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Verfahren zur Isolierung und Reinigung von S-Adenosyl-1-methionin
und S-Adenosyl-1-äthionin Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von
S-Adenosyl-1-methionin und S-Adenosyl-1-äthionin aus Hefe und die weitere Reinigung
dieser Substanzen.
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S-Adenosyl-1-methionin (kurz SAM genannt) ist eine der wichtigsten
biologisch vorkommenden Schwefelverbindungen, die bei allen enzymatischen Transmethylierungsreaktionen
als Methyldonor auftritt. Diese Methylgruppenübertragung ist von fundamentaler Bedeutung
flir die Physiologie aller Organismen und erklärt das große Interesse der Pharmazie
und Biochemie ftlr diese Verbindung. Beispielsweise
ist SAM der
Methyldonor in der Biosynthese folgender Substanzen: N-MethyltetrahydroSolsäure,
methionin, Cholin, Adrenalin, Metadrenalin, Creatin, Anserin, 1-Methylhistamin,
N-Methylnicotinamid, Spermidin, Spermin, verschiedenen Alkaloiden, Ribonucleinsäure
und Desoxyribonucleinsäure. Ähnliche Eigenschaften weist das S-Adenosyl-1-äthionin
(SAÄ) auf.
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Die Darstellung von SAM erfolgte bisher durch Methylierung von S-Adenosyl-1-homocystein
mit Methyljodid zum Racemat oder durch Isolierung aus Hefe.
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Eine weitere Methode ist die enzymatische Synthese aus Adenosintriphosphat
und 1-Methionin.
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Diese Verfahren sind entweder sehr aufwendig oder sie führen wie bei
der Isolierung aus Hefe nur zu einer wässrigen Lösung eines sehr unreinen Produktes.
Beispielsweise erfordert die chemische Synthese S-Adenosyl-1-homocystein, ein Produkt,
das nur schwer herzustellen ist und liefert bei mäßiger Ausbeute ein nur zu 50 %
biologisch aktives Produkt.
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Bei der enzymatischen Synthese muß zuerst ein Enzym aus Kaninchenleber
isoliert werden, was für ein technisches Verfahren viel zu teuer und umständlich
ist.
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Pür ein technisches Verfahren kam daher in erster Linie die Isolierung
aus Hefe in Betracht, die jedoch nach den bisher bekannten Verfahren zu einem Produkt
führt, welches eine sehr störende, kaum entfernbare Verunreinigung enthält. Außerdem
ist die Ausbeute unbefriedigend.
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Bedingt durch die chemischen Eigenschaften von SAM und SAÄ bereitet
die Isolierung und Reinigung dieser Verbindungen aus Hefe erhebliche Schwierigkeiten.
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S-Adenosyl-1-methionin bzw. -äthionin ist sehr instabil und zerfällt,
je nach den Bedingungen, in verschiedene Bruchstücke durch Spaltung bei b, B, C,
D und E, wie die nachstehende Strukturformel seigt:
Die Bindung A wird bevorzugt bei erhöhter Temperatur gespalten, die von B, C und
3 bevorzugt im alkalischen Medium. Bei stark saurem pH wird ebenfalls die glykosidische
Bindung B zerstört.
Daraus ergibt sich, daß die Substanz nur in
schwach saurem pH-Bereich stabil sein kann, was andererseits die Isolierung und
Aufarbeitung sehr erschwert.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den Bedarf an SAM zu befriedigen,
die Nachteile der bekannten Verfahren zu beseitigen und ein Verfahren zu schaffen,
das auch in technischem Maßstabe durchführbar ist.
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Nunmehr wurde überraschenderweise gefunden, daß SAM mit guter Ausbeute
ohne größere Degradation aus der Hefe isoliert und in reiner fester Form ohne unerwtinschte
Verunreinigungen erhalten werden kann.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von S-Adenosyl-1 -methionin
oder S-Adenosyl-1-äthionin aus Hefe durch sauren Aufschluß und KationenaustauscherchroFatographie
ist dadurch gekennzeichnet, daß in beliebiger Reihenfolge eine Picrinsäurefällung
durchgeführt oder bzw. und Borsäure zugesetzt und die schwachalkalisch gestellte
Boratkomplexlösung über einen Anionenaustauscher chromatographiert wird.
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Als Ausgangsprodukt für die Isolierung dient eine in bekannter Weise
durch Zusatz von Methionin bzw. Äthionin an SAM und SdÄ angereicherte Hefe, wie
z.B. Saccharomyces cerevisiae oder Torulopsia Diese Hefe wird in bekannter Weise
in saurem Milieu aufgeschlossen.
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Dieser bekannte saure Aufschluß wird mit 1,5 N Perchlorsäure oder
Trichloressigsäure bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei in mittlerer Ausbeute
eine wässrige Lösung eines Rohproduktes erhalten wird, aus welchem die Säuren vor
der weiteren Aufarbeitung entfernt werden müssen. In großtechnischem Maßstab ist
diese Methode ungeeignet. Die zur Gewinnung von Coenzymen ebenfalls häufig durchgeführte
Aufschlußmethode in der Siedehitze ist bei SAM und SAX nicht durchführbar, da hierbei
die Bindung A wie oben näher erläutert gespalten wird. Es wurde nunmehr überraschend
gefunden, und vorzugsweise wird erfindungsgemäß der Auf schluß auf diese Weise durchgeführt,
daß durch kurzzeitiges Erhitzen der Hefe bei pH O bis 3,5 auf eine Temperatur von
50 bis 700C eine wesentliche Verbesserung des Aufschlußergebnisses erzielt werden
kann. Besonders bevorzugt wird hierbei die Verwendung von verdünnter Ameisensäure,
beispielsweise mit einer Konzentration von 0,05 bis 0,5 M, ein pH-Wert von 2,0 bis
3,0 und eine Temperatur von 6000. Die Verwendung von Ameisensäure unter diesen Bedingungen
führt zu keiner merklichen Zersetzung der gewünschten Verbindungen, setzt SAM und
SAX praktisch quantitativ aus den Hefezellen frei und erfordert keine vorherige
Abtrennung der zum Aufschluß verwendeten Säure vor der weiteren Reinigung über einen
Kationenaustauscher.
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Außerdem verläuft der Aufschluß sehr rasch und trotzdem vollständig.
Gut geeignet ist auch Essigsäure.
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Nach dem Aufschluß wird der gewonnene wässrige Extrakt entweder nach
Entfernung der Perchlorsäure oder Trichloressigsäure in bekannter
Weise
oder bei Verwendung von Ameisensäure direkt auf einen Kationenaustauscher gegeben
und nach Waschen mit verdünnter Mineralsäure, beispielsweise Q,1 N Schwefelsäure
oder Salzsäure eluiert. Als Kationenaustauscher hat sich besonders Amberlite IRC-50
bewährt.
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In dem so gewonnenen sauren Eluat wird SAM bzw. SAÄ entweder als Picrat
gefällt oder durch Borsäurezusatz in den Boratkomplex überführt und in schwach-alkalischem
Medium über einen Anionenaustauscher chromatographiert. Nach beiden Methoden gelingt
es, die nach dem bisherigen Verfahren nicht abtrennbare störende Verunreinigung
zu entfernen und ein sehr reines Produkt zu erhalten.
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Vorzugsweise werden die beiden erfindungsgemäßen Verfahreneschritte
kombiniert in beliebiger Reihenfolge angewendet.
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Die Picratfällung erfolgt vorzugsweise durch Zusatz einer kaltgesättigten
wässrigen Picrinsäurelösung und Stehenlassen der so erhaltenen Mischung bei Zimmertemperatur.
Es ist jedoch auch möglich, hierbei in der Kälte su arbeiten. Nach dem Ausfallen
des SAM- bzw. SA-Picrates wird der Niederschlag vom Überstand getrennt, beispielsweise
durch Filtrieren oder Zentrifugieren und wieder gelöst. Als Lösungsmittel besonders
geeignet ist eine Mischung aus verdünnter Mineralsäure und einammit Wasser mischbaren
Lösungsmittel. Wegen ihrer leichten Entfernbarkeit als schwer lösliches Salz wird
hierbei Schwefelsäure bevorzugt. Als organisches Lösungsmittel eignen sich vor allem
Alkohole und Ketone, insbesondere
Aceton. Das auf diese Weise gebildete
Mineralsalz von SAN oder sAÄ läßt sich durch Zugabe von weiterem organischen Lösungsmittel
wieder ausfällen, wobei die Picrinsäure gelöst im Uberstand zurückbleibt. Das eo
erhaltene Präparat weist einen Reinheitsgrad von etwa 40 % auf und enthält vor allem
eine störende Komponente nicht mehr, welche bei der bekannten Fällung als Reineckat
bsw. Phosphorwolframat nicht abtrennbar ist. Außerdem ist die Picrinaäure wesentlich
billiger als diese bisher verwendeten Fällungsmittel und daher unter Jedem Gesichtspunkt
vorteilhafter.
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alternativ oder zusätzlich werden SAM und sAÄ als Boratkomplex über
einen Anionenaustauscher gereinigt. SAM und SAX besitzen einen protonierten Schwefel
und stellen daher ein starkes Kation dar, welches von Anionenaustauschern nicht
absorbiert wurde. Nunmehr wurde gefunden, daß durch Zusatz von Borsäure oder einem
geeigneten Borsäurederivat SAM und SAK einen Boratkomplex bilden, welcher an Anionenaustauschern
adsorbierbar ist. Weiter wurde überraschenderweise gefunden, daß dieser Boratkomplex
in schwachalkalischem Milieu in Gegensatz zu freiem SAM bzw. sAÄ relativ stabil
ist. Während z.B. SAM bei pH 8,8 in 24 Stunden zu 70 % gespalten wird, sinkt die
Aktivität des entsprechenden Boratkomplexes in 72 Stunden beim gleichen pH-Wert
nur um 30 k. Diese Stabilität ermöglicht die alkalische Chromatographie ohne wesentliche
Zerstörung, da die Bindungen B, C.und E hierbei eine wesentlich erhöhte Beständigkeit
aufweisen.
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Die Boratkomplexlösung wird in schwach-alkalischem Medium, günstig
bei pH 7,0 bis 9, auf den Anionenaustauscher gegeben. Bevorzugt wird ein pH-Wert
von 8.
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Als Anionenaustauscher eignen sich die üblichen Produkte, wie z.B.
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Dowex 1x2, vorzugsweise. in der Boratform. Die Chromatographie wird
zur Erhöhung der Stabilität des SAM bzw. SAä vorzugsweise unter Kühlung durchgeführt,
insbesondere bei einer Temperatur zwischen O und 5°C. Die Elution des Anionenaustauschers
erfolgt mit verdünnter Säure, beispielsweise Ameisensäure.
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Besonders vorteilhaft ist, wie erwähnt, eine kombinierte Anwendung
der beiden erfindungsgemäßen Verfahrensschritte. Diese erfolgt vorzugsweise derart,
daß zuerst die Picratfällung und dann die Chromatographie des Boratkomplexes durchgeführt
wird. Man erhält auf diese Weise SAM und SAK in sehr hoher Reinheit. Vorteilhaft
wird das Produkt aus seiner wässrigen Lösung in Form des Bisulfas durch Zusatz eines
mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel6 gefällt. Hierzu wird vorzugsweise
eine Mischung von Methanol mit einem weiteren organischen Lösungsmittel, insbesondere
einem niedrigen Keton oder Alkohol, oder einem Äther, verwendet. Man erhält eo ein
farbloses Pulver, welches in der Kälte monatelang stabil ist.
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Zur weiteren Reinigung kann günstig auch noch eine Chromatographie
über Aktivkohle durchgeführt werden, um begleitende Salze zu entfernen. Vorzugsweise
erfolgt die Elution von SAM und SAÄ von der Kohle bei pH 4 bis 5 mit einem Pyridin
als Base enthaltenden Lösungsmittelgemisch. Diese Arbeitsweise ist vorteilhafter
als die übliche Elution mit Ammoniak oder Natronlauge bei pH 8.
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Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin
zu sehen, daß eine nach den bisher bekannten Verfahren nicht abtrennbare störende
Verunreinigung entfernt werden kann. Hierbei handelt es sich um eine Substanz, die
eine schwache Anfärbung mit Ninhydrin ergibt. Sie läßt sich weder durch den Hefeaufschluß
noch durch Perchlorsäure fällen. Erst ein großer Vberschuß an Trichloressigsäure
führt zur Ausfällung eines eiweißartigen Produktes, welches aber anschließend im
Gegensatz zu normalem Eiweiß sehr gut wasserlöslich ist.
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Ein weiterer wesentlicher Vorteil des Verfahrens der Erfindung besteht
in der Möglichkeit, SAM bzw. SAX in Form des Sulfates auszufällen. Bisher war eine
Fällung im üblichen Sinne nicht möglich. Die im Handel erhältlichen SAM-Präparate
liegen als Jodid vor und werden aus der Lösung durch Konzentrieren bis zir Trockne
und Homogenisieren des festen Rückstandes mit absolutem Alkohol gewonnen. Auf diese
Weise werden die Verunreinigungen praktisch alle weiter mitgeschleppt, während sie
bei der erfindungsgemäß durchführbaren Fällung abgetrennt werden.
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Die Verbindungen SAM.HS04 und SAÄ.HS04 sind neu.
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Die folgenden Beispiele erläutern Ausführungsformen der Erfindung.
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Beispiel 1 10 kg an SAM nach Schlenk (Enzymologia 29, 283 (1965))
angereicherte Bäckerhefe wird in 40 1 0,1 m Ameisensäure suspendiert, 5 Minuten
auf 600C erhitzt und sofort wieder gekühlt. Der durch Zentrifugieren von den Zellfragmenten
befreite ttberstand wird bei O bis 10°C über eine Chromatographiesäule (Länge ca.
140 cm, 5,5 bis 6 cm) mit Kationenaustauscherharz Amberlite IRC-50, Ammoniumform
(mit Essigsäure auf pH 6 äquilibriert) gegeben, mit 20 ml 0,1 m Essigsäure gewaschen
und mt 0,1 n Schwefelsäure eluiert. Die SAM-haltigen Fraktionen werden vereinigt
(Prüfung auf SAM durch Papier- oder Dünnschichtchromatographie System Isopropanol:H20:Eisessig
= 50:50:25. RF von SAM = 0,4), mit 8 1 einer kaltgesättigten, wässrigen Picrinsäurelösung
versetzt und über Nacht stehengelassen. Der Picratniederschag wird abfiltriert,
mit eiskalter Picrinsäurelösung gewaschen und in einer Mischung aus 800 ml Aceton
und 800 ml In Schwefelsäure gelöst. Diese Lösung wird unter gutem Rühren in 8 1
Aceton eingegossen, der ausgefallene Niederschlag abzentrifugiert, 2mal mit Aceton
gewaschen und im Vakuum getrocknet (ca. 60 g Zwischenprodukt mit etwa 40 % SAM).
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Die 60 g Zwischenprodukt werden in 300 ml dest. H20 gelöst, auf OOC
gekühlt, mit 30 g Borsäure versetzt und mit Barytlauge auf
pH 8,0
gestellt. Das ausgefallene Bariumsulfat wird abzentrifugiert und der klare Überstand
über einen Borat beladenen Anionenaustauscher (Dowex 1x2, 50 - 100 mesh, Säulendimension
Länge ca.
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100 cm, 3 cm) bei O bis 50C chromatographiert. Die Säule wird mit
wenig dest. Wasser von OOC gewaschen und mit 0,5 n Ameisensäure eluiert. Die SiM-haltigen
Fraktionen werden vereinigt, mit Schwefelsäure auf pH 1 bis 2 angesäuert und auf
eine 1,5 1 Chromatographiesäule mit Carboraffin C-gohle bei 0°C aufgezogen. Die
Säule wird mit 5 1 eiskaltem dest. Wasser gewaschen und mit Äthanol:H2O:Pyridin-(=100:100:5)
Gemisch bei OOC eluiert. Die SBM-haltigen Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum
auf ca. 300 ml konzentriert und mit Schwefelsäure auf pH 1 angesäuert.
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Diese schwefelsaure Lösung wird unter gutem Rührern in eine Mieichung
aus 3 1 Aceton und 1,5 1 Methanol gegossen. Der auagefallene Niederschlag von SAM
HSO4 wird abzentrifugiert, 2mal mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet.
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Ausbeute: 25 g SAM . HS04 mit 70 % SAM, 23-% S04, 5 bis 6 % H20 Beispiel
2 Es wird wie im Beispiel 1 verfahren, jedoch wird das getrocknete Zwischenprodukt
in 500 ml dest. Wasser gelöst und, wie unter Beispiel
1 beschrieben,
über eine Chromatographiesäule mit Carboraffin C Kohle chromatographiert. Durch
den Wegfall der Boratchromatographie wird die Ausbeute auf Kosten der Reinheit etwas
höher.
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Ausbeute: 32 g AM . HSO4 mit ca. 60 Beispiel 3 Der Hefeaufschluß und
die Chromatographie über Amberlite 1 - 0 werden wie unter Beispiel 1 beschrieben
durchgeführt. Die vereinigtan SAM-haltigen Eluate werden auf 1,5 1 im Vakuum konzentriert
und in 15 1 Aceton unter gutem Rühren eingegoßsen. Der ausgefallene Niederschlag
wird abzentrifugiert, 2mal mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Es werden
etwa 130 bis 150 g rohes SAM . HS04 erhalten, die wie unter Beispiel 1 beschrieben
als Boratkomplex über einen Anionenaustauscher und eine Eohlesäule chromatographiert
und anschließend gefällt werden.
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Ausbeute: 30 bis 32 g SAM . HS04 mit ca. 60 % SAM.