CN112752583A

CN112752583A - 神经变性疾病治疗剂

Info

Publication number: CN112752583A
Application number: CN201980065100.3A
Authority: CN
Inventors: 宫崎彻
Original assignee: Harasaki Takashi
Current assignee: Harasaki Takashi
Priority date: 2018-10-01
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2021-05-04
Also published as: IL281869A; KR20210068104A; EP3862012A4; JPWO2020071318A1; US20220000975A1; CA3114869A1; CA3114869C; EP3862012A1; JP7289033B2; WO2020071318A1; SG11202103250UA

Abstract

本发明提供神经变性疾病的治疗或预防剂，其包含巨噬细胞凋亡抑制剂(AIM)、具有AIM的生物学活性的AIM片段、或编码该AIM或AIM片段的核酸。

Description

神经变性疾病治疗剂

技术领域

本发明涉及神经变性疾病的治疗剂等，详细而言，涉及以巨噬细胞凋亡抑制剂(AIM)作为有效成分的神经变性疾病的治疗剂和使用其的神经变性疾病的治疗或预防方法。

背景技术

阿兹海默病、运动神经元病等神经变性疾病是因特定的神经变性、脱落而呈现进行性且难治性的认知功能障碍和运动功能障碍的疾病。神经变性疾病已知多种，所述神经变性疾病中共通的病理学特征是异常的蛋白质的蓄积，该蓄积被认为是神经变性的中心病况。因此，作为神经变性疾病的治疗或预防途径，研究了构建去除或抑制所述异常的蛋白质的蓄积的手段。

作为神经变性疾病中包含的代表性疾病之一，可以举出阿兹海默病。阿兹海默病患者的脑内，已知首先发生淀粉样β的斑块形成，接着发生tau蛋白质的乙酰基化和凝聚、脯氨酰异构酶Pin1的丧失等。因此，可以认为通过去除在该疾病的初期阶段中的淀粉样β的蓄积的手段、和/或抑制该蛋白质的蓄积的手段，能够治疗和/或预防阿兹海默病，实际上，报告了大量成为阿兹海默病的治疗剂的候选物的物质(专利文献1~3)。

AIM(也被称为CD5L)是本发明人等确定的巨噬细胞特异性产生、抑制巨噬细胞本身的凋亡的因子(非专利文献1)，迄今暗示了与多种疾病相关。例如，AIM伴随肥胖而血中浓度上升，通过CD36介导的内吞作用而被脂肪细胞摄取，诱导蓄积的中性脂肪的分解(lipolysis)，因此暗示了与抗肥胖的关系(非专利文献2)。此外，AIM通过分解中性脂肪而从脂肪细胞中释放游离脂肪酸，所释放的脂肪酸经由toll样受体的刺激而在脂肪组织中引发/维持慢性炎症。代谢综合征中，获得与肥胖相伴的胰岛素抵抗性成为其基础，但脂肪组织中的慢性炎症是重要的，因此AIM据信与代谢综合征存在关系(非专利文献3)。本发明人等此外还表明，AIM抑制了脂肪前体细胞向成熟脂肪细胞的分化，诱导了脂肪细胞中的脂肪滴的分解，报告了AIM应用于肥胖的可能性(专利文献4)。进一步，本发明人等表明，负荷高卡路里饮食的肥胖AIM敲除(KO)小鼠显示出肥胖、脂肪肝、肝实质的纤维化、癌症发病之类的近似于人NASH病况的病况，报告了AIM应用于肝脏疾病的可能性(专利文献5)。除此之外，本发明人等表明，在进行两侧性的短暂性肾缺血再灌注的AIMKO小鼠中发生急性肾衰竭，发生坏死的肾小管细胞的蓄积和与其相伴的肾障碍的急速进行、以及全身状态的恶化，能够确认高频度的死亡。并且，发明人等对该AIMKO小鼠给予AIM的结果显示，BUN值改善，确认到肾功能的急速改善，确认到与其相伴的全身症状和死亡率的改善，报告了通过补充AIM而治疗急性肾衰竭以及预防或治疗慢性肾疾病的可能性(专利文献6)。然而，迄今不存在关于AIM与神经变性疾病的关系的报告。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利5765857号公报

专利文献2：日本专利5692073号公报

专利文献3：国际公开第00/24392号

专利文献4：国际公开2010/140531号

专利文献5：国际公开2013/162021号

专利文献6：国际公开2015/119253号

非专利文献

非专利文献1：Miyazaki, J Exp Med 189:413-422, 1999

非专利文献2：Kurokawa, Cell Metab 11:479-492, 2010

非专利文献3：Kurokawa, PNAS 108:12072-12077, 2011。

发明内容

发明要解决的课题

本发明的课题在于，提供使用AIM蛋白质的神经变性疾病的新型治疗方法或预防方法。

用于解决课题的手段

本发明人对上述课题进行深入研究的结果发现，(1)作为脑内的巨噬细胞的小胶质细胞不产生AIM，(2)AIM无法通过血脑屏障(BBB)，(3)如果在阿兹海默病的疾病模型小鼠(5XFAD小鼠)的脑内中通过显微注射给予重组AIM蛋白质，则该AIM蛋白质在淀粉样斑块处堆积，(4)使用腺相关病毒，在5XFAD小鼠的海马区域中表达AIM，由此淀粉样斑块显著减少，(5)如果在体外多聚体的淀粉样β与重组AIM蛋白质结合，则显著促进利用源自脑的小胶质细胞的多聚体的淀粉样β的吞噬等，基于所述见解进一步进行研究，由此完成了本发明。即，本发明如下所述。

[1]神经变性疾病的治疗或预防剂，其包含巨噬细胞凋亡抑制剂(AIM)、具有AIM的生物学活性的AIM片段、或编码该AIM或AIM片段的核酸。

[2]根据[1]所述的治疗或预防剂，其特征在于，编码AIM或AIM片段的核酸被整合至病毒载体中。

[3]根据[2]所述的治疗或预防剂，其中，病毒载体为选自腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、和仙台病毒中的病毒载体。

[4]根据[3]所述的治疗或预防剂，其中，病毒载体为腺相关病毒。

[5]根据[4]所述的治疗或预防剂，其中，腺相关病毒为AAV血清型5(AAV5)或AAV血清型9(AAV9)。

[6]根据[1]~[5]中任一项所述的治疗或预防剂，其中，神经变性疾病选自阿兹海默病、帕金森病、莱维小体型认知症、前额颞型认知症、多系统萎缩症、皮克氏病、大脑皮质基底核变性症、进行性核上性麻痺、肌肉萎缩性侧索硬化症、脊髓延髓性肌肉萎缩症（球脊髄性筋萎縮症）、脊髄性进行性肌肉萎缩症、亨廷顿氏病、脊髄小脑变性症、海马硬化症、进行性肌阵挛性癫痫、和齿状核红核苍白球路易体萎缩症。

[7]神经变性疾病的治疗或预防方法，其包括将AIM、具有AIM的生物学活性的AIM片段、或编码该AIM或AIM片段的核酸向对象给予。

[8]根据[7]所述的治疗或预防方法，其特征在于，编码AIM或AIM片段的核酸被整合至病毒载体中。

[9]根据[8]所述的治疗或预防方法，其中，病毒载体为选自腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、和仙台病毒中的病毒载体。

[10]根据[8]所述的治疗或预防方法，其中，病毒载体为腺相关病毒。

[11]根据[10]所述的治疗或预防方法，其中，腺相关病毒为AAV血清型5(AAV5)或AAV血清型9(AAV9)。

[12]根据[7]~[11]中任一项所述的治疗或预防方法，其中，神经变性疾病选自阿兹海默病、帕金森病、莱维小体型认知症、前额颞型认知症、多系统萎缩症、皮克氏病、大脑皮质基底核变性症、进行性核上性麻痺、肌肉萎缩性侧索硬化症、脊髓延髓性肌肉萎缩症、脊髄性进行性肌肉萎缩症、亨廷顿氏病、脊髄小脑变性症、海马硬化症、进行性肌阵挛性癫痫、和齿状核红核苍白球路易体萎缩症。

[13]巨噬细胞凋亡抑制剂(AIM)、具有AIM的生物学活性的AIM片段、或编码该AIM或AIM片段的核酸，其用于在神经变性疾病的治疗或预防方法中的使用。

[14]根据[13]所述的巨噬细胞凋亡抑制剂(AIM)、具有AIM的生物学活性的AIM片段、或编码该AIM或AIM片段的核酸，其特征在于，编码AIM或AIM片段的核酸被整合至病毒载体中。

[15]根据[2]所述的巨噬细胞凋亡抑制剂(AIM)、具有AIM的生物学活性的AIM片段、或编码该AIM或AIM片段的核酸，其中，病毒载体为选自腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、和仙台病毒中的病毒载体。

[16]根据[15]所述的巨噬细胞凋亡抑制剂(AIM)、具有AIM的生物学活性的AIM片段、或编码该AIM或AIM片段的核酸，其中，病毒载体为腺相关病毒。

[17]根据[16]所述的巨噬细胞凋亡抑制剂(AIM)、具有AIM的生物学活性的AIM片段、或编码该AIM或AIM片段的核酸，其中，腺相关病毒为AAV血清型5(AAV5)或AAV血清型9(AAV9)。

[18]根据[13]~[17]中任一项所述的巨噬细胞凋亡抑制剂(AIM)、具有AIM的生物学活性的AIM片段、或编码该AIM或AIM片段的核酸，其中，神经变性疾病选自阿兹海默病、帕金森病、莱维小体型认知症、前额颞型认知症、多系统萎缩症、皮克氏病、大脑皮质基底核变性症、进行性核上性麻痺、肌肉萎缩性侧索硬化症、脊髓延髓性肌肉萎缩症、脊髄性进行性肌肉萎缩症、亨廷顿氏病、脊髄小脑变性症、海马硬化症、进行性肌阵挛性癫痫、和齿状核红核苍白球路易体萎缩症。

[19]巨噬细胞凋亡抑制剂(AIM)、具有AIM的生物学活性的AIM片段、或编码该AIM或AIM片段的核酸在制造用于治疗或预防神经变性疾病的药物中的用途。

[20]根据[19]所述的用途，其特征在于，编码AIM或AIM片段的核酸被整合至病毒载体中。

[21]根据[20]所述的用途，其中，病毒载体为选自腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、和仙台病毒中的病毒载体。

[22]根据[21]所述的用途，其中，病毒载体为腺相关病毒。

[23]根据[22]所述的用途，其中，腺相关病毒为AAV血清型5(AAV5)或AAV血清型9(AAV9)。

[24]根据[19]~[23]中任一项所述的用途，其中，神经变性疾病选自阿兹海默病、帕金森病、莱维小体型认知症、前额颞型认知症、多系统萎缩症、皮克氏病、大脑皮质基底核变性症、进行性核上性麻痺、肌肉萎缩性侧索硬化症、脊髓延髓性肌肉萎缩症、脊髄性进行性肌肉萎缩症、亨廷顿氏病、脊髄小脑变性症、海马硬化症、进行性肌阵挛性癫痫、和齿状核红核苍白球路易体萎缩症。

发明的效果

根据本发明，能够抑制对象的脑中的异常蛋白质的蓄积。其结果是，能够治疗或预防以阿兹海默病为首的因异常蛋白质的蓄积而引起的神经变性疾病。

附图说明

图1中，通过使用小鼠脑整体的裂解物的蛋白质印迹法来研究脑中的AIM的表达确认。野生型C57BL/6小鼠(泳道1：野生型)、AIM缺失小鼠(泳道2:AIM-KO)的脑裂解物(20ng/泳道)和作为阳性对照的重组AIM蛋白质(50ng)在SDS-PAGE中分级，使用抗AIM抗体进行蛋白质印迹法。野生型小鼠、AIM缺失小鼠均未确认到在脑中表达AIM。

图2中，免疫组织化学地研究脑中的AIM的表达确认。野生型C57BL/6小鼠的脑组织切片(纵切)使用抗AIM抗体进行免疫染色。通过使用过氧化物酶反应的DAB显色法进行检测，但未确认到AIM的表达。

图3中，对野生型C57BL/6小鼠(WT)的脑整体(泳道1)、AIM缺失小鼠(AIM-KO)的脑整体(泳道2)、WT小鼠的肝脏(阳性对照、泳道3)、AIM-KO小鼠的肝脏(泳道4)、从WT小鼠新生儿脑分离并增殖的小胶质细胞(泳道5)、从AIM-KO小鼠新生儿脑分离并增殖的小胶质细胞(泳道6)，从各自中提取总RNA，通过定量RT-PCR法，将AIM的表达利用以肝脏中的表达设为1的相对表达来分析。其结果是，脑整体和小胶质细胞单独中均未确认到AIM的显著表达。

图4中，在5XFAD小鼠的右脑的海马区域中，显微注射溶解于PBS中的重组小鼠AIM(rAIM)10μg(溶解于PBS 10μL)，3小时后分离脑组织，进行切片后，使用对 AIM(绿)和淀粉样Aβ(红)的抗体，通过免疫染色法进行共染色，通过荧光显微镜观察。AIM和淀粉样Aβ斑块共同局部存在的部分大量被观察到(上图：红和绿重叠而呈现黄色的部分、以及红和绿在相同部位被观察到的部分)。此外，将其他部分强放大(x400)，如果各自分别拍摄AIM和淀粉样Aβ(下图)，则更明确地示出其共同局部存在。

图5中，对8周龄的5XFAD小鼠，将表达小鼠AIM的腺相关病毒(AAV)血清型5(AAV5)和空的AAV5(模拟物)，以相同病毒量在小鼠的海马区域中显微注射(n=7~8)。15周后摘出脑，将切片用抗淀粉样Aβ抗体染色，以%比较淀粉样Aβ阳性部分(淀粉样斑块)相对于海马整体的面积的面积。感染表达AIM的AAV的个体与感染模拟物AAV的个体相比，确认到显著的淀粉样斑块的减少(T检验)。

图6中，使N末端用Cy5标记的Ab(淀粉样β)42肽多聚体化，在从AIM-KO小鼠新生儿脑分离·培养得到的包含小胶质细胞的细胞集团中具有rAIM(50mg/mL)(+rAIM)或不具有(+PBS)的条件下，在DMEM培养基+10%FBS中进行37℃、1小时反应。将细胞洗涤后，用抗F4/80抗体染色，用流式细胞仪分析。分析作为F4/80高阳性的小胶质细胞中的Cy5的荧光强度、即Ab42多聚体的摄取量的结果是，在rAIM存在的情况下，与不存在的情况下相比，Cy5阳性的小胶质细胞显著(16%→84%)增加。

图7是7周龄的不具有转运蛋白的(Non-TG)5xFAD小鼠与TG(+)5xFAD小鼠中的相对于脑整体而言的Aβ(淀粉样)斑块面积(%)进行比较的图。

图8是7周龄的Non-TG 5xFAD小鼠、TG(+)5xFAD小鼠、和野生型C57BL/6小鼠的海马区域中的示出AIM与Aβ斑块的共同存在的照片。

图9是示出在人PDGF-B启动子下在脑神经细胞中表达小鼠AIM的转运蛋白的映射的图。各个片段的长度以Kb(千碱基)表示。

具体实施方式

以下，详细说明本发明。

1.神经变性疾病的治疗或预防剂

本发明提供神经变性疾病的治疗或预防剂(以下有时称为“本发明的药剂”)，其包含AIM、具有AIM的生物学活性的AIM片段、或编码该AIM或AIM片段的核酸。

本发明中使用的AIM是包含与SEQ ID NO: 1(源自人的AIM蛋白质的氨基酸序列)所示的氨基酸序列相同、或与其实质上相同的氨基酸序列的蛋白质。AIM可以是例如从恒温动物(例如人、小鼠、大鼠、兔、羊、猪、牛、马、猫、狗、猴、大猩猩、鸟等)的免疫细胞、即巨噬细胞分离·纯化的蛋白质。此外，也可以是化学合成或通过无细胞翻译系统而生物化学合成的蛋白质，或者也可以是由导入了包含编码上述氨基酸序列的碱基序列的核酸的转化子产生的重组蛋白质。本发明中使用的成为AIM的来源的生物种类有时优选与罹患神经变性疾病的对象的生物种类一致。例如，在本发明的药剂的应用对象为人的情况下，优选使用人AIM。

作为与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列，可以举出具有与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列约60%以上、优选为约70%以上、进一步优选为约80%以上、特别优选为约90%以上、最优选为约95%以上的一致性或相似性的氨基酸序列等。在此“一致性”是指使用该技术领域中公知的数学算法而将2个氨基酸序列对齐的情况下的最优对齐(优选该算法为了最优对齐，可以考虑向序列中的一者或两者中导入间隔)中相同氨基酸和相似氨基酸残基相对于重叠的全部氨基酸残基的比例(%)。此外，“相似性”是指将2个氨基酸序列对齐时这两个序列中存在相同或相似氨基酸残基的位置的数量相对于全长氨基酸残基数的比例(%)。“相似氨基酸”是指物理化学的性质中相似的氨基酸，可以举出被例如被分类为芳族氨基酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族氨基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、极性氨基酸(Gln、Asn)、碱性氨基酸(Lys、Arg、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、具有羟基的氨基酸(Ser、Thr)、侧链小的氨基酸(Gly、Ala、Ser、Thr、Met)等相同组的氨基酸。利用这样的相似氨基酸的替代被预测对蛋白质的表型不产生变化(即，保守性氨基酸替代)。保守性氨基酸替代的具体例是该技术领域中公知的，记载于各种文献中(例如参照Bowie等人,Science,247:1306-1310(1990))。

本说明书中的氨基酸序列的一致性或相似性可以通过使用一致性或相似性计算算法NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic LocalAlignment Search Tool)，在以下的条件(期待值=10；允许间隔；矩阵=BLOSUM62；过滤器=OFF)进行计算。作为用于确定氨基酸序列的一致性或相似性的其他算法，可以举出例如Karlin等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)中记载的算法[该算法被整合至NBLAST和XBLAST程序(version2.0)中(Altschul等,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402(1997))]、Needleman等,J.Mol.Biol.,48:444-453(1970)中记载的算法[该算法被整合至GCG软件包中的GAP程序中]、Myers和Miller,CABIOS,4:11-17(1988)中记载的算法[该算法被整合至作为CGC序列对齐软件包的一部分的ALIGN程序(版本2.0)中]、Pearson等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444-2448(1988)中记载的算法[该算法被整合至GCG软件包中的FASTA程序]等，它们也同样可以优选使用。更优选与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列是指具有与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列约60%以上、优选为约70%以上、进一步优选为约80%以上、特别优选为约90%以上、最优选为约95%以上的一致性的氨基酸序列。

作为包含与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列的蛋白质，可以举出例如包含前述的与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列、且具有与野生型的AIM所具有的生物学活性实质上同质的活性的蛋白质。作为野生型的AIM所具有的生物学活性，可以举出例如对巨噬细胞(包括小胶质细胞)的内吞作用活性、巨噬细胞的凋亡抑制活性、动脉硬化的维持/促进活性、脂肪细胞分化抑制活性、脂肪细胞的脂肪滴溶解活性、脂肪细胞缩小活性、CD36结合活性、对脂肪细胞的内吞作用活性、FAS结合活性、FAS功能抑制活性、抗肥胖活性、肝疾病(脂肪肝、NASH、肝硬化、肝癌)的预防或治疗活性、肾疾病(急性肾衰竭、慢性肾炎、慢性肾衰竭、肾病综合征、糖尿病性肾病、肾硬化症、IgA肾病、高血压性肾病、伴随胶原病的肾病或IgM肾病)的预防或治疗活性等，本发明中特别是对巨噬细胞的内吞作用活性能够成为优选的指标。该活性可以使用在本申请的实施例中详细描述的体外的巨噬细胞(或小胶质细胞)的吞噬试验来确认，但不限于此。此外，本说明书中“实质上同质”是指这些活性定性(例如生理学或药理学)相同。因此，前述活性优选为同等，但这些活性的程度(例如约0.1~约10倍、优选为约0.5~约2倍)、蛋白质的分子量等量的要素可以不同。前述活性的测定可以按照本身公知的方法来进行。

此外，本发明中使用的AIM中，还包括例如包含下述的蛋白质等：(1)SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列之中1或2个以上(优选为1~100个左右、优选为1~50个左右、进一步优选为1~10个左右、特别优选为1~数(2、3、4或5)个)氨基酸缺失的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上添加了1或2个以上(优选为1~100个左右、优选为1~50个左右、进一步优选为1~10个左右、特别优选为1~数(2、3、4或5)个)氨基酸的氨基酸序列；(3)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中插入了1或2个以上(优选为1~50个左右、优选为1~10个左右、进一步优选为1~数(2、3、4或5)个)氨基酸的氨基酸序列、(4)SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列之中1或2个以上(优选为1~50个左右、优选为1~10个左右、进一步优选为1~数(2、3、4或5)个)氨基酸被其他氨基酸替代的氨基酸序列、或(5)它们组合得到的氨基酸序列。如上述那样，氨基酸序列插入、缺失或被替代的情况下，该插入、缺失或替代的位置只要保持该蛋白质的期望生物学活性(例如对巨噬细胞(包括小胶质细胞)的内吞作用活性)，则没有特别限定。

本发明的AIM优选为具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的人AIM蛋白质(GenBank访问编号：AAD01446)、或者其他哺乳动物中的其类似物[例如GenBank中作为访问编号：AAD01445而登记的小鼠类似物等]，更优选为包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的人AIM蛋白质。

本说明书中，蛋白质和肽按照肽标记的惯例以左端为N末端(氨基末端)、右端为C末端(羧基末端)来记载。以包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的蛋白质为首的本发明中使用的AIM中，C末端可以为羧基(-COOH)、羧酸根(-COO-)、酰胺(-CONH₂)或酯(-COOR)中任一者。

在此作为酯中的R，可以使用例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基等C_1-6烷基；例如环戊基、环己基等C_3-8环烷基；例如苯基、α-萘基等C_6-12芳基；例如苯甲基、苯乙基等苯基-C_1-2烷基；α-萘基甲基等α-萘基-C_1-2烷基等C_7-14芳烷基；特戊酰氧基甲基等。

本发明中使用的AIM在除了C末端之外具有羧基(或羧酸根)的情况下，羧基被酰胺化或酯化的物质也包括在本发明的蛋白质中。作为该情况的酯，可以使用例如上述C末端的酯等。

进一步，本发明中使用的AIM中，还包括N末端的氨基酸残基的氨基被保护基(例如甲酰基、乙酰基等C_1-6烷酰基等C_1-6酰基等)保护的物质、在生物体内能够被裂解而生成的N末端的谷氨酰胺残基发生焦谷氨酸化得到的物质、分子内的氨基酸的侧链上的替代基(例如-OH、-SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)被适当的保护基(例如甲酰基、乙酰基等C_1-6烷酰基等C_1-6酰基等)保护的物质、或者糖链结合得到的所谓糖蛋白质等复合蛋白质等。

本说明书中“AIM”是不仅包括野生型的AIM，还包括具有与野生型的AIM的生物学活性实质上同质或提高的活性的它们的变体等在内的概念。在此“实质上同质的活性”是指与上述相同含义。此外，“实质上同质的活性”的测定可以与AIM的情况同样进行。

作为AIM的变体的一例，可以举出以下，但不限于此。

本发明的变异型人AIM优选包括以下的(1b)至(5b)中任一种氨基酸序列。

(1b)SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的氨基酸编号191的半胱氨酸被替代为丝氨酸而得到的氨基酸序列。

(2b)SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的氨基酸编号300的半胱氨酸被替代为丝氨酸而得到的氨基酸序列。

(3b)SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的氨基酸编号191的半胱氨酸被替代为丝氨酸、且SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的氨基酸编号300的半胱氨酸被替代为丝氨酸而得到的氨基酸序列。

(4b)与(1b)至(3b)中任一种氨基酸序列实质上相同、且(1b)至(3b)中任一种氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该替代的丝氨酸残留的氨基酸序列。

(5b)在除了(1b)至(3b)中任一种氨基酸序列中存在的半胱氨酸和该替代的丝氨酸之外的部位处进一步包含1至数个氨基酸缺失、添加、插入或替代或者其组合的氨基酸序列。

应予说明，针对具有与野生型重组AIM同等或提高的功能的AIM变体，可以使用日本特愿2017-220733等中公开的物质。

此外，作为本发明的药剂的成分，不仅可以使用AIM，还可以使用具有AIM的生物学活性的AIM片段。AIM片段是否具有野生型AIM的生物学活性通过前述方法确定即可。

作为AIM片段的一例，例如完整的AIM蛋白质包含大量包含半胱氨酸的3个SRCR(清道夫受体富半胱氨酸)结构域，因此可以举出各自的SRCR结构域作为具有与野生型AIM所具有的生物学活性实质上同质的活性的AIM片段的例子。更具体而言，可以例如将具有各自包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列之中的SRCR1结构域(SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列之中的氨基酸编号24~125)、SRCR2结构域(SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列之中的氨基酸编号138~239)、SRCR3结构域(SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列之中的氨基酸编号244~346)的部分氨基酸序列、包含SRCR结构域的任意组合的部分氨基酸序列的物质等用作AIM片段。具有与野生型AIM的生物学活性实质上同质的活性的AIM片段只要包含上述功能结构域，则其尺寸没有特别限制，可以举出优选包含50个以上的部分氨基酸序列的物质、更优选包含100个以上的部分氨基酸序列的物质、进一步优选包含200个以上的部分氨基酸序列的物质。该部分氨基酸序列可以为一个连续的部分氨基酸序列，或者也可以为不连续的多个部分氨基酸序列连接而得到的物质。

此外，本发明中使用的AIM片段中，C末端可以为羧基(-COOH)、羧酸根(-COO^-)、酰胺(-CONH₂)或酯(-COOR)中任一者。在此作为酯中的R，可以举出与针对AIM前述的同样的物质。本发明的部分肽在除了C末端之外还具有羧基(或羧酸根)的情况下，羧基被酰胺化或酯化的物质也包括在本发明的部分肽中。作为该情况的酯，可以使用例如与C末端的酯同样的物质等。

进一步，本发明中使用的AIM片段中，与上述AIM同样地，还包括N末端的氨基酸残基的氨基被保护基保护的物质、N末端的谷氨酰胺残基发生焦谷氨酸化得到的物质、分子内的氨基酸的侧链上的替代基被适当的保护基保护的物质、或者糖链结合得到的所谓糖肽等复合肽等。

本发明中使用的AIM(包括AIM片段)可以为盐的形态。例如，可以使用与生理学可接受的酸(例如：无机酸、有机酸)、碱(例如：碱金属盐)等形成的盐，尤其优选为生理学可接受的酸加成盐。作为这样的盐，可以使用例如与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐、或者与有机酸(例如乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、丁二酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等。

AIM可以由前述哺乳动物的巨噬细胞通过本身公知的蛋白质的纯化方法而制造。具体而言，将哺乳动物的巨噬细胞匀浆，通过低速离心而去除细胞碎片后，将上清液高速离心，使含细胞膜的级分沉淀，对该上清液施加反相色谱、离子交换色谱、亲和色谱等色谱等，由此可以制备AIM或其盐。

AIM(包括AIM片段)还可以按照公知的肽合成法而制造。肽合成法可以为例如固相合成法、液相合成法中任一者。能够构成AIM的部分肽或氨基酸与残余部分缩合、产物具有保护基的情况下，可以通过将保护基脱离而制造目标蛋白质。

在此，缩合、保护基的脱离可以按照本身公知的方法、例如以下的(1)和(2)中记载的方法来进行。

(1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti, Peptide Synthesis,IntersciencePublishers,New York(1966年)

(2)Schroeder和Luebke,The Peptide,Academic Press,New York(1965年)

以这样的方式得到的AIM可以通过公知的纯化法而纯化分离。在此，作为纯化法，可以举出例如溶剂萃取、蒸馏、柱色谱、液体色谱、重结晶、它们的组合等。

通过上述方法得到的AIM为游离体的情况下，可以将该游离体通过公知的方法或者按照其的方法变换为适当的盐，相反AIM以盐的方式得到的情况下，可以将该盐通过公知的方法或者按照其的方法变换为游离体或其他盐。

进一步，AIM还可以通过培养含有编码其的核酸的转化子，从所得培养物中分离纯化AIM，从而制造。编码AIM或AIM片段的核酸可以为DNA或RNA，或者也可以为DNA/RNA嵌合体。优选为DNA。此外，该核酸可以为双链或单链。双链的情况下，可以为双链DNA、双链RNA或DNA:RNA的杂交体。单链的情况可以为有义链(即编码链)或反义链(即非编码链)。

作为编码AIM(包括AIM片段)的DNA，可以举出基因组DNA、源自恒温动物(例如人、牛、猴、马、猪、羊、山羊、狗、猫、天竺鼠、大鼠、小鼠、兔、仓鼠、鸟等)的巨噬细胞的cDNA、合成DNA等。如果为编码AIM或AIM片段的基因组DNA，则可以使用由前述动物的任何细胞[例如肝细胞、脾细胞、神经细胞、胶质细胞、胰β细胞、骨髄细胞、肾小球膜细胞、朗格汉斯细胞、表皮细胞、上皮细胞、杯状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞、肝细胞或间质细胞、或这些细胞的前体细胞、干细胞或癌细胞等]、或这些细胞所存在的任何组织[例如脑、脑的各部位(例如嗅球、扁桃核、大脑基底球、海马、丘脑、下丘脑、大脑皮质、延髄、小脑)、脊髄、下垂体、胃、胰脏、肾脏、肝脏、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、肾上腺、皮肤、肺、消化道(例如大肠、小肠)、血管、心脏、胸腺、脾脏、颌下腺、外周血、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘、子宫、骨、关节、脂肪组织(例如褐色脂肪组织、白色脂肪组织)、骨骼肌等]制备的基因组DNA级分作为模板，通过聚合酶链式反应(以下简称为“PCR法”)直接扩增，如果为编码AIM或AIM片段的cDNA，则也可以将由巨噬细胞制备的全RNA或mRNA级分各自作为模板，通过PCR法和逆转录酶-PCR(以下简称为“RT-PCR法”)直接扩增。或者，编码AIM或其肽片段的基因组DNA和cDNA也可以由在适当的载体中插入上述基因组DNA和全RNA或mRNA的片段而制备的基因组DNA文库和cDNA文库，通过菌落或噬菌斑杂交法或PCR法等，各自进行克隆。文库中使用的载体可以为噬菌体、质粒、黏粒、噬菌粒等中任一者。

作为编码AIM的核酸，可以举出例如包含与SEQ ID NO: 2所示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核酸等。作为包含与SEQ ID NO: 2所示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸，可以使用例如含有具有与SEQ ID NO: 2所示的碱基序列约60%以上、优选为约70%以上、进一步优选为约80%以上、特别优选为约90%以上的一致性或相似性的碱基序列、对具有与前述AIM实质上同质的活性的蛋白质进行编码的核酸等。一个方式中，包含与SEQ ID NO: 2所示的碱基序列实质上相同的碱基序列的核酸是具有与SEQ ID NO: 2所示的碱基序列约60%以上、优选为约70%以上、进一步优选为约80%以上、特别优选为约90%以上的一致性的碱基序列、且对具有与前述AIM实质上同质的活性的蛋白质进行编码的核酸。编码AIM的核酸中，为了提高成为应用对象的生物中的表达效率，还可以包含进行密码子最优化的核酸序列等。

本说明书中的碱基序列的一致性或相似性可以通过使用一致性或相似性计算算法NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic LocalAlignment Search Tool)，在以下的条件(期待值=10；允许间隔；过滤器=ON；匹配度=1；失配度=-3)下计算。作为用于确定碱基序列的一致性或相似性的其他算法，可以同样优选例示出上述氨基酸序列的一致性计算算法。

编码AIM的核酸优选为包含SEQ ID NO: 2所示的碱基序列所示的对人AIM蛋白质进行编码的碱基序列的核酸(GenBank访问编号：AF011429)或者其他哺乳动物中的其类似物[例如GenBank中作为访问编号：AF011428而登记的小鼠类似物等]。

进一步，作为本发明的药剂的成分，还可以使用编码AIM、或具有AIM的生物学活性的AIM片段的核酸。

本发明中使用的编码AIM或AIM片段的核酸只要包含对包含与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列中的一部分相同或实质上相同的氨基酸序列的肽进行编码的碱基序列，则可以为任意者。具体而言，作为编码AIM片段的核酸，可以使用例如(1)包含SEQ ID NO: 2所示的碱基序列的部分碱基序列的核酸；或(2)包含具有与包含SEQ ID NO: 2所示的碱基序列的部分碱基序列的核酸约60%以上、优选为约70%以上、进一步优选为约80%以上、特别优选为约90%以上的一致性或相似性的碱基序列、对具有与前述AIM实质上同质的活性的蛋白质进行编码的核酸等。

编码AIM或AIM片段的核酸可以使用具有编码该AIM或AIM片段的碱基序列中的一部分的合成DNA引物，通过PCR法进行扩增，或者通过将整合至适当的表达载体中的DNA与编码AIM中的一部分或者全区域的DNA片段或合成DNA进行了标记得到的物质进行杂交，从而进行克隆。杂交可以按照本身公知的方法或者按照其的方法、例如按照分子克隆(Molecular Cloning)第2版(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press,1989)中记载的方法等进行。此外，在使用市售的文库的情况下，杂交可以按照随附的使用说明书中记载的方法而进行。杂交可以优选按照严格条件进行。

作为高严格条件，可以举出例如在6×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中45℃下的杂交反应后，在0.2×SSC/0.1%SDS中65℃下进行一次以上的洗涤等。本领域技术人员可以通过适当变更杂交溶液的盐浓度、杂交反应的温度、探针浓度、探针的长度、失配的数量、杂交反应的时间、洗涤液的盐浓度、洗涤的温度等而容易地调节至期望的严格度。此外，在使用市售的文库的情况下，杂交可以按照该文库随附的使用说明书中记载的方法进行。

编码AIM或AIM片段的核酸可以功能性地连接于具有脑特异性地表达的启动子的表达载体等。通过将包含编码AIM或AIM片段的核酸的表达载体递送至脑内，能够脑特异性地表达AIM或AIM片段。脑特异性启动子中，包括SCG10、GFAP启动子、突触素1启动子、微管蛋白α1启动子、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II启动子、神经元特异性烯醇化酶启动子、PDGF(血小板源生长因子β)-β链启动子等，但不限于此。

此外，优选的一个方式中，可以将编码AIM或AIM片段的核酸搭载于病毒载体中。作为适合的病毒载体，可以举出腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、和仙台病毒，但不限于此。如果考虑到用于基因治疗，则从长期表达导入基因的观点、源自非病原性病毒而安全性高等理由出发，优选为腺相关病毒。此外，作为腺相关病毒的血清型，只要得到本发明的期望的效果，则没有特别限定，可以使用血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、和10中任一者。特别是如果考虑到在神经组织中表达效率高，则优选为血清型1、2、5、9、或10(关于AAV的多样血清型，参照WO2005/033321)，进一步从高表达效率的观点出发，更优选为AAV5，从具有更高效地通过血脑屏障的特性的观点出发，更优选为血清型9(AAV9)(Iwata N et al,Sci Rep.2013;3:1472)。应予说明，本发明中使用的病毒载体中，还包括其派生物。病毒载体的派生物公知为改变了衣壳的物质等，特别地，作为AAV的派生物，可以例示出例如WO2012/057363等中公开的物质，但不限于此。

在病毒载体中搭载编码AIM或AIM片段的核酸时，为了在目标脑内特异性地表达AIM或AIM片段，作为控制编码AIM或AIM片段的核酸的表达的启动子，优选使用脑特异性启动子。所述脑特异性启动子中，包括SCG10、GFAP启动子、突触素1启动子、微管蛋白α1启动子、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II启动子、神经元特异性烯醇化酶启动子、PDGF(血小板源生长因子β)-β链启动子等，但不限于此。此外，除了启动子之外，可以将PolyA加成信号、Kozak共有序列、标签序列、接头序列、和NLS等公知的序列根据目的而适当与编码AIM或AIM片段的核酸一起搭载在病毒载体中。

包含编码AIM或AIM片段的核酸的病毒载体可以通过公知的方法而制备。简而言之，制备插入了编码AIM或AIM片段的核酸、和根据需要具有期望的功能的核酸(例如脑特异性启动子等)的病毒表达用质粒载体，将其转染至适当的宿主细胞，短暂性地产生包含本发明的多核苷酸的病毒载体，将其回收即可。

例如，在制备AAV载体的情况下，首先，残留野生型的AAV的基因组序列之中两端的ITR，替代除此之外的编码Rep蛋白质和衣壳蛋白质的DNA，插入编码AIM或AIM片段的核酸，从而制作载体质粒。另一方面，编码形成病毒颗粒所需的Rep蛋白质和衣壳蛋白质的DNA插入另一质粒。进一步，制作包含承担AAV的增殖所需的腺病毒的辅助作用的基因(E1A、E1B、E2A、VA、和E4orf6)的质粒，作为腺病毒辅助质粒。将这3种质粒共转染至宿主细胞，由此在该细胞内产生重组AAV(即AAV载体)。作为宿主细胞，优选使用能够提供承担前述辅助作用的基因的基因产物(蛋白质)之中的一部分的细胞(例如293细胞等)，在使用这样的细胞的情况下，编码能够由该宿主细胞提供的蛋白质的基因不需要搭载于前述腺病毒辅助质粒中。所产生的AAV载体存在于核内，因此将宿主细胞冻结溶解而回收，通过使用氯化铯的密度梯度超离心法、柱法等，进行分离和纯化，由此制备期望的AAV载体。

使用本发明的药剂来治疗或预防对象的神经变性疾病的情况下，其给予途径只要实现成为有效成分的AIM蛋白质向脑内的递送，则没有特别限定。在一个方式中，本发明的药剂中含有的成分为AIM蛋白质的情况下，考虑到AIM蛋白质不通过血脑屏障(Blood-BrainBarrier、BBB)，可以在对象的头盖骨上开针孔，对脑组织通过显微注射等本身公知的方法直接导入本发明的药剂。或者，在变更为能够通过血脑屏障的脂质体中包封AIM蛋白质，将其通过静脉给予等向对象给予，由此也能够将AIM蛋白质递送至脑内。此外，本发明的药剂中含有的成分为编码AIM蛋白质的核酸的情况下，也可以通过从在对象的头盖骨上设置的针孔直接导入本发明的药剂的方法、前述的使用脂质体的方法等而向脑内递送编码AIM蛋白质的核酸。

本发明的药剂的成分为搭载了编码AIM的核酸的病毒载体的情况下，可以在对象的头盖骨上设置针孔，经由该针孔向脑组织通过显微注射等本身公知的方法直接导入本发明的药剂。此外，如上所述，如果使用AAV9，则可以不在对象的头盖骨上设置针孔，仅通过将本发明的药剂注入循环血中，使AIM在对象的脑内特异性地表达，故而非常优选。即，在使用脂质体、AAV9等能够通过血脑屏障的手段的方式中，本发明的药剂可以进行非经口给予、例如静脉内给予、动脉内给予、皮下给予、腹腔内给予。

本发明的药剂被制剂化为用于非经口给予的情况下，可以制剂化为例如注射剂、栓剂等。注射剂可以包含静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂型。这样的注射剂可以按照公知的方法而制备。作为注射剂的制备方法，可以通过例如将AIM、编码AIM的核酸、和/或搭载了编码AIM的核酸的病毒等成分在通常注射剂中使用的无菌的水性液、或油性液中溶解、悬浮或乳化，从而制备。作为注射用的水性液，可以使用例如包含生理食盐水、葡萄糖、其他辅助药的等渗液等，与适当的助溶剂、例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。作为油性液，可以使用例如芝麻油、大豆油等，作为助溶剂，可以组合使用苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。所制备的注射液优选填充在适当的安瓿瓶中。

通过本发明的药剂而能够治疗或预防的神经变性疾病只要因脑内的异常蛋白质的蓄积引起，则没有特别限定。应予说明，本说明书中的“异常蛋白质”是指由于因基因变异、化学修饰等而引起的立体结构变化等而导致原本的生物学功能丧失、减退、亢进、或变化，其结果是包含可能成为疾病的原因的蛋白质，此外，还包括即使以单个来看与正常蛋白质相同，但异常凝聚或蓄积，以整体来看形成异常的蛋白质凝聚体，其结果是可能成为疾病的原因的蛋白质凝聚体。使用本发明的药剂而能够治疗或预防的神经变性疾病中，包括例如阿兹海默病、帕金森病、莱维小体型认知症、前额颞型认知症、多系统萎缩症、皮克氏病、大脑皮质基底核变性症、进行性核上性麻痺、肌肉萎缩性侧索硬化症、脊髓延髓性肌肉萎缩症、脊髄性进行性肌肉萎缩症、亨廷顿氏病、脊髄小脑变性症、海马硬化症、进行性肌阵挛性癫痫、和齿状核红核苍白球路易体萎缩症，但不限于此。一个方式中，本发明的药剂的适用疾病是阿兹海默病。

本发明的药剂向对象的给予量只要是治疗和/或预防有效量，则没有特别限定，可以根据有效成分的种类和形态、对象的年龄和体重、给予日程、以及给予方法等而适当最优化即可。

通过将本发明的药剂向罹患神经变性疾病的对象应用，AIM或AIM片段被递送至对象的脑内，或在对象的脑内表达。脑内的AIM或AIM片段与在脑内存在的异常蛋白质结合，将该蛋白质标记为去除对象。该被标记的异常蛋白质通过利用小胶质细胞的吞噬，迅速从脑内去除。其结果是，能够治疗和/或预防对象中的神经变性疾病。

应予说明，本说明书中的疾病的“治疗”中，不仅可以包括疾病的治愈，还可以包括疾病的缓解和疾病的程度的改善。

此外，本说明书中的疾病的“预防”中，除了防止疾病的发病之外，还包括推迟疾病的发病。除此之外，本说明书中的疾病的“预防”中，还可以包括防止治疗后的该疾病的复发、或推迟治疗后的该疾病的复发。

2.神经变性疾病的治疗或预防方法

本发明此外提供神经变性疾病的治疗或预防方法(以下有时称为“本发明的方法”)，其包括将AIM、具有AIM的生物学活性的AIM片段、或编码该AIM或AIM片段的核酸向对象给予。

针对本发明的方法中的用作有效成分的AIM等、各成分的给予手段等，与“1.神经变性疾病的治疗或预防剂”中说明的相同。

应用本发明的方法的对象中，可以包括可能罹患神经变性疾病的任意生物，具体而言，可以例示出人、牛、猴、马、猪、羊、山羊、狗、猫、天竺鼠、大鼠、小鼠、兔、仓鼠、鸟等恒温动物。应予说明，如上所述，应用对象与所给予的AIM等的来源优选一致。

本发明的优选的一个方式中，可以制成搭载编码AIM的核酸的病毒载体。针对能够使用的病毒载体等，与“1.神经变性疾病的治疗或预防剂”中说明的相同。

此外，通过本发明的方法治疗或预防的神经变性疾病也与“1.神经变性疾病的治疗或预防剂”中说明的相同。

本发明的方法中的AIM等各成分向对象的给予量只要是治疗和/或预防有效量，则没有特别限定，根据有效成分的种类和形态、对象的年龄和体重、给予日程、以及给予方法等适当最优化即可。

以下的实施例中，进一步具体说明本发明，但本发明不因这些例子而受到任何限定。

实施例

[实施例1]野生型小鼠的脑中的AIM蛋白质的表达的确认

将野生型C57BL/6小鼠(泳道1：野生型)、AIM缺失小鼠(泳道2：AIM-KO)的脑整体在裂解缓冲液中匀浆而制作裂解物，将以蛋白质成分量计20ng与阳性对照的rAIM蛋白质(50ng)一起在SDS-PAGE上分级后，转印至聚偏二氟乙烯(PDVF)膜上，使用抗AIM抗体(兔抗小鼠AIM抗血清)，进行蛋白质印迹法。

结果示于图1。如图1所示那样，野生型小鼠、AIM缺失小鼠均在脑中未确认到AIM的表达。

[实施例2]野生型小鼠的脑的免疫染色

将野生型C57BL/6小鼠的脑组织用4%多聚甲醛固定而进行石蜡块化后，制作包括脑的主要部位在内的4μm厚的切片。脱石蜡处理后，使用抗AIM抗体(兔抗小鼠AIM抗血清：经验证用于免疫染色的抗体)，进行免疫染色，通过使用过氧化物酶反应的DAB显色法，尝试检测。

结果示于图2。如图2所示那样，在野生型小鼠的脑整体中，未确认到AIM的表达。

[实施例3]野生型小鼠的脑中的AIMmRNA的确认

对野生型C57BL/6小鼠(WT)的脑整体(泳道1)、AIM缺失小鼠(AIM-KO)的脑整体(泳道2)、WT小鼠的肝脏(阳性对照、泳道3)、AIM-KO小鼠的肝脏(泳道4)、从WT小鼠新生儿脑分离而增殖的小胶质细胞(泳道5)、该AIM-KO的小胶质细胞(泳道6)，从各自提取RNA，通过定量RT-PCR法分析AIM的表达。将肝脏中的表达设为1，将各样本中的表达设为相对表达而数值化。

结果示于图3。如图3所示那样，野生型小鼠的脑整体、和脑内的小胶质细胞中任一者中均未确认AIM的mRNA的转录。

如果总结实施例1~3的结果，则脑中AIM基因未被转录，此外，可以认为AIM蛋白质被血脑屏障(BBB)阻挡，不会转移至脑内。

[实施例4]AIM向脑内的导入和淀粉样斑块的局部存在

将麻醉下露出头顶部头盖骨的阿兹海默病的模型小鼠、即5XFAD小鼠用立体定位仪(或定位固定装置)固定，向右脑的海马区域，在实体显微镜下显微注射重组小鼠AIM(rAIM、SEQ ID NO: 4)10μg(溶解于PBS 10μL)。3小时后，将脑组织分离，实施4%多聚甲醛固定后，制作冻结切片，使用对AIM(绿)和淀粉样β(Aβ:红)的抗体，通过免疫染色法进行共染色，通过荧光显微镜观察。

结果示于图4。如图4所示那样，向5XFAD小鼠的海马区域导入的重组AIM显示出与淀粉样斑块共同局部存在。

[实施例5]因脑内的AIM的表达而导致的淀粉样斑块的减少

向用立体定位仪(或定位固定装置)固定的8周龄的5XFAD小鼠的脑海马区域，以相同病毒量显微注射表达小鼠AIM的腺相关病毒血清型5(AAV-AIM)和空的AAV5(AAV-模拟物)(n=7~8)。15周后摘出脑，进行4%多聚甲醛固定，将石蜡切片用抗Ab抗体染色，使用NIHimageJ软件测量Aβ阳性部分(淀粉样斑块)的面积。相对于海马整体的面积而言的淀粉样斑块的面积用%表示，用感染了AAV-AIM的小鼠和感染了AAV-模拟物的小鼠进行比较。

结果示于图5。如图5所示那样，感染了表达AIM的腺相关病毒的个体与感染了模拟物AAV的个体相比，淀粉样斑块显著减少(n=7~8、P=0.00048、T检验)。根据本结果显示，通过将AIM蛋白质递送至脑内，能够高效率地减少脑内的异常蛋白质。

[实施例6]利用AIM的结合的多聚体淀粉样β的去除

将N末端用Cy5标记的Ab(淀粉样β)42肽(Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala:SEQ ID NO: 3)多聚体化，在从AIM-KO小鼠新生儿脑分离、培养的小胶质细胞细胞集团中小鼠rAIM(50mg/mL)有(+rAIM)无(+PBS)的条件下，在DMEM培养基+10%FBS中进行37℃、1小时反应。将细胞洗涤后，用抗F4/80抗体染色，用流式细胞仪分析。

结果示于图6。分析F4/80高阳性的小胶质细胞中的Cy5的荧光强度、即多聚体Ab42的摄取度的结果是，在rAIM存在的条件下，与不存在的情况相比，Cy5阳性的小胶质细胞显著(16%→84%)增加。即，显示出利用AIM标记作为异常蛋白质的多聚体Ab42，由此利用小胶质细胞的多聚体Ab42的摄取显著亢进。

虽然不期望受理论约束，但可以认为以上的结果是指下述那样的机理。即，通常在脑中不存在AIM。因此，即使成为阿兹海默病的原因的多聚体淀粉样β蓄积，小胶质细胞也无法高效率地将其去除。然而，如果使用某种方法将AIM递送至脑内或在脑内表达，则AIM标记多聚体淀粉样β作为异常蛋白质。由此，小胶质细胞能够高效率地去除多聚体淀粉样β，其结果是实现了阿兹海默病的治疗或预防。

[实施例7]利用AIM的表达的Aβ(淀粉样)斑块面积的减少

将5xFAD小鼠与在人PDGF-B启动子下在脑神经细胞中表达小鼠AIM的转基因小鼠(TG)交配，制作不具有转运蛋白的(Non-TG)5xFAD小鼠和具有转运蛋白的(TG(+))5xFAD小鼠。应予说明，在人PDGF-B启动子下在脑神经细胞中表达小鼠AIM的转基因小鼠(TG)的制作中使用的转运蛋白的映射示于图9。应予说明，人PDGF-B启动子序列(XbaI-HindIII)(SEQID NO: 6)在“PDGF B-chain in neurons of the central nervous system, posteriorpituitary, and in a transgenic model. Sasahara M, Fries JW, Raines EW, GownAM, Westrum LE, Frosch MP, Bonthron DT, Ross R, Collins T. Cell. 1991 Jan 11;64(1):217-227.”中详细描述。

在7周龄的时点，比较这些小鼠中的相对于脑整体而言的Aβ(淀粉样)斑块面积(%)。其结果示于图7。如图7所示那样，在TG(+)5xFAD小鼠中确认到显著的斑块的减少(T-检验)。

[实施例8]脑组织中的AIM与Aβ(淀粉样)斑块的共同局部存在

将7周龄的、Non-TG 5xFAD小鼠、TG(+)5xFAD小鼠、和野生型C57BL/6小鼠的脑组织分离而制作切片。通过使用对AIM(红)和Aβ(绿)的抗体的免疫染色法，进行AIM和Aβ的共染色，用荧光显微镜观察这些蛋白质的局部存在。结果示于图8。如图8所示那样，TG(+)5xFAD小鼠中，AIM与Aβ斑块共同局部存在的部分被大量观察到(上图：红与绿重叠而形成黄色的部分、以及红与绿在相同部位观察到的部分)。应予说明，照片是海马区域，但在脑整体中确认到这样的AIM与Aβ斑块的共同局部存在。

工业实用性

根据本发明，能够治疗和/或预防以阿兹海默病为首的神经变性疾病，因此在医疗领域中是极其有用的。

本申请以在日本提交的日本特愿2018-186759(申请日：2018年10月1日)为基础，其内容整体包括在本说明书中。

序列表

<110> 宮崎彻

<120> 神经变性疾病治疗剂

<130> 092953

<150> JP2018-186759

<151> 2018-10-01

<160> 6

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 347

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Ala Leu Leu Phe Ser Leu Ile Leu Ala Ile Cys Thr Arg Pro Gly

1 5 10 15

Phe Leu Ala Ser Pro Ser Gly Val Arg Leu Val Gly Gly Leu His Arg

20 25 30

Cys Glu Gly Arg Val Glu Val Glu Gln Lys Gly Gln Trp Gly Thr Val

35 40 45

Cys Asp Asp Gly Trp Asp Ile Lys Asp Val Ala Val Leu Cys Arg Glu

50 55 60

Leu Gly Cys Gly Ala Ala Ser Gly Thr Pro Ser Gly Ile Leu Tyr Glu

65 70 75 80

Pro Pro Ala Glu Lys Glu Gln Lys Val Leu Ile Gln Ser Val Ser Cys

85 90 95

Thr Gly Thr Glu Asp Thr Leu Ala Gln Cys Glu Gln Glu Glu Val Tyr

100 105 110

Asp Cys Ser His Asp Glu Asp Ala Gly Ala Ser Cys Glu Asn Pro Glu

115 120 125

Ser Ser Phe Ser Pro Val Pro Glu Gly Val Arg Leu Ala Asp Gly Pro

130 135 140

Gly His Cys Lys Gly Arg Val Glu Val Lys His Gln Asn Gln Trp Tyr

145 150 155 160

Thr Val Cys Gln Thr Gly Trp Ser Leu Arg Ala Ala Lys Val Val Cys

165 170 175

Arg Gln Leu Gly Cys Gly Arg Ala Val Leu Thr Gln Lys Arg Cys Asn

180 185 190

Lys His Ala Tyr Gly Arg Lys Pro Ile Trp Leu Ser Gln Met Ser Cys

195 200 205

Ser Gly Arg Glu Ala Thr Leu Gln Asp Cys Pro Ser Gly Pro Trp Gly

210 215 220

Lys Asn Thr Cys Asn His Asp Glu Asp Thr Trp Val Glu Cys Glu Asp

225 230 235 240

Pro Phe Asp Leu Arg Leu Val Gly Gly Asp Asn Leu Cys Ser Gly Arg

245 250 255

Leu Glu Val Leu His Lys Gly Val Trp Gly Ser Val Cys Asp Asp Asn

260 265 270

Trp Gly Glu Lys Glu Asp Gln Val Val Cys Lys Gln Leu Gly Cys Gly

275 280 285

Lys Ser Leu Ser Pro Ser Phe Arg Asp Arg Lys Cys Tyr Gly Pro Gly

290 295 300

Val Gly Arg Ile Trp Leu Asp Asn Val Arg Cys Ser Gly Glu Glu Gln

305 310 315 320

Ser Leu Glu Gln Cys Gln His Arg Phe Trp Gly Phe His Asp Cys Thr

325 330 335

His Gln Glu Asp Val Ala Val Ile Cys Ser Gly

340 345

<210> 2

<211> 1044

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

atggctctgc tattctcctt gatccttgcc atttgcacca gacctggatt cctagcgtct 60

ccatctggag tgcggctggt ggggggcctc caccgctgtg aagggcgggt ggaggtggaa 120

cagaaaggcc agtggggcac cgtgtgtgat gacggctggg acattaagga cgtggctgtg 180

ttgtgccggg agctgggctg tggagctgcc agcggaaccc ctagtggtat tttgtatgag 240

ccaccagcag aaaaagagca aaaggtcctc atccaatcag tcagttgcac aggaacagaa 300

gatacattgg ctcagtgtga gcaagaagaa gtttatgatt gttcacatga tgaagatgct 360

ggggcatcgt gtgagaaccc agagagctct ttctccccag tcccagaggg tgtcaggctg 420

gctgacggcc ctgggcattg caagggacgc gtggaagtga agcaccagaa ccagtggtat 480

accgtgtgcc agacaggctg gagcctccgg gccgcaaagg tggtgtgccg gcagctggga 540

tgtgggaggg ctgtactgac tcaaaaacgc tgcaacaagc atgcctatgg ccgaaaaccc 600

atctggctga gccagatgtc atgctcagga cgagaagcaa cccttcagga ttgcccttct 660

gggccttggg ggaagaacac ctgcaaccat gatgaagaca cgtgggtcga atgtgaagat 720

ccctttgact tgagactagt aggaggagac aacctctgct ctgggcgact ggaggtgctg 780

cacaagggcg tatggggctc tgtctgtgat gacaactggg gagaaaagga ggaccaggtg 840

gtatgcaagc aactgggctg tgggaagtcc ctctctccct ccttcagaga ccggaaatgc 900

tatggccctg gggttggccg catctggctg gataatgttc gttgctcagg ggaggagcag 960

tccctggagc agtgccagca cagattttgg gggtttcacg actgcaccca ccaggaagat 1020

gtggctgtca tctgctcagg atag 1044

<210> 3

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 淀粉样β42

<400> 3

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

35 40

<210> 4

<211> 352

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 4

Met Ala Pro Leu Phe Asn Leu Met Leu Ala Ile Leu Ser Ile Phe Val

1 5 10 15

Gly Ser Cys Phe Ser Glu Ser Pro Thr Lys Val Gln Leu Val Gly Gly

20 25 30

Ala His Arg Cys Glu Gly Arg Val Glu Val Glu His Asn Gly Gln Trp

35 40 45

Gly Thr Val Cys Asp Asp Gly Trp Asp Arg Arg Asp Val Ala Val Val

50 55 60

Cys Arg Glu Leu Asn Cys Gly Ala Val Ile Gln Thr Pro Arg Gly Ala

65 70 75 80

Ser Tyr Gln Pro Pro Ala Ser Glu Gln Arg Val Leu Ile Gln Gly Val

85 90 95

Asp Cys Asn Gly Thr Glu Asp Thr Leu Ala Gln Cys Glu Leu Asn Tyr

100 105 110

Asp Val Phe Asp Cys Ser His Glu Glu Asp Ala Gly Ala Gln Cys Glu

115 120 125

Asn Pro Asp Ser Asp Leu Leu Phe Ile Pro Glu Asp Val Arg Leu Val

130 135 140

Asp Gly Pro Gly His Cys Gln Gly Arg Val Glu Val Leu His Gln Ser

145 150 155 160

Gln Trp Ser Thr Val Cys Lys Ala Gly Trp Asn Leu Gln Val Ser Lys

165 170 175

Val Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys Gly Arg Ala Leu Leu Thr Tyr Gly

180 185 190

Ser Cys Asn Lys Asn Thr Gln Gly Lys Gly Pro Ile Trp Met Gly Lys

195 200 205

Met Ser Cys Ser Gly Gln Glu Ala Asn Leu Arg Ser Cys Leu Leu Ser

210 215 220

Arg Leu Glu Asn Asn Cys Thr His Gly Glu Asp Thr Trp Met Glu Cys

225 230 235 240

Glu Asp Pro Phe Glu Leu Lys Leu Val Gly Gly Asp Thr Pro Cys Ser

245 250 255

Gly Arg Leu Glu Val Leu His Lys Gly Ser Trp Gly Ser Val Cys Asp

260 265 270

Asp Asn Trp Gly Glu Lys Glu Asp Gln Val Val Cys Lys Gln Leu Gly

275 280 285

Cys Gly Lys Ser Leu His Pro Ser Pro Lys Thr Arg Lys Ile Tyr Gly

290 295 300

Pro Gly Ala Gly Arg Ile Trp Leu Asp Asp Val Asn Cys Ser Gly Lys

305 310 315 320

Glu Gln Ser Leu Glu Phe Cys Arg His Arg Leu Trp Gly Tyr His Asp

325 330 335

Cys Thr His Lys Glu Asp Val Glu Val Ile Cys Thr Asp Phe Asp Val

340 345 350

<210> 5

<211> 1059

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 5

atggctccat tgttcaactt gatgctggcc atcttgagca tttttgttgg atcgtgtttt 60

tcagagtctc caaccaaagt gcagctagtg ggaggtgccc accgctgtga agggcgagtg 120

gaggtggaac acaatggcca gtgggggact gtgtgtgatg atggctggga ccggcgtgat 180

gtggctgtgg tgtgccgaga gctcaattgt ggagcagtca tccaaacccc gcgtggcgca 240

tcatatcagc caccagcatc agagcaaaga gttcttattc aaggggttga ctgcaacgga 300

acggaagaca cgttggctca atgtgagcta aattacgatg tttttgactg ctcacatgaa 360

gaagatgctg gggcacagtg tgagaaccca gacagtgacc tcctcttcat tccagaggat 420

gtgcgtctag tagatggccc ggggcactgc cagggtcgag tggaggtgct ccaccagtcc 480

cagtggagca ctgtgtgtaa agcaggctgg aacttacagg tctcaaaggt ggtgtgcagg 540

cagctcgggt gtgggcgggc attactgacc tacggaagct gcaacaagaa tactcagggc 600

aaaggaccca tctggatggg caagatgtcg tgttctggac aagaagcaaa ccttcggtct 660

tgccttttga gtcgtttgga gaacaactgt acccatggcg aggacacatg gatggaatgt 720

gaagatcctt ttgagctgaa gctggtggga ggagacaccc cctgctctgg gaggttggag 780

gtgctgcaca agggttcctg gggctccgtc tgtgatgaca actggggaga aaaggaggac 840

caagtggtct gcaagcaact gggttgtggg aagtccctcc atccatcccc caaaacccgg 900

aaaatctatg ggcctggggc aggccgcatc tggctggatg acgtcaactg ctcagggaag 960

gaacagtctc tggagttctg ccggcacagg ttgtgggggt accacgactg tacccacaag 1020

gaagatgtgg aggtgatctg cacagacttt gatgtgtga 1059

<210> 6

<211> 1497

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人PDGF-B启动子序列 (Xba I - Hind III)

<400> 6

tctagaggat ccacagtctc ctgagtagct gggactacag gagcttgtta ccacacccag 60

ctccagttta taaattcatc tccagtttat aaaggaggaa accgaggtac tgagaggtta 120

aaaaaccttc ctgcagacac ttgtccagca agtggccact ccaggatttg gaccaaggtg 180

atgtgtcttc aggctgtgtc tctgccactg tgccacgctg ctgggtggta ggcagcagtg 240

ggtgggtgcc tgcagtggtc tgtaaagacc acctgagatg tccttcctcc tctgttccac 300

cctgtccagg tccaagaaga cagtctatga agagagagca ggtgtgactc tctcagtgtg 360

ctcctctgtg agaagcaggc tgacatccca aagggaaggg cggataacag agacagtgca 420

agcggaggag atgagggtgc ctcaaagccg ggaggctggg tgatgcagga gcctgcgtgt 480

cccgaggggg gtgctgggcc cagtgtgagt acgtgtgact gtgactgaga cagtgtgact 540

gctgaaggca gggacacagc agctccctga ctgggggcag aaggcgttaa ctgtgtgaag 600

gctggttgtg ggtgggtggg ctctgggcct cgaacccggg ggctgaggga gatagtaaac 660

agcagggtga ctgacgggaa gatcatgttg gtagccctgc gaagatgctg cagggctgtg 720

ggggtttgtg tgactttgca gttcaacaaa ttcaaattca gccaacgctg gcagggcctg 780

ttgtgccagg caaccagcta ggaggaggag actcggaccc agcttgcagc tgaagggcgc 840

tggctgccgg gttctgtggg ttcaccttgc ggtgtcttcc cttgctaaca ctgagtcctt 900

acaatagccc catctccagg ttgaggctag atggagggga cagagggaag tgacttgccc 960

aaggtgaccc aaactcccga gtgccagggc aggatctgaa ttcaggctct cagactgcag 1020

agcctgagtc cctccctgcc atgcctgtgc cagggtggaa atgtctggtc ctggagggga 1080

gcgtggactc ctggccttgg ctctggagac atccccctag accacgtggg ctcctaacct 1140

gtccatggtc actgtgctga ggggcgggac ggtgggtcac ccctagttct tttttcccca 1200

gggccagatt catggactga agggttgctc ggctctcaga gaccccctaa gcgccccgcc 1260

ctggccccaa gccctccccc agctcccgcg tcccccccct cctggcgctg actccgggcc 1320

agaagaggaa aggctgtctc cacccacctc tcgcactctc ccttctcctt tataaaggcc 1380

ggaacagctg aaagggtggc aacttctcct cctgcagccg ggagcggcct gcctgcctcc 1440

ctgcgcaccc gcagcctccc ccgctgcctc cctagagtcg acctgcagcc caagctt 1497

Claims

1.神经变性疾病的治疗或预防剂，其包含巨噬细胞凋亡抑制剂(AIM)、具有AIM的生物学活性的AIM片段、或编码该AIM或AIM片段的核酸。

2.根据权利要求1所述的治疗或预防剂，其特征在于，编码AIM或AIM片段的核酸被整合至病毒载体中。

3.根据权利要求2所述的治疗或预防剂，其中，病毒载体为选自腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、和仙台病毒中的病毒载体。

4.根据权利要求3所述的治疗或预防剂，其中，病毒载体为腺相关病毒。

5.根据权利要求4所述的治疗或预防剂，其中，腺相关病毒为AAV血清型5(AAV5)或AAV血清型9(AAV9)。

6.根据权利要求1~5中任一项所述的治疗或预防剂，其中，神经变性疾病选自阿兹海默病、帕金森病、莱维小体型认知症、前额颞型认知症、多系统萎缩症、皮克氏病、大脑皮质基底核变性症、进行性核上性麻痺、肌肉萎缩性侧索硬化症、脊髄延髓性肌肉萎缩症、脊髄性进行性肌肉萎缩症、亨廷顿氏病、脊髄小脑变性症、海马硬化症、进行性肌阵挛性癫痫、和齿状核红核苍白球路易体萎缩症。

7.神经变性疾病的治疗或预防方法，其包括将AIM、具有AIM的生物学活性的AIM片段、或编码该AIM或AIM片段的核酸向对象给予。

8.根据权利要求7所述的治疗或预防方法，其特征在于，编码AIM或AIM片段的核酸被整合至病毒载体中。

9.根据权利要求8所述的治疗或预防方法，其中，病毒载体为选自腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、和仙台病毒中的病毒载体。

10.根据权利要求8所述的治疗或预防方法，其中，病毒载体为腺相关病毒。

11.根据权利要求10所述的治疗或预防方法，其中，腺相关病毒为AAV血清型5(AAV5)或AAV血清型9(AAV9)。

12.根据权利要求7~11中任一项所述的治疗或预防方法，其中，神经变性疾病选自阿兹海默病、帕金森病、莱维小体型认知症、前额颞型认知症、多系统萎缩症、皮克氏病、大脑皮质基底核变性症、进行性核上性麻痺、肌肉萎缩性侧索硬化症、脊髄延髓性肌肉萎缩症、脊髄性进行性肌肉萎缩症、亨廷顿氏病、脊髄小脑变性症、海马硬化症、进行性肌阵挛性癫痫、和齿状核红核苍白球路易体萎缩症。