CN112852811B - 一种lncRNA分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种lncRNA分子及其应用，属于分子生物医学技术领域。本发明提供了一种在AAV患者外周血高表达的lncRNA分子，名称为LINC0219。本发明通过RNA‑seq及临床大样本验证成功筛选出AAV患者外周血中高表达的lncRNA，其可作为AAV诊断或评估的分子标志物或靶点，应用于AAV的早期诊断、活动性评估或作为治疗靶点，并可用于进一步阐明AAV发病的分子机制、信号通路等，具有极大的应用前景。

Description

一种lncRNA分子及其应用
技术领域
本发明涉及一种lncRNA分子及其应用，属于分子生物医学技术领域。
背景技术
抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关性血管炎(AAV)是一组多系统受累的自身免疫性炎症性疾病，其特征是中小血管的坏死性血管炎。AAV包括三种不同的临床类型：肉芽肿性多血管炎(GPA)，显微镜下多血管炎(MPA)和嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)。本病几乎可以累及任何一个系统器官，临床表现缺乏特异性，疾病进展迅速，如不能早期诊断、及时治疗，累及肺、肾、消化道等重要脏器时通常会引起脏器不可逆损伤甚至危及生命。且疾病反复复发活动导致了治疗的困难，如不能早期识别疾病活动、正确评估，会严重影响患者的预后。
伯明翰血管炎活动评分(BVAS)被广泛用于评估AAV的疾病活动性和严重程度，但因其条目众多，给临床医生带来了不便，极大限制了其临床应用。此外，一些血清学指标包括血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、补体3a(C3a)、C5a 和基质金属蛋白酶3(MMP-3)等也被用于评估疾病活动性，但是它们的特异性与灵敏性不高。虽然评估方式很多，但是评分系统种类繁多、每个量表包含的条目众多，不易操作、既不能监测炎症反应又不能提供治疗靶点。因此，寻找AAV 相关的分子标志物，进一步明确其发病机制，并开发可应用于临床早期诊断、活动性评估和治疗靶点的指标尤为重要。
长链非编码RNA(Long Noncoding RNA,lncRNA)是一类转录本长度超过200nt 的不编码蛋白的RNA分子。但是它们作为RNA分子可在多个层面如基因水平、转录水平及转录后水平参与蛋白编码基因的调控。LncRNA在先天及适应性免疫中的作用已被证实，且与自身免疫性疾病的诊断、疾病活动和预后密切相关。但是在AAV中的作用尚未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是为解决如何获得AAV诊断和疾病活动性评估的标志物以及该标志物可为AAV提供治疗上的靶点的技术问题。
为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种lncRNA 分子，为一种在AAV患者外周血高表达的lncRNA分子，其核苷酸序列为SEQ ID No.1。
本发明提供一种核苷酸序列为SEQ ID No.1的lncRNA分子的检测方法，包括以下步骤：
步骤1：收集静脉血，分离外周血白细胞，提取总RNA；
步骤2：设计实时定量荧光PCR引物；
步骤3：进行qRT-PCR反应，检测lncRNA分子的表达；
优选地，上述步骤2中PCR引物设为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。
本发明提供一种用于制备辅助诊断或评估AAV的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增SEQ ID No.1的lncRNA分子的特异性引物、标准DNA模版和PCR反应液；采用上述lncRNA分子的检测方法。
本发明提供一种lncRNA分子在制备AAV诊断、评估或辅助治疗的试剂或试剂盒中的应用。
本发明提供一种用于检测lncRNA分子的试剂在制备AAV诊断、评估或辅助治疗试剂或试剂盒中的应用。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明通过提供RNA-seq及临床大样本验证成功筛选出AAV患者外周血中高表达的lncRNA，其可作为AAV诊断/评估的分子标志物或靶点，应用于AAV的早期诊断、活动性评估或作为治疗靶点，并进一步阐明AAV发病的分子机制、信号通路等，具有极大的应用前景。解决了获得AAV诊断和疾病活动性评估的标志物以及该标志物可作为AAV提供治疗上的靶点的技术问题。
附图说明
图1为本发明实施例中利用RNA-seq技术筛选出差异表达的lncRNA；
图2为本发明实施例中qRT-PCR结果的散点图；
图3为本发明实施例中通过ROC曲线下面积检测诊断效能图；
图4为本发明实施例中分析lncRNA在不同疾病活动度下的表达水平；
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：
如图1-4所示；本发明提供了一种在AAV患者外周血高表达的lncRNA分子，名称为LINC0219，其核苷酸序列SEQ ID No.1如下：
UGCACACAUCUUCUUCUCCAAGGUUUGUGUGCAGAACAUCCUGCCCAUGCUGCCCCAGCAGCUUC AGUUGGCACCUGCCCCAGUCCAGCCUCUGGGAACCAUGCAGCAGCUCCCAGCGGCCCUGCACCCACCAC CAGCAUCCGUUUCACCUGCAGUUGAAGAUCCGUGAGGUGCCCAGAAGAUCAUGCAGUCAUCAGUCCCAC GGAGCAGCCCGCGAGGCUGAGGCUCCUCCCACUGGACCGCCCCCCAACUGGCACCACUGCUGCCCCUGC CCCUACUCUCAGCCUCACGUGACUCUCGGGCAGAAGCAGUGGUGGGGCAGCCAGGGCAGCGUCAAGAGU CUGAGCCAGCUGCAGGACAAGUUCGAGCAUCUUAAAAUGAUUCAACAGGAGGAGAUAAGGAAGCUCGAG GAAGAGAAAAAACAACUGGAAGGAGAAAUCAUAGAUUUUUAUAAAAUGAAAGCUUCCUCUGAAGCACUG CAGACUCAGCUGAGCACCGAUACAAAGAAAGACAAACAUCCUGAUCCAUAUGAAUUCCUCUUAUUAAGA AAAAUAAAGCAUCCAGGAUUCAAUGAAGAACUAUCACCUUGUUAAUCAUUCAGAAACAUGUUGCAGGCU UAAGCCAUUUUUGAUAUAGAUACUGAAACAAUUACUUGCUAAGAGCAAACUUGAAGGUAUGGAUAAGGC CCUGAGUCAUCUUCCUGAGCUGAAUGAUAGUUAAGCU；
lncRNA分子LINC0219在制备AAV诊断、评估或辅助治疗试剂或试剂盒中的应用。
用于检测lncRNA分子LINC0219的试剂在制备AAV诊断、评估或辅助治疗试剂或试剂盒中的应用。
用于检测lncRNA分子LINC0219的试剂包括用于扩增LINC0219分子的特异性引物对。
所用引物对序列如下：
上游引物SEQ ID No.2：5’-GGCTGAGGCTCCTCCCACTG-3’；
下游引物SEQ ID No.3：5’-ACCACTGCTTCTGCCCGAGAG-3’。
用于检测lncRNA分子LINC0219的试剂盒在制备AAV辅助诊断、评估工具中的应用。
用于检测lncRNA分子LINC0219的试剂盒在制备AAV辅助治疗工具中的应用。
一种用于辅助诊断/评估AAV的试剂盒包括：
a)用于扩增LINC0219的特异性引物；
b)标准DNA模版；
c)PCR反应液。
一种检测LINC0219的方法，包括以下步骤：
a)提取样品总RNA；
b)制备样品cDNA；
c)定量扩增LINC0219。
实施例1
AAV相关的lncRNA分子的筛选：
收集AAV患者和健康对照静脉血(每组各5例)，分离外周血白细胞，提取总RNA，利用RNA-seq技术筛选出差异表达的lncRNA(见图1)。
实施例2
大样本验证筛选出的差异表达基因：
1、样本收集
收集2019.1-2020.12就诊于复旦大学附属中山医院风湿免疫科，根据1990 年ACR和2012年CHCC会议诊断标准诊断为GPA和MPA的患者共35例，排除其他自身免疫性疾病、肿瘤和感染的患者。同时收集20例健康体检者作为对照。用EDTA采血管采集患者和健康对照每人10ml静脉血。试验中标本采集已取得病人和健康对照的知情同意。
2、样本总RNA提取
1)将采集的静脉血以20:1的比例加入红细胞裂解液，室温静置5-7min，待红细胞完全裂解后400g离心10min弃上清液，并用PBS洗一次后得到外周血总白细胞；
2)将白细胞加入1ml trizol裂解液，冰上静置5min；
3)加入200μl氯仿，振荡混匀后室温放置15min；
4)4℃12000g离心15min；
5)吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；
6)加入0.5ml异丙醇混匀，室温放置5-10min；
7)4℃，12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；
8)加入1ml 75％乙醇，悬浮沉淀；
9)4℃，12000g离心5min，尽量弃上清；
10)室温晾干或真空干燥5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
11)用20μl DEPC H2O溶解RNA样品。
12)RNA纯度的测定和RNA的定量以DEPC H2O为对照(Blank)，取2μl RNA 溶液于酶标仪上检测样本浓度和质量。
3、引物设计
依据实时定量荧光PCR引物设计原则,使用Primer5.0软件设计实时定量荧光PCR引物。本实施例使用的引物全部由上海生工生物技术有限公司合成，其中β-Actin为内参校准基因。
LINC0219引物对为：
上游引物SEQ ID No.2：5’-GGCTGAGGCTCCTCCCACTG-3’；
下游引物SEQ ID No.3：5’-ACCACTGCTTCTGCCCGAGAG-3’。
β-Actin引物对为：
上游引物：5’-GGCACCCAGCACAATGAAG-3’；
下游引物：5’-CCGATCCACACGGAGTACTTG-3’。
4、qRT-PCR检测LINC0219的表达。
PCR反应体系：
Figure BDA0002926634640000051
反应条件：95℃30s，之后[95℃5s，60℃30s]40个循环。
测定CT值，以β-Actin为内参。
5、结果计算
各样品的目的基因和管家基因分别进行qRT-PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。统计软件SPSS 25.0进行数据分析。以2-△Ct表示各样本的LINC0219的相对表达量。数据符合正态分布时采 用两组独立样本的t检验，不符合正态分布时用两组独立样本的秩和检验，P<0.05时具有统计学意义。
qRT-PCR结果的散点图(如图2)所示，可以看到：以β-Actin作为参照， AAV组的LINC0219与正常人比较，表达上调(P<0.001)。通过ROC曲线下面积检测了LINC0219的诊断效能，如图3所示，LINC0219诊断的AUC达到0.920(95％ CI：0.835to 1.000)。上述结果表明LINC0219可以区分患者和正常人。
进一步分析LINC0219在不同疾病活动度下的表达水平(如图4)，将上述 35例患者分为初发未治活动组、治疗后疾病缓解组、复发活动组，结果表明，活动组(初发及复发活动组)LINC0219的表达显著高于疾病缓解组(p<0.05)。表明LINC0219的水平与疾病活动性有关。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Figure BDA0002926634640000071
Figure BDA0002926634640000081
序列表
<120> 一种lncRNA分子及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 723
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
ugcacacauc uucuucucca agguuugugu gcagaacauc cugcccaugc ugccccagca 60
gcuucaguug gcaccugccc caguccagcc ucugggaacc augcagcagc ucccagcggc 120
ccugcaccca ccaccagcau ccguuucacc ugcaguugaa gauccgugag gugcccagaa 180
gaucaugcag ucaucagucc cacggagcag cccgcgaggc ugaggcuccu cccacuggac 240
cgccccccaa cuggcaccac ugcugccccu gccccuacuc ucagccucac gugacucucg 300
ggcagaagca gugguggggc agccagggca gcgucaagag ucugagccag cugcaggaca 360
aguucgagca ucuuaaaaug auucaacagg aggagauaag gaagcucgag gaagagaaaa 420
aacaacugga aggagaaauc auagauuuuu auaaaaugaa agcuuccucu gaagcacugc 480
agacucagcu gagcaccgau acaaagaaag acaaacaucc ugauccauau gaauuccucu 540
uauuaagaaa aauaaagcau ccaggauuca augaagaacu aucaccuugu uaaucauuca 600
gaaacauguu gcaggcuuaa gccauuuuug auauagauac ugaaacaauu acuugcuaag 660
agcaaacuug aagguaugga uaaggcccug agucaucuuc cugagcugaa ugauaguuaa 720
gcu 723
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggctgaggct cctcccactg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accactgctt ctgcccgaga g 21

Claims (1)

1.一种lncRNA分子的检测试剂用于制备辅助诊断或评估抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增SEQ ID No.1的lncRNA分子的特异性引物、标准DNA模版和PCR反应液；所述特异性引物为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。
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