KR101377535B1 - 원섬유 형태의 베타­아밀로이드 단백질에 대해 특이적인 항체 - Google Patents

원섬유 형태의 베타­아밀로이드 단백질에 대해 특이적인 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 저분자량 형태의 β-아밀로이드 펩타이드와 비교하여 원섬유 형태의 사람 β-아밀로이드 펩타이드의 반복 입체형태 에피토프에 대하여 특이적 친화도를 나타냄을 특징으로 하는 분리된 항체에 관한 것이다. 이러한 분리된 항체 및 관련된 약제학적으로 효과적인 조성물은 원섬유 형태의 β-아밀로이드 펩타이드가 알츠하이머병 관련 합병증과 연관된 섬유 형태를 형성하는 능력을 효과적으로 차단함으로써 알츠하이머병의 치료 및/또는 예방에서 유용할 수 있다. 본 발명의 분리된 항체는 또한 각종 진단 검정법 및 관련 키트에서 유용하다.

Description

원섬유 형태의 베타­아밀로이드 단백질에 대해 특이적인 항체{Antibodies specific for the protofibril form of beta-amyloid protein}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2007년 11월 16일자로 출원된 미국 임시출원 제60/988,481호 및 2008년 1월 8일자로 출원된 미국 임시출원 제61/019,747호에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용은 참조로 인용된다.
기술분야
본 발명은 원섬유 (protofibril) 형태의 사람 β-아밀로이드 펩타이드의 입체형태 에피토프 (epitope)와 특이적으로 상호작용하는 분리된 항체에 관한 것이다. 이러한 항체는 저분자량 형태의 β-아밀로이드 펩타이드에 대한 친화도가 최소이거나 검출가능하지 않다. 본원에 개시된 항체는 알츠하이머병의 발생 및 진행과 관련된 β-아밀로이드 플라크 침착의 진단, 치료 및/또는 예방에 유용할 것이다.
β-아밀로이드 (Aβ) 펩타이드는 아밀로이드 플라크를 형성하는 불용성 Aβ 펩타이드 원섬유의 형성 및 당해 원섬유의 침착을 통해 알츠하이머병 (Alzheimer's disease; "AD")에 대한 원인물질인 것으로 생각된다. 기억 및 기타 인지 기능에 중요한 뇌 영역 내에서 이러한 플라크의 형성은 상기 질병과 관련된 치매를 유발하는 것으로 생각된다[문헌 참조: Selkoe, 1994, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:438-447]. β-아밀로이드 펩타이드는 각각 아미노 말단 및 카복실 말단에서 β-세크레타제 및 γ-세크레타제 둘다에 의해 아밀로이드 전구체 단백질 (amyloid precursor protein; APP)로부터 단백질 가수분해 처리된 39 내지 43개의 아미노산 길이의 펩타이드 그룹을 포함한다. 이들은 각각 563, 695, 714, 751 및 770개의 아미노산 길이인 APP의 5개 이상의 뚜렷한 이소형태이다[문헌 참조: Wirak et al., 1991 Science 253:323]. 이러한 APP의 이소형태는 APP 유전자의 1차 전사체의 선택적 스플라이싱에 의해 발생한다. 다수의 미스센스 돌연변이는 상염색체 우성 조기 발생 알츠하이머병을 갖는 가족의 APP에서 확인되었다. 상기 세크레타제 근처의 일부 돌연변이군은 부위를 절단하여 Aβ 형태 (예를 들어, Aβ42)의 생산 또는 비율을 증가시킴으로써 APP 대사에 영향을 미치는데, 이러한 Aβ 형태는 다른 형태보다 더욱 많이 원섬유를 형성하고 더욱 빨리 응집하는 경향이 있다. 신경세포 독성은 가용성 Aβ 펩타이드를 불용성 원섬유로 응집시키고, 후속적으로 원섬유를 아밀로이드 플라크로 혼입시킴으로써 형성된 고분자량 원섬유에 존재할 수 있다. 중간체 원섬유 형태는 시험관내에서 가용성이고 약 670kDa 단위로서 분리될 수 있는 Aβ 펩타이드의 원섬유 (protofibril; PF) 형태인 고분자량 올리고머 형태이다. 따라서, 불용성 Aβ 펩타이드 원섬유의 시험관내 형성은 구조적으로 뚜렷한 가용성 고분자량 원섬유 형태를 형성하는 Aβ 펩타이드의 초기 올리고머화의 최종 결과이다. 이러한 일시적 원섬유 구조는 알츠하이머병 (AD) 및 기타 단백질 응집 질병에서 세포 기능장애 및 신경세포 손실의 원인이 되는 상기 아밀로이드 섬유에 대한 전구체이다.
Aβ 펩타이드의 형성을 예방하는 시도에서 각종 치료제, 예를 들어, APP의 단백질 가수분해 과정을 예방하는 억제제가 제공되었다. 또한, (아밀로이드 침착물의 제거를 유도하는) 항 Aβ 항체의 투여 또는 (체액성 반응을 촉진하는) Aβ 펩타이드 항원에 의한 면역화와 같은 면역요법 전략은 플라크 크기 및 밀도를 감소시키는 시도에서 요청되었다.
란펠트 등 (Lannfelt et al.)의 미국 특허 제7,179,463호에는 Aβ 펩타이드 암호화 영역 내의 극지 (Arctic) 돌연변이로 이루어진 원섬유에 대하여 증가된 항체를 투여함으로써 알츠하이머병을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 증가된 항체의 예시는 상기 명세서에 존재하지 않으며, 저분자량 형태의 Aβ 펩타이드에 대한 친화도에 관한 비교도 존재하지 않는다.
쉥크 등 (Schenk et al.)의 미국 특허 제6,761,888호 및 제6,750,324호에는 Aβ42의 아미노산 서열에 따른 각종 에피토프를 인식하는 일련의 항체가 개시되어 있다. Aβ42의 N 말단 및 중간 영역에 대해 특이적인 항체는 생체외 및 생체내 둘다에서 플라크를 감소시키는 효능을 나타냈다.
알츠하이머병 치료 및 예방 분야에서 현재의 지식에도 불구하고, 이러한 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 저분자량 형태의 Aβ 펩타이드에 대한 검출가능한 친화도가 최소이고 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드에 특이적인 항체를 개시함으로써 이러한 요구를 다루고 충족시킨다. 이러한 항체 또는 항체들을 포함하는 약제학적으로 효과적인 조성물은 알츠하이머병의 발생 및 진행과 관련된 것으로 공지된 β-아밀로이드 플라크 침착을 치료 및/또는 예방하는데 유용하다.
본 발명의 요약
본 발명은 원섬유 형태의 β-아밀로이드 펩타이드의 입체형태 에피토프와 특이적으로 결합하는 분리된 항체에 관한 것이다. 야생형 β-아밀로이드 (Aβ) 펩타이드의 단량체는 당업계에 공지되어 있으며, 본원에서 서열번호 1로서 나타낸다. 본 발명의 분리된 항체는 다른 형태의 Aβ 펩타이드, 예를 들어, 단량체 또는 이량체 형태의 Aβ 펩타이드에 대한 친화도가 최소이거나 전혀 없고, 고분자량 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 반복 입체형태 에피토프에 대한 친화도가 있다.
본 발명은 또한 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 입체형태 에피토프에 특이적으로 결합하고 이에 대해 측정가능한 친화도를 나타내는 분리된 항체에 관한 것으로, 상기 원섬유 에피토프는 Aβ 펩타이드의 노출 부분의 아미노 말단 부분을 포함하는 Aβ-원섬유 형태의 노출 영역으로 나타내어진다.
본 발명은 추가로 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 입체형태 에피토프에 특이적으로 결합하고 이에 대해 측정가능한 친화도를 나타내는 분리된 항체에 관한 것으로, 상기 원섬유 에피토프는 Aβ 펩타이드의 노출 부분의 아미노산 1 내지 20 (서열번호 2)을 포함하는 Aβ-원섬유 형태의 노출 영역으로 나타내어진다.
본 발명은 또한 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 입체형태 에피토프에 특이적으로 결합하고 이에 대해 측정가능한 친화도를 나타내는 분리된 항체에 관한 것으로, 상기 원섬유 에피토프는 Aβ 펩타이드의 노출 부분의 아미노산 4 내지 12 및 9 내지 20 (각각 서열번호 3 및 4)을 포함하는 Aβ-원섬유 형태의 노출 영역으로 나타내어진다.
본 발명은 부분적으로 모노클로날 항체 13C3, 1D1 및 19A6, 및 임의의 친화도 성숙 형태의 13C3, 1D1 및 19A6에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 13C3, 1D1 및 19A6에 대하여 본원에 개시된 관능 특이성을 모방하는 항체에 관한 것이다. 이 때문에, 본 발명은 또한 돌연변이가 13C3, 1D1, 19A6 또는 13C3 유사 항체 결합 단백질의 유사하거나 개선된 버전을 야기하는 항체 또는 항체 결합 단백질에 대한 기초를 제공하도록 아미노산 치환 (예를 들어, VH 또는 VL 영역의 목적하는 형태의 친화도 성숙으로서), 결실, 부가, 아미노 말단 절단 및 카복시 말단 절단을 포함하지만 반드시 이에 한정되지 않는 13C3, 1D1, 19A6, 13C3 유사, 1D1 유사 또는 19A6 유사 항체의 생물학적 활성 단편 및/또는 돌연변이체에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 부분의 한 양태에서, 13C3의 VH 또는 VL 영역은 각각 서열번호 7 (VH) 및/또는 서열번호 5 (VL)에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 추가로 13C3, 1D1 또는 19A6 항체의 VH 및/또는 VL 영역을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자, 특히 13C3의 생물학적 관련 부분, 또는 13C3, 1D1 또는 19A6 항체의 친화도 성숙 버전 또는 돌연변이 버전을 암호화하는 분리된 핵산 분자 (폴리뉴클레오타이드)에 관한 것이다. 이 때문에, 본 발명의 한 양태는 각각 서열번호 8 (13C3: VH 영역) 및 서열번호 6 (13C3: VL 영역)에 나타낸 13C3의 VH 또는 VL 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 분리된 항체 13C3, 1D1 또는 19A6, 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 입체형태 에피토프에 특이적으로 결합하고 이에 대해 측정가능한 친화도를 나타내는 분리된 항체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마에 관한 것이다. 본 발명의 특정 하이브리도마는 각각 예시된 모노클로날 항체 13C3, 19A6 및 1D1을 생산하는 하이브리도마를 포함한다.
본 발명은 본원에 개시되고 추가로 정의된 분리된 항체, 즉 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 반복 입체형태 에피토프에 특이적으로 결합하고 이에 대한 친화도 및 이와 특이적으로 결합하는 능력은 측정가능하고 저분자량 형태의 Aβ 펩타이드에 대한 친화도가 최소이거나 측정가능하지 않는 항체를 포함하는 약제학적으로 효과적인 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 하나 이상의 담체, 하나 이상의 부형제 및/또는 하나 이상의 화학적 유도체를 임의로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 분리된 항체, 즉 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 반복 입체형태 에피토프에 특이적으로 결합하고 이에 대해 측정가능한 친화도를 나타내며 저분자량 형태의 Aβ 펩타이드에 대한 친화도는 최소이거나 측정가능하지 않는 항체를 포함하는 약제학적으로 효과적인 조성물을 알츠하이머병을 앓고 있는 개체에 투여함을 포함하는, 알츠하이머병을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 알츠하이머병을 앓고 있는 개체의 뇌에서 아밀로이드 침착물의 양을 감소시키기 위한 치료 개입을 제공할 것이다. 본 발명의 이러한 부분의 특정 양태는 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 입체형태 에피토프에 대하여 특이적인 친화도 (적어도 저분자량 형태의 Aβ 펩타이드와 비교하여)를 나타내는 항체와 배합된 약제학적으로 효과적인 조성물을 알츠하이머병을 앓고 있는 개체에 투여함을 포함하는, 알츠하이머병을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 특히 상기 원섬유 에피토프는 Aβ 펩타이드의 노출 부분의 아미노산 1 내지 20 (서열번호 2)을 포함하는 Aβ-원섬유 형태의 노출 영역으로 나타내어진다. 본원에 개시된 이러한 치료 및 예방 방법에 관한 특정 양태는 본원에 검토된 항체 또는 특정 결합 구성원을 포함하나 이에 한정되지 않는 예시된 마우스 모노클로날 항체 13C3, 19A6, 1D1 및 친화도 성숙 버전의 임의의 이러한 항체, 키메라 항체, 사람화된 항체, 사람 모노클로날 항체 및/또는 당업계에 공지된 임의의 다른 이러한 항체를 이용할 수 있다. 임의의 이러한 항체 또는 특정 결합 구성원은 본원에서 "13C3 유사 항체"로서 언급될 수 있다. 따라서, "13C3 유사 항체"는 또한 본원에 개시된 13C3 모노클로날 항체를 포함하는 의미이다.
본 발명은 또한 알츠하이머병과 관련된 원섬유 및/또는 노인성 플라크 형성의 억제제로서 작용할 수 있는 화합물을 스크리닝하고 선택하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 원섬유 및/또는 플라크 형성 과정을 조절하는 화합물을 선택하기 위한 각종 항체/펩타이드/시험 화합물 상호작용 검정법에서 13C3 유사 특징[예를 들어, PF (원섬유) 형태 대 LMW (저분자량) 형태의 Aβ 펩타이드에 대한 특이적인 친화도]을 갖는 항체를 이용함을 포함한다.
본 발명은 추가로 피검체 또는 환자 내의 원섬유 수준을 특이적으로 측정하는 진단 검정 방법에 관한 것이다. 이러한 검정법은 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역측정법, 면역조직화학 검정법, 면역침강법 또는 당업계에 공지된 기타 면역화학 검정법을 포함하나 이에 한정되지 않는, 당업자에게 공지되고 이용가능한 임의의 기술에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명의 이러한 부분의 한 양태는 피검체 또는 환자로부터의 조직 샘플을 채취하고, 진단 키트 및 관련 검정법을 사용하여 상기 샘플에서 PF Aβ 수준을 측정하는 것에 관한 것으로서, 상기 키트는 13C3 유사 항체를 포함하고, 이렇게 하여 상기 조직 샘플에서 PF Aβ 수준을 특이적으로 측정할 수 있게 한다. 검정용 조직 샘플은 통상적으로 피검체 또는 환자로부터의 혈액, 혈장, 혈청, 점액 또는 뇌척수액이다.
이 때문에, 본 발명의 항체는 적어도 다음 용도를 위해 이용될 수 있다: (1) 알츠하이머병과 관련된 플라크 침착물을 예방하거나 감소시키는 예방제 또는 치료제 (단독으로 또는 임의의 이용가능한 병용 요법과 함께); (2) 알츠하이머병의 치료에 관한 예방 백신 또는 치료 백신 전략에서 효과적인 항체 반응을 유도하는데 사용될 수 있는 펩타이드 면역원의 설계; (3) 본 발명의 항체에 결합하는 잠재 에피토프(들)를 모방하는 예방적 또는 치료적 항-개체특이형 항체 (Ab2)의 생산; (4) 예방법 및/또는 치료법에 사용하기 위한 원섬유 형성 억제제를 스크리닝하는데 사용하기 위한 본 발명의 중화 항체의 상보성 결정 영역 (complementarity determining region; CDR)으로부터 유도된 펩타이드의 설계; 및 (5) AD가 발생할 위험이 높은 환자의 혈청 또는 CSF에서 원섬유성 Aβ의 수준을 측정하는 진단 시약.
본 발명의 목적은 Aβ 펩타이드의 노출 부분의 아미노산 1 내지 20 (서열번호 2)을 포함하는 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 노출된 입체형태 에피토프와 특이적으로 상호작용하고 이에 대한 친화도가 있는 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 Aβ 펩타이드의 노출 부분의 아미노산 4 내지 12 및 9 내지 20 (서열번호 3 및 4)을 포함하는 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 노출된 입체형태 에피토프와 상호작용하고 이에 대한 친화도가 있는 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 알츠하이머병과 관련된 플라크의 침착물에 결합하는 Aβ 펩타이드 원섬유 형성을 예방하거나 감소시키는 13C3 유사 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 알츠하이머병과 관련된 플라크 침착을 치료하는데 유용한 화합물을 선택하는 항체/펩타이드/시험 화합물 상호작용 검정법에서 13C3 유사 항체를 이용하는 검정법을 제공하는 것이다.
본원에 사용된 "Ka"란 특정 항체-항원 상호작용의 결합 상수를 의미하는 것으로 의도되고, "Kd"란 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 의미하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"란 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위, 또는 항체가 대항하여 생산되고/되거나 항체가 결합하는 분자 상의 부위를 의미한다. 예를 들어, 에피토프는 에피토프를 규정하는 항체에 의해 인식될 수 있다. 에피토프는 "선형 에피토프" (일차 아미노산 일차 서열은 에피토프, 통상적으로 3개 이상의 인접 아미노산 잔기, 더욱 일반적으로 5개 이상 및 약 8 내지 약 10개 이하의 유일 서열 아미노산을 포함한다) 또는 "입체형태 에피토프" (일차 인접 아미노산 서열이 에피토프의 유일 규정 성분이 아닌 에피토프)일 수 있다. 입체형태 에피토프는 이러한 입체형태 에피토프가 펩타이드 또는 단백질의 3차 구조를 인식하기 때문에 선형 에피토프에 비하여 증가된 다수의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 분자가 3차 구조를 형성하기 위해 접히는 경우, 입체형태 에피토프를 형성하는 특정 아미노산 및/또는 폴리펩타이드 골격은 항체가 에피토프를 인식할 수 있도록 병렬한다. 에피토프의 입체형태를 측정하는 방법은, 예를 들어, X선 결정법, 2차원 핵자기 공명 분광법 및 부위 지정 회전 표지법 및 전자 상자성 공명 분광법을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다[문헌 참조: Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996); 개시 내용은 본원에 참조로 전부 인용된다].
본원에 사용된 2개의 실체 사이에서 "특이적 결합"이란 적어도 106M-1, 107M-1, 108M-1, 109M-1 또는 1010M-1의 친화도를 의미한다.
본원에 사용된 "원섬유"란 곡선 구조를 형성하는 일련의 구형 구조를 나타내는 것으로 보이는 Aβ 펩타이드를 포함하는 구형 구조를 함유하는 원섬유성 응집물이다.
본원에 사용된 용어 "분리된"은 당업계에서 사용되는 바와 같이 본원에 사용된다. 즉, 항체/특이적인 결합 구성원, 핵산 분자 등이 발견되는 상태를 의미한다. 항체/특이적인 결합 구성원 및 핵산 분자는 이들이 자연적으로 결합하는 물질, 예를 들어, 이들이 자연 환경, 또는 재조합 DNA 기술 (시험관내에서 또는 생체내에서 실시함)에 의해 제조되는 경우 이들의 제조 환경 (예를 들어, 세포 배양)에서 발견되는 다른 폴리펩타이드 또는 핵산이 없거나 실질적으로 없다. "분리된"이란 이러한 초기 환경으로부터 제거한 본 발명의 확인 및 특징 성분(들)을 함유하는 임의의 형태를 포함한다. 예로는 약제학적 제형, 희석제 함유 제형, 시험관내에서 또는 생체내에서 변형된 (예를 들어, 항체 글리코실화) 항체/특이적인 결합 구성원, 핵산 분자 및 이들의 일부가 포함되나, 이에 반드시 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "재조합 사람 항체"란 당업계에 널리 공지된 재조합 DNA 기술 및 비-사람 유전자 삽입의 각종 수단에 의해 생산된 생존 가능 서브세트의 "항체"를 의미한다. 이러한 방법은 다음 기원 중의 하나로부터 유래한 항체를 생산하는데 이용된다: (1) 조합 사람 항체 라이브러리로부터 분리된 scFv 또는 대체 항체, (2) 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염된 (예를 들어, 각각의 CH 및 CL 뉴클레오타이드 서열과 함께 발현 벡터에 VH 및 VL을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 서브클로닝하여, PF 형태의 Aβ에 대하여 특이적인 소정 형태의 항체의 발현을 촉진하는) 각각의 발현 벡터로부터 생산된 부분 또는 완전 항체, 및/또는 (3) 사람 면역글로불린 유전자를 함유하는 비-사람 형질전환 동물로부터 분리된 항체, 또는 사람 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 재조합 "혼합 및 매치 (mixing and matching)"하여 목적하는 사람 재조합 항체를 생산하는 임의의 다른 공지된 방법에 의한 항체.
용어 "피검체" 또는 "환자"란 사람을 제외한 영장류, 예를 들어, 침팬지 및 기타 유인원 및 원숭이 종을 포함하여 사람 및 다른 영장류를 포함하나 이에 한정되지 않는 척삭동물 문의 임의의 구성원; 가축, 예를 들어, 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 애완용 포유동물, 예를 들어, 개 및 고양이; 설치류, 예를 들어, 마우스, 래트 및 기니아 피그를 포함하는 실험실 동물; 가금류, 야생 조류 및 수렵조, 예를 들어, 닭, 칠면조 및 다른 순계류 (gallinaceous bird), 오리, 거위 등을 포함한 조류를 포함하는 의미이다.
용어 질병의 "치료하는" 또는 "치료"란 질병의 징후 또는 증상을 완화시키려는 노력으로 하나 이상의 약물을 피검체 (사람 또는 기타)에 투여함을 포함할 수 있는 프로토콜을 실행함을 의미한다. 완화는 질병의 징후 또는 증상이 나타나기 전에 뿐만 아니라 나타난 후에도 일어날 수 있다. 따라서, "치료하는" 또는 "치료"는 질병의 "예방하는" 또는 "예방"을 포함한다. 알츠하이머병의 경우, "예방하는" 또는 "예방"은 또한 알츠하이머병과 관련된 증상의 발생을 예방하거나 지연시키기 위해 치료 과정을 진행시킨 상황에서도 일어난다. 추가로, "치료하는" 또는 "치료"는 징후 또는 증상의 완전한 완화를 요하지 않으며, 치유를 요하지 않으며, 구체적으로 피검체에 단지 미미하게 긍정적인 영향을 미치는 프로토콜을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "활성 성분"이란 원섬유 구조의 β-아밀로이드의 아미노 말단 부분에 대한 친화도 및 특이성 (예를 들어, 특이적인 결합)을 나타내는 13C3 유사 항체를 의미한다.
본원에 사용된 용어 항체의 "유효량" 또는 "약제학적 유효량"이란 본원에 제시된 바와 같이 목적하는 생물학적 결과를 제공하기 위한 활성 성분의 무독성이지만 충분한 양을 의미한다. 임의의 각각의 경우에서 적당한 "유효량"은 통상적인 실험을 사용하여 당업계의 통상적인 기술 중 하나에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는" 또는 "약리학적으로 허용되는"이란 임의의 바람직하지 못한 생물학적 효과를 일으키지 않거나 함유되는 조성물 (예를 들어, "약제학적으로 허용되는 조성물") 중의 임의의 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 제형화된 생물학적 제제와 함께 약물 전달 장치로 개체에 투여될 수 있는 물질을 의미한다.
본원에 사용된 상호교환적으로 사용될 수 있는 표현 "약리학적으로 허용되는 담체" 및 "약제학적으로 허용되는 담체"란 유기체에 대하여 자극을 현저하게 일으키지 않고, 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 소멸시키지 않는 담체, 희석제 및 부형제를 의미한다. 보조제는 이러한 표현 하에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "부형제"란 활성 성분의 투여를 더욱 용이하게 하기 위해 약제학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 의미한다.
원섬유성 형태의 Aβ 펩타이드에 대한 항체의 친화도를 다른 형태, 예를 들어, 원섬유, 시트 구조 및 저분자량 올리고머 및 단량체의 Aβ 펩타이드에 대한 항체의 친화도와 비교하여 사용된 용어 "최소의 친화도"란, 다른 형태의 Aβ 펩타이드에 대한 친화도에 대한 원섬유성 형태의 Aβ 펩타이드에 대한 친화도의 비율이 약 2 초과임을 의미한다. 바람직하게는, 비율은 약 3 초과, 약 4 초과 또는 약 5 초과이다.
도 1은 원섬유 올리고머의 형성을 포함한 Aβ 원섬유 형성의 과정을 나타낸다.
도 2A 및 2B는, 용출 용적에 대하여 mAU215에서의 흡광도 (215nm에서의 흡광도)로 표시된 바와 같이, 0시간 (A) 및 4시간 (B)에서 Aβ 원섬유 형성 및 Aβ 형태의 정제 과정을 나타낸다. 4시간 (B)에서, 저분자량 (LMW) 형태는 약 15kDa 이량체로서 용출되며, 원섬유 형태 크기는 약 670kDa에서 용출된다.
도 3A 및 3B는, 원섬유 (PF: -◆-) 및 저분자량 (LMW: -■-) 형태의 Aβ 모두의 증가 농도에 대하여 450/650nm에서 판독된 광학 밀도 (OD)로 표시된 바와 같이, PF 및 LMW 형태의 Aβ에 대한 모노클로날 항체 13C3 (A) 및 4G8 (B)의 특이성을 나타낸다.
도 4A 내지 4C는 0.25 내지 4.0 μg/ml LMW Aβ인 저분자량 (LMW) 형태의 Aβ의 변하는 농도에 대한 모노클로날 항체 4G8 (A), 13C3 (B) 및 대조군 IgG1 (C)의 친화도를 나타내는 바이아코아 (Biacore®) 결합 검정법으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 5A 및 5B는 상기 기재된 항 Aβ 항체에 의해 인식된 에피토프를 확인하는 데이터를 나타낸다. 도 5A는 실시예 5에서 기재된 바와 같이 중첩하는 13개의 아미노산 펩타이드 시리즈에 대한 모노클로날 항체 13C3 (상부 패널), 1D1 (중간 패널) 및 4G8 (하부 패널)에 따른 웨스턴 도트 블롯 분석을 도시한다. 도 5B는 Aβ1-42의 아미노산 서열 (서열번호 1) 뿐만 아니라 모노클로날 항체 13C3 및 1D1의 예상 에피토프를 도시한다.
도 6은 Aβ 올리고머를 분비하는 7PA2 상청액으로부터의 SEC 분획에 따른 모노클로날 항체 13C3 (-■-) 및 4G8 (-◆-)의 반응성을 나타낸다. 450/650에서 판독된 광학 밀도 (OD)로 측정된 원섬유 (PF) 및 저분자량 (LMW) 분획은 x축 상에 표시된다.
도 7A 내지 7C는 Aβ 원섬유 (B 및 C) 상의 반복 구조에 대한 모노클로날 항체 13C3의 친화도를 나타내는 절편 면역 전자현미경 사진을 나타낸다. 대조군 면역 전자현미경 사진은 IgG1 (A)이다.
도 8A 및 8B는 13C3 모노클로날 항체 (B)의 투여와 비교하여 대조군 IgG1 항체 (A)의 투여 후 대표적인 TgCRND8 형질전환 마우스에서 플라크 수의 감소를 나타낸다.
도 9A 및 9B는 주당 1회 요법 (A) 또는 주당 2회 요법 (B)으로 13C3 모노클로날 항체에 의한 TgCRND8 형질전환 마우스의 치료가 노인성 플라크 형성을 감소시킴을 나타낸다.
도 10은 mAb 13C3에 대한 클로닝된 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 11은 APP 형질전환 마우스에서 13C3의 급성 말초 투여가 기준 항체 3D6 투여와 달리 혈장 Aβ의 증가를 유발하지 않음을 나타낸다.
도 12는 13C3이 AD 뇌에서 (응집된) 사람 아밀로이드 신경반을 인식하지만 기준 3D6 항 Aβ 항체와 달리 분산된 Aβ 침착물을 인식하지 못함을 나타낸다.
아밀로이드 전구체 단백질 (APP)은 알츠하이머병 (AD)의 발병에 중요한 역할을 한다. β-세크레타제 및 γ-세크레타제에 의한 APP의 단백질 가수분해 처리는 통상적으로 39 내지 43개의 아미노산 길이의 범위인 Aβ 펩타이드 (Aβ)를 생산한다. 알츠하이머병의 발병은 뇌에서 올리고머 또는 응집 형태의 Aβ의 축적을 특징으로 한다. 본 발명의 면역학적 조성물은 알츠하이머병의 치료 또는 예방, 진단 검정법에서 시약으로서의 사용 및 아밀로이드 침착의 소분자 억제제 설계에 유용하다. 본 발명의 13C3 유사 항체는 알츠하이머병의 발병을 제거, 감소 또는 지연시키기에 충분한 양 및/또는 투여 요법으로, 목적하는 약제학적으로 허용되는 제형으로 포유동물, 특히 사람의 일반적인 집단에 예방적으로 투여될 수 있다. 예방적 방법은 알츠하이머병의 유전성 또는 가족성 위험이 있는 것으로 공지된 개체에 보장된다. 알츠하이머병에 대한 위험의 다수의 유전적 마커는 확인되었으며, 이는 몇 가지 열거하자면 APP 돌연변이, 예를 들어, 인도 돌연변이 (Val717Phe), 스웨덴 돌연변이 (Lys670Asn, Met671Leu), 헨드릭스 돌연변이 (Ala692Gly), 네덜란드 돌연변이 (Glu693Gln), 이란 돌연변이 (Thr714Ala), 독일 돌연변이 (Val715Ala) 및 플로리다 돌연변이 (Ile716Val)가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 알츠하이머병의 위험 증가를 나타낼 수 있는 추가의 돌연변이는 프리세닐린 유전자 (PS1 및 PS2) 및 ApoE4에서의 돌연변이를 포함한다. 본 발명은 또한 알츠하이머병 증상 및 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로, 특징적인 치매로부터 인식될 수 있는 알츠하이머병을 현재 앓고 있는 개체, 특히 상기 기재된 위험 요인의 존재하에 있거나 이러한 질병을 이미 앓고 있는 개체를 위한 13C3 유사 항체를 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물을 통한 치료 개입에 관한 것이다. 본원에 상정되는 예방 또는 치료에 기초한 방법은 조기 또는 만기 발병 알츠하이머병을 다루는데 사용될 수 있다. 알츠하이머병 발병에서 올리고머 형태의 Aβ의 중요성의 관점에서, 본 발명은 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 반복 입체형태 에피토프와 특이적으로 상호작용하고 이에 대한 친화도가 측정되는 분리된 항체에 관한 것이다. 야생형 Aβ 펩타이드의 단량체 (Aβ42; 42개의 아미노산 형태)는 당업계에 공지되어 있으며, 서열번호 1로서 본원에 나타낸다:
Figure 112010032542089-pct00001
본 발명의 분리된 항체는 고분자량 올리고머성 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 반복 입체형태 에피토프에 대하여 친화도를 나타내면서, 다른 형태의 Aβ 펩타이드, 예를 들어, 저분자량 단량체 및 이량체에 대한 친화도가 최소이다.
본 발명은 또한 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 입체형태 에피토프에 결합하고 이에 대해 측정가능한 친화도를 나타내는 분리된 항체에 관한 것으로, 상기 원섬유 에피토프는 Aβ 펩타이드의 노출 부분의 아미노 말단 부분을 포함하는 Aβ-원섬유 형태의 노출 영역으로 나타내어진다.
본 발명은 추가로 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 입체형태 에피토프에 특이적으로 결합하고 이에 대해 측정가능한 친화도를 나타내는 분리된 항체에 관한 것으로, 상기 원섬유 에피토프는 다음과 같은 Aβ 펩타이드의 노출 부분의 아미노산 1 내지 20 (서열번호 2)을 포함하는 Aβ-원섬유 형태의 노출 영역으로 나타내어진다.
Figure 112010032542089-pct00002
본원에 예시된 바와 같이, 원섬유 (PF) 형태의 Aβ 펩타이드와 특이적으로 상호작용하고 이에 대한 친화도가 특이적이고 저분자량 종의 Aβ 펩타이드에 대한 친화도가 최소인 마우스 모노클로날 항체가 확인되었다. 이량체 형태의 Aβ (약 15kDa)는 시간의 흐름에 따라 중합되어 분자량이 약 670kDa인 가용성 PF 형태의 Aβ를 형성한다. 마우스를 이러한 고분자량 PF Aβ로 면역화시킨다. 고분자량 PF 형태의 Aβ 펩타이드에 대한 특이성이 있고 저분자량 형태의 Aβ와 결합하는 능력이 최소이거나 전혀 없는 모노클로날 항체를 스크리닝한다. 본 발명의 이러한 부분은 약 670kDa인 고분자량 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드에 대하여 형성된 모노클로날 항체의 13C3 시리즈 (즉, 13C3, 1D1 및 19A6)를 스크리닝, 분리 및 특성화함으로써 예시된다. 모노클로날 항체의 이러한 시리즈는 시험관내에서 목적하는 특이성을 나타내며, 또한 형질전환 마우스 알츠하이머병 모델에서 알츠하이머병과 관련된 플라크 형성을 감소시킨다. 따라서, 본 발명의 특정 양태에서, 분리된 항체는 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 입체형태 에피토프에 특이적으로 결합하고 이에 대해 측정가능한 친화도를 나타내며, 상기 원섬유 에피토프는 Aβ 펩타이드의 노출 부분의 아미노산 4 내지 12 (서열번호 3) 및 아미노산 9 내지 20 (서열번호 4)을 포함하는 Aβ-원섬유 형태의 노출 영역으로 나타내어진다:
Figure 112010032542089-pct00003
본 발명의 한 양태는 PF 대 LMW 형태의 Aβ 펩타이드에 대한 13C3 유사 특이성을 부여하기 위해 13C3에 대하여 개시된 바와 같은 VH (서열번호 7) 및/또는 VL (서열번호 5) 영역을 포함하는 항체에 관한 것이다. 추가의 양태는 LMW 형태의 Aβ 펩타이드에 비하여 PF 형태 Aβ 펩타이드에 대한 특이성을 나타내는 13C3 유사 항체 또는 이의 생물학적 관련 단편이다. 따라서, 본 발명은 또한 돌연변이가 13C3, 1D1, 19A6 또는 13C3 유사 항체 결합 단백질의 유사 또는 개선 버전을 유발하는 항체 또는 항체 결합 부분을 위한 기초를 제공하도록 아미노산 치환 (예를 들어, 친화도 성숙 유도 형태의 VH 또는 VL 영역으로서), 결실, 부가, 아미노 말단 절단 및 및 카복시 말단 절단을 포함하나 이에 한정되지 않는 생물학적 활성 단편 및/또는 13C3, 1D1, 19A6 또는 13C3 유사 항체의 돌연변이체에 관한 것이다. 본원에 공지된 바와 같이, 본 발명의 이러한 부분의 한 양태는 각각 서열번호 7 및/또는 서열번호 5에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 이러한 항체의 VH 및/또는 VL 영역에 관한 것이다. 본 발명은 동일한 항체 또는 이의 부분 (예를 들어, 동일한 scFv 또는 IgG의 VH 및/또는 VL 부분을 암호화하는 대체 핵산 분자)을 발현하는 DNA 분자를 다양화할 수 있는 코돈 중복의 존재를 언급한다. 본원의 목적상, 하나 이상의 치환 코돈을 갖는 서열은 축퇴성 변이로서 정의된다. 또 다른 서열 변이원은 RNA 교정을 통해 일어날 수 있다. 이러한 RNA 교정은 또 다른 형태의 코돈 중복을 유발할 수 있으며, 개방 판독 프레임에서의 변화는 발현된 단백질에서 변형 아미노산 잔기를 유발하지 않는다. 발현된 항체의 궁극적인 물리적 특징을 개선하는 DNA 서열 또는 해독된 항체에서의 돌연변이도 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이 때문에, 본 발명은 (1) 13C3, 1D1, 19A6 또는 임의의 다른 이러한 13C3 유사 항체의 친화도 성숙 버전 및/또는 (2) 공지된 친화도 성숙 방법 및 부위 특이적 돌연변이를 도입하기 위해 공지된 재조합 DNA 기술을 통해 생성된 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함하나 이에 한정되지 않는 13C3, 1D1, 19A6 또는 임의의 다른 이러한 13C3 유사 항체의 돌연변이 버전에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 분리된 항체는 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 입체형태 에피토프와 특이적으로 상호작용하는 항체이다. 본 발명의 분리된 항체는 고분자량 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 이러한 입체형태 에피토프에 대한 친화도를 나타내며, 다른 형태의 Aβ 펩타이드, 예를 들어, 원섬유, 시트 구조 및 저분자량 올리고머 및 단량체에 대한 친화도가 최소이다.
본 발명은 또한 분리된 모노클로날 항체 13C3에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 부분은 또한 모노클로날 항체 13C3을 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다. 모노클로날 항체 13C3을 생산하는 하이브리도마는 ATCC 수탁번호 PTA-8830 하에 이용가능하다.
본 발명은 또한 분리된 모노클로날 항체 1D1에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 부분은 또한 모노클로날 항체 1D1을 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다.
본 발명은 또한 분리된 모노클로날 항체 19A6에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 부분은 또한 모노클로날 항체 19A6을 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다.
본 발명은 또한 알츠하이머병과 관련된 원섬유 및/또는 노인성 플라크 형성의 억제제로서 작용할 수 있는 화합물을 스크리닝하고 선택하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 원섬유 및/또는 플라크 형성 과정을 조절하는 화합물을 선택하기 위한 각종 항체/펩타이드/시험 화합물 상호작용 검정법에서 PF 형태의 Aβ 펩타이드에 대한 13C3 유사 친화도를 갖는 항체를 이용함을 포함한다. 상기 화합물은 비단백질성 유기 또는 무기 분자, 펩타이드 (예를 들어, 잠재적 예방 또는 치료 펩타이드 백신으로서), 단백질, DNA (일본쇄 또는 이본쇄) 또는 RNA (예를 들어, siRNA 또는 shRNA)일 수 있다. PF 형태의 Aβ 펩타이드와 결합하기 위해 13C3 유사 항체와 효과적으로 경쟁하는 임의의 이러한 펩타이드 또는 소분자가 알츠하이머병의 예방 또는 치료에 관하여 가능한 유도 화합물을 나타냄은 본원의 개시내용 및 교시내용을 검토하면 입증된다. 이 때문에, PF 형태의 Aβ 펩타이드의 13C3 에피토프를 점유하거나 이와 상호작용하는 화합물을 확인하고 항체를 대신하기 위한 상호작용 검정법은 고효율 스크리닝을 위해 사용된다.
알츠하이머병의 예방 또는 치료에 유용한 화합물 (예를 들어, 유기 소분자 또는 후보 펩타이드 백신)을 스크리닝하는데 있어서 필수 시약으로서 본 발명의 13C3 유사 항체를 포함하고 이에 의존하는 당업계에 공지된 각종 항체/항원 기반 검정법이 사용될 수 있으며, 이는 ELISA 검정법, 방사선면역 측정법, 웨스턴 블롯 분석법, 분리 또는 세척 단계를 필요로 하지 않고 검출가능한 생물학적 상호작용에 의존하는 임의의 균질 검정법[예를 들어, 퍼킨엘머 (PerkinElmer)사제 알파스크린 (AlphaScreen) 참조] 및/또는 SPR 기반 기술 (예를 들어, 바이아코아 참조)을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 13C3 유사 항체의 사용을 통해 확인된 화합물 및/또는 펩타이드 백신 후보는 각종 검정법에 의해 검출될 수 있다. 상기 검정법은 공지된 항체/항원 복합체를 형성하는 능력의 변화가 존재하는지를 측정하는 간단한 "예/아니오" 검정법일 수 있거나 ELISA 기반 검정법, 균질 검정법 또는 SPR 기반 검정법과 같은 검정법을 이용함으로써 사실상 정량적으로 이루어질 수 있다. 이 때문에, 본 발명은 사용되는 공지된 방법에 관계없이 PF 형태의 Aβ 펩타이드의 13C3 에피토프의 아미노 말단 부분의 적절한 펩타이드 또는 단백질 모방체에 대하여 13C3 유사 항체와 경쟁하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 임의의 이러한 검정법에 관한 것이다.
본원에 기재된 항체는 조직 샘플에서 Aβ 원섬유 형태의 존재를 측정하는 다수의 상이한 면역측정법에서 기본 시약으로서 사용될 수 있다. 일반적으로 말하자면, 항체는 임의의 유형의 면역측정법에서 질적으로 또는 양적으로 사용될 수 있다. 이는 비경쟁적 유형의 2 부위 샌드위치 검정법과 단일 부위 면역측정법 모두뿐만 아니라, 통상적인 경쟁적 결합 검정법을 포함한다. 검출 용이성 및 양적 성질에 대한 관심 대상의 한 양태는 샌드위치 또는 이중 항체 검정법이며, 이의 다수의 변형이 존재하며, 이의 모두가 본 발명의 이러한 부분에 의해 포함된다. 예를 들어, 통상적인 상기 샌드위치 검정법에서, 미표지 항체는 고체 기질, 예를 들어, 미세역가 플레이트 웰 상에 고정되고, 시험 샘플은 결합 분자와 접촉하게 된다. 항체-항원 2원 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 적합한 항온처리 시간 후, 이어서 검출가능한 신호를 유도할 수 있는 리포터 분자로 표지된 2차 항체를 첨가하고, 상이한 부위에서 항원과 결합하고 항체-항원 표지된 항체의 3원 복합체를 형성하기에 충분한 시간을 허용하는 항온처리를 계속한다. 임의의 미반응 물질을 세척 제거하고, 항원의 공지된 양을 함유하는 대조군 샘플과 비교하여 정량화될 수 있는 신호의 관찰에 의해 항원의 존재를 측정한다. 상기 샌드위치 검정법에 대한 변형은 샘플과 항체 모두를 결합 항체에 동시에 첨가하는 동시 검정법, 또는 표지 항체 및 시험 샘플을 먼저 배합하고 항온처리하고 미표지된 표면 결합 항체에 첨가하는 역 샌드위치 검정법을 포함한다. 이러한 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 약간의 변형 가능성은 용이하게 명백하다. 본원에 사용된 "샌드위치 검정법"은 기본적인 2 부위 기술에 대한 모든 변형을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 샌드위치 검정법의 경우, 유일한 제한 요인은 두 항체가 Aβ 원섬유 형태에 대한 상이한 결합 특이성을 갖는다는 것이다. 따라서, 다수의 가능한 조합이 가능하다. 더욱 특정한 예로서, 통상적인 상기 샌드위치 검정법에서, 1차 항체는 고체 지지체에 공유결합되거나 수동적으로 결합된다. 고체 표면은 일반적으로 유리 또는 중합체이고, 가장 흔하게 사용되는 중합체는 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐클로라이드 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 관, 비이드, 디스크 또는 마이크로플레이트, 또는 면역측정법을 수행하는데 적합한 임의의 다른 표면의 형태일 수 있다. 결합 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 결합한 후, 고체상-항체 복합체는 시험 샘플의 준비를 위해 세척한다. 이어서, 시험 대상의 Aβ 원섬유 형태를 함유하는 체액의 분취량을 고체상 복합체에 첨가하고, 임의의 Aβ 원섬유 형태 단백질이 Aβ 원섬유 형태에 대한 특이적인 항체와 결합하기에 충분한 시간 동안 25℃에서 항온처리한다. 이어서, 2차 항체를 고체상 복합체에 첨가하고, 2차 항체가 1차 항체-항원 고체상 복합체와 결합하기에 충분한 추가의 시간 동안 25℃에서 항온처리한다. 2차 항체는 샘플 중의 임의의 항원에 대한 2차 항체의 결합을 표시하기 위해 사용되는 가시 신호인 리포터 분자에 연결된다. 본원에 사용된 "리포터 분자"란 화학적 성질에 의해 항원 결합 항체를 검출하도록 분석적으로 검출가능한 신호를 제공하는 분자를 의미한다. 검출은 샘플 중의 항체의 양을 측정하기 위해 적어도 상대적으로 정량화할 수 있어야 하며, 이는 절대항으로 산출될 수 있거나 공지된 통상 수준의 항원을 함유하는 표준물질 (또는 표준물질 시리즈)과 비교하여 수행될 수 있다.
이러한 유형의 검정법에서 가장 흔하게 사용되는 리포터 분자는 효소 또는 형광단이다. 효소 면역측정법의 경우, 효소는 종종 글루타르알데하이드 또는 과옥소산염에 의해 2차 항체에 결합한다. 그러나, 용이하게 인식되는 바와 같이, 다양한 상이한 결합 기술이 존재하며, 이는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 흔하게 사용되는 효소는 그 중에서도 서양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코오스 옥시다제, β-갈락토시다제 및 알칼리성 포스파타제를 포함한다. 특이적 효소와 사용되는 기질은 일반적으로 상응하는 효소에 의한 가수분해에 따라 검출가능한 색 변화를 생성하기 위해 선택된다. 예를 들어, p-니트로페닐 포스페이트는 알칼리성 포스파타제 결합물로 사용하기에 적합하고; 퍼옥시다제 결합물의 경우, 1,2-페닐렌디아민 또는 톨루이딘이 흔하게 사용된다. 상기 발색성 기질보다 오히려 형광 생성물을 제공하는 형광성 기질을 사용하는 것도 가능하다. 모든 경우에서, 효소 표지된 항체를 항체-Aβ 원섬유 단백질 복합체에 먼저 첨가하여 복합체에 결합시킨 후, 과량의 시약을 세척 제거한다. 이어서, 적합한 기질을 함유하는 용액을 항체-항원 표지된 항체의 3차 복합체에 첨가한다. 질적 가시 신호를 제공하는 기질은 2차 항체와 결합된 효소와 반응하며, 이는 혈청 샘플에 존재하는 항원의 양을 평가하기 위해 일반적으로 분광광도법으로 추가로 정량화될 수 있다.
추가적으로, 형광 화합물, 예를 들어, 플루오레세인 또는 로다민은 결합 용량을 변화시키기 않고 항체에 화학적으로 결합할 수 있다. 특정 파장의 광을 갖는 조명에 의해 활성화되는 경우, 형광 색소 표지된 항체는 분자 내에서 여기 상태를 유도한 후 특징적인 장파장에서 광의 방출을 유도하는 광 에너지를 흡수한다. 방출은 광 현미경으로 육안 검출가능한 특징적인 색으로 나타난다. 효소 면역측정법 (enzyme immunoassay; EIA)에서와 같이, 형광 표지된 항체는 1차 항체-Aβ 원섬유 형태 단백질 복합체와 결합한다. 비결합 시약을 세척한 후, 잔류하는 3원 복합체를 적합한 파장의 광에 노출시켜 형광이 관찰되면 항원의 존재를 나타낸다. 면역형광 및 EIA 기술은 모두 당업계에 널리 확립되어 있으며, 본 발명에 특히 바람직하다. 그러나, 다른 리포터 분자, 예를 들어, 방사성 동위원소, 화학 발광성 또는 생체 발광성 분자도 또한 사용될 수 있다. 필요한 용도에 적합하도록 절차를 변화시키는 방법은 당업자에게 용이하게 자명하다.
또 다른 양태에서, 시험 샘플 (예를 들어, Aβ 원섬유 형태를 함유하는 사람 혈액 또는 척수액)은 공유결합 또는 비공유결합으로 고체 기질과 부착되는 단일 부위 면역측정법에서 사용될 수 있다. 비표지된 항 Aβ 원섬유 단백질 항체는 고체 기질 상에 결합된 샘플과 접촉시킨다. 항체-항원 2원 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 적합한 항온처리 시간 후, 이어서 검출가능한 신호를 유도할 수 있는 리포터 분자로 표지된 2차 항체를 첨가하고, 항체-항원 표지된 항체의 3원 복합체를 형성하기에 충분한 시간을 허용하는 항온처리를 계속한다. 단일 부위 면역측정법의 경우, 2차 항체는 관심 대상의 Aβ 원섬유 단백질 형태에 특이적인 항체와 결합할 수 있는 일반적인 항체 (즉, 면역글로불린에 대한 이종 항체, 특히 리포터 분자에 결합된 항- (IgM 및 IgG))일 수 있다.
13C3 유사 항체는 당업계에 공지된 다수의 형태 중의 하나를 가질 수 있다. 항체는 임의의 유형의 관련 항체 단편, 항체 결합 부분, 특이적 결합 구성원, 비단백질 합성 모방체, 또는 결합 특이성/중화 활성을 적어도 실질적으로 유지하는 실체를 의미하는 당업계에 공지된 임의의 다른 관련 전문용어의 형태를 가질 수 있다. 따라서, 본원에서 임의의 문맥에 사용된 용어 "항체"란 임의의 특이적 결합 구성원, 면역글로불린 부류 및/또는 이소타입 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD, IgE 및 IgM); 및 Fab, F(ab')2, Fv 및 scFv(단일 쇄 또는 관련 실체)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 생물학적 관련 단편 또는 이의 특이적 결합 구성원을 포함하지만 이에 한정되지 않음을 의미한다. 따라서, "항체"가 이황화 결합에 의해 상호연결된 2개 이상의 중쇄 (H) 및 2개 이상의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질, 또는 이의 항원 결합 부분을 의미함은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 단지 검토로서 포함된다. 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)으로 이루어진다. 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 이루어진다. 중쇄와 경쇄 모두의 가변 영역은 골격 영역 (framework region; FWR) 및 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 4개의 FWR 영역은 비교적 전환 (converse)되는 반면, CDR 영역 (CDR1, CDR2 및 CDR3)은 과가변 영역을 나타내며 NH2 말단으로부터 COOH 말단까지 배열된다: FWR1, CDR1, FWR2, CDR2, FWR3, CDR3 및 FWR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유하는 반면, 불변 영역(들)은 이소타입에 따라 숙주 조직 또는 요인에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 그렇긴 하지만, 키메라 항체, 사람화된 항체 및 재조합 항체가 또한 비-사람 형질전환 동물로부터 생산된 사람 항체뿐만 아니라 당업자에게 이용가능한 다수의 기술을 사용하여 라이브러리로부터 선택된 항체로서 "항체"의 작동 정의에 포함된다. 항체 단편은 하기에 검토된 바와 같이 당업자에게 용이하게 공지되고 이용가능한 기술을 사용하여 수득된다. 따라서, "항체"는 본원에 기재된 바와 같이 원섬유 형태의 Aβ의 입체형태 에피토프와 특이적으로 결합하는 임의의 이러한 실체 또는 특이적 결합 구성원이다. 따라서, 용어 "항체"는 자연적으로 생산되거나 부분 또는 전체 합성으로 생산되는 면역글로불린; 항체 결합 도메인과 동종이거나 실질적으로 동종인 결합 도메인을 갖는 임의의 폴리펩타이드 또는 단백질을 서술한다. 이들은 천연 공급원으로부터 유도될 수 있거나, 이들은 부분 또는 전체 합성으로 생산될 수 있다. 항체의 예는 면역글로불린 이소타입 및 이의 이소타입의 하위부류; 하기에 제한 없이 논의된 바와 같이 항원 결합 도메인, 예를 들어, Fab, scFv, Fv, dAb, Fd 및 디아바디(diabody)를 포함하는 단편이다. 모노클로날 및 다른 항체를 조작하고, 재조합 DNA 기술의 기법을 사용하여 본래 항체의 특이성을 보유하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 생산할 수 있음은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 기법은 불변 영역에 대한 항체의 면역글로불린 가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR), 또는 다른 면역글로불린의 불변 영역 및 골격 영역을 암호화하는 DNA를 도입하는 것을 진전시킬 수 있다. 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 다른 세포는 생산된 항체의 결합 특이성을 변화시키거나 변화시키지 않을 수 있는 유전자 돌연변이 또는 다른 변화를 겪을 수 있다. 항체는 다수의 방식으로 변형될 수 있고, 용어 "항체"는 필요한 특이성을 갖는 결합 도메인을 갖는 임의의 특이적 결합 구성원 또는 물질을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 이러한 용어는 천연 또는 전부 또는 부분 합성의 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 포함하는 "항체"의 항체 단편, 유도체, 기능성 동등물 및 동족체를 포함한다. 이러한 실체는 (1) VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (2) 경첩 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (3) VH 및 CH 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (4) 항체의 단일 아암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (5) VH 도메인을 포함하는 dAb 단편; (6) 분리된 상보성 결정 영역 (CDR); (7) 'scAb', VH 및 VL 뿐만 아니라 CL 또는 CH를 함유하는 항체 단편; 및 (8) 피브로넥틴 유형 III 폴리펩타이드 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는 단백질 골격에 기초한 인공 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는 항체의 용어 "항원 결합 부분" 또는 "특이적 결합 구성원" 내에 포함되는 결합 단편일 수 있다[문헌 참조: 코이데 (Koide)의 미국 특허 제6,703,199호 (2004년 3월 9일자 발행) 및 국제공개공보 제WO 02/32925호]. 더욱이, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 VL 및 VH 영역이 짝을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄[단일 쇄 Fv (scFv)로서 공지됨]로서 이루어질 수 있게 하는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 분리된 13C3 또는 13C3 유사 항체에 대한 가변 경쇄 (VL) 영역은 339개 염기쌍의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 6)에 의해 암호화되는 113개 아미노산의 펩타이드 서열 (서열번호 5)을 포함할 수 있다:
Figure 112010032542089-pct00004
추가의 양태에서, 본 발명의 분리된 13C3 또는 13C3 유사 항체에 대한 가변 중쇄 (VH) 영역은 345개 염기쌍의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 8)에 의해 암호화되는 115개 아미노산의 펩타이드 서열 (서열번호 7)을 포함할 수 있다:
Figure 112010032542089-pct00005
추가의 양태에서, VL 쇄의 골격 영역, FWR1, FWR2, FWR3 및 FWR4는 각각 다음의 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12에 나타낸 아미노산으로 이루어질 수 있다:
Figure 112010032542089-pct00006
추가의 양태에서, VL 쇄의 상보성 결정 영역, CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 다음의 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15에 나타낸 아미노산으로 이루어질 수 있다:
Figure 112010032542089-pct00007
추가의 양태에서, VH 쇄의 골격 영역, FWR1, FWR2, FWR3 및 FWR4는 각각 다음의 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19에 나타낸 아미노산으로 이루어질 수 있다:
Figure 112010032542089-pct00008
추가의 양태에서, VH 쇄의 상보성 결정 영역, CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 다음의 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22에 나타낸 아미노산으로 이루어질 수 있다:
Figure 112010032542089-pct00009
개시된 치료 방법에서 유용한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체는 공지된 기술에 의해 수득될 수 있다. 선택 표적의 입체형태 에피토프에 대하여 특이성을 나타내는 단일특이적 쥐 (마우스) 항체는 이러한 영역에 대하여 반응성인 항체를 함유하는 포유동물 항혈청으로부터 정제될 수 있거나, 콜러 (Kohler) 및 밀스테인 (Milstein)의 기술[문헌 참조: Nature 256: 495-497, 1975]을 사용하여 모노클로날 항체로서 제조될 수 있다. 본원에 사용되는 단일특이적 항체는 균일 결합 특성을 갖는 단일 항체 종 또는 다중 항체 종, 예를 들어, 모노클로날 항체의 13C3 시리즈로 본원에 예시된 마우스 모노클로날 항체로서 정의된다. 하이브리도마 세포는 안정한 하이브리도마를 형성할 수 있는 조건하에 비장 림프구를 적절한 융합 파트너, 바람직하게는 골수종 세포와 혼합함으로써 제조된다. 비장 항체 생산 세포 및 골수종 세포는 항체 생산을 위해 융합, 선택 및 스크리닝된다. 항체 양성 웰로부터의 하이브리도마 세포는 맥퍼슨 (MacPherson)의 연질 한천 기술[문헌 참조: Soft Agar Techniques, in Tissue Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson, Eds, Academic Press, 1973]과 같은 기술에 의해 클로닝된다. 모노클로날 항체는 각각의 하이브리도마 세포를 본래의 초회감작 마우스에 주입하고, 일정한 시간 간격 후 복수액을 수거하고 당업계에 공지된 기술에 의해 제조함으로써 생체내에서 생산된다.
상기 기재된 종 특이적 모노클로날 항체 외에, 본 발명의 항체는 또한 "키메라 항체", 쥐 공급원으로부터 유도된 가변 영역, 및 의도된 숙주 공급원 (예를 들어, 사람)[문헌 참조: Morrison and Oi, 1989, Advances in Immunology, 44: 65-92]로부터 유도된 불변 영역으로부터 제작된 모노클로날 항체의 형태일 수 있다. 예를 들어, 설치류 (예를 들어, 마우스) 항체로부터의 가변 경쇄 및 중쇄 DNA 서열 (예를 들어, 각각 서열번호 6 및 8)을 포유동물 발현 벡터에 클로닝시킬 수 있다. 이러한 경쇄 및 중쇄 "키메라" 발현 벡터를 수용자 세포주에 공동 형질감염시키고 공지된 기술에 의해 확장시킨다. 이어서, 이러한 세포주를 공지된 세포 배양 기술에 적용시켜 경쇄와 중쇄 모두를 생산할 수 있다. 역사적으로, 이러한 기메라 항체는 원래 설치류 모노클로날의 항원 결합 용량을 가지면서 숙주 투여시 면역원성을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다.
키메라 항체에 대한 논리적 개선은 키메라 또는 완전 쥐 모노클로날 항체의 사용과 비교하여 치료 항체에 대하여 면역 반응을 시작하는 환자의 기회를 거의 틀림없이 감소시키는 "사람화된 항체"이다. 쥐 Mab를 "사람화하는" 전략은 각각의 잔기의 부위 지시된 돌연변이에 의해 또는 전체 상보성 결정 영역의 이식에 의해 사람 항체의 아미노산 잔기와 상이한 아미노산 잔기를 치환하는데 기초한다[문헌 참조: Jones et al., Nature 321: 522-526, 1986]. 이러한 기술은 또한 지금 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이러한 기술에 대하여 개선된 다수의 전략, 즉 "재형성 (reshaping)"[문헌 참조: Verhoeyen, et al., Science 239: 1534-1536, 1988], "과키메라화 (hyperchimerization)"[문헌 참조: Queen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 2869-2873, 1991] 또는 "베니어링 (veneering)"[문헌 참조: Mark, et al., Derivation of Therapeutically Active Humanized and Veneered anti-CD18 Antibodies Metcalf end Dalton, eds . Cellular Adhesion : Molecular Definition to Therapeutic Potential. New York: Plenum Press, 291-312, 1994]을 포함하나 이에 한정되지 않는 시행 전략에 의해 대표된다. 이러한 전략은 설치류에서부터 사람 컨센서스까지의 특이적 아미노산 치환이 적합한지를 결정하기 위해 모두 설치류와 사람 서열 사이의 서열 비교를 어느 정도까지 포함한다. 어떠한 변이일지라도, 사람화된 항체의 생산에 관련된 중심 주제는 CDR 이식에 의존하며, 경쇄와 중쇄 모두로부터의 이러한 3개의 항원 결합 부위는 항체 클론을 발현하는 설치류로부터 효과적으로 제거되고 사람 항체의 골격 영역을 암호화하는 발현 벡터에 서브클로닝된다 (또는 "이식된다"). 예를 들어, 상기 기술을 사용하여, 가변 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 각각 서열번호 13, 14 및 15에 나타내고 가변 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 각각 서열번호 20, 21 및 22에 나타낸 사람화된 항체가 발현될 수 있다. 따라서, "사람화된 항체"는 효과적으로 단지 쥐 CDR (상기 언급된 전략의 하나 이상을 도입함으로써 발생되는 임의의 추가의 개선을 제외함)로 제작된 항체이며, 가변 영역의 나머지 및 불변 영역의 모두는 사람 공급원으로부터 유도된다.
본 발명은 또한 13C3 항체, 또는 13C3, 1D1, 19A6 또는 다른 13C3 유사 항체의 친화도 성숙 버전 또는 돌연변이 버전의 VH 및/또는 VL 영역에 관련된 분리된 핵산 분자 및 관련 아미노산 서열, 더욱 구체적으로 13C3의 생물학적 관련 부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자 (폴리뉴클레오타이드)에 관한 것이다. 이러한 핵산은 실질적으로 다른 핵산이 없다. 대부분의 클로닝 목적의 경우, DNA는 바람직한 핵산이다. 이러한 DNA 분자를 발현 벡터에 서브클로닝한 후, 재조합 숙주 세포가 13C3, 1D1, 19A6 또는 13C3 유사, 1D1 유사 또는 19A6 유사 항체, 또는 이들의 친화도 성숙 버전의 관련 부분의 실질적인 수준을 위해 공급원을 제공하는 선택된 숙주 세포에 형질감염시킬 수 있다. 이러한 절차는 다양한 용도, 예를 들어, scFv 생산 또는, 예를 들어, IgG 항체의 사람 CH 및 CL 영역을 암호화하는 포유동물 발현 벡터 시스템에서 이러한 VH 및 VL 쇄의 공동 발현을 위해 사용될 수 있다. 유전자 암호의 축퇴는 2개의 아미노산을 제외한 모두의 경우 하나 이상의 암호가 특정 아미노산을 암호화하는 것이다. 이는 합성 DNA의 뉴클레오타이드 서열이 본원에 개시된 뉴클레오타이드 서열과 현저하게 상이한 본 발명의 항체를 암호화하지만 여전히 이러한 항체를 암호화하는 합성 DNA의 구성을 허용한다. 이러한 합성 DNA는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 특정 숙주 세포 또는 유기체에서 이러한 합성 DNA를 발현하는 것이 목적이라면, 특정 숙주의 암호 사용을 반영하도록 이러한 합성 DNA의 암호 사용을 조절할 수 있고, 따라서 본 발명의 항체를 고수준으로 발현시킬 수 있다. 환언하자면, 특이적 아미노산을 암호화하는 각종 코돈에서의 이러한 축퇴는 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서, 본 발명은 또한 동일 아미노산의 최종 해독을 암호화하는 대체 코돈을 포함하는 RNA를 암호화하는 이러한 DNA 서열에 관한 것이다: A=Ala=알라닌: 코돈 GCA, GCC, GCG, GCU; C=Cys=시스테인: 코돈 UGC, UGU; D=Asp=아스파르트산: 코돈 GAC, GAU; E=Glu=글루탐산: 코돈 GAA, GAG; F=Phe=페닐알라닌: 코돈 UUC, UUU; G=Gly=글라이신: 코돈 GGA, GGC, GGG, GGU; H=His =히스티딘: 코돈 CAC, CAU; I=Ile =이소류신: 코돈 AUA, AUC; AUU; K=Lys-라이신: 코돈 AAA, AAG; L=Leu=류신: 코돈 UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU; M=Met=메티오닌: 코돈 AUG; N=Asp=아스파라긴: 코돈 GAU, GAC; P=Pro=프롤린: 코돈 CCA, CCC, CCG, CCU; Q=Gln=글루타민: 코돈 CAA, CAG; R=Arg=아르기닌: 코돈 AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU; S=Ser=세린: 코돈 AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU; T=Thr=트레오닌: 코돈 ACA, ACC, ACG, ACU; V=Val=발린: 코돈 GUA, GUC, GUG, GUU; W=Trp=트립토판: 코돈 UGG; Y=Tyr=타이로신: 코돈 UAC, UAU. 이어서, 대체 항체 형태를 생산하기 위해 이러한 재조합 발현 벡터를 적합한 세포주에 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염시킨다.
본 발명은 동일 항체 또는 이의 부분 (예를 들어, IgG의 동일 scFv 또는 VH 및/또는 VL 부분을 암호화하는 대체 핵산 분자)을 암호화하는 DNA 분자를 다양화할 수 있는 코돈 중복의 존재를 언급한다. 본원의 목적상, 하나 이상 치환된 코돈을 갖는 서열은 축퇴성 변이로서 정의한다. 서열 변이의 또 다른 공급원은 RNA 교정을 통해서 일어날 수도 있다. 이러한 RNA 교정은 또 다른 형태의 코돈 중복을 유발할 수 있으며, 개방 판독 프레임에서의 변화는 발현된 단백질에서 변형 아미노산 잔기를 유발하지 않는다. 발현된 항체의 궁극적인 물리적 특징을 개선하는 DNA 서열 또는 해독된 항체에서의 돌연변이도 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이 때문에, 본 발명은 (1) 13C3, 19A6 및 1D1을 포함하나 이에 한정되지 않는 13C3 유사 항체의 친화도 성숙 버전 및/또는 (2) 공지된 친화도 성숙 방법 및 부위 특이적 돌연변이를 도입하기 위해 공지된 재조합 DNA 기술을 통해 생성된 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함하나 이에 한정되지 않는 13C3, 19A6 및/또는 1D1을 포함하나 이에 한정되지 않는 13C3 유사 항체의 돌연변이 버전에 관한 것이다. 이러한 분리 또는 정제된 핵산 분자는 13C3 유사 항체의 VH 및/또는 VL 부분을 나타낸다. 이러한 핵산은 실질적으로 다른 핵산이 없다. 대부분의 클로닝 목적의 경우, DNA가 바람직한 핵산이다. 이러한 DNA 분자를 발현 벡터에 서브클로닝한 후, 재조합 숙주 세포가 13C3 유사 항체 또는 이의 친화도 성숙 버전의 관련 부분의 실질적인 수준을 위해 공급원을 제공하는 선택된 숙주 세포에 형질감염시킬 수 있다. 이러한 절차는 각종 용도, 예를 들어, scFv 생산 또는, 예를 들어, IgG 항체의 사람 CH 및 CL 영역을 암호화하는 포유동물 발현 벡터 시스템에서 이러한 VH 및 VL 쇄의 공동 발현을 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 13C3 유사 항체의 각각 중쇄 및/또는 경쇄 영역을 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 재조합 벡터 및 재조합 원핵 및 진핵 숙주 세포에 관한 것이다. 이러한 핵산 분자는 자연적으로 연결되지 않는 다른 DNA 분자 (즉, 재조합 사람 항체의 생산에 사용되는 면역글로불린을 포함하는 DNA 분자)와 전체 또는 부분적으로 연결되어 각각의 사람 재조합 항체를 암호화하는 "재조합 DNA 분자"를 형성할 수 있다. 이러한 벡터는 DNA 또는 RNA로 이루어질 수 있다. 대부분의 클로닝 목적의 경우, DNA 벡터가 바람직하다. 통상적인 벡터는 플라스미드, 변형 바이러스, 박테리오파지, 코스미드, 효모 인공 염색체, 및 기타 형태의 에피솜 또는 통합 DNA를 포함한다. 특정 유전자 이식, 재조합 사람 항체의 생산 또는 기타 용도를 위한 적절한 벡터를 결정하는 것은 당업자의 범위 내에 있다. 관심 대상의 핵산 분자를 발현 벡터에 서브클로닝시키고, 벡터를 함유하는 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 방법, 및 각각의 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하고 적절한 조건하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 순수 단백질을 실질적으로 제조하는 방법은 널리 공지되어 있다. 이렇게 제조된 항체 (예를 들어, IgG 재조합 사람 항체)를 통상의 방식으로 숙주 세포로부터 수거할 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 적절한 전사 조절 요소를 함유하는 임의의 벡터를 포함하는 임의의 공지된 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 이러한 부분을 실시할 수 있다. 생성된 발현 구성물을 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 이식하여 재조합 단백질을 생산한다. 발현 벡터는 적합한 숙주에서 클로닝 DNA의 전사 및 이의 rnRNA의 해독에 적합한 DNA 서열로서 본원에서 정의된다. 이러한 벡터를 사용하여 진핵 세포 DNA를 각종 숙주, 예를 들어, 세균, 남조류, 식물 세포, 곤충 세포 및 동물 세포에서 발현시킬 수 있다. 특이적으로 설계된 벡터는 세균-효모 또는 세균-동물 세포와 같은 숙주 사이에서 DNA를 셔틀링 (shuttling)시킬 수 있다. 적당하게 제작된 발현 벡터는 숙주 세포에서 자가 복제를 위한 복제 오리진, 선택가능한 마커, 일부 유용한 제한 효소 부위, 높은 복제수를 위한 포텐셜 및 활성 프로모터를 함유해야 한다. 프로모터는 RNA 폴리머라제에 명령을 내려 DNA와 결합하고 RNA 합성을 개시하게 하는 DNA 서열로서 정의한다. 강력한 프로모터는 rnRNA가 높은 빈도로 개시되도록 하는 프로모터이다. 이러한 조작 기술은 문헌[참조: Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기재되어 있으며, 당업자에게 널리 공지되어 있고 이용가능하다. 발현 벡터는 클로닝 벡터, 변형 클로닝 벡터, 특이적으로 설계된 플라스미드 또는 바이러스를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 적합할 수 있는 시판중인 포유동물 발현 벡터는 pcDNA3.neo[인비트로겐 (Invitrogen)], pcDNA3.1 (인비트로겐), pCI-neo[프로메가 (Promega)], pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 및 pLITMUS39[뉴잉글랜드 바이올로앱스 (New England Bioloabs)], pcDNAI, pcDNAIanp (인비트로겐), pcDNA3 (인비트로겐), pMClneo[스트라타젠 (Stratagene)], pXT1 (스트라타젠), pSG5 (스트라타젠), EBO pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) 및 lZD35 (ATCC 37565)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, pCR2.1 (인비트로겐), pET1 la[노바겐 (Novagen)], lambda gtl 1 (인비트로겐) 및 pKK223-3[파마시아 (Pharmacia)]을 포함하나 이에 한정되지 않는 각종 세균 발현 벡터가 이용가능하다. 또한, pYES2 (인비트로겐) 및 Pichie 발현 벡터 (인비트로겐)를 포함하나 이에 한정되지 않는 각종 진균 세포 발현 벡터가 사용될 수 있다. 또한, pBlueBacIII 및 pBlueBacHis2 (인비트로겐), 및 pAcG2T[파미겐 (Pharmingen)]를 포함하나 이에 한정되지 않는 각종 곤충 세포 발현 벡터가 사용될 수 있다.
세균, 예를 들어, 이.콜라이 (E. coli), 진균 세포, 예를 들어, 효모, 동물 세포 (소, 돼지, 원숭이 및 설치류 기원의 세포주가 포함되나, 이에 한정되지는 않음) 및 곤충 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 재조합 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 적합할 수 있는 포유동물 종은 L 세포 L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), L 세포 L-M (ATCC CCL 1.2), Saos-2 (ATCC HTB-85), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171) 및 CPAE (ATCC CCL 209)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
상기에서 검토된 바와 같이, 재조작 항체에 대한 또 다른 개선은 완전한 사람 모노클로날 항체의 생산이다. 첫째는 마우스 항체 유전자가 불활성화되고 결국 기능성 사람 항체 유전자의 레퍼토리로 치환되지만 마우스 면역 시스템의 다른 성분이 변하지 않게 남아 있는 면역 시스템을 갖는 유전자 조작 마우스 세포주의 사용을 포함한다. 이러한 유전자 조작 마우스는 자연적인 생체내 면역 반응 및 높은 친화도의 완전한 사람 모노클로날 항체를 유발하는 친화도 성숙 과정을 허용한다. 이러한 기술은 또는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 미국 특허 제5,939,598호, 제6,075,181호, 제6,114,598호, 제6,150,584호 및 관련 계열 구성원[압제닉스 (Abgenix)에 양도됨, 이종마우스 (XenoMouse) 기술을 개시함]; 및 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,789,650호, 제5,877,397호, 제5,661,016호, 제5,814,318호, 제5,874,299호 및 제5,770,429호[젠팜 인터내셔널 (GenPharm International)에 양도되고, "UltraMab Human Antibody Development System"의 산하의 메다렉스 (Medarex)를 통해 이용가능함]를 포함하나 이에 한정되지 않는 각종 공보 및 문헌[참조: Kellerman and Green, Curr. Opinion in Biotechnology 13: 593-597, 2002]에 완전히 상세하게 기재되어 있다.
마지막으로, 파지 디스플레이, 리보솜 디스플레이[문헌 참조: Hanes and Pluckthun, Proc. Nat. Acad. Sci . 94: 4937-4942, 1997], 세균 디스플레이[문헌 참조: Georgiou, et al., Nature Biotechnology 15: 29-34, 1997] 및/또는 효모 디스플레이[문헌 참조: Kieke, et al., Protein Engineering 10: 1303-1310, 1997]를 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 기술을 사용하여 라이브러리로부터 항체 단편을 선택하는 기술은 당업자에게 이용가능하며, 표적 사이토카인과 특이적으로 결합하는 단일 쇄 항체를 선택하기 위해 이전에 논의된 기술에 대한 대안으로서 사용될 수 있다. 단일 쇄 항체는 필라멘트형 파지 기술을 이용하여 직접 생산된 단일 쇄 항체의 라이브러리로부터 선택된다. 파지 디스플레이 기술은 당업계에 공지되어 있다[문헌 참조: 미국 특허 제5,565,332호, 제5,733,743호, 제5,871,907호, 제5,872,215호, 제5,885,793호, 제5,962,255호, 제6,140,471호, 제6,225,447호, 제6,291650호, 제6,492,160호, 제6,521,404호, 제6,544,731호, 제6,555,313호, 제6,582,915호, 제6,593,081호; 및 다른 미국 패밀리 구성원, 또는 1992년 5월 24일자로 출원된 영국 특허 제9206318호의 우선권을 주장하는 특허원에 개시된 바와 같은 캠브리지 항체 기술 (Cambridge Antibody Technology; CAT)로부터의 기술; 및 Vaughn, et al., Nature Biotechnology 14: 309-314, 1996]. 또한, 단일 쇄 항체는 이용가능한 재조합 DNA 기술, 예를 들어, DNA 증폭 방법 (예를 들어, PCR)을 사용하거나 각각의 하이브리도마 cDNA를 주형으로서 가능한 한 사용하여 설계되고 제작된다. 단일 쇄 항체는 단일 특이성 또는 이중 특이성일 수 있으며, 2가 또는 4가일 수 있다. 하기에 기재된 바와 같이, 단일 쇄 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 수동 또는 자동화 뉴클레오타이드 합성을 사용하여 제작하고, 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 발현 구성물에 클로닝시키고, 세포에 도입하여 암호화 서열을 발현시킨다.
본 발명은 추가로 알츠하이머병과 관련된 원섬유 및/또는 노인성 플라크 형성을 억제하는 예방 또는 치료 선택을 제공하는 유효량의 13C3 유사 항체 또는 친화도 성숙 버전을 포함하는 항체 기반 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체 기반 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 다수의 방법에 의해 제형화될 수 있다[문헌 참조: McGoff and Scher, Solution Formulation of Proteins/Peptides: In McNally, E.J., ed. Protein Formulation and Delivery. New York, NY: Marcel Dekker; pp. 139-158, 2000; Akers and Defilippis, Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Philadelphia, PA: Talyor and Francis; pp. 145-177, 2000; Akers, et al., Pharm. Biotechnol. 14:47-127, 2002]. 환자 투여에 적합한 약제학적으로 허용되는 조성물은 생물학적 활성을 보유하고 허용되는 온도 범위 내에서 저장 동안 안정성을 최대로 높인 제형에 유효량의 항체를 포함한다. 약제학적 조성물은 또한 목적하는 제형에 따라 약제학적으로 허용되는 희석제, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 약제학적으로 허용되는 부형제, 또는 동물 또는 사람 투여를 위해 약제학적 조성물을 제조하는데 흔하게 사용되는 임의의 이러한 비히클을 포함할 수 있다. 희석제는 배합물의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예로는 증류수, 포스페이트 완충 생리 식염수, 링거 용액, 덱스트로오스 용액 및 행크 (Hank) 용액이 있다. 본 발명의 약제학적 조성물 또는 제형에 유용한 부형제의 양은 조성물을 통해 항체를 균일하게 분배하는데 도움을 주어 이를 필요로 하는 피검체에 전달될 때 균일하게 분산될 수 있는 양이다. 이는 목적하는 유용한 완화 또는 치유 결과를 제공하는 농도로 항체를 희석하면서 동시에 매우 고농도로부터 일어날 수 있는 임의의 불리한 부작용을 최소화하는데 도움이 될 수 있다. 이는 또는 보존 효과를 가질 수도 있다. 따라서, 높은 생리 활성을 갖는 항체의 경우, 보다 많은 부형제가 사용될 수 있다. 한편, 낮은 생리 활성을 나타내는 임의의 활성 성분(들)의 경우, 보다 적은 양의 부형제가 사용될 수 있다. 일반적으로, 조성물 중의 부형제의 양은 전체 조성물의 약 50 내지 99.9중량%이다. 항체가 특히 낮은 생리 활성을 나타내는 경우, 부형제의 양은 1중량% 정도로 적을 수 있다. 한편, 특히 높은 생리 활성을 갖는 항체의 경우, 부형제의 양은 약 98.0 내지 약 99.9중량%일 수 있다. 추가로, 항체(들)는 "화학적 유도체" (통상적으로 기본 분자의 일부가 아닌 추가의 화학 잔기를 함유하는 분자)의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 잔기는 생물학적 제제의 용해도, 반감기, 흡수도 등을 향상시킬 수 있다. 또는, 이러한 잔기는 항체의 바람직하지 못한 부작용을 약화시킬 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 크고 느리게 대사되는 거대분자, 예를 들어, 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 공중합체 (예를 들어, 라텍스 관능화된 세파로오스, 아가로오스, 셀룰로오스 등), 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 지질 응집물 (예를 들어, 오일 소적 또는 리포좀)을 포함할 수 있다. 추가로, 이러한 담체는 면역자극제 (즉, 보조제)로서 작용할 수 있다. 비경구 투여의 경우, 본 발명의 제제는 멸균 액체, 예를 들어, 수유 (water oil), 식염수, 글리세롤 또는 에탄올일 수 있는 약제학적 담체와 함께 생리학적으로 허용가능한 희석제 중의 물질의 용액 또는 현탁액으로서 주사가능한 용량으로 투여될 수 있다. 추가로, 보조제 물질, 예를 들어, 습윤제 또는 유화제, 계면활성제, pH 완충 물질 등이 조성물에 존재할 수 있다. 약제학적 조성물의 기타 성분은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 성분, 예를 들어, 땅콩유, 대두유 및 광유일 수 있다. 일반적으로, 글리콜, 예를 들어, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 바람직한 액체 담체, 특히 주사용 용액이다.
항체 제형은 액체 형태 또는 고체 형태일 수 있다. 고체 제형은 일반적으로 동결건조되어 1회 또는 수회 복용으로 투여하기 전에 용액으로 되어야 한다. 제형은 열변성을 방지하기 위해 과도한 온도 또는 pH에 노출되지 않아야 한다. 따라서, 생물학적 관련 pH 범위 내에서 본 발명의 항체 조성물을 제형화하는 것은 필수적이다. 저장 동안 적절한 pH를 유지하기 위해 완충된 용액은 제형과 투여 사이의 장기간 동안 저장되는 액체 제형에 특히 필요하다. 지금까지, 액체 및 고체 제형은 모두 장기간 동안 안정성을 유지하기 위해 저온 (일반적으로 2 내지 8℃)에서 저장할 필요가 있다. 제형화 항체 조성물, 특히 액체 제형은 저장 동안 단백질 가수분해를 방지하거나 최소화하기 위해 정균제[유효 농도 (일반적으로 1%w/v 미만)의 벤질 알콜, 페놀, m-크레졸, 클로로부탄올, 메틸파라벤 및/또는 프로필파라벤이 포함되나, 이에 한정되지 않음]를 함유할 수 있다. 정균제는 일부 환자에 사용금지될 수 있다. 따라서, 동결건조 제형은 이러한 성분을 함유하거나 함유하지 않는 용액으로 재구성될 수 있다. 추가의 성분은 완충된 액체 또는 고체 항체 제형에 첨가될 수 있으며, 이의 예로는 동결방지제로서의 당류 (폴리하이드록시 하이드로카본, 예를 들어, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤 및 둘시톨, 및/또는 이당류, 예를 들어, 수크로오스, 락토오스, 말토오스 또는 트레할로오스가 포함되지만 반드시 이에 한정되지는 않음) 및, 예를 들어, 관련 염 (NaCl, KCl 또는 LiCl이 포함되지만 이에 한정되지는 않음)이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 항체 제형, 특히 장기간 저장 동안 슬레이트된 (slated) 액체 제형은 2 내지 8℃ 또는 그 이상의 온도에서 장기간 안정성을 증대시키기고, 또한 비경구 주사에 유용한 제형을 제조하기 위해 유용한 범위의 전체 오스몰 농도에 의존한다. 유효 범위의 전체 오스몰 농도 (용액 중의 분자의 총 수)는 약 200 내지 약 800 mOs/L이다. 동결방지제, 예를 들어, 수크로오스 또는 소르비톨의 양이 용액의 전체 오스몰 농도를 적절한 범위 내에 유지하도록 하기 위해 제형 중의 염의 양에 의존함은 명백하다. 따라서, 염 무함유 제형은 수크로오스를 약 5 내지 약 25%, 바람직하게는 약 7 내지 약 15%, 특히 바람직하게는 10 내지 12%의 범위로 함유할 수 있다. 또는, 염 무함유 소르비톨계 제형은 소르비톨을 약 3 내지 약 12%, 바람직하게는 약 4 내지 7%, 특히 바람직하게는 약 5 내지 약 6%의 범위로 함유할 수 있다. 염 무함유 제형은 물론 효과적인 오스몰 농도 수준을 유지하기 위해 각각의 동결방지제의 범위 증가를 보장한다. 이러한 제형은 또한 2가 양이온 (MgCl2, CaCl2 및 MnCl2가 포함되지만 반드시 이에 한정되지는 않음), 및 비이온성 계면활성제[폴리소르베이트-80 (트윈 80®), 폴리소르베이트-60 (Tween 60®), 폴리소르베이트-40 (트윈 40®) 및 폴리소르베이트-20 (트윈 20®), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (Brij 58® 및 Brij 35®가 포함되지만 이에 한정되지는 않음) 및 기타 (트리톤 X-100®, 트리톤 X 114®, NP40®, 스판 85 및 비이온성 계면활성제의 플루로닉 시리즈, 예를 들어, 플루로닉 121)가 포함되지만 반드시 이에 한정되지는 않음]를 포함할 수 있다. 정균제의 가능한 함유를 포함하는 이러한 성분의 임의의 배합물은 본 발명의 항체 함유 조성물을 충전하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 항체 조성물은 또한 "화학적 유도체"일 수 있으며, 이는 통상적으로 면역글로불린 분자의 일부가 아닌 추가의 화학 잔기 (예를 들어, 페길화)를 함유하는 항체를 서술한다. 이러한 잔기는 기본 분자의 용해도, 반감기, 흡수도 등을 향상시킬 수 있다. 또는, 이러한 잔기는 기본 분자의 바람직하지 못한 부작용을 약화시키거나 기본 분자의 독성을 감소시킬 수 있다.
각종 담체, 희석제, 부형제 등의 다수의 예는 당업계에 공지되어 있으며, 분원에 인용된 문헌 뿐만 아니라 문헌[참조: Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990]에 개시되어 있고, 그 내용은 본원에 참조로 인용된다. 간단히 말하자면, 적합한 담체, 부형제 및 기타 제제가 약제학적 조성물을 제형화하는데 혼입되어 전이, 전달, 내성 등을 향상시킴은 자명하다. 생물학적 제제 및/또는 추가의 활성 성분(들)을 담체에 혼입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 본 발명의 실시자에 의해 선택되는 생물학적 제제의 성질 및 담체의 성질에 좌우된다. 이온성 결합, 겔 캡슐화 또는 담체 내부로의 물리적 포착, 이온삼투요법, 및 생물학적 제제 용액 중에 담체의 침지는 개시된 치료 방법의 실시에 사용되는 약제학적 조성물을 제형화하는데 상정되는 적합한 예이다. 또는, 담체는 생물학적 제제에 대하여 희석제보다 더욱 적을 수 있다. 이러한 제형은, 예를 들어, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 무수 흡수 기재, 수중유 또는 유중수 유화액, 유화액 카보왁스 (다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔, 및 카보왁스 함유 반고체 혼합물을 함유할 수 있다. 본 발명의 화합물을 사용하는 투여 요법은 환자의 유형, 종, 연령, 체중, 성별 및 의학적 조건; 치료 대상 질환의 중증도; 투여 경로; 환자의 신장, 간 및 심혈관 기능; 및 사용되는 특정 생물학적 제제를 포함하는 각종 요인에 따라 선택된다. 당업계의 의사 또는 수의사는 질환의 진행을 예방, 대응 또는 저지하는데 필요한 약물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 독성 없이 효능을 수득하는 범위 내에서 약물의 농도를 달성하는 최적 정확도는 표적 부위에 대한 약물 이용가능성의 동력학에 기초한 요법을 필요로 한다. 이는 약물의 분배, 평형 및 제거의 고려를 수반한다. 임의의 상기 제형은, 제형 중의 활성 성분이 제형에 의해 불활성화되지 않고 제형이 생리학적으로 상용가능한 경우, 본 발명에 따른 처리 및 치료에 적당할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 알츠하이머병에 대하여 치료를 제공하기에 충분한 양으로 당업계에 이용가능한 임의의 방식, 전략 및/또는 이들의 배합으로 숙주에 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 당업계에 공지된 다양한 경로, 특히 정맥내 (IV), 근육내 (IM)와 같은 비경구 경로를 포함하나 이에 제한되지 않는 비경구 경로 또는 피하 (SC) 투여에 의해 개체에 제공될 수 있으며, IV 투여는 치료 항체 투여의 기술 내에서 표준이다. 이러한 조성물은 개별 또는 복합 투여 (즉, 치료 요법 동안 제형의 멸균 조건을 유지함으로써 시차를 두고 항체를 투여함)로서 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물을 사용하는 투여 요법은 환자 (예를 들어, 사람 환자)의 유형, 종, 연령, 체중, 성별 및 의료 조건; 치료 대상 질환의 중증도; 투여 경로; 환자의 신장, 간 및 심혈관 기능; 및 사용되는 특정 항체를 포함하는 각종 요인에 따라 선택된다. 당업계의 의사 또는 수의사는 항체의 치료 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 독성 없이 효능을 수득하는 범위 내에서 항체의 농도를 달성하는 최적 정확도는 표적 부위에 대한 약물 이용가능성의 동력학에 기초한 요법을 필요로 한다. 이는 약물의 분배, 평형 및 제거의 고려를 수반한다. 본원에 기재된 항체는 적당한 투여량으로 단독으로 사용될 수 있다. 또는, 다른 제제와의 공동 투여 또는 순차 투여가 바람직할 수 있다. 대체 예방 또는 치료 요법의 투여와 병행하여 본 발명의 항체를 위한 치료상 투여 요법을 제공하는 것이 가능하다. 효과적인 투여 요법은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 사람인지 동물인지, 투여되는 기타 약물, 및 처리가 예방 또는 치료인지를 포함하는 다수의 상이한 요인에 따라 달라진다. 13C3 유사 항체의 투여의 경우, 투여 범위는 0.0001 내지 100mg/kg 숙주 체중, 더욱 통상적으로 0.01 내지 5mg/kg 숙주 체중이다. 아밀로이드 침착물이 뇌에 발생하는 알츠하이머병의 경우, 본 발명의 제제는 또는 혈액-뇌 장벽을 가로질러 본 발명의 제제의 통과를 증가시키는 기타 제제와 병행하여 투여될 수 있다.
본 발명의 13C3 유사 항체 조성물을 위한 전달 및 투여 요법에 관한 또 다른 양태는 비경구 경로를 통한 약물 전달에 관한 것으로, 비주사용 및 주사용 장치를 포함할 수 있다. 통상적으로, 주사용 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 제조되며, 주사 전에 액체 비히클 중의 액체 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태도 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 상기에서 논의된 바와 같이 리포좀 또는 미세입자, 예를 들어, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 강화 보조제 효과용 공중합체에 유화되거나 캡슐화될 수 있다[문헌 참조: Langer, Science 249: 1527-1523, 1990; 및 Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997]. 본 발명의 제제는 활성 성분의 서방형 또는 박동형 방출을 허용하는 방식으로 제형화될 수 있는 데포 주사액 또는 삽입물 제제의 형태로 투여될 수 있다.
특정 양태는 본원에 논의되고 당업계에 추가로 공지된 바와 같은 PLGA 미세구뿐만 아니라, 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트; PEVAc)를 포함하는 중합체계 비분해성 비히클을 포함하다. 추가로, 항체 기반 치료 생성물의 제어 방출 및 국소 전달은 문헌[참조: Grainger, et al., Expert Opin. Biol. Ther. 4(7): 1029-1044, 2004]에서 검토되며, 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. 항체를 캡슐화할 수 있는 적합한 미세캡슐은 또한 액적형성 기술 또는 계면 중합 기술에 의해 제조된 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴 미세캡슐 및 폴리메틸 메타크릴레이트 미세캡슐을 포함한다[문헌 참조: 단백질이 PLGA 미세구에 캡슐화된 "IGF-1 서방형 방출 제형의 제조방법"이란 명칭의 국제공개공보 제WO 99/24061호; 그 전체가 본원에 참조로 인용된다]. 추가로, 미세유화액 또는 콜로이드성 약물 전달 시스템, 예를 들어, 리포좀 및 알부민 미세구도 또한 사용될 수 있다. 다른 바람직한 서방형 방출 조성물은 투여 부위에서 항체를 유지하기 위해 생물접착제를 포함한다. 상기에서 언급한 바와같이, 서방형 방출 제형은 내부에 항체가 배치되는 생분해성 중합체를 포함할 수 있으며, 이는 즉각적이지 않은 방출을 제공할 수 있다. 비주사용 장치는 본원에서 "삽입물", "약제학적 데포 삽입물", "데포 삽입물", "비주사용 데포" 또는 일부 이러한 유사 용어로서 기술된다. 일반적인 데포 삽입물에는 고체 생분해성 및 비생분해성 중합체 장치 (예를 들어, 신장 중합체 또는 동축 막대형 장치) 뿐만 아니라, 당업계에 공지된 다수의 펌프 시스템이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 주사용 장치는 볼루스 주사액 (주사 후 약물의 방출 및 소실), 및 주사 부위에서 저장소를 제공하여 시간의 흐름에 따라 생물학적 제제의 서방형 방출을 허용하는 저장형 또는 데포 주사액으로 나누어진다. 데포 삽입물은 시간의 흐름에 따라 항체의 지연 방출에 적합한 저장소를 제공하기 위해 전달 지점에 외과적으로 부착될 수 있다. 이러한 장치는 미리 정한 기간에 걸쳐 치료 또는 예방에 필요한 양으로 약물 제형을 운반할 수 있다. 데포 삽입물은 또한 치료기간 동안 체내 과정 (예를 들어, 프로테아제)에 의한 분해로부터 제형에 대한 보호를 제공할 수 있다. 당업계에 공지된 용어 "서방형 방출"은 연장된 시간에 걸쳐 블록 중합체 매트릭스로부터 이러한 제제의 점진적인 (연속 또는 불연속) 방출을 의미한다. 특정 장치와 관계없이, 13C3 유사 항체 조성물의 서방형 방출은 항체의 국소적인 생물학적 유효 농도를 유도한다. 생물학적 제제(들)의 서방형 방출은 하루, 수일, 1주일 이상의 기간 동안이지만, 가장 적당하게는 제형에 따라 1개월 이상 또는 약 6개월 이하 동안이다. 당업계에 공지된 천연 또는 합성 중합체는 다방면의 분해 동력학, 안전성 및 생체적합성과 같은 특성으로 인해 데포 삽입물로서 유용하다. 이러한 공중합체는 활성 성분의 약동학을 변화시키고, 효소의 공격으로부터 제제를 차폐할 뿐만 아니라, 부착 또는 주사 부위에서 시간의 흐름에 따라 분해되도록 조작될 수 있다. 당업자는 이러한 공중합체의 특성을 조작하기 위한 교시내용이 서방형 데포 삽입물 또는 데포 주사액의 각각의 제조 공정, 사용 촉매 및 최종 분자량을 포함하여 당업계에 충분히 존재함을 이해할 것이다. 천연 중합체에는 단백질 (예를 들어, 콜라겐, 알부민 또는 젤라틴); 다당류 (설룰로오스, 전분, 알기네이트, 키틴, 키토산, 사이클로덱스트린, 덱스트란, 히알루론산) 및 지질이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 생분해성 합성 중합체로는 각종 폴리에스테르, L-글루탐산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체[문헌 참조: Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556, 1983], 폴리락타이드 ([PLA]; 미국 특허 제3,773,919호 및 유럽 특허공보 제058,481호 참조), 폴리락테이트 폴리글리콜레이트 (PLGA), 예를 들어, 폴리락타이드-코-글리콜라이드 (예를 들어, 미국 특허 제4,767,628호 및 제5,654,008호 참조), 폴리글리콜라이드 (PG), 폴리(α-하이드록시산)의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 공액물, 폴리오르토에스테르, 폴리아스피린, 폴리포스파젠, 비닐피롤리돈, 폴리비닐 알콜 (PVA), PVA-g-PLGA, PEGT-PBT 공중합체 (다활성), 메타크릴레이트, 폴리 (N-이소프로필아크릴아미드), PEO-PPO-PEO (플루로닉), PEO-PPO-PAA 공중합체, PLGA-PEO-PLGA, 폴리오르토에스테르 (POE), 또는 상기 기재된 바와 같은 이들의 임의의 배합물 (예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 제6,991,654호 및 미국 특허원 제20050187631호 참조), 하이드로겔[문헌 참조: Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277, 1981; Langer, Chem. Tech. 12: 98-105, 1982], 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트 (예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트 디스크 및 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)), 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어, 루프론 데포 (Lupron Depot™), 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산 (유럽 특허공보 제133,988호), 히알루론산 겔 (예를 들어, 미국 특허 제4,636,524호 참조), 알긴산 현탁액, 폴리오르토에스테르 (POE) 등이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 폴리락타이드 (PLA) 및 글리콜라이드와 이의 공중합체 (PLGA)는 PLA 중합체를 사용하는 최초의 비경구 서방형 방출 제형으로 1989년에 승인된 루프론 데포의 상업화 이후로 당업계에 널리 공지되어 있다. 활성 성분의 서방형 방출을 달성하기 위한 부형제로서 PLA 및 PLGA를 사용하는 제품의 추가 예로는 아트리독스 (Atridox) (PLA; 치주질환), 누트로핀 데포 (Nutropin Depot) (PLGA; hGH 함유) 및 트렐스타 데포 (Trelstar Depot) (PLGA; 전립선암)가 포함된다. 기타 합성 중합체로는 폴리(c-카프롤락톤), 폴리 3-하이드록시부티레이트, 폴리 (β-말산) 및 폴리(디옥사논); 폴리무수물, 폴리우레탄 (국제공개공보 제WO 2005/013936호), 폴리아미드, 사이클로덱스트란, 폴리오르토에스테르, n-비닐 알콜, 폴리에틸렌 옥사이드/폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리포스파젠, 폴리포스페이트, 폴리포스포네이트, 폴리오르토에스테르, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리디하이드로피란 및 폴리아시탈이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 비생분해성 장치로는 각종 셀룰로오스 유도체 (카복시메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 아세테이트 프로피오네이트, 에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스) 규소계 삽입물 (폴리디메틸실록산), 아크릴계 중합체, (폴리메타크릴레이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리하이드록시(에틸메틸아크릴레이트) 뿐만 아니라, 폴리에틸렌-코-(비닐 아세테이트), 폴록사머, 폴리비닐피롤리돈, 폴록사민, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리아세탈, 폴리에스테르, 폴리에틸렌-클로로트리플루오로에틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE 또는 "Teflon™"), 스티렌 부타디엔 고무, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리페닐렌 옥사이드-폴리스티렌, 폴리-a-클로로-p-크실렌, 폴리메틸펜텐, 폴리설폰 및 기타 관련 생체안정한 중합체가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 서방형 방출 데포 제형에 적합한 담체로는 미소구, 필름, 캡슐제, 입자, 겔, 피복물, 매트릭스, 웨이퍼, 환제 또는 기타 약제학적 전달 조성물이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 서방형 방출 제형의 예는 상기에 기재되어 있다[문헌 참조: 미국 특허 제6,953,593호, 제6,946,146호, 제6,656,508호, 제6,541,033호 및 제6,451,346호 참조; 각각의 내용은 본원에 참조로 인용된다]. 투여 형태는 미리 정한 기간에 걸쳐 치료에 필요한 양 및 농도로 약물 제형을 운반할 수 있어야 하고, 치료 기간 동안 체내 과정에 의한 분해로부터 제형을 충분히 보호해야 한다. 예를 들어, 투여 형태는 대사 과정 및, 예를 들어, 누출, 균열, 파손 또는 뒤틀림의 위험으로부터의 분해에 대하여 보호 특성을 갖는 물질로 이루어진 외면에 의해 둘러싸일 수 있다. 이는, 예를 들어, 피검체에 의한 정상적인 관절 및 기타 운동의 결과로서 약물 방출 장치에 가해지는 물리적 힘 또는, 예를 들어, 대류성 약물 전달 장치의 경우 저장소 내에서 발생된 압력과 관련된 물리적 힘으로 인해, 사용 동안에 가해지는 응력하에 비조절 수단으로 투여 형태 내용물의 방출을 방지할 수 있다. 약물을 수용하거나 함유하기 위한 약물 저장소 또는 기타 수단은 또한 활성 제제 제형과 의도되지 않은 반응을 방지하기 위해 이러한 물질로 이루어져야 하며, 바람직하게는 생체적합성이 있어야 한다 (예를 들어, 투여 형태가 삽입되는 경우, 이는 피검체의 신체 또는 체액에 대하여 실질적으로 비반응성이다). 일반적으로, 각각의 생물학적 제제(들)는 12시간 이상 내지 1주일 이상 동안, 가장 적당하게는 필요에 따라 약물을 전달하도록 설계된 삽입물을 통해 10, 20, 30, 100일 이상 또는 4개월 이상, 또는 6개월 이상 동안 개체에 투여된다. 13C3 유사 항체는 제형이 방출되는 부위 근처의 조직 장애 또는 외상을 최소화하기 위해 비교적 낮은 용적 속도, 예를 들어, 약 0.001 내지 1ml/일로 전달될 수 있다. 제형은 특정 생물학적 제제(들)에 따라 낮은 용량의 속도, 예를 들어, 약 0.01 또는 0.1, 0.25, 1μg/시간, 일반적으로 약 200μg/시간 이하로 방출될 수 있거나, 낮은 용적 속도, 예를 들어, 약 0.001 내지 약 1ml/일, 예를 들어, 0.01μg/일 내지 약 20mg/일의 용적 속도로 전달된다. 투여량은 사용되는 활성 성분 (예를 들어, IgG 항체)의 효능, 생체이용가능성 및 독성 및 피검체의 조건과 같은 다수의 요인에 좌우된다.
본 발명의 이러한 목적, 기타 목적, 이점 및 특징은 하기에 더욱 완전히 나타낸 바와 같은 방법 및 조성물의 상세내용을 검토하면 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
실시예 1: 원섬유 형태의 아밀로이드 (Aβ42)의 제조
Aβ42 합성 펩타이드[미국 캘리포니아주 소재의 아메리칸 펩타이드 캄파니 인크 (American Peptide Company, Inc.)]를 페조우이 등 (Fezoui, et al.)에 의해 기재된 방법에 따라 제조하였다[문헌 참조: Fezoui et al., Amyloid 7(3): 166-178, 2000]. 간단히 말하자면, 동결건조된 Aβ42를 1mg/ml 농도 (pH 약 10.5)로 2mM NaOH에 용해시킨 후 초음파 처리 및 동결건조하였다. NaOH 처리된 Aβ를 1mg/ml의 농도로 물에 용해시키고, 0.22μm의 울트라프리 (ULTRAFREE)-MC 필터[미국 매사추세츠주 소재의 밀리포아 (Millipore)]로 여과하였다. 0.5mg/ml 펩타이드 용액을 최종 농도의 50mM 포스페이트 및 100mM 염화나트륨으로 완충시키고, 실온에서 4시간 동안 항온처리하였다. 저분자량 단백질로부터 원섬유 형태를 분리하기 위해, 크기 배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography; SEC)를 사용하여 상청액을 분획하였다. 이어서, 정제된 SEC 분획을 4℃에서 저장하였다.
함께 결합하여 고분자량 올리고머 (원섬유)를 형성하는 단량체 또는 이량체로서의 능력을 보여주는 각종 형태의 Aβ42 단백질을 나타냈다 (도 1). 가용성 원섬유의 추가 응집은 불용성 형태의 단백질을 생성하는 반면, 원섬유는 저분자량 형태로 다시 해리할 수 있다.
저분자량 단백질로부터 원섬유 형태의 Aβ를 정제하기 위해, 수퍼덱스 (Superdex) 75 크기 배제 칼럼을 사용하여 AKTA 크로마토그래피 시스템으로 샘플을 분획하였다. 도 2A는 Aβ42 합성 펩타이드를 실온에서 항온처리하지 않은 경우 원섬유를 형성하는 올리고머의 응집이 없음을 보여준다. 도 2B는 Aβ42 합성 펩타이드의 4시간 항온처리 후, 후속적인 SEC 정제가 최고의 원섬유 분획을 나타냄을 도시한다.
실시예 2: 원섬유 Aβ에 대하여 특이성을 갖는 모노클로날 항체의 생산
당업계에 공지된 프로토콜[문헌 참조: Harlow, et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]을 사용하여 Balb/c 마우스를 원섬유성 Aβ 단백질로 면역화시킴으로써, 13C3, 19A6 및 1D1 항체를 생산하였다. 비장을 제거하고, 몇 개의 96 웰 플레이트에서 SP2 골수종 세포와 융합시켰다. 융합 배양물을 생장에 대하여 모니터링하고, 상청액을 항체 포획 면역측정법에 의해 원섬유 분획과 결합하는 능력에 대하여 스크리닝하였다.
실시예 3: 원섬유 Aβ에 대하여 특이성을 갖는 모노클로날 항체의 특성화
하이브리도마로부터 생산된 모노클로날 항체 (13C3, 19A6 및 1D1)를 추가로 특성화하기 위해 항체 포획 검정법을 사용하였다. 미세역가 플레이트에, 2μg/ml의 원섬유성 Aβ42 단백질 용액 50μl를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 항온처리 후, 잔류하는 항원 용액을 제거하고, PBS 용액으로 세척하였다. 하이브리도마 상청액의 순차 희석액을 결합 항원 함유 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이러한 1차 항체 용액을 제거하고, 웰을 PBS 용액으로 다시 세척하였다. 효소 표지된 2차 항체를 다음에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 2차 항체 용액을 제거한 후, 결합 효소에 대하여 특이적인 발색성 기질을 반응물에 첨가하고, 포획 항체를 검출하여 정량적 결과를 수득하였다.
추가로, 이소타입 특이적 항면역글로불린 항체에 대하여 2차 시약을 변화시켜, 각각의 모노클로날의 특정 면역글로불린 이소타입을 확인하였다. 본 실험에서, 13C3, 19A6 및 1D1 모노클로날 항체의 결합 특이성을 비교하기 위해 시판중인 항 Aβ42 항체를 사용하였다.
도 3A 및 3B는 원섬유성 (PF) 및 저분자량 (LMW) 형태의 Aβ42 펩타이드가 항체 포획 면역측정법에서 13C3 항체의 특이성을 시험하는데 사용됨을 도시한다. 구체적으로, 도 3A는 13C3 항체가 원섬유성 형태 (PF)의 Aβ42에 대하여 특이적이고 저분자량 (LMW) 형태의 단백질을 인식하지 않음을 나타내는, ELISA로부터 생성된 플롯을 도시한다. 도 3B는 시판중인 4G8 항체가 저분자량 및 원섬유성 형태의 Aβ42 단백질 모두를 인식함을 나타내는, 시판중인 4G8 항체에 대한 ELISA 데이터를 도시한다.
실시예 4: 표면 플라스몬 공명 (바이아코아)을 사용하여 원섬유성 형태의 Aβ42에 대한 모노클로날 항체의 특이성
하기 표 1에 열거된 정제된 모노클로날 항체를 공개 프로토콜에 따라 바이아코아 센서 칩에 고정시켰다[문헌 참조: Nice, et al., BioEssays 21: 339-352, 1999]. 고감도의 바이아코아 광학 반응은 반사율의 변화를 정량화하고, 리간드 단독에 대한 기준선 반응을 생성한다. 분석물, LMW 형태 또는 PF 형태의 Aβ42를 센서 칩에 용액으로 주입함에 따라 상호작용 분석을 수행하고, 표면 플라스몬 공명의 변화는 LMW 및 PF Aβ42와 결합하는 각각의 항체의 능력의 특이성을 확인하는 반응을 생성한다. 13C3 및 19A6 항체는 모두 LMW 형태보다 높은 특이성을 갖는 PF 형태의 Aβ42와 결합한다. 본 시험에 사용된 모든 항체 중에서, 시판중인 항체는 PF 결합/LMW 결합의 비율로서 나타낸 바와 같이 PF 형태의 Aβ42에 비하여 LMW Aβ42에 대해 보다 높은 특이성을 나타냈다.
Figure 112010032542089-pct00010
표면 플라스몬 공명 분석은 13C3 (도 4B)이 LMW 형태의 Aβ42 단백질과 결합하지 않음을 센서그램으로 나타냈다. 그러나, 4G8 (도 4A)는 LMW Aβ42 단백질에 대한 표준 결합/해리 곡선을 나타낸다. 항체 이소타입 대조군 IgG1 (도 4C)도 역시 LMW Aβ와 결합하지 않는다. 표면 플라스몬 공명의 검출 원리를 사용하는 자동화 바이아코아 시스템을 본 실험에서 사용하였다. 19A6 항체에 대한 결합 특이성 데이터는 19A6의 결합 비율이 5.8임을 나타내며, 이는 결합 비율이 5.3인 13C3과 유사하다.
실시예 5: 13C3 항체의 에피토프 매핑 (mapping)
레플리토프 마이크로어레이스 시스템[RepliTope Microarrays system; JPT 펩타이드 테크놀로지스 게엠베하 (Peptide Technologies GmbH)]을 사용하여 공개 프로토콜[문헌 참조: Korth, et al. 390: 74, 1997]에 따라 13C3, 1D1 및 19A6의 에피토프에 대한 매핑을 수행하였다. 마이크로어레이 상의 각각의 스폿은 Aβ42의 13개 아미노산의 펩타이드를 함유하며, 마이크로어레이 상의 위치에서 각각의 이동은 아미노산 이동 (N 말단에서 C 말단으로), 즉 서열번호 23, 서열번호 24, …, 서열번호 51 및 서열번호 52를 나타낸다. 슬라이드 어레이 상의 위치에 상응하는 펩타이드 및 이의 정확한 아미노산 서열을 하기에 열거한다. 일단 펩타이드를 레플리토프 마이크로어레이에 고정하고, 샘플을 13C3 항체와 함께 항온처리한 후, 후속적으로 선택되는 화학 발광 태그와 결합된 2차로 표지한다. 신호를 생성하는 스폿은 항체에 의한 단백질에 대한 에피토프 결합 부위를 나타낸다.
Figure 112010032542089-pct00011
Figure 112010032542089-pct00012
도 5A는 Aβ1-42 펩타이드 상에서 항체 13C3, 1D1 및 4G8의 에피토프를 확인하는 레플리토프 마이크로어레이 실험으로부터의 도트 블롯을 도시한다. 결합된 항체는 화학 발광 신호로 나타내어진다. 도 5B는 이들이 서열에서 일어날 때 13C3 에피토프의 폴리펩타이드 단편을 나타내는 Aβ1-42 아미노산 서열을 도시한다. 1D1 항체는 13C3과 동일한 에피토프를 나타내는 반면, 시판중인 4G8 항체는 상이한 에피토프를 확인한다.
실시예 6: 13C3 특이성의 특성화
도 6은 7PA2 세포주, 분비성 Aβ 올리고머 세포주로부터의 상청액을 크기 배제 크로마토그래피로 정제한 분획을 도시한다. SEC 정제된 7PA2로부터의 원섬유성 및 저분자량 분획과 13C3 항체의 결합을 추가로 특성화하기 위해 항체 포획 검정법을 사용하였다. 미세역가 플레이트에, 각각의 분획의 1:200 희석액 100μl를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 항온처리 후, 잔류하는 항원 용액을 제거하고, PBS 용액으로 세척하였다. 13C3 상청액의 순차 희석액을 결합 항원 함유 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이러한 1차 항체 용액을 제거하고, 웰을 PBS 용액으로 다시 세척하였다. 효소 표지된 2차 항체를 다음에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 2차 항체 용액을 제거한 후, 결합 효소에 대하여 특이적인 발색성 기질을 반응물에 첨가하고, 포획 항체를 검출하여 정량적 결과를 수득하였다. 본 검정법은 13C3 항체가 원섬유성 분획만을 특이적으로 인식하는 반면, 4G8 항체는 모든 분획을 인식함을 확인하였다. 7PA2 세포주는 하버드 메디칼 스쿨의 데니스 (Dennis J. Selkoe, M.D.)에 의해 제공되었다.
실시예 7: EM에 의한 13C3 반응성의 특성화
표준 프로토콜[문헌 참조: Brenner, et al., Biochim. Biophys. Ada 34, 103-110, 1959]을 사용하여 염색 방법을 수행하였다. 소량 (10μl)의 0.2mg/ml 원섬유 용액을 탄소 피복된 폼바 그리드 (formvar grid) (400메쉬)에 2분 동안 가하였다. 이어서, 그리드를 1% BSA로 차단하고, 13C3 항체와 함께 항온처리한 후, 후속적으로 콜로이드성 금과 결합한 2차 항체와 함께 항온처리하였다. 샘플을 2% 포스포텅스텐산 연속 2방울 상에 각각 30초 동안 위치시킴으로써 음성 염색하였다. 과량의 염료를 여과지로 닦아내고, 그리드를 공기 건조시키고, JEOL 1OOCX 투과 전자현미경 상에서 80kV로 관찰하였다. 이미지를 대형 코닥 (Kodak) 4489 음화 상에 기록하고, 평판 스캐너 상에서 디지털화하였다.
IEM (면역 전자현미경) 이미지는 Aβ42 섬유에 대한 항 Aβ 항체 클론 13C3의 결합 특이성을 나타내는 반면 (도 7B 및 7C), 이소타입 대조군 항체, IgG1은 결합을 나타내지 않는다 (도 7A). 2차 항체는 콜로이드성 금 입자와 결합한다.
실시예 8: 사람 AD의 마우스 모델의 치료
알츠하이머병 마우스 모델, TgCRND8에서 Aβ 플라크를 치료하기 위해 13C3 모노클로날 항체를 사용하였다. 마우스는 사람 APP695 cDNA 이식 유전자를 함유하며, 이는 마우스 뇌에서 1월령 이내에 나타나는 Aβ 아밀로이드 플라크의 침착을 가속화시킨다. 5주령인 5마리의 TgCRND8 마우스의 샘플 그룹에 10mg/kg 마우스의 농도의 13C3 모노클로날 항체로 7주 동안 1주일에 1회 면역화시켰다. 5마리의 TgCRND8 마우스의 제2 그룹에 치료 과정을 제공하였으나, 이소타입 대조군 IgG1을 투여하였다. 실험을 1주일에 1회 대신에 1주일에 2회로 반복 치료하였다.
대조군과 실험 동물 모두를 12주령에서 희생시켰다. 뇌의 조직학적 제제는 13C3 치료된 마우스에서 Aβ 플라크의 감소를 나타냈다.
TgCRND8 마우스로부터의 저온보존 뇌의 순차 절편을 13C3 또는 IgG1 모노클로날 항체로 처리하였다. 도 8A 및 8B는 각각의 항체 사이에서 Aβ 아밀로이드 플라크 수의 차이를 도시한다.
통계적 T 시험은 1주일에 1회의 13C3 항체 치료가 알츠하이머병 모델에서 Aβ 아밀로이드 플라크를 감소시킴을 나타낸다 (도 9A). 그러나, 1주일에 2회의 치료는 동일한 수준의 플라크 감소를 나타낸다 (도 9B).
상기 TgCRND8 마우스는 모두 토론토 대학의 데이비드 (Dr. David Westaway)로부터 수득하였다.
실시예 9: MAB 13C3의 가변 영역의 분자 특성화
IgG 중쇄 가변 영역 및 IgG 카파 (Kappa) 경쇄 영역을 13C3 하이브리도마로부터 클로닝시켰다. VBASE2 (http://www.vbase2.org), EMBL 뱅크 및 Ensembl 데이터 라이브러리로부터 추출한 사람 및 마우스의 면역글로불린 유전자좌로부터의 생식선 가변 유전자의 데이터베이스를 사용하여 중쇄와 경쇄 서열을 분석하였다 (도 10)[문헌 참조: Retter et al., Nucleic Acids Res. 33: D671-4, 2005]. 분석에 대한 결과는 경쇄와 중쇄 가변 영역 모두가 새롭게 확인된 면역글로불린으로부터 유래하지만, 데이터베이스의 다른 면역글로불린 가변 영역에 대하여 각각 73% 및 81% 동일성을 가짐을 확인하였다. 또한, 골격 영역 (FWR) 및 상보성 결정 영역 (CDR)이 이들 데이터베이스에 대하여 이들 서열에서 확인되었다. 결과는 서열을 VBASE, KABAT 및 IMGT/LIGM 데이터베이스에 대하여 분석하였을 때 약간만 변하였다.
실시예 10: APP 형질전환 마우스에서 13C3의 급성 말초 투여는 기준 항체 3D6 투여와 달리 혈장 Aβ의 증가를 유발하지 않음
APP 형질전환 마우스 (Thy APPSL, 10 내지 14주령)에 항체 13C3, 대조군 IgG1 (DM4, Aβ를 인식하지 못함), 및 Aβ의 모든 이형태체를 인식하는 기준 항 Aβ 항체 3D6를 10mg/kg (즉, 300μg/마우스)의 용량으로 복강내 주사하였다. 동일한 마우스에서 시간 0 예비 주사, 6시간, 24시간 및 7일 후 주사로 혈장 Aβ를 정량화하였다. Aβ와 결합하는 13C3 또는 3D6을 방해하지 않고 항 Aβ 항체 쌍을 사용하는 면역측정법으로 혈장 Aβ의 정량화를 수행하였다.
Aβ의 모든 이형태체에 대한 항체인 3D6의 투여는 분해로부터 Aβ 분자를 보호함으로써 혈장 Aβ에서 큰 증가를 유발한다. 이러한 효과는 항 Aβ 면역요법의 작용 메카니즘으로서 잠재적인 "말초 싱크" 가설을 제안하는데 이용된다[문헌 참조: Demattos et al., PNAS 17: 8850, 2001]. 3D6과 달리, 13C3 투여는 혈장 Aβ 수준에서 어떠한 증가도 유발하지 않는다. 이는 원섬유성 형태의 Aβ에 대하여 특이적인 항체인 13C3의 특성과 일치하며, 가용성 단량체 또는 올리고머 형태의 Aβ 펩타이드를 인식하지 못한다. 이러한 형태는 혈장에서 존재하는 것이다.
실시예 11: 13C3은 AD 뇌에서 (응집된) 사람 아밀로이드 신경반을 인식하지만 기준 3D6 항 Aβ 항체와 달리 분산된 Aβ 침착물을 인식하지 못함
표준 기술을 사용하여 사람 알츠하이머 진단 뇌 절편에 대하여 13C3 및 3D6 항체로 면역조직화학 연구를 수행하였다. 항체 면역염색을 DAB 크로모겐으로 검출하였다 (도 12). 13C3는 가벼운 얼룩, 또는 거대한 플라크의 경우에는 매우 강한 염색에 의해 둘러싸인 매우 조밀한 코아를 갖는 성숙 아밀로이드 신경반 (조밀 플라크로도 칭함)의 통상적인 형태로 아밀로이드 침착물을 표지한다. 인접 뇌 절편에서, 3D6은 저배율에서 관찰할 때 13C3보다 더 많은 물체를 염색한다 (도 12, 좌측 패널). 고배율에서의 추가 특성화는 3D6이 13C3과 동일한 성숙 아밀로이드 신경반, 및 항 Aβ 면역표지를 사용하여 통상대로 기재되어 있는 다수의 분산된 아밀로이드 침착물을 표지함을 나타냈다 (도 12, 우측 패널). 분산된 플라크는 원섬유의 티오플라빈 S 및 기타 조직학적 마커에 의해 검출될 수 없기 때문에 문헌에서 기재된 바와 같이 원섬유 성질이 아니다[문헌 참조: Mann, Ann. Med. 21: 133, 1989]. 2개의 항체의 감도 차이를 배제하기 위해, 유사한 실험을 고농도 (20μg/ml)의 13C3으로 수행하였고, 분산된 침착물을 다시 검출할 수 없었다. 이러한 데이터는 원섬유성 형태의 Aβ에 대하여 특이적이고 3D6과 달리 가용성 단량체 또는 올리고머 형태의 Aβ 펩타이드를 인식하지 못하는 항체인 13C3의 특성과 일치한다.
본 발명은 알츠하이머병의 치료 및 진단 용도를 갖는다.
특허 문헌 및 비특허 문헌을 포함하는 본원에 인용된 모든 문헌은 본 발명이 적용되는 당업자의 기술수준을 나타낸다. 이러한 모든 문헌은 각각의 문헌이 참조로 인용되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 언급되는 것과 동일한 정도로 전체적으로 본원에 참조로 인용된다.
본 발명이 본원에서 특정 양태를 참조로 기재되어 있지만, 이러한 양태가 본 발명의 원리 및 용도를 단지 예시하는 것임은 명백하다. 따라서, 다수의 변형이 예시된 양태에 대해 이루어지고, 다른 배열이 다음 특허청구범위에 의해 한정되는 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 고안될 수 있음은 명백하다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (35)

  1. ATCC 수탁번호 PTA-8830의 하이브리도마에 의해 생산되는 13C3 항체 또는 이의 사람화된 항체인, 원섬유 (protofibril) 형태의 Aβ (β-아밀로이드) 펩타이드의 입체형태 에피토프 (epitope)에 특이적으로 결합하고 이에 대해 측정가능한 친화도를 나타내는, 분리된 모노클로날 항체.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 항체가 ATCC 수탁번호 PTA-8830의 하이브리도마에 의해 생산되는 13C3 항체의 사람화된 항체인, 분리된 모노클로날 항체.
  4. (i) 서열번호 13에 나타낸 CDR1 영역, 서열번호 14에 나타낸 CDR2 영역 및 서열번호 15에 나타낸 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄 및 (ii) 서열번호 20에 나타낸 CDR1 영역, 서열번호 21에 나타낸 CDR2 영역 및 서열번호 22에 나타낸 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는, 원섬유 형태의 Aβ (β-아밀로이드) 펩타이드의 입체형태 에피토프에 특이적으로 결합하고 이에 대해 측정가능한 친화도를 나타내는, 분리된 모노클로날 항체.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제4항에 있어서, 항체가 사람화된 모노클로날 항체인, 분리된 모노클로날 항체.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제7항에 있어서, 사람화된 모노클로날 항체가 ATCC 수탁번호 PTA-8830의 하이브리도마에 의해 생산되는 13C3 항체의 사람화된 항체인, 분리된 모노클로날 항체.
  11. 삭제
  12. (a) 피검체로부터 수득된 조직 또는 체액 샘플을 제1항, 제3항, 제4항, 제7항 및 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 샘플에서 원섬유 형태의 Aβ (β-아밀로이드) 펩타이드의 양을 정량하는 단계를 포함하는,
    조직 또는 체액 샘플에서 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드의 양을 정량하는 방법.
  13. 삭제
  14. (a) 제1항, 제3항, 제4항, 제7항 및 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및
    (b) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 직접 또는 간접적으로 결합하는 시약을 포함하고,
    저분자량 형태의 Aβ (β-아밀로이드) 펩타이드에 대한 친화도보다 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드에 대한 친화도가 더 크고 저분자량 형태의 Aβ 펩타이드에 대한 친화도는 최소인, 원섬유 형태의 Aβ 펩타이드를 검출하기 위한 키트.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제1항, 제3항, 제4항, 제7항 및 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 알츠하이머병의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  24. 삭제
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