CN113198016B - 靶向生物标志物的试剂在制备缓解/治疗肝癌的药物中的应用 - Google Patents

靶向生物标志物的试剂在制备缓解/治疗肝癌的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种靶向生物标志物的试剂在制备缓解/治疗肝癌的药物中的应用，其中，所述生物标志物为GBA。所述靶向生物标志物的试剂抑制GBA的过表达，GBA过表达与肝癌的恶性进展和不良预后密切相关，其机制可能是GBA过表达诱导肝癌细胞自噬，促进其增殖活性，从而推进肝癌的恶性发展。所述靶向生物标志物的试剂通过抑制GBA的异常高表达，阻止肝癌细胞内自噬小体降解，导致自噬流下游被阻滞，从而发挥其抗肝癌的药效。

Description

靶向生物标志物的试剂在制备缓解/治疗肝癌的药物中的 应用
技术领域
本公开涉及生物医药技术领域，具体地，涉及GBA作为肝细胞肝癌生物标志物的应用。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是原发性肝癌的主要类型，其发病率在世界范围内总体呈明显上升的趋势，作为全球最常见的恶性癌症之一，HCC具有高致死率的特征。随着医疗水平的发展，肝癌的诊断和治疗有了很大的改善，例如手术切除、局部消融、肝移植和分子靶向药物治疗(例如索拉非尼)已被批准作为HCC治疗的治疗选择，患者的预后较过去已有所改善。但是，由于具有易转移与复发等特点，HCC患者手术切除术后复发率高达50-70％，其五年生存率不足10％，患者的长期预后仍然不理想，均表明仍需要更有效的治疗策略来改善HCC患者的临床结局。HCC的发生发展与多种癌基因过度表达，以及抑癌基因的失活密切相关。因此，揭示HCC发生发展的分子机制，对HCC早期诊断与治疗的药物开发至关重要。
自噬是在所有真核细胞中发生的程序性细胞死亡。目前已经发现自噬在各种类型的癌症中的作用是复杂的，具有双重性，其在癌症恶性进展过程中的作用仍待研究。特别是在肝癌患者中，自噬标记基因ATG5的表达降低和SQSTM1/p62的积累均与不良的总生存率显著相关。因此，研究分子靶标的鉴定和调节自噬的潜在机制对其在肝癌治疗策略的发展和改进中具有重要意义。葡糖苷神经酰胺酶(glucocerebrosidase,GCase)，也称为β-葡糖苷酶和葡糖脑苷脂酶，其编码基因为GBA，作为一种溶酶体水解酶，负责通过裂解糖苷键将糖苷神经酰胺转化为葡萄糖和神经酰胺。GBA过表达与肝癌的恶性进展和不良预后密切相关，其机制可能是，GBA过表达导致肝癌细胞自噬，促进其增殖活性，从而推进肝癌的恶性发展。GBA的过度激活和失活均可改变亚细胞神经酰胺水平，从而导致自噬通量的受损。因此，亟需提供一种靶向试剂抑制GBA的过表达。
发明内容
本公开提供了靶向生物标志物的试剂在制备缓解/治疗肝癌的药物中的应用，所述靶向生物标志物的试剂通过抑制GBA的异常高表达，阻止肝癌细胞内自噬小体降解，导致自噬流下游被阻滞，从而发挥其抗肝癌的药效。为了实现上述目的，一方面，本公开提供了靶向生物标志物的试剂在制备缓解/治疗肝癌的药物中的应用，其中，所述生物标志物为GBA。
根据本公开，其中，所述靶向生物标志物的试剂为GBA的抑制剂。
根据本公开，其中，所述药物中还包括辅助成分，所述辅助成分可以是药学中可以接受的载体。
根据本公开，其中，所述GBA的抑制剂包括GBA基因的siRNA、shRNA、反义寡核苷酸和功能缺失型基因中的至少一种。
根据本公开，其中，所述GBA的抑制剂为针对GBA基因或其上游或下游基因的干扰分子、核酸抑制物、结合分子、小分子化合物中的至少一种。
根据本公开，其中，所述siRNA为si-GBA-313，所述si-GBA-313的正义链和反义链的核酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示：
5'-CCACAUACUGUGACUCCUUTT-3'SEQ ID No.1，
5'-AAGGAGUCACAGUAUGUGGTT-3'SEQ ID No.2。
根据本公开，其中，所述siRNA为si-GBA-1620，所述si-GBA-1620的正义链和反义链的核酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示：
5'-GCUGUUGUGGUCGUGCUAATT-3'SEQ ID No.5，
5'-UUAGCACGACCACAACAGCTT-3'SEQ ID No.6。
根据本公开，其中，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、混悬剂、口服溶液、粉针和注射剂中的至少一种。
另一方面，本公开还提供了一种缓解/治疗肝癌的药物，其中，所述药物含有siRNA作为有效成分，所述siRNA为si-GBA-313和/或si-GBA-1620，
所述si-GBA-313的正义链和反义链的核酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示：
5'-CCACAUACUGUGACUCCUUTT-3'SEQ ID No.1，
5'-AAGGAGUCACAGUAUGUGGTT-3'SEQ ID No.2；
所述si-GBA-1620的正义链和反义链的核酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示：
5'-GCUGUUGUGGUCGUGCUAATT-3'SEQ ID No.5，
5'-UUAGCACGACCACAACAGCTT-3'SEQ ID No.6。
根据本公开，其中，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、混悬剂、口服溶液、粉针和注射剂中的至少一种。
根据本公开，其中，所述药物中，所述siRNA的浓度为0.5-2μM。
通过上述技术方案，本公开提供的一种靶向生物标志物的试剂在制备缓解/治疗肝癌的药物中的应用，所述靶向生物标志物的试剂通过抑制GBA的异常高表达，阻止肝癌细胞内自噬小体降解，导致自噬流下游被阻滞，从而发挥其抗肝癌的药效。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是GBA的过表达与HCC患者的不良预后和人类HCC组织中自噬受损有关。(A)收集来自三名HCC患者的三对肝癌和癌旁肝组织通过微阵列分析检测其GBA mRNA的表达水平(肝癌vs癌旁，P＝0.03)；(B)收集99例HCC和18例癌旁肝组织通过qPCR检测其GBA mRNA的表达水平(肝癌vs癌旁，P<0.001)；(C)和(D)基于TCGA数据集比较肝癌患者的总体生存率(P＝0.02)和无病生存率(P＝0.04)与GBA mRNA表达水平的相关性的Kaplan-Meier曲线。(E)和(F)临床HCC和癌旁肝组织中GBA和SQSTM1/p62蛋白表达水平的免疫组织化学分析和相应的半定量结果。(G)和(H)临床HCC和癌旁肝组织中LC3B蛋白的表达水平和亚细胞定位的免疫荧光分析和相应的半定量结果。原始放大倍数，×400；比例尺，50μm。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001是指与癌旁肝组织的比较。
图2是GBA对HepG2和MHCC-97H细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和细胞克隆形成的影响。(A)和(B)通过Western Blot分析检测经三种si-GBA载体(si-GBA-313，si-GBA-1255和si-GBA-1620)转染后的的HepG2和MHCC-97H细胞中GBA蛋白的表达水平情况。柱状图显示了相对蛋白质表达的结果。(C)和(D)通过CCK-8测定法检测经si-GBA-313和si-GBA-1620转染后的HepG2和MHCC-97H细胞的细胞增殖情况。(E)(F)(K)和(N)通过流式细胞术检测经si-GBA-313和si-GBA-1620转染后的HepG2和MHCC-97H细胞的细胞周期情况。(G)(H)(L)和(O)通过TUNEL细胞凋亡测定法检测经si-GBA-313和si-GBA-1620转染后的HepG2和MHCC-97H细胞的细胞凋亡情况。(I)(J)(M)和(P)通过细胞克隆测定法检测经si-GBA-313和si-GBA-1620转染后的HepG2和MHCC-97H细胞的细胞克隆情况。数据表示为平均值±SD。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，si-GBA组与si-NC组的比较。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开提供一种靶向生物标志物的试剂在制备缓解/治疗肝癌的药物中的应用，其中，所述生物标志物为GBA。
根据本公开，其中，所述靶向生物标志物的试剂为GBA的抑制剂。
现有技术中表明基因HNRPD和PHF17在HCC组织中表达上调，但暂无实验证据表明将其抑制后能否缓解肝癌。本申请所述基因GBA在HCC组织中表达量上调，通过本申请所述靶向生物标志物的试剂可以抑制GBA的过表达，所述靶向生物标志物的试剂通过抑制GBA的异常高表达，阻止肝癌细胞内自噬小体降解，导致自噬流下游被阻滞，从而发挥其抗肝癌的药效。
根据本公开，其中，所述药物中还包括辅助成分，所述辅助成分包括药学上可接受的载体。
根据本公开，其中，所述GBA的抑制剂包括GBA基因的siRNA、shRNA、反义寡核苷酸和功能缺失型基因中的至少一种。
根据本公开，其中，所述GBA的抑制剂为针对GBA基因或其上游或下游基因的干扰分子、核酸抑制物、结合分子、小分子化合物中的至少一种。
根据本公开，其中，所述siRNA为si-GBA-313，所述si-GBA-313的正义链和反义链的核酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示：
5'-CCA CAU ACU GUG ACU CCU UTT-3'SEQ ID No.1，
5'-AAG GAG UCA CAG UAU GUG GTT-3'SEQ ID No.2。
根据本公开，其中，si-GBA还可以为si-GBA-1255，所述si-GBA-1255的正义链和反义链的核酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示：
5'-CCAUGCUCUUUGCCUCAGATT-3'SEQ ID No.3，
5'-UCUGAGGCAAAGAGCAUGGTT-3'SEQ ID No.4；
si-GBA-1255对于GBA表达的敲低效果较好，但是相较于si-GBA-313和si-GBA-1620，其转染效率较低。
根据本公开，其中，所述siRNA为si-GBA-1620，所述si-GBA-1620的正义链和反义链的核酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示：
5'-GCUGUUGUGGUCGUGCUAATT-3'SEQ ID No.5，
5'-UUAGCACGACCACAACAGCTT-3'SEQ ID No.6。
根据本公开，其中，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、混悬剂、口服溶液、粉针和注射剂中的至少一种。
所述注射剂包括包括玻璃体内注射(ivt)制剂、静脉注射(iv)制剂、皮下注射(sc)制剂、愈伤组织内注射制剂和瘤内注射制剂。
另一方面，本公开还提供了一种缓解/治疗肝癌的药物，其中，所述药物含有siRNA作为有效成分，所述siRNA为si-GBA-313和/或si-GBA-1620，
所述si-GBA-313的正义链和反义链的核酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示：
5'-CCA CAU ACU GUG ACU CCU UTT-3'SEQ ID No.1，
5'-AAG GAG UCA CAG UAU GUG GTT-3'SEQ ID No.2；
所述si-GBA-1620的正义链和反义链的核酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示：
5'-GCU GUU GUG GUC GUG CUA ATT-3'SEQ ID No.5，
5'-UUA GCA CGA CCA CAA CAG CTT-3'SEQ ID No.6。
根据本公开，其中，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、混悬剂、口服溶液、粉针和注射剂中的至少一种。
根据本公开，其中，所述药物中，所述siRNA的浓度为0.5-2μM。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
实施例1
本实施例用于说明GBA可以作为肝癌治疗的新靶点。
病例来源及样本量：本公开从100例肝癌患者中收集了99份HCC组织和18份癌旁肝组织样本，所述样本来自解放军总医院第五医学中心，符合纳入标准。其中，三对肝癌与癌旁肝组织用于微阵列检测，其他组织用于GBA表达及其与各种临床病理特征关系的实验验证。
纳入标准：(1)经组织学证实的HCC；(2)接受手术切除；(3)可获得完整的临床数据；(4)无术前化疗或放疗；(5)无其他恶性肿瘤病史。手术后立即收集组织样品并保存在液氮中。
本公开从肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atals，TCGA)数据库中收集373例HCC患者的RNA测序(RNA-Seq)数据及相应的临床信息。最后一次随访检查的日期或直到死亡或复发的初步诊断的日期用于计算总体生存期和无病生存期。本公开临床队列和TCGA队列的临床病理特征，包括患者的年龄、性别、术前血清AFP水平、肿瘤分期、肿瘤等级、肝硬化和侵袭状态如表1和表2所示。
表1本公开临床队列HCC患者中GBA表达与临床病理特征的关联性
Figure BDA0003016741160000071
表2 TCGA数据库队列HCC患者中GBA表达与临床病理特征的关联性
Figure BDA0003016741160000081
基于来自三名HCC患者的三对肝癌与癌旁肝组织的微阵列分析得到转录组谱，结果表明HCC组织中GBAmRNA的水平显著高于癌旁肝组织(肝癌vs.癌旁，分别为7.54±1.10vs5.73±1.02，P＝0.03，如图1A所示)，该结果已通过ABI 7900HT qPCR检测实验进行了独立样本集的验证，所述qPCR检测实验以GAPDH用作标准化和定量检测的内部对照，所有引物序列为：
GBA，正向，5'-CATCCGCACCTACACCTATGC-3'SEQ ID NO.9，
GBA，反向，5'-TGAGCTTGGTATCTTCCTCTGG-3'SEQ ID NO.10；
GAPDH，正向5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'SEQ ID NO.11，
GAPDH，反向5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'SEQ ID NO.12。
该方法使用了本申请的临床队列中的99例HCC和18例癌旁肝组织(肝癌vs癌旁，0.07±0.07vs 0.01±0.01，P<0.001，如图1B)。本公开使用上述99位患者的HCC组织中GBA表达水平的中位数(0.506)将患者分为高和低GBA表达组(分别为n＝50和49)，高GBA表达组的HCC患者相比低GBA表达组的HCC患者术前血清AFP水平和肿瘤等级较高(如表1所示)。同时，TCGA数据集的统计结果[TCGA，RNASeq V2，373个样品)]显示，GBA的过度表达与老年患者的年龄(P＝0.02)、肝癌患者的转移(0.01<P<0.05)和血管浸润(P＝0.04)的存在以及总生存期短(P＝0.01)显著相关(如表2所示)。本公开进行了Kaplan-Meier生存分析以评估GBA表达的预后价值，数据表明，高GBA表达组总体上较差(P＝0.02，图1C)，无疾病(P＝0.04，图1D)的存活率高于低表达组。此外，为了确定GBA表达与自噬状态之间的关系，本公开分别通过免疫组织化学和免疫荧光分析检测了肝癌与癌旁组织中GBA，SQSTM1/p62和LC3B蛋白的亚细胞定位和表达水平。结果显示，与癌旁组织比较，来自相同患者的HCC组织显示出GBA蛋白和SQSTM1/p62积累的强阳性染色(图1E)，以及癌组织中GFP-LC3B点的数量增加(图1H)。半定量数据用于表明统计意义，如图1F和2G所示。
实施例2
本实施例用于说明siRNA敲低技术可以抑制GBA的过表达，从而诱导肝细胞自噬降解受损，并通过使用LT1291进一步反向证明GBA可作为肝癌治疗的靶点。
人HCC细胞系(HepG2和MHCC-97H)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rock-ville，MD，美国)。将这些细胞系保存在改良的Eagle培养基(DMEM，HyClone，Logan，UT，美国)中培养，再加入10％胎牛血清和1％青霉素G和链霉素，并在37℃的潮湿空气中(含5％CO2)保存。
然后将三个对GBA特异性的小干扰RNA(siRNA)构建体插入hRNU6-MCS-CMV-Puro载体(LncBio Co.，shRNA-304，中国上海)。三个siRNA靶向序列为si-GBA-313、si-GBA-1255和si-GBA-1620，其中，si-GBA-313包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；si-GBA-1255包括SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4；si-GBA-1620包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；
5'-CCACAU ACU GUG ACU CCU UTT-3'SEQ ID NO.1，
5'-AAG GAG UCA CAG UAU GUG GTT-3'SEQ ID NO.2；
5'-CCA UGC UCU UUG CCU CAG ATT-3'SEQ ID NO.3，
5'-UCU GAG GCA AAG AGC AUG GTT-3'SEQ ID NO.4；
5'-GCU GUU GUG GUC GUG CUA ATT-3'SEQ ID NO.5，
5'-UUA GCA CGA CCA CAA CAG CTT-3'SEQ ID NO.6。
用于人体GBA的siRNA序列还包括si-NC组，阴性对照序列包括SEQ ID NO.7和SEQID NO.8：
5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'SEQ ID NO.7，
5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'SEQ ID NO.8。
本公开使用聚乙烯亚胺(408727，Sigma-Aldrich，德国)在HepG2和MHCC-97H细胞中进行瞬时转染；LTI-291(10nM，S1024，Selleck，中国上海)用于激活HepG2细胞中的GBA表达；Bafilomycin A1(BAF，10nM，S1413，Selleck，中国上海)用于抑制HepG2细胞的自噬流晚期。
本公开利用上述三种si-GBA载体转染了两个人类HCC细胞系HepG2和MHCC-97H，Western Blot分析结果表明，si-GBA转染组中GBA的表达水平均显著低于si-NC转染组(所有P<0.05，如图2A和B所示)。本公开还通过CCK-8分析测定了细胞增殖能力，结果表明，在不同时间点，用si-GBA载体转染的HepG2和MHCC-97H细胞的OD值均显著低于用si-NC载体转染的OD值(对于HepG2细胞：48h后；对于MHCC-97H细胞：24h后，所有P<0.05，图2C和D)。此外，本公开还通过Annexin V/PI染色法检测GBA在细胞凋亡中的作用，并通过流式细胞仪分析了早期凋亡细胞(Annexin V阳性和PI阴性)和晚期凋亡细胞(Annexin V阳性和PI阳性)的百分比。结果表明，GBA的敲除增加了早期和晚期凋亡细胞的百分比，有效地诱导了HCC细胞凋亡(HepG2和MHCC-97H，P<0.01，图2G、H、L和O)。此外，通过细胞克隆实验进一步评估细胞的生存能力，结果表明，si-NC转染组的细胞数量远大于si-GBA转染组(HepG2和MHCC-97H，P<0.01，图2I，J，M和P)。当GBA表达受到抑制时(所有P<0.05，图2E，F，K和N)，HepG2和MHCC-97H细胞的细胞周期均被阻滞在G1期。
本公开提供了靶向生物标志物的试剂在制备缓解/治疗肝癌的药物中的应用，所述靶向生物标志物的试剂通过抑制GBA的异常高表达，阻止肝癌细胞内自噬小体降解，导致自噬流下游被阻滞，从而发挥其抗肝癌的药效。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 中国中医科学院中药研究所
中国人民解放军总医院第五医学中心
<120> 靶向生物标志物的试剂在制备缓解/治疗肝癌的药物中的应用
<130> 19744ICMM
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccacauacug ugacuccuut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaggagucac aguauguggt t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccaugcucuu ugccucagat t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ucugaggcaa agagcauggt t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcuguugugg ucgugcuaat t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
uuagcacgac cacaacagct t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgugacacg uucggagaat t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
catccgcacc tacacctatg c 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgagcttggt atcttcctct gg 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 12
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims (5)

1.靶向生物标志物GBA的抑制剂在制备缓解、治疗肝癌的药物中的应用，其特征在于，所述GBA的抑制剂为siRNA；
所述siRNA为si-GBA-313，所述si-GBA-313的正义链和反义链的核酸序列如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示：
5'-CCACAUACUGUGACUCCUUTT-3' SEQ ID No.1，
5'-AAGGAGUCACAGUAUGUGGTT-3' SEQ ID No.2。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、混悬剂、口服溶液和注射剂中的至少一种。
3.一种缓解、治疗肝癌的药物，其中，所述药物含有siRNA作为有效成分，所述siRNA为si-GBA-313，
所述si-GBA-313的正义链和反义链的核酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示：
5'-CCA CAU ACU GUG ACU CCU UTT-3' SEQ ID No.1，
5'-AAG GAG UCA CAG UAU GUG GTT-3' SEQ ID No.2。
4.根据权利要求3所述的药物，其中，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、混悬剂、口服溶液和注射剂中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的药物，其中，所述药物中，所述siRNA的浓度为0.5-2μM。
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