CN115820848A

CN115820848A - lncRNA DDIT4-AS1的应用及乳腺癌诊断和治疗制剂

Info

Publication number: CN115820848A
Application number: CN202210958176.2A
Authority: CN
Inventors: 程岩; 蒋婷; 姜世龙; 龚蓉; 钟常歆; 程月影
Original assignee: Second Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Second Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2022-08-11
Filing date: 2022-08-11
Publication date: 2023-03-21

Abstract

本发明公开了lncRNA DDIT4‑AS1的应用及乳腺癌诊断和治疗制剂。本发明发现沉默lncRNA DDIT4‑AS1可以抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移等，同时沉默DDIT4‑AS1增强乳腺癌细胞对化疗药物紫杉醇、多柔比星、顺铂的敏感性；裸鼠成瘤实验进一步表明抑制DDIT4‑AS1表达增强了紫杉醇的抑癌效果。本发明为后期相关药物开发以及临床诊断和治疗提供了全新的思路，具有极大的社会意义及市场前景。

Description

lncRNA DDIT4-AS1的应用及乳腺癌诊断和治疗制剂

技术领域：

本发明属于生物医药领域，涉及包含lncRNA DDIT4-AS1在制备乳腺癌诊断试剂、治疗、增强化疗敏感性制剂中的应用，以及相应的诊断、治疗制剂。

背景技术：

全世界每年约新增乳腺癌患者120万人，每年约有40万人死于该病，并且以每年2％～3％的速度递增，美国的乳腺癌发病率己位居女性恶性肿瘤第一位，其死亡率居恶性肿瘤死亡率的第二位。中国乳腺癌发病率也已跃居女性恶性肿瘤的首位，且发病年龄呈年轻化趋势。因此，临床上迫切需要新的生物标志物及治疗靶点改善患者预后。人类基因组有超过90％的转录产物为非编码RNA,在不同水平参与基因表达的调控，不仅调控生长发育、器官功能等基本的生物学过程，也在整个人类疾病尤其是癌症中扮演重要角色。

我们首次发现与乳腺癌进展密切相关的lncRNA DDIT4-AS1，进一步发现沉默DDIT4-AS1可以抑制乳腺癌细胞的增殖及迁移；并且，沉默DDIT4-AS1可以增强乳腺癌细胞对化疗药物如紫杉醇、顺铂和多柔比星的敏感性。因此，靶向lncRNA DDIT4-AS1可以增强化疗药物的疗效，为乳腺癌临床治疗提供新的策略和潜在的药物靶点。

发明内容：

本发明首次发现lncRNA DDIT4-AS1的表达量在乳腺癌和正常乳腺组织中有差异，还发现抑制lncRNA DDIT4-AS1表达，能够抑制乳腺癌增殖、侵袭和/或转移，预示着该lncRNA DDIT4-AS1是潜在的乳腺癌诊断和治疗靶点。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

本发明的首要目的是提供检测lncRNA DDIT4-AS1表达量的试剂在制备乳腺癌诊断制剂中的应用；所述的lncRNA DDIT4-AS1序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的检测lncRNA DDIT4-AS1表达量的试剂包括PCR检测试剂或者原位杂交检测试剂。

PCR检测试剂的引物序列，进一步优选：

F:CTGCCTACAACAGGTCATAACAAA，如SEQ ID NO.2所示；

R:AGCATGAAACAAAGGCTTAGGG，如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的是提供一种乳腺癌诊断试剂盒，包括检测lncRNA DDIT4-AS1表达量的试剂，优选PCR检测试剂或者原位杂交检测试剂；PCR检测试剂的引物序列(F:CTGCCTACAACAGGTCATAACAAA，R:AGCATGAAACAAAGGCTTAGGG)；所述的lncRNA DDIT4-AS1序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供抑制lncRNA DDIT4-AS1表达的试剂在制备乳腺癌预防和/或治疗制剂中的应用；所述的lncRNA DDIT4-AS1序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的抑制lncRNA DDIT4-AS1表达的试剂包括基于DDIT4-AS1基因设计的shRNA、siRNA中的一种或多种。shRNA、siRNA的靶向序列优选如表1所示；也如SEQ IDNo.4-11所示。

本发明的第四个目的是提供一种乳腺癌预防和/或治疗制剂，包括lncRNA DDIT4-AS1抑制剂；所述的lncRNA DDIT4-AS1序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的lncRNA DDIT4-AS1抑制剂，包括基于DDIT4-AS1基因设计的shRNA、siRNA中的一种或多种。shRNA、siRNA的靶向序列如表1所示；也如SEQ ID No.4-11所示。

本发明的第五个目的是提供抑制lncRNA DDIT4-AS1表达的试剂在制备增强乳腺癌化疗药物敏感性制剂中的应用；所述的lncRNA DDIT4-AS1序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的乳腺癌化疗药物包括紫杉醇、顺铂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、多柔比星、丝裂霉素中的一种或多种。

本发明的第六个目的是提供一种增强乳腺癌化疗药物敏感性制剂，包括lncRNADDIT4-AS1抑制剂；所述的lncRNA DDIT4-AS1序列如SEQ ID NO.1所示；进一步所述的lncRNA DDIT4-AS1抑制剂，包括基于DDIT4-AS1基因设计的shRNA、siRNA中的一种或多种。shRNA、siRNA的靶向序列如表1所示；也如SEQ ID No.4-11所示。

本发明的乳腺癌预防和/或治疗制剂、增强乳腺癌化疗药物敏感性制剂剂型选自片剂、胶囊剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、凝胶剂、栓剂中的一种或多种。

上述制剂添加的药学上可接受的载体选自填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、着色剂、防腐剂、矫味剂、抗氧化剂、溶剂中的一种或多种。

lncRNA DDIT4-AS1的cDNA序列信息：

TTGAACATCAAGTGTATTCATGAACAGTGAGTATCTTATCTTCATGTAAACAGTTCTAGATGGAAGACCCAGATGGCACTCCTCCCGGGGAGGGGTTCCAGCCCCCACCCTCTCAGCCCCTCCCCTGCCAGCTCAACTCTGCAGTACACGATGGGGGAAGGCTTAAACGCAGCTGCCAGGTGTAATTTTTCAAGTGTCAAAGATCCCAAGTGATCCCTGACACCCACCCCTTCCTACTCTTACATTCATGCGTCTGTAAGATAGCTGCCTACAACAGGTCATAACAAAAATAATAAGGTACATGCTACACACACATCCAGCTGGAAGCCTTGTTGGCCCCTAAGCCTTTGTTTCATGCTACAGTACTGAGGGGTATGTGTCCCCAATGCACAGCCACCCGCACACAACTCAATGAGCTTCCTGGGAAACACTATTCCCCCACCTCCACCTTAGGTGGCTGCCTCAGTTTTCCAACCACAGGAATCAGTCCCTCAGCTCCTGCCTCTAGTCTCCACCCCAAAAGTTCAGTCGTCTCTGTCTTGGAGGGCACTGTCGGCCCCCTCAGGTTGAAGTTCAACACTCCTCAATGAGCAGCTGTTCCGAGCTGTACAGCTTCTTCTTGATGACTCGGAAGCCAGTGCTCAGCGTCAGGGACTGGCTGAAGCCAGGGAGGAAGGGAGAGTTGGCGGAGCTAAACAGCCCCTGGATCTTGGGCCAGAGTCGTGAGTCCAGGCGCAGCACGAGGGTCAGCTGGAAGGTGGGCACCAGGCTGGGGTCGAGTGCCAGCTGGCCCACGCTGTGGCAGCTCTTGCCCTGCTCCACGCAGACGTCCAGCAGCGCCCCCCGC

表1shRNA、siRNA的靶向序列

本发明有益效果：

本发明发现lncRNA DDIT4-AS1在乳腺癌癌组织及乳腺癌癌细胞中高表达，在乳腺癌旁组织及正常乳腺上皮细胞中表达较低(图1)，可作为乳腺癌诊断依据。干扰lncRNADDIT4-AS1的表达，可以抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移等(图2-3)；干扰lncRNA DDIT4-AS1的表达可以增强乳腺癌细胞对化疗药物紫杉醇、顺铂、多柔比星的敏感性，且具有剂量依赖性(图4)。同时单独沉默lncRNA DDIT4-AS1可以抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，沉默DDIT4-AS1进一步增强了紫杉醇的体内抗肿瘤作用(图5)。因此，抑制DDIT4-AS1表达的物质或干扰DDIT4-AS1的表达载体可在制备抑制乳腺癌增殖、侵袭和/或转移、或者增强化疗敏感性的药物中应用。

附图说明：

图1为lncRNA DDIT4-AS1在乳腺癌及癌旁组织、乳腺癌细胞及正常乳腺上皮细胞MCF10A中的表达水平示意图。

图2为沉默lncRNA DDIT4-AS对乳腺癌细胞增殖影响示意图。

图3为沉默lncRNA DDIT4-AS对乳腺癌细胞迁移影响示意图。

图4为沉默lncRNA DDIT4-AS影响乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性示意图。

图5是本发明裸鼠成瘤实验结果图。

具体实施方式：

实施例1LncRNA DDIT4-AS1在乳腺癌组织及乳腺癌细胞中的表达水平研究

本发明的BT549、MCF-7、MDA-MB-453、4T1细胞系购自中国科学院上海细胞库，MDA-MB-231、MCF10A、T47D、SKBR3细胞系来源于中国科学院昆明动物研究所。

收集乳腺癌患者手术切除的乳腺癌组织及癌旁组织(湘雅二医院乳腺外科诊断为乳腺癌，进行乳腺切除手术时，临床医生取患者的癌组织及相应的癌旁组织，共69例)，并与患者签署知情同意书；组织样本离体后迅速冻存于液氮中。将乳腺癌细胞及乳腺上皮细胞MCF10A接种于六孔板内，待细胞汇合度达90％-100％，收集样本。TRIzol法提取组织或细胞总RNA，逆转录，通过qPCR法检测lncRNA DDIT4-AS1的表达情况(引物F:CTGCCTACAACAGGTCATAACAAA，R:AGCATGAAACAAAGGCTTAGGG)，β-actin为内参(引物序列F:ACCCTGAAGTACCCCATCGAG，SEQ ID No.13，R:AGCACAGCCTGGATAGCAAC，SEQ ID No.14)。图1a显示在乳腺癌病人样本中，lncRNA DDIT4-AS1在癌组织的表达水平高于癌旁组织，差异具有统计学意义。图1b显示与MCF10A相比，DDIT4-AS1在多株乳腺癌细胞中表达水平较高，特别是人源的MDA-MB-231、BT549细胞和鼠源的4T1细胞。

实施例2沉默lncRNA DDIT4-AS1抑制乳腺癌细胞增殖

针对Human lncRNA DDIT4-AS1的mRNA序列设计并构建了两条shRNA及shNT慢病毒对照(靶向序列如表1所示)，携带靶点序列的工具载体和病毒包装辅助质粒共转染293T细胞，在转染完成后的48-72h进行病毒收获，再进行浓缩纯化、质量检测。利用辅助转染试剂聚凝胺，将合格的包装病毒转染至MDA-MB-231和BT549细胞中，24h后更换为正常培养基，嘌呤霉素筛选建立稳定沉默DDIT4-AS1的细胞系；qPCR验证了该shRNA的有效性及特异性，结果如图2a所示，即两条shRNA都能够显著抑制DDIT4-AS1在细胞内的表达水平。

随后利用MDA-MB-231和BT549稳转细胞系分别进行CCK8、细胞计数和平板克隆形成实验，结果显示沉默DDIT4-AS1降低了MDA-MB-231细胞的增殖能力(图2b-d)，差异具有统计学意义。

实施例3沉默lncRNA DDIT4-AS1抑制乳腺癌细胞迁移

进一步地，在人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549中分别转染对照shRNA 和shDDIT4-AS1-1、shDDIT4-AS1-2，通过划痕实验和Transwell实验检测乳腺癌细胞的迁移能力。结果分别如图3所示,对DDIT4-AS1予以沉默后，MDA-MB-231和BT549细胞的迁移能力均得到了显著的降低，差异具有统计学意义。

实施例4沉默lncRNA DDIT4-AS增强乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性

MDA-MB-231细胞转染对照shRNA和shDDIT4-AS1-1/2，按3000个细胞/孔接种于96孔板，化疗药物紫杉醇(PTX)或顺铂(DDP)或多柔比星(DOX)浓度梯度处理48h后，CCK8检测细胞活力。图4结果表明沉默DDIT4-AS1可以分别增强乳腺癌细胞对紫杉醇、顺铂、多柔比星的敏感性。

实施例5沉默DDIT4-AS1增强紫杉醇对乳腺癌细胞裸鼠体内成瘤的抑制能力

为了进一步确定lncRNA DDIT4-AS1对乳腺癌生长及紫杉醇治疗敏感性的影响，对照组和稳定沉默DDIT4-AS1的乳腺癌细胞MDA-MB-231分别接种裸鼠皮下，建立裸鼠异种移植瘤模型，再观察紫杉醇治疗(10mg/kg，每三天腹腔注射一次)对肿瘤生长的影响。开始给药后，每两天测量并记录不同组之间肿瘤体积和小鼠体重，绘制肿瘤体内生长曲线(图5b)和体重变化曲线(图5c)；在第12天麻醉小鼠,手术取瘤拍照并称重(图5a)；肿瘤组织切块进行多聚甲醛固定，进行肿瘤增殖指标Ki67的免疫组化实验(图5d)。综上，沉默DDIT4-AS1显著抑制了乳腺癌生长，而沉默DDIT4-AS1可以进一步显著增强乳腺癌对紫杉醇的敏感性。

Claims

1.检测lncRNA DDIT4-AS1表达量的试剂在制备乳腺癌诊断制剂中的应用；所述的lncRNA DDIT4-AS1序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测lncRNA DDIT4-AS1表达量的试剂包括PCR检测试剂或者原位杂交检测试剂。

3.一种乳腺癌诊断试剂盒，其特征在于，包括检测lncRNA DDIT4-AS1表达量的试剂，优选PCR检测试剂或者原位杂交检测试剂，所述的lncRNA DDIT4-AS1序列如SEQ ID NO.1所示。

4.抑制lncRNA DDIT4-AS1表达的试剂在制备乳腺癌预防和/或治疗制剂中的应用；所述的lncRNA DDIT4-AS1序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的抑制lncRNA DDIT4-AS1表达的试剂包括基于DDIT4-AS1基因设计的shRNA、siRNA中的一种或多种；优选shRNA、siRNA的靶向序列如SEQ ID No.4-11所示。

6.一种乳腺癌预防和/或治疗制剂，其特征在于，包括lncRNA DDIT4-AS1抑制剂；所述的lncRNA DDIT4-AS1序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求6所述的乳腺癌预防和/或治疗制剂，其特征在于，所述的lncRNADDIT4-AS1抑制剂，包括基于DDIT4-AS1基因设计的shRNA、siRNA中的一种或多种；优选shRNA、siRNA的靶向序列如SEQ ID No.4-11所示。

8.抑制lncRNA DDIT4-AS1表达的试剂在制备增强乳腺癌化疗药物敏感性制剂中的应用；所述的lncRNA DDIT4-AS1序列如SEQ ID NO.1所示；所述的抑制lncRNA DDIT4-AS1表达的试剂，优选包括基于DDIT4-AS1基因设计的shRNA、siRNA中的一种或多种；优选shRNA、siRNA的靶向序列如SEQ ID No.4-11所示。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的乳腺癌化疗药物包括紫杉醇、顺铂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、多柔比星、丝裂霉素中的一种或多种。

10.一种增强乳腺癌化疗药物敏感性制剂，其特征在于，包括lncRNA DDIT4-AS1抑制剂；所述的lncRNA DDIT4-AS1序列如SEQ ID NO.1所示；进一步所述的lncRNA DDIT4-AS1抑制剂，包括基于DDIT4-AS1基因设计的shRNA、siRNA中的一种或多种；优选shRNA、siRNA的靶向序列如SEQ ID No.4-11所示。