CN114099536B - 用于下调Czib基因表达的试剂在制备治疗或改善肺纤维化的药物中的应用 - Google Patents
用于下调Czib基因表达的试剂在制备治疗或改善肺纤维化的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于下调Czib基因表达的试剂在制备治疗或改善肺纤维化的药物中的应用，涉及生物医学技术领域，本发明针对肺纤维调控功能基因进行研究，首次提出基因Czib与肺纤维化的发生有显著的关系，发现下调Czib基因的表达水平能达到抑制肺纤维化发生的效果。此外，还筛选到特异性的针对Czib的靶点，根据该靶点设计的siRNA可以有效地抑制博莱霉素诱导的A549细胞的损伤、凋亡、线粒体膜电位下降以及细胞上皮间质转化，为肺纤维化、细胞损伤的治疗以及细胞上皮间质转化的抑制提供了新的途径和研究方向。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及用于下调Czib基因表达的试剂在制备治疗或改善肺纤维化的药物中的应用。
背景技术
肺纤维化作为多种间质性肺病的终末结局，是一种慢性进行性致死疾病，其病理学特点为肺实质破坏、肺泡上皮细胞表型显著变化、细胞外基质的沉积以及成纤维细胞异常增殖与积累。现在已知200多种原因可以引起肺纤维化，如遗传性疾病、自身免疫性疾病、暴露于环境中有毒物质、药物和放射等，其中未发现病因的肺纤维化称作特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF)。据统计，全球每年约新增IPF患者500万人，预后较差，诊断后中位生存期为2-3年。
尽管现在已经开展了大量研究，但仍缺乏对机理的认识和临床处理对策，除肺移植外，尚无有效的治疗方法。美国FDA批准的两种抗纤维化药物，Nintedanib(尼达尼布：小分子酪氨酸激酶的抑制剂)和Pirfenidone(吡非尼酮：生长因子和胶原前体生成抑制剂)仅对减缓病情恶化有一定的积极作用，但两种药物都有明显的副作用。因此，深入研究肺纤维化发病机制，找逆转纤维化的新靶点和研发低副作用药物具有重要的意义，为肺纤维化的基础研究和临床治疗提供新理论和新对策。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供用于下调Czib基因表达的试剂在制备治疗或改善肺纤维化的药物中的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了用于下调Czib基因表达的试剂在制备治疗或改善肺纤维化的药物中的应用。
第二方面，本发明实施例提供了用于下调Czib基因表达的试剂在制备药物中的应用，所述药物具备以下至少一项功能：抑制细胞损伤、抑制细胞凋亡和抑制线粒体膜电位的降低。
第三方面，本发明实施例提供了用于下调Czib基因表达的试剂在制备抑制细胞上皮间质转化的药物中的应用。
第四方面，本发明实施例提供了一种治疗或改善肺纤维化的药物，其包括用于下调Czib基因表达的试剂。
第五方面，本发明实施例提供了一种治疗或改善肺纤维化的药物组合物，其包括前述实施例所述的治疗或改善肺纤维化的药物。
本发明具有以下有益效果：
本发明针对肺纤维调控功能基因进行研究，首次提出基因Czib与肺纤维化的发生有显著的关系，发现下调Czib基因的表达水平，能够达到抑制肺纤维化发生的效果。此外，还筛选到特异性的针对Czib的靶点，根据该靶点设计的siRNA可以有效地抑制博莱霉素诱导的A549细胞的损伤、凋亡、线粒体膜电位下降以及细胞上皮间质转化，为肺纤维化、细胞损伤的治疗以及细胞上皮间质转化的抑制提供了新的途径和研究方向。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中Czib在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中的表达变化，其中A为免疫组化检测结果，B为免疫印迹检测结果；
图2为实施例2中Czib在博莱霉素诱导的A549细胞中的表达；其中，A为qPCR的检测结果，B为免疫印迹的检测结果；
图3为实施例3中Czib siRNA的筛选结果；其中，A为不同siR处理后Czib的mRNA表达量的变化，B为不同siR处理后Czib蛋白的变化；
图4为实施例4中siR-Czib抑制了博莱霉素诱导的A549细胞的损伤；其中，A为mRNA水平的变化，B为蛋白水平的变化；
图5为实施例5中siR-Czib对博莱霉素诱导的A549细胞的凋亡的影响结果；
图6为实施例6中siR-Czib对博莱霉素诱导的A549细胞的线粒体膜电位的影响结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
Czib(CXXC motif containing zinc binding protein)，在大鼠中位于第5号染色体上，有8个外显子，由160个氨基酸组成，计算分子量约为18KD。Czib在多种动物中均有表达且保守型较高，其中，大鼠和小鼠中同源性达到90％以上，特别是大鼠和小鼠的同源性达到了95％以上。由于其在人和其他一些动物中位于1号染色体开放阅读框123中，又称C1ORF123。Czib在人中有7个外显子，由141个氨基酸组成。Czib蛋白仅存在于真核细胞中，属于真核蛋白超家族DUF866(PF05907)。Czib的核苷酸序列如下：5’-atggggaaaatcgcgctgcaactcaaagccacgctggagaacatcaccaacctccggcccgtgggcgaggacttccggtggtacctgaaggacagtgtggcactgaaggggggccgtggcagtgcttccatggtccagaagtgcaagctgtgtgcaagagaaaattccatcgagattttaagcagcaccatcaagccttacaatgctgaagacaatgagaacttcaagacaatagtggagtttgagtgccggggccttgaaccagttgatttccagccgcaggctgggtttgctgctgaaggtgtggagtcagggacagccttcagtgacattaatctgcaggagaaggactggactgactatgatgaaaaggcccaggagtctgtgggaatctatgaggtcacccaccagtttgtgaagtgctga-3’。
目前，Czib的功能未知，本发明针对肺纤维调控功能基因进行研究，首次提出基因Czib与肺纤维化的发生有显著的关系，应用Western blot和免疫组化技术检测博莱霉素诱导小鼠肺纤维化中Czib的表达变化；同时，通过筛查siRNA，筛选到特异性的针对Czib的靶点，应用cck8和Westernblot分析方法检测siRNA对博莱霉素诱导A549细胞损伤的影响，实验结果表明针对该靶点应用siRNA可以有效地抑制博莱霉素诱导的A549细胞的损伤。具体地，本发明提供的技术方案如下。
首先，本发明实施例提供了用于下调Czib基因表达的试剂在制备治疗或改善肺纤维化的药物中的应用。
在可选的实施例中，不对具体的试剂进行限制，只要满足下调Czib基因表达即可。在优选的实施例中，所述用于下调Czib基因表达的试剂包括抑制Czib基因表达的siRNA。
在优选的实施例中，所述siRNA的靶序列选自SEQ ID No.1～3中的至少一条，更优选为SEQ ID No.3所示的靶序列，基于该靶序列设计的siRNA的干扰效果尤为突出，相比其他靶标序列而言，能达到显著下调Czib基因表达的效果。
在优选的实施例中，所述siRNA包括siRNA1、siRNA2和siRNA3中的至少一种，更有选为siRNA3。
具体地，所述siRNA1的靶序列为SEQ ID No.1，siRNA1的正反义链的核苷酸序列依次如SEQ ID No.4～5所示。
所述siRNA2的靶序列为SEQ ID No.2，所述siRNA2的正反义链的核苷酸序列依次如SEQ ID No.6～7所示；
所述siRNA3的靶序列为SEQ ID No.3，所述siRNA3的正反义链的核苷酸序列依次如SEQ ID No.8～9所示。
本发明实施例还提供了用于下调Czib基因表达的试剂在制备药物中的应用，所述药物具备以下至少一项功能：抑制细胞损伤、抑制细胞凋亡和抑制线粒体膜电位的降低。
在优选的实施例中，所述用于下调Czib基因表达的试剂包括抑制Czib基因表达的siRNA。
优选地，所述siRNA的靶序列选自SEQ ID No.1～3中的至少一条。
优选地，所述siRNA包括siRNA1、siRNA2和siRNA3中的至少一种。
所述siRNA1的正反义链的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1和4所示。
所述siRNA2的正反义链的核苷酸序列依次如SEQ ID No.2和5所示。
所述siRNA3的正反义链的核苷酸序列依次如SEQ ID No.3和6所示。
在更优选的实施例中，选择siRNA3作为下调Czib基因表达试剂，相比其他siRNA而言，其具备更好的抑制效果，能更有效的达到抑制细胞损伤的功效。
本发明实施例还提供了用于下调Czib基因表达的试剂在制备抑制细胞上皮间质转化的药物中的应用。
在优选的实施例中，所述用于下调Czib基因表达的试剂包括抑制Czib基因表达的siRNA；
优选地，所述siRNA的靶序列选自SEQ ID No.1～3中的至少一条；
优选地，所述siRNA包括siRNA1、siRNA2和siRNA3中的至少一种；
所述siRNA1的正反义链的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1和4所示；
所述siRNA2的正反义链的核苷酸序列依次如SEQ ID No.2和5所示；
所述siRNA3的正反义链的核苷酸序列依次如SEQ ID No.3和6所示；
可选地，所述细胞可选自：A549细胞、IMR-90细胞和HepG2细胞中的任意一种。
在更优选的实施例中，选择siRNA3作为下调Czib基因表达试剂，相比其他siRNA而言，其具备更好的抑制效果，能更有效的达到抑制细胞损伤的功效。
本发明实施例提供了一种治疗或改善肺纤维化的药物，其包括用于下调Czib基因表达的试剂。
优选地，所述用于下调Czib基因表达的试剂包括抑制Czib基因表达的siRNA。
优选地，所述siRNA的靶序列选自SEQ ID No.1～3中的至少一条。
优选地，所述siRNA包括siRNA1、siRNA2和siRNA3中的至少一种。
所述siRNA1的正反义链的核苷酸序列依次如SEQ ID No.4～5所示。
所述siRNA2的正反义链的核苷酸序列依次如SEQ ID No.6～7所示。
所述siRNA3的正反义链的核苷酸序列依次如SEQ ID No.8～9所示。
此外，本发明实施例提供了一种治疗或改善肺纤维化的药物组合物，其包括前述任意实施例所述的治疗或改善肺纤维化的药物。
在可选的实施方式中，所述药物组合物还可以包括医学上可接受的载体，或其他用于治疗或改善肺纤维化的物质。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
Czib在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中的表达变化。
博莱霉素小鼠模型的构建：小鼠采用戊巴比妥钠(30mg/kg)肌肉注射麻醉，麻醉成功后将其固定在操作台上，消毒切皮逐层剥离暴露颈部气管，用注射器抽取0.3ml博莱霉素(Bleo)生理盐水溶液(按5mg/kg比例溶于0.2-0.3生理盐水中)，将注射器针尖对准环状软骨间隙刺入气管回抽见空气后，左手抬高动物头端一定角度，右手推动针头顺着气管后壁缓慢注射，再继续注入0.3ml空气，之后立即竖起动物左右旋转并轻拍小鼠胸背部促使药物在肺部均匀分布，对照组(Sal)用同样方法注入等体积生理盐水。21天后取材，一部分提取蛋白，一部分用多聚甲醛固定制成石蜡切片。用免疫印迹和免疫组化的方法检测Czib蛋白在博莱霉素小鼠模型中的表达变化，结果如图1所示，与对照组相比，Czib博莱霉素小鼠模型中的表达均上调(图1)。
实施例2
Czib在博莱霉素诱导的A549细胞中的表达。
构建A549细胞损伤模型：用博莱霉素处理A549细胞，72小时后，提取总蛋白，用qPCR和Western blot技术检测Czib和纤维化标志蛋白aSMA的表达。结果如图2所示aSMA上调表达，表明A549细胞损伤模型的诱导成功，在该细胞模型中Czib显著上调表达。
实施例3
制备获得有效Czib siRNA。
采用siRNA设计软件，根据GenBank获取大鼠的Czib mRNA序列(NM_001304759.2)搜索AA序列并记录每个AA 3’端相邻的19个核苷酸，筛选出GC含量在30-55％之间的siRNA。再根据siRNA设计原则进行进一步筛选，并将筛选出的siRNA序列在GenBank的基因组数据库中用BLAST检索其同源性，选用与非同源基因有3个以上的碱基错配的序列，以排除非特异性抑制的可能，在满足以上条件的基础上，筛选出3条抑制Czib表达的siRNA(见表1)。
表1靶向Czib的siRNA序列
备注：siRNA序列中，5’-3’为正义链，3’-5’为反义链。
合成表1所示的siRNA序列，同时合成一个杂乱的不识别任何哺乳动物基因的序列作为阴性对照。
取对数生长期的A549细胞，0.25％胰酶(Invitrogen公司)消化，按0.3×104个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃继续培养12h，按脂质体转染试剂(LipofectamineTM2000，Invitrogen,USA)操作说明书进行细胞转染。简言之，分别将50nM的siRNA(表1所示)和0.2μl转染试剂加入5μl OPTI-MEM培养基，室温静置5min。将上述溶液轻轻混匀，形成转染复合物，室温静置20min，加入到含0.1mL OPTI-MEM培养基的细胞中，37℃孵育4h，换完全培养基。每个实验组设置3个复孔，实验重复3次。
细胞总RNA抽提按Trizol试剂操作说明书进行(Invitrogen Corporation,Carlsbad,California,USA)，分光光度计检测其纯度(A260/280吸光值)。然后，以2μg RNA为模板，按照AMV反转录试剂盒(Promega，USA)操作说明进行反转录，得到第一链cDNA。最后，取1μl cDNA，按PCR试剂盒(Promega，USA)扩增基因，检测基因的扩增产物荧光信号值，并以Gapdh(NM_001256799.3)为内参计算基因的相对表达量(Ratio值)。每个样品做3个复孔，实验重复3次。根据基因在GenBank登录的序列号，用primer express 2.0软件设计其相应引物，并由上海生工有限公司合成(表2)。
表2 qRT-PCR的引物序列
| Genes | 上游引物(5'-3') | 下游引物(5'-3') |
| Czib | GGTGGTACCTGAAGGACAGTGTG | GTAAGGCTTGATGGTGCTGCT |
| αSMA | GTCCCAGACATCAGGGAGTAA | TCGGATACTTCAGCGTCAGGA |
| Gapdh | AGAAGGCTGGGGCTCATTTG | AGGGGCCATCCACAGTCTTC |
Czib siRNA转染A549细胞，48h后收集细胞，提取总RNA，其中28S:18S的条带约为2:1，提取RNA的OD260:280为1.9-2.1。用qRT-PCR检测Czib的表达情况。结果表明转染CzibsiRNA的A549细胞中，Czib表达量明显低于阴性对照NC组(比值分别为0.42、0.72、0.23)(图3)。用SPSS 19.0软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)的最小显著性法(leastsignificance difference,LSD)进行统计学分析，结果表明，与NC对照比，siR 2组差异显著(p＜0.05)，siR1组和siR 3组差异极显著(p＜0.01)，但三者中siR 3干涉效果最为显著，因此后续试验均采用siR 3。
实施例4
siR-Czib抑制了博莱霉素诱导的A549细胞的损伤。
采用实施例2建立博莱霉素诱导的A549细胞损伤模型，24小时后，转染筛选出的siR-Czib进入A549细胞，48小时后，提取总蛋白，用Western blot技术检测Czib和纤维化标志蛋白αSMA和上皮间质转化先关蛋白E-cadherin和N-cadherin的表达。
结果如图4所示Czib和αSMA均下调表达，表明siR-Czib抑制了博莱霉素诱导的A549细胞的损伤。上皮间质转化先关蛋白E-cadherin和N-cadherin均下调表达，说明siR-Czib可抑制细胞上皮间质转化。
实施例5
siR-Czib抑制了博莱霉素诱导的A549细胞的凋亡。
采用实施例2建立博莱霉素诱导的A549细胞损伤模型，24小时后，转染筛选出的siR-Czib进入A549细胞，48小时后，收取细胞，采用FITC Annexin V凋亡试剂盒用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。
结果如图5所示与对照组相比，siR-Czib组早期凋亡细胞比例显著减少，表明siR-Czib抑制了博莱霉素诱导的A549细胞的凋亡。
实施例6
siR-Czib抑制了博莱霉素诱导的A549细胞的线粒体膜电位的下降。
采用实施例2建立博莱霉素诱导的A549细胞损伤模型，24小时后，转染筛选出的siR-Czib进入A549细胞，48小时后，收取细胞，采用JC-10试剂盒用流式细胞仪检测线粒体膜电位变化。
结果如图6所示与对照组相比，siR-Czib组膜电位降低的细胞比例显著减少，表明siR-Czib抑制了博莱霉素诱导的A549细胞的膜电位的降低。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 河南师范大学
<120> 用于下调Czib基因表达的试剂在制备治疗或改善肺纤维化的药物中的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tccggtggta cctgaagat 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctggactgac tatgatgaa 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aatcgcgctg caactcaaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
uccgguggua ccugaagau 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
aggccaccau ggacuucua 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
cuggacugac uaugaugaa 19
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaccugacug auacuacuu 19
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 8
aaucgcgcug caacucaaa 19
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 9
uuagcgcgac guugaguuu 19
Claims (2)
1. 用于下调Czib基因表达的试剂在制备治疗或改善肺纤维化的药物中的应用，所述用于下调Czib基因表达的试剂为抑制Czib基因表达的siRNA，所述siRNA的靶序列选自SEQID No.1~3中的至少一条。
2.根据权利要求1所述的用于下调Czib基因表达的试剂在制备治疗或改善肺纤维化的药物中的应用，其特征在于，所述siRNA为siRNA1、siRNA2和siRNA3中的至少一种；
所述siRNA1的正反义链的核苷酸序列依次如SEQ ID No.4和5所示；
所述siRNA2的正反义链的核苷酸序列依次如SEQ ID No.6和7所示；
所述siRNA3的正反义链的核苷酸序列依次如SEQ ID No.8和9所示。
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