【発明の詳細な説明】Ｓｐα： 新規なスカベンジャー受容体であるシステインが豊富なドメインを 含有するポリペプチドおよび該ポリペチドに対するモノクローナル抗体 技術背景
本発明は一般的に免疫調節ポリペプチドに関する。特に、本発明はＳｐαと命
名される新規なスカベンジャー受容体であるシステインが豊富なドメインを含有
するポリペプチド、および該Ｓｐαポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチ
ドに関する。加えて、本発明はＳｐαとの反応性を有する抗体、並びに該抗体を
用いてＳｐαと該受容体間の相互作用をモジュレートし、および本相互作用をモ
ジュレートする他の分子を同定する方法に関する。
背景技術
多くの別個の細胞表面抗原および分泌抗原は白血球の機能を調節することが知
られている。特に、該抗原は白血球の活性化、増殖、生存、細胞付着および細胞
移動、エフェクター機能を支配している。白血球の機能を調節することが分かっ
ている該抗原は、スカベンジャー受容体であるシステインが豊富な（scavenger
receptor cysteine−rich；“ＳＲＣＲ”）ドメインを含有するタンパク質ファ
ミリーの一員である。本タンパク質ファミリーの一員は短く、ジスルフィドで安
定化されたドメインにより特徴付けられる保存配列モチーフを有している。
該ＳＲＣＲドメインは最初にＩ型マクロファージ・スカベンジャー受容体の構
造分析の間に認識され、該分析においておよそ１０１個のアミノ酸残基のモチー
フが同定されている。該ＳＲＣＲドメインは古く、非常によく保存されたシステ
インが豊富なタンパク質のファミリーと定義されており、このものはＣＤ５およ
びＣＤ６分子中に存在している（フリーマン(Freeman)らによる(1990)、Proc．N
atl．Acad．Sci USA 87:8810）。
タンパク質の該ＳＲＣＲファミリーは群Ａおよび群Ｂと称される２個の群に分
類することができる。該群は主に各ＳＲＣＲドメイン中に、位置的に保存された
システイン残基が６個（群Ａでは）または８個（群Ｂでは）存在することによっ
て区別することが可能であるが、しかしながら、各ＳＲＣＲドメイン中に該残基
を６個有するタンパク質もまたＣ1およびＣ4位にシステイン残基が存在すること
で、少なくとも部分的に群Ｂタンパク質と特徴付けられている（レスニック(Res
nick)らによる(1994)、Trends Biochem．Sci．19:5-8）。群ＡおよびＢにおける
独立したＳＲＣＲ共通配列も複合配列と同様に同定されている（レスニックらに
よる(1994)上述を参照）。群Ｂとしては細胞表面タンパク質ＣＤ５（ジョーンズ
(Jones)らによる(1986)、Nature 323:346-349）およびＣＤ６（アルフォ(Aruffo
)らによる(1991)、J．Exp．Med．174:949-952）が挙げられ、これらは胸腺細胞
、成熟Ｔ細胞並びにＢ細胞の部分集合、ＷＣ１（ウインガード(Wijngaard)らに
よる(1992)、J．Immunol．149:3273-3277；ウインガードらによる(1994)、J．Im
munol．152:3476-3482）（このものはウシのγδＴ細胞によって発現する）およ
びＭ１３０(ローラ(Law)らによる(1993)、Eur．J．Immunol．23:2320-2325)（こ
のものは活性化単球によって発現する）によって優先して発現する。
架橋モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の架橋研究により、ＣＤ５およびＣＤ６が
共にＴ細胞の活性化をモジュレートすることができる補助分子として機能し得る
と示唆されている（ガンゲミ(Gangemiらによる(1989)、J．Immunol．143:2439-2
447；レッドベター(Ledbetter)らによる(1985)、J．Immunol．135:2331-2336）
。Ｔ細胞機能の調節におけるＣＤ５およびＣＤ６の本役割は、Ｔ細胞の活性化に
続き、該２個のタンパク質の細胞質ドメインにおけるチロシン残基が一時的にホ
スホリル化されるという発見により支持されている。このため、ＣＤ５およびＣ
Ｄ６両方の細胞質ドメインがシグナル形質導入に関係するタンパク質を含有した
細胞内ＳＨ２と相互作用可能であるという分子機構を提供する（ラブ(Raab)らに
よる(1994)、Mol．Cell．Biol．14:2862-2870）。その上、ＣＤ５−欠損マウス
菌株の表現型分析により、該Ｔ細胞が刺激に対してより高い反応性を有すること
が示され(タラクホフスキー(Tarakhovsky)らによる(1994)、Eur．J．Immunol．2 4
:1678-1684；タラクホフスキーらによる(1995)、Science．269：535-537)、こ
のことはＴ細胞受容体が媒介するＴ細胞の活性化の正常な調節に対
してＣＤ５の発現が必要であることを示唆している。加えて、野生型もしくはＣ
Ｄ５−欠損マウス由来のＢ−１およびＢ−２細胞における抗−免疫グロブリンＭ
に誘起される成長応答を比較することにより、ＣＤ５がＢ−１ａ細胞における膜
免疫グロブリンＭが媒介した信号発信の負の調節因子として働くことが示唆され
ている。ビカー(Bikah)らによる(1996)、Science 274:1906-1909。該筆者らはあ
る自己免疫状態はＣＤ５が媒介した膜ＩｇＭ信号発信の負の調節における欠点に
起因し得ると提案している。
ＣＤ５およびＣＤ６は、タンパク質における群ＢのＳＲＣＲファミリーのなか
で、構造的に最も密接に関連した一員である（レスニックらによる、上述）。そ
れらのものは共にＩ型膜タンパク質であり、該細胞該領域は各８個のシステイン
残基を持つ３個のＳＲＣＲ似ドメインからなり、これらのものは鎖内ジスルフィ
ド結合を形成すると考えられている。ＣＤ５およびＣＤ６の細胞外ドメインは疎
水性貫膜ドメインおよび長い細胞膜ドメインを介して細胞膜にアンカーしている
。ＣＤ５がＢ細胞抗原ＣＤ７２およびＣＤＳＬに結合していること、活性化Ｂ細
胞によって一時的に発現される抗原がいまだ完全には特徴付けられていないこと
が報告されている。ＣＤ６は白血球活性化抗原、活性化白血球付着分子（“ＡＬ
ＣＡＭ”）に結合していることが分かっている。密接に関連したＣＤ５およびＣ
Ｄ６と違って、ＣＤ７２およびＡＬＣＡＭは相同ではない。ＣＤ７２はＣ型レク
チンと相同であるII型膜タンパク質であるが、しかしながらＣＤ７２に対するレ
クチン活性はいまだ報告されていない。ＡＬＣＡＭはＩ型膜タンパク質であり、
該細胞外領域は５個のＩｇ似ドメインからなる（ボーエン(Bowen)らによる(1995
)、J．Exp．Med．181:2213-2220）。該相互作用に関係するＣＤ５およびＣＤ７
２の領域はいまだ同定されていない。ＣＤ６およびＡＬＣＡＭの両方の先端を切
った(truncated)形態を用いた研究により、該２個のタンパク質間の相互作用が
主にＣＤ６の膜近位ＳＲＣＲドメインおよびＡＬＣＡＭのアミノ末端Ｉｇ−似ド
メインによって媒介されることが分かっている（ホワイトニー(Whitney)らによ
る(1995)、J．Biol．Chem．270:18187-18190；ボーエンらによる(1996)、J．Bio
l．Chem．271:17390-17396）。
白血球の機能に関係する新規分子を同定することにより、免疫調節機能の追跡
および該分子との治療学的介入のための新規な標的を提供する。
本発明の要約
発明者らは、“Ｓｐα”と命名される新規なＳＲＣＲドメインを含有するポリ
ペプチドを同定し、クローン化した。Ｓｐαは分泌タンパク質であり、ＣＤ５お
よびＣＤ６と相同である。ＳｐαはＣＤ５およびＣＤ６の細胞外領域と全く同一
のドメイン構成を有しており、３個のＳＲＣＲドメインからなる。本明細書中に
示す通り、ＳｐαをコードするＲＮＡ転写物はヒトの骨髄、脾臓、リンパ節、胸
腺および胎児の肝臓にみられるが、非−リンパ組織中にはみられない。Ｓｐα−
免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質を用いた結合研究により、Ｓｐαがエル
トリエーションしたばかりの単球、前単球細胞系Ｋ−５６２および骨髄様細胞系
ＴＨＰ−１をはじめとした単球系統の細胞に結合可能であると分かった。Ｓｐα
はまたＢ細胞系ＲａｊｉおよびＴ細胞系Ｈｕｔ７８に結合する。Ｓｐαは単球の
活性化、機能化および／または生存の調節に関係していると思われ、ゆえに免疫
調節システムにおける重要な成分である。
したがって、１実施態様において、本発明はＳｐαポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを目的とする。
別の実施態様において、本発明は該ポリヌクレオチド分子からなる組換えベク
ターを目的とする。
さらに他の実施態様において、本発明はＤＮＡからなるベクターを用いて形質
転換した組換え宿主細胞および該形質転換した細胞を用いた組換えポリペプチド
を産生する方法を目的とする。
別の実施態様において、本発明は単離Ｓｐαポリペプチドを目的とする。
本発明の別の実施態様において、Ｓｐαポリペプチドに対する抗体を提供する
。
更なる実施態様において、本発明はＳｐαポリペプチドおよび該Ｓｐαポリペ
プチド受容体間での相互作用をモジュレートする方法を目的とする。
本発明の該および他の実施態様は本明細書における開示を考えると当業者が容
易に思いつくであろう。
図面の簡単な説明
図１Ａ〜１Ｂは、ＳｐαをコードするＤＮＡ配列（配列番号：＿）および対応
する推定アミノ酸配列（配列番号：＿）を示す。下線部のアミノ酸配列はＳＲＣ
Ｒドメインを表している。共通システイン残基を太文字のイタリックで示す。ポ
リアデニル化部位を二重下線部で表し、アデニル酸塩／ウリジル酸塩が豊富な要
素（“ＡＲＥｓ”）には影をつける。図２はＳｐα、Ｍ１３０およびＣＤ６にお
けるＳＰＣＲドメインのアミノ酸配列（配列番号：＿〜＿）の比較を示す。個々
のドメインはＤ１、Ｄ２などを示唆する。相同性を最小化するのにギャップを導
入し、ドットで表す。アミノ酸を１文字コードで表す。共通システイン残基をボ
ックスで囲む。灰色に目立たせた領域は１５個のアミノ酸のうち１１個が相同で
ある領域である。
図３はＲＮＡメッセージがＳｐαに対してハイブリダイゼーションしているこ
とを示す組織ノーザンブロット分析の結果を示す。Ａ、ＢおよびＣの記号はＳｐ
αに対してハイブリダイゼーションしている３個のバンドを示唆する。
図４Ａは実施例４に記載のＳｐα融合免疫グロブリン構成物を示す。Ｄ１、Ｄ
２およびＤ３はＳＲＣＲドメインであり、ｍＩｇはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３
ドメインを含有するマウス免疫グロブリン部である。図４Ｂは融合ポリペプチド
の１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル(page)電気泳動の写真である。
図５はＫ−５６２細胞に対するＳｐα−ｍＩｇ（ソリッド・サークル）および
ＷＣ１−ｍＩｇ（オープン・サークル）の結合力の比較を例示したグラフである
。相対平均蛍光値をフローサイトメトリーのデータから得た。
発明の詳細な説明
特に指示がなければ、本発明を実施するに際し、当分野の技術範囲内である通
常のタンパク質化学および生化学、微生物学および組換えＤＮＡテクノロジーの
技法を使用する。該技法は文献内で十分に説明されている。例えば、サンブルッ
ク(Sambrook)、フリッチ(Fritsch)&マニアティス(Maniatis)による、分子クロー
ニング(Molecular Cloning)：実験マニュアル(A Laboratory manual)、第２版(1
989)；ＤＮＡクローニング(DNA Clonimg)、ＩおよびII巻(Ｄ.Ｎ.グローバー
(Glover)らによる(1985))；オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesi
s)（Ｍ.Ｊ.ガイト(Gait)による(1984)）；核酸ハイブリダイゼーション（Nuclei
c Acid Hubridization）(Ｂ.Ｄ.ハーメス(Hames)&Ｓ.Ｊ.ヒギンス(Higgins)らに
よる(1984)；動物細胞の培養(Animal Cell Culture)(Ｒ.Ｋ.フレシュニー(Fresc
hney)らによる(1986)；固定化細胞および酵素(Immobilized Cells and Enzymes)
(IRL出版社、1986)；パーバル(Perbal),Ｂ.による、分子クローニングの実施指
針(A Practical Guide to Molecular Cloning)(1984)；酵素学の方法(Methods i
n Enzymology)のシリーズ(Ｓ.コロウィック(Colowick)およびＮ.カプラン(Kapla
n)らによるアカデミック・プレス社)を参照。
本明細書および添付した請求の範囲で使用する際、単数形“ａ、“ａｎ”およ
び“ｔｈｅ”は、内容が特に明らかに指示しないならば、複数の引例を含むもの
とする。
Ａ．定義
本明細書を記載する際、以下の語句を使用し、以下に示唆する通り定義するこ
とを意図する。
語句“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”とは、相互に変換
可能で使用し、ペプチド結合で連結したアミノ酸のいかなる高分子（ジペプチド
またはそれ以上）をも称する。したがって、語句“ポリペプチド”、“ペプチド
”および“タンパク質”とは、オリゴペプチド、タンパク質フラグメント、アナ
ローグ、突然変異タンパク質、融合タンパク質などが挙げられる。したがって、
“Ｓｐαポリペプチド”とは、単離、組換えまたは合成したものに関わらず、図
１に示すものと同一のアミノ酸配列および該フラグメント（これらは生物学的活
性、例えば触媒および／または免疫学的活性を保持するために該ポリペプチドに
とって必要な大部分の分子を含有する）、併せて該ペプチドにとって実質的に相
同なアナローグ、突然変異または変異型タンパク質および該活性を保持したもの
などを意味する。
２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、ヌクレオチドまたはアミ
ノ酸の少なくとも約８５％（少なくとも約８５％〜約９０％が好ましく、および
少なくとも約９５％であることが最も好ましい）が分子内の定義した鎖上で一致
している場合、“実質的に相同”である。本明細書中で使用する通り、実質的に
相同とはまた特定のポリペプチド配列との同一性を示す配列を称する。実質的に
相同である核酸配列を、特定のシステムについて定義する際、例えばストリンジ
ェント条件下、サザン・ハイブリダイゼーション実験において同定可能である。
定義した適当なハイブリダイゼーションの条件は当技術分野の範囲内である。例
えば、サンブルックらによる、上述；DNA Cloning、I&II巻、上述；Nucleic Aci
d Hybridization、上述を参照。ＰＣＲ産物を直接配列決定することで、該配列
をまた確認し、さらに特徴付けることも可能である。核酸およびアミノ酸配列の
同一性を決定するための他の技法が該分野で公知であり、関心ある遺伝子（通常
、ｃＤＮＡ中間体を介して）に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列の決定および
該遺伝子をコードするアミノ酸配列の決定およびこのものと第２アミノ酸配列と
の比較が挙げられる。２個のポリヌクレオチド間での同一性並びに２個のポリペ
プチド配列間での同一性および類似性の両方を計算するプログラムをウィスコン
シン配列分析パッケージ、バージョン８(Wisconsin Sequence Analysis Package
，Version 8)(ジェネテック・コンピューター・グループ(Genetic Computer Gro
up)、マディソン、ウィスコンシンから入手可能)、例えばギャップ・プログラム
を入手可能である。配列間の同一性および類似性を計算する他のプログラムが該
分野で公知である。
語句“縮退変異型”とは、該ポリヌクレオチドにおける核酸配列の変化、例え
ば挿入、欠損もしくは置換などを含むポリヌクレオチドであって、縮退変異菌株
が派生した参照ポリペプチドと全く同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを意味する。
語句“Ｓｐαポリペプチドとの反応性を有する抗体”とは、Ｓｐαポリペプチ
ドにとって特異的、または該抗体に相同なタンパク質にとって特異的なポリクロ
ーナルまたはモノクローナルな抗体を意味する。該反応性を当分野で公知の方法
を用いて免疫沈降およびウエスタン・ブロット分析によって決定可能である。該
抗体はＳｐαポリペプチドに対する特異性を保持した無傷の細胞だけでなく該活
性フラグメントを意味する。（抗体フラグメントの産生に関する記述として、例
えば、ボールドウィン,Ｒ.Ｗ.らによる癌検出および治療におけるモノクローナ
ル抗体(Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy)(アカデミ
ック・プレス(1985)を参照)。該語句はまた、問題のＳｐαタンパク質に対する
特異性を保持したキメラ抗体を意図する。特に、該抗体はＳｐα分子に対する特
異性を保持した可変領域または該可変領域のフラグメントを含有してもよい。残
りの抗体は抗体を使用する種から誘導可能である。したがって、抗体をヒトに用
いるならば、該抗体は免疫原性を減少するが活性を保持するために“ヒト化”し
得る。キメラ抗体に関する記述としては、ウインター(Winter)、Ｇ.およびミル
スタイン(Milstein)、Ｃ.による(1991)、Nature 349:293-299；ジョーンズ(Jone
s)らによる(1986)、Nature 321:522-525；リッチマンらによる(1988)、332:323-
327；およびカーター(Carter)らによる(1992)、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89
:4285-4289を参照。該語句はまた一本鎖抗体をはじめとしたＳｐαに結合する他
の組換え抗原−結合分子、少なくとも１個の可変領域がＳｐαに結合した二重特
異的な抗原−結合分子などが挙げられる。
ポリヌクレオチドを記載するために本明細書中で使用する“組換え”とは、ゲ
ノム、ｃＤＮＡ、半合成的または合成起源のポリペプチドを意味し：該起源また
は操作によって（１）本来会合しているポリヌクレオチドの全部またはその一部
と会合している；および／または（２）本来連結しているもの以外のポリヌクレ
オチドに連結している、ポリペプチドを意味する。タンパク質またはポリペプチ
ドに関して使用する際の語旬“組換え”とは組換えポリヌクレオチドの発現によ
って産生するポリペプチドを意味する。“組換え宿主細胞”、“宿主細胞”、“
細胞”、“細胞系”、“細胞培養”および培養する原核微生物または真核細胞系
を示す単細胞の実体などの他の語句は、相互交換可能に使用され、組換えベクタ
ーもしくは他の転移ＤＮＡに対する受容体として現在もしくはこれまで使用可能
であった細胞を称し、このものはトランスフェクトされた本来の細胞の子孫を含
有する。偶発的もしくは意図的な突然変異により、単一親細胞の子孫は必ずしも
形態学的に、または本来の母細胞に対するゲノムもしくは全ＤＮＡ補体において
必ずしも完全に同一であるとは限らない。母細胞の子孫（このものは目的のペプ
チドをコードしたヌクレオチド配列の存在などの適性によって特徴付けられる
ように該親に対して十分に類似している）としては、本定義によって意図する子
孫が挙げられ、上記の語句によって包含されるものである。
“ベクター”とは、レプリコン、すなわちプラスミド、ファージもしくはコス
ミドなどの細胞内にあるポリヌクレオチドレプリコンの自律性単位として作用す
る遺伝要素であり、このものは接合セグメントのレプリコンを生じるために別の
ＤＮＡセグメントに結合可能である。
ＤＮＡ“コード配列”または特定のタンパク質を“コードしたヌクレオチド配
列”とは、適当な調節配列のコントロール下に置いた時、インビボもしくはイン
ビトロでポリペプチド中に転写および翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列
の境界は５'(アミノ)末端位の出発コドンおよび３'(カルボキシ)末端位の翻訳停
止コドンによって決定される。該コード配列としては、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤ
ＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列でさえも含まれるが、これらのものに限定される
ものではない。転写末端配列は通常コード配列に対して３'位に位置する。
ＤＮＡ“コントロール配列”とは、全体としてプロモーター配列、リボソーム
結合部位、ポリアデニル化信号、転写末端配列、上流調節ドメイン、エンハンサ
ーなどを称し、このものは全体として宿主細胞中のコード配列の転写および翻訳
を提供する。
“操作可能に連結した(Operably linked)”とは、記載した成分が該通常の機
能を行なうように配置された要素の配列を称する。したがって、コード配列に操
作可能に連結したコントロール配列はコード配列の発現に影響を及ぼすことが可
能である。該コントロール配列は、それらが該発現を目的に機能する限り、コー
ド配列と相接(contiguous)させる必要がない。したがって、例えば未翻訳である
が転写された介在配列はプロモーター配列とコード配列の間に存在可能であり、
該プロモーター配列は該コード配列に“操作可能に連結した”とさらにみなされ
得る。
ＤＮＡ組成物の“異種の”領域とは、別のＤＮＡ分子（このものは本来他の分
子と会合していない）中の、または結合したＤＮＡの同定可能なセグメントであ
る。したがって、該異種領域がヒト遺伝子をコードする場合、該遺伝子は通常Ｄ
ＮＡ（このものはヒトゲノム中のヒト遺伝子をフランクする）によってフランク
される。異種コード配列の別例としては、コード配列自身が天然に存在しない組
成物（例えば、天然の遺伝子とは違ったコドンを有する合成配列）が挙げられる
。アレリックな変化または自然に起こる突然変異的な事象は本明細書中で使用す
る通り、ＤＮＡの異種領域では起こらない。
以下の１文字表記アミノ酸の略号は本明細書全般にわたって使用可能である：
アラニン Ａ アルギニン Ｒ
アスパラギン Ｎ アスパラギン酸 Ｄ
システイン Ｃ グルタミン Ｑ
ヒスチジン Ｈ イソロイシン Ｉ
ロイシン Ｌ リシン Ｋ
メチオニン Ｍ フェニルアラニン Ｆ
プロリン Ｐ セリン Ｓ
トレオニン Ｔ トリプトファン Ｗ
チロシン Ｙ バリン Ｖ
Ｂ．一般法
本発明の主要部は、Ｓｐαポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発見
である。該分泌ポリペプチドは３個のＳＲＣＲドメインを含有するものとして特
徴付けられてきた。Ｓｐαは腫瘍細胞系および単球由来の細胞に結合することが
できる。ＲＮＡブロット分析により、Ｓｐαをコードする転写物がリンパ球組織
中で排他的に発現し、およびＳｐαがリンパ様区画の発生および維持の両方につ
いての工程に関係することが示唆されている。
Ｓｐαが末梢単球に結合することの観察およびサイトカインなどの他の分泌ポ
リペプチドが免疫調節機能を有していることの認識は、Ｓｐαにおける同様の機
能を明らかに暗示している。
加えて、ＳｐαまたはＳｐαが関係する相互作用のモジュレーションを炎症応
答を調節する場合に使用可能である。Ｓｐαは単球様ＴＨＰ１細胞上のＳｐαポ
リペプチド受容体における調節を上昇(upregulate)させ、かつ非接着状態と接着
状態にあるＴＨＰ１細胞を区別することができる。血管内皮は接着分子および化
学誘引物質サイトカインの発現を介した炎症性リンパ球の補強において活発な役
割を果たしている。該誘導可能なエフェクターは急性および慢性炎症反応の特徴
の重要な決定因子であると思われる。したがって、Ｓｐαと該リガンド、例えば
適当な標的の抗体または他の分子との相互作用を抑制することは細胞表面上の接
着分子における調節の上昇を抑制することになる。細胞表面の接着分子における
調節の増大を抑制することにより、末梢から周囲の組織までの該細胞の動きを抑
制し、ゆえに単球／マクロファージに関連する創傷治癒および炎症応答などの事
象を調節する手段を提供する。
本発明のＳｐαポリペプチドは該分野で公知の通常の技法、例えば固相ペプチ
ド合成などの化学的合成法によって合成可能である。一般的に、該方法は固相ま
たは液相合成法のどちらかで使用可能である。例えば、固相ペプチド合成に関し
ては、Ｊ.Ｍ.スチュワート(Stewart)およびＤ.ヤング(Young)による、固相ペプ
チド合成(Solid Phase Peptide Synthesis)、２巻；Pierce Chemical社，Rockfo
rd，IL(1984)およびＧ.バラニー(Barany)およびＲ.Ｂ.メリフィールド(Merrifie
ld)による、ペプチド：分析、合成、生物学(The Peptides:Analysis，Synthesis
，Biology)、Ｅ.グロス(Gross)およびＪ.マイエンホファー(Meienhofer)監修、
２巻、アカデミック・プレス、ニューヨーク(1980)、p.3-245；古典的な溶液合
成に関しては、Ｍ.ボダンスキー(Bodansky)によるペプチド合成の原理(Principl
es of Peptide Synthesis)、Springer-Verlag、Berlin(1984)およびＥ.グロスお
よびＪ.マインホーファーらによる、ペプチド：分析、合成、生物学、上述、Ｉ
巻を参照。Ｌ−またはＤ−アミノ酸のいずれかを含有するポリペプチドを本様式
で合成可能である。ポリペプチド組成物を定量アミノ酸分析によって確認し、各
ペプチドの特定の配列を配列分析によって決定可能である。
または、ＡＴＧ開始コドンと共にＳｐαポリペプチドをコードするＤＮＡを供
した組換え法によって、該Ｓｐαポリペプチドを産生可能である。アミノ酸配列
の知識に基づいて、コードするＤＮＡを合成により、または技法の組合わせによ
り製造したゲノムまたはｃＤＮＡから、Ｓｐαを誘導することが可能である。次
いで、該ＤＮＡを当分野で公知の方法（サンブルックらによる、上述を参照）を
用いて、Ｓｐαを発現するためまたはＲＮＡ製造用の鋳型として使用可能である
。
特に一層、ＳｐαをコードするＤＮＡを適当なＤＮＡライブラリーまたはｃＤ
ＮＡライブラリー（このものは適当な源、例えばヒト脾臓ｍＲＮＡから単離した
ｍＲＮＡより製造）から得ることができる。ＤＮＡライブラリーはグランスタイ
ン(Grunstein)ら（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 73:3961(1975)）により記載の
製法を用いてスクリーニングすることが可能である。合成オリゴヌクレオチドを
、ワルナー(Warner)(DNA 3:401(1984))により記載のものなどの自動化オリゴヌ
クレオチド合成装置を用いて製造可能である。
一旦Ｓｐαポリペプチドに対するコード配列が合成または単離されると、それ
らは発現用のいずれの適当なベクター中でもクローン化することが可能である。
莫大のクローニングベクターが当業者によって知られており、適当なクローニン
グベクターを選択することが選択上の問題である。クローニング用組換えＤＮＡ
ベクターおよび形質転換可能な宿主細胞としては、例えばバクテリアファージλ
（大腸菌）、ｐＢＲ３２２（大腸菌）、ｐＡＣＹＣ１７７（大腸菌）、ｐＫＴ２
３０（グラム陰性菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラ
ム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（非−大腸菌グラム陰性菌）、ｐＨＶ１４（大腸菌お
よび枯草菌）、ｐＢＤ９（バチルス）、ｐＩＪ６１（ストレプトミセス）、ｐＵ
Ｃ６（ストレプトミセス）、ＹＩｐ５（サッカロミセス）、ＹＣｐ１９（サッカ
ロミセス）およびウシパピローマウイルス（哺乳類細胞）が挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。一般的にＤＮＡクローニング(DNA cloning)：Ｉ&
II巻、上述；サンブルックらによる上述；Ｂ.パーバル(Perbal)上述を参照。バ
キュロウイルス系などの昆虫細胞発現系をまた使用可能であり、これらは当業者
にとって公知であり、例えばサマーズ(Summers)およびスミス(Smith)によるTexa
s Agricultural Experiment Station Bulletin番号1555(1987)に記載されている
。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系用の物質および方法は、なかんずくInvitr
ogen、San Diego CA（“MaxBac”キット）からキットの形態で商業的に入手可能
である。
該遺伝子をプロモーター、リボソーム結合部位（細菌を発現する場合）および
任意にオペレーター（本明細書中ではまとめて“コントロール”要素と称する）
のコントロール下におくことが可能であり、その結果目的のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列は、本発現組成物を含有するベクターによって形質転換された
宿主細胞中におけるＲＮＡに転写される。該コード配列はシグナルペプチドまた
はリーダー配列を含有しても、しなくてもよい。宿主有機体から発現したポリペ
プチドの分泌を引き起こすコード配列に、異種のリーダー配列を加えることが可
能である。リーダー配列を翻訳後プロセシング状態にある宿主によって除去する
ことが可能である。米国特許第4,431,739、4,425,437、4,338,397号参照。
他の調節的配列もまた望むことが可能であり、該配列は宿主細胞の増殖に相対
的なタンパク質配列の発現の調節を許容する。該調節配列は当業者にとって知ら
れており、例えば化学的または物理的刺激（例えば、調節化合物の存在）に応答
する際、遺伝子の発現を引き起こしたり、引き起こさなかったりするものが挙げ
られる。他の型の調節要素もまたベクター中、例えばエンハンサー配列に存在し
得る。
該コントロール配列および他の調節配列を上記に記載のクローニングベクター
などのベクター内に挿入する前に、コード配列に連結することが可能である。ま
たは、該コード配列をコントロール配列および適当な制限部位を既に含む発現ベ
クター中に直接にクローン化することも可能である。
場合により、該コントロール配列が適当な配向で結合できるように、コード配
列を改良、すなわち適当な読み枠を維持することも必要となる。また、関心のあ
るポリペプチドの突然変異物質またはアナローグの産生を望むことも可能である
。タンパク質をコードする配列の一部の欠損によって、配列の挿入によって、お
よび／または該配列内での１個以上のヌクレオチドの置換によって、突然変異物
質またはアナローグを製造可能である。部位−指向突然変異物質などのヌクレオ
チド配列の改良法は当業者にとって公知である。例えば、サンブルックらによる
、上述；DNA Cloning、Ｉ&II巻、上述；Nucleic Acid Hybridization、上述を参
照。
次いで、発現ベクターを適当な宿主細胞を形質転換するのに使用する。多くの
哺乳類細胞系が当分野で公知であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（ＡＴＣＣ）から入手可能な不老死細胞系が挙げられ、例えば、チャイニ
ーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラ細胞、乳児ハムスター腎臓（ＢＨ
Ｋ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞性癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ
２）、マディン−ダービー・ウシ腎臓（“ＭＤＢＫ”）細胞、併せて他のものが
挙げられるが、これらに限定されるものではない。同様に、細菌性宿主、例えば
大腸菌、枯草菌および連鎖球菌などは本発現組成物と共に使用する。本発明にお
いて有用な酵母菌としては、なかんずくサッカロミセス・セレビシエ(Saccharom
yces cerevisiae)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・マ
ルトーサ(Candida maltosa)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha
)、クリーベロミセス・フラジリス(Kluyveromyces fragilis)、クリーベリミセ
ス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ピヒア・ギレリモンディー(Pichia gu
illerimondii)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)、スキゾサッカロミセス
・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)およびヤロウイア・リポリティカ(Yarrow
ia lipolytica)が挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターと共に使用する昆
虫細胞としては、なかんずくエイデス・エジプチ(Aedes aegypti)、オートグラ
ファ・カリフォルニカ(Autographa californica)、ボンビクス・モリ(Bombyx mo
ri)、ショジョウバエ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)、スポドプテ
ラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)およびトリコプラシア(Trichoplusia
)ｎｉが挙げられる。該タンパク質をまたトリパノソーマ中で発現することも可
能である。
選択した発現系および宿主に従い、関心あるタンパク質が発現される条件下、
上記に記載の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を増殖することで、
本発明のタンパク質を産生する。次いで、該タンパク質を宿主細胞から単離し、
精製した。該発現系が成長培地中にタンパク質を分泌する場合、該タンパク質を
培地から直接に精製することも可能である。タンパク質が分泌しないならば、細
胞溶解液から単離する。適用な培養条件および回収法の選択は該技術分野の範囲
内である。一旦精製すると、エドマン分解の反復繰り返し、続いて高速液体クロ
マトグラフィー(“ＨＰＬＣ”)などのアミノ酸分析によって、タンパク質のアミ
ノ酸配列を決定可能である。アミノ酸の配列決定における他の方法もまた当分野
で公知である。
加えて、他の種、組織および細胞型（例えば、クローニングおよび診断の目的
用）内でのＳｐαもしくは他の種の存在を検出するのに、オリゴヌクレオチドプ
ローブを設計するのに、本明細書中に開示の配列をまた使用可能である。特に、
目的の組織から誘導したゲノムおよびｃＤＮＡライブラリーを当分野で公知の技
法を用いて製造可能である。決定配列の一部に対するコドンを含有するオリゴヌ
クレオチドプローブを、Ｓｐα遺伝子および該異種体に関するライブラリーのス
クリーニングするのに製造可能である。オリゴヌクレオチドプローブおよびＤＮ
Ａライブラリーを製造するための基本戦略は、核酸ハイブリダイゼーションによ
るスクリーニングと併せて、当業者にとって公知である。例えば、DNA Cloning:
Ｉ巻、上述；Nucleic Acid Hybridization、上述；Oligonucleotide Synthesis
、上述；サンブルックらによる上述を参照。該スクリーニングされたライブラリ
ー由来のクローンを正(positive)ハイブリダイゼーションによって一旦同定する
ならば、特定のライブラリー挿入断片が実際にＳｐα遺伝子を含有しており、お
よび該遺伝子が単離可能であるという事実を、制限酵素分析およびＤＮＡ配列決
定によって確認することが可能である。例えば、サンブルックらによる上述を参
照。Ｓｐαポリペプチドをコードする単離遺伝子を上記に記載の通り、いずれの
適当な発現用ベクター中でもクローン化することができる。
Ｓｐαポリペプチドを例えば自己免疫病、ウイルス感染、移植拒絶反応の抑制
、腫瘍細胞の増殖反応の抑制、様々な免疫不全の組合せなどの免疫応答をモジュ
レートするために医薬組成物中で使用可能である。本発明のＳｐαポリペプチド
を様々な投与形態で治療学的組成物中に処方することができるが、該投与形態と
してはたとえば、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、坐剤、高分子マイクロカプ
セルまたは微小賦形剤(microvesicle)、リポソームおよび注入もしくは注射液剤
が挙げられるが、これらのものに限定されるものではない。好ましい形態は、投
与様式および標的にされた特定の癌型に依る。該組成物としてはまた当分野で公
知の医薬的に許容し得る賦形剤、担体もしくはアジュバンドが好ましく、これら
のものとしてはヒト血清アルブミン、イオン交換剤、アルミナ、レシチン、緩衝
物質が挙げられ、該緩衝物質としてはホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソ
ルビン酸カリウムなどの塩または硫酸プロタミンなどの電解質が挙げられる。適
当な賦形剤としては、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタ
ノールおよび該組み合わせがある。該組成物を製造する実施の方法は当業者にと
って公知であり、明白であろう。例えば、Remington's Pharamaceutical Scienc
es、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvania、18刊、1990を参照。
静脈内、腹腔内、経口、リンパ管内、もしくは皮下投与をはじめとする通常の
デリバリ様式を用いて、上記の組成物を投与することが可能である。問題の腫瘍
または炎症部位に対する局部投与、例えば関節炎の関節部位に対する直接注入を
また本発明と共に使用可能である。
治療学的に有効な薬用量は、当業者によって容易に決定可能であり、病気の痛
みの程度および経過、処置に対する患者の健康状態および応答、並びに処置する
医者の判断に依る。
本発明のＳｐαポリペプチドもしくは該フラグメントをまた、ポリクローナル
およびモノクローナルな両抗体を産生するのに使用可能である。ポリクローナル
抗体を望むならば、選択した哺乳類（例えばマウス、兎、ヤギ、馬、ブタなど）
を本発明の抗原もしくは該フラグメント、または突然変異抗原を用いて免疫化す
る。該免疫化した動物由来の血漿を収集し、公知の方法にしたがって処置した。
ポリクローナル抗体を含有する血漿を使用する場合、該ポリクローナル抗体を公
知の製法を用いたイムノアフィニティー・クロマトグラフィーなどの様々な方法
によって精製可能である。
Ｓｐαタンパク質および該フラグメントに対するモノクローナル抗体をまた、
例えばハイブリドーマ・テクノロジーを用いて当業者によって容易に産生可能で
ある。ハイブリドーマ・テクノロジーを用いることによるモノクローナル抗体を
作る一般的な方法論は公知である。例えば、不死の抗体産生細胞系を細胞融合、
併せて発癌性ＤＮＡを用いたＢリンパ球の形質転換、またはエプスタインーバー
ウイルスを用いたトランスフェクションなどの他の技法により作製することがで
きる。例えば、シュライヤー(Schreier)らによる、ハイブリドーマ法(Hybridoma
Techniques)(1980)；ハマーリング(Hammerling)らによるモノクローナル抗体お
よびＴ−細胞ハイブリドーマ(Monoclonal Antibodies and T-cell
Hybridomais)(1981)；ケネット(Kennett)らによるモノクローナル抗体(Monoclon
al Antibodies)(1980)；米国特許番号第4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,4
44,887；4,452,570；4,466,917；4,472,500；4,491,632；および4,493,890を参
照。Ｓｐαタンパク質に対して産生したモノクローナル抗体のパネルを様々な特
性、すなわちイソ型、エピトープ、親和力などについてスクリーニングすること
が可能である。
Ｓｐαタンパク質に対して生成させた抗体を、診断薬として、標準イムノアッ
セイにおいて、該タンパク質の存在の有無に関してもしくは異常なＳｐαタンパ
ク質の有無に関して組織および／または腫瘍をスクリーニングするために、また
はＳｐαと該リガンド間の相互作用をモジュレートする分子をスクリーニングす
るために使用可能である。加えて、Ｓｐαに結合する抗体自身をＳｐαの免疫調
節効果をモジュレートすることによって、Ｓｐαおよび該リガンド間での相互作
用をモジュレートするために使用可能である。
例えば、Ｓｐαタンパク質の存在を、競争的、直接反応もしくはサンドイッチ
型アッセイをはじめとする標準電気泳動および免疫診断技法を用いて検出可能で
ある。該アッセイとしてはウエスタン・ブロット；凝集試験；酵素−標識および
媒介イムノアッセイ、例えば酵素結合免疫吸着定量法（“エライザ法”）；ビオ
チン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動法；免疫沈降
法などが挙げられるが、これらのものに限定されるものではない。該反応として
は一般的に、蛍光、化学発光、放射線活性または酵素標識または染色分子などの
表示標識、または上記に記載の通りＳｐαタンパク質と該抗体間での複合体の形
成を検出する他の方法が挙げられる。
Ｓｐαタンパク質および該タンパク質への抗体が沈降反応条件下、複合体を形
成するように、アッセイをまた溶液中で行なうことも可能である。次いで、該沈
降した複合体を試験試料から、例えば遠心分離によって分離することも可能であ
る。反応混合物を上記に記載の通り免疫診断法などの多くの標準法のいずれかを
用いて、抗体−Ｓｐα複合体の存在の有無を決定するのに分析可能である。
上記に記載の通り免疫検定を行なうために、Ｓｐαタンパク質およびそれに対
する抗体を適当な装置および他の必要な試薬を備えたキット中で供することがで
きる。該キットはまた、使用する特定の免疫アッセイに従って適当な標識および
他のパッケージ試薬および物質（すなわち、洗浄用緩衝液(wash buffer)など）
を含有してもよい。該キットを用いて、上記に記載したものなどの標準イムノア
ッセイを行なうことができる。
Ｃ．実施例
以下に、本発明を実行する場合における特定の実施態様の例を挙げる。該実施
例は単に例示的な目的で供するのであり、とにかく本発明の範囲を限定すること
を意図するものではない。
使用した数字（例えば、量、温度など）に関しては精度を確認するように努力
を払うが、いくつかの実験誤差および偏差は当然許容されるべきである。
Ｓｐαのクローニング：完全鎖ｃＤＮＡをヒト脾臓ライブラリー（クロンテッ
ク（Clontech）ＨＬ５０１１ａ）からプラーク・ハイブリダイゼーションによっ
てクローン化した。およそ１×１０6個のクローンを２０プレート上にプレート
し、商標主の指示に従い、ハイボンド(Hybond)Ｎ+ナイロン膜（アマーシャム（A
mersham）ｒｐｎ132ｂ）にトランスフェクトした。紫外線放射に被曝させること
で膜は架橋化し、次いでチャーチ(Church)らの方法によってハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。全ハイブリダイゼーションを、発現配列ｔａｇ（expressed se
quencetag；“ＥＳＴ”）クローン番号201340(リサーチ・ジェネティクス)から
得た部分的Ｓｐα・ｃＤＮＡから消化された放射線標識ＥｃｏＲ１フラグメント
を用いて行なった。該ＥｃｏＲ１フラグメントは塩基対１〜１５９４を含有する
が、このものをランダムに標識化したキット(a random labeling kit)(Boehring
er Mannheim)を用いたγ−［３２Ｐ］−ｄＣＴＰ(Amersham)を使用することで標
識化した。高ストリンジェンシーな洗浄用緩衝液を用いて６０℃で洗浄し、コダ
ックＸ−線フィルム（Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲ）に被曝させた。次いで、正プラーク
の部分集合を再プレートし、再スクリーニングを行なった。スクリーニングを３
回繰り返した後、１０個の独立したクローンを得、そのうちの２個は完全鎖であ
った。該完全鎖クローンの両方をジデオキシ法（サンガー(Sanger)ら
による(1977)、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74:5463）を用いて両方向について
配列決定を行なった。
ノーザンブロット法：２個の組織および１個の細胞系ノーザンブロットをクロ
ーンテック（Clontech）(各々、カタログ番号7766−1、7754−1および7757−1)
から購入し、商業主の指示に従い、５０％ホルムアミド中、４２℃でハイブリダ
イゼーションを行なった。放射線標識化したノーザンブロットプローブはＧＡＰ
ＤＨもしくはβ−アクチンである。正ブロットを高ストリンジェンシー条件下で
洗浄した。ブロットをコダックＸ−線フィルム(Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲ)に被曝させ
た。
融合タンパク質組成物：Ｓｐαの翻訳領域に対応するＤＮＡを、鋳型として完
全鎖Ｓｐα ｃＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）によって得
た。Ｓｐα ＣをマウスＩｇＧ２ａ(ｍＩｇ)におけるヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ
３ドメインに末端ライゲーション可能な制限部位を有するように設計する。配列
および読み枠の正しさを証明するために、全構成物を配列決定した。Ｓｐα−ｍ
Ｉｇ（ＣＤＭ８発現ベクター中）をＣＯＳ細胞中で一時的に発現させた（アルフ
ォらによる(1990)、Cell 61:1303-1313）。可溶性Ｓｐα−ｍＩｇをタンパク質
−ＡカラムクロマトグラフィーによってＣＯＳ細胞上澄みから精製した。タンパ
ク質−Ａを結合させ、続いて該カラムをホスフェート緩衝塩液（“ＰＢＳ”）（
ｐＨ７.０、溶出液：４.０Ｍイミダゾール、ｐＨ８.０、ＭｇＣｌ2およびＣａＣ
ｌ2(各１ｍＭ)を含有）を用いて広く洗浄した。ＰＢＳを用いて溶出したタンパ
ク質を広く透析した。
細胞培養：イスコブ改良ダルベッコ培地（Iscove's Modified Dulbecco's Med
ium(“ISDM”)、１０％ウシ胎児血清を含有）中、０.５〜０.９×１０6細胞／ｍ
ｌにまで、ヒト細胞系を増殖した。ヒト末梢血液Ｔ、Ｂおよび単球細胞を向流遠
心分離エルトリエーションによって分離した。
フローサイトメトリー：氷上、Ｓｐα−ｍＩｇ融合タンパク質(２０μｇ／ｍ
ｌ)およびヒトＩｇＧ(シグマカタログ番号Ｉ−8640)(２００μｇ／ｍｌ)を含有
した染色緩衝液(ＰＢＳ含有２％ウシ血清アルブミン、フラクションＶ、０.０５
％アジ化ナトリウム、ＭｇＣｌ2およびＣａＣｌ2を各々１ｍＭ)(１００μｌ)中
で１時間、およそ５×１０5細胞をインキュベートした。次いで、染色緩衝液を
用いて細胞を洗浄し、遠心分離し、吸引した。２回目の洗浄に続き、氷上、染色
緩衝液（１：１００に希釈したフルオロセイン・イソチオシアネート(“ＦＩＴ
Ｃ”)で標識化したウサギ抗−マウスＩｇＧ２ａ抗体（発酵(Zymed)カタログ番号
６１−０２１２を含有）中で１時間、細胞をインキュベートした。次いで、細胞
を２回洗浄し、染色緩衝液(０.５ｍｌ)中で再度懸濁した。試料をベクトンーデ
ィキンソンＦａｃｓｃａｎ上で実験を行なった。試料を実験する前に、プロピジ
ウム・ヨージド(“ＰＩ”)を１μｇ／ｍｌだけ加えた。死亡細胞をＰＩ正と同定
し、除き（gate out）、分析には使用しなかった。ＣＤ３(６４.１ジェフ、レッ
ドベッター(Jeff Ledbetter)、Ph.D.)、ブリストルーマイヤー・スクイブによっ
て寛大に寄与された、Ｔ細胞）、ＣＤ１９（IOB4a Amak 1313、Ｂ細胞）および
ＣＤ１４（MY4 Coulter 6602622、単球）をエルトリエーションした細胞を確認
するために使用した。該抗体を染色するための第２の工程は、ＦＩＴＣで標識化
したヤギ抗−マウスＩｇＧ（バイオサイエンス(Bioscience)4408）である。
実施例１
Ｓｐαのクローニング
タンパク質のＳＲＣＲファミリーにおける新規な一員を以下の通り単離した。
ＤＮＡデーターベースのスクリーニングにより、ＣＤ５、ＣＤ６、Ｍ１３０およ
びＷＣ１を含有するＳＲＣＲ群Ｂタンパク質の一員と相同な延長(extensive)配
列を示す、ヒトＥＳＴデータベース由来のｃＤＮＡフラグメントを同定した。該
ＥＳＴ配列（胎児肝臓−脾臓由来）を、ヒト脾臓から単離したｍＲＮＡから製造
したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、プローブとして使用し
た。このことにより、１０個のｃＤＮＡクローンの単離を行なった。２個の最長
クローン、１８０４ｂｐおよび２１５２ｂｐは各々両配向において配列決定し、
３４７個のアミノ酸ポリペプチドをコードする長鎖オープン・リーディング・フ
レーム、いわゆるＳｐα（このものは分泌タンパク質の特徴を有する）を含有し
ていることが分かった。Ｓｐαをコードする該ｃＤＮＡ配列および該推定アミノ
酸配列を図１Ａ〜１Ｂ（配列番号：＿〜＿）に示す。
ＣＯＳ細胞によって産生されるＳｐα免疫グロブリン融合タンパク質のＮ−末
端配列によって指示されている通り、Ｓｐαは分泌シグナル配列として作用し、
および成熟タンパク質から除去された１９個の疎水性アミノ酸のアミノ末端配列
を含有する。本推定上の分泌シグナル配列は３個のシステインが豊富なドメイン
（このものは各々およそ１００個のアミノ酸である）を伴う。図２に示す通り、
該システインが豊富なドメインはタンパク質のＳＲＣＲ群Ｂファミリー中に見出
される該システインが豊富なドメインに非常に相同である（レスニック（Resnic
k）らによる(1994)、生化学の傾向(Trends Biochem．Sci．19:5-8)）。ＳＰαの
第３のＳＲＣＲドメインはインフレーム停止コドンを伴う。
該ＳＰαのＳＲＣＲドメインはおよそ４０％〜４８％の同一性、すなわちＣＤ
５、ＣＤ６、ＷＣ１およびＭ１３０における対応するドメインとの同一アミノ酸
一同一位という同一性を示す。加えて、Ｓｐαは群Ｂフェミリーの一員として同
定する８個の保存システイン残基を含有する。しかしながら、群Ｂファミリーの
他の一員と違って、Ｓｐαはトランスメンブラン・ドメインを含有しない。その
上、Ｓｐαの予想アミノ酸配列は推定上のＮ−連結グリコシル化部位を含有しな
い。
該２個のＳｐαクローンは二つの面で互いに相違している。第１に、９６８位
での該２個のクローン間には塩基対の相違が１個存在している。ＴからＣへの変
化はコード配列中に位置するものであるが、Ｓｐαの予想アミノ酸配列中の変化
を生じさせるものではない。第２に、該２個のクローンは該３'未翻訳領域の鎖
において相違しており、１個のクローンが他よりも３４８ｂｐ長い３'ＵＴＲを
有している。短い方のクローンはポリアデニル化共通配列由来の１８塩基上流を
開始とするポリ−Ａ配列を有している。該長い方のクローンは、２個のポリアデ
ニル化共通配列を有し：第１の配列は短い方のクローン中で見出されたポリアデ
ニル化共通配列と同一であり；および第２の配列は最初のポリアデニル化部位か
ら３５１ｂｐ下流に位置している。該長い方のクローンはまた３'未翻訳配列中
に３個のアデニル酸塩／ウリジル酸塩が豊富な要素（ＡＲＥｓ；ＡＵＵＵＡ）を
含有している。該３個のＡＲＥｓは２個のポリアデニル化部位の間に位置してい
る。ＡＲＥ要素はｍＲＮＡの３'未翻訳領域中に位置しており、およびＲＮＡ安
定性の最も通常の決定因子であることが分かった（シャウ(Shaw)らによる(1986)
、Cell 46:659-667；チェン(Chen)らによる(1995)、Trends Biochem．Sci．20:4
65-470）。サイトカインをコードするメッセンジャーＲＮＡおよび転写因子は互
いに該要素を含有しており、該要素は該たんぱく質をコードするｍＲＮＡの安定
性つまりは半減期を目的とすることによって、タンパク質の発現の調節に関する
機構をさらに提供するものである。ＳｐαをコードするｍＲＮＡの少なくとも１
個がＡＲＥモチーフを含有しているという発見は、本タンパク質の発現がしっか
りと調節されている可能性を示唆している。
ＳＰαとＳＲＣＲ群Ｂファミリーの他の一員との比較により、該ＳＲＣＲドメ
インがＭ１３０中に見出されるものと最も密接に関連していることが分かった（
図２）。しかしながら、Ｓｐαは該ドメインの構成の点でＣＤ５およびＣＤ６と
非常によく類似している。ＣＤ５およびＣＤ６の両方とも細胞該ドメインが３個
のＳＲＣＲドメインからなる細胞表面タンパク質である。
実施例２
ＳｐαをコードするｍＲＮＡ転写物を発現する組織の同定
プローブとしてＳｐαフラグンメントを使用するＲＮＡブロット分析により、
ＳｐαをコードするｍＲＮＡが脾臓、リンパ節、胸腺、脊髄および胎児の肝臓だ
けでなく、前立腺、睾丸、子宮、小腸、結腸、末梢血液白血球および虫垂におい
ても発現することを示した（図３）。全ての場合において、Ｓｐαをコードする
ｍＲＮＡ転写物を発現する組織は３個のハイブリダイゼーションした転写物を発
現する。該転写物はおよそ２.４、２.１および１.８ｋｂｐ(キロベースペア)／
鎖である。鎖中、２個の最も長いｃＤＮＡに相当する１.８ｋｂｐおよび２.１ｋ
ｂｐ転写物を牌臓ｃＤＮＡライブラリーから単離した。該単離した２個のｃＤＮ
ＡがＲＮＡブロット中に見られるものと大きさが一致するという発見により、そ
れらが全てＳｐαをコードし得るが、該未翻訳領域の鎖中においては互いに相違
していることが示唆される。１個以上の該転写物が密接に関連したタンパク質を
コードし得る可能性は、該データによって排除することができないと断るべきで
ある。どの細胞がＳｐαを産生するかを決定するために、いくつかの細胞系をノ
ーザンブロット分析によって分析する。Ｓｐαに関するＲＮＡメッセンジャーは
以下の細胞系：ＨＬ６０、Ｋ５６２、Ｒａｊｉ、Ｍｏｌｔ４、Ａ５４９、ＳＷ４
８０、ＧＡ３６ １、ヒーラＳ３および末梢血液白血球中においては検出されな
い。
該ＲＮＡブロット分析により、Ｓｐαをコードする転写物はリンパ系組織中で
は排他的に発現することが示唆される。それに対して、白血球は本タンパク質を
発現しないように思われる。本発見により、Ｓｐαがリンパ球組織における特殊
化した上皮および内皮細胞によって産生し得ることが示唆される。Ｓｐαが脊髄
、胸腺および胎児の肝臓併せて脾臓およびリンパ節において発現することを観察
することにより、本タンパク質が該工程においてリンパ区画の発展および維持の
両方に関与することが暗示される。
実施例３
骨髄性細胞系および単球に対するＳｐα−ｍＩｇの結合
以前に、免疫グロブリン(Ｉｇ)融合アプローチはＣＤ６リガンドを発現する細
胞を同定するのに使用していた（ウィー(Wee)らによる、細胞免疫学(Cell.Immun
ol.)158:353-364）。該研究により、ＡＬＣＡＭ(ボーエン(Bowen)らによる、J．
Exp．Med．181:2213-2220)と称されるＣＤ６リガンドをコードするｃＤＮＡを単
離することができた。本同一のアプローチを用いて、ＣＤ６の膜近位ＳＲＣＲド
メインのみを含有したＩｇ融合タンパク質、ＣＤ６Ｄ３−ＩｇがＡＬＣＡＭに結
合可能であることが分かった（ホワイトニー(Whitney)らによる(1995)、J．Biol
．Chem．270:18187-18180）。本同一のアプローチを本明細書中でＳｐα受容体
を発現するタンパク質を同定するのに使用した。
完全鎖Ｓｐα−ｍＩｇ融合タンパク質（図４Ａ）を、ＣＯＳ細胞中で一時的に
発現させることで産生し、および共有結合ホモ二量体として発現させた（図４Ｂ
）。
Ｓｐα−ｍＩｇ融合タンパク質のヒト細胞系に結合する能力を組織的に調べる
ために、フローサイトメトリーを使用した。Ｓｐα−ｍＩｇに結合し、コントロ
ールタンパク質（このものは、ウシＷＣ１におけるアミノ末端の３個のＳＲＣＲ
ドメインを含有）に結合していない骨髄腫細胞系Ｋ−５６２を、マウスＩｇＧ２
ａ、ＷＣ１−ｍＩｇの同一の定常ドメインに融合させる。Ｓｐα−ｍＩｇの結合
をまたリンパ腫Ｂ細胞系ＲａｊｉおよびＴ細胞系Ｈｕｔ７８上で観察した。ＷＥ
１−ｍＩｇ以外の該Ｓｐα−ｍＩｇ融合タンパク質を末梢性血球単核細胞（ＰＢ
ＭＣ）に結合させた。エルトリエーションしたＢ細胞のみならずエルトリエーシ
ョンした末梢性血球Ｔ細胞上でも、Ｓｐα−ｍＩｇの結合はみられなかった。Ｓ
ｐα−ｍＩｇの異なる供与体由来のエルトリエーションした単球に対する結合は
常に検出可能であるが、ある程度の変異性を示す。
実施例４
抗−Ｓｐαモノクローナル抗体の製造
免疫化：年齢６〜８週の雌性バルブシー・マウス（Tagonic，Germantown，NY
）を、マウスＩｇＧ２ａ抗体のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合させ
た完全鎖Ｓｐαからなる精製Ｓｐα−ｍＩｇ融合タンパク質を用いて免疫した。
第１および第２の接種を、Ｒｉｂｉアジュバンド（Ｒ−７３０；Ribi Immuno Ch
em Research，Inc.，Hamilton，MT）中に乳化させたタンパク質を用いて、腹膜
内投与して行なった。細胞融合の３日前に、該マウスに融合タンパク質ＰＢＳ溶
液を血管内投与にて接種した。
ハイブリドーマの生成に関しては、脾臓および同定可能な全リンパ節から収集
した細胞を、レーン(Lane)によるJ．Imnunol．Methods 81:223-228に記載の方法
に従い、Ｘ６３−Ａｆ８.６５骨髄腫細胞を用いて、白血球：骨髄腫細胞(３：１
)の割合で融合した。生成した融合後の細胞懸濁液を、イスコブの改良ダルベッ
コ培地（Ｌ−グルタミン(２ｍＭ)、ペニシリン(１００Ｕ／モル)、ストレプトマ
イシン(１００μｇ／ｍｌ)(全てＧＩＢＣＯ製)、１０％胎児仔ウシ血清、１
０％ハイブリドーマ・クローニング因子（BM-Condimed H1；Boehringer-Mannhei
m，Indianapolis，IN）およびハイブリドーマ用選択剤としてのＨＡＴ(ＧＩＢＣ
Ｏ)を捕捉）からなる９６−ウェル培地プレート（コスター(Costar)）中にシー
ドした。
マスターウェルスクリーン：Ｓｐαに対する抗体に関して正のマスターウェル
を、エライザアッセイを用いてスクリーニングを行なった。該アッセイで用いた
組換えＳｐαタンパク質組成物を以下に示し、該中、Ｄ１、Ｄ２およびＤ３は図
１に示す通りＳＲＣＲドメインを表す。該フラッグ・テイル（flag tail）は該
Ｓｐαタンパク質のＣ−末端部に位置する長さ：８個のアミノ酸のペプチド(コ
ダック(Kodak))である。組換えタンパク質はＣＯＳ細胞中での一時的な発現によ
って産生し（例えば、アルフオらによる(1990)、Cell 61:1303-1313を参照）、
タンパク質−Ａカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。細菌アルカリ性ホ
スファターゼ（ＢＡＰ）コントロールタンパク質（コダック番号、ＩＢ13201）
を負のコントロールとして使用した。マスターウェルを完全鎖Ｓｐα組成物のみ
を用いてスクリーニングを行なった。次いで、抗−Ｓｐα−正マスターウェルを
、下記のドメインに特異的なＳｐα組成物を用いてドメイン特異性について再ス
クリーニングを行なった。
ドメインに特異的なＳｐα−フラッグ組成物
エライザアッセイ：Ｓｐα−フラッグ（ＰＢＳ中で希釈）（３００ｎｇ／ｍｌ
）の１００μｌ／ウェルをミクロタイター・プレート（微量定量プレート）中に
加え、４℃で終夜インキュベートした。次いで、該プレートを洗浄用緩衝液（０
.０５％ツイーンを含有したＰＢＳ）を用いて２回洗浄した。検体希釈剤（ジェ
ネティック・システムズ・インコーポレイティッド）を各ウェルに加え、該プレ
ートを室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄用緩衝液で２回洗浄した。マ
スターウェル上積み液（１００μｌ／ウェル）を各ウェルに加え、該プレートを
室温で１時間インキュベートした。上記に記載の通り２回洗浄後、１／５０００
に希釈したヤギ−抗−マウスＩｇＧ−ホース・ラッディシュ・ペルオキシダーゼ
（バイオソース4404）(１００μｌ)を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベ
ートした。該プレートを再度、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。各ウェルに、１／
１００に希釈した色素原試薬（１００μｌ）(ジェネティック・システムズ・イ
ンコーポレイティッド)を加えた。着色が現れた後、１.０Ｎ Ｈ2ＳＯ4(５０μ
ｌ)を加え、該プレートをエライザ読み取り機を用いて４５０ｎｍおよび６３０
ｎｍで走査した。
該エライザスクリーンにより、抗−Ｓｐα抗体に関して正の１７３マスターウ
ェルを得た。全１７３正ウェルについてＳｐαドメイン特異性に関してエライザ
法によってスクリーニングを行なった。
モノクローナルマウス抗体を限界希釈によって、マスターウェルからクローン
化した。Ｓｐαに対してクローン化した抗体を表１に示す。
本発明を実施する際に有用な菌株の寄託
以下の菌株の生物学的に純粋な培養菌株の寄託を、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland）を用い
て、ブタベスト条約の規定の下に行なった。生存可能性を十分に試験後、示され
た相続数を分譲し、必要な金額を払った。該指示された寄託は寄託日から３０年
間、または最終の寄託要請後５年間維持されるが、どちらも長い。培養菌が生存
し得なくなるか、不注意にこわされるか、プラスミドを含有する菌株において、
該プラスミドが失われた場合には、分類上同一の生存培養菌で交換する。寄託さ
れたハイブリドーマ細胞系の社会へのアベイラビリティー上でのあらゆる制限が
本特許が付与される際、取返しのつかないぐらい除かれる。
雑多な配列決定の間違いのため、本出願において提出される配列と該寄託プラ
スミド中の関心ある遺伝子配列の間に矛盾が存在する場合、該寄託プラスミドに
おける配列をコントロールする。
従って、新規なＳＲＣＲドメインを含有するポリペプチドを開示する。主題の
本発明における好ましい実施態様については詳細に記載するが、添付した請求の
範囲によって定義する通り、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、明
白な変更を行なうことが可能であると理解する。
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｐ 35/00
// Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ａ６１Ｐ 19/02 5/00 Ｂ
35/00 Ａ６１Ｋ 37/02
(72)発明者 アルフォ，アレハンドロ・エイ
アメリカ合衆国08502ニュージャージー州
ベル・ミード、チェストン・コート33番