ME01026B - Antitijela specifična za protofibrilni oblik beta-amiloid proteina - Google Patents

Antitijela specifična za protofibrilni oblik beta-amiloid proteina

Info

Publication number
ME01026B
ME01026B MEP-2010-76A MEP7610A ME01026B ME 01026 B ME01026 B ME 01026B ME P7610 A MEP7610 A ME P7610A ME 01026 B ME01026 B ME 01026B
Authority
ME
Montenegro
Prior art keywords
antibody
seq
monoclonal antibody
peptide
affinity
Prior art date
Application number
MEP-2010-76A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jeffrey Ravetch
Hidehiro Fukuyama
Original Assignee
Univ Rockefeller
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Rockefeller filed Critical Univ Rockefeller
Publication of ME01026B publication Critical patent/ME01026B/me

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)

Description

UPUĆIVANJE NA SRODNE PRIMENE
Ova prijava zahteva prioritet u odnosu na prethodne prijave patenata: 60/988, 481 popunjena 16. novembra 2007.; i 61/019, 747 popunjena 8. januara 2008., čiji sadržaji su uključeni navođenjem.
OBLAST PRONALASKA
Predstavljeni pronalazak se odnosi na izolovana antitela koja na određeni način interaguju sa konformacionim epitopima protofibrilnog oblika humanog beta-amiloid peptida. Ova antitela pokazuju minimalni afinitet ili afinitet koji se ne može detektovati prema oblicima beta-amiloid peptida manje molekulske težine. Ovde otkrivena antitela će biti korisna u dijagnozi, lečenju i/ili prevenciji stvaranja naslaga beta-amiloidnog kamenca vezanog s početkom i razvojem Alchajmerove bolesti.
POZADINA PRONALASKA
Beta-Amiloid (Aβ) peptidi se smatraju izazivačem Alchajmerove bolesti (“AD”) preko stvaranja nerastvomih Aβ peptidnih vlakana i taloženjem ovih vlakana se stvaraju amiloidne naslage. Smatra se da stvaranje ovakvih naslaga u delu mozga kritičnim za pamćenje i druge kognitivne funkcije vodi ka demenciji koja je vezana za ovu bolest (vidi Selkoe, 1994, J. Neurapathol. Exp. Neural. 53: 438-447). Beta-Amiloid peptidi se sašto je od grupe peptida dugačkih 39-43 aminokiselina koje su proteolitički obrađeni od amiloid prekurzor proteina (APP),
i od β-sekretaze i od γ-sekretaze na amino- i karboksilnim- krajevima, za svaki posebno.
Pošto je najmanje pet različitih oblika APP-a: 563, 695, 714, 751 i 770 aminokiselina dužine, za svaki posebno (vidi Wirak et al„ 1991 Science 253: 323). Ovi izo- oblici APP-a se generišu naizmeničnim uplitanjem primarnih kopija APP gena. Identifikovane su brojne misens mutacije u porodicama sa autozomno dominantnim nasleđivanjem APP gena u ranom stadijumu Alchajmerove bolesti. Neke mutacije se grupišu blizu mesta cepanja sekretaze i utiču na metabolizam APP-a bilo povećavajući proizvodnju ili udeo Aβ oblika (npr., Aβ42), koji ima tendenciju da bude više fibrilogeničan i da se brže gomila nego drugi oblici. Neuronalna toksičnost može da se nalazi u vlaknima velike molekulske težine koja nastaju gomilanjem rastvorljivih Aβ peptida u nerastvorljivim vlaknima i, kao posledica toga, uključivanjem vlakana u amiloidne naslage. Međuoblik vlakana je oblik protofibrila (PF), oblik Ap peptida velike molekulske težine koji je rastvorljiv in vitro i može da se izoluje kao približno ~670 kDa jezgro. Na taj način, in vitro stvaranje nerastvorljivih vlakana Aβ peptida je krajnji rezultat početne oligomerizacije Aβ peptida pri čemu se stvara strukturno različit, rastvorljiv oblik protofibrila veće molekulske težine. Ove prelazne protofibrilne strukture su prekurzori amiloidnih vlakana odgovornih za ćelijsku disfunkciju i gubitak neurona u Alchajmerovoj bolesti (AD) i druge bolesti gomilanja proteina.
Primenjene su različite metode lečenja u pokušajima da se spreči stvaranje Aβ peptida, na primer, inhibitori radi sprečavanja proteolitičk prerade APP-a. Takođe, upisane su i imunoterapijske strategije kao što je upravljanje anti- Aβ antitelima (da bi se pobudilo raščićavanje amiloidnih naslaga) ili imunizacija sa Aβ peptidnim antigenima (da bi se potpomogao humoralni odgovor), u pokušaju da se smanji veličina naslaga i gustina.
SAD patent br. 7, 179, 463, priznat Lannfelt-u i saradnicima, obelodanjuje metod lečenja Alchajmerove bolesti primenom antitela naraslih nasuprot protofibrila koji se sastoji od Arktičke mutacije u okviru oblasti kodiranja Aβ peptida. U specifikaciji nije prikazano nijedno potvrđivanje primerom naraslih antitela i nijedno poređenje u odnosu na afinitet prema oblicima Aβ peptida male molekulske težine.
SAD patenti br. 6, 761, 888 i 6, 750, 324. priznati Schenk-u i saradnicima, obelodanjuju seriju antitela koja prepoznaju različite epitope duž niza aminokiselina Aβ42. Antitela specifična za N kraj i središnje regione Aβ42 pokazala su efikasnost u smanjivanju naslage i,, ex vivo" i,, in vivo“.
Uprkos sadašnjem znanju u oblasti lečenja i prevencije Alchajmerove bolesti, ostaje potreba za poboljšane sastave i metode lečenja i/ili prevencije ove bolesti. Sastavi i metode prikazanog pronalaska okrenuti su i zadovoljavaju ove potrebe obelodanjujući antitela specifična za protofibrilne oblike Aβ peptida, pri čemu pokazuju najmanji afinitet koji se može otkriti prema oblicima Aβ peptida male molekulske težine. Farmaceutski efikasni sastavi koji obuhvataju takvo antitelo ili antitela će biti korisni u lečenju i/ili prevenciji stvaranja beta-amiloidnih naslaga za koje se zna da su povezane s pojavom i razvojem Alchajmerove bolesti.
KRATAK PREGLED PRONALASKA
Prikazani pronalazak se odnosi na izolovano antitelo koje pokazuje naročito vezivanje za konformacioni epitop protofibrilnog oblika β-amiloid peptida. Monomer divljeg tipa beta-amiloid (AP) peptida je poznat u struci i ovde je prikazan kao SEQ ID NO: 1. Izolovana antitela prikazanog pronalaska imaju afinitet za takve ponovljene konformacione epitope za protofibrilne oblike Aβ peptida veće molekulske težine dok pokazuje minimalni afinitet ili uopšte nema afinitet za druge oblike Aβ peptida, kao što su monomemi ili dimerni oblici Aβ peptida.
Prikazani pronalazak se takođe odnosi na izolovano antitelo koje naročito interaguje sa, i pokazuje merljiv afinitet prema konformacionom epitopu protofibrilnog oblika Aβ peptida, dok je protofibrilni epitop predstavljen izloženom oblašću Aβ-protofibrilnog oblika koji sadrži amino terminalni deo izloženog dela Aβ peptida.
Prikazani pronalazak se dalje odnosi na izolovano antitelo koje naročito interaguje i pokazuje merljiv afinitet prema konformacionom epitopu protofibrilnog oblika Aβ peptida, dok je protofibrilni epitop predstavljen izloženom oblašću Aβ-protofibrilnog oblika koji sadrži aminokiseline 1-20 (SEQ ID NO: 2) izloženog dela Aβ peptida.
Prikazani pronalazak se takođe odnosi na izolovano antitelo koje naročito interaguje i pokazuje merljiv afinitet prema konformacionom epitopu protofibrilnog oblika Aβ peptida, dok je protofibrilni epitop predstavljen izloženom oblašću Aβ-protofibrilnog oblika
koji obuhvata aminokiseline 4-12 i 9-20 (SEQ ID brojevi: 3 i 4, redom) izloženog dela Aβ peptida.
Prikazani pronalazak se delimično odnosi na monoklonalna antitela 13C3, IDI i 19A6, i bilo koji afmitetno zreli oblik 13C3, IDI i 19A6. Prikazani pronalazak se dalje odnosi na antitelo koje oponaša funkcionalnu specifičnost kao što je ovde opisano za 13C3, IDI i 19A6. U tom cilju se prikazani pronalazak takođe odnosi na biološki aktivne fragmente i/ili mutante 13C3, IDI, 19A6 antitela ili antitela slična 13C3-, IDI-, ili 19A6-, uključujući ali ne obavezno ograničavajući se na supstituciju aminokiselina (npr., kao usmereni oblik sazrevanja afiniteta oblasti VH ili VL), oduzimanja, sabiranja, otsecanja amino kraja i karboksilnog kraja, takvih da ove mutacije obezbeđuju osnovu za antitelo ili vezni deo antitela koji za rezultat ima sličnu ili poboljšanu verziju 13C3, IDI, 19A6 veznog proteina antitela ili veznog proteina antitela sličnog 13C3. U jednom oličenju ovog dela pronalaska, VH i VL oblast 13C3 sadrži niz aminokiselina kako je utvrđeno u SEQ ID NO: 7 (VH) i/ili SEQ 1D NO: 5 (VL), redom. Prikazani pronalazak se dalje odnosi na izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži niz nukleotida koji kodira oblasti VH i/ili VLantitela 13C3, IDI ili 19A6; i posebno izolovani molekul nukleinske kiseline (polinukleotid) koji kodira biološki relevantan deo 13C3, afmitetno zrele verzije ili na drugi načina mutiranu verziju 13C3, IDI ili 19A6 antitela. U tom cilju, jedno oličenje prikazanog pronalaska se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji sadrži niz nukleotida koji kodira VH i VLoblast 13C3, kako je utvrđeno u SEQ ID NO: 8
(13C3: V„ oblast) i SEQ ID NO: 6 (13C3: VL oblast), redom.
Prikazani pronalazak se takođe odnosi na izolovana antitela 13C3, IDI ili 19A6 kako je ovde izneto, antitela koja posebno interaguju i pokazuju merljiv afinitet prema konformacionom epitopu protofibrilnog oblika Aβ peptida.
Prikazani pronalazak se takođe odnosi na hibridome sposobne da proizvode monoklonalna antitela prikazanog pronalaska. Određeni hibridomi prikazanog pronalaska uključuju hibridome koji proizvode monoklonalna antitela navedena kao primer, 13C3, 19A6 i IDI, redom.
Prikazani pronalazak se odnosi na farmaceutski efikasne sastave koji sadrže izolovano antitelo kao što je ovde obelodanjeno i u daljem izlaganju definisano: izolovano antitelo koje posebno interaguje i pokazuje merljiv afinitet i sposobnost da se posebno vezuje za ponavljanje konformacionog epitopa protofibrilnog oblika Aβ pri čemu pokazuje minimalni afinitet ili ne pokazuje merljiv afinitet prema oblicima Aβ male molekulske težine. Ovi sastavi mogu opcionoda sadrže jednog ili više nosača, jednog ili više ekscipienata, i/ili jedan ili više hemijskih derivata.
Prikazani pronalazak se takođe odnosi na metode lečenja osoba unesrećenih Alchajmerovom bolešću koje sadrže prepisivanje osobi farmaceutski efikasnog sastava koji sadrži ovde obelodanjeno izolovano antitelo, to jest antitelo koje posebno interaguje i pokazuje merljiv afinitet za ponavljanje konformacionog epitopa protofibrilnog oblika Aβ peptida pri čemu pokazuje minimalni afinitet ili ne pokazuje merljiv afinitet prema oblicima Aβ peptida manje molekulske težine. Ove metode će obezbediti terapeutsku intervenciju tako da
se smanji količina amiloidnih naslaga u mozgu osobe obolele od Alchajmerove bolesti. Određena oličenja ovog dela prikazanog pronalaska se odnose na metode lečenja osoba obolelih od Alchajmerove bolesti koje sadrže prepisivanje farmaceutski efikasnih sastava formulisanih sa antitelom koje pokazuje poseban afinitet (kao što je najmanje u poređenju sa oblicima Aβ peptida male molekulske težine) prema konformacionom epitopu protofibrilnog oblika Aβ peptida, posebno tamo gde je protofibrilni epitop predstavljen izloženom oblašću Aβ-protofibrilnog oblika koji sadrži aminokiseline 1-20 (SEQ 1D NO: 2) izloženog dela Aβ peptida. Određena oličenja koja se odnose na ove terapeutske i profilaktičke metode, ovde obelodanjena, mogu da koriste mišja monoklonalna antitela 13C3, 19A6, IDI navedena kao primer, kao i afmitetno zrele verzije bilo kog ovakvog antitela, himeričnog antitela, humanizovanog antitela, humanog monoklonalnog antitela, i/ili bilo kog ovakvog oblika antitela u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na antitela ili određene vezne članove ovde prikazane. Bilo koje ovakvo antitelo ili određeni vezni član mogu se pripisati ovoj specifikaciji kao „antitelo slično 13C3". Na taj način „antitelo slično 13C3" znači da takođe obuhvati ovde obelodanjeno monoklonalno antitelo 13C3.
Prikazani pronalazak se takođe odnosi na metode skrininga za izbor jedinjenja koji mogu da deluju kao inhibitor stvaranja fibrilnih i/ili senilnih naslaga povezanih s Alchajmerovom bolesti. Ovakva metodologija sadrži korišćenje antitela sa karakteristikama nalik 13C3 (npr. određeni afinitet prema PF nasuprot LMW oblicima Aβ peptida) u različitim ispitivanjima interakcija antitela/peptida/ispitnih jedinjenja da bi se izabralo jedinjenje
koje moduliše proces stvaranja vlakana i/ili naslaga.
Prikazani pronalazak se dalje odnosi na dijagnostičke metode ispitivanja posebno za određivanje nivoa protofibrila kod subjekta ili pacijenta. Ovakva ispitivanja mogu da se obave bilo kojim tehnikama poznatim i raspoloživim stručnjaku, uključujući, ali ne ograničavajući se na,. Westem blot-ove" (proteinske imunoblotove), ELISA-e, radioimunološka ispitivanja, imunohistohemijska ispitivanja, imunoprecipitacije, ili druga imunohemijska ispitivanja poznata u struci. Na ovaj način, jedno oličenje ovog dela pronalaska se odnosi na uzimanje uzorka tkiva od subjekta ili pacijenta i određivanje nivoa PF Aβ u uzorku korišćenjem dijagnostičkog kompleta i ispitivanja u vezi s njim; pri čemu komplet sadrži antitelo slično 13C3, čime se dozvoljava posebno određivanje nivoa PF Aβ u uzorku tkiva. Uzorak tkiva za analizu je obično krv, plazma, serum, sluz, ili cerebralna kičmena tečnost subjekta ili pacijenta. U tom cilju, antitela prikazanog pronalaska mogu da se koriste najmanje za sledeće namene:
(1) kao profilaktički ili terapijski agens za sprečavanje, ili smanjenje naslaga povezanih s Alchajmerovom bolesti, bilo samostalno, bilo u sprezi s bilo kojom kombinovanom terapijom;
(2) u dizajniranju peptidnih imunogena koji mogu da se koriste za izazivanje efikasnog odgovora antitela u strategijama profilaktičke, ili terapijske vakcinacije koje se odnose na tečenje Alchajmerove bolesti; (3) za generisanje profilaktičkog, ili terapijskog anti-idiotipskog antitela (Ab2) koje podražava kriptični(e) epitop(e) koji vezuje antitela prikazanog pronalaska; i (4) u dizajniranju peptida izvedenih iz oblasti za određivanje komplementarnosti (complementarity determining regions - CDRs) neutrališućih antitela prikazanog pronalaska za
upotrebu ili u skriningu inhibitora stvaranja protofibrila za upotrebu u profilaktičkim i/ili terapijskim režimima i (4) kao dijagnostički reagens za određivanje nivoa protofibrilamog Aβ u serumu ili cerebralnoj kičmenoj tečnosti pacijenta u opasnosti od razvoja Alchajmerove bolesti.
Predmet prikazanog pronalaska je da obezbedi antitela koja na određeni način interaguju i pokazuju afinitet prema izloženom, konformacionom epitopu protofibrilnog oblika Aβ peptida koji sadrži aminokiseline 1-20 (SEQ ID NO: 2) izloženog dela Aβ peptida.
Dalje je predmet prikazanog pronalaska da obezbedi antitela koja interaguju i pokazuju afinitet prema izloženom konformacionom epitopu protofibrilnog oblika Aβ peptida koji sadrži aminokiseline 4-12 i 9-20 (SEQ 1D NO: 3, 4).
Još jedan predmet prikazanog pronalaska je da obezbedi antitela slična 13C3 koja sprečavaju ili smanjuju stvaranje protofibrila Aβ peptida povezanih sa stvaranjem naslaga u vezi sa Alchajmerovom bolesti.
Još jedan predmet prikazanog pronalaska je da obezbedi ispitivanja koja koriste antitela slična 13C3 u u različitim ispitivanjima interakcija antitela/peptida/ispitnih jedinjenja da bi se izabrala jedinjenja koja će biti korisna u lečenju naslaga vezanih sa Alchajmerovom bolesti. Onako kako se ovde koristi, „Ka" je namenjeno da se odnosi na konstantu asocijacije određene interakcije antigen - antitelo,,, Kd" je nemenjeno da se odnosi na konstantu disocijacije određene interakcije antigen - antitelo.
Onako kako se ovde koristi, pojam,, epitop“ ili „antigenska determinanta" se odnosi na mesto na antigenu na koje reaguju B i/ili T ćelije, ili na mesto na molekulu nasuprot kojeg će biti proizvedeno antitelo i/ili za koje će se antitelo vezati.
Na primer, epitop može da se prepozna po antitelu koje definiše epitop. Epitop može da bude ili „linearni epitop" (gde primarna aminokiselina primami niz sadrži epitop; uobičajeno najmanje 3 susedna ostatka aminokiseline i, još uobičajenije, najmanje 5 i do oko 8 i do oko 10 aminokiselina u jedinstvenom nizu) ili „konformacioni epitop" (epitop u kojem primarni, susedni niz aminokiseline nije jedina komponenta koja definiše epitop). Konformacioni epitop može da sadrži povećan broj aminokiselina u odnosu na linearni epitop, jer ovaj konformacioni epitop prepoznaje trodimenzionalnu strukturu peptida ili proteina. Na primer, kada se molekul proteina savija da obrazuje trodimenzionalnu strukturu, određene aminokiseline i/ili polipeptidna kičma koji obrazuju konformacioni epitop se postavljaju uporedo omogućavajući antitelu da prepozna epitop. Metode određivanja konformacije epitopa uključuju, ali nisu ograničene na, na primer, kristalografiju X-zracima, dvodimenzionalnu spektroskopiju pomoću nuklearne magnetne rezonance i spektroskopiju pomoću elektronske spin rezonance i elektronske paramagnetne rezonanse. Videti, na primer, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996), čije je obelodanjivanje ovde u potpunosti uključeno pozivanjem na nju.
Onako kako se ovde koristi, „određeno vezivanje" između dva jezgra znači afinitet od najmanje 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, ili 1010 M-1.
Onako kako se ovde koristi, „protofibrili" su protofibrilami agregati (skupovi) koji uključuju sferne strukture koje sadrže Aβ peptide koji se pojavljuju da predstavljaju nizove sferičnih sruktura koje obrazuju krivolinijske strukture.
Onako kako se ovde koristi, pojam „izolovani" se ovde koristi kako se koristi u struci. Naime, stanje u kojem se nalaze antitela/određeni vezivni članovi, molekuli nukleinske kiseline i slično. Antitela/određeni vezivni članovi i molekuli nukleinske kiseline će biti bez ili uglavnom bez materijala s kojim su oni prirodno povezani kao što su drugi polipeptidi ili nukleinske kiseline s kojima se oni nalaze u njihovom prirodnom okruženju, ili okruženju u kojem se oni pripremaju (npr. ćelijska kultura) kada se takva priprema obavlja tehnologijom rekombinacije DNK (obavljanom „ili vitro") ili,, in vivo“. „Izolovani" pokriva bilo koji oblik koji sadrži identifikovane i okarakterisane delove prikazanog pronalaska posle vađenja iz tog početnog okruženja. Primeri, ali svakako ne ograničenja, uključuju farmaceutske formulacije, formulacije sa rastvaračima, antitela/određene vezivne članove, molekule nukleinskih kiselina i delove ovih, koji su modifikovani (npr. glikozilacija antitela) bilo,, in vitro“ bilo,, in vivo" i izvađeni iz tog okruženja.
Onako kako se ovde koristi, pojam „rekombinantno ljudsko antitelo" predstavlja podskup „antitela" sposoban da se razvija, generisan na različite načine tehnologijom rekombinacije DNK i transgena neljudskog porekla koji su dobro poznati u struci. Ovakva metodologija se koristi za generisanje antitela na jedan od sledećih načina: (i) scFv ili alternativno antitelo izolovano iz kombinatome biblioteke ljudskih antitela; (ii) delimično ili potpuno antitelo generisano iz odgovarajućeg postojanog ekspresionog vektora postojano ili prolazno transfektovano u ćeliju domaćina, najradije ćeliju domaćina sisara (npr., subkloniranje nukleotidnih nizova koji kodiraju VH i VL lance u ekspresioni vektor u vezi s odgovarajućim CH i CL nukleotidnim nizovima, tako da bi pomoglo izražavanje
predeterminisanog oblika antitela koje pokazuje specifičnost prema PS obliku Aβ; i/ili (iii) antitelo izolovano iz neljudske transgene životinje koja sadrži ljudske imunoglobulinske gene, ili bilo kojom drugom poznatom metodologijom koja se oslanja na rekombinantno „mešanje i podudaranje" nizova ljudskog imunoglobulinskog gena sa drugim DNK nizovima kako bi se generisalo ljudsko rekombinantno antitelo od značaja.
Pojmovi „subjekt" ili „pacijent" imaju za cilj da uključe bilo kog člana hordata, uključujući, bez ograničenja, ljude i druge primate, uključujući neljudske primate kao što su šimpanze i druge majmune i majmunske vrste; domaće životinje kao što su goveda, ovce, svinje, koze i konji; domaće sisare kao što su psi i mačke; laboratorijske životinje uključujući glodare kao što su miševi, pacovi i zamorčići; ptice, uključujući domaće i divlje ptice (pernatu divljač) kao što su pilići, ćurke i druge hodajuće ptice, patke, guske i slično.
Pojam „lečenje (obuhvata engleske izraze „treating" i „treatment")" bolesti se odnosi na izvršavanje protokola, koji može da sadrži prepisivanje jednog ili više lekova subjektu (čoveku ili drugom), u bilo kom naporu da se ublaže znaci ili simptomi bolesti. Ublažavanje (olakšanje) može da se dogodi pre pojave znakova i simptoma bolesti, kao i posle njihovog pojavljivanja. Na ovaj način „lečenje (treating i treatment)" obuhvata „sprečavanje (obuhvata engleske izraze „preventing" i „prevention")" bolesti. U slučaju Alchajmerove bolesti, „sprečavanje (preventing i prevention)" može takođe da se dogodi u situaciji gde se lečenje preduzima unapred kako bi se sprečio ili zaustavio razvoj simptoma povezanih s Alchajmerovom bolesti. Dodatno, „lečenje (treating i treatment)" ne zahteva potpuno ublažavanje znakova ili simptoma,
ne zahteva izlečenje, i posebno uključuje protokole koji imaju samo marginalni pozitivan efekat na subjekt.
Onako kako se ovde koristi, pojam „aktivni sastojak" se odnosi na antitelo slično 13C3 koje pokazuje afinitet i specifičnost (npr., specifično vezivanje) za krajnji amino deo protofibrilne strukture beta-amiloida.
Onako kako se ovde koriste, pojmovi „efikasna količina" ili „farmaceutski efikasna količina" antitela, kako je ovde dato, se odnose na netoksičnu, ali dovoljnu količinu aktivnog sastojka da bi se obezbedio željeni biološki rezultat. Odgovarajuća „efikasna" količina u bilo kom individualnom slučaju može da se odredi nekom od običnih veština u struci korišćenjem rutinskih eksperimenata.
Onako kako se ovde koriste, pojmovi „farmaceutski prihvatljiv" ili „farmakološki prihvatljiv" znače da materijal može da se da kao leko osobi u uređaju za davanje lekova zajedno s formulisanim biološkim agensom bez izazivanja neželjenih bioloških efekata ili interakcije na štetan način s bilo kojom komponentom sastava (mešavine) u kojoj se on sadrži (npr., „farmaceutski prihvatljiv sastav").
Onako kako se ovde koriste, pojmovi „fiziološki prihvatljiv nosač" i „farmaceutski prihvatljiv nosač" koji se mogu uzajamno koristiti, odnose se na nosač, rastvarač i ekscipijens koji ne izaziva značajni nadražaj organizma i ne poništava biološku aktivnost i svojstva primenjenog jedinjenja. Katalizator je obuhvaćen ovim frazama.
Onako kako se ovde koristi, pojam „ekscipijens" se odnosi na inertnu materiju dodatu farmaceutskom sastavu da dalje olakša primenu aktivnog sastojka.
Pojam „minimalni afinitet" kako je korišćen u poređenju s afinitetom antitela prema protofibrilamom obliku Aβ peptida sa afinitetom antitela za druge oblike Aβ peptida, kao što su vlakna, pločaste strukture i oligomeri i monomeri male molekulske mase, ukazuje daje odnos afiniteta prema protofibrilamim oblicima Aβ prema afinitetu prema drugim oblicima Aβ veći od oko 2. Najradije, odnos je veći od oko 3, ili oko 4, ili oko 5.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1 prikazuje proces Aβ fibrilogeneze, uključujući stvaranje protofibrilnih oligomera.
Slika 2A-B prikazuje proces Aβ fibrilogeneze i prečišćavanje Aβ oblika u trenutku vremena 0 (A) i 4 sata (B) kako je naznačeno preko apsorbanse na mAlLis (apsorbansa na 215 nm) za elucione zapremine. Na 4 sata (B), oblik male molekulske težine (low molecular weight -LMW) se izdvaja kao ~15 kDa dimer (kombinacija dva identična molekula) dok se veličina protofibrilnog oblika izdvaja na ~670 kDa.
Slika 3A-B prikazuje specifičnost monoklonalnih antitela 13C3 (A) i 4G8 (B) za protofibrilne (PF: -♦-) i oblike male molekulske težine (LMW: -■-) Aβ, kako je naznačeno očitavanjem optičke gustine (OD) na 450/650 nm za rastuće koncentracije i PF i LMW oblika Aβ.
Slika 4A-C prikazuje podatke Biacore® ispitivanja vezivanja koji pokazuju afinitet monoklonalnih antitela 4G8 (A), 13C3 (B) i kontrolnog IgG1 (C) prema promenama koncentracija oblika male molekulske težine (LMW) Aβ od 0, 25 pg/ml LMW Aβ to 4, 0 pg/ml LMW Aβ.
Slika 5A-B prikazuje podatke koji identifikuju epitope prepoznate anti- Aβ antitelima gore opisanim. Slika 5A ilustruje,, Westem Dot Blot“ analizu sa monoklonalnim antitelima 13C3 (gornja ploča), IDI (srednja ploča) i 4G8 (donja ploča) u zavisnosti od serije 13 peptida aminokiselina koji se preklapaju kako je opisano u Primeru 5. Slika 5B ilustruje niz aminokiselina Aβi1-42 (SEQ 1D NO: 1), kao i predviđene epitope monoklonalnih tela 13C3 i lDl.
Slika 6 prikazuje reaktivnost monoklonalnih tela 13C3 (-■-) i 4G8 (-♦-) sa SEC delovima 7PA2 koji isplivava na površinu ispuštajući Aβ oligomere. Protofibrilni delići (PF) i delići male molekulske mase (LMW) su naznačeni na x-osi kako je izmereno očitavanjem optičke gustine (OD) na 450/650.
Slike 7A-C prikazuju mikrografove tankog režnja imuno-elektronske mikroskopije koji pokazuju afinitet monoklonalnog antitela 13C3 prema ponovljenim strukturama na Aβ vlaknima (B, C). Kontrolni imuno-EM je IgG1 (A).
Slika 8A-B prikazuje podatke sa elektronskih mikrografova koji pokazuju smanjenje u brojevima naslaga kod reprezentativnog TgCRND8 transgenskog miša posle primene kontrolnog lgG| (A) antitela u poređenju sa primenom 13C3 monoklonalnih antitela (B).
Slika 9A-B prikazuje daje lečenje TgCRND8 transgenskog miša sa 13C3 monoklonalnim antitelima u režimu jednom nedeljno (A) ili dva puta nedeljno (B) za rezultat imalo smanjenje stvaranja senilnih naslaga.
Slika 10 prikazuje niz nukleotida i aminokiselina kloniranih lakih i teških lanaca promenljivih oblasti za mAb 13C3.
Slika 11 prikazuje da akutna periferna primena 13c3 kod APP transgenskog miša ne vodi
porastu Aβ iz plazme za razliku od primene referentnog antitela 3D6.
Slika 12 prikazuje da 13C3 prepoznaje ljudske amiloidne neuritičke naslage (nagomilane) u mozgovima obolelih od Alchajmerove bolesti, ali ne i difuzne Aβ naslage za razliku od referentnog 3D6 anti-Aβ antitela.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Amiloid prekurzor protein (APP) igra značajnu ulogu u patogenezi Alchajmerove bolesti (AD). Proteolitička obrada APP-a p- i y-sekretazama generiše Aβ peptide (Aβ) koji normalno obuhvataju opseg dužina od 39 do 43 amino kiseline. Razvoj Alchajmerove bolesti karakteriše akumulacija oligorneričkih ili nagomilanih oblika Aβ u mozgu. Imunološki sastavi prikazanog pronalaska su korisni u lečenju i prevenciji Alchajmerove bolesti, za upotrebu kao reagensi u dijagnostičkim ispitivanjima, kao i za dizajniranje malih molekulskih inhibitora amiloidnih naslaga. Antitela slična 13C3 prikazanog pronalaska mogu da se primene profilaktički na opštu populaciju sisara, posebno ljudi, u posmatranoj farmaceutski prihvatljivoj formulaciji u količini i/ili režimu doziranja dovoljnim da eliminiše, smanji ili odloži razvoj bolesti. Metode profdaktčkog lečenja su posebno zagarantovane kod pojedinaca za koje je poznato da imaju genetski ili porodični rizik od Alchajmerove bolesti. Brojni genetski markeri rizika od Alchajmerove bolesti su identifikovani, uključujući, ali ne ograničavajući se na mutacije APP-a (npr. Indijska mutacija (Val717Phe), Švedske mutacije (Lys670Asn, Met671Leu), Hendricks-ova mutacija (Ala692Gly), Holandska mutacija (Glu693Gln), Iranska
Mutacija (Thr714Ala), Nemačka mutacija (Val716Ala), i Floridska mutacija (lle716Val), da nabrojimo nekoliko. Dodatne mutacije koje mogu da ukažu na povećani rizik od Alchajmerove bolesti uključuju mutacije presenilnih gena (PSI i PS2) i ApoE4. Prikazani pronalazak se takođe odnosi na terapeutske intervencije pomoću farmakološki prihvatljivih sastava koji sadrže antitela slična 13C3 za pojedince koji sada pate od Alchajmerove bolesti koji se mogu prepoznati po karakterističnoj demenciji, posebno u prisustvu faktora rizika gore opisanih ili koji već pate od ove bolesti, u količini koja je dovoljna da izleči, ili najmanje delimično zaustavi, simptome i komplikacije Alchajmerove bolesti. Bilo profilaktičke, bilo terapeutske metode lečenja ovde posmatrane mogu se koristiti za rani ili kasni razvoj Alchajmerove bolesti. U pogledu značaja oligomernih oblika Aβ u razvoju Alchajmerove bolesti, prikazani pronalazak se odnosi na izolovano antitelo koje posebno interaguje i pokazuje merljiv afinitet prema ponavljanju konformacionog epitopa protofibrilnog oblika Aβ peptida. Monomer divljeg tipa Aβ peptida (Aβ42; oblik aminokiseline 42) je poznat u struci i ovde je prikazan kao SEQIDNO: l:
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lle Ala (SEQ 1D NO: 1).
Izolovana antitela prikazanog pronalaska će pokazati afinitet za ponavljanje konformacionog epitopa veće molekulske težine, oligomemog protofibrilamog oblika Aβ peptida pri čemu će pokazivati minimalni afinitet za druge oblike Aβ peptida, kao što su monomeri i dimeri male molekulske težine.
Prikazani pronalazak se takođe odnosi na izolovano antitelo koje interaguje i pokazuje merljiv afinitet prema konformacionom epitopu protofibrilnog oblika Aβ peptida, pri čemu je protofibrilni epitop prikazan izloženom oblašću oblika Aβ-protofibrila koja obuhvata amino kraj izloženog dela Aβ peptida.
Prikazani pronalazak se dalje odnosi na izolovano antitelo koje posebno interaguje i pokazuje merljiv afinitet prema konformacionom epitopu protofibrilnog oblika Aβ peptida, pri čemu je protofibrilni epitop prikazan izloženom oblašću oblika Aβ-protofibrila koja obuhvata aminokiseline 1-20 (SEQ ID NO: 2) izloženog dela Aβ peptida, i to: Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe (SEQ ID NO: 2).
Kako je radi primera ovde navedeno, identifikovana su mišja monoklonalna antitela koja posebno pokazuju određeni afinitet za protofibrilni (PF) oblika Aβ peptida, pri čemu pokazuju minimalni afinitet za vrste male molekulske težine Aβ peptida. dimerni oblik Aβ (-15 kDa) vremenom polimerizuje da bi obrazovao rastvorljiv PF oblik Aβ, molekulske težine približno 670 kDa. Miševi su imunizovani ovim PF oblikom veće molekulske težine Aβ. Monoklonalna antitela su prikazana zbog specifičnosti zbog PF oblika velike molekulske težine Aβ peptida pri čemu pokazuju minimalnu sposobnost ili uopšte ne pokazuju sposobnost da vezuju oblike manje molekulske težine Aβ. Ovaj deo prikazanog pronalaska je ilustrovan skriningom, izolacijom i karakterizacijom 13C3 serije monoklonalnih antitela naraslim nasuprot -670 kDa protofibrilnog oblika velike molekulske težine Aβ peptida (tj., 13C3, IDI i 19A6). Ova serija
monoklonalnih antitela pokazuje određenu specifičnost,. in vitro'1 pri čemu takođe smanjuje stvaranje naslaga povezanih s Alchajmerovom bolesti kod transgenskih miševa koji su korišćeni kao model za Alchajmerovu bolest. Na taj način, u određenom oličenju pronalaska, izolovano antitelo posebno interaguje i pokazuje merljiv afinitet prema konformacionom epitopu protofibrilnog oblika Aβ peptida, pri čemu je protofibrilni epitop prikazan izloženom oblašću Aβ- protofibrilnog oblika koji sadrži aminokiseline 4-12 (SEQ 1D NO: 3) i 9-20 (SEQ ID NO: 4) izloženog dela Aβ peptida: Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val (SEQ 1D NO: 3); Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe (SEQ ID NO: 4).
Jedno oličenje prikazanog pronalaska se odnosi na antitelo koje sadrži VM (SEQ ID NO: 7) i/ili VL (SEQ ID NO: 5) oblast kako je rečeno za 13C3, kako bi saopštavanje specifičnosti nalik 13C3 PF-u nasuprot LMW obliku Aβ peptida. Dodatno oličenje je antitelo slično I3C3 ili biološki relevantan fragment od tog koji pokazuje specifičnost prema PF obliku više nego prema LMW obliku Aβ peptida. Na taj način, prikazani pronalazak se takođe odnosi na biološki aktivne fragmente i/ili mutante 13C3, IDI, 19A6 ili antitelo slično 13C3, uključujući, ali ne ograničavajući se obavezno na supstituciju aminokiselina (npr. kao usmereni oblik sazrevanja afiniteta VH ili VL oblasti), oduzimanja, sabiranja, otsecanja amino kraja i karboksilnog kraja, takvih da ove mutacije obezbeđuju osnovu za antitelo ili vezni deo antitela koji za rezultat ima sličnu ili poboljšanu verziju 13C3, IDI, 19A6 veznog proteina antitela ili veznog proteina antitela sličnog 13C3. Kako je ovde napomenuto, jedno oličenje ovog dela pronalaska
koje se odnosi na VH i/ili VL oblast ovakvog antitela koje sadrži niz aminokiselina je izloženo u SEQ ID NO: 7 i/ili SEQ ID NO: 5, redom. Prikazani pronalazak napominje postojanje suvišnosti kodona koja može da ima za rezultat da različiti DNK molekuli izražavaju identična antitela ili njihove delove (npr. naizmenični molekuli nukleinske kiseline kodiraju identičan scFv ili VH i/ili VL deo jednog IgG-a). Za potrebe ove specifikacije, niz koji nosi jedan ili više zamenjenih kodona će biti definisan kao degenerativna varijacija. Drugi izvor varijacije niza može da se pojavi kroz ispravljanje RNK. Ovakvo ispravljanje RNK može da ima za rezultat drugi oblik suvišnosti kodona, u kome promena u okviru otvorenog čitanja nema za rezultat promenjeni ostatak aminokiseline u određenom proteinu. U obimu ovog pronalaska su takođe uključene mutacije bilo niza DNK ili preobraženog antitela koje poboljšavaju osnovna fizička svojstva određenog antitela. U ovom cilju, prikazani pronalazak se odnosi na (i) afmitetno zrele verzije 13C3, IDI, 19A6 ili bilo kog drugog antitela kao što je antitelo slično 13C3, i/ili (ii) mutirane oblike 13C3, IDI, I9A6, ili bilo kog antitela kao što je antitelo slično 13C3, uključujući, ali ne ograničavajući se na jednu ili više mutacija u oblastima CDR1, CDR2 i/ili CDR3 kao i generisana pomoću poznate metodologije sazrevanja afiniteta i tehnika rekombinacije DNK za koje je poznato da unose mutacije specifične za mesto. Na taj način, izolovana antitela prikazanog pronalaska su antitela koja posebno interaguju sa konformacionim epitopom protofibrilnog oblika Aβ peptida. Izolovana antitela prikazanog pronalaska će pokazati afinitet prema takvom konformacionom epitopu za protofibrilame oblike veće molekulske težine Aβ peptida pri čemu će pokazivati minimalni afinitet za ostale oblike Aβ peptida, kao što su vlakna,
pločaste strukture i oligomeri i monomeri male molekulske težine.
Prikazani pronalazak se takođe odnosi na izolovano monoklonalno antitelo, 13C3. Ovaj deo pronalaska se takođe odnosi na hibridome koji proizvode monoklonalno telo, 13C3. Hibridom koji proizvodi monoklonalno antitelo 13C3 je na raspolaganju pod ATCC Accession No. PTA-8830.
Prikazani pronalazak se takođe odnosi na izolovano monoklonalno antitelo, IDI. Ovaj deo pronalaska se takođe odnosi na hibridome koji proizvode monoklonalno telo, IDI.
Prikazani pronalazak se takođe odnosi na izolovano monoklonalno antitelo, 19A6. Ovaj deo pronalaska se takođe odnosi na hibridome koji proizvode monoklonalno telo, 19A6.
Prikazani pronalazak se takođe odnosi na metode skrininga i izbora jedinjenja koja mogu da deluju kao inhibitor stvaranja vlakana i/ili senilnih naslaga povezanih s Alchajmerovom bolesti. Ovakva metodologija sadrži korišćenje antitela sa afinitetom sličnim 13C3 prema PF obliku Aβ peptida u različitim ispitivanjima interakcije antitela/peptida/ispitnih jedinjenja da bi se izabralo jedinjenje koje moduliše proces stvaranja vlakana i/ili naslaga. Jedinjenje može da bude neproteinski organski ili neorganski molekul, peptid (npr., kao potencijalna profilaktička ili terapeutska peptidna vakcina), protein, DNK (jednom ili dva puta zavijena) ili RNK (kao što je siRNK ili shRNK). Posle pregleda otkrića i upoznavanja s ovom specifikacijom biće evidentno da bilo koji ovakav peptid ili mali molekul koji se efikasno takmiči sa antitelom sličnim 13C3
za vezivanje sa PF oblikom Aβ peptida predstavlja moguće vodeće jedinjenje u vezi sa profilaktičkim ili terapijskim tečenjem Alchajmerove bolesti. U ovom cilju, ispitivanja interakcija mogu se koristiti za skrining visoke propusnosti da bi se identifikovala jedinjenja koja zaposedaju ili interaguju sa 13C3 epitopima PF oblika Aβ peptida i zamenjuju antitelo. Mogu se koristiti različita ispitivanja poznata u struci zasnovana na antitelima/antigenima koja uključuju i oslanjaju se na antitela slična 13C3 prikazanog pronalaska, kao neophodnog reagensa u skriningu za jedinjenjima korisnim u profilaktičkom ili terapijskom lečenju Alchajmerove bolesti (npr„ mali neorganski molekul ili kandidat za peptidnu vakcinu), uključujući, ali ne ograničavajući se na ELISA ispitivanje, radioimunološka ispitivanja, „VVestern blot" analizu, bilo koje homogeno ispitivanje koje se oslanja na detektabilne biološke interakcije koje ne zahtevaju korake separacije ili pranja (npr., vidi,, AlphaScreen“ od Perkin Elmer-a) i/ili tehnologiju zasnovanu na SPR (npr., vidi BIACore)). Jedinjenja i/ili kandidati za peptidnu vakcinu identifikovana upotrebom antitela sličnog 13C3 mogu se detektovati različitim ispitivanjima. Ispitivanje može da bude jednostavno,, da/ne" ispitivanje da bi se odredilo da li ima promene sposobnosti da se obrazuje poznati kompleks antitelo/antigen, ili može da bude kvantitativne prirode, korišćenjem ispitivanja kao što je ELISA, homogenog ispitivanja, ili ispitivanja zasnovanog na SPR. U ovom cilju, prikazani pronalazak se odnosi na bilo koje ovakvo ispitivanje, bez obzira na iskorišćenu poznatu metodologiju, koje meri sposobnost ispitnog jedinjenja da konkuriše antitelu sličnom 13C3, do odgovarajućeg mimetičkog peptida ili proteina amino kraja 13C3 epitopa PF oblika Aβ peptida.
Antitela ovde opisana mogu se koristiti kao osnovni reagensi u određenom broju različitih imunoloških ispitivanja da
bi se odredilo prisustvo Aβ protofibrilnog oblika u uzorku tkiva. Načelno govoreći, antitela se mogu koristiti u bilo kojoj vrsti imunoloških ispitivanja, bilo kvalitativnih, bilo kvantitativnih. Ovo uključuje i „sendvič" ispitivanje na dva mesta i imunološko ispitivanje najednom mestu nekompetitivne vrste, kao i tradicionalna kompetitivna ispitivanja vezivanja. Jedno oličenja koje je značajno, po jednostavnosti detekcije i njegovoj kvantitativnoj prirodi, je „sendvič" ili dvostruko ispitivanje antitela, za koje postoji određeni broj varijacija, koje su sve namenjene da budu obuhvaćene ovim delom prikazanog pronalaska. Na primer, uobičajeno „sendvič ispitivanje unapred" (forward sandwich assay). neobeleženo antitelo se imobiliše na čvrstom supstratu, npr., ploče za mikrotitriranje i uzorak koji se testira se dovodi u kontakt sa vezanim molekulom. Posle odgovarajućeg perioda inkubacije, za period vremena koji je dovoljan da se omogući stvaranje binarnog kompleksa antitelo-antigen. drugo antitelo, označeno sa molekulom „izveštačem" sposobno da izazove detektabilan signal, se zatim dodaje i inkubacija se nastavlja omogućavajući dovoljno vreme za vezivanje sa antigenom na različitim mestima i stvaranje trojnog kompleksa antitelo-antigen-označeno antitelo. Bilo koji neizreagovani materijal se ispira i prisustvo antigena se određuje posmatranjem signala, koji može da se kvantifikuje u poređenju sa kontrolnim uzorkom koji sadrži poznate količine antigena. Varijacije „sendvič ispitivanja unapred" uključuju simultana ispitivanja, u kojima se i uzorak i antitelo dodaju simultano vezanom antitelu, ili „obrnuto sendvič ispitivanje" (reverse sandwich assay) u kojem se prvo kombinuju označeno antitelo i uzorak koji treba da se ispita, inkubiraju se i dodaju neoznačenom antitelu vezanom za površinu. Ove tehnike su dobro poznate stručnjacima i mogućnost minornih varijacija će biti
lako vidljiva. Onako kako se ovde koristi, „sendvič ispitivanje" je namenjeno da obuhvati sve varijacije osnovne tehnike na dva mesta.
Za „sendvič" ispitivanja prikazanog pronalaska, jedini ograničavajući faktor je da oba antitela imaju različite specifičnosti vezivanja za protofibrilni oblik Aβ. Na taj način, moguć je određeni broj mogućih kombinacija. Još karakterističniji primer je daje u uobičajenom „sendvič ispitivanju unapred", primarno antitelo ili kovalentno ili pasivno vezano za čvrstu potporu. Čvrsta površina je obično staklo ili polimer, najčešće korišćeni polimeri su celuloza, poliakrilamid, najlon, polistiren, polivinilhlorid ili polipropilen. Čvrste potpore mogu da budu u obliku cevi, perli, diskova ili mikroploča, ili bilo koje druge površine pogodne za obavljanje imunološkog ispitivanja. Procesi vezivanja su dobro poznati u struci. Posle vezivanja, čvrsta faza kompleksa antitela se pere u okviru pripreme uzorka za ispitivanje. Alikvot telesne tečnosti koji sadrži protofibrilni oblik Aβ koji treba da se ispita se onda dodaje kompleksu u čvrstoj fazi i inkubira na 25 °C tokom perioda vremena dovoljnog da se omogući vezivanje bilo kog prisutnog protofibrilnog oblika A(3 proteina za antitelo karakteristično za protofibrilni oblik A(3. Onda se kompleksu čvrste faze dodaje drugo antitelo i inkubira na 25 °C tokom dodatnog perioda vremena dovoljnog da se omogući vezivanje drugog antitela za primami kompleks čvrste faze antitelo-antigen. Drugo antitelo je vezano za molekul „izveštač", čiji vidljivi signal se koristi za indikaciju vezivanja drugog antitela za bilo koji antigen u uzorku. Pod „molekul izveštač", kako je korišćeno u prikazanoj specifikaciji se misli na molekul koji po svojoj hemijskoj prirodi obezbeđuje analitički detektabilan signal koji omogućava detekciju
antitela vezanog za antigen. Detekcija mora da se najmanje relativno kvantifikuje, da bi se omogućilo određivanje količine antigena u uzorku, ovo može da se izračuna u apsolutnim jedinicama, ili može da se uradi u poređenju sa standardom (ili serijom standarda) koji sadrže normalni nivo antigena.
Najčšće korišćeni „molekuli izveštači" u ovoj vrsti ispitivanja su ili enzimi ili fluorofori. U slučaju enzimskih imunoloških ispitivanja, enzim se sjedinjuje sa drugim antitelom, često pomoću glutaraldehida ili periodata. Kao što će biti lako prepoznatljivo, međutim, postoji širok spektar različitih tehnika konjugacije, koje su dobro poznate iskusnom stručnjaku. Uobičajeno korišćeni enzimi uključuju peroksidazu rena, glukoznu oksidazu, beta-galaktosidazu i alkalnu fosfatazu, između ostalih. Supstrati koji će biti korišćeni sa određenim enzimima se načelno biraju za proizvodnju, posle hidrolize odgovarajućim enzimom, detektabilne promene boje. Na primer, p-nitrofenil fosfat je pogodan za upotrebu sa konjugatima alkalne fosfataze; za konjugate peroksidaze se obično koriste 1, 2-fenildiamin ili toluidin. Takođe je moguće da se koriste fluorogeni supstrati, koji za prinos imaju fluoroscentni proizvod umesto gore navedenih hromogenih supstrata. U svim slučajevima, antitelo označeno enzimom se dodaje prvom antitelu kompleksa Aβ protofibrilnog proteina i omogućava se njegovo vezivanje za kompleks i zatim se višak reagensa ispira. Rastvor koji sadrži odgovarajući supstrat se zatim dodaje tercijarnom kompleksu antitela obeleženog antitelom antigenom. Supstrat reaguje sa enzimom vezanim za drugo antitelo, dajući kvalitativan vizuelni signal, koji se dalje može kvantifikovati, obično
spektrofotometrijski, da bi dao evaluaciju količine antigena koja je prisutna u uzorku seruma. Dodatno, fluorescentna jedinjenja, kao što su fluoroscein ili rodamin, mogu hemijski da se spoje sa antitelima bez promene njihovog kapaciteta vezivanja. Kada se aktivira osvetljavanjem svetlom određene talasne dužine, antitelo označeno fluorohromom apsorbuje svetlosnu energiju, pobuđujući stanje ekscitabilnosti u molekulu, praćeno emisijom svetla na karakterističnoj većoj talasnoj dužini. Emisija se javlja kao karakteristična boja koja se može vizuelno detektovati svetlosnim (optičkim) mikroskopom. Kao u enzimskom imunološkom ispitivanju (E1A), fluoroscentom obeleženom antitelu se omogućava da se veže za prvo antitelo kompleksa Aβ protofibrilnog oblika proteina. Posle ispiranja nevezanog reagensa, preostali tercijarni kompleks se zatim izlaže svetlu odgovarajuće talasne dužine i uočena fluorescencija ukazuje na prisustvo antigena. Tehnike imunofluoroscencije i EIA su obe veoma dobro uspostavljene u struci i posebno su prioritetne za prikazanu metodu. Međutim, drugi „molekuli izveštači", kao što su radioizotopi, hemiluminiscentni ili bioluminiscentni molekuli se takođe mogu koristiti. Iskusnom stručnjaku će biti lako prepoznatljivo kako da varira proceduru da bi je prilagodio potrebnoj nameni.
U drugom oličenju, uzorak koji treba da se ispita (npr.. ljudska krv ili kičmena tečnost koje sadrže protofibrilni oblik Aβ) mogu da se koriste u imunološkom ispitivanju najednom mestu u kojem je ona nalepljena na čvrst supstrat bilo kovalentno, bilo nekovalentno. Neoznačeno antitelo anti Aβ protofibrilno proteina se dovodi u kontakt sa uzorkom vezanim za čvrst supstrat. Posle prikladnog perioda inkubacije, tokom perioda vremena dovoljnog da se omogući stvaranje
binarnog kopmleksa antitelo-antigen, drugo antitelo, označeno „molekulom izveštačem" sposobno da indukuje detektabilan signal, se onda dodaje i inkubacija se nastavlja omogućavajući dovoljno vremena za stvaranje tercijarnog kompleksa antitela označenog antigen-antitelom. Za imunološko ispitivanje najednom mestu, drugo antitelo može da bude opšte antitelo (tj„ zenogensko antitelo imunoglobulina, posebno anti- (IgM i IgG) vezano za „molekul izveštač") koje je sposobno za vezivanje antitela koje je karakteristično za posmatrani Aβ protofibrilni protein.
Antitelo slično 13C3 može da ima jedan od brojnih oblika poznatih u struci. Antitela mogu da uzmu oblik bilo kog relevantnog delića antitela, veznog dela antitela, određenog veznog člana, neproteinskog sintetičkog mimika, ili bilo koje relevantne terminologije poznate u struci koja se odnosi na jezgro koje najmanje suštinski zadržava aktivnost specifičnost/neutralizaciju vezivanja. Na taj način, pojam „antitelo" kako je korišćen u bilo kom kontekstu u okviru ove specifikacije obuhvata, ali nije ograničen na, bilo koji određeni član, imunoglobulinsku klasu i/ili izotop (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD, IgE i IgM); i njihov biološki relevantni delić ili određeni vezni član, uključujući, ali se ne ograničavajući na Fab, F(ab')2, Fv i scFv (jednolančano ili slično jezgro). Zbog toga, dobro je poznato u struci i uključeno samo radi pregleda, da se „antitelo" odnosi na glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (Fl) lanca i dva laka (L) lanca međusobno spojena disulfidnim vezama, ili njihov vezni deo antigena. Teški lanac se sastoji od promenljive oblasti teškog lanca (VH) i stalne oblasti teškog lanca (CH1, CH2 i CH3). Laki lanac se sastoji od promenljive oblasti lakog lanca (VL) i stalne oblasti teškog lanca (CL).
Promenljive oblasti i teškog i lakog lanca sadrže okvirne oblasti (FWR) i oblasti određivanja komplementarnosti (CDR). Četiri FWR oblasti su relativno konverzne dok CDR oblasti (CDR1, CDR2 i CDR3) predstavljaju hiperpromenljive oblasti i raspoređene su od NFF kraja do COOH kraja na sledeći način: FWR1, CDR1, FWR2, CDR2, FWR3. CDR3, FWR4. Promenljive oblasti teških i lakih lanaca sadrže vezno područje koje interaguje s antigenom dok, zavisno od izotopa, stalna oblast(i) mogu da posreduju pri vezivanju imunoglobulina za tkiva ili posrednike domaćina. To znači da su u radnu definiciju „antitela" uključena himerična antitela, humanizovana antitela, rekombinantno antitelo, kao ljudska antitela generisana od strane transgenskih neljudskih životinja, kao i antitela izabrana iz biblioteka korišćenjem tehnologija obogaćivanja koje su na raspolaganju stručnjaku. Delići antitela se dobijaju već poznatim tehnikama i raspoloživim onima koji vladaju uobičajenim veštinama u struci, kako je dole navedeno. Zbog toga, „antitelo" je takvo jezgro ili određeni vezivni član, koji se posebno vezuje sa konformacionim epitopom protofibrilnog oblika Aβ kako je ovde opisano. Zbog toga, pojam „antitelo" opisuje imunoglobulin, bilo prirodni ili delimično ili potpuno sintetički proizveden; bilo koji polipeptid ili protein koji ima vezno područje. Oni mogu da budu izvedeni iz prirodnih izvora, ili mogu da budu delimično ili potpuno sintetički proizvedeni. Primeri antitela su izotopi imunoglobulina i nhijove uobičajene podklase; delići koji sadrže područje vezivanja antigena kao što su Fab, scFv, Fv, dAb, Fd i diatela, kako je razmotreno bez ograničenja, „infra". U struci je poznato daje
moguće manipulisati monoklonalnim ili drugim antitelima i koristiti tehnike tehnologije rekombinacije DNK da bi se proizvela druga antitela ili himerični molekuli koji zadržavaju specifičnost originalnog antitela. Ovakve tehnike mogu da se prošire uvođenjem kodiranja promenljive oblasti imunoglobulina DNK, ili oblasti za određivanje komplementarnosti (CDR-ovi) antitela na stalne oblasti, ili stalnih oblasti plus okvirnih oblasti različitog imunoglobulina. Hibridom ili druga ćelija koja proizvodi antitelo može da bude subjekt genske mutacije ili druge promene, koje mogu, ili ne moraju da promene specifičnost vezivanja proizvedenih antitela. Antitela mogu da se modifikuje na razne načine i pojam „antitelo" treba da se shvati kao pojam koji pokriva bilo koji određeni vezni član ili supstancu koja ima vezno područje sa potrebnom specifičnošću. Na taj način, ovaj pojam pokriva deliće antitela, derivate, funkcionalne ekvivalente i homologe „antitela" uključujući bilo koji peptid koji sadrži imunoglobulinska vezna područja, bilo daje prirodni, ili potpuno, ili delimično sintetički. Takvo jezgro može da bude vezni delić obuhvaćen pojmom „antigenski vezni deo" ili „određeni vezni član" antitela uključujući, ali se ne ograničavajući na (i) Fab delić, monovalentni delić koji se sastoji od VL. VH, CL i CH područja; (ii) F(ab')2 delić, bivalentni delić koji sadrži dva Fab delića vezana disulfidnih mostom u oblasti zgloba; (iii) Fd delić koji se sastoji od VH i CH područja; (iv) Fv delić koji se sastoji od VL i VH područja jednog kraka antitela (v) dAb delić, koji sadrži VH područje; (vi) izolovana oblast za određivanje komplementarnosti (CDR); (vii) ’scAb', delić antitela koji sadrži VH i VL kao i bilo CL, bilo CH; (viii) veštačka antitela zasnovana na proteinskim skelama.
uključujući, ali se ne ograničavajući na polipeptidna antitela fibronektin tipa III (npr., vidi SAD patent Br. 6, 703, 199, priznat Koide-u 9. marta 2004. i PCT Broj objavljivanja međunarodne prijave WO 02/32925). Pored toga, iako su dva područja Fv delića, VL i VH, kodirana odvojenim genima, ona se mogu spojiti, korišćenjem rekombinantnih metoda, sintetičkim povezivačem koji im omogućava da budu kao jedan proteinski lanac u kojem se VL i VH oblasti uapruju da bi obrazovale monovalentne molekule (poznate kao jednostruki lanac Fv (scFv)).
U jednom oličenju, promenljiva laka oblast (VL) izolovanog antitela 13C3 i antitela sličnog
13C3 prikazanog pronalaska mogu da sadrže peptidni niz 113 aminokiseline (SEQ ID NO: 5)
koji se kodira sa nukleotidnim nizom 339 osnovnog para (SEQ ID NO: 6):
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gly Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn Thr Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg (SEQ ID NO: 5)
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCC ATCTCT'FGC AGATCTGGTCAG AGCCT'1'GTACACAGTAA'TGGAAACACCTATTTAC ATTGG TACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTATACAG'1TTCCAACCGATTT TCTGGGGTCCCGGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGTCAGATT'FCACACTCAAGATC AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAATACATTTGTTCCT TGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAA1CAAACGG(SFQ ID NO: 6)
U daljem oličenju, promenljiva teška oblast (VH) izolovanog antitela 13C3 i antitela sličnog
13C3 prikazanog pronalaska mogu da sadrže peptidni niz 115 amino kiseline
(SEQ ID NO: 7) koji se kodira sa nukleotidnim nizom 345 osnovnog para (SEQ ID NO: 8):
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asp Asp Gly Tyr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID NO: 7);
CAGGTCCAGCTGCACiCAGTCTGGGCCTGAGCTGGTGAGGCCTGGCiGTCTCAGTG AAGAT I TCCTGCAAGGGTTCCGGCTACACATTCACTGATTATGCTATGCACTGGGTGAAGCAGAGT C ATGC AAAG AGTCT AGAGTGGATTGGAGTTATT AGTACT AAGT ATGGT AAG AC AA ACT AC AACCAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCACAATGACTGTTGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAT ATGGAGCTTGCCAGATTGACATCTGAGGA TTCTGCCATCTATTACTGTGCAAGAGGGGAC GATGGTTAI TCCTGGGGTCAAGGAACCTCACi rCACCGTC I CCTCA (SEQ ID NO: 8).
U daljem oličenju, okvirne oblasti, LWR1, LWR2, LWR3, i LWR4, VL lanca mogu da sadrže
aminokiseline poredane u SEQ ID NO: 9. SEQ ID NO: IO, SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 12,
redom, na sledeći način:
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gly (SEQ ID NO: 9);
Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr (SEQ ID NO: 10);
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys (SEQ ID NO: 11);
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg (SEQ ID NO: 12).
U daljem oličenju, oblasti za određivanje komplementarnosti, CDR1, CDR2, i CDR3, VL lanca mogu da sadrže aminokiseline poredane u SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, redom, na sledeći način:
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 13);
Thr Val Ser(SEQ ID NO: 14);
Ser Gln Asn Thr Phe Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 15).
U daljem oličenju, okvirne oblasti, FWR1, FWR2, FWR3. i FWR4, VH lanca mogu da sadrže aminokiseline poredane u SEQ ID NO: 16. SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, i SEQ ID NO: 19, redom, na sledeći način:
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val Ser Val Lys lle Ser Cys Lys (SEQ ID NO: 16);
Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp lle Gly Val (SEQ 1DNO: 17);
Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala lle Tyr Tyr Cys Ala Arg (SEQ ID NO: 18);
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID NO: 19).
U daljem oličenju, oblasti za određivanje komplementarnosti, CDR1, CDR2, i CDR3, VF1 lanca mogu da sadrže aminokiseline poredane u SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, redom, na sledeći način:
Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala (SEQ ID NO: 20); lle Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys (SEQ ID NO: 21);
Gly Asp Asp Gly Tyr Ser (SEQ ID NO: 22).
Poliklonalna ili monoklonalna antitela za upotrebu u obelodanjenim metodama lečenja mogu da budu odgajena poznatim tehnikama. Monospecifična murinska (mišja) antitela koja pokazuju specifičnost prema konformacionom epitopu izabranog cilja mogu da se prečiste od antiseruma sisara koji sadrži antitela reaktivna na ovu oblast, ili mogu da se pripreme kao monoklonalna antitela korišćenjem tehnike Kohler-a i Milstein-a (1975, Nature 256: 495-497). Monospecifično antitelo kako se ovde koristi je definisano kao vrsta jednostrukog antitela ili vrsta višestrukog antitela sa homogenim karakteristikama vezivanja, kao što su monoklonalna mišja antitela ovde navedena kao primer sa 13C3 serijom monoklonalnih antitela. Ćelije hibridoma su proizvedene mešanjem slezinskih limfocita sa odgovarajućim fuzionim partnerom, najradije mijelomskim ćelijama, u uslovima koji će omogućiti stvaranje stabilnih hibridoma. Slezinske ćelije koje proizvode antitela i mijelomske ćelije se spajaju, biraju i prikazuju za proizvodnju antitela. Ćelije hibridoma iz pozitivnih izvora antitela se kloniraju tehnikom kao što je tehnika mekog agara MacPherson-a (1973, Soft Agar Techniques, in Tissue Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson, Eds, Academic Press). Monoklonalna antitela se proizvode,, in vivo" ubrizgavanjem osobitih ćelija hibridoma u „pristine-primed" miša, skupljanjem ascitne tečnosti posle intervala vremena i pripremaju se tehnikama dobro poznatim u struci.
Izvan vrsta gore opisanih specifičnih monoklonalnih antitela, antitela prikazanog pronalaska mogu takođe da budu u obliku „himeričnog antitela", monoklonalnog antitela stvorenog od promenljivih oblasti izvedenih iz recimo, murinskog izvora i stalnih oblasti izvedenih iz namenjenog izvora domaćina (npr., ljudski; za pregled, vidi Morrison and Oi, 1989, Advances in Immunology, 44: 65-92). Na primer, promenljivi laki i teški nizovi DNK (npr., SEQ ID NO: 6 i 8, redom) glodara (npr., miš) antitela mogu da se kloniraju u ekspresioni vektor sisara. Ovi laki i teški „himerični" ekspresioni vektori se kotransfektuju u liniju ćelije primaoca i biraju i šire poznatim tehnikama. Ova linija ćelija može da bude podvrgnuta poznatim tehnikama ćelijske kulture, što za rezultat ima proizvodnju i lakog lanca
i teškog lanca himeričnog antitela. Ovakva himerična antitela su istorijski posmatrano pokazala kapacitet vezivanja antigena originalnog glodarskog monoklonalnog pri čemu značajno smanjuju imunogenske probleme primene kod domaćina.
Logično poboljšanje himeričkog antitela je „humanizovano antitelo", koje verovatno smanjuje šanse da pacijent stvori imuni odgovor na terapijsko antitelo u poređenju sa upotrebom himeričkog ili potpuno murinskog monoklonalnog antitela. Strategija „humanizacije" murinskog Mab je zasnovana na zameni ostataka aminokiseline koji se razlikuju od onih u ljudskim nizovima mutagenezom usmerenom na mesto pojedinačnih ostataka ili kalemljenjem celokupnih oblasti za određivanje komplementarnosti ((Jones et al„ 1986, Nature 321: 522526). Ova tehnologija je opet dobro poznata u struci i prikazana je brojnim strategijama za poboljšanje ove tehnologije; to jest primenom strategija uključujući, ali se ne ograničavajući na, „preoblikovanje" (vidi Verhoeyen, et al„ 1988, Science 239: 1534-1536), „hiperhimerizacije (hyperchimerization)“ (vidi Queen, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 2869-2873) ili „oblaganja (veneering)" (Mark, et al„ 1994, Derivation of Therapeutically Active Humanized and Veneered anti-CD18 Antibodies Metcalf end Dalton, eds. Cellular Adhesion: Molecular Defmition to Therapeutic 25 Potential. New York: Plenum Press, 291 -312). Sve ove strategije do izvesnog stepena obuhvataju poređenje niza između niza glodara i ljudskog niza da bi se odredilo da li su određene zamene aminokiselina od glodarskog ka ljudskom konsenzusu odgovarajuće. Koja god daje varijacija, centralna tema koja je obuhvaćena u generisanju humanizovanog antitela se oslanja na kalemljenje CDR-a, gde su ova tri mesta vezivanja antigena i lakog i teškog lanca efikasno
uklonjena iz klona antitela koje predstavlja glodara i subklonirana (ili „nakalemljena") u kodiranje ekspresionog vektora za okvirnu oblast ljudskog antitela. Na primer, korišćenjem gornjih tehnika humanizovano antitelo može da se izrazi u kome su oblasti CDR1, CDR2, i CDR3 promenljivog lakog lanca utvrđene u SEQ ID NOS: 13, 14 i 15, redom, i CDR1, CDR2, i CDR3 oblastima promenljivog teškog lanca utvrđene u SEQ ID NOS 20, 21 i 22, redom. Zbog toga, „humanizovano antitelo" je u stvari antitelo stvoreno samo sa murinskim CDR-ovima (minus bilo koja dodatna poboljšanja generisana uključivanjem jedne ili više od gore pomenutih strategija), s ostatkom promenljive oblasti i ćelom stalnom oblasti izvedenim iz ljudskog izvora.
Prikazani pronalazak se takođe odnosi na izolovane molekule nukleinske kiseline i povezane nizove aminokiseline koji se odnose na VH i/ili VL oblasti antitela 13C3 i još određenije, izolovani molekul nukleinske kiseline (polinukleotid) koji kodira biološki relevantan deo 13C3, ili afmitetno zrelu verziju ili na drugi način mutiranu verziju 13C3, IDI, 19A6, ili drugog antitela sličnog 13C3. Ove nukleinske kiseline su suštinski slobodne od drugih nukleinskih kiselina. Za većinu svrha kloniranja, DNK je prioritetna nukleinska kiselina. Ovi DNK molekuli mogu da se subkloniraju u ekspresione vektore i zatim transfektuju u ćeliju domaćina po izboru u čemu rekombinantna ćelija domaćina obezbeđuje izvor za bitne nivoe relevantnih delova 13C3, IDI, 19A6, ili antitela sličnih 13C3, IDI, 19A6, ili njihovoj afmitetno zreloj verziji. Ovakve procedure mogu da se koriste za različite uslužne programe, kao što je generisanje scFv-ova ili,, co-expressing“ (zajedničko izražavanje)
ovih VH i VL lanaca u sistemu ekspresionog vektor sisara koji kodira ljudske CH i CL oblasti, recimo IgG antitela. Degeneracija genetskog koda je takva da, za sve osim dve aminokiseline, više od jednog kodona kodira određenu aminokiselinu. Ovo omogućava izgradnju sintetičke DNK koja kodira antitelo prikazanog pronalaska gde se niz nukleotida sintetičke DNK značajno razlikuje od nizova nukleotida ovde obelodanjenih, ali još uvek kodira ovakvo antitelo. Ovakve sintetičke DNK su namenjene da budu u okviru obima prikazanog pronalaska. Ako se želi da se ovakve sintetičke DNK izraze u određenoj ćeliji domaćinu ili organizmu, kodonska upotreba ovakve sintetičke DNK može da se prilagodi da odražava kodonsku upotrebu tog određenog domaćina, na taj način dovodeći do viših nivoa izražavanja antitela prikazanog pronalaska. Drugim rečima, ovaj višak različitih kodona koji kodiraju određene aminokiseline je u okviru obima prikazanog pronalaska. Zbog toga, ovaj pronalazak je takođe usmeren na one nizove DNK koji kodiraju RNK koji sadrži naizmenične kodone koji kodiraju eventualne translacije identične aminokiseline, kao što je dole prikazano: A=Ala=Alanin: kodoni GCA, GCC, GCG, GCU; C=Cys=Cistein: kodoni UGC, UGU; D=Asp=Asparaginska kiselina kodoni GAC, GAU E=Glu=Glutaminska kiselina: kodoni GAA, GAG; F=Phe=Fenilalanin: kodoni UUC, UUU; G=Gly=Glicin: kodoni GGA, GGC, GGG, GGU; H=His =Histidin: kodoni CAC, CAU; I=lle =Izoleucin: kodoni AUA, AUC; AUU; K=Lys-Lizin: kodoni AAA, AAG; F=Feu=Leucin: kodoni UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU; M=Met=Metionin: kodon AUG; N=Asp=Asparagin: kodoni GAU, GAC; P=Pro=Prolin: kodoni CCA, CCC, CCG, CCU; Q=Gln=Glutamin: kodoni CAA, CAG; R=Arg=Arginin: kodoni AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU; S=Ser=Serin: kodoni AGC, AGU,
UCA, UCC, UCG, UCU; T=Thr=Treonin: kodoni ACA, ACC, ACG, ACU; V=Val=Valin: kodoni GUA, GUC, GUG, GUU; W=Trp=Triptofan: kodon UGG; Y=Tyr=Tirozin: kodoni UAC, UAU. Ovakvi rekombinantni ekspresioni vektori mogu onda da se postojano ili prelazno transfektuju u odgovarajuću liniju ćelija za generisanje alternativnog oblika antitela.
Prikazani pronalazak napominje postojanje suvišnosti kodona što može da ima za rezultat da različiti DNK molekuli izražavaju identično antitelo ili deo njega (npr., naizmenični molekuli nukleinske kiseline kodiraju identičan scFv ili VH i/ili VL deo IgG-a). Za svrhe ove specifikacije, niz koji nosi jedan ili više zamenjenih kodona će biti definisan kao degenerisana varijacija. Drugi izvor varijacije niza može da se dogodi kroz ispravljanje RNK. Ovakvo ispravljanje RNK može da ima za rezultat drugi oblika suvišnosti kodona, u kojem promena otvorenog okvira čitanja nema za rezultat promenjen ostatak aminokiseline u izraženom proteinu. U okviru obima ovog pronalaska takođe su uključene mutacije bilo niza DNK, bilo transliranog antitela što poboljšava osnovna fizička svojstva izraženog antitela. U tom cilju, prikazani pronalazak se odnosi na (i) afinitetno zrele verzije antitela sličnog 13C3, uključujući, ali se ne ograničavajući na 13C3, 19A6 i IDI, i/ili (ii) mutirane oblike antitela sličnog 13C3, uključujući, ali se ne ograničavajući na 13C3, I9A6 i/ili IDI, uključujući, ali se ne ograničavajući na oblasti CDR1, CDR2 i/ili CDR3 generisane pomoću poznate metodologije sazrevanja afiniteta i rekombinantnih DNK tehnika poznatih po uvođenju mutacija vezanih za mesto. Ovakvi izolovani, ili prečišćeni molekuli nukleinske kiseline će predstavljati VH i/ili VL delove antitela sličnog 13C3. Ove nukleinske kiseline su suštinski slobodne od drugih nukleinskih kiselina. Za većinu
svrha kloniranja, DNK je prioritetna nukleinska kiselina. Ovi molekuli DNK mogu da se subkloniraju u ekspresioni vektor i zatim transfektuju i izabranu ćeliju domaćina u kojem rekombinantna ćelija domaćina obezbeđuje izvor značajnih nivoa relevantnog dela antitela sličnog 13C3, ili njegovog afmitetno zrelog dela. Ovakve procedure mogu da se koriste za različite uslužne programe, kao kao što je generisanje scFv-ova ili,, co-expressing" ovih VH i VL lanaca u sistem ekspresionog vektor sisara koji kodira ljudske CH i CL oblasti, recimo IgG antitela.
Prikazani pronalazak se takođe odnosi na rekombinantni vektor i rekombinantne domaćine, oba prokariotska i eukariotska, koji sadrže molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju odgovarajuće teške i/ili lake oblasti antitela sličnog 13C3. Ovi molekuli nukleinske kiseline, u celini, ili delimično, mogu da se povežu sa drugim DNK molekulima (tj., DNK molekulima koji obuhvataju imunoglobulinske gene koji se koriste za generisanje rekombinantnih ljudskih antitela) koji nisu prirodno povezani, da obrazuju „rekombinantne DNK molekule" koji kodiraju odgovarajuće ljudsko rekombinantno antitelo. Ovi vektori mogu da se sašto je od DNK ili RNK. Za većinu svrha kloniranja prioritetni su DNK vektori. Uobičajeni vektori uključuju plazmide, modifikovane viruse, bakteriofage, kozmide, veštačke hromozome kvasca i druge oblike epizomalnih ili integrisanih DNK. U okviru je delokruga iskusnog stručnjaka da odredi odgovarajući vektor za transfer određenog gena, generacije rekombinantnog ljudskog antitela ili drugu upotrebu. Metode subkloniranja posmatranih molekula nukleinske kiseline u ekspresione vektore, transformisanje ili transfektovanje ćelija domaćina koje sadrže vektore i metode pravljenja suštinski čistog proteina sadrže korake uvođenja odgovarajućeg ekspresionog vektora u ćeliju domaćina,
i kultivisanje ćelije domaćina pod odgovarajućim uslovima su dobro poznate. Tako proizvedeno antitelo (kao što je IgG rekombinantno ljudsko antitelo) može da se požnje sa ćelije domaćina konvencionalnim načinima. Bilo koji poznat ekspresioni vektor može da se koristi za upražnjavanje ovog dela pronalaska, uključujući i bilo koji vektor koji sadrži prigodan promoter i druge odgovarajuće regulatome elemente transkripcije. Rezultujući izraz izgradnje se prenosi u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina da proizvede rekombinantni protein. Ekspresioni vektori su ovde definisani kao nizovi DNK i translacije njihovih mRNK u odgovarajućeg domaćina. Ovakvi vektori mogu da se koriste za izražavanje eukariotskih DNK u različitim domaćinima kao što su bakterije, plavo zelene alge, ćelije biljaka, ćelije insekata i ćelije životinja. Naročito dizajnirani vektori omogućavaju kretanje tamo-amo DNK između domaćina kao što je bakterija-kvasac ili bakterija-ćelije životinje. Na odgovarajući način konstruisan ekspresioni vektor mora da sadrži: izvor replikacije za autonomnu replikaciju u ćelijama domaćina, selektabilne markere, ograničeni broj korisnih mesta za ograničavanje enzima, potencijal za veliki broj kopiranja i aktivne promotere. Promoter je defmisan kao niz DNK koji naređuje RNK polimerazi da se veže za DNK i započne RNK sintezu. Jak promoter je onaj koji izaziva započinjanje mRNK velikom frekvencijom. Tehnike za takve manipulacije mogu da se nađu opisane u Sambrook, et al. (1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nevv York) su dobro znane i na raspolaganju su stručnjacima koji vladaju uobičajenim veštinama u struci. Ekspresioni vektori mogu da uključe, ali nisu ograničeni na, vektore za kloniranje, modifikovane vektore za kloniranje, posebno dizajnirane plazmide ili,
viruse. Komercijalno raspoloživi ekspresioni vektori sisara koji mogu da budu pogodni, uključuju, ali nisu ograničeni na, pcDNA3. neo (Invitrogen), pcDNA3. 1 (Invitrogen), pCI-neo (Promega), pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 and pLITMUS39 5 (New England Bioloabs). pcDNAI, pcDNAlanp (Invitrogen), pcDNA3 (lnvi trogen), pMCIneo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-l(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 10 37146), pUCTag (ATCC 37460), and IZD35 (ATCC 37565). Takođe, na raspolaganju su različiti bakterijski ekspresioni vektori, uključujući, ali se ne ograničavajući napCR2. 1 (Invitrogen), pETl la(Novagen), lambdagtl 1 (Invitrogen), i pKK223-3 (Pharmacia). Pored toga, mogu se koristiti različiti gljivični ekspresioni vektori, uključujući, ali se ne ograničavajući na pYES2 (Invitrogen) i Pichie ekspresioni vektor (Invitrogen). Takođe, mogu se koristiti različiti ekspresioni vektori ćelija insekata, uključujući, ali se ne ograničavajući na pBlueBacIII and pBlueBacHis2 (Invitrogen), i pAcG2T (Pharmingen).
Rekombinantne ćelije domaćina mogu da budu prokariotske ili eukariotske, uključujući, ali se ne ograničavajući na, bakterije kao što je E. Coli, ćelije gljivica kao što je kvasac, ćelije sisara, uključujući, ali se ne ograničavajući na ćelijske linije goveđeg, svinjskog, majmunskog i glodarskog porekla; i ćelije insekata. Vrste sisara koje mogu da budu pogodne, -26 uključujući, ali se ne ograničavajući na, L ćelije L-M (TK-) (ATCCCCLI. 3), L ćelije L-M (ATCC CCL 1. 2), Saos-2 (ATCCHTB-85), 293 (ATCCCRL1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-I (ATCC CRL1650), 30 COS-7(ATCC CRL 1651), CHO-KI (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), Cl271 (ATCC
CRL 1616), BS-C-1(ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCCCCL171) i CPAE (ATCC CCL 209).
Još jedno poboljšanje ponovo projektovanih antitela kako je gore opisano je generacija potpuno ljudskih monoklonalnih antitela. Prvi obuhvata upotrebu genetički projektovanih mišjih kultura koje imaju imuni sistem u kojem su mišji geni antitela deaktivirani i u zauzvrat zamenjeni repertoarom funkcionalnih ljudskih gena antitela, dok su ostali delovi mišjeg imunog sistema ostali nepromenjeni. Ovakav genetski projektovan miš omogućava prirodni,, in vivo" imuni odgovor i proces sazrevanja afiniteta koji za rezultat ima visok afinitet, potpuno ljudska monoklonalna antitela. Ova tehnologija je ponovo sada dobro poznata u struci i potpuno je opisana u različitim publikacijama, uključujući, ali se ne ograničavajući na SAD patente pod brojevima: 5, 939, 598; 6, 075, 181; 6, 114, 598; 6, 150, 584 i s njima vezani članove familije (pripisane Abgenix-u, u kojima se obelodanjuje njihova XenoMouse tehnologija); kao i SAD patente pod brojevima: 5, 545, 806; 5, 569. 825; 5, 625, 126; 5, 633, 425; 20 5, 789, 650; 5, 877, 397; 5, 661, 016; 5, 814, 318; 5, 874, 299; i 5, 770, 429 (pripisane GenPharm Intemational-u i raspoložive preko Medarex-a, pod okriljem „UltraMab Human Antibody Development System"). Vidi takođe pregled Kellerman-a i Green-a (2002, Curr. Opinion in Biotechnology 13: 593 - 597).
Konačno, stručnjaku su na raspolaganju tehnike izbora delića antitela iz biblioteka korišćenjem tehnologija obogaćivanja, uključujući, ali se ne ograničavajući na „phage display (displej fagova)",.. ribosome display (displej ribozoma)" (Hanes and Pluckthun, 1997, Proc. 30 Nat. Acad. Sci. 94: 4937-4942). „bacterial display (displej bakterija)1' (Georgiou, et al., 1997,
Nature Biotechnology 15: 29-34) i/ili,, yeast display (displej kvasca)" (Kieke, et al., 1997, Protein Engineering 10: 1303-
1310) mogu se koristiti kao alternative prethodno razmatranim tehnologijama za izbor antitela jednostrukog lanca koji se posebno vezuje za ciljni citokin. Antitela jednostrukog lanca se biraju iz biblioteke antitela jednostrukog lanca proizvedenih neposredno korišćenjem tehnologije vlaknastih fagova. Tehnologija fagova je poznata u struci (npr., vidi tehnologiju Cambridge Antibody Technology (CAT)) kako je obelodanjeno u SAD patentima brojevi: 5, 565, 332; 5, 733, 743; 5, 871, 907; 5, 872, 215; 5, 885, 793; 5, 962, 255; 10 6, 140, 471; 6, 225, 447; 6, 291650; 6, 492, 160; 6, 521, 404; 6, 544, 731; 6, 555, 313; 6, 582, 915; 6, 593, 081, kao i drugim SAD članovima porodica, ili primene koje se oslanjaju na priroritetno punjenje GB 9206318, napunjeno 24. maja 1992.; vidi takođe Vaughn, et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 309314). Antitela jednostrukog lanca mogu takođe da se dizajniraju i konstruišu korišćenjem raspoloživih rekombinantnih DNK tehnologija, kao što je metoda amplifikacije DNK (npr., PCR), ili po mogućnosti korišćenjem pojedinih hibridoma cDNK kao šablon. Antitela jednostrukog lanca mogu da budu mono ili bispecifična; bivalentna ili tetravalentna. Niz nukletoida koji kodira antitela jednostrukog niza može da bude mono ili bispecifičan; bivalentan ili tetravalentan. Niz nukletoida koji kodira antitela jednostrukog niza može da bude konstruisan korišćenjeme ručne ili automatske sinteze nukleotida, kloniran u izraz, konstruisan korišćenjem standardnih rekombinantnih DNK metoda i uveden u ćeliju da izrazi niz kodiranja, kako je dole opisano.
Prikazani pronalazak se dalje odnosi na farmaceutski sastav zasnovan na antitelu koji sadrži efikasnu količinu antitela sličnog 13C3, ili afinitetno zrelu verziju, koja obezbeđuje izbor profilaktičkog ili terapijskog lečenja da bi se zaustavilo (sprečilo) stvaranje fibrilnih i/ili senilnih naslaga povezanih s Alchajmerovom bolesti. Farmaceutski sastav zasnovan na antitelu prikazanog pronalaska može da se formuliše bilo kojim brojem strategija poznatih u struci
(npr., vidi McGoff and Scher, 2000, Solution Formulation of Proteins/Peptides: In McNally, E. J., ed. Protein Formulation and Delivery. New York, NY: Marcel Dekker; pp. 139-158;
Akers and Defilippis, 2000, Peptides and Proteins as 5 Parenteral Solutions. In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Philadelphia, PA: Talyor and Francis; pp. 145-177; Akers, et al., 2002, Pharm. Biotechnol. 14: 47-127). Farmaceutski prihvatljiv sastav pogodan za primenu kod pacijenta će sadržati efikasnu količinu antitela u formulaciji koja zadržava biološku aktivnost dok takođe potpomaže maksimalnu stabilnost za vreme skladištenja u okviru prihvatljivog temperatuskog opsega. Farmaceutski sastavi mogu takođe da obuhvate, zavisno od željene formulacije, farmaceutski prihvatljive rastvarače, farmaceutski prihvatljive nosače i/ili farmaceutski prihvatljive ekscipijente, ili bilo kakvo ovakvo sredstvo (nosilac) uobičajeno korišćeno da se formulišu farmaceutski sastavi za primenu na životinjama i ljudima. Rastvarač se bira tako da ne utiče na biološku aktivnost kombinacije. Primeri ovakvih rastvarača su destilovana voda, fiziološki slani fosfatni pufemi rastvor, Ringerov rastvor, rastvor dekstroze i Henkov rastvor. Količina ekscipijenta koja je korisna u farmaceutskom sastavu ili formulaciji ovog pronalaska je u količini koja služi da se antitelo ravnomemo rasporedi kroz rastvor tako da on može da se ravnomerno rasprši kada se nanosi na subjekt, ako je potrebno. On može da služi da se antitelo rastvori do koncentracije koja obezbeđuje željene palijativne ili kurativne rezultate pri čemu u isto vreme minimizira bilo koje negativne prateće efekte koji mogu da se jave zbog prevelike koncentracije. On takođe može da ima prezervativan
efekat. Na taj način, za antitelo koje ima visoku fiziološku aktivnost, može se iskoristiti jedan ili više ekscipijenasa. S druge strane, za bilo koji aktivni sastojak(e) koji pokazuje nižu fiziološku aktivnost, biće iskorišćena manja količina ekscipijensa. U načelu, količina ekscipijensa u sastavu će biti između 50 % maseno (m/m) i 99, 9 %m/m ukupnog sastava. Ako antitelo pokazuje posebno nisku fiziološku aktivnost, količina ekscipijensa može da bude tako mala, i do 1 %m/m. S druge strane, za antitelo koje ima posebno visoku fiziološku aktivnost, količina ekscipijensa može da bude između 98, 0 i 99, 9 %m/m. Pored toga, antitelo ili antitela mogu da se primene u obliku „hemijskog derivata'1 (molekul koji sadrži dodatne hemijske udele koji normalno nisu deo baznog molekula). Ovakvi udeli mogu da poboljšaju rastvorljivost, poluživot, apsorpciju, itd. biološkog agensa. Alternativno, ovi udeli mogu da ublaže neželjena sporedna dejstva antitela. Farmaceutski sastavi mogu takođe da obuhvate velike, sporo metabolišuće makromolekule kao što su proteini, polisaharidi, polilaktične kiseline, poliglikolne kiseline i kopolimere (kao što je lateks funkcionališuća sefaroza, agaroza, celuloza i slično) polimeme amino kiseline, kopolimere amino kiselina i lipidne agregate (kao što su kapljice ulja ili lipozomi). Pored toga, ovi nosioci mogu da funkcionišu kao imuno stimulišući agensi (tj., adjuvansi). Za parenteralnu primenu, agensi pronalaska mogu da se primene kao doze koje se mogu ubrizgati rastvora ili suspenzije supstance u fiziološki prihvatljivom rastvaraču sa farmaceutskim nosačem koji može da bude sterilna tečnost kao što su vodena ulja, slani rastvori, glicerol ili etanol. Pored toga, pomoćne supstance kao što su
agensi za ovlaživanje ili emulzifikovanje, surfaktanti, supstance za pH puferisanje i slične mogu da budu prisutne u sastavima. Druge komponente farmaceutskih sastava su one naftnog, životinjskog, biljnog, ili sintetičkog porekla, na primer, ulje kikirikija, sojino ulje i mineralno ulje. Načelno, glikoli kao što je propilen glikol ili polietilen glikol su prioritetni tečni nosioci, posebno za rastvore koji se ubrizgavaju.
Formulacija antitela može da bude u tečnom obliku ili čvrstom obliku. Čvrsta formulacija je načelno liofilizovana i u rastvor se unosi pre primene bilo jedne, bilo više doza. Formulacije ne smeju da se izlažu ekstremnim temperaturama ili pH kako bi se izbegla toplotna denaturacija. Na taj način, neophodno je da se formuliše sastav antitela prikazanog pronalaska u okviru biološki relevantnog pH opsega. Rastvor puferovan da održi pravilan pH opseg za vreme skladištenja je naznačen, posebno za tečne formulacije koje se skladište duže vremenske periode između sastavljanja i primene. Do danas, i tečne i čvrste formulacije zahtevaju skladištenje na nižim temperaturama (uobičajeno 2-8 °C) da bi zadržale stabilnost tokom dužih perioda. Formulisani sastavi antitela, posebno tečne formulacije, mogu da sadrže bakteriostat da bi se sprečila ili svela na najmanju meru proteoliza za vreme skladištenja, uključujući, ali se ne ograničavajući na efikasne koncentracije (obično <1 %w/v) benzil alkohola, fenola, m-krezola, hlorbutanola, metilparabena i/ili propilparabena. Zbog toga, liofilizovana formulacija može da se rekonstituiše u rastvoru bilo da sadrži, bilo da ne sadrži ovakvu komponentu. Dodatne komponente mogu da se dodaju ili puferovanoj tečnoj ili čvrstoj formulaciji antitela, uključujući, ali se ne ograničavajući na šećere kao
krioprotektante (uključujući, ali se ne ograničavajući na polihidroksi ugljovodonike kao što su sorbitol, manitol, glicerol i dulcitol i/ili disaharide kao što je sukroza, laktoza, maltoza ili trehaloza) i, u nekim slučajevima, relevantnu so (uključujući, ali se ne ograničavajući na NaCl, KC1 ili LiCl). Ovakve formulacije antitela, posebno tečne formulacije namenjene za dugotrajno skladištenje, će se oslanjati na koristan opseg ukupne osmolamosti da bi i potpomogao dugotrajnu stabilnost na temperaturi od 2 - 8 °C, ili višoj, i takođe učinio formulaciju upotrebljivom za parenteralno ubruzgavanje. Efikasan opseg ukupne osmolamosti (ukupan broj molekula u rastvoru) je od oko 200 mOs/L do oko 800 mOs/L. Biće jasno da će količina krioprotektanta, kao što je sukroza ili sorbitol, zavisiti od količine soli u formulaciji da bi ukupna osmolamost rastvora ostala u okviru odgovarajućeg opsega. Zbog toga formulacije bez soli mogu da sadrže oko 5 % do oko 25 % sukroze, sa prioritetnim opsegom sukroze od oko 7 % do oko 15 %, sa posebno prioritetnom koncentracijom sukroze u formulacijama bez soli između 10 i 12 %. Alternativno, formulacija bez soli, zasnovana na sorbitolu, može da sadrži sorbitol u opsegu od oko 3 % do oko 12 %, sa prioritetnim opsegom sukroze od oko 4 % do 7 %, i posebno prioritetan opseg je od ok 5 % do oko 6 % sorbitola u formulaciji bez soli. Formulacije bez soli će svakako garantovati povećane opsege odgovarajućih krioprotektanata da bi se održali efikasni nivoi osmolamosti. Ove formulacije mogu takođe da sadrže divalentni katjon (uključujući, ali se ne ograničavajući na MgCl2, CaCl2 i MnCL2); i ne- 32 jonski surfaktant (uključujući, ali se ne ograničavajući na Polisorbat-80 (Tween 80®), Polisorbat-60 (Tween 60®),
Polisorbat-40 (Tvveen 40®) i Polisorbat-20 (Tvveen 20®), polioksietilen alkil etre, uključujući, ali se ne ograničavajući na Brij 58®, Brij 35®, kao i druge kao što su Triton X-100®, Triton X 114®, NP40®, Špan 85 i Pluronic serija nejonskih surfaktanata (npr., Pluronic 121)). Bilo koja kombinacija ovih komponenti, uključujući verovatne inkluzije bakteriostata, može da bude korisna za punjenje formulacija koje sadrže antitela prikazanog pronalaska. Sastav s antitelima prikazanog pronalaska može takođe da bude „hemijski derivat", koji opisuje antitelo koje sadrži dodatne hemijske udele koji nisu obično deo molekula imunoglobulina (npr., pegilacija). Ovakvi udeli mogu da poboljšaju rastvorljivost, poluživot, apsorpciju itd. osnovnog molekula. Alternativno, udeli mogu da razblaže neželjene sporedne efekte osnovnog molekula ili da smanje toksičnost osnovnog molekula.
U struci su poznati brojni primeri različitih nosača, rastvarača, ekscipijenasa i takvih i obelodanjeni su u ovde citiranim referencama, kao i u Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed.; Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990), čiji sadržaji su ovde uključeni pozivanjem na nju. Ukratko, biće korisno da odgovarajući nosači, ekscipijensi i drugi agensi mogu da budu uključeni da se formulišu farmaceutski sastavi da obezbede poboljšani transfer, dostavu, toleranciju i slično. Metode uključivanja biološkog agensa i/ili dodatnog aktivnog sastojka(aka) u nosač su poznate osobi uobičajene veštine u struci i zavise od prirode nosača izabranog od strane osobe koja primenjuje ovaj pronalazak. Jonsko vezivanje, inkapsulacija gela ili fizičko hvatanje unutar nosača, jontoforeza i potapanje
nosača u rastvor biološkog agensa su prikladni primeri posmatrani u formulisanju farmaceutskih sastava koji će se koristiti za primenu obelodanjenih metoda lečenja. Alternativno, nosač može da bude malo više od rastvarača za biološki agens. Ove formulacije mogu da obuhvate na primer, prahove, paste, masti, žele, voskove, ulja, lipide, anhidrovane apsorpcione baze, emulzije ulja u vodi ili vode u ulju. emulzije carbowax-a (polietilen glikoli različite molekuske težine), polučvrsti gelovi i polučvrste smeše koje sadrže carbowax. Režimi doziranja koji koriste jedinjenja prikazanog pronalaska se biraju u skladu sa različitim faktorima uključujući tip, vrste, starost, težinu, pol i medicinkso stanje pacijenta; ozbiljnost stanja koje se leči; put primene; renalnu, hepatičku i kardiovaskularnu funkciju pacijenta; i na osnovu toga se upotrebljava određeni biološki agens. Lekar ili veterinar uobičajene veštine može lako da odredi i prepiše efikasnu količinu leka potrebnog da se spreči, suprotstavi ili zaustavi razvoj stanja. Optimalna preciznost u postizanju koncentracija leka u okviru opsega koji postiže efikasnost bez toksičnosti zahteva režime zasnovane na kinetici raspoloživosti leka na ciljnim mestima. Ovo obuhvata razmatranje distribucije, ravnotežnog stana i eliminacije leka. Bilo koja od prethodnih formulacija može da bude odgovarajuća u lečenjima i terapijama u skladu sa prikazanim pronalaskom, pod uslovom da aktivni sastojak u formulaciji nije deaktiviran formulacijom i daje formulacija fiziološki kompatibilna.
Farmaceutski sastavi prikazanog pronalaska mogu da se primene na domaćina na bilo koji način, bilo kojom strategijom i/ili raspoloživom kombinacijom koja je na raspolaganju u struci u količinama dovoljnim da se pokuša terapijsko lečenje Alchajmerove bolesti. Ovi sastavi mogu da budu obezbeđeni pojedincu različitim putevima poznatim u struci, posebno parenteralnim putevima kao što je intravenozna (IV), imtramuskulama (IM); ili subkutana (SC) primena, pri čemu je IV primena norma u okviru struke za primenu terapijskih antitela. Ovi sastavi mogu da se primene kao zasebne ili višestruke doze (tj., primena antitela stepenasto održavanjem sterilnih uslova formulacije tokom režima lečenja). Režimi doziranja koji koriste jedinjenja prikazanog pronalaska se biraju u skladu s različitim faktorima uključujući tip, vrste, starost, težinu, pol i medicinsko stanje pacijenta (kao što je ljudski pacijent); ozbiljnost stanja koje se leči; put (način) primene; renalnu, hepatičku i kardiovaskularnu funkciju pacijenta; i određeno antitelo koje se stoga primenjuje. Lekar ili veterinar uobičajene veštine može lako da odredi i prepiše efikasnu količinu leka potrebnog da se spreči, suprotstavi ili zaustavi razvoj stanja. Optimalna preciznost u postizanju koncentracija leka u okviru opsega koji postiže efikasnost bez toksičnosti zahteva režime zasnovane na kinetici raspoloživosti leka na ciljnim mestima. Ovo obuhvata razmatranje distribucije, ravnotežnog stana i eliminacije leka. Ovde opisana antitela mogu da se koriste samostalno u odgovarajućim dozama. Alternativno, paralelna primena ili sekvencijalna primena drugog agensa može da bude poželjna. Biće
moguće predstaviti terapijski režim doziranja za antitela prikazanog pronalaska u sprezi s primenom alternativnih profilaktičkih ili terapijskih režima. Efikasan režim doziranja će varirati u zavisnosti od mnogih različitih faktora, uključujući načine primene, ciljno mesto, fiziološko stanje pacijenta, da li je pacijent čovek ili životinja, druge lekove koji se primenjuju i da lije lečenje prfilaktičko ili terapijsko. Za primenu antitela sličnog 13C3, opsezi doziranja od oko 0, 0001 do 100 mg/kg, i još uobičajenije 0, 01 do 5 mg/kg telesne težine domaćina. U slučaju Alchajmerove bolesti, amiloidne naslage se javljaju u mozgu, agensi pronalaska mogu takođe da se primene u sprezi s drugim agensima koji uvećavaju prolaz agenasa pronalaska kroz moždano-krvnu pregradu.
Drugi aspekt u pogledu režima dostave i doziranja za sastav antitela sličnog 13C3 prikazanog pronalaska se odnosi na dostavu leka preko parenteralnih puteva, koji mogu da obuhvate uređaja bez i sa ubrizgavanjem. Obično, sastavi koji se ubrizgavaju se pripremaju ili kao tečni rastvori ili suspenzije; čvrsti oblici pogodni za rastvaranje, ili suspendovanje, pre ubrizgavanja takođe se mogu pripremiti tečni nosioci. Preparat takođe može da bude emulizifikovan, ili inkapsuliran u lipozomima ili mikročesticama kao što su poliaktid, plojiglikolid, kako je gore razmotreno (vidi Langer, 1990, Science 249; 1527-1523; and Hanes, 1997, Advanced Drug Delivery Revievvs 28: 97-119). Agensi ovog pronalaska mogu da se primene u oblik depo inekcija ili implant preparata koji može da bude formulisan na takav način
da dozvoli stalno ili naizmenično oslobađanje aktivnog sastojka.
Određena oličenja obuhvataju PLGA mikrosfere, kako je ovde razmotemo i kako je dalje poznato u struci, kao i nerazgradljive nosioce zasnovane na polimerima koji sadrže poli (etilen kovinil acetat; PEVAc). Pored toga, kontrolisano oslobađanje i lokalizovana dostava terapijskih proizvoda zasnovanih na antitelima je prikazana u Grainger, et al., 2004, Expert Opin. Biol. Ther. 4(7): 1029-1044), ovde u potpunosti uključena pozivanjem na nju. Prikladne mirkokapsule sposobne da inkapsuliraju antitelo mogu da takođe da obuhvate hidrometil celulozu ili želatinske mikrokapsule i mikrokapsule od polimetil metakrilata pripremljene tehnikama koacervacije ili interfacijalnom polimerizacijom. Vidi PCT publikaciju WO 99/24061 pod naslovom "Method for Producing IGF-1 Sustained-Release Formulations (Metoda za proizvodnju IGF-1 formulacija sa stalnim oslobađanjem), " u gde je protein inkapsuliran u PLGA mikrosferama, ova referenca koja je ovde u potpunosti uključena pozivanjem na nju. Pored toga, mogu se takođe koristiti mikroemulzije ili koloidalni sistemi dostave lekova kao što su lipozomi i albuminske mikrosfere. Drugi prioritetni sastavi sa stalnim oslobađanjem koriste bioadhezive da bi zadržali antitelo na mestu primene. Kako je gore napomenuto, formulacija sa stalnim oslobađanjem može da sadrži biodegradabilni polimer u koji je spremljeno antitelo, koji može da obezbedi odloženo oslobađanje. Uređaji bez ubrizgavanja mogu se ovde opisati kao „implant'", „farmaceutski depo implant", „depo imlpant", „depo bez ubrizgavanja"1 ili nekim ovakvim sličnim pojmom. Uobičajeni depo implanti mogu da obuhvate, ali nisu ograničeni na, čvrste bio degradabilne i bio nedegradabilne polimerne uređaje (kao što je produžen polimemi ili koaksijalni uređaj u obliku šipke), kao i brojne pumpne
sisteme takođe poznate u struci. Uređaji sa ubrizgavanjem su podeljeni na bolusne inekcije (oslobađanje i disipacija leka posle ubrizgavanja), i repozitome ili depo inekcije, koje obezbeđuju rezervoar na mestu ubrizgavanja, koji omogućava trajno oslobađanje biološkog agensa tokom vremena. Depo implant može da bude hirurški vezan za tačku dostave tako da obezbedi odgovarajući rezervoar za produženo oslobađanje antitela tokom vremena. Ovakav uređaj će biti sposoban da nosi formulaciju leka u takvim količinama kakve su terapijski ili profilaktički potrebne za lečenje za vreme prethodno izabranog perioda. Depo implant takođe može da obezbedi zaštitu formulacije od degradacije telesnim procesima (kao što je proteaza) za vreme trajanja lečenja. Kako je poznato u struci, pojam „trajno oslobađanje" se odnosi na postepeno (stalno ili povremeno) oslobađanje takvog agensa iz bloka polimerne matrice tokom produženog perioda vremena, Bez obzira na određeni uređaj, trajno oslobađanje sastava sa antitelom sličnim 13C3 će imati za rezultat biološki efikasne koncentracije antitela. Trajno oslobađanje biološkog agensa (agenasa) će biti za vreme perioda od jednog dana, nekoliko dana, nedelju dana ili više; ali, najverovatnije tokom mesec dana ili više, ili do oko šest meseci, zavisno od formulacije. Prirodni ili sintetički polimeri poznati u struci će biti korisni kao depo implanti zbog svojstava kao što su prilagodljiva kinetika degradacije, bezbednost i biokompatibilnost. Ovi kopolimeri se mogu udešavati da se modifikuje farmakokinetika aktivnog sastojaka, zaštiti agens od enzimskog napada, kao i od degradacije tokom vremena na mestu pričvršćivanja ili ubrizgavanja. Stručnjak će razumeti da pošto je opširna uputstva u struci za podešavanje
svojstava ovh kopolimera, uključujući pojedine procese proizvodnje, korišćene katalizatore i krajnje molekulske težine depo implanta sa trajnim oslobađanjem ili depo inekcija. Prirodni polimeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na proteine (npr. kolagen, albumin ili gelatin); polisaharide (celulozu, škrob, alginati, hitin, hitosan, ciklodekstrin, dekstran, hijaluronska kiselina) i masti. Biodegradabilni sintetički polimeri mogu da obuhvate, ali nisu ograničeni na različite pollestre, kopolimere L- glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamat (Sidman et al„ 1983, Biopolymers 22: 547-556), poliaktide ([PLA]; SAD patent br. 3. 773, 919 i EP 058, 481), poliaktat, poliglikolat (PLGA) kao što je poliaktid-ko-glikolid (vidi, na primer, SAD patente brojevi 4, 767, 628 i 5, 654, 008), poliglikolid (PG), polietilen glikol (PEG) konjugati poli(a-hidroksi kiselina), poliortoestri, poliaspirini, polifosfageni, vinilpirolidon, polivinil alkohol (PVA), PVA-g-PLGA, PEGT-PBT kopolimer (poliaktivni), metakrilati, poli (N-izopropilakrilamid), PEO-PPO-PEO (pluronics), PEO-PPO-PAA kopolimeri, PLGA-PEO-PLGA, poliortoestri (POE), ili bilo koja njihova kombinacija, kako je gore opisano (vidi, na primer, Langeretal., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277; Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105, nedegradabilan etilen-vinil acetat (npr. etilen vinil acetat diskovi i poli(etilen-ko-vinil acetat)), degradabilni polimeri laktičke kiselina glikolne kiselina kao što je Lupron Depot™, poli-D-(-)-3-hidroksiputerna kiselina (EP 133, 988), gelovi hijaluronske kiseline, (vidi, na primer, SAD patent br. 4, 636, 524), suspenzije alginske kiseline, poliortoestri (POE), i
slični. Poliaktid (PLA) i njegovi kopolimeri sa glikolidima (PLGA) su dobro poznati u struci od komericijalizacije Lupron Depot™, odobrenog 1989. kao prve parenteralne formulacije sa stalnim oslobađanjem koja koristi PLA polimere. Dodatni primeri proizvoda koji koriste PLA i PLGA kao ekscipijens da bi postigli trajno oslobađanje aktivnog sastojka obuhvataju Atridox (PLA; peridontalna bolest), Nutropin Depot (PLGA; sa hGH), i Trelstar Depot (PLGA; rak prostate). Drugi sintetički polimeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na poli (c-kaprolaktam), poli3-hidroksibutirat, poli (β-malna kiselina) i poli (dioksanon)]; polianhidridi, poliuretan (vidi WO 2005/013936), poliamidi, ciklodestrani, poliortoestri, n-vinil alkoholo, polietilen oksid / polietilen tereftalat, polifosfazen, polifosfat, polifosfonat, poliortoester, policijanoakrilat, poletilenglikol, polihidropiran i poliacital. Bio nedegradabilni uređaji obuhvataju, ali nisu ograničeni na različite derivate celuloze (karboksimetil celuloza, celulozni acetat, celulozni aceta propionat, etil celuloza, hidroksipropil metil celuloza) implanti na bazi silikona (polidimetilsiloksan), akrilni polimeri, (polimetakrilat, polimetilmetakrilat, polihidroksi(etilmetilakrilat), kao i polletilen-ko-(vinil acetat), poloksamer, polivinilpirolidon, poloksamin, polipropilen, poliamid, poliacetal, pollester, poli etilen-hlortrifluoretilen, politetrafluoretilen (PTFE ili „Teflon™"), stiren butadijen guma, polietilen, polipropilen, polifenilen oksid-polistiren, poli-a-hloro-p-ksilen, polimetilpenten, polisulfon i drugi srodni biostabilni polimeri. Prikladni nosači za depo formulacije za trajno oslobađanje obuhvataju, ali nisu ograničeni na, mikrosfere,
filmove, kapsule, čestice, gelove, premaze, matrice, vafere (ploče), pilule ili druge farmaceutske sastave za dostavu. Primeri ovih formulacija za trajno oslobađanje su gore opisani. Vidi takođe SAD patente brojevi: 6, 953, 593; 6, 946, 146; 6, 656, 508; 6, 541, 033; i 6, 451, 346, čiji su sadržaji ovde uključeni pozivanjem na njih. Oblik doziranja mora da bude sposoban da nosi formulaciju leka u takvim količinama i koncentracijama kako je terapijski potrebno za lečenje tokom prethodno izabranog perioda i mora da obezbedi dovoljnu zaštitu formulacije od degradacije telesnim procesima za vreme trajanja lečenja. Na primer, oblici doziranja mogu da budu okruženi spoljašnošću napravljenom od materijala koji ima svojstva da štiti od degradacije od metaboličkih procesa i rizika od njih, npr. curenje, krekovanje, lom, ili iskrivljavanje. Ovo može da spreči istiskivanje sadržaja oblika za doziranje na nekontrolisani način pod pritiscima kojima može da bude podvrgnut za vreme upotrebe, npr. zbog fizičkih sila kojima je izložen pod dejstvom uređaja za oslobađanje leka kao rezultat normalne artikulacije mesta spajanja i drugih pokreta subjekta ili, na primer, kod konvektivnih uređaja za dostavu leka, fizičkih sila povezanih sa pritiskom nastalim u okviru rezervoara. Rezervoar leka ili druga sredstva za držanje leka moraju takođe da budu od takvog materijala da bi se izbegle nenameravane reakcije sa formulacijom aktivnog agensa i koji je prioritetno biokompatibilan (npr., u pogledu tela subjekta ili telesnih tečnosti). Načelno, dotični biološki agens(i) se primenjuje na pojedinca najmanje 12 sati, najmanje jednu nedelju i najverovatnije preko implanta dizajniranog da dostavlja lek najmanje 10, 20, 30, 100 dana ili najmanje 4 meseca, ili najmanje 6 meseci ili više,
po potrebi. Antitelo slično 13C3 može da se dostavi pri tako relativno niskim protocima, npr. od oko 0, 001 ml/dan do 1 ml/dan tako da se minimizira poremećaj tkiva ili trauma u blizini mesta gde se formulacija oslobađa Formulacija može da se oslobodi brzinom od, zavisno od određenog biološkog agensa (agenasa), pri maloj dozi, npr., od oko 0, 01 μg/h ili 0, 1 μg/h, 0, 25 μg/h, 1 μg/h, načelno do oko 200 μg/h, ili se formulacija oslobađa pri malom zapreminskom protoku npr., zapreminski protok od oko 0, 001 ml/dan do oko 1 ml/dan, na primer 0, 01 mikrograma dnevno do oko 20 miligrama dnevno. Doziranje zavisi od određenog broja faktora kao što su potencija, bioraspoloživost i toksičnost aktivnog sastojka (npr., IgG antitelo) koji se koriste i potreba subjekta.
Ovi i drugi objekti, prednosti i svojstva prikazanog pronalaska će postati vidljivi osobama veštim u struci posle čitanja detalja o metodologiji i sastavima koji su potpunije izneti dole. PRIMERI
PRIMER 1: PRIPREMANJE PROTOFIBRILARNOG OBLIKA AMILOID BETA (A(342) Aβ42 sintetički peptidi (American Peptide Company, Ine., CA) su pripremljeni u skladu sa metodom koju su opisali Fezoui et al. (Fezoui, et ai. Amyloid 7(3): 166-178. (2000)). Ukratko, liofilizovan Aβ42 je rastvoren u 2mM NaOH u koncentraciji 1 mg/ml (pH~ 10, 5) posle čega je sonikacije i liofilizacije. Aβ obrađen sa NaOH je rastvoren u vodi u koncentraciji od 1 mg/ml i filtriran kroz filter 0, 22 pm ULTRAFREE-MC filter (Millipore, MA). Peptidni rastvor od 0, 5 mg/ml je puferovan na krajnjoj koncentraciji od 50 mM fosfata; 100 mM natrijum hlorid i inkubiran 4 sata na
sobnoj temperaturi. Da bi se odvojio protofibrilarnih oblik proteina male molekulske mase, supematant je izdeljen korišćenjem ekskluzione hromatografije (SEC). Prečišćene SEC frakcije su zatim uskaldištene na 4 °C.
Različizi oblici Aβ42 proteina su se prikazali pokazujući svoju sposobnost da kao monomeri ili dimeri povežu zajedno da stvore oligomer (protofibril) velike molekulske težine (Slika 1).
Dalja agregacija rastvorljivih protofibrila stvara nerastvorljiv oblik proteina, pri čemu protofibrili mogu da disosuju nazad u oblik male molekulske težine.
Da bi se prečistio protofibrilami oblik Aβ od proteina male molekulske težine, uzorci su podeljeni pomoću sistema AKTA hromatografije korišćenjem Superdex 75 ekskluzione kolone. Slika 2A prikazuje da bez inkubiranja Aβ 42 sintetičkih peptida na sobnoj temperaturi, nema agregacije oligomera da bi se stvorili protofibrili. Slika 2B ilustruje da posle 4 sata inkubacije Aβ42 sintetičkih peptida, kasnije SEC prečišćavanje pokazuje konačnu protofibrilnu frakciju.
PRIMER 2: GENERISANJE MONOKLONALNIH ANTITELA SA SPECIF1ČNOŠĆU ZA PROTOFIBRILARNI Aβ
Antitela I3C3, 19A6, i IDI su stvorena imunizovanjem Balb/c miša fibrilamim Aβ proteinom koristeći protokol poznat u struci. (Harlow, et al. Cold Spring Harbor Laboratory. (1988)) Slezina je uklonjena i spojena sa SP2 mijelomskim ćelijama u nekoliko poslužavnika za 96 uzoraka. Praćenje rast i fuzionih kultura i supematanti su proveravani za njihovu sposobnost da vežu protofibrilami oblik imunološkim ispitivanjima za vezivanje antitela.
PRIMER 3: KARAKTERIZACIJA MONOKLONALNIH TELA SA SPECIFIČNOŠĆU ZA
PROTOFIBRILARNI Aβ
Ispitivanja za hvatanje antitela su korišćena za dalju karakterizaciju monoklonalnih tela proizvedenih iz hibridoma (13C3, 19A6, i IDI). Ploče za mikrotitriranje, 50 ul od 2 ug/ml rastvora protofibrilamog Aβ42 proteina su dodate svakoj pločici i ploče su inkubirane na 4 °C preko noći. Posle inkubacije, rezidualni rastvor antigena je uklonjen i ispran PBS rastvorom. Serijska razblaženja supematanata hibridoma su dodavana na ploče koje sadrže vezani antigen i inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Ovaj primarni rastvor antitela je uklonjen i pločice su ponovo isprane PBS rastvorom. Posle toga je dodato sekundarno antitelo označeno enzimom i inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi. Posle uklanjanja rastvora sekundarnog antitela, hromogenični supstrat karakterističan za konjugovane enzime, je dodat u reakciju i detekcija uhvaćenog antitela proizvodi kvantitativne rezultate.
Pored toga, identifikovano je menjanje sekundarnog agensa u anti-imunoglobulinska antitela karakteristična za izotop, određenog izotopa imunoglobulina svakog monoklonalnog antitela.
U ovim eksperimentima, komercijalno raspoloživa anti-Aβ42 antitela su korišćena za poređenje vezivne specifičnosti monoklonalnih antitela 13C3, 19A6, i IDI.
Slike 3A i B ilustruju protofibrilame (PF) oblike i oblike male molekulske težine (LMW) Aβ42 peptida korišćenog za ispitivanje specifičnosti antitela 13C3 u imonološkim ispitivanjima hvatanja antitela. Naročito, Slika 3A ilustruje dijagram generisan iz ELISA-e koji pokazuje da je antitelo 13C3 karakteristično za protofibrilami oblik (PF) Aβ42 i da ne prepoznaje oblike
male molekulske težine (LMW) proteina. Slika 3B i 1 u stru j e ELISA podatke sa komercijalno raspoloživim 4G8 antitelom, pokazujući da on prepoznaje i protofibrilame i oblike male molekulske težine Aβ42 proteina.
PRIMER4: SPECIFIČNOST MONOKLONALNIH ANTITELA PROTOFIBRILARNOG OBLIKA Aβ42 KORIŠĆENJEM POVRŠINSKE PLAZMON REZONANSE (bIACORE)
Prečišćena monoklonalna antitela navedena u Tabeli 1 (dole), su imobilisana na BIAcore senzorskom čipu u skladu sa objavljenim protokolima. (Niče, et al. BioEssays 21: 339-352 (1999)). Velika senzitivnost BIAcore optičkog odgovora kvantifikuje promenu reflektivnosti i generiše se osnovni odgovor samo na ligand. Interakciona analiza se obavlja čim se analiti, LMW oblik ili PF oblik Aβ42, ubrizgaju u rastvor preko senzorskog čipa i promena u površinskoj plazmon rezonansi generiše odgovor indentifikujući specifičnost sposobnosti svakog antitela da veže LMW i PF Aβ42. I 13C3 i 19A6 antitela vezuju se za PF oblik Aβ 42 sa većom specifičnošću od LMW oblika. Od svih antitela korišćenih u ovom eksperimentu, komercijalno raspoloživa antitela su pokazala veću specifičnost za LMW Aβ42 nego za PF oblik Aβ 42, kako je naznačeno odnosom PF vezivanje / LMW vezivanje (stepen vezivanja).
Tabela 1
Analiza pomoću površinske plazmon rezonanse pokazala je senzorgramom da se 13C3 (Slika 4B) ne vezuje za LMF oblike
Aβ 42 proteina. Međutim, 4G8 (Slika 4A) pokazuje standardnu krivu asocijacije/disocijacije za LMW Aβ42 protein. Kontrolni izotop antitela lgGl (Slika C) se takođe ne vezuje za LMA Aβ. Automatizovani BlAcore sistemi, koji koriste princip detekcije Površinske plazmon rezonanse, su korišćeni u ovim eksperimentima. Podaci o specifičnosti vezivanja za antitelo 19A6 su pokazali da 19A6 ima stepen vezivanja od 5, 8, što je slično stepenu vezivanja antitela 13C3 od 5, 3.
PRIMER 5: MAPIRANJE EPITOPA ANTITELA 13C3
Mapiranje epitopa 13C3, IDI i 19A6 je sprovedeno korišćenjem aparata RepliTope Microarrays system (JPT Peptide Technologies GmbH) u skladu s objavljenim protokolom. (Korth, et al. 390: 74 (1997)). Svaka tačka na mikronizu sadrži 13 peptida aminokiselina Aβ42 gde svaki pomer, tj., aj položaja na mikronizu predstavlja pomeraj aminokiseline (od N-člana do C-člana) SEQ 1D NO: 23, SEQ ID NO: 24... SEQ 1D NO: 51; i SEQ ID NO: 52. Dole su nabrojani peptidi i njihovi tačni nizovi aminokiselina, koji odgovaraju njihovom položaju na kliznom nizu. Kada se jednom peptidi fiksiraju za RepliTope Microarray, uzorci se inkubiraju 13C3 antitelom i zatim redom označavaju sekundarnim koje je konjugovano hemiluminiscentnom oznakom (tagom) po izboru. Tačke koje proizvode signal reprezentuju mesta vezivanja epitopa na protein pomoću antitela.
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His (SEQ ID NO:
23)
Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His (SEQ ID NO:
24)
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln (SEQ ID NO:
25)
Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys (SEQ ID NO:
26)
Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu (SEQ ID NO:
27)
His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val (SEQ ID NO:
28)
Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe (SEQ ID NO:
29)
Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe (SEQ ID NO:
30) '
Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala (SEQ ID NO: 31 )
Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu (SEQ ID NO:
32)
Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp (SEQ ID NO:
33)
Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val (SEQ ID NO:
34)
His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly (SEQ ID NO:
35)
His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser (SEQ ID NO:
36)
Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn (SEQ ID NO:
37) '
Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys (SEQ ID NO: 38 )
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly (SEQ ID NO:
39)
Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala (SEQ ID NO:
40)
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile (SEQ ID NO:
41)
Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lle Ile (SEQ ID NO:
42)
Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly (SEQ ID NO:
43)
Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu (SEQ ID NO: 44 )
Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met (SEQ ID NO:
45)
Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val (SEQ ID NO:
46)
Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile lle Gly Leu Met Val Gly (SEQ ID NO:
47)
Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly (SEQ ID NO:
48)
Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val (SEQ ID NO:
49)
Lys Gly Ala Ile lle Gly Leu Met Val GIy Gly Val Val (SEQ ID NO:
50)
Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile (SEQ ID NO:
51)
Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala (SEQ ID NO:
52)
Slika 5A ilustruje,, dot blot" iz eksperimenta RepliTope Microarray identifikujući epitope antitela, 13C3, IDI i 4G8 na Aβ 1-42 peptida. Vezano antitelo je prikazano hemiluminiscentnim signalom. Slika 5B ilustruje niz aminokiseline Aβ 1-42 koji pokazuje polipeptidne nizove epitopa 13C3 kako se oni javljaju u nizu. Antitelo IDI pokazuje iste epitope kao 13C3 dok komercijalno 4G8 antitelo identifikuje različite epitope.
PRIMER 6: KARAKTERIZACIJA SPECIFIČNOSTI 13C3
Slika 6 ilustruje delove ekskluzione hromatografije supernatanata iz ćelijske linije 7PA2, sekretujuću Aβ oligomemu ćelijsku liniju. Ispitivanja hvatanja antitela su korišćena da se dalje karakteriše vezivanje antitela 13C3 sa protofibrilamim delovima i delovima male molekulske težine 7PA2 prečišćenog u SEC. Na ploče za mikrotitriranje, dodato je 100 ul rastvora 1: 200 svake frakcije na svaku pločicu i ploče su inkubirane preko noći na 4 °C. Posle inkubacije, rezidualni rastvor antigena je uklonjen i ispran PBS rastvor. Serijska razređenja 13C3 supernatanata su dodata na ploče koje sadrže vezani antigen i inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Ovaj primami rastvor antitela je uklonjen i pločice su ponovo oprani PBS rastvorom. Sekundarno antitelo označeno enzimom je zatim dodato i inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi. Posle uklanjanja rastvora sekundarnog antitela, hromogeni supstrat karakterističan za konjugovani enzim je dodat u reakciju i detekcija uhvaćenih antitela je proizvela kvantitativne rezultate. Ovo ispitivanje je identifikovalo da antitelo 13C3 naročito prepoznaje samo protofibrilame frakcije dok antitelo 4G8 prepoznaje sve frakcije. 7PA2
ćelijsku liniju je obezbedio Dennis J. Selkoe, M. D. sa Medicinskog fakulteta na Harvardu. PRIMER 7 KARAKTERIZACIJA REAKTIVNOSTI 13C3 POMOĆU EM Metod razmazivanja je obavljen korišćenjem standardnog protokola. (Brenner, et al. Biochim. Biophys. Ada 34, 103110 (1959)). Mala zapremina (10 mikrolitara) 0, 2 mg/ml protofibrilamog rastvora je primenjena na „formvar" mreže obložene ugljenikom (400 mrežica) za 2 minuta. Onda su mreže blokirane u 1% BSA i inkubirane antitelom 13C3 posle čega je kasnije obavljena inkubacija sekundarnim antitelom konjugovanim za koloidalno zlato. Uzorci su negativno razmazani postavljanjem 2 sukcesivne kapi 2% fosfotungstične kiseline po 30 sekundi svaki. Višak razmaza je obrisan filter papirom, mreže su osušene na vazduhu i posmatrane na transmisionom elektronskom mikroskopu JEOL 100CX na 80 kV. Slike su snimljene na Kodak 4489 negative velikog formata i digitalizovane na ravnom skeneru.
IEM (Imuno Elektronska Mikroskopija) slike pokazuju specifičnost vezivanja anti-Aβ klona antitela 13C3 na Aβ42 vlakna (Slike 7B i 7C), dok se izotopno kontrolno antitelo, IgGl ne vezuje (Slika 7 A). Sekundarno antitelo je konjugovano na česticu koloidalnog zlata.
PRIMER 8: LEČENJE MIŠJEG MODELA LJUDSKE AD POMOĆU 13C3 Monoklonalno antitelo 13C3 je korišćeno za tretiranje Aβ naslaga kod mišjeg modela Alchajmerove bolesti, TgCRND8. Miš sadrži ljudski APP695 cDNK transgen, koji ubrzava stvaranje naslaga Aβ amiloidnih naslaga u mozgu miša, koje se pojavljuju u okviru 1 meseca starosti. Ogledna grupa od 5 TgCRND8 miševa pet nedelja starosti je bila imunizovana monoklonalnim antitelom 13C3 koncentracije 10 mg/kg telesne težine miša jednom nedeljno u toku sedam nedelja. Druga grupa od 5 TgCRND8 miševa,
je primila kuru lečenja, međutim primenjeno je izotopsko IgGl kontrolno antitelo. Eksperimenti su ponovljeni s lečenjima dva puta nedeljno umesto jednom nedeljno.
I kontrolne i eksperimentalne životinje su žrtvovane u starosti od 12 nedelja. Histološki preparati mozga su otkrili smanjenja Aβ naslaga kod miševa tretiranih sa 13C3.
Serijski isečci mozgova TgCRND8 miša sačuvani u kriološkim uslovima su tretirani monoklonalnim antitelim 13C3 ili IgGl. Slike 8A i 8B ilustruju razlike u broju Aβ amiloidnih naslaga između svakog pojedinog antitela.
Statistički T-testovi pokazuju da lečenje sa 13C3 jednom nedeljno smanjuje Aβ amiloidne naslage kod modela Alchajmerove bolesti (Slika 9A). Međutim, lečenja dva puta nedeljno (Slika 9B) pokazuju isti nivo smanjenja naslaga.
Svi gore navedeni TgCRND8 miševi su dobijeni od Dr. David Westaway sa Univerziteta u Torontu.
PRIMER 9: MOLEKULARNA KARAKTERIZACIJA PROMENLJIVIH OBLASTI MAB
13C3
Promenljiva oblast IgG teškog lanca i Kappa oblast IgG lakog lanca su klonirane od 13C3 hibridoma. I niz teškog i niz lakog lanca (Slika IO) su analizirani korišćenjem VBASE2 (http: //www. vbase2. org), baze podataka linije klica varijabilnih gena od imunoglobulinskog Iokusa ljudi i miševa izvađene iz EMBL-Bank i Ensembl bibiloteke podataka. (Retter et al. Nucleic Acids Res. 33: D671 -4 (2005)). Rezultati analiza su identifikovali da su promenljive oblasti i teških i lakih lanaca bile od novo identifikovanog imunoglobulina, ali su imale 73 % i 81 % istovetnosti, redom, sa drugim imunoglobulinskim promenljivim oblastima u bazi podataka. Takođe su u ovim nizovima, prema ovim bazama podataka, identifikovane okvirne oblasti (FWR) i oblasti za određivanje komplementarnosti (CDR). Rezultati su se malo razlikovali kada su nizovi analizirani prema bazama podataka VBASE, KABAT, i IMGT/L1GM.
PR1MER 10: AKUTNA PERIFERALNA PRIMENA 13C3 KOD APP TRANSGENSK1H MIŠEVA NE DOVODI DO POVEĆANJA PLAZMA Aβ ZA RAZLIKU OD PR1MENE REFERENTNOG ANTITELA 3D6
U APP transgenske miševe (Thy APPSL, starosti 10-14 nedelja) su intraperitonealno ubrizgane doze od 10 mg/kg (tj., 300 μg/mišu) antitela 13C3, kontrolnog IgGl (DM4, ne prepoznaje Aβ) i referentnog anti-Aβ antitela 3D6 koja prepoznaju sve konformere Aβ. Plazma Aβ je kvantifikovano u nultom trenutku pre ubrizgavanja, 6 h, 24 h i 7 dana posle ubrizgavanja u istog miša. Kvantifikovanje plazma Aβ je obavljeno imunološkim ispitivanjem korišćenjem anti-Aβ parova antitela koji ne ometaju vezivanje 13C3 ili 3D6 za Aβ.
Primena 3D6 antitela prema svim konformerima Aβ vodi do velikog povećanja plazma Aβ, verovatno zaštitom Aβ molekula od degradacije. Ovaj efekat je korišćen za pretpostavku potencijalne hipoteze „periferijskog ponora'' kao mehanizma dejstva anti-Aβ imunoterapije (Demattos et al„ 2001, PNAS 17: 8850). Za razliku od 3D6, primena 13C3 ne dovodi do porasta nivoa plazma Aβ. Ovo je konzistentno sa svojstvima 13C3, antitela koje je karakteristično za protofibrilame oblike Aβ i koje ne prepoznaje rastvorljive mono- ili oligomerne oblike Aβ peptida. Ovi oblici su verovatno oni koji su prisutni u plazmi.
PRIMER 11: 13C3 PREPOZNAJE LJUDSKE AMILOIDNE NASLAGE (NAGOMILANE) U MOZGOVIMA BOLESNIKA OD AD ALI NE ŠIRE NASLAGE Aβ ZA RAZLIKU OD REFERENTNOG 3D6 ANTI-Aβ ANTITELA
Korišćenjem standardnih tehnika obavljene su imuno histohemijske studije antitela 13C3 i 3D6 na isečcima ljudskog mozga sa dijagnostikovanom Alchajmerovom bolesti. Imuno razmazivanje antitela je detektovano DAB hromogenom (SI. 12). 13C3 označava amiloidne naslage tipične morfologije zrelih amiloidnih
neuritičnih naslaga (takođe zvanih guste naslage) s veoma gustom korom okruženom lakšim oreolom ili za veće naslage veoma jakim zamrljanjem. Kod susednih moždanih delova 3D6 boji mnogo više objekata nego 13C3 kao što se vidi pri manjem uvećanju (SI. 12, leve ploče). Dalja karakterizacija pri većem uvećanju ((SI. 12, desne ploče) je naznačila da 3D6 označava iste zrele amiloidne neuritičke naslage kao i 13C3 i dodatno, brojne difuzne amiloidne naslage koje su klasično opisivane korišćenjem anti-Aβ imuno označavanja. Difuzne naslage nisu fibrilame prirode kako je opisano u literaturi jer one ne mogu da se otkriju pomoću tioflavina A i drugih histoloških markera ili vlakana (Mann, 1989, Ann. Med. 21: 133). Da bi se isključile razlike u osetljivosti dva antitela, sprovedeni su slični eksperimenti sa većim koncentracijama (20 μg/ml) 13C3 i ponovo nisu mogle da budu otkrivene difuzne naslage. Ovi podaci su konzistentni sa svojstvima 13C3, antitela koje je karakteristično za protofibrilame oblike Aβ i koje ne prepoznaje mono- ili oligomerne oblike Aβ peptida za razliku od 3D6. INDUSTRIJSKA PRIMENLJIVOST
Pronalazak ima primene u lečenju i dijagnozi Alchajmerove bolesti.
Sve publikacije citirane u specifikaciji, i patentne publikacije i nepatentne publikacije, ukazuju na nivo veštine onih koji vladaju veštinama u struci na koju se odnosi ovaj pronalazak. Sve ove publikacije su ovde potpuno uključene pozivanjem na njih do istog obima kao daje svaka pojedina publikacija određeno i posebno navedena daje uključena pozivanjem na nju.
Iako je ovde opisan pronalazak sa pozivanjem na određena oličenja, treba razumeti da su ova oličenja samo ilustracija principa i primena prikazanog pronalaska. Zbog toga treba razumeti da mogu da se obave brojne modifikacije ilustrativnih oličenja i da se mogu osmisliti drugi aranžmani bez napuštanja duha i obima prikazanog pronalaska kako je definisano u sledećim zahtevima.

Claims (29)

1.    Izolovano antitelo koje posebno interaguje i pokazuje merljiv afinitet prema konformacionom epitopu protofibrilnog oblika Aβ peptida, pri čemu je protofibrilni epitop predstavljen izloženom oblašću Aβ-protofibrilnog oblika koja sadrži niz aminokiseline kako je utvrđeno u SEQ ID NO: 2, gde rečeno antitelo pokazuje minimalni afinitet ili uopšte ne pokazuje afinitet prema monomemim ili dimernim oblicima Aβ peptida.
2.    Antitelo iz zahteva 1 koje je monoklonalno antitelo.
3.    Monoklonalno antitelo iz zahteva 2 koje je humanizovano monoklonalno antitelo.
4.    Izolovano antitelo koje posebno interaguje i pokazuje merljiv afinitet prema konformacionom epitopu protofibrilnog oblika Aβ peptida, pri čemu je protofibrilni epitop predstavljen izloženom oblašću Aβ- protofibrilnog oblika koja sadrži niz aminokiseline izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 4, gde rečeno antitelo pokazuje minimalni afinitet ili uopšte ne pokazuje afinitet prema monomemim ili dimernim oblicima Aβ peptida.
5.    Antitelo iz zahteva 4 koje je monoklonalno antitelo.
6.    Monoklonalno antitelo iz zahteva 5 koje je označeno sa 13C3.
7.    Monoklonalno antitelo iz zahteva 5 koje je humanizovano monoklonalno antitelo ili ljudsko monoklonalno antitelo.
8.    Antitelo iz zahteva 4 dalje obuhvata promenljivi laki lanac koji obuhvata niz aminokiseline kako je utvrđeno u SEQ ID NO: 5, ili promenljivi teški lanac koji obuhvata niz aminokiseline kako je utvrđeno u SEQ ID NO: 7.
9.    Antitelo iz zahteva 4 dalje obuhvata promenljivi laki lanac koji obuhvata CDR1 oblast kako je utvrđeno u SEQ ID NO: 13; CDR2 oblast kako je utvrđeno u SEQ ID NO: 14; i CDR3 kako je utvrđeno u SEQ ID NO: 15, ili promenljivi teški lanac koji obuhvata CDR1 oblast kako je utvrđeno u SEQ ID NO: 20; CDR2 oblast kako je utvrđeno u SEQ ID NO: 21; i CDR3 kako je utvrđeno u SEQ ID NO: 22.
10.    Metod proizvodnje monoklonalnog antitela koje se posebno vezuje,, in vitro“ za ponavljanje konformacionog epitopa protofibrilnog oblika β-amiloid peptida pri čemu pokazuje veći afinitet prema protofibrilnom obliku β- amiloid peptida nego prema obliku β-amiloid peptida male molekulske težine, koji obuhvata: (a)    imunizaciju sisara protofibrilamim oblikom β- amiloid peptida; (b)    žetvu B- ćelija rečenog sisara; (c)    pravljenje hibridoma od požnjevenih B- ćelija, gde rečeni hibridomi proizvode antitela; i, (d)    izbor hibridoma koji proizvode antitela koja se posebno vezuju za protofibrilami oblik β-amiloid peptida pri čemu pokazuju minimalan afinitet prema monomemim i dimernim oblicima β-amiloid peptida.
11.    Metod za kvantifikaciju količine protofibrilamog oblika β-amiloid peptida u uzorku tkiva ili tečnosti, koji obuhvata: (a)    uzimanje uzorka tkiva ili tečnosti od subjekta; (b)    dovođenje u dodir uzorka tkiva ili tečnosti sa antitelom ili njegovim delićem koje se posebno vezuje za protofibrilami oblik β-amiloid peptida pri čemu pokazuje minimalni afinitet prema oblicima β-amiloid peptida male molekulske težine i (c)    kvantifikovanje količine protofibrilamog oblika β-amiloid peptida u uzorku tkiva.
12.    Metod iz zahteva 11 u kojem je antitelo monoklonalno antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od 13C3, IDI i 19A6.
13.    Oprema za detektovanje protofibrilamog oblika β-amiloid peptida pri čemu pokazuje veći afinitet prema protofibrilanom obliku β-amiloid peptida nego prema obliku β-amiloid peptida male molekulske težine, koja obuhvata: (a) antitelo ili njegov delić, sposobno da se posebno veže,, in vitro“ za ponavljanje konformacionog epitopa protofibrilamog oblika β-amiloid peptida pri čemu pokazuje minimalni afinitet prema oblicima β-amiloid peptida male molekulske težine; i (b) reagens koji se vezuje, neposredno, ili posredno za rečeno antitelo ili njegov delić.
14.    Oprema iz zahteva 13 u kojoj je antitelo monoklonalno antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od 13C3, lDl i 19A6.
15.    Farmaceutski sastav koji sadrži delić promenljive oblasti koji posebno interaguje sa protofibrilamim oblikom β-amiloid peptida, gde se rečena posebna interakcija opisuje odnosom afiniteta rečenog delića promenljive oblasti za protofibrilami oblik Ab i afiniteta za druge oblike Ab većim od 2.
16.    Metod iz zahteva 15 u kojem je antitelo monoklonalno antitelo.
17.    Metod iz zahteva 16 u kojem je monoklonalno antitelo antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od 13C3, IDI i 19A6.
18.    Metod iz zahteva 16 u kojem je monoklonalno antitelo humanizovano monoklonalno antitelo.
19. Hibridom koji luči antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od 13C3, IDI i 19A6.
20.    Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira delić promenljivog teškog lanca monoklonalnog antitela 13C3, gde delić promenljivog teškog lanca obuvata niz aminokiseline kako je utvrđeno u SEQ 1D NO: 7.
21.    Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira delić promenljivog teškog lanca monoklonalnog antitela 13C3, gde molekul nukelinske kiseline obuvata niz nukleotida kako je utvrđeno u SEQ ID NO: 8.
22.    Ekspresioni vektor za izražavanje delića promenljivog teškog lanca monoklonalnog antitela 13C3 u rekombinantnoj ćeliji domaćina, gde rečeni eskpresioni vektor sadrži molekul nukleinske kiseline iz zahteva 21.
23.    Ćelija domaćina koja izražava delić promenljivog teškog lanca monoklonalnog antitela 13C3, gde rečena ćelija domaćina sadrži ekspresioni vektor iz zahteva 22.
24.    Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira delić promenljivog lakog lanca monoklonalnog antitela 13C3, gde delić promenljivog lakog lanca obuhvata niz aminokiseline kako je utvrđeno u SEQ 10 NO: 5.
25.    Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira delić promenljivog lakog lanca monoklonalnog antitela 13C3, gde delić promenljivog lakog lanca obuhvata niz nukelotida kako je utvrđeno u SEQ 10 NO: 6.
26.    Ekspresioni vektor za izražavanje delića promenljivog lakog lanca monoklonalnog antitela 13C3 u rekombinantnoj ćeliji domaćina, gde rečeni eskpresioni vektor sadrži molekul nukleinske kiseline iz zahteva 25.
27.    Ćelija domaćina koja izražava delić promenljivog lakog lanca monoklonalnog antitela 13C3, gde rečena ćelija domaćina sadrži ekspresioni vektor iz zahteva 26.
28.    Izolovani delić promenljivog teškog lanca monoklonalnog antitela 13C3 koji obuhvata niz aminokiseline utvrđen u SEQ 10 NO: 7.
29.    Izolovani delić promenljivog lakog lanca monoklonalnog antitela 13C3 koji obuhvata niz aminokiseline kako je utvrđeno u SEQ 10 NO: 5.
MEP-2010-76A 2007-11-16 2008-11-14 Antitijela specifična za protofibrilni oblik beta-amiloid proteina ME01026B (me)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US98848107P 2007-11-16 2007-11-16
US1974708P 2008-01-08 2008-01-08
PCT/US2008/083659 WO2009065054A2 (en) 2007-11-16 2008-11-14 Antibodies specific for the protofibril form of beta-amyloid protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ME01026B true ME01026B (me) 2012-10-20

Family

ID=40639468

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MEP-2010-76A ME01026B (me) 2007-11-16 2008-11-14 Antitijela specifična za protofibrilni oblik beta-amiloid proteina

Country Status (33)

Country Link
US (3) US8470321B2 (me)
EP (2) EP2207568B1 (me)
JP (3) JP5616230B2 (me)
KR (3) KR101377535B1 (me)
CN (1) CN102006887B (me)
AU (1) AU2008322523B2 (me)
BR (1) BRPI0819312A2 (me)
CA (1) CA2705582A1 (me)
CO (1) CO6270277A2 (me)
CR (1) CR11350A (me)
CY (1) CY1119376T1 (me)
DK (1) DK2207568T3 (me)
DO (1) DOP2010000097A (me)
EA (1) EA201000809A1 (me)
ES (1) ES2639016T3 (me)
HK (1) HK1244823A1 (me)
HR (1) HRP20171292T1 (me)
HU (1) HUE033825T2 (me)
IL (1) IL204542A (me)
LT (1) LT2207568T (me)
MA (1) MA31890B1 (me)
ME (1) ME01026B (me)
MX (2) MX335965B (me)
MY (1) MY158903A (me)
NI (1) NI201000046A (me)
NZ (1) NZ583632A (me)
PL (1) PL2207568T3 (me)
PT (1) PT2207568T (me)
SG (1) SG2014011183A (me)
SI (1) SI2207568T1 (me)
TN (1) TN2010000128A1 (me)
WO (1) WO2009065054A2 (me)
ZA (1) ZA201002592B (me)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE0401601D0 (sv) 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
PL2004688T5 (pl) 2006-03-23 2014-09-30 Bioarctic Neuroscience Ab Ulepszone przeciwciała wobec protofibryli oraz ich zastosowania
HRP20140049T1 (hr) 2007-01-05 2014-02-28 University Of Zürich Anti beta-amiloid antitijela i njihova upotreba
ES2439490T3 (es) * 2007-01-05 2014-01-23 University Of Zurich Anticuerpo anti-beta amiloide y usos del mismo
BRPI0819312A2 (pt) 2007-11-16 2020-09-15 The Rockefeller University específico anticorpo para a forma protofibril de proteínas amilóide beta
CA2746778C (en) 2008-12-19 2019-04-23 University Of Zurich Human anti-alpha-synuclein autoantibodies
FR2945538B1 (fr) 2009-05-12 2014-12-26 Sanofi Aventis Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide.
JP2012532094A (ja) * 2009-06-29 2012-12-13 バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー アルツハイマ病の治療および診断方法における使用のためのＮ末端切断型アミロイドβプロトフィブリル／オリゴマ
US9125846B2 (en) 2010-10-15 2015-09-08 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Antibodies that bind amyloid oligomers
US10266585B2 (en) 2009-08-28 2019-04-23 The Board Of Regents Of The Univerity Of Texas System Methods of treating brain injury
CA2772488C (en) 2009-09-11 2018-04-17 Probiodrug Ag Heterocyclic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
EP2595644B1 (en) * 2010-07-23 2016-03-30 Gwangju Institute of Science and Technology Amyloid-beta clearance
AR085302A1 (es) 2011-02-24 2013-09-18 Sanofi Sa Metodo de produccion de anticuerpos sialilados
DK2723379T3 (en) 2011-06-23 2018-10-15 Biogen Int Neuroscience Gmbh ANTI-ALPHA SYNUCLEIN BINDING MOLECULES
WO2013075740A1 (en) 2011-11-23 2013-05-30 Sanofi Antibody purification method
JP2013159596A (ja) * 2012-02-08 2013-08-19 Nihon Univ β−アミロイド前駆体タンパク質のマイクロ凝集体に特異的なモノクローナル抗体
WO2013167681A1 (en) 2012-05-10 2013-11-14 Georg-August-Universität Göttingen CONFORMATIONAL-SPECIFIC ANTIBODIES AGAINST Αβ OLIGOMERS
EP2674495A1 (en) 2012-06-14 2013-12-18 Sanofi CHO expression system
AU2014264697B2 (en) 2013-05-06 2019-08-22 Sanofi Continuous multistep process for purifying antibodies
US10035847B2 (en) 2013-10-02 2018-07-31 The Rockefeller University Amyloid protofibril antibodies and methods of use thereof
JO3537B1 (ar) * 2014-07-10 2020-07-05 Bioarctic Neuroscience Ab أجسام مضادة لييفية أولية لاميلويد بيتا الببتيد ab المحسنة
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
US20180326027A1 (en) * 2015-11-09 2018-11-15 The University Of British Columbia Epitopes in amyloid beta and conformationally-selective antibodies thereto
JP7448174B2 (ja) * 2015-11-09 2024-03-12 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア アミロイドベータ中間領域エピトープおよびそれに対する立体配座選択的抗体
CN108350053A (zh) 2015-11-09 2018-07-31 英属哥伦比亚大学 淀粉样蛋白β表位及其抗体
US10772969B2 (en) 2015-11-09 2020-09-15 The University Of British Columbia N-terminal epitopes in amyloid beta and conformationally-selective antibodies thereto
DE102016005169B3 (de) * 2016-04-29 2017-07-13 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Identifikation von Inhibitoren der primären Nukleation der Amyloid-Beta-Aggregation
AU2017299858B2 (en) * 2016-07-18 2024-07-25 Promis Neurosciences, Inc. Antibodies to Amyloid beta
US20180125920A1 (en) 2016-11-09 2018-05-10 The University Of British Columbia Methods for preventing and treating A-beta oligomer-associated and/or -induced diseases and conditions
EP3354278A1 (en) * 2017-01-31 2018-08-01 Sanofi Neuronal cell protective effect of antibodies specific for the protofibrillar form of the beta-amyloid peptide
US12286469B2 (en) 2017-07-18 2025-04-29 The University Of British Columbia Humanized antibodies binding to amyloid-beta (A-beta)
US12227567B2 (en) 2017-07-25 2025-02-18 Truebinding, Inc. Treating cancer by blocking the interaction of TIM-3 and its ligand
KR20250053967A (ko) 2017-08-22 2025-04-22 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 항-베타 아밀로이드 항체를 함유하는 약제학적 조성물
ES2812698T3 (es) 2017-09-29 2021-03-18 Probiodrug Ag Inhibidores de glutaminil ciclasa
EP3708575A4 (en) * 2017-10-12 2021-10-27 E&S Healthcare Co., Ltd. THIOREDOXIN 1 EPITOPE AND MONOCLONAL ANTIBODIES BINDING SPECIFICALLY TO THE SAME
KR102523019B1 (ko) * 2018-05-30 2023-04-18 내셔날 헬스 리서치 인스티튜트 항-a베타 항체 및 이의 용도
AU2020206593A1 (en) 2019-01-09 2021-07-15 Centre National De La Recherche Scientifique Transferrin receptor-binding molecules, conjugates thereof and their uses
CN116063520A (zh) 2019-01-30 2023-05-05 真和制药有限公司 抗gal3抗体及其用途
TW202110878A (zh) 2019-05-16 2021-03-16 法商賽諾菲公司 在神經系統中表現抗原結合蛋白
JPWO2021006212A1 (me) * 2019-07-08 2021-01-14
CA3151927A1 (en) * 2019-08-20 2021-02-25 The Curators Of The University Of Missouri Amyloid-beta antibodies
CN116157151A (zh) 2020-05-26 2023-05-23 真和制药有限公司 通过阻断半乳凝素-3治疗炎性疾病的方法
EP4185612A4 (en) 2020-07-23 2024-12-25 Othair Prothena Limited Anti-abeta antibodies
TW202300517A (zh) 2021-03-12 2023-01-01 美商美國禮來大藥廠 抗類澱粉β抗體及其用途
WO2022251048A1 (en) 2021-05-24 2022-12-01 Eli Lilly And Company Anti-amyloid beta antibodies and uses thereof
JP2024534269A (ja) * 2021-08-30 2024-09-18 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド 神経変性疾患を治療するための方法および物質
CN114544940B (zh) * 2022-02-21 2024-09-24 中国海洋大学 一种用于快速检测透明质酸的胶体金试纸条
KR102530956B1 (ko) * 2022-09-08 2023-05-11 주식회사 알츠코리아 아밀로이드 베타 유래 에피토프를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 백신 조성물 및 이의 용도
CN120513256A (zh) 2023-01-20 2025-08-19 迈威(美国)生物治疗有限公司 抗淀粉样蛋白β原纤丝/低聚物抗体和其用途
EP4480965A1 (en) 2023-06-22 2024-12-25 Vect-Horus Transferrin receptor-binding molecules, conjugates thereof and their uses to prevent or treat cns diseases
WO2024261333A1 (en) 2023-06-22 2024-12-26 Vect-Horus Transferrin receptor-binding molecules, conjugates thereof and their uses to prevent or treat nervous system diseases

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4636524A (en) 1984-12-06 1987-01-13 Biomatrix, Inc. Cross-linked gels of hyaluronic acid and products containing such gels
US5869620A (en) * 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
ATE139258T1 (de) 1990-01-12 1996-06-15 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9206318D0 (en) 1992-03-24 1992-05-06 Cambridge Antibody Tech Binding substances
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
AU8507191A (en) 1990-08-29 1992-03-30 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5871907A (en) 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5962255A (en) 1992-03-24 1999-10-05 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing recombinant vectors
US6492160B1 (en) 1991-05-15 2002-12-10 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6225447B1 (en) 1991-05-15 2001-05-01 Cambridge Antibody Technology Ltd. Methods for producing members of specific binding pairs
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
US5872215A (en) 1991-12-02 1999-02-16 Medical Research Council Specific binding members, materials and methods
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
EP0729353B2 (en) 1993-11-19 2012-09-12 Alkermes, Inc. Preparation of biodegradable microparticles containing a biologically active agent
CA2282410A1 (en) 1997-03-03 1998-10-01 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies to human cd6
US6656508B2 (en) 1997-04-17 2003-12-02 Amgen Inc. Sustained-release alginate gels
EP0985039B1 (en) 1997-06-12 2008-02-20 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Artificial antibody polypeptides
US6573238B2 (en) 1997-11-07 2003-06-03 Chiron Corporation Method for producing sustained-release formulations
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6750324B1 (en) 1997-12-02 2004-06-15 Neuralab Limited Humanized and chimeric N-terminal amyloid beta-antibodies
US6541033B1 (en) 1998-06-30 2003-04-01 Amgen Inc. Thermosensitive biodegradable hydrogels for sustained delivery of leptin
US6451346B1 (en) 1998-12-23 2002-09-17 Amgen Inc Biodegradable pH/thermosensitive hydrogels for sustained delivery of biologically active agents
CA2349434A1 (en) * 1999-09-03 2001-03-15 Ramot University Authority For Applied Research & Industrial Development Ltd. Agents and compositions and methods utilizing same useful in diagnosing and/or treating or preventing plaque forming diseases
US6953593B2 (en) 2000-02-01 2005-10-11 Lipoprotein Technologies, Inc. Sustained-release microencapsulated delivery system
DE1257584T1 (de) 2000-02-24 2003-05-28 Lilly Co Eli Humanisierte antikörper, die amyloid beta peptid demarkieren
AU7487301A (en) 2000-05-22 2001-12-03 Univ New York Synthetic immunogenic but non-amyloidogenic peptides homologous to amyloid beta for induction of an immune response to amyloid beta and amyloid deposits
JP5362164B2 (ja) 2000-07-07 2013-12-11 バイオアークティック ニューロサイエンス アーベー アルツハイマー病の予防及び治療
JP2004526419A (ja) 2000-10-16 2004-09-02 フィロス インク． 抗体模倣物および他の結合タンパク質のためのタンパク質骨格
CA2428932A1 (en) * 2000-11-15 2002-07-11 Zymogenetics, Inc. Neuropilin homolog zcub5
PE20020574A1 (es) 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
AU2002248792B2 (en) 2001-04-18 2006-09-21 Nostrum Pharmaceuticals Inc. A novel coating for a sustained release pharmaceutical composition
MY147019A (en) * 2002-03-13 2012-10-15 Biogen Idec Inc Anti-alpha v beta 6 antibodies
KR100708398B1 (ko) 2002-03-22 2007-04-18 (주) 에이프로젠 인간화 항체 및 이의 제조방법
EP1578361B1 (en) 2002-09-12 2011-04-20 The Regents of The University of California Immunogens and corresponding antibodies specific for high molecular weight aggregation intermediates common to amyloids formed from proteins of differing sequence
US7063725B2 (en) 2002-10-21 2006-06-20 Sdgi Holdings, Inc. Systems and techniques for restoring and maintaining intervertebral anatomy
US20040223970A1 (en) * 2003-02-28 2004-11-11 Daniel Afar Antibodies against SLC15A2 and uses thereof
US20050124016A1 (en) 2003-08-01 2005-06-09 Enh Research Institute Antibodies specific for toxic amyloid beta protein oligomers
CA2437639C (en) 2003-08-11 2016-07-05 Valera Pharmaceuticals, Inc. Long term drug delivery devices with polyurethane based polymers and their manufacture
AU2004272112A1 (en) 2003-09-12 2005-03-24 The Regents Of The University Of California Monoclonal antibodies specific for conformational epitopes of prefibrillar aggregates
US20050187631A1 (en) 2004-01-27 2005-08-25 Sdgi Holdings, Inc. Prosthetic device
SE0401601D0 (sv) * 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
CA2593846A1 (en) 2005-01-14 2006-08-10 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for inhibiting drusen formation and for diagnosing or treating drusen-related disorders
AU2006208226A1 (en) 2005-01-24 2006-08-03 Amgen Inc. Humanized anti-amyloid antibody
EP1937720B1 (en) 2005-08-18 2014-04-09 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Single chain antibodies against beta-amyloid peptide
CN101506236B (zh) * 2005-11-30 2012-12-12 雅培制药有限公司 抗淀粉样β蛋白的单克隆抗体及其用途
PL2004688T5 (pl) * 2006-03-23 2014-09-30 Bioarctic Neuroscience Ab Ulepszone przeciwciała wobec protofibryli oraz ich zastosowania
EP2170389B1 (en) 2007-06-12 2014-10-29 AC Immune S.A. Humanized antibodies to amyloid beta
BRPI0819312A2 (pt) 2007-11-16 2020-09-15 The Rockefeller University específico anticorpo para a forma protofibril de proteínas amilóide beta
FR2945538B1 (fr) 2009-05-12 2014-12-26 Sanofi Aventis Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide.

Also Published As

Publication number Publication date
KR101478995B1 (ko) 2015-01-12
PT2207568T (pt) 2017-09-01
EP2207568A4 (en) 2013-01-09
CN102006887A (zh) 2011-04-06
IL204542A (en) 2016-03-31
ZA201002592B (en) 2011-05-25
KR20100074297A (ko) 2010-07-01
JP5616230B2 (ja) 2014-10-29
DK2207568T3 (en) 2017-09-18
NI201000046A (es) 2011-01-10
SI2207568T1 (sl) 2017-11-30
US9340607B2 (en) 2016-05-17
TN2010000128A1 (en) 2011-09-26
HK1244823A1 (en) 2018-08-17
US20100209422A1 (en) 2010-08-19
MY158903A (en) 2016-11-30
AU2008322523A1 (en) 2009-05-22
JP2014223074A (ja) 2014-12-04
HRP20171292T1 (hr) 2017-12-15
WO2009065054A2 (en) 2009-05-22
AU2008322523B2 (en) 2013-10-10
EP3257865A1 (en) 2017-12-20
IL204542A0 (en) 2010-11-30
KR101377535B1 (ko) 2014-03-27
BRPI0819312A2 (pt) 2020-09-15
MA31890B1 (fr) 2010-12-01
US20130315917A1 (en) 2013-11-28
DOP2010000097A (es) 2016-12-30
KR20130051021A (ko) 2013-05-16
CO6270277A2 (es) 2011-04-20
CN102006887B (zh) 2016-02-03
EA201000809A1 (ru) 2010-12-30
JP2018140988A (ja) 2018-09-13
SG2014011183A (en) 2014-06-27
HUE033825T2 (en) 2018-01-29
JP2011504360A (ja) 2011-02-10
KR20140141671A (ko) 2014-12-10
EP2207568B1 (en) 2017-05-31
MX2010003828A (es) 2010-04-27
CY1119376T1 (el) 2018-02-14
US8470321B2 (en) 2013-06-25
PL2207568T3 (pl) 2018-01-31
MX335965B (es) 2016-01-05
CA2705582A1 (en) 2009-05-22
EP2207568A2 (en) 2010-07-21
WO2009065054A3 (en) 2009-12-30
NZ583632A (en) 2012-05-25
US20160319006A1 (en) 2016-11-03
LT2207568T (lt) 2017-12-11
KR101581733B1 (ko) 2015-12-31
ES2639016T3 (es) 2017-10-25
CR11350A (es) 2010-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2207568B1 (en) Antibodies specific for the protofibril form of beta-amyloid protein
TWI557136B (zh) 特異性結合β-類澱粉蛋白之抗體及相關核酸分子、表現載體、細胞、組合物、套組、方法及用途
WO2008011348A2 (en) Humanized antibody against amyloid beta
MXPA04008740A (es) Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloide beta.
US11161898B2 (en) Anti-amyloid-beta antibodies
RS56986B1 (sr) Humanizovana antitela na beta amiloid
TWI508976B (zh) 對β－類澱粉蛋白之基原纖維形式具專一性之抗體
HK1146531A (en) Antibodies specific for the protofibril form of beta-amyloid protein
HK1146531B (en) Antibodies specific for the protofibril form of beta-amyloid protein
OA19316A (en) Antibodies specific for the protofibril form of beta-amyloid protein
RU2820628C2 (ru) Белки, связывающие глюкагоновые рецепторы, и способы их применения
HK1140433B (en) Humanized antibodies to amyloid beta
HK1183631A (en) Humanized antibodies to amyloid beta