CN117512110A - Pd-l1作为分子标志物在制备骨髓增殖性肿瘤的辅助诊断试剂盒中的应用 - Google Patents
Pd-l1作为分子标志物在制备骨髓增殖性肿瘤的辅助诊断试剂盒中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了PD‑L1作为分子标志物在制备骨髓增殖性肿瘤的辅助诊断试剂盒中的应用，所述骨髓增殖性肿瘤的辅助诊断试剂盒包括PD‑L1分子标志物的检测试剂和/或检测引物和/或检测试剂盒；所述检测引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述检测试剂盒，包括所述的检测引物。本发明可检测患者骨髓中PD‑L1的表达水平，从而快速方便的检测骨髓PD‑L1骨髓增殖性肿瘤患者和正常对照者的表达水平，灵敏度达到81.18％以上，特异度达到83.33％以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，特别涉及PD-L1作为分子标志物在制备骨髓增殖性肿瘤的辅助诊断试剂盒中的应用。
背景技术
骨髓增殖性肿瘤(Myeloproliferative neoplasms,MPN)是一组以骨髓一系或多系细胞持续增殖为特征的克隆性造血干细胞疾病。经典型Ph阴性的MPN主要包括真性红细胞增多症(PV)，原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)，其发病机理复杂，涉及细胞分化、增殖、凋亡等多方面的异常改变。近期研究表明，MPN是典型的慢性炎症性肿瘤，具有骨髓增殖和免疫微环境失调的共同特征。MPN患者体内的T细胞往往处于免疫抑制状态，免疫抑制因子TGF-β和ARG1水平增高，免疫应答分子HLA-1减少。MPN患者的外周血髓源性抑制细胞(MDSCs)水平显著升高，MDSCs通过抑制自体CD3+T淋巴细胞的增殖和诱导ARG-1表达产生免疫抑制作用，从而介导肿瘤免疫逃逸，造成MPN免疫功能失调。间充质干细胞(MSCs)是驻留在骨髓中的具有广泛分化潜能的多能干细胞，其可促进MDSCs细胞增殖，导致MPN患者免疫耐受性肿瘤微环境的形成。免疫微环境紊乱与骨髓增殖性肿瘤的发生、发展、转化及治疗耐药性密切相关。
JAK2，MPL及CARL等驱动基因突变以及其他相关基因的二次打击均与MPN的发生发展相关。骨髓活检，包括巨核细胞形态和骨髓增殖程度，对于区分ET与PV和PMF至关重要。然而，目前临床上对于MPN的诊断，还存在一定的困难。近年来MPN发病率呈升高态势。MPN患者在病程中饱受血栓形成和出血并发症的困扰，最终进展或转化为骨髓纤维化、急性白血病。基于MPN发病过程的复杂度、临床转归的恶性度，识别新型的生物标志物对于骨髓增殖性肿瘤的及时、早期诊断非常重要，有必要开发一种新的灵敏度、特异度高的骨髓增殖性肿瘤的标志物。
发明内容
本发明目的是提供PD-L1作为分子标志物在制备骨髓增殖性肿瘤的辅助诊断试剂盒中的应用，可检测PD-L1在患者骨髓中的表达水平，可用于区分骨髓增殖性肿瘤患者和正常对照者，灵敏度达到81.18％以上，特异度达到83.33％以上。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了PD-L1作为分子标志物在制备骨髓增殖性肿瘤的辅助诊断试剂盒中的应用。
进一步地，所述骨髓增殖性肿瘤的辅助诊断试剂盒包括PD-L1分子标志物的检测试剂和/或检测引物和/或检测试剂盒。
进一步地，所述PD-L1分子标志物的检测引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
进一步地，所述检测试剂盒包括PD-L1分子标志物的实时荧光定量PCR试剂盒，包括如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的检测引物、用于均一化的内参引物、阳性对照模板、阴性对照模板和qPCR反应常规试剂。
进一步地，所述用于均一化的内参引物为以GAPDH为内参的引物，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述阳性对照模板为经测序验证过的PD-L1的PCR扩增产物；所述阴性对照模板为去离子水；所述qPCR反应常规试剂包括SYBR-Green IPremix Ex Taq。
在本发明的第二方面，提供了PD-L1的检测引物或试剂盒在制备用于诊断骨髓增殖性肿瘤的产品中的应用。
在本发明的第三方面，提供了一种骨髓增殖性肿瘤的辅助诊断试剂盒，包括如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示的检测引物。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
1、本发明提供的PD-L1作为分子标志物在制备骨髓增殖性肿瘤的辅助诊断试剂盒中的应用，本申请发明人经多次实验后首次发现，与正常人相比，骨髓增殖性肿瘤患者骨髓中PD-L1表达量显著上调；同时，发明人还发现，PD-L1基因在原发性血小板增多，真性红细胞增多症及骨髓纤维化中有上升的趋势，这表明PD-L1基因能够作为骨髓增殖性肿瘤的辅助诊断、危险度分层标记物，为骨髓增殖性肿瘤的诊断或险度分层提供了新的检测指标。
2、本发明提供了检测骨髓增殖性肿瘤辅助诊断分子标志物PD-L1表达水平的引物，利用所述引物可检测患者骨髓中PD-L1的表达水平，从而使骨髓增殖性肿瘤的诊断更加方便易行。利用所述引物可制备骨髓增殖性肿瘤辅助诊断的试剂盒，从而快速方便的检测PD-L1在患者骨髓中的表达水平。
3、本发明将骨髓PD-L1的表达水平用于辅助诊断骨髓增殖性肿瘤患者，单独检测骨髓PD-L1的表达水平区分骨髓增殖性肿瘤患者和正常对照者，灵敏度达到81.18％以上，特异度达到83.33％以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为PD-L1在MPN患者样本及缺铁贫对照样本差异表达；
图2为在MPN患者样本中PD-L1检测结果的ROC曲线；
图3为PD-L1在原发性血小板增多，真性红细胞增多症及骨髓纤维化中差异表达。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
通过开展实验首次发现骨髓PD-L1的表达与骨髓增殖性肿瘤的发生密切相关。研究结果表明，表明PD-L1基因能够作为骨髓增殖性肿瘤的辅助诊断、危险度分层标记物，为骨髓增殖性肿瘤的诊断或险度分层提供了新的检测指标，骨髓PD-L1的表达水平可用于区分骨髓增殖性肿瘤患者与健康对照者，具有较高的诊断价值。
本发明将骨髓增殖性肿瘤辅助诊断分子标志物的引物(所述的引物的序列如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示)用于制备骨髓增殖性肿瘤辅助诊断的试剂盒中，检测骨髓增殖性肿瘤辅助诊断分子标志物—PD-L1的表达水平，从而使骨髓增殖性肿瘤的诊断更加方便易行。
所述试剂盒为实时荧光定量PCR试剂盒，包括所述的检测引物，还包括：用于均一化的内参引物、阳性对照模板、阴性对照模板和qPCR反应常规试剂。
采用实时荧光定量PCR试剂盒用于检测上述分子标记物的方法，包括以下步骤：
以逆转录获得的cDNA为模板，采用所述实时荧光定量PCR试剂盒配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线；所述扩增反应体系包括：SYBR-Green IPremix ExTaq10μL、如SEQ ID NO：1所示的引物(2μM)0.8μL、如SEQ ID NO：2所示的引物(2μM)0.8μL、RNase-free water 6.4μL、cDNA2μL。所述扩增程序为：95℃5min，95℃30sec,61.6℃30sec,72℃30sec，除第一步外，其余共计40个循环，获得Ct PD-L1；
同时用GAPDH作为均一化参照引物对逆转录合成待检测样本cDNA进行qPCR扩增，获得Ct GAPDH；
Ct值是指反应管中的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，反映了样本所含的起始拷贝数。起始拷贝数越少，Ct越大，反之则越小。通过计算ΔCt PD-L1-ΔCt GAPDH得出ΔΔCt。
对2-ΔΔCt进行分析判断原则为：
将待测样本的2-ΔΔCt值与健康对照者样本的2-ΔΔCt值进行比较，并进行统计学分析获得P值，以P<0.05为差异有统计学意义。
若2-ΔΔCt<18.73，待测样本不诊断为骨髓增殖性肿瘤；
若2-ΔΔCt≥18.73，待测样本诊断为骨髓增殖性肿瘤。
下面将结合实施例及实验数据对本申请进行详细说明。
实施例1骨髓增殖性肿瘤患者骨髓PD-L1表达水平异常升高以及试剂盒的制备
1、细胞、骨髓标本采集和处理
收集体外培养的HEL细胞，PBS洗涤2次，向获得的细胞团块中加入1mL Trizol(购自TaKaRa)，反复吹打混匀后。
收集武汉大学在中南医院2020年1月至2023年6月初诊的MPN骨髓标本82例，缺铁贫对照骨髓样本89例，所有参加者均签署知情同意书；采用EDTA抗凝采血管采集骨髓标本5ml，记录患者信息；采用淋巴细胞分离液(Ficoll)密度梯度离心法收集单个核细胞，最后向收集的单个核细胞团块中加入Trizol试剂，反复吹打混匀，置于EP管中，-80℃保存待用。
2、细胞、骨髓标本RNA提取(骨髓RNA提取试剂盒—Bioteke)
向所述获得的细胞EP管中加入200μl氯仿，上下用力震荡混匀15s，静置10min后，4℃、12000g离心15min；离心后液体分为三层(上层水相为RNA，中层白色为DNA，下层红色为蛋白质)，小心吸取上层无色水相置于新的1.5ml Ep管中；加入等体积的异丙醇混匀，静置10min后，4℃、12000g离心10min；可见管底有少许白色沉淀，小心弃去上清，在沉淀加入1ml75％乙醇颠倒清洗，4℃、12000g离心5min，洗两遍；在超净工作台中，使管底的沉淀物(总RNA)自然干燥，期间观察沉淀是否变无水透明，即表明RNA已晾干；根据RNA沉淀的量加入适量体积(20-50μl)的DEPC水溶解RNA，测RNA浓度(A260/A280＝1.8～2.1)。
3、逆转录(PrimeScriptTM RT试剂盒—Takara)
采用Takara的PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser试剂盒逆转录，具体操作流程如下：
①在冰盒中准备下面反应试剂：
表1
弹匀，点离5～10sec；
②PCR仪上42℃孵育2min，或者室温放置30min；
③在上述产物中加入下面反应物：
表2
总体积20μL，轻柔混匀后，点离5-8sec；
④在PCR仪上37℃反应15min，继续85℃持续5sec。
⑤合成的第一链cDNA可以立即进行PCR扩增，或置于-20℃保存。若要长期保存可置于-80℃冰箱。
4、实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)：
(1)引物序列：PD-L1和GAPDH的引物序列如下表3：
表3
| 引物名称 | 序列(5’-3’) |
| PD-L1-F | 5'-CCATCTTATTATGCCTTGGTGTAG-3'(SEQ ID NO:1) |
| PD-L1-R | 5'-TTTGCTTCTTTGAGTTTGTATCTTG-3'(SEQ ID NO:2) |
| GAPDH-F | 5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'(SEQ ID NO:3) |
| GAPDH-R | 5'-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3'(SEQ ID NO:4) |
(2)反应体系：采用SYBR-Green I Premix Ex Taq(康为世纪)和上述特异性引物，对步骤3获得的cDNA进行定量PCR扩增，定量PCR扩增的反应体系如表4：
表4
(3)Real-time qPCR：盖紧8联管盖，做好标记，震荡混匀，室温离心1min，离心力1000g，设置Real-time qPCR程序并运行。反应程序如表5：
表5
注意全程在冰上操作，且避免外源DNA的污染。运行完成后，通过观察溶解曲线，判断是否有引物二聚体形成以及非特异性扩增。Ct值是指反应管中的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，反映了样本所含的起始拷贝数。起始拷贝数越少，Ct越大，反之则越小。对于每个样品来说，PD-L1的实际Ct值为其两个复孔Ct的平均值，GAPDH的实际Ct值为其两个复孔Ct的平均值，通过计算CtPD-L1-CtHEL PD-L，CtGAPDH-CtHEL GAPDH分别得出PD-L1分子和GAPDH分子的ΔCt值(HEL细胞株为本实验的对照)。qPCR运行完成后的8联管可置于4℃保存。
(4)琼脂糖电泳
通过3％琼脂糖凝胶电泳试验检测PCR扩增产物，并将PCR产物送上海生工测序公司测序，经过序列Blast比对，确认扩增产物为PD-L1基因(SEQ ID NO:5)，表明本实施例设计的引物能够特异性扩增PD-L1基因。
5、实验结果
(1)PD-L1基因表达量计算及结果分析
采用2-ΔΔCt法计算PD-L1基因表达量，ΔΔCt＝ΔCtPD-L1-ΔCtGAPDH数据用SPSS24软件进行统计分析，采用Kruskal-WallisH秩和检验比较数据差异，用ROC曲线分析诊断效能(P＜0.05考虑有统计学差异)
骨髓PD-L1基因表达情况结果见图1，结果显示：PD-L1基因表达量在初诊MPN患者骨髓中显著高于对照组。与正常人相比，骨髓增殖性肿瘤患者骨髓中PD-L1表达量显著上调；同时，PD-L1基因在原发性血小板增多，真性红细胞增多症及骨髓纤维化中有上升的趋势(图3)，这表明PD-L1基因能够作为骨髓增殖性肿瘤的辅助诊断、危险度分层标记物，为骨髓增殖性肿瘤的诊断或险度分层提供了新的检测指标。
(2)ROC曲线分析：
运用受试者工作特征曲线(Receiver-operator characteristic,ROC)评估了骨髓PD-L1在骨髓增殖性肿瘤中的诊断价值。所有统计分析均使用GraphPad Prism8.0和IBMSPSS Statistics 26.0进行。以P<0.05为差异有统计学意义。
通过ROC曲线来评估骨髓PD-L1基因在MPN诊断中的诊断效能(见图2与表6)，本领域技术人员所熟知的是ROC曲线下面积在1.0和0.5之间，在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5-0.7时有较低准确性，AUC在0.7-0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性，该值大于0.7即表示检测靶点能够作为该种检测的特异性标示物，我们的标志物AUC是0.86，表明骨髓PD-L1可以作为MPN的辅助诊断标记。
表6
结果如图2和表6可知，ROC曲线分析结果表明，骨髓PD-L1的水平可用于区分骨髓增殖性肿瘤患者和正常对照者(AUC＝0.86，P<0.0001)，灵敏度为81.18％，特异度为83.33％。
(3)PD-L1表达量与MPN患者疾病严重程度分析
PD-L1表达量在MPN患者疾病进展进程中分析，分析结果见图3。
由图3可见，PD-L1基因的表达量在原发性血小板增多，真性红细胞增多症及骨髓纤维化中有上升的趋势，表明PD-L1基因可作为骨髓增殖性肿瘤危险度分层指标。
综上所述，本发明通过开展实验首次发现骨髓PD-L1的表达与骨髓增殖性肿瘤的发生密切相关。研究结果表明，PD-L1基因能够作为骨髓增殖性肿瘤的辅助诊断、危险度分层标记物，为骨髓增殖性肿瘤的诊断或危险度分层提供了新的检测指标。骨髓PD-L1的表达水平可用于区分骨髓增殖性肿瘤患者与健康对照者，具有较高的诊断价值。本发明将用于检测骨髓PD-L1的表达水平的引物及其试剂盒用于辅助诊断骨髓增殖性肿瘤患者，单独检测骨髓PD-L1的表达水平区分骨髓增殖性肿瘤患者和正常对照者，灵敏度达到81.18％以上，特异度达到83.33％以上。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (8)
1.PD-L1作为分子标志物在制备骨髓增殖性肿瘤的辅助诊断试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨髓增殖性肿瘤的辅助诊断试剂盒包括PD-L1分子标志物的检测试剂和/或检测引物和/或检测试剂盒。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PD-L1分子标志物的检测引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒包括PD-L1分子标志物的实时荧光定量PCR试剂盒，包括如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的检测引物、用于均一化的内参引物、阳性对照模板、阴性对照模板和qPCR反应常规试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述用于均一化的内参引物为以GAPDH为内参的引物，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述阳性对照模板为经测序验证过的PD-L1的PCR扩增产物；所述阴性对照模板为去离子水；所述qPCR反应常规试剂包括SYBR-Green IPremix Ex Taq。
7.PD-L1的检测引物或试剂盒在制备用于诊断骨髓增殖性肿瘤的产品中的应用。
8.一种骨髓增殖性肿瘤的辅助诊断试剂盒，其特征在于，包括如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示的检测引物。
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