CN101328478A - 一种具有抗血小板性栓塞活性的蛋白质及生产方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的抗血小板凝集的AmphiC1qDC及编码该蛋白的基因，以及该蛋白质在制备治疗心血管性疾病药物中的应用。本发明通过兼并引物扩增，从文昌鱼中分离得到AmphiC1qDC基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。该基因编码的蛋白质(PC1qDC)，其推测的氨基酸序列如序列表<400>2序列所示。本发明的重组文昌鱼PC1qDC蛋白具有抑制由胶原诱导的血小板凝集作用，可用于制备治疗心血管性疾病的药物。
Description
技术领域
本发明涉及文昌鱼基因AmphiC1qDC及其编码的蛋白PC1qDC，以及该蛋白在制备治疗心血管性疾病的药物上的应用。
背景技术
血小板在止血、血栓形成、动脉粥样硬化过程中起着重要的作用。长期的临床实践证实，抗血小板药具有抑制血小板的黏附、聚集和释放功能，从而防止血栓形成，可有效地防止心血管疾病的发生，并能延长患者的生存期。近年来，随着人们对冠状动脉粥样硬化性心脏病，特别是急性冠脉综合征和支架植入后血栓形成机制的深入理解，抗血小板药物在上述领域的应用越来越广泛。而且人口老龄化正推动心脑血管市场的增长，一些新开发药物为制药公司提供大量机会。在国内市场中，抗血小板凝集类药物已抢占溶栓类和抗凝血类药物的市场份额，占据抗血栓药物市场首位。近年来，溶栓药物市场份额缩水较厉害，抗凝血药物的市场份额也呈逐年减少趋势。但相关分析可以看出，抗血小板凝集类药物的增长情况良好，近年来的增长率为30％～65％。
C1q家族为生物体内中含有C1q结构域(因为折叠成球状，也常称为global C1qdomain，简称gC1q)的一大类分子。该家族的各个成员在gC1q区域有高度的保守性，这类分子包括经典补体途径的核心亚成分C1q(complement component 1)、参与糖脂和能量代谢的adiponectin、胶原蛋白VIII和X、某些和动物冬眠相关的蛋白以及EMILIN等等。C1qTNF1即为C1qTNF相关蛋白1，也是C1q家族成员之一，它具有C1q家族的特征性胶原区和C1q球状区，并在血管壁组织中高度表达。通过重组人的C1qTNF1蛋白发现：它可以和纤维状胶原特异结合并阻断胶原蛋白诱导的血小板凝集，阻断机理在于它竞争了vWF和胶原的结合位点。因而，从医学角度，通过灵长类动物模型研究发现，C1qTNF1可以阻止血小板性血栓形成，在医学的血管损伤性疾病中有重要意义。
文昌鱼(Branchiostoma belcheri)，属于脊索动物门(Chordate)，头索动物亚门(cephalochordate)，是现存和脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物，是一种海洋源性的潜在药物开发物种。我们从文昌鱼中克隆了一个与人的C1qTNF1基因直系同源的C1q家族成员AmphiC1qDC，并对其蛋白PC1qDC进行了制备及研究了功能，发现PC1qDC能够阻止血小板性血栓形成，是一种潜在的治疗血栓的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于文昌鱼的新的抗血小板栓塞药物AmphiC1qDC基因及其编码的蛋白。
本发明的另一目的在于提供上述基因的PC1qDC蛋白在制备治疗感染性疾病的药物中的应用。
本发明通过兼并引物扩增和RACE全长扩增的方法从文昌鱼中分离得到AmphiC1qDC基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
上述本发明AmphiC1qDC基因所编码的蛋白(重组蛋白C1qDC，命名为PC1qDC)，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；去除信号肽的成熟蛋白等电点为6.93，分子量为25.8 kDa。
该成熟蛋白通过表达载体pETTRX-AmphiC1qDC在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达。
所述表达载体pETTRX-AmphiC1qDC是建立以硫氧环蛋白为融合伴体，中间插入His的亲和标记位点及蛋白酶3C识别位点的高效表达载体，该系统使PC1qDC在大肠杆菌中大量表达。
本发明所选择的青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)采集于山东省沙子口水域。
本发明通过兼并引物扩增从成体文昌鱼的cDNA一链中克隆得到了含有C1q结构域的部分片段，并对这个片段进行了5′和3′RACE扩增，得到了含有C1q结构域基因序列的全长克隆，命名为AmphiC1qDC(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码251个氨基酸(其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示)，含有16个氨基酸的信号肽。去除信号肽的成熟蛋白等电点为6.93，分子量为25.8kDa。具有抑制血小板凝集的活性。
本发明通过设计了一对引物，将编码新基因AmphiC1qDC的成熟蛋白序列克隆到原核融合表达载体pETTRX上(本实验构建，经Merck公司的pET-21b载体引入TRX蛋白序列及EK酶酶切位点)，构建表达质粒并将其转化大肠杆菌E.coli Rosetta-gamiTM。此表达载体(pETTRX-AmphiC1qDC)以T7为启动子，TRX为分子融合伴体，帮助重组蛋白正确折叠，以可溶的形式表达，TRX的C端有柔链区和6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所设计的上游引物含有蛋白酶3C位点，利于外源蛋白单体的获得。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，PC1qDC融合蛋白的表达量有所提高较高。为了得到更多的蛋白，我们对超声破碎后的包涵体进行了变复性处理，得到了浓度和纯度都比较高的蛋白。
本发明还摸索和优化了重组PC1qDC蛋白的纯化条件包括可溶的表达产物Ni2+ChelatingSepharose亲和色谱层析得到融合蛋白，可得到纯度在95％以上的PC1qDC蛋白。
本发明的表达质粒复制方法：参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloning.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用CaCl2的方法将质粒转化E.coli DH5
，用含氨苄青霉素(100
g/mL)的LB培养基培养转化菌株或者将工程载体转化到E.coliRosetta-gamiTM菌株，用含50mg/L氨卞青霉素，15mg/L卡那霉素，35mg/L氯霉素和12.5mg/L四环素的LB培养基培养转化菌株，碱法提取质粒。
附图表说明
图1为本发明文昌鱼PC1qDC蛋白与其它C1q家族成员蛋白的序列比较结果。Bc，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)；Ci，海鞘(Ciona intestinalis)；Hs，人类(Homo Sapiens)；La，七鳃鳗(lamprey)；Mm，小鼠(Mus mouse)；Sp，海胆(Stronglocentrotuspurpuratus).The sequence used in alignment and phylogenetic analysis：Bc.C1qDC1(AAP09230)；Bc.C1qDC2(AAP09231)；Bc.C1qDC3(AAP09378)；Sp.C1qDC1(AAK11302)；Sp.C1qDC2(AAK11303)；Sp.C1qDC3(AAG16425)；Sp.C1qDC4(AAK11309)；Sp.C1qDC5(AAK11305)；Ci.C1qDC1(ENSCINP00000006605)；Ci.C1qDC2(ENSCINP00000005965)；La.C1q(BAD22833)；Hs.cqt1(AAQ88790)；Hs.cqt2(AAH11699)；Hs.cqt3(AAQ88754)；Hs.cqt4(AAH35628)；Hs.cqt5(AAH29485)；Hs.cqt6(AAH20551)；Hs.cqt7(AAH24015)；Hs.cqt8(P60827)；Hs.gliacolin(CAH73145)；Hs.adiponectin(NP_004788).
图2为兼并引物扩增的AmphiC1qDC基因片段。1.DNA分子量标准(DL2000)；2.52℃退火进行扩增得到的产物；3.50℃退火进行扩增得到的产物。
图3为5′RACE和3′RACE扩增得到的AmphiC1qDC基因目的片段。1.5′RACE内巢扩增片段；2.5′RACE外套扩增片段；3.DNA分子量标准(DL2000)；4.3′RACE内巢扩增片段；5.3′RACE内巢扩增片段；6.DNA分子量标准(DL2000)。
图4扩增得到的AmphiC1qDC基因全长片段。
图5为基因AmphiC1qDC的重组表达质粒pETTRX-AmphiC1qDC构建图。
图6为重组PC1qDC蛋白诱导表达、亲和层析电泳图。1.未经诱导的pETTRX-AmphiC1qDC菌体总蛋白；2.经IPTG诱导的pETTRX-AmphiC1qDC菌体总蛋白；3.诱导菌超声沉淀总蛋白；4.诱导菌超声上清总蛋白。
图7为TRX-PC1qDc蛋白经Ni柱纯化后的蛋白电泳图。
图8重组蛋白PC1qDC的血小板凝集抑制实验。
具体实施方式
以下实施将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1：文昌鱼总RNA的提取和AmphiC1qDC部分片段扩增。
总RNA的提取和RACE cDNA合成：取文昌鱼全鱼，采用Trizol试剂法提取总RNA，酚/氯仿抽提去除蛋白质，获得文昌鱼总RNA。取1
g总RNA，按照TOYOBO公司的FirstStrand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace-α-TM(code No.FSK-100)说明书操作进行逆转录合成第一链。取2
1 cDNA一链产物，以根据C1q家族其他基因设计的兼并引物5′PCR Primer：5′-GG(A/G)GAACG(C/G/A)GGGT T(C/T)CCT-3′和3′PCR Primer：5′-AAC(T/C)AAATGICCATT(G/A)AAGGTG-3′为引物进行RT-PCR扩增AmphiC1qDC的部分片段350bp，经1％琼脂糖凝胶检测如图2所示。将扩增得到的目的片段连接到pGEX T easy vector(promega)后转化DH5α大肠杆菌，挑选重组克隆测序。Blast同源分析表明，获得了这个片段含有gC1q结构域，是C1q家族成员。
实施例2：RACE扩增AmphiC1qDC基因5′和3′末端。
按照Invitrogen的GeneRacerTM Kit进行RNA的去磷酸化RACE、脱帽反应、RNAoligo的连接及mRNA的逆转录从而合成cDNA一链，采用Takara的LA Taq聚合酶按照GeneRacerTM Kit的反应体系进行PCR扩增。其中根据上面扩增得到的部分AmphiC1qDC的序列设计进行5′RACE扩增的基因特异的外套引物为5′-gene-specific primer：5′-GCTGCGAATGACAGAG AAGGCTGAT-3′；内巢引物为5′-nested primer：5′-CTTGGGTCCAGGAGGTCCAGC AACA-3′；AmphiC1qDC的3′RACE扩增的基因特异的外套引物为5′-gene-specific primer：5′-CGCAGCATCATGCAGTCCCAGA-3′；内巢引物为5′-nested primer：5′-GACCAGGTATGGATGAGGATGGACTA-3′；扩增得到的目的片段如图3。将扩增得到的目的片段连接到pGEX T easy vector(promega)后转化DH5α大肠杆菌，挑选重组克隆测序。并与前面得到的目的片段进行拼接得到了AmphiC1qDC基因的全长EST序列，长度是978bp，编码251个氨基酸的PC1qDC蛋白。。
实施例3：AmphiC1qDC全长的扩增及序列分析。
根据上面拼接得到的序列设计引物5′-TCAGCAGCAGTCCCACCAT-3′和5′-GATTTGTAGTCACAACAGAGG-3′采用Takara的LA Taq聚合酶扩增AmphiC1qDC的全基因，扩增得到的900bp片段的电泳图谱如图4。将扩增得到的目的片段连接到pGEX Teasy vector(promega)后转化DH5α大肠杆菌，挑选重组克隆测序。Blast同源分析表明，获得了编码AmphiC1qDC全基因的EST序列，其序列如序列表400<1>所示。
用NCBI的在线BLASTX搜索，发现这段序列比对上的都是C1q家族成员，其中与C1qTNF1相似性最高，达到51％。我们对得到的AmphiC1qDC与其他物种中发现的C1q家族蛋白进行了进化分析，发现AmphiC1qDC是C1qTNF1的直系同源基因。
实施例4：重组PC1qDC表达质粒的构建
依据AmphiC1qDC基因的两端序列合成一对引物，上游引物含Kpn I和3C蛋白酶Prescission Protease切割位点，下游引物含Not I切割位点。
上游引物(P1)：
5’-GG GGTACC CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC GTTACCCGATATGAACGTC-3’
保护碱基Kpn I 3C蛋白酶切割对应位点 AmphiC1qDC基因序列
下游引物(P2)：
5’-ATAAGAAT GCGGCCGC TCAGGCTGATGCATTGTTGCC-3’
保护碱基 Not I AmphiC1qDC基因序列
以含AmphiC1qDC基因的pGEX质粒为模板，P1、P2为引物PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小在700bp左右。将PCR扩增产物克隆到原核融合表达载体pETTRX(本实验构建，经Merck公司的pET-21b载体引入TRX蛋白序列及EK酶酶切位点)上，得到重组表达载体pETTRX-AmphiC1qDC(其构建过程如图5所示)。表达载体pETTRX-AmphiC1qDC中的外源基因经测序鉴定正确。所设计的上游引物中含Prescission蛋白酶切割位点，以便切除融合伴侣TRX。
实施例5：文昌鱼PC1qDC融合蛋白的表达
将pETTRX-AmphiC1qDC转化大肠杆菌E.coli Rosetta-gamiTM，基因工程菌超声裂解上清液与沉淀经SDS-PAGE电泳分析表明，菌株经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与用软件DNATOOLS6.0预测的TRX-PC1qDC融合蛋白大小约38kD一致，并且预测得到该蛋白pI值6.23。对培养时间，诱导浓度，温度等条件的摸索得出基因工程菌的培养条件为：挑取单菌落接种于含有50mg/L氨卞青霉素，15mg/L卡那霉素，35mg/L氯霉素和12.5mg/L四环素的LB培养基中，37℃振摇培养过夜活化菌种，按照1∶100的比例接种到200ml2×yT培养基，37℃放大培养至OD600约为0.9时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，18℃诱导培养36hr后离心收集菌体。将总菌体用Tris缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris，pH8.5)洗涤，再用适量的Tris缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris，pH8.5)悬浮，超声处理后，裂解上清液和超声后的沉淀经SDS-PAGE电泳分析表明，在此条件下PC1qDC融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的50％以上，处于部分可溶状态(图6)。
实施例6：重组文昌鱼PC1qDC融合蛋白的纯化
超声后的上清液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析纯化，收集重组蛋白的洗脱峰。实验发现TRX-PC1qDC能被Ni2+柱所吸附，用50mM洗Ni2+柱时，能把大部分吸附在柱上的杂蛋白洗下，而用100mM、200mM浓度的咪唑能把目的蛋白TRX-PC1qDC洗下。为了提高重组蛋白的得率和浓度，简化实验步骤，缩短对重组蛋白的处理时间，在用Ni2+柱亲和色谱层析纯化重组蛋白时，我们采用一步法进行纯化。根据载体质粒pETTRX所表达的外源蛋白与Ni2+亲和柱的结合能力较强的特点，我们选用了较简化的洗脱条件：先用50mM的咪唑洗Ni2+柱，弃洗脱峰，然后直接用200mM的咪唑洗Ni2+柱，收集重组蛋白的洗脱峰。我们可以得到纯度比较高的融合蛋白TRX--PC1qDC(图7)。
实施例11：PC1qDC重组蛋白的血小板凝集抑制实验
血小板的收集：取健康供血者新鲜全血(3.8％枸橼酸三钠1∶9抗凝)，用sepharose 2B富集PRP血浆。将血小板与TRX--PC1qDC或者TRX对照蛋白混合，加入在终浓度为1.25μg/ml的胶原I，检测632nm的透光率的变化，以加入TRX对照蛋白由胶原I诱导的血小板凝集为基准比较加入TRX--PC1qDC蛋白的抑制效果。图8表示TRX--PC1qDC能够抑制由胶原引起的血小板凝集。
序列表
<110>中山大学
<120>一种具有抗血小板性栓塞活性的蛋白质及生产方法和应用
<160>3
<210>1
<211>987
<212>DNA
<213>文昌鱼(Branchiostoma belcheri)
<220>
<221>protein
<222>(51)…(804)
<400>1
ctccggccgc catggcggcc gcgggaattc gatttcagca gcagtcccac c atg acg tcc 60
Met Thr Ser
1
ctc ctg tac act gtc ctg atc ata cca gcc tgc ctg gcg gtc agc atc tat ggc cag ggg 120
Leu Leu Tyr Thr Val Leu Ile Ile Pro Ala Cys Leu Ala Val Ser Ile Tyr Gly Gln Gly
5 10 15 20
tca tat tct gac cag ggg aaa cat tct ggc cga ggg aaa cag tct gag gag gcg cct gag 180
Ser Tyr Ser Asp Gln Gly Lys His Ser Gly Arg Gly Lys Gln Ser Glu Glu Ala Pro Glu
25 30 35 40
agt ggc cag tgt gtg agg tgc tgc cca cag gac aac cca cca ggg cct cag atc atc gct 240
Ser Gly Gln Cys Val Arg Cys Cys Pro Gln Asp Asn Pro Pro Gly Pro Gln Ile Ile Ala
45 50 55 60
ctg cct caa cac atg gca tca gag aag gga gat aaa gga gaa cgt ggg ttc cct gga aga 300
Leu Pro Gln His Met Ala Ser Glu Lys Gly Asp Lys Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Arg
65 70 75 80
aca ggg aag atg gga cca aaa gga cac aag ggt gtt gct gga cct cca gga cct gag gga 360
Thr Gly Lys Met Gly Pro Lys Gly His Lys Gly Val Ala Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly
85 90 95 100
gta gcc ggc cct cct ggc cca cca gag aaa ctc cag gca tca gcc ttc tct gtc atc cgc 420
Val Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Glu Lys Leu Gln Ala Ser Ala Phe Ser Val Ile Arg
105 110 115 120
agc aaa ccc atg gag ggg acc aag tat tac cag gtg gtc atg tac gac aaa gtg ttg gtt 480
Ser Lys Pro Met Glu Gly Thr Lys Tyr Tyr Gln Val Val Met Tyr Asp Lys Val Leu Val
125 130 135 140
aac act gga gaa cac ttc aac ttg ttc aca ggg aag ttc tac tgg gtc atc cct ggc atc 540
Asn Thr Gly Glu His Phe Asn Leu Phe Thr Gly Lys Phe Tyr Cys Val Ile Pro Gly Ile
145 150 155 160
tac tac ttc tct gcc aca gtc cac agc tac aac agc cgg acg acc tac cta cat ctg atg 600
Tyr Tyr Phe Ser Ala Thr Val His Ser Tyr Asn Ser Arg Thr Thr Tyr Leu His Leu Met
165 170 175 180
aag aac aac caa cca cag gtc atc ctg ttt gcc cag gag ggg gac cgc agc atc atg cag 660
Lys Asn Asn Gln Pro Gln Val Ile Leu Phe Ala Gln Glu Gly Asp Arg Ser Ile Met Gln
185 190 195 200
tcc cag acg gtc atg ttg gag ctg ata gtg ggg gac cag gtg tgg atg agg atg gac tac 720
Ser Gln Thr Val Met Leu Glu Leu Ile Val Gly Asp Gln Val Trp Met Arg Met Asp Tyr
205 210 215 220
gga gac cat ctc gcc ata ttt ggt gat gag gaa gat gcc tac atc acc ttc agt gga cat 780
Gly Asp His Leu Ala Ile Phe Gly Asp Glu Glu Asp Ala Tyr Ile Thr Phe Ser Gly His
225 230 235 240
tta gtt ttc ccc acg tat aac atg tga ttt atcagacgta tattgtaaga atgaatatcc 840
Leu Val Phe Pro Thr Tyr Asn Met*
245 250
tgaaaatttt tgatactaag agtcctgatt ttttttgtcc tttacacata tgtcagccac 900
atggtatacc agtacctctg ttgtgactac aaatcaatca ctagtgaatt cgcggccgcc 960
tgcaggtcga ccatatggga gagctcc 987
TGC AGG TCG ACC ATA TGG GAG AGC TCC
<210>2
<211>251
<212>PRT
<213>文昌鱼(Branchiostoma belcheri)
<220>
<221>protein
<222>(1)…(251)
<400>2
Met Thr Ser Leu Leu Tyr Thr Val Leu Ile Ile Pro Ala Cys Leu Ala
1 5 10 15
Val Ser Ile Tyr Gly Gln Gly Ser Tyr Ser Asp Gln Gly Lys His Ser
20 25 30
Gly Arg Gly Lys Gln Ser Glu Glu Ala Pro Glu Ser Gly Gln Cys Val
35 40 45
Arg Cys Cys Pro Gln Asp Asn Pro Pro Gly Pro Gln Ile Ile Ala Leu
50 55 60
Pro Gln His Met Ala Ser Glu Lys Gly Asp Lys Gly Glu Arg Gly Phe
65 70 75 80
Pro Gly Arg Thr Gly Lys Met Gly Pro Lys Gly His Lys Gly Val Ala
85 90 95
Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly Val Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Glu
100 105 110
Lys Leu Gln Ala Ser Ala Phe Ser Val Ile Arg Ser Lys Pro Met Glu
115 120 125
Gly Thr Lys Tyr Tyr Gln Val Val Met Tyr Asp Lys Val Leu Val Asn
130 135 140
Thr Gly Glu His Phe Asn Leu Phe Thr Gly Lys Phe Tyr Cys Val Ile
145 150 155 160
Pro Gly Ile Tyr Tyr Phe Ser Ala Thr Val His Ser Tyr Asn Ser Arg
165 170 175
Thr Thr Tyr Leu His Leu Met Lys Asn Asn Gln Pro Gln Val Ile Leu
180 185 190
Phe Ala Gln Glu Gly Asp Arg Ser Ile Met Gln Ser Gln Thr Val Met
195 200 205
Leu Glu Leu Ile Val Gly Asp Gln Val Trp Met Arg Met Asp Tyr Gly
210 215 220
Asp His Leu Ala Ile Phe Gly Asp Glu Glu Asp Ala Tyr Ile Thr Phe
225 230 235 240
Ser Gly His Leu Val Phe Pro Thr Tyr Asn Met*
245 250
<220>
<221>成熟蛋白
<222>(1)…(251)
<400>3
Val Ser Ile Tyr Gly Gln Gly Ser Tyr Ser Asp Gln Gly Lys His Ser
1 5 10 15
Gly Arg Gly Lys Gln Ser Glu Glu Ala Pro Glu Ser Gly Gln Cys Val
20 25 30
Arg Cys Cys Pro Gln Asp Asn Pro Pro Gly Pro Gln Ile Ile Ala Leu
35 40 45
Pro Gln His Met Ala Ser Glu Lys Gly Asp Lys Gly Glu Arg Gly Phe
50 55 60
Pro Gly Arg Thr Gly Lys Met Gly Pro Lys Gly His Lys Gly Val Ala
65 70 75
Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly Val Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Glu
80 85 90 95
Lys Leu Gln Ala Ser Ala Phe Ser Val Ile Arg Ser Lys Pro Met Glu
100 105 110
Gly Thr Lys Tyr Tyr Gln Val Val Met Tyr Asp Lys Val Leu Val Asn
115 120 125
Thr Gly Glu His Phe Asn Leu Phe Thr Gly Lys Phe Tyr Cys Val Ile
130 135 140
Pro Gly Ile Tyr Tyr Phe Ser Ala Thr Val His Ser Tyr Asn Ser Arg
145 150 155
Thr Thr Tyr Leu His Leu Met Lys Asn Asn Gln Pro Gln Val Ile Leu
160 165 170 175
Phe Ala Gln Glu Gly Asp Arg Ser Ile Met Gln Ser Gln Thr Val Met
180 185 190
Leu Glu Leu Ile Val Gly Asp Gln Val Trp Met Arg Met Asp Tyr Gly
195 200 205
Asp His Leu Ala Ile Phe Gly Asp Glu Glu Asp Ala Tyr Ile Thr Phe
210 215 220
Ser Gly His Leu Val Phe Pro Thr Tyr Asn Met*
225 230
Claims (8)
1.从中国青岛文昌鱼中克隆得到的AmphiC1qDC基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。
2.权利要求1所述基因编码的蛋白质PC1qDC，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。
3.权利要求2所述的蛋白质PC1qDC的成熟蛋白，其氨基酸序列如序列表400<3>所示。
4.权利要求3所述的蛋白PC1qDC在大肠杆菌中以部分可溶的形式表达的方法，按照以下步骤进行：
(1)重组表达载体pETTRX-AmphiC1qDC的构建；
(2)将pETTRX-AmphiC1qDC转化大肠杆菌E.coli Rosetta-gamiTM；
(3)对转化的大肠杆菌E.coli Rosetta-gamiTM进行培养；
(4)重组文昌鱼PC1qDC融合蛋白的纯化。
5.根据权利要求4所述的蛋白PC1qDC在大肠杆菌中以可溶的形式表达的方法，其特征在于：所述的重组表达载体pETTRX-AmphiC1qDC的构建包括以下步骤：
(a)依据权利要求1所述的AmphiC1qDC基因的两端序列合成一对引物，上游引物含KpnI和3C蛋白酶Prescission Protease切割位点，下游引物含Not I切割位点；上游引物(P1)：
5’-GG GGTACC CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC GTCAGCATCTATGGCCAGGG-3’保护碱基Kpn I 3C蛋白酶切割对应位点 AmphiC1qDC基因序列下游引物(P2)：
5’-ATAAGAAT GCGGCCGC TCACATGTTATACGTGGGGAAAA-3’
保护碱基 Not I AmphiC1qDC基因序列
(b)以含AmphiC1qDC基因的pGEM T easy vector质粒为模板，P1、P2为引物PCR扩增；
(c)将PCR扩增产物克隆到原核融合表达载体pETTRX上，得到重组表达载体pETTRX-AmphiC1qDC。
6.根据权利要求4所述的蛋白PC1qDC在大肠杆菌中以可溶的形式表达的方法，其特征在于：步骤(3)的培养条件为：挑取单菌落接种于含有50mg/L氨卞青霉素，15mg/L卡那霉素，35mg/L氯霉素和12.5mg/L四环素的2×YT培养基中，37℃振摇培养过夜活化菌种，按照1∶100的比例接种到含有相应抗生素的200ml 2×YT液体培养基，37℃放大培养至OD600约为0.9时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，18℃诱导培养36hr后离心收集菌体。
7.根据权利要求4所述的蛋白PC1qDC在大肠杆菌中以可溶的形式表达的方法，其特征在于：步骤(4)重组文昌鱼PC1qDC融合蛋白的纯化方法为：
将总菌体用Tris缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris，pH 8.5)洗涤，再用适量的Tris缓冲液(150mMNaCl，50mM Tris，pH 8.5)悬浮，超声处理后，裂解上清液经Ni2+ChelatingSepharose亲和色谱层析纯化，收集重组蛋白的洗脱峰。
8.权利要求2所述的蛋白在制备治疗心血管性疾病的药物的应用。
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2008
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