WO2004007711A1 - 新規蛋白質およびその用途 - Google Patents

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WO2004007711A1
WO2004007711A1 PCT/JP2003/008690 JP0308690W WO2004007711A1 WO 2004007711 A1 WO2004007711 A1 WO 2004007711A1 JP 0308690 W JP0308690 W JP 0308690W WO 2004007711 A1 WO2004007711 A1 WO 2004007711A1
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protein
present
salt
polynucleotide
partial peptide
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PCT/JP2003/008690
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Yuji Matsuzawa
Toru Funahashi
Iichirou Shimomura
Naoki Furuyama
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel secreted or membrane protein derived from mouse white adipocytes or a salt thereof, a DNA encoding the same, and uses thereof.
  • Obesity with visceral fat accumulation has a high probability of vascular disease such as diabetes, hypertension, and atherosclerosis, and visceral fat accumulation is considered to be a common basis for triggering the actual onset of pathological conditions. It is possible that proteins produced by fat cells may be involved in the pathogenesis of fat accumulation.However, genes expressed in adipose tissue have a high frequency of secretory protein genes, including complement and complement. It has been shown to contain genes for physiologically active substances such as growth factors. Such a substance
  • Adipocytokine also called adipocytokine
  • Adipocytokine naturally plays an important role in the metabolism of fat cells themselves, but it is possible that hypersecretion or, conversely, deficiency in secretion during fat accumulation may adversely affect the metabolism of the whole individual.
  • PA I-1 plasminogen activator overnight inhibitor 1
  • adipose most abundant gene transcript-1 which is specifically and frequently expressed in adipose tissue, encodes a collagen-like protein (adiponect in), and this substance is present in large amounts in human blood. Although it has the effect of strongly inhibiting the proliferation of vascular smooth muscle cells, it has been shown that blood levels in obese people are conversely reduced, leading to vascular disease [Arita, Y.] "Biochemical 'and' Biophysical Research Communications (Biochem. Biophys. Res. Commun.) ", (USA), Vol. 257 (No. 1), pp. 79-83 (1999)].
  • Adipocytes also synthesize large amounts of fat and actively degrade lipolysis, releasing fatty acids and glycerol into the blood.
  • the membrane protein aquaporin adipose cloned by Kuriyama et al. Is used as a glycerol channel molecule in adipocytes. [Kishida, K. et al., J. Biol. Chemistry, (USA), Vol. 275 (No. 27) No.), pp. 20896-20902 (2000)].
  • adipocytes secrete various biologically active substances (ie, ligands), and express membrane proteins (ie, receptors) on the cell surface. Therefore, regulation of the expression or biological activity of these secretory membrane proteins may lead to the development of novel methods for preventing and treating obesity, diabetes, and vascular diseases (eg, arteriosclerosis). Be expected.
  • the present invention may be a useful tool for developing preventive and therapeutic drugs for obesity, diabetes, arteriosclerosis, etc., or a useful diagnostic marker for these diseases.
  • the purpose of the present invention is to identify novel secretory and membrane protein genes specifically or highly expressed in adipocytes.
  • the present invention provides a recombinant vector containing the novel gene, a transformant carrying the recombinant vector, a method for producing the secretory membrane protein by culturing the transformant, and a secretory membrane protein.
  • the present inventors prepared a cDNA library derived from visceral adipose tissue of a high-fat diet-loaded mouse, and deleted the cDNA from the N-terminal extracellular region.
  • Constitutively active trombopoietin receptor (serine at position 498 is replaced by asparagine) c.
  • Construction of retrovirus expression library integrated into 5 'side of DNA, high titer from packaging cells The retrovirus was recovered, infected with a mouse proB cell line (BaZF3), and cells that maintained proliferation were selected. Genomic DNA was extracted from the selected cells, and the introduced mouse adipocyte-derived cDNA was subcloned using PCR, and its nucleotide sequence was determined.
  • cDNA clones containing the full length of the protein coding region were isolated from mouse adipocyte-derived cDNA, and their nucleotide sequences were determined. I knew it was a gene.
  • [1] a protein comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a partial peptide thereof, or a salt thereof;
  • [5] a protein comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, a partial peptide thereof, or a salt thereof;
  • a protein comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, or a partial peptide thereof or a salt thereof;
  • [17] a protein comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, a partial peptide thereof, or a salt thereof;
  • a protein comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, or a partial peptide thereof, or a salt thereof; [22] a base encoding the protein or partial peptide according to the above [21] A polynucleotide comprising the sequence;
  • polynucleotide or processing result of the polynucleotide described in [22] above A polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the initial transcript resulting from the polynucleotide or a part thereof;
  • a protein comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, or a partial peptide thereof, or a salt thereof; [26] a base encoding the protein or partial peptide according to the above [25] A polynucleotide comprising the sequence;
  • a protein comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, or a partial peptide thereof, or a salt thereof; [30] a base encoding the protein or partial peptide according to the above [29] A polynucleotide comprising the sequence;
  • polynucleotide according to the above-mentioned [30] the polynucleotide according to the above-mentioned [30], or a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the initial transcript or a part thereof which results in the polynucleotide as a result of processing;
  • a protein comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, or a partial peptide thereof, or a salt thereof; [34] a base encoding the protein or partial peptide according to the above [33] A polynucleotide comprising the sequence;
  • a protein comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, or a partial peptide thereof or a salt thereof; [38] encoding the protein or partial peptide according to the above [37] A polynucleotide comprising a base sequence;
  • a protein comprising the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 or a partial peptide thereof or a salt thereof; [42] the protein or the partial peptide of the above-mentioned [41] is encoded; A polynucleotide comprising a base sequence;
  • a medicament comprising the protein according to [25], [29], [33], [37] or [41], or a partial peptide thereof or a salt thereof;
  • a diagnostic agent comprising:
  • a medicament comprising an obtainable compound or a salt thereof;
  • a medicament comprising a compound or a salt thereof obtainable by using the method of the above-mentioned [58] or the kit of the above-mentioned [59];
  • a medicament comprising a compound or a salt thereof obtainable by using the method of the above-mentioned [62] or the kit of the above-mentioned [63];
  • the protein of the present invention is a secretory or membrane protein expressed in white adipocytes upon a high fat diet load, it can be used as a preventive or therapeutic agent for diseases associated with adipocyte differentiation or abnormal metabolic function, or It has an excellent effect as a tool for screening candidate drug compounds that are effective for the prevention and treatment of the disease.
  • the present invention relates to secretory or membrane proteins specifically or highly expressed in white adipose tissue of humans or other mammals loaded with a high-fat diet (hereinafter referred to collectively as “proteins of the present invention”. Yes) is provided.
  • the protein of the present invention is a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (hereinafter referred to as “SST20-14 (Long form) j
  • a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 hereinafter, also referred to as “SST20-14 (Shortfonn)”
  • SEQ ID NO: 6 A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the represented amino acid sequence (hereinafter also referred to as “SST22-22 (Long form)”); identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8
  • SEQ ID NO: 8 A protein containing the same amino acid sequence (hereinafter also referred
  • a protein comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 (hereinafter, also referred to as “SST9-8”); represented by SEQ ID NO: 20
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence (hereinafter sometimes referred to as “SST2 3”); or the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 Containing identical amino acid sequences (Hereinafter also referred to as “SST20-6”).
  • the protein of the present invention is a secretory or membrane protein highly expressed in adipose tissue of mammals, particularly white adipose tissue, but is not particularly limited in its origin as long as it has the above-mentioned properties.
  • Human, mouse, rat, egret, sheep, pig, pig, dog, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc. Human, mouse, rat, egret, sheep, pig, pig, dog, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc.
  • hepatocytes hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, brain cells
  • bone marrow cells mesangial cells, Langerin's cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibers Blast cells, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes , Synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or progenitor cells, stem cells or cancer cells of these cells] or their cells Any tissue [e.g., hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, brain cells) 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerin's cells, epiderma
  • brain parts of the brain (eg olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary, stomach, kidney, kidney, liver Gut, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testicle, ovary, placenta, uterus , Bone, joints, adipose tissue (eg, brown adipose tissue, white adipose tissue), skeletal muscle, etc.].
  • adipose tissue eg, brown adipose tissue, white adipose tissue
  • skeletal muscle etc.
  • a protein biochemically synthesized by chemical synthesis or a cell-free translation system Or a recombinant protein produced from a transformant into which a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the above amino acid sequence has been introduced.
  • substantially identical amino acid sequence the amino acid sequence represented by each of the above SEQ ID NOs (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 20 or 22) And about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and particularly preferably about 95% or more.
  • homoology refers to an optimal alignment (preferably, the algorithm is optimized for optimal alignment) when two amino acid sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art. (Which may take into account the introduction of gaps in one or both of the sequences), the percentage of identical and similar amino acid residues to all overlapping amino acid residues.
  • Similar amino acids means amino acids that are similar in physicochemical properties, such as aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr), aliphatic amino acids (Ala, Leu, Ile, Val), and polar amino acids (Gln , Asn), basic amino acids (Lys, Arg, His), acidic amino acids (Glu, Asp), amino acids with hydroxyl groups (Ser, Thr), amino acids with small side chains (Gly, Ala, Ser, Thr, Met) And other amino acids classified in the same group. It is expected that substitutions with such similar amino acids will not change the phenotype of the protein (ie, conservative amino acid substitutions).
  • the ⁇ substantially identical amino acid sequence '' is about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, Particularly preferred are amino acid sequences having about 90% or more identity.
  • protein containing substantially the same amino acid sequence examples include, for example, a protein containing the aforementioned “substantially identical amino acid sequence” and containing the amino acid sequence represented by each of the above SEQ ID NOs. Proteins having substantially the same activity are preferred.
  • the “substantially the same activity” includes, for example, a receptor binding activity (or ligand) binding activity and a signal transduction activity. “Substantially equivalent” indicates that their activities are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) equivalent. Therefore, it is preferable that the activities such as the receptor binding activity (ligand) and the signaling activity are equivalent (eg, about 0.5 to about 2 times), but the degree of these activities, the molecular weight of the protein, etc. The quantitative elements of may be different.
  • Activity such as receptor (or ligand) binding activity and signal transduction activity can be measured in accordance with a method known per se.
  • Ligands can be measured according to the methods used in screening methods for agonists and antagonists.
  • Examples of the protein of the present invention include: (1) one or more or more amino acid sequences represented by the above-mentioned SEQ ID NOs (preferably, about 1 to 30, preferably about 1 to 10) More preferably, an amino acid sequence in which a number (1 to 5) of amino acids have been deleted.
  • One or more amino acids preferably about 1 to 30, preferably An amino acid sequence to which about 1 to 10 amino acids have been added, and more preferably a number (1 to 5) of amino acids; and 3) one or two or more amino acids (preferably 1 to 30) An amino acid sequence into which about, preferably about 1 to 10, and more preferably a number (1 to 5) amino acids have been inserted; 1 one or more of the amino acid sequences represented by the above-mentioned SEQ ID NOs.
  • about 1 to 30, preferably 1 to 10 A protein comprising an amino acid sequence in which the number of amino acids has been replaced by another amino acid, and more preferably a number (1 to 5) of amino acids, or a combination thereof.
  • proteins having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by the number is as defined above.
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited as long as the activity of the protein is maintained.
  • the protein of the present invention is a secreted or membrane protein, which is usually translated in vivo as a precursor polypeptide having a signal peptide at the N-terminus, and then processed by signal peptidase to form a mature (or pro) protein.
  • a mature (or pro) protein Becomes The cleavage site of the signal peptide (N-terminus of the mature (pro) protein) can be determined, for example, by subjecting the completely or partially purified protein of the present invention to the Edman degradation method. Can be predicted using a known mathematical algorithm. Examples of such an algorithm include the algorithm described in Nielsen et al., Int. Neural Syst., 8 (5-6): 581-599 (1997) [The algorithm is a SignalP program (WWW server: http: ⁇ www).
  • the polypeptide having the amino acid sequence represented by each of the above SEQ ID NOs: Is expected to be cleaved between Does not always correspond to the actual cleavage site, and the signal cleavage position may vary depending on the cell type expressing the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention is preferably a mouse SST20-14 (Long form) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a mouse SST20-14 (Short form) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 SST22-22 (Long form) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, mouse SST22-22 (Short form) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, represented by SEQ ID NO: 10
  • Mouse SST8-5 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, mouse SST19-15 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 (Long form), mouse SST19- having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 15 (Short form), mouse SST13-11 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, mouse SST9-8 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, represented by SEQ ID NO: 20
  • Mouse SST2 having an amino acid sequence or represented by SEQ ID NO: 22 Is their homologs in mice SST20
  • proteins and peptides are described according to the convention of peptide labeling, with the left end being the N-terminus (amino terminus) and the right end being the C-terminus (carboxyl terminus).
  • the C-terminus has a lipoxyl group (1-COOH), carboxylate (one COO-), ⁇ bromide (- CONH 2), or, as R in the ester good c the ester be any of (-COOR), for example, methyl, Echiru, n _ propyl, isopropyl, n- C i _ 6 alkyl groups such as butyl; for example, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclopropyl pentyl, cyclohexyl; for example, phenylene Le, such as single-naphthy
  • the protein of the present invention has a lipoxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus
  • a protein in which the lipoxyl group is amidated or esterified is also included in the protein of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned terminal ester and the like are used.
  • the proteins of the present invention what is Amino groups of the amino acid residues at the N-terminus is protected with a protecting group (e.g., formyl group, etc. Ashiru groups such as C Bok 6 Arukanoiru such Asechiru group), in vivo N-terminal glutamine residue that can be generated by cleavage with a pyroglutamine oxidation, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, --OH, --SH, amino group, imidazole group, indole group) , Guanijino group, etc.) a suitable protecting group (e.g., formyl groups, C E, such Asechi Le group - such as 6 Arukanoiru C i _ 6 Ashiru group such group) as protected by, a sugar chain bound Complex proteins such as so-called glycoproteins are also included.
  • a protecting group e.g., formyl group, etc. Ashiru groups such as C Bok 6 Aru
  • partial peptide of the protein of the present invention is a peptide having the partial amino acid sequence of the protein of the present invention, and the protein of the present invention. As long as they have substantially the same activity as Or any one of them.
  • substantially the same activity is as defined above.
  • the “substantially equivalent activity” can be measured in the same manner as in the case of the protein of the present invention.
  • the partial peptide of the present invention for example, of the amino acid sequence represented by each of the above SEQ ID NOs, it binds to a biological substance (receptor or ligand) that can interact with the protein of the present invention.
  • a biological substance receptor or ligand
  • Those having a partial amino acid sequence that further includes a region involved and a region involved in signal transduction through the interaction are used.
  • the partial peptide of the present invention is preferably a peptide having at least 30 or more, preferably 60 or more, more preferably 100 or more amino acids.
  • a peptide containing a partial amino acid sequence of the protein of the present invention but not having substantially the same activity as the protein interacts with the protein of the present invention among the amino acid sequences represented by the above SEQ ID NOs.
  • Those having a partial amino acid sequence that includes a region involved in binding to a biological substance (receptor or a ligand) that is capable of binding, but does not include a region involved in signal transduction through the interaction are described in the present invention. Not included.
  • a peptide can bind to a biological substance (receptor or ligand) capable of interacting with the protein of the present invention and block the signal transduction action of the protein, abnormal enhancement of the signal transduction is involved. It can be useful for preventing and treating pathological conditions and diseases.
  • the C-terminus may be any of a hydroxyl group (-COOH), a carboxylate (-C ⁇ -), an amide (_C ⁇ NH 2 ), or an ester (-COOR).
  • R in the ester those similar to those described above for the protein of the present invention can be mentioned.
  • the partial peptide of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminus, those in which the lipoxyl group is amidated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention.
  • the ester in this case, for example, those similar to the C-terminal ester and the like are used.
  • the partial peptide of the present invention has, similarly to the above-mentioned protein of the present invention, one in which the amino group of the N-terminal amino acid residue is protected by a protecting group, and one in which the glutamine residue at the N-terminal has undergone pyroglutamine oxidation. And those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, or complex peptides such as so-called glycopeptides to which a sugar chain is bound.
  • Examples of the salt of the protein of the present invention or its partial peptide include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-described mammalian cells or tissues by a protein purification method known per se. Specifically, when the protein of the present invention is localized in the cell membrane, mammalian tissues or cells are homogenized, and cell debris is removed by low-speed centrifugation. (If necessary, the cell membrane fraction is purified by density gradient centrifugation or the like), and the fraction is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like. Thus, the protein or a salt thereof can be prepared.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention is secreted extracellularly, after culturing mammalian tissues or cells in an appropriate medium, the culture supernatant is separated by filtration or centrifugation, and the supernatant is separated.
  • the protein or its salt can be prepared by chromatography or the like in the same manner as described above.
  • protein (peptide) of the present invention may be produced according to a known peptide synthesis method.
  • the peptide synthesis method may be, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • Partial peptide or amino acid that can constitute the protein (peptide) of the present invention The desired protein can be produced by condensing the amino acid and the remaining portion and, when the product has a protecting group, removing the protecting group.
  • condensation and the elimination of the protecting group are performed according to a method known per se, for example, the methods described in the following 1 to 1.
  • the protein (peptide) thus obtained can be purified and isolated by a known purification method.
  • the purification method include solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and combinations thereof.
  • the free form can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, the protein (peptide) is converted into a salt.
  • the salt can be converted to a free form or another salt by a known method or a method analogous thereto.
  • resins for protein synthesis include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamide methyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl resin — Fmoc aminoethyl) phenoxy resin.
  • amino acids having a suitably protected amino group and side chain functional group are condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein (peptide) according to various known condensation methods.
  • proteins and the like are cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein (peptide) or its amide. .
  • the condensation of the above protected amino acids various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable.
  • carbodiimides DCC, N, N'-diisopropylcarboimide, N-ethyl-N '-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used.
  • the protected amino acids may be added directly to the resin along with racemization inhibitors (eg, HOB't, HOOBt) or may be added as symmetrical anhydrides or HOBt esters or HOOBt esters. It can be added to the resin after activation of the protected amino acid.
  • the solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylvinylidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol , Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate one of these.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range that can be used for the protein bond formation reaction, and is usually selected from the range of about ⁇ 20 to 50.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, tertiary pentoxycarbonyl, isopolnyoxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CI—Z, Br_Z, and adamantylo.
  • Xycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the carboxyl group may be, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Or cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 412 trobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-cyclobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification Benzyloxycarbonyl hydrazide, tert-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclo
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for the esterification for example, a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarponyl group, an ethoxycarbonyl group, and the like are used.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrovinyl group, a t-butyl group, and the like.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z and C 1 2 - B z 1, are needed use 2-nitrobenzyl, B r _ Z, such as tertiary butyl.
  • Examples of the protecting group for histidine imidazole include Tos, 4-methoxy2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, and benzyloxy. Cimethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • the acid treatment for example, anisol, phenol, thioanisole, meth-cresol, para-cresol, dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, It is effective to add a cation scavenger such as 1,2 monoethanedithiol, etc. Also, imidazole preservation of histidine is effective.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as a protecting group is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group for tributofan is the presence of 1,2-ethanedithiol and 1,4-butanedithiol as described above. In addition to the deprotection by acid treatment below, it is also removed by an alkaline treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • Examples of the activated carbonyl group of the raw material include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4 —Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOB t)].
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4 —Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOB t
  • the activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • a peptide chain is extended to a desired chain length on the amino group side.
  • a protein (peptide) from which only the protecting group for the amino group at the N-terminal of the peptide chain was removed and a protein (peptide) from which only the protecting group for the carboxyl group at the C-terminus were removed, Both The protein (peptide) is condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the protected protein (protected peptide) obtained by the condensation After purifying the protected protein (protected peptide) obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude protein (crude peptide).
  • the crude protein (crude peptide) is purified by using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein (peptide).
  • the ester form of the protein (peptide) can be obtained, for example, by condensing the ⁇ -hydroxyl group of the carboxy-terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then in the same manner as in the case of the amide form of the protein (peptide). Can be done.
  • the partial peptide of the present invention or a salt thereof can also be produced by cleaving the protein of the present invention or a salt thereof with an appropriate peptidase.
  • the protein (peptide) of the present invention is obtained by culturing a transformant containing a polynucleotide encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof, and transforming the protein (peptide) of the present invention from the resulting culture. It can also be produced by separation and purification.
  • the polynucleotide encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera. Preferably, DNA is used. Further, the polynucleotide may be double-stranded or single-stranded.
  • a double-stranded DNA it may be a double-stranded DNA, a double-stranded RNA or a hybrid of DNA: RNA.
  • a single strand it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
  • Examples of the DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof include mammals (for example, humans, pests, monkeys, pumas, bushes, sheep, goats, dogs, cats, guinea pigs, rats, Mouse, rabbit, hamster, etc.) genomic DNA, all cells of the mammal [eg, hepatocytes, spleen cells, nerve cells, Darya cells, Teng i3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, Epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fibroblasts, muscle cells, fat cells, immune cells (e.g., macrophages, T cells, B cells, Natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, liver
  • the genomic DNA and cDNA encoding the protein or its partial peptide of the present invention are obtained by using the genomic DNA fraction and the total RNA or mRNA fraction prepared from the above-described cells and tissues as type III, respectively. It can also be directly amplified by Reaction (hereinafter, abbreviated as “PCR method”) and Reverse Transcriptase-PCR (hereinafter, abbreviated as “RT-PCR method”). Alternatively, the genomic DNA and cDNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof can be obtained by inserting the genomic DNA prepared from the cells and tissues described above and the entire RNA or mRNA fragment into an appropriate vector. Each of the prepared genomic DNA library and cDNA library can be cloned by colony or plaque hybridization or PCR.
  • the vector used in the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • Examples of the DNA encoding the protein of the present invention include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a base sequence that hybridizes with the base sequence under high stringent conditions; DNA encoding a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by 2 (hereinafter sometimes abbreviated as “Sst20-14 (Long form)”); SEQ ID NO: A DNA containing the nucleotide sequence represented by 3 or a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence under high stringent conditions; No .: DNA encoding a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by 4 (hereinafter sometimes abbreviated as “Sst20-14 (Short form)”); SEQ ID NO: A DNA comprising the nucleotide sequence represented by 5 or a protein comprising a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence under high stringency conditions and comprising the amino acid sequence represented by SEQ
  • DNA encoding the protein of interest (hereinafter sometimes abbreviated as “Sstl9-15 (Long form)”); DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 or Stringent DNA encoding a protein containing a nucleotide sequence that hybridizes under the conditions and having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (hereinafter, “Sstl9-15 (Short form)”).
  • a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 or a base sequence that hybridizes with the base sequence under high stringent conditions DNA encoding a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented (hereinafter sometimes abbreviated as "Sstl3-11"); the base represented by SEQ ID NO: 17 DNA containing sequence or base sequence and DNA DNA encoding a protein containing a nucleotide sequence that hybridizes under the conditions and having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 (hereinafter, abbreviated as “Sst9-8”)
  • the nucleotide sequence represented by each of the above SEQ ID NOs (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 11, 13, 15, 17, 19, or 21) and highly stringent conditions
  • the DNA that can be hybridized with the above base sequence has a homology of about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, particularly preferably about 80% or more, and most preferably about 90% or more with the nucleotide sequence.
  • DNA containing a nucleotide sequence having a property is used.
  • NCBI BLAST National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool
  • the above-mentioned algorithm for calculating the homology of the amino acid sequence is preferably exemplified as well.
  • Hybridization is carried out by a method known per se or a method analogous thereto, such as a method described in Molecular Cloning, 2nd edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can be performed in accordance with Also, using a commercially available library, Hybridization can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Hybridization can be performed preferably under high stringent conditions.
  • High stringency conditions include, for example, a sodium salt concentration of about 19 to about 40 mM, preferably about 19 to about 20 mM, and a temperature of about 50 to about 70 ° C, preferably about 60 to about Conditions at 65 ° C., etc.
  • the sodium salt concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • the salt concentration of the hybridization solution, the temperature of the hybridization reaction, the probe concentration, the length of the probe, the number of mismatches, the time of the hybridization reaction, the salt concentration of the washing solution, the washing temperature, etc. Can be easily adjusted to a desired stringency by appropriately changing.
  • the DNA encoding the protein of the present invention is preferably a DNA encoding the mouse SST20-14 (Long form) protein having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the nucleotide represented by SEQ ID NO: 3 DNA encoding the mouse SST20-14 (Short form) protein having the sequence, DNA encoding the mouse SST22-22 (Long form) protein having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: DNA encoding the mouse SST22-22 (Short form) protein having the nucleotide sequence represented by 7, DNA encoding the mouse SST8-5 protein having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: : DNA encoding the mouse SST19-15 (Long form) protein having the nucleotide sequence represented by 11, and mouse SST19-15 (Short form) protein having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 DNA to encode, having a base sequence represented by SEQ ID NO: 15 A
  • Escherichia coli Topi 0 / pCR4-TOPO SST20-1 1 ong form
  • Escherichia coli Topi 0 / pCR4-TOPO SST20-14 short form
  • Topl0 / pCR4-T0P0 (SST22-221ong form), (4) Escherichia coli To lO / pCR4-TOPO (SST22-22short form), (5) Escherichia coli Topl0 / pCR4-T0P0 (SST8-5), (6) Escherichia coli Topi 0 / pCR4-T0P0 (SST19-151 long form), (7) Escherichia coli To i 0 / pCR4-TOPO (SST19-15 short form), (8)
  • Escherichia coli To i 0 / pCR4-TOPO SST13-11> (9) Escherichia coli ToplO / pENTR / D-T0PO (SST9-8), (10) Escherichia coli TolO / pCR4-T0P0 (SST2 to 3) and (11) Escherichia coli ToplO / pCR4-TOPO (SST20-6)] are FERM BP-8406, FERM BP-8407, FERM BP-8408, FERM BP-8409, FERM BP-8402, FERM BP-8404, and FERM, respectively.
  • a signal sequence strap (SST) method As a simple method for cloning a nucleic acid encoding a secretory or membrane protein such as the protein of the present invention, a signal sequence strap (SST) method is known. This method basically creates a cDNA library derived from the target tissue and 5 'of the DNA encoding a protein that enables cell selection only when secreted or transferred to the cell membrane. Using a fusion protein expression vector integrated on the side, secretion or translocation to the cell membrane is used as an index to select cDNA encoding a secretory or membrane protein.
  • SST signal sequence strap
  • a yeast expression plasmid in which a target cDNA library is fused to the 5 'side of a mutant invertase gene with a signal sequence deletion is introduced into a yeast having a mutant invertase that cannot assimilate sucrose, and sucrose is used as a carbon source.
  • a method for selecting a yeast having a signal deficient mutant 5 '5' The mammalian expression vector obtained by fusing the DNA library is introduced into appropriate mammalian cells, and separated by immunostaining using an anti-CD25 antibody.
  • cDNA encoding a part of secreted or membrane protein can be isolated and subcloned into an appropriate cloning vector.
  • the nucleotide sequence of the cDNA thus obtained can be determined using a method known per se (such as the Maxam-Gilbert method, the dideoxy-one-minute method).
  • two types of synthetic DNA primers having the partial nucleotide sequence of the above-identified and sequenced cDNA identified above and an appropriate adapter primer are used.
  • the 5'- and 3'-RACE reactions are performed using the mRNA derived from the target tissue as type II, and the amplified fragments obtained are ligated using restriction enzymes and ligase to form a full-length cDNA.
  • a DNA containing part or all of the above-sequenced cDNA as a probe and screening again by hybridization from the library to obtain a full-length cDNA examples include, but are not limited to, methods.
  • any adapter sequence (for example, subcloning In this case, a sequence containing a restriction enzyme recognition site for signaling) with oligo dT added to the 3 ′ end may be preferably used.
  • 5′-RACE when using the intrinsic terminal transferase activity of reverse transcriptase, several dCs are mainly added, and therefore an adapter primer having dG added to the 3 ′ end can be preferably used.
  • the hybridization can be carried out by a method known per se or a method similar thereto, for example, Molecular Cloning, 2nd edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • hybridization can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the base sequence of the full-length cDNA thus obtained can be determined by a method known per se (Maxam's Gilbert method, dideoxy termination method, etc.) in the same manner as the partial sequence.
  • DNA encoding the full-length mouse SST20-14 (Short form) protein (mSst20-14 (Short form)) is obtained from, for example, a cDNA library derived from a mouse white adipose tissue loaded with a high fat diet.
  • the nucleotide sequence of the nucleic acid (mSst20-14 (partial)) obtained using the SST method and cloned into Escherichia coli TolO / pENTR / D-TOPO (20-14)
  • a DNA encoding the full-length mouse SST22-22 (Short form) protein (mSst22-22 (Short form)) having a sequence is, for example, a cDNA library derived from a mouse white adipose tissue loaded with a high fat diet. Nucleotide sequence of a nucleic acid (mSst 22-22 (partial)) obtained from E.
  • DNA encoding the full-length mouse SST8-5 protein (mSst8-5) having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 can be obtained, for example, from a cDNA library derived from a mouse white adipose tissue loaded with a high fat diet.
  • the nucleotide sequence of the nucleic acid (mSst8-5 (partial)) (SEQ ID NO: 25) obtained by using the SST method and cloned into Escherichia coli ToplO / pENTR / D-TOPO (8-5) was obtained. It can be obtained by 5'- and 3'-RACE reactions using a primer designed based on the primer and an adapter primer.
  • DNA (mSstl3-ll) encoding the full-length mouse SST13-11 protein having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 is, for example, a cDNA library derived from a mouse white adipose tissue loaded with a high fat diet.
  • nucleic acid (mSstl3-ll (partial)) obtained from the E. coli Escherichia coli ToplO / pENTR / D-TOPO (13-11) strain using the SST method SEQ ID NO: It can be obtained by 5'- and 3'-RACE reaction using a primer designed based on 27) and an adapter primer.
  • DNA (mSst9-8) encoding the full-length mouse SST9-8 protein having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 is, for example, a cDNA library derived from mouse white adipose tissue loaded with a high fat diet. From the rally using the SST method described above. And a primer designed based on the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 28) of nucleic acid 0nSst9-8 (partial) cloned into Escherichia coli TolO / pENTR / D-TOPO (9-8) strain. It can be obtained by 5'- and 3, -RACE reactions using adapter primers.
  • DNA (mSst21-3) encoding the full-length mouse SST21-3 protein having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19 is, for example, cDNA derived from mouse white adipose tissue loaded with a high fat diet.
  • DNA (mSst20-6) encoding the full-length mouse SST20-6 protein having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21 is, for example, a cDNA library derived from mouse white adipose tissue loaded with a high fat diet.
  • Base sequence of a nucleic acid (mSst20-6 (partial)) obtained from the rally using the above SST method and cloned into Escherichia coli ToplO / pENTR / D-TOPO (20-6) strain (SEQ ID NO: It can be obtained by 5'- and 3'-RACE reaction using a primer designed based on 30) and an adapter primer.
  • Escherichia coli ToplO / pENTR / D-TOPO (20-14), Escherichia coli ToplO / pENTR / D-TOPO (22-22), Escherichia coli TolO / pENTR / D-T0P0 (8-5) , Escherichia coli ToplO / pENTR / D-TOPO (19-15) strain,
  • Escherichia coli TolO / pENTR / D-TOPO 13-11) strain
  • Escherichia coli ToplO / pENTR / D-TOPO 9-8) strain
  • Escherichia coli TolO / pENTR / D-TOPO (21-3) strain
  • Escherichia coli ToplO / pENTR / D-TOPO (20-6) strains are FERM BP-8104, FERM BP-8109, FERM BP-8110, FERM BP-8108, FERM BP-8107, FERM BP-8105, FERM BP, respectively.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention is a DNA of the amino acid sequence represented by each of the above SEQ ID NOs (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, or 22). Any nucleotide may be used as long as it contains a nucleotide sequence encoding a peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, (1) a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by each of the above SEQ ID NOs or (2) a nucleotide represented by each of the above SEQ ID NOs: It has a base sequence that hybridizes under high stringent conditions to DNA having a sequence, and has substantially the same activity as the above-mentioned protein of the present invention (eg, binding activity of receptor (or ligand), signaling activity, etc.) ) Which encodes a peptide having
  • Examples of the DNA that can hybridize with the DNA having the nucleotide sequence represented by each of the above-mentioned SEQ ID NOs under high stringent conditions include, for example, about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably Examples include a DNA containing a nucleotide sequence having an identity of about 80% or more, most preferably about 90% or more.
  • High stringency conditions include the same conditions as above.
  • the nucleotide sequence of the cloned DNA encoding the protein of the present invention or its partial peptide can be obtained from known kits such as Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo), Mutan TM -K (Takara Shuzo) )), ODA-LA PCR,
  • the conversion can be carried out according to a method known per se, such as the gapped duplex method and the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the cloned DNA can be used as it is depending on the purpose, or after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG at the 5 'end as a translation initiation codon, and may have TAA, TGA or TAG at the 3' end as a translation stop codon. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using a suitable synthetic DNA adapter.
  • DNA containing the above-described protein of the present invention or a partial peptide thereof is included.
  • the protein (peptide) of the present invention can be produced.
  • An expression vector containing a DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof can be obtained, for example, by cutting out a DNA fragment of interest from the DNA encoding the protein and placing the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by connecting to
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13); Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194); yeast Derived plasmids (eg, pSH19, pSH15); insect cell expression plasmids (eg, pFast—Bac); animal cell expression plasmids (eg, PAI-11, pXTl, pRcZCMV, pRc / RSV, bacteriophage such as ⁇ phage; insect virus vectors such as baculovirus (eg, BmNPV, AcNPV); animal virus vectors such as retrovirus, vaccinia virus, and adenovirus.
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • the promoter may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SR promoter SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (Rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (molo mouse) Leukemia virus) LTR, HS V-TK (simple virus virus thymidine kinase) Promoter etc.
  • CMV promoter, SRa promoter and the like are preferable.
  • trp promoter Isseki one 1 ac promoter - coater, re cA promoter one, eh P L promoter, lpp promoter evening one, such as T 7 promoter are preferred.
  • the SPO1 promoter, SP02 promoter, penP promoter and the like are preferable.
  • PH ⁇ 5 promoter PH ⁇ 5 promoter
  • PGK promoter G
  • G An AP promoter, an ADH promoter and the like are preferred.
  • a polyhedrin promoter When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferred.
  • an expression vector in addition to the above, those containing an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori) and the like, if desired, etc. Can be used.
  • the selection marker include dihydrofolate reductase gene (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr, Mesotorekise Ichito (M TX) resistance), the ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as # 038 r), neomycin Resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as neo 1 , G418 resistance), etc.
  • dh fr gene-deficient Chinese Hamster cells are used and the dh fr gene is used as a selection marker, thymidine is included.
  • the target gene can also be selected depending on the medium used.
  • a base sequence (signal codon) encoding a signal sequence suitable for the host may be added to the 5 ′ end of the DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof (or a native signal codon). With).
  • the host when the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a PhoA * signal sequence, an OmpA signal sequence, and the like:
  • the host When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, an ⁇ -amylase signal sequence, a subtilisin signal sequence, and the like;
  • yeast In the case of yeast, MF-signal sequence, SUC2-signal sequence, etc .
  • insulin-signal sequence, hyphen-feron, signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. are used, respectively. It is possible.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia coli K12 ⁇ DH1 [Procedures of the National Academy of Sciences, Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], Escherichia coli JM103 [Nucleic Acids Research, Vol. 9, 309 (1981)), Escherichia Kori J 221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)] ], Escherichia coli 101 (Journal of Molecular Molecular Biology, 41, 459 (1969)), Escherichia coli C600 (Genetics, 39, 440 (1954)), etc. Is used.
  • Bacillus species include, for example, Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) MI 114 (Gene, 24, 255 (1983)), Bacillus subtilis 207-21 (Journal of Bob Biochemistry).
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R—, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12 Schizosaccharomyces pombe NCYC 1913, NCYC2036, Pichia 'Pastris
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from night larvae of moth larvae (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, and High Five derived from eggs of Trichoplusia ni TM cells, cells derived from Mamestra brass icae, cells derived from Estigmena acrea, and the like.
  • the virus is BmNPV
  • the insect cells include silkworm-derived cell lines.
  • Sf cell (Bombyx mori N cells; BmN cells).
  • Sf9 cell ATCC CRL1711
  • Sf21 cell (Vaughn, 'JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like. Is used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, Vol. 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey COS-7 cells, monkey Vero cells, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dh fr Gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr-) cells), mouse L cells, mouse AtT-20 cells, mouse myeoma cells, rat GH3 cells, human FL cells, etc. are used. .
  • Transformation can be performed according to a known method depending on the type of host.
  • the genus Escherichia is described in, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Proc. Natl. Acad. Sci. (1972) and Gene ; 17 ; 107 (1982).
  • Bacillus sp. Can be transformed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168, 11 (1979).
  • Yeasts are, for example, Methods in Enzymology
  • Insect cells and insects are, for example, biotechnology
  • Animal cells are transformed according to the method described in, for example, Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experimental Protocol, 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973).
  • the culturing of the transformant can be carried out according to a known method depending on the type of the host.
  • a liquid medium is preferable as the medium used for the culture.
  • the medium contains the carbon source, nitrogen source, inorganic substances, etc. necessary for the growth of the transformant.
  • a carbon source for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc .
  • a nitrogen source for example, ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, Inorganic or organic substances such as soybean meal and potato extract
  • examples of the inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • the medium may be supplemented with yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like.
  • the pH of the medium is preferably from about 5 to about 8.
  • a medium for culturing a transformant whose host is Escherichia sp. For example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Ja-Nar-Ov-Esperimen 'in' Molecular ⁇ Genetics (Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] are preferred.
  • an agent such as 3-indolylacrylic acid may be added to the medium to make the promoter work efficiently.
  • Culture of a transformant whose host is a bacterium belonging to the genus Escherichia is usually performed at about 15 to about 43 ° C. for about 3 to about 24 hours. If necessary, ventilation or stirring may be performed.
  • Culture of the transformant whose host is a bacterium of the genus Bacillus is usually performed at about 30 to about 40 ° C. for about 6 to about 24 hours. If necessary, ventilation or stirring may be performed.
  • a medium for culturing a transformant in which the host is yeast for example, a minimal medium (Burkholder) minimum medium [Bostian, KL, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, Inc. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] and SD medium containing 0.5% casamino acid CBitter, GA, Proc. Prob. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5 330 (1 984)].
  • the pH of the medium is preferably from about 5 to about 8.
  • the cultivation is usually performed at about 20 to about 35, for about 24 to about 72 hours. Ventilation or stirring may be performed as necessary.
  • a medium for culturing an insect cell or a transformant whose host is an insect for example, 10% inactivated in Grace's Insect Medium [Grace, T., Nature, 195, 788 (1962)] Those to which additives such as serum are appropriately added are used.
  • the pH of the medium is preferably from about 6.2 to about 6.4. Culturing is usually about 27, and is performed for about 3 to about 5 days. Ventilation or stirring may be performed as necessary.
  • the pH of the medium is preferably from about 6 to about 8.
  • the cultivation is usually about 30 to about 40, and is performed for about 15 to about 60 hours. Aeration and stirring may be performed as necessary.
  • the protein (peptide) of the present invention can be produced inside or outside the cells of the transformant.
  • the protein (peptide) of the present invention can be separated and purified from a culture obtained by culturing the transformant according to a method known per se.
  • the cells or cells collected from the culture by a known method are suspended in an appropriate buffer, and then subjected to ultrasound, lysozyme and After the cells or cells are destroyed by freeze-thawing or the like, a method of obtaining a crude extract of soluble protein by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM .
  • the protein (peptide) of the present invention contained in the soluble fraction, membrane fraction or culture supernatant thus obtained can be isolated and purified according to a method known per se.
  • Such methods include methods that utilize solubility such as salting out and solvent precipitation; methods that mainly use differences in molecular weight, such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Method; method using difference in charge such as ion exchange chromatography; method using specific affinity such as affinity chromatography; use difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography A method utilizing a difference between isoelectric points, such as isoelectric focusing, and the like. These methods can be appropriately combined.
  • the free form can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and when the protein or peptide is obtained as a salt, The salt can be converted into a free form or another salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • the protein (peptide) of the present invention produced by the transformant may be arbitrarily modified or the polypeptide may be partially removed before or after purification by the action of an appropriate protein-modifying enzyme. You can also.
  • the protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the protein (peptide) of the present invention is a non-human protein consisting of an RNA corresponding to the DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof as a type II, such as a heron reticulocyte lysate, a wheat germ lysate, and an Escherichia coli lysate.
  • a DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof can also be synthesized in type III using a cell-free transcription Z translation system containing RNA polymerase.
  • the protein of the present invention (ie, identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 16, 18, 20, or 22)
  • the resulting nucleic acid can be said to be “antisense” to the target nucleic acid, while a nucleic acid containing a base sequence having homology to the target region of the target nucleic acid is referred to as a “sense” to the target nucleic acid.
  • “having homology” or “complementary” refers to about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more between base sequences.
  • the nucleic acid has a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention or a part thereof (hereinafter, referred to as “95% or more identity or complementarity”).
  • the “antisense nucleic acid of the present invention” may be designed and synthesized based on the cloned or determined base sequence information of the nucleic acid encoding the protein of the present invention.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can hybridize with the RNA transcribed from the gene encoding the protein of the present invention. , It is possible to inhibit the synthesis of mR NA (processing) or function (translation into protein).
  • the target region of the antisense nucleic acid of the present invention is a hybrid where the antisense nucleic acid is hybridized.
  • the length is not particularly limited as long as the translation of the protein of the present invention is inhibited as a result.
  • the entire sequence of the mRNA encoding the protein may be a partial sequence.
  • the short one may be about 15 bases, and the long one may be the entire sequence of mRNA or early transcript. Considering the ease of synthesis and antigenicity, oligonucleotides consisting of about 15 to about 30 bases are preferred, but not limited thereto.
  • the 5'-end hairpin loop, 5'-end 6—base pair 'repeat, 5'-end untranslated region, 5'-end untranslated region, polypeptide translation initiation codon, and protein coding region of the nucleic acid encoding the protein of the present invention can be selected as target regions, but any region in the gene encoding the protein of the present invention can be selected. Can be selected as target. For example, it is also preferable to use the intron portion of the gene as a target region.
  • the antisense nucleic acid of the present invention not only hybridizes with mRNA or the initial transcript encoding the protein of the present invention to inhibit translation into the protein, but also encodes the protein of the present invention which is a double-stranded DNA. May form a triplex (tripleplex) by binding to a gene that causes RNA transcription.
  • Antisense nucleic acids may be deoxysilipnucleotides containing 2-dexoxy_D-reports, ribonucleotides containing D-reports, or other types of nucleotides that are N-glycosides of primines or pyrimidine bases. Or other polymers having a non-nucleotide backbone (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds (provided that the polymer is in DNA or RNA) Pairing of bases (including nucleotides having a configuration that allows base attachment) as described in (1).
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can also be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides).
  • Natural nucleotides substituted by analogs modified intramolecular nucleotides, such as those with uncharged bonds (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), charged bonds Or those having sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), such as proteins (nucleases, nucleases, inhibitors, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) , Sugars (eg, monosaccharides, etc.) with side-chain groups, in-current compounds (eg, acridine, psoralen, etc.), chelating compounds (eg, metals, radioactive metals) , Boron, oxidizing metals, etc.) Those containing alkylating agents, those with modified linkages (e.g.
  • nucleic acid may be used.
  • the “nucleoside”, “nucleotide” and “nucleic acid” may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or functionalities such as ethers, amines, etc. It may be converted to a group.
  • Antisense nucleic acids are RNA, DNA, or modified nucleic acids (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and polynucleoside amides, which are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • Antisense nucleic acids can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to make the antisense nucleic acid more cell permeable, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Make sense nucleic acids less toxic. Many such modifications are known in the art, for example, J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; disclosed in ST Crooke et al. Ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993.
  • Antisense nucleic acids can contain altered or modified sugars, bases, or linkages, can be provided in special forms such as ribosomes, microspheres, applied by gene therapy, or added forms.
  • the addition forms include polycations such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, and lipids, which enhance the interaction with cell membranes and increase the uptake of nucleic acids ( For example, crude water-based substances such as phospholipids and cholesterol are exemplified.
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acid can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups that are specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids to prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNases.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, such as dalicol such as polyethylene dalicol and tetraethylene glycol.
  • a ribozyme capable of specifically cleaving mRNA or an early transcript encoding the protein of the present invention inside the coding region (including an intron portion in the case of the initial transcript) is also included in the antisense nucleic acid of the present invention.
  • the term "ribozyme” refers to RNA having an enzymatic activity for cleaving a nucleic acid. Recently, it has been revealed that oligo DNA having the nucleotide sequence of the enzyme active site also has a nucleic acid-cleaving activity. Therefore, in the present specification, the term is used as a concept including DNA as long as it has sequence-specific nucleic acid cleavage activity.
  • the most versatile liposomes include self-splicing RNAs found in infectious RNAs such as Viroid and Willsoid, and hammerhead and hairpin types are known.
  • Hammerhead type is about 40 bases
  • the target mRNA can be expressed by decomposing the target mRNA by making several bases (about 10 bases in total) at both ends adjacent to the hammerhead structure into a sequence that is complementary to the desired cleavage site of the mRNA.
  • This type of ribozyme has the additional advantage that it does not attack genomic DNA, since it uses only RNA as a substrate.
  • the target sequence can be determined by using a hybrid liposome linked to an RNA motif derived from a viral nucleic acid that can specifically bind to an RNA helicase. Acad. Sci. USA, 98 (10): 5572-5577 (2001)].
  • the ribozyme is used in the form of an expression vector containing the DNA encoding the ribozyme, a hybrid in which a tRNA-modified sequence is further ligated to promote the transfer of the transcript to the cytoplasm. It can also be used as a driposium [Nucleic Acids Res., 29 (13): 2780-2788 (2001)].
  • RNA interference RNA interference
  • the antisense oligonucleotide and ribozyme of the present invention determine the target region of mRNA or early transcript based on the cDNA or genomic DNA sequence information encoding the protein of the present invention, and are commercially available DNAZRNA automated. It can be prepared by synthesizing a complementary sequence using a synthesizer (Applied Biosystems, Beckman, etc.). For siRNA having RNAi activity, the sense strand and the antisense strand are each synthesized using a DNAZRNA automatic synthesizer, denatured in a suitable annealing buffer, for example, at about 90 to about 95, for about 1 minute, and then denatured.
  • About 30 to about 70 and about 1 to about 8 It can be prepared by annealing for a time. It is also possible to prepare longer double-stranded polynucleotides by synthesizing complementary oligonucleotide strands so that they alternate with each other, annealing them, and ligating them with ligase. it can.
  • the gene expression-inhibiting activity of the antisense nucleic acid of the present invention may be determined by using a transformant containing the nucleic acid encoding the protein of the present invention, a gene expression system encoding the protein of the present invention in vivo or in vitro, or a gene expression system encoding the same. It can be examined using a translation system of the protein of the invention in vivo or in vitro.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
  • the present invention also provides an antibody against the protein (peptide) of the present invention.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody as long as it has a specific affinity for the protein (peptide) of the present invention.
  • An antibody against the protein (peptide) of the present invention can be produced by using the protein (peptide) as an antigen according to a method known per se for producing an antibody or antiserum.
  • the protein (peptide) of the present invention is administered to a mammal at a site where the antibody can be produced by administration, itself or together with a carrier and a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, ⁇ herons, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and mice and rats are preferably used.
  • a mammal immunized with the antigen for example, a mouse with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma By fusing the antibody-producing cells contained with the myeloma cells, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the measurement of the antibody titer in the antiserum is performed, for example, by labeling described below. After reacting SS169s with antiserum, the activity can be measured by measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Kera and Milstein [Nature (Nature, 256, 495, 1975)].
  • Glycol (PEG), Sendai virus and the like can be mentioned, but PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P3U1, and 3 to 20, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and the concentration of PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is about 10 to 80%.
  • the cell fusion can be carried out efficiently by incubating at about 20 to 40, preferably about 30 to 37 for about 1 to 10 minutes.
  • a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) on which an antigen such as a protein is adsorbed directly or together with a carrier.
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme if the cell used for cell fusion is a mouse, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A, is added, and the monoclonal antibody bound to the solid phase is added.
  • Detection method Hybridoma culture supernatant is added to the solid phase to which anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, and proteins etc.
  • the selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, but is usually carried out in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GI ⁇ medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or hybridoma culture containing 1 to 10% fetal bovine serum Serum-free medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used.
  • the culture temperature is Usually it is 20 to 40, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified in the same manner as ordinary polyclonal antibodies.
  • salting out alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchanger ( (E.g., DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific antibody that only binds to the active adsorbent such as protein A or protein G and dissociates the bond to obtain the antibody Purification method].
  • ion exchanger (E.g., DEAE) adsorption / desorption method
  • ultracentrifugation method ultracentrifugation method
  • gel filtration method antigen-binding solid phase or specific antibody that only binds to the active adsorbent such as protein A or protein G and dissociates the bond to obtain the antibody Purification method.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (an antigen such as a protein) and a carrier-protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody, and the protein (peptide) of the present invention is immunized from the immunized animal. ) Can be produced by collecting the antibody-containing substance against and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio between the carrier and the hapten are determined by the fact that the antibody is efficiently used for the hapten immunized by crosslinking the carrier. If possible, any material may be cross-linked at any ratio.For example, serum serum albumin, thyroglobulin, keyhole 'limpet' hemocyanin, etc. in a weight ratio of 1 hapten to 1 hapten About 0.:! A method of coupling at a rate of about 20 to 20 and preferably about 1 to 5 is used.
  • condensation product is administered to a mammal at a site where antibody production is possible or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, preferably ascites, etc., of a mammal immunized by the above method, preferably from blood.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above.
  • the separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
  • Expression localization eg, white adipose tissue, brown adipose tissue, liver, skeletal muscle, etc.
  • high stress conditions eg, high-fat diet, fasting, re-feeding after fasting, stimulation of insulin resistance inducer
  • the expression fluctuations are based on the cloned cDNA as it is or on the determined base sequence.
  • Identification can be performed by performing quantitative RT-PCR using synthetic oligonucleotides as primers.
  • All of the genes encoding the protein of the present invention are highly expressed in white adipose tissue loaded with a high fat diet.
  • the Sst20-14 gene shows expression specific to white adipose tissue
  • the Sstl9-15, Sstl3-ll, Sst9-8, and Sst23 genes are also expressed in brown adipose tissue.
  • the Sst21-3 gene is also expressed in undifferentiated preadipocytes.
  • the expression of the Sst20-14 gene decreases during fasting, and increases (recovers) after refasting after fasting. Further, the expression of the gene decreases in response to stimulation of an insulin resistance-inducing factor such as TNF-string. Also, due to overexpression of the gene, Differentiation of preadipocytes into mature adipocytes is suppressed.
  • the expression of the Sst8-5 gene increases in response to stimulation of an insulin sensitizer.
  • the expression of the Sstl3-11 gene decreases during fasting, and increases (recovers) after refasting after fasting.
  • the expression of the gene increases in response to high fat and high sucrose load. Furthermore, the gene is highly expressed in obesity models.
  • the expression of the Sst21-3 gene decreases during fasting, and increases (recovers) after refasting after fasting.
  • the gene is highly expressed in a diabetes model.
  • the expression of the Sstl9-15 gene also decreases during fasting, and increases (recovers) when fasted again.
  • the expression of the gene encoding the protein of the present invention varies in response to diet or stimulation of insulin resistance regulators, or in obesity or diabetes, and in the expression of fat cells Affects differentiation.
  • the protein (peptide) of the present invention a nucleic acid (including an antisense nucleic acid) encoding the protein (peptide), and an antibody against the protein (peptide) are: Determination of a compound having a specific affinity (a ligand for the protein of the present invention if it is a membrane protein, a receptor for a secretory protein if it is a secretory protein), (2) a disease associated with dysfunction of the protein of the present invention (3) Prevention and treatment of diseases associated with overexpression of the protein of the present invention, (4) Gene diagnostic agent, (5) Screening for compounds that alter the expression level of the protein of the present invention A method for preventing or treating various diseases containing a compound that alters the expression level of the protein of the present invention, (7) a method for quantifying a compound having a specific affinity for the protein of the present invention, 8) a method for screening a compound (eg, agonist, angonist, etc.) that changes the binding property between the protein of the present invention and a compound having
  • prophylactic / therapeutic agents for various diseases which contain compounds (argonist, angonist gonist) that change the binding property to a compound having a specific affinity for the protein and (10) the protein (peptide of the present invention) (11) a method of screening for a compound that alters the amount of the protein of the present invention in the cell membrane or extracellular fluid; (12) a method of altering the amount of the protein of the present invention in the cell membrane or extracellular fluid.
  • Prophylactic / therapeutic agents for various diseases containing a compound to be added; (13) the protein of the present invention;
  • non-human transgenic animal having a DNA encoding the (peptide), (14) for producing a knockout non-human animal in which the gene encoding the protein of the present invention is inactivated, and the like.
  • the protein (peptide) of the present invention is a compound having a specific affinity for the protein of the present invention or a salt thereof (receptase). Or ligand) is useful as a reagent for searching or determining.
  • the present invention provides a method for determining a compound having a specific affinity for the protein of the present invention or a salt thereof, which comprises contacting the protein (peptide) of the present invention with a test compound.
  • the protein of the present invention is a membrane receptor
  • a known ligand eg, angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid
  • Purine vasopleucine, oxytocin, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatos, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal and Restricted Polypeptide), somatosuccine , Dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcito-ningene relayed peptide), leukotriene, pancreastati , Prostaglandins, thromboxanes, adenosine, adrenaline, paraffin and] 3-chemokines (eg,
  • the tissue extract, cell culture supernatant, or the like is added to the receptor protein of the present invention, and fractionation is performed while measuring cell stimulating activity and the like, thereby finally obtaining a single ligand.
  • the test compound may be, for example, a human or mammalian tissue extract, an intact cell, or a cell membrane fraction in the same manner as described above, in addition to the known receptor for the ligand.
  • Cell culture supernatant and the like are used.
  • the tissue extract, intact cells, cell membrane fraction, cell culture supernatant, and the like are added to the secreted protein of the present invention, and fractionated while measuring cell stimulating activity and the like. Etc. can be obtained.
  • a method for determining a compound having a specific affinity for the protein of the present invention or a salt thereof uses the protein (peptide) of the present invention or expresses the protein (peptide) by recombination.
  • the cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca. 2+ release, intracellular c AMP generation, intracellular c GMP generation, inositol phosphate production, fluctuations in cell membrane potential, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc.
  • the secretory protein of the present invention and Compound of having stimulatory activity, or a method to determine their salts eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca).
  • the cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca
  • 2+ release intracellular c AMP generation, intracellular c GMP generation, inositol phosphat
  • the protein (peptide) of the present invention is contacted with a test compound.
  • a test compound for example, the amount of a test compound bound to the protein (peptide), cell stimulating activity, and the like are measured.
  • the present invention provides
  • the protein of the present invention or a protein thereof which is characterized by measuring the amount of binding of the labeled test compound to the protein (peptide) when the labeled test compound is brought into contact with the protein (peptide) of the present invention.
  • a method for determining a compound having a specific affinity for a salt is characterized by measuring the amount of binding of the labeled test compound to the protein (peptide) when the labeled test compound is brought into contact with the protein (peptide) of the present invention.
  • a labeled test compound is added to a cell or cell membrane fraction that produces the protein of the present invention, or an extracellular solution or cell culture supernatant (for example, in this case, a solid phase on which the antibody of the present invention is immobilized (cell culture) Immobilizing the secreted protein using a plate, etc.), and measuring the amount of the labeled test compound bound to the cells, the membrane fraction, the extracellular solution, or the cell culture supernatant.
  • the labeled test compound was expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the protein of the present invention or its partial peptide, or secreted into the culture supernatant.
  • a protein for example, the secretory protein (peptide) is immobilized using a solid phase (cell culture plate or the like) on which the antibody of the present invention is immobilized
  • a method for determining a compound having a specific affinity for the protein or a salt thereof of the present invention which comprises measuring the amount of binding of the identified test compound to the protein or a salt thereof.
  • the test compound (or a cell containing a test compound such as a membrane protein on the cell membrane) is transferred to a cell producing the membrane protein of the present invention (or a culture supernatant of a cell producing the secretory protein of the present invention).
  • Cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular
  • cAMP production e.g, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular
  • a membrane protein which is a test compound when contacted cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, pH reduction, etc.
  • test compound (or a cell containing a membrane protein or the like as a test compound on the cell membrane) is expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing a DNA encoding the membrane protein of the present invention.
  • the membrane of the present invention when contacted with the membrane protein (or the secretory protein secreted in the culture supernatant by culturing a transformant containing the DNA encoding the secretory protein of the present invention).
  • ⁇ white matter (or test compound in a membrane protein, etc.) mediated cell stimulating activity e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular C AM P production, intracellular c GM P product, inositol Phosphate production, cell membrane potential fluctuations, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, activity to promote or suppress pH reduction, etc.
  • test compound binds to the protein (peptide) of the present invention.
  • the protein (peptide) of the present invention used in the method for determining a ligand (or receptor) may be any of the above-described protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof.
  • the recombinant protein of the present invention and the like, which are expressed in a large amount by using it, are suitable.
  • the above-mentioned expression method is used for producing the recombinant protein of the present invention, but it is preferable to express the DNA encoding the protein of the present invention in mammalian cells or insect cells.
  • cDNA is usually used, but is not necessarily limited to this.
  • a gene fragment or a synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment should be a promoter derived from SV40. Overnight, retrovirus promoter, meta-oral thionein promoter, human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, evening, SRO!
  • the protein (peptide) of the present invention is obtained by purifying the protein of the present invention by a method known per se.
  • the cells When cells producing the protein (peptide) of the present invention are used in the method for determining a ligand of the present invention, the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the protein (peptide) of the present invention refers to a host cell expressing the protein (peptide) of the present invention.
  • Examples of the host cell include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, and animal cells. Are used.
  • the cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • the cells can be disrupted by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Perling blender or a polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, pressing the cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press, etc. Fracture by eruption is mentioned.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • cell lysate may be prepared at low speed (500 rpm to 3,000 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes).
  • the membrane fraction is rich in the expressed protein (peptide) of the present invention and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • an appropriate protein (peptide) -containing membrane fraction of the present invention and a labeled test compound are required.
  • the protein (peptide) -containing membrane fraction of the present invention may be a natural protein-containing membrane fraction of the present invention, or a recombinant protein (peptide) -containing membrane fraction of the present invention having an activity equivalent thereto. Minutes are desirable.
  • equivalent activity means equivalent ligand binding activity, signal transduction action, and the like.
  • a cell producing the protein (peptide) of the present invention or a membrane fraction thereof is suspended in a buffer suitable for the determination method.
  • the protein (peptide) standard of the present invention is prepared by turbidity.
  • the buffer may be any buffer that does not inhibit the binding between the protein of the present invention and its ligand, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) and a buffer of Tris-HCl.
  • surfactants such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Atlas), digitonin, and dexcholate are used to buffer various proteins such as serum albumin and gelatin. Can also be added.
  • a protease inhibitor such as PMSF, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), and peptide suptin can be added for the purpose of suppressing the degradation of the receptor and the ligand by the protease. 0.01 protein m.
  • a test compound in which the count (B-NSB) obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the total binding amount (B) exceeds 0 cpm is selected as a ligand (agonist) for the protein of the present invention or a salt thereof. can do.
  • a cell stimulating activity mediated by the protein of the present invention for example, 'Acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular CAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activity Activity or activity for promoting pH reduction, etc.
  • a cell stimulating activity mediated by the protein of the present invention for example, 'Acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular CAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activity Activity or activity for promoting pH reduction, etc.
  • a known method or a commercially available measurement kit Specifically, first, cells producing the protein of the present invention, (peptide), are cultured in a multiwell plate or the like.
  • the activity of inhibiting the production of MP can be detected as the activity of inhibiting the production of cells whose basal production has been increased by forskolin or the like.
  • a kit for determining a compound having specific affinity for the protein of the present invention or a salt thereof comprises a protein (peptide) of the present invention, a cell producing the protein of the present invention or a membrane fraction thereof, and a protein of the present invention. It contains the culture supernatant of secreted cells.
  • kits for determining a ligand (receptor) of the present invention include the following.
  • CHO cells expressing the protein (peptide) of the present invention were subcultured on a 12-well plate in 5 ⁇ 10 5 Z-wells and cultured for 2 days at 37 ° C., 5% C 2 , and 95% air. (When the protein of the present invention is a secreted protein, the plate is coated with an antibody against the protein).
  • Test compounds that are poorly soluble in water should be dissolved in dimethylformamide, DMSO, methanol, etc.
  • the same as the labeling compound is prepared at a concentration 100 to 1,000 times higher.
  • Examples of the ligand capable of binding to the membrane protein of the present invention or a salt thereof include substances specifically present in the brain, pituitary gland, kidney and the like. Physically, angiotensin, bombesin, canapinoids, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, obioid, pudding, vasoprescin, oxitocin, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adreno, medutin, medutin , GHRH.
  • oral tensin, TRH, pancreatic polypeptide, and galanin are used.
  • the protein (peptide) of the present invention or (2) the protein (peptide) depends on the action of the compound.
  • Can be used as a medicament such as an agent for preventing or treating diseases associated with dysfunction of the protein of the present invention.
  • the protein (peptide) of the present invention when there is a patient who cannot expect the physiological action of the ligand (or the receptor) due to a decrease in the protein of the present invention in a living body (deficiency of the protein of the present invention), 1) the protein (peptide) of the present invention Is administered to the patient to replenish the amount of the protein of the present invention, or (2) the DNA encoding the protein (peptide) of the present invention is administered to the patient for expression, or (mouth) DNA encoding the protein (peptide) of the present invention is introduced into By transplanting the cells into the patient after the expression, the amount of the protein of the present invention in the body of the patient can be increased, and the effect of the ligand (or receptor) can be sufficiently exerted. That is, the protein (peptide) of the present invention or DNA encoding the same is useful as a safe and low toxic agent for the prophylaxis or treatment of diseases associated with dysfunction of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention is highly expressed in white adipocytes during high-fat diet load stress, and its expression fluctuates depending on diet, stimulation with insulin resistance regulators, obesity / diabetes, and the like.
  • Diseases related to the dysfunction of the protein of the present invention include abnormalities (insufficiency or enhancement) of adipocyte differentiation and Z or metabolic functions (particularly sugar / lipid metabolism).
  • -Related diseases eg, obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc.).
  • the protein (peptide) of the present invention and (2) the DNA encoding the protein (peptide) are pharmacologically acceptable, if necessary. It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of the protein of the present invention after being mixed with a possible carrier to form a pharmaceutical composition.
  • the pharmacologically acceptable carrier various organic or inorganic carrier substances commonly used as a drug substance are used, such as a solid preparation, a lubricant, a binder, a disintegrant, and a solvent in a liquid preparation. It is formulated as a solubilizer, suspending agent, isotonic agent, buffer, soothing agent, and the like. If necessary, pharmaceutical additives such as preservatives, antioxidants, coloring agents and sweeteners can also be used.
  • excipients include lactose, sucrose, D-mannitol, D-sorbitol, starch, starch arsenide, dextrin, crystalline cellulose, low-substituted hydroxypropylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, gum arabic, dextrin , Pullulan, light citric anhydride, synthetic citric acid aluminum, magnesium metasilicate, and the like.
  • the lubricant include magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloidal silica and the like.
  • Preferred examples of the binder include starch arsenide, sucrose, gelatin, gum arabic, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, crystalline cellulose, sucrose, D_mannitol, trehalose, dextrin, pullulan, and hydroxypropyl Cellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone and the like can be mentioned.
  • Preferred examples of the disintegrant include lactose, sucrose, starch, carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium, light caustic anhydride, and low-substituted hydroxypropylcellulose. No.
  • Preferred examples of the solvent include water for injection, physiological saline, Ringer's solution, alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol, sesame oil, corn oil, olive oil, cottonseed oil and the like.
  • solubilizers include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, trehalose, benzyl benzoate, ethanolyl, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, and quinic acid.
  • solubilizers include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, trehalose, benzyl benzoate, ethanolyl, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, and quinic acid.
  • suspending agent examples include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzal conidum chloride, benzethonium chloride and glyceryl monostearate; Hydrophilic polymers such as polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and hydroxypropylcellulose; polysorbates, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, etc. Can be surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzal conidum chloride, benzethonium chloride and glyceryl monostearate; Hydrophilic polymers such as polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyeth
  • Preferred examples of the tonicity agent include sodium chloride, glycerin, D-mannitol, D-sorbitol, glucose and the like.
  • Preferred examples of the buffer include buffers such as phosphate, acetate, carbonate, and citrate.
  • Preferred examples of the soothing agent include benzyl alcohol and the like.
  • Preferable examples of the preservative include paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • Suitable examples of the antioxidant include sulfite, ascorbate and the like.
  • coloring agents include water-soluble edible tar dyes (e.g., edible pigments such as edible red Nos. 2 and 3, edible yellows 4 and 5, edible blues 1 and 2, water-insoluble Lake dyes (eg, the aluminum salt of the water-soluble edible tar dye, etc.);
  • water-soluble edible tar dyes e.g., edible pigments such as edible red Nos. 2 and 3, edible yellows 4 and 5, edible blues 1 and 2, water-insoluble Lake dyes (eg, the aluminum salt of the water-soluble edible tar dye, etc.);
  • Preferred examples of the sweetener include saccharin sodium, dipotassium glycyrrhizinate, aspartame, stevia and the like.
  • Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition include oral preparations such as tablets, capsules (including soft capsules and microcapsules), granules, powders, syrups, emulsions, and suspensions; and injections (eg, Subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, etc.), external preparations (eg, nasal preparations, transdermal preparations, ointments, etc.), suppositories (eg, rectal suppositories, Parenteral preparations such as vaginal suppositories, pellets, drops, and sustained-release preparations (eg, sustained-release microcapsules).
  • oral preparations such as tablets, capsules (including soft capsules and microcapsules), granules, powders, syrups, emulsions, and suspensions
  • injections eg, Subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, etc.
  • external preparations
  • the pharmaceutical composition can be produced by a method commonly used in the field of formulation technology, for example, the method described in the Japanese Pharmacopoeia and the like. Hereinafter, the specific production method of the drug product will be described in detail.
  • the content of the active ingredient in the pharmaceutical composition varies depending on the dosage form, the dose of the active ingredient and the like, but is, for example, about 0.1 to 100% by weight.
  • oral preparations include, as active ingredients, excipients (eg, lactose, sucrose, starch, D-mannitol, etc.), disintegrants (eg, carboxymethylcellulose calcium, etc.), binders (eg, pregelatinized starch). , Gum arabic, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, etc.) or lubricants (eg, talc, magnesium stearate, polyethylene glycol 600, etc.) and compression molding Then, if necessary, taste It is produced by coating with a coating base by a method known per se for the purpose of soaking, enteric coating or persistence.
  • excipients eg, lactose, sucrose, starch, D-mannitol, etc.
  • disintegrants eg, carboxymethylcellulose calcium, etc.
  • binders eg, pregelatinized starch.
  • binders eg, pregelatinized starch.
  • binders
  • the coating base examples include a sugar coating base, a water-soluble film coating base, an enteric film coating base, a sustained release film coating base, and the like.
  • sucrose is used, and one or more kinds selected from talc, precipitated calcium carbonate, gelatin, gum arabic, pullulan, carnauba wax and the like may be used in combination.
  • water-soluble film coating base examples include cellulosic polymers such as hydroxypropylcellulose, hydro'xypropylmethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and methylhydroxyethylcellulose; polyvinylacetate-l-ethylacetylaminoacetate. And synthetic polymers such as aminoalkyl methacrylate copolymer E (Eudragit E (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.) and polyvinylpyrrolidone; and polysaccharides such as pullulan.
  • cellulosic polymers such as hydroxypropylcellulose, hydro'xypropylmethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and methylhydroxyethylcellulose
  • polyvinylacetate-l-ethylacetylaminoacetate examples include polyvinylacetate-l-ethylacetylaminoacetate.
  • synthetic polymers such as aminoalkyl methacrylate copolymer E (Eudragit E (trade name), Rohm Pharma
  • enteric film coating base examples include cellulosic polymers such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate, hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate, carboxymethylethylcellulose, and cellulose acetate phthalate; Copolymer L [Eudragit L (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.], Methacrylic acid copolymer LD [Eudragit L-1 30 D55 (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.], Methacrylic acid copolymer S [Eudragit S (trade name) And Rohm Pharma Co.]; natural products such as shellac.
  • cellulosic polymers such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate, hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate, carboxymethylethylcellulose, and cellulose acetate phthalate
  • Copolymer L Eudragit L (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.]
  • Methacrylic acid copolymer LD Eudragit L-1 30 D55 (
  • sustained-release film coating base examples include cellulosic polymers such as ethyl cellulose; aminoalkyl methacrylate copolymer RS (Eudragit RS (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.), ethyl acrylate, methacrylic acid An acrylic acid polymer such as a methyl copolymer suspension [Eudragit NE (trade name) Rohm Pharma Co., Ltd.].
  • cellulosic polymers such as ethyl cellulose; aminoalkyl methacrylate copolymer RS (Eudragit RS (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.), ethyl acrylate, methacrylic acid
  • An acrylic acid polymer such as a methyl copolymer suspension [Eudragit NE (trade name) Rohm Pharma Co., Ltd.].
  • the above-mentioned coating bases are used by mixing two or more kinds thereof at an appropriate ratio. You may. Further, at the time of coating, a light-shielding agent such as titanium oxide, iron sesquioxide and the like may be used.
  • Injectables contain active ingredients as dispersants (eg, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, etc., polyethylene glycol, carboxymethylcellulose, sodium alginate, etc.), preservatives (eg, methylparaben, pulpylparaben, benzyl) Alcohol, chlorobutanol, phenol, etc.), isotonic agents (eg, sodium chloride, glycerin, D-mannitol, D-sorbitol, dextrose, etc.) and aqueous solvents (eg, distilled water, physiological saline, Ringer's solution) It is manufactured by dissolving, suspending or emulsifying in an oily solvent (eg, vegetable oil such as olive oil, sesame oil, cottonseed oil, corn oil, propylene glycol, etc.).
  • an oily solvent eg, vegetable oil such as olive oil, sesame oil, cottonseed oil, corn oil, propylene glycol, etc.
  • additives such as a solubilizing agent (eg, sodium salicylate, sodium acetate, etc.), a stabilizer (eg, human serum albumin, etc.), a soothing agent (eg, benzyl alcohol, etc.) may be used.
  • a solubilizing agent eg, sodium salicylate, sodium acetate, etc.
  • a stabilizer eg, human serum albumin, etc.
  • a soothing agent eg, benzyl alcohol, etc.
  • the injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against mammals (eg humans, rats, puppies, higgs, bushes, puppies, cats, dogs, sal, etc.). Can be administered.
  • mammals eg humans, rats, puppies, higgs, bushes, puppies, cats, dogs, sal, etc.
  • the DNA of the present invention may be used alone or after being inserted into an appropriate expression vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adeno-associated virus vector. It can also be administered according to the procedure. Further, the DNA of the present invention can be administered as it is or together with an auxiliary agent for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • an appropriate expression vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adeno-associated virus vector. It can also be administered according to the procedure. Further, the DNA of the present invention can be administered as it is or together with an auxiliary agent for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the dose of the protein (peptide) of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • about 0.1 to 10 Omg per day preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 2 Omg per day.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • about 0.01 to 3 Omg per day preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day It is convenient to administer the degree. Even when the subject to be administered is not human, the dose can be administered in terms of 60 kg of body weight.
  • the dosage of the DNA of the present invention varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in a patient with abnormal glucose and lipid metabolism (as 60 kg) Is about 0.1 to 10 Omg per day, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. (As O kg), it is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0 :! to 1 Omg per day. Even when the subject to be administered is not a human, the dose can be administered in terms of 60 kg of body weight.
  • Antibodies against the protein (peptide) of the present invention may be used for signal transduction functions involving the protein of the present invention, for example, cell stimulating activity mediated by the protein of the present invention (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, Inhibition of intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, activity to suppress or decrease pH etc.) It can be activated (ie neutralized).
  • cell stimulating activity mediated by the protein of the present invention eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, Inhibition of intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, activity to suppress or decrease pH etc.
  • an antisense nucleic acid (including a double-stranded oligo RNA having lipozyme RNAi activity) of the protein of the present invention or its partial peptide is used for transcription of the protein gene of the present invention, processing of the transcript, and / or mRNA.
  • the expression of the protein of the present invention can be inhibited. Therefore, (1) the antibody of the present invention or (2) the antisense nucleic acid of the present invention can be used as a medicament such as an agent for preventing or treating a disease associated with overexpression of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention is highly expressed in white adipocytes at the time of high-fat diet stress, and its expression fluctuates depending on the diet, stimulation with insulin resistance regulators, obesity, diabetes, and other pathological conditions.
  • Diseases associated with the overexpression of the protein of the present invention include adipocyte differentiation and abnormal or impaired metabolic functions (especially sugar or lipid metabolism) (insufficiency or enhancement).
  • -Related diseases eg, obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc.).
  • the antibody of the present invention and the antisense nucleic acid of the present invention can be formulated in the same manner as in the aforementioned “agent for preventing and treating diseases associated with dysfunction of the protein of the present invention”. Further, the antisense nucleic acid can be administered as it is by using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the dose of the antibody of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, patients with abnormal glucose and lipid metabolism (assuming a body weight of 60 kg) About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • body weight 6 (As O kg) it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg of body weight.
  • the dosage of the antisense nucleic acid of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. ), About 0.1 to 10 Omg per day, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like. 6 O kg), about 0.01 to 30 mg / day, preferably about 0.1 to 20 mg / day. More preferably, it is convenient to administer about 0.1 to 1 Omg. Even when the target of administration is other than human, the dose can be administered in terms of 60 kg of body weight.
  • the nucleic acid containing the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention or a part thereof can be used as a probe to obtain a mammal (eg, It is possible to detect abnormalities (DNA abnormalities) in the DNA or mRNA encoding the protein of the present invention in humans, rats, rabbits, rabbits, sheep, bushfishes, horses, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the DNA or mRNA is useful as a diagnostic agent for a gene such as damage, mutation, or reduced expression of the DNA or mRNA, and increased or excessive expression of the DNA or mRNA.
  • the above-described genetic diagnosis using the sense nucleic acid or the antisense nucleic acid of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, 2766-27 70 Page (1989)).
  • a decrease in the expression of the protein of the present invention when a decrease in the expression of the protein of the present invention is detected by Northern hybridization, it means that, for example, the subject is suffering from a disease associated with dysfunction of the protein or is likely to suffer from the disease in the future. Can be diagnosed. Conversely, when overexpression of the protein of the present invention is detected by, for example, Northern hybridization, for example, the patient is suffering from a disease associated with hyperactivity of the protein or will suffer from the disease in the future It can be diagnosed that the probability is high.
  • the protein of the present invention is highly expressed in white adipocytes at the time of high-fat diet stress, and its expression fluctuates depending on the diet, stimulation with insulin resistance regulators, obesity, diabetes, and other pathological conditions. Do not affect adipocyte differentiation
  • the sense nucleic acid or antisense nucleic acid of the present invention can be used for diseases involving abnormalities (insufficiency or enhancement) of adipocyte differentiation and Z or metabolic functions (especially glucose / lipid metabolism) (eg, obesity, diabetes, It is useful for diagnosis of impaired glucose tolerance, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc.).
  • the sense or antisense nucleic acid of the present invention By using the sense or antisense nucleic acid of the present invention as a probe, it can be used for screening a compound that changes the expression level of a gene encoding the protein of the present invention. Also, a compound that changes the expression level of the gene encoding the protein of the present invention can be screened by performing RT-PCR using the sense nucleic acid and the antisense nucleic acid of the present invention as a pair of primers. be able to.
  • the present invention relates to, for example, (i) a non-human mammal's (2) blood, (2) a specific organ, (3) a tissue or cell isolated from an organ, or (ii) a protein of the present invention contained in a transformant or the like.
  • the amount of mRNA encoding the protein (peptide) of the present invention is measured as follows.
  • non-human mammals e.g., mice, rats, egrets, sheep, sheep, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc .; more specifically, obese mice, diabetic mice, hypertension
  • Drugs eg, antiobesity drugs, antidiabetic drugs, antihypertensive drugs, vasoactive drugs, anticancer drugs, etc.
  • physical stress e.g, flooding stress, electric shock
  • Blood or specific organs (eg, brain, liver, kidney, etc.) or tissues isolated from the organs (eg, brown or white adipose tissue, etc.) ) Or cells (such as fat cells).
  • MRNA encoding the protein of the present invention contained in the obtained cells for example, MRNA can be extracted from cells or the like by an ordinary method, and quantified by using a technique such as TaqMan PCR, or analyzed by performing Northern blotting by a method known per se.
  • a transformant expressing the protein (peptide) of the present invention is prepared according to the above-mentioned method, and mRNA encoding the protein (peptide) of the present invention contained in the transformant is similarly quantified. , Can be analyzed.
  • test compound is administered simultaneously with the physical stress, and after a lapse of a certain period of time after the administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), It can be carried out by quantifying and analyzing the amount of mRNA encoding the protein of the present invention contained in the cells,
  • test compound When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in a medium, and after culturing for a certain period of time (1 to 7 days, preferably 1 to 3 days, more preferably 2 days to Three days later), the amount of mRNA encoding the protein (peptide) of the present invention contained in the transformant can be determined and analyzed.
  • a kit for screening a compound that changes the expression level of a gene encoding the protein of the present invention includes: (a) a probe comprising a sense and / or antisense nucleic acid of the present invention, preferably a double-stranded oligo DNA; or (b) A primer set comprising the sense nucleic acid of the present invention and the antisense nucleic acid of the present invention is characterized in that the primer set is constituted.
  • the probe those labeled with RI, fluorescence, enzyme, or the like by a conventional method are used.
  • the screening kit may further comprise an RNA extraction reagent and And / or tools (eg, extraction buffer, spin column, etc.), reagents for PCR or Northern hybridization, and Z or tools (eg, dNTPs, PCR reaction buffer, heat-resistant DNA polymerase, etc.), of the present invention
  • RNA extraction reagent and And / or tools eg, extraction buffer, spin column, etc.
  • reagents for PCR or Northern hybridization eg, dNTPs, PCR reaction buffer, heat-resistant DNA polymerase, etc.
  • Z or tools eg, dNTPs, PCR reaction buffer, heat-resistant DNA polymerase, etc.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an action of changing the expression level of a gene encoding the protein of the present invention.
  • the cell stimulating activity through the interaction between the protein of the present invention and its receptor (or ligand) (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, cell Activity to promote or suppress intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, wild boar! Phosphoric acid production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, decrease in PH, etc.
  • the receptor for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, cell Activity to promote or suppress intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, wild boar! Phosphoric acid production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, decrease in PH, etc.
  • mouth
  • Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, and fermentation products. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low-toxic drug for enhancing the physiological activity of the protein of the present invention.
  • the compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for decreasing the physiological activity of the protein of the present invention.
  • a compound or a salt thereof obtained by the above-mentioned screening method is used as a medicament, it can be formulated as in the above-mentioned "agent for preventing / treating a disease associated with dysfunction of the protein of the present invention".
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against mammals (eg humans, rats, puppies, higgs, bushes, puppies, cats, dogs, sal, etc.). Can be administered.
  • mammals eg humans, rats, puppies, higgs, bushes, puppies, cats, dogs, sal, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • the dose is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like. (As 60 kg), it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day. Even when animals to be administered are animals other than humans, the dose can be administered per 60 kg of body weight.
  • a preventive / therapeutic agent for various diseases containing a compound that alters the expression level of the gene encoding the protein of the present invention
  • the protein of the present invention is highly expressed in white adipocytes at the time of high-fat diet load stress, and its expression fluctuates depending on the condition such as diet, stimulation with an insulin resistance regulator, obesity and diabetes, and the like. Since the fluctuation of the expression affects the differentiation of adipocytes, it is considered that they play an important role in the regulation of adipocyte differentiation and / or metabolic function.
  • compounds that alter the expression level of the gene encoding the protein of the present invention include diseases associated with abnormalities (insufficiency or enhancement) of adipocyte differentiation and / or metabolic functions (especially sugar / lipid metabolism) (for example, It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc.
  • prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with dysfunction or enhancement of the protein of the present invention the same as the above-mentioned "prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with the dysfunction of the protein of the present invention" is used.
  • prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with the dysfunction of the protein of the present invention Can be formulated.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in mammals (eg humans, rats, puppies, sheep, shreds, poultry, cats, dogs, sal, etc.). Can be administered.
  • mammals eg humans, rats, puppies, sheep, shreds, poultry, cats, dogs, sal, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, a patient having abnormal glucose and lipid metabolism (assuming a body weight of 6 O kg) About 0.1 to 100 per day mg, preferably about 1.0-5 Omg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • the subject to be administered is an animal other than a human, the dose can be administered in terms of the body weight per 6 O kg.
  • the protein (peptide) of the present invention has a binding property to a ligand (or receptor) for the protein of the present invention, the concentration of the ligand (or receptor) in a living body can be quantified with high sensitivity. it can.
  • the ligand (or receptor) quantification method of the present invention can be performed, for example, in combination with a competition method. That is, the ligand (or receptor) concentration in the sample can be measured by bringing the sample into contact with the protein (peptide) of the present invention. Specifically, for example, the method can be carried out according to the method described in (1) or (2) below or a method analogous thereto. (1) Hiro Irie "Radio No Tsutsui" (Kodansha, published in 1974)
  • a compound eg, agonist, angonist, etc.
  • the protein of the present invention By using the protein (peptide) of the present invention or constructing an expression system for the recombinant protein (peptide) of the present invention, and using the affinity system using the expression system, the protein of the present invention and its Compounds (eg, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) that change the binding properties of ligands (or receptors) or salts thereof can be efficiently screened.
  • Compounds eg, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.
  • Such compounds via a receptor-stimulating activity (e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular C AM P production, intracellular c GM P product, inositol
  • a receptor-stimulating activity e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular C AM P production, intracellular c GM P product, inositol
  • a receptor-stimulating activity e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular C AM P production, intracellular c GM P product, inositol
  • the compound (a) is preferably screened by the ligand determination method described in (1) above.
  • the present invention relates to (i) a case where the protein (peptide) of the present invention is brought into contact with its ligand (or receptor); and (ii) a protein (peptide) of the present invention and its ligand (or receptor). And a ligand of the present invention, which is compared with the case of contact with a test compound.
  • the screening method of the present invention is characterized in that in (i) and (ii), the amount of ligand (or receptor) bound to the protein of the present invention, the cell stimulating activity and the like are measured and compared.
  • the present invention provides
  • a method for screening a compound to be changed or a salt thereof (2)
  • the labeled ligand (or receptor) is added to a cell producing the protein of the present invention or its membrane fraction, or an extracellular fluid or cell culture supernatant (in this case, for example, the antibody of the present invention described above is used).
  • an immobilized solid phase such as a cell culture plate
  • the labeled ligand (or receptor) and a test compound produce the protein of the present invention.
  • the labeled ligand (or receptor) is secreted into the protein (peptide) of the present invention expressed on the cell membrane by culturing the transformant containing the DNA of the present invention or the culture supernatant.
  • the protein (peptide) of the present invention in this case, for example, the protein (peptide) of the present invention is immobilized using a solid phase (cell culture plate or the like) on which the antibody of the present invention is immobilized).
  • the labeled ligand (or receptor) and the test compound are expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention.
  • Binding amount of labeled ligand (or receptor) to protein (peptide) when brought into contact with secreted protein (peptide) of the present invention Measured, compared protein and a test compound to the binding Ru varied with its ligand (or receptions evening I) of the present invention which is characterized in that,
  • a compound that activates the protein of the present invention for example, a ligand for the membrane protein of the present invention, etc.
  • a compound that is activated by the protein of the present invention for example, a receptor for the secretory protein of the present invention, etc.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention is brought into contact with cells expressing on the cell membrane or a culture supernatant from which the protein of the present invention is secreted, it is activated by a compound that activates the protein of the present invention or by the protein of the present invention.
  • Cell stimulatory activity via receptor receptor e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuations, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, activity to suppress or decrease pH, etc.
  • receptor receptor e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuations, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, activity to suppress or decrease pH, etc.
  • a compound that activates the protein of the present invention for example, a ligand for the membrane protein of the present invention or a compound that is activated by the protein of the present invention (for example, receptor for the secretory protein of the present invention)
  • the protein of the present invention expressed on the cell membrane by culturing the transformant containing the DNA of the present invention
  • (Peptide) or a transformant containing the DNA of the present invention is cultured to contact the protein (Peptide) of the present invention secreted in the culture supernatant, and activates the protein of the present invention.
  • Receptor-mediated cell stimulating activity eg, arachidonic acid
  • any protein containing the above-described protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof may be used.
  • Produces the protein of the present invention Cell membrane fractions or extracellular fluids of living mammalian organs are preferred.
  • human-derived proteins (peptides) of the present invention and the like which are expressed in large amounts using recombinants are suitable for screening.
  • the above-mentioned method is used for producing the protein (peptide) of the present invention, but it is preferably carried out by expressing the DNA of the present invention in mammalian cells or insect cells.
  • CDNA is used as the DNA fragment encoding the target protein portion, but is not necessarily limited thereto.
  • a gene fragment or a synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment In order to introduce a DNA fragment encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof into host animal (insect) cells and express them efficiently, the DNA fragment must be a promoter fragment derived from SV40. , Retrovirus promoter, meta-oral thionine promoter, human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, SRo! Promoter, nucleopolyhedrovirus belonging to baculovirus with insect host
  • NPV nuclear polyhedrosis virus
  • the protein (peptide) of the present invention used in the screening method of the present invention may be the protein (peptide) of the present invention purified according to a method known per se, or the protein (peptide) of the present invention. It may be in the form of a cell to be produced or a cell membrane fraction thereof, or a culture supernatant of a cell secreting the protein (peptide) of the present invention.
  • the cells when cells that produce the protein (peptide) of the present invention are used, the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell that produces the protein (peptide) of the present invention refers to a host cell that expresses the protein (peptide) of the present invention. Examples of the host cell include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, and animal cells. Used.
  • the cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • the cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehj em-type homogenizer, crushing with a pellet blender or polytron (Kinematica), crushing with an ultrasonic wave, pressing the cells while applying pressure with a French press, etc. Crushing by ejecting from a thin nozzle is mentioned.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 300 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (150 rpm to 1000 rpm). Spin at 30,000 rpm for 30 minutes to 2 hours, and use the resulting precipitate as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed protein (peptide) of the present invention and membrane components such as cell-derived phospholipid / membrane proteins.
  • the protein-containing fraction of the present invention is preferably a natural protein-containing fraction of the present invention, or a recombinant protein-containing fraction of the present invention having an activity equivalent thereto.
  • “equivalent activity” means equivalent ligand binding activity, signal information transduction action and the like.
  • Labeled ligands include labeled ligand, labeled ligand analog And the like. For example, ligands labeled with [ 3 H], C 125 I], [ 14 C], C 35 S] are used.
  • the protein (peptide) preparation of the present invention is prepared by suspending the suspension in a buffer.
  • Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding between the protein of the present invention and its ligand, such as a phosphate buffer of pH 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) and a buffer of tris-hydrochloride.
  • surfactants such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Atlas), digitonin, and dexcholate can be added to the buffer for the purpose of reducing non-specific binding.
  • a proteinase inhibitor such as PMSF, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), pepstatin and the like can be added for the purpose of suppressing the degradation of the receptor and ligand by the protease.
  • the reaction is carried out at about 0 ° C to 5 Ot :, preferably at about 4 ° C to 37 ° C, for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours.
  • the solution is filtered through a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured using a liquid scintillation counter or an air counter.
  • the specific binding amount (B—NSB) The test compound that is 50% or less can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • a cell stimulating activity mediated by the protein of the present invention for example, arachidonic acid
  • acetylcholine release for example, acetylcholine release
  • intracellular Ca release for example, acetylcholine
  • intracellular CAMP generation for example, acetylcholine
  • intracellular cGMP generation for example, inositol
  • cells that produce the protein (peptide) of the present invention are cultured on a multi-well plate or the like. Before conducting screening, replace the cells with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and extract cells or supernatant. And the products generated are quantified according to the respective methods. If the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of cell stimulating activity is difficult to perform due to the presence of a degrading enzyme contained in cells, it may be possible to add an inhibitor against the degrading enzyme to perform the assay. Good. In addition, activities such as inhibition of cAMP production can be detected as an activity of inhibiting production of cells whose basal production has been increased by forskolin or the like.
  • a substance for example, arachidonic acid
  • the cell that expresses the protein (peptide) of the present invention is preferably a cell line that produces a natural type of the membrane protein of the present invention, or a cell line that expresses the aforementioned recombinant protein (peptide) of the present invention.
  • test compounds for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. are used. Or a known compound.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property between the protein of the present invention and its ligand (or receptor) was specifically described by taking the case where the protein of the present invention is a membrane protein, Even when the protein of the present invention is a secretory protein, those skilled in the art can easily screen for a compound that alters the binding properties between the secretory protein of the present invention and its receptor by applying the above-described method.
  • the protein of the present invention and a compound having specific affinity for the protein (ligand or the like) Screening kit for a compound or a salt thereof that alters the binding of the protein or the peptide of the present invention, a cell producing the protein (peptide) of the present invention, a membrane fraction thereof, or the present invention. It contains the culture supernatant of cells that secrete proteins (peptides).
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • CHO cells expressing the protein (peptide) of the present invention were subcultured on a 12-well plate in 5 ⁇ 10 5 Z-wells, and cultured for 2 days in 37t :, 5% CO 2 , 95% air ( When the protein (peptide) of the present invention is secreted, the plate is coated with an antibody against the protein).
  • proteoribosomes in which the receptor protein was embedded in a ribosome membrane having an appropriate lipid composition were suspended in an appropriate dispersion medium (water, PBS, etc.), and stored in step 4. Those can also be used.
  • Measurement method (1) After washing the protein (peptide) expression CHO cells of the present invention cultured on a 12-well tissue culture plate twice with the assay buffer lm1, (if the protein ( ⁇ peptide) of the present invention is secreted, after the cells and removed after plating the culture supernatant was washed similarly with assay buffer) is added 490 1 of assay buffer to each well ⁇ test compound solution 2 10- 3 ⁇ 10- 1Q M After adding 51, add 5 ⁇ 1 of labeled ligand (or receptor) and react at room temperature for 1 hour. A supplementary 5 ⁇ 1 10_ 3 Micromax ligand (or LES Scepter) standard solution in place of the test compound to determine the amount of non-specific binding.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the above-described screening method or screening kit has an effect of changing the binding property between the protein of the present invention and a compound (ligand or receptor) having specific affinity for the protein.
  • cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production, etc.
  • A) a compound that does not have the cell stimulating activity a so-called antagonist against the receptor of the membrane protein of the present invention or the secretory protein of the present invention
  • a protein of the present invention and its ligand or (2) a compound that decreases the binding force between the protein of the present invention and its ligand (or receptor).
  • Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, and fermentation products. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the agonist against the membrane protein of the present invention (or the receptor for the secretory protein of the present invention) has the same action as the physiological activity of the ligand for the membrane protein of the present invention (or the secretory protein of the present invention for the receptor). Therefore, it is useful as a safe and low toxic drug depending on the ligand activity.
  • An antagonist to the membrane protein of the present invention can suppress the physiological activity of the ligand for the membrane protein of the present invention (or the secretory protein of the present invention for one receptor). It is useful as a safe and low toxic drug for suppressing the ligand activity.
  • the compound that enhances the binding between the membrane protein of the present invention and its ligand (or the secretory protein of the present invention and its receptor) is a ligand for the membrane protein of the present invention (or the secretory protein of the present invention against receptor Yuichi). It is useful as a safe and low toxic drug for enhancing the physiological activity of (protein).
  • the compound that decreases the binding force between the membrane protein of the present invention and its ligand has the ligand for the membrane protein of the present invention (or the secretory protein of the present invention for the receptor). It is useful as a safe and low toxic drug for reducing physiological activity.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, It can be administered to a substance (eg, human, rat, rabbit, sheep, pig, pig, cat, cat, dog, sal).
  • a substance eg, human, rat, rabbit, sheep, pig, pig, cat, cat, dog, sal.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method and the like.
  • the single dose is although it depends on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, in the case of an injection, it is usually about 0.01 to 3 Omg per day for patients with abnormal lipid metabolism (assuming a body weight of 60 kg).
  • the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
  • the protein of the present invention is highly expressed in white adipocytes at the time of high-fat diet load stress, and its expression fluctuates depending on the condition such as diet, stimulation with an insulin resistance regulator, obesity and diabetes, and the like. Since the fluctuation of the expression affects the differentiation of adipocytes, it is considered that they play an important role in the regulation of adipocyte differentiation and metabolic function.
  • compounds that alter the binding between the protein of the present invention and its ligand (or receptor) are useful for adipocyte differentiation and metabolism (particularly, It can be used as a prophylactic or therapeutic agent for diseases (such as obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia) related to abnormalities (insufficiency or enhancement of glucose and lipid metabolism). .
  • diseases such as obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia
  • prophylactic and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction or enhancement of the protein of the present invention the same as the above-mentioned "prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the protein of the present invention" C
  • the preparation obtained in this way is safe and has low toxicity. It can be administered to a substance (eg, human, rat, rabbit, sheep, pig, pig, cat, cat, dog, sal).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in a patient with abnormal glucose / lipid metabolism (with a body weight of 60 kg). Is about 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • the amount can be administered in terms of the body weight per 60 kg.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the protein (peptide) of the present invention, it is used for the quantification of the protein (peptide) of the present invention in a test solution, particularly for quantification by a sandwich immunoassay. can do. That is, the present invention provides, for example, (i) reacting an antibody of the present invention with a test solution and a labeled protein (peptide) of the present invention in a competitive manner, and the labeled protein (peptide) bound to the antibody; A method for quantifying the protein ( ⁇ peptide) of the present invention in a test solution, which comprises measuring the ratio of
  • the insolubilized antibody and the labeled antibody have an antigen recognition site that does not hinder the binding to the protein (peptide) of the present invention (for example, one of the antibodies
  • the N-terminal of the protein (peptide) of the present invention is recognized, and the other antibody reacts with the C-terminal of the protein (peptide) of the present invention, etc.).
  • the protein (peptide) of the present invention can be measured using a monoclonal antibody against the protein (peptide) of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and detection by tissue staining or the like can be performed. You can also.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2, Fab', or F'ab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the measurement method using an antibody against the protein (peptide) of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen or an antibody corresponding to the amount of the antigen in the test solution (for example, the amount of the protein of the present invention). Any method can be used to detect the amount of one antigen complex by chemical or physical means and calculate this from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. Is also good.
  • nephrometry for example, nephrometry, a competition method, an immunometric method, and a sandwich method are suitably used, but it is particularly preferable to use a sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. Is a radioactive isotope, for example, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], Ru is used and [1 4 C].
  • a radioactive isotope for example, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], Ru is used and [1 4 C].
  • the above-mentioned enzyme those which are stable and have a large specific activity are preferable.
  • fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • insolubilization of an antigen or an antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing or immobilizing a protein or an enzyme may be used.
  • the carrier for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass are used.
  • a test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and the labeled monoclonal antibody of the present invention is further reacted.
  • secondary reaction the amount of the protein of the present invention in the test wave can be determined by measuring the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving the measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction has a site where the protein (peptide) of the present invention binds.
  • Different antibodies are preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is used in the primary reaction, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein (peptide) of the present invention.
  • an antibody that recognizes preferably other than the C-terminal for example, an N-terminal is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • the competition method after the antigen in the test wave and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen is separated from (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody ( BZF separation), measure the amount of labeling of either B or F, and quantify the amount of antigen in the test wave.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the above antibody or a solid phase antibody is used as the first antibody.
  • An immobilization method using an immobilized antibody as the second antibody and a soluble antibody as the second antibody is used.
  • an antigen in a test wave and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of a labeled antibody, and then a solid phase and a liquid phase are separated. And an excess amount of the labeled antibody, and then immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, The amount of label in any of the phases is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • nephrometry the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing scattering by a laser is preferably used.
  • the measurement system for the protein (peptide) of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to the ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, it is possible to refer to reviews and compendiums.
  • the protein (peptide) of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • various diseases associated with dysfunction or enhancement of the protein of the present invention can be diagnosed by quantifying the protein of the present invention or salts thereof in vivo using the antibody of the present invention.
  • the protein of the present invention is highly expressed in white adipocytes during a high-fat diet load stress, and The expression of the protein of the present invention varies depending on the disease state such as obesity and diabetes, and the fluctuation of the expression affects the differentiation of adipocytes.
  • Diseases associated with abnormalities (insufficiency or enhancement) of adipocyte differentiation and / or metabolic functions (particularly glucose and lipid metabolism) eg, obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia) Disease).
  • the antibody of the present invention can be used for specifically detecting the protein of the present invention or a salt thereof present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the protein (peptide) of the present invention, detection of the protein (peptide) of the present invention in each fraction at the time of purification, and protein of the present invention in test cells It can be used to analyze the behavior of
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the protein (peptide) of the present invention, it can be used for screening for a compound that changes the amount of the protein of the present invention in the cell membrane or extracellularly.
  • Non-human mammal 1) Blood, 2) Specific organs, 3) Tissues or cells isolated from the organs are destroyed, then the cell membrane fraction is isolated, and the protein of the present invention contained in the cell membrane fraction.
  • the present invention provides a method for screening a compound that changes the amount of the protein (peptide) of the present invention in a cell membrane by confirming the protein (peptide) of the present invention on the cell membrane.
  • the quantification of the protein (peptide) of the present invention contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
  • non-human mammals e.g., mice, rats, egrets, higgs, bushus, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.
  • Drugs for example, anti-obesity drugs, anti-diabetic drugs, antihypertensive drugs, vasoactive drugs, anti-cancer drugs, etc.
  • physical stress for example, flooding stress, electricity
  • tissues e.g, brown or white adipose tissue
  • Obtain cells eg, fat cells, muscle cells, etc.
  • the obtained cells and the like are suspended in, for example, an appropriate buffer (for example, a Tris-chloride buffer, a phosphate buffer, a HEPES buffer, or the like), and a surfactant (for example, Triton X100 TM , by using a Tween, such as 2 0 TM) destroy Said sub ⁇ , the cell membrane fraction is obtained using further centrifugation or filtration, a technique such as column fractionation.
  • an appropriate buffer for example, a Tris-chloride buffer, a phosphate buffer, a HEPES buffer, or the like
  • a surfactant for example, Triton X100 TM , by using a Tween, such as 2 0 TM
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • Cell disruption methods include Potter— Methods such as crushing cells with an Elvehjem homogenizer, crushing with a Perling blender or Polytron (manufactured by Kinematica), crushing by ultrasonic waves, crushing by blowing cells from a thin nozzle while applying pressure by French press, etc. No.
  • the fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used for fractionation of cell membrane.
  • the membrane fraction is rich in the protein (peptide) of the present invention and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the protein (peptide) of the present invention contained in the cell membrane fraction can be quantified by, for example, sandwich immunoassay using the antibody of the present invention, Western blot analysis, or the like.
  • Such a sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and the Western plot can be performed by a means known per se.
  • a transformant expressing the protein (peptide) of the present invention is prepared according to the method described above, and the protein (peptide) of the present invention contained in the cell membrane fraction can be quantified.
  • Screening for a compound that alters the amount of the protein of the present invention in the cell membrane comprises:
  • test compound is administered, and after a lapse of a certain period of time after administration (3'0 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the protein of the present invention in the cell membrane.
  • the test compound is mixed in the medium, and after culturing for a certain period of time (1 to 7 days, preferably 1 to 3 days, more preferably 2 days to After 3 days), the determination can be performed by quantifying the amount of the protein (peptide) of the present invention in the cell membrane.
  • non-human mammals e.g., mice, rats, egrets, higgs, bushus, puppies, cats, dogs, monkeys, etc .; more specifically, obese mice, diabetic mice, hypertension
  • Drugs eg, antiobesity drugs, antidiabetic drugs, antihypertensive drugs, vasoactive drugs, anticancer drugs, etc.
  • physical stress e.g, flooding stress, electric shock
  • Blood or specific organs (eg, liver, kidney, etc.), tissues (eg, brown or white adipose tissue) or cells (eg, fat) Cells).
  • the obtained cells and the like are cut into tissue sections according to a conventional method, and immunostaining is performed using the antibody of the present invention.
  • the protein of the present invention on the cell membrane can be quantitatively or qualitatively confirmed by confirming the protein of the present invention on the cell membrane. You can check the quantity.
  • a kit for screening a compound that changes the amount of the protein of the present invention in a cell membrane is characterized by containing the antibody of the present invention as a component.
  • the antibody of the present invention can be provided in any of the forms described in (10) above, depending on the immunological assay method to be used.
  • the antibody of the present invention used in the primary reaction may be a suitable insoluble carrier (eg, synthetic resins such as insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, polystyrene, polyacrylamide, and silicon).
  • the antibody of the present invention used for the secondary reaction in a state of being (or possibly being) fixed to
  • radioisotopes [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], etc. [1 4 C]
  • Enzymes (3-galactosidase,) 3-darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc., fluorescent substances (fluorescamine, fluorescein isothiosinate, etc.), luminescent substances ( Luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, etc.).
  • the screening kit may further comprise, if desired, a blocking reagent or a washing solution necessary or suitable for immunological measurement, a reagent or a suitable reagent for isolating a cell membrane fraction, a protein of the present invention ( And a transformant that expresses the peptide).
  • the screening method and the screening kit described above specifically described screening for a compound that alters the amount of the protein of the present invention in a cell membrane when the protein of the present invention is a membrane protein, those skilled in the art It goes without saying that the above method can be easily applied to screening for a compound that changes the amount of the protein of the present invention outside the cell when the protein of the present invention is a secretory protein. Absent.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the above screening method is a compound having an action of changing the amount of the membrane protein of the present invention in the cell membrane or the amount of the secretory protein of the present invention extracellularly.
  • the cell stimulating activity through ligand-receptor interaction eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, Intracellular Ca 2+ release, Intracellular CAMP production, Intracellular cGMP production, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, Activation of c-fos, Low pH Compound that enhances or suppresses the activity of
  • (Mouth) A compound that reduces the cell stimulating activity by reducing the amount of the membrane protein of the present invention in the cell membrane or the amount of the secretory protein of the present invention outside the cell.
  • Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, and fermentation products. These compounds may be novel compounds, Known compounds may be used.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low-toxic drug for enhancing the physiological activity of the protein of the present invention.
  • the compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for decreasing the physiological activity of the protein of the present invention.
  • a compound or a salt thereof obtained by the above-mentioned screening method is used as a medicament, it can be formulated as in the above-mentioned "agent for preventing / treating a disease associated with dysfunction of the protein of the present invention".
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, so they can be administered to mammals (eg humans, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, sal, etc.) can do.
  • mammals eg humans, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, sal, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in a patient with abnormal glucose / lipid metabolism (with a body weight of 60 kg). Is about 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • the dose can be administered in terms of the weight per 60 kg of body weight.
  • the protein of the present invention is highly expressed in white adipocytes during high-fat diet load stress, and its expression fluctuates depending on the diet, stimulation with an insulin resistance regulator, obesity and diabetes, and the like. Since the fluctuation of the expression affects the differentiation of adipocytes, it is considered that they play an important role in adipocyte differentiation and regulation of Z or metabolic function. Therefore, in the cell membrane or extracellular Compounds that alter the amount of the protein of the present invention include diseases associated with abnormalities (insufficiency or enhancement) in adipocyte differentiation and / or metabolic functions (especially sugar / lipid metabolism) (eg, obesity, diabetes, It can be used as a preventive or therapeutic agent for impaired glucose tolerance, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, etc.
  • diseases associated with abnormalities insufficiency or enhancement
  • metabolic functions especially sugar / lipid metabolism
  • the compound When the compound is used as a prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with dysfunction or enhancement of the protein of the present invention, the compound is used in the same manner as in the above-mentioned "prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with the dysfunction of the protein of the present invention". Can be formulated.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in mammals (eg, humans, rats, puppies, sheep, bush ', puppies, cats, dogs, sal). Can be administered.
  • mammals eg, humans, rats, puppies, sheep, bush ', puppies, cats, dogs, sal.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in a patient with abnormal glucose / lipid metabolism (with a body weight of 60 kg). Is about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-5 Omg, more preferably about 1.0-20 mg per day.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc. (As 6 O kg), it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 2 Omg, and more preferably about 0.1 to 1 Omg per day. .
  • the dose can be administered in terms of the weight per 60 kg of body weight.
  • the present invention has a DNA encoding the exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • a non-human mammal is provided.
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof include unfertilized eggs, fertilized eggs, spermatozoa and their progenitor cells.
  • the DNA transgenic animal of the present invention include unfertilized eggs, fertilized eggs, spermatozoa and their progenitor cells.
  • the stage of embryonic development in non-human mammal development preferably, at the stage of single cells or fertilized egg cells and generally before the 8-cell stage
  • calcium phosphate method preferably, at the stage of single cells or fertilized egg cells and generally before the 8-cell stage
  • calcium phosphate method preferably, at the stage of single cells or fertilized egg cells and generally before the 8-cell stage
  • electric pulse method preferably, Lipofection It can be produced by transferring the target DNA by a method such as a coagulation method, a coagulation method, a microinjection method, a particle gun method, or a DEAE-dextran method.
  • the exogenous DNA of the present invention can be transferred to body cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like by the DNA transfer method, and can be used for cell culture, tissue culture, and the like. Can be fused with the above-mentioned germ cells by a cell fusion method known per se to produce the DNA-transferred animal of the present invention.
  • non-human mammal for example, red sea lions, bushes, higgins, goats, blue herons, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats, and the like are used.
  • rodents are relatively short in terms of ontogeny and biological cycle in terms of the creation of diseased animal model systems, and rodents that are easy to breed, especially mice (for example, hybrids such as C57BLZ6 and DBA2 as pure strains)
  • a strain a B6C strain, a BDFi strain, a B6D2F strain, a BALBZc strain, an ICR strain, etc.
  • a rat eg, Wistar, SD, etc.
  • mammals in a recombinant vector that can be expressed in mammals include humans and the like in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers to the DNA of the present invention once isolated and extracted from a mammal, not the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal.
  • mutant DNA of the present invention those in which a mutation (for example, mutation) has occurred in the nucleotide sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition, deletion, DNA that has been replaced with a base or the like is used, and also includes abnormal DNA.
  • a mutation for example, mutation
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein or the like of the present invention, such as DNA that expresses a protein or the like that suppresses the function of the normal protein of the present invention.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal of the same species or a different species as the target animal.
  • a promoter capable of being expressed in animal cells For example, when the human DNA of the present invention is transferred, it may be derived from various mammals (eg, egret, dog, cat, guinea pig, hampus, rat, mouse, etc.) having the DNA of the present invention having high homology thereto.
  • a DNA construct eg, a vector, etc.
  • a DNA construct comprising the human DNA of the present invention downstream of various promoters capable of expressing DNA into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg;
  • a DNA-transferred mammal that highly expresses the DNA of the present invention can be produced.
  • Examples of the expression vector for carrying the DNA of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as ⁇ phage, a retrovirus such as Moroni monoleukemia virus, a vaccinia virus or Animal viruses such as baculovirus are used.
  • a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • promoters that regulate DNA expression include, but are not limited to: (1) DNA derived from viruses (eg, Simian virus, cytomegalovirus, Moroni mouse leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.) Promoters 2 Promoters derived from various mammals (human, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), for example, albumin, insulin II, peroplatin II, elastase, erythrocyte poetin, endothelin, muscle Creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, Daltathione S-transferase, platelet-derived growth factor / 3, keratin 1, K10 and K14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase / 3 I subunit, dystrophin, tartrate-resistant Lucariphosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor thymic
  • cytomegalovirus promoter capable of high expression throughout the whole body
  • a human peptide chain elongation factor la (EF-1 ⁇ ) promoter a human and a chicken i3 actin promoter are preferable.
  • the vector preferably has a sequence that terminates the transcription of the messenger RNA of interest in a DNA-transferred mammal (generally referred to as “Yuichi Mineta”).
  • the sequence of A can be used, and preferably, Simian virus SV40 or the like is used.
  • a splicing signal of each DNA, an enhancer region, a part of an intron of eukaryotic DNA, etc. are 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region. Alternatively, it may be linked to the 3 'downstream of the translation region depending on the purpose.
  • the normal translation region of the protein or the like of the present invention is derived from liver, kidney, thyroid cells, fibroblasts derived from various mammals (eg, human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.). DNA and various commercially available genomes D From the NA library, it is possible to obtain the whole or a part of the genomic DNA, or the complementary DNA prepared by a known method from RNA derived from liver, kidney, thyroid cells and fibroblasts as a raw material.
  • an exogenous abnormal DNA can be obtained by preparing a translation region obtained by mutating a normal translation region of the protein of the present invention or the like obtained from the above cells or tissues by a point mutagenesis method.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which it is connected to the downstream of the promoter (and optionally to the upstream of the transcription termination site).
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer indicates that the progeny of the produced animal retains the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells Means to do.
  • the offspring of such animals inheriting the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and is subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal. You can do it.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the DNA transfer indicates that all the offspring of the produced animal contain the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. Means to have.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and eventually enhances the function of the endogenous normal DNA, thereby ultimately causing hyperactivity of the protein of the present invention.
  • the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used for a screening test for a therapeutic drug for a disease associated with the protein. .
  • the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention is to be confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and to be subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. Can be done. Furthermore, the desired foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a source substance.
  • the DNA construct with the promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the transfer of the DNA means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of the germ cells and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the endogenous normal DNA is inhibited, so that the function of the protein of the present invention is finally inactivated. It may cause type refractory disease and can be used as a model animal for the disease.
  • the abnormal DNA transgenic animal of the present invention it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention is useful for inhibiting the function of the normal protein by the abnormal protein of the present invention (dominant negative activity) in the inactive refractory disease of the protein of the present invention. ) Is a model for elucidating. Further, since the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released abnormal protein of the present invention, it is also used for a therapeutic drug screening test for a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention. It is possible.
  • ⁇ ⁇ Isolation and purification of the mutant protein of the present invention and production of its antibody can be considered. Further, using the DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to examine clinical symptoms of diseases related to the protein of the present invention, including inactive refractory disease of the protein, and the like. More detailed pathological findings in each organ of the disease model related to the disease can be obtained, which can contribute to the development of a new treatment method and the research and treatment of secondary diseases caused by the disease.
  • a therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention including a functionally inactive refractory disease
  • using the DNA-transferred animal of the present invention the above-described test method and quantitative method, etc.
  • the method it is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease.
  • using the DNA-transferred animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention it is possible to examine and develop a method for treating DNA associated with the protein of the present invention.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA in which the DNA of the present invention is inactivated [7] the DNA is obtained by introducing a reporter gene (eg, a / 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli).
  • a reporter gene eg, a / 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli.
  • the non-human mammal according to item (6), wherein the non-human mammal is inactivated, and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention.
  • a compound or a salt thereof which comprises administering a test compound to the animal according to (7) and detecting the expression of a reporter gene, which enhances or inhibits the activity of the promoter for DNA of the present invention.
  • a screening method The non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are artificially mutating the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, thereby suppressing the expression ability of the DNA, Alternatively, by substantially losing the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA, the DNA does not substantially have the ability to express the protein of the present invention (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention). This is sometimes referred to as a non-human mammalian embryonic stem cell (hereinafter abbreviated as ES cell). As the non-human mammal, the same one as described above is used.
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by, for example, shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon by these mutations.
  • Non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated include, for example,
  • the DNA of the present invention possessed by a non-human mammal to be isolated is isolated and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, lacZ ( ⁇ -galactosidase gene), DNA sequence that disrupts exon function by inserting a reporter gene, such as the Nicol acetyltransferase gene), or terminates transcription of the gene in the intron between exons.
  • a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, lacZ ( ⁇ -galactosidase gene), DNA sequence that disrupts exon function by inserting a reporter gene, such as the Nicol acetyltransferase gene), or terminates transcription of the gene in the intron between exons.
  • a DNA chain having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene (hereinafter abbreviated as targeting vector 1) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, a homologous recombination method.
  • Southern hybridization analysis using the DNA sequence on or near the DNA of the invention as a probe or DNA sequence on the targeting vector and the targeting vector The neighboring region other than the DNA of the present invention used for the production of the targeting vector Of the knockout ES cells of the present invention by PCR using the DNA sequence of Can be obtained.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established may be used as described above.
  • a newly established one may be used.
  • 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, an alternative pure immunological and genetically
  • BDF mice C57BL / 6 mice and C57B LZ6 that have reduced the number of eggs 08 eight / / 2 and 1) can be favorably used such as that established with.
  • BDFi mice have the advantage of high number of eggs collected and robust eggs.
  • C57BLZ6 mice are used as a background
  • ES cells obtained using these mice have the following characteristics: It can be used advantageously in that the genetic background can be replaced by C57BL6 mice by backcrossing with 57BLZ6 mice.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. Early embryos can be obtained.
  • male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • An example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR. If this method was used, the number of ES cells required for a karyotype analysis would have been about 10 6 , but only about 1 colony of ES cells (about 50 cells) was required.
  • the primary selection of ES cells in the initial stage can be performed by gender discrimination, and the selection of male cells at an early stage can greatly reduce the labor required in the initial stage of culture.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G_banding method.
  • the number of chromosomes in the resulting ES cells 100% of the normal number is desirable, but if it is difficult due to physical manipulations at the time of establishment, knock out the gene of the ES cell, and It is desirable to clone again into a certain cell).
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good growth potential, but must be carefully subcultured because they tend to lose their ability to develop somatically.
  • LIF on a suitable feeder cell such as STO fibroblasts
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be compared with a normal animal by measuring the mRNA amount of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level. It is possible to distinguish.
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be obtained, for example, by introducing the evening-getting vector produced as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and The DNA sequence in which the DNA of the present invention has been inactivated undergoes homologous recombination to replace the DNA of the present invention on the chromosome of a mouse embryonic stem cell or mouse egg cell by gene homologous recombination. Can be knocked out. Since most of the recombination in mammals is non-homologous, means for screening cells that have undergone homologous recombination include, for example, drug resistance such as a neomycin resistance gene inside the DNA of the present invention.
  • a drug corresponding to the inserted drug resistance gene is constructed by inserting a gene and constructing a targeting vector containing a thymidine kinase (tk) gene in the vicinity of the DNA of the present invention and introducing the vector into embryonic stem cells or egg cells.
  • tk thymidine kinase
  • G418 for the neomycin resistance gene
  • ganciclovir resistance is obtained. Since it is incorporated at the same time, it has a ganciclovir impression.
  • the randomly inserted cells are killed by the production of the toxin, so that selection with a single drug becomes possible.
  • the final confirmation of the cells in which the DNA of the present invention was knocked out was performed by Southern hybridization analysis or DNA sequence on the gettering vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe.
  • the analysis can be performed by PCR using the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used as one targeting vector as a primer.
  • non-human mammalian embryonic stem cells When non-human mammalian embryonic stem cells are used, clone the cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by homologous recombination and The chimeric embryo thus prepared is injected into the uterus of the pseudo-pregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by judging coat color or the like. Since individuals obtained in this manner are usually individuals with heterozygous expression deficiency, the individuals with heterozygous expression deficiency can be bred to obtain individuals with homozygous expression deficiency of the protein of the present invention from their offspring. .
  • a transgenic non-human mammal having a chromosome into which a gettering vector has been introduced can be obtained by injecting a DNA solution into a nucleus of an egg cell by a microinjection method.
  • These transgenic non-human mammals can be obtained by selecting those having a mutation at the DNA locus of the present invention by homologous gene recombination.
  • the animal individual obtained by the crossing can confirm that the DNA has been knocked out, and can be reared in a normal breeding environment. .
  • the germline can be obtained and maintained according to a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and a plurality of homozygous animals are obtained. By crossing male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is The lack of various biological activities that can be induced can serve as a model for diseases caused by inactivation of the biological activity of the protein, and is useful for investigating the causes of these diseases and examining therapeutic methods.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be used for screening a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention.
  • the present invention is characterized in that a test compound is administered to a non-human mammal deficient in expression of a DNA of the present invention, and changes in the animal are observed and measured.
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof, which has a therapeutic / preventive effect against a disease that occurs.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include the same as described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound and compared with an untreated control animal, and changes in organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal are indicated as an index.
  • the therapeutic and prophylactic effects of the test compound can be tested.
  • a method of treating a test animal with a test compound for example, oral administration, intravenous injection, or the like is used, and an appropriate method is selected according to the symptoms of the test animal, properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected depending on the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • the blood glucose level of the test animal is about 10% or more, preferably about 30% or more: more preferably, about 50% or more. Treating the test compound against the above-mentioned diseases It can be selected as a compound having a preventive effect.
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and is a disease caused by deficiency or damage of the protein of the present invention, for example, differentiation and / or metabolism of fat cells. It can be used as a safe and low-toxic treatment or prophylactic agent for diseases associated with abnormal functions (eg, obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia). it can. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkalis). And the like, for example, metals), and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable.
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, etc.) Acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, etc.
  • Acid succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • a drug containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be formulated in the same manner as in the above "Preventive / therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of the protein of the present invention".
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, mammals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bush dogs, dogs, cats, dogs, monkeys) Etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • the compound is orally administered, for example, patients with abnormal glucose / lipid metabolism (body weight 6 (As 0 kg), from about 0.1 to: L 0 O mg per day, preferably from about 1.0 to 5 O mg, more preferably from about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose varies depending on the subject to be administered, the target organ, symptoms, administration method, etc. 6 O kg) It is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day. Even when a subject to be administered is an animal other than a human, the dose can be administered in terms of the body weight per 6 O kg.
  • the present invention provides a test compound administered to a non-human mammal deficient in expression of a DNA of the present invention, and detects or promotes the activity of a promoter of the DNA of the present invention, which is characterized by detecting expression of a reporter gene.
  • a method for screening a compound or a salt thereof is provided.
  • the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention may be selected from the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention by introducing the reporter gene into the DNA of the present invention. Those which are activated and which can express the reporter gene under the control of the promoter for the DNA of the present invention are used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • reporter gene the same ones as described above are used; 3-galactosidase gene (1 ac Z), soluble alkaline phosphatase gene or luciferase gene and the like are preferable.
  • the protein of the present invention can be simply and in vivo Can be observed. Specifically, a mouse deficient in the protein of the present invention or a tissue section thereof is fixed with daltaraldehyde, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with a staining solution containing X-ga1.
  • a reagent that becomes a substrate for / 3-galactosidase such as 5_broth_4-chloro-3-indolyl / 3 / 3-galactopyranoside (X-gal).
  • the i3-galactosidase reaction is stopped by washing the tissue specimen with lm MED TA / PBS solution, and the color is observed. Good. Further, mRNA encoding lacZ may be detected according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof obtained by the above screening method is a compound selected from the test compounds described above, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity of DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids). And the like, and particularly preferably a physiologically acceptable acid addition salt.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid,
  • salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • the compound or a salt thereof that promotes the promoter activity of the DNA of the present invention can promote the expression of the protein of the present invention and promote the function of the protein. It is useful as a medicine for preventing and treating remedies.
  • the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits the promoter activity for DNA can inhibit the expression of the protein of the present invention and inhibit the function of the protein, for example, a disease associated with overexpression of the protein It is useful as a drug such as a preventive or therapeutic drug.
  • Diseases associated with dysfunction or overexpression of the protein of the present invention include, for example, diseases involving abnormalities of adipocyte differentiation and / or metabolic function (eg, obesity, diabetes, impaired glucose tolerance, arteriosclerosis). , Hypertension, hyperlipidemia, etc.) No.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as a drug containing a compound that alters the binding property between the protein of the present invention and its ligand (or receptor). it can.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in mammals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, higgs, bushus, dogs, dogs, cats, dogs, Monkeys).
  • mammals eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, higgs, bushus, dogs, dogs, cats, dogs, Monkeys.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • a compound that promotes or inhibits the promoter overnight activity against DNA of the present invention is orally administered, Generally, for example, in a patient with a sugar / lipid metabolism disorder (assuming a body weight of 60 kg), about 0.1 to 10 Omg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day It is.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is usually used, for example, in patients with abnormal glucose and lipid metabolism (body weight).
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening a compound or its salt that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention, and the expression of the DNA of the present invention. It can greatly contribute to investigating the causes of various diseases caused by insufficiency or developing therapeutic drugs.
  • transgenic animal a DNA containing the promoter region of the protein of the present invention
  • genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (transgenic animal).
  • transgenic animal transgenic animal
  • a protein having the action of specifically promoting or suppressing the in vivo production ability of the protein of the present invention itself can be obtained. It can be used as a search system for molecular compounds.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations of the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below.
  • amino acids can have optical isomers, the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSSno-14 (Long form).
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding a secretory or membrane protein mSST20-14 (Short form) derived from mouse white adipose tissue.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST20-14 (Short form).
  • [SEQ ID NO: 5] 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding secretory or membrane protein mSST22-22 (long form) derived from mouse white adipose tissue.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST22-22 (Long form).
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST-22 (Short form).
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST22-22 (Short form).
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST8-5.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein H1SST8-5.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding secretory or membrane protein mSST19-15 (Long form) derived from mouse white adipose tissue.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST19-15 (Long form).
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding secretory or membrane protein mSST19-15 (Short form) derived from mouse white adipose tissue.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST13-11.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST13-11.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST9-8. .
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST9-8.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSSni-3.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST21-3.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST20-6.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein D1SST20-6.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein cDNA fragment mSs 120-14 (partial).
  • the nucleotide sequence of 5 (partial) is shown.
  • Fig. 3 shows the nucleotide sequence of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein cDNA fragment mSstl9-15 (partia1).
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of mouse secretory or membrane protein cDNA fragment InSst9-8 (partial) derived from white adipose tissue.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of a gene-specific primer for 5′-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST20-14. [SEQ ID NO: 34]
  • 3 shows the nucleotide sequence of a gene-specific primer for 3'-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSSO-14.
  • the nucleotide sequence of the gene-specific primer for 5'-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST22-22 is shown.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence of a 3′-RACE gene-specific primer for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST22-22.
  • 5 shows the nucleotide sequence of a gene-specific primer for 5′-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST8-5.
  • 3 shows the nucleotide sequence of a gene-specific primer for 3′-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST8-5.
  • Fig. 4 shows the nucleotide sequence of a gene-specific primer for 5'-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein H1SST19-15.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence of a gene-specific primer for 3′-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST 19-15.
  • SEQ ID NO: 41 The nucleotide sequence of a gene-specific primer for 5'-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST13-11 is shown.
  • 3 shows the nucleotide sequence of a gene-specific primer for 3′-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST13-11.
  • FIG. 5 shows the nucleotide sequence of a gene-specific primer for 5′-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein D1SST9-8.
  • 3 shows the nucleotide sequence of a gene-specific primer for 3′-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST9-8.
  • the nucleotide sequence of the gene-specific primer for 5'-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST2-3 is shown.
  • 3 shows the nucleotide sequence of a gene-specific primer for 3′-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST21-3.
  • the nucleotide sequence of a gene-specific primer for 5'-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mouse white adipose tissue-derived secretory or membrane protein mSST20-6 is shown.
  • mSST20-6 3 shows the nucleotide sequence of a gene-specific primer for 3'-RACE for identifying the nucleotide sequence to be used.
  • Mouse pro B cell line Ba / F3 (RIKEN cell bank; RCB0805) requires IL-3 for its survival and growth. These cells express the thrompopoietin receptor (MPL) on the cell membrane, and form a homodimer by binding of the ligand, thrombopoietin, to transmit a proliferation signal to the cell.
  • MPL thrompopoietin receptor
  • MPL will become a ligand-independent constitutive Tekikatsu property type (MPL M) by S er 498
  • MPL M ligand-independent constitutive Tekikatsu property type
  • the extracellular domain to produce a retroviral vector one which is by cormorants design incorporate c DNA 5 'to the MP L M which was deleted, if incorporated cDNA is a signal Sequence the fusion protein encoded protein and MPL M in c DNA is expressed on the cell membrane of B a / F 3, the B AZF 3 is to survive 'grown in IL -3-independent.
  • a retroviral vector containing the coding region of Me t 1 ⁇ Th MPL M with the r 441 deleted (AMPL M) (pMX-SST ; Kojima and Kitamura, above) to the BstXI site of a high
  • a retrovirus expression library was constructed by inserting cDNA derived from adipose tissue-fat-loaded mouse white adipose tissue, and cloning of secretory membrane protein cDNA was performed.
  • mice loaded with high fat diet C57B1 / 6J, 12 weeks old, 30% high fat for 12 days Visceral adipose tissue (white fat around the mesentery and epididymis) was removed from the hamster, and poly A (+) A was isolated using the Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia) according to the attached protocol. Isolate and Superscript Choice
  • CDNA was converted to cDNA by random hexamer using System (Gibco-BRL).
  • the resulting cDNA was inserted into BstXI sites
  • Bok retroviral vectors PMX- SST with BstXI adapters one (Invitrogen) was the cDNA 5 'to the MPL M is Raige one Chillon.
  • the obtained DNA was introduced into E. coli DH10B strain by electroporation and amplified. Purification of plasmid DNA according to a conventional method, and packaging cells for retrovirus production (Plat-E; Morita et al., Gene Ther., 7 (12): 1063-1066, 2000; entered by Dr.
  • coli strains have accession numbers of FERM BP-8106, FERM BP-8109, FERM BP-8105, FERM BP-8107, FERM BP-8108, FERM BP-8104, FERM BP-8102 and FERM BP-8110, respectively. It was deposited on July 2, 2002 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary Center (Tokuto, Tsukuba, Ibaraki Prefecture, 305-8566, Japan).
  • AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • Example 1 Using the novel cDNA obtained in Example 1 as a probe, the state of expression of these genes was examined by Northern blot analysis under various conditions.
  • the expression level of Sstl3-11 increased in high-fat and high-sucrose-loaded mice compared to control mice. In obesity model mice ob / ob, the expression level was also higher than in control C57bl6 / J mice.
  • Sst21-3 The expression level of Sst21-3 was increased in the diabetic model mouse db / db compared to the control C57bl6 / J mouse. In addition, when the expression in 3T3-L1 cells capable of differentiating into white fat was examined, Ss121-3 was also expressed in undifferentiated preadipocytes. Sst20- had a motif capable of binding to lipoprotein lipid in the obtained clone fragment.
  • the 5′-RACE gene-specific primer (GSP1) and the 3′-RACE gene Specific primers (GSP2) SEQ ID NOS: 33 and 34 for Sst20-14; SEQ ID NOs: 35 and 36 for Sst22-22, respectively; SEQ ID NOs: 37 and 38 for Sst8-5; Sstl9 SEQ ID NOs: 39 and 40 for -15; SEQ ID NOs: 41 and 42 for Sstl3-ll; SEQ ID NOs: 43 and 44 for Sst9-8; SEQ ID NOs: 45 and 46 for Sst2-3, respectively For Sst20-6, SEQ ID Nos.
  • the PCR product was separated by agarose gel electrophoresis, the resulting band was excised from the gel, extracted, and then TA-cloned into PCR4-T0P0 or pENTR / D-TOPO (both from Invitrogen).
  • Escherichia coli Topi 0 / pCR4-TOPO SST22-22 long form
  • Escherichia coli ToplO / pCR4-TOPO SST22-22 short form
  • Escherichia coli Topl0 / pENTR / D-T0P0 SST9-8 (10) Escherichia coli ToplO / pCR4-T0P0 (SST2U3) and (11) Escherichia coli ToplO / pCR4-TOP0 (SST20-6) strain were obtained.
  • coli strains are FERM BP-8406, FERM BP-8407, FERM BP-8408, FERM BP-8409, FERM BP-8402, FERM BP-8404, FERM BP-8405, FERM BP-8403, FERM BP- 841K FERM BP-8413 and FERM BP-8412 are provided with accession numbers.
  • (1) to (8) are dated June 20, 2003, and (9) to (11) are It has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary (T305-8566, 1-1 1-1 Tsukuba-Higashi, Ibaraki Prefecture) on June 24, 2003.
  • AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • 3T3-L1 cells are seeded on a 6-well plate at a cell count of 2xl0 5 cells / well, and cultured in DMEM (invitrogen) medium supplemented with 10% fetal serum (Invitrogen) at 37 “C for 7 days, and then cultured The solution was aspirated, washed twice with PBS (Invitrogen), and 0 PTI-MEM (Invitrogen) was added at 2 ml / well. 0 PTI-MEM (100 1) and FuGENE TM 6 (10; ti 1, Roche) were added.
  • an expression construct pCMV was prepared by inserting SST20-14 (Long form) cDNA into the EcoRI-Hindi II cloning site of the expression plasmid pCMV-Tag4A (Sigma). -2 ⁇ g of SST20-14 was added and left at room temperature for 45 minutes. The expression construct-containing solution was added to the above 3T3-L1 cells, cultured at 37 ° C for 6 hours, and then cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum under 37 for 40 hours.
  • DMEM medium containing 250 nM dexamethasone (Sigma), 0.5 mM 1-methyl-3-isobutylxanthine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 10 g / ml insulin (Sigma), and 10% fetal serum serum]. And cultured for 72 hours. Thereafter, the cells were further cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum for 8 days. After completion of the culture, the culture solution was aspirated, washed twice with PBS, added with 2 ml of 10 formalin (Wako Pure Chemical), and allowed to stand for 30 minutes. After washing once with distilled water, an oil red-0 solution was added and staining was performed for 10 minutes.
  • DMEM medium containing 250 nM dexamethasone (Sigma), 0.5 mM 1-methyl-3-isobutylxanthine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 10 g / ml insulin (Sigma), and 10% fetal serum serum.
  • 3T3-L1 cells were seeded on a 6-well plate at a cell number of 4xl0 5 cells / well, cultured in DMEM (Invitrogen) medium supplemented with 10 ⁇ fetal serum (Invitrogen) for 5 days under 37 days, and then differentiation medium [250 nM Dexamethasone (Sigma), 0.5 mM trimethyl-3-isobutylxanthine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 10 g / ml insulin (Sigma), and 10% fetal serum serum-added DMEM medium], and the cells were further cultured for 24 hours.
  • DMEM Invitrogen
  • differentiation medium 250 nM Dexamethasone (Sigma), 0.5 mM trimethyl-3-isobutylxanthine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 10 g / ml insulin (Sigma), and 10% fetal serum serum-added DMEM medium
  • TNF- Gene Techne
  • 3T3-L1 cells were seeded in a 6-well plate at a cell count of 4xl0 5 cells / well, and cultured in DMEM (Invitrogen) medium supplemented with 10% fetal calf serum (Invitrogen) at 37 ° C for 5 days to differentiate.
  • the medium was replaced with a DMEM medium containing 250 nM dexamethasone (Sigma), 0.5 mM trimethyl-3-isobutylxanthine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), lO ⁇ g / ml insulin (Sigma), and 10% fetal serum.
  • the insulin resistance-improving drug piodarisuzone (10 M, Takeda Pharmaceutical) was added, and the cells were cultured for 72 hours in the presence of insulin. After completion of the culture, the cells were washed with PBS (Invitrogen), and the cells were collected. Total RNA was collected from the collected cells using RNAeasy kit (Qiagen) according to the procedure attached to the kit. Using the collected total RNA, the mRNA expression levels of SST8-5 and 36B4 used as an internal standard were quantified using TaqMan PCR (Applied Biosystems). As a result, the expression level of SST8-5 was increased about 2.4 times as much as that of the control (without addition of Piodari evening hydrochloride) by the addition of Piodari evening hydrochloride. Industrial applicability
  • the protein of the present invention is a secretory or membrane protein expressed in white adipocytes upon a high fat diet load, it can be used as a preventive or therapeutic agent for diseases associated with adipocyte differentiation or abnormal metabolic function, or It has an excellent effect as a tool for screening candidate drug compounds that are effective for the prevention and treatment of the disease. Sequence listing free text
  • Oligonucleotides designed to function as primers for amplifying mouse white adipocyte-derived secretory or membrane protein cDNA fragments.
  • Oligonucleotides designed to function as gene-specific primers for 5'-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mSST20-14. [SEQ ID NO: 34]
  • oligonucleotide designed to function as a gene-specific primer for 3'-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mSST20-14. [SEQ ID NO: 35]
  • Oligonucleotides designed to function as gene-specific primers for 5'-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mSST22-22. [SEQ ID NO: 36]
  • Oligonucleotides designed to function as gene-specific primers for 3'-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mSST22-22. [SEQ ID NO: 37]
  • Oligonucleotide designed to function as a gene-specific primer for 5'-RACE for identifying a nucleotide sequence encoding the full length of mSST8-5.
  • Oligonucleotide designed to function as a 3′-RACE gene-specific primer for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mSST8-5.
  • Oligonucleotides designed to function as gene-specific primers for 5'-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mSST19-15. [SEQ ID NO: 40]
  • oligonucleotide designed to function as a gene-specific primer for 3'-RACE for identifying a nucleotide sequence encoding the full length of mSST19-15.
  • [SEQ ID NO: 41] An oligonucleotide designed to function as a gene-specific primer for 5'-RACE for identifying a full-length nucleotide sequence encoding mSST13-ll.
  • Oligonucleotides designed to function as gene-specific primers for 3'-RACE for identifying the full-length nucleotide sequence encoding mSST13-ll. [SEQ ID NO: 43]
  • Oligonucleotides designed to function as 5'-RACE gene-specific primers for identifying the full-length nucleotide sequence encoding mSST9-8.
  • Oligonucleotide designed to function as a 3′-RACE gene-specific primer for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mSST9-8.
  • Oligonucleotides designed to function as gene-specific primers for 3'-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mSST21-3.
  • Oligonucleotides designed to function as gene-specific primers for 5'-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mSST20-6. [SEQ ID NO: 48]
  • Oligonucleotides designed to function as gene-specific primers for 3'-RACE for identifying the nucleotide sequence encoding the full length of mSST20-6.

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Abstract

本発明は、脂肪細胞の分化および／または代謝機能に関連する新規分泌／膜蛋白質、詳細には、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸酸配列を含有する脂肪細胞由来分泌／膜蛋白質、それをコードする核酸、それに対する抗体、それらを用いた脂肪細胞の分化／代謝機能の異常が関与する疾患の予防・治療薬のスクリーニング方法・スクリーニング用キット、それらを含有する当該疾患の予防・治療剤または診断剤を提供する。

Description

明 細 書 新規蛋白質およびその用途 技術分野
本発明は、 マウス白色脂肪細胞由来の新規分泌もしくは膜蛋白質またはそ の塩およびそれをコ一ドする DNA、 並びにそれらの用途に関する。 背景技術
内臓脂肪が蓄積した肥満者は糖尿病や高血圧、 動脈硬化などの血管病の確 率が高いことで、 内臓脂肪蓄積は実際に病態を発症させる引き金となる共通 の基盤と考えられる。 脂肪蓄積によりおこる病態の発症には脂肪細胞がつく る蛋白質が関係している可能性が考えられるが、 脂肪組織に発現する遺伝子 には分泌蛋白質遺伝子の頻度が高く、 その中には補体、 増殖因子等の生理活 性物質の遺伝子が含まれていることが示されている。 このような物質
(adipocytokineとも呼ばれる) は、 元来脂肪細胞自身の代謝に重要な役割 を果たすが、 脂肪蓄積時に過剰分泌や逆に分泌不全が起こり個体全体の代謝 に悪影響を及ぼす可能性が考えられる。 例えば、 下村らは線溶系の重要な調 節因子であるプラスミノーゲンァクティべ一夕インヒビター 1 (PA I - 1) が、 脂肪蓄積がおこると特に内臓脂肪で著しく発現量が増加して血中濃 度も増加し、 血管合併症の成因のひとつとなり得ることを明らかにした [下 村 （Shimomura, I.) ら、 「ネイチヤー 'メディシン （Nat. Med.) 」 、 （米 国） 、 第 2巻 （第 7号） 、 p p. 800 - 803 ( 1996年） ] 。 また、 脂肪組織に特異的かつ高頻度に発現していた遺伝子 adipose most abundant gene transcript- 1はコラーゲン様の蛋白質 （adiponect in) をコードしてお り、 この物質はヒトの血中に多量存在し、 血管平滑筋細胞の増殖を強く抑制 する作用を持っているが、 肥満者では血中レベルが逆に低下しており血管病 へとつながることがわかってきている [有田 （Arita, Y. ) ら、 「バイオケ ミカル 'アンド 'バイオフィジカル · リサーチ ·コミュニケーションズ (Biochem. Biophys. Res. Commun. ) 」 、 （米国） 、 第 257巻 （第 1号） 、 pp. 79— 83 (1 999年） ] 。
また、 脂肪細胞は多量の脂肪を合成するとともに脂肪分解も活発に行つて おり、 血中に脂肪酸とグリセロールを放出するが、 栗山らがクローニングし た膜蛋白質 aquaporin adiposeは脂肪細胞でグリセロールチャネル分子とし て機能する可能性が示唆されている [岸田 （Kishida, K. ) ら、 「ジャーナ ル ·ォヴ ·バィォロジカル ·ケミストリー （J. Biol. Chem. ) 」 、 （米国） ， 第 275巻 （第 27号） 、 p p. 20896-20902 (2000年） ] 。 このように脂肪細胞は様々な生理活性物質 （即ち、 リガンド） を分泌し、 また、 膜蛋白質 （即ち、 レセプ夕一） を細胞表面に発現している。 したがつ て、 これらの分泌'膜蛋白質の発現もしくは生理活性を調節することによつ て、 新規な肥満、 糖尿病、 血管病 （例、 動脈硬化） の予防 ·治療法が開発さ れることが期待される。
従来、 細胞表面レセプ夕一と生理活性物質 （即ち、 リガンド） との結合を 阻害する物質や、 結合して生理活性物質 （即ち、 リガンド） と同様なシグナ ル伝達を引き起こす物質は、 これらレセプターの特異的なアンタゴニストま たはァゴニストとして、 生体機能を調節する医薬品に活用されてきた。 従つ て、 このように生体内での発現において重要であるばかりでなく、 医薬品開 発の標的ともなりうる膜レセプ夕一蛋白質およびそのリガンド分子 （例えば、 分泌蛋白質） を新規に見出し、 その遺伝子 （例えば cDNA) をクロ一ニン グすることは、 新規レセプター蛋白質の特異的リガンドゃ、 ァゴニスト、 ァ ン夕ゴニストを見出す、 もしくは新規分泌蛋白質の特異的レセプ夕一を見出 す際に、 非常に重要な手段となる。
しかし、 脂肪細胞で分泌もしくは細胞表面に発現する蛋白質はその全てが 見出されているわけではなく、 現時点でもなお未知の分泌 ·膜蛋白質が多数 存在しており、 新たなリガンド、 レセプターの探索および機能解明が切望さ れている。
したがって、 本発明は、 肥満、 糖尿病、 動脈硬化などの予防 ·治療薬開発 の有用なツール、 あるいはこれらの疾患の有用な診断マーカ一となり得るよ うな、 脂肪細胞で特異的もしくは高発現している新規分泌 ·膜蛋白質遺伝子 を同定することを目的とする。 さらに、 本発明は、 該新規遺伝子を含有する 組換えベクター、 該組換えベクターを保持する形質転換体、 該形質転換体を 培養することによる該分泌 ·膜蛋白質の製造方法、 該分泌 ·膜蛋白質もしく はその部分べプチドまたはその塩に対する抗体、 該分泌 ·膜蛋白質の発現量 を変化させる化合物、 該分泌 ·膜蛋白質に対して特異的親和性を有する生体 物質の決定方法、 該特異的親和性を有する生体物質と該分泌 ·膜蛋白質との 結合性を変化させる化合物 （アン夕ゴニスト、 ァゴニスト） またはその塩の スクリーニング方法、 該スクリーニング用キット、 該スクリーニング方法も しくはスクリーニングキットを用いて得られる該特異的親和性を有する生体 物質と該分泌 ·膜蛋白質との結合性を変化させる化合物 （アンタゴニスト、 ァゴニスト） またはその塩、 および該特異的親和性を有する生体物質と該分 泌 ·膜蛋白質との結合性を変化させる化合物 （アン夕ゴニスト、 ァゴニス ト） もしくは該分泌 ·膜蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩を 含有してなる医薬などを提供することを目的とする。 発明の開示
本発明者らは、 上記の目的を達成すべく、 高脂肪食負荷マウスの内蔵脂肪 組織由来の c D NAライブラリーを作製し、 該 c D NAを N末端の細胞外領 域を欠失させた恒常的活性型トロンポポイエチン受容体 （4 9 8位のセリン がァスパラギンに置換されている） c D NAの 5 ' 側に組み込んだレトロゥ ィルス発現ライブラリーを構築、 パッケージング細胞から高力価レトロウイ ルスを回収してマウスプロ B細胞株 （B a Z F 3 ) を感染させ、 増殖性を保 持した細胞を選択した。 選択された細胞からゲノム D NAを抽出、 P C R法 を用いて導入されたマウス脂肪細胞由来 c D NAをサブクローニングし、 そ の塩基配列を決定した。 その結果、 8つの未知分泌もしくば膜蛋白質をコ一 ドすると考えられる c D NA断片が同定された。 これらの c D NA断片を用 いて、 マウス脂肪細胞由来 c D N Aから蛋白質コード領域の全長を含む c D N Aクローンを単離し、 それらの塩基配列を決定したところ、 いずれも新規 遺伝子であることが分かつた。
さらに、 これら遺伝子の発現の組織特異性、 肥満 ·糖尿病モデルにおける 発現量の変動、 食餌に対する応答、 インスリン抵抗性惹起因子もしくは改善 薬に対する応答、 脂肪細胞分化に及ぼす効果等を解析した結果、 これらの遣 伝子は脂肪細胞の分化や糖 ·脂質代謝機能に関連することが明らかとなった < 本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに研究を重ねた結果、 本発 明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
[1] 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩；
[2] 上記 [1] 記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基配列 を含むポリヌクレオチド；
[3] 上記 [2] 記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結果と して該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列またはそ の一部を含むポリヌクレオチド；
[4] 上記 [1] 記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体；
[5] 配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩；
[6] 上記 [5] 記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基配列 を含むポリヌクレオチド；
[7] 上記 [6] 記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結果と して該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列またはそ の一部を含むポリヌクレオチド；
[8] 上記 [5] 記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体；
[9]·配列番号： 6で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩；
[10] 上記 [9] 記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基配 列を含むポリヌクレオチド；
[1 1] 上記 [10] 記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結 果として該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列また はその一部を含むポリヌクレオチド；
[12] 上記 [9] 記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に 対する抗体；
[13] 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩；
[14] 上記 [13] 記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基 配列を含むポリヌクレオチド；
[15] 上記 [14] 記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結 果として該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列また はその一部を含むポリヌクレオチド；
[16] 上記 [13] 記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 に対する抗体；
[17] 配列番号： 10で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩；
[18] 上記 [17] 記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基 配列を含むポリヌクレオチド；
[19] 上記 [18] 記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結 果として該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列また はその一部を含むポリヌクレオチド；
[20] 上記 [17] 記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 に対する抗体；
[21] 配列番号： 12で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩； [22] 上記 [21] 記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基 配列を含むポリヌクレオチド；
[23] 上記 [22] 記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結 果として該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列また はその一部を含むポリヌクレオチド；
[24] 上記 [21] 記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 に対する抗体；
[25] 配列番号： 14で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩； [26] 上記 [25] 記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基 配列を含むポリヌクレオチド；
[27] 上記 [26] 記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結 果として該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列また はその一部を含むポリヌクレオチド；
[28] 上記 [25] 記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 に対する抗体；
[29] 配列番号： 16で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩； [30] 上記 [29] 記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基 配列を含むポリヌクレオチド；
[31] 上記 [30] 記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結 果として該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列また はその一部を含むポリヌクレオチド；
[32] 上記 [29] 記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 に対する抗体；
[33] 配列番号： 18で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩； [34] 上記 [33] 記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基 配列を含むポリヌクレオチド；
[35] 上記 [34] 記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結 果として該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列また はその一部を含むポリヌクレオチド； [36] 上記 [33] 記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 に対する抗体；
[37] 配列番号： 20で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩； [38] 上記 [37] 記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基 配列を含むポリヌクレオチド；
[39] 上記 [38] 記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結 果として該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列また はその一部を含むポリヌクレオチド；
[40] 上記 [37] 記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 に対する抗体；
[41] 配列番号： 22で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩； [42] 上記 [41] 記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基 配列を含むポリヌクレオチド；
[43] 上記 [42] 記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結 果として該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列また はその一部を含むポリヌクレオチド；
[44] 上記 [41] 記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 に対する抗体；
[45] 上記 [1] 、 [5] 、 [9] 、 [13] 、 [17] 、 [21] 、
[25] 、 [29] 、 [33] 、 [37] または [41] 記載の蛋白質もし くはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬；
[46] 上記 [2] 、 [6] 、 [10] 、 [14] 、 [18] 、 [22] 、 [[2266]] 、、 [[3300]] 、、 [[3344]] 、 [ 38 ] または [ 42 ] 記載のポリヌクレ ォチドを含有してなる医薬；
[47] 上記 [3] 、 [7] 、 [1 1] 、 [15] 、 [19] 、 [23] 、
[27] 、 [31] 、 [35] [39] または [43] 記載のポリヌクレ ォチドを含有してなる医薬； [48] 上記 [4] 、 [8] 、 [12] 、 [16] 、 [20] 、 [24] 、 [28] 、 [32] 、 [36] 、 [40] または [44] 記載の抗体を含有 してなる医薬；
[49] 脂肪細胞の分化および Zまたは代謝機能の異常が関与する疾患の予 防'治療剤である上記 [45] 〜 [48] のいずれかに記載の医薬；
[50] 上記 [2] 、 [6] 、 [10] 、 [14] 、 [18] 、 [22] 、 [26] 、 [30] 、 [34] 、 [38] もしくは [42] 記載のポリヌク レオチドまたはその一部を含有してなる診断薬；
[ 51 ] 上記 [ 3 ] 、 [ 7 ] 、 [11] 、 [15] 、 [19] 、 [23] 、 [27] 、 [31] 、 [35] 、 [39] または [43] 記載のポリヌクレ ォチドを含有してなる診断薬；
[52] 上記 [4] 、 [8] 、 [12] 、 [16] 、 [20] 、 [24] 、 [28] 、 [32] 、 [36] 、 [40] または [44] 記載の抗体を含有 してなる診断薬；
[53] 脂肪細胞の分化および または代謝機能の異常が関与する疾患の診 断用である上記 [50] 〜 [52] のいずれかに記載の診断薬；
[54] 上記 [1] 、 [5] 、 [9] 、 [13] 、 [17] 、 [21] 、 [25] 、 [29] 、 [33] 、 [37] または [41] 記載の蛋白質もし くはその部分べプチドまたはその塩を用いることを含む、 該蛋白質またはそ の塩に対して特異的親和性を有する化合物またはその塩、 あるいは該蛋白質 またはその塩と該化合物またはその塩との結合性を変化させる化合物または その塩のスクリーニング方法；
[55] 上記 [1] 、 [5] 、 [9] 、 [13] 、 [17] 、 [21] 、 [25] 、 [29] 、 [33] 、 [37] または [41] 記載の蛋白質もし くはその部分ペプチドまたはその塩を含んでなる、 該蛋白質またはその塩に 対して特異的親和性を有する化合物またはその塩、 あるいは該蛋白質または その塩と該化合物またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩 のスクリ一ニング用キッ卜；
[56] 上記 [54] 記載の方法または上記 [55] 記載のキットを用いて 得られうる化合物またはその塩を含有してなる医薬；
[57] 脂肪細胞の分化および Zまたは代謝機能の異常が関与する疾患の予 防 ·治療剤である上記 [56] 記載の医薬；
[58] 上記 [2] 、 [6] 、 [10] 、 [14] 、 [18] 、 [22] 、
[26] 、 [30] 、 [34] 、 [38] もしくは [42] 記載のポリヌク レオチドまたはその一部を用いることを特徴とする、 上記 [1] 、 [5] 、
[9] 、 [13] 、 [17] 、 [21] 、 [25] 、 [29] 、 [33] 、
[37] または [41] 記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化さ せる化合物またはその塩のスクリーニング方法；
[59] 上記 [2] 、 [6] 、 [10] 、 [14] 、 [18] 、 [22] 、
[26] 、 [30] 、 [34] 、 [38] もしくは [42] 記載のポリヌク レオチドまたはその一部を含んでなる、 上記 [1] 、 [5] 、 [9] 、 [1 3] 、 [17] 、 [21] 、 [25] 、 [29] 、 [33] 、 [37] また は [41] 記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化させる化合物ま たはその塩のスクリーニング用キット；
[60] 上記 [58] 記載の方法または上記 [59] 記載のキットを用いて 得られうる化合物またはその塩を含有してなる医薬；
[61] 脂肪細胞の分化および Zまたは代謝機能の異常が関与する疾患の予 防 ·治療剤である上記 [60] 記載の医薬；
[62] 上記 [4] 、 [8] 、 [12] 、 [16] 、 [20] 、 [24] 、
[28] 、 [32] 、 [36] 、 [40] または [44] 記載の抗体を用い ることを特徴とする、 細胞膜もしくは細胞外液における上記 [1] 、 [5]
[9] 、 [13] 、 [17] 、 [21] 、 [25] 、 [29] 、 [33] 、
[37] または [41] 記載の蛋白質またはその塩の量を変化させる化合物 またはその塩のスクリーニング方法；
[63] 上記 [4] 、 [8] 、 [12] 、 [16] 、 [20] 、 [24] 、
[28] 、 [32] 、 [36] 、 [40] または [44] 記載の抗体を含ん でなる、 細胞膜もしくは細胞外液における上記 [1] 、 [5] 、 [9] 、
[13] 、 [17] 、 [21] 、 [25] 、 [29] 、 [33] 、 [37] または [ 4 1 ] 記載の蛋白質またはその塩の量を変化させる化合物またはそ の塩のスクリ一ニング用キット；
[ 6 4 ] 上記 [ 6 2 ] 記載の方法または上記 [ 6 3 ] 記載のキットを用いて 得られうる化合物またはその塩を含有してなる医薬；および
[ 6 5 ] 脂肪細胞の分化およびノまたは代謝機能の異常が関与する疾患の予 防 ·治療剤である上記 [ 6 4 ] 記載の医薬；
などを提供する。
本発明の蛋白質は、 高脂肪食負荷により白色脂肪細胞で発現する分泌もし くは膜蛋白質であることなどから、 脂肪細胞の分化や代謝機能の異常に関連 する疾患の予防 ·治療剤として、 あるいは当該疾患の予防 ·治療に有効な医 薬品候補化合物のスクリーニングのためのツールとして優れた効果を発揮す る。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 高脂肪食負荷されたヒトまたは他の哺乳動物の白色脂肪組織で 特異的に、 もしくは高発現する分泌もしくは膜蛋白質 （以下、 これらを総称 して 「本発明の蛋白質」 という場合がある） を提供する。 具体的には、 本発 明の蛋白質は、 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質 （以下、 「SST20- 14 (Long f orm) j と いう場合もある） ；配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質 （以下、 「SST20-14 (Shor t f onn)」 という場合もある） ；配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質 （以下、 「SST22- 22 (Long f orm)」 という場合もある） ；配列番号： 8で表わされるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質 （以下、 rsST22-22 (Shor t f orm)」 という場合もある） ；配列番号： 1 0で表わされ るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質 (以下、 「SST8-5」 という場合もある） ；配列番号： 1 2で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質 （以下、 「SST 1 9- 1 5 (Long f orm)」 という場合もある） ；配列番号： 1 4で表わされ るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含む蛋白質 (以下、 「SST 1 9- 1 5 (Sho r t f orm)」 という場合もある） ；配列番号： 1 6で 表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む 蛋白質 （以下、 「SST 13- 1 1」 という場合もある） ；配列番号： 1 8で表わさ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質 (以下、 「SST9- 8」 という場合もある） ；配列番号： 2 0で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含む蛋白質 （以下、 「SST2卜 3」 という場合もある） ；または配列番号： 2 2で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質 （以下、 「SST20- 6」 という場合もある） である。
本発明の蛋白質は、 哺乳動物の脂肪組織、 特に白色脂肪組織で高発現する 分泌もしくは膜蛋白質であるが、 上記の性質を有する限りその由来に特に制 限はなく、 例えば、 哺乳動物 （例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒ ッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） の細胞
[例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 滕臓) 3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲル八ンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内 皮細胞、 平滑筋細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 (例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細 胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など] もしくはそれらの細胞が存在 するあらゆる組織 [例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底 球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆嚢、 骨髄、 副腎、 皮膚、 肺、 消化管 (例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 脂肪組織 （例、 褐色脂肪組織、 白色脂 肪組織） 、 骨格筋など] 等から単離 ·精製される蛋白質であってもよい。 ま た、 化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質であって もよいし、 あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を 導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
上記 「実質的に同一のアミノ酸配列」 としては、 上記各配列番号 （配列番 号： 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20または 22) で 表されるアミノ酸配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 さらに好 ましくは約 90%以上、 特に好ましくは約 95%以上の相同性を有するアミ ノ酸配列などが挙げられる。 ここで 「相同性」 とは、 当該技術分野において 公知の数学的アルゴリズムを用いて 2つのアミノ酸配列をァラインさせた場 合の、 最適なアラインメント （好ましくは、 該アルゴリズムは最適なァライ ンメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得る ものである） における、 オーバ一ラップする全アミノ酸残基に対する同一ァ ミノ酸および類似アミノ酸残基の割合 （％) を意味する。 「類似アミノ酸」 とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、 例えば、 芳香族ァ ミノ酸 （Phe、 Trp、 Tyr) 、 脂肪族アミノ酸 (Ala, Leu、 Ile、 Val) 、 極性 アミノ酸 （Gln、 Asn) 、 塩基性アミノ酸 （Lys、 Arg、 His) 、 酸性アミノ酸 (Glu、 Asp) 、 水酸基を有するアミノ酸 （Ser、 Thr) 、 側鎖の小さいァミノ 酸 （Gly、 Ala, Ser、 Thr, Met) などの同じグループに分類されるアミノ酸 が挙げられる。 このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化 をもたらさない （即ち、 保存的アミノ酸置換である） ことが予測される。 保 存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、 種々の文献に記載 されている （例えば、 Bowieら， Science, 247： 1306-1310 (1990)を参照） ' 本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い、 以下の条件 （期待値 =10；ギャップを許 す；マトリクス =BLOSUM62； フィルタリング =0FF) にて計算することができ る。 アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、 例 えば、 Karlinら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 5873-5877 (1993)に 記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは NBLASTおよび XBLASTプログラム (version 2.0) に組み込まれている (Altschul ら， ucleic Acids Res. , 25： 3389-3402 (1997) ) ] 、 Needlemanら， J. Mol . Bi ol . , 48 : 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは GCGソフトウエアパッケ一 ジ中の GAPプログラムに組み込まれている] 、 Myersおよび Mi l l er, CABIOS, 4 : 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは CGC配列ァライ ンメントソフトウェアパッケージの一部である ALIGNプログラム （vers i on 2. 0) に組み込まれている] 、 Pearsonら, Pro at l . . Acad. Sc i . USA, 85 : 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは GCGソフト ウェアパッケージ中の FASTAプログラムに組み込まれている] 等が挙げられ、 それらも同様に好ましく用いられ得る。
より好ましくは、 「実質的に同一のアミノ酸配列」 とは、 上記各配列番号 で表されるアミノ酸配列と約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 さらに 好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上の同一性を有するァ ミノ酸配列である。
「実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質」 としては、 例えば、 前 記した 「実質的に同一のアミノ酸配列」 を含有し、 且つ上記各配列番号で表 されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質 が好ましい。
「実質的に同質の活性」 としては、 例えば、 レセプ夕一 （もしくはリガン ド） 結合活性およびシグナル情報伝達作用などが挙げられる。 「実質的に同 質」 とは、 それらの活性が性質的に （例：生理学的に、 または薬理学的に） 同質であることを示す。 したがって、 レセプ夕一 （リガンド） 結合活性ゃシ グナル情報伝達作用などの活性が同等 （例：約 0 . 5〜約 2倍） であること が好ましいが、 これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異な つていてもよい。
レセプター （もしくはリガンド） 結合活性やシグナル情報伝達作用などの 活性の測定は、 自体公知の方法に準じて行なうことができるが、 例えば、 後 述する特異的親和性を有する生体物質 （レセプ夕ーもしくはリガンド） の決 定方法ゃァゴニスト、 アン夕ゴニストのスクリーニング方法において用いら れる方法に従って測定することができる。 また、 本発明の蛋白質としては、 例えば、 ①上記各配列番号で表されるァ ミノ酸配列のうち 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 好まし くは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が欠失 したアミノ酸配列、 ②上記各配列番号で表されるアミノ酸配列に 1または 2 個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに 好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③上記各 配列番号で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 ④上記各配列番号で表されるァミノ 酸配列のうち 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が他のアミ ノ酸で置換されたァミノ酸配列、 または⑤それらを組み合わせたアミノ酸配 列を含有する蛋白質であって、 且つ上記各配列番号で表されるアミノ酸配列 を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質も含まれる。 ここで 「実質的に同質の活性」 とは前記と同義である。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その 挿入、 欠失または置換の位置は、 蛋白質の活性が保持される限り特に限定さ れない。
本発明の蛋白質は分泌もしくは膜蛋白質であり、 通常、 生体内では N末端 にシグナルペプチドを有する前駆ポリペプチドとして翻訳された後、 シグナ ルぺプチダ一ゼによるプロセッシングを受けて成熟 （もしくはプロ） 蛋白質 となる。 シグナルペプチドの開裂部位 （成熟 （プロ） 蛋白質の N末端） は、 例えば、 完全もしくは部分精製した本発明の蛋白質をエドマン分解法に付す ことにより決定することができるが、 前駆ポリぺプチドの一次構造から公知 の数学的アルゴリズムを用いて予測することができる。 このようなアルゴリ ズムとしては、 例えば、 Nielsenら, Int. Neural Syst., 8(5-6)： 581-599 (1997)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは SignalPプログラム （WWW サーバー： http：〃 www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/上で利用可能） に組 み込まれている] 、 Emanuel s sonら, J. Mol. Biol. 300: 1005-1016 (2000) に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは TargetPプログラム （WWWサーバ ―： http：〃 www. cbs.dtu.dk/services/TargetP/上で利用可能) に組み込ま れている] 、 von Heijne, Nucl. Acids Res., 14: 4683 (1986)に記載のァ ルゴリズム [該アルゴリズムは PSORT IIプロダラ （WWWサーバー： http：〃 psort. ims.u- tokyo.a jp/form2.html上で利用可能) に組み込まれ ている] 、 SOSUI (Signal)プログラム Beta Version (WWWサーバー： ht tp://sosui. roteome. bio. tuat. ac. jp/cgi- bin/sosui. cgi?/sosuisignal/sosuisignal_submi t. html上で禾 U用可育 に組 み込まれるアルゴリズム等が挙げられるが、 これらに限定されない。 例えば 上記 PSORT IIプログラムを用いた場合、 上記各配列番号で表されるァミノ 酸配列を有するポリペプチドはそれぞれアミノ酸番号一 1とアミノ酸番号 1 の間で開裂し得ると予測されるが、 それらは現実の開裂部位と必ずしも一致 するわけではなく、 また、 本発明の蛋白質を発現させる細胞種によってシグ ナルの切断位置が異なる場合も起こり得る。 従って、 本発明の蛋白質には、 上記各配列番号で表されるアミノ酸配列中ァミノ酸番号 1以降のアミノ酸配 列、 あるいは該アミノ酸配列において 1または 2個以上のアミノ酸が付加も しくは欠失したアミノ酸配列を含有する蛋白質も包含される。
本発明の蛋白質は、 好ましくは、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を 有するマウス SST20- 14(Long form), 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列 を有するマウス SST20- 14(Short form), 配列番号： 6で表されるアミノ酸配 列を有するマウス SST22-22(Long form), 配列番号： 8で表されるアミノ酸 配列を有するマウス SST22- 22 (Short form), 配列番号： 10で表されるアミ ノ酸配列を有するマウス SST8 - 5、 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列を 有するマウス SST19-15(Long form), 配列番号： 14で表されるアミノ酸配 列を有するマウス SST19- 15(Short form), 配列番号： 16で表されるァミノ 酸配列を有するマウス SST13- 11、 配列番号： 1 8で表されるアミノ酸配列を 有するマウス SST9- 8、 配列番号： 20で表されるアミノ酸配列を有するマウ ス SST2卜 3または配列番号： 22で表されるアミノ酸配列を有するマウス SST20- 6、 あるいは他の哺乳動物におけるそれらのホモログである。 本明細書において、 蛋白質およびペプチドは、 ペプチド標記の慣例に従つ て左端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） で記載 される。 配列番号： 2または 4で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 1以 降のアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、 本発明の蛋白質は、 C 末端が力ルポキシル基 （一 C O OH) 、 カルボキシレート（一 C O O—) 、 ァ ミド （― C O N H 2) またはエステル （—C O O R) の何れであってもよい c ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n _プロ ピル、 イソプロピル、 n—ブチルなどの C i _ 6アルキル基；例えば、 シクロ ペンチル、 シクロへキシルなどの C 3 _ 8シクロアルキル基；例えば、 フエ二 ル、 ひ一ナフチルなどの C 6— 1 2ァリール基；例えば、 ベンジル、 フエネチ ルなどのフエ二ルー 0卜2アルキル基； α—ナフチルメチルなどのひ—ナフ チルー C i _ 2アルキル基などの C 7 _ i 4ァラルキル基； ビバ口ィルォキシメチ ル基などが用いられる。
本発明の蛋白質が C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルボキシレー ト） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されて いるものも本発明の蛋白質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例え ば上記した 末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明の蛋白質には、 N末端のアミノ酸残基のァミノ基が保護基 (例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C卜 6アルカノィルなどの ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断されて生成し得る N末 端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側 鎖上の置換基 （例えば— O H、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾール基、 インド ール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチ ル基などの Cェ— 6アルカノィル基などの C i _ 6ァシル基など） で保護されて いるもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質など も含まれる。
本発明の蛋白質の部分ペプチド （以下、 単に 「本発明の部分ペプチド」 と 略称する場合もある） は、 上記した本発明の蛋白質の部分アミノ酸配列を有 するぺプチドであり、 且つ本発明の蛋白質と実質的に同質の活性を有する限 り、 何れのものであってもよい。 ここで 「実質的に同質の活性」 とは上記と 同意義を示す。 また、 「実質的に同質の活性」 の測定は本発明の蛋白質の場 合と同様に行なうことができる。
具体的には、 本発明の部分ペプチドとして、 例えば、 上記各配列番号で表 されるアミノ酸配列のうち、 本発明の蛋白質と相互作用し得る生体物質 （レ セプ夕一もしくはリガンド） との結合に関わる領域および該相互作用を介し たシグナル伝達に関わる領域をさらに含む部分アミノ酸配列を有するものな どが用いられる。
本発明の部分ペプチドとしては、 少なくとも 3 0個以上、 好ましくは 6 0 個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上のアミノ酸を有するペプチドなどが好 ましい。
一方、 本発明の蛋白質の部分アミノ酸配列を含むが該蛋白質と実質的に同 質の活性を有しないペプチド、 例えば、 上記各配列番号で表されるアミノ酸 配列のうち、 本発明の蛋白質と相互作用し得る生体物質 （レセプ夕一もしく はリガンド） との結合に関わる領域を含むが、 該相互作用を介したシグナル 伝達に関わる領域を含まない部分アミノ酸配列を有するものなどは、 「本発 明の部分ペプチド」 には含まれない。 しかしながら、 かかるペプチドは、 本 発明の蛋白質と相互作用し得る生体物質 （レセプ夕ーもしくはリガンド） と 結合して該蛋白質によるシグナル伝達作用を遮断することができるので、 該 シグナル伝達の異常亢進が関与する病態 ·疾患の予防 ·治療などに有用であ り得る。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が力ルポキシル基 （一 C O O H) 、 カルボキシレート （― C〇〇—） 、 アミド （_ C〇N H 2 ) またはエステル ( - C O O R ) の何れであってもよい。 ここでエステルにおける Rとしては、 本発明の蛋白質について前記したと同様のものが挙げられる。 本発明の部分 ペプチドが C末端以外にカルボキシル基 （またはカルポキシレート） を有し ている場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されているものも 本発明の部分ペプチドに含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば、 C末端のエステルと同様のものなどが用いられる。 さらに、 本発明の部分ペプチドには、 上記した本発明の蛋白質と同様に、 N末端のアミノ酸残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N末端の グルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上 の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したい わゆる糖ペプチドなどの複合べプチドなども含まれる。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドの塩としては、 酸または塩基との 生理学的に許容される塩が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加 塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン 酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プ ロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ 酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩など が用いられる。
本発明の蛋白質またはその塩は、 前述した哺乳動物の細胞または組織から 自体公知の蛋白質の精製方法によって製造することができる。 具体的には、 本発明の蛋白質が細胞膜に局在する場合は、 哺乳動物の組織または細胞をホ モジナイズし、 低速遠心により細胞デブリスを除去した後、 上清を高速遠心 して細胞膜含有画分を沈澱させ （必要に応じて密度勾配遠心などにより細胞 膜画分を精製し） 、 該画分を逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマト グラフィ一、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー 等に付すことにより該蛋白質またはその塩を調製することができる。 また、 本発明の蛋白質が細胞外に分泌される場合は、 哺乳動物の組織または細胞を 適当な培地中で培養した後、 濾過または遠心分離等により培養上清を分取し, 該上清を上記と同様にクロマトグラフィー等に付すことにより該蛋白質また はその塩を調製することができる。
本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 「本発明 の蛋白質 （ペプチド） 」 と略記する場合がある） は、 公知のペプチド合成法 に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれであっても よい。 本発明の蛋白質 （ペプチド） を構成し得る部分ペプチドもしくはアミ ノ酸と残余部分とを縮合し、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離す ることにより目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、 縮合や保護基の脱離は、 自体公知の方法、 例えば、 以下の①〜⑤ に記載された方法に従って行われる。
Μ. Bodanszky および Μ.Α. Ondetti、 ペプチド 'シンセシス （Peptide Synthesis) , Interscience Publishers, New York (1966年)
② Schroederおよび Luebke、 ザ 'ペプチド（The Peptide), Academic Press, New York (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 蛋白質の化学 IV、 205、 (1977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店
このようにして得られた蛋白質 （ペプチド） は、 公知の精製法により精製 単離することができる。 ここで、 精製法としては、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロマトグラフィー、 液体クロマトグラフィー、 再結晶、 これらの組 み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られる蛋白質 （ペプチド） が遊離体である場合には、 該遊離 体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換すること ができるし、 逆に蛋白質 （ペプチド） が塩として得られた場合には、 該塩を 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換す ることができる。
本発明の蛋白質 （ペプチド） の合成には、 通常市販の蛋白質合成用樹脂を 用いることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4 一べンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルアミ ン樹脂、 PAM樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチ ル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 （2' , 4' —ジメトキシフエ二ル —ヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4— (2' ， 4' —ジメトキシフエ ニル— Fmocアミノエチル） フエノキシ樹脂などを挙げることができる。 こ のような樹脂を用い、 ひ—アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸 を、 目的とする蛋白質 （ペプチド） の配列通りに、 自体公知の各種縮合方法 に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂から蛋白質等を切り出すと 同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィ ド結合 形成反応を実施し、 目的の蛋白質 （ペプチド） またはそのアミド体を取得す る。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 蛋白質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルボ ジイミド類としては、 D C C、 N, N ' —ジイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチル— N ' — （3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが 用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HO B ' t、 H O O B t)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、 または、 対 称酸無水物または H O B tエステルあるいは H O O B tエステルとしてあら かじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。 保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、 蛋白質縮合反 応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N， N—ジメチルホルムアミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メチルビ 口リドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化 炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホ キシドなどのスルホキシド類、 ピリジンなどのアミン類， ジォキサン， テト ラヒドロフランなどのエーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなど の二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの 適宜の混合物などが用いられる。 反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され 得ることが知られている範囲から適宜選択され、 通常約— 2 0 〜 5 0 の 範囲から適宜選択される。 活性化されだアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍 過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分 な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分 な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られない ときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸を ァセチル化することができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその 保護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の 手段から適宜選択しうる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 ターシャリーペ ンチルォキシカルボニル、 イソポルニルォキシカルボニル、 4ーメトキシべ ンジルォキシ力ルポニル、 C I— Z、 B r _ Z、 ァダマンチルォキシカルボ ニル、 トリフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニル スルフエニル、 ジフエ二ルホスフイノチオイル、 F m o cなどが用いられる。 カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチ ル、 プロピル、 ブチル、 ターシャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキ シル、 シクロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4一二トロべンジルエステル、 4—メトキシベンジルェ ステル、 4—クロ口べンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエ ナシルエステル化、 ベンジルォキシカルボニルヒドラジド化、 ターシャリ一 ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒドラジド化などによつて保護 することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護す ることができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基 などの低級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキ シカルポニル基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが 用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロビラ二ル基、 t 一ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z し C 1 2 - B z 1、 2—ニトロベンジル、 B r _ Z、 ターシャリーブチルなどが用 いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 T o s、 4—メト キシー 2， 3， 6 _トリメチルベンゼンスルホニル、 D N P、 ベンジルォキ シメチル、 B u m、 B o c、 T r t、 F m o cなどが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 01—黒ぁるぃは？(1ー炭 素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水 素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸 あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体 アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱 離反応は、 一般に約— 2 0 ° (：〜 4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理におい ては、 例えば、 ァニソ一ル、 フエノール、 チオアニソール、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾール、 ジメチルスルフイド、 1， 4—ブタンジチオール、 1 , 2 一エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる 2 , 4—ジニトロフエ二 ル基はチォフエノール処理により除去され、 トリブトファンのインドール保 護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2—エタンジチオール、 1 , 4 -ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化 ナトリゥム溶液、 希アンモニアなどによるアル力リ処理によっても除去され る。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸 無水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノ —ル、 2， 4 , 5—トリクロ口フエノール、 2， 4—ジニトロフエノール、 シァノメチルアルコール、 パラニトロフエノール、 H〇N B、 N—ヒドロキ シスクシミド、 N—ヒドロキシフタルイミド、 H O B t) とのエステル〕 な どが用いられる。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対 応するリン酸アミドが用いられる。
蛋白質 （ペプチド） のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ末端アミノ酸のひ一力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にぺプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプチド鎖の N末 端のひーァミノ基の保護基のみを除いた蛋白質 （ペプチド） と C末端のカル ポキシル基の保護基のみを除去した蛋白質 （ペプチド） とを製造し、 この両 蛋白質 （ペプチド） を上記したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の 詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護蛋白質 （保護べ プチド） を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗 蛋白質 （粗ペプチド） を得ることができる。 この粗蛋白質 （粗ペプチド） は 既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望 の蛋白質 （ペプチド） のアミド体を得ることができる。
蛋白質 （ペプチド） のエステル体は、 例えば、 カルポキシ末端アミノ酸の α _力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした 後、 上記蛋白質 （ペプチド） のアミド体の場合と同様にして得ることができ る。
本発明の部分ペプチドまたはその塩は、 本発明の蛋白質またはその塩を適 当なぺプチダーゼで切断することによつても製造することができる。
さらに、 本発明の蛋白質 （ペプチド） は、 本発明の蛋白質またはその部分 ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養し、 得 られる培養物から本発明の蛋白質 （ペプチド） を分離精製することによって 製造することもできる。 本発明の蛋白質またはその部分べプチドをコ一ドす るポリヌクレオチドは D NAであっても R N Αであってもよく、 あるいは D N A/R NAキメラであってもよい。 好ましくは D N Aが挙げられる。 また, 該ポリヌクレオチドは二本鎖であっても、 一本鎖であってもよい。 二本鎖の 場合は、 二本鎖 D N A、 二本鎖 R NAまたは D NA： R N Aのハイブリッド でもよい。 一本鎖の場合は、 センス鎖 （即ち、 コード鎖） であっても、 アン チセンス鎖 （即ち、 非コード鎖） であってもよい。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする D NAとしては、 哺 乳動物 （例えば、 ヒト、 ゥシ、 サル、 ゥマ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ィヌ、 ネ コ、 モルモット、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ハムスターなど） のゲノム D N A、 該哺乳動物のあらゆる細胞 [例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 ダリ ァ細胞、 滕臓 i3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 繊維芽細胞、 繊維細 胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 (例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨 核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細 胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細 胞など] もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織 [例えば、 脳、 脳の 各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆 嚢、 骨髄、 副腎、 皮膚、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 脂肪 組織 （例、 褐色脂肪組織、 白色脂肪組織） 、 骨格筋など] 由来の cDNA、 合成 DN Aなどが挙げられる。 本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコ ードするゲノム DNAおよび cDNAは、 上記した細胞'組織より調製した ゲノム DN A画分および全 RNAもしくは mRN A画分をそれぞれ铸型とし て用い、 Polymerase Chain Reaction (以下、 「PCR法」 と略称する） お よび Reverse Transcriptase- PCR (以下、 「RT— PCR法」 と略称する） によって直接増幅することもできる。 あるいは、 本発明の蛋白質またはその 部分ペプチドをコードするゲノム DNAおよび c DNAは、 上記した細胞 · 組織より調製したゲノム DN Aおよび全 RN Aもしくは mRN Aの断片を適 当なベクター中に挿入して調製されるゲノム DNAライブラリーおよび c D N Aライブラリ一から、 コロニーもしくはプラークハイブリダィゼーション 法または PC R法などにより、 それぞれクローニングすることもできる。 ラ イブラリーに使用するべクタ一は、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。
本発明の蛋白質をコードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 1で表 される塩基配列を含有する DNAまたは該塩基配列とハイストリンジェント な条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、 配列番号： 2で表される アミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコ一 ドする DNA (以下、 「Sst20— 14(Long form)」 と略記する場合がある） ； 配列番号： 3で表される塩基配列を含有する DN Aまたは該塩基配列とハイ ストリンジヱン卜な条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、 配列番 号： 4で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有 する蛋白質をコードする DNA (以下、 「Sst20— 14(Short form)」 と略記 する場合がある） ；配列番号： 5で表される塩基配列を含有する DNAまた は該塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配 列を含有し、 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質 的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNA (以下、 「Sst22- 22 (Long form) j と略記する場合がある） ；配列番号： 7で表される塩基配 列を含有する DNAまたは該塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハ イブリダィズする塩基配列を含有し、 配列番号： 8で表されるアミノ酸配列 を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコ一ドする DNA (以下、 「Sst22- 22(Short form)j と略記する場合がある） ；配列番号： 9 で表される塩基配列を含有する DNAまたは該塩基配列とハイストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、 配列番号： 10で表 されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質 をコードする DNA (以下、 「Sst8- 5」 と略記する場合がある） ；配列番 号： 1 1で表される塩基配列を含有する DNAまたは該塩基配列とハイスト リンジェン卜な条件下でハイプリダイズする塩基配列を含有し、 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有す る蛋白質をコードする DNA (以下、 「Sstl9-15(Long form)」 と略記する 場合がある） ；配列番号： 1 3で表される塩基配列を含有する DN Aまたは 該塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列 を含有し、 配列番号： 14で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質 的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNA (以下、 「Sstl9- 15(Short form)」 と略記する場合がある） ；配列番号： 1 5で表される塩基 配列を含有する DNAまたは該塩基配列とハイストリンジェン卜な条件下で ハイブリダィズする塩基配列を含有し、 配列番号： 16で表されるアミノ酸 配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする D NA (以下、 「Sstl3- 11」 と略記する場合がある） ；配列番号： 1 7で表さ れる塩基配列を含有する D N Aまたは該塩基配列とハイス 条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、 配列番号： 18で表される アミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコー ドする DNA (以下、 「Sst9- 8」 と略記する場合がある） ；配列番号： 1 9 で表される塩基配列を含有する DNAまたは該塩基配列とハイストリンジェ ントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、 配列番号： 20で表 されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質 をコードする DNA (以下、 「Sst2卜 3」 と略記する場合がある） または配 列番号： 21で表される塩基配列を含有する DN Aまたは該塩基配列とハイ ストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を含有し、 配列番 号： 22で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を 有する蛋白質をコードする DNA (以下、 「Sst20-6」 と略記する場合があ る） が挙げられる。
上記各配列番号 （配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9または 2 1) で表される塩基配列とハイストリンジェン卜な条件下 でハイブリダィズできる DNAとしては、 当該塩基配列と約 50%以上、 好 ましくは約 60%以上、 さらに好ましくは約 70%以上、 特に好ましくは約 80 %以上、 最も好ましくは約 90 %以上の相同性を有する塩基配列を含有 する DN Aなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い、 以下の条件 （期待値 =10；ギャップを許 す；フィルタリング =0N；マッチスコア =1 ； ミスマッチスコア =-3) にて計算 することができる。 塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムと しては、 上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく 例示される。
ハイブリダィゼーションは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー ·クローニング （Molecular Cloning) 第 2版 （J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法な どに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する塲合、 ハイブリダィゼーションは、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なう ことができる。 ハイブリダィゼーシヨンは、 好ましくは、 ハイストリンジェ ン卜な条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、 例えば、 ナトリウム塩濃度が約 1 9〜約 40 mM、 好ましくは約 1 9〜約 20 mMで、 温度が約 50〜約 7 0°C、 好ましくは約 60〜約 65 °Cの条件等が挙げられる。 特に、 ナトリウ ム塩濃度が約 19 mMで温度が約 65 °Cの場合が好ましい。 当業者は、 ハイ ブリダイゼーション溶液の塩濃度、 ハイブリダゼーション反応の温度、 プロ ーブ濃度、 プローブの長さ、 ミスマッチの数、 ハイブリダィゼーシヨン反応 の時間、 洗浄液の塩濃度、 洗浄の温度等を適宜変更することにより、 所望の ストリンジエンシーに容易に調節することができる。
本発明の蛋白質をコードする DNAは、 好ましくは、 配列番号： 1で表さ れる塩基配列を有する、 マウス SST20-14(Long form)蛋白質をコードする D NA、 配列番号： 3で表される塩基配列を有する、 マウス SST20-14(Short form)蛋白質をコードする DNA、 配列番号： 5で表される塩基配列を有す る、 マウス SST22-22 (Long form)蛋白質をコードする DNA、 配列番号： 7 で表される塩基配列を有する、 マウス SST22-22 (Short form)蛋白質をコード する DNA、 配列番号： 9で表される塩基配列を有する、 マウス SST8-5蛋 白質をコードする DNA、 配列番号： 1 1で表される塩基配列を有する、 マ ウス SST19- 15(Long form)蛋白質をコードする DNA、 配列番号： 13で表 される塩基配列を有する、 マウス SST19- 15(Short form)蛋白質をコードする DNA、 配列番号： 1 5で表される塩基配列を有する、 マウス SST13- 11蛋 白質をコードする DNA、 配列番号： 1 7で表される塩基配列を有する、 マ ウス SST9- 8蛋白質をコードする DNA、 配列番号： 1 9で表される塩基配 列を有する、 マウス SST2卜 3蛋白質をコードする DNA、 または配列番号： 2 1で表される塩基配列を有する、 マウス SST20-6蛋白質をコードする DN Aなどである。
上記各 DNAをプラスミドとして保持する大腸菌株 [順に（1)
Escherichia coli Topi 0/pCR4-TOPO (SST20-1 1 ong form), (2) Escherichia coli Topi 0/pCR4-TOPO (SST20-14shor t form), (3) Escherichia coli
Topl0/pCR4-T0P0(SST22-221ong form), (4) Escherichia coli To lO/pCR4- TOPO(SST22-22short form), (5) Escherichia coli Topl0/pCR4-T0P0(SST8- 5)、 (6) Escherichia coli Topi 0/pCR4-T0P0 (SST19-151 ong form), (7) Escherichia coli To i 0/pCR4-TOPO (SST19-15shor t form), (8)
Escherichia coli To i 0/pCR4-TOPO (SST13-11) > (9) Escherichia coli ToplO/pENTR/D- T0PO(SST9-8)、 (10) Escherichia coli To lO/pCR4- T0P0(SST2卜 3)および（11) Escherichia coli ToplO/pCR4-TOPO(SST20-6)] は、 それぞれ FERM BP- 8406、 FERM BP - 8407、 FERM BP-8408、 FERM BP- 8409、 FERM BP - 8402、 FERM BP- 8404、 FERM BP-8405, FERM BP- 8403、 FERM BP- 8411. FERM BP-8413および FERM BP-8412の受託番号を付され、 （1)〜（8)について は平成 1 5 (2003) 年 6月 20日付で、 （9)〜（11)については平成 1 5
(2003) 年 6月 24日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生 物寄託センター （〒305- 8566 茨城県つくば巿東 1一 1一 1 中央第 6) に 寄託されている。
本発明の蛋白質のような分泌もしくは膜蛋白質をコードする核酸をクロー ニングする簡便な手法としてシグナルシークェンストラップ （S ST) 法が 知られている。 この方法は、 基本的には、 目的の組織由来の c DN Aライブ ラリーを作製し、 これを分泌もしくは細胞膜へ移行した場合にのみ細胞の選 択を可能にする蛋白質をコードする DNAの 5' 側に組み込んだ融合蛋白質 発現ベクターを用い、 該蛋白質の分泌もしくは細胞膜への移行を指標にして 分泌もしくは膜蛋白質をコードする cDN Aを選択するというものである。 例えば、 スクロースを資化できない変異インベル夕一ゼを有する酵母に、 目 的 cDNAライブラリーをシグナル配列欠失変異ィンベルターゼ遺伝子の 5' 側に融合させた酵母発現プラスミドを導入し、 スクロースを炭素源とす る培地で増殖性を有する酵母を選択する方法 （Kleinら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 7108-7113, 1996) 、 シグナル欠損変異 C D 25抗原遺伝子 の 5 ' 側に目的 c DNAライブラリーを融合させた哺乳動物用発現ベクター を適当な哺乳動物細胞に導入し、 抗 CD 25抗体を用いた免疫染色により分 泌 ·膜蛋白質をコードする cDN Aを有するクローンを選択する方法
(Tashiroら， Science, 261: 600-603, 1993) 、 B aノF 3細胞株をI Lー 3非依存的に増殖可能にする変異ト口ンボボイェチン受容体 （N末端細胞外 ドメインコード領域を欠失する） の 5' 側に目的 c DNAライブラリーを融 合させた哺乳動物用発現ベクターを B aZF 3細胞に導入し、 I L— 3非存 在下で増殖性を有する細胞を選択する方法 （Koj imaおよび Ki tamura,
Nature Biotech., 17: 487-490, 1999; Tsurugaら， Biochem. Biophys. Res. Commun. , 272: 293-297, 2000) 等が挙げられる。
選択された細胞からゲノム DNA (導入された c DNAがゲノムに組み込 まれている場合） またはプラスミド DNAもしくはウィルス DNA (導入さ れた c DN Aがゲノムに組み込まれていない場合） を抽出し、 使用したべク 夕一の 5' フランキング配列と融合させたマーカー蛋白質遺伝子の 5' 側配 列とを基にしてセンスおよびアンチセンスプライマーを作製し、 前記 DNA を铸型として P C R法を行うことにより分泌もしくは膜蛋白質の一部をコー ドする cDNAを単離し、 適当なクローニングベクター中にサブクロ一ニン グすることができる。
こうして得られた cDNAの塩基配列は自体公知の方法 （マキサム ·ギル バート法、 ジデォキシ夕一ミネーシヨン法等） を用いて決定することができ る。
本発明の蛋白質をコードする核酸のクローニングの手段としては、 上記の ようにして同定され、 配列決定された上記 cDNAの部分塩基配列を有する 2種の合成 DN Aプライマーと適当なアダプタープライマーとを用いて、 目 的の組織由来の mRNAを铸型とする 5 ' —および 3' —RACE反応を行 レ 得られた各増幅断片を制限酵素とリガーゼを用いて連結するなどして完 全長の c DNAを得る方法、 あるいは配列決定された上記 cDNAの一部あ るいは全領域を含む DN Aをプローブとして用い、 ライブラリ一から再度ハ イブリダィゼーションによるスクリ一ニングを行って完全長 c DNAを得る 方法等が挙げられるが、 これらに限定されない。 RACE法による場合、 ァ ダブ夕一プライマ一としては任意のアダプタ一配列 （例えば、 サブクロー二 ング用の制限酵素認識部位を含む配列） の 3' 末端にオリゴ dTが付加され たもの等が好ましく用いられ得る。 5 ' —RACEにおいて、 逆転写酵素の 内在のターミナルトランスフェラーゼ活性を利用する場合は主として数個の dCが付加されるので、 3' 末端に dGを付加したアダプタープライマーが 好ましく用いられ得る。 ハイブリダィゼーシヨン法による場合、 ハイブリダ ィゼーシヨンは自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキ ユラ一 ·クローニング （Molecular Cloning) 第 2版 （J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なう ことができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 ハイブリダィゼ ーシヨンは、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 こうして得られた完全長 c DNAの塩基配列は、 部分配列と同様に自体公 知の方法 （マキサム 'ギルバート法、 ジデォキシターミネーシヨン法等） を 用いて決定することができる。
配列番号： 1で表される塩基配列を有する、 マウス SST20- 14(Long form) 蛋白質の完全長をコードする DNA (mSst20-14(Long form)) 、 および配列 番号： 3で表される塩基配列を有する、 マウス SST20- 14(Short form)蛋白質 の完全長をコードする DNA (mSst20-14(Short form)) は、 例えば、 高脂 肪食負荷されたマウス白色脂肪組織由来の c D N Aライブラリーから、 上記 S ST法を用いて得られ、 大腸菌 Escherichia coli To lO/pENTR/D-TOPO (20- 14)株にクローニングされた核酸 (mSst20-14(partial)) の塩基配列
(配列番号： 23) を基に設計したプライマーと、 アダプタープライマーと を用いた 5' —および 3' —RACE反応により得ることができる。
配列番号： 5で表される塩基配列を有する、 マウス SST22-22 (Long form) 蛋白質の完全長をコードする DNA (mSst 22-22 (Long form)) 、 および配列 番号： 7で表される塩基配列を有する、 マウス SST22-22(Short form)蛋白質 の完全長をコードする DNA (mSst 22-22 (Short form)) は、 例えば、 高脂 肪食負荷されたマウス白色脂肪組織由来の cDNAライブラリ一から、 上記 SST法を用いて得られ、 大腸菌 Escherichia coli Topl0/pENTR/D-T0PO (22-22)株にクローニングされた核酸 （mSst 22-22 (partial)) の塩基配列 (配列番号： 24) を基に設計したプライマ一と、 アダプタープライマーと を用いた 5' —および 3' —RACE反応により得ることができる。
配列番号： 9で表される塩基配列を有する、 マウス SST8-5蛋白質の完全 長をコードする DNA (mSst8-5) は、 例えば、 高脂肪食負荷されたマウス 白色脂肪組織由来の cDNAライブラリーから、 上記 SST法を用いて得ら れ、 大腸菌 Escherichia coli ToplO/pENTR/D-TOPO (8- 5)株にクローニング された核酸 (mSst8-5 (partial)) の塩基配列 (配列番号 : 25) を基に設計 したプライマーと、 アダプタープライマーとを用いた 5' —および 3' — R AC E反応により得ることができる。
配列番号： 1 1で表される塩基配列を有する、 マウス SST19-15 (Long form)蛋白質の完全長をコードする DNA (mSstl9-15(Long form)) 、 およ び配列番号： 13で表される塩基配列を有する、 マウス SST19-15(Short form)蛋白質の完全長をコードする DNA (mSst 19-15 (Short form)) は、 例 えば、 高脂肪食負荷されたマウス白色脂肪組織由来の cDNAライブラリ一 から、 上記 S ST法を用いて得られ、 大腸菌 Escherichia coli
ToplO/pENTR/D-TOPO (19-15)株にクローニングされた核酸 (mSstl9- 15(partial)) の塩基配列 （配列番号： 26) を基に設計したプライマーと. アダプタープライマーとを用いた 5 ' —および 3 ' —RACE反応により得 ることができる。
配列番号： 1 5で表される塩基配列を有する、 マウス SST13-11蛋白質の 完全長をコードする DNA (mSstl3-ll) は、 例えば、 高脂肪食負荷された マウス白色脂肪組織由来の cDNAライブラリ一から、 上記 S ST法を用い て得られ、 大腸菌 Escherichia coli ToplO/pENTR/D-TOPO (13- 11)株にクロ —ニングされた核酸 （mSstl3-ll (partial)) の塩基配列 （配列番号： 27) を基に設計したプライマーと、 アダプタープライマ一とを用いた 5' —およ び 3' —RACE反応により得ることができる。
配列番号： 1 7で表される塩基配列を有する、 マウス SST9-8蛋白質の完 全長をコードする DNA (mSst9-8) は、 例えば、 高脂肪食負荷されたマウ ス白色脂肪組織由来の cDNAライブラリーから、 上記 S ST法を用いて得 られ、 大腸菌 Escherichia coli To lO/pENTR/D-TOPO (9 - 8)株にクローニン グされた核酸 0nSst9-8(partial)) の塩基配列 （配列番号： 28) を基に設 計したプライマーと、 アダプタープライマーとを用いた 5 ' —および 3， - RACE反応により得ることができる。
配列番号： 1 9で表される塩基配列を有する、 マウス SST21- 3蛋白質の完 全長をコードする DNA (mSst21-3) は、 例えば、 高脂肪食負荷されたマウ ス白色脂肪組織由来の c DNAライブラリーから、 上記 S ST法を用いて得 られ、 大腸菌 Escherichia coli ToplO/pENTR/D-TOPO (2卜 3)株にクローニン グされた核酸 (mSst21-3(partial)) の塩基配列 (配列番号： 29) を基に 設計したプライマーと、 アダプタープライマーとを用いた 5 ' —および 3 ' —RACE反応により得ることができる。
配列番号： 21で表される塩基配列を有する、 マウス SST20-6蛋白質の完 全長をコードする DN A (mSst20-6) は、 例えば、 高脂肪食負荷されたマウ ス白色脂肪組織由来の cDNAライブラリーから、 上記 S ST法を用いて得 られ、 大腸菌 Escherichia coli ToplO/pENTR/D-TOPO (20-6)株にクローニン グされた核酸 （mSst20- 6(partial)) の塩基配列 （配列番号： 30) を基に 設計したプライマ一と、 アダプタープライマーとを用いた 5 ' —および 3 ' —RACE反応により得ることができる。
上記の Escherichia coli ToplO/pENTR/D-TOPO (20- 14)株、 Escherichia coli ToplO/pENTR/D-TOPO (22-22)株、 Escherichia coli To lO/pENTR/D- T0P0 (8 - 5)株、 Escherichia coli ToplO/pENTR/D-TOPO (19-15)株、
Escherichia coli To lO/pENTR/D-TOPO (13- 11)株、 Escherichia coli ToplO/pENTR/D-TOPO (9-8)株、 Escherichia coli To lO/pENTR/D-TOPO (21- 3)株および Escherichia coli ToplO/pENTR/D-TOPO (20- 6)株は、 それぞれ FERM BP - 8104、 FERM BP-8109、 FERM BP- 8110、 FERM BP-8108, FERM BP-8107, FERM BP- 8105、 FERM BP- 8102および FERM BP- 8106の受託番号を付され、 平 成 14 (2002) 年 7月 14日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （〒305- 8566 茨城県つくば巿東 1一 1一 1 中央第 6) に寄託されている。 本発明の部分ペプチドをコードする DNAは、 上記各配列番号 （配列番 号： 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20または 22) で 表されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 有するペプチドをコードする塩基配列を含むものであればいかなるものであ つてもよい。 具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする DNAとして は、 例えば、 （1) 上記各配列番号で表される塩基配列の部分塩基配列また は （2) 上記各配列番号で表される塩基配列を有する DNAとハイストリン ジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 前記した本発明の 蛋白質と実質的に同質の活性 （例： レセプ夕一 （もしくはリガンド） 結合活 性、 シグナル伝達作用など） を有するペプチドをコードする DN Aなどが用 いられる。
上記各配列番号で表される塩基配列を有する D N Aとハイストリンジェン トな条件下でハイブリダィズできる DN Aとしては、 例えば、 該塩基配列と 約 60%以上、 好ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 80 %以上、 最 も好ましくは約 90%以上の同一性を有する塩基配列を含有する DNAなど が挙げられる。 ハイストリンジェントな条件としては上記と同様の条件が挙 げられる。
クローン化された本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする D NAの塩基配列は、 公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (宝 酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 ODA-LA PCR法、
Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方 法に従つて変換することができる。
クローン化された DN Aは、 目的によりそのまま、 または所望により制限 酵素で消化するか、 リンカ一を付加した後に、 使用することができる。 該 D N Aはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、 また 3' 末 端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TG Aまたは TAGを有していて もよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAァ ダブターを用いて付加することができる。
上記した本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする DNAを含 む発現ベクターで宿主を形質転換し、 得られる形質転換体を培養することに よって、 本発明の蛋白質 （ペプチド） を製造することができる。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする DNAを含む発現べ クタ一は、 例えば、 該蛋白質をコードする DNAから目的とする DNA断片 を切り出し、 該 DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に 連結することにより製造することができる。
発現べクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322， p BR 325, pUC 12, pUC 13) ；枯草菌由来のプラスミド （例、 p UB 1 10, pTP 5, p C 194) ；酵母由来プラスミド （例、 p SH 1 9， p SH 15) ；昆虫細胞発現プラスミド （例： p F a s t— B a c) ； 動物細胞発現プラスミド （例： PAI— 1 1、 pXTl、 pRcZCMV、 pRc/RSV, pcDNA I/Ne o) ； λファージなどのバクテリオフ ァ一ジ；バキュロウィルスなどの昆虫ウィルスベクタ一 （例： BmNPV、 AcNPV) ； レトロウイルス、 ワクシニアウィルス、 アデノウイルスなど の動物ウィルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロ モーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 宿主が動物細胞である場合、 SRひプロモータ一、 SV40プロ モータ一、 LTRプロモーター、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモー 夕一、 、 RSV (ラウス肉腫ウィルス） プロモー夕一、 MoMuLV (モロ 二一マウス白血病ウィルス） LTR、 HS V-TK (単純へルぺスウィルス チミジンキナーゼ） プロモー夕一などが用いられる。 なかでも、 CMVプロ モーター、 S R αプロモータ一などが好ましい。
宿主がェシエリヒア属菌である場合、 t r pプロモ一夕一、 1 a cプロモ —ター、 r e cAプロモータ一、 え PLプロモーター、 l p pプロモー夕一、 T 7プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、 SPOlプロモーター、 SP02プロモ 一ター、 p e n Pプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、 PH〇 5プロモーター、 PGKプロモーター、 G A Pプロモーター、 AD Hプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモー ターなどが好ましい。
発現ベクターとしては、 上記の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライ シングシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製起点 (以下、 SV40 o r iと略称する場合がある) などを含有しているもの を用いることができる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元 酵素遺伝子 （以下、 d h f rと略称する場合がある、 メソトレキセ一ト （M TX) 耐性） 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 amp rと略称する場合が ある） 、 ネオマイシン耐性遺伝子 （以下、 n e o1"と略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハ ムスター細胞を用い、 dh f r遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、 チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することもできる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列 (シグナルコドン） を、 本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードす る DNAの 5' 末端側に付加 （またはネイティブなシグナルコドンと置換） してもよい。 例えば、 宿主がェシエリヒア属菌である場合、 PhoA *シグ ナル配列、 Omp A ·シグナル配列などが：宿主がバチルス属菌である場合、 α—アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン · シグナル配列などが；宿主 が酵母である場合、 MFひ ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など が；宿主が動物細胞である場合、 インスリン ·シグナル配列、 ひーィン夕ー フエロン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ用いられ る。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細 胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌としては、 例えば、 ェシエリヒア -コリ （Escherichia coli) K 12 · DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデ ミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 60巻， 160 (1968)〕 ， ェシエリヒア · コリ JM103 〔ヌクレイック 'ァシッズ' リサーチ （Nucleic Acids Research) , 9巻， 309 (1981)) , ェシエリヒア 'コリ J Α221 〔ジャーナル ·ォブ · モレキュラー ·バイオロジー （Journal of Molecular Biology) , 120巻， 517 (1978)〕 ， ェシエリヒア 'コリ ΗΒ 101 〔ジャーナル ·ォブ · モレキュラー 'バイオロジー， 41巻， 459 (1969)〕 ， ェシエリヒ ァ .コリ C 600 〔ジェネティックス （Genetics) , 39巻， 440 (19 54)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス 'サブチルス （Bacillus subtil is) M I 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1983)〕 ， バチルス · サブチルス 207— 21 〔ジャーナル 'ォブ ·バイオケミストリー
(Journal of Biochemistry) , 95卷， 87 (1984)〕 などが用いられ る。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス 'セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R—， NA 87 - 1 1 A, DKD- 5 D, 20 B- 12 シゾサッカロマイセス ·ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) NCYC 1913, NCYC2036、 ピキア 'パストリス
(Pichia pastoris) KM 71などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia ni の中腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia ni の卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brass icae由来の細胞、 Estigmena acrea由来の細胞などが用いら れる。 ウィルスが BmNPVの場合、 昆虫細胞としては、 蚕由来株化細胞
(Bombyx mori N細胞； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞として は、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn,' J.L.ら、 イン *ヴイボ （In Vivo) ，13， 213-217, (1977)) などが用いられる。 昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチ ヤー （Nature) ， 315巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル COS— 7細胞、 サル Ve r o細胞、 チ ャィニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） 、 dh f r遺 伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (d h f r-) 細胞と略記） 、 マウス L細胞， マウス A t T— 20細胞、 マウスミエ口一マ 細胞， ラット GH3細胞、 ヒト FL細胞などが用いられる。
形質転換は、 宿主の種類に応じ、 公知の方法に従って実施することができ る。
ェシエリヒア属菌は、 例えば、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナ ル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 69巻， 2 1 10 ( 1 972) やジーン （Gene) ; 1 7巻， 107 ( 1 982) などに記載の方法に従って形質転換することが できる。
バチルス属菌は、 例えば、 モレキュラー ·アンド ·ジェネラル ·ジエネテ イツクス （Molecular & General Genetics) , 168卷， 1 1 1 (197 9) などに記載の方法に従つて形質転換することができる。
酵母は、 例えば、 メソッズ ·イン ·ェンザィモロジ一 （Methods in
Enzymology) , 194巻， 182 - 187 ( 1 99 1 ) 、 プロシ一ジング ズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ · ザ.ユーエスェ一 （Pro Natl. Acad. Sci. USA) , 75卷， 1929 (1 978) などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、 例えば、 バイオ テクノロジ一
(Bio/Technology) , 6巻， 47— 55 (1 988) などに記載の方法に従 つて形質転換することができる。
動物細胞は、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロトコール， 2 63 - 267 (1995) (秀潤社発行） 、 ヴイロロジー （Virology) , 5 2巻， 456 ( 1973) に記載の方法に従って形質転換することができる, 形質転換体の培養は、 宿主の種類に応じ、 公知の方法に従って実施するこ とができる。
例えば、 宿主がェシエリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を 培養する場合、 培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。 また、 培地は、 形質転換体の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物などを含有する ことが好ましい。 ここで、 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキスト リン、 可溶性澱粉、 ショ糖などが；窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム 塩類、 硝酸塩類、 コ一ンスチープ' リカ一、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシウムなど がそれぞれ挙げられる。 また、 培地には、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促 進因子などを添加してもよい。 培地の pHは、 好ましくは約 5〜約 8である。 宿主がェシエリヒア属菌ャある形質転換体を培養する場合の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミノ酸を含む M 9培地 〔ミラ一 （Miller) ， ジャ —ナル ·ォブ ·ェクスペリメンッ 'イン 'モレキュラー ·ジエネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics) , 43 1— 433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 が好ましい。 必要に より、 プロモーターを効率よく働かせるために、 例えば、 3 一インドリル アクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がェシエリヒア属菌である形質転換体の培養は、 通常約 1 5〜約 4 3°Cで、 約 3〜約 24時間行なわれる。 必要により、 通気や撹拌を行っても よい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、 通常約 30〜約 40°Cで、 約 6〜約 24時間行なわれる。 必要により、 通気や撹拌を行ってもよい。 宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、 例えば、 ノ' 一クホ一ルダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian， K.L.ら， プロシージン グズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ · ザ 'ュ一エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 77巻， 4505 (1 980) 〕 や 0.5%カザミノ酸を含有する SD培地 CBitter, G.A.ら， プ ロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィ ズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 8 1巻， 5 330 (1 984) 〕 などが挙げられる。 培地の pHは、 好ましくは約 5〜 約 8である。 培養は、 通常約 20で〜約 35でで、 約 24〜約 72時間行な われる。 必要に応じて、 通気や撹拌を行ってもよい。 宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地として は、 例えば Grace's Insect Medium [Grace, T. ， ネイチヤー (Nature) ， 195巻， 788 (1962) ) に非働化した 10%ゥシ血清等の添加物を 適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは、 好ましくは約 6. 2〜約 6. 4である。 培養は、 通常約 27 で、 約 3〜約 5日間行なわれる。 必要 に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、 例えば、 約 5〜約 20 %の胎児ゥシ血清を含む最小必須培地 （MEM) 〔サイエンス (Science) , 122巻， 501 (1952) 〕 ， ダルベッコ改変イーグル 培地 （DMEM) 〔ヴイロロジー （Virology) ， 8巻， 396 (195
9) 〕 , RPM I 1640培地 〔ジャーナル 'ォブ ·ザ ·アメリカン ·メ ティカル 'アソシエーション (The Journal oi the American Medical Association) , 199巻， 519 (1967) 〕 ， 199培地 〔プロシー ジング ·ォブ ·ザ ·ソサイエティ ·フォー ·ザ ·バイオロジカル ·メディス ン (Proceeding of the Society for the Biological Medicine) , 73巻, 1 ( 1950) 〕 などが用いられる。 培地の pHは、 好ましくは約 6〜約 8 である。 培養は、 通常約 30 〜約 40でで、 約 15〜約 60時間行なわれ る。 必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内または細胞外に本発明の蛋白質 (ペプチド） を製造せしめることができる。
前記形質転換体を培養して得られる培養物から本発明の蛋白質 （ぺプチ ド） を自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、 本発明の蛋白質 （ペプチド） を培養菌体あるいは細胞の細胞質か ら抽出する場合、 培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な 緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって 菌体あるいは細胞を破壊した後、 遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽 出液を得る方法などが適宜用いられる。 該緩衝液は、 尿素や塩酸グァニジン などの蛋白質変性剤や、 トリトン X— 100TMなどの界面活性剤を含んでい てもよい。 一方、 膜画分から本発明の蛋白質 （ペプチド） を抽出する場合は、 上記と同様に菌体あるいは細胞を破壊した後、 低速遠心で細胞デブリスを沈 澱除去し、 上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させる （必要に応じて 密度勾配遠心などにより細胞膜画分を精製する） などの方法が用いられる。 また、 本発明の蛋白質 （ペプチド） が菌体 （細胞） 外に分泌される場合には、 培養物から遠心分離またはろ過等により培養上清を分取するなどの方法が用 いられる。
このようにして得られた可溶性画分、 膜画分あるいは培養上清中に含まれ る本発明の蛋白質 （ペプチド） の単離精製は、 自体公知の方法に従って行う ことができる。 このような方法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を 利用する方法；透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S —ポリアク リルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；ィォ ン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；ァフィ二ティー クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロ マトグラフィ一などの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの 等電点の差を利用する方法；などが用いられる。 これらの方法は、 適宜組み 合わせることもできる。
かくして得られる蛋白質 （ペプチド） が遊離体である場合には、 自体公知 の方法あるいはそれに準じる方法によって、 該遊離体を塩に変換することが でき、 蛋白質またはペプチドが塩として得られた場合には、 自体公知の方法 あるいはそれに準じる方法により、 該塩を遊離体または他の塩に変換するこ とができる。
なお、 形質転換体が産生する本発明の蛋白質 （ペプチド） を、 精製前また は精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加え たり、 ポリペプチドを部分的に除去することもできる。 該蛋白修飾酵素とし ては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダー ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして得られる本発明の蛋白質 （ペプチド） の存在は、 それに対する特 異抗体を用いたェンザィムィムノアツセィゃウエスタンプロッティングなど により確認することができる。 さらに、 本発明の蛋白質 （ペプチド） は、 上記の本発明の蛋白質またはそ の部分ペプチドをコードする D N Aに対応する R N Aを铸型として、 ゥサギ 網状赤血球ライセート、 コムギ胚芽ライセート、 大腸菌ライセートなどから なる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ合成することができる。 あるい は、 さらに R NAポリメラ一ゼを含む無細胞転写 Z翻訳系を用いて、 本発明 の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする D N Aを铸型としても合成す ることができる。
「本発明の蛋白質 （即ち、 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 2 0または 2 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質） をコードする塩基配列またはその 一部」 、 あるいは 「該塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部」 を含有 する核酸とは、 前述の本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする 核酸だけではなく、 フレームの合わない塩基配列をも含む意味で用いられる ( 目的核酸の標的領域と相補的な塩基配列を含む核酸、 即ち、 目的核酸とハ イブリダィズすることができる核酸は、 該目的核酸に対して 「アンチセン ス」 であるということができる。 一方、 目的核酸の標的領域と相同性を有す る塩基配列を含む核酸は、 該目的核酸に対して 「センス」 であるということ ができる。 ここで 「相同性を有する」 または 「相補的である」 とは、 塩基配 列間で約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以 上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の同一性または相補性を有することをいう < 本発明の蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部 を含有する核酸 （以下、 「本発明のアンチセンス核酸」 ともいう） は、 クロ ーン化した、 あるいは決定された本発明の蛋白質をコードする核酸の塩基配 列情報に基づき設計し、 合成しうる。 そうした核酸は、 本発明の蛋白質をコ —ドする遺伝子の複製または発現を阻害することができる。 即ち、 本発明の アンチセンス核酸は、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子から転写される R NAとハイブリダィズすることができ、 mR NAの合成 （プロセッシング） または機能 （蛋白質への翻訳） を阻害することができる。
本発明のアンチセンス核酸の標的領域は、 ァンチセンス核酸がハイブリダ ィズすることにより、 結果として本発明の蛋白質の翻訳が阻害されるもので あればその長さに特に制限はなく、 該蛋白質をコードする m R N Aの全配列 であっても部分配列であってもよく、 短いもので約 1 5塩基程度、 長いもの で m R N Aまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。 合成の容易さや抗原 性の問題を考慮すれば、 約 1 5〜約 3 0塩基からなるオリゴヌクレオチドが 好ましいがそれに限定されない。 具体的には、 例えば、 本発明の蛋白質をコ ードする核酸の 5 ' 端ヘアピンループ、 5 ' 端 6—ベースペア ' リピート、 5 ' 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン、 蛋白質コード領域、 O R F翻訳開始コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 ' 端パリンドローム領域、 および 3 ' 端ヘアピンループが標的領域として選択しうるが、 本発明の蛋白質をコ —ドする遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。 例えば、 該遺伝 子のイントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
さらに、 本発明のアンチセンス核酸は、 本発明の蛋白質をコードする mR N Aもしくは初期転写産物とハイブリダィズして蛋白質への翻訳を阻害する だけでなく、 二本鎖 D N Aである本発明の蛋白質をコードする遺伝子と結合 して三重鎖 （トリプレックス） を形成し、 R NAの転写を阻害し得るもので あってもよい。
アンチセンス核酸は、 2—デォキシ _ D—リポースを含有しているデォキ シリポヌクレオチド、 D—リポースを含有しているリボヌクレオチド、 プリ ンまたはピリミジン塩基の N—グリコシドであるその他のタイプのヌクレオ チド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー （例えば、 巿 販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー） または特殊な結合を 含有するその他のポリマ一 （但し、 該ポリマーは D NAや R NA中に見出さ れるような塩基のペアリングゃ塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチ ドを含有する） などが挙げられる。 それらは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D N A, 2本鎖 R NA、 1本鎖 R NA、 さらに D NA： R NAハイブリッドであるこ とができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド （または非修飾オリゴヌクレオチ ド） 、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標 識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以上の天 然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾のされ たもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエス テル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する 結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォェ一ト、 ホスホロジチォェ —トなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレア一ゼ、 ヌクレア一ゼ ·イン ヒビ夕一、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ— L—リジンなど） や 糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 イン 夕一カレント化合物 （例えば、 ァクリジン、 プソラレンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金 属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を 持つもの （例えば、 αァノマー型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌ クレオシド」 、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミ ジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつよ うなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリンおよ びピリミジン、 ァシル化されたプリンおよびピリミジン、 あるいはその他の 複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチドおよび修飾された ヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1個以上の水酸 基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。
アンチセンス核酸は、 R N A、 D N A、 あるいは修飾された核酸 （R N A、 D N A) である。 修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体ゃチォ ホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミドゃオリゴヌクレオシド アミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定されるものではな レ^ 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 アンチセ ンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性を より大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性 をより小さなものにする。 こうした修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J . Kawakami e t al . , Pharm Tech Japan, Vo l . 8, pp. 247, 1992 ; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed.， Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
アンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を 含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与 されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられるこ とができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格 の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜と の相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピド、 コレステロールなど） といった粗水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたも のは、 核酸の 3' 端あるいは 5' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分 子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。 その他の基とし ては、 核酸の 3' 端あるいは 5' 端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 RNa s eなどのヌクレア一ゼによる分解を阻止する ためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレン ダリコール、 テトラエチレングリコールなどのダリコールをはじめとした当 該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 それに限定されるもので はない。
本発明の蛋白質をコードする mRNAもしくは初期転写産物を、 コード領 域の内部 （初期転写産物の場合はイントロン部分を含む） で特異的に切断し 得るリボザィムもまた、 本発明のアンチセンス核酸に包含され得る。 「リボ ザィム」 とは核酸を切断する酵素活性を有する RNAをいうが、 最近では当 該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴ DN Aも同様に核酸切断活性を有 することが明らかになっているので、 本明細書では配列特異的な核酸切断活 性を有する限り DN Aをも包含する概念として用いるものとする。 リポザィ ムとして最も汎用性の高いものとしては、 ウイロイドゃウィルソィド等の感 染性 RNAに見られるセルフスプライシング RNAがあり、 ハンマーへッド 型やヘアピン型等が知られている。 ハンマーへッド型は約 40塩基程度で酵 素活性を発揮し、 ハンマーへッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ず つ （合わせて約 10塩基程度） を mRNAの所望の切断部位と相補的な配列 にすることにより、 標的 mRNAのみを特異的に切断することが可能である, このタイプのリボザィムは、 RNAのみを基質とするので、 ゲノム DNAを 攻撃することがないというさらなる利点を有する。 SS169 mRNAが自身で 二本鎖構造をとる場合には、 RN Aヘリカーゼと特異的に結合し得るウィル ス核酸由来の RN Aモチーフを連結したハイプリッドリポザィムを用いるこ とにより、 標的配列を一本鎖にすることができる [Pro atl. Acad. Sci. USA, 98(10)： 5572-5577 (2001)] 。 さらに、 リボザィムを、 それをコード する DNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、 転写産物の細胞 質への移行を促進するために、 t RNAを改変した配列をさらに連結したハ イブリツドリポザィムとすることもできる [Nucleic Acids Res., 29(13)： 2780-2788 (2001)] 。
本発明の蛋白質をコードする mRNAもしくは初期転写産物のコード領域 内の部分配列 （初期転写産物の場合はイントロン部分を含む） に相補的な二 本鎖オリゴ RNA (s i RNA) もまた、 本発明のアンチセンス核酸に包含 され得る。 短い二本鎖 RN Aを細胞内に導入するとその RNAに相補的な m RNAが分解される、 いわゆる RNA干渉 （RNA i) と呼ばれる現象は、 以前から線虫、 昆虫、 植物等で知られていたが、 最近、 この現象が哺乳動物 細胞でも起こることが確認されたことから [Nature, 411 (6836)： 494-498 (2001)] 、 リボザィムの代替技術として注目されている。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザィムは、 本発明の蛋 白質をコードする c DN A配列もしくはゲノム DN A配列情報に基づいて m RNAもしくは初期転写産物の標的領域を決定し、 市販の DNAZRNA自 動合成機 （アプライド ·バイオシステムズ社、 ベックマン社等） を用いて、 これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。 RNA i 活性を有する s i RNAは、 センス鎖及びアンチセンス鎖を DNAZRNA 自動合成機でそれぞれ合成し、 適当なアニーリング緩衝液中で、 例えば、 約 90〜約 95 で約 1分程度変性させた後、 約 30〜約 70でで約 1〜約 8 時間アニーリングさせることにより調製することができる。 また、 相補的な オリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、 これら をァニーりングさせた後リガーゼでライゲ一ションすることにより、 より長 い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。
本発明のアンチセンス核酸の遺伝子発現阻害活性は、 本発明の蛋白質をコ 一ドする核酸を含有する形質転換体、 生体内や生体外の本発明の蛋白質をコ ードする遺伝子発現系または本発明の蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用 いて調べることができる。 該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用で さる。
本発明はまた、 本発明の蛋白質 （ペプチド） に対する抗体を提供する。 該 抗体は、 本発明の蛋白質 （ペプチド） に対して特異的親和性を有するもので あれば、 モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。 本発明の蛋白質 （ペプチド） に対する抗体は、 該蛋白質 （ペプチド） を抗原 として用い、 自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することが できる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明の蛋白質 （ペプチド） は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が 可能な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際 して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイ ントアジュバントを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行なわれる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ^サギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された哺乳動 物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜5 日後に脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄 腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを 調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化 SS169類と抗血清とを反応させた後、 抗体に結合した標識剤の活性を測定す ることにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケ一ラ —とミルスタインの方法 〔ネイチヤー （Nature 256巻、 '495頁 （1 975年） 〕 に従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 3? 2 0などが挙 げられるが、 P 3U 1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾 臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは、 PEG1000〜PEG6000) が 10〜 80%程 度の濃度で添加され、 約20〜40で、 好ましくは約 30〜37 で約 1〜 10分間ィンキュペートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノクローナル抗体産生ハイプリド一マのスクリーニングには種々の方法 が使用できるが、 例えば、 蛋白質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着 させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用 いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロプリン抗体が用いられる） またはプロティン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する 方法、 抗免疫グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイブ リドーマ培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識した蛋白質等を加 え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。 モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従つ て行なうことができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地などで行なうことが Ί?きる。 選別およ び育種用培地としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような 培地を用いても良い。 例えば、 1〜20%、 好ましくは 10〜20%の牛胎 児血清を含む RPMI 1640培地、 1〜10%の牛胎児血清を含む G I Τ培地 （和光純薬工業 （株） ) またはハイプリドーマ培養用無血清培地 （S FM— 101、 日水製薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 、 好ましくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3 週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行 なうことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の 抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクロ一ナル抗体の分離精製 と同様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等 電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相またはプロテイン Aあるいはプロティ ン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得 る特異的精製法〕 に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法 にしたがって製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （蛋白質等の抗原） とキャリア一蛋白質との複合体を作り、 上記のモノクローナル抗体の製造法 と同様に哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明の蛋白質 （ぺプチ ド） に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製 造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複 合体に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合 比は、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くで きれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ 血清アルブミン、 ゥシサイログロブリン、 キーホール ' リンペット 'へモシ ァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . ：！〜 2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリア一の力プリングには、 種々の縮合剤を用いるこ とができるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エス テル、 チオール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用い られる。 縮合生成物は、 哺乳動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体ある いは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるた め、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与し てもよい。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 10回程度行な うことができる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水な ど、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定 と同様にして測定できる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノク ローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行な うことができる。
前記の方法によりクローニングされ、 配列決定された本発明の蛋白質をコ —ドする cDN Aに対応する遺伝子の発現局在性 （例：白色脂肪組織、 褐色 脂肪組織、 肝臓、 骨格筋など） や所定のストレス （例：高脂肪食負荷、 絶食、 絶食後再給餌、 インスリン抵抗性惹起因子刺激など） 条件下における発現変 動は、 クロ一ニングされた cDNAをそのまま、 もしくは決定された塩基配 列に基づいて該 c DNAの一部を合成したものをプローブとして、 種々の組 織由来の RNAについて、 あるいはストレス条件下および非ストレス条件下 における所定の組織由来の RN Aについてノーザンブロット分析を行うか、 合成ォリゴヌクレオチドをプライマーとして定量的 R T -PCRを実施する ことにより同定することができる。
本発明の蛋白質をコードする遺伝子は、 いずれも高脂肪食負荷された白色 脂肪組織で高発現している。 このうち Sst20-14遺伝子は白色脂肪組織特異 的な発現を示すが、 Sstl9- 15、 Sstl3-ll、 Sst9-8および Sst2卜 3遺伝子は褐 色脂肪組織でも発現している。 Sst21-3遺伝子は未分化な前駆脂肪細胞でも 発現している。
Sst20-14遺伝子は絶食時に発現が低下し、 絶食後再給餌により発現が上昇 (回復） する。 さらに、 該遺伝子は TNF—ひなどのインスリン抵抗性惹起 因子の刺激に応答して発現が低下する。 また、 該遺伝子の過剰発現により、 前駆脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化が抑制される。
Sst8-5遺伝子はィンスリン抵抗性改善薬の刺激に応答して発現が上昇する。 Sstl3- 11遺伝子は絶食時に発現が低下し、 絶食後再給餌により発現が上昇 (回復） する。 また、 該遺伝子は高脂肪一高スクロース負荷に応答して発現 が上昇する。 さらに、 該遺伝子は肥満モデルにおいて高発現している。
Sst21- 3遺伝子は絶食時に発現が低下し、 絶食後再給餌により発現が上昇 (回復） する。 また、 該遺伝子は糖尿病モデルにおいて高発現している。 Sstl9-15遺伝子もまた絶食時に発現が低下し、 絶食後再給餌により発現が 上昇 （回復） する。
上記の通り、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子は、 食事やインスリン抵 抗性調節薬の刺激に応答して、 あるいは肥満や糖尿病の病態において発現が 変動し、 また、 その発現の変動により脂肪細胞の分化に影響を及ぼす。
したがって、 本発明の蛋白質 （ペプチド） 、 該蛋白質 （ペプチド） をコー ドする核酸 （アンチセンス核酸を含む） 、 および該蛋白質 （ペプチド） に対 する抗体は、 （1) 本発明の蛋白質に対して特異的親和性を有する化合物 (本発明の蛋白質が膜蛋白質の場合はそれに対するリガンド、 分泌蛋白質の 場合はそれに対するレセプ夕一） の決定、 （2) 本発明の蛋白質の機能不全 に関連する疾患の予防 ·治療剤、 （ 3 ) 本発明の蛋白質の過剰発現に関連す る疾患の予防 ·治療剤、 （4) 遺伝子診断剤、 （5) 本発明の蛋白質の発現 量を変化させる化合物のスクリーニング方法、 （6) 本発明の蛋白質の発現 量を変化させる化合物を含有する各種疾患の予防 ·治療剤、 （ 7 ) 本発明の 蛋白質に対して特異的親和性を有する化合物の定量法、 （8) 本発明の蛋白 質とそれに対して特異的親和性を有する化合物との結合性を変化させる化合 物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニストなど） のスクリーニング方法、 （9) 本発 明の蛋白質とそれに対して特異的親和性を有する化合物との結合性を変化さ せる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニスト） を含有する各種疾患の予防 ·治 療剤、 （10) 本発明の蛋白質 （ペプチド） の定量、 （1 1) 細胞膜または 細胞外液における本発明の蛋白質の量を変化させる化合物のスクリーニング 方法、 （12) 細胞膜または細胞外液における本発明の蛋白質の量を変化さ せる化合物を含有する各種疾患の予防 ·治療剤、 （13) 本発明の蛋白質
(ペプチド） をコードする DNAを有する非ヒトトランスジエニック動物の 作製、 （14) 本発明の蛋白質をコードする遺伝子が不活性化されたノック ァゥト非ヒト動物の作製などに用いることができる。
特に、 本発明の組換え蛋白質 （ペプチド） の発現系を用いたァフィ二ティ 一アツセィ系を使用することによって、 本発明の蛋白質とそのレセプター
(もしくはリガンド） の結合性を変化させる化合物 （例：ァゴニスト、 アン 夕ゴニストなど） をスクリーニングすることができ、 該ァゴ二ストまたはァ ンタゴ二ストを各種疾患の予防 ·治療剤などとして使用することができる。 本発明の蛋白質 （ペプチド） 、 該蛋白質 （ペプチド） をコードする DN A (以下、 「本発明の DNA」 と略記する場合がある） 、 本発明のアンチセン ス核酸および本発明の蛋白質 （ペプチド） に対する抗体 （以下、 「本発明の 抗体」 と略記する場合がある） の用途について、 以下に具体的に説明する。
(1) 本発明の蛋白質に対して特異的親和性を有する化合物の決定 本発明の蛋白質 （ペプチド） は、 本発明の蛋白質またはその塩に対して特 異的親和性を有する化合物 （レセプ夕ーもしくはリガンド） を探索し、 また は決定するための試薬として有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明の蛋白質 （ペプチド） と試験化合物とを接触 させることを特徴とする本発明の蛋白質またはその塩に対して特異的親和性 を有する化合物の決定方法を提供する。
試験化合物としては、 本発明の蛋白質が膜レセプターである場合、 公知の リガンド （例えば、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシ ス卜キニン、 グルタミン、 セロ卜ニン、 メラ卜ニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレ チン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チ ン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシト ニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチ ン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 ひ および ]3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L— 8、 GROひ、 GR 0/3、 GROァ、 NAP— 2、 ENA_ 7 8、 P F4、 I P 1 0、 GCP_ 2、 MCP— 1、 HC 1 4、 MCP— 3、 1 — 3 09、 M I P 1 α M I P — 1 β、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒス夕 ミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イドまた はガラニンなど） の他に、 例えば、 哺乳動物 （例えば、 ヒト、 マウス、 ラッ ト、 ブタ、 ゥシ、 ヒッジ、 サルなど） の組織抽出物、 細胞培養上清などが用 いられる。 例えば、 該組織抽出物、 細胞培養上清などを本発明のレセプター 蛋白質に添加し、 細胞刺激活性などを測定しながら分画し、 最終的に単一の リガンドを得ることができる。 一方、 本発明の蛋白質が分泌蛋白質である場 合、 試験化合物として、 例えば上記リガンドに対する公知のレセプ夕一の他 に、 上記と同様にヒトまたは哺乳動物の組織抽出物、 無傷細胞、 細胞膜画分、 細胞培養上清などが用いられる。 例えば、 該組織抽出物、 無傷細胞、 細胞膜 画分、 細胞培養上清などを本発明の分泌蛋白質に添加し、 細胞刺激活性など を測定しながら分画し、 最終的に単一のレセプ夕一等を得ることができる。 具体的には、 本発明の蛋白質またはその塩に対して特異的親和性を有する 化合物の決定方法は、 本発明の蛋白質 （ペプチド） を用いるか、 または組換 えによる該蛋白質 （ペプチド） の発現系を構築し、 該発現系を用いたァフィ 二ティ一アツセィ系を用いることによって、 本発明のレセプター蛋白質に結 合して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細 胞内 C a2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトール リン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o s活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活性） を有する化合物 （例え ば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物な ど） 、 または本発明の分泌蛋白質に結合して上記の細胞刺激活性を有する化 合物、 あるいはそれらの塩を決定する方法である。
本発明の蛋白質またはその塩に対して特異的親和性を有する化合物の決定 方法においては、 本発明の蛋白質 （ペプチド） と試験化合物とを接触させた 場合の、 例えば、 該蛋白質 （ペプチド） に対する試験化合物の結合量や、 細 胞刺激活性などを測定することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、
①標識した試験化合物を、 本発明の蛋白質 （ペプチド） に接触させた場合に おける、 標識した試験化合物の該蛋白質 （ペプチド） に対する結合量を測定 することを特徴とする、 本発明の蛋白質またはその塩に対して特異的親和性 を有する化合物の決定方法、
②標識した試験化合物を、 本発明の蛋白質を産生する細胞または細胞膜画分、 あるいは細胞外液または細胞培養上清 （この場合、 例えば、 上記の本発明の 抗体を固定化した固相 （細胞培養プレート等） を用いて分泌蛋白質を固相化 する） に接触させた場合における、 標識した試験化合物の該細胞、 該膜画分、 該細胞外液または該細胞培養上清に対する結合量を測定することを特徴とす る、 本発明の蛋白質またはその塩に対して特異的親和性を有する化合物の決 定方法、
③標識した試験化合物を、 本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコード する D N Aを含有する形質転換体を培養することによつて細胞膜上に発現し た、 または培養上清に分泌された本発明の蛋白質 （ペプチド） （この場合、 例えば、 上記の本発明の抗体を固定化した固相 （細胞培養プレート等） を用 いて分泌蛋白質 （ペプチド） を固相化する） に接触させた場合における、 標 識した試験化合物の該蛋白質またはその塩に対する結合量を測定することを 特徴とする、 本発明の蛋白質またはその塩に対して特異的親和性を有する化 合物の決定方法、
④試験化合物 （または試験化合物である膜蛋白質等を細胞膜上に含有する細 胞） を、 本発明の膜蛋白質を産生する細胞 （または本発明の分泌蛋白質を生 成する細胞の培養上清） に接触させた場合における、 本発明の膜蛋白質 （ま たは試験化合物である膜蛋白質等） を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキ ドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋 白質のリン酸化、 c 一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性また は抑制する活性など） を測定することを特徴とする本発明の膜蛋白質 （また は分泌蛋白質） またはその塩に対するリガンド （またはレセプ夕一） の決定 方法、 および
⑤試験化合物 （または試験化合物である膜蛋白質等を細胞膜上に含有する細 胞） を、 本発明の膜蛋白質をコードする D NAを含有する形質転換体を培養 することによつて細胞膜上に発現した該膜蛋白質 （または本発明の分泌蛋白 質をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによって培養上 清中に分泌された該分泌蛋白質） に接触させた場合における、 本発明の膜蛋 白質 （または試験化合物である膜蛋白質等） を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 C AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する 活性または抑制する活性など） を測定することを特徴とする本発明の膜蛋白 質 （または分泌蛋白質） またはその塩に対するリガンド （またはレセプ夕 一） の決定方法を提供する。
特に、 上記①〜③の試験を行ない、 試験化合物が本発明の蛋白質 （ぺプチ ド） に結合することを確認した後に、 上記④〜⑤の試験を行なうことが好ま しい。
まず、 リガンド （またはレセプター） 決定方法に用いる本発明の蛋白質 (ペプチド） としては、 上記した本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチド またはその塩であれば何れのものであってもよいが、 動物細胞を用いて大量 発現させた本発明の組換え蛋白質などが適している。
本発明の組換え蛋白質を製造するには、 前述の発現方法が用いられるが、 本発明の蛋白質をコードする D N Aを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現させる ことにより行なうことが好ましい。 目的とする蛋白質部分をコードする D N A断片には、 通常、 c D NAが用いられるが、 必ずしもこれに制約されるも のではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 D NAを用いてもよい。 本発明の蛋 白質をコードする D NA断片を宿主動物 （または昆虫） 細胞に導入し、 それ らを効率よく発現させるためには、 該 D NA断片を、 S V 4 0由来のプロモ 一夕一、 レトロウイルスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒトヒートショックプロモーター、 サイトメガロウィルスプロモー夕一、 S RO!プロモーター、 昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角体病 ウィルス （nuclear polyhedrosis virus； NP V) のポリヘドリンプロモー ターなどの下流に組み込むのが好ましい。 発現した蛋白質の量と質の検査は それ自体公知の方法で行なうことができる。 例えば、 文献 〔Nambi， P. ら、 ザ ·ジャーナル 'ォブ 'バイオロジカル ·ケミストリ一 （J. Biol. Chem.) ， 267巻， 19555〜 1 9559頁， 1 992年〕 に記載の方法に従つて 行なうことができる。
本発明のリガンド （またはレセプ夕一） 決定方法において、 本発明の蛋白 質 （ペプチド） は、 それ自体公知の方法に従って精製した本発明の蛋白質
(ペプチド） であってもよいし、 本発明の蛋白質 （ペプチド） を産生する細 胞またはその細胞膜画分、 あるいは本発明の蛋白質 （ペプチド） を分泌する 細胞の培養上清の形態で用いてもよい。
本発明のリガンド決定方法において、 本発明の蛋白質 （ペプチド） を産生 する細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固 定化してもよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことがで さる。
本発明の蛋白質 （ペプチド） を含有する細胞とは、 本発明の蛋白質 （ぺプ チド） を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。
前記細胞膜画分とは、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる 細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破碎方法としては、 Potter 一 Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮーリングブレンダ一 やポリトロン （Kinematica社製） による破砕、 超音波による破碎、 フレンチ プレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破碎 などが挙げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離 法などの遠心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液を 低速 （500 r pm〜3, 000 r pm) で短時間 （通常、 約 1〜 10分） 遠心し、 上清をさらに高速 （1 5, 0 0 0 r pm〜3 0， 0 0 0 r pm) で 通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現した本発明の蛋白質 （ペプチド） と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質など の膜成分が多く含まれる。
本発明の蛋白質 （ペプチド） を産生する細胞やその膜画分中の本発明の蛋 白質 （ペプチド） の量は、 1細胞当たり 1 03〜 1 08分子であるのが好まし く、 1 05〜 1 07分子であるのがより好適である。 なお、 発現量が多いほど 膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が高くなり、 高感度なスクリー ニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロッ卜で大量の試料を測定 できるようになる。
本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する上記の①〜③の 方法を実施するためには、 適当な本発明の蛋白質 （ペプチド） 含有膜画分と 標識した試験化合物が必要である。
本発明の蛋白質 （ペプチド） 含有膜画分としては、 天然型の本発明の蛋白 質含有膜画分か、 またはそれと同等の活性を有する組換え型の本発明の蛋白 質 （ペプチド） 含有膜画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等 のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す。
標識した試験化合物としては、 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 C35 S〕 などで標識したアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシ ス卜キニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレ チン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル アンド リイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニン ジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよ び β—ケモカイン (chemokine) (例えば、 I L— 8、 GR〇ひ、 GRO GR〇ァ、 NAP— 2、 ENA— 7 8、 PF 4、 I P 1 0、 GCP— 2、 M CP - 1、 HC 14、 MCP— 3、 I一 309、 M I P 1ひ、 M I P - 1 3. RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 二 ユーロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイドまたはガラニ ンなどが好適である。
具体的には、 本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法を 行なうには、 まず本発明の蛋白質 （ペプチド） を産生する細胞またはその膜 画分を、 決定方法に適したバッファ一に懸濁することにより本発明の蛋白質 (ペプチド） 標品を調製する。 バッファーには、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファー、 トリス—塩酸バッファ一などの本発明の 蛋白質とそのリガンドとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでも よい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Twe e n- 80™ (花王—アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界面活 性剤ゃゥシ血清アルブミンやゼラチンなどの各種蛋白質をバッファ一に加え ることもできる。 さらに、 プロテアーゼによるレセプ夕一やリガンドの分解 を抑える目的で PMSF、 ロイぺプチン、 E—64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテア一ゼ阻害剤を添加することもできる。 0.01 m 1〜 10m 1本発明の蛋白質 （ぺプチド） 懸濁液に、 一定量 （5000 c pm〜500000 c pm) の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識した試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知る ために大過剰の未標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。 反応 は約 0〜50で、 望ましくは約 4〜37 :で、 約 20分〜 24時間、 望まし くは約 30分〜 3時間行なう。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の 同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シン チレ一シヨンカウンタ一あるいはァーカウンタ一で計測する。 全結合量 (B) から非特異的結合量 （NSB) を引いたカウント （B— NSB) が 0 c pmを越える試験化合物を本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンド (ァゴ二スト） として選択することができる。
本発明の蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する上記の④〜⑤の 方法を実施するためには、 · 本発明の蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 '酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 C AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c 一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する 活性または抑制する活性など） を公知の方法または市販の測定用キットを用 いて測定することができる。 具体的には、 まず、 本発明の蛋白質，（ぺプチ ド） を産生する細胞をマルチウエルプレート等に培養する。 リガンド決定を 行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当 なバッファーに交換し、 試験化合物などを添加して一定時間インキュベート した後、 細胞を抽出あるいは上清を回収して、 生成した産物をそれぞれの方 法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 （例えば、 ァラキドン 酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、 該 分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよい。 また、 c A
M P産生抑制などの活性については、 フォルスコリンなどで細胞の基礎的産 生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することがで さる。
本発明の蛋白質に対して特異的親和性を有する化合物の決定方法について、 本発明の蛋白質が膜蛋白質の場合を取り上げて具体的に説明したが、 当業者 は、 上記の手法を応用して、 本発明の蛋白質が分泌蛋白質の場合についても 容易に特異的親和性を有する化合物の決定を実施することができるだろう。 本発明の蛋白質またはその塩に対して特異的親和性を有する化合物の決定 用キットは、 本発明の蛋白質 （ペプチド） 、 本発明の蛋白質を産生する細胞 またはその膜画分、 本発明の蛋白質を分泌する細胞の培養上清などを含有す るものである。
本発明のリガンド （レセプター） 決定用キットの例としては、 次のものが 挙げられる。
1 . リガンド （レセプ夕一） 決定用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Bal anced Sa l t So l ut i on (ギブコ社製） に、 0 . 0 5 %のゥシ血清 アルブミン （シグマ社製） を加えたもの。 孔径 0.45 mのフィルターで濾過滅菌し、 4 で保存するか、 あるい は用時調製しても良い。
②本発明の蛋白質 （ペプチド） 標品
本発明の蛋白質 （ペプチド） を発現させた CHO細胞を、 12穴プレート に 5 X 105個 Z穴で継代し、 37°C、 5%C〇2、 95% a i rで 2日間培 養したもの （本発明の蛋白質が分泌蛋白質の場合、 該プレートは該蛋白質に 対する抗体でコーティングされている） 。
③標識試験化合物
市販の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識した化合物、 または適当な方法で標識化したもの。
水溶液の状態のものを 4 あるいは— 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩 衝液にて 1 Mに希釈する。 水に難溶性を示す試験化合物については、 ジメ チルホルムアミド、 DMSO、 メタノール等に溶解する。
④非標識試験化合物
標識化合物と同じものを 100〜1, 000倍濃い濃度に調製する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明の蛋白質 （ペプチド） 発現 CHO細胞を、 測定用緩衝液 lmlで 2回洗浄した後 （本発明の蛋白質が分 泌される場合は、 細胞および培養上清を除去後プレートを測定用緩衝液で同 様に洗浄した後） 、 490 ^ 1の測定用緩衝液を各穴に加える。
②標識試験化合物を 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合 量を知るためには非標識試験化合物を 5 1加えておく。
③反応液を除去し、 lm 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞 （プレー ト） に結合した標識試験化合物を 0.2 N NaOH— 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ一夕一 A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレーシヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を 測定する。
本発明の膜蛋白質またはその塩に結合することができるリガンドとしては、 例えば、 脳、 下垂体、 塍臓などに特異的に存在する物質などが挙げられ、 具 体的には、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキ二 ン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 オビオイ ド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グ ルカゴン、 カルシトニン、 アドレノ，メジュリン、 ソマトスタチン、 GHRH. CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテステ イナル アンド リレイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ド一パ ミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーン リレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロス タグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよび /3_ ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L一 8、 GROo;、 GRO 3、 GR Ογ、 NAP— 2、 ΕΝΑ— 78、 PF4、 Ι Ρ 10、 GCP - 2、 MCP _ 1、 HC 14、 MCP— 3、 1— 309、 M I P 1ひ、 MI P— 1 /3、 R ANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガス卜リン、 ヒスタミン、 ニュ —口テンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイド、 ガラニンなど が用いられる。 また、 本発明の分泌蛋白質またはその塩に結合することがで きるレセプ夕一としては、 上記したリガンドに対するレセプ夕一や種々のォ 一ファンレセプターなどが用いられる。
(2) 本発明の蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防 ·治療剤
上記 （1) において、 本発明の蛋白質に対して特異的親和性を有する化合 物が明らかになれば、 該化合物が有する作用に応じて、 ①本発明の蛋白質 (ペプチド） または②該蛋白質 （ペプチド） をコードする DN Aを、 本発明 の蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防 ·治療剤などの医薬として使用す ることができる。
例えば、 生体内において本発明の蛋白質が減少しているためにリガンド (またはレセプター） の生理作用が期待できない （本発明の蛋白質の欠乏 症） 患者がいる場合に、 ①本発明の蛋白質 （ペプチド） を該患者に投与し本 発明の蛋白質の量を補充したり、 ② （ィ） 本発明の蛋白質 （ペプチド） をコ ードする DNAを該患者に投与し発現させることによって、 あるいは （口） 対象となる細胞に本発明の蛋白質 （ペプチド） をコードする DNAを導入し 発現させた後に、 該細胞を該患者に移植することなどによって、 患者の体内 における本発明の蛋白質の量を増加させ、 リガンド （またはレセプター） の 作用を充分に発揮させることができる。 即ち、 本発明の蛋白質 （ペプチド） またはそれをコードする D N Aは、 安全で低毒性な、 本発明の蛋白質の機能 不全に関連する疾患の予防 ·治療剤として有用である。
本発明の蛋白質は、 高脂肪食負荷ストレス時に白色脂肪細胞で高発現し、 さらに食事、 インスリン抵抗性調節薬による刺激、 肥満 ·糖尿病などの病態 に応じて発現が変動し、 その発現の変動が脂肪細胞の分化に影響することな どから、 本発明の蛋白質の機能不全に関連する疾患としては、 脂肪細胞の分 化および Zまたは代謝機能 （特に糖 ·脂質代謝） の異常 （不全もしくは亢 進） が関与する疾患 （例えば、 肥満症、 糖尿病、 耐糖能異常、 動脈硬化、 高 血圧、 高脂血症など） などが挙げられる。
①本発明の蛋白質 （ペプチド） および②該蛋白質 （ペプチド） をコードす る D N A (本明細書中、 「本発明の D NA」 と称する場合もある） は、 必要 に応じて薬理学的に許容し得る担体とともに混合して医薬組成物とした後に、 本発明の蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防 ·治療剤として用いること ができる。
ここで、 薬理学的に許容される担体としては、 製剤素材として慣用の各種 有機あるいは無機担体物質が用いられ、 固形製剤における陚形剤、 滑沢剤、 結合剤、 崩壊剤；液状製剤における溶剤、 溶解補助剤、 懸濁化剤、 等張化剤、 緩衝剤、 無痛化剤などとして配合される。 また必要に応じて、 防腐剤、 抗酸 化剤、 着色剤、 甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、 乳糖、 白糖、 D—マンニトール、 D—ソルビ トール、 デンプン、 ひ化デンプン、 デキストリン、 結晶セルロース、 低置換 度ヒドロキシプロピルセルロース、 カルポキシメチルセルロースナトリウム、 アラビアゴム、 デキストリン、 プルラン、 軽質無水ケィ酸、 合成ケィ酸アル ミニゥム、 メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げられる。
滑沢剤の好適な例としては、 ステアリン酸マグネシウム、 ステアリン酸力 ルシゥム、 タルク、 コロイドシリカなどが挙げられる。 結合剤の好適な例としては、 ひ化デンプン、 ショ糖、 ゼラチン、 アラビア ゴム、 メチルセルロース、 カルポキシメチルセルロース、 カルボキシメチル セルロースナトリウム、 結晶セルロース、 白糖、 D _マンニトール、 トレハ ロース、 デキストリン、 プルラン、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ヒドロ キシプロピルメチルセルロース、 ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。 崩壊剤の好適な例としては、 乳糖、 白糖、 デンプン、 カルポキシメチルセ ルロース、 カルポキシメチルセルロースカルシウム、 クロスカルメロースナ トリウム、 カルボキシメチルスターチナトリウム、 軽質無水ケィ酸、 低置換 度ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、 注射用水、 生理的食塩水、 リンゲル液、 アルコ ール、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 ゴマ油、 トウモロ コシ油、 ォリーブ油、 綿実油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、 ポリエチレングリコール、 プロピレング リコ一ル、 D—マンニトール、 トレハロース、 安息香酸ベンジル、 エタノー リレ、 トリスァミノメタン、 コレステロール、 トリエタノールァミン、 炭酸ナ トリウム、 クェン酸ナトリウム、 サリチル酸ナトリウム、 酢酸ナトリウムな どが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、 ステアリルトリエタノールァミン、 ラウリ ル硫酸ナトリウム、 ラウリルアミノプロピオン酸、 レシチン、 塩化べンザル コニゥム、 塩化べンゼトニゥム、 モノステアリン酸グリセリンなどの界面活 性剤；例えばポリビニルアルコール、 ポリビニルピロリドン、 カルボキシメ チルセルロースナトリウム、 メチルセルロース、 ヒドロキシメチルセルロー ス、 ヒドロキシェチルセルロース、 ヒドロキシプロピルセルロースなどの親 水性高分子；ポリソルべ一ト類、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙 げられる。
等張化剤の好適な例としては、 塩化ナトリウム、 グリセリン、 D—マンニ トール、 D—ソルビトール、 ブドウ糖などが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、 リン酸塩、 酢酸塩、 炭酸塩、 クェン酸塩など の緩衝液などが挙げられる。 無痛化剤の好適な例としては、 ベンジルアルコールなどが挙げられる。 防腐剤の好適な例としては、 パラォキシ安息香酸エステル類、 クロロブ夕 ノール、 ベンジルアルコール、 フエネチルアルコール、 デヒドロ酢酸、 ソル ビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、 亜硫酸塩、 ァスコルビン酸塩などが挙げら れる。
着色'剤の好適な例としては、 水溶性食用タール色素 （例、 食用赤色 2号お よび 3号、 食用黄色 4号および 5号、 食用青色 1号および 2号などの食用色 素、 水不溶性レーキ色素 （例、 前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩 など） 、 天然色素 （例、 3—カロチン、 クロロフィル、 ベンガラなど） など が挙げられる。
甘味剤の好適な例としては、 サッカリンナトリウム、 グリチルリチン酸二 カリウム、 アスパルテーム、 ステビアなどが挙げられる。
前記医薬組成物の剤形としては、 例えば錠剤、 カプセル剤 （ソフトカプセ ル、 マイクロカプセルを含む） 、 顆粒剤、 散剤、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤 などの経口剤；および注射剤 （例、 皮下注射剤、 静脈内注射剤、 筋肉内注射 剤、 腹腔内注射剤など） 、 外用剤 （例、 経鼻投与製剤、 経皮製剤、 軟膏剤な ど） 、 坐剤 （例、 直腸坐剤、 膣坐剤など） 、 ペレット、 点滴剤、 徐放性製剤 (例、 徐放性マイクロカプセルなど） 等の非経口剤が挙げられる。
医薬組成物は、 製剤技術分野において慣用の方法、 例えば日本薬局方に記 載の方法等により製造することができる。 以下に、 製剤の具体的な製造法に ついて詳述する。 医薬組成物中の有効成分の含量は、 剤形、 有効成分の投与 量などにより異なるが、 例えば約 0 . 1ないし 1 0 0重量％である。
例えば、 経口剤は、 有効成分に、 賦形剤 （例、 乳糖， 白糖， デンプン， D —マンニトールなど） 、 崩壊剤 （例、 カルポキシメチルセルロースカルシゥ ムなど） 、 結合剤 （例、 α化デンプン， アラビアゴム， カルポキシメチルセ ルロース， ヒドロキシプロピルセルロース， ポリビニルピロリドンなど） ま たは滑沢剤 （例、 タルク， ステアリン酸マグネシウム， ポリエチレングリコ ール 6 0 0 0など） などを添加して圧縮成形し、 次いで必要により、 味のマ スキング、 腸溶性あるいは持続性を目的として、 コーティング基剤を用いて 自体公知の方法でコーティングすることにより製造される。
該コ一ティング基剤としては、 例えば糖衣基剤、 水溶性フィルムコーティ ング基剤、 腸溶性フィルムコーティング基剤、 徐放性フィルムコーティング 基剤などが挙げられる。
糖衣基剤としては、 白糖が用いられ、 さらに、 タルク、 沈降炭酸カルシゥ ム、 ゼラチン、 アラビアゴム、 プルラン、 カルナバロウなどから選ばれる 1 種または 2種以上を併用してもよい。
水溶性フィルムコーティング基剤としては、 例えばヒドロキシプロピルセ ルロース、 ヒドロ'キシプロピルメチルセルロース、 ヒドロキシェチルセル口 ース、 メチルヒドロキシェチルセルロースなどのセルロース系高分子；ポリ ビニルァセ夕一ルジェチルァミノアセテート、 アミノアルキルメタァクリレ 一トコポリマー E 〔オイドラギット E (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 、 ポ リビニルピロリドンなどの合成高分子； プルランなどの多糖類などが挙げら れる。
腸溶性フィルムコ一ティング基剤としては、 例えばヒドロキシプロピルメ チルセルロース フタレート、 ヒドロキシプロピルメチルセルロース ァセ テートサクシネート、 カルポキシメチルェチルセルロース、 酢酸フタル酸セ ルロースなどのセルロース系高分子；メタアクリル酸コポリマー L 〔ォイド ラギット L (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 、 メタアクリル酸コポリマー L D 〔オイドラギット L一 3 0 D 5 5 (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 、 メタ アクリル酸コポリマー S 〔オイドラギット S (商品名） 、 ロームフアルマ 社〕 などのアクリル酸系高分子；セラックなどの天然物などが挙げられる。 徐放性フィルムコーティング基剤としては、 例えばェチルセルロースなど のセルロース系高分子；アミノアルキルメタァクリレートコポリマー R S 〔オイドラギット R S (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 、 アクリル酸ェチ ル ·メタアクリル酸メチル共重合体懸濁液 〔オイドラギット N E (商品名） ロームフアルマ社〕 などのアクリル酸系高分子などが挙げられる。
上記したコ一ティング基剤は、 その 2種以上を適宜の割合で混合して用い てもよい。 また、 コーティングの際に、 例えば酸化チタン、 三二酸化鉄等の ような遮光剤を用いてもよい。
注射剤は、 有効成分を分散剤 （例、 ポリソルベート 8 0 , ポリオキシェチ レン硬化ヒマシ油 6 0など， ポリエチレングリコール， カルボキシメチルセ ルロース， アルギン酸ナトリウムなど） 、 保存剤 （例、 メチルパラベン， プ 口ピルパラベン， ベンジルアルコール， クロロブ夕ノール， フエノールな ど） 、 等張化剤 （例、 塩化ナトリウム， グリセリン， D—マンニトール， D 一ソルビトール， ブドウ糖など） などと共に水性溶剤 （例、 蒸留水， 生理的 食塩水， リンゲル液等） あるいは油性溶剤 （例、 ォリーブ油， ゴマ油， 綿実 油， トウモロコシ油などの植物油、 プロピレングリコール等） などに溶解、 懸濁あるいは乳化することにより製造される。 この際、 所望により溶解補助 剤 （例、 サリチル酸ナトリウム， 酢酸ナトリウム等） 、 安定剤 （例、 ヒト血 清アルブミン等） 、 無痛化剤 （例、 ベンジルアルコール等） 等の添加物を用 いてもよい。 注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動 物 （例えば、 ヒト、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
本発明の D NAを上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 本発明の D N Aを単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデ ノ随伴ウィルスベクターなどの適当な発現ベクター中に挿入した後、 常套手 段に従って投与することもできる。 また、 本発明の D NAは、 そのままで、 あるいは摂取促進のための補助剤とともに、 遺伝子銃やハイドロゲルカテ一 テルのようなカテーテルによって投与することもできる。
本発明の蛋白質 （ペプチド） の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に、 例えば糖 ·脂 質代謝異常患者 （体重 6 0 k gとして） においては、 一日につき約 0 . 1〜 1 0 O m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 O m gである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対 象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば注射剤の形では、 通常、 例えば糖 ·脂質代謝異常患者 （体重 60 kgとして） においては、 一 日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を投与するのが好都合である。 投与 対象がヒト以外の場合も、 体重 60 k g当たりに換算した量を投与すること ができる。
本発明の DNAの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などに より 異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に、 例えば糖 ·脂質代謝異常患 者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0.1〜10 Omg、 好ま しくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非 経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法などによっても異なるが、 例えば注射剤の形では、 通常、 例えば糖 · 脂質代謝異常患者 （6 O kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜 3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. ：!〜 1 Omg程度を投与するのが好都合である。 投与対象がヒト以外の場合 も、 体重 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
(3) 本発明の蛋白質の過剰発現に関連する疾患の予防 ·治療剤
本発明の蛋白質 （ペプチド） に対する抗体は、 本発明の蛋白質の関与する シグナル伝達機能、 例えば、 本発明の蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cAM P生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 pHの低下などを促進する 活性または抑制する活性など） を不活性化 （すなわち中和） することができ る。 一方、 本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドのアンチセンス核酸 (リポザィムゃ RNA i活性を有する二本鎖オリゴ RNAを含む） は、 本発 明の蛋白質遺伝子の転写、 転写産物のプロセッシングおよび または mRN Aからの翻訳をプロックすることにより、 本発明の蛋白質の発現を阻害する ことができる。 従って、 ①本発明の抗体または②本発明のアンチセンス核酸 を、 本発明の蛋白質の過剰発現に関連する疾患の予防 ·治療剤などの医薬と して使用することができる。 本発明の蛋白質は、 高脂肪食負荷ストレス時に白色脂肪細胞で高発現し、 さらに食事、 インスリン抵抗性調節薬による刺激、 肥満 ·糖尿病などの病態 に応じて発現が変動し、 その発現の変動が脂肪細胞の分化に影響することな どから、 本発明の蛋白質の過剰発現に関連する疾患としては、 脂肪細胞の分 化およびノまたは代謝機能 （特に糖 ·脂質代謝） の異常 （不全もしくは亢 進） が関与する疾患 （例えば、 肥満症、 糖尿病、 耐糖能異常、 動脈硬化、 高 血圧、 高脂血症など） などが挙げられる。 ' 本発明の抗体および本発明のアンチセンス核酸は、 前記 「本発明の蛋白質 の機能不全に関連する疾患の予防 ·治療剤」 と同様にして製剤化することが できる。 また、 該アンチセンス核酸は、 そのままで、 遺伝子銃やハイドロゲ ルカテーテルのようなカテーテルによって投与することもできる。
本発明の抗体の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによ り差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に、 例えば糖 ·脂質代謝異常患者 (体重 60 kgとして） においては、 一日につき約 0.1〜 100mg、 好 ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば注射剤の形では、 通常、 例えば 糖 ·脂質代謝異常患者 （体重 6 O kgとして） においては、 一日につき約 0 01〜30mg程度、 好ましくは約 0.. l〜20mg程度、 より好ましくは 約 0. 1〜1 Omg程度を投与するのが好都合である。 投与対象がヒト以外 の場合も、 体重 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のアンチセンス核酸の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与 方法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に、 例えば糖 ·脂質 代謝異常患者 （体重 6 O kgとして） においては、 一日につき約 0.1〜1 0 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20 mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象 臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば注射剤の形では、 通 常、 例えば糖 ·脂質代謝異常患者 （体重 6 O kgとして） においては、 一日 にっき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 よ り好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を投与するのが好都合である。 投与対 象がヒト以外の場合も、 体重 60 k g当たりに換算した量を投与することが できる。
(4) 遺伝子診断剤
本発明の蛋白質をコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸 （以 下、 「本発明のセンス核酸」 という） または本発明のアンチセンス核酸は、 プローブとして使用することにより、 哺乳動物 （例えば、 ヒト、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） における本発明の蛋白 質をコードする DN Aまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出すること ができるので、 例えば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは 発現低下や、 該 DN Aまたは mRNAの増加あるいは発現過多などの遺伝子 診断剤として有用である。
本発明のセンス核酸またはアンチセンス核酸を用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザンハイブリダィゼーシヨンや P C R— S S C P法 (ゲノミックス （Genomics) ， 第 5巻， 874〜 879頁 （ 1 989年） 、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシ イスヽォブ ·ユーエスエー (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) , 第 86巻， 2766〜27 70頁 （1989年） ） などにより実施することができる。
例えば、 ノーザンハイブリダィゼーシヨンにより本発明の蛋白質の発現低 下が検出された場合は、 例えば、 該蛋白質の機能不全に関連する疾患に罹患 している、 もしくは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。 ま た逆に、 例えば、 ノーザンハイブリダィゼ一シヨンにより本発明の蛋白質の 発現過多が検出された場合は、 例えば、 該蛋白質の機能亢進に関連する疾患 に罹患している、 もしくは将来罹患する可能性が高いと診断することができ る。
本発明の蛋白質は、 高脂肪食負荷ストレス時に白色脂肪細胞で高発現し、 さらに食事、 インスリン抵抗性調節薬による刺激、 肥満 ·糖尿病などの病態 に応じて発現が変動し、 その発現の変動が脂肪細胞の分化に影響することな どから、 本発明のセンス核酸またはアンチセンス核酸は、 脂肪細胞の分化お よび Zまたは代謝機能 （特に糖 ·脂質代謝） の異常 （不全もしくは亢進） が 関与する疾患 （例えば、 肥満症、 糖尿病、 耐糖能異常、 動脈硬化、 高血圧、 高脂血症など） の診断に有用である。
( 5 ) 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化させる化合物のス クリーニング方法
本発明のセンスまたはアンチセンス核酸は、 プローブとして用いることに より、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化させる化合物のス クリーニングに用いることができ'る。 また、 本発明のセンス核酸およびアン チセンス核酸を一対のプライマーとして用い、 R T— P C Rを行うことによ つても、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化させる化合物を スクリ一二ングすることができる。
すなわち、 本発明は、 例えば、 （ i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の 臓器、 ③臓器から単離した組織もしくは細胞、 または （i i ) 形質転換体等に 含まれる本発明の蛋白質 （ペプチド） をコードする mR NA量を測定するこ とによる、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化させる化合物 のスクリーニング方法を提供する。
本発明の蛋白質 （ペプチド） をコードする mR NA量の測定は具体的には 以下のようにして行なう。
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には、 肥 満マウス、 糖尿病マウス、 高血圧ラット、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスな ど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗肥満薬、 抗糖尿病薬、 降圧薬、 血管作用薬、 抗癌剤など） あるいは物理的ストレス （例えば、 浸水ストレス、 電気ショッ ク、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経過した後に、 血液、 あるいは 特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓など） 、 または臓器から単離した組織 (例えば、 褐色または白色脂肪組織など） 、 あるいは細胞 （脂肪細胞など） を得る。
得られた細胞に含まれる本発明の蛋白質をコードする mR N Aは、 例えば、 通常の方法により細胞等から m R N Aを抽出し、 例えば TaqMan PCRなどの 手法を用いることにより定量することができ、 自体公知の手段によりノーザ ンブロットを行なうことにより解析することもできる。
(i i) 本発明の蛋白質 （ペプチド） を発現する形質転換体を前述の方法に従 つて作製し、 該形質転換体に含まれる本発明の蛋白質 （ペプチド） をコード する mR N Aを同様にして定量、 解析することができる。
本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化させる化合物のスクリ 一二ングは、
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理 的ストレスなどを与える一定時間前 （3 0分前ないし 2 4時間前、 好ましく は 3 0分前ないし 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前ないし 6時間前） も しくは一定時間後 （3 0分後ないし 3日後、 好ましくは 1時間後ないし 2日 後、 より好ましくは 1時間後ないし 2 4時間後） 、 または薬剤あるいは物理 的ストレスと同時に被検化合物を投与し、 投与後一定時間経過後 （3 0分後 ないし 3日後、 好ましくは 1時間後ないし 2日後、 より好ましくは 1時間後 ないし 2 4時間後） 、 細胞に含まれる本発明の蛋白質をコードする mR N A 量を定量、 解析することにより行なうことができ、
( i i) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、 一定時間培養後 （1日後ないし 7日後、 好ましくは 1日後ないし 3日後、 よ り好ましくは 2日後ないし 3日後） 、 該形質転換体に含まれる本発明の蛋白 質 （ペプチド） をコードする mR N A量を定量、 解析することにより行なう ことができる。
本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化させる化合物のスクリ 一二ング用キットは、 （a) 本発明のセンスおよび またはアンチセンス核酸、 好ましくは二本鎖オリゴ D NAからなるプローブ、 または (b) 本発明のセン ス核酸および本発明のアンチセンス核酸からなるプライマーセットを構成と して含むことを特徴とする。 該プローブとしては、 常法により R I、 蛍光ま たは酵素等で標識されたものが使用される。
該スクリーニング用キットは、 所望により、 さらに R NA抽出用試薬およ び/またはツール （例：抽出バッファー、 スピンカラム等） 、 P C Rまたは ノーザンハイブリダィゼーシヨン用試薬および Zまたはツール （例： d N T P s 、 P C R反応バッファー、 耐熱性 D N Aポリメラーゼ等） 、 本発明の蛋 白質（ペプチド）を発現する形質転換体などを含んでいてもよい。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 本 発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化させる作用を有する化合物 であり、 具体的には、 （ィ） 本発明の蛋白質の発現量を増加させることによ り、 本発明の蛋白質とそのレセプター （またはリガンド） との相互作用を介 する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞 内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシ! ルリ ン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 P Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を増強させる化合 物、 （口） 本発明の蛋白質の発現量を減少させることにより、 該細胞刺激活 性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明の蛋白質の生理活性を増強 するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明の蛋白質の生理活性を減少 させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬とし て使用する場合、 前記 「本発明の蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防 · 治療剤」 と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動 物 （例えば、 ヒト、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法 などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に、 例えば糖 ·脂質代謝 異常患者 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき約 0.1〜100 mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg である。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば注射剤の形では、 通常、 例 えば糖 ·脂質代謝異常患者 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき 約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ま しくは約 0. 1〜1 Omg程度を投与するのが好都合である。 投与対象がヒ ト以外の動物の場合も、 体重 60 kg当たりに換算した量を投与することが できる。
(6) 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現量を変化させる化合物を含 有する各種疾患の予防 ·治療剤
本発明の蛋白質は、 前述の通り、 高脂肪食負荷ストレス時に白色脂肪細胞 で高発現し、 さらに食事、 インスリン抵抗性調節薬による刺激、 肥満 ·糖尿 病などの病態に応じて発現が変動し、 その発現の変動が脂肪細胞の分化に影 響することなどから、 脂肪細胞の分化および/または代謝機能の調節に重要 な役割を果たしていると考えられる。 従って、 本発明の蛋白質をコードする 遺伝子の発現量を変化させる化合物は、 脂肪細胞の分化および/または代謝 機能 （特に糖 ·脂質代謝） の異常 （不全もしくは亢進） が関与する疾患 （例 えば、 肥満症、 糖尿病、 耐糖能異常、 動脈硬化、 高血圧、 高脂血症など） の 予防 ·治療剤として用いることができる。
該化合物を本発明の蛋白質の機能不全もしくは亢進に関連する疾患の予 防 ·治療剤として使用する場合は、 前記 「本発明の蛋白質の機能不全に関連 する疾患の予防 ·治療剤」 と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動 物 （例えば、 ヒト、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ズタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法 などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に、 例えば糖 ·脂質代謝 異常患者 （体重 6 O kgとして） においては、 一日につき約 0.1〜 100 mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg である。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば注射剤の形では、 通常、 例 えば糖 ·脂質代謝異常患者 （体重 6 O kgとして） においては、 一日につき 約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. ：!〜 20 mg程度、 より好ま しくは約 0. 1〜1 Omg程度を投与するのが好都合である。 投与対象がヒ ト以外の動物の場合も、 体重 6 O kg当たりに換算した量を投与することが できる。
(7) 本発明の蛋白質に対して特異的親和性を有する化合物 （リガンドまた はレセプ夕一） の定量法
本発明の蛋白質 （ペプチド） は、 本発明の蛋白質に対するリガンド （また はレセプター） に対して結合性を有しているので、 生体内における該リガン ド （またはレセプター） 濃度を感度良く定量することができる。
本発明のリガンド （またはレセプ夕一） 定量法は、 例えば、 競合法と組み 合わせて実施することができる。 すなわち、 被検体を本発明の蛋白質 （ぺプ チド） と接触させることによって被検体中のリガンド （またはレセプター） 濃度を測定することができる。 具体的には、 例えば、 以下の①または②など に記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って実施することができる。 ①入江寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発行）
②入江寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行）
(8) 本発明の蛋白質とそれに対して特異的親和性を有する化合物 （リガン ドまたはレセプ夕一） との結合性を変化させる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕 ゴニストなど） のスクリーニング方法
本発明の蛋白質 （ペプチド） を用いるか、 または本発明の組換え蛋白質 (ペプチド） の発現系を構築し、 該発現系を用いたァフィ二ティーアツセィ 系を使用することによって、 本発明の蛋白質とそのリガンド （またはレセプ ター） の結合性を変化させる化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非べプチ ド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩を効率よくスクリ 一二ングすることができる。 このような化合物には、 （ィ） レセプターを介して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 C AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する 活性または抑制する活性など） を有する化合物 （いわゆる、 本発明の膜蛋白 質もしくは本発明の分泌蛋白質のレセプ夕一に対するァゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を有しない化合物 （いわゆる、 本発明の膜蛋白質もしくは本 発明の分泌蛋白質のレセプ夕一に対するアン夕ゴニス卜） 、 （八） 本発明の 蛋白質とそのリガンド （またはレセプター） との結合力を増強する化合物、 あるいは （二） 本発明の蛋白質とそのリガンド （またはレセプ夕一） との結 合力を減少させる化合物などが含まれる （なお、 上記 （ィ） の化合物は、 上 記 （1 ) で述べたリガンド決定方法によってスクリーニングすることが好ま しい） 。
すなわち、 本発明は、 （ i ) 本発明の蛋白質 （ペプチド） とそのリガンド (またはレセプ夕一） とを接触させた場合と （i i) 本発明の蛋白質 （ぺプチ ド） とそのリガンド （またはレセプター） および試験化合物とを接触させた 場合との比較を行なうことを特徴とする、 本発明の蛋白質とそのリガンド
(またはレセプ夕一） との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ 一二ング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、 （ i ) と （i i) の場合における、 本発明の蛋白質に対するリガンド （またはレセプター） の結合量、 細胞刺激 活性などを測定して、 比較することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、
①標識したリガンド （またはレセプ夕一） を、 本発明の蛋白質 （ペプチド） に接触させた場合と、 標識したリガンド （またはレセプ夕一） および試験化 合物を本発明の蛋白質 （ペプチド） に接触させた場合における、 標識したリ ガンド （またはレセプター） の該蛋白質 （ペプチド） に対する結合量を測定 し、 比較することを特徴とする本発明の蛋白質とそのリガンド （またはレセ プター） との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 ②標識したリガンド （またはレセプ夕一） を、 本発明の蛋白質を産生する細 胞またはその膜画分、 あるいは細胞外液または細胞培養上清 （この場合、 例 えば、 上記の本発明の抗体を固定化した固相 （細胞培養プレート等） を用い て本発明の蛋白質を固相化する） に接触させた場合と、 標識したリガンド (またはレセプ夕一） および試験化合物を本発明の蛋白質を産生する細胞ま たはその膜画分、 あるいは細胞外液または細胞培養上清に接触させた場合に おける、 標識したリガンド （またはレセプ夕一） の該細胞または膜画分、 あ るいは細胞外液または細胞培養上清に対する結合量を測定し、 比較すること を特徴とする本発明の蛋白質とそのリガンド （またはレセプター） との結合 性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
③標識したリガンド （またはレセプ夕一） を、 本発明の D N Aを含有する形 質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質 （ぺプ チド） 、 または培養上清に分泌された本発明の蛋白質 （ペプチド） （この場 合、 例えば、 上記の本発明の抗体を固定化した固相 （細胞培養プレート等） を用いて本発明の蛋白質 （ペプチド） を固相化する） に接触させた場合と、 標識したリガンド （またはレセプター） および試験化合物を本発明の D N A を含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の 蛋白質 （ペプチド） 、 または培養上清に分泌された本発明の蛋白質 （ぺプチ ド） に接触させた場合における、 標識したリガンド （またはレセプター） の 該蛋白質 （ペプチド） に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする 本発明の蛋白質とそのリガンド （またはレセプ夕一） との結合性を変化させ る化合物またはその塩のスクリーニング方法、
④本発明の蛋白質を活性化する化合物 （例えば、 本発明の膜蛋白質等に対す るリガンドなど） または本発明の蛋白質により活性化される化合物 （例えば、 本発明の分泌蛋白質に対するレセプターなど） を、 本発明の蛋白質を細胞膜 上に発現する細胞または本発明の蛋白質が分泌された培養上清に接触させた 場合と、 本発明の蛋白質を活性化する化合物または本発明の蛋白質により活 性化される化合物および試験化合物を、 本発明の蛋白質を細胞膜上に発現す る細胞または本発明の蛋白質が分泌された培養上清に接触させた場合におけ る、 レセプ夕一を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチ ルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生 成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性な ど） を測定し、 比較することを特徴とする本発明の蛋白質とそのリガンド (またはレセプ夕一） との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ 一二ング方法、 および
⑤本発明の蛋白質を活性化する化合物 （例えば、 本発明の膜蛋白質に対する リガンドなど） または本発明の蛋白質により活性化される化合物 （例えば、 本発明の分泌蛋白質に対するレセプ夕一など） を、 本発明の D NAを含有す る形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質
(ペプチド） または本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することに よって培養上清中に分泌された本発明の蛋白質 （ペプチド） に接触させた場 合と、 本発明の蛋白質を活性化する化合物または本発明の蛋白質により活性 化される化合物および試験化合物を、 本発明の D NAを含有する形質転換体 を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質 （ペプチド） ま たは本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することによつて培養上清 中に分泌された本発明の蛋白質 （ペプチド） に接触させた場合における、 レ セプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリ ン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 ィ ノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を 測定し、 比較することを特徴とする本発明の蛋白質とそのリガンド （または レセプター） との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング 方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明の蛋白質 （ペプチド） としては、 上記した本発明の蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩 を含有するものであれば何れのものであってもよいが、 本発明の蛋白質を産 生する哺乳動物の臓器の細胞膜画分または細胞外液が好適である。 しかし、 特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、 スクリーニングに用い られるものとしては、 組換え体を用いて大量発現させたヒト由来の本発明の 蛋白質 （ペプチド） などが適している。
本発明の蛋白質 （ペプチド） を製造するには、 前述の方法が用いられるが、 本発明の D N Aを哺乳細胞や昆虫細胞で発現させることにより行なうことが 好ましい。 目的とする蛋白質部分をコードする DNA断片には cDNAが用 いられるが、 必ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片 や合成 DN Aを用いてもよい。 本発明の蛋白質またはその部分べプチドをコ ードする DNA断片を宿主動物 （昆虫） 細胞に導入し、 それらを効率よく発 現させるためには、 該 DNA断片を、 S V40由来のプロモー夕一、 レトロ ウィルスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒトヒートショ ックプロモーター、 サイトメガロウィルスプロモーター、 SRo!プロモ一夕 一、 昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス
(nuclear polyhedrosis virus； NP V) のポリヘドリンプロモーターなど の下流に組み込むのが好ましい。 発現した蛋白質の量と質の検査はそれ自体 公知の方法で行うことができる。 例えば、 文献 CNambi, P. ら、 ザ'ジャー ナル ·ォブ ·バイオロジカル ·ケミストリ一 （J. Biol. Chem. ) ， 267巻, 19555〜 19559頁， 1992年〕 に記載の方法に従って行なうこと ができる。
したがって、 本発明のスクリーニング方法において用いられる本発明の蛋 白質 （ペプチド） は、 それ自体公知の方法に従って精製した本発明の蛋白質 (ペプチド） であってもよいし、 本発明の蛋白質 （ペプチド） を産生する細 胞またはその細胞膜画分、 あるいは本発明の蛋白質 （ペプチド） を分泌する 細胞の培養上清の形態であってもよい。
上記スクリーニング方法において、 本発明の蛋白質 （ペプチド） を産生す る細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定 化してもよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができ る。 本発明の蛋白質 （ペプチド） を産生する細胞としては、 本発明の蛋白質 (ペプチド） を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。
前記細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得ら れる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Pot ter— Elvehj em型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮーリングブレ ンダ一やポリトロン （Kinemat ica社製） による破砕、 超音波による破砕、 フ レンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによ る破砕などが挙げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠 心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破 砕液を低速 （5 0 0 r p m〜3， 0 0 0 r p m) で短時間 （通常、 約 1〜 1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 （1 5 , 0 0 0 r p m〜3 0， 0 0 0 r p m) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分 中には、 発現した本発明の蛋白質 （ペプチド） と細胞由来のリン脂質ゃ膜蛋 白質などの膜成分が多く含まれる。
本発明の蛋白質 （ペプチド） を産生する細胞やその膜画分中の本発明の蛋 白質 （ペプチド） の量は、 1細胞当たり 1 0 3〜1 0 8分子であるのが好まし く、 1 0 5〜1 0 7分子であるのがより好適である。 なお、 発現量が多いほど 膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が高くなり、 高感度なスクリ一 ニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロットで大量の試料を測定 できるようになる。
本発明の蛋白質とそのリガンドとの結合性を変化させる化合物をスクリ一 ニングする上記の①〜③を実施するためには、 例えば、 適当な本発明の蛋白 質 （ペプチド） 含有画分と、 標識したリガンドが必要である。
本発明の蛋白質含有画分としては、 天然型の本発明の蛋白質含有画分か、 またはそれと同等の活性を有する組換え型の本発明の蛋白質含有画分などが 望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情 報伝達作用などを示す。
標識したリガンドとしては、 標識したリガンド、 標識したリガンドアナロ グ化合物などが用いられる。 例えば 〔3H〕 、 C125 I] 、 〔14C〕 、 C35 S〕 などで標識されたリガンドなどが用いられる。
具体的には； 本発明の蛋白質とそのリガンドとの結合性を変化させる化合 物のスクリーニングを行なうには、 まず本発明の蛋白質 （ペプチド） を産生 する細胞またはその膜画分を、 スクリーニングに適したバッファ一に懸濁す ることにより本発明の蛋白質 （ペプチド） 標品を調製する。 バッファ一には、 PH4〜： 10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファー、 トリス一塩酸 バッファ一などの本発明の蛋白質とそのリガンドとの結合を阻害しないバッ ファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Twe e n- 80™ (花王—アトラス社） 、 ジギトニン、 デォ キシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的で PMSF、 ロイぺプチン、 E—64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプスタチンなどのプロテ ァ一ゼ阻害剤を添加することもできる。 0.01〜： L 0m 1の該レセプター 溶液に、 一定量 （5， 000 c pm〜50, 0000 c pm) の標識したリ ガンドを添加し、 同時に 10— 4M〜10_1QMの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えた 反応チューブも用意する。 反応は約 0°Cから 5 Ot：、 望ましくは約 4°Cから 37°Cで、 約 20分から 24時間、 望ましくは約 30分から 3時間行う。 反 応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラ ス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンターまたはァ 一カウンターで計測する。 拮抗する物質がない場合のカウント（BQ) から非 特異的結合量 （NSB) を引いたカウント （B。― NSB) を 100%とし た時、 特異的結合量 （B— NSB) が、 例えば、 50%以下になる試験化合 物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
本発明の蛋白質とそのリガンドとの結合性を変化させる化合物をスクリー ニングする上記の④〜⑤の方法を実施するためには、 例えば、 本発明の蛋白 質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a遊離、 細胞内 CAM P生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトール リン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 C一 f O Sの活性 ィ匕、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を公知の方法 または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、 まず、 本発明の蛋白質 （ペプチド） を産生する細胞をマルチ ゥエルプレート等に培養する。 スクリーニングを行なうにあたっては前もつ て新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試 験化合物などを添加して一定時間ィンキュベ一トした後、 細胞を抽出あるい は上清液を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細 胞刺激活性の指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞 が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤 を添加してアツ.セィを行なってもよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性 'については、 フオルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた 細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 本発明の蛋白質 (ペプチド） を膜上に発現した適当な細胞が必要である。 本発明の蛋白質 (ペプチド） を発現した細胞としては、 天然型の本発明の膜蛋白質を産生す る細胞株、 前述の本発明の組換え蛋白質 （ペプチド） を発現した細胞株など が望ましい。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが 用いられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物で あってもよい。
本発明の蛋白質とそのリガンド （またはレセプ夕一） との結合性を変化さ せる化合物またはその塩のスクリーニング方法について、 本発明の蛋白質が 膜蛋白質である場合を取り上げて具体的に説明したが、 本発明の蛋白質が分 泌蛋白質である場合も、 当業者は、 上記の手法を応用して、 本発明の分泌蛋 白質とそのレセプターの結合性を変化させる化合物を容易にスクリーニング することができる。
本発明の蛋白質とそれに対して特異的親和性を有する化合物 （リガンドま たはレセプター） の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン グ用キットは、 本発明の蛋白質 （ペプチド） 、 本発明の蛋白質 （ペプチド） を産生する細胞またはその膜画分、 あるいは本発明の蛋白質 （ペプチド） を 分泌する細胞の培養上清などを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものが挙げられる。
1. スクリーニング用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0.05%のゥシ血清 アルブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 /mのフィルタ一で濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるい は用時調製しても良い。
②本発明の蛋白質 （ペプチド） 標品
本発明の蛋白質 （ペプチド） を発現させた CHO細胞を、 12穴プレート に 5 X 105個 Z穴で継代し、 37t：、 5%C02、 95%a i rで 2日間培 養したもの （本発明の蛋白質 （ペプチド） が分泌される場合、 該プレートは 該蛋白質に対する抗体でコーティングされている） 。
③標識リガンド （レセプ夕一）
市販の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識したリガン ド （レセプター）
水溶液の状態のものを 4 あるいは一 20 にて保存し、 用時に測定用緩 衝液にて 1 Mに希釈する。
④リガンド （レセプ夕一） 標準液
リガンド （レセプ夕一） を 0.1 %ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を 含む PBSで ImMとなるように溶解し、 —20でで保存する。
標識レセプターおよびレセプター標準液としては、 レセプ夕一蛋白質を適 当な脂質組成からなるリボソーム膜に包埋させたプロテオリボソームを適当 な分散媒 （水、 PBS等） 中に懸濁し、 4 で保存したものを用いることも できる。
2. 測定法 ① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明の蛋白質 （ペプチド） 発現 CHO細胞を、 測定用緩衝液 lm 1で 2回洗浄した後 （本発明の蛋白質 （ぺ プチド） が分泌される場合は、 細胞および培養上清を除去後プレートを測定 用緩衝液で同様に洗浄した後） 、 490 1の測定用緩衝液を各穴に加える < ② 10— 3〜10— 1QMの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識リガンド (またはレセプター） を 5 ^ 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的 結合量を知るためには試験化合物の代わりに 10_3Μのリガンド （またはレ セプター） 標準液を 5 ^ 1加えておく。
③反応液を除去し、 lm 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞 （またはプ レート） に結合した標識リガンド （またはレセプ夕一） を 0.2N NaO
H— 1%SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ一夕一 A (和光純薬製） と 混合する。
④液体シンチレーシヨンカウンタ一 （ベックマン社製） を用いて放射活性を 測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式 〔数 1〕 で求める。 〔数 1〕
PMB= [ (B-NS B) / (B。一 NSB) ] X 100
PMB： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NS B： Non-specific Binding (非特異的結合量)
B0 ：最大結合量
上記スクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 本発明の蛋白質とそれに対して特異的親和性を有す る化合物 （リガンドまたはレセプ夕一） との結合性を変化させる作用を有す る化合物であり、 具体的には、 （ィ） リガンドーレセプ夕一相互作用を介し て細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン 酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f 0 sの活性化、 PHの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を有する化合物 (いわゆる、 本発明の膜蛋白質または本発明の分泌蛋白質のレセプ夕一に対 するァゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を有しない化合物 （いわゆる、 本 発明の膜蛋白質または本発明の分泌蛋白質のレセプ夕一に対するアンタゴニ スト） 、 （八） 本発明の蛋白質とそのリガンド （またはレセプター） との結 合力を増強する化合物、 あるいは （二） 本発明の蛋白質とそのリガンド （ま たはレセプ夕一） との結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
本発明の膜蛋白質 （もしくは本発明の分泌蛋白質のレセプター） に対する ァゴニストは、 本発明の膜蛋白質に対するリガンド （もしくはレセプターに 対する本発明の分泌蛋白質） が有する生理活性と同様の作用を有しているの で、 該リガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明の膜蛋白質 （もしくは本発明の分泌蛋白質のレセプター） に対する アン夕ゴニストは、 本発明の膜蛋白質に対するリガンド （もしくはレセプタ 一に対する本発明の分泌蛋白質） が有する生理活性を抑制することができる ので、 該リガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。 本発明の膜蛋白質とそのリガンド （もしくは本発明の分泌蛋白質とそのレ セプ夕一） との結合力を増強する化合物は、 本発明の膜蛋白質に対するリガ ンド （もしくはレセプ夕一に対する本発明の分泌蛋白質） が有する生理活性 を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明の膜蛋白質とそのリガンド （もしくは本発明の分泌蛋白質とそのレ セプター） との結合力を減少させる化合物は、 本発明の膜蛋白質に対するリ ガンド （もしくはレセプターに対する本発明の分泌蛋白質） が有する生理活 性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
上記スクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩を医薬として使用する場合、 前記 「本発明の蛋白質の機 能不全に関連する疾患の予防 ·治療剤」 と同様にして製剤化することができ る。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動 物 （例えば、 ヒト、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法 などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に、 例えば脂質代謝異常 患者 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 1〜： L 0 Omg. 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである, 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば注射剤の形では、 通常、 例えば脂 質代謝異常患者 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 01 〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を投与するのが好都合である。 投与対象がヒト以外の動物 の場合も、 体重 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
(9) 本発明の蛋白質とそれに対して特異的親和性を有する化合物 （リガン ドまたはレセプター） との結合性を変化させる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕 ゴニスト） を含有する各種疾患の予防 ·治療剤
本発明の蛋白質は、 前述の通り、 高脂肪食負荷ストレス時に白色脂肪細胞 で高発現し、 さらに食事、 インスリン抵抗性調節薬による刺激、 肥満 ·糖尿 病などの病態に応じて発現が変動し、 その発現の変動が脂肪細胞の分化に影 響することなどから、 脂肪細胞の分化およびノまた'は代謝機能の調節に重要 な役割を果たしていると考えられる。 従って、 本発明の蛋白質とそのリガン ド （もしくはレセプ夕一） との結合性を変化させる化合物 （ァゴ二スト、 ァ ン夕ゴ二スト） は、 脂肪細胞の分化およびノまたは代謝機能 （特に糖 ·脂質 代謝） の異常 （不全もしくは亢進） が関与する疾患 （例えば、 肥満症、 糖尿 病、 耐糖能異常、 動脈硬化、 高血圧、 高脂血症など） の予防 ·治療剤として 用いることができる。
該化合物を本発明の蛋白質の機能不全もしくは亢進に関連する疾患の予防 および/または治療剤として使用する場合は、 前記 「本発明の蛋白質の機能 不全に関連する疾患の予防 ·治療剤」 と同様にして製剤化することができる c このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動 物 （例えば、 ヒト、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法 などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に、 例えば糖 ·脂質代謝 異常患者 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき約 0.1〜100 mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg である。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば注射剤の形では、 通常、 例 えば糖 ·脂質代謝異常患者 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき 約 0. 01〜3 Omg程率、 好ましくは約 0. ：!〜 20 mg程度、 より好ま しくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 投与対象がヒト以外の動物の場合も、 体重 60 k g当たりに換算した量を投 与することができる。
(10) 本発明の蛋白質 （ペプチド） の定量
本発明の抗体は、 本発明の蛋白質 （ペプチド） を特異的に認識することが できるので、 被検液中の本発明の蛋白質 （ペプチド） の定量、 特にサンドィ ツチ免疫測定法による定量などに使用することができる。 すなわち、 本発明 は、 例えば、 （i) 本発明の抗体と、 被検液および標識した本発明の蛋白質 (ペプチド） とを競合的に反応させ、 該抗体に結合した該標識化蛋白質 （ぺ プチド） の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明の蛋白質 （ぺ プチド） の定量法、
(11) 被検波と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させた後、 不溶化担体上の標識剤の活 性を測定することを特徴とする被検液中の本発明の蛋白質 （ペプチド） の定 量法を提供する。
上記 （ii) においては、 不溶化抗体と標識化抗体とが互いに本発明の蛋白 質 （ペプチド） との結合を妨害しないような抗原認識部位を有することが好 ましい （例えば、 一方の抗体が本発明の蛋白質 （ペプチド） の N端部を認識 し、 他方の抗体が本発明の蛋白質 （ペプチド） の C端部に反応する等） 。 本発明の蛋白質 （ペプチド） に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明 のモノクローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明の蛋白質 （ぺプ チド） の測定を行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あるいは F'a b画分を用いてもよい。 本発明の蛋白 質 （ペプチド） に対する抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきもので はなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 本発明の蛋白質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測 定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。 標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同 位元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素とし ては、 例えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが用いられ る。 上記酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 i3 —ガラクトシダーゼ、 /3—ダルコシダ一ゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パ —ォキシ ーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用い られる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシ フェリン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識 剤との結合にピオチン一アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通 常、 蛋白質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を 用いる方法でもよい。 担体としては、 例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリ コン等の合成樹脂、 あるいはガラス等が用いられる。
サンドイッチ法にお ては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検 液を反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体 を反応させ （2次反応） た後、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定すること により被検波中の本発明の蛋白質量を定量することができる。 1次反応と 2 次反応は逆の順序に行なっても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずら して行なつてもよい。 標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じる ことができる。
また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標 識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を 向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明の蛋白質 （ペプチド） の測定法にお いては、 1次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は本 発明の蛋白質 （ペプチド） の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いら れる。 即ち、 1次反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反 応で用いられる抗体が、 本発明の蛋白質 （ペプチド） の C端部を認識する場 合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を 認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例え ば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いること ができる。 競合法では、 被検波中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的 に反応させた後、 未反応の標識抗原と（F)と抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し （B Z F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検波中の 抗原量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分 離をポリエチレングリコール、 上記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相 法、 および、 第 1抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は 可溶性のものを用い第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いら れる。
ィムノメトリック法では、 被検波中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識 化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検 液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反 応の標識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 い ずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、 生じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少 量の沈降物しか得られない場合にもレーザ一の散乱を利用するレーザーネフ ロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の蛋白質 （ペプチド） の定量に適用 するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれ の方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本 発明の蛋白質 （ペプチド） の測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技 術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照することができる 〔例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行） 、 石川栄治ら 編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 53年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素' 免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 62年発行） 、 「メソッズ -ィ ン 'ェンジモノジー （Methods in ENZYMOLOGY) 」 Vol. 70
(Immunochemical Techniques (Part A))、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected
Immunoassays)) ^ 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E:
Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)) , 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、 アカデミックプレス社発行）など参照〕 。 以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明の蛋白質 （ぺ プチド） を高感度に定量することができる。
さらに、 本発明の抗体を用いて、 生体内での本発明の蛋白質またはその塩 を定量することによって、 本発明の蛋白質の機能不全もしくは亢進に関連す る各種疾患の診断をすることができる。 本発明の蛋白質は、 高脂肪食負荷ス トレス時に白色脂肪細胞で高発現し、 さらに食事、 インスリン抵抗性調節薬 による刺激、 肥満 ·糖尿病などの病態に応じて発現が変動し、 その発現の変 動が脂肪細胞の分化に影響することなどから、 本発明の蛋白質の機能不全も しくは亢進に関連する疾患としては、 脂肪細胞の分化および または代謝機 能 （特に糖 ·脂質代謝） の異常 （不全もしくは亢進） が関与する疾患 （例え ば、 肥満症、 糖尿病、 耐糖能異常、 動脈硬化、 高血圧、 高脂血症など） など が挙げられる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明の蛋 白質またはその塩を特異的に検出するために使用することができる。 また、 本発明の蛋白質 （ペプチド） を精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明の蛋白質 （ペプチド） の検出、 被検細胞内におけ る本発明の蛋白質の挙動の分析などに使用することができる。
( 1 1 ) 細胞膜または細胞外における本発明の蛋白質の量を変化させる化合 物のスクリーニング方法
本発明の抗体は、 本発明の蛋白質 （ペプチド） を特異的に認識することが できるので、 細胞膜または細胞外における本発明の蛋白質の量を変化させる 化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち本発明は、 例えば、
( i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器、 ③臓器から単離した組織も しくは細胞等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本 発明の蛋白質を定量することによる、 細胞膜における本発明の膜蛋白質の量 を変化させる化合物のスクリーニング方法 （あるいは、 非ヒト哺乳動物の血 漿、 尿、 その他の体液等の細胞外液を分離し、 それに含まれる本発明の蛋白 質を定量することによる、 細胞外における本発明の蛋白質の量を変化させる 化合物のスクリーニング方法） 、
( i i) 本発明の蛋白質 （ペプチド） を発現する形質転換体等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本発明の蛋白質 （ペプチド） を 定量することによる、 細胞膜における本発明の蛋白質の量を変化させる化合 物のスクリーニング方法 （あるいは、 本発明の蛋白質 （ペプチド） を発現す る形質転換体の培養上清を分離し、 該培養上清に含まれる本発明の蛋白質 (ペプチド） を定量することによる、 細胞外における本発明の蛋白質の量を 変化させる化合物のスクリーニング方法） 、
( i i i) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器、 ③臓器から単離した組織 もしくは細胞等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層 での本発明の蛋白質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の本発 明の蛋白質を確認することによる、 細胞膜における本発明の蛋白質の量を変 化させる化合物のスクリーニング方法、
(iv) 本発明の蛋白質またはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を切 片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での本発明の蛋白質 (ペプチド） の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の本発明の蛋 白質 （ペプチド） を確認することによる、 細胞膜における本発明の蛋白質 (ペプチド） の量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。 細胞膜画分に含まれる本発明の蛋白質 （ペプチド） の定量は具体的には以 下のようにして行なう。
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には、 月巴 満マウス、 糖尿病マウス、 高血圧ラット、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスな ど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗肥満薬、 抗糖尿病薬、 降圧剤、 血管作用薬、 抗癌剤など） あるいは物理的ストレス （例えば、 浸水ストレス、 電気ショッ ク、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経過した後に、 血液、 あるいは 特定の臓器 （例えば、 肝臓、 腎臓、 塍臓、 筋肉など） 、 組織 （例えば、 褐色 または白色脂肪組織など） あるいは細胞 （例えば、 脂肪細胞、 筋肉細胞な ど） を得る。 得られた細胞等を、 例えば、 適当な緩衝液 （例えば、 トリス塩 酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 H E P E S緩衝液など） 等に懸濁し、 界面活性剤 (例えば、 トリトン X 1 0 0 TM、 ツイーン 2 0 TMなど） などを用いて該細 胞等を破壊し、 さらに遠心分離や濾過、 カラム分画などの手法を用いて細胞 膜画分を得る。
細胞膜画分とは、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞 膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Po t ter— Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮーリングブレンダ一や ポリトロン （Kinematica社製） のよる破砕、 超音波による破碎、 フレンチプ レスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕な どが挙げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法 などの遠心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液を低 速 （500 r pm〜3, O O O r pm) で短時間 （通常、 約 1〜： L 0分） 遠 心し、 上清をさらに高速 （15, 000 r pm〜30, O O O r pm) で通 常 30分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 本発明の蛋白質 （ペプチド） と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分 が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれる本発明の蛋白質 （ペプチド） は、 例えば、 本発明の 抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、 ウェスタンブロット解析などにより 定量することができる。
かかるサンドィツチ免疫測定法は前述の方法と同様にして行なうことがで き、 ウエスタンプロットは自体公知の手段により行なうことができる。
(ii) 本発明の蛋白質 （ペプチド） を発現する形質転換体を前述の方法に従 つて作製し、 細胞膜画分に含まれる本発明の蛋白質 （ペプチド） を定量する ことができる。
細胞膜における本発明の蛋白質の量を変化させる化合物のスクリーニング は、
(i) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理 的ストレスなどを与える一定時間前 （30分前ないし 24時間前、 好ましく は 30分前ないし 12時間前、 より好ましくは 1時間前ないし 6時間前） も しくは一定時間後 （30分後ないし 3日後、 好ましくは 1時間後ないし 2曰 後、 より好ましくは 1時間後ないし 24時間後） 、 または薬剤あるいは物理 的ストレスと同時に被検化合物を投与し、 投与後一定時間経過後 （3'0分後 ないし 3日後、 好ましくは 1時間後ないし 2日後、 より好ましくは 1時間後 ないし 24時間後） 、 細胞膜における本発明の蛋白質の量を定量することに より行なうことができ、 ( i i) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、 一定時間培養後 （1日後ないし 7日後、 好ましくは 1日後ないし 3日後、 よ り好ましくは 2日後ないし 3日後） 、 細胞膜における本発明の蛋白質 （ぺプ チド） の量を定量することにより行なうことができる。
細胞膜画分に含まれる本発明の蛋白質 （ペプチド） の確認は、 具体的には 以下のようにして行なう。
( i i i) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には、 肥 満マウス、 糖尿病マウス、 高血圧ラット、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスな ど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗肥満薬、 抗糖尿病薬、 降圧剤、 血管作用薬、 抗癌剤など） あるいは物理的ストレス （例えば、 浸水ストレス、 電気ショッ ク、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経過した後に、 血液、 あるいは 特定の臓器 （例えば、 肝臓、 腎臓など） 、 組織 （例えば、 褐色または白色脂 肪組織など） あるいは細胞 （例えば、 脂肪細胞など） を得る。 得られた細胞 等を、 常法に従って組織切片とし、 本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。 細胞表層での本発明の蛋白質の染色度合いを定量化することによって、 細胞 膜上の本発明の蛋白質を確認することにより、 定量的または定性的に、 細胞 膜における本発明の蛋白質 （ペプチド） の量を確認することができる。
(iv) 本発明の蛋白質 （ペプチド） を発現する形質転換体等を用いて同様の 手段をとることにより確認することもできる。
細胞膜における本発明の蛋白質の量を変化させる化合物のスクリーニング 用キットは、 本発明の抗体を構成として含むことを特徴とする。 本発明の抗 体は、 用いる免疫学的測定方法に応じて、 上記 （1 0 ) で述べたいずれかの 形態で供することができる。 例えば、 サンドウイツチ法を用いる場合には、 1次反応に用いる本発明の抗体は適当な不溶性担体 （例：ァガロース、 デキ ストラン、 セルロースなどの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルァ ミド、 シリコン等の合成樹脂、 あるいはガラス等） に固定化された （もしく はされ得る） 状態で、 2次反応に用いられる本発明の抗体は適当な標識剤
[例：放射性同位元素 （ 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 など） 、 酵素 （3—ガラクトシダ—ゼ、 ）3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ —ゼ、 バーオキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素など） 、 蛍光物質 （フルォレ スカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなど） 、 発光物質 （ルミノー ル、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなど） 等] で標識された (もしくはされ得る） 状態で提供される。
該スクリーニング用キットは、 所望により、 さらに免疫学的測定に必要も しくは好適なブロッキング試薬、 洗浄液などや、 細胞膜画分の単離に 、要も しくは好適な試薬類、 本発明の蛋白質 (ぺプチド）を発現する形質転換体など を含んでいてもよい。
上記スクリーニング方法およびスクリーニング用キットについて、 本発明 の蛋白質が膜蛋白質である場合の、 細胞膜における本発明の蛋白質の量を変 化させる化合物のスクリーニングを取り上げて具体的に説明したが、 当業者 は、 上記の手法を応用して、 本発明の蛋白質が分泌蛋白質である場合の、 細 胞外における本発明の蛋白質の量を変化させる化合物のスクリーニングにつ いても容易に実施し得ることはいうまでもない。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 細胞膜 における本発明の膜蛋白質の量、 あるいは細胞外における本発明の分泌蛋白 質の量を変化させる作用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） 細胞膜 における本発明の膜蛋白質、 あるいは細胞外における本発明の分泌蛋白質の 量を増加させることにより、 リガンドーレセプター相互作用を介する細胞刺 激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊 離、 細胞内 C AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低 下などを促進する活性または抑制する活性など） を増強させる化合物、
(口） 細胞膜における本発明の膜蛋白質、 あるいは細胞外における本発明の 分泌蛋白質の量を減少させることにより、 該細胞刺激活性を減弱させる化合 物である。
該化合物としては、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明の蛋白質の生理活性を増強 するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明の蛋白質の生理活性を減少 させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬とし て使用する場合、 前記 「本発明の蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防 · 治療剤」 と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動 物 （例えば、 ヒト、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法 などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に、 例えば糖 ·脂質代謝 異常患者 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 1〜 100 mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg である。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば注射剤の形では、 通常、 例 えば糖 ·脂質代謝異常患者 （体重 6 O kgとして） においては、 一日につき 約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ま しくは約 0. 1〜1 Omg程度を投与するのが好都合である。 投与対象がヒ ト以外の動物の場合も、 体重 60 kg当たりに換算した量を投与することが できる。
(12) 細胞膜あるいは細胞外における本発明の蛋白質の量を変化させる化 合物を含有する各種疾患の予防 ·治療剤
本発明の蛋白質は、 前述の通り、 高脂肪食負荷ストレス時に白色脂肪細胞 で高発現し、 さらに食事、 インスリン抵抗性調節薬による刺激、 肥満 ·糖尿 病などの病態に応じて発現が変動し、 その発現の変動が脂肪細胞の分化に影 響することなどから、 脂肪細胞の分化および Zまたは代謝機能の調節に重要 な役割を果たしていると考えられる。 従って、 細胞膜あるいは細胞外におけ る本発明の蛋白質の量を変化させる化合物は、 脂肪細胞の分化および/また は代謝機能 （特に糖 ·脂質代謝） の異常 （不全もしくは亢進） が関与する疾 患 （例えば、 肥満症、 糖尿病、 耐糖能異常、 動脈硬化、 高血圧、 高脂血症な ど） の予防'治療剤として用いることができる。
該化合物を本発明の蛋白質の機能不全もしくは亢進に関連する疾患の予 防-治療剤として使用する場合は、 前記 「本発明の蛋白質の機能不全に関連 する疾患の予防 ·治療剤」 と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動 物 （例えば、 ヒト、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕'、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法 などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に、 例えば糖 ·脂質代謝 異常患者 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき約 0.1〜100 mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0~20mg である。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば注射剤の形では、 通常、 例 えば糖 '脂質代謝異常患者 （体重 6 O kgとして） においては、 一日につき 約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ま しくは約 0. 1〜1 Omg程度を投与するのが好都合である。 投与対象がヒ ト以外の動物の場合も、 体重 60 kg当たりに換算した量を投与することが できる。
(13) 本発明の蛋白質をコードする DNAを有する非ヒトトランスジェニ ック動物の作製
本発明は、 外来性の本発明の蛋白質をコードする DNA (以下、 本発明の 外来性 DNAと略記する） またはその変異 DNA (本発明の外来性変異 DN Aと略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
〔1〕 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、 〔2〕 ゲッ歯動物である第 〔1〕 記載の動物、 〔3〕 ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 〔2〕 記載の動物、 および 〔4〕 本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを含有し、 哺乳動物にお いて発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒ卜哺乳動物 （以 下、 本発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およ びその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物 の発生における胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞 の段階でかつ一般に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リポフエクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクル ガン法、 DEAE—デキストラン法などにより目的とする DNAを転移する ことによって作出することができる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細 胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述 の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明の D NA転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが 比較的短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純 系として、 C 57BLZ6系統， DBA2系統など、 交雑系として、 B6C 系統， BDFi系統， B6D2F 系統， BALBZc系統， I CR系 統など） またはラット （例えば、 Wi s t a r， SDなど） などが好ましい。 哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 として は、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の D NAではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをい う。
本発明の変異 DN Aとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例 えば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠失、 他の 塩基への置換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含ま れる。
該異常 DNAとしては、 異常な本発明の蛋白質等を発現させる DNAを意 味し、 例えば、 正常な本発明の蛋白質の機能を抑制する蛋白質等を発現させ る DN Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DNAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの 哺乳動物由来のものであってもよい。 本発明の DN Aを対象動物に転移させ るにあたっては、 該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に 結合した DNAコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒト DNAを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の DNA を有する各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス 夕一、 ラット、 マウスなど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモータ一 の下流に、 本発明のヒト DNAを結合した DNAコンストラクト （例、 べク ターなど） を対象哺乳動物の受精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロイン ジェクションすることによって本発明の DNAを高発現する DNA転移哺乳 動物を作出することができる。
本発明の DN Aを担持させる発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラス ミド、 枯草菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどの バクテリオファージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワク シニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ゥィルスなどが用いられ る。 なかでも、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵 母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモ一夕一としては、 例えば、 ①ウィル ス （例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一マウス白血病 ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロモーター、 ②各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モル モット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモータ一、 例えば、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスターゼ、 エリス口 ポェチン、 エンドセリン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性蛋白質、 ダルタチオン S—トランスフェラ一ゼ、 血小板由来成長因子 /3、 ケラチン 1， K 10および K 14、 コラーゲン I型および I I型、 サイクリック AM P依存蛋白質キナーゼ /3 Iサブユニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性ァ ルカリフォスファタ一ゼ、 心房ナトリウム利尿性因子、 内皮レセプターチ口 シンキナーゼ （一般に T i e 2と略される） 、 ナトリウムカリウムアデノシ ン 3リン酸化酵素 （Na, K-ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタ口プロティナ一ゼ 1組織インヒビ夕 一、 MHCクラス I抗原 （H— 2L) 、 H— r a s、 レニン、 ド一パミン ]3 一水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダ一ゼ （TPO) 、 ペプチド鎖延長因子 1 a (EF— 1ひ） 、 3ァクチン、 ひおよび i3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1 および 2、 ミエリン基礎蛋白質、 チログロブリン、 Thy— 1、 免疫グロブ リン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロ ビン、 トロポニン (：、 平滑筋 αァクチン、 プレブ口エンケフアリン Α、 バソ プレシンなどのプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発現す ることが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、 ヒトペプチド鎖延長因 子 l a (EF- 1 α) のプロモータ一、 ヒトおよびニヮトリ i3ァクチンプロ モータ一などが好適である。
上記ベクターは、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー RNAの転写を終結する配列 （一般に夕一ミネタ一と呼ばれる） を有してい ることが好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DN Aの配列を用いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの S V40夕 一ミネタ一などが用いられる。
その他、 目的とする外来性 DN Aをさらに高発現させる目的で各 DN Aの スプライシングシグナル、 ェンハンサ一領域、 真核 DNAのイントロンの一 部などをプロモーター領域の 5'上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるい は翻訳領域の 3 '下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明の蛋白質等の翻訳領域は、 各種哺乳動物 （例えば、 ヒト、 ゥ サギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の 肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DN Aおよび市販の各種ゲノム D N Aライブラリ一よりゲノム DNAの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 RN Aより公知の方法により調製された 相補 DNAを原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 DNA は、 上記の細胞または組織より得られた正常な本発明の蛋白質等の翻訳領域 を点突然変異誘発法により変異させた翻訳領域を作製することによって得る ことができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、 前記のプロモーターの下流 （および所望により転写終結部位の上流） に連結 させる通常の D N A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DNAの転移は、 対象哺乳動物の 胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 D N A転移後 の作出動物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 DN Aが存在することは、 作出動物の後代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外 来性 DN Aを保持することを意味する。 本発明の外来性 DN Aを受け継いだ この種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DNAを有する。
本発明の外来性正常 DN Aを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外 来性 DN Aを安定に保持することを確認して、 該 DN A保有動物として通常 の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DNAの転移は、 対象哺乳動物の 胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 DNA転 移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 DN Aが過剰に存在する ことは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の 外来性 DNAを過剰に有することを意味する。 本発明の外来性 DN Aを受け 継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外 来性 DNAを過剰に有する。
導入 DN Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この 雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 DN Aを過剰に有するよ うに繁殖継代することができる。 本発明の正常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 DNAが高 発現させられており、 内在性の正常 DN Aの機能を増強することにより最終 的に本発明の蛋白質の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動 物として利用することができる。 例えば、 本発明の正常 DN A転移動物を用 いて、 本発明の蛋白質の機能亢進症や、 該蛋白質が関連する疾患の病態機序 の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。 また、 本発明の外来性正常 DNAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発 明の蛋白質の増加症状を有することから、 該蛋白質に関連する疾患に対する 治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 DN Aを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により 外来性 DN Aを安定に保持することを確認して該 DN A保有動物として通常 の飼育環境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 DNAを 前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。 プロモータ 一との DNAコンストラク卜は、 通常の DNA工学的手法によって作製する ことができる。 受精卵細胞段階における本発明の異常 DNAの転移は、 対象 哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。 DN A転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常 D N Aが存在すること は、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 DNAを有することを意味する。 本発明の外来性 DNAを受け継いだこの種 の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 DNAを 有する。 導入 DN Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し， この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 DNAを有するよう に繁殖継代することができる。
本発明の異常 DNAを有する非ヒ卜哺乳動物は、 本発明の異常 DNAが高 発現させられており、 内在性の正常 DNAの機能を阻害することにより最終 的に本発明の蛋白質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデ ル動物として利用することができる。 例えば、 本発明の異常 DN A転移動物 を用いて、 本発明の蛋白質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこ の疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。 また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本発明の蛋白質の機能不活性型不応症における本発明の異常蛋白質による正 常蛋白質の機能阻害 （dominant negat ive作用） を解明するモデルとなる。 また、 本発明の外来異常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明 の異常蛋白質の増加症状を有することから、 本発明の蛋白質の機能不活性型 不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の D N A転移動物のその他の利用可能性として、 例えば、
①組織培養のための細胞源としての使用、
②本発明の D N A転移動物の組織中の D NAもしくは R N Aを直接分析する か、 または D N Aにより発現された蛋白質を分析することによる、 本発明の 蛋白質により特異的に発現あるいは活性化する蛋白質等との関連性について の解析、
③ D N Aを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使 用しての、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
④上記③記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のス クリーニング、 および
⑤本発明の変異蛋白質の単離精製およびその抗体作製などが考えられる。 さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明の蛋白質の機能不活性 型不応症などを含む、 該蛋白質に関連する疾患の臨床症状を調べることがで き、 また、 本発明の蛋白質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細 な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患による 二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の D NA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシ ンなどの蛋白質分解酵素により、 遊離した D NA転移細胞の取得、 その培養 またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明の 蛋白質産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 ま たはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることな どができ、 本発明の蛋白質およびその作用解明のための有効な研究材料とな る。
さらに、 本発明の D N A転移動物を用いて、 本発明の蛋白質の機能不活性 型不応症を含む、 該蛋白質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療薬のスク リーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の D NA転移動物 または本発明の外来性 D N A発現ベクターを用いて、 本発明の蛋白質が関連 する疾患の D N A治療法を検討、 開発することが可能である。
( 1 4 ) 本発明の蛋白質をコードする遺伝子が不活性化されたノックアウト 非ヒト動物の作製
本発明は、 本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞およ び本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
〔1〕 本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
〔2〕 該 D N Aがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の ]3—ガラクトシダー ゼ遺伝子） を導入することにより不活性化された第 〔1〕 項記載の胚幹細胞、 〔3〕 ネオマイシン耐性である第 〔1〕 項記載の胚幹細胞、
〔4〕 ゲッ歯動物である第 〔1〕 項記載の胚幹細胞、
〔5〕 ゲッ歯動物がマウスである第 〔4〕 項記載の胚幹細胞、
〔6〕 本発明の D NAが不活性化された該 D N A発現不全非ヒト哺乳動物、 〔7〕 該 D N Aがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の /3—ガラクトシダー ゼ遺伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が本発 明の D NAに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 〔6〕 項記載の非 ヒト哺乳動物、
〔8〕 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 〔6〕 項記載の非ヒト哺乳動物、 〔9〕 ゲッ歯動物がマウスである第 〔8〕 項記載の非ヒト哺乳動物、 および
〔1 0〕 第 〔7〕 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子 の発現を検出することを特徴とする本発明の D N Aに対するプロモーター活 性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供す る。 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト 哺乳動物が有する本発明の DN Aに人為的に変異を加えることにより、 DN Aの発現能を抑制するか、 もしくは該 D N Aがコードしている本発明の蛋白 質の活性を実質的に喪失させることにより、 DN Aが実質的に本発明の蛋白 質の発現能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することが ある） 非ヒト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。 非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DN Aに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子ェ 学的手法により該 DN A配列の一部又は全部の削除、 他 DN Aを挿入または 置換させることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を 破壊することにより本発明のノックアウト DNAを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明 の D N A不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト ES細胞と略記す る） の具体例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明 の DNAを単離し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロ マイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは l a c Z (β— ガラクトシダーゼ遺伝子） 、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトラン スフエラ一ゼ遺伝子） を代表とするレポ一ター遺伝子等を挿入することによ りェキソンの機能を破壊するか、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺 伝子の転写を終結させる DNA配列 （例えば、 poly A付加シグナルなど） を 挿入し、 完全なメッセンジャー RNAを合成できなくすることによって、 結 果的に遺伝子を破壊するように構築した DN A配列を有する DN A鎖 （以下、 ターゲッティングベクタ一と略記する） を、 例えば相同組換え法により該動 物の染色体に導入し、 得られた ES細胞について本発明の DNA上あるいは その近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダィゼーシヨン解析 あるいは夕一ゲッティングベクター上の DNA配列とターゲッティングべク 夕一作製に使用した本発明の DN A以外の近傍領域の DN A配列をプライマ —とした PCR法により解析し、 本発明のノックアウト ES細胞を選別する ことにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DN Aを不活化させる元の ES細胞 としては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また 公知の Evansと Kaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例え ば、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用 されているが、 免疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系 で免疫学的に遺伝的背景が明らかな E S細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57 BL/6マウスや C 57 B LZ 6の採卵数の少なさを D B AZ 2との 交雑により改善した BDF マウス （〇578 6と08八//2との 1) を用いて樹立したものなども良好に用いうる。 BDFiマウスは、 採卵数が 多く、 かつ、 卵が丈夫であるという利点に加えて、 C 57BLZ6マウスを 背景に持つので、 これを用いて得られた ES細胞は病態モデルマウスを作出 したとき、 C 57 BLZ6マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景 を C 57 BL 6マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。 また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使 用するが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることに より効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が 生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減 するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上 の性決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげること ができる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の 細胞数を要していたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むので、 培養初期における ES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別 で行なうことが可能であり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培 養初期の手間は大幅に削減できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G_バンデイング法による 染色体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細胞の染色体数は 正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場 合は、 ES細胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウス では染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ま しい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個 体発生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要であ る。 例えば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F
(1 - 1000 OU/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸 ガス、 95 %空気または 5 %酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37°C で培養するなどの方法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZEDT A溶液 （通常 0.001 -0.5%トリプシン Z0.1 - 5mM EDTA、 好 ましくは約 0.1%トリプシン ZlmM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフィーダ一細胞上に播種する方法などがとられる。 このよう な継代は、 通常 1 _ 3日毎に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態的 に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 また は細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋 などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及 び M. H. Kaufman, ネィチヤ一 （Nature) 第 292巻、 154頁、 1981 年； G. R. Martin, プロシ一ディングス ·ォブ'ナショナル'アカデミー ' ォブ'サイエンス 'ユーエスエー （Pro atl. Acad. Sci. U.S.A.) 第 7 8巻、 7634頁、 1981年； Τ· C. Doetschman ら、 ジャーナル ·ォ ブ ·ェンブリオロジー 'アンド 'ェクスペリメンタル ·モルフォロジ一 （J. Embryo 1. Exp. Morphol.) 、 第 87巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の E S細胞を分化させて得られる本発明の DNA発現不全細胞は、 インビトロに おける本発明の蛋白質または該蛋白質の細胞生物学的検討において有用であ る。
本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRN A量を公知方 法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と 区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作 製した夕ーゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導 入し、 導入された夕一ゲッティングベクター中の本発明の D NAが不活性化 された D N A配列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス 卵細胞の染色体上の本発明の D N Aと入れ換わる相同組換えをさせることに より、 本発明の D NAをノックアウトさせることができる。 哺乳動物におけ る組換えの多くは非相同的であるため、 相同組換えを起こした細胞をスクリ 一二ングする手段として、 例えば、 本発明の D N Aの内部にネオマイシン耐 性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子を挿入するとともに、 本発明の D NAの近傍 にチミジンキナーゼ （t k ) 遺伝子を含む夕ーゲッティングベクタ一を構築 して胚幹細胞または卵細胞に導入し、 挿入された薬剤耐性遺伝子に対応する 薬剤 （例えば、 ネオマイシン耐性遺伝子であれば G418等） およびガンシク 口ビル存在下で生存する細胞を選択する方法が挙げられる。 即ち、 相同組換 えにより本発明の挿入変異 D NAが染色体上に組み込まれた場合、 t k遺伝 子は排除されるのでガンシクロビル耐性であるが、 非相同組換えで組み込ま れた場合は t k遺伝子も同時に組み込まれるためガンシクロビル感矣性とな る。 また、 t k遺伝子の代わりにジフテリア毒素遺伝子などを用いれば、 ラ ンダム挿入された細胞は該毒素の産生により死滅するので、 単一の薬剤での 選択が可能となる。
本発明の D N Aがノックアウトされた細胞の最終的な確認は、 本発明の D N A上またはその近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイプリダイゼ ーシヨン解析または夕一ゲッティングベクター上の D N A配列と、 夕一ゲッ ティングベクタ一に使用したマウス由来の本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列とをプライマ一とした P C R法による解析を用いて行なうことが できる。
非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発 明の D N Aが不活性化された細胞株をクローニングし、 その細胞を適当な時 期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、 作製した キメラ胚を偽妊娠させた該非ヒ卜哺乳動物の子宮に移植する。 作出された動 物は正常な本発明の D N A座をもつ細胞と人為的に変異した本発明の D N A 座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D NA座をもつ場合、 このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より 全ての組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成され た個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られ る。 このようにして得られた個体は、 通常へテロ発現不全個体であるので、 当該へテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発明の蛋白質の ホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクショ ン法で D N A溶液を注入することにより夕一ゲッティングベクターを染色体 内に導入したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これら のトランスジエニック非ヒト哺乳動物から、 遺伝子相同組換えにより本発明 の D N A座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D N Aがノックアウトされている個体は、 交配に より得られた動物個体も該 D N Aがノックアウトされていることを確認して 通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわ ち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D NAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られ たホモザィゴート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴート 複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 へ テロザィゴート動物の雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有する ホモザィゴートおよびへテロザィゴート動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の蛋白質により 誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 該蛋白質の生物活性の不活性 化を原因とする疾患のモデルとなり得るので、 これらの疾患の原因究明及び 治療法の検討に有用である。
( 1 4 a ) 本発明の D NAの欠損や損傷などに起因する疾患に対して治療 · 予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D N Aの欠損や損傷 などに起因する疾患に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニン グに用いることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合 物を投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D N Aの欠損や損傷などに起因する疾患に対して治療 ·予防効果を有する化合 物またはその塩のスクリ一ニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D NA発現不全非ヒト 哺乳動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿 などがあげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化 合物であってもよい。
具体的には、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処 理し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾患の症状など の変化を指標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。 試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈 注射などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適 宜選択す
ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性 質などにあわせて適宜選択することができる。
該スクリーエング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該試験動物の血糖値が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上： より好まし くは約 5 0 %以上低下した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して治療 · 予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物か ら選ばれた化合物であり、 本発明の蛋白質の欠損や損傷などによって引き起 こされる疾患、 例えば、 脂肪細胞の分化および または代謝機能の異常が関 与する疾患 （例：肥満症、 糖尿病、 耐糖能異常、 動脈硬化、 高血圧、 高脂血 症など） に対する安全で低毒性な治療 ·予防剤などの医薬として使用するこ とができる。 さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される 化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化 合物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や 塩基 （例、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に 許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例 えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例 えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石 酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンス ルホン酸など） との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 「本発明の蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防 ·治療剤」 と同様に して製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳 動物 （例えば、 ヒト、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。 該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなど により差異はあるが、 例えば、 該化合物を経口投与する場合、 一般的に、 例 えば糖 ·脂質代謝異常患者 （体重 6 0 k gとして） においては、 一日につき 約 0 . 1〜： L 0 O m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 0 m gである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投 与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば注射剤 の形では、 通常、 例えば糖 '脂質代謝異常患者 （体重 6 O k gとして） にお いては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜20 mg程度、 より好ましくは約 0. 1~1 Omg程度を投与するのが好都合で ある。 投与対象がヒト以外の動物の場合も、 体重 6 O kg当たりに換算した 量を投与することができる。
(14 b) 本発明の DNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害す る化合物のスクリーニング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与 し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに 対するプロモータ一の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスク リーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動 物としては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本 発明の D N Aがレポ一タ一遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レ ポー夕一遺伝子が本発明の D N Aに対するプロモ一夕一の制御下で発現しう るものが用いられる。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 ；3—ガラクト シダーゼ遺伝子 （ 1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子また はルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明の DN Aをレポ一夕一遺伝子で置換された本発明の DN A発現不全 非ヒト哺乳動物では、 レポ一夕一遺伝子が本発明の DNAに対するプロモー ターの支配下に存在するので、 レポ一夕一遺伝子がコードする物質の発現を トレースすることにより、 プロモーターの活性を検出することができる。 例えば、 本発明の蛋白質をコードする DNA領域の一部を大腸菌由来の /3 —ガラクトシダーゼ遺伝子 （ 1 a c Z) で置換している場合、 本来、 本発明 の蛋白質の発現する組織で、 該蛋白質の代わりに) 3—ガラクトシダーゼが発 現する。 従って、 例えば、 5_ブロ乇_4—クロロ—3—ィンドリル—/3— ガラクトピラノシド （X— g a l) のような /3—ガラクトシダ一ゼの基質と なる試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明の蛋白質の動物生体内 における発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明の蛋白質を 欠損するマウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 リ ン酸緩衝生理食塩液 （P B S ) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温 または 3 7 °C付近で、 約 3 0分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を l m M E D TA/ P B S溶液で洗浄することによって、 i3—ガラクトシダーゼ 反応を停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 l a c Zをコ 一ドする mR N Aを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記し た試験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D N Aに対するプロモー ター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化 合物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 有機酸など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加 塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン 酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リン ゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との 塩などが用いられる。
本発明の D N Aに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩 は、 本発明の蛋白質の発現を促進し、 該蛋白質の機能を促進することができ るので、 例えば、 本発明の蛋白質の機能不全に関連する疾患などの予防 ·治 療薬などの医薬として有用である。
本発明の D N Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩 は、 本発明の蛋白質の発現を阻害し、 該蛋白質の機能を阻害することができ るので、 例えば、 該蛋白質の発現過多に関連する疾患などの予防 ·治療薬な どの医薬として有用である。
本発明の蛋白質の機能不全もしくは発現過多に関連する疾患としては、 例 えば、 脂肪細胞の分化および/または代謝機能の異常が関与する疾患 （例え ば、 肥満症、 糖尿病、 耐糖能異常、 動脈硬化、 高血圧、 高脂血症など） 等が 挙げられる。
さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同 様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記した本発明の蛋白質とそのリガンド （またはレセプター） との結合性を 変化させる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳 動物 （例えば、 ヒト、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕， ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなど により差異はあるが、 例えば、 本発明の DN Aに対するプロモ一夕一活性を 促進または阻害する化合物を経口投与する場合、 一般的に、 例えば糖 ·脂質 代謝異常患者 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき約 0.1〜1 0 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20 mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象 臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば注射剤の形では、 通 常、 例えば糖 ·脂質代謝異常患者 （体重 6 O kgとして） においては、 一日 にっき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 よ り好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を投与するのが好都合である。 投与対 象がヒト以外の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算した量を投与すること ができる。
このように、 本発明の DNA発現不全非ヒ卜哺乳動物は、 本発明の DNA に対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をス クリーニングする上で極めて有用であり、 本発明の DNA発現不全に起因す る各種疾患の原因究明または予防 ·治療薬の開発に大きく貢献することがで さる。
また、 本発明の蛋白質のプロモーター領域を含有する DNAを使って、 そ の下流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に 注入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特異的にその蛋白質を合成させ、 その生体での作用を検討することも可能と なる。 さらに上記プロモ一夕一部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、 これが発現するような細胞株を樹立すれば、 本発明の蛋白質そのものの体内 での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探 索系として使用できる。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC— I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略 号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記す る。 またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA デォキシリポ核酸
c DNA 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C
RNA リボ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸
d ATP デォキシアデノシン三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP デォキシグアノシン三リン酸
dCTP デォキシシチジン三リン酸
ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸
SD S ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
V a 1 バリン
Le u I 1 e
S e r セリン
Th r スレオニン
Cy s
Me t メチォニン
G 1 u グルタミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン
P h e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
T r p トリブトファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン
G 1 n ダル夕ミン
pG 1 u ピログルタミン酸
Me メチル基
E t ェチル基
Bu ブチル基
Ph フエニル基
TC チアゾリジン一 4 (R) —カルポキサミド基 また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で する。
To s p -トルエンスルフォニル
CHO ホルミル
B z 1 ベンジル
Cl2Bzl 2, 6—ジクロ口べンジル Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルポニル
C 1一 z 2一クロ口べンジルォキシカルボニル
B r— Z 2一ブロモベンジルォキシカルポニル
B o c t一ブトキシカルボニル
DNP ジニトロフエノール
T r t トリチル
Bum t一ブトキシメチル
Fm o c N— 9 _フルォレニルメトキシカルポニル
HOB t 1—ヒドロキシベンズトリアゾ一ル
HOOB t 3, 4—ジヒドロ一 3—ヒドロキシ一 4—ォキソ一
1, 2， 3 _ベンゾトリアジン
HONB 卜ヒドロキシ -5-ノルボルネン -2, 3-ジカルポキシィ
DCC ： N, Ν' - 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST20-14(Long form)をコ —ドする c D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 2〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSSno- 14 (Long form)のァ ミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST20- 14 (Short form)を コ一ドする c DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST20-14(Short form)の アミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 5〕 マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST22- 22 (Long form)をコ ードする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST22-22 (Long form)のァ ミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 7〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST - 22 (Short form)を コードする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 8〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST22-22(Short form)の アミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 9〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST8-5をコードする c D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 0〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 H1SST8-5のァミノ酸配列を 示す。
〔配列番号： 1 1〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST19- 15 (Long form)をコ ードする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 2〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST19- 15 (Long form)のァ ミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 3〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST19- 15(Short form)を コードする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 4〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST19-l 5 (Short form)の アミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 1 5〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST13- 11をコードする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 6〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST13- 11のアミノ酸配列 を示す。
〔配列番号： 1 7〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST9- 8をコードする c D N Aの塩基配列を示す。.
〔配列番号： 1 8〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST9-8のアミノ酸配列を 示す。
〔配列番号： 1 9〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSSni-3をコードする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 20〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST21-3のァミノ酸配列 を示す。
〔配列番号： 2 1〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST20- 6をコードする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 22〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 D1SST20-6のァミノ酸配列 を示す。
〔配列番号： 23〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 c D N A断片 mS s 120- 14 (partial)の塩基配列を示す。
〔配列番号： 24〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 c DNA断片 mSst22- 22 (par t ial)の塩基配列を示す。
〔配列番号： 25〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質cDNA断片mSst8-
5 (partial)の塩基配列を示す。
〔配列番号： 26〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 cDNA断片 mSstl9- 15 (par t i a 1 )の塩基配列を示す。
〔配列番号： 27〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 cDNA断片 mSstl3- 11 (partial)の塩基配列を示す。
〔配列番号： 28〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質cDNA断片InSst9- 8 (partial)の塩基配列を示す。
〔配列番号： 29〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 cDNA断片 mSst21- 3 (partial)の塩基配列を示す。
〔配列番号： 30〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 c D N A断片 mSs t20 -
6 (partial)の塩基配列を示す。
〔配列番号： 31〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 cDNA断片を増幅するた めのプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 32〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 cDNA断片を増幅するた めのプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 33〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST20-14の全長をコード する塩基配列を同定するための 5' -RACE用遺伝子特異的プライマーの塩基 配列を示す。 〔配列番号： 34〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSS O- 14の全長をコード する塩基配列を同定するための 3' -RACE用遺伝子特異的プライマーの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 35〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST22-22の全長をコード する塩基配列を同定するための 5' -RACE用遺伝子特異的プライマーの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 36〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST22- 22の全長をコード する塩基配列を同定するための 3' -RACE用遺伝子特異的プライマーの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 37〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST8-5の全長をコードす る塩基配列を同定するための 5' -RACE用遺伝子特異的プライマーの塩基配 列を示す。
〔配列番号： 38〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST8-5の全長をコードす る塩基配列を同定するための 3' -RACE用遺伝子特異的プライマーの塩基配 列を示す。
〔配列番号： 39〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 H1SST19-15の全長をコード する塩基配列を同定するための 5' -RACE用遺伝子特異的プライマーの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 40〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST 19- 15の全長をコード する塩基配列を同定するための 3' -RACE用遺伝子特異的プライマーの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 41〕 マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST13- 11の全長をコード する塩基配列を同定するための 5 ' -RACE用遺伝子特異的プライマーの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 4 2〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST13- 11の全長をコード する塩基配列を同定するための 3' -RACE用遺伝子特異的プライマーの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 4 3〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 D1SST9-8の全長をコードす る塩基配列を同定するための 5 ' -RACE用遺伝子特異的プライマーの塩基配 列を示す。
〔配列番号： 4 4〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST9- 8の全長をコードす る塩基配列を同定するための 3 ' -RACE用遺伝子特異的プライマーの塩基配 列を示す。
〔配列番号： 4 5〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST2卜 3の全長をコード する塩基配列を同定するための 5 ' -RACE用遺伝子特異的プライマーの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 4 6〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST21- 3の全長をコード する塩基配列を同定するための 3' -RACE用遺伝子特異的プライマーの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 4 7〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST20- 6の全長をコード する塩基配列を同定するための 5 ' -RACE用遺伝子特異的プライマーの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 4 8〕
マウス白色脂肪組織由来分泌もしくは膜蛋白質 mSST20-6の全長をコード する塩基配列を同定するための 3' -RACE用遺伝子特異的プライマーの塩基 配列を示す。
以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明 の範囲を限定するものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モレキュラー 'クローニング （Molecular cloning; 上述） に記載されてい る方法に従った。 実施例 1
マウス白色脂肪組織由来の分泌 ·膜蛋白質 c DNAのスクリーニング マウスプロ B細胞株 B a/F 3 (理研セルバンク； RCB0805) は、 その生 存 ·増殖に I L— 3が必須である。 該細胞は細胞膜上にトロンポポイエチン 受容体 （MPL) を発現しており、 リガンドであるトロンボポイエチンの結 合によりホモ二量体を形成し、 細胞内に増殖シグナルが伝えられる。 MPL は、 膜貫通領域の S e r 498 As n変異によりリガンド非依存的な恒常的活 性型 （MPLM) になり、 B a ZF 3が I L— 3非存在下においてもその生 存-増殖が維持され、 しかも、 MP LMの活性には細胞外ドメインの大半は 不要で、 C末端の 187アミノ酸を含めば細胞膜上に発現してホモ二量体を 形成し得ることが見出されている （Kojimaおよび Kitamura, 上述） 。 すな わち、 細胞外領域を欠失させた MP LMの 5 ' 側に c DNAを組み込めるよ うデザインされたレトロウイルスベクタ一を作製し、 組み込んだ cDNAが シグナルシークェンスを有していれば、 c DNAにコードされた蛋白質と M P LMの融合蛋白質が B a/F 3の細胞膜上に発現し、 該 B aZF 3が I L —3非依存下で生存'増殖することになる。 この原理に基づいて、 Me t 1 〜Th r 441を欠失させた MPLMのコード領域 （AMPLM) を含むレトロ ウィルスベクター （pMX-SST； Kojimaおよび Kitamura, 上述） の BstXIサイ トに、 高脂肪食負荷マウス白色脂肪組織由来 c D N Aを挿入してレトロウイ ルス発現ライブラリーを構築し、 分泌 ·膜蛋白質 cDNAのクローニングを 行った。
まず、 高脂肪食負荷マウス （C57B1/6J, 12週齢， ォスに 12日間 30%高脂 肪食を与えた） から内臓脂肪組織 (腸間膜および副睾丸周囲の白色脂肪）を切 除し、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia) を用いて、 添付の プロトコールに従って poly A (+) Aを単離し、 Superscript Choice
System (Gibco-BRL) を用いてランダムへキサマ一により cDNAに変換した。 得られた cDNAを、 BstXIアダプタ一 （Invitrogen) を用いてレトロウイルス ベクター pMX- SSTの BstXIサイ卜に挿入し、 MPLMの 5'側に該 cDNAをライゲ一 シヨンさせた。 得られた DNAを E. coli DH10B株にエレクトロボレ一ショ ン法を用いて導入し、 増幅させた。 常法に従ってプラスミド DNAを精製し， レトロウイルス作製用パッケージング細胞 （Plat-E； Moritaら， Gene Ther. , 7 (12): 1063-1066, 2000；東京大学 医科学研究所 北村俊雄博士より入 手） (2 X 106細胞/ dish) に Lipofectamine™試薬 (Invitrogen) を用いて 添付のプロトコ一ルに従いトランスフエクシヨンした。 10%ゥシ胎仔血清添 カロ DMEM培地中で 24 時間培養後に、 同新鮮培地に交換し 24時間培養し培 養上清を採取して感染性を有した高力価レトロウイルスストック （感染効率 10-30%) を得た。 このレトロウイルスストックで蛋白質発現用細胞
(Ba/F3) を感染させ、 IL-3添加 RPMI1640 培地中で 1 日間培養した後、 96 - wellプレート中に 1 X lOVwell となるように播き、 I L— 3無添加培 地中で選択した。 感染後に増殖性を保持した Ba/F3を選択し、 それらから常 法によりゲノム DNAを抽出した。 次いで、 配列番号 3 1および 32に示され るオリゴヌクレオチドをプライマーとし、 ゲノム DNAを铸型として PCRを行 つた （98°C、 60秒の後、 98 、 20秒および 68°C、 120秒を 30サイクル） 。 増幅された断片を pENTR/D- topo (Invitrogen, 登録商標） にサブクローニン グした。 各 cDNAインサートの塩基配列を BigDye Terminator Cycle
Sequencing FS Ready Kit (PE Biosystems) および DNA自動シークェンサ一 (ABI Prism 377) を用いて決定したところ、 8つの新規な cDNAクローン
(Sst20-6、 Sst22-22、 Sst9-8、 Sstl3 - 11、 Sstl9 - 15、 Sst20— 14、 Sst2卜 3お よび Sst8- 5) が確認された。
尚、 上記 8種の cDNAクローンをそれぞれ挿入されたプラスミド pENTR/D— T0P0 (20-6)、 pENTR/D-TOPO (22-22)、 pENTR/D-T0P0 (9-8)、 pENTR/D- TOPO (13-11)、 pENTR/D-TOPO (19-15)、 pENTR/D-TOPO (20-14)、 pENTR/D -TOPO (2卜 3)および pENTR/D— TOPO (8- 5)で大腸菌コンビテントセル
Escherichia coli ToplO (Invi trogen) を形質転換し、 形質転換体
Escherichia coli Top 10/pENTR/D- TOPO (20-6), Escherichia coli
To lO/pENTR/D-TOPO (22-22)、 Escherichia coli ToplO/pENTR/D-TOPO (9- 8)、 Escherichia coli ToplO/pENTR/D-TOPO (13-11)、 Escherichia coli ToplO/pENTR/D-TOPO (19 - 15)、 Escherichia coli To lO/pENTR/D-TOPO (20- 14)、 Escherichia coli ToplO/pENTR/D-TOPO (21- 3)および Escherichia coli To lO/pENTR/D-TOPO (8-5)株を得た。 これらの大腸菌株は、 それぞれ FERM BP- 8106、 FERM BP- 8109、 FERM BP - 8105、 FERM BP-8107, FERM BP- 8108、 FERM BP-8104, FERM BP- 8102および FERM BP- 8110の受託番号を付され、 平 成 14年 7月 2日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託セ ' ンター （〒305-8566 茨城県つくば巿東卜卜 1 中央第 6) に寄託されてい る。 実施例 2
新規分泌 ·膜蛋白質遺伝子の発現解析
実施例 1で得られた新規 cDNAをプローブとして用い、 種々の条件下でノ —ザンブロット解析によりこれらの遺伝子の発現の様子を調べた。
まず、 白色脂肪組織における発現と、 発現組織の特異性を解析した。 その 結果、 Sst20- 14は白色脂肪組織特異的な発現を示した。 一方、 Sst2卜 3， Sstl3-ll, Sst9-8, SSU9-15は褐色脂肪組織においても発現が確認された。
Sstl3- 11は、 高脂肪-高スクロース負荷マウスにおいて、 対照マウスと比 較して発現量が上昇した。 また、 肥満モデルマウス ob/obにおいても、 対照 の C57bl6/Jマウスと比較して発現量が上昇した。
Sst21- 3は、 糖尿病モデルマウス db/dbにおいて、 対照の C57bl6/Jマウス と比較して発現量が上昇した。 また、 白色脂肪に分化しうる 3T3-L1細胞に おける発現を調べたところ、 S s 121 - 3は未分化な前駆脂肪細胞でも発現して いた。 Sst20- は、 得られたクローン断片中に、 リポ蛋白質の脂質に結合しうる モチーフを有していた。
さらに、 Sst20_14、 Sstl9-15、 Sstl3- 11、 Sst2ト 3は、 絶食により発現量 が低下し、 絶食後再給餌により発現量が上昇 （回復） した。 実施例 3
完全長 c DN Aのクローニング
実施例 1で得られた 8つの新規分泌もしくは膜蛋白質の cDNA断片につい て、 決定された各々の塩基配列を基に 5' -RACE用遺伝子特異的プライマ一 (GSP1) および 3' -RACE用遺伝子特異的プライマー （GSP2) (Sst20- 14に ついてはそれぞれ配列番号 3 3および 34 ； Sst22-22についてはそれぞれ配 列番号 3 5および 3 6 ； Sst8-5についてはそれぞれ配列番号 3 7および 3 8 ； Sstl9-15についてはそれぞれ配列番号 3 9および 40 ； Sstl3-llにつ いてはそれぞれ配列番号 41および 42 ； Sst9-8についてはそれぞれ配列番 号 43および 44 ； Sst2卜 3についてはそれぞれ配列番号 45および 46 ； Sst20- 6についてはそれぞれ配列番号 47および 48) を設計し、 SMART™ RACE cDNA a即 lification kit (clontech) を用いて 5' -RACEおよび 3， - RACE反応を実施した。 実験は kitの添付書に従って実施した。 C57BL/6Jマ ウスから実施例 1と同様にして全 RNAを抽出した後、 アダプタ一プライマ一 の附加と逆転写反応を行って cDNAを作製した。 この cDNAを铸型として PCR を以下の条件で行った（94 5sec, 72°C 3min=5cycle, 94で 5sec, 69で lOsec, 12V, 3min=5cycle, 94で 5sec， 66 lOsec, 72 3min=40cycle)„ PCR産物を ァガロースゲル電気泳動で分離し、 得られたバンドをゲルか ら切り出して抽出した後、 PCR4-T0P0または pENTR/D-TOPO (いずれも Invitrogen) 中に TAクローニングした。 得られたプラスミドのインサート DNAの配列を常法により決定したところ、 いずれのクローンも完全な 0RFを 含んでいた。 また、 Sst20- 14、 Sst22-22および Sstl9- 15については長さの 異なる 0RFを含む 2種類のクローンが得られた （0RFの長短によりそれぞれ Long formおよ Short formと命名した） 。 これら合計 11種の cDNAクローン がそれぞれ挿入されたプラスミド pCR4-TOP0(SST20- Ulong form), pCR4- T0P0(SST20-14short form), pCR4-T0P0 (SST22-221ong form), pCR4- TOPO(SST22-22short form), pCR4- TOPO (SST8-5)、 pCR4-T0P0(SST19-15l'ong form), pCR4-T0P0(SST19-15short form), pCR4-T0P0(SST13-l 1)、 ENTR/D- T0P0(SST9- 8)、 pCR4-TOPO(SST21-3)および pCR4- T0P0(SST20-6)で大腸菌コン ピテントセル Escherichia coli ToplO (Invitrogen) を形質転換し、 形質転 換体（1) Escherichia coli To i 0/pCR4-TOPO (SST20-141 ong form), (2) Escherichia coli ToplO/pCR4-TOPO(SST20-14short form), (3)
Escherichia coli Topi 0/pCR4-TOPO(SST22-22 long form), (4) Escherichia coli ToplO/pCR4-TOPO(SST22-22short form), (5) Escherichia coli
To lO/pCR4-TOPO(SST8-5), (6) Escherichia coli Topl0/pCR4-T0PO(SST19- 151ong form), (7) Escherichia coli Topi 0/pCR4-T0P0 (SST19-15shor t form), (8) Escherichia coli Topi 0/pCR4-TOPO(SSTl 3-11), (9)
Escherichia coli Topl0/pENTR/D-T0P0(SST9-8) (10) Escherichia coli ToplO/pCR4 - T0P0(SST2卜 3)および（11) Escherichia coli ToplO/pCR4- T0P0(SST20- 6)株を得た。 これらの大腸菌株は、 それぞれ FERM BP-8406, FERM BP- 8407、 FERM BP - 8408、 FERM BP-8409, FERM BP-8402, FERM BP- 8404、 FERM BP - 8405、 FERM BP- 8403、 FERM BP-841K FERM BP - 8413および FERM BP-8412の受託番号を付され、 （1)〜（8)については平成 1 5 (2003) 年 6月 20日付で、 （9)〜（11)については平成 15 (2003) 年 6月 24日 付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （T305 - 8566 茨城県つくば巿東 1一 1— 1 中央第 6) に寄託されている。 実施例 4
前脂肪細胞株 3T3-L1の成熟脂肪細胞への分化に対する作用解析
3T3-L1細胞を 2xl05cells/wellの細胞数で 6-well plateに播種し、 10%ゥ シ胎仔血清（Invitrogen)添加 DMEM(invitrogen)培地中、 37"C下で 7日間培養 後、 培養液を吸引し PBS( Invitrogen)で 2回洗浄後、 0PTI-MEM(Invi trogenn) を 2ml/well添加した。 0PTI-MEM(100 1)および FuGENETM6(10;ti 1、 Roche)を 混合し室温にて 5分間静置したものに、 発現プラスミドである pCMV- Tag4A (Sigma)の EcoRI- Hindi IIクローニングサイ卜に SST20- 14 (Long form) cDNAを挿入して作製した発現用コンストラクト pCMV- SST20- 14を 2^g添加 し、 室温にて 45分間静置した。 該発現コンストラクト含有溶液を上記の 3T3-L1細胞に添加し、 37°Cで 6時間培養した後、 10%ゥシ胎仔血清添加 DMEM 培地中、 37 下で 40時間培養した。 次いで、 分化培地 [250nMデキサメタ ゾン（Sigma)、 0.5mM 1-メチル -3-イソブチルキサンチン（和光純薬）、 10 g/ml インスリン（Sigma)、 10%ゥシ胎仔血清添加 DMEM培地] に交換して 72 時間培養した。 その後、 10%ゥシ胎仔血清添加 DMEM培地中でさらに 8日間培 養した。 培養終了後、 培養液を吸引し、 PBSで 2回洗浄し、 10 ホルマリン (和光純薬）を 2ml加えて 30分間静置した。 蒸留水で 1回洗浄後、 oil red-0 溶液を添加し 10分間染色し、 蒸留水で 2回洗浄後、 風乾し脂肪滴の蓄積を 調べた。 その結果、 SST20- 14を過剰発現させた 3T3-L1細胞は、 対照コント ロール 3T3-L1細胞に比較して、 脂肪滴の蓄積が顕微鏡下による観察で定性 的に半分以下に減少し、 成熟脂肪細胞への分化に影響を与えた。 実施例 5
新規分泌 ·膜蛋白質遺伝子のィンスリン抵抗性惹起因子による発現解析
3T3-L1細胞を 4xl05cells/wellの細胞数で 6-well plateに播種し、 10 ゥ シ胎仔血清（Invitrogen)添加 DMEM(Invitrogen)培地中、 37 下で 5日間培養 後、 分化培地 [250nMデキサメタゾン（Sigma)、 0.5mM 卜メチル -3-イソブチ ルキサンチン（和光純薬）、 10 g/ml インスリン（Sigma)、 10%ゥシ胎仔血清 添加 DMEM培地] に交換し、 さらに 24時間培養した。 分化培地への交換の際、 TNF- (Genzyme Techne)をそれぞれ 1ηΜ、 100pMおよび 10pMの濃度で同時に 添加した。 培養終了後、 PBS(Invitrogen)で洗浄した後、 細胞を回収した。 回収した細胞から総 RNAを RNAeasy ki t (Qiagen)を用いて、 kit添付の手順 書に従って採取した。 採取した総 RNAを用いて、 SST20- 14および内部標準と して用いる 36B4の mRNA発現量を TaqMan PCR (Applied Biosystems)を用いて 定量した。 その結果、 添加した TNF-ひの濃度に依存して SST20-14の発現量 が変動し、 TNF-αの InMの 24時間添加により、 SST20-14の発現量は、 コン トロール （TNF- α無添加） に比較して約 70%の発現低下が認められた。 実施例 6
新規分泌 ·膜蛋白遺伝子のィンスリン抵抗性改善薬による発現解析
3T3-L1細胞を 4xl05cells/wellの細胞数で 6-well plateに播種し、 10%ゥ シ胎仔血清（Invitrogen)添加 DMEM (Invitrogen)培地中、 37°C下で 5日間培養 後、 分化培地 [250nMデキサメタゾン（Sigma)、 0.5mM 卜メチル -3-イソブチ ルキサンチン（和光純薬）、 lO^g/ml インスリン（Sigma)、 10 ゥシ胎仔血清 添加 DMEM培地] に交換した。 分化培地への交換の際、 インスリン抵抗性改 善薬である塩酸ピオダリ夕ゾン（10 M、 武田薬品）を添加し、 インスリン存 在下で 72時間培養した。 培養終了後、 PBS(Invitrogen)で洗浄した後、 細胞 を回収した。 回収した細胞から総 RNAを RNAeasy ki t (Qiagen)を用いて、 kit 添付の手順書に従って採取した。 採取した総 RNAを用いて、 SST8-5および内 部標準として用いる 36B4の mRNA発現量を TaqMan PCR (Ap lied Biosystems) を用いて定量した。 その結果、 塩酸ピオダリ夕ゾンの添加によって SST8-5 の発現量がコントロール （塩酸ピオダリ夕ゾン無添加） と比較して約 2.4倍 に増加した。 産業上の利用可能性
本発明の蛋白質は、 高脂肪食負荷により白色脂肪細胞で発現する分泌もし くは膜蛋白質であることなどから、 脂肪細胞の分化や代謝機能の異常に関連 する疾患の予防 ·治療剤として、 あるいは当該疾患の予防 ·治療に有効な医 薬品候補化合物のスクリーニングのためのツールとして優れた効果を発揮す る。 配列表フリーテキスト
〔配列番号： 31〕
マウス白色脂肪細胞由来分泌もしくは膜蛋白質 cDNA断片を増幅するた めのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 32〕
マウス白色脂肪細胞由来分泌もしくは膜蛋白質 c D N A断片を増幅するた めのプライマーとして機能すべく設計されたォリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 33〕
mSST20-14の全長をコードする塩基配列を同定するための 5' -RACE用遺伝 子特異的プライマーとして機能すべく設計されたォリゴヌクレオチド。 〔配列番号： 34〕
mSST20-14の全長をコードする塩基配列を同定するための 3' -RACE用遺伝 子特異的プライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。 〔配列番号： 35〕
mSST22-22の全長をコードする塩基配列を同定するための 5' -RACE用遺伝 子特異的プライマ一として機能すべく設計されたォリゴヌクレオチド。 〔配列番号： 36〕
mSST22- 22の全長をコードする塩基配列を同定するための 3' -RACE用遺伝 子特異的プライマ一として機能すべく設計されたォリゴヌクレオチド。 〔配列番号： 37〕
mSST8-5の全長をコ一ドする塩基配列を同定するための 5' -RACE用遺伝子 特異的プライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 38〕
mSST8-5の全長をコードする塩基配列を同定するための 3' -RACE用遺伝子 特異的プライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 39〕
mSST19- 15の全長をコ一ドする塩基配列を同定するための 5' -RACE用遺伝 子特異的プライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。 〔配列番号： 40〕
mSST19-15の全長をコードする塩基配列を同定するための 3' -RACE用遺伝 子特異的プライマ一として機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 41〕 mSST13-llの全長をコードする塩基配列を同定するための 5' -RACE用遺伝 子特異的プライマ一として機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 42〕
mSST13-llの全長をコードする塩基配列を同定するための 3' -RACE用遺伝 子特異的プライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。 〔配列番号： 43〕
mSST9-8の全長をコードする塩基配列を同定するための 5' -RACE用遺伝子 特異的プライマ一として機能すべく設計されたォリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 44〕
mSST9-8の全長をコードする塩基配列を同定するための 3' -RACE用遺伝子 特異的プライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 45〕
mSST21-3の全長をコードする塩基配列を同定するための 5' -RACE用遺伝 子特異的プライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。 〔配列番号： 46〕
mSST21-3の全長をコードする塩基配列を同定するための 3' -RACE用遺伝 子特異的プライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
〔配列番号： 47〕
mSST20-6の全長をコ一ドする塩基配列を同定するための 5' -RACE用遺伝 子特異的プライマ一として機能すべく設計されたォリゴヌクレオチド。 〔配列番号： 48〕
mSST20-6の全長をコードする塩基配列を同定するための 3' -RACE用遺伝 子特異的プライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩。
2 . 請求項 1記載の蛋白質もしくは部分べプチドをコ一ドする塩基配列を含 むポリヌクレオチド。
3 . 請求項 2記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結果として 該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列またはその一 部を含むポリヌクレオチド。
4 . 請求項 1記載の蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する 抗体。
5 . 配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩。
6 . 請求項 5記載の蛋白質もしくは部分べプチドをコードする塩基配列を含 むポリヌクレオチド。
7 . 請求項 6記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結果として 該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列またはその一 部を含むポリヌクレオチド。
8 . 請求項 5記載の蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する 抗体。
9 . 配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩。
1 0 . 請求項 9記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基配列を 含むポリヌクレオチド。
1 1 . 請求項 1 0記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結果と して該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列またはそ の一部を含むポリヌクレオチド。
1 2 . 請求項 9記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対す る抗体。
1 3 . 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩。
1 4. 請求項 1 3記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基配列 を含むポリヌクレオチド。
1 5 . 請求項 1 4記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結果と して該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列またはそ の一部を含むポリヌクレオチド。
1 6 . 請求項 1 3記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対 9—る仉体。
1 7 . 配列番号： 1 0で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩。
1 8 . 請求項 1 7記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基配列 を含むポリヌクレオチド。
1 9 . 請求項 1 8記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結果と して該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列またはそ の一部を含むポリヌクレオチド。
2 0 . 請求項 1 7記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体。
2 1 . 配列番号： 1 2で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩。.
2 2 . 請求項 2 1記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基配列 を含むポリヌクレオチド。
2 3 . 請求項 2 2記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結果と して該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列またはそ の一部を含むポリヌクレオチド。
2 4. 請求項 2 1記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体。
2 5 . 配列番号： 1 4で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩。
2 6 . 請求項 2 5記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基配列 を含むポリヌクレオチド。
2 7 . 請求項 2 6記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結果と して該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列またはそ の一部を含むポリヌクレオチド。
2 8 . 請求項 2 5記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体。
2 9 . 配列番号： 1 6で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩。
3 0 . 請求項 2 9記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基配列 を含むポリヌクレオチド。
3 1 . 請求項 3 0記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結果と して該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列またはそ の一部を含むポリヌクレオチド。 '
3 2 . 請求項 2 9記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体。
3 3 . 配列番号： 1 8で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩。
3 4 . 請求項 3 3記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基配列 を含むポリヌクレオチド。
3 5 . 請求項 3 4記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結果と して該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列またはそ の一部を含むポリヌクレオチド。
3 6 . 請求項 3 3記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体。
3 7 . 配列番号： 2 0で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩。
3 8 . 請求項 3 7記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基配列 を含むポリヌクレオチド。
3 9 . 請求項 3 8記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結果と して該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列またはそ の一部を含むポリヌクレオチド。
4 0 . 請求項 3 7記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体。
4 1 . 配列番号： 2 2で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含む蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩。
4 2 . 請求項 4 1記載の蛋白質もしくは部分ペプチドをコードする塩基配列 を含むポリヌクレオチド。
4 3 . 請求項 4 2記載のポリヌクレオチドもしくはプロセッシングの結果と して該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と相補的な塩基配列またはそ の一部を含むポリヌクレオチド。
4 4 . 請求項 4 1記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体。
45. 請求項 1、 5、 9、 13、 17、 21、 25、 29、 33、 37また は 41記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる
46. 請求項 2、 6、 10、 14、 18、 22、 26、 30、 34、 38ま たは 42記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
47. 請求項 3、 7、 11、 15、 19、 23、 27、 31、 35、 39ま たは 43記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
48. 請求項 4、 8、 12、 16、 20、 24、 28、 32、 36、 40ま たは 44記載の抗体を含有してなる医薬。
49. 脂肪細胞の分化および/または代謝機能の異常が関与する疾患の予 防 ·治療剤である請求項 45〜48のいずれかに記載の医薬。
50. 請求項 2、 6、 10、 14、 18、 22、 26、 30、 34、 38も しくは 42記載のポリヌクレオチドまたはその一部を含有してなる診断薬。
51. 請求項 3、 7、 11、 15、 19、 23、 27、 31、 35、 39ま たは 43記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
52. 請求項 4、 8、 12、 16、 20、 24、 28、 32、 36、 40ま たは 44記載の抗体を含有してなる診断薬。
53. 脂肪細胞の分化および/または代謝機能の異常が関与する疾患の診断 用である請求項 50〜 52のいずれかに記載の診断薬。
54. 請求項 1、 5、 9、 13、 17、 21、 25、 29、 33、 37また は 41記載の蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を用いることを 含む、 該蛋白質またはその塩に対して特異的親和性を有する化合物またはそ の塩、 あるいは該蛋白質またはその塩と該化合物またはその塩との結合性を 変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
55. 請求項 1、 5、 9、 13、 17、 21、 25、 29、 33、 37また は 41記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含んでなる、 該蛋白質またはその塩に対して特異的親和性を有する化合物またはその塩、 あるいは該蛋白質またはその塩と該化合物またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
56. 請求項 54記載の方法または請求項 55記載のキットを用いて得られ うる化合物またはその塩を含有してなる医薬。
57. 脂肪細胞の分化および/または代謝機能の異常が関与する疾患の予 防 ·治療剤である請求項 56記載の医薬。
58. 請求項 2、 6、 10'、 14、 18、 22、 26、 30、 34、 38も しくは 42記載のポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特徴とす る、 請求項 1、 5、 9、 13、 17、 21、 25、 29、 33、 37または 41記載の蛋白質をコ一ドする遺伝子の発現量を変化させる化合物またはそ の塩のスクリーニング方法。
59. 請求項 2、 6、 10、 14、 18、 22、 26、 30、 34、 38も しくは 42記載のポリヌクレオチドまたはその一部を含んでなる、 請求項 1 5、 9、 13、 17、 21、 25、 29、 33、 37または 41記載の蛋白 質をコードする遺伝子の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリー ニング用キッ卜。
60. 請求項 58記載の方法または請求項 59記載のキットを用いて得られ うる化合物またはその塩を含有してなる医薬。
61. 脂肪細胞の分化および/または代謝機能の異常が関与する疾患の予 防 ·治療剤である請求項 60記載の医薬。
62. 請求項 4、 8、 12、 16、 20、 24、 28、 32、 36、 40ま たは 44記載の抗体を用いることを特徴とする、 細胞膜もしくは細胞外液に おける請求項 1、 5、 9、 13、 17、 21、 25、 29、 33、 37また は 41記載の蛋白質またはその塩の量を変化させる化合物またはその塩のス クリーニング方法。
63. 請求項 4、 8、 12、 16、 20、 24、 28、 32、 36、 40ま たは 44記載の抗体を含んでなる、 細胞膜もしくは細胞外液における請求項 1、 5、 9、 13、 17、 21、 25、 29、 33、 37または 41記載の 蛋白質またはその塩の量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング 用キット。
64. 請求項 62記載の方法または請求項 63記載のキッ卜を用いて得られ うる化合物またはその塩を含有してなる医薬。
65. 脂肪細胞の分化および または代謝機能の異常が関与する疾患の予 防 ·治療剤である請求項 64記載の医薬。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7638270B2 (en) 2003-01-24 2009-12-29 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 254P1D6B useful in treatment and detection of cancer

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110104666A1 (en) * 2009-11-02 2011-05-05 Toshiya Matsubara Insulin resistance marker
JP7311620B2 (ja) 2019-03-08 2023-07-19 メビオン・メディカル・システムズ・インコーポレーテッド 粒子線治療システムのためのコリメータおよびエネルギーデグレーダ

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000053758A2 (en) * 1999-03-08 2000-09-14 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
WO2001000638A2 (en) * 1999-06-29 2001-01-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes encoding proteins having diagnostic, preventive, therapeutic, and other uses
WO2001048192A1 (en) * 1999-12-23 2001-07-05 Genesis Research & Development Corporation Limited Polynucleotides, polypeptides expressed by the polynucleotides and methods for their use
WO2001051636A2 (en) * 2000-01-14 2001-07-19 Incyte Genomics, Inc. Secreted proteins
WO2001053312A1 (en) * 1999-12-23 2001-07-26 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
WO2001057188A2 (en) * 2000-02-03 2001-08-09 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
WO2001064835A2 (en) * 2000-02-28 2001-09-07 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
WO2001090357A1 (en) * 2000-05-24 2001-11-29 Genesis Research & Development Corporation Limited Compositions isolated from skin cells and methods for their use
WO2002022886A2 (en) 2000-09-18 2002-03-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Expression of genes in diabetes mellitus and insulin resistance
US20030032155A1 (en) * 1997-03-31 2003-02-13 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE447583T1 (de) 1997-09-17 2009-11-15 Genentech Inc Polypeptide und dafür kodierende nukleinsäure
US20030040471A1 (en) * 1998-04-29 2003-02-27 Watson James D. Compositions isolated from skin cells and methods for their use
AU2001250932A1 (en) * 2000-03-23 2001-10-03 Diadexus, Inc. Compositions and methods of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating prostate cancer
US20020197679A1 (en) * 2000-06-20 2002-12-26 Tang Y. Tom Novel nucleic acids and polypeptides

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030032155A1 (en) * 1997-03-31 2003-02-13 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2000053758A2 (en) * 1999-03-08 2000-09-14 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
WO2001000638A2 (en) * 1999-06-29 2001-01-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes encoding proteins having diagnostic, preventive, therapeutic, and other uses
WO2001048192A1 (en) * 1999-12-23 2001-07-05 Genesis Research & Development Corporation Limited Polynucleotides, polypeptides expressed by the polynucleotides and methods for their use
WO2001053312A1 (en) * 1999-12-23 2001-07-26 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
WO2001051636A2 (en) * 2000-01-14 2001-07-19 Incyte Genomics, Inc. Secreted proteins
WO2001057188A2 (en) * 2000-02-03 2001-08-09 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
WO2001064835A2 (en) * 2000-02-28 2001-09-07 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
WO2001090357A1 (en) * 2000-05-24 2001-11-29 Genesis Research & Development Corporation Limited Compositions isolated from skin cells and methods for their use
WO2002022886A2 (en) 2000-09-18 2002-03-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Expression of genes in diabetes mellitus and insulin resistance

Non-Patent Citations (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Immune-chemical Techniques", vol. 84, ACADEMIC PRESS PUBLISHING
"Immunochemical Techniques", ACADEMIC PRESS PUBLISHING
"Immunochemical Techniques", vol. 121, ACADEMIC PRESS PUBLISHING
"Immunochemical Techniques", vol. 74, ACADEMIC PRESS PUBLISHING
"Irnmunochemical Techniques", vol. 92, ACADEMIC PRESS PUBLISHING
"Radioimmunoassay", 1974, KODANSHA LTD.
"Sequel to the Radioimmunoassay", 1979, KODANSHA LTD.
ARITA, Y. ET AL., BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS (BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 257, no. 1, 1999, pages 79 - 83
DATABASE GENBANK [online] 1 February 2002 (2002-02-01), Database accession no. (BC022616) *
DATABASE GENBANK [online] 1 March 2002 (2002-03-01), Database accession no. (BC024888) *
DATABASE GENBANK [online] 1 May 2002 (2002-05-01), STRAUSBERG R.L. ET AL.: "Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences", XP002981511, Database accession no. (BC028869) *
DATABASE GENBANK [online] 10 July 2000 (2000-07-10), ADACHI J. ET AL.: "RIKEN functional annotation of a full-length mouse cDNA collection", XP002981507, Database accession no. (AK017880) *
DATABASE GENBANK [online] 10 July 2000 (2000-07-10), ADACHI J. ET AL.: "RIKEN functional annotation of a full-length mouse cDNA collection", XP002981510, Database accession no. (AK009771) *
DATABASE GENBANK [online] 10 July 2000 (2000-07-10), ADACHI J. ET AL.: "RIKEN Funtional annotation of a full-length mouse cDNA collection", XP002981505, Database accession no. (AK007787) *
DATABASE GENBANK [online] 10 July 2000 (2000-07-10), Database accession no. (AK012437) *
DATABASE GENBANK [online] 16 April 2002 (2002-04-16), Database accession no. (AK077118) *
DATABASE GENBANK [online] 16 April 2002 (2002-04-16), Database accession no. (AK080754) *
DATABASE GENBANK [online] 16 April 2002 (2002-04-16), Database accession no. (AK082963) *
DATABASE GENBANK [online] 16 April 2002 (2002-04-16), Database accession no. (AK084668) *
DATABASE GENBANK [online] 16 July 2001 (2001-07-16), ADACHI J. ET AL.: "RIKEN functional annotation of a full-length mouse cDNA collection", XP002981509, Database accession no. (AK030584) *
DATABASE GENBANK [online] 16 July 2001 (2001-07-16), ADACHI J. ET AL.: "RIKEN functional annotation of a full-length mouse cDNA collection", XP002981512, Database accession no. (AK043006) *
DATABASE GENBANK [online] 16 July 2001 (2001-07-16), Database accession no. (AK035957) *
DATABASE GENBANK [online] 16 July 2002 (2002-07-16), Database accession no. (AK082495) *
DATABASE GENBANK [online] 29 October 2001 (2001-10-29), STRAUSBERG R.L. ET AL.: "Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences", XP002981508, Database accession no. (BC016252) *
DATABASE GENBANK [online] 4 September 2001 (2001-09-04), STRAUSBERG R.L. ET AL.: "Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences", XP002981506, Database accession no. (BC013497) *
EMANUELSSON ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 300, 2000, pages 1005 - 1016
ERDING HU ET AL.: "AdipoQ is a novel adipose-specific gene dysregulated in obesity", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 271, no. 18, 1996, pages 10697 - 10703, XP002096544 *
ERDING HU, JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 271, no. 18, 1996, pages 10697 - 10703
GENOMICS, vol. 5, 1989, pages 874 - 879
HEIJNE, NUCL. ACIDS RES., vol. 14, 1986, pages 4683
J. SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LAB. PRESS
KAZUHISA MAEDA ET AL.: "Analysis of an expression profile of genes in the human adipose tissue", GENE, vol. 190, 1997, pages 227 - 235, XP002136672 *
KAZUHISA MAEDA, GENE, vol. 190, 1997, pages 227 - 235
KEE-HONG KIM ET AL.: "A cysteine-rich adipose tissue-specific secretory factor inhibits adipocyte differentiation", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 276, no. 14, 2001, pages 11252 - 11256, XP002973338 *
KEE-HONG KIM, JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 276, no. 14, 2001, pages 11252 - 11256
KISHIDA, K. ET AL., JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY (J. BIOL. CHEM., vol. 275, no. 27, 2000, pages 20896 - 20902
NAMBI, P. ET AL., JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY (J. BIOL. CHEM., vol. 267, 1992, pages 19555 - 19559
NATURE, vol. 411, no. 6836, 2001, pages 494 - 498
NUCLEIC ACIDS RES., vol. 29, no. 13, 2001, pages 2780 - 2788
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 98, no. 10, 2001, pages 5572 - 5577
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 86, 1989, pages 2766 - 2770
See also references of EP1541677A4
SYLVAIN BAULANDE ET AL.: "Adiponutrin, a transmembrane protein corresponding to a novel dietary- and obesity-linked mRNA specifically expressed in the adipose lineage", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 276, no. 36, 2001, pages 33336 - 33344, XP002973337 *
SYLVAIN BAULANDE, JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 276, no. 36, 2001, pages 33336 - 33344

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7638270B2 (en) 2003-01-24 2009-12-29 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 254P1D6B useful in treatment and detection of cancer
US8460881B2 (en) 2003-01-24 2013-06-11 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 254P1D6B useful in treatment and detection of cancer

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