BRPI0819312A2 - específico anticorpo para a forma protofibril de proteínas amilóide beta - Google Patents

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BRPI0819312A2
BRPI0819312A2 BRPI0819312-6A BRPI0819312A BRPI0819312A2 BR PI0819312 A2 BRPI0819312 A2 BR PI0819312A2 BR PI0819312 A BRPI0819312 A BR PI0819312A BR PI0819312 A2 BRPI0819312 A2 BR PI0819312A2
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Hidehiro Fukuyama
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The Rockefeller University
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Abstract

Foram caracterizados anticorpos isolados que mostram específica afinidade para um epitope repetido conformacional de uma forma protofibril do humano peptídeo (Beta) amilóide como compara a forma de baixo peso molecular de peptíeo(Beta)-amolóide. Estes anticorpos isolados e composições farmaceuticamente efetivas relacionadas podem ser útil no tratamento terapêutico e/ou profilático de Doença de Alzheimer por efetivamente bloquear a habilidade da forma protofibril de peptídeo (Beta)-amilóide para formar formas fibril ligadas com complicações associadas com Doença de Alzheimer. Os anticorpos isolados da presente invenção são também úteis em vários ensaios de diagnósticos e kits associados.

Description

ESPECÍFIICO ANTICORPO PARA A FORMA PROTOFIBRIL DE PÈOTEÍNA AMTLÕIDE BETA
REFERÊNCIA CRUZADA E APLICAÇÕES RELATIVAS Esta aplicação reivindica prioridade para Aplicações de 5 Patente provisória: 60/988,481 depositada em 16 de nov.embro de- 2007; e 61/019,747 depositada em 8 de jàné-iro de 2008, e q c,onteúdQ delas sãQ incorpQrados pQr Eeferên-eia.,
CAMPO DA INVENÇÃO A preSente invençãó relata para anticorp'os isolados que 10 interagem eespecíficamente com epítQpe confQrmaciQnal de 0 uma forma protofibril de peptídeo amilóide |3 huTnarLo. Eg3teS anticorpos a'presentam mínimos ou ne.nhuuia .a£irLídade detectaàa p®t"à farmas de peso molecular baixo peptídeo ã,milóide |3. Os' anticorpos descritos neste documento serão 1'5. útil no diagncSstico, tratamento e/ou prevenção de depõsito
P de plaqueta de arnilóide |3 assoeiado corn cj começp e pmgressão da doença.de Àlzheimer.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO peptídéos amilóides j3 Mj) são estudados p'or ser um agente 20 cãusador para a doença de Alzheimer ( "AD" ) atravês de formação de f ibras insol.úveis de pept ídeo A|3 e depõs-it-ós 0 destas fibras para formar plaquetas cle amilóide. A forÍnaçãQ de plaquetas dentro 'da ãrea crítica do eérebrQ p,ara memória e outras funções cogni t ivas são est.udadas para condu.zir a 25 dernência associada corn esta doença (ver "Selkoe, 19-94 , J- Neuropathol. Exp. NeurQl. 53 :438-447") . P'eptíde.os amilõides b'eta compreendem um grupo de pe-ptíde.os 3 9-43 áeicíQs amin9 lon"go que são prote0liti€amente prccêssades de ami.lóide reçur3or proteína (APP) , para a.mbas ÍJ-se-çretase e y- 30 s'eçretase de aminQ e carbQxi terminal, respectivamente .
Existém pelo rnerlQs cinco distintas isoformas de app: 563 ,
2: 695, 714 , 7'51, e 770 áci d"os amino' nci comp"rimento, respectivamente (see Wirak e.t al. , 1991 Science 253:323) .
Est as isoformas de APP são geradas por al ternat iyo "spIicing" de primãrio Lran¢.cri to do gene app. NL1merosas 5 mutações miSsenses foram ident j. f icadas no APP em famílias com .autoss'ôrrrica dominante no início precoce da dpença de dQe.nça cle Alzheimer . Alguns Clast-ers de mttações per.to de local de clivagem de secretaSe e afeito do metabQlismo APP por incrementar a produção ou a proporção de f orrrias AJ3 (ex.
0 10 AB42) , que tende a ser mais. fibrilogêniQ e agregam mais rápído do que cmtras forrnas - Toxiqidade neuronal pçxíe residir nas f ibras de peso mcilecular gÈ"arLde qu e são formadas via ag4eg'aç'ão de solúveis peptídeos aB dentro de f ibras insolúveis e, subsequentementt", in.corpo.ração de 15 f ibFas3 dentro de pIacas de amilõide. Uma Eoruia de f i bra intermediária é a f orma protof ibril '( PF) a €9Ema cAig.ornérica de peso molecular grande de peptídeos Afj que é 8Qlúvel in vi. tro e pode ser j solada cQmQ uma entidade klja de aproximadamente -670 . Desse rriodo, a fQrmaçãc} in vi tro 20 de -insolúveis f ib.ras peptídeo A{J é o resµltadç) f inal. da.
0 olígomerização inicial de pept ídeo Ajj para f ormar uma estruturalmente distinta, f orma solúvel de fibras protof ibri I de pe'so molecular grande protofibril . Estas estruturas de transiente pro'tofibris são precursores para 25 ias fibr.as de amilóide respons.áveis pela disfunção de células e perda neuronal da Doença de Alzl}eimer (AD) e outras doenças de agregação. de proteínas.
Vãri.os- tratamentos f oram remetidQs em tentativas para prev'enir forrnação cío Peptídeo aB , por exemplo, inibidore-s 30 PàEã pre\TErjiL- d pFocem.saInento pFçjteolítico de A.PP .
Também, estratégias de imunoterapia tal ccjmo a.dminístração de anticorpo "de anti-Aj3 (para induzir depu-ração de amilóide depositado) ou imunização com Pept ídeo Af3, antígcn.oos fpara prcmover uma. respo's La humoral) foi listado ern uma tentatíva para reduzir tarnanho de placa e densidade.
A Patente USA N°. '7, 179,463, depositada pof Lannfe1t et 5 al . , descre.ve um método de cratamento da Doença de A'lzheimer por adrninistrar um antico-rpo elevado cont ra um protof ibril con.sistíndo da mutação de Arctic dentro. de Peptídeo Aj3 que codifíca regiãçc Cpmci eXempIiE icações dé elevados ant icorpos são a.presentadas na esp.ecífíeãção -a 10 comparação como para afinidade para f oruias P.ept ídeo Aj3 de 0 peso moleçular baixQ. As par-erltes usa n"' 6, 761,888 e- 6,750, 324, depos·i.tadas por Schenk et a1., descrev'em uma séri e de ant icorpos que reeonheeem vár'ios epítopos ao longo da sequência de ãcido 15 aminQ de A(Â2 - E-speeíficos anticorpos para ,as regiõe.s N- terminais e regiões médias de Al3q2 lTEo3traram efic:á.cia na redução de amb.as as plaquetas ex vivo e in vivo.
Apesar de eonheeíment c) a tua L no campo de tr.atamento e prevençãó da Doençtj cle Alzheimer , .ainda ejçiste a 20 ríe'cessidade de melhorar cornposições e métodos de tratamento e lou prevenção des ta doença . As composições e métQcíos ,da 0 pres.'erLte i nvenção endereçam e reúnem estas necessidàdes descobr indo anticorpos específicos pam f ormas de protof ibrilar de Peptídeo Af3, enquanto mostra af inidade 25 de.tectável mínima contra formas "de Peptídeo Aj3 de pes.o rrlQleeular baixo comp0-sições farrnaceutica.mente efet.ivas ç.ompreendem um anticorpa ou anticõrpos que serão úteis n'çj tEaÉamento ê/ou: prevenção de dep'osi'çãa de plaqueta de beta-amilóide,,. 30' pl..aqueta eonhecida pQr estar associada com o cíoníe'ço e peogressão de Doença d'e Alzheimer. SUMÁRIO DA ÇÃ'O a presente invên-çãó reíâta para úm isó-1adç) ãnti¢órpO we mostxa específ ic.a ligação para uma conformacional epitopo de uma f orma pmto£ibril de peptídeo B-amilãide. O manãmero de t ipo selvagem pept ídeo beta-amilõide (aB) ê 5 conhecido- na matéri.a e ê moctrado neste docu-mento como SEQ In NO: 1. Os isolados anticorpos da presente invençãQ t.êm -afinidades para. tal repetída cQrlformacional ·epitopo para a forrna protofibril de peptídeo Ajj de pe·sp mDleeula-E baíxo enqua.nto mostra mínima cju nenhuma afinida.de- paxa ouçras 10 formas de peptídeo A|3, tais como formas de peptídeo Ajj de manômero ou dímero . A p'resente irjvenção tambêm releíta para um isolado anticorpo que especír içamerLte interage e ü!QsEra a Tnensuráyel af inidade para a conf ormacional epitopo de uma f orma 15 protof ibril de peptídeo Ajj, p.or m'eio do que a pFQtoEibril 0 epi topQ é representaàa por uma reg ião de expos i ção de uma fg.rma protof ibríl Ajj compreendendo a porçãç' LeEminal de u.ma porçãò exposta do peptídeo %- A presente invenção também relata para um isolado anticorpo 20 que espec j-f icam'ente interage e apresenta uma afinidade 0 mensu rável para uma conforTnacional epit.opo ãe uma f orma protofibril de peptídeo Ajj, desta forma pmtofikril épitopç) é répresentado por tjmà região de exp0síçãç) a urtta tormà de pro.tofibril Ajj compreendendo ácidos amino 1-2 0 (SEQ ID 25 NO:2) de uma porção e'xposta do peptídeo Ajj.
A pFesente invenção também relata para um is9lado anticorpo qu'e especi f icame.nte interage e âprementa uma af inidade mens.urãvel. para uma conf orrnacional epito-po de uma forma proto.f ibrii de peptídeo Al3, por meio do qual o pro.tpfib-ril 30 epitopo .é rep-resenta.do po-r uma r.egião de exposição de uma forma de prQt9fibril aB que coTnpreende ácidos amínó 4-12. e
9 -20 (SE'Q ID NOS: 3 e 4 , rèspetttiVamétíte) de urna porção exp0s'ta do peptídeo Ajj .
A presente invenção relata em parte NÉâ monoc lona i s; anticorpos 13C3 , 1Dl e 19A6 , e qualquer forma de afinidade 5 maturada forrua de 13C3, 1D1 e 19A6 - A presente invenção tambêm relata para um arItieoFpo que imi ta a furícional espèeifieidade como descrito nes.te documeR.tD pata 13c3, idi e 19A6. Para este fim, a presente invenção também iselata para Eragmentos biologicarnente at ivos e/.ou mutantes da 0 10 13C3, IDI, 19a6 ou um 1-3C3 - , 1Dl- , Oíjl 19A6- como ant icempo, imèjµindo, mas não necessaríamer}te .lim.it.and9 pmm substutuições de áoido amino (ex. , c-omo uma iíorrna direta d,e maturação de af inidade das regiéles Vfj ou Vl) , ret iradas , adições, tetminal t ru'ncaçÕes de amino e t r1Incaeões de 15 çar'boxi - terminal, t al que estas mutaçCies provem uma .base
Ü para um anticorpo ou porção de ]. igação de ant i c.orp.Q que resulta ern uma similar ou melhorada versão de um 13C3, IÍ21, 19A6 ou 13C3-ccmo proteína de ligação de arrticorpo. Em uma c'oncreti zação desta porção da inv'enção, a regiãa de V,, e V.l 20 região de 13C3 compreende a sequência de ácido aminç} como e.stabeIeçidç) na se.q id no: 7 (VH) e/9u SEQ ID NO:Fi ('Jl) , 0 respec'tivamente - A pre'sente invenção também relata p.ara uma isolada molécula incluíndo a nucleotide de áeido aucléico, sequêricia que 25 cQdi£iQa as regíões de % e/.cm Vl de Ijjú à-n.ti¢or-p.O 13.c3, i.di ou 1'9A6 i e especialment= uma isolada molé'cula de ácido nucllêico (polinucleotide) codif icando uma porção biologicamente relev'ante de 13C3 , ou vers.ão de afinidade tnàtu-rada ou çaso coütrárió -versão maturada de ant i c:cyrpQ 30 13C3, J-DI Qu 1ÇA6 - Para este fiuí, um.a conc:úet i%ação da pisesente invenção relata para uma molécula ácido nuclléico 0 que compreende uma sequência de nucleot ide codif icando a reg-ião Vh e Vl de 13C, como e.stàbelecido na SEQ ID NO:8 .(1.-3C3: Vh região) e SEQ ID NO: 6 (13C3: região) Vl, respect ivamente .
A preserite invenção também relata para isolados anticorpos 5 13C3-, IDI ou 19A6 como descrito neste documento, anticorpos que especifícamente ín.terage e mostra uma afinidade mensurável para um cQnformacíQaaI epit0pD de uma f'orma protofibril de peptídeo Af3- a presente inveríç'ão também relata para uma híbEidQ'ma capaz 0 10 de produzir um anti-c.orpo morioclonal da presente invenção - ParticulaEes hibriel0mas da presen.te in"vençãçj incluem hibricíomas que produzem exempli E icados an t i eorpos inonoclonai s 13C3 , 19A6 e 1D1, respeet ivamênte .
A preserite invenção relata para cornposições 15 farmaceut i camente efetivas que comprêende um i soIado
Ç anticorpo Eomo descrito e também d.efínido E}este doçumento : um ant icorpo iAolado q'ue especificamente interage e apresenta a afinidade mensurável e a habilidade para especi f icarnente ligar paFa üm repedidot çpnfor"maç ional 20 epitopo de urrta forma protof ibril de @, enquanto mostra 0 mínima ou nenhuma af inidade rnensurável para formas de baixo pe so molecular de Ajj- Estas composições podern opcionalmente comp'reender um ou mais tra'nsp.ortadores, urn ou rr!aís excipierjtes, e/'o'u i-jm ou mais derivativos quírnico.s. 25 A preserite invenção também relatà p.ara rnétódo-s de tratàr um indivíduo afetado com Doença de Alzheimer incluíndo administrar para o indivíduo um'a ccmposição Earmaceut icamente efetiva .que compreende um isolado ant.ícorpo deseritó neste doçumento , nomeado um ant icorpo 30 qµe espeçi f içamen.te interage e apresenta uma af inidademens.urável para um repetidp confQrmaciç)nal epitopò de uma forma de protofibril Ajj, enquanco mostra mí n ima cm tiàçj detectável af inidade Pat:a f ormas de baixó peso molecular de peptídeo Al3. Bstes métodos proverão ,para uma inversão terapêutica, tanto quanto para reduz ir a quant idade de amilóide de'posi tada no cérebro. de um 5 indivíduo af etado com Doença de Alzheimer. Part icul.ares çQrLereti zaçõès desÉa porção da presente i rlvenção relata paí"a rnétodos de tratar um indivíduo afetado com Doença de Alzheirner in.cluíndo administrar uma composição Earm"aceuticamerite ef'etiva form'ulada com um ant icorpo 0 10 Tr!o$randc} êsp.ec íf. iica af ittiQade ( e0mo pelo' menos cQmpa rada para. formas de baixo pe·so molecular de peptídeo aB) para um co-nformac'ional epitopo de um.a farma protofibril de peptídeo %, espe.cialmente p.or meiQ .do que :o protof ibril epitnpo é' representado por uma regi.ão de exposição de uma forma de Ajj 15 protofibril que' compreen@e ácidos amino 1-2Q (SEQ ID NO:2) b de uma p.orção e.xposta do peptídeo Ajj . Espçzcíf icas €c}ncret j zãçÕt?E relatarn para estes TnêtodoS terapêutic9s e profiláticos descritos neste documento podendo utilizar exempli f icado,s monoc lonai s anticorpos de rato 13 C3 , 19A6 , 20 1D1, tão bem como veFsão de afinidade matiúrada .de qualq1jeÉ 0 des:tes ant icorpos , anticorpo químico , anticorpo humani zado, anticorpo monoclonal humano , e /cjú quaisquer out ras ta is fQrmas de anticQr"po conhecida I)ã matéria, incluindo, ma.s não límí tando para q ant icorpo o-u específ i-ca 1igaçãQ 25 associada revista neste documerito . Quai s'quer tais a-nticorpos o,u específ ica ligação associada podem ser referidos para dentro desta espe.cíficação como um "13C3 - como ant icorpo" - Deste modo, um "13C3 -ccmo anticorpo" é s,ig.nifieado para tnmbém incluir q 13c3 ahtic0rpo monQclonal 30 descrito n.este documento.
A presente invenção tambêm relata para métodos de triagem para seleção de compostos que podem ag ir como um inibidor dé" tó_r"m'ação de' plaqueta "d'e fibriia e/'ou senile associ.ada.
ccm Doença de Alzheimer. Tal m.e todalogia comp re ende utilizar um anticorpo çorn çaracterísticas corno 13C3 (eix - , eSpeçíEíca afini.dade para as formas PF vs. lmw de peptí-deçj 5 AÍJ) em vários ensaios de teste de interação de compostos antiçorpQ/peptídeU com c) objetivo de se.lecionaE ijm cQmpQsto que module cj proce'"so de formação de fibrila e/ou plaqueta. A p.resente invenção também relata para métodos de -ensaio de diagnóstico para especif icmnente determinar níveis de 0 10 pFQtQfibri1 dentro de urn sujeito ou pacie-nte. Tais erísaios podem ser conduzidos por qualquer técnica conhecida e disponível para o artesão, incluindo, mas não limitando para ensaios "western blots" , " ELISA" , ensaio radioimuno, » e'nsa ió imunohistoquímico, ensaio imunoprecipitaç'ões , ou 15 o-utros ensaios imunoquímicos conhecidQ na matéría. As.sim, 0 uma concretiza'ção desta pa-rte da invenção relata para levar uma a.most ra de tecido de um sujeito ou paciente- e determinando o nivel de PF Ajj na amostra ujeando, urn kit de diagnõstico e ensaio associad.o; por meio de que c) kit 2,0 compreende urn anticorpo como 13C3, deste modo pe'rmitin-dçj 0 p.ara especifica deterruinação de níveis de PF AÍ3 no tecido da amos'tEa. a amostra de tecido para análise é tipicamente sangue , plasma, sofo, muco ou f luido espinhal cerebral do sujeitQ ou paciente . 25 Para este fim, os anticorpos da presente inv.enção podem seÊ utilizados pa.ra pelo nlenos os seguintes usQs: (I) cQtnç} µm agente profilã'tico ou terapêutico para prevenir ou Eedu-zir depó'sito de plaqueta associada corn Doe.nça, de Alzheimer, sqz inho .ou ,em c'Qnj unto corn qualquer di sponível combinação 30 de terapia; (2) e-m plane j ado imunõgeno pept í dec' quê pode se,r usadc> par.a ex..Er.air um efetivo antícorpQ EeÈpónsãvel na profilãtica ou terapêutica estratégia de vacínação re.lativa para traEaTnento de Doença de Alzheimem (3) p.ara gerar urn profilático Oli terapêuticQ arLtiçQrpo anti-idiot:ípice (Ab2) imitando o epitopo enigmático que liga os anticorp9q da presente invenção; e, (4) em planejados derivados de 5 peptídeos da eomplementaridade, que determina reg-iões (CDRS) dos anticorpos neutralízados da presente iwvenção para uso em triagem inibidera de formação dê prcxofibril para uso em regimes profilâtico e/ou terapêutico regimes e (4") como um reagente de diagnÓstico para determinar o nível 0 10 de "pKotDfíbri1ar Ajj no 8oro ou CSF de urn paciente com .alto FÍsço de desenvDlver Doença de Alzheirner- É ob'jeto da presertte invenção cj fQrnecilÍIerlto dos anKZQo.rpQ's qu.e especificamente interagem e mostram afí-ni-da.de .paxa um- eXpO-stQ, çQnf9rmacionaI epítopo de uma protofibril forma de 15 peptídeo Ajj que compreende ácidos a,miRo 1-20 (seq id NO:2) ¢ de uma porção exposta do peptídeo aB. É também obje'to da presente ínvenção fQrrIeceF antiec)rpçjs que interagem e mostram afinidade para um exDQsto &.
conformaeional epitQpo de uma Eorma protofibril de pe'ptídeo 20 AÍ3 que compree.nde ãcidõs amino 4-12 e 9-20 (SEQ ID NO:3, 4) 0 de uma parte exposra do peptídeo Ajj .
Outro objeto d.a presente invenção é forneç'er anticQrpos corno. 13C3 que previnem ou reduzem a forutação de proLQfibEil peptídeo Al3 ligado para a deposição de plaquetas associadas 25 com Doença de Alzheimer.
Ou-tr'o objeto da presente invenção é fornecer ensaios utilizando arltiçorpo$ cqúiçj 13C3 em anEicorpQs /' peptídeo / ensaios de interação de composto para s.el.eçiònar coFnpo.st,os que serão usados no tratamento de' deposição de plaqueta 30 associada eorn Doença de Alzheimer.
'Como usadD neste documento, "Ka' é êntendidó pâm r.ê:térir- se para uma associação con'm:ante de um particular anticorpo de interação antí geria "Kd" é entendido" par'a referir - se para. a di ssQéia.ção eonstante de ijm particular- 5 ant ic'oFpo-dè interação antígena.
Como usado nes te documento , o t ermõ "epitopo" cjTj "dete'rminante ant igenõic.o" refere- se p'ara uuí local sobre um antígeno para que células B e/ou T respondam, o.u um local sQbre urna Tnoléçula de um anticorpo cont ra o qual -serâ 0 10 produzido e/ou para a qual um ant i coepo 1 igará , Por exernplo , um epitopo pode se.r reco"ríhr=cido por um anticorpo definindD um epitopo- O epitopo pode s.er um '"li.near epitopo" (onde uma sequênc:ia de ácido aUling. primário c.ompreende .q epi to.po; tipíear.nentr pelo meno's 3 regíCiüos 15 ãci do amino çontíguos , e mais usualmente, pelo menos 5, e rnaiQr àiMa ,. paxa eerca de S para cerca de 10 ácidos aminç) ern uma única sequência) ou um " ccsn formà'çíona,l ep i tjopo" (ym epi-topo caracterizdo poru a pr--irhãria, seqçiência contíguo de á'ci.do amino nào é o íínicQ 20 elem.ento deFinindQ cornpç}nent e dô epitQpg) ,. um c'onformac i onal epitopo pode compreender um acrêscitno de 0 números de ãcidos arnino relativo para um linear epitopo, cQrr!cj este conformacíonal ep'i topo reconhece urrta estrutura tridimensional do peptídeo ou pFQteí.na . Po.r exe.Wplo., 25 quando urna molécula de proteina dobra pafa Eormar uma e.str-utura tridimensional, certos ãcidos amino e /ou a espinha dQrsal do pc£Lipeptídeo f ormam q conf o.rmacional epieQpQ e se LQrna jystaposko, perin.i t inda .o anticQrpó para reconheer õ epitopo. MéLo.doS de deteFmíRar cmf oÊmãção de 30 epitQpos incluem,, mas não são limitados para, pqr exem'pto,, eristalografia de raios -X, espectrocopia de res sonãnc-i a magnética nuelear de duas dimensõeA e "site-directed spin
'1 iabel i-ng" e espectrocopia eletrÔnica dê réssònãrj¢ia para-magnét ica . Ver, por exemplo, "Epitope Mappirla protQcQis in Method in Moieçuiar BiologY, vol. 66, Glenn E. MQFKis, Ed . (1996) " , a descobert-a que é incorporada por 5 inteiro rIesEe documento por referência.
Como usado neste documento, "ligação específica"' entre duas titulares significa uma afinidade de pelo menos 1_0' M"l, 10' IyÍ"i, j(jS M_i, 109M_', o.u 10' 'QM-l·.
Como usadQ neste d'Qcllmé'n l¢) ,. 'protpfibril" SãQ 0 10 pro'tof ibrilares a.gregados que ineluem e-struturas .esférícas irtC1uírido Peptídeos Af3 F que. .apareicem' para repres.entar fibEas3 das. estruturas esférieasi por grupo àe estrtitu.ràs curvilíneas . Ccjmcj usado nes-te documento, cj terrno "isola'da" ê usado nes'te 15 dQcIÀmenEo cQmo é usãFjo na matéria. A saber, o estado em que q ant icorpos/meuibros específico. de ligaçãO', mo'1éeulas dê ácido nuclléico e ds seme lhant es sãcj encontrados . Anticorpos/membros eRpecíficos de li.gação e rno1éculas .de áçid-o nucllêico são livre q ou substancjía1mente livres ·de 20 m'ateriais com o"s quais s'ão naturalmente associados, tais como outros polipeptídeos ou ãcido's nuclléicos com os quais 0 sãQ encontrados ern seus ambientes naturais, ou os ambientes3 em que são preparados (ex - cultura de cêluj-a) qu.ando t al preparação é. feita por tecnologia recombinante de DNA 25 (praticada in vitro) ou in vivo . "Isolaãa" sob qual(iuer Eorrria que contenha o component e ( s ) identif icado e caracteri zado da preserLte iz1verLção segúido da remoção daquele ambiente inicial. EXeruplos , mas certamente não limitados, i nclue'm formulações f armacêuticas, formulações 30 com dilu'en'te.es, anticorpos/membros esp.ec.íf icos de ligação, moléeulas de á-cído nuclléico e por.ções destes qju.e foram
UÍç3dif icados (ex : glicosilação de anticorp'o) in vi t ro ou in víiv"Q e r'emovidos do arnbiente. Como us.ado neste documento, o terrno "antiçQrpo de a.ntic9EpQ recombinante anticorpo" repre6enta um subconj unto viãvel de 5 "anticorpos'! gerada por vãrios meiQs de tecn.ologia d-e D'NA .recombinant e e transgênicos não huITIanQs que são bem conhe€idDs n-a matéri a . Tal metodologia é utilizada para g.eraF uríj anticorpo dé u.ma das seguirites Qrígens: (i) um sCFv ou alternativo anticorpo isolado de um conj uríto de 0 10 ant'iecn:pos combinatQriais humanos ; (ii) um parcíal ou c-ompl.eto anticorpo geisado de um respectivo vetor eypressão e$táve1 ou trarr'fectado tramsirntemenre dentrç) de uma célula hospedeira, preferencialmente a célula hospedeira de mamífero (ex- , sequêriei.as riueleotide subclonada codifiicando 15 çadeia.s de vh e VL dent ro de um vet,ôr êxprêssãQ em conjun'ção corn respeetivas sequências de nucleotide CH e CL, tan to eomo .pa ra prorr|çj'ver expressão de um predet e rminado. an.t; i ccúrpo mostrMo especif icarnente para a -f cj-rma PF àcj aB) í ejau (iii) um antioorpo isolado dê um animal 20 t ransgêni có não humano que' c: on t enha genes de imunoglobi na 0 humana, ou por qualquer outra meto.dologia conhecida conf i ãvel da reccmbiríante "mi s turada e comb inada" de seqüêncías gerIe de imumglobina humàna para 9uEras sequências de DNA em ordem para gera,r o antioorpo 25 recombinante humano de interesse.
Os termos "sujeito" ou "paciente " sinalif i-ca para incluir qualquer membro da "phylum Chor'data" , inçlu indQ, s'em limitàçãp, htjmanos e 9utros pHmatas , ínclu.íIjdg pEoTnat.as não humanos tal como chimpan'zés e ou'tros macacos e 30 especiais macacos ; animais d"e f azenda tal 'corno gado, oveíha, porcos , cabras e cav.alo's i marnífero's domést i co's tal c-omo çachorros e gatos ; anijnais de labora'táriQ inCluíndO roedoFes tais como camundongo , ratos, porcos de guiné , pãssaros , incluíndo dcmésticos , pãssaros selvagens e jogos tais como galirúias , peru e Qütros pássaros galináceos .corrro patots , gansos, e semelha.ntes . 5 O teruio '"tr.atamento " ou "tratar" de uma doerIça refere - se para executar um protocolo, que pode incluir administrar urna ou mais drogas para um sujeito (humano ou Qütra forma) , em um esfo-rço de aliviar sinais ou sintomas da doença .
Aj-ívio podçz o.ç9rEer antes de sinais ou sintcmas da doença 0 10 aparecer, COUlO rnelhorar depois de aparecer . Éntão, " tratamento" ou "tratar" i.nclui "prevenção" o.u "prevenir"' a 'doença - No caso de Doença de Alzheimer, "prevenção" cjü '"pFevenir" pQde tamb.ém ocorrer em uma situa'çãO o:ncíe um trarame'nto em cur":o ê avançado de modo a preveni r ou 15 protelar o começo de sintomas associados com a Doença de Alzhe i mer . Em adição, "tratamento" ou "trat,ar" não requer completo alívío de sinais ou a¶inLoma", não requer uma c-ura, e especi.ficamente incl.ui protQco1Qs que tenha sõ um efeito mar.ginal positivo no stijeito.
20 còmô usaào ne'ste documento , o termo " ingrediente ativo" ref ere - se para um an.ticorpo como 13.C3 ant icDrpQ que 0 apresenta af iriidade e especificidade (ex - , espe'cífjica Iigação) para a porção de amino terrninal .áa estrutura de.
pFotofibEil de beta-amilõíde- 25 Como usado neste docurnento, os terrnos "quantida.de efet iva " ou "quant idade f armaceuticamente ef etiva" de ant icorpQ , corno providn nEste dcx:umento. ref ere-se para urua quaríE ida.de- não Uxi ca , .wa s- Suf i ci ente de íngred ient e at ivo em 0rd.em para prover o resultado biolõgicQ desejado. Uma ap ropri PM 30 quancid.ade "efetiva" em qualquer oaso ind i víduo pode se"r deterrrtinada por um experiente na matéria us'and.o .experimen'tações rotineiras -
1.4 Como usado neste documêntó, os "téruíás " ijíármacéut ícámen'te aceitãvel" ou "farInacologicam(=nte aceitável" sign.ific:a que um material pMe ser administrado para um indivíduo através de um dispositivo de entrega de droga por agente biolõgico 5 mutilado servj causar qualquer efeito ibiolÓgi.co indesejável õu interagindo em uma ma.neira danosa com quâisquer dos componentes da composição na qual é contido (ex- , wna "c.omposição farmaceuticamente aceitável" ) .
Como usado neste doc'umento, as frases " transp.ortador 0 10 f.i.siologicamente a.¢eítáveI" e " transpor tâdor farrnaceuticame.nce aceitãvel" que pqGÍ{2 Sèf" usad.õ interca.mbiado ref ere - se para urn tran'sportador, diluente, e excipiente que rião causa irritação significante para uni organiswo e não revoga a atividade b-iológica e propriedades 15 cÍq .composto adrniríistrado . Urri adjuvante é incluido a estas fases. b Como us.adcj rieste d.ocuTnenLQ, o t'ermo "excipi.en'te" r'efjeré -se para ,uma substância inerte acrèscentada paFa uma. comp'QsiçãQ f arrnacêutica para também facili tar a administ-raç'ão de um 20 ing-rediente at ivo..
O termo "af inidade míri ima" como usado para comparar ·Cq1t\ a 0 afinidade dos anticorpos para uma forma protofibrilar do pept ídeo A|3 ccm af inidade para outras formas de peptídeo m, tal cQmo fibril-as, estruturas de folha, e oligômero de 25 baixo peso mcjecular e manômeros, indicando que a razão 'de afinidade para a forma protofibriZar AÍ3 para a af i.nida.de para outras formas A|3 é maior que 'cerca de 2.
Pref.eren'cialmente, .a razão é maior que cerca d'e 3, ou cerca .de 4:, ou c.erca de ". 30 DESCRIçÂO resumtda DAS FIGURÀS Figura 1 mgstra q prpçesso .de f ibrilogênese aB, inéluíndo fgrmaç.ão de pEotofibFil oligômeros .
'FigµEa 2A-B mostra o processa de f ibri l-õgênese aB e purifjjicaçã0 de formas Ajj rL/o tempo 0 (A) e teyipo. 'l h.oFas (B) ¢QWCj indicado por absorbârici a a TnAU2Is ( absoí"bânc i a @ "215 nm) por volumes de eluição. Em 4 hora's (B) , a eluição 5 de f.orma (LMW) de baixo peso molecular como um aproximado
15. JcDa dímero enquant c) o tamanho da f orma protofíibr-il eluiCíQ a aproxímada!nente 670 kDa.
Figú ra 3.A- B mostra a especif ícídade de anticorpo's monaclona i s' 13 C3 (A) e 4G8 (B) par-a c) protofibril (PF:—0—) 0 1. 0 e (LMW: -W—) f ormas M de baixQ peso molecular como indicado por densidad'e õtica (OD) li'da a 450/650 rírn por acréscimo .de .con.centrações de ambos PF e. LMW para f ormas de Ajj- Figura 4a-c mostra dados de urn ensaio de Bíacore" ligaçãò 15 njQ8trando afinidade de anticorpos monoclonais 4G8 (A) , 13C3 '? (B") e controle IgG,L (C) para variação de concentraçõ'es de uma forma Ajj (LMW) d.e baixo peso malem-ílãr 0 , 25' µg/mi LMW A|3 para 4,0 µg/m1 LMW Ajj, Figura 5A B mostra dados de identif ieação de ePitopos 20 recçLnhecido por ant icorpó anti - aB descrí eo acima- Figura 0 5A ilustra u.ma análisê "Wc'stèrn Dot Bl-ot " com anticorpos monoclonais 13C3 (painel de cima) , IDI (panel do meio) e 4G8 (panel de baixo) contra uma série de 5obreposiçõeA 13 de ácido amino peptídêos ç0'rnQ descri'to no ExempiQ 5.
25 Figura 5B ilustra sequência de ãcido aminO de AB1-l2 (SEQ id NO:l) , tanto quãnto a pre!visão de epiEcjpQs de a3j.EiçQrpos nlQn.Qc1oRais 13c3, e IDI- Pígura 6 mostra a reat ividade de ant icorpos TnonQcl.Qnai s 13C3 (~) e 4G8 (—0—) com f rações SEC de 7PA2 secreç.ão 30 subre.nada-nte oligôrneros M. ProtQÍí ibril (PF) e f ra.çõe's de baixo pe"so molecular '(LMW) são indicad'as sobre o eixo dos x c:omo medido por densidade ótica (OD) lida a 450/650. Figura" 7A-C mostram mic!Fográficos de seções finas de rn.içroscõpio de irnuno - elét ron mostrar1dQ a afinidade de 5 ant ieo.rpo Tnpnoc1onal 13C3 para estruturas repetidas sobre fibrilas M (B, C,) . Imuno controle EM é Iggl (A) .
Figura 8A- B mostra dados de rnicrogrãficos de elétron mQstrando redução em números de p1aqueta8 e'm um represerítat ivo TgCRND8 rato transgêriico de'ppis de eQntrQle 0 10 de administração de antic-orpo IgG, (A) em comparação para administração de 13C3 anticorpos mor]oc1o.nais (B) . Éügura 9A-B mostra que tratarnento de TgCRND8 de ratQ tr"ansgênicQ com 13C3 ant1eorpc)s monoclc)na.is eW uní Eeginze de uma ve z por semana (A') ou duas véZM3 semanlamente (B) 15 resuLta em uma redução de formação de plaqueta .
Figµra 1-0 mostra o nucleotide e sequência de ãcido amino do clonado de regiões variáveis de cadeia leve e pesada para mAb 13C3. Fígura II niostra que a administração perifériea aguda de 20 1.3ç3 em APP rato transgênico náo eonduz a um açréscimô no plasma AB referência distinta de administração de anticorp.o 0 3D6. Figura 12 tnostra que 13C3 reconhece p1aquetas ÍIeurit·e de ami.lóide humano (agregado) em cérebro de- doença de 25 Alzheimer, mas não c) depósito difuso de AB distint'o a re.ferência 3D6 de anticorpo anti-AM
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO a prçjteina. pEeçurs9Ka de amilóíde prec.ursçjE (APP) desempenha importante papel na patogêneses de Doença de 3,0 Alzheimer ("AD) , processando protealitico de APP pQr ser:retases B e 1/ qera peptídeos M (AÍ3) , que normalmente nQ intervalo do comprimento de 3 9' a 43. ilo cmipriment o de ácidos amino. O eomeço de Doença de Alzhe hner é caraçteizado pe la acumulação de ol-igôrnero ou f ormas agEegadas de A|3 no cérebro. As composições imunolõgicas da pre'sente invenção são útei no txatamento ou prevenção da 5 ljoen.ça de A·lzheimer, por uso como reagentes em ensaios de diagnóstico, tanto como por proj etar inibídor-es de moléculas pequenas de depos íção de amilóide - Os aIlti corpos cQmçj 13C3 da presente invenção pode ser administ rado profilati.camente para a população em geral de um mamífero, 0 10 especialment.e um huulanQ , em uma contemplada f ormuíação faruraceutícament e açeiEável pQr mutãçãp em um regime de qµantidade e/ou dosagem suficiente para el i.minar, reduzir ou retardar q começo da doenç.a - Métodos .de tratamento pr9.fiIáticc) são. especialmerite garant idos ccm indivíduos 15 éonh'ècidos poe estàrem em risco genético ou f arnilar de v Doença de Alzheímer - Numerosos rnarcador.es genéticcis de ris:co para Doença de Alzheimer foram identifiiçados, inelu.índo, mas não Iimitando para mutações de APP (ex - , a mutação "Indian! (Val717Phe) , as tnutaçães "Swedi sh" 20 (Ly,s670Asn, Met6'71Leu) , a mutação "Hendricks" (Ala692Gly) , ~ a' mumçãô '"Dutçh" (Glu693Gjm) , a .mutação "' Iránian " (ThL714A1a) , a mutação "German" n (Va1715Ala) , e a mutação "Florida" (Ile.716Val) , para lista poucas . Mutações.
adi'cionai s que podem indi car um aurnento de ri sco de Íjcjençà 25 de Álzheimer inclnjé tnutaç'õe8 em genes preseni.l.ina (PSI e J?S2') e appe4 - a pEesente invenção também relata para int ervenção terapêutica via composições fa.rmaceuticamente aceítáveis ineluíndo. q an.t ico:rpo comp í3C3 para indivíduos present eTrrent e s cjf rendo de Doe.iiça dê Al'zhe i me r 30 que pode seF recõnheeida pela çaraçterístíca de d.em.ência, especi.alrneELte na presença de Eatores de risccs "descrito acima ou já sofrendo de tal doença em uma qu'ant idãde suü.ciente para cura, ou pelo rnenos parcialment e , dete.r os SintQmas e cowiplicações da Doença de Alzheimer.
Profilátic'o ou Terapêutico baseado em [nétQdçjs de tratamentçj métodos contemplados neste documento pode ser usado para 5 recQnhecer q começo cedo ou tarde da Doença de Alzheimer.
A 'vista da importância de foruías oligõme.ricas de Ajj j)o começo de DoeI]ça de Alzheimer, a presente invenção relata para uní ant ieorpo ísolado que especif ieamente iWerage e apreseríta uma af i-nidade mensurável para um repe!Lidc} 0 10 conformacional epi topo de de uma forma protofibril peptídeo %. O manÔmero de tipo selvagem pept ídeo AÍ3 (A|3q2; a Íiorrna de ãcido amino .42) Éi conhecido na matéri.a e é mastrado ríeste documento como SEQ ID NO: I: Asp A.la Glu Phe Airg His Asp Ser Gi;j Tyr glu. V-al His His gln 15 Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala e Ile Ile Gly Leu MÈt Val Gly Gly val Val Ile Ala (SEQ ID NQ: 1) .
Os ant icorpos isolados da presente imvenção most-rarão af inidade para um repetido conf ormacional eµitopo' de pes.o 20 molecul-ar grande , forma protofibril.ar oligomérí ca do * pêptídeo %, enquanto Inç)stra mínima af inidadè para çmtras fQrm,as de peptideo Ajj, tal gç}m"cj manôme ros e dímerQs de baixo peso molecular- A presente invenção também relata para um anticorpo isolado 25 que interage e apresenta uma afinidade mensurável para um contorlnacional epitopo de uma forrna proto.fibril de peptídeo aB, por meio do qual o protof,ibri1 epitopo é representado por uma região de e.xposição de uma forma de protofibril Ajj que eompreende porção de aTnino terminal de urria porção 30 exposta do pep.tídeo Ajj.
1,9 A presente invenção tambérri relata para um anticôrpó isó1êidó que especif icatnente interage e apresenta uma af inidade mensurãvel para um contormaeional epitopo de uma porção de protQfibEil pept ídeo aB, por meio do qual o PrrQtQf iíbril 5 epítopQ é r:epresentado por uma reg ião de éxpos i ção de uma porç'ão de protof ibril Al3 que compreende ácidms amim 1-2(j ,(5EQ ID NO:2) de uma porção exposta do peptídeo Ajj, CQWQ segue: àsp Ala glu Phe Arg Hi.s Asp 'Ser Gly tryr Glü, V.al Hís His Gln Lys Leu Val Phe Phe (SEQ ID NO:2) .
0 10 Corno ex'empí if icaáo neste documento, foram esp.ecificamente identi £içadQ's antiç0rpQs monoclonais ele ratcj que mostr-auí específica afinidade para porção de prQE·Q.fibEi1 (P'F) do peptídeD M, enquanto mostrando mínima af inidade para espêcíes de baixo peso molecular do peptideo Ajj. O dírrLero
1.5 f orma de Ajj çaproximadamentelS kDa ) durante o tempo b polimeriza para a forma solüvej. de PF de Ajj , com um peso moleeular de aproximadamente 6"7 0 kDa . Ratos f oram imunizados com estes PF % de alto peso molecular.
Anticorpos monocLonais foram perjeiradc)s por especifíiciàade 2'0 de alto peso molecul.ares PF forma do peptídeo aB enquanto 0 mostrava mínima ou nenhuma habilidade p.ara li-gar formas de % de baixo peso molecular. Estas porções da p-t"esente invenção é e'xernplificada por triagem, isolação e caracterização da 13C3 series de anticorpos monoc1Qnais 25 'elçvados çQrLtra a ãproximadamente 670 kDa forma protQ£ibriI do peptídeo Ajj de alto peso ÍnQleçUlar (isto é, 1-3c3, IDI e L9A6). Esta série de antiç9rpQS monQç1orIais apresenta umà planejada espec-ificidade in uitro enquarLto também Eeduz a Doença de Alzheimer associados à formação de plaqueta em um 30 Tnçjdel0- de Doença de Àlzheimer em rat.o transgênico. Deste ,modo, em uma particular concretização da invenção, o anti.cor'po isolado especi ficarnerite interage e apresenta uma ãfínidacie mensurável para um conforma.ciorjai epiE.ç)pç) de um prQtç?£ibLil- forrna de peptídeo %, por meici da qual o prOtòfibril epi tõpo é representado pojé uma região de
5 e-xpDsição de uma f orma Â{J-protof ibril que comp reende ácidos amino 4 - 12 (SEQ ID NO:3) e 9 -20 (SEQ ID NO:4) de uma porçãô exposta do peptídeo Al3: Phe Arg His AS.p Ser G.ly
Tyr Glu Val (SEQ ID NO:3) ; GIy Tyr Glu Vaí His Êiis Gln Lys Leu val Phe Phe (SEX TD NO:4) . 0 1.0 Uma eoncretização da presente invenção re-lata. para. iiín anticorpa que compreende uma região Vh (SEQ ID NO: 7) e/'ou
V,, (SEQ ID NQ: 5) como àescrita por 13c3-, tant q çowq. para conceder esp'ecificidade como 13C3 paEa. o .PF ve;És1i6 L.N9 forma do peptídeo %- Uma coneretização adic-ional é um 15 anticorpo como 13C3 ou bi,ologi camente relevante fragmento 0 deste que mostra especifiçidade para a fQ.ruia PF sobre g LMW do peptídeo Ajj.
Assim, a presen-t¢ inven'çãç' Lawbém reLaEa pa;ra f ragmentos biologi c-amente ativos e-/'õu mut ant es dos anticorpos como 13C3 , IDI, 19A6 ou 13C3, ineluindo, rna's não 20 necessariamente. limitando para substituiçães de áe'idO amino
0 (ex. , ecmo u.ma d.ireta forrna de mut-ação dê af inidãde- das regiões V,, ou Vl) , deleções, adições', truncações de amino termínal e terminal truncações de carboxi , ' tal que e.stas mutações provenham urna ba se para urri ant ieorpo ou por.çàg de 25 1igação dé ant iccirpo que resulta em uma similar ou-
.melhorada versão de um anticorpo de ligação de proteina como 13C3, IDI, 19A6 ou 13C3 . Como -notado neste dacumento,
uma çoncretização desta p.arte da inven.ção relata para a região Vh e/ou \/L de tal anticorpo incluíndo a semjêrLeia de 30 áçido arnino ccjmo posição adiante na SEQ ID NOz 7 e/ou SEQ
ID NO: 5 , respectivamente . A presente invenção nota a existência de redundânc ia de cõdon que p.ode resul tar .em
ClifeEentes moléculas d'e DNA expressando um ant icorpo idêntico ou porção deste (ex . , moléculas alternativas de ãcido nuclléico codi ficando um idêntico SCFV ou uma porção de VH e lou VL de an ÍgG) . Para o propÓsito desta 5 é.speç"i£icação, urna sequência referenciando uma ou mais c6dons recolocados será def inida como uma vari ação
. degenerada . Out ra f onte de variação de sequên.cia pcide o.correr atr.avés de edição de RNA- Tal edição de RNA pade rêsultâr em ôutra f orma de redu tânçia de có.dDn 10 caracteri zado por a troca do quadro de leitura abert.o não 0 re'sultar em um resíduo alterado de ácido amino na proteína expressada . Também incluído dent:ro do escopo des'ta inyenção são mLltações na sequêneía de DNA OLl o aAtieQrp9 tr.ansladado que aument a propríedades fí'sic'as finais do 15 an'tícorpo expressado . Para. este f im, a presente invenção relata para (i) versões matLlradas de 'a.f inidade de um l3'C3,
ID1, 19A6 ou qualquer oucro tal a.nt icorpo corno 13C3 , e /ou (ii) forma de mutações de 13C3, ID1, 19A6 ou qualquer outr.a tal anticorpo como 13C3, incl-uindo, mas n,ão limitando para 2'0 um çj1à rnais mutaçÕes r|as regiões CDRI, CDR2 è/QII CRR3 COf11Q gerada atravês de conhecida metodologia de .maturação de
0 af inidade e conhecidas técnicas de DNA recomb.ina.nte por introdução no Iocal de específ i cas mutações . Desta fiorma, cjs a.nticorpos isolados da presente inverição São mu icorpos 25 que especif icamente interagern com um corrforrnac'ional epitopo de uma f orma protofibril de peptídeo Aj3. Os anticorpas isolados da presente invenção mostraram afinid.ade para tal conf ormac ional epitopo p.ara protQfibriIar de alto peso molecular de peptíd-eo aB enquanto mostra mínima afinidade
30 para outras formas de. peptídeo Aí3, tal çoruo fibrilis,
estruturas de fol.has e oligômeros e manômeros de baixo pesa mole.cular.
A presente invenção também relata pàra antic.prpo iSo1ad9 monoclona I , 13C3 . Esta parte da invenção tarcibém relata para uma hibridoma que produz o ant icorpo monocl<mal, l3C3 .
Uma hibridoma que produz o anticorpo mç)noçIma1 13C3 é 5 disponível sob "ATCC Aceession Nc) . PTA- 883Q" .
A presênte invenção também relata para o antioorpõ isolado monoelonal, ID1. Esta parte da invenção tambêm relata para um híbridoma que' produz o ant'ic.orp.o monoclonal , 1'Dl . A presente invenção também relata para éj ant iççjrjpQ isoladü 0 10 mQnoç1Qnal, J-9A6 . Esta parte da írtven.ção também relàtà para uma hibridoma que produz o anticorpo mon.oclon-al, 19A6 . A presente invenção tambêm relata para métQdos de triagem e seleção de compos Èos que podem agir c-orn0 uM iníbídoF d.e fQrluação de fibrila e/ou plaqueta associa.das com a Doenç'a 15 de Al zheimer . Tal rnetQdologia compreende utilizar urn a-nticorpo como 13c3 com af inídade para a f.cSrma PF .de peptídeQ Ajj em vários antÁ-coLpo/peptídeo,/çQmp9St9s de teste em ensaios de interação coru a f inali.dade de seleciór1ar um eomposto que modula o processo de formação de f ibrila e/ou ,20 plaqueta . O compo-sto pode ser uma rjão protéica molécula orgâniea c)1j inorgâniça, un1 peptídeo (éx e , çç]mo uma 0 poteneial vacina de peptídeo profilático ou terapêutico) , uma proteína, DNA ( " single Qr double stranded" ) ou RNA (tal .corncj s1RNA ou shRNA) - Tornar- se - ã evidente .ern revi sões da 25 descç)berta e e.nsinamenLo desta espêéi fíe,ação que qlL.alquer tal peptídeo ou molécula pequena que ef etivarciente cornpteta c-om um anticorpo corno 13C3 por ligação para a forma PF de pept ídeo A[3 representa um possível compçj-,stQ que é relacionado p.ara tratamento profiIâticQ cju terapêuEiçQ d'e 3'0 Dbença de Alzheíme-r- para este fim. ensaios de int'e-ração pcdêm se-r utilizados coTíj O prQpósito de éle.wr o prQçessamen-tQ de triagem para idencificar compos'tos que
Qcüpam o-u interagem com c) epi topo 13C3 da forrna PF de- peptideo Ajj e desloca o anticorpo.
Vãrios ensaios baseados em arLticoEpo/antíg?nc) cQrLh.e¢idos na matéria podem ser usados para incorporar e apoiar sòbre um 5 anticorpo como 13C3 da presF=nte irivenção corn.o urn reagente e.ssêncíal na tiriagem para oompostos üteis Ilo tratamento profilático ou terapêutico da Doença de A.lzheimeK (ex. , uma pequena molécula inorgânica ou vacina de pept ídeo pretendente) , irLc1uj.ndo, mas não limitando p'ara um ens'aio 10 ELISA, um ensaio r-adíoimune, uma análíse de "Western blot" , 0 qualquer ensaio homogêneo conf iável sobre deteçtável interação biolõgica que não requererá separação ou passo de lavâgem (ex . , ver "AlphaSc re en frcm PerkiriElmer") e lou "SPR-based technológy" (ex . , ver "BrAccjre" ) ) - cQmpostQs
1.5 e[ou vacina de peptídeo candidato ident i f icado através de q uso. de um ant icorpo como 13C3 poâe ser deteet.ado por uma variedadé de ensaios . Q ensaio pode Qer tjm SimpXs ensai.o "sim/não" , para determinar se ocorre mudança ría maneira de Eo"mar o conhecido complexo ant icorpo/ant ígeno, o.u se pode 20 ser feito de natureza guantitativa por utilizàção de um ensaio tal como um ensaio baseado em ELISA, um. ensaio 0 homogêneo, cyll um ensa io ba"'eado ern SPR . Para este fim, a presente invenção relata para qualqcier ensaio, indiferente da metodologia conhecida empregada, que mede a habilidade 25 de um composto de teste para compet ir com o" anticorpo eomol3C3 , para um apropriàdo peptídeo ou proteína minética da porç.ão d.e au)in0 terrnírLal. de u.m 13c3 epitop9 .da fortnà pf de peptídeo aB.
ôs anticorpos descritos neste documen'to podem SeF µsados 30 c.cmo rea.g.entes hásieos em vários imu'noensaios di f eren'tes.
para determinar a presença de um-a forma protof"ibri1 A|3 em uma amostra de pele . Geral ment.e falandcí, os antic.c)rpDs podern ser empregados em qualquer t i po de jTnunoencaio,
qualitativo ou quant itativo.
Estes incluem auibas os ensaios
"two- site sandwi.ch" e imunoensaio "single site" do tipo não compet i t: i"v"o, como também .em ensaiD8 tràdicionais de jiçjaçãQ 5 c'ompetitiva ., Uma concret ização de ínteresse , para fácil detecção, e sua natureza quant itativa , é o ensaio de ant i'corpo "Sandwich" ciu "Double" , do qual existe grande número de var i açõe s , todos eles são plane jados para &er çercado por esta parte da p-rese'nte invenção - Por exempIo ,
0 10 em um típo de ensaio "ward sandwich." ,. antícor.po não identif icado é imobilizado sobre um substrato sólido, ex . ,
pl.aca boa de microtitulaçãm e a amostra para ser test.ada é cc)locadQ ern ccm t.at'O coít) a molécula de ligação . Depois de período adequado de incubação, por um período de ternpo 15 suficienÉe para permitir formação de um complexQ anticorpo-
antígeno binário, um segundo anticorpo, etiquetado com uma molécula reporter capaz de induzir um s inat detectável, é entãp acrescido e a incubação 'é continuada permi tíndo sufieiente tempo para ligação ecmi o antígeno para um loeal 20 di£eren.te e a formação de um corrtplexo ternáriQ de antiçoEpo antígeno de anticorpo não identif icado.
Qualquer material 0 n.ão reagido é lavado, e a preseuça do' ant ígeno é dêtèrminada por obserxração de um sinal . que pode ser quanti ficado por compara,ção com uma amostra de conLÉQle 25 contendo quantidade conhecida de antígeno.
Variações sobrê ensaios "ward sandwich" inclui o ensai-o simultâneo, eni .que ambas as amostras e antiç9rpos. sã.o acresçen,tadQs simultar1én\ente par-a o mt imrpo d.e lig-ãçã.o, iOlj w! er1sa.i.9
"reverse sandwich" em que o ant i corpõ id.¢nEificado e a 3'0 amostra. para ser testada sã.o p.rimeiramente c"onibinado's ,
in-cubaâos e acrescentados para a s,uperficie não id.entificãda do antiçQrpo de iigaçãQ.
Essais Éécnieas sãçj bem conhecidas para experient.es na matêria, e a possibilidãdê de meno re s variações serã prontamente aparente.
Como usa"do neste d9eL]mentò, enèaio "":andwi ch" é entendido para cercar todas as variações sôbre a téetiiea 5 "basie two-Site"-
Para çjS ensaios "sandwicja" da presente invenção, o única fator Limitante e que arnbos 05. anticorpos possuem difeFentes especificidade de ligação para formA do aB protMibril.
Desta foÉma, µm número de possíveis
0 10 ccmbinações é possível como um mais específi'ço exeFnpIQ, ew um ensaio típicci para 'ensaio de "ward. sarídwich", um anticorpo primáÊío é coyalente ou passivarnente ligado p.ara um suporte sólido. a superfície sõIida é usualmehte cristal ou um polímero·, os mais comumente po].ímerocY usados são 15 c'eIu1ose, poliacralamida, nylon, poIiestireno,
polivinilcloreto cju pcjipropileno- O suporte sóIido pode ser na forrrta de tubos, contas, discos ou micropr,at.os, çj1j qúMquer outra superfície adequada para conduçãQ de urn imunoensaió- Os processos de ligação são bem conhecidos na 20 matéria.
Seguindo ligação, a fase sóI-i.da do ccmplexo de àntícorpo é lavada na preparação para teste àa amostra.
Uma 0 alíquota do fluido do corpo contendo uma forma P$ protofibríl para ser testada é então acrescentada para a fase sõlida do complexo e incu.bada a 25.°C por um periodo de 25 tempo suficiente para permitir ligação de qualquer forTna dé jAÍ3 protofibril proteí'na presente para cj ianEiçorpo específico para a forma Ajj protofibril.
O seguEldç) anticorpo é então acrescentado pat:a a fasé sõIída do complexo e incubadçj a 25°C por período adicional de tempõ 30 su,fieiente para perrr|itir o segundo anticorpo ligar para a prímãrià faee sõIida do complexo anticQrpo-antigerIcj.
O segundo anticorpo é 1igadQ paKa uma molécula rep.orter, o
1' 26 visív'el s·irta1a que é mado para inàicar a ligação do segundo ant icorpo pa.ra qllalqueÊ ant ígeno na amQstra - pof '"molécula reporter" , c.amo usado na presente esp.e'eif ic'açãm SígrLifica uma molêcula que por sua natüFéM guímica, prove 5 uín sinal anali t icamente detectãve.l que perulit:e a detecção çie ligação antígeno anticorpo. A detecção pode ser peLci menQs relativamente quant i ficada, para permit i r determinação da quaritidade' de ant ígeno n-a amostra, isto pode set calcul.ado em terTnos absolutos, ou pode ser feim !U ]. Q 'em comparação com um padrão (caã sêries de padrães) contendo q um conheçido nível normal de antígeno .
' As mais comumçmte u"adas molêculas reporter nos Eipo.gã de ensaio sãcj enzimas ou fluorofor'es. NO çãs.Q de urn imunoensaio d·e erjzi.ma. uÍT!a enzima é conj ugada para o. segundQ 15' anticorpo, f requentemente por me i.o de glutaral,déidQ ou período até como será rapídamente recanheeidò, entretanto, existe uma larga variedade de àiferentes téc'nicas de eonj ugação, que são bem conhecidas paEst g) artesão experiente- Comumente enzimas usadas iizcluem p.eroxi.dase de 20 ra iz - forte, oxidase de glicose, b'eta-galagtQsidas.e e fQsfatase alcalína, éntre outras. Os substratos pa'ra sçzrêm b usados com às3 especít icas enzima'" são geralmente escc)lhidos t pela produção, euí hidrõlise pa,r:a uma cgjrrespondente enzima, di" uma troc.a detectáve-l de eor. Por exemplo, f osfato de 25 p-nitrofenil é adequado para uso com .Eosfatase alcalina conjugada ; para peroxidase conjugada , i, 2-fenile.nediaujino ou toluidino são comumente usados . É também .possível pa.ra empregar substratos Eluorogênico , que rende urn produto fluoréscente erri lugar dos substratos eromogênícos 30 aprçsentados ac-ima . Ejm tQdçjs p9 eiasç)s , ò anticorpo i.den.tifiea.dQ da enz ima é acrescentadp paFa- o pri.me iro c'omplexo aj7ticorpQ-Al3, peotof ibril proteí-na e pemi tindo j ligação para o complexo, e então o êxcessD de reagente é lavado . Uma solução contendo o apropriadao substrat-o é "entãQ acrescentada para o complexo terciário do anticor'po id.entificado anticorpo antígeno. O substrato reàgido ço.m .a 5 enzima ligacjo com o segundo antic'orpo, dá uma sinalização qualitativa visual , que pode ser também quantificada, usüalmente espectrofotometricamente, para dá uma avaliação da qu.anE.idade de antígenó que está presente na. amost:ra de Sqeq .
Qj 10 .Adícíanalme'nte ,, cQmpQsto.s fluo.rescentes,, tal como f Iuoreseina au -rodaTnina, p9dem ser qUímicamente ca8adoS paEa anticorpos sem alterar suàs oapacidades de 1 iga.ção . Quand.o ativado por iluminação com Iuz de um particular' comprimento de onda, q ant i corpo fi1uorocrQmo ident if ieado 15 absQrve a energia da luz, indu z indo íj.m çstadò de excitabilidade na molécula, seguindo por emissã-o da luz a, um c,ar.acEerístieo comprimento de onda m.aior- A em,i ssã'o apareçe çomo uma característica de ,- cQr vísua1men-te detecrãvel corn u.m mi.croscõplo de luz. Como no imunoensaio 20 de enzima (EIA) , o an-tieorpo fluorescen.te ide'ntifica'do é perÍnetidQ para ligar para cj primeiro anticorpQ dà foEma @ O prQtQf ibril proteína complexa . Depois de lavadQ o reagenEe não ligado, c) complexo remanescente terciãrio é então expQ.g t.o pa ra luz do apropriado comprimento de orída , e a 25 f luQrescência obsêrvada indica a presença dQ ant ígeno.
Téenicas de imµríof luorescência e EIA sãcj ambaS mui tcj bern e'stabelecidas na matéria e são particularuiente preferidas pa-ra o prese'nte úÍétociQ . Ent,retanto, Qütras moléculas repof"tQ-r, tal cqitiq moléculas ÈadiQiSótopQs, 30 qu imi1Hm.ine'8cen Fe çjü biç)1umines€ente pMem também' ser empregadas . Serâ pron t'amente reconhecida para c) artesão' e'xp.eriente como para varíar o p.rocedimento para cj uso exígido- Em óutra côncretização, a amostra para ser testiada (e:x . , sangue hLlm'ano ou fluido espinhal contento uma forma de a Ajj protofibril) pode ser usada em urn imunoensaío de local s.imples caracterizado por ser aderente par'a um' 5 substrato sól ido covalentemente ou noncovalentemènte - Um anticorpo não identificado Ajj protofibri1 prote-ína é eoloeado em ccmtat:o com a amostra ligando eom o substrato ' sólido . Íjepois de um adequado peEícjdo de íncubaçãçj, pQr um período de ternpo suf iciente para permitir forrnação de um 0 10 comp.lex.o arjti corpo - ant ígeno binário urn segundo .anti corpo.
ídent if icado com uma rnólecula reporter eapaz de induziX uma detectãvel sinalização, é então acresce.ntado e a ínçúbação é continuada perinitindo tempo suficiente paEa a formaç-ão d.e um compíexo terciãrio de ant icorpo ident i f icado ant íg,eno- 15 an tíçorpo . Para q imunop=nsaiô de locaí simples, o segundQ antic-orpo pode ser um anticorpo geral (isto é,' anticorpo zenogenéi co para irnunoglobina , part i cularment e anti - ( Ig,M e Igg) ligdo para uma mãlecula reporter) que é capaz de ligar utn anticorpo que é específico para a f orma de AÍ3 20 prcitôf ibril proteína de interesse .
Um ant icorpo como 13C3 pode tomar uma das nurnero,"as fQrmas 0 conhecidas na matéria. Ant icorpos podem to'mar a Eorma de quajqyer tipò de relevante fragmento cIe ant icorpc', porçãc' de anticorpo de ligação, específ icos membrQs dê ligação, 25 uma não proteína artificialmente sintética, ou qualqjuer outra terminologia relevante conhecida na matéria, que se refêre paim um enEituladç) que pelo menos. mtém .su.bs.Eançialmênte a âtividadé de ligaçãô- e.spêcificamente neutralizada - Deste rriodcs, cj t ermo "ant i corpo" c-omo usado 30 em qualquer .contexto dentro desta específ icmção significa para incluir, mas não para ser limitada para qualquer rnembrcj de espec:í-f ica ]. igação, elasse de imunoglohina e/ou
2'9 ísotipo" '("ex- , ÍgG, , IgG,, IgG',, ígG,, ÍgM, ÍgA, Ígij', I'gE' e
ÍgM.} .; e fragmentos biologicarnente relevantes ou membros de .espqcífica ligaçáo destes, incluíndo mas não limitando para
F'ab., F(ab')2, Fv , e scFv (cadeia s irTIp1es Qú entidade 5 Eelatada) . ,Por esta razão ê bem conhecido na matéria, e é incluído só coruo revisão, que Ltm' "ant i.corpo" refere-s.e para uma glicoproteína incluíndo pelo menos düas cadeias pesadas
(H) e dua.s cadeias Ieves (L) interçQnectadas por ligaçãç) de dissulfeto, ou uma porção de ligação antígena deste's.
Uma
0 10' cadeia pesada é compr'eendid.a .de u'ma cadeia pesada de região variãvel (VH) e umâ cadeía p'esadâ de região eRnsEante (CHI,
CH2 e CH3) . A cadei a leve é compreendi da de uma cadeia leve de região variável região (VL) e uma cadeia ieve de região constante (CL) .. As regiões variáveis de arnbas as 15 ca.deijàs leve e pesada compreendem regiões de dQInínic) de variãvel (FWR) e regi-ões de complerneatariedade determinada (CDR) . As quatro regiões FWR são relaEivam.erIte a3ociadas enqu.an t: o ÊegiÊjes CDR (CDRI, CDR2 e CDR3 ) representam regiõe.s hipervariãve.ís sãcj arranjadas de terminal de NH2 20 pa'ra o t e rminal CQQH corno s eguem : FWRI, CDRI , FWR2', CDR2 ,
FWR3 , CDR3 , FWRA - as regiões variáveis de çadeias pesada e 0 leve contém um domínio de ligação que interagem com um an t ígeno enquanto, depende do i.sotipo, a região (s) coristante pode intermediar a ligação da ímnoglobina çom
25 tecido hospedeiro ou Eator.
Issc) significa também incluir a def inição de trabalho de "anticorpo" : são ant ic'orpo qu.íniico, anticorpo hurnanizado, um ant icorpo recombinante ,
como ant i corpos. h.uWanos gerados de um t ransgêní ço' arj imal não humano , .tanto qua.nto anticor.po" selec-ion.ados de lista 30 de tecnologia ricamente usada disponível para o artesão.
Urn fragment.a de ant i corp.o ê obtido usando técnica prontamente conhecida -e diSponível para estes experierítes na rnatéria,
como revisado aba ixo . PÓ:t està razão, urn "ant icorpo" é qualquer ent i-dacle ou membro de específic-a lígação, que espe'eíf icamente ligam o conformacional epitopo da fQrrrla prótof ibri-l de Ajj como desc-rito neste doc'ument'ó, Pof esta 5 razãa, Cj te rmo "anticorpo" desceve uma imunpgl.Qb i na ,
natural ou parcialmente ou comple tamente produz ido sinteti-camente; qua.lquer polipeptídeo Otl proteína tenM urna
Iig,ação dominante que é, ou é subs t-arícialmerite homóloga ,
para uma ligação dominante de anticorpo . Este p0de ser
0 10 derivado de fontes riatural , 0\1 podem SêF parcialmente OLl ccmpietament-e produzido sinteticamente.
Exemplos âe am i corpos sã.o os isotípicos de irnunoglobina e suas subclasses de fragínentos de isatípicos; f ragmêntos que compreertdem uma Iiqação dominante de -ant ígeno , tal como 15 Fa.b, ScFv, Fv, dAb, Pd e diacorpos, .como di scut ido sem ' lirnitação, infra . É conheeido na m-atétia que é pDssível pa'ra manipülaE mo.noclQnal e outros anticorpos e usa f:écnic:a.s de tecnologia de re'.combinante DNA para produzir outros anticorpos3 ou mejlêculas quími'cas que retêm a 20 especificidade do anticòrpo original . Tais- t.écnicas pod.em envo1"ver introduzir DNA codifi.cando a região variãvel da 0 imunoglobina, çm a comp Ieníentariedade de regiões determinada {CDRS) , de um ant-icorpo para as reg iCies constantes, ou regiões constantes de regiãeq [nais 2'5 dcminantes , de uma dif ererzte imunoglobina . Urn hibridoma ou outra célula produz indo urn anticorpo pode estar sujeito para mut.a.ções genét'iças Qü. 9utras t.rocas , qjue pode ou não pode a1Lerar a espec'if icidade ãe ligaçã.o de anticç)rpos p.rçjduz idos . Ant ico.rpos pode'm ser modif icadQs de yárías 30 maneiras e q termp " ant icorpo" s.erá construído como cobriwíQ quàlque:ú rnemb-ro de 1ígãç·ão epecífiçÊL ou substância tendp urna li,gãção dominan te com o requerido
31'
especificam'ente. 'Entãó, este termo cobt-e fragméntos -âé- anticorpo , derivat 1vc)s , equivalentes funcionais e h(3rnólogos dê "' ant ícorpo'" i nclu í ndo qualquer polipeptídeo incluíndo um domínio de ligação de imunoglobina, natural ou 5 completamente ou parcialmente sintet izada.
Tal entidade pode ser um fragmento de ligação cobrirído dentrci CÍ0 termo
"porção de ligação antígerj.a" ou " memb ro de ligação espeçífica" de um ant icorpo incluindo, mas não limitando para (i) um f ragmento Fab , um f ragmento monov"a lerít e 0 10 consistindo de dotníni'o de VL, VH, CL e CH: (ii) um
£,ragmento de f (ab ' ) 2 , um fragmentQ bivalçnte incluíndo dois fragmen.tcjs de Fab ligados por uma p.onte de dissu.lEeto a região de dobradiça; (i i i ) um fragmento de F'd .con-sistindo. do.s. domín ios de VH e CH ; ( iv) um f ragmen tO de Fv" 15 çQ-nsistindo de domínios de VL e VH de urn único braço de um arít icorHo (v) wn f ragmento de dAb, que compreende um dcmínio de vh; (vi ) uma regi ão de eQwpIeme.ntà.ri.edade isolada determimando região (CDR) ; (vii) uuí 'scAb' , um fragmenco de ant icorpo contendo VH e VL como tambérn CL ou 20 CH; e (viii) ant i corpo. artificial baseado eni proteírj.a
"3ea£fcj1ds" , inc'luíndo mas não limitandõ pa.ra fibronectin 0 ti.po IIT anticorpo de polipeptídeo (ex . , ver "U.
S . Patent
No . 6,703,199, issued for Koide on March 9, 2004 e PCT Inte.rnational Appli-caticm Publieation No- YQC) 02/32925"") . "25 Além disso, embora ós dois domíniQs do fragmento de Fv, VL e VH , ~ sao cobertas por genes sepa rados , eles podem ser associados, usando métodos recombinantes, p.ara uma ligação sintética que capacita para serem feitQs çomo uma cadêia de prQte.ína síTnple,s em que o par de regi.ões VL e VH fQr.mam 30 mo1éculas TIíonovalentes. (conhecidà c!q1tiq cMe ia s-imples Fv
(S.CPV)) ,
Eni uma eQnçEetiz-açãQ, a va£iável da c:ade ia I-eve (vl) o isoZado anticorpo como 13C3 ou ]- 3C3 da presente i.n.venção pode compreender um âcido amino 113 sequên.cia de peptídeo (SEQ ID NO: 5) que é codi fjj cado por 33 9 para kase de 5 aequência de nuçlentide (SEQ ID NO: 6) : asp Val Val M.et Thr GIn Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser" Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser cys Arg Ser Gly Gln Se-r Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Lei.i gln Lys Pr.o.
, Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Lle Tyr Thr vaí Sex Asn AFg Phç 0 10 Sq:r Gl.y Val Pro ítsp Arg Phe Ser Gly Ser GLy Ser Gly Ser Asp Phe Tbr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala GIu Asp Leu Gly Val- Tyr' phe Cys Ser GIn Asn Thr Phe Val Pro Trp Thr Phe gly GiY Gly Thr Lys Lêu Glu Ile Íi,ys Arq (SEQ ID NO; 5') GATGTTGTGATGACCCAAAC!TCCACT"CTCCCTGCCTGTCAGTCTTG.GAGATCAAGCCTC 1'5 CÁTCTCTTGCAGATCTGGTCAGAGCCT'TGTACACAGTAATGGAAAéACCTATTTACATT ggTAç;cTgcAgAAgccAgdccAgTcTccAAA(;cTccTgÁTcTATAcAgTTTccAAccgA TTTT.cTggggTcccggAcAggT1'cAg'rggcAgTggAT'cAgggTcAgATTTcAcAcTcAA GATCAGCAGAG'TGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGC-TCTCAAAATAC.ATTTG TTCçTTGGACGTTCGC3TGGAGGCACCAAGCTGGTC.CGG (SEQ id no : 6,) 20' 'Em uma adicional concretização, a variáv'el região pesada (VH) para o isoladn ou ant icorpos c orno. 1 3.C3 da p.resente 0 irrvenção pode compreende r um 115 ác:ido aTnino pept.í.deç) - sequê.ncia (SEQ id NO: 7) codif icado por uma sequêneia 34i 5 de pat" de base pair nucleotide (SEQ ID NO': 8) : 25 Gln Vai Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pr.o Glu Leu Val Arg Pro gly Val Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser GIy Tyr Thr phe 'Thr Asp Tyr Ala. Met His Trp Val- lys GJ-n Sç;r Higa .^a Lys SeE Lêtl Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr As'n Gln Lys phe Lys GIy Lys Ala Thr Met Thr Val Asp L.y3 Ser -30 Ser Ser Thr Ala Tyr Met GLu Leu Ala Arg Leu 'Thr Ser G-lu Asp se-r Ala Tle Tyr Tyr Cys Ala Arg gly Asp aSp GI'j Tyr Ser Trp Gl.y G.l.n. Gly Thr Ser 'Ual Thr Vaí Ser Ser (SEQ Ijj NOi 7) ;
CAGGTCCAGCTGCAGCA-GTCTGGGCCTGAGCTGG"TGAGGCCTGGGG.TCTCAGTGAAGAT TTccTgcAAgggTTccggcTAcAcATTcAcTgATTATgcTATgcAcTgggTgmgcAgA GTCATGCAAAGAGTCTAGAGTGGATTGGAGTTATTAGTACTAAG,TATGGTAAGACC TACAACCAGAAGTTTAAGGGCAAG(2CCACAATGACTGTTGAC~TCCTCCAGCACAGC 5 cTATATggAgcT"rgccAgA-TTgAcATcTgAggATTcTgccATcTATTAcTgTgc^AgAg GGGACGATGGTTATTCCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NOí 8). .
Em uma adic-ional concretiza.ção, as regiões dominante3, FWRI, FWR2 , FWR3 , e FWR4 , da cad.eia VL p.ode ser 0 10 cmmpreendida de grupo de -Eorma de ácido amino da .SEQ ID NO t.9, SEQ id NO:lO, SEQ ID NO:11, e SEQ ID NO:12, respectivamente, como segue:' Asp Val Val Met Thr Gla Thr Prci Leu Ser Leu Pro Va'l Ser Leu GIy Asp Gln Ala Ser Ile Sçr cys .A.yg ser Gly (SEQ ID NO: 9) ; 15 Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser pro Lys Leu Leu q 6 Ile Tyr (SEQ ID NO: 10); A.srj Arg Phe Ser Gly Val. Pfq asp Arg phe Ser Gly Sêr Gly SeE Gly Ser àsp Phe Thr Leu Lys Ile S-er mg Val glu Ála Glu A.sp L'eu Gly Val Tyr Phe Cys (SEQ ID NO: 11) ; 20 Phe Gly Gly GIy Thr Lys Leu Glu Ile L.ys Arg (SEQ id NO: 1-2) . 0 Em uma adicional conc.retização, a ccmplementaried'ade que determina regiães , CDRI, CDR2 , e CDR3 , da 'cadeíà de vl poàem ser eQmpreendidas do ecm j unEo de fortnàs de ácidos 25 amino na SEQ ID " NO: 13 , SEQ ID NO: 14 , SEQ ID NO: 15, respectivamente, como segue : Gln S.e'r Leu Val His S.er Asn Gly Asn Thr Tyr (SEQ id NO: 13): Thr val scf (SEQ id no.: 14) i' 30 Ser Gln Asn Thr Phe Val Pro Trp Thr (SEQ id no: 15) .
Em urna adicional concretização, as regi.ões dominantes , FWRI,, FWR2, FWR3 , e FWRA, da cadeía de VH cadeia compreendida ão grupo de formas de ácidQs arni.no. na SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, e SEQ ID NO';19, respectivamente, como segue: Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gl.y 5 Val Ser Valjjys Ile Ser Cys Lys (SEQ ID NQ: 16)j Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Sér Leíu glu Trp Ile . Gly val (SEQ ID NO: 17)i Ajja Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser ser Thr Ala Tyr Met glu Leu Ala Arg Leu Thr ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Àla 0 1"0 Arg' (SEQ ID no: 18), Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID NQ: L9}. Etn uma adiçíç)nal concretização, a complêmentariedade de re'g"iões que determinam, CDRI, CDR2, e CDR3, da càdeià. de VH 15 podeni ser cornpreendidas de grupo de fo.rma de ác-ido mino na SEQ, ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:2Z, respectivamente, como segue: GiY ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala (SEQ ID NO: 20); Ile Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr' Asn Tyr Aan GIn Lys Phe Lys 20 Gly Lys (SEQ ID NO: 21); Gly Asp Asp Gly Tyr Ser (SEQ ID NO: 22). 0 Anticorpos poli-clonais ou monoclonais para uso em métocios de t"ratamenteo descrito podem ser melhorados por técnicas conhecidas. Anticorpo de murino monoespeçífiçQ (ratp) 25 mostrado especificamente para o conformacional epitopo de um alvo de escolha pode ser purificado com antisoro de rnamíferQ contêMo anticorpos reactivo cQ·rltra esta regiãQ, ou pode ser preparado cõrncj antiçQrpç)& mcjnDe1onais usando a técnica de "Kohler and Milstein (1975, Na'tµFe 256: 4.95- 30 497)". Anticorpo monoespecífico como usado' ne'ste docutnento.
é definido como -uui antícorpo de espécie simples ou anticorpo de espécie Mltípla corn ligação homogênea earaçteFística, tal cam9 os Ánticorr)Qs mõno'c1órLáis de Íí'átô exemplificado neste documento com a série de 13C3 de anticarpos ,monoclonais - A's células de hibridoma sãcj produzidas por mistura do linfÓcito em repouso .cquí um 5 apFopriadQ çomp.anheiro de fusãcj, pref.ererjcíalmente eélulas de meloma , sob condições que permitirá a f ormação de hibri'domas estáveis.
Q anticorpo em repouso produz células e c'élulas de mieloma que sãQ fundidas, selecionada"'., e pérmiradas para produção de ant i corpo - As çé1uías de
0 10 hib.ridoma boas de anticorpo posit ivo são clçmadas por uma técnica tal como a técnica de "Soft Agar" "Macpherson (1973, Scjf t Agar Te'cn.ics , in tissue Culture Methds e Applíc'ations, Kruse an.d Paterscm, Eds , Acàdemic press) . Os an'ticorpos monoclonais são produzidos in vivo por injeção 15 de células hidridouia respectiva dentro de ratos prirríitívos prep'arados, Eluido asciE? ê coletadò depoís de um ihterva1Q de tempo, e preparado por técnicas bem conhecidas na matéria . Alé.m de espé-ci-es espe.eificas .de anticcmpos rnonoc Lorjais .20 dêscritos acima os antic!ôEpos da .presente invenção pode tarribêm ser da forma de um "anticorpo químico" , um anticorpo 0 monoclonal cxjns truído de regiões variãveís regiões derivadas da dita, a fonte de murine, e derivadòs de regiões constantes da desej ada fonte de hospedeiro (e'x . , 25 humano ; para uma revisão, ver "Morrison and Qi , 1989,
Advances in i munol ogy, 44: 65-92") . Por exemplo , as yariãveis leves e pesadas sequências de DNA (ex.
SEQ id NO:
6 e 8, respectivamente) anticorpo de rQedQr (ex . , rato) pod.e ser clonado dentro de um vetor e-xpressão de mamífero. 30 Estas "expressões de veEores "quimicos" leves e pes'ados"
são cotransfeetadoe dentro de uma I inhagem de célul.a d.est. i nat áEi.a e seIeciQnada e exparidi da poè têcnicas conhecidas- Esta linha.gem de célula pode então ser súbmetícía para conhecidas técnicas de cultura de cé.lula, resultandõ ria produção de cadeias leve ê pesada de um anticorpo químico . Tais anticorpos quími cos f oram 5 historicarnente mostrados pa-ra serem capazes .d-e ligaçã.o de antígeno do original monoclonal do roedor , enquarit o signiEicativamente reduz problemas de imun2geAi€idade em admiriistraçãô hospedeira .
Uma l.ógica melhora para o anticorpo químico é o "anticc)£po 0 10 hurnani zado, " que indiscut ivelmente reduz a chance do paciente supòrtü tma respost:a imune contra, um 'ant;iç.erpo terapêut ico quando eomparado com o uso de um arieicorpo monoclonal quírni-co ou murine completo. A estratégia d.e "humanizar" um murine Mab é baseada sobre r_epassar re-síduç).g3 1'5 ãé ã.çido amino que ciífere destes da sequêncíà humana por mutagêneses diretamente c) local do resíduo individual ou por enxertar inteira complementariedade de regiões de.terminadas (jònes et al., 1986, Nature 3'21: 522-526) . Esta tecnologia é novamente agora bem corihecida na mat-éria 2'0 e é representada por numerosas estratégias para aurnentar esta tecnologia ; conhecida por ineluir iníp1ernentações 0 .estmatégicas, mas não limitando para, "Le.shaping" (ver "Verhoeyen, et al., 1988, Science 239: 1534-1536) , "hyperchimerization" (ver "Queen, et al. , 1991, Proc. Natl. 25 Acad. sci . 88 :2869-2873") or "veI1eering" " (M.ark, eè a.Z, ,
19.94, , Derivation of Terapêutícoally Àctive Humanoized and VeI1eered anti-CD18 Anti çc}rp9s Me.Eçal.f en-d Dâltón, ed-s.
Cêlulaular Adhesiom Molecular Defini tion para Terapêu.t ico Potential. New York: Plenum Press, 291<312" ) - Todas e'stas 30 estrategias envolvern algurri grau .de comparação de sequências entre sequência.,s de roedor e humano, para .determinar se é apropriada a espeeífica SibstituiçãC' dê ácido amino de um.
rped'or para con.senso humano . Qua isquer das va,riâçõês , d .t.ema central envolve na geração de urri anticorpo humarLQ confiãvel sobre enxerto de CDR, onde estas três Iigaçõe6 locais de antígeno de arrbas oadeias leve e pesada são 5' efetivamente removida da expressão do roedor do ant icç)rpo clone e subclonado (ou "enxertado" ) derltEo de um vet,ot expressão codif icado para região principal do anticorpo humano - Por exemplo, utilizando as têcnicas acirna um anticorpo humanizado pode ser expresso e carac'terizado por 0 10 a.s regiões CDRI, CDR2, e CDR3 das cadeias variá-veis leve seEegn aloc:adas nas seq id nos: 13, là e 15, respect ivamente, e as regiões CDRI, CDR2, e CDR3 da cadeia variâvel pesada serem aloc.adas nas SEQ ID NOS 20, 21 e 22, resp'ectivamente . 1'5 p'czè esta ra.zão, um "antjcorpo humanizado" ê ef'etivamente um antic:orpo construido s.õ eom rato cdrs (menos qualquer adicion.ai melhoria gerada por incorporação de um ou mai s d.ãs estratêgias menc i..onadas acima) , com restante da região variãvel e tpdas as regiões constantes são deriv'adas de uma 20 f ont.e humana .
A presente invenção também relata para isoladas moléeulas 0 áçído nuclléico e sequências associadas de ácidos' amirios que relata pata as regiões de Vh e/ou Y'l do anticorpo 13C3, e ma is especif icamente, uma i solada molécula de ácido 25 nuclléico (polinucleotide) c-odi f icarado uma biçjIogicamente " relevante porçã.o de 13C3 , ou versão de af irjidade Waturada mí Qutr.a m.aRe.ira de v.ersão maturada de 13C3, I.DI, 19A6 cju outro ant icorpo cQmçj 13C3 . Estes ácidos nuclléicos SãQ substancialme-nte livres de çmtros ácidos ríue1léico.s. para 30 os principais propõ'si'tos de clon.agem, DNA é Uhi prefêrido áçido nuclléico - Estas molêculas DN.A podem sEr s1ibelç}nadâs.
dent,m de üm Yêtcm expressão e subsequent ement e trarisfectado dentro de uma céjnj.ia hospedeir.a de esçQlha caracterizada por a célula hospeciei.ra recom'binante pmver um'a fonte para níveis substanciais de urna porção relevant.e &) anticorpo cQmcj 13c3, 1Dl, 19a6 ou 13C3-, 1Dl-, ou 19A6, 5 Qu versão de afinidâde maturada destes.
Tais pr'oc.edimentos podeuí ser usados para uma variedade de utilidadeS, tal como geração de scFvS ou por co-expressar estas cadeias "\/h e
Vj) eín urrí vetor expressão de mamifer"o sistema que cobre humanas regiões de Ce{ e Cl, é chamada, urn antice)rpo Igg.
A
0 10 dege.neração do código genéticQ é tal quê, para todç>s me:nos dois ácidos amino, mais que um simples códon codifica um particíílar ãcidcz aminçj.
Isto pe'rmite cjue a eonstrução de sititétiQo DNA que codifica um anticorp'o da p.resente invenção onde a sequência de nucleotide do EiiIjtêEiço DNA 15 difere significantemente da nucleotide sequências de nuçleotide descrita neste documento, mas permanece: eodificada para um antícorpo, Taís sintétíços DNAS s.ãçj
.entenciidos para estar dentro do esc0pcj da presente invenção.
Se for desejado para expressar tais sintéticos. 20 DNAS em uma célula hospeàeira particular ou orgâniswo., c)
usado cõdon de tais sintéticos dnas pode ser ãjüstado para
0 refletir o códon usado de tal hospedeiro particular, deste mQdD conduzind,o para niveis altos de expressã'o de urn a.ntiçorpo da presente invenção.
Em outras palavr-as, esta 25 redundância de v.ários cõdons que c'odifica pará específiççjs ácidos arnino está dentro do escopo da presente invenção-
P'or esta razãQ, esta invençã.o. é também direcionada para testar sequênçias de DNA que codificam RNA, incluindQ códo-ns a1ternaLiv0s qjue eodificam p.ara eventual trans1ação 30 cíçj áçido aminçj idênt.icQ, comQ mostrado acimã:
A=Ala=A1anir1e: côdons GCA, gcc, GCG, GCU; C=Cys=eysLeíne:
códons UGC, UGU; 1kAsp=Aspartic ácido: códons GAC, GAU
E=glu=Glutamic ácido z cõdons GAA, GAG; F=Phe=Pheny1alanine:
códo-ns UUC, UU1Jj G='G1y=Glycine : códons GGA, GGC, GGG, GG.U;
j-I=H1 s =Hi.stidine: códons CAC, cau; 1= I1e =Isoleuçine : çóçXms AUA, AUC; AUU; K=Lys-Lysine: cõdons AAA, AAG; 5 L=Léu=Leucine : cõdons UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU;
M%Me-t=Methian ine : cõdQn AUG; N=Asp=Aspar.agine : cõdons GAU,
GÀCj p=prQ=proline : cõdons CCA, CCC, CCG, CCU; Q=G1n=Glutamíne : eódons CAA, CÃGí R=Arg =Argínine- : eódons
AGA, AGG, CGA., CGC, CGG, CGUj S=Ser=Serine': eódons AGC,
0 10 AGU, UCA, UCC , UCG , UCU ; T=Thr=Threoni ne : cCidons ACA, ACC,
AC'G, ACU; V=Va1=Valine: cõdons GUA, GUC, GUG, GUU ; W=Trp=Tryptophan : cõdcirí UGG ; Y=Tye=Tyrgs iríe : cádons UAC,
IJAU, T.ais vetores expressões recornbinante's p.odem e.ntão ser estãvel ou tra.nsientemente transfectado dent ro de uma 15 a-propriada célula linear para geração de forma de anticorpo a Itêrnativo . A presente invenção nota a existência de redundância çódon q-ue pode resultar ern difererites moléculas DNA expressando um antí.corpo idêntico ou porção destes (ex . , moléculas 20 alternativas .ácido nuclléico codi Ílicando um idêntico sCF'v ou uma porção de VH e/ou VL de tm IgG) . Para o. propósitQ 0 destâ especificação, uma sequência conservaI1do um ou mais códons recQlocados será definada como uroa variação degenerada . Outras. fQntes de varíação de sequência podêm 25 ocorrer através de edição de RNA.
Tal edição dê RNA pode resultar em outra f orma de redundânçia de códon, caFacteríz.ada pç'ín uwa troç'a n.o quadm de leitura aberto não resultar ern uma alteração do re"sídu.o de ãc'ido amino na proteína e.xpressada. 30 Tàmbérn inc1uindQ den.t rçj do esCopo dêSta i rrvenção são mutações nâ sequência de DNA Qu çj antiçQrpo LrarIsla'dado que aumenLa, çlS3 prç}priedades f ísicas def init ivas da anticorpo expressado- Para este fim, a presente invençã'ó relata para (i) versão de afinidade ínaturada de um 13C3, inoluindo, mas não limitando para 13C3, 19A6 e 1Dl, e/Qu (ii) maturadas- fo.rmas de u'm anticorpo como 13C3, incluindo mas não 5 límitando p.ara 13C3, 19A6 e/cm IDI, iTlcluíndç} mas não 1in!itandò paEa um ou mais mutações rias regiões CDRI, CDR2 uma/c3ü mais regiõ'es CDR3 como gerada através da conhecida metodologia de afinidade maturação e têcnicas çQnhecidas de recombinante DNA pcir apresentar local de {r!utação 0 10 espeeífico. Tais isoladas ou purificadas motéculas' de ácido nuclléico representará a porção de VH e/ou VL de u.m anticorpo como 13C3. Estes ãcidos rruclléieos são sub'stancialmente 1ivres de outros ãcidos .nµe1léiçQ8- para a maioria dos propósitos de clonagem, DNA é um preferido 15 ácido nuclléico. Estas moléculas de. DNA podem ser subclonadas dentro de um vetor expressãQ e subseqy.entemmte tEansÍjjectado dentro de uma c-élula hosp'edeira de escolha caracterizada por a célula recombinante hospedeira p'rover uma fonte para substaneial níveig cje uma pQrçãç) rele\Tante '20 de um anticcirpo como 13C3, ou versão de ãfinidade maturada destes. Tais procedimentos podem ser usados p.ara uma 0 variedade de utilidades, tal como geração de scFvS cm por co-expressão destas cadeia vh e VL em um sistema de vetor expressão de mamífero que codifica regiõe8 de humano CH e 25 CIi, charnado de um anti.corpo IgG.
A presente invenção mmbém relata ds vetores recofnbinantes e hospedeiros recombinantes ambos os prQcari.óticos e euçarióEiços, que contém moléculas de áeid.o nuclléico codificando a res-pectivas regiões pesada e/ou leve .de um
3.0 anticorpo cqitio 13C3. Estas molécul-as de ãcidp nuclléiço, errl parte ou no todo, podé ser ligada com oütras molécu.1às DNÀ (ísto é, moléçulas de DNA que en-bloba gerLeS de imn.noglobina u3adçj para geração de um anticorpo humano recombinante,) que nãçj sÊÍ0 naturalmente Iigados para forrnar "molécula de recombinante DNA" que codifica um respectivo anticorpo huma-no recombinante. Estes vetores poderrr ser c"9mpr.eeHdidos 5 .de' DNA ou RNA. Para maiores propõsitos de clonagem vetQres DNA são pr'eferidos- Vetores típicos incluem plas'mides, viroses modificada, bacteriofage, cosm-ídeos, rçmçjs8mna artific'ial de Ieveduta, e outras formas de epis.somal ou inte-grado DNA. Isto está dentro da esfera cÍq ãrteSão 0 1'0 qualificado para deterwinar urn apropria:do vetor para uma paEtícular tra?js£erênçia de gene, geração de urrí anticorpo r'ecombinante ou outro uso. Métodos de sµbclQnagem de.
moléculas de ãcido nuclêico de interesse dentro do vetor expressões, transformarn ou Eransfectarn células hospedeiras 15 incluíndo os vetor.es, e método-s de fazer substançialrnente proteína pura incluíndo qs passos de intrcjd!1-ziE q vetor expressão respectivo dent,ro de uma célula hospedeira, e çultivando a célula hospedeira sQíj apropriada condiçÕes são bem conheci.cias. O anticorpo (tal como um antic'QEpQ huma.no 20 reccmbinante IgG) assim produzido pode ser armazenado nas eélulas hospedeiras de maneiras convencionai.s. Qualquer 0 ccmhecido vetor expressãc) pode ser utílizado para praticar esta parte da invenção, i-ncluí.ndo qjualquer vetor contendo um adequado promoter e ouÈro apropriado elemento de 25 transcripção regulatória. A resultante exprescão construida é trarlsferida dentEò de urria célula hospedeira de prooariõ.tica ou eucariótica para produzir prQteína recombina-nte. Vetor expressões são defiriidos neste docume-nto como sequênc'ias de DNA que são requiridas para 30 t-ranscrição de clonado DNA e translação de seus rnRNAs em um .apropriadQ hç)spedeiFo. Tâis veto-res podem ser usados para expressar DNA de eucaEiótiga em urna variedade de hQS'pÊdeiros tais cQmQ bactét"ia, algas verde azIjl , çélulas de pLanta, células de inseto e células de animal .
Especif icamente vetores designados pe-rmitem um transpate de DNA entre hospedeiros, ta.i s como células de bactêria-
5. fermento ou . bactéri a - anirnaL . Uma apropriada eonstruçãcj de 'jeLtçjr — expressao devéria conter uma orig.em de replic.ação para aut ônoma replicação nas células . hospedeiras , marcadores de seleção, um número limitado de loca is de restrição de enzima úteis, um pQtç-ncial para nüme rc) de 0 10 cópi,a alto, e promoteres ativo. Ijm promoter é defirIid'Q cQmçj uma sequência de DNA que direciona polimera'se de RNA para ligar para DNA e iniciar a síntese de RNA- Ejm pr'Qmot er" fjQFte ê um que mot iv.a rnRNAs para dar iní·eío a altà fEeq.uência . Técnicas para taig manipulações podem ser 15 encont radas e descritas em "Sambrook , et al- . (1989. 0 Molecular Cloning. a Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Yc)rk" ) são bem c.onhecidas e disponiveis para o artesãci exp.eriente na
P matéria. Vetores expressões pode'm incluir, rnaâ não são 20 liuíitados para , -vetores de clone , vetçjEes de clone modif icado especificamente plasmides design.ados ou viroses. . CQrrlercialmente disponível vetor expressões d'e marnífero' que pode ser adequada , inclue rnas não são limítadQs para, peDNA3 .neo (Ínvitrogen) , pcDNA3 . 1 (Invitrogen) , pCl-neo 25 (Promega) , pLITMUS28 , plITMUS29, pLITMUS38 e pLITMUS3-9 (New England Bioloabs) , pcDNAT , pcDNAIanp (Invi t ro-gen) ,, pcDNA3 (Invitrogen) , pMClneo (Stratagene) , pXTl (stratagene) . pSG5 (s..Eratag'ene) , EBO pSV2 -neo (ATCC 37 593) pbpv-I (8- 2) (ATCC 37110) , pdBPV-M'MTneo (342-12) (ATCC 37224) , pRSVgpt (ATCC 30 37199,) , pRSVne.o (ATCC 37198) , pSV2- dhf r ('ATCC 37146) , p1jCT,ag (ATCC 37460), e IZD35 (ATCC 37565) , Também, uma var"iedadé de vetores expressões de baçtêEia sãQ dispcmíve ís, incluíndo ma s não limitando para pcR2 . 1 ( Irrvi trogen) , peti la (Novagen) , larnbda gtl 1 (Invitrogen) , e pKK223 - 3 (Pharmacia) . Em adição, utna varied.ade de vetores expressões de célula fungal pode ser usada , 5 incluíndo njas não limitando para pYES2 (Inv"i trogen) e Pichie vetor expressão (Invitrogen) . Taníbém, uma v"ariedade de vetore's expressõe's de céIu1a de inseto podem. ser usadas , incluíndo mas não são limitadas para pBlueBacIII e pBlueBacHis2 ( Invi trogen) , e pAcG2'T (Pharmingen) - 0 10 Cé'lul-as recombinantes hospèdeirac podem s.er procaríót icas ou euc'arióticas, incluindo, mas não limitando para , bactéria tal como E. c'oli, células fungais tal como f ermento, células de matní fero incluindo, mas não limitando para , eélüla Iinea:ú de boviAD, pqycq, Trlaçaço e roedores 15 õ.Eigi.n.ais; e cêlulas de iríseto. Espécies de mamífer,o que 'podem ser adequados , -b26 ineluem', ma's não são l imit.adas para, L çélulas l-m (TK- ) (ATCCçCLI . 3) , l cé1µlas l-m (atcc CCL 1 -2) , Saos -2 (ATCCHTB- 8 5) , 29 3 (ATCCCRLl"i73) , Raj i ,(ATCC CCL 86 ) , C'V- 1 ('ATCC CCL 7 0 ) , COS - l (ATCC CRL165 0) , 20 C,OS-7 (CTCC CRL 165.1) , CHO-KI (ATCC CCL 61) , 3.T3 (ATCC CCL 92) , NIH/ 3T,3 (ATCC CRL 1658), He.La (ATCC' CCL 2) , C127I 0 (ATCC CRL 16.16) , BS-C-l (ATCC CCL 26) , MRC-S (ATCCCCL171) e CP-AE (ATCC ,CCL 209) - Ainda outra melhorià sóbrê re-engènhàrià de â.ntiQçLrp9s coitiq 25 revist0 acima é .a geraçã-o de anticorpos monoclcina i s cmnpletamente humanos . Os primeiros envo Ivem o uso, .de engenharia g'enética, envolvendo ratos que possuem um sis,terna .imune. por mè-io do qual o,s genes de antíç'òrpQ de rãlO f9ram i-rja tivi dàdos e em tmca subsíituído com urn
3.0 reper"tóri9 d.e tunciori.ais geries de an t i c-orpo de humanos , enqua-nto resíduos de autrcis componentes do s istema de rato' imune é inalteradQ.. Tal engenhar i a genética de ra.to
4'4 perutíte por natural in v"ivo imune resposta "é mâtumçâò àó proc!ej" so de afinidade que res.ulta e:m alta afin idade, anc i.corpos monoclonais complet arnente humanos . E'sta tecnologia ê novamente agora bem conhecida na matéria e é 5 completamente detalhada em várias publicaç.õ.es, in'cluindo,
tnas não liTnitarldD para, Patente U.
S . Nos . 5 , S) 3 9, 598i
6,075,181; 6,114,598; 6,.150, 584 e relatada por fajnília de
(assinalado paím "Abgen ix , disclosing their XenoMouse technolagy" ) ; tarltQ como na patente U.S . Nqs. -5,,545,,80.6; 10 5,5,.69,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5., 877, 397; 0 5, 66.1, 016j 5,81.4,318; 5,874,299; e 5,770,429 (assinalada para GenPharm Internat ional and ava i lable through Medarex,
under the umbreLla ©f the "UltraMab Hurnan Antiho.dy
Reve1opment SysE-e[n" ) . ver Earnbém uma revi são' de " Kê1lérman
15 e Gre.en (2002, Curr.
Opinion in BiDtechno1ogy 13 : 5 93 -
597) " . ' a
Finalmente té'cnicas estão disponiveis para o artesão para a sè1eçãç) de firagment9s de anticorpo dé um gru.pg usando teen'ologia de enriquecimento, inclu indo , mas não limit"ando 2,0 para, "phage dis'play" , " ribosome display" ( "Ha-nes and
Piuçkthun, 19 9'7 , Pr.oc . Na t- Ac'ad.
Sci . 94 : 4937-4942" ') ,
0 "bacterial display" ( "Georgiou , et .al . , 1997, Nature
Bio'technology 15: 29-34") e/ou "yeast disp'lay" ("Kieke, et a1- , 1997, PrQteína Engineering 10 : i303-1310") podem ser 25 ' uf:iliza'das corno a1ternaEivas para tecncjógias prevía.mente di,scucidas para selecionar anticorpos de çadeia simpl-es que esp.ecificamente ligam para alvo de citooina . Anticorpos de cadeia simpl.es são selecionados de um conj unto de anticorpos de caàeia simples produzidos d iiretameM: e 30 utilizandâ filar!1ent,ous da tecnológia de fage, TeçnQlègia de dispíay de f age é cQnhecida na rriatéria (ex . , ve.r
"technology f rom Cambridge Ant icorpo Technology ÍCAT) ")
couio discutido nas Patentes U.S. Nos. 5, 565, 332i 5,733 ,743í 5,871, 907; 5,872,215; 5, 885, 793; 5,962,255; 6 ,140, 471'; 6,225,447, 6,291650; 6,492.160; 6,5"21,404: 6,544, 73Ij 6,555,3I3i 6,582,915; 6 , 5 93 , 081, EanEo q!janto ern out ros 5 memb.ros da . família U.S., ou aplicações que confa em arquivamento de prioridade GB 92063-18, depositada em 24 .de mai9 de 1992;- ver tarnbém ( "Vaughn, et al . 1996, Nature Biotechnology 14 : 3 09 -314 " ) . Antieorpos 'de çãdeia s.imples po.dem tarnbém ser designados e construídos usando tecnolQgiía 0 10 di spQn ível de Eecombinante DNA, tal ccmo um mét odo d'e .amp1íação de DNA (ex . , PCR) , ou possivelmerILe p0i? u$a-r um respect ivo hibridcma cIjNA €Qmo ürri temp.late . AÍltieorpos de cadei-a simples pode ser mono óu biespecífiea; bív'alente pu tetravalente. Uma sequência de nucleot i.de eodificando um 15 anti corpo de cadeia simples pode ser eQnst=uída usando síntese de nucl-eotide manual ou autoináticas, clo.nada dentro de uma e.xpressão co.nstruída, usando métod'os' padrões de recorrbinante DNA, e introduz.indo dentro de, u.n]a célula paEa expressar a sequência de codif icação, como descríto acima. 20 A presente invenção tambérn relata para uma composição faÉmacêutica baseada em anticorpo incluíndo uma quantidade efetiva de um anticorpo como J-3C3 , ou uma versãcj afinidade rua tur ada . que prove um traLarnento prof ílãtico cju t.erapêutico escolhido para inibir formação de plaqueta de 25 fibrila e/ou senila associados com a Doença de Alzheimer.
A composição f armacêutica baseada em ant icçjEp9 da prese'nte invenção pode ser mulatada por qualquer número de es·tratégias cQnhecidas na rnatéria (ex . , "ver "McGof í: and sehet, 20qq, Solução Formula tion of Protei'ns/Peptids2s: Irí 30 Mc-Nally, E. j . , ed. Protein Formulat icm àm Deli"verY- New Yo'rk, NY: Marcel Dekker; pp- 139-15'8; Akê;rs- and Def itippis, 2000, pept'ides and proteins as Par-ênteral Soluções. In:
phaEmaceUt ical Formulation Development of Pe"ptide"s and Proteins. Philadelphia, PA: Talyor anci Francis ; pp - ]-4 5 - l77j Akers, et al. , 2002, Pharm- Bi otechnol. 14:47-127).
Urna cornpos ição aceitã.vel farmaceutícarnente .adequada para 5 administração de paciente conterá uma quantidade efetiva do anticorpo erri uma f ortnulação que ambcís ret enharn ativi dade biolõgica enquanto também prornove máxima estabilídade dur.ante arínazenagem dentro de um intervalo aceítável de temperatüra . As cçmpos i ções faimacêuticas podem também 0 10 i.ncluir, dependendo da formulação dese jada ,, diluente-q farm'acêuticos , transportadores farmacêuticç}3 e /ou excipientes aceitáye,is Earmaceutieamentê, Qü qúaj-quer tal v.eícüiQ çomumçn te usado para compos ições, farmacêutioas formuladas para administração de animal ou h-umano . O 15 diluente é selecionado para não afetar a at ividade biológica da combirLação . ExempÍoq de tais diluentes são água destilada, soro f isicjõgi.co, fosfatm salino bufera.do, soluções de "Ringer" , solução de dextrose e sc)lução de "Hank" . a quant i dade de um excípíente que é útil em 20 çomp9sições f armaeêuticas ou formulações desta inverição é uma qua.nt idad.e que serve para distribuir unifortnemente o 0 anticorpo ao longo da composição de forma que isto possa ser uni forrriemente dispersD quando é encregue para um sujeito que necessi.ta disto. Pode servir para diluir o 25 anticorpo para uma concentração que provenha o resultàdo do benef ício desejado paliativa ou curativo, enquantD ao mesmo tempo minimi.za qualquer: adversçj ef eito çolatç.ral que pode ocorre!.E de concentração muito a ]. ta . Pode também ter uut efeito preservativo. D.este modo, "o anticorpo que tem uma 30 atividade Eisiolõgica alc.a, será empregado uma quantidãdê maic>r de exc'ipientê - De çmtra maneira , para q!jalquer ingred i erLte ativo(s) que exibe yma baixa at ividade fisi"o1õgica, 'umà" 'mènor quantidade do excipiente será êmp"regada.
Em qèral, a quantidade de excipi.ent.e na çompôsição serã entre cerca de 50% peso e 99,9'% do peso da total camposição.
Se o ancicorpo, paticu'larmente, exibç
5 uma baixa atividade fisiológica, a quantidade de excipiente po.de ser menor do que 1% do peso- De outra maneira, para urn a.Htie0rpo que possue uma partieularmente -alta ativid-ade , fisiolõgica, a quantidade de excipiente pQde ser entre cerca de 98,0% e cerca de 99.9% do peso.
Em adição, o 0 10 antiçorpcj cm antieorpos pode ser administrado na forma de µjn. "derivativo químico'" (uma moléeula que contenha adicional porção química que não são nòrmalmente uma parte da molécula base). Tais porções podem melhorar a so1ílbilidade, vidà mêdia, ab.sorção, etc- do agente
15 biolõgico.
Alternativamente, estas porçõçs podem a.Lenuar indesejãveis efeitos colaterais do antico'rpo.
Composições f'armacêutieas podem também incluir abundantes ma,cEomQlêcu1as metabolizadas 1erItamente taie çq¶íq proteína-s,, polisacaraides, ácidos poliláctico, ácidos :20 polig1ícólicQ. e copolímeros (tais como latex fµncionaliza.d.os sefarose, agarose, eêlulose, e qs 0 semelhantes), poliméricos de ácidos de amino, copoIímeros de ãcido amino e lip.ídios agregadosí (tais como gotículas de óleçj ou lipQsomes). Adíeionalmente, estes Eran3porEadDres 25 podem tuncionar como agenteg imunostimuladOr (isàto é,
adjuvantes). Por admimistração parenteral, agenEeS da invenção podem ser administrados como d'osagens injetáveis de úma solução ou suspensãç) da subs'tância em urn dilu.ente fi-si,o1Qgiçamente âcêi.tável çom um transpDrtador
30 farmacêutico que pode ser um líquído esterelizado tal cpmo ãgua o'leosa, salina, glicerol, ou etanol- Ãdicionalmente,
substâncias, auxiliares, tais. c.omo agentes de umi'dific'ação
4'8 óú étnl1síFicandá, SúrttaetàÍÍtes, substânc'a para buferar .o de pH e semelhante-s, podem estar presentes nas composições.
Outros componentes d.e eomposiç'ões tarmacêuticas são estes d-e origem de petróleo, animal, vegetal, ou sintético, por 5 exemplo, õl.eo de amendoim, õleo de feíjão-süja, e õl'eo mi'nqraI.
Ern geraI, glicóis tais como gliçol .de propileno ou glíeol polietileno Ükj transporÉadores líquidos preferenciais, particularmente para soIuções injetáv'eis.
A formulação de anticorpo pode ser da forma líquida ou 10 s.Õ'lida.
Uma formulação sólida é geraimente liofil-izad.a e 0 eolo'eada da solução antes da administraçãQ par'a d'osagem simples ou mültipla.
As formulações nào pMem ser expç}st-as para temperatura extrema ou pH, para ·=vitar denaturação térmi.ea. [)esta forina, é essenci-al para formular um'a 15 cóTnpQsiç-ãQ de an-tiçorpQ da pre.sent,e invenção dentjro d.e Uü1 intervalo biolagicamente relevante de pH.
Uma soiução buferada para manter unt intervalo de pH prõprio durante armazenage,FR é indicado, especialrnente p.ara fc)rTnu1ações líquidas por períodos longós de' tempo entre a fçjrmUlaçãQ e 20 a administração.
Datar, ambas as formulações líquidas e sÓlidas requer arTnazenagem a temperaturas baixa.s 0 (ysua1mente 2-8°C) em ordem para manter a estabilidade por períodos longos.
Composição de anticorpo formulada, esp.ecialrriente formulações líquidas, pode conter um 25 baçteriostático para prevenir ou minimizar . proteóli-se durante armazenagem, incluindo, mas não límitando para, coneentraçãQ e·fetiva (usua1.mente <1% p/v) de álcool berízil, fenol, m-cresol, clorobutanol, metilparaben, e/ou propilparaben.
Um bacteríostãtico pode ser contra indicado 30 para alguns pacientes. por êsta razão, uma formuíação liofilizada pode Ser recorístituídeí euí urna s'olução eontendo ou nãçi cQntendQ tal componente. componentes adi¢iQrIais podem sA·r acizescen't ados 'p-ara um liquido bu'fer'ad'o ou forrnulação sõlida de anticorpo. incluindo, mas não limitando para , açúcar como um criQprotectante ( incluindo, mas não rIecessáFiamente ]-in)itad0 para, pçAíhidroxi 5 hi droca]"bònQs , tais como sorbitol, manito.l, gl icerol and .dulci tal e lou disacarides tais como sucrose, lactose, malto&e ou trehaloèd e, em alguns exemplos , um re1evante sal (incluíndo, m,as oÊio limitando para, Nacl, KCl ou Licl) .
Tai s f ormulações de anticorpo, espeeialmente formulações 0 10 liquidas mantidas por muito tempo armazenadas, conf iarã em' urrí útil intervalo de osmolaridade para ambos promoveMo èstábi Iídade longa à temperatuEa de 2 - 8°C, ou maíor, enquanto tambérn faz a formulação útil para inj eção parenteral . Uín intervalo efetivo de total osmoralidade (o 15 .número total de moléculas na- solução) é de çer¢A çle 200 mos/L para cerca de 8 00 mos/L . Será evidente que a 'quantidade de um ci roproLectante , tal eomo. suerose ciµ sotbito,l, dependerá da quant idade de sa í Da f 9rmu1ação em ord-em para osmoralidade da .solução par.a permanecer 'den'tro 20 de um intervalo apropriado . Por esta razão, uma de sai livr? pode conter de cerca de 5% para cerca de 25 % de 0 sucrose, COül um ihtervaio preferencial de suerose de cerca de 7% para cerca de 15% , corn um especial-mente preferida cQ·ncentração de sucrose em uma f ormuj-ação de sal livre 25 sendo de 10% para 12%- Alternativameate, uin sal iívre de for.mulação baseada em sorbitol pode conter sorbi.tol dentro de um intervalo de cerca de 3 "g pa.ra cerca de 1 2 "5 , corrí intervalo preferencial de eerca de 4%, para 7%, e um especialmente inter"\TalQ pEeferençia,L é de .cercia de 5% para 30 cerca de 6% de sorbitol em uma formulaç'ão de sal Iivre.
Formulações de sal livre com certeza gara:nt irão aumento do interva1o dQ respect i"vo criopro.t.ectante em ordem p'ara manter efetivos ní'veis de osmoralidade. Estas fornuílações podem também c'onter um cation divalente (incluindo, mas n.ã'o necessariamente limitado para, Mgçl2, CaCl2 e Mncl2) ; e um - Surfactante aniÔnico 32 (incluindo, mas não neç-es.sariamente 5 l.irnitadci para, Polisorbate-80 (T'ween 80") , Polisorbate- 60 (Tween 60") , Polisorbate 40 (Tween 40") e Polisorbate 20 (Twe'en 20") , pDlic)xiyetileni alciyl éter, inc1uindQ, mas não limitando para, Brij 58", Brij 3 5", tanto quantó outros tais como Triton X 100", Triton X 114", NP40', Span 85 e a 0 10 sêrie PIuronic de aniônico surfactantes (ex . , Plurcinic 121) ) . Qualquer combinação de tajs compcmentes , inelu.ín'dQ p.rovável inelusão .de urn bacter-iostãtico, pode Ser útil para encher as forrrtulações de anticorpo cont idos na presente irív.enção . A corriposição de anticorpo da pr'esente invençào "1 5 pode taMbém ser um derivatívo químico, qiie de'sç re"ve um anticorpo gue con.tém adicionais poÉções quítnicas que não são' normalmente uma parte da molécula da imunogloblulinâ (ex. , "pegylat io'n" ) . Tai s porções podem melhoKa.r a s¢)1ubi1idade, vida média., absorção, etc . da molêeula base . 20 Alternat iva'mente as porções podem atenuar ef eitos c.olaterais da rnolécula bâse ou decFeseer a toxicidade da 0 mQlécula base .
Numerosos exeuiplos de vãrios transportadores , diluentes, exeipientes e os quais são conhecidos na maté'ria e são 25 demcr'itos ern referênciâs citadas neste documento, comó -também "Remington 's Farmacêut íco Sciencés (18th ed. ; Mack Publi shing CQmpany, Eas ton , Pa . , 199 0 ) " , os conteúdos que .são incorporados neste documento por referêncía . Resumidamente , serã evide'nte que adequados transportadores , 30 excipientes . e outros agentes poden ser incorpQrados para fQrTnula·r as composições farmacêut ieas p-ara p Êo'ver transfeEências mélhomdas , ent rega , tolerância, e
.séítle1hánt és.
Os m'êLò"dáq dé ineorpóraF ó ágénte' biói'lÊigicó ê/Qü adicional irlgrediente ativo (s) cientro do transportadQr sãó conhecidas para uma pessoa e'xperiente na matéría e depende da natureza do agente biolõgi'co e da natureza do 5 tr-an.5portadQr seleci-onad.o por uma pessoa praticante da pEesente irivenção . Ligação iôniea, encapsu1.amerILD a gel ou apEisionamento físioo dentro do transpoFtad.or, iQnEoforese e saturar c) transportador em uma solução dp agçmte biolõgico são adequados exemplos contemplados na formulação 0 10 de uma composição f armacêutica para ser usada par-a prática de descritos métódòs d.e trataÍjnento- A1LerFIat ivament-e, o transportador pode ser pouco mai s que um diluente par"a ç}
age'nte biolãgico.
Estas formulações podem incluir, p.or exèmplo, põ-s , pastas, unguent ds , geléiãs, ceras , Cleos, 15 lipídios, bases que absorvem anidro, ernuísõeq de óleo em ãgua ou ãgua em õle"o, emulsães de carbowax (glioals de-
poliet ileno de uma variedade de peso moleçular) , gels semi sólidoa e misturas semi sóIidas eQr1tendD carbQwax .. o regiTn.e de dosagem utilizando o's compostos da presente invenção é 20 selecionado em concordân-c i.a c.om uma variedade de fat.ores in.ç1uíndo t ipô, espécies, ídade, peso, sexo e condição 0 médica do paciente; a. severidade da coMi çã'Q pàrà ser tratada; o modo de adTuinistraçãoi as f unções renal ,
he'pát iea e cardiovascular do paciente; e o part icülàr
25 ag.ente biQ1õgico destes empregados . Um tnédic;·o ¢jü vêterinário experiente pode prQntamente cíet=rujinar e prescrever a quantidade efetiva da droga requ'e r i da para prevenir, conte"r ou dete-r c) progresso da condição.. Ót ima pr-eci são a1canç.ando de 'çQncen.traçõe's da droga eíentxQ de
30 irLterva.lp que. rênda eficácià sem tQxicidade re.queE "um regi.me basedQ na cinéti.ca das drQgas dis.pQrLíveis para loc-ais designados . Isto envolve a cons ide ração da
52'
distribuiçãò, equiíibrio, e e1iminação da tirógà.
Quaígq1íer das ar)tecedentes formulações podem ser apropriadas no tra"tarnento e terapiaA de acordo com a presente in-venção, prQVendo que o ingrediente at ivo na f ormuiaçãQ nâo é 5 inatívado pela formulação e a formulação é fisiolô'gicamente compat ível.
As c.ompQsições farmacêuticas da presente invenção podem ser a'dministradas para o hospedei'ro de qualquer mane ira, estratégia e/ou conibirLaçãQ disponível na matéria errt 10 quantidade suficiente para ofe:recer um terapêutiç'Q 0 tratamento cQntra a Doença de Alzheimer . Estas composições podem ser providas para o indivíduo por uma variedade de mane iras" oonhecidas ria rnatêria, especialmente dr- modo parenteral, incluindo, mas não litnitando a mane ir.a p.ara 15 modo parenteral, tal como administração intravenosa (IV) , íntramuscula.r (IM) ; eru subcutânea (SC) , com adminístração i intrave'nosa que é a normal dent ro da matéria de administFação de anticorpo terapêut ico . Estas cornpos ições po.dem ser aámini stradas como ao3es separadas ou rníilt iplas 20 (ísto ê, adm.ínistraçãQ do an t i-corpo a horário esealado mantendo a condi.ção estéril d,a formulaçã'o através do regim'e 0 de tratamento) . O regime de dosagem rutilizando qs .cornpostos da presente invenção ê selecionado de acordo com uma variedade de fatores incluindo: tipo, espécies, idade, 25 pes.o , sexo e condição médica do paciente mi ço.mo urn p'aciente humano) ; a severidad,e da condição para ser tratada; o modo de adrninistração; funções renal, hepática e c.ardiovascu1ar do paeiente.; é o pa-rticular anticorpo. destes empregadQs - Um médicQ Qu vete.rHáriO experiente pQde 30 pront ame.nt.e det errriinar e pre s c reve r a quantidade efetiva te-ra-pêuti'ca do anticorpo.
Precisão ót ima alcançada d.e concentração ant ico'rpo dentro dQ intervalo. que rende
'êEícãcia sem tòx'ie"idade 'reque'r um regime basêàdõ 'na cinét i ca das drogas awail habilidade para target sites. Isto envolve uma consideração da distribuição, equilíbr'o, e eliminação da droga . Anticorpos descritQs neste documento 5 podêm se:r . Usados sozinhos na dosagem a.proprijada.
.Alternativamente , co-administração ciu administração s.equenci al de outr.o.s agente's pode ser de'sejãvel. Será pos-sível p-at a present:e jrrvençào urrí regime de dosa,gem terapêutica para os ant icorpos em c-ón junção cotn a
1.0 ãdministração de regime profilático ou terapêutico 0 alternativo. Um re'gime efetivo de domgem variará, e'nquanto deperide de mui tos fatores diferentes, inelusive meios de ' à'dministração, local designado , estado f isiolõgico do paciente, se o paciente é humana Qü urn animal, outros 1 5, medicamentQs administradçss, e. 3e o tratamento é profilãctíeo gjü teí ap.êut.i.cQ. pãra admi.n,i. s.Ê r.ação ,de um anticorpo como 13C3 , q intervalo de dosagení de cetma de 0,0001 para 100 mg/kg., é mais usualmente de 0, 01 p.ãra 5 mg/k.g do pesQ do corpo do Mspedeirm No çasQ de Doença de 20 Alzheimer, depõsitos de amilõide ocorrerti no cérebro, agentes da invenção podem também ser administrados na 0 eonjunçã'o com outros agentes que aumentarn a passagem dos agentes da invenção através da barreira do cérebro. Outro aspecto relativo a regimes de entrega e dosagem para 25 uma composição de anticorpo coukj 13C3 da presente invenção relata para entrega da droga via maneira parenteral, que pode incluír d.isposi t ivo não injetável ou injetável. Tipicament e , composições injetâveis são preparadas como soluções líquidas ou suspensães ; form'as sõlidas
30. s.atisfatórias para solução ou su spens ão p-ara veículos líquidos3 antes de in j eçãQ também põdem ser prep.arados . A preparaçãç) também p'ode SeF e-mulsifiçada qu êncapsulada e.m'
liposomes ou micropartíçula8 tal çõmo paliiaetide, poli'glicQlide, ou copolímero para melhorar efeitos adjuvantes, como discutidos acima (ver "Lange r , 19 9,0 , Sci-ence 249: 1527-1523; and Hanes , 1997, Advanced D:rogà 5 De'1iv"ery Re'vi ews 2.8 : '97-119" ) . Os a.gentes desta, invenção p9deTn ser administrados na forma de uma injeção de depõsito ou preparação de implante que podem ser formulados de tal maneita para permitir uma liberação contínua ou pulsativa CÍQ. ingrediente ativo .
0 10 Cçmçretizações específicas incluem micreoesferas de PLGA, goKto discutido neste documento e como també'm xTeícuIçys não degradantes baseados eín políTnerQs que incluem p.Qii (etileno-co-vinil aceLatQ; PEVAç) . Adic ionalmente , çQEltEole de liberaçào e entrega localizada de ant i corpo 15 baseado em prQdutos terapêut i cos é revi sado em ( "grairLger, et al-, 2004, Expert Opin. Bíçil. Thet-. 4,(7") : /029-1044") , por çste meio ineorporado inteiramente por referência. Mic.rocãpsulas adequada capaz de encapsular o anti eorpo podem também ineluir hidroximetil celulose ou microcãpsulas 20 de gelaLina e microcãpsula.s de polimetil metiacrilato preparadas por técnicas de conservação ou por poIime'r'ização 0 interfaci.al. Ver publicação PCT WO 99/'24061- com íítdlo '"Me'thod for Producing IGF-I LÍberaçãõ retardada FQ'Emulations, " caracterizado por uma proteína ser 25 encapsulada em microesfera de PLGA, esta referência we é desta f orma incorporada inteiramente nest.e documentg por referência. Em adição, rnicroemulsões ou siStemas de êntreg.a de dÊoga coloidais eorno miero esfera de liposomes e albumiria, podem também ser usadas . O'utras pref erenciais 30 composições de liberação sustentada empr'egam um bioadesivo para r'et.er o antieorpo no loeal da admí"nistFação, Como notaçíò açima , a formulação de libéração sustentada pode compreender um pol í mera b'iodegra-dável dé'ntro do qual o anticorpo é çôlç)ea·dQ, que pode prover' Iiberação nã(D imedíata . Dispositivos não injetãveis podem ser descritos n-este docurnento como urn " implant e" , "implan-te de depósito 5 farmacêuticQ" , " implant e de depõsito" , "dep-ósito não injetá"jeI" ou Qütr'os te.rmos siwilares. CQmuns implante.s de depó.sito pQdem inclui-r, mas não são limitâdos para, sólido biodegradável e dispositivo de polímeros não biodegradãveis (tal como urn polímero estendidci Dü dispositivo de forma 0 10 cjlíndt"ica coaxial) , tanto quanto numèrosos sisternas de bQTTíba também .conhecida na rnatéria. Dísp'osítí\TQs injetãveis são fendidos em injeções de bolus (liberação e dissipação da droga subs3equente para in jeção) ,, e repositório ou ij'íj ?ções de depõs i t.o , que contenham um reserva.tóriQ de 15 armazenagem no local da injeção, permitindo a liberação ¶ sustentável do agente biolõgicQ com o passar do temp'o . Um dep6sito de implante pode ser cirurgicamente an1arradò ng b pon'to de entrega tal como para prover um adequado reajuste' para liberação prolongada cíçj anticorpo ao passar do temp.o. 20 Tal di spositivo será capaz de transportar a fQrTrFulação da draga na quancidade requerida para tratar terapeut ic'amente 0 ou profilaticamente pe ].q período pré-selecionado. O.
dep'õsito de implante pode Eambém prov"er proteçào. para degEad.ação da f ormulação por proeessos dp corpo ( tal çqtt|o 25 proteases) pela duração do tratamento. Como conhec ido na matéria, o termo "liberação sustentável" refere-se para a gradual (cont ír-ua ou descont ínua ) liberação de tal agent.e do bloco dà m.atriz de pòI ímero atravês de um peFíodo e"stemdido de tempo - IndifeFentemente cÍq dísp.ositívo 3'0 específico, a liberação sustentávej. da composição 'do ant i.co.rpo como 13C3 resultarã e.m uma local con.centra-çãQ bicjIçjgicamerIte efetiva do ant ícorpo- Uma libe ração sust'entãvel d'o agente ('S') biolôgieo será por um péríódó- de. ürn s.imples dia, vãrios dias, uma seman.a ou' rnai s ; mas mja-is p.or'vávei por um mes ou mais, ou aumentado para cerca de seis meses, dependendo d.a fotmulação- Políwer.o.s naturais ou 5 sintéticos .conhecidos na rrtatéria serãa úteis cotfiq um depÕsi to de implante devido às características tai.s cçmo einé t i ca de degra.dação , versâtil, segurança., bi.ç)eç)mpat ibilidade . EStes copolímeros podem ser ma.nípulados para modifiear a farmacocínética dos
0 10 ingre'dientes at ivos , paEa protegeE c) ãgênte de ataqjue enz.imático, tanto quanto degra.dação com 'o pas3sar do tempo n.o .l.gc:aj acessórjjo ou de inj eção . O artesão entenderá que existem arnplos en s inament os na matéria para wanipular as p-rQpr iedades destes copolímeros, incluíndo q reSpeçtivQ. 15 pro.ce.sso 'de produçào, e usam catalisadores e peso' molecular í: ihai do irnplante àe depõsito de Iiberação çon-t ínua ou injeção de depõsito.
Polímeros naturais imçluem, nlAs nã-ç' SãCY limitados para, proteínas (ex . , colãgeno, gelatina ou albumina, ) ; p0lisaçiaEides (celulose, goma , .al.gin.at'os, 20 quitina, qjuitQsana, ciclodextrin, dex"tFan, ácido. de hialurônico) e lipídios . Polímeros biodegradâve.i s 0 sintéticos podeui incluir, mas não sãcj limi tado"s para , vários poliesteres, oopolímeres de ãcido L-glutamic ,e gamma etil-L-gluta-mato ("Sidman et al. , 1983, Bi.opç>limèrs 22,:547- 25 556" ) . poliláticos ([PLA]; Patente U.
S . No. 3,"773, 919 e
EP 058,481) , poliiactato pologlicQjl.ato (PLGA) tal como poli1ãtico-co-glicolido (ver, por exemplo , Patente U.. S.
Nos. 4,767',6.28 e 5,654,008)', pQliglic·olido (PG) , polietileno glicol (PEG) conjugados de poIi (ácidQs ql- 30 hidrQxi) , poli orto ésteres, poliãs-pírir[s, polifos.fagen.es,
vinilpirro1idorLe, ãlcool de polivinil (PVA) , PVA-g-PLGA, PE'GT- PBT eopç í.uiero (poLiativo) , metaacrilatos, poli (N-
íg0propílaçEi 1amida) , PEO - ppo- peo (pluroríic:s) , PEO- pp'o- F'AA QQpolímeros, PLGA - E'EO - PLGA, poli oFto é-steres (POE) , ojj qualquer combinação destes, como de'sc.ri to ac irna (ver , por exemplo, Patente U-S.. No- 6.,991,654 e aplicação de Patente 5 U. s.
No . 20050187631, c:ada uma delas é iTlcorpc)rada . inEeiramer1te neste document o pQr Eeferência, hidregels (ver ., por exemplo , "Langer et al - , 1981, J.
B i omed . , Mater.
Res . lS:167-277i La.nger, 1982, Chem.
Tech. 12: 9.8- 105" , acetato de etileno-vinil (ex . Disco de acetate de
0 10 etiKmo vinil e pciíi (àcêtate de etileno-co-vinil) ) , copolímeros cle ácido de ãcido glicõlioo Láctico degradável tal corno o " Lupron Depo t'M , ) . poI1-D- (-) -3-hi-droxibutirico ácido ( ep 133,988) , hialurônico ãçido gels (ve'r por exemplo, Patente U.S.
Ncj. 4 ,636,524) , suspensãç) de áçído 15 alginico, poli orto ésteres ( POE) , e sernelhantes.
Matéria de polilijtico' (pla) e seus 'copolímeros com gli.colide (PLGA)
sã.o bern conhecidos desd.e a çornerei alizaçãó do LIupFQrL Depot", aprovado em 1989 como o prime ira f ormulação parenteral de liberação retardada utilizando pQ1írneros de 20 PLA . Exemplos adieiônais de produtos que 11tilizam pla é
PLGA como excipientes para alcançar a liberação retardada 0 do ingrediente ativo inclue Atri dox (PLA; doença peridental) , Nutropin Depot (PLGA; corn hgH) , .e o.
Trelstar Depot (PLGA; c'âncer de próstata) . Oijt ros pçjZ íme ro"" 25 s"intéticos incluem, mas não sãcj limitados par.a, poli (e-
caprolactone) , poli3-hidroxibutirato, poli (âoid-o |3-mãlico)
e poli (dioxanone.) ]; polianidridos, poliuretano (ver WO 2005/013'936) V pQ"iiamidas, ciclçjde.strans, poIi orto êsteres,
ãleool dè n-vin:íl, pç)1ieLil.erjo ox-ido/pol ie"ti leno 30 .tçmef tajatm pQl-ifQsfazenQ, pQlifjosFatíQ, pQlifQsfQn-at,Q.,
poli ortho êster, policiaríoaerilato, polieEi1en.Qgilcol, poIidiidropiran,, e poLiacital.
Dispositivos não biQdeg'ra'dá-veI incluírido, mas não são limitaMs para, "vãrios deFivatjivos de celulo.se ( carbox irne i 1 çelu1Qse, celulos.e açetato, celulose acetatQ prçjpi9natQ , et il çe1ulç?se, hidroxipropil metiil eelulose) impl-antes b.aseados errr 5 silicone ,(poIidimetiísi1oxane) , polímeros acrílicõs, (polimetacrilato, poIimetilmetacrilato, poIijdroxí (et ilmetílacrílato) , tanto qLlantQ po1ietíleno-co- (vínil acetato) , pQ1QxameF , ., pôIi,v-inilpírrol-idon.a , poloxamine, .. poliprópileno, poliamída, p01iac-etal, 0 10 poIiester, pol i etileno-cloro.trifluoretileno, politeErafluoroeti.leno (PTFE ou " Teflon" " ) , estire'no bU.ta.dierÍo rubber, políçtileno, pQ1iÊjÈ'opileno, polif'enileno oxido-polisti.reno, poli-a-cloro-p-xilenê, pQ1iTnetoi1pentene, polisulfone e outros relatados polímeros 1·5 b'iç 'está'vel. Transportadores adequados para liberação , Eetardadia de depõsito de formul.ações incluíndo, mas HÊÍq limitados para, micosferas, filmes, cãpsulas, particulas, geís, coberturas , matrizes, wafers , pirul-as cjü cmtras eemposi ções de entrega farmacêut ico. ExempiQs de tal 20 formulações de l iberação retardad.a são desçritos. aoima.
Ver também Patente U -S . Nos . 6,953,593; 6,946,146i 0 6,656,508; 6,541,033; e 6,451,346, o conte'íido de cada urrta são incorporados neste documento por referênci.a- A dosagem mais capaz de transportar a f ormulação da droga em .tal 25 quantidade e concentração como t erapeut icamente requerido para o trataniento no per íocXj pré seleciona'do, e pos'sa prover sufioiente proteção contra a degradação da .f Qrrnulaçãp pQr proçessQs do co,rpo pela duração do tra.tamento. Por exemplo, a forma de dosa.gem pcAe ser 30 cercada por um exterior feito de um material que tem pro"priedades. para proteger contra degradação dos process-os m"etabõ1icQs e riseo de, 'ex . , va z-amento , rachadura, quebra au di'sto'rção. Estes "poãe'm preveni r expelir os c'onteü'dos da forrna de dosagem de uma mane i ra desccmtrolada debaixo de tensães que seria suportada durante (3 us·O, ex - , devido as forças físicas rnostradas no dispositivo de liberação da 5 droga, como. resultado da articulação normal da junta e outros movi-mentos do su j eito ou, por exemplo, liberação da .droga ern disposi t-ivos convectivos , força física associada cem pressão gerada dentro do reservatório., Q reserva.tóriD de droga ou outros meios, por segurar o\j cçmter a 'd.roga, 10 também dev.ern ser de material que evite reaçiiiSes não 0 intencioriai s çorn cj agente ativo da formulação, e ê preferèncialmeljLe bi9col¶pativéI (ex . , onde a forma de dosagern é implanta.da, ê substancialmente nãQ rea.tivp çom respe.ito aa corpo do sujeito ou f luido do corpo), . 15 Geralmente, o respeetiuo agente (5) b.iolÓgico é administrado pmm um iadivíduo por pelo mene-s 12 h©Fas para peío me,nos uma semana, e mais provável via um implante desenhado para entregar urna droga por pelo rnenos 10 , 20, 30, IOQ dias .ou pel9 lne.nos 4 meses , ou pelo Tnenos 6. meses ou mais, como 20 re.querido. Q anticorpo corrto 13C3 pode seE erL"Eregue a tais rela'tivarnente baixas taxas de volume, ex . , de cerca de 0 0 , O.Cll ml/dia para 1 rnl/dia tantQ como para minimi zar distúrbio de tecido ou trauma perto do local cmde a forrnul.ação e liberada . A f ormulàção pode ser liberada a 25 razão de urria baixa dose, dependendo do específieo agente (s) biológico, ex . , de cerca de 0 , 01 µg/h ou 0., 1 µg/h,, , 0, 2 5 µg/h, 1 µg/h, geralmente aumentada para cerea de 200 µg/h.
ou a formulaçãõ é entreguê razão de baix9 YQlume em , 1jnIa razão de volume de cerca de 0,001 rrtl/d.i.a par'a cerca de I 30 ml/dia, por exemplo, 0., 01 mi crogramas. por di a aumentada p.ara eerca de 20 milligramas pQr dia . A dos:agem depende .de vários fator-es tal eorrtQ pot êne-ia , jbi.Q disponíkjílidaÊ$e e toxieídàdê 'dQ ingred"íente atívQ (ex . , anÊi'éorpo Tgg) usa'dQ' e o requ'erime.nto do sujeito. Estes e, o.utrQs objetos,, vantage'ns e características da presente ínvençãç) fieàMo evidente.g a essas pessoas, 5 ©lali£ieada'S na matéria a Ier os detalhes da meto.àologia e
F composições mais completamente como apresentadas abaix9 - EXEMPLO$3 ,EXEMPLO 1: PREPARANDO A FORMA PROTOFIBRILAR DE AMILÕIDE BETA (AB42) 0 10 Qs peptídeos sintéticos Ajj42 ( "Am.erican Pept ídeo Company, Ine . , CA" ). forarn preparadQs. de acordQ ç:orn o método. deserito pof "Fezoui et AL" . ("Fezoui , et al. Amilóide 7"(3) : 166- 17 8 . (2000)"). Re sumidamen t.e , liofilizada A[J4 2 fo"i dissolvido ern 2mM NaOll a uma concentraçãQ de img/ml (pH 15 aproximado de 10 , 5) seguido por ultrcj som e Iiof'ilizaçã'o. 4 NaOH tratado % foi d.issòlvido em água a uIna eone'eritração de j-mg/ml e f ilti:ado com um "ULTRAFREE - MC flilter (Mi llipore, MA) " 0, 22µm. Uma solução de pept í.deo 0 ,. 5m'g/ml fXji buferad.à à coneéntração f inal de f osfato50mM; Cloreto 20 de sódi.o 1O0ruM e incmbada por 4 hQras à temperatur.a ambiente. Para separar a forma de protofibrilar de proteína 0 de baixo peSo rnolecular, cj subrernadante foi fracicmado usarldo ercmotografia de exclusão de e aman.ho . Frações purificadas de SEC foram então armazenadas .a 4C° . 25 Várias formas da proteína Ajj4 2 são representadas como rnostrando suas habilidades como um manômero ou dí.mero pa.ra associar j unto-s p,ara fQrTnar oligômero de pesQ moleculâr .alto (proto.£ibríl) ('Fígúra 1) - TambéTIi a agregação do promfi-brils solúvel cria uma Eorma de p.rQteíha insolú.vel, 30 [ron-sidera.ndo que o prntofibrils pode di'sassociar para .trã's para uma forma molecular de baixo peso.
P"ãFã purificar a protofibril.ar Ílôrma À de p'£pKeínas de baixo peso molecular, amostras f oram f racionadas com um sÍi s.tema de crcmiatograf ia de AKTA usando um Supe.rd.ex coIun'a 75 d.e exclusão de tamanho . Figura 2A inostra que sem incubar 5 cj's peptideQS sintéticos Aj342 à tempera.t.ú.Eà. aTnbienEê., ríão existe agregação de oligômeros' para f ormar o protof ibrils . Figura 2B ilustra que depoi-s de 4 horas de incubação dos pep-tídeos sintéticos Aj34 2 , subsequente purificação SEC apresenta uma definitivâ fração de protof ibril.
0 10 EXEMPLO 2 : GERAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS
ESPECIFICAMENTE POR PROTOFIBRILAR AB O.s ant ieorpos 13C3 , 19A6 , e idi fora'm criados por imunização de rato Bâlb/c com a proteína f ibriliar A.|3 usando um p]:Qt-ocQQ canhecido na matêria. ( "Harlow, et al. 15 Cold Spring Harbor Labora t Q.W- (19 8 8 ) " ) Baços f oram tem9vidos e fundido çoin çélü1as de wíeloma Sr2 em várías placas boas 96. Culturas de fusão foram monitoradas por cres.cimento e s"obrenatantes f orawi sep'arados por suas hãbilidàdes para 1igar a f raçãç' de protofibriliar por 20 anticorpo capturado dos imunoensaios .
EXEMPLO 3: CARACTERIZAÇÃO DE ANTTCORPOS MONOCLONATS 0 ESPECIFTCAMENTE POR PROTOFIBRILAR Af3 Ensaios para, capturar ant icorpo f oram usados para t ambém caracterizar os ant icorpos monoclonais produzidos dos 25 híbr idoma s (13C3, 19A6 , e 1Dl) . Pafa placas de microtitalação, 50ul de uma solução de proteína prç)Lçjf ibrilar aB42 2ug/ml foi acrescentada para cada bom e as placas forarn incubadas a 4 °C durante a noite- Depois de incubaçã.o, a soLução residu-al de antígeno foi remo"vida e 30 la"vada com soluçã'o. de PBS . Diluiçõ.es seriais do hibridoma soh-ren'atantes foEam acrescentadas para as pIates contendo q iarltígenQ de ligaçã9 e i.rLc!1bado pq1" 1 hQra à teu\peEatLlra àmbiente. E'sta s'olução µFimã"ria- de anticcirpo fícj'.i removi.da e os borí": Eoram lavados c"ontra utna soluçãa de PBS . Um antícorpo de enzima secundária ident i f icado Eoi depois açrescentado e íncubado por 1 hora à temperaEura ambie-nt.e, '5 Depç>is de removida a solução de ant icotpp se'çundário, um.
substrato cromogênico especif icado por enzima conj ugada, fo:i acrescentado para a reação e a detecção do antic.orp'o.
.capturado rendeu resultados quantitat 1\tcj8 - Dp A.diçionalmeIjte, mudando o reagente sec1ilndãFiQ p.ara 0 10 és.pecificos isotípicos anticorpos de anti - imunõglobulina, o particuiar isõtipo imunoglob ina de cada monoclonal foi identificada- Nestes expe r imen.tos , comerc i alment e -dis.poníveis antic'orpos .anti-AB42 fcmam usado8 para co[nparar a ligação especi f icarnente de anticorpcis monocLo'nais J.3C3 , 15 19A6 , e IDI .
Figuras 3.A e b ilustrata q prQtofibriLar (E?F) e as Eprmas de baixo peso molecular (IJMW) do peptíde'o Aj342' usado. para testar a especifici.dade do anticorpo 13C3 capt'urado nos imunoensaios ., Espeei£iqamente, a FigtlL'a 3a ilu.stria q '20 dese"nhQ gerado do ELISAS mostrando que cj ant ic·oEÊjQ 13C3 é específico para a forma protofibrilar (PF) de AÍ342 e não é 0 reconhecida a forma de ba ixo peso molecular (LMW) da proteína . Figura 3B ij-ustra os daclos do. elisa data com o comercialmente di sponível anticorpo 4G8 , mostrando que 25 reconhece arríbas as formas a de peso molecular baixo .e a pr-otof i.brilar da proteína Aj342.
exemplo 4: espec ífi cidade de ant icorpos monoclonaís para formas protofibrilar de AB42 us'ando RESSONÂNCIA de SUPERFÍCIE de plasma (bIACORE) .
30 Os ant icorpos monoclonais purificados listados na tabela 1 (.ab-aixo) , foram imobilizados para Llúl chip de' sensor clê BIAeore , de acorda c:orn, p rçjÊçjçolos publ ícados . ( "Níçe , et al, BiQEE!s'ay-s 2í: 339-3SZ '(1999')") . a ãlta sémsibi'lid'ade- da resposta óptica do BIAcore quantifica uma mudanç a .eni reflectividade e uma resposta cíe linhas base, quanto o Iigando isolado é gerada. A anãlise .de int.eração .é 5 e.Xê.-cütada como o V '' analísta, a forma LMW ou á fQ-rma pf do Aj342 , são iríjetadas n'a solução sobre çj çhip do sensgr e a mudança da ressonãncia da superf ícíe do plasrna gera uma resp.osta que identif ica a especif icidade da habiliciade de cãda ant:icorpo para ligar LMW e PF A|342 . Em ambos cjs 0 10 anEiçoFpos 13c3 e 19A6 todas as ligações para a for'ma PF do Aj34 2 com especificamente uiais alta qjue a f orma LMW. De tados os anticorpos usados no experimento, o.s anticc)rpQs diSpOrLíveis come rgi almÊnte mostraram alta especifícidade para o LMW Af342 em eima da forrna PF do Af342, eomo indica a 15 razão àe ligação PF / ligação LMW.
Tabela l- BÍACORE Anáíise de LigaçãQ N'Qme Epitopu lsotipo Fonte _ L.MW _ P,F _ R,a,z,ão(PF/LMW) 1D1 estrutura lgGl Ravetch 23,2 122,3 5,3 13C3 estrutura lgGi Ravetch 25 124,8 5,0 19A6 estrutura IgG3 Ravetch 3D6 Ajj l 5 lgG2b Elan PharmaceuticaÍs 424,6 402,7 0,9 4G8 Al3 17-22 !gG2b Senetek lnc- 228.6 340,3 1f 6'E1O Ajj 3-8 IgG2b Senetek lnc. 400,1 541,1 1,4 0 _ 82E1 A|J 127 lgGl IBL 69,9 68,4 1,0 A Análise de Re".sonânQia. de Superfície cle Plasma mostra 'por sensorgrama què 13C3 (Figura 4B) não Iiga n fo-rma LMW de 20 proteína A|3 42. Erribora o 4G8 (Figura 4A) apresente uma curva padrão associação/disassociação para a proteína LMW Aj342 . O controle de anticorpo i sotipo IgGl (Figura C) não liga q LMW Aj3 tão bem- Sistemas .automatizados de BIAcQre, que usa c) princípio de detecção de Rçssonância de 25 Superf ície de Plasrna, forarn usados nestes experim'entos . .Os dad.os de especif icidade de ligação para c) anticorpo 19A6 mostrou que" 19A6 t'eve' uma raz ão de ligaçM '5, 8', 'que é .üjniiar para o l3C3 a uma razão de 5, 3. EXEMPLO 5: MAPEAMENTO DO EPITOPO DO ANTICOR'PO 13C3
O mapeando dos epitopos de 13C3 , 1D1 e 19A6 foi ccmduzido 5 usando o S@tema de Microarranjo RepliTope ( "JPT Peptíde'o
Technologi e s GtnbH " ) de acordo COúl o protoco1o publ.i cado. ( "Ko.rth, et al. 390: 74 (1997) ") , cada lugar, no micmoarra-njo con-tinha um peptídeo de ácido am.ino 13 de A|"42 ande cada troca na posição sobre q microaEran-j o representa 0 10 urna troca no· ácido amino (forma N- termo para C-termo) , ist.o é SEQ TD NO: 23, SEQ ID NO: 24, .SEQ ID NO: 51; e SEQ IR NO:
52 . São listados abaixo qs pept ídeos e suas sequências exatas de ácido aríiincj, correspondend'o a suas .posic.iões no deslocarne.nto do arranjo.
Un;ia ve z os pept í de.os são f 1XMOs 15 para o RepliTope Mi-croarranjo, as arnostras sãó incubadas
CQúl o anticorpo 13C3 e, então subsequentemente identif ícadQ çqi1) um secundário que é conjugado para uma etiqueta de quimiluminesoência de escolh.a.
Cada lugar que rendeu um ainal representa o local de ligação de epitopo s"obre a 20 proteína para o anticorpo -
Asp Ala Glu Phe Ar'g His Asp Ser Gly Tyr gIu val His (SEQ ID 0 no: 23)
Ala Glu Phe Arg His Asp Ser GLy Tyr Glu val His His (SEQ ID NO: 24) 25 Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr GIu Val Eíis Efís G1ri (SEQ ID
NO: 25)
Phe Arg His Asp Ser GJ-y Tyr Glu Val His His Gln Lys (seq id nq,: 26) Arg Hís asp Ser Gly Tyr gIyt va.l Hi$ His Gln Lys Leu (seq id 30 NCk 27)
His Aap Ser Gly T-yr Glu Val His His GIn Lys Leu val (SEQ id no.: 2-8)
Asp 'Se:r GIy Tyr giu Val His His 'Glm Lys Lep Val Phe (SEQ id'
NO: 29) Ser Gl.y 'Tyr Glu Val Elis- Hi's Gln Lys Leu Val Phe Phe (SEQ ID NO: 30) 5 Gly Tyr GIu .Val Kis His gln Lys Lezi v.al "phe Phe Ala (SEQ ID
NQ.;' 31) Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu V'al Phe Phe Alà GLu (SEQ ID NO: 32J GIu Val H.is His gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp (SEQ ID 0 10 Nqg 33') Val Elis His Gln Ly's Leu Val Phe Phe Ala gIu Asp Val jsEQ Ilj NO: 34) His His Glrr Ly.s Leu vaj E'he Phe, AJA gI:tj Asp val GIy (SEQ ID NQ: 3$) 15 His- 'Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser (SEQ ID
:NQ: 3'6) 0 gln Lys Leu Val Phe phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn (SEQ ID
NO: 3.7) Lys Leu yai phe Phe Ala GLu Asp Val Gly Se.-r íwn Ly:" (SEQ id 2Q, NQ: 38)
Leu Val Phe Phe Ala GIu Asp Val Gly Ser Asn Lys.
Gly (SEQ ID 0 NO: 39)
val Phe Phe A.la glu Asp val GLy Ser Asn Lys Giy Al-a (SE'Q ID NO: 40) 25 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asri Lys Gly Ala Ile (SEQ ID
NQ: 41) phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lle I.l.e (SEQ ID
NO: 42) Ala Glu Asp Val GiY Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile G'ly (SEQ IE) 30 NO: 43)
glu .ASp val Gly ser As.n L.ys Gly AJla Ile Ííe GIy Leü (SEQ Ílj no: 44)
As.p val Gly Ser Asn Lys gjY Ala Ile Ile "Gly "Leu "Me't ("S'E'Q ID' NO: 45.) val Gly Ser Asn Lys Gly Ala. Iie Ile GIy Leu Met Wl. (SEQ ID NO: 46) 5' Gly Ser Asn .Lys Gly Al.a I1e Ile GiY Leu Met Val gly (SEQ ID NO: 47") Ser As.r Lys Gly Ala Ile í1e gW Le!j' MêE val Gly Gly (SEQ id . NO: 48) Asn Lys Gly Ala Ile' Ile' GLy Leu Met Val Gly Gly Val {SEQ ID 0 10 NO: 49) Lys Gly Al.a Ile- Ile Gly Lçm Nlet Val GIy Gly val Val (seq id NO: '50) gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Vaí Gly Gly Val Val Ile' (SEQ ID. nq: 51) 15 Ala Ile Ile Gly Leu Met Val gly Gly Val Vaí íle Ala (SEQ ID NO: 52) 0 Figura 5A iíus tra Uri borrão de pontos para um experimento de "RepliTope Mi{2roarran j q identificando q ep it©pos do anticorpos, 13C3 , lljl e 4,G8 s'obre o peptídeo Aj3 1-42. A 20 ligaçêio .cÍq ant i corpo é represent ada p.or um sínal quimilurninescente. Figuras "B ilustram a SequêrLcia Aj3 1-42 0 de ácido amino rnostrando os segmentos de polipeptídeo do epitopos l3C3 corno eles ocorrem na sequêneia. O anticorpo IDI apresenta os mesmos epiÊopos coino o 13C3 considendo que 25 o anticoFpo 4g8 cornercial identific'a um diferente.
EXEM.PLO 6 : CARACTERIZAçÃO da ESPECIFICIDADE de 13C3 Figura 6 ilust ra frações de cromotograf ia de exclusão de t amanho dos sobrenadantes da línha de célula 7PA2 , uma Seg-regação da linha de célula de oI igârneFo Aj3 - Enaaios de 30 eaptura de anticorp.o fQEam µsad0s para .também ça-raçteri%ar a ligação do anticorpo 13C3 cQm o protofibrií-ar e fr.ações de baixo peso molecular 'dQ SEC-purificado 7PA2. para placas
'67 de mic'roti tulação, I'OO'ul de urria diluíç'ão 1:200 de cada Eração foi acrescentadQ para cada born e as placas fo-ram iFIeuba.das a 4 °C durante a noite. Depois dà inctj.bação, a solução de ant ígeno residual f Qi removida e lavada com 5 solução de PBS. Dilmições em série dos s;obrenadantes 13C3 foram acrescentadas pàra as pIacas corltendp o antígeno de ligâção e ineubado por I ho.ra à temperatura ambientç. Est:a solução de anticorpo priTnãFia foi rerncsvida e CjS bçms foram outra vez lavados com solução de pbs . Um a.nt icorpo 10 secundário de. enzima identif i.cada foi depois acrescentado e 0 inçubado por 1 hora à temperaturja arribiente . Depoi s de remov ido da solução de antieorpo secu.ndá r.i q , um substrato cromogêni co específico p'ara a enz irna conjugada, f oi acreseentado para a reação e a detecção do anticçn:po 1 5 captura'dó rendeu resultados quantitati"v"os , Eejte ens.aig identif icou que o ant icQrpo' 13C3 especi,ficame-nte reconhece só a fraç.ão de protofibri Iar eonsiderando qiiie o ant i corpo 4G8 reconhece todas as Erações. A Iínha de célula 7pa2 foi provida por 'Denni s j. Selkoe , P4 . D . at Harva rd Medi cal 20 school" .
EXEMPLO 7 CARACTERIZAÇÃO DA REATIVIDADE DE 13C3 POR EM.
0 o método de coloração que usou um p cQtoçolo padrã.o foi executado . ( 'Brenner, et al. Biochim. Biophys . Ada 34 , 103- 110 (1959)") . Um volume pequeno (10 rnicrolitros) de uma 2-5 sQiüção protof ibr ilar 0 , 2mg/rnl fcji aplieada para carbonQ EWest ido por grades mvar (400 malhas) por 2 miri.
Então as malhas foram bloqueadas em 1'%BSA e incubadas com 'the 13C3 se.g'u i-do por uma subsequente i n.cubaçã'o ccim um" ãnticorpo secundá rio corí j ugadçj para ou't.rp ç9Ioida1 . As' 30 amQstras f ora.m negaEivamente [narIchadas por .cQlQçaçãQ sqb-re 2 $ucessiv9a 9cNâs de .ácidci. f QsfoturLgsL içç> 22 por 3 OÊ3 cada. o excesso de rnancha foi reti.rad,a com filtro de papel,
6'8 -as gEad'e# f'@rat!n s«aáas à àr, e 'c5bseÊ'vada6 sQb.r'e um JE'OL 10 QCX microscópio de transmíssão elétron de 8okv. As imagens foram registradas em forma to 'grande c"om ne'ga t ivo.s Kodak 448-9 e digitalizada.m sobre um escâner de placa plana. 5 As imagens ae IEM ( '"Imrrlurlo -Eleetron Microscopy" ) mostram a especificida.de de lígação dp anticotpô anti-A|3 c,lònado 13c'3 paÉa fibras Aj342 Figuras 7B e 7C) , cpnsiderando que o isotipo de controle de antiEQ"rpo, IgGl apresenta não ·. ligação (Figura 7A) . O ant icorpo secmndârio é conj u'gado 0 10 para uma partíeula cíé eò-lOidaL pçira, EXEMPLO 8: TRATAMENTO DE UM MODELO de RATO DE HUMANO AD 13C3 O arltieçjrp.Q mononlo:nal l3C3 cqtyiq uSado para t-ratat" p-Laquçtas A[3 na Doença de Alzheimer de modelo de rato, 15 TgCRND8. O rato contendo c) APP695 cDNA transgene humano, $ que .aeelera a deposiçào de pjaquetas amilÓide Aj3 no cérebro do rato, ap.are-eeu wxéj i Ms de idade. Uh) gr;upo dé aul9StEa de ratos 5 TgCRND8 de 5 semanas de idade erarn de imuni'zaçõ.es- do anti.corpo monoclonal 13C3 a uma concentraçâo 20 ,d.e 1Omg/ kg de rato a cada semana pela duração de seEe semarjas. IJm segundó grupo de ratos 5 TgCRND8, foi dado o 0 curso do tratamento, porém um controle de isotipo de anticorpo IgGi foi adrninistrado- Os experimêntos fo-ram repetidos cõm tratamento a duas vezes po;r semana ao inv'és 25 de uma vez por semana.
Foram sacrif icados ambos os controles e animais expe.rimenta i-s com 12 semanas de i.dad.e . Preparações his'tológicas cZqs cérebros. revelar-aw redução nas plaqíLetas Af3 nczs r,atQs traEadQs çotyí 13c3. 30 Séções em Série de cérebros criopre'serv.ado de t"atos TgCRND8 forarn tratados co.m anticorpos monoclona is l3C3 ou IgGl.
Fi'guras [8A e ÉSB iZus'tram diferenças· ElÒ núTneEõ de plaqu.eLas arnilóide Aj3 entre cada anticorpo respectivo..
Estatística de teste T mostra qjue o 'antieD'rpo 13-C3 tFa.Lame.Rt0 a. uma vez po'r s euiana reduziu as plaqueta's 5 amilõide A,f3. no .modçlô de DQença Aj-áhêimer (Figura 9A) - Entretanto, tratamento duas vezes por semana (Figura 9B.) mostra o uiesmo' nível .de redução de plaquetas .
TQCÍOS os ratos TgCRND8 acima foram obtido's de "Dr . David Westaway of the ljniversity of Torcmto" - 0 10 EXEMPLO 9: CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS -REG-IÕES VARIÂVEIS DE MAB 13C3 R região de cadeia pesada variável IgG e a região cadeia leve IgG Kappa foram clonadas do hibridouia 13C3 . Ambas as sequências de c'ade ia pesada e leve (F'ígura 10 ) fçjram 15 ana1isadas usando VBASE2 (http.: / /www . vbase2 . cirg) , uma base de ' dados de genes va ri áxel "gêrm-line g'enes" da imunoglobina local de liumano e rato extEaídQ da. "EMBL-Bank and Ensernbl data libraries" . ("Retter et al. Nueleic Acids Re.s. 33:D671-4 (2005) ") . Result ados da a.nãl ise" 20 identi fiearam que ambas as. reg,iões variá'veis de cMkia pesada e leve forarn de uma imunoglobin-a regerLtemêrLte 0 iden'tificada, teve ident idade 73"s e 81%, respect ivamente , para out ra i mmunoglobulina de regiões var'âveis no banco de dados . Também identificaãa nestas sequências ' 25 con'tra estes bancos de dados foram as "Fra.me Work Regions" ( FWR) e as "Cornplementarity Determining Regions" (CDR) Resultados foratn sõ ligeiramente variados quando sequênci-as fioi:arn analisadas contra base de dados VBASE , KABAT e IMGT/LIGM. 30 EXEMPLO 10 : ADMTNISTRAÇÃO PERIFERAL AGUDA DE 13C3 EM RATO
TRANSGÊNICO APP NÃO CONDUZ PARA UM INCREMENTO NO PLASMA AE REFERÊNCIA DISTINT'A DO ADMINISTRADO DO ANTICORPO 3D6
No Rato transgênico APP (T"h-y -APFSL, 10- 14- semanas de idade ) foram inj etadoa intraperi tonealmente a doses de 1(3 mg /kg (isto é, 300 µg/rato) cotfl ant'icç)rpQs Z3C3, uút c!QntEole IgGl (DM4 , não reconhecido AfS) e uin ref ereàeial 5 anticorpo ant i -AB 3D6 reconheceu todos cjs conformes de AB.
O plasma AB foi qu.an'tificado a tempo zero da prê injeção, 6h, 24 h 12 7 di.as após inj eção nos mesmQs r-atos . a quantiticação de plasma AB fpj eixeçutada cçm urn -imunoe'nsaio usarIdQ pares de anticorpo ami -aj9 não interferindo çQm 1.3C3 0 10 ou 3.D6 ligação para AB.
A administração de 3D6 , .em urn ant icorpo contr.a todos còMormes de AB, conduziu para um grande inc,rement o no pIasma AB, conhecido por prptege'r moléculas AJ9 de .degradação. Este efeito 'foi usaào para sugerir o p:otencial 15 "periphera1 sink" hipõtese como mecani Rmo de ação de imwl-oterapíÀ dê ant i -AjlS ( "Dernattos et al. , 2001, PNAS
17.z8850") . A administração de distintos 3D6 , i3 C3 não 'eondaz iu para qualqjuer aumenLo río nível de plaswa AB- IStQ é 'çQxisistente com as propriedades dt= 1-3C3, um antiçórpo què 20 é' e'specífieo para as formas de protof ibrilar de AB e não são rc"conhecidas as Eormas solúvei.s de mono ou olígõmerico 0 de pept ícleo AÊ . Estas f ormas são f ormas eonhec ida s ,pKesent.es no plasma. EXEMPLO 11: RECONHECIMENTO DE PLAQUETAS DE AMILÓTDE neuri te 25 HUMÀNO 13C3 (AGREGADO) NOS CÉREBROS AD, MAS NÃO O DIFUSO DEPÕSITO & DE DTSTTNTA REFERÊNCIA DE ANTICORPO ANTI-AB 3D6 Estudos imunohistoquímicos foram reali 7adcjs com anticorpQs 13C3 e 3D6 d.iagnosticados em seçõeg de cé-rçbro de Alzheimer d'e hurnano , usando. técnicas padrões . Irnunocoloraç.ão de 3'0 ant i.corpo fj oi de tec tada çom um cromogé'no DAB (Fig. 12) .
Iden-ti f icados qs amilóides l3C3 deposita.do.s c.om uma m9EfQ.I.Qgia de pl.aquetas de neurít ieo de âmijSide madurç)s
(também chamada p'Iaquet·a's den'sas)' c.om' u-m- n'úel-eo muito denso ce'rcado por um halo mais claro ou grandes plaquetas de uma mançha forte.
Uma adjaeente seçãQ de cérebro, Tnanchas 3D.6 wuitQ mais 5 czôntestado .que 13C3, como vista a ampliaçã.Q rnaís ba.ixa- (Fig. 12, (painéis esquerdos). Também caracterização d-a mais alta ampliação (Fig. 12, painéis direitos) indicou que identíficado 3d6 mesrna plaqueta de neurítieo de am.ilõide ma'duro como 13C3 e, em adição, riumerpsos depõsitQs d.ê 0 10 amilóide difusQ, que foram descritos classicamente usando irmjno identificação anti-AB, As plaquetas difusas não são d.e .n.a't[ur·eza Eibrilar como descrito na literatura como eles não podem ser detectados por tioflavin S e outras marc:as his.to1ogicaq de fibrilas ("Mann, 1989, Ann. Med. 2lc133").
15 a regrà &!2m diferênças na sensitividade dos dois , anticorpos, foram adminiêtradas experiências semelhante" com uma concentração mais alta (20 µg/mlj de 13C3 e nQvamente não pµderaIn ser de.scobertos depõsit9s difusos Estes dados são consistentes com as propriedades de 13C3, 20 um anticQrp'o que é+especificô para a farma protofibrilar de AB e não é reccmhecido em forma solíivel de mono ou 0 olígomérica de peptídeo AE distinto de 3D6.
APLICABTLIDADE TNDUSTRIAL A invenção tem aplicação no tratamento e diagnõstico da 25 Doença de A1zlÍeimer- TE)das .as pubIicações citadas na espeeificação, sendo publicaçães de pate-ntes e não publicações de patentes sãcj indicativas do níxrel de habilidade dessa qualificação. na artje para a qual çzsta invençãcj pertence. Tod-as est.as 30 p!jblicações s.ão ineorpç)radas neste doeumen.to pqt referência para a mesma extensão cgmo Se Cada p:ublicâção individua1 foss"e especificamente e individualmente indic'a'd.a como se-ndo incorporada por referência- Embora a inveação deste doeumento tenha sido descrita com referência para particulares cQnçretizaçi5es, ê para ser 5 ent'endido .que estas concretízações são meramente ilustrativas das principais, e as aplicaçães da presente , invençâo. Por esta razãQ, é para 3e.r entendido que n.umeÊosas mç)difiçações podem 'ser feitas para ãs ilustrativas concretizações e que outÊos arrarjjQs pMem ser 10 inventados serrí se afastar do espírito e escopo da presente 0 invenç;ão c0mo defiríido para as se.guintes- r.eivindicações.
W 0

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo isolado, que especificamente interage e apresenta uma mensurável afinidade com um epítopo conformacional de uma forma protofibril de peptídeo AO, por meio do que o epítopo protofibril é representado por uma região de exposição de uma forma protofibril Adi, incluindo a sequência de aminoácidos como tal como estabelecida na SEQ ID NO:2, caracterizado por: mostrar mínima ou nenhuma afinidade com a forma monómera ou dímera de peptídeo Af3.
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: ser um anticorpo monoclonal.
3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por: ser um anticorpo monoclonal humanizado ou um anticorpo monoclonal humano.
4. Anticorpo isolado que especificamente interage e apresenta uma afinidade mensurável com um epítopo conformacional de uma forma protofibril de peptídeo A(3, pelo qual o protofibril epítopo é representado por uma região de exposição de uma forma protofibril A13, incluindo um sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo da SEQ 1D NO:3 e daSEQ ID NO:4, caracterizado por: apresentar mínima ou nenhuma afinidade com a forma monâmera ou dímera de peptídeo Adi.
5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por: ser um anticorpo monoclonal.
6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 5 ,caracterizado por: ser designado como 13C3.
7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por: ser um anticorpo monoclonal humanizado ou um anticorpo monoclonal humano.
8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por:. compreender também uma cadeia variável leve incluída da sequência de aminoácido como estabelecida na. SEQ ID NO:5, ou uma cadeia variável pesada incluída da sequência de aminoácido como estabelecido na SEQ ID NO:7.
9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por: compreender também uma cadeia variável leve incluindo uma região de CDR1 tal como estabelecida na SEQ ID NO:13, uma região CDR2 tal como estabelecida na SEQ ID NO:14, e um CDR3 tal como estabelecida na SEQ ID NO:15, ou uma cadeia variável pesada incluída de uma região CDR1 tal como estabelecida na SEQ ID NO:20, uma região de CDR2 tal como estabelecida na SEQ ID NO:21, e uma CDR3 tal como estabelecida na SEQ ID NO:22.
10. Método para produzir um anticorpo monoclonal, que especificamente in vitro tende a uma repetição do epitopo conformacional de uma forma protofibril de peptídeo amiloide 3, enquanto apresenta maior afinidade com uma forma de protofibril de peptídeo amiloide J3 do que com uma forma de menor peso molecular de peptídeo amiloide (3, caracterizado por: compreender as etapas de: (a) imunizar um mamífero com a forma protofibril de peptídeo amiloide 13; (b) colher células B do dito mamífero; (c) criar hibridomas das células B colhidas, onde os ditos hibridomas produzem anticorpos; e,
(d) selecionar hibridomas que produzem anticorpos especificamente tendentes à forma protofibril de peptídeo amiloide 0 quando mostrarem mínima afinidade com as formas monômera ou dímera do peptídeo amiloide P.
11. Método para mensurar a quantidade de uma forma de protofibril de peptídeo amiloide 13 em uma amostra de tecido ou fluído caracterizado por: compreender as etapas de: (a) obter a amostra de tecido ou fluído de um sujeito; (b) colocar em contato a amostra de tecido ou fluído com um anticorpo ou fragmento deste que especificamente tende à forma de protofibril peptídeo amiloide f3 enquanto apresenta mínima afinidade com a forma de menor peso molecular de peptídeo amiloide 13; e, (c) mensurar a quantidade de uma forma protofibril de peptídeo amiloide 13 na amostra.
12. Método, de acordo com a reivindicação li, caracterizado por: o anticorpo ser anticorpo monoclonal selecionado de grupo composto de 13C3, 1D1 e 19A6.
13. Kit para detectar forma de protofibril de peptídeo amiloide 13, enquanto apresentar maior afinidade com uma forma de protofibril peptídeo amiloide 13 que com a forma de menor peso molecular de peptideo amiloide 0, cacterizado por: compreender: (a) um anticorpo ou um fragmento deste, capaz de especificamente in vitro tender a uma repetição do epítopo conformacional de uma forma protofibril de peptídeo amiloide 13, enquanto apresenta mínima afinidade para formas de peso molecular baixo de peptídeo amiloide 13; e, (b) um reagente que tenda, diretamente, ou indiretamente, ao dito anticorpo ou ao fragmento deste.
14. Kit da reivindicação 13 caracterizado por: o anticorpo ser anticorpo monoclonal selecionado de grupo composto de 13C3, 1D1 e 19A6.
15. Composição farmacêutica compreendendo um fragmento de região variável que especificamente interage com a forma protofibrilar de amiloide 13, caracterizada por: a dita interação específica ter uma razão entre a afinidade do fragmento de região variável com a forma de protofibrilar Ab e a afinidade com outras formas Ab maior que cerca de 2.
16. Composição farmacêutica da reivindicação 15 caracterizada por: o anticorpo ser um anticorpo monoclonal.
17. Composição farmacêutica da reivindicação 16 caracterizada por: o anticorpo monoclonal ser um selecionado de grupo composto de 13C3, 19A6 e 101.
18. Composição farmacêutica da reivindicação 16 caracterizada por: o anticorpo monoclonal ser um anticorpo monoclonal humanizado ou um anticorpo monoclonal humano.
19. Hibridoma caracterizado por: segregar um anticorpo selecionado de grupo composto de 1 13C3, 19A6 e 1D1.
20. Molécula de ácido nucléico isolada que codifica um fragmento de cadeia pesada variável de anticorpo monoclonal 13C3 caracterizada por: o fragmento de cadeia pesada variável compreender a sequência de aminoácido tal como estabelecida na SEQ IC NO: 7.
21. Molécula de ácido nucléico isolada que codifica um fragmento de cadeia pesada variável de anticorpo monoclonal 13C3 caracterizado por:
i 5/6 a molécula de ácido nucléico compreender a sequência de nucleotide tal como na SEQ ID NO:8.
22. Vetor expressão, para a expressão de um fragmento de cadeia pesada variável de anticorpo monoclonal 13C3 em uma célula hospedeira recombinante, caracterizado por: conter a molécula de ácido nucléico da reivindicação
21.
23. Célula hospedeira que expressa um fragmento de cadeia pesada variável de anticorpo monoclonal 13C3 caracterizada por: conter o vetor expressão da reivindicação 22.
24. Molécula de ácido nucléico isolada que codifica um fragmento de cadeia leve variável de anticorpo monoclonal isolada que codifica um fragmento de cadeia leve variável de anticorpo monoclonal 13C3 caracterizada por: o fragmento de cadeia leve variável compreender a sequência de aminoácido tal como estabelecida na SEQ ID NO: 5.
25. Molécula de ácido nucléico isolada que codifica um fragmento de cadeia leve variável de anticorpo monoclonal 13C3 caracterizada por: a molécula de ácido nucléico compreender a sequência de nucleotide tal como estabelecida na SEQ ID NO:6.
26. Vetor expressão, para a expressão de um fragmento de cadeia leve variável de anticorpo monoclonal 13C3 em uma célula hospedeira recombinante, caracterizado por: a dita expressão de vetor conter a molécula de ácido nucléico da reivindicação 25.
27. Célula hospedeira que expressa um fragmento de cadeia leve variável de anticorpo monoclonal 13C3 caracterizada por: conter a expressão de vetor da reivindicação 26.
28. Fragmento isolado de cadeia pesada variável de anticorpo monoclonal 13C3 caracterizado por:
compreender a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:7.
29. Fragmento isolado de cadeia leve variável de anticorpo monoclonal 13C3 caracterizado por: compreender a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:5.
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