CN110317808B

CN110317808B - 肝细胞癌相关基因的siRNA分子及其应用

Info

Publication number: CN110317808B
Application number: CN201910496303.XA
Authority: CN
Inventors: 卓朗; 付中国; 张捷婷
Original assignee: Naptide Qingdao Biomedical Co ltd
Current assignee: Naptide Qingdao Biomedical Co ltd
Priority date: 2019-06-10
Filing date: 2019-06-10
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2039-06-10
Also published as: CN110317808A

Abstract

提供了一种肝细胞癌相关基因的siRNA分子及其应用。该siRNA分子能够抑制包括AEG‑1、Cat S、IL‑6、IL‑6R基因中的至少一种基因的表达；其中，抑制AEG‑1基因的siRNA分子为SEQ ID NO:1～6中任意一对；抑制Cat S基因的siRNA分子为SEQ ID NO:7～8、SEQ ID NO:9～12中任意一对；抑制IL‑6基因的siRNA分子为SEQ ID NO:13～18中任意一对；抑制IL‑6R基因的siRNA分子为SEQ ID NO:19～24中任意一对。所提供的siRNA分子可以抑制肝细胞癌中相关基因的表达，从而用于治疗肝细胞癌。

Description

肝细胞癌相关基因的siRNA分子及其应用

技术领域

本发明涉及siRNA分子及其应用，具体涉及一种肝细胞癌相关基因的siRNA分子及其应用。

背景技术

原发性肝癌是目前世界上常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康，死亡率极高。根据肿瘤组织学分型可以分为肝细胞肝癌、胆管细胞型肝癌及混合性肝癌，其中肝细胞癌症占90％，是最常见的类型。

肝细胞癌的发病机制非常复杂，涉及多种基因的突变、细胞信号通路和新生血管的异常增生。近年来，随着对肝细胞癌分子机制的深入研究，肝细胞癌的某些特异性基因表达产物、生长因子及其受体和信号通路成为肝细胞癌治疗的潜在靶点。在肝细胞癌药物研发方面，迄今为止，索拉非尼仍然是唯一获得批准治疗晚期肝癌的分子靶向药物。因此寻求能够治疗肝癌的药物或基因疗法迫在眉睫。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)现象是在1998年被发现，成为一种特异性抑制靶基因表达的有效工具。因此针对肿瘤特定表达基因，设计短干扰RNA(short interferingRNA，siRNA)，可以高效的抑制肿瘤相关基因的表达，降低蛋白水平，干扰肿瘤细胞的信号传导，从而对肿瘤进行基因治疗。而且siRNA仅仅作用于靶基因的mRNA，而不影响其他基因的转录与表达，因此siRNA介导的肿瘤基因治疗具有安全高效的特点。

针对肝癌发病相关基因设计siRNA用于肝癌的治疗，具有重要的意义。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种肝细胞癌相关基因siRNA分子及其在治疗肝细胞癌中的应用。

本发明是基于发明人的如下研究获得的：

本发明的发明人主要对肝细胞癌发病相关基因进行研究和筛选，确定了与肝细胞癌相关的四种基因，针对这几种基因进行siRNA分子的筛选以及对siRNA鸡尾酒组合的作用效果进行探索，从而为肝癌治疗药物的研发提供新方法。AEG-1、Cat S、IL-6、IL-6R基因可以分别通过不同的信号通路影响肿瘤的形成，增殖或者转移。通过对这些基因进行研究，可以设计针对这些基因中的任意一个基因的siRNA分子，或者是设计针对任意两个，任意三个或者全部基因的siRNA分子，实现单靶点或者多靶点的同时抑制，从而可以通过不同的信号通路途径影响到肿瘤细胞的生长，用于肿瘤的治疗。

其中，星形细胞上调基因-1(Astrocyte elevated gene-1，AEG-1)是近年新发现的癌基因，存在于多种肿瘤组织中，可以促进肿瘤的形成、增殖、侵袭和转移等过程。研究显示肝细胞癌中AEG1的表达明显高于癌旁组织和正常肝组织，AEG1可以激活NF-κB、P13K/Akt、Wnt/β-catenin、MAPK等多个信号转导途径。另一方面，抑制AEG-1的表达，在体外明显降低人原发性肝癌细胞对5-FU的敏感性，AEG-1siRNA与5-FU联合应用，与单独使用5-FU相比，明显一直裸鼠中原发性肝细胞癌的生长。由此看见，以AEG1为靶点为肝细胞癌治疗提供新的视野。

组织蛋白酶(Cathepsin)在蛋白降解中发挥重要的作用，其中组织蛋白酶S(Cathepsin S,Cat S)属于半膀胱氨酸蛋白水解酶，其介导的细胞外基质降解在许多组织中起到关键的作用，与肿瘤血管的生成和血管外肿瘤细胞的转移密切相关。依据细胞的类型和细胞微环境，它可以参与生长因子、血管增殖调节、协助其他细胞因子调节等。在肝细胞癌模型中，研究发现Cat S在肿瘤血管生成时高表达，并且其在内皮细胞表达高于浸润淋巴细胞，这表明Cat S可能参与肝细胞癌新生血管的形成。因此以Cat S为靶点，设计抗血管生成来治疗肝癌有重要的意义。

白细胞介素-6,(Inter leukin 6，IL-6)，是一种多效应的细胞因子，来源非常广泛。血液中的IL-6主要来源于活化的单核细胞，而局部组织中的IL-6主要由成纤维细胞、吞噬细胞、内皮细胞和某些肿瘤细胞产生。白介素-6受体，简称IL6R，是一种由两条多肽链构成的二聚体，以模型受体和可溶性受体两种形式存在于细胞或血液中。IL6通过与IL6R的特异性结合而激活下游信号通路，从而发挥其生物学作用。IL-6在肿瘤中的生物学功能主要包含促进肿瘤血管的生成，利于癌细胞的生长和转移，抑制机体的免疫功能，通过JAK/STAT3的活化调节细胞周期蛋白的表达。在肝细胞癌中，STAT3基因是异常活化状态，是参与肝细胞癌发生的关键致癌因子。磷酸化后的STAT3(p-STAT3)只存在于肝细胞癌中，在正常的肝组织中几乎检测不到。因此IL6/IL6R可能成为肝细胞癌的一个重要靶点，针对该IL6/IL6R分子靶向治疗或许为肝细胞癌治疗带来新的希望。

具体而言，本发明提供了如下技术方案：

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种siRNA分子，所述siRNA分子能够抑制包括AEG-1、Cat S、IL-6、IL-6R基因中的至少一种基因的表达；其中，能够抑制所述AEG-1基因的siRNA分子为SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:3～4、或者SEQ ID NO:5～6；能够抑制所述Cat S基因的siRNA分子为SEQ ID NO:7～8、SEQ ID NO:9～10、或者SEQ ID NO:11～12；能够抑制所述IL-6基因的siRNA分子为SEQ ID NO:13～14、SEQ ID NO:15～16、或者SEQ IDNO:17～18；能够抑制所述IL-6R基因的siRNA分子为SEQ ID NO:19～20、SEQ ID NO:21～22、或者SEQ ID NO:23～24。这些siRNA分子可以抑制一个或者多个与肝细胞癌发生密切相关的基因表达，具体为AEG-1、Cat S、IL-6或者IL-6R基因的表达，从而影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移能力并诱导肝癌细胞的凋亡，从而扩用于治疗肝细胞癌。

根据本发明的实施例，以上所述的siRNA分子进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述siRNA分子能够抑制AEG-1、Cat S、IL-6、IL-6R基因中的至少两种基因的表达；其中，能够抑制所述AEG-1基因的siRNA分子为SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:3～4、或者SEQ ID NO:5～6；能够抑制所述Cat S基因的siRNA分子为SEQ IDNO:7～8、SEQ ID NO:9～10、或者SEQ ID NO:11～12；能够抑制所述IL-6基因的siRNA分子为SEQ ID NO:13～14；能够抑制所述IL-6R基因的siRNA分子为SEQ ID NO:19～20、SEQ IDNO:21～22。

在本发明的一些实施例中，所述siRNA分子能够抑制AEG-1、Cat S和IL-6基因的表达；其中，能够抑制所述AEG-1基因的siRNA分子为SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:3～4、或者SEQ ID NO:5～6；能够抑制所述Cat S基因的siRNA分子为SEQ ID NO:7～8、SEQ ID NO:9～10、或者SEQ ID NO:11～12；能够抑制所述IL-6基因的siRNA分子为SEQ ID NO:13～14。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种DNA序列，所述DNA序列编码如本发明第一方面所述的siRNA分子。

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第一方面任一实施例所述的siRNA分子。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞表达本发明第一方面任一实施例所述的siRNA分子。可以通过不同的方法将siRNA导入到重组细胞中，从而使得重组细胞可以表达siRNA，从而可以抑制与肝细胞癌相关的AEG-1、Cat S、IL-6、IL-6R基因的表达，用来治疗肝细胞癌或者抑制肝细胞癌细胞的生长。重组细胞可以是真核细胞。可用的方法包括但不限于：磷酸钙共沉淀的方法，电穿孔的方法，阳离子脂质体试剂的方法等等。例如可以采用常用的阳离子脂质体Lipofectamine 2000。所形成的重组细胞除了能够表达本发明第一方面所述的siRNA之外，还可以含有任何形式的载体：如多聚物载体、多肽载体、高分子聚合物载体、金属纳米载体、配体功能的各类载体等等。

在本发明的一些实施例中，所述宿主细胞包括本发明第三方面任一实施例所述的表达载体。

根据本发明的第五方面，本发明提供了一种抑制基因表达的方法，所述基因包括AEG-1、Cat S、IL-6、或者IL-6R基因中的至少一种，所述方法包括利用siRNA分子转染细胞，以便抑制所述细胞中基因的表达，所述siRNA分子为本发明第一方面任一实施例所述的siRNA分子。可用的方法包括但不限于：磷酸钙共沉淀的方法，电穿孔的方法，阳离子脂质体试剂的方法等等。例如可以采用常用的阳离子脂质体Lipofectamine 2000，还可以含有任何形式的载体：如多聚物载体、多肽载体、高分子聚合物载体、金属纳米载体、配体功能的各类载体等等。

根据本发明的第六方面，本发明提供了一种治疗肝细胞癌的药物，包括有效量的如本发明第一方面所述的siRNA分子和药学上可接受的载体。治疗肝细胞癌的药物可以采用常规方法制备成不同的制剂，例如可以采用生理盐水或者含有葡萄糖和其他辅剂的水溶剂通过常规方法制备成针剂。所制备成的不同的药物可以以任何方便的形式给药，例如可以通过局部、静脉、肌肉、皮下、皮内等不同的途径给药。药物的用量可以根据实际情况进行适应性调整。

根据本发明的第七方面，本发明提供了一种药盒，所述药盒包括本发明第一方面所述的siRNA分子或者包括本发明第六方面所述的治疗肝细胞癌的药物。

根据本发明的第八方面，本发明提供了siRNA分子在制备治疗肝细胞癌的药物中的用途，所述siRNA分子为本发明第一方面任一实施例所述的siRNA分子。

附图说明

图1是根据本发明的实施例提供的siRNA分子对于AEG-1基因的抑制结果图。

图2是根据本发明的实施例提供的siRNA分子对于Cat S基因的抑制结果图。

图3是根据本发明的实施例提供的siRNA分子对于IL-6基因的抑制结果图。

图4是根据本发明的实施例提供的siRNA分子对于IL-6受体基因的抑制结果图。

图5是根据本发明的实施例提供的不同的siRNA分子组合应用对于AEG1基因的抑制结果图。

图6是根据本发明的实施例提供的不同的siRNA分子组合应用对于Cat S基因的抑制结果图。

图7是根据本发明的实施例提供的不同的siRNA分子组合应用对于IL6受体基因的抑制结果图。

图8是根据本发明的实施例提供的经不同的siRNA分子组合处理，各基因蛋白水平的电泳结果。

图9是根据本发明的实施例提供的经不同的siRNA分子处理的细胞的MTT结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提供了一种siRNA分子，所述siRNA分子能够抑制包括AEG-1、Cat S、IL-6、IL-6R基因中的至少一种基因的表达，从而用于肝细胞癌的治疗。

在本发明的至少一些实施方式中，所述siRNA分子为SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:3～4、或者SEQ ID NO:5～6。该siRNA分子能够抑制AEG-1基因的表达。

在本发明的至少一些实施方式中，所述siRNA分子为SEQ ID NO:7～8、SEQ ID NO:9～10、或者SEQ ID NO:11～12。该siRNA分子能够抑制Cat S基因的表达。

在本发明的至少一些实施方式中，所述siRNA分子为SEQ ID NO:13～14、SEQ IDNO:15～16、或者SEQ ID NO:17～18。该siRNA分子能够抑制IL-6基因的表达。

在本发明的至少一些实施方式中，所述siRNA分子为SEQ ID NO:19～20、SEQ IDNO:21～22、或者SEQ ID NO:23～24。该siRNA分子能够抑制IL-6R基因的表达。

当然，这些siRNA分子也可以组合应用，即可以将不同的siRNA分子组合应用，来同时抑制两个基因或者三个基因甚至是四个基因的表达。例如可以采用序列为SEQ ID NO:3～4的siRNA分子和序列为SEQ ID NO:9～10的siRNA分子组合应用。再例如可以将序列为SEQ ID NO:3～4的siRNA分子和序列为SEQ ID NO:9～10的siRNA分子以及序列为SEQ IDNO:15～16的siRNA分子组合应用，用于抑制基因的表达，或者用于治疗肝细胞癌。

本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

实施例1分别针对AEG-1、Cat S、IL-6、IL6-R基因，设计了siRNA分子。其中，每个基因转录本信息如下表1所示，各基因转录本信息记载与PUBMEND数据库中：

表1各基因转录本信息

Human AEG-1	NC_000008.11
		Human Cat S	NC_000001.11
Human IL-6	NC_000007.14
		Human IL-6R	NC_000001.11

其中每个基因所设计的siRNA分子的序列信息如下表2所述：

表2用于各基因的siRNA分子

其中表2中siRNA分子各序列均由上海吉马公司合成，scramble siRNA作为阴性对照，即为一个随机序列，对所有的基因没有影响的序列。体外实验采用末端未进行修饰的siRNA；siRNA分子利用DEPC水溶解，存储在4℃备用。

同时，为验证siRNA干扰效果，进行如下实验验证。

1、mRNA水平沉默效果的验证实验

采用反式转染的实验方法进行mRNA水平的沉默实验。所用到的细胞为人肝细胞癌细胞系Huh7细胞，将人肝细胞癌细胞系Huh7细胞利用含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基，在5％CO₂饱和湿度培养箱中常规培养和传代维护，传代培养至对数生长期备用。简述如下：

把1.5μl的阳离子脂质体Lipofectamine 2000稀释到25μl的OPTI-MEM中，充分混匀，室温静置5min。然后把siRNA稀释到25μlOPTI-MEM中，充分混匀，室温静置5min。将两者混合，充分混匀后室温静置10min。

同时，消化细胞，离心，重悬计数。4万/孔，每孔加500μl到24孔板中。最后，把混合好的siRNA/lipo溶液加入细胞中，十字交叉混匀，培养48小时后，提取RNA，进行实时定量PCR(real time PCR)实验。操作为：

取转染48h后的huh7细胞，用TRIzol裂解提取总RNA。用试剂盒将RNA逆转录成cDNA。随后，cDNA作为模板，用SYBR green Master Mix进行实时定量PCR检测。循环条件为：预变性95℃30s，然后95℃10s，60℃30s，40个循环，用GAPDH作为内参对照。用2^-△△Ct方法计算qRT-PCR的扩增结果。引物序列如下表3所示：

表3引物序列

	编号	序列
			AEG-1-Forward	SEQ ID NO:27	5’-CGTGATAAGGTGCTGACTGATTC-3’
AEG-1-Reverse	SEQ ID NO:28	5’-CAGGAAATGATGCGGTTGTAAG-3’
			Cat S-Forward	SEQ ID NO:29	5’-TGACAACGGCTTTCCAGTACA-3’
Cat S-Reverse	SEQ ID NO:30	5’-GGCAGCACGATATTTTGAGTCAT-3’
			IL-6R-Forward	SEQ ID NO:31	5’-CCCCTCAGCAATGTTGTTTGT-3’
IL-6R-Reverse	SEQ ID NO:32	5’-CTCCGGGACTGCTAACTGG-3’
			IL-6-Forward	SEQ ID NO:33	5’-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3’
IL-6-Reverse	SEQ ID NO:34	5’-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3’
			GAPDH-Forward	SEQ ID NO:35	5’-ACACTGTGCCCATCTAGGAGG-3’
GAPDH-Reverse	SEQ ID NO:36	5’-AGGGGCCGGACTCGTCTACT-3’

实验结果如下，其中各图中untreated代表空白对照，即未加入任何东西的空白对照。

由图1可知，实施例中设计的三条AEG-1siRNA在Huh7细胞中对AEG-1mRNA均有高效的沉默效果，沉默效果均可达70％左右。

由图2可知，实施例中设计的三条Cat S siRNA在Huh7细胞中对Cat S mRNA均有高效的沉默效果，沉默效果均可达90％左右。

由图3可知，实施例中设计的三条IL-6siRNA在Huh7细胞中对IL6mRNA均有高效的沉默效果，其中第一条的效果最好，沉默效果可达82％。

由图4可知，实施例中设计的三条IL-6R siRNA在Huh7细胞中对IL6R mRNA均有高效的沉默效果，沉默效果均可达85％左右。

考虑到不同基因的siRNA分子同时使用时，可能会出现彼此干扰的现象，同时对两个或者三个基因等进行沉默表达，例如同时对AEG-1基因和IL6R基因进行沉默表达，或者同时对AEG-1、Cat S和IL6R基因进行沉默表达，比较各基因的沉默效果。其结果如图5～图7所示，其中针对AEG-1基因的siRNA分子为AEG-1siRNA#2，针对Cat S基因的siRNA分子为Cat SsiRNA#2，针对IL-6R基因的siRNA分子为IL-6R siRNA#2。在组合应用时，也是用的这几个编号的siRNA分子。

同时，由图5、图6和图7可知，在Huh7细胞中，鸡尾酒组合AEG-1、Cat S、IL-6RsiRNA时，各自的siRNA对其目的基因具有高效的沉默效果。而且从图7的结果可以看出，相较于单独对IL6R基因进行沉默表达，采用siRNA分子同时对AEG-1和IL6R基因进行沉默表达或者采用siRNA分子同时对Cat S和IL6R基因进行沉默表达，其沉默效果要比单独对IL6R基因进行沉默的效果要差。不受理论限制，可能的原因是：加入AEG1或者Cas siRNA后，它们当中的调节的下游基因会影响IL6R的表达。尽管如此，在同时加入三个siRNA分子后(AEG-1siRNA#2、CatS siRNA#2、IL6R siRNA#2)仍然对IL6R mRNA有50％以上的沉默效果。

2、蛋白水平沉默效果的验证实验

实验时，采用反式转染的实验方法进行蛋白水平的沉默实验。简述如下：

把3μl的Lipofectamine 2000稀释到100μl的OPTI-MEM中，充分混匀，室温静置5min。然后把siRNA稀释到100μlOPTI-MEM中，充分混匀，室温静置5min。将两者混合，充分混匀后室温静置10min。

同时，消化细胞，离心，重悬计数。12万/孔，每孔加1.8ml到6孔板种。最后，把混合好的siRNA/lipo溶液加入细胞中，十字交叉混匀，培养72小时后，提取细胞的总蛋白，以BCA试剂盒检测定量。等量上样于10％SDS-PEGA凝胶电泳，电转移到PVDF膜后，加入一抗抗体，然后清洗，加入二抗抗体，清洗后，用ECL化学发光显影，以GAPDH为内参。

其中用于各基因的siRNA分子均为第二条siRNA分子。从图8蛋白表达水平的检测结果可以看出，在Huh7细胞中，鸡尾酒组合AEG-1、Cat S、IL-6R siRNA时，各自的siRNA对其目的基因具有高效的沉默效果。

3、MTT法细胞增殖抑制活性测试

把0.24μl/孔的Lipofectamine 2000稀释到4μl的OPTI-MEM中，充分混匀，室温静置5min。然后把siRNA稀释到4μlOPTI-MEM中，充分混匀，室温静置5min。将两者混合，充分混匀后室温静置10min。

同时，取对数期生长的Huh7细胞，用新鲜配置的含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基配置成1.5×10⁴个/ml的细胞悬液，接种于96孔板，每孔200μL(约3000个细胞/孔)。然后加入上述混合好溶液。培养48小时后，，每孔加入MTT溶液(含5mg/mLMTT的PBS溶液)各20μL，30℃孵育4h，吸收上清，加150μL DMSO溶解甲臜结晶，用酶标仪测定每孔570nm处OD值。

其中，用于各基因的siRNA分子均为第二条siRNA分子。结果如图9所示，相对于scramble siRNA组，AEG1siRNA组和IL6R siRNA组能够抑制细胞的增殖，两个siRNA联合时，也能够抑制细胞增殖，三个siRNA联合使用时的抑制效果最高。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 纳肽得（青岛）生物医药有限公司

<120> 肝细胞癌相关基因的siRNA分子及其应用

<130> PIDC3192311

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<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正义链

<400> 23

ccucagcaau guuguuugut t 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反义链

<400> 24

acaaacaaca uugcugaggt t 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 正义链

<400> 25

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 反义链

<400> 26

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 27

cgtgataagg tgctgactga ttc 23

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 28

caggaaatga tgcggttgta ag 22

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 29

tgacaacggc tttccagtac a 21

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 30

ggcagcacga tattttgagt cat 23

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 31

cccctcagca atgttgtttg t 21

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 32

ctccgggact gctaactgg 19

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 33

actcacctct tcagaacgaa ttg 23

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 34

ccatctttgg aaggttcagg ttg 23

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 35

acactgtgcc catctaggag g 21

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 36

aggggccgga ctcgtctact 20

Claims

1.一种siRNA分子，其特征在于，所述siRNA分子能够抑制AEG-1和Cat S基因的表达；所述siRNA分子序列为SEQ ID NO:3~4和SEQ ID NO:9~10。

2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码如权利要求1所述的siRNA分子。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的siRNA分子。

4.一种重组微生物细胞，其特征在于，所述重组微生物细胞表达权利要求1述的siRNA分子。

5.根据权利要求4所述的重组微生物细胞，其特征在于，所述重组细胞包括权利要求3所述的表达载体。

6.一种在体外抑制基因表达的方法，其特征在于，所述基因包括AEG-1和Cat S基因，所述方法包括利用siRNA分子转染细胞，以便抑制所述细胞中基因的表达，所述siRNA分子为权利要求1所述的siRNA分子。

7.一种治疗肝细胞癌的药物，其特征在于，包括有效量的权利要求1所述的siRNA分子和药学上可接受的载体。

8.一种药盒，其特征在于，所述药盒包括权利要求1所述的siRNA分子或者包括权利要求7所述的治疗肝细胞癌的药物。

9.siRNA分子在制备治疗肝细胞癌的药物中的用途，所述siRNA分子为权利要求1所述的siRNA分子。