DE1815225C3 - Verfahren zur mikrobiologischen Gewinnung von Orotidin aus einer Fermentationsflüssigkeit - Google Patents
Verfahren zur mikrobiologischen Gewinnung von Orotidin aus einer FermentationsflüssigkeitInfo
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/38—Nucleosides
- C12P19/385—Pyrimidine nucleosides
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Description
Orotidin ist das N-Ribosid des 6-Carboxyuracils, d. h. der Orotsäure. Es weist nachstehende Strukturformel
auf:
M g
vn üblichen Kohlenstoffquellen, n.
r-irate. Vorzugsweise wird Sac '
HO OH
35
Da die Nachfrage nach Orotidin, insbesondere als Zwischenprodukt für Synthesen in der Pyrimidinreihe,
ständig steigt, besteht Bedarf nach einem zur technischen Durchführung geeigneten einfachen Gewinnungsverfahren.
Es ist bekannt, Orotidin. aus dem Mycel von pyrimidinbedüftigen
Neurospora crassa-Mutanten zu gewinnen. Dieses Verfahren (USA.-Patentschrift 2 788 346) hat jedoch den Nachteil, daß die Aufarbeitung
des Mycels umständlich ist, viele störende Begleitsubstanzen und Verunreinigungen entfernt werden
müssen und die Ausbeute unbefriedigend ist. Ferner ist es bekannt, Orotidin aus den Wachstumsbrühen pyrimidinbedürftiger Mutanten der Bakterien-
stamme Micrococcus glutamicus, Brevibacterium ammoniagenes und Corynebacterium rathayi sowie Bacillus
subtilis (britische Patentschrift 1 006 732) zu gewinnen. Diese von Bakterienmutanten ausgehenden
Verfahren haben den Nachteil einer gegenüber der Verwendung von Pilzmutanten wesentlich erhöhten
Infektionsgefahr der Ansätze, einer schwierigeren Trennung der Zellmasse vom Medium und einer weit
stärkeren Verunreinigung mit Fremdsubstanzen und Farbstoffen, so daß die Aufarbeitung der Brühen und
die Reinigung des Orotidins erschwert ist.
Die Nachteile dieser bekannten Verfahren werden beseitigt durch die erfindungsgemäße Verwendung
voh durch Züchten von Neurospora crassa FGSC 36 601 in hierfür üblichen Pyrimidin enthaltenden
Nährmedien erhaltenen Fermentationsflüssigkeiten zur Gewinnung von Orotidin.
Die Züchtung von Neurospora crassa 36 601 in Pyrimidin enthaltenden Nährmedien, wöbe. . .,ots:iure
in der Fermentationsflüssigkeit erhalten .:rd.
is^bereks bekann. (Journal of Biol. Chem., Vol. :-.
1948 S ^25).
Im Rahmen · 1^r Windung können bekannte WV. hstumsmedien
u-r.wndot worden, die z. B. in der I/ Λ.-Patentschrif;
: ";':<-" ^'' beschrieben sind. Vor,iL-sweise
wird"<■■'■■ vh ei:. Medium verwendet, weites
mindester..-, lli'i. , -r/ugswcise 0.02 bis 0.04 Gewiss
Volumprozent -numionen und mindestens 3. ■ nr-7uasweise
30 l·:- .·■) mg 1 Zn-Ionen enthält. Es v...,de
befunden. daü -'-- -'inern derartigen Medium ,iie
Ausbeute an .-..rü/.ellulärem Orotidin \veser,;--.ii
gesteigert wc: ■ ·;! '-.ann.
~ Die" Züch -; ί·:->' Neurospora crassa-Mu;.:: te
erfolgt erfirii ■■_ >;iß bei einem pH-Wc-^t zwis^i.n
3.5 und 5.5. -.■>. ^ · - :ise bei pH 4,0 bis 4,4. Wäh. nd
der Züchhir.izv ■ '■ -'-' w'rd darauf geachtet, dal.'· ',ie
KohlenstiMtqüe:.·. im Medium in genügender konzentration
μ■■-';:■ .'. ! !!orderlichenfalls werden nachträglich
weit·.·:-.· ! r.iien der Kohlenstoffquelle /umsetzt.
Als K-'hi_ii^i-"»ii"Mue!Ie eigner s'cn d'e bi I<
züchtung-wr:.!1 ff
züchtung-wr:.!1 ff
besondere K■.■■',
rose verwende
rose verwende
Die Züehtuivj^.iauer bis zur Abtrennung des Micriorganismu^
iicu' ?m illgemeinen zwischen 8 und
14Tacen. je nachdem, ob eine Infektion erfolgte
und ob die optische Dichte bei 280 m;z noch zunimmt.
Gewöhnlich wird ein Endwert OD280 zwischen 20
und 60, m1 er/ielt
Die Gewinnung des extrazellulär akkumulierten
Orotidins erfolgt" au sehr einfache Weise durch
physikalische Filtration des Mycels und Isolierung des Orotidins aus dem Medium. Verfahren zur Isolierung
von Or tidin aus wäßrigen Nährmedien sind bekannt und können hierzu angewendet werden.
Beispielsweise kann das Orotidin durch Fällung mit Bleisubacetat in bekannter Weise isoliert werden.
Nach Abtrennung des Bleis aus dem so gewonnenen Niederschlag wird das Orotidin dann in das Cyclohexylaminsalz
übergeführt und eingeengt und mit organischen Lösungsmitteln gefällt.
An Stelle des bekannten Verfahrens kann eine Kohlechromatographie in saurem Medium durchgeführt
werden. Hierbei wird günstig ein pH-Wert zwischen 2 und 4, vorzugsweise 2,2 bis 2,5, eingestellt.
Die Elution der Kohlesäule erfolgt günstig mit neutralem oder schwach basischem Wasser-Alkohol-Gemisch.
Die Kohlechromatographie kann vorteilhaft mit weiteren Reinigungsschritten kombiniert werden. Besonders
günstig ist als nächster Schritt eine Chromatographie an einem Anionenaustauscher wie z. B. an
einem kugelförmigem, stark basischem Polystyrol-Anionenaustauscherharz
mit quaternären Benzylammoniumgruppen und mit 8% einpolymerisiertem
Divinylbenzol. Zur Elution eignet sich beispielsweise eine 0,05 bis 0,1 N Ameisensäure-Ammoniumformiatlösung.
An Stelle der Austauscherchromatographie oder im Anschluß an diese kann die Kohlechromatographie
wiederholt werden, wobei ebenfalls vorteilhaft die oben angegebenen Bedingungen eingehalten werden.
Weiterhin wurden günstige Ergebnisse erhalten, wenn im Anschluß an die erste oder an die zweite
Kohlechromatographie eine erneute Ionenaustauscherchrpmatographie durchgeführt wird, beispielsweise
unter Verwendung eines kernsulfonierten Poly-
Ntyrolharzes von kugelförmigem Korn mit 8% einpolymerisienem
Divinylbenzol. Falls diese zweite lonenaustauscherchromatographie im Anschluß an
eine zweite Kohlechromatographie durchgeführt wird, erhält man ein besonders reines Produkt. Bei An-
»\ endung dieser zweimaligen Wiederholung der Kohlehromatographie
und der Austauscherchromatographie erhält man eine Ausbeute von etwa 40 g pro i'iOl Medium an 95- bis 100%ig reinem Orotidin.
Die Feinreinigung an einem kernsulfonierten PoIyi\rolharz
von kugelförmigem Korn mit 8% ein- : ülymerisiertem Divinylbenzol läßt sich jedoch auch
.iirekt nach der ersten Kohlechromatographie anu enden und führt auf diese Weise ebenfalls zu einem
; Todukt sehr guter Reinheit. Dies gilt in noch höherem
Maße dann, wenn zwei Kohlechromatographieschritte unmittelbar hintereinandergeschaltet wurden ohne
vnwcndung einer ernten Anionenaustauscherehroniatügraphk.
Bei der Austauscherfeinchromatographie. z. B. an dem obigen kernsulionierten Polystyrolharz,
wird der Austauscher gewöhnlich in H + -Form verwendet. Es ist jedoch auch möglich, statt dessen
einen mit Cyclohexylamin beladenen Austauscher /u verwenden, wobei die Umsetzung des Salzes mit
dem Cyvlohexylamin nach Durchführung der Reinigungsschritte
in Wegfall kommen kann. Ein ganz besonders einfaches Verfahren besteht daher darin,
nach Durchführung der ersten Kohlechromatographie sofort eine Ionenaustauscherchromatographie über
einen mit Cjw-lohexvlamin beladenen Ionenaustauscher,
wie des obige 1! ernsui'.mierte Polystyrolharz,
durchzuführen und aus dem Durchlauf direkt das C yclohexylammoniumsalz des )rotidins zu kristallisieren.
Es ist auch möglich, das Orotidin in Form anderer Salze zu gewinnen, beispielsweise in Form des Natriumsalzes.
So kann die jeweils erhaltene Orotidinfraktion bis zur Sirupkonsistenz eingeengt, mit Methanol
oder einem anderen niedrigen Alkohol abgedampft und dann mit einem Natriumsalz, vorzugsweise
NaJ-Lösung in Aceton, versetzt werden. Man erhält so direkt das Natriumsalz des Orotidins in
nahezu quantitativer Ausbeute. Das Natriumsalz läßt sich hierbei mit Aceton frei von restlichem NaJ
waschen. Auf die Isolierungsmethoden zur Gewinnung des Orotidins wird hier kein Wert gelegt.
Die Erfindung ermöglicht eine wesentliche einfachere Gewinnung von Orotidin als das bekannte
Verfahren unter Verwendung von Neurospora crassa (USA.-Patentschrift 2 788 346) und ergibt demgegenüber
eine etwa lOfach größere Ausbeute. Gegenüber der Verwendung von Bakterienmutanten (britische
Patentschrift 1 006 732) erlaubt sie die Züchtung in einem sauren pH-Wert-Bereich, bei dem die sonst
vorhandene Infektionsgefahr wesentlich herabgesetzt ist. Ferner ist die Abtrennung der Zellmasse vom
Medium bei Neurospora crassa (FGSC 36601) wesentlich einfacher als beim Arbeiten mit Bakterien, was
für das Arbeiten in technischem Maßstab von großer Bedeutung ist. Schließlich sind auch Bakterienkulturmedien
erfahrungsgemäß stärker mit Fremdsubstanzen und Farbstoffen verunreinigt wie Neurospora
crassa-Kulturmedien, so daß sich eine grundsätzlich einfachere Reinigung sowie reinere Endprodukte ergeben.
Die Nacharbeitung der bekannten Verfahren unter Verwendung von Bakterien hat ergeben, daß
es außerordentliche Schwierigkeiten bereitet, ein auch nur einigermaßen reines Produkt zu erhalten.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung weiter. Beispiel 1
In einer 200-1-Umlaufapparatur werden 100 1 eines
sterilen Mediums der nachstehend beschriebenen Zusammensetzung mit 4 1 einer Neurospora crassa-36601
Kultur beimpft.
Zusammensetzung des Mediums
Ammoniumtartrat 500 g
Ammoniumnitrat 100 g
K2HPO4 100 g
werden in 85 1 entsalztem Wasser im Kessel aufgelöst und sterilisiert. Dann werden 2 kg Saccharose in
2x51 entsalztem Wasser sterilisiert.
MgSO4 -7H2O 50 g
NaCl 70 g
CaCI2 10 g
Cytidinsulfat 1.5 g
ZnSO4-7 H2O 10 g
Spurenelementlösung 100 ml
werden in 5 1 entsalztem Wasser gelöst und sterilisiert.
Dann werden sämtliche Lösungen steril vereinigt.
Während der Fermentation im Umlaufapparat
wird der pH-Wert durch Zusatz von Ammoniak zwischen 4,0 und 4,4 gehalten. Nach 3 Tagen wird
die Saccharosekonzentration bestimmt und auf 10 g 1 nachgestellt. (Dann wird die Saccharosekonzentration
täglich kontrolliert und auf den angegebenen Wert nachgestellt.) Die Fermentation wird fortgesetzt, bis
die optische Dichte OD280ZmI zwischen 20 und 60
liegt (etwa 8 bis 14 Tage).
Danach werden die Organismen abzentrifugiert. Der überstand wird auf pH "".,3 eingestellt und" dann
auf eine Kohlesäule gegeben. Die Kohlesäule wird auf 340 ml Naßvolumenkohle pro 100 000 OD260
dimensioniert. Nach saurem und neutralem Waschen wird mit einer Mischung von Äthanol und Wasser
1:1, die 2 ml Ammoniak im Liter enthält, eluiert.
Die Hauptmenge des Orotidins erscheint in den ersten 51 Eluat. Die orotidinhaltigen Fraktionen
werden vereinigt, konzentriert und stehengelassen. Auskristallisiertes Uracil bzw. Orotsäure wird abgetrennt
und das Konzentrat auf eine Säule mit einem kugelförmigen, stark basischen Polystyrol-Anionenaustauscherharz
mit quaternären Benzylammonium-
5J Gruppen und mit 8% einpolymerisiertem Divinylbenzol
in Formiatform gebracht. Nach Waschen mit Wasser wird mit 0,077 N-NH4OOCH/HCOOH (Herstellung:
1,4N-HCOOH und 0,8N-NH4OOCH 1 : 1 mischen und mit H2O die Normalität an
. 55 NH4OOCH einstellen) eluiert.
Die orotidinhaltigen Fraktionen werden vereinigt, auf pH 2,3 eingestellt und erneut auf einer Kohlesäule,
wie oben, Chromatographien. Aus dem Eluat wird nach Zusatz von Cyclohexylamin das Orotidin-
.60 Cyclohexylaminsalz durch Stehenlassen in der Kälte kristallisiert.
Es wird wie im Beispiel 1 beschrieben vorgegangen. Das Eluat der zweiten Kohlechromatographie wird
jedoch zur Entfernung von NH3 und Alkohol eingeengt und auf eine Säule mit einem kernsulfoniertem
Polystyrolharz von kugelförmigem Korn mit 8%
einpolymerisiertem Divinylbenzol in H'-lorni gegeben.
Der Durchlaut'wird mn 2,5 g CvclolKxylamir.
je (jramni Oroiidin versetzt, kenzentriert und mit
Methanol aufgenommen. Das Einengen und Abdampfen mit Methanol wird mehrfach wiederholt
und das schließlich erhaltene sirupöse konzentrat
mit wenig Aceton versetzt. Nach Stehenlassen und Anreiben in der Kälte tritt Kristallisation ein.
Ausbeute: etwa 40g pro 100 1 Medium 95- bi-,
lOO'Oises Orotidin.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verwendung von durch Züchten von Neurospora crassa FGSC 36 601 in hierfür üblichen Pyrimidin enthaltenden Nährmedien erhaltenen Fermentationsflüssigkeiten zur Gewinnung von Orotidin.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19681815225 DE1815225C3 (de) | 1968-12-17 | 1968-12-17 | Verfahren zur mikrobiologischen Gewinnung von Orotidin aus einer Fermentationsflüssigkeit |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19681815225 DE1815225C3 (de) | 1968-12-17 | 1968-12-17 | Verfahren zur mikrobiologischen Gewinnung von Orotidin aus einer Fermentationsflüssigkeit |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1815225A1 DE1815225A1 (de) | 1970-06-18 |
DE1815225B2 DE1815225B2 (de) | 1973-03-15 |
DE1815225C3 true DE1815225C3 (de) | 1973-10-18 |
Family
ID=5716489
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19681815225 Expired DE1815225C3 (de) | 1968-12-17 | 1968-12-17 | Verfahren zur mikrobiologischen Gewinnung von Orotidin aus einer Fermentationsflüssigkeit |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE1815225C3 (de) |
-
1968
- 1968-12-17 DE DE19681815225 patent/DE1815225C3/de not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE1815225B2 (de) | 1973-03-15 |
DE1815225A1 (de) | 1970-06-18 |
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E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
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