JP5581493B2 - 動脈硬化性疾患の検出用バイオマーカーおよび動脈硬化性疾患の検査方法 - Google Patents
動脈硬化性疾患の検出用バイオマーカーおよび動脈硬化性疾患の検査方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、動脈硬化性疾患の検出用バイオマーカーおよび動脈硬化性疾患の検査方法に関する。より詳しくは、動脈硬化性疾患の早期診断・進展予防の確認を可能とする動脈硬化性疾患の検出用バイオマーカーに関し、さらには当該バイオマーカーを検出または定量することを特徴とする動脈硬化性疾患の検査方法に関する。
動脈硬化が原因で発症する各種疾患、例えば、心臓または脳の血管狭窄で発症する虚血性心疾患や脳梗塞は、日本における死因の約３０％を占めており、動脈硬化性血管病の予防・診断・治療法の確立は、国民の健康推進活動において極めて重要な課題である。特に２１世紀の医療目標は、オーダーメード予防医学である。
動脈硬化の発症には、内皮細胞の障害と酸化ＬＤＬ（低比重リポ蛋白）等の異常リポ蛋白粒子が関与するが、ＬＤＬに対する低下療法の治療効果は約３０％程度であり、他の動脈硬化への危険因子に対するアプローチが必要とされている。生活習慣病である高血圧、糖尿病や高トリグリセリド血症等が合併した病態（メタボリックシンドローム）が最近話題となっており、この病態が動脈硬化性心血管病への危険因子となり、治療対象となっている。高トリグリセリド血症の持続により、トリグリセリド（ＴＧ）とコレステロールエステル（ＣＥ）に富む、動脈硬化惹起性リポ蛋白の蓄積が認められる。
動脈硬化は無症状で進展し、冠動脈壁の内膜等に単球由来のマクロファージが侵入し、このマクロファージは動脈硬化惹起性リポ蛋白を取込み、細胞内にＣＥを異常蓄積して泡沫細胞になり、粥状動脈硬化巣を形成することが病理学的に確認されている。動脈硬化の進展による破綻と血栓形成で急激な血管障害が生じ、急性心筋梗塞等が発症し、死に至る場合がある。
動脈硬化性疾患の診断は、脈派伝導速度（ＰＷＶ）測定、頚動脈エコーによる内膜肥厚測定、造影剤を用いる心臓カテーテル検査やＭＤ−ＣＴ（ｍｕｌｔｉ-ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）法の画像検査にて行われ、冠動脈の狭窄度が評価されている。また、炎症マーカーＣＲＰ（Ｃ-ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）（非特許文献１）や可溶性ＬＯＸ−１（Ｌｅｃｔｉｎ-ｌｉｋｅ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ-１）（非特許文献２）の血中濃度測定により、心血管イベントとの関連研究も行われている。しかしながら、これらの診断方法は、いずれも動脈硬化性疾患の初期病変の検出には困難性を伴う。
リポ蛋白リパーゼ（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐａｓｅ：ＬＰＬ、以下単に「ＬＰＬ」ともいう。）は、脂肪組織などで合成・分泌され、毛細血管の血管内皮細胞表面に存在すると考えられている。ＬＰＬは、アポ蛋白Ｃ-ＩＩを賦活因子として、循環血液中のリポ蛋白粒子内のＴＧを分解し、遊離脂肪酸を生成する働きをしている。生じた遊離脂肪酸は、それを必要とする細胞内に取り込まれる。脂肪細胞では、ＬＰＬにより分解されて取り込まれた遊離脂肪酸は、アシル-ＣｏＡを経て中性脂肪であるＴＧに再合成され、貯蔵される。
ＬＰＬは粥状動脈硬化巣の形成に関与する単球由来のマクロファージにおいても合成・分泌されている。
ＬＰＬ遺伝子の欠損ヘテロ接合体は、動脈硬化惹起性高ＴＧ血症の遺伝素因として考えられる。ＬＰＬ欠損症は常染色体劣性遺伝形式で遺伝するが、ホモ接合体者は１００万人に１人、ヘテロ接合体者は５００人に１人といわれている。血中のＴＧの標準値は５０−１５０ｍｇ／ｄｌであるが、ヘテロ接合体者は、粗悪な生活習慣の要因も加わることで、１５０−８００ｍｇ／ｄｌ程度の高ＴＧ血症になる（非特許文献３）。高ＴＧ血症状態は、動脈硬化の危険因子となることが報告されている。一方、ホモ接合体者は正常上限値の１０倍以上の高ＴＧ血症となり、膵炎を発症し、死に至る場合がある（非特許文献４）。
ヒトＬＰＬはＬＰＬ遺伝子のエキソン１から９の翻訳領域から作られ（図１Ａ参照）、その構造は公知であり、例えばGenBank Accession No. NP_000228に登録されているものは、アミノ酸残基数４７５個からなる前駆体ＬＰＬ蛋白の配列である。これは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸残基数２７個のシグナルペプチドとアミノ酸残基数４４８個の成熟ＬＰＬからなるものである（図１Ｂ参照）。ヒト膵臓由来の膵リパーゼが結晶化され、３次元構造が決定されている（非特許文献５）。この構造を基に、ヒトＬＰＬは２つのドメイン（Ｎ末部位とＣ末部位）がβシートで繋がっていると推定されている（図１Ｃ参照）。ヒトＬＰＬのＮ末部位のアスパラギン残基４３およびＣ末部位のアスパラギン残基３５９が糖鎖付加部位であることが報告されているが、特定の糖鎖を認識できるレクチンによる解析や糖鎖構造解析等は、行われていない（図１Ｃ参照）（非特許文献６）。ヒトＬＰＬのＣ末部位、３１３−４４８番目までのアミノ酸からなるフラグメント（１３６アミノ酸残基）は遺伝子組換え技術により大腸菌において糖鎖を含まない蛋白として人工合成されている（非特許文献７）。この人工合成したＬＰＬのＣ末部位（３１３−４４８）は、ＬＤＬレセプター関連蛋白（ＬＲＰ）およびＴＧに富むリポ蛋白に結合する部位を含み、リポ蛋白の細胞内への取込みに関与している。更に、人工合成したＬＰＬのＣ末部位のＬＲＰ結合に必要な部位が、３７８−４２３番目までのアミノ酸からなる領域との報告がある（非特許文献８）。
ヒトの冠動脈の動脈硬化巣において、ＴＧに富むリポ蛋白である超低比重リポ蛋白やＬＤＬの主要構成蛋白であるアポ蛋白Ｂ-１００およびＬＰＬが免疫組織化学的に検出されている（非特許文献９）。マウスの実験において、マクロファージに特異的に発現させたヒトＬＰＬが動脈硬化を促進することが報告されている（非特許文献１０）。しかしながら、動脈硬化とそれに結びつくＬＰＬの構造との関係については、いかなる種においても、未だ解明されていない。
Circulation; 109; 2818-2825 (2004) Circulation; 112; 812-818 (2005) Progress in Medicine;15; 2343-2357 (1995) The metabolic and molecular bases of inherited disease, McGraw-Hill, New York, pp. 2789-2816 (2001) Nature; 343; 771-774 (1990) J Lipid Research; 35; 1511-1523 (1994) J Biological Chemistry; 269; 8653-8658 (1994) J Biological Chemistry; 269; 31747-31755 (1994) J Biological Chemistry; 275; 5694-5701 (2000) Arterioscler Thromb Vasc Biol.; 21; 1809-1815 (2001)
Circulation; 109; 2818-2825 (2004) Circulation; 112; 812-818 (2005) Progress in Medicine;15; 2343-2357 (1995) The metabolic and molecular bases of inherited disease, McGraw-Hill, New York, pp. 2789-2816 (2001) Nature; 343; 771-774 (1990) J Lipid Research; 35; 1511-1523 (1994) J Biological Chemistry; 269; 8653-8658 (1994) J Biological Chemistry; 269; 31747-31755 (1994) J Biological Chemistry; 275; 5694-5701 (2000) Arterioscler Thromb Vasc Biol.; 21; 1809-1815 (2001)
本発明は、動脈硬化性疾患の発症・進展の診断、さらには当該疾患に対する治療効果や予防・治療薬の薬効などの評価を行うことができる動脈硬化性疾患検出用バイオマーカーを提供することを課題とし、さらには当該バイオマーカーを検査することを特徴とする動脈硬化性疾患の検査方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、ヒト血液中にＬＰＬ蛋白のＣ末部分である２０ｋＤａと２１ｋＤａの分子が存在することを見出し、これら２種類の分子の違いは、主にＬＰＬ蛋白部分に結合している糖鎖に由来することを明らかにした。これらの２種の分子をバイオマーカーとして、検出または定量することにより動脈硬化性疾患を検査しうることを発案し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．リポ蛋白リパーゼのＣ末部分からなる動脈硬化性疾患の検出用バイオマーカー。
２．リポ蛋白リパーゼのＣ末部分が、リポ蛋白リパーゼのうち、Ｃ末端から数えて１４２番目までのアミノ酸部分からなる前項１に記載のバイオマーカー。
３．シグナルペプチド部分を含まない成熟リポ蛋白リパーゼを構成する全アミノ酸残基数４４８個のアミノ酸配列のうち、そのＮ末端から数えて３０７−４４８番目までのアミノ酸部分からなる前項１または２に記載のバイオマーカー。
４．バイオマーカーのアミノ酸配列が、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列、または前記配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、１〜複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加および／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなる前項１〜３のいずれか１に記載のバイオマーカー。
５．分子サイズが２０ｋＤａまたは２１ｋＤａである、前項１〜４のいずれか１に記載のバイオマーカー。
６．分子サイズが２０ｋＤａのバイオマーカーのアミノ酸配列の５番目および／または１０番目に位置するチロシン残基が、修飾されているチロシン残基であることを特徴とする、前項５に記載のバイオマーカー。
７．生体から生体検体を分離し、当該分離した生体検体について前項１〜６のいずれか１に記載のバイオマーカーを検出または定量することを特徴とする動脈硬化性疾患の検査方法。
８．バイオマーカーの検出または定量を、免疫学的手法および／またはレクチンによる糖鎖検出方法により行う、前項７に記載の検査方法。
９．生体検体が、血液である、前項７または８に記載の検査方法。
１０．抗リポ蛋白リパーゼ抗体またはレクチンを含む、前項７〜９のいずれか１に記載の検査方法に用いる検査用試薬。
１１．前記抗リポ蛋白リパーゼ抗体は、リポ蛋白リパーゼのＣ末部分を認識しうる抗体であり、前記レクチンは、リポ蛋白リパーゼのＣ末部分の糖鎖を認識しうるレクチンである、前項１０に記載の検査用試薬。
１．リポ蛋白リパーゼのＣ末部分からなる動脈硬化性疾患の検出用バイオマーカー。
２．リポ蛋白リパーゼのＣ末部分が、リポ蛋白リパーゼのうち、Ｃ末端から数えて１４２番目までのアミノ酸部分からなる前項１に記載のバイオマーカー。
３．シグナルペプチド部分を含まない成熟リポ蛋白リパーゼを構成する全アミノ酸残基数４４８個のアミノ酸配列のうち、そのＮ末端から数えて３０７−４４８番目までのアミノ酸部分からなる前項１または２に記載のバイオマーカー。
４．バイオマーカーのアミノ酸配列が、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列、または前記配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、１〜複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加および／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなる前項１〜３のいずれか１に記載のバイオマーカー。
５．分子サイズが２０ｋＤａまたは２１ｋＤａである、前項１〜４のいずれか１に記載のバイオマーカー。
６．分子サイズが２０ｋＤａのバイオマーカーのアミノ酸配列の５番目および／または１０番目に位置するチロシン残基が、修飾されているチロシン残基であることを特徴とする、前項５に記載のバイオマーカー。
７．生体から生体検体を分離し、当該分離した生体検体について前項１〜６のいずれか１に記載のバイオマーカーを検出または定量することを特徴とする動脈硬化性疾患の検査方法。
８．バイオマーカーの検出または定量を、免疫学的手法および／またはレクチンによる糖鎖検出方法により行う、前項７に記載の検査方法。
９．生体検体が、血液である、前項７または８に記載の検査方法。
１０．抗リポ蛋白リパーゼ抗体またはレクチンを含む、前項７〜９のいずれか１に記載の検査方法に用いる検査用試薬。
１１．前記抗リポ蛋白リパーゼ抗体は、リポ蛋白リパーゼのＣ末部分を認識しうる抗体であり、前記レクチンは、リポ蛋白リパーゼのＣ末部分の糖鎖を認識しうるレクチンである、前項１０に記載の検査用試薬。
本発明のＬＰＬのＣ末部分からなる動脈硬化性疾患の検査用バイオマーカー、具体的には、主に糖鎖の違いによる２０ｋＤａと２１ｋＤａの２種類の分子サイズを有するアミノ酸部分からなるバイオマーカー（ＬＰＬ２０とＬＰＬ２１）は、生体検体、具体的には血液中に検出され、動脈硬化性疾患を検出可能である。当該バイオマーカーの検出または定量により、簡便に、動脈硬化性疾患の発症・進展の診断、さらには当該疾患に対する治療効果や予防・治療薬の薬効などの評価を行うことができる。
本発明において、動脈硬化性疾患とは、動脈硬化に起因するあらゆる疾患をいう。動脈硬化は、動脈硬化の発生態様や発生部位によりアテローム（粥状）硬化、細動脈硬化、メンケルベルグ型（中膜）硬化などのタイプに分類される。本発明における動脈硬化は特に限定されないが、特に好適にはアテローム（粥状）硬化に起因するものが挙げられる。動脈硬化性疾患として、例えば動脈硬化そのものも含まれ、さらには動脈硬化に起因する心臓または脳の血管狭窄で発症する心筋梗塞や狭心症などの虚血性心疾患や脳梗塞、脳出血、その他大動脈瘤、大動脈解離、腎動脈での腎硬化症やそれによる腎不全、末梢動脈での閉塞性動脈硬化症などが例示される。
本発明の動脈硬化性疾患の検出用バイオマーカーは、これらの疾患の発症に直結するバイオマーカーであり、ＬＰＬのＣ末部分からなる（図１と図２参照）。ここにおいて、ＬＰＬのＣ末部分は、全アミノ酸残基数４４８個からなる成熟ＬＰＬのアミノ酸配列のＣ末端から数えて１４２番目までのアミノ酸部分をいい、より具体的には成熟ＬＰＬのＮ末端から数えて３０７−４４８番目までのアミノ酸部分をいう（図１と図２参照）。
本発明のバイオマーカーは、成熟ＬＰＬのＮ末端から数えて３０７−４４８番目までのアミノ酸部分からなる。本発明のバイオマーカーは、２種類の分子サイズのものに分類され、分子サイズ２０ｋＤａのバイオマーカーおよび分子サイズ２１ｋＤａのバイオマーカーが挙げられる。以下、本明細書において、分子サイズが２０ｋＤａのバイオマーカーを「ＬＰＬ２０」といい、分子サイズが２１ｋＤａのバイオマーカーを「ＬＰＬ２１」ということとする（図３および図４参照）。ＬＰＬ２０およびＬＰＬ２１は、脂肪細胞や単球由来マクロファージ由来のＬＰＬのＣ末部分からなる。
ＬＰＬ２０とＬＰＬ２１を、Ｎ-Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ Ｆにより糖鎖切断を行うと、両者は同一の分子サイズ１８ｋＤａになる。このことから、両者の分子サイズ１ｋＤａの違いは、主としてＬＰＬ蛋白部分に結合している糖鎖の違いによるものであることが示唆される。また、糖鎖の違いのほか、ＬＰＬ２０は、その配列の５番目および／または１０番目に位置するチロシン残基が、何らかの物質により修飾されていることを特徴とするが、ＬＰＬ２１は、この修飾を受けていない。ここにおいて、何らかの物質により修飾とは、チロシン残基が修飾されうるものであれば良く、特に限定されないが、例えばリン酸基、スルホ基、ニトロ基などによる修飾が考えられる。
本発明において、全アミノ酸残基数４４８個からなる成熟ＬＰＬのアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示す配列の１−４４８番目までの配列として表すことができ（図１Ｂ参照）、成熟ＬＰＬのＮ末端から数えて３０７−４４８番目までのアミノ酸部分は、配列表の配列番号３（図２参照）に示す配列で表すことができる。本発明のバイオマーカーは、動脈硬化性疾患を検出可能であれば、上記アミノ酸配列のうち、１〜複数個、具体的には１〜５個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加および／若しくは挿入された変異のある配列であっても差し支えない。この場合において、上記の成熟ＬＰＬのＮ末端から数えて３０７−４４８番目までに示されるアミノ酸配列、または配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列の、５番目および／または１０番目に該当する位置のアミノ酸残基がチロシン残基であり、修飾されているか、または修飾されていないチロシン残基であることを要する。
本発明は、動脈硬化性疾患の検査方法にも及ぶ。動脈硬化性疾患の検査方法は、生体から生体検体を分離し、その生体検体中に存在する、本発明の動脈硬化性疾患の検出用バイオマーカーを検出または定量することを特徴とする。当該バイオマーカーの検出または定量は、ＬＰＬ２０とＬＰＬ２１を認識できる免疫学的手法および／またはレクチンによる糖鎖検出方法によることができる。
ここにおいて、免疫学的な手法とは、特に限定されないが、ＬＰＬに特異的な抗ＬＰＬ抗体を用いた手法とすることができる。抗ＬＰＬ抗体の抗原認識部位は、検査方法により適宜決定することができる。例えば、ウェスタンブロッティングによる検査の場合は、認識すべきバイオマーカーの分子サイズと免疫学的特異性を基に判断するので、ＬＰＬに特異的な抗体であれば良く、特定な部位を認識する点については特に限定されないが、特に好適にはＬＰＬのＣ末部分を認識しうる抗体が挙げられる。ウェスタンブロッティングで検出する場合のバイオマーカーの定量は、検出されたバンドの濃度・面積などを算出することにより行うことができる。他の免疫学的手法としては、特異抗体を用いたサンドイッチ酵素標識抗体法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay：ＥＬＩＳＡ）や免疫クロマトグラフィー法などを挙げることができる。
また、レクチンによる糖鎖検出方法に使用されるレクチンついても、検査方法により適宜決定することができる。例えば認識すべきバイオマーカーの分子サイズと糖鎖反応性をもとに判断する場合は、ＬＰＬの糖鎖を認識するレクチンであればよい。特に好適には、ＬＰＬのＣ末部分の糖鎖を認識しうるレクチンが挙げられ、具体的にはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）などが挙げられる。
本発明の検査方法に付される被験者由来の生体検体は、特に限定されないが、生体への侵襲が少ないものであることが好ましく、例えば、血液、血清、血漿、唾液、精液、粘膜、涙、尿などの人から分泌されるものや、生検から採取されるものが挙げられる。好適には、血液、血清、血漿を挙げることができる。例えば血液中のＬＰＬ２０とＬＰＬ２１をバイオマーカーとして検出または定量することにより、動脈硬化性疾患の初期病変を検出することができる。さらに、バイオマーカーを定量し、測定値の変動を確認することで、簡便に、動脈硬化性疾患の発症・進展についての検査を行うことができ、さらには当該疾患に対する治療効果や予防・治療薬の薬効などの評価を行うことができる。
本発明は、上記検査方法に使用しうる動脈硬化性疾患の検査用試薬にもおよび、具体的には抗ＬＰＬ抗体および／またはＬＰＬの糖鎖を認識できるレクチンを含む検査用試薬にもおよぶ。免疫学的手法に使用される抗ＬＰＬ抗体は、自体公知の方法により作製することができる。感度よく定量する場合には、抗ＬＰＬ抗体の特異性を上げることが望ましく、例えばＬＰＬのＣ末部分を認識しうる抗体とするのが好適である。また、レクチンによる糖鎖検出方法の場合は、レクチンの特異性を上げることが望ましく、例えばＬＰＬのＣ末部分を認識しうるレクチンを用いることが好適である。さらには、ＬＰＬ２０とＬＰＬ２１の識別が可能な抗体および／またはレクチンを用いるのがより好適である。本発明は、このような抗体またはレクチンを含む試薬にも及び、さらにはこのような試薬を含む動脈硬化性疾患の検査用キットにも及ぶ。
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の理解を深めるために具体例を示して説明するものであり、特許請求の範囲を限定するものではないことは明らかである。
（実施例１）ウェスタンブロッティング−抗体染色法によるバイオマーカーの検出
生体検体として、ヒト血液を採取し、ウェスタンブロッティング−抗体染色法により血液中のバイオマーカーを確認した。
生体検体として、ヒト血液を採取し、ウェスタンブロッティング−抗体染色法により血液中のバイオマーカーを確認した。
１）血液検体の処理
ヒトから血液検体を４０ｍｌ採血し、血清または血漿を２０ｍｌ得た。ＬＰＬのＣ末部位を特異的に認識するマウス抗ヒトＬＰＬモノクローナル抗体（Ｂ４Ｄ４）を結合させたアガロース樹脂（樹脂１ｍｌあたりモノクローナル抗体、１．９ｍｇが結合している）、０．６ｍｌをカラムに充填した。この作製したマウス抗ヒトＬＰＬモノクローナル抗体アフィニティーカラムに、上記血清を通し、リン酸緩衝液でカラムに結合しない蛋白等を洗い流し、カラムに結合した蛋白（特異的にＬＰＬ蛋白が結合している）を酸性溶液で溶出して、濃縮したＬＰＬを含む試料を調製した（図３参照）。マウス抗ヒトＬＰＬモノクローナル抗体（Ｂ４Ｄ４）は、特公平６−２０７５号公報（特許第１８７９３４６号）に記載のものを使用した。
ヒトから血液検体を４０ｍｌ採血し、血清または血漿を２０ｍｌ得た。ＬＰＬのＣ末部位を特異的に認識するマウス抗ヒトＬＰＬモノクローナル抗体（Ｂ４Ｄ４）を結合させたアガロース樹脂（樹脂１ｍｌあたりモノクローナル抗体、１．９ｍｇが結合している）、０．６ｍｌをカラムに充填した。この作製したマウス抗ヒトＬＰＬモノクローナル抗体アフィニティーカラムに、上記血清を通し、リン酸緩衝液でカラムに結合しない蛋白等を洗い流し、カラムに結合した蛋白（特異的にＬＰＬ蛋白が結合している）を酸性溶液で溶出して、濃縮したＬＰＬを含む試料を調製した（図３参照）。マウス抗ヒトＬＰＬモノクローナル抗体（Ｂ４Ｄ４）は、特公平６−２０７５号公報（特許第１８７９３４６号）に記載のものを使用した。
２）ウェスタンブロッティング−抗体染色法
調製した上記試料を、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、ゲル内の蛋白等をニトロセルロース膜に電気的に転写させた。転写後のニトロセルロース膜に存在するＬＰＬ蛋白をＬＰＬのＣ末部位を特異的に認識する特異的なＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識マウス抗ヒトＬＰＬモノクローナル抗体（Ｄ２Ｂ２）と反応させた。反応後の膜をＨＲＰ酵素に対する化学発光検出試薬（ＥＣＬ ｐｌｕｓ(R)）と反応させ、化学発光量をルミノ・イメージアナライザー（ＬＡＳ-１０００(R)）により解析し、ＬＰＬ蛋白を検出・定量した（図３参照）。
調製した上記試料を、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、ゲル内の蛋白等をニトロセルロース膜に電気的に転写させた。転写後のニトロセルロース膜に存在するＬＰＬ蛋白をＬＰＬのＣ末部位を特異的に認識する特異的なＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識マウス抗ヒトＬＰＬモノクローナル抗体（Ｄ２Ｂ２）と反応させた。反応後の膜をＨＲＰ酵素に対する化学発光検出試薬（ＥＣＬ ｐｌｕｓ(R)）と反応させ、化学発光量をルミノ・イメージアナライザー（ＬＡＳ-１０００(R)）により解析し、ＬＰＬ蛋白を検出・定量した（図３参照）。
ウェスタンブロッティング−抗体染色法の結果を図４に示した。上記試料のブロッティング結果により、２０ｋＤａおよび２１ｋＤａの位置にバイオマーカーとしてのＬＰＬ２０とＬＰＬ２１バンドが検出された。脂質水解活性を有するＬＰＬ分子は、分子サイズ約６１ｋＤａの蛋白質であるが、Ｎ末部位とＣ末部位の間で、蛋白分解酵素により分解されて、Ｎ末部位とＣ末部位になる。ブロッティング結果により検出されたＬＰＬ２０とＬＰＬ２１のバンドは、ＬＰＬのＣ末部位を特異的に認識するモノクローナル抗体により検出されているので、ＬＰＬのＣ末部位に由来するものである。ＬＰＬ２０とＬＰＬ２１の分子サイズの差は、主として、ＬＰＬ蛋白部分に結合している糖鎖の違いによるものである。
（実施例２）ウェスタンブロッティング−レクチン染色法によるバイオマーカーの検出
生体検体として、ヒト血液を採取し、レクチンによる糖鎖検出法により血液中のバイオマーカーを確認した。
生体検体として、ヒト血液を採取し、レクチンによる糖鎖検出法により血液中のバイオマーカーを確認した。
１）血液検体の処理
実施例１と同手法により処理し、試料を調製した。
実施例１と同手法により処理し、試料を調製した。
２）ウェスタンブロッティング−レクチン染色法
調製した上記試料を、実施例１と同手法により、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、ゲル内の蛋白等をニトロセルロース膜に電気的に転写させた。転写後のニトロセルロース膜に存在するＬＰＬ蛋白を、ＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）標識レクチン（コンカナバリンＡ；ＣｏｎＡ）と反応させた。反応後の膜をＡＬＰ酵素に対する発色試薬であるＢＣＩＰ／ＮＢＴと反応させ、色素発色量をルミノ・イメージアナライザー（ＬＡＳ-１０００(R)）により解析し、ＬＰＬ蛋白を検出・定量した（図３参照）。
調製した上記試料を、実施例１と同手法により、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、ゲル内の蛋白等をニトロセルロース膜に電気的に転写させた。転写後のニトロセルロース膜に存在するＬＰＬ蛋白を、ＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）標識レクチン（コンカナバリンＡ；ＣｏｎＡ）と反応させた。反応後の膜をＡＬＰ酵素に対する発色試薬であるＢＣＩＰ／ＮＢＴと反応させ、色素発色量をルミノ・イメージアナライザー（ＬＡＳ-１０００(R)）により解析し、ＬＰＬ蛋白を検出・定量した（図３参照）。
ウェスタンブロッティング−レクチン染色法の結果を図４に示した。レクチン（ＣｏｎＡ）によっても、実施例１の抗ＬＰＬ抗体によって検出されたＬＰＬ２０とＬＰＬ２１蛋白と同様に、２０ｋＤａおよび２１ｋＤａの位置にバイオマーカーとしてのバンドが検出された。
（実施例３）ＬＰＬ２０およびＬＰＬ２１の解析
実施例１で検出されたバイオマーカーについて、Ｐｒｏｃｉｓｅ(R)（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた自動化エドマン反応により、Ｎ末端からのプロテインシーケンシングシステム解析を行った。その結果、これらのバイオマーカーのアミノ酸配列は、両者同一であり、全アミノ酸残基数４４８個からなる成熟ＬＰＬのアミノ酸配列（配列番号２）のうち、Ｎ末端から数えて３０７−４４８番目までのアミノ酸部分（配列番号３）であることが確認された。得られた配列についてさらに解析を行った結果、ＬＰＬ２０については、そのＮ末端から数えて３１１番目と３１６番目（すなわち、ＬＰＬ２０バイオマーカー蛋白のＮ末端から数えて５番目および１０番目）のチロシン残基が、何らかの修飾を受けていることが示唆された（図２）。
実施例１で検出されたバイオマーカーについて、Ｐｒｏｃｉｓｅ(R)（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた自動化エドマン反応により、Ｎ末端からのプロテインシーケンシングシステム解析を行った。その結果、これらのバイオマーカーのアミノ酸配列は、両者同一であり、全アミノ酸残基数４４８個からなる成熟ＬＰＬのアミノ酸配列（配列番号２）のうち、Ｎ末端から数えて３０７−４４８番目までのアミノ酸部分（配列番号３）であることが確認された。得られた配列についてさらに解析を行った結果、ＬＰＬ２０については、そのＮ末端から数えて３１１番目と３１６番目（すなわち、ＬＰＬ２０バイオマーカー蛋白のＮ末端から数えて５番目および１０番目）のチロシン残基が、何らかの修飾を受けていることが示唆された（図２）。
（実施例４）健常者および動脈硬化既往歴を有する者からのＬＰＬ２０とＬＰＬ２１バイオマーカーの解析
生体検体として、健常者２名（１、２）および動脈硬化既往歴を有する者２名（３、４）から血液を採取し、ウェスタンブロッティング−抗体染色法によりバイオマーカーを確認した。血液検体の処理およびウェスタンブロッティングは、実施例１と同手法により行った。
生体検体として、健常者２名（１、２）および動脈硬化既往歴を有する者２名（３、４）から血液を採取し、ウェスタンブロッティング−抗体染色法によりバイオマーカーを確認した。血液検体の処理およびウェスタンブロッティングは、実施例１と同手法により行った。
その結果を図５に示した。全ての試料より２１ｋＤａに位置するＬＰＬ２１を検出し、健常者、既往歴者のいずれにも存在することを認めたが、２０ｋＤａに位置するＬＰＬ２０については、既往歴者については明らかに検出されたが、健常者には検出されないか、ごくわずかに検出されたのみであった。これにより、ＬＰＬ２０とＬＰＬ２１の定量比率あるいはＬＰＬ２０の単独定量値が、動脈硬化性疾患の検出用バイオマーカーとなりうることが示唆された。
上記各実施例から得られた結果より、動脈硬化発症の過程におけるＬＰＬ２０とＬＰＬ２１の役割について考察したものを図６と図７に示した。
冠動脈等の内皮細胞障害部位の内膜内に単球由来のマクロファージが侵入し、マクロファージは動脈硬化惹起性リポ蛋白を取込み、細胞内にＣＥを異常蓄積して泡沫細胞になり、粥状動脈硬化初期病変を形成する（図６参照）。マクロファージ細胞は、リポ蛋白のＴＧを水解する分子サイズ６１ｋＤａの成熟ＬＰＬ蛋白（活性中心を含むＮ末部位と基質結合部位を含むＣ末部位からなる）を分泌し、成熟ＬＰＬは動脈硬化惹起性リポ蛋白（ＴＧとＣＥに富む）のＴＧを水解後、蛋白分解酵素で切断され、Ｃ末部位のＬＰＬ２０とＬＰＬ２１蛋白になる。ＬＰＬ２０とＬＰＬ２１蛋白は、動脈硬化惹起性リポ蛋白に結合し、レセプターへのリガンドとなり、動脈硬化惹起性リポ蛋白を細胞内に取込む役割をすると共に一部は循環血中に放出されると考えられる（図６参照）。このＬＰＬ２０とＬＰＬ２１蛋白は、ＬＤＬのマクロファージへの取込みにおいても関与している可能性がある。動脈硬化巣の内膜内に侵入した単球由来マクロファージ細胞の増加に伴い、動脈硬化の発症・進展・破綻に至る。これらすべてのステージにおいて、マクロファージから由来するＬＰＬ２０とＬＰＬ２１蛋白が、動脈硬化性疾患の発症予知（早期診断）・進展度の予測・治療効果の判定に有効な血液検体を用いた生化学的検査法によるバイオマーカーになると期待される（図７参照）。
冠動脈等の内皮細胞障害部位の内膜内に単球由来のマクロファージが侵入し、マクロファージは動脈硬化惹起性リポ蛋白を取込み、細胞内にＣＥを異常蓄積して泡沫細胞になり、粥状動脈硬化初期病変を形成する（図６参照）。マクロファージ細胞は、リポ蛋白のＴＧを水解する分子サイズ６１ｋＤａの成熟ＬＰＬ蛋白（活性中心を含むＮ末部位と基質結合部位を含むＣ末部位からなる）を分泌し、成熟ＬＰＬは動脈硬化惹起性リポ蛋白（ＴＧとＣＥに富む）のＴＧを水解後、蛋白分解酵素で切断され、Ｃ末部位のＬＰＬ２０とＬＰＬ２１蛋白になる。ＬＰＬ２０とＬＰＬ２１蛋白は、動脈硬化惹起性リポ蛋白に結合し、レセプターへのリガンドとなり、動脈硬化惹起性リポ蛋白を細胞内に取込む役割をすると共に一部は循環血中に放出されると考えられる（図６参照）。このＬＰＬ２０とＬＰＬ２１蛋白は、ＬＤＬのマクロファージへの取込みにおいても関与している可能性がある。動脈硬化巣の内膜内に侵入した単球由来マクロファージ細胞の増加に伴い、動脈硬化の発症・進展・破綻に至る。これらすべてのステージにおいて、マクロファージから由来するＬＰＬ２０とＬＰＬ２１蛋白が、動脈硬化性疾患の発症予知（早期診断）・進展度の予測・治療効果の判定に有効な血液検体を用いた生化学的検査法によるバイオマーカーになると期待される（図７参照）。
本発明のバイオマーカーおよび検査方法によれば、患者の血液検体を用いて、非侵襲的に、かつ高精度・高感度に動脈硬化性疾患の発症・進展の診断、さらには当該疾患に対する治療効果や予防・治療薬の薬効などの評価を行うことができる。これにより、従来は動脈硬化性疾患の予測が不可能な場合でも、より早期に予防的処置や早期治療を開始することができる。また、動脈硬化の初期病変のうちに生活習慣改善や薬物療法により、動脈硬化進展の遅延や阻止が可能となる。さらには、それらの処置による動脈硬化の退縮等の状態を、バイオマーカーの検出または定量により確認することができ、生活習慣改善への意欲の活性化につなげることができる。
Claims (7)
- リポ蛋白リパーゼのＣ末部分からなる動脈硬化性疾患の検出用バイオマーカーであって、リポ蛋白リパーゼのＣ末部分が、リポ蛋白リパーゼのうち、Ｃ末端から数えて１４２番目までのアミノ酸部分からなり、分子サイズが２０ｋＤａである、バイオマーカー。
- シグナルペプチド部分を含まない成熟リポ蛋白リパーゼを構成する全アミノ酸残基数４４８個のアミノ酸配列のうち、そのＮ末端から数えて３０７−４４８番目までのアミノ酸部分からなる請求項１に記載のバイオマーカー。
- 前記バイオマーカーのアミノ酸配列が、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列、または前記配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち、１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加および／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、前記バイオマーカーが動脈硬化性疾患を検出可能なものである、請求項１または２に記載のバイオマーカー。
- 前記バイオマーカーのアミノ酸配列の５番目および／または１０番目に位置するチロシン残基が、修飾されているチロシン残基であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１に記載のバイオマーカー。
- 生体から分離された生体検体について請求項１〜４のいずれか１に記載の前記バイオマーカーを検出または定量することを特徴とし、前記バイオマーカーが検出された場合、または、前記バイオマーカーの量が健常者と比較して多く検出された場合に、動脈硬化性疾患であると判定される、動脈硬化性疾患の検出用バイオマーカーの検査方法。
- 前記バイオマーカーの検出または定量を、免疫学的手法および／またはレクチンによる糖鎖検出方法により行う、請求項５に記載の検査方法。
- 生体検体が、血液である、請求項５または６に記載の検査方法。
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