CN112206324A - Fhl2在制备治疗多囊卵巢综合征排卵障碍药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生殖医学领域，具体是FHL2在制备治疗多囊卵巢综合征排卵障碍药物中的应用。本发明优点在于：本发明针对PCOS排卵障碍发病的重要信号通路，找到PCOS发病机制中重要分子靶点FHL2，可作为未来PCOS排卵障碍的治疗靶点，对PCOS发病分子机制的研究及治疗方法提供了新思路。

Description

FHL2在制备治疗多囊卵巢综合征排卵障碍药物中的应用

技术领域

本发明涉及生殖医学领域，具体地说，是一种转录调节因子FHL2(Four and ahalf LIM domain 2)在多囊卵巢综合征治疗中的应用。

背景技术

多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome，PCOS)是育龄期妇女常见的内分泌代谢性疾病，在中国的发病率为5.6％，以稀发排卵或无排卵、高雄激素血症、胰岛素抵抗、卵巢多囊样改变为特征的内分泌紊乱症候群。对于育龄期PCOS患者，排卵障碍造成的持续性无排卵是不孕症最主要原因。PCOS排卵障碍的发病机制目前尚未明确，对PCOS引起的不孕症治疗在临床上仍是一个棘手问题。

临床上对PCOS的治疗多以针对某种临床症状为主，采取个体化对症治疗措施。对有生育要求的PCOS患者，治疗方式主要包括生活方式调整、调整月经周期、缓解高雄激素症状、胰岛素增敏剂、促排卵治疗、手术治疗以及辅助生殖技术等，但因PCOS病因尚未阐明，各种治疗方法均有一定局限性。

PCOS是一种极为复杂的内分泌代谢性疾病，目前临床上对PCOS的治疗多以针对某种临床症状为主，对有生育要求的PCOS患者，首先经过生活方式及月经周期调整等一系列治疗，但很多患者仍不能自发排卵，继而采用促排卵及辅助生殖技术治疗。针对不孕症，采用促排卵及辅助生殖技术虽能解决大多数PCOS的排卵障碍，但常规促排卵治疗容易发生卵巢过度刺激综合征，其卵子质量、受精率、种植率、流产率均受一定影响。鉴于各种治疗方法的局限性，探索PCOS发病的分子机制以寻找较为关键的治疗靶点的需求仍迫切。

发明内容

本发明的目的在于提供多囊卵巢综合征排卵障碍发病机制中较为精准的靶点FHL2，通过靶向FHL2介导的AR致病作用及FHL2调节的ERK1/2信号通路，可能逆转多囊卵巢综合征排卵障碍的发病机制。

由于多囊卵巢综合征病因尚未阐明，尚难根治。目前针对PCOS的相关不孕症，采用促排卵及辅助生殖技术虽能解决大多数PCOS的排卵障碍，但其卵巢过度刺激综合征的风险增加，且卵子质量、受精率、种植率、流产率均受一定影响。目前针对PCOS发病机制的靶点研究受到广泛关注，本发明针对PCOS排卵障碍发病的分子机制，结合排卵过程中参与调控的重要信号通路，找到PCOS排卵障碍发病中关键分子FHL2，未来可研发针对FHL2的分子靶向抑制剂用于PCOS排卵障碍的治疗。

基于此，本发明的第一方面，提供一种治疗多囊卵巢综合征排卵障碍的靶点，即FHL2(Four and a half LIM domains 2)。

本发明的第二方面，提供FHL2在制备治疗多囊卵巢综合征排卵障碍药物中的应用。

进一步的，所述的应用是将FHL2作为治疗多囊卵巢综合征排卵障碍的干预靶点。

进一步的，所述的药物是通过抑制或下调FHL2的表达量治疗多囊卵巢综合征排卵障碍的药物。

本发明的第三方面，提供抑制或下调FHL2的表达量的试剂在制备治疗多囊卵巢综合征排卵障碍药物中的应用。

进一步的，所述的抑制或下调FHL2的表达量的试剂包括但不限于：

特异性结合FHL2的蛋白；

特异性干扰FHL2基因表达、加工的小干扰分子，如siRNA分子、miRNA分子、反义核苷酸等；

FHL2抑制剂、拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。

在本发明的一个实施方式中，所述的抑制或下调FHL2的表达量的试剂是FHL2的干扰RNA(siRNA)，所述的干扰RNA的序列选自以下任一：

FHL2 siRNA-1靶序列5'-CCUGCUAUGAGAAACAACA-3'(SEQ ID NO.1)；

FHL2 siRNA-2靶序列5'-GCAAGGACUUGUCUUACAA-3'(SEQ ID NO.2)。以上siRNA在3’端加上TT以增加siRNA的稳定性。

本发明的第四方面，提供一种重组载体在制备治疗多囊卵巢综合征排卵障碍药物中的应用，所述的重组载体中包含上述的特异性干扰FHL2基因表达、加工的小干扰分子。所述的载体包括病毒载体和非病毒载体。

本发明的第五方面，提供一种治疗多囊卵巢综合征排卵障碍的药物，所述的药物以抑制或下调FHL2的表达量的试剂或上述的重组载体作为活性成分。

进一步的，所述的治疗多囊卵巢综合征排卵障碍的药物中还包括其他药学上可接受的成分。

本发明的第六方面，提供FHL2在制备C/EBPβ抑制剂中的应用。

本发明的第七方面，提供FHL2在制备ERK通路抑制剂中的应用。

本发明的第八方面，提供FHL2在制备AR通路调节剂的应用。

本发明的主要技术方案是：

本发明发现FHL2在PCOS患者颗粒细胞中高表达，并通过生物信息富集的方法，发现转录调节因子FHL2和排卵相关基因C/EBPβ(CCAAT/enhancer-binding proteinβ)可能调控相同的PCOS中差异表达的基因。因此，推测FHL2可能参与PCOS排卵障碍的发病机制。

FHL2(Four and a half LIM domains 2)，属于FHL蛋白家族成员，含有4-1/2LIM结构域，不与DNA结合，通过蛋白与蛋白之间结合发挥调控作用；FHL2可参与调控骨骼形成、心脏发育、细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡等；FHL2表达具有组织特异性，在心脏、卵巢、大脑、肝、肺中均有表达；在小鼠卵巢中，FHL2在卵泡发育各个时期均有表达，其表达主要定位于颗粒细胞和卵母细胞。

高雄激素血症是PCOS发病的核心，卵巢局部雄激素水平增高，是造成卵巢多囊样改变的主要原因。雄激素通过雄激素受体(androgen receptor，AR)发挥作用，AR介导的雄激素作用是PCOS发病的重要环节。研究表明，AR敲除的小鼠给予雄激素诱导，可避免其发生类PCOS样表型。本发明发现，AR在PCOS患者颗粒细胞中表达升高，与既往研究结果一致。

本发明研究发现，FHL2通过与AR结合，作为AR的辅调节因子，促进AR对排卵基因C/EBPβ的抑制作用；并且，FHL2通过与ERK1/2结合，抑制ERK1/2磷酸化，从而抑制ERK通路调控的排卵相关基因。动物实验中，通过慢病毒介导的卵巢局部过表达FHL2，导致大鼠排卵数减少、MII卵率下降、卵巢中囊状卵泡增多等类PCOS样表型；并且，FHL2过表达组大鼠卵巢中p-ERK/ERK、C/EBPβ、COX2及HAS2的表达水平下降，验证了KGN细胞中FHL2抑制排卵的分子机制。

本发明优点在于：

本发明针对PCOS排卵障碍发病的重要信号通路，找到PCOS发病机制中重要分子靶点FHL2，可作为未来PCOS排卵障碍的治疗靶点，对PCOS发病分子机制的研究及治疗方法提供了新思路。

附图说明

图1：PCOS患者卵泡液颗粒细胞中FHL2、AR在mRNA水平表达升高，C/EBPβ在PCOS患者颗粒细胞mRNA水平表达下降。

(a)PCOS和非PCOS患者卵泡液颗粒细胞中FHL2在mRNA水平的表达情况。(b)PCOS和非PCOS患者卵泡液颗粒细胞中AR在mRNA水平的表达情况。(c)PCOS和非PCOS患者卵泡液颗粒细胞中C/EBPβ在mRNA水平的表达情况。*表示P<0.05，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。

图2：KGN细胞系中，FHL2抑制排卵相关基因的表达。

(a,b)敲低FHL2后，检测FHL2，C/EBPβ，COX2及HAS2在mRNA和蛋白水平的表达情况。(c,d)过表达FHL2后，检测FHL2，C/EBPβ，COX2及HAS2在mRNA和蛋白水平的表达情况。(e,f)Forskolin(FSK,10μM)作用0,4,16小时后，FHL2，AR，C/EBPβ，COX2及HAS2在mRNA和蛋白水平的表达变化。(g,h)敲低FHL2和(或)添加FSK(10μM,4h)后，检测FHL2，C/EBPβ，COX2及HAS2在mRNA和蛋白水平的表达情况。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001vs.controls；#表示P<0.05，##表示P<0.01vs.FSK。

图3：KGN细胞系中，FHL2作为AR的辅调节因子抑制C/EBPβ的表达。

(a)敲低AR后，检测AR、C/EBPβ、COX2及HAS2在mRNA和蛋白水平的表达情况。(b)DHT(10nM,24h)作用后，ChIP实验检测AR与C/EBPβ启动子区域的结合。(c)敲低FHL2后，Co-IP实验检测FHL2与AR蛋白之间的结合。(d)FHL2过表达后，Co-IP检测FHL2与AR之间的结合。(e)FSK(10μM，4h)作用后，Co-IP检测FHL2与AR之间的结合。(f)DHT(10nM,24h)作用后，Co-IP检测FHL2与AR之间的结合。(g)过表达FHL2和(或)敲低AR后，检测FHL2、AR、C/EBPβ、COX2及HAS2在蛋白水平的表达。(h)ChIP检测过表达FHL2后，AR与C/EBPβ启动子区域的结合。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，***表示P<0.0001。

图4：KGN细胞系中，FHL2与ERK1/2结合抑制ERK1/2磷酸化，从而抑制ERK1/2下游排卵基因表达。

(a)敲低FHL2后，检测FHL2及p-ERK/ERK蛋白水平的表达。(b)过表达FHL2后，检测FHL2及p-ERK/ERK蛋白水平的表达。(c)FSK(10μM,4h)作用后，p-ERK/ERK表达水平的变化。(d)敲低FHL2和(或)添加FSK(10μM,4h)后，检测FHL2及p-ERK/ERK蛋白水平的表达。(e)添加FSK(10μM,4h)和(或)添加ERK1/2通路抑制剂U0126后，检测p-ERK/ERK、C/EBPβ、COX2及HAS2在蛋白水平的表达。(f)敲低FHL2后,Co-IP检测FHL2与ERK1/2之间的结合。(g)过表达FHL2后，Co-IP检测FHL2与ERK1/2之间的结合。(h)FSK(10μM,4h)作用后，Co-IP检测FHL2与ERK1/2之间的结合。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001vs.controls；#表示P<0.05,##表示P<0.01vs.FSK。

图5：PCOS患者血清基础睾酮水平与颗粒细胞中FHL2表达丰度呈正相关，且DHT通过AR介导促进FHL2的表达。

(a)Spearman相关性分析PCOS颗粒细胞中FHL2表达丰度与血清基础睾酮水平之间的相关性(n＝37)。(b)KGN细胞中，不同浓度DHT(1-100nM)作用24小时，检测FHL2及AR在mRNA水平的表达。(c)KGN细胞中，不同浓度DHT(1-100nM)作用24小时，检测FHL2及AR在蛋白水平的表达。(d)添加DHT(10nM,24h)和(或)添加氟他胺(雄激素受体拮抗剂，5μM，预处理24h)，检测FHL2及AR在蛋白水平的表达。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001vs.controls；#表示P<0.05，##表示P<0.01vs.DHT。

图6：卵巢局部注射FHL2过表达慢病毒1周后超促排卵，大鼠排卵功能明显抑制。

(a)hCG扳机不同时间点(0,4,16h)，Control组和FHL2过表达组大鼠卵巢FHL2mRNA表达水平。(b)hCG16小时，Control组和FHL2过表达组大鼠血清孕酮水平。(c)Control组和FHL2过表达组大鼠体重(左)和卵巢重量(右)。(d)Control组和FHL2过表达组大鼠获卵数。(e)Control组和FHL2过表达组大鼠MII卵率。(f)Control组和FHL2过表达组大鼠获卵数及MII卵率代表图。(g)hCG4小时，Control组和FHL2过表达组大鼠卵巢HE染色观察卵丘颗粒细胞扩张水平。比例尺(100μm)。(h)hCG16小时，Control组和FHL2过表达组大鼠卵巢HE染色。比例尺(500μm)。(i)hCG4小时，检测Control组和FHL2过表达组大鼠卵巢中FHL2、p-ERK/ERK、C/EBPβ、COX2及HAS2在mRNA及蛋白水平的表达。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

图7：卵巢局部注射FHL2过表达慢病毒3周引起大鼠卵巢类PCOS样改变。

(a)Control组和FHL2过表达组大鼠动情周期的情况。D，动情间期；P，动情前期；E，动情期；M，动情后期。(b)Control组和FHL2过表达组大鼠体重(左)和卵巢重量(右)。(c)Control组和FHL2过表达组大鼠血清孕酮水平。(d)Control组和FHL2过表达组大鼠卵巢HE染色。(e)Control组和FHL2过表达组大鼠卵巢FHL2、C/EBPβ、COX2及HAS2在mRNA水平的表达。(f)Control组和FHL2过表达组大鼠卵巢FHL2、p-ERK/ERK、C/EBPβ、COX2及HAS2蛋白水平的表达。*表示P<0.05，**表示P<0.01。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例：

(一)、收集上海交通大学医学院附属仁济医院生殖医学中心就诊的拟行IVF-ET的PCOS患者(n＝37)及非PCOS患者(n＝33)，hCG扳机后34-36h后，在阴道超声引导下穿刺取卵获得卵泡液。样本标准：年龄20～35岁，使用“OC+拮抗”方案促排卵，PCOS诊断符合鹿特丹诊断标准。

从卵泡液中提取颗粒细胞，通过提取RNA及RNA逆转录合成cDNA，进行real-timePCR检测目标基因在mRNA水平表达情况；结果发现，相较于非PCOS患者，PCOS患者卵泡液颗粒细胞中FHL2、AR mRNA表达水平升高，而C/EBPβ表达下降，如图1所示。

(二)、使用人卵巢颗粒细胞癌细胞系(KGN细胞系)，通过脂质体转染FHL2 siRNA敲低FHL2，通过慢病毒载体过表达FHL2建立稳转KGN细胞系，添加模拟LH峰作用的腺苷酸环化酶激活剂forskolin(FSK)，结果提示FHL2对排卵相关基因C/EBPβ、COX2及HAS2具有负向调节作用，如图2所示。

FHL2 siRNA-1靶序列5'-CCUGCUAUGAGAAACAACATT-3'(SEQ ID NO.1)；

FHL2 siRNA-2靶序列5'-GCAAGGACUUGUCUUACAATT-3'(SEQ ID NO.2)。

通过转染AR siRNA，发现AR对排卵相关基因C/EBPβ、COX2及HAS2亦具有负向调节作用；通过CHIP实验，证明AR可与C/EBPβ启动子区域结合；co-IP实验证实FHL2与AR之间相互结合。通过回复实验，过表达FHL2和(或)敲低AR发现，过表达FHL2对排卵基因的抑制作用可被敲低AR挽回，进一步证明FHL2对排卵相关基因的抑制作用可部分通过AR介导的通路进行。并且，FHL2过表达增加了AR与C/EBPβ启动子区域结合，证实FHL2作为AR的辅抑制因子，抑制C/EBPβ的表达，如图3所示。

AR siRNA靶序列5'-GAAAUGAUUGCACUAUUGAUU-3'(SEQ ID NO.3)。

(三)、在KGN细胞系中，通过脂质体转染FHL2 siRNA敲低FHL2，慢病毒载体过表达FHL2建立稳转KGN细胞系，添加forskolin(FSK)以模拟LH峰作用和(或)添加ERK通路抑制剂U0126。结果提示，FHL2对ERK磷酸化具有负向调节作用。Co-IP实验证实FHL2与ERK1/2之间相互结合。因此推测，FHL2通过与ERK1/2结合，抑制ERK通路激活，从而抑制其下游的排卵基因(图4)。

(四)、通过spearman相关性分析，发现PCOS患者颗粒细胞中FHL2表达丰度与血清睾酮水平呈正相关。KGN细胞中添加DHT干预，发现DHT促进FHL2及AR的表达，预先加入AR抑制剂(氟他胺)24小时，可抑制DHT对FHL2及AR的促进作用。结果说明，PCOS患者颗粒细胞中FHL2表达增加与高雄激素血症相关。DHT通过AR介导的通路，促进FHL2的表达(图5)。

(五)、将38只清洁级SD大鼠(6周龄，约150g)，根据时间点随机分为3组：PMSG 48h(hCG 0h)10只，hCG 4h 10只，hCG 16h 18只。麻醉后于背部划一切口，分离出卵巢，予卵巢局部注射10ul过表达FHL2慢病毒(1×10⁸TU/ml)，对照组注射Control-vector慢病毒(剂量同前)，缝合伤口。1周后给予大鼠腹腔注射PMSG(30IU/只)，48小时后腹腔注射HCG(30IU/只)，按不同分组在不同时间点处死两组大鼠。统计获卵数、MII卵率、大鼠体重、卵巢重量，卵巢切片及HE染色，并检测卵巢中FHL2、p-ERK/ERK、C/EBPβ、COX2及HAS2的表达水平。结果发现，FHL2过表达组大鼠获卵数明显减少，为11.10±1.73个/卵巢，Control组平均获卵数为21.56±2.59个/卵巢(图6d)；FHL2过表达组大鼠MII卵率明显下降(图6e)。HCG 4小时，HE染色显示FHL2过表达组卵丘颗粒细胞扩张水平受抑制(图6g)。HCG16小时，HE染色显示FHL2过表达组卵巢黄体数量减少，囊状卵泡增多(图6h)；且ELISA检测血清孕酮水平明显降低(图6b)。结果提示，卵巢过表达FHL2抑制大鼠排卵功能。HCG4小时，检测发现FHL2过表达组卵巢中p-ERK/ERK、C/EBPβ、COX2及HAS2表达明显减少(图6i)，验证了KGN细胞中FHL2抑制排卵作用的分子机制。

(六)、将10只清洁级SD大鼠(6周龄，约150g)随机分为2组，每组5只，卵巢局部注射FHL2过表达慢病毒及对照空载慢病毒(方法及剂量同前)。第14天开始做阴道涂片观察大鼠动情周期，3周后处死2组大鼠。统计大鼠体重，卵巢重量，收集卵巢行切片及HE染色，收集大鼠血清。结果发现，FHL2过表达组动情周期紊乱(图7a)，FHL2过表达组卵巢囊状卵泡增多，黄体数目减少(图7d)，与类PCOS大鼠模型中卵巢囊性改变相似。且FHL2过表达组血清孕酮水平下降(图7c)。同样FHL2过表达组卵巢中p-ERK/ERK、C/EBPβ、COX2及HAS2表达明显下降(图7e,f)，验证体外实验中FHL2抑制排卵基因的分子机制。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属仁济医院

<120> FHL2在制备治疗多囊卵巢综合征排卵障碍药物中的应用

<130> /

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

ccugcuauga gaaacaaca 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

gcaaggacuu gucuuacaa 19

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

gaaaugauug cacuauugau u 21

Claims (10)

1.FHL2在制备治疗多囊卵巢综合征排卵障碍药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的FHL2在制备治疗多囊卵巢综合征排卵障碍药物中的应用，其特征在于，所述的应用是将FHL2作为治疗多囊卵巢综合征排卵障碍的干预靶点。

3.根据权利要求1所述的FHL2在制备治疗多囊卵巢综合征排卵障碍药物中的应用，其特征在于，所述的药物是通过抑制或下调FHL2的表达量治疗多囊卵巢综合征排卵障碍的药物。

4.抑制或下调FHL2的表达量的试剂在制备治疗多囊卵巢综合征排卵障碍药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的抑制或下调FHL2的表达量的试剂在制备治疗多囊卵巢综合征排卵障碍药物中的应用，其特征在于，所述的抑制或下调FHL2的表达量的试剂包括但不限于：

特异性结合FHL2的蛋白；

特异性干扰FHL2基因表达、加工的小干扰分子，如siRNA分子、miRNA分子、反义核苷酸等；

FHL2抑制剂、拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂。

6.一种重组载体在制备治疗多囊卵巢综合征排卵障碍药物中的应用，其特征在于，所述的重组载体中包含特异性干扰FHL2基因表达、加工的小干扰分子。

7.一种治疗多囊卵巢综合征排卵障碍的药物，其特征在于，所述的药物以抑制或下调FHL2的表达量的试剂或重组载体作为活性成分。

8.FHL2在制备C/EBPβ抑制剂中的应用。

9.FHL2在制备ERK通路抑制剂中的应用。

10.FHL2在制备AR通路调节剂的应用。

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