害が改善した7日目ではAIMの量が減少していた。
AIM-KOマウスに両側性のIRを施し、IR後3日目に200μgのrAIMを投与して経時的に取得した腎臓切片について、PAS染色および抗AIM抗体による免疫染色を行った(図17)。AIMが集積した死細胞塊は速やかに縮小した。
AIM-KOマウスに両側性のIRを施し、IR後3日目の腎臓をコラゲナーゼ処理し、F4/80陽性のマクロファージをFACSソーターを用いて単離した後、その貪食能を解析した(図18)。貪食の標的として、ヒト尿細管細胞株であるHK2細胞を熱処理で壊死させFITCでラベルした後、リコンビナントAIM(rAIM)またはbovine serum albumin (BSA)でコートしたHK2死細胞を用いた。Noneとしては、rAIMでもBSAでもコートしていないHK2死細胞を用いた。マクロファージと上記3種類のHK2死細胞をincubateし、マクロファージ内に取り込まれたFITC陽性のHK2死細胞をフローサイトメーター(FACS)で経時的に解析した。BSAでコートしたHK2死細胞、あるいはコートしていないHK2死細胞に対してrAIMでコートしたHK2死細胞はより高効率にマクロファージに貪食されることが示された。
実施例18と同様の実験を、貪食細胞としてAIM-KO由来の骨髄細胞をM-CSFによって分化させたマクロファージを用いて行った(図19)。実施例18では、BSAでコートしたHK2死細胞とコートしていないHK2死細胞では貪食のされ方に差がなかったので、本実施例ではコートしていないHK2死細胞は使用しなかった。実施例18の結果と同様に、rAIMでコートしたHK2死細胞の貪食が上昇した。
AIM-KOマウスに両側性のIRを施した後、1日目から3日目までrAIM 200μg/マウスまたは等容量のPBSを静脈注射した(n=5−6)。PBSを打ったマウスの生存率は7日目で40%以下であったが、rAIMを投与したマウスでは100%に回復した(図20)。
実施例20のマウスについて、実施例8と同様にクリニカルスコアを検討した(図21)。rAIM投与後からクリニカルスコアの著しい回復を認めた。
実施例20のマウスについて、実施例9と同様に経時的にBUNを測定した(図22)。rAIM投与によりBUN値の有意な低下を認めた。
AIM-KOマウスに両側性のIRを施した後、1日目から3日目までrAIM 200 μg/マウスまたは等容量のPBSを静脈注射し、3日目と7日目の腎臓の状態をPAS染色で解析した(図23)。PBS投与では近位尿細管内死細胞が蓄積しているが、rAIMを投与したマウスでは著しい除去が認められ、7日目にはbrush border (冊子縁)を持つ尿細管細胞が回復した。
IR後7日目の腎臓で、図23で認められるような近位尿細管中の死細胞塊の面積を、1切片辺りの全面積に対する割合として算出することによって定量化した(n=3 each)(図24)。rAIM投与群では死細胞塊の著しい減少が認められた。
実施例20のマウスについて、IR後7日目の腎臓からRNAを抽出し、炎症性サイトカインであるIL-1βおよびIL-6について定量的RT-PCRで解析を行った(図25)。rAIM投与群ではIL-1β、IL-6ともPBS投与群に比較して低下しており、急性腎不全に伴う炎症反応もrAIM投与によって抑制されたことが示唆された。
実施例6〜25で実施した両側性のIRでは、虚血を30分間実施し、AIM-KOに対し致死率の高い程度の急性腎不全を誘導した。本実施例では、虚血時間を短くし(30分→25分)、AIM-KOでも7日目での生存率が100%ある程度の腎不全をAIM-KOマウスに誘導し、実施例20と同様に1日目から3日目までrAIMまたはPBSを頸静脈に注射投与した。このようなマイルドな条件のIRにおいても、rAIM投与によってBUNの改善をより加速させることが出来た(n=5 each)(図26)。
もともと内因性のAIMを持っているWTマウスに対し両側性のIR(虚血30分間)を施し、実施例20と同様に、rAIMまたはPBSを投与した(n=5〜6)。WTではもともと内因性のAIMによって腎障害は回復するが、rAIMによってその改善をさらに加速できた(図27)。rAIM投与によって、2日目まで上昇していたBUN値が既に低下していることが分かった。
実施例26と同様のマイルドなIRをWTおよびAIM-KO マウスに施し、IR後28日目の腎臓の状態をPAS染色(死細胞塊をみるため)とAzan染色(線維化をみるため)によって解析した(図28)。28日目でもAIM-KOではPAS陽性の死細胞塊がWTに比べて多少残っていた。またAIM-KOでは著明な線維化(Azan陽性)が認められ、尿細管の構造もWTに比べていびつであった。
実施例28のマウスについて、IR後28日後の腎臓からRNAを抽出し、定量的RT-PCRで4種類の線維化マーカーについて解析した(n=4 each)(図29)。AIM-KOではWTに比べ、線維化マーカーが全て上昇した。
年齢がほぼ等しい、(1)健常者(男142、女:54)、(2)腎障害のない(Cre<1.0 mg/dl)糖尿病患者(男:70、女:57)、(3)糖尿病性の慢性腎不全患者(男:146、女:54)、について男女分けて血中AIM濃度を計測した(図30)。男女とも、(1)と(2)ではAIM値に有意差はなかったが、(3)では有意に低かった。
慢性腎臓疾患(CKD)患者の血中AIM値を解析し、個々の腎機能のマーカーであるeGFR(糸球体濾過量)および血中クレアチニン値との相関を調べた(n=55)。CKDの原因疾患としては、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、高血圧性腎症、IgA腎症などが挙げられる。また男女混合で患者年齢は60歳以下である。図31Aのように、血中AIM値と腎機能は有意な相関関係を示した。さらに、この解析の時点で比較的AIM値が高い人は、2−3年後の追跡調査で腎機能が改善しており、逆にAIMが低値だった患者は腎機能が悪化していた(図31B)。すなわち、AIMはCKD患者において、現在の腎機能のみならず予後を予測する有用なマーカーとなり得る。
イヌ(3匹)、ネコ(3匹)およびマウスのそれぞれの血清を抗AIM抗体(Rab2:マウスrAIMをウサギに免疫して作製したポリクローナル抗体。これまでマウスおよびヒトAIMを検出することが分かっている)を用い、還元条件で免疫ブロットを行った(図32A)。その結果、イヌ血清にはシグナルが確認できたが、ネコでは3匹ともほとんどシグナルが検出できなかった。これは抗体の問題ではなく、ネコAIM cDNAをクローニングし(実施例36参照)、pCAGGS発現ベクターにC末端にHAタグを付けた形で組み込み、HEK293T細胞に発現させた培養上清から抗HA抗体カラムを用いて精製したネコrAIM蛋白質は、マウスrAIMと同程度に本抗体を用いた還元条件での免疫ブロットで検出することが出来た(図32B)。これらの結果から、本実施例で検討を行ったネコは機能的なAIM mRNAを発現しているが、血中にAIM蛋白質としてほとんど存在していないことが分かった。
図35に示すネコAIM cDNAを発現ベクターに挿入したプラスミドを、HEK293T細胞にトランスフェクションし、その培養上清から精製した組換えネコAIM(1 mg)をネコ(雑種、オス2歳3か月齢)に静注し1時間後に採血し、血清分離した。血清を、ゲルによるサイズ分画を行い、各分画についてAIMとIgMについてウエスタンブロット法により解析した。図33Aに示すように、AIMの存在する分画とIgMの存在する分画は明らかに異なっている。この結果は、マウスAIMをAIM KOマウスに静注した血清を同様に分画解析した結果(図33B、比較例)(IgMとAIMの分画が完全に一致している)とは異なっている。すなわち、本来AIMは、血液中でIgMと結合し、その安定性が保たれる(先行文献:Arai et al., Cell Reports 3: 1187-1198, 2013)結果、AIMの血中濃度が維持される。しかし、ネコではAIMがIgMと結合できないため、血中におけるAIMの安定性が保てず、その結果、AIMの血中濃度が維持できないと考えられる。
マウスAIMを用いて、実施例33と同様な試験を実施した。組換えマウスAIM(1 mg)をネコ(雑種、オス2歳3か月齢)に静注し1時間後に採血し、血清分離した。血清を、ゲルによるサイズ分画を行い、各分画についてAIMとIgMについてウエスタンブロット法により解析した。図34に示すように、マウスAIMの存在する分画とネコIgMの存在する分画は完全に一致した。したがって、ネコAIMと異なり、マウスAIMはIgMと結合し、血中で安定すると考えられる。
C末端を欠損した組換え改変マウスAIMを複数作製した。これらの改変マウスAIMとIgMの結合をin vitroで確認した。その結果、SRCR3ドメインの一部を欠損した改変マウスAIMは、IgMとの結合が著しく低下した。よって、マウスAIMのSRCR3ドメインがIgMとの結合に重要であることがわかった。
NCBI Resourcesに公開されているネコCD5L(=AIM)の予想配列(GenBank Accession No.:XM_003999688.1)をもとにプライマーを複数設計し、ネコ脾臓のcDNAプールからネコAIM cDNAの全長(配列番号:5)を単離した(図35)。配列上、特にリーダーペプチドをコードする配列が、公開されている配列と大きく異なっていた。
ネコ、ヒト、マウス、イヌ、それぞれのAIM蛋白質のリーダーペプチド配列の疎水性を示す(図36〜39)。いずれも十分な疎水性を持ち、分泌蛋白質としての条件を満たした。なお、ネコは我々が単離したcDNAから、イヌAIMに関しては、NCBI Resourcesに公開されている予想配列(GenBank Accession No.:XM_846487.2)からリーダーペプチドについて解析した。
リーダーペプチド(LS)、各SRCR、およびヒンジ部分について3者でアミノ酸配列の比較を示す(図40)。図中、3者で共通しているアミノ酸を“*”で、ヒトとネコのみで共通しているものは“.”で、ヒトとマウスでのみ共通しているものは“:”で示した。
実施例32においては、抗マウスAIM抗体を使用してネコAIMの検出を試みたが、本実施例においては、ネコAIMのcDNAにHAタグを連結したDNAを発現ベクターに組み込み、HEK293T細胞に遺伝子導入することによってC末端にHAペプチドを負荷したリコンビナント・ネコAIMタンパク質(rcAIM-HA)を産生した。それをマウスに免疫して、抗ネコAIMモノクローナル抗体を樹立した。その抗体を用いて、様々な系統のネコ(48個体)について血中AIM濃度を還元型のウエスタンブロッティング法により解析した(図41)。濃度のコントロールとしてrcAIM-HAを用いた。その結果、系統に関わらず、AIMが検出される個体と、AIMが検出されない個体がいることが分かった。AIMが検出される個体のうち、代表的な4個体の血中AIM濃度の平均値は16.8μg/mlであり、これはマウスやヒトの約5μg/mlよりも著しく高値であった。
血中AIM濃度が高いネコでIRによる急性腎不全誘導法を確立した。全身麻酔下で腹腔鏡下で両側腎動脈をクランプで1時間結紮したのち開放した。その後血液及び尿を経時的に採取し、腎機能を検討した。図42に血中BUN値とCre値の推移を示す。IR後12時間でBUN値、Cre値は共にピークとなったが、その後7日目まで改善しなかった。すなわちAIM-KOマウスと同じように急性腎不全からの回復が障害されている可能性が高いことが示唆された。
マウスではIR後尿中にAIMが検出され、それが尿細管中に詰まった死細胞塊に集積すると考えられる。IR後のネコの血清および尿を抗ネコAIM抗体を用いて還元型ウエスタンブロッティング法によって解析した結果、ネコではIR後尿中にAIMは検出されなかった(図43)。また血中AIMの量にも明らかな変化は起こらなかった。
ネコに両側性のIRを施し3日目の腎臓について、尿細管内壊死細胞塊にAIMが集積しているかについて免疫染色によって解析した(図44)。近位尿細管内に壊死細胞塊は検出された(白矢印部)が、同箇所にAIMの集積は認められなかった。実施例41において、IR後尿中にAIMは検出されなかったことを示したが、その結果、尿細管中の死細胞塊にAIMが達しなかったことが示唆された。
実施例40の記載の方法と同様に、ネコ(メス5歳)に両側性のIRを施し、24時間後に麻酔下で動脈カテーテルを鼠蹊部動脈より挿入し、腎動脈までカテーテル先端を進め、rAIM 50mgをPBS50mlに溶解した溶液を片側腎動脈にそれぞれ25ml(rAIM:25mg)ずつ注入した。別のネコ(同じくメス5歳)に同様にIRおよびカテーテル挿入を行い、PBSのみを片側腎動脈にそれぞれ25mlずつ注入した。IR前とrAIMまたはPBS注入後24時間(IR後48時間)での体表面積で標準化したGFR(Glomerular Filtration Rate;糸球体濾過量)を示す(図45)。PBSのみ注入したネコでは、GFRが低下し腎機能が低下していたが、rAIMを注入したネコではGFRの低下は見られず、腎機能の低下が起きなかった。
実施例43の記載の方法と同様に、両側性のIRを施し、rAIMまたはPBS注入後24時間(IR後48時間)で腎組織をPAS染色で解析した(図46)。PBSを注入したネコでは尿細管上皮細胞の壊死と脱落、尿細管構造の破壊および間質の増殖が認められたが、rAIM注入したネコでは尿細管上皮細胞は既に回復しており冊子縁も復活し、構造も復元していた。また間質もPBSを注入したネコに比べて薄く、増殖は認められなかった。組織学的にもrAIMによる腎不全の治癒は明らかである。
6〜8歳のネコに、AIMまたはvehicleを連日投与する。投与2〜4週後に腎機能(BUN値)を測定する。AIM投与群では、vehicle投与群で観察される腎機能の悪化が抑制される。従って、AIMがネコの腎機能悪化、腎不全の予防に有用であることがわかる。また、AIMの代わりに、AIMの機能をアゴニスティックに調節できる薬剤(AIM活性を有するAIMの部分ペプチドを含む)やAIMの発現を誘導する薬剤を使用しても同様の結果が得られる。
ネコAIMのSRCR3ドメインをマウスAIMのSRCR3ドメインに改変し、IgMと結合する改変ネコAIMを作製する。6〜8歳のネコに、改変AIMまたはvehicleを連日投与する。投与2〜4週後に腎機能(BUN値)を測定する。改変AIM投与群では、vehicle投与群で観察される腎機能の悪化が抑制される。従って、AIMがネコの腎機能悪化、腎不全の予防に有用であることがわかる。また、改変ネコAIMは血中のIgMと結合し、安定化することから、ネコAIMを投与するよりも低用量の改変ネコAIM投与で有効性が得られる。改変ネコAIMは、ネコIgMと結合すれば良く、限定されない。
本出願は、日本で出願された特願2014−022041(出願日:平成26年2月7日)を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
Claims (26)
- AIMもしくはその部分ペプチドであって、AIMと実質的に同質の活性を有するペプチド、またはそれらをコードする塩基配列を含む核酸を含有してなる、腎疾患の予防又は治療剤であって、
腎疾患が急性腎不全、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、IgA腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症またはIgM腎症である、予防又は治療剤。 - 腎疾患が急性腎不全または慢性腎不全である請求項1に記載の予防又は治療剤。
- 予防又は治療の対象がヒトである請求項1又は2に記載の予防又は治療剤。
- 予防又は治療の対象がネコである請求項1又は2に記載の予防又は治療剤。
- AIMまたはその部分ペプチドであって、AIMと実質的に同質の活性を有するペプチドが、ネコIgMと結合することを特徴とする、請求項4に記載の予防又は治療剤。
- ネコIgMと結合するAIMもしくはその部分ペプチドであって、AIMと実質的に同質の活性を有するペプチドが、マウス由来AIMのSRCR3ドメインを含む、請求項5に記載の予防又は治療剤。
- AIM発現不全非ヒト哺乳動物に片側尿管結紮、一側性腎摘出後の一過性腎虚血再灌流または両側性の一過性腎虚血再灌流を行うことによって得られる動物を用いる、腎疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、
腎疾患が急性腎不全、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、IgA腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症またはIgM腎症である、スクリーニング方法。 - 以下の工程を含むことを特徴とする、請求項7に記載のスクリーニング方法:
(1)片側尿管結紮、一側性腎摘出後の一過性腎虚血再灌流または両側性の一過性腎虚血再灌流を行う条件下、AIM発現不全非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
(2)被検物質を投与されたAIM発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程:
(i)壊死した尿細管細胞の蓄積と腎実質の線維化、
(ii)糸球体構造の崩壊と線維化、
(iii)腎臓における炎症性サイトカインの発現量、
(iv)腎臓におけるマクロファージの割合、
(v)BUN値、
(vi)生存率、
(3)被検物質非投与の場合と比較して、前記特性のいずれか一項目以上が改善される被検物質を選択する工程。 - AIM発現不全非ヒト哺乳動物に片側尿管結紮、一側性腎摘出後の一過性腎虚血再灌流または両側性の一過性腎虚血再灌流を行うことによって得られる動物を用いる、腎疾患予防又は治療剤の予防又は治療効果の評価方法であって、
腎疾患が急性腎不全、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、IgA腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症またはIgM腎症である、評価方法。 - 以下の工程を含むことを特徴とする、請求項9に記載の評価方法:
(1)片側尿管結紮、一側性腎摘出後の一過性腎虚血再灌流または両側性の一過性腎虚血再灌流を行う条件下、AIM発現不全非ヒト哺乳動物に腎疾患予防又は治療剤を投与する工程、
(2)腎疾患予防又は治療剤を投与されたAIM発現不全非ヒト哺乳動物の下記特性のいずれか一項目以上を観察する工程:
(i)壊死した尿細管細胞の蓄積と腎実質の線維化、
(ii)糸球体構造の崩壊と線維化、
(iii)腎臓における炎症性サイトカインの発現量、
(iv)腎臓におけるマクロファージの割合、
(v)BUN値、
(vi)生存率、
(3)前記特性のいずれか一項目以上を腎疾患予防又は治療剤非投与の場合と比較して、腎疾患予防又は治療剤の効果を評価する工程。 - 被検者の試料中のAIM濃度を測定することを含む、腎疾患患者の予後の予測方法であって、腎疾患が急性腎不全、ネフローゼ症候群、腎硬化症、IgA腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症またはIgM腎症であり、該試料中のAIM濃度が、健常者または一定水準と比べて低い場合に、被検者の腎疾患が将来的に悪化する可能性が高いとの指標となる、予測方法。
- 試料が血液または血清である、請求項11に記載の予測方法。
- AIM濃度の測定方法が抗AIM抗体を用いた免疫学的方法である、請求項11または12に記載の予測方法。
- 被検者の試料中のAIM濃度を測定することを含む、急性腎不全の検査方法であって、該試料中のAIM濃度が、健常者または一定水準と比べて高い場合に、被検者が急性腎不全に罹患しているとの指標となる、検査方法。
- 試料が尿である、請求項14に記載の検査方法。
- AIM濃度の測定方法が抗AIM抗体を用いた免疫学的方法である、請求項14または15に記載の検査方法。
- 以下の(a)または(b)を含む、腎疾患の診断または予後の予測キット:
(a)AIM遺伝子の転写産物とハイブリダイズし得る核酸プローブまたは核酸プライマー、および/または
(b)AIMに対する抗体、
ここで、腎疾患が急性腎不全、ネフローゼ症候群、腎硬化症、IgA腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症またはIgM腎症である。 - AIMもしくはその部分ペプチドであって、AIMと実質的に同質の活性を有するペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸を対象に有効量投与することを含む、非ヒト動物の腎疾患の予防又は治療方法であって、
腎疾患が急性腎不全、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、IgA腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症またはIgM腎症である、予防又は治療方法。 - 腎疾患が急性腎不全または慢性腎不全である、請求項18に記載の予防又は治療方法。
- 予防又は治療の対象がネコである、請求項18又は19に記載の予防又は治療方法。
- AIMまたはその部分ペプチドであって、AIMと実質的に同質の活性を有するペプチドが、ネコIgMと結合することを特徴とする、請求項20に記載の予防又は治療方法。
- 腎疾患の予防又は治療剤を製造するための、AIMもしくはその部分ペプチドであって、AIMと実質的に同質の活性を有するペプチドまたはそれらをコードする塩基配列を含む核酸の使用であって、
腎疾患が急性腎不全、慢性腎炎、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、IgA腎症、高血圧性腎症、膠原病に伴う腎症またはIgM腎症である、使用。 - 腎疾患が急性腎不全または慢性腎不全である、請求項22に記載の使用。
- 予防又は治療の対象がヒトである、請求項22又は23に記載の使用。
- 予防又は治療の対象がネコである、請求項22又は23に記載の使用。
- AIMまたはその部分ペプチドであって、AIMと実質的に同質の活性を有するペプチドが、ネコIgMと結合することを特徴とする、請求項25に記載の使用。
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