CN113713104A - miR-345-3p在制备乳腺癌治疗药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于乳腺癌治疗技术领域，具体公开了miR‑345‑3p在制备乳腺癌治疗药物中的用途。本发明首次揭示了miR‑345‑3p在人乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中均呈高表达，并发现在乳腺癌细胞中抑制miR‑345‑3p表达能够通过促进PPP2CA表达而有效下调PI3K/AKT信号通路，因此，miR‑345‑3p可以作为乳腺癌新的治疗靶点，并为进一步研究乳腺癌的发病机制以及miR‑345‑3p基因的功能提供新的技术思路。
Description
技术领域
本发明涉及乳腺癌治疗技术领域，特别是涉及miR-345-3p在制备乳腺癌治疗药物中的用途。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均位居女性恶性肿瘤之首。高侵袭性乳腺癌细胞的远端转移是这些女性死亡的主要原因，但乳腺癌的具体发病机制仍不明确。尽管诊治技术不断进步，但在大多数情况下，复发、转移和化疗耐药的发展不可避免，乳腺癌患者的临床结局仍然不能令人满意。因此探索出一些具有应用前景的针对乳腺癌的诊断和预后指标显得尤为重要，更重要的是可以帮助优化某些特定的诊断治疗方法，以免产生不必要的创伤或延误诊断治疗的最佳时期。miRNA是一类非编码核糖核酸分子，通过与互补的靶mRNA结合，在细胞分化、增殖和存活中发挥核心作用，导致靶mRNA翻译抑制或降解。有大量证据表明，miRNA及其生物发生机制参与了癌症的发展，约有73％的乳腺癌表现出miRNA表达的异常，miRNA通过靶向不同的靶mRNA在癌症发生发展中扮演促癌或抑癌的角色。通过挑选特定的miRNA靶向在疾病条件下改变的多种mRNA，这些miRNA分子成为有趣的候选治疗剂(以miRNA模拟物的形式)或治疗剂的靶点(以anti-miRs的形式)，为癌症的创新治疗方法的发展提供了机会。同时，体内递送RNA技术的进步使得基于miRNA的治疗成为可能。这些构建体通过在RNA骨架上对RNA进行各种修饰，提供更高的稳定性、避免核酸酶的降解。多种不同的信号通路参与乳腺癌的发生发展过程，例如PI3K/AKT、Wnt/β-catenin、Hippo、MAPK以及NF-κB信号通路。其中，PI3K/AKT信号通路在信号转导和多种生物进程中起着重要作用，例如在细胞增殖、分化和细胞存活过程中。然而目前为止，关于miR-345-3p在乳腺癌中的作用和分子机制还未有文献报道。
发明内容
本发明首次揭示了miR-345-3p在人乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中均呈高表达，并发现在乳腺癌细胞中抑制miR-345-3p表达能够通过促进PPP2CA表达而有效下调PI3K/AKT信号通路，因此，miR-345-3p可以作为乳腺癌新的治疗靶点，并为进一步研究乳腺癌的发病机制以及miR-345-3p基因的功能提供新的手段。基于此，本发明提供了miR-345-3p在制备乳腺癌治疗药物中的用途。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供miR-345-3p基因在制备或筛选用于抑制PI3K/AKT信号通路的药物中的用途。
进一步，所述miR-345-3p基因作为所述药物的作用靶标。
进一步，所述药物通过抑制miR-345-3p基因的表达水平来抑制PI3K/AKT信号通路。
进一步，所述药物抑制miR-345-3p基因表达能够靶向作用于PPP2CA，上调PPP2CA蛋白表达水平而起到抑制PI3K/AKT信号通路的作用。
进一步，所述miR-345-3p基因通过与PPP2CA 3’UTR结合而靶向作用于PPP2CA。
进一步，所述PI3K/AKT信号通路为乳腺癌细胞或乳腺癌组织中的PI3K/AKT信号通路。
进一步，所述抑制PI3K/AKT信号通路的药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒，所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
本发明第二方面提供一种抑制PI3K/AKT信号通路的药物，通过分离的miR-345-3p基因制备或筛选得到，所述药物含有有效剂量的用于抑制miR-345-3p基因的药效成分。
进一步，所述miR-345-3p基因作为所述药物的作用靶标。
进一步，所述药物通过抑制miR-345-3p基因的表达水平来抑制PI3K/AKT信号通路。
进一步，所述药物抑制miR-345-3p基因表达能够靶向作用于PPP2CA，上调PPP2CA蛋白表达水平而起到抑制PI3K/AKT信号通路的作用。
进一步，所述miR-345-3p基因通过与PPP2CA 3’UTR结合而靶向作用于PPP2CA。
进一步，所述PI3K/AKT信号通路为乳腺癌细胞或乳腺癌组织中的PI3K/AKT信号通路。
进一步，所述抑制PI3K/AKT信号通路的药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒，所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
进一步，所述药物的施用量为足够降低miR-345-3p基因的转录，或者足够降低miR-345-3p活性的剂量，以使miR-345-3p基因的表达维持在能够抑制PI3K/AKT信号通路的水平。
本发明第三方面提供一种抑制PI3K/AKT信号通路的方法，通过敲低miR-345-3p基因的表达水平来抑制PI3K/AKT信号通路。
进一步，抑制miR-345-3p基因表达水平能够靶向作用于PPP2CA，通过上调PPP2CA蛋白表达水平而起到抑制PI3K/AKT信号通路的作用。
进一步，所述miR-345-3p基因通过与PPP2CA 3’UTR结合而靶向作用于PPP2CA。
进一步，所述PI3K/AKT信号通路为乳腺癌细胞或乳腺癌组织中的PI3K/AKT信号通路。
本发明第四方面提供miR-345-3p基因在制备乳腺癌治疗药物中的用途。
进一步，所述miR-345-3p基因作为所述乳腺癌治疗药物的作用靶标。
进一步，所述乳腺癌治疗药物通过抑制miR-345-3p基因的表达水平来抑制PI3K/AKT信号通路。
进一步，所述乳腺癌治疗药物抑制miR-345-3p基因表达能够靶向作用于PPP2CA，上调PPP2CA蛋白表达水平而起到抑制PI3K/AKT信号通路的作用。
进一步，所述miR-345-3p基因通过与PPP2CA 3’UTR结合而靶向作用于PPP2CA。
进一步，所述PI3K/AKT信号通路为乳腺癌细胞或乳腺癌组织中的PI3K/AKT信号通路。
进一步，所述乳腺癌治疗包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒，所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
本发明第五方面提供一种乳腺癌治疗药物，通过分离的miR-345-3p基因制备或筛选得到，所述药物含有有效剂量的用于抑制miR-345-3p基因的药效成分。
进一步，所述miR-345-3p基因作为所述乳腺癌治疗药物的作用靶标。
进一步，所述乳腺癌治疗药物通过抑制miR-345-3p基因的表达水平来抑制PI3K/AKT信号通路。
进一步，所述乳腺癌治疗药物抑制miR-345-3p基因表达能够靶向作用于PPP2CA，上调PPP2CA蛋白表达水平而起到抑制PI3K/AKT信号通路的作用。
进一步，所述miR-345-3p基因通过与PPP2CA 3’UTR结合而靶向作用于PPP2CA。
进一步，所述PI3K/AKT信号通路为乳腺癌细胞或乳腺癌组织中的PI3K/AKT信号通路。
进一步，所述乳腺癌治疗药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒，所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
进一步，所述乳腺癌治疗药物的施用量为足够降低miR-345-3p基因的转录，或者足够降低miR-345-3p活性的剂量，以使miR-345-3p基因的表达维持在能够抑制PI3K/AKT信号通路的水平。
本发明第六方面提供一种乳腺癌的治疗方法，为向乳腺癌组织或乳腺癌细胞中敲低miR-345-3p基因表达水平。
如上所述，本发明的miR-345-3p在制备乳腺癌治疗药物中的用途，具有以下有益效果：本发明首次揭示了miR-345-3p在乳腺癌中呈现高表达，发现在乳腺癌细胞中抑制miR-345-3p表达能够通过促进PPP2CA表达而有效下调PI3K/AKT信号通路，因此，miR-345-3p可以作为乳腺癌新的治疗靶点，并为进一步研究乳腺癌的发病机制以及miR-345-3p基因的功能提供了新的技术思路。
附图说明
图1显示为miR-345-3p在乳腺癌组织中的表达情况。
图2显示为miR-345-3p在乳腺癌细胞中的表达情况。
图3显示为敲低miR-345-3p抑制乳腺癌细胞的增殖能力。
图4显示为敲低miR-345-3p抑制乳腺癌细胞的迁移能力。
图5显示为敲低miR-345-3p抑制乳腺癌细胞的侵袭能力。
图6显示为生物信息学预测miR-345-3p的下游靶基因。
图7显示为生物信息学预测miR-345-3p与PPP2CA 3’UTR作用的靶位点。
图8显示为双荧光素酶报告系统检测miR-345-3p对PPP2CA的调控作用。
图9显示为在乳腺癌细胞中抑制miR-345-3p上调了PPP2CA蛋白水平的表达。
图10显示为在乳腺癌细胞中转染miR-345-3p inhibitors后磷酸化AKT的表达变化。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
miR-345-3p在制备乳腺癌治疗药物中的用途本发明经过广泛而深入的研究，发现miR-345-3p在人乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中均呈现高表达。接着，本发明发现miR-345-3p在蛋白水平上抑制了PPP2CA的表达，而PPP2CA是一个已知的PI3K/AKT信号通路的抑制蛋白，PPP2CA通过去磷酸化AKT抑制PI3K/AKT信号通路。进一步地，本发明研究发现在乳腺癌细胞中抑制miR-345-3p可下调PI3K/AKT信号通路。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1
miR-345-3p在乳腺癌癌组织和乳腺癌细胞中均呈高表达
为分析miR-345-3p在乳腺癌组织和两种乳腺癌细胞中的表达情况，本实施例收集了乳腺癌病人(来自于重庆医科大学附属第一医院病理科)的乳腺癌组织和配对的癌旁组织，通过FISH实验检测组织中miR-345-3p的表达水平，FISH实验过程如下：MicroRNA FISH探针和荧光原位杂交(FISH)试剂盒(上海吉玛)用于检测miR-345-3p在人乳腺癌组织和配对正常乳腺组织中的表达，石蜡切片经过二甲苯和梯度酒精脱蜡后，用蛋白酶K消化并在78℃下变性8分钟，然后在37℃下与预变性的miR-345-3p FISH探针杂交过夜；用DAPI染色细胞核；用共聚焦显微镜拍摄，结果如图1所示。
由图1可知，在乳腺癌组织中相对于相邻的癌旁组织中miR-345-3p的表达是上调的。如图2，相对于人正常乳腺上皮细胞MCF-10A，在MCF-7、MDA-MB-231、SKBR3、T47D四种乳腺癌细胞中，miR-345-3p的表达也是上调的。
实施例2
敲低miR-345-3p抑制乳腺癌细胞侵袭迁移和增殖的生物学作用研究。
作为阴性对照，本实施例转染了negative control inhibitors，并通过cck8、划痕实验和tmaswell实验检测敲低miR-345-3p对乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。
cck8实验：
Cell Counting Kit-8(CCK8)(MCE)测定用于确定细胞的增殖能力。在MDA-MB-231中转染miR-345-3p inhibitors，以阴性对照(NC)为对照。处理48小时后，将细胞悬液以5×103个细胞/孔的密度接种于96孔板中。分别在24小时、48小时和72小时后，在37℃下将细胞与10％Cell Counting Kit-8(CCK8)孵育1.5小时。在数字分光光度计中读取450nm处的光密度(OD)值。每个实验重复3次，结果如图3所示。
划痕实验：
将MDA-MB-231细胞铺在6孔板中，当细胞融合度达到60％-80％时，转染miR-345-3p inhibitors，以阴性对照(NC)为对照。使用200ul枪头在细胞中进行划痕，并用PBS去除漂浮的细胞。剩余的贴壁细胞在无血清培养基中培养以满足细胞生长和划痕愈合的需要。分别在0h、12h、24h和36h后，使用相差显微镜拍摄图像，结果如图4所示。
tmaswell实验：
基质胶(BD Bioscience)用无血清培养基以1∶8的比例稀释，将含有100ul稀释后的基质胶的transwell上室在37℃下孵育1.5小时。将transwell小室置于24孔板上，在下室中添加含有10％FBS的500ul培养基。在MDA-MB-231中转染miR-345-3p inhibitors，以阴性对照(NC)为对照。处理后的细胞用PBS洗涤后重悬于无血清培养基中，每个transwell小室加入含2×104个细胞的200ul无血清培养基。培养48h后，将转移至下层的侵袭细胞固定，结晶紫染色后，用棉签轻轻擦拭上室中未侵袭的细胞，使用显微镜拍摄图像，结果如图5所示。
由图3、图4、图5可知，通过cck8、划痕实验和trnaswell实验检测敲低miR-345-3p对乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响，发现敲低miR-345-3p抑制乳腺癌细胞侵袭迁移和增殖。
实施例3
本实施例验证了在乳腺癌癌细胞中敲低miR-345-3p能通过调控PPP2CA下调PI3K/AKT信号通路。
为了找出乳腺癌中miR-345-3p作用的机制，本实施例通过Targetscan、miRDB、miRtarbase三个在线预测网站对miR-345-3p的下游靶基因进行了预测，发现PPP2CA是miR-345-3p发挥作用可能的靶基因，并对miR-345-3p发挥作用所结合的PPP2CA的3’UTR位点进行了预测，并对结合位点进行突变(图6、图7)。
has-miR-345-3p：3’-GAGGUCUGGGGAGCAAGUCCCG-5’(SEQ ID No.1)；
PPP2CA3’UTR wildtype：5’-UUGUUCUUUUUAUUUUCAGGGA-3’(SEQ ID No.2)；
PPP2CA3’UTR mutant：5’-UUGUUCUUUUUAUUGGACUUUA-3’(SEQ ID No.3)。
接下来，利用双荧光素酶报告系统检测该靶位点是否具有功能性，双荧光素酶报告实验过程如下：使用Lipofectamine 2000将1ug野生型或突变的PPP2CA 3′UTR质粒和NC或miR-345-3p mimics共转染在24孔板中培养的细胞；使用Luc-PairTMDuo-Luciferase HSAssay Kit(GeneCopoeia)在转染48小时后测量荧光素酶活性，结果如图8所示。由图8可知，miR-345-3p可以通过结合PPP2CA 3’UTR下调Luciferase的表达。
进一步地，通过在乳腺癌细胞中转染hsa-miR-345-3p inhibitors来抑制miR-345-3p，结果如图9所示，发现抑制miR-345-3p可上调PPP2CA蛋白水平的表达。
最后，为验证miR-345-3p是否靶向PPP2CA调控其下游的PI3K/AKT信号通路，本实施例还通过抑制miR-345-3p检测了PI3K/AKT信号通路中的磷酸化AKT(p-AKT)的表达变化，结果如图10所示，发现敲低miR-345-3p后p-AKT表达下调，这提示抑制miR-345-3p可通过直接调控PPP2CA而下调PI3K/AKT信号通路来影响细胞的增殖与凋亡，使乳腺癌细胞达到一个平衡的状态。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆医科大学国际体外诊断研究院
<120> miR-345-3p在制备乳腺癌治疗药物中的用途
<130> PCQYK2110976-HZ
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> has-miR-345-3p
<400> 1
gaggucuggg gagcaagucc cg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PPP2CA3'UTR wildtype
<400> 2
uuguucuuuu uauuuucagg ga 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PPP2CA3'UTR mutant
<400> 3
uuguucuuuu uauuggacuu ua 22
Claims (10)
1.miR-345-3p基因在制备或筛选用于抑制PI3K/AKT信号通路的药物和/或乳腺癌治疗药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述miR-345-3p基因作为所述药物的作用靶标；
和/或，所述PI3K/AKT信号通路为乳腺癌细胞或乳腺癌组织中的PI3K/AKT信号通路。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述药物通过抑制miR-345-3p基因的表达水平来抑制PI3K/AKT信号通路。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述药物抑制miR-345-3p基因表达能够靶向作用于PPP2CA，上调PPP2CA蛋白表达水平而起到抑制PI3K/AKT信号通路的作用。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述miR-345-3p基因通过与PPP2CA 3’UTR结合而靶向作用于PPP2CA。
6.一种药物，用于抑制PI3K/AKT信号通路和/或治疗乳腺癌，其特征在于：所述药物通过分离的miR-345-3p基因制备或筛选得到，所述药物含有有效剂量的用于抑制miR-345-3p基因的药效成分。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于：所述miR-345-3p基因作为所述药物的作用靶标，所述PI3K/AKT信号通路为乳腺癌细胞或乳腺癌组织中的PI3K/AKT信号通路，所述药物通过抑制miR-345-3p基因的表达水平来抑制PI3K/AKT信号通路。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于：所述药物抑制miR-345-3p基因表达能够靶向作用于PPP2CA，上调PPP2CA蛋白表达水平而起到抑制PI3K/AKT信号通路的作用。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述miR-345-3p基因通过与PPP2CA 3’UTR结合而靶向作用于PPP2CA。
10.一种抑制PI3K/AKT信号通路的方法，其特征在于：通过敲低miR-345-3p基因的表达水平来抑制PI3K/AKT信号通路。
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