DE69206580T2

DE69206580T2 - Silikontetrahydrazide und Reinigung von DNS.

Info

Publication number: DE69206580T2
Application number: DE69206580T
Authority: DE
Inventors: Adriann J Howard; Daniel L Woodard
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1991-10-31
Filing date: 1992-09-28
Publication date: 1996-06-05
Anticipated expiration: 2012-09-29
Also published as: DE69206580D1; US5534054A; US5329000A; EP0540170A1; CA2079749A1; EP0540170B1; CA2079749C

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Mikrobiologie. Insbesondere betrifft die Erfindung das Gebiet der Reinigung von Desoxyribonudeinsäure,

AUSGANGSSITUATION DER ERFINDUNG

Die stetigen Fortschritte in der Mikrobiologie und in verwandten Fachgebieten führen zu einem anhaltenden Verbesserungsbedarf für Werkzeuge, die mit der vollen Würdigung und Entwicklung der modernen Technologie verbunden sind.
Eine große Anzahl von Techniken erfordern die Verwendung von Desoxyribonudeinsäure (DNA) in den verschiedensten Formen. Zum Beispiel erfordern die Fortschritte auf dem Gebiet der DNA-Rekombinationstechnik immer wieder die Verwendung von DNA in Form von Sonden, genomischer DNA und Plasmid-DNA.
Fortschritte auf dem Gebiet der Diagnostik nutzen gleichfalls DNA auf viele verschiedene Arten. Zum Beispiel werden DNA-Sonden routinemäßig beim Nachweis und der Diagnose humaner Pathogene eingesetzt. Ebenso verwendet man DNA bei der Erkennung genetischer Störungen. DNA wird auch beim Nachweis von Lebensmittelverunreinigungen verwendet. Außerdem verwendet man DNA beim Lokalisieren, Bestimmen und Isolieren von interessierender DNA aus den verschiedensten Gründen, die von der Genkartierung bis zur Klonierung und der Expression von Rekombinanten reichen.
In vielen Fällen ist DNA in extrem geringen Mengen verfügbar, und Isolierungs- und Reinigungsverfahren können mühselig und zeitraubend sein. Die häufig zeitraubenden und mühseligen Verfahren können zum Verlust von DNA führen. Bei der Reinigung von DNA aus Proben, die von Serum, Urin und Bakterienkulturen entnommen werden, besteht das zusätzliche Risiko einer Verunreinigung sowie falsch positiver Resultate.
Typische DNA-Reinigungsvorschriften erfordern die Verwendung ätzender und giftiger Zusammensetzungen. Die typische DNA-Reinigungsvorschrift verwendet hohe Konzentrationen chaotroper Salze, wie z. B. Natriumiodid und Natriumperchlorat.
Es gibt zahlreiche Arbeitsvorschriften für die Reinigung von DNA. Wie die Aktivität der letzten Zeit auf dem Gebiet der DNA-Reinigung zeigt, gibt es ein fortgesetztes Streben nach optimalen DNA-Reinigungsvorschriften. Die US-PS-4 923 978 offenbart ein Verfahren zur Reinigung von DNA, bei dem eine Lösung von Protein und DNA über einen hydroxylierten Träger geleitet, das Protein gebunden und die DNA eluiert wird. Die US-PS-4 935 342 und die EP- A-270017 offenbaren eine Reinigung von DNA durch selektive Bindung der DNA an Anionenaustauscher und nachfolgende Elution. Die US-PS-4 946 952 offenbart die Isolierung von DNA durch Ausfällen mit wasserlöslichen Ketonen. Eine DNA-Reinigungsvorschrift unter Verwendung von Chaotropen und dialysierter DNA wird in der US-PS-4 900 677 offenbart.
Die gegenwärtigen Arbeitsvorschriften zur Reinigung von DNA können zwar ihr Ziel erreichen, aber neben der Gewinnung größerer Mengen DNA ist es wünschenswert, DNA ohne Verwendung solcher ätzender und giftiger Verbindungen wie z. B. der besonders häufig verwendeten Chaotrope zu reinigen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bietet ein Verfahren zur Reinigung von DNA mit einer Bindung der DNA an eine Siliciumtetrahydrazidverbindung, die durch vollständige Umsetzung von Siliciumtetrachlorid mit Hydrazin hergestellt wird.
Die Umsetzung von Siliciumtetrahalogeniden mit Hydrazinverbindungen in Gegenwart von Wasser zur Erzeugung von Polysiloxazanen ist aus der EP-A-327773 bekannt.
Die vorliegende Erfindung kann zur Reinigung von DNA aus den verschiedensten Quellen und in den verschiedensten Formen verwendet werden. Das Verfahren nutzt die erfindungsgemäße Zusammensetzung und läßt den Gebrauch von Bindungspuffern, wie z. B. von Chaotropen, wahlfrei werden. Die DNA kann bei Raumtemperatur in einer wäßrigen Lösung gebunden werden, wie z. B. in TE-Puffer. Außerdem kann die DNA durch Erhitzen aus den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in Wasser eluiert werden, oder es können üblicherweise verwendete Elutionspuffer eingesetzt werden, wie z. B. TE oder 1 X TAE. Zu den DNA-Quellen für die Reinigung gehören Bakterien, Bakteriophagen, Proben, Pflanzen, Tiere und dergleichen. DNA ist in den verschiedensten Formen zu finden und schließt einzelsträngige, doppelsträngige, ringförmige und lineare DNA ein. Die Erfindung kann bei DNA aus jeder beliebigen Quelle in jeder beliebigen Form praktisch angewandt werden.
Als DNA-Reinigungskits werden auch Reaktionsprodukte von H&sub2;NNH&sub2; und SiCl&sub4; bereitgestellt.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG

Im allgemeinen ergeben Reaktionsprodukte von H&sub2;NNH&sub2; und SiCl&sub4; eine perlenartige Struktur mit wiederkehrenden Struktureinheiten.
Es ist möglich, daß die Elektronenkonstitution dieses Polymers so beschaffen ist, daß Oberflächenmodifikationen vorgenommen werden können, die von einer eher herkömmlichen Art sind, aber wegen des Vorhandenseins dieses Polymers im Mittelpunkt der Perle elektronisch verändert werden (wodurch eine für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung wirksamere Oberfläche entsteht). Zum Beispiel könnte die Oberfläche mit SiCl&sub4; modifiziert und anschließend hydratisiert werden, wodurch ein Silanolüberzug auf der Oberfläche entstehen würde. Andere Modifikationen könnten mit der Verwendung von NaOH verbunden sein und eine stärker polarisierte Oberfläche ergeben. Die Wechselwirkung mit der DNA erfolgt durch die freiliegende Struktureinheit, und daher sind Oberflächen, welche die Struktureinheit aufweisen, auch für die praktische Ausführung der Erfindung geeignet. Oberflächen die so gestaltet werden können, daß erfindungsgemäße Zusammensetzungen an der Oberfläche liegen, weisen unter anderem Tauchstab-, Röhren-, Ampullen-, Filterkonfigurationen und dergleichen auf.
Die Arbeitsvorschrift zur Gewinnung der Zusammensetzungen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren und Kit verwendet werden, weist im allgemeinen das Verdünnen von H&sub2;NNH&sub2; mit Tetrahydrofuran (THF) und anschließendes Abkühlen auf. Dann wird SiCl&sub4; zugegeben, bis kein Chlorwasserstoffgas HCL(g) mehr entweicht, und dann wird H&sub2;NNH&sub2; im Überschuß zugegeben, um eine vollständige Umsetzung des SiCl&sub4; sicherzustellen.
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und der Reaktionsprodukte von (Hydrazin) H&sub2;NNH&sub2; + SiCl&sub4; beinhaltet die Zugabe von Hydrazin zu Tetrahydrofuran und anschließendes Abkühlen. Anstelle von THF kann ein beliebiges Lösungsmittel verwendet werden, das nicht mit dem Siliciumtetrachlorid reagiert. Die Umsetzung kann auch ohne Lösungsmittel durchgeführt werden. Das Verhältnis von Hydrazin zu Tetrahydrofuran beträgt im allgemeinen etwa 1:10 Teile, vorzugsweise etwa 1:5 Teile. Dann wird dem Hydrazingemisch SiCl&sub4; zugesetzt, bis die Entstehung von gasförmigem HCl aufhört. Das Verhältnis von SiCl&sub4; zu Hydrazin beträgt im allgemeinen etwa 10:1, vorzugsweise etwa 6:1. Diese Lösung wird etwa dreißig (30) Minuten gerührt. Dann wird dieser Lösung Hydrazin im Überschuß zugesetzt und etwa dreißig (30) Minuten gerührt. Der bis dahin umgesetzte Hydrazinanteil reicht aus, um sicherzustellen, daß das gesamte SiCl&sub4; umgesetzt ist. Das entstandene Produkt wird filtriert und dann gewaschen und getrocknet. Geeignete Waschmittel sind Aceton und dergleichen. Das Produkt ist jetzt gebrauchsfertig für die Reinigung von DNA.
Für den Beginn jedes DNA-Reinigungs- oder -Isolierungsverfahrens ist die Gewinnung der gewünschten DNA aus ihrer Quelle erforderlich. Typische Arbeitsvorschriften für die Gewinnung von DNA aus Proben, wie z. B. aus Serum, Urin und Bakterienkulturen, sind gut bekannt und werden routinemäßig ausgeführt. Ebenso kann man DNA routinemäßig aus genomischen Genbanken und dergleichen erhalten. Der Schlüssel zur Erfindung ist die Fähigkeit zur Reinigung von DNA nach deren Gewinnung aus ihrer Quelle. Typische Verfahren zur Gewinnung von DNA ergeben eine Suspension der DNA in Lösung. Literaturhinweise betreffen u. a. die Isolierung von DNA aus biologischen Proben: Harding, J.D., Gebeyehu, G., Bebee, R., Simms, D., Ktevan, L., Nucleic Acids Research 17 (1989) 6947, und Marko, M.A., Chipperfield, R., und Birnboim, H.C., Analytical Biochemistry 121 (1982) 382. Verfahren für die Isolierung von Plasmid-DNA sind in Lutze, L.H., Winegar, R.A., Nucleic Acids Research 20 (1990) 6150 zu finden. Die Extraktion von doppelsträngiger DNA aus biologischen Proben wird in Yamada, 0., Matsumoto, T., Nakashima, M., Hagri, S., Kamahora, T., Ueyama, H., Kishi, Y., Uemura, H., Kurimura, T., Journal of Virological Methods 27 (1990) 203 beschrieben. Die meisten DNA-Lösungen enthalten die DNA in einem geeigneten Puffer, wie z. B. in TE-(Tris-EDTA), TEA-Puffer (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA) oder in einem Lysat.
Sobald die DNA in einer geeigneten Lösung vorliegt, wird der Lösung typischerweise eine Bindungsmatrix zugesetzt. Allgemein verwendete Bindungsmatrizen sind Siliciumdioxid in Form von Glas oder Diatomeen. Verfahren mit Verwendung von Siliciumdioxid erfordern jedoch hohe Konzentrationen von Chaotropen oder Alkoholen zum Binden der DNA an die Oberflächen. Beliebte Chaotrope sind unter anderen Natriumiodid (NaI), Harnstoff, Guanidinhydrochlond, Natriumperchlorat (NaClO&sub4;) und Kaliumbromid (KBr). Chaotrope und Alkohole können toxisch, ätzend, entflammbar und/oder teuer sein. Das erfindungsgemäße Verfahren erfordert nicht die Anwesenheit von Chaotropen oder Alkoholen zur Bindung an die erfindungsgemäßen Oberflächen. Bei derartigen Verfahren wird daher DNA in wäßriger Lösung gebunden. Auf Wunsch können jedoch beim erfindungsgemäßen Verfahren auch Chaotrope, Alkohole und dergleichen verwendet werden.
Typische Arbeitsvorschriften zur Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind unter anderem die Zugabe der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zu einer DNA-Lösung, im allgemeinen mit anschließender Zugabe eines Bindungspuffers. Hierbei ist es von Vorteil, daß das erfindungsgemäße Verfahren keinen Bindungspuffer benötigt. Für das Verfahren ist Raumtemperatur geeignet. Die Lösung kann kurze Zeit bei Raumtemperatur inkubiert werden. Nach dem Zentrifugieren kann die überstehende Flüssigkeit abgenommen und das Pellet kann gewaschen werden. Die DNA kann dann eluiert werden.
Bei der praktischen Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird typischerweise die erfindungsgemäße Zusammensetzung in einen Behälter gegeben, der DNA enthält. Es können Masseverhältnisse der Zusammensetzung zu Wasser im Bereich von etwa 1:10 bis 1:1 verwendet werden. Vorzugsweise werden überschüssige Wassermengen vermieden, und anstelle von Wasser können Puffer verwendet werden, wie z. B. TE.
Als nächstes wird ein Bindungspuffer zugegeben, falls ein solcher verwendet wird. Nach kurzer Inkubationszeit von etwa 1 bis 20, vorzugsweise etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur kann der Behälter zentrifugiert werden, um ein Pellet und überstehende Fraktionen zu erhalten. Die überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt, und das Pellet wird mit einem Mittel wie z. B. Ethanol, das mit 50 mM Tris verdünnt ist, gewaschen. Eine bevorzugte Waschmittelkonzentration ist 80% Ethanol. Die DNA kann dann aus den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen mit Hilfe von Elutionspuffern herausgelöst werden, wie z. B. mit TE-Puffer, 1 X TAE-Puffer und 1 X TBE- Puffer. Wichtiger ist, daß auf die Verwendung von Elutionspuffern gänzlich verzichtet und die DNA durch Erhitzen in Wasser eluiert werden kann. Zur Erzielung maximaler Ausbeuten kann der Elutionsschritt wiederholt werden.
Die erfindungsgemäßen chemischen Zusammensetzungen können zweckmäßig zu einem Kit zusammengefaßt werden. Ein Kit mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann die Zusammensetzung in einem Behälter, wie z. B. einer Ampulle, zusammen mit einem geeigneten Puffer enthalten, wie z. B. TE- Puffer und TAE-Puffer, und er kann wahlweise einen Behälter mit einem Bindungspuffer, wie z. B. Chaotropen, einen Behälter mit Waschpuffer, wie z. B. einer mit 50 mM Tris oder 1 X TAE verdünnten Ethanollösung, und einen Behälter mit Elutionspuffer, wie z. B. TE-Puffer, 1 X TAE-Puffer und 1 X TBE-Puffer, aufweisen. Ein solcher Kit gestattet eine bequeme DNA- Reinigung.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die speziellen Ausführungsformen der im vorliegenden Dokument beschriebenen Erfindung. Wie der Fachmann erkennen wird, sind verschiedene Änderungen und Modifikationen möglich und fallen in den Schutzumfang der beschriebenen Erfindung.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Synthese von Siliciumtetrahydrazid

MATERIALIEN

THF (Aldrich, Fabr.-Nr. 63314PM, Milwaukee, WI)
H&sub2;NNH&sub2; (Aldrich, Fabr.-Nr. 01427KX, Milwaukee, WI)
SiCl&sub4; (Petrarch Systems, Fabr.-Nr. 80879, Bristol, PA)

VERFAHREN

4 ml H&sub2;NNH&sub2; werden zu 20 ml THF gegeben. Abkühlen auf 0ºC im Eisbad. 25 ml SiCl&sub4; werden in einen Zugabetrichter gegeben und über dem Erlenmayer- Kolben befestigt, der das Hydrazin enthält. SiCl&sub4; langsam zugeben, bis die Entwicklung von HCl-Gas aufhört. 0,5 ml SiCl&sub4; zugeben und etwa 30 Minuten rühren. Etwa 3 ml Hydrazin zugeben, etwa 30 Minuten rühren, filtrieren, mit 500 ml Aceton waschen, etwa 1 Stunde an der Luft trocknen, etwa 1 Stunde im Ofen trocknen. In einem Exsikkator aufbewahren.

BEISPIEL 2

Bei diesem Experiment wird beschrieben, wie das DNA-Bindevermögen von SUPER FINE SUPER FLOSS CELITE (dt. etwa: superfeines superweiches Celite) (Industriestandard (Manville)) bestimmt wurde und was dieses Bindevermögen bedeutet. Es wurde festgestellt, daß SUPER FINE SUPER FLOSS CELITE bei 2,5 M mit NaClO&sub4; als Bindungspuffer DNA fest bindet und eluiert.

MATERIALIEN

Super Fine Super Floss (SFSF) (Probe von Manville, Denver, CO (im Gewichtsverhältnis 1:5 mit H&sub2;0))
λ-DNA (BRL Kat.-Nr. 56125A, Fabr.-Nr. AJU702)
50 mM Tris, pH 7,0 (Verdünnt aus 1 M Stammlösung), BRL Kat.-Nr. 5505UA, Fabr.-Nr. 60926
(PREP-A-GENE-Kit (Bio-Rad, Richmond, CA)) Bindungspuffer (Verdünnt aus 6 M Stammlösung) NaClO&sub4;, Fisher Kat.-Nr. 5490-500, Fabr.-Nr. 914199
Waschpuffer 80% Ethanol in 50 mM Tris, pH 7,0
Elutionspuffer Milli Q H&sub2;O
Ethidiumbromid (10 mg/ml), Sigma Kat.-Nr. E-8751, Fabr.-Nr. 99F3722 1%-ige Agarose, BRL Kat.-Nr. 5510UA, Fabr.-Nr. 9N2204
1X TAE (aus 50X-Stammlösung), Tris-Base - Sigma Kat.-Nr. T-1503, Fabr.-Nr. 80H5633, Essigsäure - Fisher A38-500, EDTA - Sigma Kat.-Nr. ED255, Fabr.- Nr. 117F-0026
Beladefarbstoff Typ II (25% Ficoll 400, 0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylolcyanol; Ficoll 400 - Sigma Kat.-Nr. F4375, Bromphenolblau - BIO-RAD Kat.-Nr. 161-0404, Fabr.-Nr. M 1264, Xylolcyanol - Sigma Kat.-Nr. X-4162, Fabr. -Nr. 8043740)
Polaroid-Film Typ 57 und 55

METHODEN

1. Es werden zwei Gruppen von Reaktionen eingerichtet, eine für jeden Oberflächentyp. In jeder Oberfläche sind 8 Röhren ausgebildet, die 50 µl der DNA-Lösung aufnehmen. Diese Lösung besteht aus 0,5 µl λ-DNA in 50 µl 50 mM Tris, pH 7,0, für 31 µg DNA pro Reaktion. Die Titration wird mit 0 M NaClO&sub4; bis 6 M NaClO&sub4; ausgeführt.
2. 20 µl jedes Oberflächentyps sind in die Reaktionsgemische einzubringen.
3. Je nach der Titration sind 400 µl Bindungspuffer zuzugeben. Für Prep-A-Gene waren dies 0 M, 2 M, 2,5 M, 3 M, 3,5 M, 4 M, 4,5 M und 6 M NaClO&sub4;. Für SFSF erfolgte die Titration mit 0 M, 1 M, 1,5 M, 2 M, 2,5 M, 3 M, 3,5 M und 4 M NaClO&sub4;.
4. Inkubation über 10 Minuten unter Schütteln bei Raumtemperatur.
5. Zentrifugieren und überstehende Flüssigkeit abnehmen.
6. Pellet 2 mal mit 80%-igem Ethanol/50 mM Tris, pH 7,0, waschen.
7. DNA in 20 µl H&sub2;O 10 Minuten lang eluieren.
8. Zentrifugieren und überstehende Flüssigkeit in ein separates Röhrchen abnehmen. Elutionsschritt wiederholen und überstehende Flüssigkeiten zu insgesamt 40 µl vereinigen.
9. 2 µl Beladefarbstoff, Typ II, in jedes Röhrchen geben.
10. Auf 1% Agarose, 1 X TAE-Gel auftragen. Etwa 25 Minuten bei 100-130 Volt in 1 X TAE-Puffer laufen lassen.
11. Mit Ethidiumbromid in H&sub2;O ( 1:1000) etwa 15 Minuten anfärben. Etwa 20-30 Minuten entfärben.
12. Mit UV-Licht und Polaroid-Film, Typ 57, fotografieren. Wenn möglich, Negative mit Film vom Typ 55 aufnehmen.

ERGEBNISSE UND SCHLUßFOLGERUNGEN

Prep-A-Gene zeigt bis zu 3 M NaClO&sub4; keine DNA-Elution, während SFSF DNA im nativen Zustand bei 2,5 M NaCLO&sub4; bindet. Offensichtlich arbeitet SFSF besser als Prep-A-Gene.

BEISPIEL 3

Bei diesem Experiment wird das DNA-Bindevermögen von Siliciumtetrahydrazid beschrieben.
Die Elektrophorese zeigt, daß diese Oberfläche bis hinab zu 1 M NaClO&sub4; als Bindungspuffer eine gute DNA-Ausbeute liefert. Diese Oberfläche übertrifft Super Fine Super Floss Celite, das nur bis hinab zu 2,5 M NaClO&sub4; eine gute Ausbeute liefert. Aus der gelelektrophoretischen Analyse ergibt sich auch, daß diese Oberfläche bis hinab zu diesen niedrigeren NaClO&sub4;- Konzentrationen als Bindungspuffer und unter nativen Bedingungen eine gleiche oder höhere DNA-Ausbeute liefert.

MATERIALIEN

Material der im Text beschriebenen Zusammensetzung (Siliciumtetrahydrazid)
SUPER FINE SUPER FLOSS (Manville), Gewichtsverhältnis zu Wasser 1:5

METHODEN

Es werden acht Reaktionsgruppen getestet. Die Bindungspuffer- Konzentrationen sind 1 M, 1,5 M, 2 M, 2,5 M, 3 M, 3,5 M, 4 M mit SFSF bei 3 M NaClO&sub4; als verwendetem Standard. Siehe das vorhergehende Experiment.

ERGEBNISSE

Die Ergebnisse für Siliciumtetrahydrazid werden durch Untersuchung des Agarosegels analysiert. In allen Registrierspuren zeigen sich eine große DNA-Menge und Übereinstimmung im Elutionsmuster.

SCHLUßFOLGERUNG

Siliciumtetrahydrazid übertrifft SFSF-Celite sowohl in der aus der Lösung gewonnenen DNA-Ausbeute als auch in der zum Zustandekommen dieser Ausbeute erforderlichen Bindungspuffer-Konzentration. Aus der agarosegelelektrophoretischen Analyse geht hervor, daß Siliciumtetrahydrazid sogar bis hinab zu 1 M NaClO&sub4; als Bindungspuffer eine DNA-Ausbeute von 100% liefert.
Die Erfindung ist zwar im Hinblick auf spezielle Modifikationen beschrieben worden, deren Details aber nicht als Einschränkungen auszulegen sind, denn offensichtlich kann man verschiedene Äquivalente, Veränderungen, und Modifikationen anbringen, ohne vom Grundgedanken und vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen, und es versteht sich, daß solche äquivalenten Ausführungsformen in den Schutzumfang der Erfindung fallen.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung von DNA mit Bindung der DNA an eine Siliciumtetrahydrazidverbindung, die durch vollständige Reaktion von Siliciumtetrachlorid mit Hydrazin hergestellt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA in Gegenwart einer chaotropen Substanz an das Siliciumtetrahydrazid gebunden wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA in Abwesenheit chaotroper Substanzen an das Siliciumtetrahydrazid gebunden wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die DNA in Abwesenheit chaotroper Substanzen eluiert wird.

5. Ausstattung oder Kit zur Reinigung von DNA, mit einer Siliciumtetrahydrazidverbindung, die durch vollständige Reaktion von Siliciumtetrachlorid mit Hydrazin hergestellt wird.

6. Ausstattung nach Anspruch 5, die ferner eine Bindungspufferlösung und eine Waschpufferlösung aufweist.