KR102089716B1 - 대식세포 사멸 억제인자의 조절제를 포함하는 염증질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대식세포 사멸 억제인자(Apoptosis inhibitor of macrophage, AIM)의 조절제를 포함하는 염증질환의 예방 및 치료용 조성물 및 상기 AIM 조절제 또는 염증 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, IL-10과 AIM의 작용 기작연구 및 염증치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

대식세포 사멸 억제인자의 조절제를 포함하는 염증질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition for treating or preventing inflammatory diseases including a regulator of Apoptosis inhibitor of macrophage}

본 발명은 대식세포 사멸 억제인자(Apoptosis inhibitor of macrophage, AIM)의 조절제를 포함하는 염증질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 조절제는 AIM 활성 또는 발현 수준을 증가시키는 것으로서, 대식세포의 인플라마좀의 활성을 억제하여, 인플라마좀의 과활성에 의한 염증질환의 치료 또는 예방을 위한 항염증 조성물 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

다세포 생물의 생존에 있어 미생물(Microorganism)의 침입 방지는 필수적이다. 인간의 신체는 유해한 병원체의 완벽한 제거를 위해, 미생물을 감지하고 파괴하기 위한 방어 기전이 견고히 갖추고 있다. 선천적 면역체계(innate immunity system)는 잠재적으로 위험한 미생물을 인식하고 제거하는 일을 담당하며, 미생물침입시 빠르게 활성화 되고 광범위한 항균기능을 나타낸다(Nature Immunol. 2009 Mar; 10(3):241). 이러한 염증반응(Inflammation)은 숙주방어 기전의 중요한 반응으로 초기 세포손상의 억제와 함께 손상된 부분의 제거, 신속한 재생과 회복에 이르도록 하기 위한 목적을 가진다.

염증은 면역조절 세포, 사이토카인, 세포자살(apoptosis) 등이 관여하는 면역조절 기작이 유해 성분을 막기 위해 일으키는 과도한 반응을 의미하며, 면역 반응을 조절한다. 이러한 면역조절 매커니즘이 결핍될 경우, 부적절한 염증 반응이 일어나 자가면역 질환, 천식, 동맥경화, 당뇨병, 알츠하이머 질환 등과 같은 광범위한 질병을 유발한다. 따라서, 염증 반응을 조절하여 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 항염증 조성물에 대한 연구가 요구되고 있는 상황이다.

인플라마좀(Inflammasome)은 caspase-1의 활성에 의해 선천성 면역의 기능을 조절할 수 있는 플랫폼으로 면역세포에서 항염증사이토카인인 IL-1β, IL-18의 단백질 분해 및 분비과정을 증가시킨다(Nature Medicine 2016 vol22(6) 1002). NLRP1, NLRP3, NLRC4인 Nod-like receptor family와 ASC adaptor 단백질과 같은 인플라마좀에 중요한 구성요소들은 미생물 및 내인성 위험 신호를 caspase-1의 활성화에 전달시키는 중요한 구성성분이다. 몇 가지 질병은 caspase-1과 IL-1β의 분비 장애로 인한 활성화와 관련되어 있음이 밝혀졌으며, 인플라마좀의 경로는 염증 관련 질병치료를 위한 잠재적 표적이 될 수 있다(Nature Immunol. 2009 Mar; 10(3):241). 이에, 인플라마좀 경로를 조절하는 염증 관련 질환 치료제에 관한 연구 및 새로운 염증치료제가 필요한 실정이다.

대식세포 사멸 억제인자(Apoptosis inhibitor of macrophage; AIM; encoded by Cd51)는 scavenger receptor cystein-rich (SRCR) family로 대식세포의 생존에 중요한 인자이며 (J. Exp. Med. 189, 413-422 (1999)), 대식세포에서 많이 발현되는 분비단백질이다. AIM은 혈액내로 분비되어 IgM과 pentamer 이루는 형태로 다수 존재한다 (PLoS One 9, e109123 (2014)). AIM은 lipopolysaccaride, 세포질의 fatty acid synthase, complement activation의 다양한 조절자와 결합하는 것으로 알려져 있다 (J. Biol. Chem. 280, 35391-35398 (2005), Cell Metab. 11, 479-492 (2010), Cell Reports 9, 61-74 (2014)). AIM은 대식세포에서 LXR(Liver X Receptor)와 RXR(Retinoid X receptor)의 핵수용체의 이합체에 의해 조절되어지는 것으로 알려져 있으나 (Cell Metab. 1, 201-213 (2005), Cell 119, 299-309 (2004)), 아직까지 생체내에서 어떠한 인자에 의해 발현이 조절되는지는 알려진 바가 없다.

최근 인플라마좀의 생리학적 중요성이 알려지고 있음에도 불구하고, 다양한 자극에 대한 반응으로 인플라마좀이 활성화되고 조절되는지에 관한 분자적 메커니즘은 아직도 잘 알려져 있지 않다. 특히, IL-10(Interleukin-10)의 발현 증가에 따른 AIM의 발현증가와 AIM에 의한 인플라마좀의 억제 및 이로 인한 항염효과에 관한 메커니즘에 관해서는 전혀 알려진 바가 없다.

본 발명의 목적은 대식세포 사멸 억제인자(Apoptosis inhibitor of macrophage, AIM)의 조절제를 포함하는 염증질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은, AIM의 조절제를 이용하여 대식세포의 인플라마좀 활성을 억제하여, 인플라마좀의 과활성에 의한 염증질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 생물학적 샘플에 염증질환의 치료 또는 예방용 조성물의 후보 물질을 처리한 후 AIM의 발현량 및 인플라마좀의 활성을 측정하여 인플라마좀의 과활성에 의한 염증질환의 치료 또는 예방을 위한 약물을 스크리닝 방법을 제공하는데 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대식세포 사멸 억제인자(Apoptosis inhibitor of macrophage, AIM)의 유전자의 발현 수준 또는 단백질 활성 수준을 증가시키는 AIM 조절제를 유효성분으로 포함하는, 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 상기 본 발명의 조성물로 염증질환의 예방 또는 치료를 달성할 수 있음을 확인하고, 구체적으로 AIM 조절제로서 AIM 유전자의 발현 촉진제, AIM 단백질의 활성 촉진제, STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 인산화 촉진제, 인산화된 STAT3, LXRα(Liver X receptor alph)/RXRα(Retinoid X receptor alpha), T0901317(LXR 리간드), AIM 단백질 또는 이의 단편, 및 IL-10으로 이루어진 군에서 선택된 것이 대식세포의 인플라마좀의 활성을 억제함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따른 염증 질환은, 구체적으로 인플라마좀의 과활성에 의한 염증질환으로서, 본 발명에 따른 AIM의 조절제, 바람직하게는 AIM 유전자 발현 또는 단백질 활성의 촉진제는 대식세포의 인플라마좀의 활성을 억제하여, 인플라마좀의 과활성에 의한 염증질환의 치료 또는 예방할 수 있다.

본 발명에 따른 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물은 항염 인자의 분비를 촉진하고 염증 인자의 분비를 억제할 수 있으며, 상기 항염인자 및 염증인자는 사이토카인일 수 있고, 그 예로 인터루킨-1 베타(interleukin-1 beta; IL-1β)의 분비를 억제하여 인플라마좀의 활성을 억제하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물은 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)에 의존적이며, 구체적으로, 본 발명의 항염증 조성물은 STAT3에 의존적이나, STAT1에는 비의존적일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면, 상기 STAT3은 AIM의 프로모터(Ensemble site : https://asia.ensembl.org/index.html, Transcription ID : ENSMUST00000015998.7 의 5' Upstream sequence) 에 직접적으로 결합하여, AIM의 발현을 촉진할 수 있다. 바람직하게는 STAT3은 AIM 프로모터의 -6942 내지 -6920 부위, 또는 -2550 내지 -2426 부위, 또는 이 두 부위 모두에 직접 결합하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 대식세포는 골수유래 대식세포(Bone marrow derived macrophage; BMDM)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 항염증 조성물로 예방 및 치료 가능한 염증질환은 인플라마좀의 과활성에 의해 발생하는 염증질환으로 바람직하게는, 치주염, 구내염, 복막염, 위염, 장염, 관절염, 신장염, 및 간염중 선택된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 염증질환은 천식, 급성신부전, 동맥경화, 2형 당뇨, 비만, 비알콜성 지방간, 및 퇴행성 뇌질환으로 구성된 군에서 선택되는 질환에 의한 염증인 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면, 상기 AIM 조절제로서 AIM 유전자의 발현 촉진제, AIM 단백질의 활성 촉진제, STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 인산화 촉진제, 인산화된 STAT3, LXRα(Liver X receptor alph)/RXRα(Retinoid X receptor alpha), T0901317(LXR 리간드), AIM 단백질 또는 이의 단편, 및 IL-10으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이상 일 수 있으며, 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 용이하게 실시할 수 있는 공지된 AIM 발현 촉진제, AIM 단백질의 활성 촉진제가 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 AIM 유전자 발현 촉진제는 인산화된 STAT3 의존적일 수 있으며, 인산화된 STAT3가 AIM 프로모터에 직접 결합해 AIM의 발현이 촉진되는 것일 수 있고, AIM 유전자 발현 촉진제는 AIM의 프로모터를 활성화시켜 AIM의 단백질 발현을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면, 상기 STAT3 인산화 촉진제는 IL-10 및 IFL-γ(interferon gamma) 중 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 IL-10일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 일반적으로 알려진 STAT3 인산화 촉진제를 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, 상기 AIM 단백질 단편은 서열번호 28번의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있고, 기능면에서는 AIM 단백질과 차이가 없는 단백질인 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 인플라마좀은 그 종류를 특별히 한정하지 않으나, NLRP3 인플라마좀(NOD-like receptor protein 3 inflammasome)일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 공지된 방법에 따라, 약학으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여, 용액, 현탁액, 에멀젼, 겔, 분말 등의 제형으로 제제화함으로써 단위용량의 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 상기의 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 아카시아 고무, 인산칼슘, 젤라틴, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸하이드록시벤조에이트, 활석, 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 항염증 조성물은 파라옥시안식향산메틸, 솔빈산칼륨 등과 같은 방부제, 안정화제, 매실향, 레몬향 등의 천연향료, 클로로필린 등의 천연색소, 과당, 벌꿀, 설탕 등과 같은 감미료, 염료, 항-산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항염증 조성물을 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국부 투여용으로 제형화하는 것을 특징으로 할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제 등이 있으며, 비수성용제 또는 현탁제의 제조를 위해 프로필렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으며, 좌제의 기제로 위텝솔, 마크로골, 카카오지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항염증 조성물의 적합한 투여량은 증상의 경중도, 환자의 체중, 연령, 성, 투여 방식 및 투여 시간 등과 같은 요인들에 의해 다양하게 결정되며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명의 항염증 조성물은 개별 치료제로 투여하거나, 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

본 발명은 (a) 염증성 질환을 갖는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에 후보물질을 처리하는 단계; (b) AIM의 발현량 및 인플라마좀의 활성을 측정하는 단계; 및 (C) AIM의 발현량을 증가시키고, 인플라마좀의 활성을 억제시키는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는, 인플라마좀 과활성에 의한 염증질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, 상기 (a)단계에서 LPS(리포폴리사카라이드) 또는/및 ATP를 추가로 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 LPS 및 ATP를 추가로 처리함으로써 염증반응을 유발할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 예는 대식세포에서 인산화된 STAT3의 AIM 프로모터의 결합을 촉진해, 대식세포의 AIM 발현을 촉진하는 방법을 제공할 수 있다.

바람직하게는, 상기 인산화된 STAT3가 AIM 프로모터의 -6942 내지 -6920 부위, 또는 -2550 내지 -2426 부위, 또는 이 두 부위 전부에 결합을 촉진해 대식세포의 AIM 발현을 촉진하는 것일 수 있다.

본 발명자들은 아래 제조예 및 실시예를 통해 대식세포에서 IL-10 신호전달의 중요한 매개체인 STAT3의 발현을 억제하거나 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) inhibitor를 처리했을 때, IL-10에 의한 AIM의 발현이 증가하지 않음을 확인하면서, IL-10에 의한 AIM의 발현 증가는 STAT3가 매개함을 밝혔다. 다음으로, STAT3가 직접적으로 AIM의 발현을 증가시키는 지 확인하기 위해 인산화 STAT3 항체를 이용하여 AIM의 프로모터 부위에 직접 결합하는 지를 ChIP assay를 수행하였다. 그 결과, AIM의 프로모터의 -6942 ~ -6920 부위와 -2550 ~ -2426 부위에 STAT3가 직접 결합하는 것을 확인하였다. 또한 -7000 부위를 포함하는 AIM 프로모터 리포터 luciferase activity가 IL-10이 존재하는 상황에서 STAT3에 의해 dose-dependent하게 증가하는 것을 확인하였으며, -7000/+121, -3000/+121, -500/+121 AIM 프로모터 리포터를 이용하여, serial 하게 STAT3에 의한 AIM 프로모터 luciferase activity가 감소하는 것을 확인하면서 AIM 프로모터의 STAT3 결합 위치를 재확인하였다.

다음으로, IL-10에 의해 증가된 AIM이 Cytokine의 분비에 미치는 영향을 확인하기 위해, 정상 마우스와 AIM 유전자소실 마우스(AIM KO)로부터 얻은 일차대식세포에 LPS와 IL-10을 처리하였다. LPS에 의해 유도되는 염증사이토카인 중 IL-10에 의한 TNFα 분비억제 효과가 AIM KO마우스에서도 동일하게 나타난 반면 IL-1β는 IL-10에 의한 분비억제 효과가 AIM KO 마우스에서는 나타나지 않음을 확인하였다. 이에 따라, IL-1β 분비에 주요한 메커니즘인 inflammasome에 AIM이 관련이 있음을 확인하였다.

본 발명자들은 염증반응이 과도하게 일어나 있는 IL-10 KO 마우스와 정상 마우스로부터 분리한 일차대식세포를 이용해 AIM 단백질 단편인, recombinant AIM protein(rAIM)을 전 처리 한 후 LPS와 ATP를 처리하여 inflammasome을 유도하면 rAIM에 의해 IL-1β의 분비가 감소하였으며 cleaved caspase-1의 양도 감소함을 확인하였다. 이때 IL-1β의 발현이 AIM에 의해 변화되지 않음을 확인하였으며, 위의 결과를 통해 IL-10에 의해 증가된 AIM은 anti-inflammasome 효과가 있음을 밝혔다.

실제로 inflammasome 형성 정도를 확인하기 위해 ASC Speck formation assay를 통해 ASC를 염색해서 Speck의 개수를 확인하였으며, 그 결과 rAIM은 LPS/ATP에 의해 형성되는 ASC speck형성을 감소시키는 것을 확인하였고 정상마우스의 경우, IL-10에 의해 ASC speck형성이 감소되었으나, AIM KO마우스로부터 분리한 일차대식세포에서는 IL-10에 의해 Speck형성 감소가 나타나지 않음을 확인함에 따라 IL-10에 의한 anti-inflammasome 형성에 AIM이 중요한 역할을 담당하는 것을 밝혔다.

따라서, 대식세포에서 IL-10에 의해 증가되는 STAT3 인산화는 직접적으로 AIM 프로모터에 결합하여 AIM의 발현을 증가시키고, 증가된 AIM은 IL-1β의 분비를 억제함으로써 anti-inflammasome의 효과를 가지는 것으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 대식세포 사멸 억제인자(Apoptosis inhibitor of macrophage, AIM)의 유전자발현 수준 또는 단백질 활성 수준을 증가시키는 AIM 조절제를 유효성분으로 포함하고, 대식세포의 인플라마좀 활성을 억제하여 인플라마좀의 과활성에 의한 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물 제공하며, 본 발명의 조성물은 염증 완화 또는 치료 효과가 우수하므로, 염증치료제 또는 건강기능식품으로 사용가능하고, 본 발명의 스크리닝 방법은 IL-10, STAT3, AIM 작용 기작 연구 및 염증 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 실시예 1에 따라 골수유래 대식세포(Bone marrow derived macrophage; BMDM)에 IL-10 처리시 AIM의 발현여부 및 시간에 따른 AIM의 단백질 발현량의 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예 2에 따라 BMDM에 IL10 처리 시, AIM의 mRNA 발현량의 증가 여부 및 시간에 따른 AIM mRNA의 발현량의 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 실시예 3에 따라 STAT1과 STAT3의 발현억제 및 활성억제를 통한 대식세포에서 AIM의 발현변화를 확인한 결과를 나타낸다. 도 3의 (A)는 STAT1의 발현을 억제하였을 경우 BMDM에서 IL-10에 의한 AIM의 발현억제 효과가 없음을 나타내며, 도 3의 (B)는 siSTAT3로 STAT3의 발현을 억제 시 IL-10에 의한 AIM의 발현 억제 효과가 나타남을 보여주는 결과이고, 도 3의 (C)는 STAT3의 인산화를 억제하는 5,15-DPP약물을 처리시 IL-10에 의한 AIM의 발현억제 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 4에 따라, IL-10 처리에 의해 증가하는 AIM 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터에서 STAT3의 결합위치를 확인한 결과이다. 도 4의 (A)는 AIM을 암호화하는 유전자 프로모터 시퀀스에서 JASPER가 STAT3가 결합하는 AIM 유전자 서열로 제시한 TTCCNGGAAN(서열번호 13) 및 STAT3의 결합을 잘하는 위치로 알려진 GAS 서열 TTCNNNNGAA(서열번호 14) 와 75% 유사도를 갖는 6개의 STAT3 결합 예상위치(Loca.1 ~ Loca.6)를 나타낸 것이다. 도 4의 (B)는 AIM 프로모터 유전자의 Loca 1 ~ Loca 6 부위를 실시예 1-3의 방법을 사용해 Real time PCR을 수행하였으며 증폭결과를 나타낸다.
도 5는 실시예 5에 따라, IL-10이 존재할 시, STAT3에 의한 AIM 프로모터의 활성도를 측정한 결과를 나타낸다. 도 5의 (A)는 mCd5l-7000/+121 luciferase reporter, mCd5l-3000/+121, mCd5l-500/+121 luciferase reporter construct를 나타낸다. 도 5의 (B)는 STAT3의 발현량 증가에 따른 AIM 프로모터의 활성도 증가 결과를 나타낸다. 도 5의 (C)는 loca. 4와 loca. 6이 AIM 프로모터를 활성화시키는 STAT3 결합부위임을 나타낸다.
도 6은 실시예 6에 따라, IL-10에 의한 IL-1β TNFα 사이토카인 분비 억제에 있어 AIM이 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7a는 실시예 7-1에 따라, recombinant AIM의 anti-inflammasome 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7b는 실시예 7-2에 따라, recombinant AIM(rAIM) 전 처리시 IL-1β의 분비변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 실시예 7-3에 따라, rAIM 전처리가 IL-1β, TNFα , NLRP3의 mRNA 발현에 미치는 효과를 확인한 결과이다.
도 9a는 실시예 7-4에 따라, rAIM의 ASC speck formation 억제 효과를 immunofluorescence 실험을 통해 확인한 결과이다.
도 9b는 실시예 7-4에 따라, rAIM의 ASC speck formation 억제 효과를 confoal microscopic을 통해 무작위적 위치 8군데 촬영한 후, 형성된 ASC Speck 개수를 측정하고 전체 세포 대비 %를 구하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 10a는 실시예 7-5에 따라, IL-10에 의한 inflammasome 억제효과가 AIM에 의해 매개됨을 immunofluorescence 수행해 확인한 결과를 나타낸다.
도 10b는 실시예 7-5에 따라, IL-10에 의한 inflammasome 억제효과가 AIM에 의해 매개됨을 confoal microscopic을 통해 마우스 한 마리당 무작위적 위치 3-4군데 촬영한 후, 형성된 ASC Speck (Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD Speck) 개수를 측정하고 평균값을 전체 세포 대비 %를 구하여 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 제조예와 실시예로 자세히 설명한다. 단 아래의 제조예와 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 아래 제조예 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 재료 및 방법

1-1. 시약

재조합 단백질 IL-10(417-ML-005 for cell experiment, 417-ML-025/CF for animal experiment), IL-6 (406-ML-005), IL-4 (404-ML-010), 및 CD5L(Recombinant AIM; 2834-CL-050)은 R&D systems에서 구매하였다. Adenosine 5'-triphosphate disodium salt (ATP, A6419) 및 Lipopolysaccharide (LPS, Escherichia coli serotype 055:B5)은 Sigma-Aldrich에서 구매하였다.

사용한 항체: anti-AIM (AF2834), from R&D systems; anti-STAT3 (#4904), anti-phospho STAT3 (#9145), anti-STAT1 (#9172), anti-phospho STAT1 (#9167), anti-NLRP3 (#15101), anti-IL-1β (#12507), anti-Caspase 1 (#2225), anti-Acetyl Histone H3(Lys9)(H3K9) (#9649) for ChIP assay from Cell signaling; anti-ASC (AG-25B-0006), anti-Caspase-1 (p20) (AG-20B-0042) from Adipogen; anti-β-actin (AP0060) from Bioworld.

1-2. 웨스턴 블랏

BMDMs (2Ⅹ10⁶/well) 를 6-well 플레이트에 넣은 후 적정 조건에서 인큐베이트하였다. RIPA 버퍼(10mM Tris-cl(pH 7.2), 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 5mM EDTA)을 사용하여 BMDMs로부터 단백질을 분리하였으며, SDS-PAGE를 수행하고 니트로 셀룰로오스 멤브레인(Whatman, Dassel)으로 옮겼다. 다음으로, 멤브레인을 5% non-fat milk로 블로킹하고, 1차 항체를 처리한 후 배양한 후, 표적 단백질을 enhanced chemiluminescene detection kit(WestPico and WestDura, Thermo scientific, Rockford)를 사용해 시각화하였다.

1-3. Real time PCR

제조사의 지시에 따라 Easy Spin RNA extraction kit (iNtRON, Gyeonggi-do)를 사용하여 마우스 BMDM으로부터 전체 RNA를 추출하였으며, ReverTraAce qPCR RT Master Mix (TOYOBO)를 사용해 cDNA를 제조하였다. Quantitative real time PCR (qPCR)은 StepOnePlus system (Applied Biosystems, Foster City, CA)에서 수행하였다. 유전자 발현의 상대적인 존재비(relative abundance of gene expression)는 36B4 전사레벨을 통해 정규화하였다. Real time PCR에 사용된 유전자 특이적 프라이머 염기서열은 표 1에 열거하였다.

명칭	프라이머 서열(5'-3')	서열번호
IL-1β(forward)	AAATACCTGTGGCCTTGGGC	1
IL-1β(reverse)	CTTGGGATCCACACTCTCCAG	2
TNFα (forward)	CCCCAAAGGGATGAGAAGTT	3
TNFα (reverse)	CACTTGGTGGTTTGCTACGA	4
NLRP3 (forward)	TCTAGAGGACCTTGAAGATG	5
NLRP3 (reverse)	AAGTGATCTGCCTTCTCCAT	6
AIM (forward)	GAGGACACATGGATGGAATGT	7
AIM (reverse)	ACCCTTGTGTAGCACCTCCA	8

1-4. ELISA(The enzyme-linked immunosorbent assay)

BMDMs (1Ⅹ10⁶/well)를 12-well 플레이트에 넣은 후 100 ng/ml의 LPS와 함께 다양한 시간대로 배양한 후, 상층액을 채취하기 전에 1시간 동안 ATP(1 또는 5 mM)를 첨가하였다. ELISA(R&D systems)를 사용해 IL-1β, IL-18, TNFα에 대한 배양 상등액 분석을 수행하였다.

1-5. ChIP assay

BMDMs (1Ⅹ10⁶/well)를 10-cm 플레이트에 넣어 키운 후 IL-10(10 ng/ml)을 처리하고 7시간동안 배양했다. 세포들을 1% 포름알데히드에 처리하고 10분동안 고정한 후, glycine을 처리해 반응을 멈췄다. ChIP assay 는 제조사의 지시서에 따라 MAGnify Chromatin Immunoprecipitation System (Invitrogen)을 사용하여 수행하였다. 간략하게, DNA shearing 추출액을 3 ug anti-phospho STAT3, anti-Acetyl HistoneH3 (Lys9)(H3K9) 또는 normal rabbit IgG 항체와 함께 4℃에서 24시간 동안 배양했다. Protein-DNA 복합체를 Dynabeads를 사용해 4℃에서 1시간동안 포확하였다. DNA조각을 DynaMag-PCR Magnet를 이용해 정제하고 정량적 real-time PCR로 측정하였다. 모든 반응은 chromatin sample preparation differences (ΔCt) 를 측정하기 위해 input activities와 비교하여 표준화하였고 fold enrichment를 위해 α-phosphoSTAT3 또는 α-H3K9 (ΔCt _{[phosphoSTAT3]} or ΔCt _[H3K9]) 과 α -IgG IP sample (ΔCt _[IgG]) 사이의 차이로 결정하였다.

1-6. 세포 배양 및 BMDM의 1차 배양

Raw264.7 세포를 10 %(v/v) fetal bovine serum, 100 units/ml penicillin, 및 100u g/ml streptomycin이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Welgene)에서 배양하였다. C57BL/6N 마우스, B6129-Cd5ltm1, B6129P2-Il10tm1Cgn/J, B6129-GFP WT 마우스로부터 1차 골수유래 대식세포 (Primary Bone marrow derived macrophage; BMDM)를 분리하였다. 10%의 FBS를 포함하는 20% L929 상등액을 이용하여 마우스의 골수 줄기세포로부터 BMDM을 분화시켰다. 배양 일주일 후, 분화된 BMDMs를 항-CD11b를 사용해 FACS 분석으로 확인하였다.

1-7. Transient Transfection 및 루시퍼라제 활성 분석

-7000/+121, -5000/+121, -500/+121을 포함하는 마우스 AIM 프로모터를 pGL4.14로 서브클로닝하였다. pCMV sport6-mouse STAT3과 pCMV sport6의 발현벡터를 21C Frontier Human Gene Bank (KRIBB, Daejeon)로부터 얻었다. X-tremeGENE HP Transfection Reagent (Sigma)를 사용해 Raw264.7 새포내로 STAT3 (0, 20, 50, 100, 및 300 ng) 플라스미드와 루시퍼라제로 표시된 mAIM 프로모터 리포터(300 ng) 및 레닐라 루시퍼레이즈 플라스미드를 동시에 세포내로 주입시켜 형질변형을시켰다. 모든 루시퍼라제 실험은 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI)을 사용해 수행하였다.

1-8. Small interfering RNA (siRNA)

아래 표 2에 나타낸 마우스용 RNA 올리고뉴클레오타이드와 Stealth RNAi siRNA 음성대조군(scramble, Med GC)를 합성하였다(Invitrogen, Carlsbad, CA). Stat1을 표적으로 하는 siRNA 서열로 SiStat1(Forward 5′-CACAGUUUUAUCCUGATGA-3′, 서열번호 9)(Sci Rep. 2016;6:29673.)을 사용하였다. 합성한 siRNA (100 nM)를 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용해 적절한 BMDM 실험용 세트에 주입하여 형질전환시켰다.

명칭	염기서열(5'-3')	서열번호
siStat3 #1 Forward (Stat3MSS209601)	AGGGCAGUUUGAGUCGCUCACGUUU	10
siStat3 #2 Forward (Stat3MSS277377)	CAGAUCACAUGGGCUAAAUUCUGCA	11
siStat3 #3 Forward (Stat3MSS277378)	GCGGCAGUUCCUGGCACCUUGGAUU	12

1-9. ASC speck formation

BMDMs(2.5Ⅹ10⁵/well)를 커버슬립이 있는 12-well plate에 넣어 키운 후, 세포에 rAIM(1 ug/ml) 또는 IL-10(10 ng/ml)을 전처리하였다. 24시간 후, 세포에 LPS를 4시간 동안 처리한 다음에 1시간동안 ATP(5mM)를 첨가하였다. 다음으로, 세포를 4%의 파라포름알데히드에 고정화시킨 후, 0.5 % Triton-X100가 들어있는 PBS를 이용해 10분간 투과시켰다. 샘플을 하룻밤동안 ASC 항체(1:200)과 함께 인큐베이트한 후 Goat-antirabbit 488 alexaFluor과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였고 DAPI(P36962, ThermoFisher Scientific)가 들어있는 용액으로 고정시켰다. ASC speck(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD Speck)의 형성을 Zeiss LSM800 laser-scanning 공초점 현미경으로 분석하였으며, Image J를 사용하여 정량화하였다. 그래프는 4~8의 별개의 구역에서 ASC specks를 갖는 세포들의 %를 나타낸다.

1-10. 통계

데이터는 평균의 표준오차(SEM)을 의미한다. in vitro와 in vivo 세트의 모든 데이터를 두개의-tailed student's test를 사용해 통계적 유의성을 분석하였다. 0.05 미만의 모든 P-values 값은 유의한 것으로 간주하였다. 통계분석은 Graph Prism 5 소프트웨어(GraphPad Software Inc)를 사용해 수행했다.

실시예 1. 대식세포에 IL-10 처리시 AIM의 단백질 발현 증가 확인

골수유래 대식세포(Bone marrow derived macrophage, BMDM)에 IL-10을 처리시 AIM 단백질(Accession No. NP_033820)의 발현 증가여부를 확인하였다.

구체적으로, 제조예 1-6의 방법을 사용해 마우스에서 분리, 분화하여 얻어낸 일차 대식세포(BMDM)에 IL-10(10ng/ml)을 처리하고, 2, 4, 8, 24 시간 배양한 후에 세포 용해물(lysates)을 제조하였다.

상기 세포 용해물을 이용해 anti-AIM 항체(AF2834), anti-phospho STAT3 항체 (#9145), anti-STAT1 항체(#9172), β-actin 을 사용해 상기 제조예 1-2의 방법을 사용해 웨스턴블랏을 수행하였으며, 결과를 도 1에 나타냈다. 도 1은 BMDM에 IL-10 처리시 AIM의 발현여부 및 시간에 따른 AIM의 단백질 발현량의 변화를 확인한 결과를 나타낸다.

도 1에 나타낸 바와 같이, IL-10을 처리하지 않은 대조군에 비해, IL-10을 처리한 대식세포에서 AIM의 발현이 증가하였으며, 시간이 지날수록 AIM 단백질 발현량이 증가함을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 대식세포에 IL-10 처리시 AIM의 mRNA level 증가 확인

골수유래 대식세포(Bone marrow derived macrophage, BMDM)에 IL-10을 처리시 AIM의 mRNA level이 증가하는지를 확인하기 위해, 제조예 1-6의 방법을 사용해 마우스에서 분리, 분화하여 얻어낸 일차대식세포(BMDM)에 IL-10(10ng/ml) 처리 후, 2, 4, 8, 24시간 동안 배양하였다.

상기 세포 배양물에 대해, 제조예 1-3의 방법을 사용해 RNA를 분리하여 cDNA를 합성하고 프라이머를 사용해 Real time PCR을 수행하여 AIM의 유전자 발현여부를 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타냈다. 도 2는 BMDM에 IL10 처리 시, AIM의 mRNA 발현량의 증가 여부 및 시간에 따른 AIM mRNA의 발현량의 변화를 확인한 결과를 나타내며, 세로축은 control 2시간 샘플을 1로 잡았을 때 증가하는 양적배수로fold increase를 의미한다.

도 2에 나타낸 바와 같이, IL-10 처리한 대식세포에서 AIM의 mRNA의 level이 증가하였으며, 이로부터 대식세포에 IL-10처리시 AIM의 유전자 발현이 증가함을 확인할 수 있었다.

실시예 3. IL-10에 의한 AIM의 발현 증가에 대한 STAT3의 효과

실시예 2에서 확인한 대식세포에서 IL-10에 의한 AIM의 발현이 STAT family, 특히 STAT1 또는 STAT3를 매개하는지를 확인하기 위해 STAT1 또는 STAT3 DNA에 결합하는 siRNA를 이용하여 STAT1과 STAT3의 발현을 억제하는 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 제조예 1-6의 방법에 따라 마우스에서 분리, 분화하여 얻어낸 일차대식세포(BMDM)에 scramble(negative control, 100nM), siSTAT1(100nM)을 RNAiMAX를 이용하여 Transfection 하고 24시간 후 IL-10(10ng/ml) 처리한 후, 용해물을 이용해 항체 AIM, phosphoSTAT1, totalSTAT1, β-actin을 immunoblot하였으며, 그 결과를 도 3의 (A)에 나타냈다. 도 3의 (A)는 STAT1의 발현을 억제하였을 경우 BMDM에서 IL-10에 의한 AIM의 발현억제 효과가 없음을 보여준다.

다음으로, 일차대식세포(BMDM)에 scramble(negative control, 100nM), siSTAT3#1, siSTAT3#2, siSTAT3#3(100nM) 을 RNAiMAX를 이용하여 Transfection 하고 24시간 후 IL-10(10ng/ml) 처리 한 후, 용해물을 이용해 항체 AIM, phosphoSTAT3, totalSTAT3, β-actin을 immunoblot하였으며, 그 결과를 도 3의 (B)에 나타냈다. 도 3의 (B)는 siSTAT3을 이용해 STAT3의 발현을 억제 시 IL-10에 의한 AIM의 발현 억제 효과가 나타남을 보여주는 결과이다.

마지막으로, 일차대식세포(BMDM)에서 5,15-DPP(100ug/ml; control-DMSO)을 처리한 후 30분 후에 IL-10(10ng/ml)을 추가해주고 24시간 인큐베이션 후 세포의 용해물로부터 항체 AIM, phosphoSTAT3, totalSTAT3, β-actin을 immunoblot하였으며, 그 결과를 도 3의 (C)에 나타냈다. 도 3의 (C)는 STAT3의 인산화를 억제하는 5,15-DPP약물을 처리시 IL-10에 의한 AIM의 발현억제 결과를 보여준다.

도 3의 (A)에 나타낸 바와 같이, siSTAT1을 이용하여 STAT1의 발현을 억제하였을 경우 BMDM에서 IL-10에 의한 AIM의 발현억제 효과를 확인할 수 없었지만, 도 3의 (B)에 나타낸 바와 같이, 3종류의 siSTAT3를 이용하여 STAT3의 발현을 억제하였을 경우, IL-10에 의해 AIM의 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다. 또한, STAT3의 발현 억제 효과 이외에도, 도 3의 (C)에 나타낸 바와 같이, IL-10에 의한 STAT3의 인산화를 억제하는 5,15-DPP약물을 처리하였을 때, IL-10에 의해 AIM의 발현이 억제됨을 확인하였으며 이로부터 IL-10에 의한 AIM의 발현증가가 STAT3을 매개함을 알 수 있었다.

실시예 4. STAT3가 결합하는 AIM(Cd5l) 프로모터 위치 확인

STAT3가 직접적으로 AIM의 발현을 증가시키는 지를 확인하기 위해, 인산화 STAT3 항체를 이용하여 STAT3가 AIM의 프로모터 부위의 결합 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

우선, AIM을 암호화하는 유전자 프로모터 -12000/+120(전사시작 전 지점) 까지의 시퀀스에서 JASPER 전사인자 결합예측 데이터베이스 사이트 (http://jaspar.genereg.net/)에서 제시해 주는 STAT3가 결합하는 AIM 유전자 서열로 제시한 TTCCNGGAAN(서열번호 13) 및 STAT3가 결합을 잘하는 위치로 알려진 GAS (Interferon-Gamma-activated sequence)서열 TTCNNNNGAA(서열번호 14) (Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 3041-3045, 1995, GENES & DEVELOPMENT 21:1396-1408 ⓒ 2007) 과 75% 유사도를 갖는 6개의 STAT3 결합위치(Loca.1 ~ Loca.6)를 vector NTI program 예측하였으며, 도 4의 (A)에 나타냈다.

다음으로, 제조예 1-6의 방법으로 마우스에서 분리, 분화하여 얻어낸 일차대식세포(BMDM)에 IL-10(10 ng/ml)을 처리하고 7시간 동안 세포를 고정시킨 후, 세포 용해물을 제조하였으며, 세포 용해물과 phosphoSTAT3 항체를 이용해 상기 실시예 1-5의 방법을 사용해 ChIP assay를 수행하였다. phosphoSTAT3과 결합된 DNA추출물을 이용하여 AIM 프로모터 유전자의 Loca 1 ~ Loca 6 부위를 아래 표 3의 프라이머를 사용해 Real time PCR을 수행하였으며 증폭결과를 도 4의 (B)에 나타냈다.

명칭	프라이머 서열(5'-3')	서열번호
mAIM pro loca.1 Forward	GCTACTCCAGTTTGTTTCTTCAGA	15
mAIM pro loca.1 Reverse	ACAAAAATAACAGGAAGCAACA	16
mAIM pro loca.2 Forward	GGAGTTTGGTGCTTCCTTTATGT	17
mAIM pro loca.2 Reverse	AGAGAGAATCTCAGGTGCAAAAAG	18
mAIM pro loca.3 Forward	CTCTGAGACCTTGAGATCCTGG	19
mAIM pro loca.3 Reverse	GAACACAACATATGCTCCAACAC	20
mAIM pro loca.4 Forward	ACCTCCCTAGATAATGCCCCTT	21
mAIM pro loca.4 Reverse	AGGGTATCCCTATGATTCCTCA	22
mAIM pro loca.5 Forward	TTCTCTTGCAGAGGACCCAGGTT	23
mAIM pro loca.5 Reverse	CCACGTTAGACTGCGAGCTTGTA	24
mAIM pro loca.6 Forward	CTCCATGCCGTGTTCTAGTAACA	25
mAIM pro loca.6 Reverse	GCCAAGTAAGCTCATTGCTTCAG	26

도 4의 (B)에 나타낸 바와 같이, ChIP assay 수행결과, AIM의 프로모터 Loca 4(-6942/-6920) 부위와 Loca.6 (-2550/-2426) 부위에 STAT3가 직접 강하게 결합하는 경향을 확인할 수 있었다.

실시예 5. STAT3 발현 증가에 따른, AIM 프로모터 활성도 증가 확인

AIM 프로모터에 STAT3가 직접 결합함을 확인하였으므로 그 다음으로, STAT3의 발현이 증가함에 따라 AIM 프로모터 활성도가 증가하는 지 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

구체적으로, Loca. 4, Loca. 6가 포함되어 있는 mCd5l-7000/+121 luciferase reporter, Loca 6만을 포함하고 있는 mCd5l-3000/+121, Loca. 4와 Loca. 6를 모두 포함하고 있지 않는 mCd5l-500/+121 luciferase reporter construct를 제작하였다. 도 5의 (A)는 mCd5l-7000/+121 luciferase reporter, mCd5l-3000/+121, mCd5l-500/+121 luciferase reporter construct를 나타낸다.

다음으로, Raw264.7 cell에 pCMV SPORT와 pCMV STAT3(0, 20, 50, 100, 300ng) pGL4.14, pmCd5l-7000/+121 reporter(300ng), renilla를 cotransfection시킨 후, 24시간 후에 IL-10(10ng/ml)을 처리하였으며, 다음 24시간 후에 세포의 용해물을 제조하고 세포 용해물을 이용해 luciferase activity를 측정하였으며, 그 결과를 도 5의 (B)에 나타냈다. 도 5의 (B)는 STAT3의 발현량 증가에 따른 AIM 프로모터의 활성도 증가 결과를 나타내며, 도 5 (B)의 세로축은 luciferase activity fold로서 IL-10이 있는 상태에서 각각의 reporter construct와 pCMV SPORT가 들어간 곳을 1로 했을 때 나타나는 활성도 배수를 나타낸다.

또한, Raw264.7 cell에 pCMV SPORT와 pCMV STAT3(100ng), pGL4.14, pmCd5l-7000/+121 또는 pmCd5l-3000/+121 또는 pmCd5l-500/+121 reporter(300ng), renilla cotransfection시킨 후, 24시간 후에 IL-10(10ng/ml)을 처리하고, 다시 24시간 후에 세포의 용해물을 제조하였으며, 세포 용해물을 이용해 luciferase activity를 측정하였으며, 그 결과를 도 5의 (C)에 나타냈다. 도 5 (C)의 세로축은 luciferase activity fold로서 IL-10이 있는 상태에서 각각의 reporter construct와 pCMV SPORT가 들어간 곳을 1로 했을 때 나타내는 활성도 배수를 나타낸다.

도 5의 (B)에 나타낸 바와 같이, STAT3의 발현이 20, 50, 100, 300 ng 순으로 증가할수록 AIM 프로모터 활성도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 5의 (C)에 나타낸 바와 같이, STAT3가 강력하게 결합하고 있는 loca. 4와 loca. 6의 부분이 포함된 mCd5I-7000/+121 에서의 STAT3에 의한 활성도가 100%일 경우와 비교해, loca.4가 제외된 mCd5I-3000/+121 에서는 AIM 프로모터 활성도가 15.4% 정도 감소하였으며, loca.4와 loca.6이 모두 제외된 mCd5I-500/+121에서는 AIM 프로모터 활성도가 추가로 28.5% 감소하는 것을 확인하였다.

따라서, IL-10 에 의해 유도되는 AIM 프로모터 활성화에 STAT3 결합 부위가 중요한 영향을 미침을 알 수 있었다.

실시예 6. IL-10에 의해 증가하는 AIM의 발현에 의한 IL-1β의 분비 조절

IL-10에 의해 활성화되는 STAT3의 인산화에 의해 AIM의 발현이 증가하고 증가한 AIM의 기능을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

우선, 정상 마우스와 AIM 유전자가 소실된 AIM KO 마우스로부터 제조예 1-6의 방법으로 분리한 일차대식세포(BMDM)에 IL-10(10ng/ml)을 24시간 동안 전처리 한 후, LPS 100 ng/ml를 처리하고 24시간 후의 배양 상층액(Sup)을 이용해 제조예 1-4의 ELISA 방법을 사용해, IL-1β, TNFα 분비 양을 정량화하였으며, 그 결과를 도 6에 나타냈다. 도 6은 IL-10에 의한 IL-1β, TNFα사이토카인 분비 억제에 있어 AIM이 미치는 영향을 확인한 결과로서, 그래프의 세로 축은 IL-1β, TNFα 분비양(pg/ml)로 나타낸 것이다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 정상마우스와 AIM KO 마우스 모두에서 IL-10 처리시 TNFα가 감소되는 반면, IL-1β의 경우 정상쥐에서는 IL-10에 의해 감소되지만 AIM KO 마우스에서는 IL-10을 처리해도 IL-1β의 분비가 감소되지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서 IL-10에 의해 증가하는 AIM은 IL-10에 의해 억제되는 항염증반응 중 IL-1β의 분비를 조절하는 인플라마좀(inflammasome) 억제기전에 영향을 미침을 확인할 수 있었다.

실시예 7. Recombinant AIM의 항-인플라마좀(anti-inflammasome) 효과 확인

7-1. immunoblot 실험

인플라마좀(Inflammasome)에 있어, AIM의 기능을 더 자세히 규명하기 위해, 정상 마우스와 염증이 심화되어 있고 IL-10 유전자가 소실된 (IL-10 KO) 마우스로부터 분리한 일차대식세포(BMDM)에 recombinant AIM(rAIM, R&D system 구매) 단백질을 24시간 동안 전 처리한 후, LPS(100ng/ml)를 처리하고 4시간 후에 ATP(1mM)을 처리하였으며, 이로부터 1시간 후에 세포배양액을 vivaspin으로 농축하고 단백질 정량을 하여 항체 caspase-1 P20을 사용해 immunoblot을 하였다. 또한, 세포용해물(lysates)를 이용하여 Pro-caspase-1, Pro-IL-1 β, NLRP3, AIM, β-actin을 immunoblot으로 확인하였으며, 그 결과를 도 7a에 나타냈다.

명칭	아미노산 서열	서열번호
AIM protein	MAPLFNLMLA ILSIFVGSCF SESPTKVQLV GGAHRCEGRV EVEHNGQWGT VCDDGWDRRD AVVCRELNC GAVIQTPRGA SYQPPASEQR VLIQGVDCNG TEDTLAQCEL NYDVFDCSHE EDAGAQCENP DSDLLFIPED VRLVDGPGHC QGRVEVLHQS QWSTVCKAGW NLQVSKVVCR QLGCGRALLT YGSCNKNTQG KGPIWMGKMS CSGQEANLRS CLLSRLENNC THGEDTWMEC EDPFELKLVG GDTPCSGRLE VLHKGSWGSV CDDNWGEKED QVVCKQLGCG KSLHPSPKTR KIYGPGAGRI WLDDVNCSGK EQSLEFCRHR LWGYHDCTHK EDVEVICTDF DV	27
recombinant AIM protein	ESPTKVQLV GGAHRCEGRV EVEHNGQWGT VCDDGWDRRD VAVVCRELNC GAVIQTPRGA SYQPPASEQR VLIQGVDCNG TEDTLAQCEL NYDVFDCSHE EDAGAQCENP DSDLLFIPED VRLVDGPGHC QGRVEVLHQS QWSTVCKAGW NLQVSKVVCR QLGCGRALLT YGSCNKNTQG KGPIWMGKMS CSGQEANLRS CLLSRLENNC THGEDTWMEC EDPFELKLVG GDTPCSGRLE VLHKGSWGSV CDDNWGEKED QVVCKQLGCG KSLHPSPKTR KIYGPGAGRI WLDDVNCSGK EQSLEFCRHR LWGYHDCTHK EDVEVICTDF DVHHHHHH	28

도 7a에 나타낸 바와 같이, BMDM에 LPS와 ATP를 처리해 Inflammasome을 유도하면 cleaved caspase 1 (p20)이 증가하며, cleaved caspase 1에 의해 IL-1β가 active IL-1β 형태로 분비됨을 확인할 수 있었다. LPS/ATP가 처리된 그룹의 media supernatant에서 IL-1β 분비뿐만 아니라 cleaved caspase 1(p20)이 증가하였으며, recombinant AIM을 처리할 경우 cleaved caspase 1(p20)의 양이 감소함을 확인할 수 있었다.

따라서, 상기 결과를 통해 전 처리된 recombinant AIM은 anti-inflammasome을 유도하여 IL-1β의 분비를 억제하는 효과가 있음을 나타냄을 확인하였다.

7-2. ELISA 정량

또한, 위의 실험조건에 준비된 세포 배양액을 이용해 LPS/ATP 처리해 inflammsome을 유도하는 조건, 또는 rAIM 전처리 + LPS/ATP 처리해 inflammsome을 유도한 조건에서 IL-1 β 의 분비량을 ELISA로 정량하였으며, 그 결과를 도 7b에 나타냈다. 도 7b의 그래프에서 세로 축은 IL-1β 분비양(pg/ml)을 나타낸 것이다.

도 7b에 나타난 바와 같이, LPS/ATP의 처리로 인해 inflammasome을 유도할 경우, IL-1 β 의 발현이 유도되었고, LPS/ATP에 의해 분비가 증가된 IL-1 β 는 recombinant AIM 전처리 과정을 거치게되면, 분비가 감소됨을 확인할 수 있었다.

7-3. recombinant AIM의 IL-1β 분비 억제 기전 확인

실시예 7-1과 7-2에서 확인한 바와 같이, IL-1β 의 분비를 억제시켜 anti-inflammasome 효과를 갖는 recombinant AIM의 효과가 세포내에서 IL-1β 의 유전자 발현을 억제함으로써 나타나는 효과인지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

우선, 정상 마우스와 IL-10 KO마우스로부터 분리한 일차대식세포 (BMDM)에 recombinant AIM (rAIM)을 24시간 전 처리 한 후, LPS(100ng/ml) 처리하고 4시간 후, ATP(1mM)을 처리하고 1시간이 지난 다음 세포를 얻어, RNA를 분리하고 cDNA를 합성하엿다. 다음으로, IL-1β 와 NF-kB에 의해 활성화 되는 다른 인자인 TNFα, NLRP3의 발현양을 확인하기 위해 SYBR을 이용해 제조예 1-3의 방법을 사용해 real time PCR을 수행했으며, 그 결과를 도 8에 나타냈다. 도 8에서 fold incrase는 정상마우스에서 mock을 1로 했을 때 나타나는 양적 증가 배수를 의미한다.

도 8에 나타낸 바와 같이, rAIM에 의해 IL-1β 의 발현은 억제되지 않았으며, 또한 NF-kB에 의해 증가되는 타겟 유전자들 IL-1β 를 포함한 TNFα, NLRP3의 발현에는 rAIM가 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 앞선 실시예 7-1, 7-2와 본 실험 결과를 통해, rAIM은 IL-1β 의 발현에는 직접적인 영향을 미치지 않으며, IL-1β의 분비에 영향을 미침으로써 inflammasome에 대한 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

7-4. inflammasome 형성 확인

Inflammasome은 ASC(Apoptosis-associated speck-like protein), NLRP3, Caspase-1 등과 복합체를 형성하여 caspase-1을 cleaved caspase-1로 만들고, cleaved caspase-1은 Pro IL-1β를 active IL-1β 로 잘라주어 IL-1β 를 분비하게 하는 메커니즘을 가지고 있다. 대식세포 내에서 inflammasome 형성이 이루어지는 지를 확인 하기 위해, inflammasome 형성에 있어 중요한 구성체인 ASC를 형광염색하여 speck 모양의 inflammasome이 형성되는지를 확인하였다.

구체적으로, 정상 마우스에서 제조예 1-6에 따라 분리, 분화하여 얻어낸 일차대식세포(BMDM)에, IL-10(10ng/ml) 또는 recombinant AIM(1ug/ml)을 전처리 한 후, 24시간 후에 LPS(100ng/ml) 처리하고 4시간 후, ATP(5mM)를 처리하고 1시간 후에 세포를 4% paraformaldehyde를 이용해 고정하였다. 다음으로 항체 ASC, Goat-antirabbit 488 alexaFluor를 이용해 immunofluorescence 수행하였으며, 그 결과를 도 9a에 나타났다.

다음으로, confoal microscopic을 통해 무작위적 위치 8군데 촬영한 후, ASC Speck 개수를 측정하고 전체 세포 대비 %를 구하여 도 9b에 나타내었다. *** P>0.005

도 9a 및 도 9b에 나타낸 바와 같이, LPS/ATP에 의해 유도된 ASC speck formation이 IL-10 또는 rAIM을 전처리할 경우 감소됨을 확인할 수 있었으며, rAIM은 IL-10만큼이나 anti-inflammasome 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

7-5. IL-10에 의해 감소되는 inflammasome형성에 있어 AIM의 역할 확인

IL-10은 NF-kB를 억제시켜 염증관련 사이토카인 및 관련 인자의 발현을 억제시키는 기전이 있으며, anti-inflammasome의 효과를 보이기도 한다. AIM이 존재하지 않을 경우 IL-10에 의해 감소되는 inflammasome에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

정상마우스와 AIM KO 마우스에서 분리, 분화하여 얻어낸 일차대식세포 (BMDM)에 IL-10(10ng/ml)을 전처리하고 24시간 후에 LPS(100ng/ml)을 추가하고 4시간 배양한 후, 5mM의 ATP를 처리하고 1시간 동안 배양해 inflammasome을 유도하였다. 다음으로, 세포를 4% paraformaldehyde를 이용해 고정하였으며 항체 ASC, Goat-antirabbit 488 alexaFluor 를 이용해 immunofluorescence 수행한 결과를 도 10a에 나타냈다.

다음으로 confoal microscopic을 통해 마우스 한 마리당 무작위적 위치 3-4군데 촬영한 후, ASC Speck 개수를 측정하고 평균값을 전체 세포 대비 %를 구하여 도 10b에 나타냈다(** P<0.01).

도 10a와 도 10b에서 확인할 수 있듯이, 정상마우스에서는 LPS/ATP를 처리해서 나타나는 ASC speck형성이 IL-10 전처리에 의해 감소하는 반면, AIM KO마우스에서는 LPS/ATP에 의해 형성된 ASC speck 형성이 IL-10에 의해 감소하지 않는 경향을 나타냈다. 따라서, IL-10에 의해 억제되는 anti-inflammasome 형성에 있어, AIM이 중요한 역할을 담당함을 확인할 수 있었다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Composition for treating or preventing inflammatory diseases including a regulator of Apoptosis inhibitor of macrophage <130> DPP20183750KR <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 beta forward primer <400> 1 aaatacctgt ggccttgggc 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 beta reverse primer <400> 2 cttgggatcc acactctcca g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF alpha forward primer <400> 3 ccccaaaggg atgagaagtt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF alpha reverse primer <400> 4 cacttggtgg tttgctacga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NLRP3 forward primer <400> 5 tctagaggac cttgaagatg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NLRP3 reverse primer <400> 6 aagtgatctg ccttctccat 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIM forward primer <400> 7 gaggacacat ggatggaatg t 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIM reverse primer <400> 8 acccttgtgt agcacctcca 20 <210> 9 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SiStat1 siRNA <400> 9 cacaguuuua uccugatg 18 <210> 10 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siStat3 #1 Forward (Stat3MSS209601) <400> 10 agggcaguuu gagucgcuca cguuu 25 <210> 11 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siStat3 #2 Forward (Stat3MSS277377) <400> 11 cagaucacau gggcuaaauu cugca 25 <210> 12 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siStat3 #3 Forward siRNA (Stat3MSS277378) <400> 12 gcggcaguuc cuggcaccuu ggauu 25 <210> 13 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIM promoter portion to which STAT3 binds as predicted by JASPER <400> 13 ttccnggaan 10 <210> 14 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAS( (Interferon-Gamma-activated sequence) sequence known as STAT3 binding site <400> 14 ttcnnnngaa 10 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAIM pro loca.1 Forward primer <400> 15 gctactccag tttgtttctt caga 24 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAIM pro loca.1 Reverse primer <400> 16 acaaaaataa caggaagcaa ca 22 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAIM pro loca.2 Forward primer <400> 17 ggagtttggt gcttccttta tgt 23 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAIM pro loca.2 Reverse primer <400> 18 agagagaatc tcaggtgcaa aaag 24 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAIM pro loca.3 Forward primer <400> 19 ctctgagacc ttgagatcct gg 22 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAIM pro loca.3 Reverse primer <400> 20 gaacacaaca tatgctccaa cac 23 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAIM pro loca.4 Forward primer <400> 21 acctccctag ataatgcccc tt 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAIM pro loca.4 Reverse primer <400> 22 agggtatccc tatgattcct ca 22 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAIM pro loca.5 Forward primer <400> 23 ttctcttgca gaggacccag gtt 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAIM pro loca.5 Reverse primer <400> 24 ccacgttaga ctgcgagctt gta 23 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAIM pro loca.6 Forward primer <400> 25 ctccatgccg tgttctagta aca 23 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAIM pro loca.6 Reverse primer <400> 26 gccaagtaag ctcattgctt cag 23 <210> 27 <211> 351 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apoptosis inhibitor of macrophage(AIM) protein <400> 27 Met Ala Pro Leu Phe Asn Leu Met Leu Ala Ile Leu Ser Ile Phe Val 1 5 10 15 Gly Ser Cys Phe Ser Glu Ser Pro Thr Lys Val Gln Leu Val Gly Gly 20 25 30 Ala His Arg Cys Glu Gly Arg Val Glu Val Glu His Asn Gly Gln Trp 35 40 45 Gly Thr Val Cys Asp Asp Gly Trp Asp Arg Arg Asp Ala Val Val Cys 50 55 60 Arg Glu Leu Asn Cys Gly Ala Val Ile Gln Thr Pro Arg Gly Ala Ser 65 70 75 80 Tyr Gln Pro Pro Ala Ser Glu Gln Arg Val Leu Ile Gln Gly Val Asp 85 90 95 Cys Asn Gly Thr Glu Asp Thr Leu Ala Gln Cys Glu Leu Asn Tyr Asp 100 105 110 Val Phe Asp Cys Ser His Glu Glu Asp Ala Gly Ala Gln Cys Glu Asn 115 120 125 Pro Asp Ser Asp Leu Leu Phe Ile Pro Glu Asp Val Arg Leu Val Asp 130 135 140 Gly Pro Gly His Cys Gln Gly Arg Val Glu Val Leu His Gln Ser Gln 145 150 155 160 Trp Ser Thr Val Cys Lys Ala Gly Trp Asn Leu Gln Val Ser Lys Val 165 170 175 Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys Gly Arg Ala Leu Leu Thr Tyr Gly Ser 180 185 190 Cys Asn Lys Asn Thr Gln Gly Lys Gly Pro Ile Trp Met Gly Lys Met 195 200 205 Ser Cys Ser Gly Gln Glu Ala Asn Leu Arg Ser Cys Leu Leu Ser Arg 210 215 220 Leu Glu Asn Asn Cys Thr His Gly Glu Asp Thr Trp Met Glu Cys Glu 225 230 235 240 Asp Pro Phe Glu Leu Lys Leu Val Gly Gly Asp Thr Pro Cys Ser Gly 245 250 255 Arg Leu Glu Val Leu His Lys Gly Ser Trp Gly Ser Val Cys Asp Asp 260 265 270 Asn Trp Gly Glu Lys Glu Asp Gln Val Val Cys Lys Gln Leu Gly Cys 275 280 285 Gly Lys Ser Leu His Pro Ser Pro Lys Thr Arg Lys Ile Tyr Gly Pro 290 295 300 Gly Ala Gly Arg Ile Trp Leu Asp Asp Val Asn Cys Ser Gly Lys Glu 305 310 315 320 Gln Ser Leu Glu Phe Cys Arg His Arg Leu Trp Gly Tyr His Asp Cys 325 330 335 Thr His Lys Glu Asp Val Glu Val Ile Cys Thr Asp Phe Asp Val 340 345 350 <210> 28 <211> 337 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant AIM protein <400> 28 Glu Ser Pro Thr Lys Val Gln Leu Val Gly Gly Ala His Arg Cys Glu 1 5 10 15 Gly Arg Val Glu Val Glu His Asn Gly Gln Trp Gly Thr Val Cys Asp 20 25 30 Asp Gly Trp Asp Arg Arg Asp Val Ala Val Val Cys Arg Glu Leu Asn 35 40 45 Cys Gly Ala Val Ile Gln Thr Pro Arg Gly Ala Ser Tyr Gln Pro Pro 50 55 60 Ala Ser Glu Gln Arg Val Leu Ile Gln Gly Val Asp Cys Asn Gly Thr 65 70 75 80 Glu Asp Thr Leu Ala Gln Cys Glu Leu Asn Tyr Asp Val Phe Asp Cys 85 90 95 Ser His Glu Glu Asp Ala Gly Ala Gln Cys Glu Asn Pro Asp Ser Asp 100 105 110 Leu Leu Phe Ile Pro Glu Asp Val Arg Leu Val Asp Gly Pro Gly His 115 120 125 Cys Gln Gly Arg Val Glu Val Leu His Gln Ser Gln Trp Ser Thr Val 130 135 140 Cys Lys Ala Gly Trp Asn Leu Gln Val Ser Lys Val Val Cys Arg Gln 145 150 155 160 Leu Gly Cys Gly Arg Ala Leu Leu Thr Tyr Gly Ser Cys Asn Lys Asn 165 170 175 Thr Gln Gly Lys Gly Pro Ile Trp Met Gly Lys Met Ser Cys Ser Gly 180 185 190 Gln Glu Ala Asn Leu Arg Ser Cys Leu Leu Ser Arg Leu Glu Asn Asn 195 200 205 Cys Thr His Gly Glu Asp Thr Trp Met Glu Cys Glu Asp Pro Phe Glu 210 215 220 Leu Lys Leu Val Gly Gly Asp Thr Pro Cys Ser Gly Arg Leu Glu Val 225 230 235 240 Leu His Lys Gly Ser Trp Gly Ser Val Cys Asp Asp Asn Trp Gly Glu 245 250 255 Lys Glu Asp Gln Val Val Cys Lys Gln Leu Gly Cys Gly Lys Ser Leu 260 265 270 His Pro Ser Pro Lys Thr Arg Lys Ile Tyr Gly Pro Gly Ala Gly Arg 275 280 285 Ile Trp Leu Asp Asp Val Asn Cys Ser Gly Lys Glu Gln Ser Leu Glu 290 295 300 Phe Cys Arg His Arg Leu Trp Gly Tyr His Asp Cys Thr His Lys Glu 305 310 315 320 Asp Val Glu Val Ile Cys Thr Asp Phe Asp Val His His His His His 325 330 335 His

Claims (11)

1. (a) 염증성 질환을 갖는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에 약물 후보물질 및 IL-10을 각각 처리하는 단계;
   (b) 약물 후보물질을 처리한 군과 IL-10을 처리한 군에서 AIM의 발현량을 측정하는 단계; 및
   (c) IL-10을 처리한 군과 AIM 발현량이 유사하거나, IL-10을 처리한 군 보다 AIM 발현량을 증가시키는 약물 후보물질을 인플라마좀의 과활성에 의한 염증질환의 치료 또는 예방을 위한 약물로 선별하는 단계를 포함하는,
   인플라마좀의 과활성에 의한 염증질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 스크리닝 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 (a)단계에서 LPS(리포폴리사카라이드) 및 ATP를 추가로 처리하는 것을 특징으로 하는, 약물의 스크리닝 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 염증질환은 치주염, 구내염, 복막염, 위염, 장염, 관절염, 신장염, 및 간염으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 약물의 스크리닝 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 염증질환은 천식, 급성신부전, 동맥경화, 2형 당뇨, 비만, 비알콜성 지방간, 및 퇴행성 뇌질환으로 구성된 군에서 선택되는 질환에 의한 염증인 것인, 약물의 스크리닝 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 AIM의 발현양은 AIM mRNA 발현양 또는 AIM 단백질 발현양인, 약물의 스크리닝 방법.
6. (a) 염증성 질환을 갖는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에 후보물질을 처리하는 단계;
   (b) AIM의 발현량을 측정하는 단계; 및
   (c) AIM의 발현량을 증가시키는 후보물질을 인플라마좀 활성 억제제로 선별하는 단계를 포함하는,
   인플라마좀 활성 억제제의 스크리닝 방법.
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