CN103865938A

CN103865938A - 艰难梭菌外毒素a羧基端序列密码子优化基因片段、表达载体构建方法及其表达蛋白的应用

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Publication number: CN103865938A
Application number: CN201210568057.2A
Authority: CN
Inventors: 刘红; 冯东晓; 邢平平; 徐从伦; 李敏; 郭桂平; 于锦丽; 赵志伟
Original assignee: SHANDONG INTERNATIONAL BIOTECHNOLOGY PARK DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: Lvye Investment Group Co., Ltd.; Shandong International Biotechnology Park Development Co., Ltd.
Priority date: 2012-12-16
Filing date: 2012-12-16
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2032-12-16
Also published as: CN103865938B

Abstract

本发明涉及密码子改造的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段、表达载体构建方法及其在大肠杆菌中的高效表达。该密码子改造后的基因序列既兼顾大肠杆菌密码子使用偏好，又降低了原始基因重复序列对于基因合成和表达的影响。本研究所涉及的高效表达载体由密码子改造后的艰难梭菌外毒素A羧基端基因与原核表达载体pET32b(+)组成，经IPTG诱导后可以高表达出带His标签的融合蛋白。该融合蛋白经凝血酶酶切后可以释放艰难梭菌外毒素A羧基端约872个氨基酸片段。本研究中经密码子改造的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段可以大肠杆菌中高效融合表达，纯化后的蛋白作为抗原可用于制备抗艰难梭菌外毒素A抗体和抗艰难梭菌感染疫苗的制备。

Description

艰难梭菌外毒素A羧基端序列密码子优化基因片段、表达载体构建方法及其表达蛋白的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及密码子改造的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段、表达载体构建方法及其在大肠杆菌中的高效表达方法。

背景技术

艰难梭菌是一种革兰氏阳性、产芽孢、专性厌氧的梭状杆菌，是目前医院内感染的主要致病因素。艰难梭菌的感染是接触性传播，可通过口-粪途径定植在结肠，并可通过与患者、被污染设备或物品(例如便盆、澡盆和电子直肠温度计)直接接触，医护人员间接接触，经过几天到8周的潜伏期，引起医院内艰难梭菌感染暴发。艰难梭菌治疗的难点在于作为休眠形式的芽孢可以耐受多种消毒剂，使其可以在医院环境中长期存在，因而一旦医院发生艰难梭菌感染暴发，难以在短时间内根除。

艰难梭菌毒性主要源于其表达的两种外毒素，毒素A和毒素B。这两种毒素都属于糖基转移酶类，可以使Rho蛋白家族的GTP酶失活。毒素A既是一种肠毒素又是一种细胞毒素，是艰难梭菌的主要毒力因子。研究表明，毒素A通过其羧基端与靶细胞表面受体结合来发挥毒性作用。已有研究证明抗艰难梭菌毒素A羧基端的抗体可以有效的中和其肠毒性和细胞毒性，从而对艰难梭菌的治疗起到积极作用。所以，艰难梭菌外毒素A羧基端是抗体开发的理想靶标，而通过合适的方法获得外毒素A羧基端片段是制备及检测其抗体的基础。

CN 101870978A中公开了一种即可在大肠杆菌中表达又可在哺乳动物中表达的密码子优化后的艰难梭菌毒素A羧基端序列，由于其兼顾性，存在原核表达系统与真核表达系统在密码自偏爱性方面的差异，其在大肠杆菌中的表达效率并不是很高。

发明内容

本发明提供一种可在大肠杆菌等原核系统中高效表达的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段，以及表达后的蛋白作为抗原在制备抗艰难梭菌外毒素A抗体和抗艰难梭菌感染疫苗中的应用。

本发明提供一种优化多重复区基因的方法，即以每个独立重复区的保守序列为模块进行多种密码子优化，再将优化后的模块进行组合得到多种重复性低且适于相应表达系统的新基因序列。

本发明还提供一种新的重组载体构建方法，运用多片段连接体系，即目的片段分两段或多段合成，后与载体同时连接的策略构建重组载体。

为实现上述目的，本发明提供了一种密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列，其是将艰难梭菌外毒素A原始序列重复区中保守氨基酸序列(conservative aa sequence，CAS)的密码子优化为大肠杆菌中使用频率高的兼并性密码子，优化后的基因序列可在大肠杆菌中表达，而氨基酸序列不变。不同保守区的多种密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因重复序列的DNA序列(表2)，根据同源性分析选取的11个保守氨基酸序列命名为CAS1-11，其中，CAS1密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1-5中的任一种序列，CAS2密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7，CAS3密码子优化后的核苷酸序列选自SE QID NO.8或SEQ ID NO.9，CAS4密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11，CAS5密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13，CAS6密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15，CAS7密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17，CAS8密码子优化后的核苷酸序列选自SEQID NO.18或SEQ ID NO.19，CAS9密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.20-24中的任一种序列，CAS10密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26，CAS11密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.28。由这些不同保守区的多种优化的重复序列可相互组合拼接成适合在大肠杆菌中表达的的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列。其中随机选取其中的三种优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列分别为：第一种优化组合具有SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列、第二种优化组合具有SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列，第三种优化组合具有SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列。本发明设计合成了既符合大肠杆菌密码子偏爱性的毒素A羧基端核苷酸序列，同时通过同义密码子替换改善了原始序列多重复区对化学基因合成的影响，降低了合成成本；并且优化是在保证艰难梭菌外毒素A羧基端氨基酸序列不变的情况下，通过密码子改变对羧基端基因重复序列进行调整，充分考虑大肠杆菌密码子利用偏好进行基因序列优化，所获得的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段可在大肠杆菌原核系统中高效表达。

本发明还提供了上述经优化后的基因片段表达的蛋白及其在制备抗艰难梭菌外毒素A抗体和抗艰难梭菌感染疫苗中的应用。

本发明还提供了一种优化多重复区基因序列的方法，包括以每个独立重复区的保守序列为模块进行多种适应于表达系统的密码子优化，优化后的氨基酸序列不变，再将优化后的模块进行组合得到多种重复性低且适于表达的新基因序列。其中重复区基因序列可为艰难梭菌外毒素A羧基端基因重复序列。所述表达系统为大肠杆菌表达系统。

本发明进一步提供了一种重组表达载体的构建方法，包括如下步骤：

A)将待表达的基因分成多段合成，一种优化的方案是分成两段合成，每段基因两端设计合适酶切位点；

B)通过PCR或限制性内切酶消化的方法获得与待表达的基因连接有对应酶切位点的载体。

C)将步骤A中获得的基因片段及步骤B获得的载体分别酶切回收后，在DNA连接酶作用下进行连接，获得含待表达基因的重组载体。

上述重组表达载体的构建方法中，基因片段可人工合成或用其他方法获得。

其中待表达的基因可为艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列或其优化后的基因序列。

本发明创新的运用了多片段同时连接的策略，优选两片段连接，获得了高表达毒素A羧基端融合蛋白的重组质粒及工程菌；其所表达的毒素A羧基端蛋白具有凝血作用及肠毒性，与毒素A蛋白的功能一致。

附图说明

图1艰难梭菌毒素A羧基端重复区示意图；

图2艰难梭菌毒素A羧基端重复区氨基酸序列同源性分析；

图3三片段连接过程及重组质粒图谱；

图4表达载体转化子质粒电泳结果；

图5表达载体转化子质粒XhoI单酶切电泳结果；

图6表达载体转化子质粒XhoI与EcoRV双酶切电泳结果；

图7表达载体转化子质粒XhoI与XbaI双酶切电泳结果；

图8表达载体转化子质粒EcoRI与XbaI双酶切电泳结果；

图9艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白诱导表达SDS-PAGE电泳结果图，其中，M：TAKARA蛋白质分子标准(低)，1：诱导前菌体样本，2：3h诱导菌体样本，3：8h诱导菌体样本；

图10毒素A羧基端融合蛋白纯化电泳结果图，其中样品采用NTA梯度洗脱；

图11毒素A羧基端融合蛋白纯化后超滤浓缩电泳结果图，其中，M、Takara分子量标准(低)；A、纯化后毒素A融合蛋白；

图12(His)6标签与毒素A羧基端融合蛋白经凝血酶酶切后电泳结果图，其中，M、Takara分子量标准(低)；A、凝血酶酶切后毒素A蛋白；

图13艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白(毒素A-DE3-1)凝血活性测定结果图；图中数字分别表示：1、空白对照；2、0.05μg；3、0.1μg；4、0.2μg；5、0.3μg；6、0.4μg；7、0.5μg；8、0.6μg；

图14艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-2凝血活性测定结果图；图中数字分别表示：1、空白对照；2、0.05μg；3、0.1μg；4、0.15μg；5、0.2μg；6、0.25μg；7、0.3μg；8、0.35μg；9、0.4μg；10、0.5μg；

图15艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-3凝血活性测定结果图，图中数字分别表示：1、空白对照；2、0.05μg；3、0.1μg；4、0.15μg；5、0.2μg；6、0.25μg；7、0.3μg；8、0.35μg；9、0.4μg；10、0.5μg；

图16艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-1注射给药肠毒性实验测定结果图；

图17艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-2注射给药肠毒性实验测定结果图；

图18艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-3注射给药肠毒性实验测定结果图；

图19免疫毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-1后小鼠血清中抗体产生情况图；

图20免疫毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-2后小鼠血清中抗体产生情况图；

图21免疫毒素A羧基端蛋白毒素A-DE3-3后小鼠血清中抗体产生情况图。

具体实施方式

本发明通过分段合成密码子优化后的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段，经分子克隆技术构建重组表达质粒pET32b(+)-TcdA-C。重组质粒转化表达宿主BL21(DE3)菌株后可被IPTG诱导表达，融合蛋白经相关鉴定为目的蛋白。另经凝血酶酶切后，可以释放完整的艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白，凝集试验表明该方法表达的毒素A羧基端蛋白有凝集活性。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。

实施例1密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列设计

选取艰难梭菌外毒素A基因羧基端2616个碱基序列(共编码872个氨基酸)，分析该编码序列，找出影响基因合成的重复序列，重复区示意图见图1。同时分析该序列与大肠杆菌密码子使用偏好不同的位点，用高频密码子替换低频密码子；另外，在兼顾大肠杆菌密码子偏好的基础上，用高频或中频密码子对重复区内的序列进行同义密码子替换，获得新的优化后的密码基因序列。

密码子改造的方法包括以下方面，即根据对重复区氨基酸序列的同源性分析(见图2)，找出了同源性相近的保守氨基酸序列(conservative aa sequence，CAS)，对这些保守氨基酸序列进行不同种类的同义密码子替换从而形成多种新核酸模块，这些核酸模块在不改变氨基酸序列的前提下可以置于不同的相关重复区内，均不影响艰难梭菌毒素A羧基端基因的转录与翻译。例如，重复区R4与R9的氨基酸序列完全相同，故优化后的R4与R9序列位置可以互换；重复区R5与R15仅有一个氨基酸的差异，两个保守序列也可以有多种组合，并且保证氨基酸序列不发生改变。也就是说，针对保守区氨基酸序列优化得到的新核酸模块的位置可以在含相关CAS的不同的重复区内进行互换，在保证氨基酸序列不发生改变的前提下可以形成多种新的基因序列，这些新序列均可用来在体外表达艰难梭菌毒素A羧基端蛋白。表1显示同源性相近的重复区内的保守序列：

表1：艰难梭菌外毒素A羧基端重复区及相关保守序列

对表1中所示保守序列进行多种优化，优化结果如表2所示：

表2：艰难梭菌外毒素A羧基端重复区内保守序列的多种优化结果

表2中保守区核苷酸序列的优化方式可相互组合成优化的艰难梭菌毒素A羧基端基因，多种组合方式均可正常转录和翻译。本发明随机选取其中的三种优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列分别为：第一种优化组合具有SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列、第二种优化组合具有SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列，第三种优化组合具有SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列。

实施例2密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列合成

根据上述实施例1的优化原则，参考大肠杆菌密码子偏爱性设计出相应的核苷酸序列，将密码子优化后的艰难梭菌外毒素A基因羧基端基因分两段送出基因合成，。每段基因两端设计酶切位点以便后续分子克隆。

第一种优化组合序列SEQ ID NO.29片段1(SEQ ID NO.32)合成序列如下，其序列包含在5’端引入限制性酶切位点EcoRV酶切识别序列“GATATC”，在3’端引入EcoRI酶切识别序列“GAATTC”：

5’gatatctcat tattctattt tgatcctata gaatttaact tagtaacagg atggcaaact 60

atcaacggca agaaatatta cttcgatata aatactggag cagctttaac tagttataag 120

attattaatg gtaaacactt ttactttaat aatgatggtg tgatgcagct gggagtattt 180

aaaggacctg atggatttga atattttgca cctgccaata ctcaaaataa taacatagaa 240

ggtcaggcta tagtttatca gagcaagttc ctgacgctga acggcaagaa gtactatttc 300

gacaacaata gcaaggccgt cactggatgg agaattatta acaatgagaa gtactatttc 360

aaccctaata atgctattgc tgcagtcgga ctgcaggtaa tcgacaataa taagtactat 420

ttcaaccctg acaccgccat catctcaaaa ggttggcaga cagttaatgg cagtagatac 480

tatttcgata ctgataccgc gattgccttt aatggctaca aaactatcga tgggaagcac 540

ttctacttcg atagtgactg tgtagtgaaa ataggtgtgt ttagtacctc taatggattt 600

gaatattttg cacctgctaa tacttataat aataacatag aaggtcaggc tatagtttat 660

caaagtaaat tcttaactct gaatggtaaa aaatattact ttgataataa ctcaaaagca 720

gttaccggac tgcaaactat tgatagtaaa aaatattact ttaatactaa cactgctgaa 780

gcagctactg gatggcaaac tattgatggt aaaaaatatt actttaatac taacactgct 840

gaagcagcta ctggatggca aactattgat ggtaaaaaat attactttaa tactaacact 900

gctatagctt caactggtta tacaattatt aatggtaaac atttttattt taatactgat 960

ggtattatgc agataggagt gtttaaagga cctaatggat ttgaatattt tgcacctgct 1020

aatacggatg ctaacaacat agaaggtcaa gctatactgt accagaatga atttctgaca 1080

ctgaacggaa agaaatacta ctttggtagt gacagtaaag ccgtgactgg ctggagaatt 1140

atcaacaata agaaatacta ttttaatcct aataatgcta ttgctgcaat tcatctgtgc 1200

actataaata atgacaagta ttactttagt tatgatggaa ttctg 3’ 1245

第一种优化组合序列SEQ ID NO.29片段2(SEQ ID NO.33)合成序列如下，其序列包含在5’端引入限制性酶切位点EcoRI酶切识别序列“GAATTC”，在3’端引入XhoI酶切识别序列“CTCGAG”：

5’

gaattctgca aaatggatat attactattg aaagaaataa tttctatttt gatgctaata 60

atgaatctaa aatggtaaca ggagtattta aaggacctaa tggatttgag tattttgcac 120

ctgctaatac tcacaataat aacatagaag gtcaggctat agtttaccag aacaagttcc 180

tgacgcttaa cggtaagaag tattattttg ataatgactc aaaagcagtt actggatggc 240

aaaccattga tggcaagaaa tattatttca atctgaacac tgctgaagca gctactggat 300

ggcaaacgat cgatggaaaa aagtactact ttaatctgaa tacagcagaa gcagctacag 360

gctggcaaac aatcgatggt aagaaatatt actttaatac taacactttc atagcctcta 420

caggatatac aagtattaat ggtaaacatt tttattttaa tactgatggt attatgcaga 480

taggagtgtt taaaggacct aatggatttg aatactttgc acctgctaat acggatgcta 540

acaacataga aggtcaagct atactgtacc aaaataaatt cttaactctg aatggtaaaa 600

aatattactt tggtagtgac tcaaaagcag ttaccggact gcgtactatt gatggtaaaa 660

aatattactt taatactaac actgctgttg cagttactgg atggcaaact attaatggta 720

aaaaatacta ctttaatact aacacttcta tagcttcaac tggttataca attattagtg 780

gtaaacattt ttattttaat actgatggta ttatgcagat aggagtgttt aaaggacctg 840

atggatttga atactttgca cctgctaata cagatgctaa caatatagaa ggtcaagcta 900

tacgttatca gaaccgtttt ctgtatctgc atgacaatat ttattatttt ggcaacaact 960

ctaaagcggc tacaggttgg gtaaccattg atggcaatag atactacttc gagccgaata 1020

cagcaatggg tgcgaatggt tataaaacta ttgataataa aaatttttac tttagaaatg 1080

gtttacctca gataggagtg tttaaagggt ctaatggatt tgaatacttt gcacctgcta 1140

atacggatgc taacaatata gaaggtcaag ctatacgtta tcaaaataga ttcctgcatt 1200

tactgggaaa aatatattac tttggtaata attcaaaagc agttactgga tggcaaacta 1260

ttaatggtaa agtatattac tttatgcctg atactgctat ggctgcagct ggtggactgt 1320

tcgagattga tggtgttata tatttctttg gtgttgatgg agtaaaagcc cctgggatat 1380

atggctaatg aaagcttgcg gccgcactcg ag 3’ 1412

第二种优化组合序列SEQ ID NO.30片段1(SEQ ID NO.34)合成序列如下，其序列包含在5’端引入限制性酶切位点EcoRV酶切识别序列“GATATC”，在3’端引入EcoRI酶切识别序列“GAATTC”：

5’gatatctcattattctattttgatcctatagaatttaacttagttactggatggcaaactattaatggtaaaaaatactactttgatataaatactggagcagctttaactagttataagattattaatggtaaacatttttattttaataatgatggtgtgatgcagctgggagtatttaaaggacctgatggatttgaatattttgcacctgccaatactcaaaataataacatagaaggtcaggctatagtttatcagagcaagtttctgacgctgaacggcaagaagtactatttcgacaacaatagcaaggccgtcaccggctggcgcatcatcaataacgagaagtactacttcaaccctaacaatgcaatcgctgcagtcggactgcaggtaatcgacaataataagtactatttcaaccctgacaccgccatcatctcaaaaggttggcagacagttaatggcagtagatactatttcgatactgataccgcgattgcctttaatggctacaaaactatcgatgggaagcacttctacttcgatagtgactgtgtagtgaaaataggtgtgtttagtacctctaatggatttgaatattttgcacctgctaatacttataataataacatagaaggtcaggctatagtttatcaaagtaaatttctgacactgaacggaaagaaatactactttgataataactcaaaagcagttaccggactgcaaactattgatagtaaaaaatattactttaatactaacactgctgaagcagctacaggttggcagaccattgatggtaaaaaatactacttcaatactaacactgctgaagcagctaccggctggcaaaccattgatggcaagaagtattattttaacactaacactgctatagcttcaactggttatacaattattaatggtaaacatttttattttaatactgatggtattatgcagataggagtgtttaaaggacctaatggatttgaatattttgcacctgctaatacggatgctaacaacatagaaggtcaagctatactgtaccagaatgaatttctgacgctgaacggcaagaagtactatttcggtagtgacagtaaagccgtcaccggctggcgcatcatcaataacaagaagtactacttcaaccctaacaatgcaatcgctgcaattcatctgtgcactataaataatgacaagtattactttagttatgatggaattctg 3’

第二种优化组合序列SEQ ID NO.30片段2(SEQ ID NO.35)合成序列如下，其序列包含在5’端引入限制性酶切位点EcoRI酶切识别序列“GAATTC”，在3’端引入XhoI酶切识别序列“CTCGAG”：

5’gaattctgcaaaatggatatattactattgaaagaaataatttctattttgatgctaataatgaatctaaaatggtaacaggagtatttaaaggacctaatggatttgagtattttgcacctgctaatactcacaataataacatagaaggtcaggctatagtttaccagaacaagttcttaaccttaaatggcaaaaaatactacttcgataatgactcaaaagcagttaccggctggcaaaccattgatggcaagaagtattattttaacctgaacactgctgaagcagctacaggttggcagaccattgatggtaaaaaatactacttcaatctgaatacagcagaagcagctaccggctggcaaaccattgatggcaagaagtattattttaacactaacactttcatagcctctacaggatatacaagtatcaatggcaaacacttctacttcaatactgatggtattatgcagataggagtgtttaaaggacctaatggatttgaatactttgcacctgctaatacggatgctaacaacatagaaggtcaagctatactgtaccaaaataaatttctgacactgaacggaaagaaatactactttggtagtgactcaaaagcagttaccggactgcgtactattgatggtaaaaaatattactttaatactaacactgctgttgcagtaacaggatggcaaactatcaacggcaagaaatattacttcaatactaacacttctatagctagtaccggctacaccattattagtggcaagcacttctatttcaataccgacggcattatgcagataggagtgtttaaaggacctgatggatttgaatactttgcacctgctaatacagatgctaacaatatagaaggtcaagctatacgttatcagaaccgttttctgtatctgcatgacaatatttattattttggcaacaactctaaagcggctacaggttgggtaaccattgatggcaatagatactacttcgagccgaatacagcaatgggtgcgaatggatacaagacaatcgacaataaaaatttttactttagaaatggtttacctcagataggagtgtttaaagggtctaatggatttgaatactttgcacctgctaatacggatgctaacaatatagaaggtcaagctatacgttatcagaaccgttttctgcatttactgggaaaaatttattattttggcaacaactctaaagcggttactggatggcaaactattaatggtaaagtatattactttatgcctgatactgctatggctgcagctggtggactgttcgagattgatggtgttatatatttctttggtgttgatggagtaaaagcccctgggatatatggctaatgaaagcttgcggccgcactcgag3’

第三种优化组合序列SEQ ID NO.31片段1(SEQ ID NO.36)合成序列如下，其序列包含在5’端引入限制性酶切位点EcoRV酶切识别序列“GATATC”，在3’端引入EcoRI酶切识别序列“GAATTC”：

5’gatatctcattattctattttgatcctatagaatttaacttagttactggatggcaaactattaatggtaaaaaatactactttgatataaatactggagcagctttaactagttataagattattaatggtaaacatttttattttaataatgatggtgtgatgcagctgggagtatttaaaggacctgatggatttgaatattttgcacctgccaatactcaaaataataacatagaaggtcaggctatagtttatcagagcaagttcctgacgcttaacggtaagaagtattattttgacaacaatagcaaggccgtcaccggctggcgcatcatcaataacgagaaatattatttcaatccgaataacgccattgctgcagtcggactgcaggtaatcgacaataataagtactatttcaaccctgacaccgccatcatctcaaaaggttggcagacagttaatggcagtagatactatttcgatactgataccgcgattgcctttaatggctacaaaactatcgatgggaagcacttctacttcgatagtgactgtgtagtgaaaataggtgtgtttagtacctctaatggatttgaatattttgcacctgctaatacttataataataacatagaaggtcaggctatagtttatcaaagtaaatttctgacactgaacggaaagaaatactactttgataataactcaaaagcagttaccggactgcaaactattgatagtaaaaaatattactttaatactaacactgctgaagcagctacaggttggcagaccattgatggtaaaaaatactacttcaatactaacactgctgaagcagctacaggctggcaaacaatcgatggtaagaaatattacttcaatactaacactgctatagcttcaactggttatacaattattaatggtaaacatttttattttaatactgatggtattatgcagataggagtgtttaaaggacctaatggatttgaatattttgcacctgctaatacggatgctaacaacatagaaggtcaagctatactgtaccagaatgaatttctgacgctgaacggcaagaagtactatttcggtagtgacagtaaagccgtcaccggctggcgcatcatcaataacaagaagtactacttcaaccctaacaatgcaatcgctgcaattcatctgtgcactataaataatgacaagtattactttagttatgatggaattctg 3’

第三种优化组合序列SEQ ID NO.31片段2(SEQ ID NO.37)合成序列如下，其序列包含在5’端引入限制性酶切位点EcoRI酶切识别序列“GAATTC”，在3’端引入XhoI酶切识别序列“CTCGAG”：

5’gaattctgcaaaatggatatattactattgaaagaaataatttctattttgatgctaataatgaatctaaaatggtaacaggagtatttaaaggacctaatggatttgagtattttgcacctgctaatactcacaataataacatagaaggtcaggctatagtttaccagaacaagttcttaaccttaaatggcaaaaaatactacttcgataatgactcaaaagcagttactggatggcaaactattgatggtaaaaaatattactttaatctgaacactgctgaagcagctacaggttggcagaccattgatggtaaaaaatactacttcaatctgaatacagcagaagcagctaccggctggcaaaccattgatggcaagaagtattattttaacactaacactttcatagcctctacaggatatacaagtatcaatggcaaacacttctacttcaatactgatggtattatgcagataggagtgtttaaaggacctaatggatttgaatactttgcacctgctaatacggatgctaacaacatagaaggtcaagctatactgtaccaaaataaattcttaactctgaatggtaaaaaatattactttggtagtgactcaaaagcagttaccggactgcgtactattgatggtaaaaaatattactttaatactaacactgctgttgcagtaacaggatggcaaactatcaacggcaagaaatattacttcaatactaacacttctatagctagtaccggctacaccattattagtggcaagcacttctatttcaataccgacggcattatgcagataggagtgtttaaaggacctgatggatttgaatactttgcacctgctaatacagatgctaacaatatagaaggtcaagctatacgttatcagaaccgttttctgtatctgcatgacaatatatattactttggtaataattcaaaagcagctacaggttgggtaaccattgatggcaatagatactacttcgagccgaatacagcaatgggtgcgaatggatacaagacaatcgacaataaaaatttttactttagaaatggtttacctcagataggagtgtttaaagggtctaatggatttgaatactttgcacctgctaatacggatgctaacaatatagaaggtcaagctatacgttatcaaaatagattcctgcatttactgggaaaaatttattattttggcaacaactctaaagcggttactggatggcaaactattaatggtaaagtatattactttatgcctgatactgctatggctgcagctggtggactgttcgagattgatggtgttatatatttctttggtgttgatggagtaaaagcccctgggatatatggctaatgaaagcttgcggccgcactcgag 3’

对上述设计的核苷酸序列进行全基因人工合成并测序正确后可用于原核表达载体构建实验。

实施例3第一种优化组合原核表达载体pET3b(+)-TcdA-C-1的构建与鉴定

1、目的基因片段获得：用EcoRV和EcoRI双酶切亚克隆质粒pUCE-TcdA-C1(基因公司合成，含第一种组合优化片段1序列)，胶回收获得片段1序列；用EcoRI和XhoI双酶切亚克隆质粒pUCE-TcdA-C2(基因公司合成，含第一种优化组合片段2序列)，胶回收获得片段2序列；

2、原核载体pET32b(+)获得：设计PCR引物扩增pET32b(+)的部分序列，其中一端引入XhoI酶切位点。PCR产物纯化试剂盒回收PCR反应后的产物，然后经XhoI单酶切释放含有粘性末端的载体。扩增载体用引物序列如下：

正向引物：AAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCA(SEQ ID NO.49)

反向引物：CATACCAGAACCGCGTGGCACCAGA(SEQ ID NO.50)

3、连接反应：上述步骤获得的载体和两段目的基因在T4DNA连接酶作用下，设计三片段连接体系，其中体系中片段1∶片段2∶载体的质量浓度比设定为6∶7∶1。温度设定为16℃，过夜连接，获得含有目的基因的表达载体；三片段连接过程以及重组质粒图谱如3图所示。

4、转化及鉴定：氯化钙法将获得含有目的基因的表达载体转化大肠杆菌DH5α，均匀涂布于含Amp抗性的LB琼脂平板，37℃培养过夜。次日挑取24个单菌落进行试管培养，并提取质粒。对转化子质粒进行四种鉴定，分别为质粒电泳鉴定(结果见图4)、XhoI单酶切鉴定(结果见图5)、XhoI与EcoRV双酶切鉴定(结果见图6)、XhoI与XbaI双酶切鉴定(结果见图7)、EcoRI与XbaI双酶切鉴定(结果见图8)。选择鉴定均显阳性的转化子18号送出测序，测序正确后正式命名为pET32b(+)-TcdA-C。

重组质粒大小应为8410bp，根据图4中的质粒电泳结果挑选1、3、10、11、14、15、18、19、20、23、24号质粒进行下一步验证。

质粒电泳初步鉴定具有阳性可能的转化子经XhoI单酶切以获得线性化的质粒，从而更直观的筛选大小为8410bp的阳性质粒。由图5可知，1、3、10、11、14、15、18、19、20、23、24号仍存在阳性的可能，还需进一步验证。

从双酶切的角度进一步对转化子质粒进行鉴定，选取XhoI与EcoRV双酶切组合。由于EcoRV位点在克隆中已消失，故电泳结果(图6)出现XhoI单酶切的结果，结果分析同上。

第二组双酶切选取XhoI与XbaI组合，该组双酶切后片段大小应分别为5329bp与3081bp，由图7可知11、15、18、19、20、24号质粒仍存在阳性可能，故进行下一步验证。

第三组双酶切选取EcoRI与XbaI组合，该组双酶切后片段大小应分别为6735bp与1675bp，由图8可知11、15、18、19、20、24号质粒可能为阳性转化子。

经以上多组酶切验证，挑选18号转化子送出测序。测序结果证明连接产物完全正确，目的片段无移码突变现象，符合实验预期。所得阳性质粒命名为pET32b(+)-TcdA-C-1，可用于下一步工程菌获得。

实施例4第二种优化组合原核表达载体pET3b(+)-TcdA-C-2的构建与鉴定

按与实施例3相同的方法构建第二种优化组合基因序列表达载体pET3b(+)-TcdA-C-2。

实施例5第三种优化组合原核表达载体pET3b(+)-TcdA-C-3的构建与鉴定

按与实施例3相同的方法构建第三种优化组合基因序列表达载体pET3b(+)-TcdA-C-3。

实施例6第一种优化组合艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白大肠杆菌表达工程菌的获得及诱导表达

诱导表达及鉴定：

将鉴定后的pET32b(+)-TcdA-C-1质粒用氯化钙法转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)，从中随机挑选单菌落进行表达。即用无菌枪头挑取单菌落于含有100μg/ml Amp的LB培养基中37℃过夜培养，转速设定为220rpm。次日清晨按1∶10接种于新鲜的LB培养基中，37℃，220rpm培养至OD值约为0.6时加入IPTG至终浓度为0.4mM，诱导在22℃条件下进行，诱导时间分别设定为3h和8h，分别取样进行12％的SDS-PAGE电泳检测(结果见图9)。因目的蛋白约为110kD，电泳显示其在Marker第一条带之上，目的蛋白表达量在30％左右。保存菌株，命名为pET32b(+)-TcdA-C-1/BL21(DE3-1)，其诱导表达的蛋白命名为毒素A-DE3-1。

由于融合蛋白较大，故在诱导表达时选择低温慢速长时间诱导，尽可能减少包涵体形成的可能。超声破碎条件选择在功率200W，超声4s，间歇8s的条件下，超声20min可以多数融合蛋白分布于上清中，方便于对融合蛋白进行可溶性蛋白的纯化操作。

实施例7第二种优化组合艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白大肠杆菌表达工程菌的获得及诱导表达

按与实施例6相同的方法构建第二种优化组合艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白大肠杆菌表达工程菌，获得的工程菌株命名为pET32b(+)-TcdA-C-2/BL21(DE3-2)，其诱导表达的蛋白命名为毒素A-DE3-2。

实施例8第三种优化组合艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白大肠杆菌表达工程菌的获得及诱导表达

按与实施例6相同的方法构建第三种优化组合艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白大肠杆菌表达工程菌。获得的工程菌株命名为pET32b(+)-TcdA-C-3/BL21(DE3-3)，其诱导表达的蛋白命名为毒素A-DE3-3。

实施例9素素A-DE3-1融合蛋白纯化及艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白酶切释放

1、素素A-DE3-1融合蛋白纯化：

(1)200ml诱导表达培养物离心获得的细胞，用10ml NTA-0重悬，置于冰浴中超声波破壁20min(200W，工作4s，间歇8s)。细胞破壁液于12000rpm，4℃离心20min，取上清置于烧杯(25ml)中。

(2)加入1ml Ni-NTA树脂混悬液(含50％V/V树脂，保存于20％V/V乙醇溶液中)，置于冰上(或在4℃冰箱中)用脱色摇床120rpm振荡1h。

(3)装入层析柱，移去层析柱底端的帽子，上清液通过NTA柱，收集流出部分，用于电泳分析。

(4)加10ml NTA-20洗涤层析柱，洗去未结合的杂蛋白。

(5)分别加入5ml NTA-60、4ml NTA-80以及2ml NTA-100梯度洗涤层析柱，尽可能洗去未结合的杂蛋白。

(6)用2ml NTA-200洗脱目的蛋白，分4次洗脱，每次0.5ml。

由图10可以看出，毒素A羧基端蛋白在NTA80溶液开始有洗脱，NTA100溶液洗脱可以达到纯度约90％，NTA200溶液洗脱可以达到95％的纯度。

经金属螯合层析纯化后的艰难梭菌毒素A融合蛋白存在于NTA200洗脱液中，该段洗脱液经30K超滤管超滤后，可进一步去除30K以下的杂蛋白，结果如图11所示。

2、素素A-DE3-1凝血酶酶切：

在载体构建时，将(His)₆标签置于毒素A羧基端序列之前，方便后续的纯化操作，并在二者之间设有编码凝血酶酶切位点的序列，更方便了后续融合蛋白经凝血酶酶切后释放目的蛋白，即毒素A羧基端蛋白。

凝血酶酶切条件为：1mg融合蛋白中加入凝血酶125单位，4℃酶切过夜，次日检测酶切效果，如下图所示：

由图12可知，经凝血酶酶切后，融合蛋白可以释放无标签的毒素A羧基端蛋白，该蛋白大小约为94KD，凝血酶的酶切效率在95％左右。

实施例10素素A-DE3-2融合蛋白纯化及艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白酶切释放

按实施例9的方法进行毒素A-DE3-2融合蛋白纯化及酶切释放。

实施例11素素A-DE3-3融合蛋白纯化及艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白酶切释放

按实施例9的方法进行毒素A-DE3-3融合蛋白纯化及酶切释放。

实施例12艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白活性验证

1、艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白凝血活性测定

取250μl 2％的兔红细胞(Rabbit erythrocytes(R-RBC)，每孔加25μl；分别配置毒素A-DE3-1、毒素A-DE3-2、毒素A-DE3-3母液，浓度为0.1mg/ml，各孔加样质量依次为空白对照、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg；将96孔板放于4℃孵育4h，观察结果(图13，图14，图15)。

凝血活性测定实验表明，本研究制备的毒素A羧基端蛋白在0.1μg-0.3μg加样情况下即可使血液发生凝集，进而出现凝血现象。

2、艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白肠毒性实验测定：

用体重2kg的家兔1只，禁食24h，通过耳缘静脉注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉，消毒后剪开腹膜。将小肠按8cm～10cm分段结扎，其中一段分别注入1ml浓度为100μg/ml分别配置毒素A-DE3-1、毒素A-DE3-2、毒素A-DE3-3(以下简称100A-1，100A-2，100A-3)，另一段分别注入1ml浓度为50μg/ml分别配置毒素A-DE3-1、毒素A-DE3-2、毒素A-DE3-3(以下简称50A-1，50A-2，50A-3)，将小肠放回腹腔、缝合，16h后观察结果。实验设两段阴性对照，用1ml生理盐水替代毒素样品。反应的强度用肠液重量长度的比值(g/cm)来表示。

实验以测量的肠液重量长度的比值(g/cm)为纵坐标，显示注射样品对小肠的肠毒性，表3中的数据及图16显示毒素A-DE3-1蛋白肠毒性程度。实验结果如下：

表3：艰难梭菌外毒素A-DE3-1蛋白肠毒性检测结果

注射样品	重量(g)	长度(cm)	重量/长度(g/cm)
				100A	23	17.5	1.314
50A	16	15.5	1.032
				生理盐水1	3.7	9	0.411

生理盐水2

3.9

10

0.39

另外两种优化方式的到的毒素A-DE3-2、毒素A-DE3-3的肠毒性结果分别如图17，图18所示。

以上实验结果表明，本研究制备的艰难梭菌外毒素A羧基端蛋白具有强烈的肠毒性，注射毒素A羧基端蛋白的小肠出现肠液积攒现象，表现为小肠肿胀。

实施例13艰难梭菌毒素A羧基端蛋白免疫小鼠后血清中抗体效价测定

1.艰难梭菌毒素A羧基端蛋白免疫雌性、6-8周龄BALB/c小鼠，实验分实验组(毒素A 100ug/只/次)和对照组(生理盐水组)；疫苗配制：毒素A羧基端蛋白∶佐剂(Imject Alum，美国Thermo)的体积比为3∶1；免疫方法为：后腿肌肉交叉注射，每周一次，每次100ul，连续四周，第0，1，2，3，4，5周断尾取血，制备血清。

2.用50mM的碳酸盐包被缓冲液(Na₂CO₃0.15克，NaHCO₃0.293克，加蒸馏水溶解，定容至100ml，pH 9.6)稀释抗原毒素A/B，使抗原浓度为100μg/ml，加100μl/孔到96孔酶标板，4℃放置过夜。

3.第二天弃去包被液后，用PBST(PBS：KH₂PO₄0.27g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g，NaCl 8g，加ddH₂O溶解，定容至1000ml；PBST为PBS+Tween200.5ml/1000ml)拍洗3次，每孔加入100μl 10％脱脂牛奶(PBST溶解)室温封闭1小时。

4.弃去封闭液后，每孔加入100μl不同倍比稀释度(100，200，400，800，1600倍等，稀释液为2％脱脂奶粉的PBST)的血清，并加入阴阳性对照样品，37℃孵育1小时。

5.PBST拍洗5次后，加入100μl稀释(稀释度参照产品说明书，稀释液为含2％脱脂奶粉的PBST)后的HRP标记的二抗，37℃孵育1小时。

6.PBST拍洗3次后，PBS拍洗2次，加入显色剂显色20min后，酶标仪上读取A450吸收值。

7.效价判定：以待测样品A450吸收值/阴性对照A450吸收值＞2为阳性结果。以毒素A-DE3-1、毒素A-DE3-2、毒素A-DE3-3为实验组得到的结果分别如图19，图20，图21所示。

实验结果表明，免疫毒素A羧基端蛋白后，小鼠血清中产生了针对毒素A的特异性抗体并且随时间推移，抗体滴度越来越来大。该结果也证明，本研究制备的三种方式优化的核酸序列表达的艰难梭菌毒素A羧基端蛋白均可作为蛋白疫苗用来刺激小鼠产生抗毒素抗体，同时可分离血清中产生的抗体用于制备治疗性抗体药物。

Claims

1.一种密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列，其是将艰难梭菌外毒素A原始序列重复区中保守氨基酸序列(conservative aa sequence，CAS)的密码子优化为大肠杆菌中使用频率高的兼并性密码子，优化后的基因序列可在大肠杆菌中表达，而氨基酸序列不变。

2.根据权利要求1所述的密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列，根据同源性分析选取的11个保守氨基酸序列命名为CAS1-11，其中，CAS1密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1-5中的任一种序列，CAS2密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7，CAS3密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9，CAS4密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11，CAS5密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13，CAS6密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15，CAS7密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17，CAS8密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19，CAS9密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.20-24中的任一种序列，CAS10密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.25或SEQID NO.26，CAS11密码子优化后的核苷酸序列选自SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.28。

3.根据权利要求2所述的密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列，其具有SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30或SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列。

4.权利要求1-3任一项所述的艰难梭菌外毒素A羧基端基因编码的蛋白在制备抗艰难梭菌外毒素A抗体中的应用。

5.权利要求1-3任一项所述的艰难梭菌外毒素A羧基端基因编码的蛋白在制备抗艰难梭菌感染疫苗中的应用。

6.一种优化多重复区基因序列的方法，包括以每个独立重复区的保守序列为模块进行多种适应于表达系统的密码子优化，优化后的氨基酸序列不变，再将优化后的模块进行组合得到多种重复性低且适于表达的新基因序列。

7.根据权利要求6所述的方法，所述多重复区基因序列为艰难梭菌外毒素A羧基端基因重复序列。

8.根据权利要求6所述的方法，所述表达系统为大肠杆菌表达系统。

9.一种重组表达载体的构建方法，包括如下步骤：

A)将待表达的基因分成多段获得，优选两段，每段基因两端设计合适酶切位点；

B)通过PCR或限制性内切酶酶消化的方法获得与待表达的基因有对应酶切位点的载体。

C)将步骤A中获得的基因片段及步骤B获得的载体分别酶切回收后，在DNA连接酶作用下进行连接，获得含有待表达基因的重组载体。

10.根据权利要求9所述的方法，所述基因片段可人工合成或用其他方法获得。

11.根据权利要求9所述的方法，其中待表达的基因为密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列。

12.根据权利要求11所述的方法，其中待表达的基因为选自权利要求1-3所述的密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列。