CN110541027A - lncRNA HIF1A-AS1抗深静脉血栓的应用 - Google Patents

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Abstract

lncRNA HIF1A‑AS1抗深静脉血栓的应用。本发明提供了一种抗深静脉血栓的药物，所述药物包括lncRNA HIF1A‑AS1表达增强剂或lncRNA HIF1A‑AS1的靶基因表达增强剂，本发明还提供了一种检测深静脉血栓的标志物，所述标志物为lncRNA HIF1A‑AS1。本发明在动物和细胞层面，通过构建lncRNA HIF1A‑AS1过表达/沉默模型，检测成栓情况、VECs的凋亡增殖情况，明确HIF1A‑AS1调节VECs凋亡与增殖作用，为DVT的分子调控和靶向药物治疗提供依据。

Description

lncRNA HIF1A-AS1抗深静脉血栓的应用
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及lncRNA HIF1A-AS1在抗深静脉血栓的应用。
背景技术
深静脉血栓(Deep Venoμs Thrombosis,DVT)是指血液在深静脉内异常凝结，阻塞血管，造成组织器官缺血缺氧坏死，危害性大，是外科(尤其骨科)手术最常见并发症，且发生率高。在美国每年DVT患者约为35万至60万(发病率为0.2％)"],国内每年约为1000万2]。创伤或骨科大手术后DVT的发生率约为40-85％，髋关节置换术约为42-57％、膝关节置换术约为41-85％、髋部骨折手术约为46-60％，并有逐年增加的趋势13-7。同时，随着中国老年人口不断增长，老年人膝关节、髋关节骨折及置换手术量显著增加，DVT、肺动脉栓塞并发症的发生率也迅速上升。DVT已成为21世纪威胁人类生命安全的严重疾病之一和威胁人类晚年健康的一大隐患及影响家庭和社会经济发展的一个重要制约因素。故而，对于DVT的预防和治疗更为迫切。但迄今为止，DVT的形成机理尚不清楚，其预防和治疗仍是一个世界性难题。
一直以来，虽有大量的学者从事血栓的研究[8-1],但迄今为止,DVT的形成机制尚不清楚,其预防和治疗仍是一个世界性难题。现在普遍认为血管内皮细胞、凝血/抗凝系统、纤溶/抗纤溶系统、血小板、血液流变改变、炎症因子等多因素均参与到DVT的病理及病理生理过程中。目前，血管壁损伤、血流改变和血液成分异常被认为是血栓形成的三大因素。其中，血管壁损伤主要是血管内皮细胞的损伤，损伤所致的内皮细胞调亡，是形成静脉血栓最重要的原因。通常，静脉内皮细胞位于血管壁内侧,主要构成血管壁内侧组织和血液屏障，因直接与血液循环系统相接触,故可特异性的感知血液变化及分泌多种血管活性物质对血管进行调节，从而具有强大的抗血栓形成的功能。如静脉内皮细胞可感知管内压并分泌如组胺、前列环素、血小板激活因子、内皮素、凝血与抗凝血因子、血管紧张素等活性物质对血管进行调节。正常情况下，这些血管活性物质处于稳定状态,对血液循环系统具有保护作用。然而，当内皮细胞受物理、化学或自身凋亡因子作用后可引起细胞损伤并触发胞膜破坏、细胞骨架裂解、核膜消失、核溶解及DNA断裂等一系列变化，最终引起细胞凋亡，从而失去抗血栓形成的功能。而且，血管壁的损伤成为血栓的始动因素，更能通过磷脂酰丝氨酸(PS)表达增加，导致膜磷脂不对称性及抗凝膜成分丢失而促进血栓形成。而我们前期研究及大量文献报道已经证实，血管内皮细胞与DVT的形成密切相关，血管内皮细胞的凋亡明显降低了其释放活性物质的能力,损害了其在血管中的多种防御功能，而且破坏了抗凝-纤溶系统的稳定性,最终形成血栓。
深静脉血栓(DVT)危害大，发病机制不清，血管内皮细胞(VECs)凋亡在DVT发生中起关键作用。我们前期建立体外VECs凋亡模型，检测发现HIF1A-AS1是变化最为显著的lncRNA，再对HIF1A-AS1进行沉默，发现其沉默后能够抑制VECs凋亡并促进增殖，提示HIF1A-AS1在体外实验中能够调控VECs的凋亡与增殖，但其在DVT动物体内是否仍具有调节VECs凋亡与增殖的作用，及其调控VECs凋亡的具体机制如何，均有待我们进行深入的研究。在前期基础上，本项目拟在动物和细胞层面，均构建HIF1A-AS1过表达/沉默模型，检测成栓情况、VECs的凋亡增殖情况，明确HIF1A-AS1调节VECs凋亡与增殖作用，探索HIF1A-AS1调节VECs凋亡的机制，为DVT的分子调控和靶向治疗提供依据。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种抗DVT的靶向物即lncRNA HIF1A-AS1，本发明在动物和细胞层面，构建HIF1A-AS1过表达/沉默模型，明确了HIF1A-AS1调节VECs的凋亡与增殖作用，为DVT的分子调控和靶向药物治疗提供依据。
本发明还提供了一种抗深静脉血栓的药物，所述药物包括lncRNA HIF1A-AS1表达增强剂或lncRNA HIF1A-AS1的靶基因表达增强剂。
本发明的有益效果为：本发明在动物和细胞层面，通过构建lncRNA HIF1A-AS1过表达/沉默模型，检测成栓情况、VECs的凋亡增殖情况，明确HIF1A-AS1调节VECs凋亡与增殖作用，为DVT的分子调控和靶向药物治疗提供依据。
附图说明
图1为3h时HE染色镜病理组织切片结果，其中，a为正常组，b为DVT对照组，c为lncRNA HIF1A-AS1高表达组，d为lncRNA HIF1A-AS1沉默组；
图2为27h时HE染色镜病理组织切片结果，其中，a为正常组，b为DVT对照组，c为lncRNA HIF1A-AS1高表达组，d为lncRNA HIF1A-AS1沉默组。
具体实施方式
实施例1创伤性DVT动物模型建立
1.选取52只SPF级SD大鼠(雌鼠26只、雄鼠26只，体重210-240g)，随机分为4组，即正常组、DVT对照组、lncRNA HIF1A-AS1高表达组和lncRNA HIF1A-AS1沉默组，饲养于SPF动物房。
2.构建创伤性DVT动物模型
1)前五天：A.正常组：连续五天给予大腿近端皮下注射20mI生理盐水。
B.DVT对照组：持续五天给予大腿近端皮下注射20ml生理盐水，造模后在普通环境下正常饮水及进食，不使用抗凝剂以及抗生素；
C.lncRNA HIF1A-AS1基因沉默组大腿近端皮下每天注射含400pmollncRNAHIF1A-AS1过表达腺病毒20ml；
D.lncRNA HIF1A-AS1高表达组大腿近端皮下每天注射含400pmol lncRNA HIF1A-AS1的在体沉默AAV-SaCas9 20ml；
2)五天后：正常组不予任何处理，将DVT对照组、lncRNA HIF1A-AS1沉默组和lncRNA HIF1A-AS1高表达组麻醉，再用定量击打装置一次性定量击打双侧大腿外侧缘,并行双髋人字石膏外固定，构建创伤性肢体DVT大鼠模型。
3)lncRNA HIF1A-AS1表达水平在3h、27h时差异最明显，故选择建模后3h、27h位点作为DVT对照组、lncRNA HIF1A-AS1基因沉默组及lncRNA HIF1A-AS1基因过表达组为合适时间点。
4)在3h、27h位点随机抽取各组造模后的一半的SD大鼠，经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后双侧大腿内侧缘切开获取造模段长1cm的股静脉组织。用玻璃分针及血管钳仔细分离股静脉,并分别对股静脉近端以及远端进行结扎，用组织剪在两结扎线内侧切取股静脉及周围组织，长约1cm，并在清洁纱布上对股静脉及周围组织进一步分离，观察骨静脉的变化、判断血栓形成情况。
实施例2股静脉组织样本石蜡切片及HE染色
方法：在流水下冲洗4％多聚甲醛固定液固定好的下腔静脉组织数小时或过夜，将洗涤好的组织材料依次经70％、80％、90％浓度的乙醇溶液进行脱水30min,然后分别放入95％、100％乙醇中各两次，每次18min。将上述脱水后的材料置于无水乙醇、二甲苯等量混合液中15min,二甲I15min,二甲苯II15min；再将处理的组织材料放入石蜡：二甲苯＝1：1的混合液中浸泡15min后放入石蜡I、石蜡II中透蜡各60min。透蜡后，将组织置入蜡模中，并倒入熔化的石蜡进行包埋。将固定好的包埋蜡块切片，厚度为5μm左右.
结果：
1)3h时的切片HE染色情况：
正常组:HE染色镜下未见血栓形成(图1a)；
DVT对照组:HE染色镜下有红细胞集聚形成表现(图1b)。；
基因沉默组:HE染色镜下有红细胞集聚表现(图1c)；
基因过表达组:HE染色镜未见血栓形成(图1d)。
2)27h时的切片HE染色情况：
正常组:HE染色镜下未见血栓形成(图2a)；
DVT对照组:HE染色镜下完全血栓形成(图2b)；.
基因沉默组:HE染色镜下完全血栓形成(图2c)；
基因过表达组:HE染色镜下不完全性血栓形成(图2d)；
实施例3TμNEL检测观察静脉血管内皮细胞凋亡
方法：将保存于液氮中的正常组、DVT对照组、基因沉默组及过表达组的3h以及27h位点的股静脉壁组织,分别采用采购自上海翊圣的TμNEL细胞凋亡检测试剂盒，按照说明书检测各组细胞凋亡发生情况，具体包括以下步骤：
1)切片放在62°烘箱中120分钟,再用二甲苯浸洗10minx2次；
2)彻底脱蜡后用梯度乙醇(100％x5min、90％x3min、70％x2min、蒸馏水x2min)进行水化，便于后续结合均匀与充分；
3)每个样本上滴加100μl Proteinase K工作液,覆盖全部样品，并在37℃下孵育30min,通透细胞；
4)加入3％H2O2室温孵育20min,去除内源性过氧化氢酶,用PBS洗2min x 3次，再PBS 5min x 2次；
5)将载玻片放入含有1xEqμilibration Buffer的染缸中，保证液体覆盖样本，取出载玻片，用吸水纸吸掉残留液体,然后在组织上加入50μl TdT孵育缓冲液,盖上盖玻片，置于湿盒内，在37℃孵育1h,并用铝箔纸包裹湿盒进行避光，移除塑料盖玻片，PBS洗3x3min；
6)将载玻片在黑暗条件下浸入装有DAPI溶液(2μg/ml,用PBS进行稀释)的染色缸，常温孕育20min；
7)将样本及其载玻片洗涤后在去离子水中常温放置5min，循环3次；
8)吸水纸吸干组织周围水份，荧光封片剂封片后立即在荧光显微镜下进行样本分析：在515nm的荧光下观察绿色荧光强度；在460nm下观察蓝色的DAPI荧光，并拍摄200x放大倍率免疫荧光组化图像；
9)采用ImageJ软件对各组在两个时间位点的内皮细胞凋亡免疫的荧光亮度进行量化，所得数据用SPSS17.0统计软件行两两间单因数方差分析，各组比较结果以P<0.05为有统计学意义。
表1：3小时位点SD大鼠股静脉内皮细胞凋亡情况免疫荧光亮度量化统计表
分组 免疫荧光亮度量化值
正常组 0
DVT对照组 0.031
基因过表达组 0.029
基因沉默组 0.039
表2：27小时位点SD大鼠股静脉内皮细胞凋亡情况免疫荧光亮度量化统计表
分组 免疫荧光亮度量化值
正常组 0
DVT对照组 0.036
基因过表达组 0.032
基因沉默组 0.054
结果：如表1和表2所示，在3h位点时正常组没有观察到细胞凋亡，DVT对照组、基因沉默组、基因过表达组存在不同程度内皮细胞调亡，但未见明显差异。但在27h位点时，正常组仍没有观察到细胞凋亡；DVT对照组显示荧光密度(即细胞凋亡程度)较为明显；与DVT对照组相比，基因沉默组细胞凋亡程度明显加剧。而基因过表达组，凋亡细胞在27h位点比DVT对照组明显要少。
结论：组化及HE涂片试验表明：27h时，lncRNA HIF1A-AS1基因过表达组，不完全性血栓形成，lncRNA HIF1A-AS1基因被沉默组，完全血栓形成。TμNEL检测结果表明：lncRNAHIF1A-AS1基因过表达组中，深静脉血栓血管内皮细胞凋亡速度缓慢，lncRNA HIF1A-AS1基因被沉默组中，深静脉血栓血管内皮细胞凋亡程度明显加剧。
以上结果表明lncRNA HIF1A-AS1过表达能减缓深静脉血栓血管内皮细胞凋亡速度，具有抗深静脉血栓的作用。

Claims (2)

1.一种检测深静脉血栓的标志物，其特征在于，所述标志物为lncRNA HIF1A-AS1。
2.一种抗深静脉血栓的药物，所述药物包括lncRNA HIF1A-AS1表达增强剂或lncRNAHIF1A-AS1的靶基因表达增强剂。
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