CN111235098A - 青蒿素在制备培养干细胞的产品中的应用、培养基及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种青蒿素在制备培养干细胞的产品中的应用、培养基及培养方法，涉及干细胞培养技术领域，本发明通过实验发现，在培养干细胞的过程中通过添加适量的青蒿素，能够有效诱导干细胞的成骨分化能力，并降低诱导过程中诱导物对细胞产生的毒性，保持细胞活性和增殖率。因此，可以利用青蒿素制备培养干细胞的产品。同时，青蒿素为中药单体，成分简单明确，还能够有效避免中药方剂成分复杂、有效物质难以定量、药效作用机理不清、难以推广等问题。

Description

青蒿素在制备培养干细胞的产品中的应用、培养基及培养 方法

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其是涉及一种青蒿素在制备培养干细胞的产品中的应用、培养基及培养方法。

背景技术

随着人口老龄化的增长、恶性肿瘤发病率的提高以及交通事故的增多，骨折和骨缺损的发病率也随之增长。传统中医中药治疗骨折等疾病历史悠久，但中医药方复杂，且需对症下药，难以大规模投入生产，而中药单体作为有效的中药成分，中外相关研究方兴未艾。现有研究中，已有研究发现丹参中的丹酚酸B可以通过ERK信号通路来促进人BMSCs的成骨分化矿化能力。有研究者观察了三七总皂苷对兔BMSCs成骨分化的影响，发现三七总皂苷可以促进兔BMSCs成骨分化，并刺激其分泌TGF-β1，但无明显促进细胞增殖的作用。

口腔干细胞是一类胚胎神经嵴来源的、存在于人体多种口腔组织中的特殊干细胞，有研究者认为，与骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs)相比，口腔干细胞具有更高的增殖分化能力，成神经和成骨细胞分化潜能，更优秀的免疫调节性能等；同时口腔干细胞获取无医源性创伤，成为极具应用前景的间充质干细胞源，在组织再生领域具有重要作用。

如何利用干细胞，尤其是口腔干细胞，促进其成骨以用于修复骨损伤，目前尚未见报道。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供青蒿素在制备培养干细胞的产品中的应用，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的第二个目的在于提供一种培养干细胞的培养基，该培养基组成简单，能够有效提高干细胞的成骨诱导率。

本发明的第三个目的在于提供一种培养干细胞的方法，该方法工艺简单，能够有效节约时间成本。

本发明提供了青蒿素在制备培养干细胞的产品中的应用。

进一步地，所述应用包括制备促进干细胞成骨分化的产品。

进一步地，所述干细胞包括牙髓干细胞。

进一步地，所述牙髓干细胞包括乳牙牙髓干细胞。

本发明还提供了一种培养干细胞的培养基，所述培养基包括青蒿素。

进一步地，所述培养基包括青蒿素和基础培养基；

优选地，所述培养基还包括胎牛血清和/或抗生素。

进一步地，所述青蒿素的浓度为2-400μM，优选为2-50μM；

优选地，所述基础培养基包括MEM、DMEM、F12或1640；

优选地，所述胎牛血清的含量为10-20％v/v；

优选地，所述抗生素包括青霉素-链霉素双抗，所述青霉素-链霉素双抗的含量优选为0.5-2％v/v。

另外，本发明还提供了一种培养干细胞的方法，使用上述的培养基进行干细胞的培养。

进一步地，在干细胞贴壁后采用所述培养基进行干细胞的培养。

进一步地，所述干细胞包括牙髓干细胞，优选包括乳牙牙髓干细胞。

本发明通过实验发现，在培养干细胞的过程中通过添加青蒿素，能够有效诱导干细胞的成骨分化能力，并降低诱导过程中诱导物对细胞产生的毒性，与其他化学小分子诱导物相比，毒性较低，保持细胞活性和增殖率。因此，可以利用青蒿素制备培养干细胞的产品。同时，青蒿素为中药单体，成分简单明确，还能够有效避免药方中药物成分复杂、药效作用机理不清等问题。

本发明提供的培养干细胞的培养基，包括青蒿素，利用青蒿素作为培养基中的有效成分，在无毒副作用的基础上，能够有效诱导干细胞的成骨分化能力，保持细胞活性和增殖率。

本发明的提供的培养干细胞的方法，工艺简单、操作方便，能够有效诱导干细胞的成骨分化能力，保持细胞活性和增殖率，同时兼具培养周期短的优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实验例2提供的干细胞ALP相对表达量的结果图；

图2A为本发明实验例1提供的应用对比例1提供的培养方法培养得到的细胞的结果图(400μm)；

图2B为本发明实验例1提供的应用实施例1提供的培养方法培养得到的细胞的结果图(400μm)；

图2C为本发明实验例1提供的应用对比例2提供的培养方法培养得到的细胞的结果图(400μm)；

图2D为本发明实验例1提供的应用对比例3提供的培养方法培养得到的细胞的结果图(400μm)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，提供了青蒿素在制备培养干细胞的产品中的应用。

青蒿素又名黄花蒿素、黄花素、黄蒿素，是从复合花序植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯的一种无色针状晶体，其分子式为 C₁₅H₂₂O₅，是一种成分明确的中药单体。在已有研究中，青蒿素用于制备抗疟特效药。

干细胞是一类具有自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。

本发明从传统药方中找到了能够有效促进干细胞成骨以修复骨损伤的中药单体。与现有技术发明相比，本发明通过实验发现，在培养干细胞的过程中通过添加适量的青蒿素，能够有效诱导干细胞的成骨分化能力，并降低诱导过程中诱导物对细胞产生的毒性，保持细胞活性和增殖率，且培养得到的干细胞在体内骨修复中具有更好的效果。因此，可以利用青蒿素制备培养干细胞的产品。同时，青蒿素为中药单体，成分简单明确，还能够有效避免药方中药物成分复杂、药效作用机理不清、中药难以作为非处方药在市场上推广的问题。

在一些优选的实施方式中，所述应用包括制备促进干细胞成骨分化的产品。

干细胞在一定条件下，能够产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，在组织器官替代治疗中可作为种子细胞，促进干细胞的成骨分化，能够进一步加强干细胞在组织工程学中的应用。

在一些优选的实施方式中，所述干细胞包括牙髓干细胞。

牙髓干细胞在骨修复中具有比BMSCs更好的效果，例如，成人牙髓干细胞(DPSCs)在体外和体内都会引起骨生成；乳牙牙髓干细胞(SHED) 被证明有通过诱导宿主细胞产生成骨细胞进而产生骨组织的能力。

在一些优选的实施方式中，所述牙髓干细胞包括乳牙牙髓干细胞。

选取乳牙牙髓干细胞SHED作为成骨分化的起始细胞，与其他MSC相比，具有更高的增殖能力和更好的免疫调节能力，便于临床骨修复的移植应用。

本发明还提供了一种培养干细胞的培养基，所述培养基包括青蒿素。

发明提供的培养干细胞的培养基，利用青蒿素作为培养基中的有效成分，在无毒副作用的基础上，能够有效诱导干细胞的成骨分化能力，保持细胞活性和增殖率。

在一些优选的实施方式中，所述培养基包括青蒿素和基础培养基。

本实施例对基础培养基的种类不做限定，凡是本领域可接受的常规细胞培养基均可，优选的基础培养基包括DMEM、F12、IMDM或MEM等，上述基础培养基均能够维持细胞生长环境的稳定，保持细胞的活性。

优选地，使用溶剂溶解青蒿素后，再与基础培养基混合。其中，溶剂例如可以为，但不限于DMSO、冰醋酸、无水乙醇或植物油，优选使用DMSO 溶解青蒿素，DMSO对青蒿素的溶解效果最好。

优选地，所述培养基还包括胎牛血清和/或抗生素。

胎牛血清能够提供细胞生长所需的营养成分，如细胞生长所需的生长因子及结合蛋白等物质，在培养基中加入胎牛血清能够进一步促进细胞的增殖。

优选地，所述胎牛血清的含量为10-20％v/v，例如可以为，但不限于 10％v/v、12％v/v、15％v/v、18％v/v或20％v/v。

抗生素能够维持细胞的无菌生长环境，避免污染，从而保证细胞的正常生长。

优选地，所述抗生素包括青霉素-链霉素双抗，所述青霉素-链霉素双抗的含量优选为0.5-2％v/v。

在一些优选的实施方式中，所述青蒿素的浓度为2-400μM，例如可以为，但不限于2μM、10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM或400μM，优选为2-50μM。通过对青蒿素的使用浓度进行进一步的限定，确定有效药物浓度，提高成骨诱导率，降低药物对细胞的毒性，并且在一定程度促进细胞的增殖。

另外，本发明还提供了一种培养干细胞的方法，使用上述的培养基进行干细胞的培养。

本发明的提供的培养干细胞的方法，工艺简单、操作方便，能够有效诱导干细胞的成骨分化能力，保持细胞活性和增殖率，同时兼具培养周期短的优点。

在一些优选的实施方式中，在干细胞贴壁后采用所述培养基进行干细胞的培养。

一般使用药物刺激时要让细胞在最佳状态，消化后的细胞有少部分会受到损伤，表现为不贴壁，一段时间后细胞死亡。选用贴壁细胞可排除状态较差的细胞。

在一些优选的实施方式中，所述干细胞包括牙髓干细胞，优选包括乳牙牙髓干细胞。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1

本实施例提供了一种干细胞的培养方法，包括：

将SHED接种在细胞培养板中，贴壁后更换含有青蒿素的培养基进行培养。

其中，所述培养基包括：DMEM和浓度为10μM的青蒿素。

实施例2

本实施例提供了一种干细胞的培养方法，包括：

将SHED接种在细胞培养板中，贴壁后更换含有青蒿素的培养基进行培养。

其中，所述培养基包括：DMEM和浓度为2μM的青蒿素。

实施例3

本实施例提供了一种干细胞的培养方法，包括：

将SHED接种在细胞培养板中，贴壁后更换含有青蒿素的培养基进行培养。

其中，所述培养基包括：DMEM和浓度为50μM的青蒿素。

实施例4

本实施例提供了一种干细胞的培养方法，包括：

将SHED接种在细胞培养板中，贴壁后更换含有青蒿素的培养基进行培养。

其中，所述培养基包括：DMEM和浓度为400μM的青蒿素。

实施例5

本实施例提供了一种干细胞的培养方法，包括：

将SHED接种在细胞培养板中，贴壁后更换含有青蒿素的培养基进行培养。

其中，所述培养基包括：DMEM和浓度为1μM的青蒿素。

对比例1

本对比例提供了一种干细胞的培养方法，包括：

将SHED接种在细胞培养板中，贴壁后更换DMEM培养基继续培养。

对比例2

本对比例提供了一种干细胞的培养方法，包括：

将SHED接种在细胞培养板中，贴壁后更换含有丹酚酸的培养基进行培养。

其中，所述培养基包括：DMEM和浓度为50μM的丹酚酸。

对比例3

本对比例提供了一种干细胞的培养方法，包括：

将SHED接种在细胞培养板中，贴壁后更换含有绿原酸的培养基进行培养。

其中，所述培养基包括：DMEM和浓度为500μM的绿原酸。

实验例1细胞增殖能力检测

为了验证本发明使用青蒿素培养干细胞对干细胞增殖能力的影响，将应用实施例1-5及对比例1-3提供的培养方法培养干细胞24小时后，收集细胞，使用cck-8试剂盒进行细胞增殖检测，结果如下表和图2A、2B、2C 和2D所示。

从上述实验结果可以看出，与对比例相比，本发明实施例组的细胞增殖率更高，表明青蒿素单体的加入能够显著提高SHED细胞增殖率。

实验例2成骨分化能力检测

为了验证本发明使用青蒿素培养干细胞对干细胞成骨分化能力的影响，在促进细胞增殖的最佳浓度下，探究青蒿素与其他药物或对照组相比对干细胞成骨分化能力的影响。(添加药物的浓度一般选择细胞能承受的范围内取最大值，在本实验中体现为本特定实验条件下，促进细胞增殖的最佳浓度)将应用实施例1-5及对比例1-3提供的培养方法培养干细胞24小时后，收集细胞，用Trizol裂解细胞，随后分别用三氯甲烷和异丙醇提取总mRNA，qPCR检测成骨相关基因的变化，结果如下表和图1所示。相对表达量(内参为GAPDH)。

从上述实验结果可以看出，与对比例相比，本发明实施例组的成骨分化相关基因(碱性磷酸酶，ALP)高表达，而对比组的成骨相关基因表达无显著差异，表明青蒿素单体的加入能够显著提高SHED成骨分化率。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.青蒿素在制备培养干细胞的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括制备促进干细胞成骨分化的产品。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述干细胞包括牙髓干细胞。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述牙髓干细胞包括乳牙牙髓干细胞。

5.一种培养干细胞的培养基，其特征在于，所述培养基包括青蒿素。

6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括青蒿素和基础培养基；

优选地，所述培养基包括胎牛血清和/或抗生素。

7.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述青蒿素的浓度为2-400μM，优选为2-50μM；

优选地，所述胎牛血清的含量为10-20％v/v；

优选地，所述抗生素包括青霉素-链霉素双抗，所述青霉素-链霉素双抗的含量优选为0.5-2％v/v；

优选地，所述基础培养基包括MEM、DMEM、F12或1640。

8.一种培养干细胞的方法，其特征在于，使用权利要求5-7任一项所述的培养基进行干细胞的培养。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在干细胞贴壁后采用所述培养基进行干细胞的培养。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述干细胞包括牙髓干细胞，优选包括乳牙牙髓干细胞。

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