ES2639016T3 - Anticuerpos específicos para la forma protofibrilar de proteína beta-amiloide - Google Patents

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Abstract

Anticuerpo monoclonal aislado que interacciona específicamente con y muestra una afinidad de al menos 106 M-1 tal como se mide mediante resonancia de plasmón superficial por un epítopo conformacional de una forma protofibrilar del péptido Ab, mediante lo cual el epítopo protofibrilar se representa mediante una región que queda al descubierto de una forma protofibrilar de Ab que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 3, que comprende además una cadena ligera variable que comprende una región CDR1 tal como se expone en SEQ ID NO: 13, una región CDR2 tal como se expone en SEQ ID NO: 14 y una CDR3 tal como se expone en SEQ ID NO: 15, y una cadena pesada variable compuesta por una región CDR1 tal como se expone en SEQ ID NO: 20, una región CDR2 tal como se expone en SEQ ID NO: 21 y una CDR3 tal como se expone en SEQ ID NO: 22.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos especificos para la forma protofibrilar de proteina beta-amiloide Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a anticuerpos aislados que interaccionan especificamente con epitopos conformacionales de una forma protofibrilar de peptido beta-amiloide humano. Estos anticuerpos muestran una afinidad minima o ninguna afinidad detectable por formas de menor peso molecular del peptido beta-amiloide. Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento seran utiles en el diagnostico, tratamiento y/o prevencion de la deposicion de placa beta-amiloide asociada con la aparicion y progresion de la enfermedad de Alzheimer.
Antecedentes de la invencion
Se piensa que los peptidos beta-amiloides (Ap) son un agente causante de la enfermedad de Alzheimer (“AD”) mediante la formacion de fibrillas de peptido AP insolubles y la deposicion de estas fibrillas para formar placas de amiloide. Se piensa que la formacion de tales placas dentro de la zona del cerebro critica para la memoria y otras funciones cognitivas conduce a demencia asociada con esta enfermedad (vease Selkoe, 1994, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:438-447). Los peptidos beta-amiloides comprenden un grupo de peptidos de 39-43 aminoacidos de longitud que se procesan proteoliticamente a partir de proteina precursora del amiloide (APP), tanto por p-secretasa como por y-secretasa en el extremo amino y carboxi-terminal, respectivamente. Hay al menos cinco isoformas distintas de APP: de 563, 695, 714, 751 y 770 aminoacidos de longitud, respectivamente (vease Wirak et al., 1991 Science 253:323). Estas isoformas de APP se generan mediante corte y empalme alternativo de transcritos primarios del gen de APP. Se han identificado numerosas mutaciones de cambio de sentido en APP en familias con enfermedad de Alzheimer autosomica dominante de aparicion temprana. Algunas mutaciones se agrupan cerca de los sitios de escision de secretasa y afectan al metabolismo de APP aumentando o bien la produccion o bien la proporcion de formas de Ap (por ejemplo, AP42), que tiende a ser mas fibrilogenica y a agregarse mas rapidamente que otras formas. La toxicidad neuronal puede residir en las fibrillas de gran peso molecular que se forman por medio de la agregacion de peptidos Ap solubles para dar fibrillas insolubles y, posteriormente, incorporacion de fibrillas para dar placas de amiloide. Una forma de fibrilla intermedia es la forma protofibrilar (PF), una forma oligomerica de gran peso molecular de peptidos Ap que es soluble in vitro y puede aislarse como una entidad de aproximadamente ~670 kDa. Por tanto, la formacion in vitro de fibrillas de peptidos Ap insolubles es el resultado final de la oligomerizacion inicial del peptido Ap para formar una forma protofibrilar estructuralmente distinta, soluble y de mayor peso molecular. Estas estructuras de protofibrillas transitorias son precursoras de las fibras de amiloide responsables de la disfuncion celular y perdida neuronal en la enfermedad de Alzheimer (AD) y otras enfermedades de agregacion de proteinas.
Se han avanzado diversos tratamientos en intentos de prevenir la formacion del peptido Ap, por ejemplo, inhibidores para prevenir el procesamiento proteolitico de APP. Ademas, se han empleado estrategias de inmunoterapia tales como la administracion de anticuerpos anti-Ap (para inducir aclaramiento de depositos de amiloide) o inmunizacion con antigenos de peptido Ap (para fomentar una respuesta humoral) en un intento por reducir el tamano y la densidad de las placas.
La patente estadounidense n.° 7.179.463, concedida a Lannfelt et al., da a conocer un metodo de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer administrando un anticuerpo producido contra una protofibrilla que consiste en la mutacion Arctic dentro de la region codificante del peptido Ap. En la memoria descriptiva no se presenta ningun ejemplo de anticuerpos producidos y no se presenta ninguna comparacion en cuanto a la afinidad por formas de bajo peso molecular del peptido Ap.
Las patentes estadounidenses n.os 6.761.888 y 6.750.324, concedidas a Schenk et al., dan a conocer una serie de anticuerpos que reconocen diversos epitopos a lo largo de la secuencia de aminoacidos de Ap42. Los anticuerpos especificos para el extremo N-terminal y regiones centrales de Ap42 mostraron eficacia en la reduccion de placa tanto ex vivo como in vivo.
A pesar del conocimiento actual en el campo del tratamiento y la prevencion de la enfermedad de Alzheimer, sigue existiendo la necesidad de composiciones mejoradas y metodos de tratamiento y/o prevencion de esta enfermedad. Las composiciones y metodos de la presente invencion abordan y cumplen estas necesidades dando a conocer anticuerpos especificos para formas protofibrilares del peptido Ap al tiempo que muestran una afinidad detectable minima frente a formas de bajo peso molecular del peptido Ap. Las composiciones farmaceuticamente eficaces que comprenden un anticuerpo o anticuerpos de este tipo seran utiles en el tratamiento y/o la prevencion de la deposicion de placa de beta-amiloide que se sabe que esta asociada con la aparicion y progresion de la enfermedad de Alzheimer.
El documento WO 2008/156622 se refiere a un anticuerpo humanizado anti-A beta hC2 que se une a un epitopo especifico de conformacion de A beta.
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El documento US 2006/280733 se refiere a un anticuerpo policlonal anti-A beta que se une a protofibrillas de A beta. El documento WO 2005/011599 se refiere a anticuerpos que se unen a oligomeros de Abeta.
El documento WO 2007/064972 se refiere a anticuerpos que se unen a oligomeros de Abeta.
Lambert et al, Journal of Neurochemistry, vol. 100, n.° 1, 1 de enero de 2007, paginas 23-35, se refiere a anticuerpos monoclonales que seleccionan como diana conjuntos patologicos de A beta.
Englund et al, Journal of Neurochemistry, 1 de octubre de 2007, vol. 103, paginas 334-345, se refiere a la deteccion mediante ELISA sensible de protofibrillas de beta-amiloide en muestras biologicas.
Sumario de la invencion
La presente invencion se refiere a un anticuerpo aislado tal como se expone en las reivindicaciones adjuntas. En el
presente documento tambien se describe un anticuerpo aislado que muestra union especifica a un epitopo
conformacional de una forma protofibrilar del peptido p-amiloide. El monomero del peptido beta-amiloide (AP) de tipo natural se conoce en la tecnica y se muestra en el presente documento como sEq ID NO: 1. Los anticuerpos aislados de la presente descripcion tienen afinidad por un epitopo conformacional repetido de este tipo por la forma protofibrilar de mayor peso molecular del peptido Ap al tiempo que muestran una afinidad minima o ninguna por otras formas del peptido Ap, tales como formas de monomero o dimero del peptido Ap.
La presente descripcion tambien se refiere a un anticuerpo aislado que interacciona especificamente con y muestra una afinidad medible por un epitopo conformacional de una forma protofibrilar del peptido Ap, mediante lo cual el epitopo protofibrilar se representa mediante una region que queda al descubierto de una forma protofibrilar de Ap que comprende la parte amino-terminal de una parte que queda al descubierto del peptido Ap.
La presente descripcion se refiere ademas a un anticuerpo aislado que interacciona especificamente con y muestra una afinidad medible por un epitopo conformacional de una forma protofibrilar del peptido Ap, mediante lo cual el epitopo protofibrilar se representa mediante una region que queda al descubierto de una forma protofibrilar de Ap que comprende los aminoacidos 1-20 (SEQ ID NO: 2) de una parte que queda al descubierto del peptido Ap.
La presente descripcion tambien se refiere a un anticuerpo aislado que interacciona especificamente con y muestra una afinidad medible por un epitopo conformacional de una forma protofibrilar del peptido Ap, mediante lo cual el epitopo protofibrilar se representa mediante una region que queda al descubierto de una forma protofibrilar de Ap que comprende los aminoacidos 4-12 y 9-20 (SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente) de una parte que queda al descubierto del peptido Ap.
La presente descripcion se refiere en parte a anticuerpos monoclonales 13C3, 1D1 y 19A6, y a cualquier forma madurada por afinidad de 13C3, 1D1 y 19A6. La presente descripcion se refiere ademas a un anticuerpo que imita la especificad funcional tal como se describe en el presente documento para 13C3, 1D1 y 19A6. Con este fin, la presente descripcion tambien se refiere a fragmentos y/mutantes biologicamente activos de los anticuerpos 13C3, 1D1, 19A6 o a un anticuerpo de tipo 13C3, 1D1 o 19A6, incluyendo, pero sin limitarse necesariamente a, sustituciones de aminoacido (por ejemplo, como una forma dirigida de maduracion por afinidad de las regiones Vh o Vl), deleciones, adiciones, truncamientos amino-terminales y truncamientos carboxi-terminales de manera que estas mutaciones proporcionan una base para un anticuerpo o parte de union de anticuerpo que da como resultado una version similar o mejorada de una proteina de union de anticuerpo 13C3, 1D1, 19A6 o de tipo 13C3. En una realizacion de esta parte de la descripcion, la region Vh y Vl de 13C3 comprende la secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ ID NO: 7 (Vh) y/o SEQ ID NO: 5 (Vl), respectivamente.
La presente descripcion se refiere ademas a una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica para las regiones Vh y/o Vl de un anticuerpo 13C3, 1D1 o 19A6; y especialmente a una molecula de acido nucleico aislada (polinucleotido) que codifica para una parte biologicamente relevante de 13C3, o version madurada por afinidad o version mutada de otro modo de un anticuerpo 13C3, 1D1 o 19A6. Con este fin, una realizacion de la presente descripcion se refiere a una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifican para la region Vh y Vl de 13C, tal como se expone en SEQ ID NO: 8 (13C3: region Vh) y SEQ ID NO: 6 (13C3: region Vl), respectivamente.
La presente descripcion tambien se refiere a anticuerpos aislados 13C3, 1D1 o 19A6 tal como se da a conocer en el presente documento, anticuerpos que interaccionan especificamente con y muestran una afinidad medible por un epitopo conformacional de una forma protofibrilar del peptido Ap.
La presente descripcion tambien se refiere a un hibridoma que puede producir un anticuerpo monoclonal de la presente descripcion. Los hibridomas particulares de la presente descripcion incluyen hibridomas que producen
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anticuerpos monoclonales a modo de ejemplo 13C3, 19A6 y 1D1, respectivamente.
La presente descripcion se refiere a composiciones farmaceuticamente eficaces que comprenden un anticuerpo aislado tal como se da a conocer y se define adicionalmente en el presente documento: un anticuerpo aislado que interacciona especificamente con y muestra una afinidad medida por y capacidad para unirse especificamente a un epitopo conformacional de repeticion de una forma protofibrilar de Ap al tiempo que muestra una afinidad minima o ninguna afinidad medible por formas de bajo peso molecular de Ap. Estas composiciones pueden comprender opcionalmente uno o mas portadores, uno o mas excipientes y/o uno o mas derivados quimicos.
La presente descripcion tambien se refiere a metodos de tratamiento de un individuo que padece enfermedad de Alzheimer que comprenden administrar al individuo una composicion farmaceuticamente eficaz que comprende un anticuerpo aislado dado a conocer en el presente documento, concretamente un anticuerpo que interacciona especificamente con y muestra una afinidad medida por un epitopo conformacional de repeticion de una forma protofibrilar del peptido Ap al tiempo que muestra una afinidad minima o ninguna afinidad detectable por formas de menor peso molecular del peptido Ap. Estos metodos proporcionaran una intervencion terapeutica con el fin de reducir la cantidad de depositos de amiloide en el cerebro de un individuo que padece enfermedad de Alzheimer. Las realizaciones particulares de esta parte de la presente descripcion se refieren a metodos para de tratamiento de un individuo que padece enfermedad de Alzheimer que comprenden administrar una composicion farmaceuticamente eficaz formulada con un anticuerpo que muestra afinidad especifica (al menos en comparacion con formas de bajo peso molecular del peptido Ap) por un epitopo conformacional de una forma protofibrilar del peptido Ap, especialmente mediante lo cual el epitopo protofibrilar se representa mediante una region que queda al descubierto de una forma protofibrilar de Ap que comprende los aminoacidos 1 -20 (SEQ ID NO: 2) de una parte que queda al descubierto del peptido Ap. Las realizaciones especificas relacionadas con estos metodos terapeuticos y profilacticos dados a conocer en el presente documento pueden utilizar anticuerpos monoclonales de raton a modo de ejemplo 13C3, 19A6, 1D1, asi como versiones maduradas por afinidad de cualquier anticuerpo de este tipo, anticuerpo quimerico, anticuerpo humanizado, anticuerpo monoclonal humano y/o cualquier otra forma de anticuerpo de este tipo conocida en la tecnica, incluyendo pero sin limitarse al anticuerpo o miembros de union especifica revisados en el presente documento. Cualquier anticuerpo o miembro de union especifica de este tipo puede denominarse esta memoria descriptiva “anticuerpo de tipo 13C3”. Por tanto, se pretende que un “anticuerpo de tipo 13C3” tambien abarque el anticuerpo monoclonal 13C3 dado a conocer en el presente documento.
La presente descripcion tambien se refiere a metodos de examen para detectar y seleccionar compuestos que pueden actuar como inhibidor de la formacion de fibrillas y/o placas seniles asociada con la enfermedad de Alzheimer. Tal metodologia comprende usar un anticuerpo con caracteristicas similares a 13C3 (por ejemplo, afinidad especifica por las formas PF frente a LMW del peptido Ap) en diversos ensayos de interaccion de anticuerpo/peptido/compuesto de prueba con el fin de seleccionar un compuesto que modula el proceso de formacion de fibrillas y/o placas.
La presente descripcion se refiere ademas a metodos de ensayo de diagnostico para determinar especificamente niveles de protofibrillas dentro de un sujeto o paciente. Tales ensayos pueden llevarse a cabo mediante cualquier tecnica conocida y disponible para el experto, incluyendo, pero sin limitarse a, inmunotransferencias de tipo Western, ELISA, radioinmunoensayos, ensayos inmunohistoquimicos, inmunoprecipitaciones u otros ensayos inmunoquimicos conocidos en la tecnica. Por tanto, una realizacion de esta parte de la descripcion se refiere a tomar una muestra de tejido de un sujeto o paciente y determinar el nivel de Ap PF en la muestra usando un kit de diagnostico y el ensayo asociado; mediante lo cual el kit comprende un anticuerpo de tipo 13C3, permitiendo por tanto la determinacion especifica de niveles de Ap PF en la muestra de tejido. La muestra de tejido para el analisis es normalmente sangre, plasma, suero, mucosidad o liquido cefalorraquideo del sujeto o paciente
Con este fin, los anticuerpos de la presente descripcion pueden usarse al menos para los siguientes usos: (1) como agente profilactico o terapeutico para prevenir o reducir los depositos de placas asociados con la enfermedad de Alzheimer, o bien solos o bien junto con cualquier terapia de combinacion disponible; (2) en el diseno de inmunogenos peptidicos que pueden usarse para provocar una repuesta de anticuerpos eficaz en estrategias de vacunacion profilacticas o terapeuticas relacionadas con el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer; (3) para generar un anticuerpo anti-idiotipico profilactico o terapeutico (Ab2) que imita el/los epitopo(s) criptico(s) que se une(n) a los anticuerpos de la presente descripcion; y, (4) en el diseno de peptidos derivados de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los anticuerpos neutralizantes de la presente descripcion para su uso en el examen de inhibidores de la formacion de protofibrillas para su uso en regimenes profilacticos y/o terapeuticos y (4) como reactivo de diagnostico para determinar el nivel de Ap protofibrilar en suero o LCR de un paciente en riesgo de desarrollar EA.
Un objeto de la presente descripcion es proporcionar anticuerpos que interaccionan especificamente y muestran afinidad por un epitopo conformacional que queda al descubierto de una forma protofibrilar del peptido Ap que comprende los aminoacidos 1-20 (SEQ ID NO: 2) de una parte que queda al descubierto del peptido Ap.
Un objeto adicional de la presente descripcion es proporcionar anticuerpos que interaccionan y muestran afinidad
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por un epitopo conformacional que queda al descubierto de una forma protofibrilar del peptido Ap que comprende los aminoacidos 4-12 y 9-20 (SEQ ID NO: 3, 4) de una parte que queda al descubierto del peptido Ap.
Otro objeto de la presente descripcion es proporcionar anticuerpos de tipo 13C3 que previenen o reducen la formacion de protofibrillas de peptido Ap relacionada con la deposicion de placas asociadas con la enfermedad de Alzheimer.
Otro objeto de la presente descripcion es proporcionar ensayos que usan anticuerpos de tipo 13C3 en ensayos de interaccion de anticuerpo/peptido/compuesto de prueba para seleccionar compuestos que seran utiles en el tratamiento de la deposicion de placas asociada con la enfermedad de Alzheimer.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que “Ka” se refiera a la constante de asociacion de una interaccion antigeno-anticuerpo particular, se pretende que “Kd” se refiera a la constante de disociacion de una interaccion antigeno-anticuerpo particular.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “epitopo” o “determinante antigenico” se refiere a un sitio en un antigeno frente al que responden celulas B y/o T o un sitio en una molecula frente al cual se producira un anticuerpo y/o al que se unira un anticuerpo. Por ejemplo, un epitopo puede reconocerse por un anticuerpo que define el epitopo. Un epitopo puede ser o bien un “epitopo lineal” (en el que la secuencia primaria de aminoacidos primarios comprende el epitopo; normalmente al menos 3 residuos de aminoacido contiguos, y mas habitualmente, al menos 5, y hasta de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoacidos en una unica secuencia) o bien un “epitopo conformacional” (un epitopo en el que la secuencia primaria de aminoacidos contiguos no es el unico componente de definicion del epitopo). Un epitopo conformacional puede comprender un numero aumentado de aminoacidos con respecto a un epitopo lineal, ya que este epitopo conformacional reconoce una estructura tridimensional del peptido o la proteina. Por ejemplo, cuando una molecula de proteina se pliega para formar una estructura tridimensional, determinados aminoacidos y/o la estructura principal de polipeptido que forma el epitopo conformacional se yuxtaponen, permitiendo que el anticuerpo reconozca el epitopo. Los metodos de determinacion de la conformacion de epitopos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, cristalografia de rayos X, espectroscopia de resonancia magnetica nuclear bidimensional y marcaje de espin dirigido al sitio y espectroscopia de resonancia paramagnetica electronica. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996), cuya divulgacion se incorpora en su totalidad en el presente documento como referencia.
Tal como se usa en el presente documento, la “union especifica” entre dos entidades significa una afinidad de al menos 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1 o 1010 M-1.
Tal como se usa en el presente documento, las “protofibrillas” son agregados protofibrilares que incluyen estructuras esfericas que comprenden peptidos Ap que parecen representar cadenas de las estructuras esfericas que forman estructuras curvilineas.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “aislado” se usa en el presente documento tal como se usa en la tecnica. Concretamente, el estado en el que se encuentran anticuerpos/miembros de union especifica, moleculas de acido nucleico y similares. Los anticuerpos/miembros de union especifica y moleculas de acido nucleico estaran libres o sustancialmente libres de material con el que estan asociados de manera natural tal como otros polipeptidos o acidos nucleicos con los que se encuentran en su entorno natural, o el entorno en el que se preparan (por ejemplo, cultivo celular) cuando tal preparacion se realiza mediante tecnologia de ADN recombinante (puesta en practica in vitro) o in vivo. “Aislado” cubre cualquier forma que contiene el/los componente(s) identificado(s) y caracterizado(s) de la presente descripcion tras la extraccion de ese entorno inicial. Los ejemplos, pero ciertamente no limitaciones, incluyen formulaciones farmaceuticas, formulacion con diluyentes, anticuerpos/miembros de union especifica, moleculas de acido nucleico y partes de las mismas que se han modificado (por ejemplo, glicosilacion de anticuerpos) o bien in vitro o bien in vivo y extraido de ese entorno.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “anticuerpo humano recombinante” representa un subconjunto viable de “anticuerpos” generados mediante diversos medios de tecnologia de ADN recombinante y animales transgenicos no humanos que se conocen bien en la tecnica. Tal metodologia se usa para generar un anticuerpo a partir de uno de los siguientes origenes: (i) un scFv o anticuerpo alternativo aislado a partir de una biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos; (ii) un anticuerpo parcial o completo generado a partir de un vector de expresion respectivo transfectado de manera estable o transitoria en una celula huesped, preferiblemente una celula huesped de mamifero (por ejemplo, subclonando secuencias de nucleotidos que codifican para cadenas de Vh y Vl en un vector de expresion junto con secuencias de nucleotidos de Ch y Cl respectivas, para fomentar la expresion de una forma predeterminada de anticuerpo que muestra especificidad por la forma PF de Ap); y/o (iii) un anticuerpo aislado a partir de un animal transgenico no humano que contiene genes de inmunoglobulina humana, o mediante cualquier otra metodologia que se base en el “mezclado y emparejamiento” recombinante de secuencias de genes de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN con el fin de generar el anticuerpo recombinante humano de interes.
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Se pretende que los terminos “sujeto” o “paciente” incluyan cualquier miembro del filo Chordata, incluyendo, sin limitacion, seres humanos y otros primates, incluyendo primates no humanos tales como chimpances y otros simios y especies de monos; animales de granja tales como ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamiferos domesticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores tales como ratones, ratas y cobayas; aves, incluyendo aves domesticas, salvajes y de caza tales como pollos, pavos y otras aves gallinaceas, patos, gansos y similares.
El termino “tratar” o “tratamiento” de una enfermedad se refiere a implementar un protocolo que puede incluir administrar uno o mas farmacos a un sujeto (humano o de otra especie), en un esfuerzo por aliviar signos o sintomas de la enfermedad. El alivio puede producirse antes de que aparezcan los signos o sintomas de la enfermedad, asi como despues de su aparicion. Por tanto, “tratar” o “tratamiento” incluye “prevenir” o “prevencion” de una enfermedad. En el caso de la enfermedad de Alzheimer, “prevenir” o “prevencion” tambien puede producirse en una situacion en la que un ciclo de tratamiento se administra por adelantado con el fin de prevenir o retrasar la aparicion de los sintomas asociados con la enfermedad de Alzheimer. Ademas, “tratar” o “tratamiento” no requiere un alivio completo de signos o sintomas, no requiere una cura, y especificamente incluye protocolos que solo tienen un efecto positivo marginal sobre el sujeto.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “principio activo” se refiere a un anticuerpo de tipo 13C3 que muestra afinidad y especificidad (por ejemplo, union especifica) por la parte amino-terminal de la estructura de protofibrilla de beta-amiloide.
Tal como se usa en el presente documento, los terminos “cantidad eficaz” o “cantidad farmaceuticamente eficaz” de anticuerpo, tal como se proporcionan en el presente documento, se refieren a una cantidad no toxica, pero suficiente, del principio activo con el fin de proporcionar el resultado biologico deseado. Una cantidad “eficaz” apropiada en cualquier caso individual puede determinarla un experto habitual en la tecnica usando experimentacion de rutina.
Tal como se usa en el presente documento, los terminos “farmaceuticamente aceptable” o “farmacologicamente aceptable” significan un material que puede administrarse a un individuo en un dispositivo de administracion de farmacos junto con el agente biologico formulado sin provocar ningun efecto biologico no deseado o interaccionar de una manera perjudicial con ninguno de los componentes de la composicion en la que esta contenido (por ejemplo, una “composicion farmaceuticamente aceptable”).
Tal como se usa en el presente documento, las expresiones “portador fisiologicamente aceptable” y “portador farmaceuticamente aceptable” que pueden usarse de manera intercambiable se refieren a un portador, diluyente y excipiente que no provoca irritacion significativa a un organismo y no anula la actividad biologica y las propiedades del compuesto administrado. Un adyuvante queda incluido en esas expresiones.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “excipiente” se refiere a una sustancia inerte anadida a una composicion farmaceutica para facilitar adicionalmente la administracion de un principio activo.
El termino “afinidad minima”, tal como se usa en la comparacion de la afinidad de los anticuerpos por la forma protofibrilar del peptido Ap con la afinidad de los anticuerpos por otras formas del peptido Ap, tales como fibrillas, estructuras de lamina y oligomeros y monomeros de bajo peso molecular, indica que la razon de la afinidad por la forma de Ap protofibrilar con respecto a la afinidad por otras formas de Ap es mayor de aproximadamente 2. Preferiblemente, la razon es mayor de aproximadamente 3 o aproximadamente 4 o aproximadamente 5.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 muestra el proceso de fibrilogenesis de Ap, incluyendo la formacion de oligomeros de protofibrillas.
Las figuras 2A-B muestran el proceso de fibrilogenesis de Ap y purificacion de formas de Ap a tiempo 0 (A) y a las 4 horas (B) tal como se indica mediante la absorbancia a IT1UA215 (absorbancia a 215 nm) para volumenes de elucion. A las 4 horas (B), la forma de bajo peso molecular (LMW) eluye como dimero de ~15 kDa mientras que el tamano de forma protofibrilar eluye a ~670 kDa.
Las figuras 3A-B muestran la especificidad de los anticuerpos monoclonales 13C3 (A) y 4G8 (B) por las formas protofibrilar (PF: -♦-) y de bajo peso molecular (LMW: -■-) de Ap, tal como se indica mediante la densidad optica (DO) leida a 450/650 nm para concentraciones crecientes de formas tanto PF como LMW de Ap.
Las figuras 4A-C muestran datos de un ensayo de union de Biacore® que muestran la afinidad de los anticuerpos monoclonales 4G8 (A), 13C3 (B) e IgG1 de control (C) por concentraciones variables de forma de bajo peso molecular (LMW) de Ap de desde 0,25 pg/ml de Ap LMW hasta 4,0 pg/ml Ap LMW.
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Las figuras 5A-B muestran datos que identifican los epitopos reconocidos por los anticuerpos anti-Ap descritos anteriormente. La figura 5A ilustra un analisis por inmunotransferencia de tipo Western por puntos con anticuerpos monoclonales 13C3 (panel superior), ID1 (panel central) y 4G8 (panel inferior) frente a una serie de peptidos de 13 aminoacidos solapantes tal como se describe en el ejemplo 5. La figura 5B ilustra la secuencia de aminoacidos de AP1-42 (SEQ ID NO: 1), asi como los epitopos predichos de los anticuerpos monoclonales 13C3 y 1D1.
La figura 6 muestra la reactividad de los anticuerpos monoclonales 13C3 (-■-) y 4G8 (-♦-) con fracciones de SEC a partir de sobrenadante de 7PA2 que secreta oligomeros de Ap. Las fracciones protofibrilar (PF) y de bajo peso molecular (LMW) se indican en el eje x tal como se mide mediante densidad optica (DO) leida a 450/650.
Las figuras 7A-C muestran microfotografias de microscopia inmunoelectronica de seccion delgada que muestran la afinidad del anticuerpo monoclonal 13C3 por estructuras repetidas en las fibrillas de Ap (B, C). El control de inmuno- EM es IgG1 (A).
Las figuras 8A-B muestran datos de microfotografias electronicas que muestran la reduccion del numero de placas en un raton transgenico TgCRND8 representativo tras la administracion del anticuerpo IgG1 de control (A) en comparacion con la administracion de los anticuerpos monoclonales 13C3 (B).
Las figuras 9A-B muestran que el tratamiento de ratones transgenicos TgCRND8 con anticuerpos monoclonales 13C3 con un regimen de una vez a la semana (A) o dos veces a la semana (B) da como resultado una reduccion de la formacion de placas seniles.
La figura 10 muestra las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de las regiones variables de cadenas ligera y pesada clonadas para AcM 13C3.
La figura 11 muestra que la administracion periferica en dosis unica de 13c3 en ratones transgenicos para APP no conduce a un aumento de Ap en plasma al contrario que la administracion del anticuerpo de referencia 3D6.
La figura 12 muestra que 13C3 reconoce placas neuriticas de amiloide humanas (agregadas) en cerebros con EA, pero no los depositos de Ap difusos al contrario que el anticuerpo anti-Ap 3D6 de referencia.
Descripcion detallada de la invencion
La proteina precursora del amiloide (APP) desempena un papel importante en la patogenesis de la enfermedad de Alzheimer (EA). El procesamiento proteolitico de APP por p y y-secretasas genera peptidos Ap (Ap) cuya longitud oscila normalmente entre 39 y 43 aminoacidos de longitud. La aparicion de la enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la acumulacion de formas oligomericas o agregadas de Ap en el cerebro. Las composiciones inmunologicas de la presente descripcion son utiles en el tratamiento o la prevencion de la enfermedad de Alzheimer, para su uso como reactivos en ensayos de diagnostico, asi como para disenar inhibidores de molecula pequena de la deposicion de amiloide. Los anticuerpos de tipo 13C3 de la presente descripcion pueden administrarse de manera profilactica a la poblacion general de un mamifero, especialmente un ser humano, en una formulacion farmaceuticamente aceptable contemplada en una cantidad y/o un regimen de dosificacion suficiente para eliminar, reducir o retrasar la aparicion de la enfermedad. Los metodos de tratamiento profilactico estan justificados especialmente con individuos que se sabe que corren un riesgo genetico o familiar de desarrollar enfermedad de Alzheimer. Se han identificado numerosos marcadores geneticos de riesgo de enfermedad de Alzheimer, incluyendo, pero sin limitarse a, mutaciones de APP (por ejemplo, la mutacion india (Val717Phe), las mutaciones suecas (Lys670Asn, Met671Leu), la mutacion de Hendricks (Ala692Gly), la mutacion holandesa (Glu693Gln), la mutacion irani (Thr714Ala), la mutacion alemana (Val715A1a) y la mutacion de Florida (Ile716Val), por mencionar unas pocas). Las mutaciones adicionales que pueden indicar un riesgo aumentado de enfermedad de Alzheimer incluyen mutaciones en los genes de presenilina (PS1 y PS2) y ApoE4. La presente descripcion tambien se refiere a intervencion terapeutica mediante composiciones farmaceuticamente aceptables que comprenden un anticuerpo de tipo 13C3 para individuos que parecen actualmente enfermedad de Alzheimer que puede reconocerse a partir de demencia caracteristica, especialmente en presencia de los factores de riesgo descritos anteriormente o que ya padecen tal enfermedad en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los sintomas y complicaciones de la enfermedad de Alzheimer. Pueden usarse metodos de tratamiento o bien profilacticos o bien terapeuticos contemplados en el presente documento para abordar enfermedad de Alzheimer de aparicion temprana o tardia. A la vista de la importancia de las formas oligomericas de Ap en la aparicion de la enfermedad de Alzheimer, la presente descripcion se refiere a un anticuerpo aislado que interacciona especificamente con, y muestra una afinidad medida por, un epitopo conformacional de repeticion de una forma protofibrilar del peptido Ap. El monomero de peptido Ap de tipo natural (Ap42; la forma de 42 aminoacidos) se conoce en la tecnica y se muestra en el presente documento como SEQ ID NO: 1: Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala (SEQ ID NO: 1). Los anticuerpos aislados de la presente descripcion mostraran afinidad por un epitopo conformacional repetido de la forma protofibrilar oligomerica, de mayor peso molecular, del peptido Ap mientras que mostraran una afinidad minima por otras formas del peptido Ap, tales como monomeros y dimeros de bajo peso
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molecular.
La presente descripcion tambien se refiere a un anticuerpo aislado que interacciona con y muestra una afinidad medible por un epftopo conformacional de una forma protofibrilar del peptido Ap, mediante lo cual el epftopo protofibrilar se representa mediante una region que queda al descubierto de una forma protofibrilar de Ap que comprende la parte amino-terminal de una parte que queda al descubierto del peptido Ap.
La presente descripcion se refiere ademas a un anticuerpo aislado que interacciona especfficamente con y muestra una afinidad medible por un epftopo conformacional de una forma protofibrilar del peptido Ap, mediante lo cual el epftopo protofibrilar se representa mediante una region que queda al descubierto de una forma protofibrilar de Ap que comprende los aminoacidos 1-20 (SEQ ID NO: 2) de una parte que queda al descubierto del peptido Ap, de la siguiente manera: Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe (SEQ ID NO: 2).
Tal como se muestra a modo de ejemplo en el presente documento, se han identificado anticuerpos monoclonales de raton que muestran especfficamente afinidad especffica por la forma protofibrilar (PF) del peptido Ap, al tiempo que muestran una afinidad mmima por especies de bajo peso molecular del peptido Ap. La forma dimerica de Ap (~15 kDa) se polimeriza a lo largo del tiempo para formar una forma PF soluble de Ap, con un peso molecular de aproximadamente 670 kDa. Se inmunizaron ratones con este Ap PF de mayor peso molecular. Se examinaron anticuerpos monoclonales para determinar la especificidad por la forma PF de alto peso molecular del peptido Ap al tiempo que muestran una capacidad mmima o ninguna capacidad de unirse a formas de menor peso molecular de Ap. Esta parte de la presente descripcion se muestra a modo de ejemplo mediante el examen, aislamiento y caracterizacion de la serie 13C3 de anticuerpos monoclonales producidos frente a la forma protofibrilar de alto peso molecular de ~670 kDa del peptido Ap (es decir, 13C3, 1D1 y 19A6). Esta serie de anticuerpos monoclonales muestra la especificidad prevista in vitro al tiempo que tambien reduce la formacion de placas asociada con la enfermedad de Alzheimer en un modelo de raton transgenico de enfermedad de Alzheimer. Por tanto, en una realizacion particular de la descripcion, el anticuerpo aislado interacciona especfficamente con y muestra una afinidad medible por un epftopo conformacional de una forma protofibrilar del peptido Ap, mediante lo cual el epftopo protofibrilar se representa mediante una region que queda al descubierto de una forma protofibrilar de Ap que comprende los aminoacidos 4-12 (SEQ ID NO: 3) y 9-20 (SEQ ID NO: 4) de una parte que queda al descubierto del peptido Ap: Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val (SEQ ID NO: 3); Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe (SEQ ID NO: 4).
Una realizacion de la presente descripcion se refiere a un anticuerpo que comprende una region Vh (SEQ ID NO: 7) y/o Vl (SEQ ID NO: 5) tal como se da a conocer para 13C3, para conferir especificidad de tipo 13C3 por la forma PF frente a la LMW del peptido Ap. Una realizacion adicional es un anticuerpo de tipo 13C3 o fragmento biologicamente relevante del mismo que muestra especificidad por la forma PF con respecto a la forma LMW del peptido Ap. Por tanto, la presente descripcion tambien se refiere a mutantes y/ fragmentos biologicamente activos de 13C3, 1D1, 19A6 o un anticuerpo de tipo 13C3, incluyendo, pero sin limitarse necesariamente a, sustituciones de aminoacido (por ejemplo, como una forma dirigida de maduracion por afinidad de las regiones Vh o Vl), deleciones, adiciones, truncamientos amino-terminales y truncamientos carboxi-terminales de manera que estas mutaciones proporcionan una base para un anticuerpo o parte de union de anticuerpo que da como resultado una version similar o mejorada de una protema de union a 13C3, 1D1, 19A6 o anticuerpo de tipo 13C3. Tal como se indica en el presente documento, una realizacion de esta parte de la descripcion se refiere a la region Vh y/o Vl de un anticuerpo de este tipo que comprende la secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ ID NO: 7 y/o SEQ ID NO: 5, respectivamente. La presente descripcion indica la existencia de redundancia de codones lo que puede dar como resultado que diferentes moleculas de ADN expresen un anticuerpo identico o una parte del mismo (por ejemplo, moleculas de acido nucleico alternativas que codifican para un scFv identico o una parte de Vh y/o Vl de una IgG). Para fines de esta memoria descriptiva, una secuencia que porta uno o mas codones sustituidos se definira como una variacion degenerada. Otra fuente de variacion de secuencia puede producirse mediante edicion de ARN. Tal edicion de ARN puede dar como resultado otra forma de redundancia de codones, en la que un cambio en el marco de lectura abierto no da como resultado un residuo de aminoacido alterado en la protema expresada. Tambien se incluyen dentro del alcance de esta descripcion mutaciones o bien en la secuencia de ADN o bien en el anticuerpo traducido que mejoran las propiedades ffsicas finales del anticuerpo expresado. Con este fin, la presente descripcion se refiere a (i) versiones maduradas por afinidad de un 13C3, 1D1, 19A6 o cualquier otro de tales anticuerpos de tipo 13C3, y/o (ii) formas mutadas de 13C3, 1D1, 19A6 o cualquier otro de tales anticuerpos de tipo 13C3, incluyendo, pero sin limitarse a, una o mas mutaciones en las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 tal como se generan mediante metodologfa de maduracion por afinidad conocida y tecnicas de ADN recombinante conocidas para introducir mutaciones especfficas de sitio. Por tanto, los anticuerpos aislados de la presente descripcion son anticuerpos que interaccionan especfficamente con un epftopo conformacional de una forma protofibrilar del peptido Ap. Los anticuerpos aislados de la presente descripcion mostraran afinidad por un epftopo conformacional de este tipo para la forma protofibrilar de mayor peso molecular del peptido Ap mientras que mostraran una afinidad mmima por otras formas del peptido Ap, tales como fibrillas, estructuras de laminas y oligomeros y monomeros de bajo peso molecular.
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La presente descripcion tambien se refiere al anticuerpo monoclonal aislado, 13C3. Esta parte de la descripcion tambien se refiere a un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal, 13C3. Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal 13C3 esta disponible con el n.° de registro ATCC PTA-8830.
La presente descripcion tambien se refiere al anticuerpo monoclonal aislado, 1D1. Esta parte de la descripcion tambien se refiere a un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal, 1D1.
La presente descripcion tambien se refiere al anticuerpo monoclonal aislado, 19A6. Esta parte de la descripcion tambien se refiere a un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal, 19A6.
La presente descripcion tambien se refiere a metodos de examen y seleccion de compuestos que pueden actuar como inhibidor de la formacion de fibrillas y/o placas seniles asociada con la enfermedad de Alzheimer. Tal metodologia comprende usar un anticuerpo con afinidad de tipo 13C3 por la forma PF del peptido Ap en diversos ensayos de interaccion de anticuerpo/peptido/compuesto de prueba con el fin de seleccionar un compuesto que modula el proceso de formacion de fibrillas y/o placas. El compuesto puede ser una molecula organica no proteica o inorganica, un peptido (por ejemplo, como posible vacuna peptidica profilactica o terapeutica), una proteina, ADN (mono o bicatenario) o ARN (tal como ARNip o ARNhc). Resultara evidente tras revisar la divulgacion y las ensenanzas de esta memoria descriptiva que cualquier peptido o molecula pequena que compita eficazmente con un anticuerpo de tipo 13C3 por la union a la forma PF del peptido Ap representa un posible compuesto lider relacionado con el tratamiento profilactico o terapeutico de la enfermedad de Alzheimer. Con este fin, pueden usarse ensayos de interaccion con el fin de un examen de alto rendimiento para identificar compuestos que ocupan o interaccionan con los epitopos de 13C3 de la forma PF del peptido Ap y desplazan al anticuerpo.
Pueden usarse diversos ensayos basados en antigeno/anticuerpo conocidos en la tecnica que incorporan y se basan en un anticuerpo de tipo 13C3 de la presente descripcion como reactivo esencial en el examen para detectar compuestos utiles en el tratamiento profilactico o terapeutico de la enfermedad de Alzheimer (por ejemplo, una molecula inorganica pequena o una vacuna peptidica candidata), incluyendo, pero sin limitarse a, un ensayo ELISA, un radioinmunoensayo, un analisis por inmunotransferencia tipo Western, cualquier ensayo homogeneo que se base en una interaccion biologica detectable que no requiere etapas de separacion o lavado (por ejemplo, vease AlphaScreen de PerkinElmer) y/o tecnologia basada en SPR (por ejemplo, vease BIACore). Los compuestos y/o candidatos de vacuna peptidica identificados mediante el uso de un anticuerpo de tipo 13C3 pueden detectarse mediante una variedad de ensayos. El ensayo puede ser un simple ensayo de tipo “si/no” para determinar si hay un cambio en la capacidad de formar el complejo antigeno/anticuerpo conocido, o puede volverse de naturaleza cuantitativa usando un ensayo tal como un ensayo basado en ELISA, un ensayo homogeneo o un ensayo basado en SPR. Con este fin, la presente descripcion se refiere a cualquier ensayo de este tipo, independientemente de la metodologia conocida empleada, que mide la capacidad de un compuesto de prueba de competir con anticuerpo de tipo 13C3, por un compuesto mimetico peptidico o proteico apropiado de la parte amino-terminal de un epitopo de 13C3 de la forma PF del peptido Ap.
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden usarse como reactivos basicos en varios inmunoensayos diferentes para determinar la presencia de una forma protofibrilar de Ap en una muestra de tejido. De manera general, los anticuerpos pueden emplearse en cualquier tipo de inmunoensayo, ya sea cualitativo o cuantitativo. Esto incluye tanto el ensayo de tipo sandwich de dos sitios como el inmunoensayo de un unico sitio de tipo sin competencia, asi como en ensayos de union de competencia tradicionales. Una realizacion de interes, por su facilidad de deteccion y su naturaleza cuantitativa, es el ensayo de anticuerpos dobles o de tipo sandwich, del que existen varias variaciones, todas las cuales se pretende que queden abarcadas por esta parte de la presente descripcion. Por ejemplo, en un ensayo de tipo sandwich directo tipico, se inmoviliza anticuerpo sin marcar sobre un sustrato solido, por ejemplo, pocillos de placa de microtitulacion, y se pone en contacto la muestra que va a someterse a prueba con la molecula unida. Tras un periodo de incubacion adecuado, durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formacion de un complejo binario antigeno-anticuerpo, entonces se anade un segundo anticuerpo, marcado con una molecula indicadora que puede inducir una senal detectable, y se continua con la incubacion permitiendo un tiempo suficiente para la union con el antigeno en un sitio diferente y la formacion de un complejo ternario antigeno-anticuerpo-anticuerpo marcado. Se elimina mediante lavado cualquier material sin reaccionar, y se determina la presencia del antigeno mediante la observacion de una senal, que puede cuantificarse mediante la comparacion con una muestra de control que contiene cantidades conocidas de antigeno. Las variaciones en el ensayo de tipo sandwich directo incluyen el ensayo simultaneo, en el que tanto la muestra como el anticuerpo se anaden simultaneamente al anticuerpo unido, o un ensayo de tipo sandwich inverso en el que en primer lugar se combinan el anticuerpo marcado y la muestra que va a someterse a prueba, se incuban y se anaden al anticuerpo no marcado unido a la superficie. Estas tecnicas las conocen bien los expertos en la tecnica, y la posibilidad de variaciones menores resultara facilmente evidente. Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el “ensayo de tipo sandwich” abarque todas las variaciones en la tecnica basica de dos sitios.
Para los ensayos de tipo sandwich de la presente descripcion, el unico factor limitante es que ambos anticuerpos tengan especificidades de union diferentes por la forma protofibrilar de Ap. Por tanto, son posibles varias
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combinaciones posibles. Como ejemplo mas especifico, en un ensayo de tipo sandwich directo, se une o bien de manera covalente o bien de manera pasiva un anticuerpo primario a un soporte solido. La superficie solida es habitualmente vidrio o un polimero, siendo los polimeros usados mas habitualmente celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno. Los soportes solidos pueden estar en forma de tubos, perlas, discos o microplacas, o cualquier otra superficie adecuada para llevar a cabo un inmunoensayo. Los procedimientos de union se conocen bien en la tecnica. Tras la union, se lava el complejo fase solida-anticuerpo para prepararlo para la muestra de prueba. Despues se anade una alicuota del liquido corporal que contiene una forma protofibrilar de Ap que va a someterse a prueba al complejo de fase solida y se incuba a 25°C durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la union de cualquier proteina de forma protofibrilar de Ap presente al anticuerpo especifico para la forma protofibrilar de Ap. Entonces se anade el segundo anticuerpo al complejo de fase solida y se incuba a 25°C durante un periodo de tiempo adicional suficiente para permitir que el segundo anticuerpo se una al complejo fase solida con antigeno-anticuerpo primario. El segundo anticuerpo se une a una molecula indicadora, cuya senal visible se usa para indicar la union del segundo anticuerpo a cualquier antigeno en la muestra. Por “molecula indicadora”, tal como se usa en la presente memoria descriptiva, quiere decirse una molecula que, por su naturaleza quimica, proporciona una senal detectable de manera analitica que permite la deteccion de anticuerpo unido a antigeno. La deteccion debe ser al menos relativamente cuantificable, para permitir la determinacion de la cantidad de antigeno en la muestra, esto puede calcularse en terminos absolutos o puede realizarse mediante la comparacion con un patron (o serie de patrones) que contienen un nivel normal conocido de antigeno.
Las moleculas indicadoras usadas mas comunmente en este tipo de ensayo son o bien enzimas o bien fluoroforos. En el caso de un inmunoensayo enzimatico, se conjuga una enzima con el segundo anticuerpo, con frecuencia por medio de glutaraldehido o peryodato. Sin embargo, tal como se reconocera facilmente, existe una amplia variedad de diferentes tecnicas de conjugacion, que conoce bien el experto en la tecnica. Las enzimas usadas comunmente incluyen peroxidasa del rabano, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina, entre otras. Los sustratos que van a usarse con las enzimas especificas se eligen generalmente para la produccion, tras hidrolisis por la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Por ejemplo, el fosfato de p-nitrofenilo es adecuado para su uso con conjugados de fosfatasa alcalina; para conjugados de peroxidasa, habitualmente se usan 1,2- fenilendiamina o toluidina. Tambien es posible emplear sustratos fluorogenicos, que proporcionan un producto fluorescente en vez de los sustratos cromogenicos indicados anteriormente. En todos los casos, se anade el anticuerpo marcado con enzima al complejo primer anticuerpo-proteina protofibrilar de Ap y se deja que se una al complejo, y despues se elimina el reactivo en exceso mediante lavado. Despues se anade una disolucion que contiene el sustrato apropiado al complejo ternario antigeno-anticuerpo-anticuerpo marcado. El sustrato reacciona con la enzima unida al segundo anticuerpo, produciendo una senal visual cualitativa, que puede cuantificarse adicionalmente, de manera espectrofotometrica habitualmente, para proporcionar una evaluacion de la cantidad de antigeno que esta presente en la muestra de suero.
Adicionalmente, pueden acoplarse quimicamente compuestos fluorescentes, tales como fluoresceina o rodamina, a anticuerpos sin alterar su capacidad de union. Cuando se activa mediante iluminacion con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo absorbe la energia luminosa, induciendo un estado de excitabilidad en la molecula, seguido por emision de la luz a una longitud de onda caracteristica mas larga. La emision aparece como un color caracteristico detectable visualmente con un microscopio optico. Como en el inmunoensayo enzimatico (EIA), se deja que el anticuerpo marcado con compuesto fluorescente se una al complejo primer anticuerpo-proteina de forma protofibrilar de Ap. Tras lavar el reactivo no unido, despues se expone el complejo ternario restante a luz de la longitud de onda apropiada, y la fluorescencia observada indica la presencia del antigeno. Tanto las tecnicas de inmunofluorescencia como de EIA estan muy bien establecidas en la tecnica y se prefieren particularmente para el presente metodo. Sin embargo, tambien pueden emplearse otras moleculas indicadoras, tales como radioisotopos, moleculas quimioluminiscentes o bioluminiscentes. Resultara facilmente evidente para el experto en la tecnica como variar el procedimiento para adaptarse al uso requerido.
En otra realizacion, la muestra que va a someterse a prueba (por ejemplo, sangre o liquido cefalorraquideo humano que contiene una forma protofibrilar de Ap) puede usarse en un inmunoensayo de un unico sitio en el que se adhiere a un sustrato solido de manera o bien covalente o bien no covalente. Se pone en contacto un anticuerpo anti- proteina protofibrilar de Ap sin marcar con la muestra unida al sustrato solido. Tras un periodo de incubacion adecuado, durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formacion de un complejo binario antigeno- anticuerpo, entonces se anade un segundo anticuerpo, marcado con una molecula indicadora que puede inducir una senal detectable, y se continua con la incubacion permitiendo un tiempo suficiente para la formacion de un complejo ternario antigeno-anticuerpo-anticuerpo marcado. Para el inmunoensayo de un unico sitio, el segundo anticuerpo puede ser un anticuerpo general (es decir, anticuerpo xenogenico frente a inmunoglobulina, particularmente anti- (IgM e IgG) unido a una molecula indicadora) que puede unirse a un anticuerpo que es especifico para la forma de proteina protofibrilar de Ap de interes.
Un anticuerpo de tipo 13C3 puede adoptar una de numerosas formas conocidas en la tecnica. Los anticuerpos pueden adoptar la forma de cualquier tipo de fragmento de anticuerpo relevante, parte de union de anticuerpo, miembro de union especifica, un compuesto mimetico sintetico no proteico, o cualquier otra terminologia relevante conocida en la tecnica que se refiere a cualquier entidad que conserva al menos sustancialmente la actividad de
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neutralizacion/especificidad de union. Por tanto, se pretende que el termino “anticuerpo” tal como se usa en cualquier contexto dentro de esta memoria descriptiva incluya, pero no se limite a, cualquier miembro de union especifica, clase y/o isotipo de inmunoglobulina (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD, IgE e IgM); y fragmento biologicamente relevante o miembro de union especifica del mismo, incluyendo, pero sin limitarse a, Fab, F(ab’)2, Fv y scFv (cadena sencilla o entidad relacionada). Por tanto, en la tecnica se conoce bien, y solo se incluye como revision, que un “anticuerpo” se refiere a una glicoproteina que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro, o una parte de union a antigeno de las mismas. Una cadena pesada esta compuesta por una region variable de cadena pesada (Vh) y una region constante de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Una cadena ligera esta compuesta por una region variable de cadena ligera (Vl) y una region constante de cadena ligera (Cl). Las regiones variables de cadenas tanto pesada como ligera comprenden regiones de entramado (FWR) y regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las cuatro regiones FWR estan relativamente conservadas mientras que las regiones CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) representan regiones hipervariables y estan dispuestas desde el extremo NH2-terminal hasta el extremo CoOH-terminal de la siguiente manera: FWR1, CDR1, FWR2, CDR2, FWR3, CDR3, FWR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de union que interacciona con un antigeno mientras que, dependiendo del isotipo, la(s) region/regiones constante(s) puede(n) mediar en la union de la inmunoglobulina a factores o tejidos del huesped. Dicho esto, en la definicion basica de “anticuerpo” tambien se incluyen anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, un anticuerpo recombinante, tal como anticuerpos humanos generados a partir de un animal transgenico no humano, asi como anticuerpos seleccionados de bibliotecas usando tecnologias de enriquecimiento disponibles para el experto. Se obtienen fragmentos de anticuerpo usando tecnicas facilmente conocidas por y disponibles para los expertos habituales en la tecnica, tal como se revisa a continuacion. Por tanto, un “anticuerpo” es cualquier entidad o miembro de union especifica de este tipo que se une especificamente al epitopo conformacional de la forma protofibrilar de Ap tal como se describe en el presente documento. Por tanto, el termino “anticuerpo” describe una inmunoglobulina, ya sea natural o producida de manera total o parcialmente sintetica; cualquier polipeptido o proteina que tiene un dominio de union que es, o es sustancialmente homologo a, un dominio de union a anticuerpo. Estos pueden derivarse de fuentes naturales, o pueden producirse de manera parcial o totalmente sintetica. Ejemplos de anticuerpos son los isotipos de inmunoglobulina y sus subclases de isotipo; fragmentos que comprenden un dominio de union a antigeno tales como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd y diacuerpos, tal como se comenta sin limitacion a continuacion. En la tecnica se conoce que es posible manipular anticuerpos monoclonales y otros y usar tecnicas de tecnologia de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moleculas quimericas que conservan la especificidad del anticuerpo original. Tales tecnicas pueden evolucionar introduciendo ADN que codifica para la region variable de inmunoglobulina, o las regiones determinantes de complementariedad (CDR), de un anticuerpo frente a las regiones constantes, o regiones constantes mas regiones de entramado, de una inmunoglobulina diferente. Puede someterse un hibridoma u otra celula que produce un anticuerpo a mutacion genetica o a otros cambios, lo que puede alterar o no la especificidad de union de los anticuerpos producidos. Pueden modificarse anticuerpos de varias maneras, y debe interpretarse que el termino “anticuerpo” cubre cualquier miembro de union especifica o sustancia que tiene un dominio de union con la especificidad requerida. Por tanto, este termino cubre fragmentos de anticuerpo, derivados, equivalentes funcionales y homologos de “anticuerpo” incluyendo cualquier polipeptido que comprende un dominio de union a inmunoglobulina, ya sea natural o total o parcialmente sintetico. Una entidad de este tipo puede ser un fragmento de union abarcado dentro del termino “parte de union a antigeno” o “miembro de union especifica” de un anticuerpo incluyendo, pero sin limitarse a, (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Ch; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un unico brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb, que comprende un domino Vh; (vi) una region determinante de complementariedad (CDR) aislada; (vii) un “scAb”, un fragmento de anticuerpo que contiene Vh y Vl asi como o bien Cl o bien Ch; y (viii) anticuerpos artificiales basados en armazones de proteina, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos de polipeptidos de fibronectina tipo III (por ejemplo, veanse la patente estadounidense n.° 6.703.199, concedida a Koide el 9 de marzo de 2004 y la publicacion de solicitud internacional PCT n.° WO 02/32925). Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, estan codificados por genes independientes, pueden unirse, usando metodos recombinantes, mediante un ligador sintetico que permite que se produzcan como una unica cadena proteica en la que las regiones Vl y Vh se emparejan para formar moleculas monovalentes (conocido como Fv de cadena sencilla (scFv)).
En una realizacion, la region variable ligera (Vl) para los anticuerpos 13C3 o de tipo 13C3 aislados de la presente descripcion puede comprender una secuencia peptidica de 113 aminoacidos (SEQ ID NO: 5) que esta codificada por una secuencia de nucleotidos de 339 pares de bases (SEQ ID NO: 6):
Asp
Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu
Gly
Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Gly Gin Ser Leu Val
His
Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro
Gly
Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe
Ser
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp
Phe
Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val
Tyr
Phe Cys Ser Gin Asn Thr Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly
Gly
Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg (SEQ ID NO: 5 )
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCC ATCTCTTGCAGATCTGGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGG TACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTATACAGTTTCCAACCGATTT TCTGGGGTCCCGGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGTCAGATTTCACACTCAAGATC AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAATACATTTGTTCCT TGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG (SEQ ID NO: 6)
5 En una realizacion adicional, la region variable pesada (Vh) para los anticuerpos 13C3 o de tipo 13C3 aislados de la presente descripcion puede comprender una secuencia peptfdica de 115 aminoacidos (SEQ ID NO: 7) codificada por una secuencia de nucleotidos de 345 pares de bases (SEQ ID NO: 8):
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly
Val Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
Asp Tyr Ala Met His Trp Val Lys Gin Ser His Ala Lys Ser Leu
Glu Trp lie Gly Val lie Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr
Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp
Ser Ala lie Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asp Asp Gly Tyr Ser Trp
Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID NO: 7);
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CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGCCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGTCTCAGTGAAGATT TCCTGCAAGGGTTCCGGCTACACATTCACTGATTATGCTATGCACTGGGTGAAGCAGAGT CATGCAAAGAGTCTAGAGTGGATTGGAGTTATTAGTACTAAGTATGGTAAGACAAACTAC AACCAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCACAATGACTGTTGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAT ATGGAGCTTGCCAGATTGACATCTGAGGATTCTGCCATCTATTACTGTGCAAGAGGGGAC GATGGTTATTCCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:
8) .
En una realizacion adicional, las regiones de entramado, FWR1, FWR2, FWR3 y FWR4, de la cadena de Vl pueden estar compuestas por los aminoacido expuestos en SeQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 15 12, respectivamente, de la siguiente manera:
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Asp
Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu
Gly
Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser ( Sly (SEQ ID NO: 9) ;
Leu
His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu
lie
Tyr (SEC ) ID NO: 10) ;
Asn
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
Gly
Ser Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
Leu
Gly Val Tyr Phe Cys (SEQ ID NO: 11);
Phe
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg (SEQ ID NO: 12).
En una realizacion adicional, las regiones determinantes de complementariedad, CDR1, CDR2 y CDR3, de la cadena de Vl pueden estar compuestas por los aminoacidos expuestos en SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, respectivamente, de la siguiente manera:
Gin Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr (SEQ ID NO: 13);
Thr Val Ser (SEQ ID NO: 14);
Ser Gin Asn Thr Phe Val Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 15).
En una realizacion adicional, las regiones de entramado, FWR1, FWR2, FWR3 y FWR4, de la cadena de Vh pueden estar compuestas por los aminoacidos expuestos en SEQ ID nO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, respectivamente, de la siguiente manera:
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val Ser Val Lys lie Ser Cys Lys (SEQ ID NO: 16);
Met His Trp Val Lys Gin Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp lie Gly Val (SEQ ID NO: 17) ;
Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala lie Tyr Tyr Cys Ala Arg (SEQ ID NO: 18) ;
imagen1
En una realizacion adicional, las regiones determinantes de complementariedad, CDR1, CDR2 y CDR3, de la cadena de Vh pueden estar compuestas por los aminoacidos expuestos en SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, respectivamente, de la siguiente manera:
Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala (SEQ ID NO: 20); lie Ser Thr Lys Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys (SEQ ID NO: 21);
Gly Asp Asp Gly Tyr Ser (SEQ ID NO: 22).
Pueden producirse anticuerpos policlonales o monoclonales para su uso en los metodos de tratamiento dados a conocer mediante tecnicas conocidas. Pueden purificarse anticuerpos murinos (de raton) monoespecificos que muestran especificidad por un epitopo conformacional de una diana de eleccion a partir de antisueros de mamifero que contienen anticuerpos reactivos contra esta region, o pueden prepararse como anticuerpos monoclonales usando la tecnica de Kohler y Milstein (1975, Nature 256: 495-497). Un anticuerpo monoespecifico tal como se usa en el presente documento se define como una unica especie de anticuerpo o multiples especies de anticuerpo con
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caracteristicas de union homogeneas, tales como los anticuerpos monoclonales de raton mostrados a modo de ejemplo en el presente documento con la serie 13C3 de anticuerpos monoclonales. Se producen celulas de hibridoma mezclando los linfocitos esplenicos con una pareja de fusion apropiada, preferiblemente celulas de mieloma, en condiciones que permitiran la formacion de hibridomas estables. Las celulas esplenicas productoras de anticuerpos y celulas de mieloma se fusionan, seleccionan y examinan para determinar la produccion de anticuerpos. Se clonan celulas de hibridoma a partir de pocillos positivos para anticuerpo mediante una tecnica tal como la tecnica de agar blando de MacPherson (1973, Soft Agar Techniques, en Tissue Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson, Eds, Academic Press). Se producen anticuerpos monoclonales in vivo inyectando celulas de hibridoma respectivas en ratones sensibilizados inmaculados, recogiendo el liquido ascitico tras un intervalo de tiempo y se preparan mediante tecnicas bien conocidas en la tecnica.
Ademas de los anticuerpos monoclonales especificos de especie descritos anteriormente, los anticuerpos de la presente descripcion tambien pueden estar en forma de un “anticuerpo quimerico”, un anticuerpo monoclonal construido a partir de las regiones variable derivadas, por ejemplo, de la fuente murina, y regiones constantes derivadas de la fuente de huesped previsto (por ejemplo, ser humano; para una revision, vease Morrison y Oi, 1989, Advances in Immunology, 44: 65-92). Por ejemplo, las secuencias de ADN de cadena ligera y pesada variables (por ejemplo SEQ ID NO: 6 y 8, respectivamente) del anticuerpo de roedor (por ejemplo, de raton) pueden clonarse en un vector de expresion de mamifero. Estos vectores de expresion “quimericos” de cadena ligera y pesada se transfectan conjuntamente en una linea celular receptora y se seleccionan y expanden mediante tecnicas conocidas. Despues puede someterse esta linea celular a tecnicas de cultivo celular conocidas, dando como resultado la produccion tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada de un anticuerpo quimerico. Historicamente se ha mostrado que tales anticuerpos quimericos tienen la capacidad de union a antigeno del anticuerpo monoclonal de roedor original al tiempo que se reducen significativamente los problemas de inmunogenicidad tras la administracion al huesped.
Una mejora logica en el anticuerpo quimerico es el “anticuerpo humanizado”, que reduce supuestamente la probabilidad de que el paciente produzca una respuesta inmunitaria frente a un anticuerpo terapeutico en comparacion con el uso de un anticuerpo monoclonal murino al completo o quimerico . La estrategia de “humanizar” un AcM murino se basa en reemplazar residuos de aminoacido que difieren de los de las secuencias humanas mediante mutagenesis dirigida al sitio de residuos individuales o mediante injerto de regiones determinantes de complementariedad completas (Jones et al., 1986, Nature 321: 522-526). De nuevo, esta tecnologia se conoce ahora bien en la tecnica y se representa mediante numerosas estrategias para mejorar esta tecnologia; en concreto implementando estrategias incluyendo, pero sin limitarse a, “remodelado” (vease Verhoeyen, et al., 1988, Science 239: 1534-1536), “hiperquimerizacion” (vease Queen, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. 88:2869-2873) o “revestimiento” (Mark, et al., 1994, Derivation of Therapeutically Active Humanized and Veneered anti-CD18 Antibodies, Metcalf end Dalton, eds. Cellular Adhesion: Molecular Definition to Therapeutic Potential. Nueva York: Plenum Press, 291-312). Todas estas estrategias implican en cierto grado una comparacion de secuencias entre secuencias de roedor y humana para determinar si resultan apropiadas sustituciones de aminoacido especificas de una secuencia consenso de roedor por humana. Independientemente de las variaciones, el concepto fundamental implicado en la generacion de un anticuerpo humanizado se basa en el injerto de CDR, en el que estos tres sitios de union a antigeno de cadena tanto ligera como pesada se retiran eficazmente del clon de anticuerpo de expresion de roedor y se subclonan (o “injertan”) en un vector de expresion que codifica para la region de entramado del anticuerpo humano. Por ejemplo, usando las tecnicas anteriores puede expresarse un anticuerpo humanizado en el que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera variable se exponen en SEQ ID NO: 13, 14 y 15, respectivamente, y las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada variable se exponen en SEQ ID NO: 20, 21 y 22, respectivamente. Por tanto, un “anticuerpo humanizado” es eficazmente un anticuerpo construido solo con CDR murinas (menos cualquier mejora adicional generada mediante la incorporacion de una o mas de las estrategias mencionadas anteriormente), derivandose el resto de la region variable y la totalidad de la region constante de una fuente humana.
La presente descripcion tambien se refiere a moleculas de acido nucleico aisladas y secuencias de aminoacidos asociadas que estan relacionadas con las regiones Vh y/o Vl del anticuerpo 13C3, y mas especificamente, a una molecula de acido nucleico aislada (polinucleotido) que codifica para una parte biologicamente relevante de 13C3, o version madurada por afinidad o version mutada de otro modo de 13C3, 1D1, 19A6 u otro anticuerpo de tipo 13C3. Estos acidos nucleicos estan sustancialmente libres de otros acidos nucleicos. Para la mayoria de los fines de clonacion, el ADN es un acido nucleico preferido. Estas moleculas de ADN pueden subclonarse en un vector de expresion y transfectarse posteriormente en una celula huesped de eleccion en la que la celula huesped recombinante proporciona una fuente para niveles sustanciales de una parte relevante de 13C3, 1D1, 19A6 o anticuerpo de tipo 13C3, 1D1 o 19A6, o version madurada por afinidad del mismo. Tales procedimientos pueden usarse para una variedad de usos, tales como generar scFv o para coexpresar estas cadenas de Vh y Vl en un sistema de vector de expresion de mamifero que codifica para regiones Ch y Cl humanas de, por ejemplo, un anticuerpo de IgG. La degeneracion del codigo genetico es tal que, para todos salvo dos aminoacidos, hay mas de un unico codon que codifican para un aminoacido particular. Esto permite la construccion de ADN sintetico que codifica para un anticuerpo de la presente descripcion en el que la secuencia de nucleotidos del ADN sintetico difiere significativamente de las secuencias de nucleotidos dadas a conocer en el presente documento, pero todavia codifica para tal anticuerpo. Se pretende que tales ADN sinteticos esten dentro del alcance de la presente
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descripcion. Si se desea expresar tales ADN sinteticos en una celula u organismo huesped particular, el uso de codones de tales ADN sinteticos puede ajustarse para reflejar el uso de codones de ese huesped particular, conduciendo por tanto a mayores niveles de expresion de un anticuerpo de la presente descripcion. Dicho de otro modo, esta redundancia en los diversos codones que codifican para aminoacidos especificos se encuentra dentro del alcance de la presente descripcion. Por tanto, esta descripcion tambien se refiere a aquellas secuencias de ADN que codifican para ARN que comprenden codones alternativos que codifican para la eventual traduccion del aminoacido identico, tal como se muestra a continuacion: A = Ala = alanina: codones GCA, GCC, GCG, GCU; C = Cys = cisteina: codones UGC, UGU; D = Asp = acido aspartico: codones GAC, GAU E = Glu = acido glutamico: codones GAA, GAG; F = Phe = fenilalanina: codones UUC, UUU; G = Gly = glicina: codones GGA, GGC, GGG, GGU; H = His = histidina: codones CAC, CAU; I = Ile = isoleucina: codones AUA, AUC; AUU; K = Lys = lisina: codones AAA, AAG; L = Leu = leucina: codones UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU; M = Met = metionina: codon AUG; N = Asp = asparagina: codones GAU, GAC; P = Pro = prolina: codones CCA, CCC, CCG, CCU; Q = Gln = glutamina: codones CAA, CAG; R = Arg = arginina: codones AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU; S = Ser = serina: codones AGC, AGU, UCA, UcC, UCG, UCU; T = Thr = treonina: codones AcA, AcC, ACG, ACU; V = Val = valina: codones GUA, GUC, GUG, GuU; W = Trp = triptofano: codon UGG; Y = Tyr = tirosina: codones UAC, UAU. Tales vectores de expresion recombinantes pueden transfectarse entonces de manera estable o transitoria en una linea celular apropiada para la generacion de una forma de anticuerpo alternativa.
La presente descripcion constata la existencia de la redundancia de codones que puede dar como resultado diferentes moleculas de ADN que expresan un anticuerpo identico o una parte del mismo (por ejemplo, moleculas de acido nucleico alternativas que codifican para una parte de scFv o de Vh y/o Vl identica de una IgG). Para los fines de esta memoria descriptiva, una secuencia que porta uno o mas codones sustituidos se definira como una variacion degenerada. Otra fuente de variacion de secuencia puede producirse mediante edicion de ARN. Tal edicion de ARN puede dar como resultado otra forma de redundancia de codones, en la que un cambio en el marco de lectura abierto no da como resultado un residuo de aminoacido alterado en la proteina expresada. Tambien se incluyen dentro del alcance de esta descripcion mutaciones o bien en la secuencia de ADN o bien en el anticuerpo traducido que mejoran las propiedades fisicas finales del anticuerpo expresado. Con este fin, la presente descripcion se refiere a (i) versiones maduradas por afinidad de un anticuerpo de tipo 13C3, incluyendo, pero sin limitarse a, 13C3, 19A6 y 1D1, y/o (ii) formas mutadas de un anticuerpo de tipo 13C3, incluyendo, pero sin limitarse a, 13C3, 19A6 y/o 1D1, incluyendo, pero sin limitarse a, una o mas mutaciones en las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 tal como se generan mediante metodologia de maduracion por afinidad conocida y tecnicas de ADN recombinante conocidas para introducir mutacion especifica de sitio. Tales moleculas de acido nucleico aisladas o purificadas representaran las partes de Vh y/o Vl de un anticuerpo de tipo 13C3. Estos acidos nucleicos estan sustancialmente libres de otros acidos nucleicos. Para la mayoria de los fines de clonacion, el ADN es un acido nucleico preferido. Estas moleculas de ADN pueden subclonarse en un vector de expresion y posteriormente transfectarse en una celula huesped de eleccion en la que la celula huesped recombinante proporciona una fuente para niveles sustanciales de una parte relevante de un anticuerpo de tipo 13C3, o version madurada por afinidad del mismo. Tales procedimientos pueden usarse para una variedad de usos, tales como generar scFv o para coexpresar estas cadenas de Vh y Vl en un sistema de vector de expresion de mamifero que codifica para regiones Ch y Cl humanas de, por ejemplo, un anticuerpo de IgG.
La presente descripcion tambien se refiere a vectores recombinantes y huespedes recombinantes, tanto procariotas como eucariotas, que contienen moleculas de acido nucleico que codifican para las regiones pesada y/o ligera respectivas de un anticuerpo de tipo 13C3. Estas moleculas de acido nucleico, en su totalidad o en parte, pueden estar unidas a otras moleculas de ADN (es decir, moleculas de ADN que abarcan genes de inmunoglobulina usados para la generacion de una anticuerpo humano recombinante) que no estan unidas de manera natural, para formar “moleculas de ADN recombinante” que codifican para un anticuerpo recombinante humano respectivo. Estos vectores pueden estar compuestos por ADN o ARN. Para la mayoria de los fines de clonacion se prefieren vectores de ADN. Los vectores tipicos incluyen plasmidos, virus modificados, bacteriofago, cosmidos, cromosomas artificiales de levadura y otras formas de ADN episomico o integrado. Se encuentra dentro del alcance del experto en la tecnica determinar un vector apropiado para una transferencia genica, generacion de un anticuerpo humano recombinante u otro uso particular. Se conocen bien metodos de subclonar moleculas de acido nucleico de interes en vectores de expresion, transformar o transfectar celulas huesped que contienen los vectores, y metodos de producir proteina sustancialmente pura que comprenden las etapas de introducir el vector de expresion respectivo en una celula huesped, y cultivar la celula huesped en condiciones apropiadas. El anticuerpo (tal como un anticuerpo humano recombinante de IgG) asi producido puede recogerse de las celulas huesped de maneras convencionales. Puede usarse cualquier vector de expresion conocido para poner en practica esta parte de la descripcion, incluyendo cualquier vector que contiene un promotor adecuado y otros elementos reguladores de la transcripcion apropiados. El constructo de expresion resultante se transfiere a una celula huesped procariota o eucariota para producir proteina recombinante. En el presente documento se definen vectores de expresion como secuencias de ADN que se requieren para la transcripcion de ADN clonado y la traduccion de sus ARNm en un huesped apropiado. Tales vectores pueden usarse para expresar ADN eucariota en una variedad de huespedes tales como bacterias, cianobacterias, celulas vegetales, celulas de insectos y celulas animales. Vectores disenados especificamente permiten el transporte de ADN entre huespedes tales como celulas bacterianas-de levadura o bacterianas-de animales. Un vector de expresion construido de manera apropiada debe contener: un origen de replicacion para la replicacion autonoma en celulas huesped, marcadores seleccionables, un numero limitado de sitios de enzimas de
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restriccion utiles, una posibilidad de un alto numero de copias y promotores activos. Un promotor se define como una secuencia de ADN que dirige la ARN polimerasa para que se una a ADN e inicie la sintesis de ARN. Un promotor fuerte es uno que provoca que se inicien ARNm a alta frecuencia. Pueden encontrarse tecnicas para tales manipulaciones descritas en Sambrook, et al. (1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York), se conocen bien y estan disponibles para el experto habitual en la tecnica. Los vectores de expresion pueden incluir, pero no se limitan a, vectores de clonacion, vectores de clonacion modificados, virus o plasmidos disenados especificamente. Los vectores de expresion de mamiferos disponibles comercialmente que pueden ser adecuados incluyen, pero no se limitan a, pcDNA3.neo (Invitrogen), pcDNA3.1 (Invitrogen), pCI-neo (Promega), pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 y pLlTMUS39 (New England Bioloabs), pcDNAI, pcDNAIanp (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) y 1ZD35 (ATCC 37565). Ademas, esta disponible una variedad de vectores de expresion bacterianos, incluyendo, pero sin limitarse a, pCR2.1 (Invitrogen), pET1 la (Novagen), lambda gtl 1 (Invitrogen) y pKK223-3 (Pharmacia). Ademas, puede usarse una variedad de vectores de expresion de celulas fungicas, incluyendo, pero sin limitarse a, pYES2 (Invitrogen) y vector de expresion Pichie (Invitrogen). Ademas, puede usarse una variedad de vectores de expresion de celulas de insectos, incluyendo, pero sin limitarse a, pBlueBacIII y pBlueBacHis2 (Invitrogen) y pAcG2T (Pharmingen).
Las celulas huesped recombinantes pueden ser procariotas o eucariotas, incluyendo, pero sin limitarse a, bacterias tales como E. coli, celulas fungicas tales como levaduras, celulas de mamiferos incluyendo, pero sin limitarse a, lineas celulares de origen bovino, porcino, de mono y de roedor; y celulas de insectos. Las especies de mamiferos que pueden ser adecuadas, incluyen, pero no se limitan a, celulas L L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), celulas L L-M (ATCC CCL 1.2), Saos-2 (ATCC HTB-85), 293 (ATCC CRL1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-l (ATCC CRL 1650), COS-7(ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-l (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171) y CPAE (ATCC CCL 209).
Aun otra mejora con respecto a anticuerpos vueltos a modificar por ingenieria genetica tal como se reviso anteriormente es la generacion de anticuerpos monoclonales totalmente humanos. Lo primero implica el uso de cepas de raton modificadas por ingenieria genetica que presentan un sistema inmunitario mediante el cual se han inactivado los genes de anticuerpos de raton y se han reemplazado a su vez por un repertorio de genes de anticuerpos humanos funcionales, mientras que se dejan inalterados otros componentes del sistema inmunitario de raton. Tales ratones modificados por ingenieria genetica permiten los procesos naturales de respuesta inmunitaria in vivo y maduracion por afinidad lo que da como resultado anticuerpos monoclonales totalmente humanos de alta afinidad. De nuevo, ahora se conoce bien esta tecnologia en la tecnica y se detalla completamente en diversas publicaciones, incluyendo, pero sin limitarse a, las patentes estadounidenses n.os 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y miembros de la familia relacionados (cedidas a Abgenix, que dan a conocer su tecnologia de XenoMouse); asi como las patentes estadounidenses n.os 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429 (cedidas a GenPharm International y disponibles a traves de Medarex, dentro del titulo global de “UltraMab Human Antibody Development System”). Vease tambien una revision de Kellerman y Green (2002, Curr. Opinion in Biotechnology 13: 593-597).
Finalmente, hay tecnicas disponibles para el experto para la seleccion de fragmentos de anticuerpo a partir de bibliotecas usando tecnologias de enriquecimiento, incluyendo, pero sin limitarse a, presentacion en fagos, presentacion en ribosoma (Hanes y Pluckthun, 1997, Proc. Nat. Acad. Sci. 94: 4937-4942), presentacion bacteriana (Georgiou, et al., 1997, Nature Biotechnology 15: 29-34) y/o presentacion en levaduras (Kieke, et al., 1997, Protein Engineering 10: 1303-1310) que pueden usarse como alternativas a tecnologias comentadas anteriormente para seleccionar anticuerpos de cadena sencilla que se unen especificamente a una citocina diana. Se seleccionan anticuerpos de cadena sencilla a partir de una biblioteca de anticuerpos de cadena sencilla producidos directamente usando tecnologia de fagos filamentosos. En la tecnica se conoce la tecnologia de presentacion en fagos (por ejemplo, vease la tecnologia de Cambridge Antibody Technology (CAT)) tal como se da a conocer en las patentes estadounidenses n.os 5.565.332; 5.733.743; 5.871.907; 5.872.215; 5.885.793; 5.962.255; 6.140.471; 6.225.447; 6.291.650; 6.492.160; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915; 6.593.081, asi como otros miembros de la familia estadounidenses, o solicitudes que se basan en la presentacion de prioridad GB 9206318, presentada el 24 de mayo de 1992; vease tambien Vaughn, et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 309-314. Tambien pueden disenarse y construirse anticuerpos de cadena sencilla usando tecnologia de ADN recombinante disponible, tal como un metodo de amplificacion de ADN (por ejemplo, PCR), o posiblemente usando un ADNc de hibridoma respectivo como molde. Los anticuerpos de cadena sencilla pueden ser mono o biespecificos; bivalentes o tetravalentes. Puede construirse una secuencia de nucleotidos que codifica para un anticuerpo de cadena sencilla usando sintesis de nucleotidos manual o automatizada, clonarse en un constructo de expresion usando metodos de ADN recombinante convencionales, e introducirse en una celula para expresar la secuencia codificante, tal como se describe a continuacion.
La presente descripcion se refiere ademas a una composicion farmaceutica basada en anticuerpo que comprende una cantidad eficaz un anticuerpo de tipo 13C3, o una version madurada por afinidad, que proporciona una opcion
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de tratamiento profilactico o terapeutico para inhibir la formacion de fibrilla y/o placas seniles asociada con la enfermedad de Alzheimer. La composicion farmaceutica basada en anticuerpo de la presente descripcion puede formularse mediante cualquiera de varias estrategias conocidas en la tecnica (por ejemplo, vease McGoff y Scher, 2000, Solution Formulation of Proteins/Peptides: En McNally, E.J., ed. Protein Formulation and Delivery. Nueva York, NY: Marcel Dekker; pags. 139-158; Akers y Defilippis, 2000, Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. En: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Filadelfia, PA: Talyor y Francis; pags. 145-177; Akers, et al., 2002, Pharm. Biotechnol. 14:47-127). Una composicion farmaceuticamente aceptable adecuada para la administracion a pacientes contendra una cantidad eficaz del anticuerpo en una formulacion que conserva la actividad biologica al tiempo que tambien fomenta una estabilidad maxima durante el almacenamiento dentro de un intervalo de temperatura aceptable. Las composiciones farmaceuticas tambien pueden incluir, dependiendo de la formulacion deseada, diluyentes farmaceuticamente aceptables, portadores farmaceuticamente aceptables y/o excipientes farmaceuticamente aceptables, o cualquier vehiculo de este tipo usado comunmente para formular composiciones farmaceuticas para la administracion a animales o seres humanos. El diluyente se selecciona de modo que no afecte a la actividad biologica de la combinacion. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solucion salina fisiologica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer, disolucion de dextrosa y solucion de Hank. La cantidad de un excipiente que es util en la formulacion o composicion farmaceutica de esta descripcion es una cantidad que sirve para distribuir uniformemente el anticuerpo a lo largo de la composicion de modo que puede dispersarse uniformemente cuando va a administrarse a un sujeto que lo necesita. Puede servir para diluir el anticuerpo hasta una concentracion que proporciona los resultados paliativos o curativos beneficiosos deseados mientras que al mismo tiempo minimiza cualquier efecto secundario adverso que puede producirse debido a una concentracion demasiado alta. Tambien puede tener un efecto conservante. Por tanto, para el anticuerpo que tiene una alta actividad fisiologica, se empleara mas cantidad del excipiente. Por otro lado, para cualquier principio activo que muestra una menor actividad fisiologica, se empleara una cantidad menor del excipiente. En general, la cantidad de excipiente en la composicion sera de entre aproximadamente el 50% en peso (p) y el 99,9% p de la composicion total. Si el anticuerpo muestra una actividad fisiologica particularmente baja, la cantidad de excipiente puede ser de tan solo el 1% p. Por otro lado, para un anticuerpo que tiene una actividad fisiologica particularmente alta, la cantidad de excipiente puede ser de entre aproximadamente el 98,0% y aproximadamente el 99,9% p. Ademas, el anticuerpo o los anticuerpos pueden administrarse en forma de un “derivado quimico” (una molecula que contiene restos quimicos adicionales que no forman parte normalmente de la molecula de base). Tales restos pueden mejorar la solubilidad, semivida, absorcion, etc. del agente biologico. Alternativamente, estos restos pueden atenuar los efectos secundarios no deseados del anticuerpo. Las composiciones farmaceuticas tambien pueden incluir grandes macromoleculas metabolizadas lentamente, tales como proteinas, polisacaridos, poli(acidos lacticos), poli(acidos glicolicos) y copolimeros (tales como Sepharose, agarosa, celulosa y similares funcionalizadas con latex), aminoacidos polimericos, copolimeros de aminoacidos y agregados lipidicos (tales como liposomas o gotitas de aceite). Adicionalmente, estos portadores pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes (es decir, adyuvantes). Para la administracion parenteral, pueden administrarse agentes de la descripcion como dosificaciones inyectables de una disolucion o suspension de la sustancia en un diluyente fisiologicamente aceptable con un portador farmaceutico que puede ser un liquido esteril tal como agua, aceites, solucion salina, glicerol o etanol. Adicionalmente, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias de tamponamiento del pH y similares en las composiciones. Otros componentes de las composiciones farmaceuticas son los de origen del petroleo, animal, vegetal o sintetico, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja y aceite mineral. En general, glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son portadores liquidos preferidos, particularmente para disoluciones inyectables.
La formulacion de anticuerpo puede estar en forma liquida o forma solida. Generalmente, una formulacion solida esta liofilizada y se pone en disolucion antes de la administracion para dosificacion o bien individual o bien multiple. Las formulaciones no deben exponerse a temperatura o pH extremos para evitar la desnaturalizacion termica. Por tanto, resulta esencial formular una composicion de anticuerpo de la presente descripcion dentro de un intervalo de pH biologicamente relevante. Se recomienda una disolucion tamponada para mantener un intervalo de pH apropiado durante el almacenamiento, especialmente para formulaciones liquidas almacenadas durante periodos de tiempo mas prolongados entre la formulacion y la administracion. Hasta la fecha, tanto las formulaciones liquidas como las solidas requieren almacenamiento a menores temperaturas (habitualmente de 2-8°C) con el fin de conservar la estabilidad durante periodos mas prolongados. Las composiciones de anticuerpo formuladas, especialmente formulaciones liquidas, pueden contener un agente bacteriostatico para prevenir o minimizar la proteolisis durante el almacenamiento, incluyendo, pero sin limitarse a, concentraciones eficaces (habitualmente <1% p/v) de alcohol bencilico, fenol, m-cresol, clorobutanol, metilparabeno y/o propilparabeno. Un agente bacteriostatico puede estar contraindicado para algunos pacientes. Por tanto, puede reconstituirse una formulacion liofilizada para dar una disolucion que o bien contiene o bien no contiene un componente de este tipo. Pueden anadirse componentes adicionales a una formulacion de anticuerpo o bien solida o bien liquida tamponada, incluyendo, pero sin limitarse a, azucares como crioprotector (incluyendo, pero sin limitarse necesariamente a, polihidroxihidrocarburos tales como sorbitol, manitol, glicerol y dulcitol y/o disacaridos tales como sacarosa, lactosa, maltosa o trehalosa) y, en algunos casos, una sal relevante (incluyendo, pero sin limitarse a, NaCl, KCl o LiCl). Tales formulaciones de anticuerpo, especialmente formulaciones liquidas destinadas al almacenamiento a largo plazo, se basaran en un intervalo util de osmolaridad total para fomentar la estabilidad a largo plazo a una temperatura de 2-8°C o mayor, al tiempo que tambien se hace que la formulacion sea util para la inyeccion parenteral. Un intervalo eficaz de osmolaridad total (el numero total de moleculas en disolucion) es de desde aproximadamente 200 mOs/l hasta aproximadamente
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800 mOs/l. Resultara evidente que la cantidad de un crioprotector, tal como sacarosa o sorbitol, dependera de la cantidad de sal en la formulacion con el fin de que la osmolaridad total de la disolucion permanezca dentro de un intervalo apropiado. Por tanto, una formulacion libre de sal puede contener desde aproximadamente el 5% hasta aproximadamente el 25% de sacarosa, con un intervalo preferido de sacarosa de desde aproximadamente el 7% hasta aproximadamente el 15%, siendo una concentracion especialmente preferida de sacarosa en una formulacion libre de sal de desde el 10% hasta el 12%. Alternativamente, una formulacion a base de sorbitol libre de sal puede contener sorbitol dentro de un intervalo de desde aproximadamente el 3% hasta aproximadamente el 12%, con un intervalo preferido de desde aproximadamente el 4% hasta el 7%, y un intervalo especialmente preferido es de desde aproximadamente el 5% hasta aproximadamente el 6% de sorbitol en una formulacion libre de sal. Evidentemente, las formulaciones libres de sal justificaran intervalos aumentados del crioprotector respectivo con el fin de mantener niveles de osmolaridad eficaces. Estas formulaciones tambien pueden contener un cation divalente (incluyendo, pero sin limitarse necesariamente a, MgCl2, CaCl2 y MnCb); y un tensioactivo no ionico (incluyendo, pero sin limitarse necesariamente a, polisorbato-80 (Tween 80®), polisorbato-60 (Tween 60®), polisorbato-40 (Tween 40®) y polisorbato-20 (Tween 20®), alquil eteres de polioxietileno incluyendo, pero sin limitarse a, Brij 58®, Brij 35®, asi como otros tales como Triton X-100®, Triton X 114®, NP40®, Span 85 y la serie Pluronic de tensioactivos no ionicos (por ejemplo, Pluronic 121)). Cualquier combinacion de tales componentes, incluyendo la probable inclusion de un agente bacteriostatico, puede ser util para cumplir con las formulaciones que contienen anticuerpo de la presente descripcion. La composicion de anticuerpo de la presente descripcion tambien puede ser un “derivado quimico”, que describe un anticuerpo que contiene restos quimicos adicionales que no forman parte normalmente de la molecula de inmunoglobulina (por ejemplo, pegilacion). Tales restos pueden mejorar la solubilidad, semivida, absorcion, etc. de la molecula de base. Alternativamente, los restos pueden atenuar efectos secundarios no deseados de la molecula de base o reducir la toxicidad de la molecula de base.
En la tecnica se conocen numerosos ejemplos de diversos portadores, diluyentes, excipientes y similares y se dan a conocer en referencias citadas en el presente documento, asi como Remington’s Pharmaceutical Sciences (18s ed.; Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990), cuyo contenido se incorpora en el presente documento como referencia. En resumen, se apreciara que pueden incorporarse portadores, excipientes y otros agentes adecuados para formular las composiciones farmaceuticas para proporcionar una transferencia, administracion, tolerancia y similares mejoradas. Los metodos de incorporar el agente biologico y/o principio(s) activo(s) adicional(es) en el portador los conoce un experto habitual en la tecnica y dependen de la naturaleza del agente biologico y la naturaleza del portador seleccionado por una persona que pone en practica la presente descripcion. La union ionica, encapsulacion en gel o atrapamiento fisico dentro del portador, iontoforesis y empapamiento del portador en una disolucion del agente biologico, son ejemplos adecuados contemplados en la formulacion de una composicion farmaceutica que va a usarse para poner en practica los metodos de tratamiento dados a conocer. Alternativamente, el portador puede ser poco mas que un diluyente para el agente biologico. Estas formulaciones pueden incluir, por ejemplo, polvos, pastas, unguentos, gelatina, ceras, aceites, lipidos, bases de absorcion anhidras, emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de una variedad de pesos moleculares), geles semisolidos y mezclas semisolidas que contienen Carbowax. El regimen de dosificacion usando los compuestos de la presente descripcion se selecciona segun una variedad de factores incluyendo tipo, especie, edad, peso, sexo y estado medico del paciente; la gravedad del estado que va a tratarse; la via de administracion; la funcion renal, hepatica y cardiovascular del paciente; y el agente biologico particular del mismo empleado. Un medico o veterinario con experiencia habitual puede determinar y prescribir facilmente la cantidad eficaz del farmaco requerida para prevenir, contrarrestar o detener la progresion del estado. La precision optima en alcanzar concentraciones de farmaco dentro del intervalo que proporciona eficacia sin toxicidad requiere un regimen basado en la cinetica de la disponibilidad del farmaco en sitios diana. Esto implica tener en cuenta la distribucion, el equilibrio y la eliminacion de un farmaco. Cualquiera de las formulaciones anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias segun la presente descripcion, siempre que el principio activo en la formulacion no se inactive por la formulacion y la formulacion sea fisiologicamente compatible.
Las composiciones farmaceuticas de la presente descripcion pueden administrarse al huesped mediante cualquier manera, estrategia y/o combinacion disponible en la tecnica en cantidades suficientes para ofrecer un tratamiento terapeutico frente a la enfermedad de Alzheimer. Estas composiciones pueden proporcionarse al individuo por una variedad de vias conocidas en la tecnica, especialmente vias parenterales, incluyendo, pero sin limitarse de ningun modo a, las vias parenterales tales como administracion intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.); o subcutanea (s.c.), siendo la administracion i.v. la norma dentro de la tecnica de la administracion de anticuerpos terapeuticos. Estas composiciones pueden administrarse como dosis independientes o multiples (es decir, administracion del anticuerpo en momentos escalonados manteniendo las condiciones esteriles de la formulacion a lo largo del regimen de tratamiento). El regimen de dosificacion usando los compuestos de la presente descripcion se selecciona segun una variedad de factores incluyendo tipo, especie, edad, peso, sexo y estado medico del paciente (tal como un paciente humano); la gravedad del estado que va a tratarse; la via de administracion; la funcion renal, hepatica y cardiovascular del paciente; y el anticuerpo particular del mismo empleado. Un medico o veterinario con experiencia habitual puede determinar y prescribir facilmente la cantidad terapeutica eficaz del anticuerpo. La precision optima en alcanzar concentraciones de anticuerpo dentro del intervalo que proporciona eficacia sin toxicidad requiere un regimen basado en la cinetica de la disponibilidad del farmaco en sitios diana. Esto implica tener en cuenta la distribucion, el equilibrio y la eliminacion de un farmaco. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden usarse solos a dosificaciones apropiadas. Alternativamente, puede ser deseable la administracion conjunta o la
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administracion secuencial de otros agentes. Sera posible presentar un regimen de dosificacion terapeutico para los anticuerpos de la presente descripcion junto con la administracion de regfmenes profilacticos o terapeuticos alternativos. Un regimen de dosificacion eficaz variara dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administracion, sitio diana, estado fisiologico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profilactico o terapeutico. Para la administracion de un anticuerpo de tipo 13C3, la dosificacion oscila entre aproximadamente 0,0001 y 100 mg/kg, y mas habitualmente entre 0,01 y 5 mg/kg del peso corporal del huesped. En el caso de la enfermedad de Alzheimer, se producen depositos de amiloide en el cerebro, tambien pueden administrarse agentes de la descripcion junto con otros agentes que aumentan el paso de los agentes de la descripcion a traves de la barrera hematoencefalica.
Otro aspecto referente a regfmenes de dosificacion y administracion para una composicion de anticuerpo de tipo 13C3 de la presente descripcion se refiere a la administracion de farmaco a traves de vfas parenterales, que pueden incluir dispositivos no inyectables e inyectables. Normalmente, las composiciones inyectables se preparan como disoluciones o suspensiones lfquidas; tambien pueden prepararse formas solidas adecuadas para su disolucion, o suspension, en vehfculos lfquidos antes de la inyeccion. La preparacion tambien puede emulsionarse o encapsularse en liposomas o micropartfculas tales como polilactida, poliglicolida, o copolfmero para un efecto adyuvante potenciado, tal como se comento anteriormente (vease Langer, 1990, Science 249: 1527-1523; y Hanes, 1997, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119). Los agentes de esta descripcion pueden administrarse en forma de una preparacion de implante o inyeccion de deposito que puede formularse de tal manera que se permite una liberacion sostenida o pulsatil del principio activo.
Las realizaciones especfficas incluyen microesferas de PLGA, tal como se comenta en el presente documento y tal como se conoce adicionalmente en la tecnica, asf como vehfculos no degradables a base de polfmero que comprenden poli(etileno-co-acetato de vinilo) (PEVAc). Adicionalmente, se revisa la liberacion controlada y administracion localizada de productos terapeuticos basados en anticuerpo en Grainger, et al., 2004, Expert Opin. Biol. Ther. 4(7): 1029-1044, incorporado en el presente documento como referencia en su totalidad. Las microcapsulas adecuadas que pueden encapsular el anticuerpo tambien pueden incluir microcapsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcapsulas de poli(metacrilato de metilo) preparadas mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial. Vease la publicacion PCT WO 99/24061 titulada “Method for Producing IGF-1 Sustained-Release Formulations”, en la que se encapsula una protefna en microesferas de PLGA, incorporandose esta referencia en el presente documento como referencia en su totalidad. Ademas, tambien pueden usarse microemulsiones o sistemas de administracion de farmacos coloidales tales como liposomas y microesferas de albumina. Otras composiciones de liberacion sostenida preferidas emplean un bioadhesivo para retener el anticuerpo en el sitio de administracion. Tal como se indico anteriormente, la formulacion de liberacion sostenida puede comprender un polfmero biodegradable en el que se dispone el anticuerpo, lo que puede proporcionar una liberacion no inmediata. Pueden describirse dispositivos no inyectables en el presente documento como “implante”, “implante de deposito farmaceutico”, “implante de deposito”, “deposito no inyectable” o algun termino similar de este tipo. Los implantes de deposito comunes pueden incluir, pero no se limitan a, dispositivos de polfmeros solidos biodegradables y no biodegradables (tales como un dispositivo de polfmero extendido o en forma de vastago coaxial), asf como numerosos sistemas de bombeo tambien conocidos en la tecnica. Los dispositivos inyectables se dividen en inyecciones en bolo (liberacion y disipacion del farmaco tras la inyeccion), e inyecciones de repositorio o deposito, que proporcionan un deposito de almacenamiento en el sitio de inyeccion, permitiendo la liberacion sostenida del agente biologico a lo largo del tiempo. Un implante de deposito puede anclarse quirurgicamente al punto de administracion para proporcionar un deposito adecuado para la liberacion prolongada del anticuerpo a lo largo del tiempo. Un dispositivo de este tipo podra portar la formulacion de farmaco en cantidades tales como se requieran de manera terapeutica o profilactica para el tratamiento a lo largo del periodo preseleccionado. El implante de deposito tambien puede proporcionar proteccion a la formulacion frente a la degradacion mediante procesos corporales (tales como proteasas) en la duracion del tratamiento. Tal como se conoce en la tecnica, el termino “liberacion sostenida” se refiere a la liberacion gradual (continua o discontinua) de un agente de este tipo a partir de la matriz de polfmero en bloque a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. Independientemente del dispositivo especffico, la liberacion sostenida de la composicion de anticuerpo de tipo 13C3 dara como resultado concentraciones locales, biologicamente eficaces del anticuerpo. Una liberacion sostenida del/de los agente(s) biologico(s) se producira durante un periodo de un unico dfa, varios dfas, una semana o mas; pero lo mas probablemente durante un mes o mas, o hasta aproximadamente seis meses, dependiendo de la formulacion. Los polfmeros naturales o sinteticos conocidos en la tecnica seran utiles como implante de deposito debido a caracterfsticas tales como cinetica de degradacion versatil, seguridad y biocompatibilidad. Estos copolfmeros pueden manipularse para modificar la farmacocinetica del principio activo, proteger al agente frente al ataque enzimatico, asf como a degradarse a lo largo del tiempo en el sitio de union o inyeccion. El experto entendera que existen extensas ensenanzas en la tecnica para manipular las propiedades de estos copolfmeros, incluyendo los procedimientos de produccion respectivos, catalizadores usados y peso molecular final de la inyeccion de deposito o el implante de deposito de liberacion sostenida. Los polfmeros naturales incluyen, pero no se limitan a, protefnas (por ejemplo, colageno, albumina o gelatina); polisacaridos (celulosa, almidon, alginatos, quitina, quitosano, ciclodextrina, dextrano, acido hialuronico) y lfpidos. Los polfmeros sinteticos biodegradables pueden incluir, pero no se limitan a, diversos poliesteres, copolfmeros de acido L-glutamico y L-glutamato de gamma-etilo (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22:547-556), polilactidas ([PLA]; patente estadounidense n.° 3.773.919 y documento EP 058.481), polilactato-poliglicolato (PLGA) tal como polilactida-co-glicolida (veanse, por ejemplo, las patentes
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estadounidenses n.os 4.767.628 y 5.654.008), poliglicolida (PG), conjugados de polietilenglicol (PEG) de poli(a- hidroxiacidos), poliortoesteres, poliaspirinas, polifosfagenos, vinilpirrolidona, poli(alcohol vinilico) (PVA), PVA-g- PLGA, copolimero de PEGT-PBT (Polyactive), metacrilatos, poli(N-isopropilacrilamida), PEO-PPO-PEo (Pluronics), copolimeros de PEO-PPO-PAA, PLGA-PEO-PLGA, poliortoesteres (POE), o cualquier combinacion de los mismos, tal como se describio anteriormente (veanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.991.654 y la solicitud de patente estadounidense n.° 20050187631, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad), hidrogeles (vease, por ejemplo, Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277; Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etileno-acetato de vinilo no degradable (por ejemplo, discos de etileno- acetato de vinilo y poli(etileno-co-acetato de vinilo)), copolimeros degradables de acido lactico-acido glicolico tales como Lupron Depot™, poli(acido D-(-)-3-hidroxibutirico) (documento EP 133.988), geles de acido hialuronico (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.636.524), suspensiones de acido alginico, poliortoesteres (POE), y similares. La polilactida (PLA) y sus copolimeros con glicolida (PLGA) se conocen bien en la tecnica desde la comercializacion de Lupron Depot™, aprobado en 1989 como primera formulacion parenteral de liberacion sostenida que usaba polimeros de PLA. Los ejemplos adicionales de productos que usan PLA y PLGA como excipientes para lograr la liberacion sostenida del principio activo incluyen Atridox (PLA; enfermedad periodontal), Nutropin Depot (PLGA; con hGH) y Trelstar Depot (PLGA; cancer de prostata). Otros polimeros sinteticos incluyen, pero no se limitan a, poli(e-caprolactona), poli-3-hidroxibutirato, poli(acido p-malico) y polidioxanona]; polianhidridos, poliuretano (vease el documento WO 2005/013936), poliamidas, ciclodextranos, poliortoesteres, alcohol n-vinilico, poli(oxido de etileno)/poli(tereftalato de etileno), polifosfaceno, polifosfato, polifosfonato, poliortoester, policianoacrilato, polietilengilcol, polidihidropirano y poliacetal. Los dispositivos no biodegradables incluyen, pero no se limitan a, diversos derivados de celulosa (carboximetilcelulosa, acetato de celulosa, acetato-propionato de celulosa, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa), implantes a base de silicio (polidimetilsiloxano), polimeros acrilicos (polimetacrilato, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de hidroxietilo), asi como polietileno-co-(acetato de vinilo), poloxamero, polivinilpirrolidona, poloxamina, polipropileno, poliamida, poliacetal, poliester, poli(etileno- clorotrifluoroetileno), politetrafluoroetileno (PTFE o “Teflon™”), caucho de estireno-butadieno, polietileno, polipropileno, poli(oxido de fenileno)-poliestireno, poli-a-cloro-p-xileno, polimetilpenteno, polisulfona y otros polimeros bioestables relacionados. Los portadores adecuados para formulaciones de deposito de liberacion sostenida incluyen, pero no se limitan a, microesferas, peliculas, capsulas, particulas, geles, recubrimientos, matrices, obleas, pastillas u otras composiciones de administracion farmaceutica. Anteriormente se describieron ejemplos de tales formulaciones de liberacion sostenida. Veanse tambien las patentes estadounidenses n.os 6.953.593; 6.946.146; 6.656.508; 6.541.033; y 6.451.346, cuyo contenido se incorpora en el presente documento como referencia. La forma de dosificacion debe poder transportar la formulacion de farmaco en cantidades y concentracion tales como se requieran terapeuticamente para el tratamiento a lo largo del periodo preseleccionado, y deben proporcionar proteccion suficiente a la formulacion frente a la degradacion mediante procesos corporales en la duracion del tratamiento. Por ejemplo, la forma de dosificacion puede estar rodeada por una parte exterior compuesta por un material que tiene propiedades para proteger frente a la degradacion mediante procesos metabolicos y el riesgo, por ejemplo, de fuga, agrietamiento, rotura o deformacion. Esto puede impedir la expulsion del contenido de la forma de dosificacion de una manera no controlada con tensiones a las que se sometera durante el uso, por ejemplo, debido a fuerzas fisicas ejercidas sobre el dispositivo de liberacion de farmaco como resultado del movimiento normal de la articulacion y otros movimientos del sujeto o, por ejemplo, en dispositivos de administracion de farmaco por conveccion, fuerzas fisicas asociadas con presion generada dentro del deposito. El deposito de farmaco u otros medios para sostener y contener el farmaco tambien deben fabricarse de un material tal como para evitar reacciones no deseadas con la formulacion de agente activo, y preferiblemente es biocompatible (por ejemplo, cuando la forma de dosificacion se implanta, es sustancialmente no reactiva con respecto a los liquidos corporales o al organismo de un sujeto). Generalmente, el/los agente(s) biologico(s) respectivo(s) se administra(n) a un individuo durante de al menos 12 horas a al menos una semana, y lo mas probablemente mediante un implante disenado para administrar un farmaco durante al menos 10, 20, 30, 100 dias o al menos 4 meses, o al menos 6 meses o mas, segun se requiera. El anticuerpo de tipo 13C3 puede administrarse a velocidades en volumen relativamente bajas tales como, por ejemplo, desde aproximadamente 0,001 ml/dia hasta 1 ml/dia para minimizar la alteracion tisular o el traumatismo cerca del sitio en el que se libera la formulacion. La formulacion puede liberarse a una velocidad, dependiendo del/de los agente(s) biologico(s) especifico(s), a una dosis baja, de, por ejemplo, desde aproximadamente 0,01 pg/h o 0,1 pg/h, 0,25 py/h, 1 pg/h, generalmente hasta aproximadamente 200 pg/h, o la formulacion se administra a una velocidad en volumen baja, por ejemplo, una velocidad en volumen de desde aproximadamente 0,001 ml/dia hasta aproximadamente 1 ml/dia, por ejemplo, de 0,01 microgramos al dia a aproximadamente 20 miligramos al dia. La dosificacion depende de varios factores tales como potencia, biodisponibilidad y toxicidad del principio activo (por ejemplo, anticuerpo de IgG) usado y los requisitos del sujeto.
Estos y otros objetos, ventajas y caracteristicas de la presente descripcion resultaran evidentes para los expertos en la tecnica tras leer los detalles de la metodologia y las composiciones tal como se exponen de manera mas completa a continuacion.
Ejemplos
Ejemplo 1: preparacion de la forma protofibrilar de beta-amiloide (AP42)
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Se prepararon peptidos sinteticos de AP42 (American Peptide Company, Inc., CA) segun el metodo descrito por Fezoui et al. (Fezoui, et al. Amyloid 7(3): 166-178. (2000)). En resumen, se disolvio AP42 liofilizado en NaOH 2 mM a una concentracion de 1 mg/ml (pH~10,5) seguido por sonicacion y liofilizacion. Se disolvio Ap tratado con NaOH en agua a una concentracion de 1 mg/ml y se filtro con un filtro ULTRAFREE-MC de 0,22 pm (Millipore, MA). Se tampono una disolucion de peptido a 0,5 mg/ml a la concentracion final de fosfato 50 mM; cloruro de sodio 100 mM y se incubo durante 4 h a temperatura ambiente. Para separar la forma protofibrilar de las proteinas de bajo peso molecular, se fracciono el sobrenadante usando cromatografia de exclusion molecular. Despues se almacenaron fracciones de SEC purificadas a 4°C.
Se representa que diversas formas de la proteina AP42 muestran su capacidad como monomero o dimero para asociarse entre si para formar un oligomero de alto peso molecular (protofibrilla) (figura 1). Una agregacion adicional de las protofibrillas solubles crea una forma insoluble de la proteina, mientras que las protofibrillas pueden disociarse de nuevo para dar una forma de menor peso molecular.
Para purificar la forma protofibrilar de Ap a partir de las proteinas de bajo peso molecular, se fraccionaron muestras con un sistema de cromatografia AKTA usando una columna de exclusion molecular Superdex 75. La figura 2A muestra que, sin incubar los peptidos sinteticos de AD 42 a temperatura ambiente, no hay agregacion de oligomeros para formar las protofibrillas. La figura 2B ilustra que tras una incubacion de 4 h de los peptidos sinteticos de AP42, una purificacion por SEC posterior muestra una fraccion de protofibrilla definitiva.
Ejemplo 2: generacion de anticuerpos monoclonales con especificidad por Ap protofibrilar
Se crearon los anticuerpos 13C3, 19A6 y 1D1 inmunizando ratones Balb/c con la proteina Ap fibrilar usando un protocolo conocido en la tecnica. (Harlow, et al. Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Se extirparon los bazos y se fusionaron con celulas de mieloma SP2 en varias placas de 96 pocillos. Se monitorizaron los cultivos de fusion para determinar el crecimiento y se examinaron los sobrenadantes para determinar su capacidad para unirse a la fraccion protofibrilar mediante inmunoensayos de captura de anticuerpos.
Ejemplo 3: caracterizacion de anticuerpos monoclonales con especificidad por Ap protofibrilar
Se usaron ensayos de captura de anticuerpos para caracterizar adicionalmente los anticuerpos monoclonales producidos a partir de los hibridomas (13C3, 19A6 y 1D1). A placas de microtitulacion se les anadieron 50 ul de una disolucion de proteina Ap42 protofibrilar a 2 ug/ml a cada pocillo y se incubaron las placas a 4°C durante la noche. Tras la incubacion, se retiro la disolucion de antigeno residual y se lavaron con disolucion PBS. Se anadieron diluciones en serie de los sobrenadantes de hibridoma a las placas que contenian el antigeno unido y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se retiro esta disolucion de anticuerpo primario y se lavaron de nuevo los pocillos con disolucion PBS. A continuacion se anadio un anticuerpo secundario marcado con enzima y se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras retirar la disolucion de anticuerpo secundario, se anadio a la reaccion un sustrato cromogenico especifico para la enzima conjugada, y la deteccion del anticuerpo capturado proporciono resultados cuantitativos.
Adicionalmente, cambiando el reactivo secundario por anticuerpos anti-inmunoglobulina especificos de isotipo, se identifico el isotipo de inmunoglobulina particular de cada anticuerpo monoclonal. En estos experimentos, se usaron anticuerpos anti-Ap42 disponibles comercialmente para comparar la especificidad de union de los anticuerpos monoclonales 1 3c3, 19A6 y 1D1.
Las figuras 3A y B ilustran las formas protofibrilar (PF) y de bajo peso molecular (LMW) del peptido Ap42 usado para someter a prueba la especificidad del anticuerpo 13C3 en inmunoensayos de captura de anticuerpos. Especificamente, la figura 3A ilustra el grafico generado a partir de ELISA que muestran que el anticuerpo 13C3 es especifico para la forma protofibrilar (PF) de Ap42 y no reconoce las formas de bajo peso molecular (LMW) de la proteina. La figura 3B ilustra los datos de ELISA con el anticuerpo 4G8 disponible comercialmente, que muestran que reconoce las formas tanto de bajo peso molecular como protofibrilar de la proteina Ap42.
Ejemplo 4: especificidad de anticuerpos monoclonales por la forma protofibrilar de Ap42 usando resonancia de plasmon superficial (bIACORE).
Se inmovilizaron los anticuerpos monoclonales purificados indicados en la tabla 1 (a continuacion) en un chip sensor de BIAcore segun protocolos publicados. (Nice, et al. BioEssays 21: 339-352 (1999)). La alta sensibilidad de la respuesta optica de BIAcore cuantifica un cambio en la reflectividad y se genera una respuesta de linea base para el ligando solo. Se realiza el analisis de interaccion a medida que se inyectan los analitos, la forma LMW o la forma PF de Ap42, en disolucion sobre el chip sensor y el cambio en la resonancia de plasmon superficial genera una respuesta que identifica la especificidad de la capacidad de cada anticuerpo para unirse a Ap42 LMW y PF. Tanto los anticuerpos 13C3 como 19A6 se unieron a la forma PF de Ap42 con mayor especificidad que a la forma LMW. De todos los anticuerpos usados en este experimento, los anticuerpos disponibles comercialmente mostraron mayor
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especificidad por AP42 LMW con respecto a la forma PF de AP42, tal como indico la razon de union a PF/union a LMW.
Tabla 1
Nombre
Epitopo Isotipo Fuente Analisis de union mediante BIACORE LMW PF Razon (PF/LMW)
1D1
estructura IgG1 Ravetech 23,2 122,3 5,3
13C3
estructura IgG1 Ravetech 25 124,8 5,0
19A6
estructura IgGs Ravetech
3D6
AP 1-5 IgG2b Elan Pharmaceuticals 424,6 402,7 0,9
4G8
AP 17-22 IgG2b Senetek Inc. 228,6 340,3 1,5
6E10
AP 3-8 IgG2b Senetek Inc. 400,1 541,1 1,4
82E1
AP 1-17 IgG1 IBL 69,9 68,4 1,0
El analisis por resonancia de plasmon superficial mostro mediante sensograma que 13C3 (figura 4B) no se une a las formas LMW de la proteina AP42. Sin embargo, 4G8 (figura 4A) muestra una curva de asociacion/disociacion convencional para la proteina AP42 LMW. El control de isotipo de anticuerpo, IgG1 (figura C), no se une a AP LMW igual de bien. En estos experimentos se usaron sistemas de BIAcore automatizados, que usan el principio de deteccion de resonancia de plasmon superficial. Los datos de especificidad de union para el anticuerpo 19A6 mostraron que 19A6 tenia una razon de union de 5,8, lo cual es similar a la de 13C3 a una razon de 5,3.
Ejemplo 5: mapeo de epitopos del anticuerpo 13C3
Se llevo a cabo el mapeo de los epitopos de 13C3, 1D1 y 19A6 usando el sistema RepliTope Microarrays (JPT Peptide Technologies GmbH) segun un protocolo publicado. (Korth, et al. 390: 74 (1997)). Cada punto en el microalineamiento contiene un peptido de 13 aminoacido AP42 en el que cada desplazamiento de posicion en el microalineamiento representa un desplazamiento de aminoacido (del extremo N-terminal al extremo C-terminal), es decir SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 51; y SEQ ID NO: 52. A continuacion se indican los peptidos y su secuencia de aminoacidos exacta, correspondiente a su posicion el alineamiento de portaobjetos. Una vez fijados los peptidos al sistema RepliTope Microarray, se incuban las muestras con el anticuerpo 13C3 y despues se marcan posteriormente con un anticuerpo secundario que esta conjugado con una etiqueta de quimioluminiscencia de eleccion. Los puntos que producen una senal representan los sitios de union a epitopo en la proteina por el anticuerpo.
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His (SEQ ID NO: 23)
Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His (SEQ ID NO: 24)
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin (SEQ ID NO: 25)
Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys (SEQ ID NO: 26)
Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu (SEQ ID NO: 27)
His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu Val (SEQ ID NO: 28)
Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu Val Phe (SEQ ID NO: 29)
Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe (SEQ ID NO: 30)
Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala (SEQ ID NO: 31)
Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu (SEQ ID NO: 32)
Glu Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp (SEQ ID NO: 33)
Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val (SEQ ID NO: 34)
His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly (SEQ ID NO: 35)
His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser (SEQ ID NO: 36)
Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn (SEQ ID NO: 37)
Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys (SEQ ID NO: 38)
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly (SEQ ID NO: 39)
Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala (SEQ ID NO: 40)
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie (SEQ ID NO: 41)
Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie (SEQ ID NO: 42)
Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly (SEQ ID NO: 43)
Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu (SEQ ID NO: 44)
Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met (SEQ ID NO: 45)
Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met Val (SEQ ID NO: 46)
Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Mel Val Gly (SEQ ID NO: 47)
Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met Val Gly Gly (SEQ ID NO: 48)
Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met Val Gly Gly Val (SEQ ID NO: 49)
Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val (SEQ ID NO: 50)
Gly Ala lie lie Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie (SEQ ID NO: 51)
Ala lie lie Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala (SEQ ID NO: 52)
La figura 5A ilustra una transferencia por puntos a partir de un experimento de RepliTope Microarray que identifica los epitopos de los anticuerpos, 13C3, 1D1 y 4G8, en el peptido AP 1-42. El anticuerpo unido se representa mediante
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una senal quimioluminiscente. La figura 5B ilustra la secuencia de aminoacidos de Ap 1-42 que muestra los segmentos de polipeptido de los epitopos de 13C3 a medida que se producen en la secuencia. El anticuerpo 1D1 muestra los mismos epitopos que 13C3, mientras que el anticuerpo 4G8 comercial identifica un epitopo diferente.
Ejemplo 6: caracterizacion de la especificidad de 13C3
La figura 6 ilustra fracciones procedentes de cromatografia de exclusion molecular de los sobrenadantes de la linea celular 7PA2, una linea celular que secreta oligomero de Ap. Se usaron ensayos de captura de anticuerpos para caracterizar adicionalmente la union del anticuerpo 13C3 con las fracciones protofibrilar y de bajo peso molecular de 7PA2 purificado mediante SEC. A placas de microtitulacion, se les anadieron 100 ul de una dilucion 1:200 de cada fraccion a cada pocillo y se incubaron las placas a 4°C durante la noche. Tras la incubacion, se retiro la disolucion de antigeno residual y se lavaron con disolucion PBS. Se anadieron diluciones en serie de los sobrenadantes de 13C3 a las placas que contenian el antigeno unido y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se retiro esta disolucion de anticuerpo primario y se lavaron de nuevo los pocillos con disolucion PBS. A continuacion se anadio un anticuerpo secundario marcado con enzima y se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras retirar la disolucion de anticuerpo secundario, se anadio a la reaccion un sustrato cromogenico especifico para la enzima conjugada, y la deteccion del anticuerpo capturado proporciono resultados cuantitativos. Este ensayo identifico que el anticuerpo 13C3 solo reconoce especificamente la fraccion protofibrilar mientras que el anticuerpo 4G8 reconoce todas las fracciones. La linea celular 7PA2 la proporciono Dennis J. Selkoe, M.D. en Harvard Medical School.
Ejemplo 7: caracterizacion de la reactividad de 13C3 mediante EM
Se realizo el metodo de tincion usando un protocolo convencional. (Brenner, et al. Biochim. Biophys. Ada 34, 103110 (1959)). Se aplico un pequeno volumen (10 microlitros) de una disolucion protofibrilar a 0,2 mg/ml a rejillas de formvar recubiertas con carbono (400 de malla) durante 2 min. Despues se bloquearon las rejillas en BSA al 1% y se incubaron con el anticuerpo 13C3 seguido por una incubacion posterior con un anticuerpo secundario conjugado con oro coloidal. Se sometieron las muestras a tincion negativa colocando 2 gotas sucesivas de acido fosfotungstico al 2% durante 30 s cada una. Se elimino la tincion en exceso con papel de filtro, se secaron las rejillas al aire y se observaron con un microscopio electronico de transmision JEOL 100CX a 80 kV. Se grabaron imagenes en negativos Kodak 4489 de gran formato y se digitalizaron en un escaner de lecho plano.
Las imagenes de IEM (microscopia inmunoelectronica) muestran la especificidad de union del clon 13C3 de anticuerpo anti-Ap a fibras de AP42 (figuras 7B y 7C), mientras que el anticuerpo de control de isotipo, IgG1, no muestra union (figura 7A). El anticuerpo secundario esta conjugado con una particula de oro coloidal.
Ejemplo 8: tratamiento con 13C3 de un modelo de raton de EA humana
Se uso el anticuerpo monoclonal 13C3 para tratar placas de Ap en un modelo de raton de enfermedad de Alzheimer, TgCRND8. El raton contiene el transgen de ADNc APP695 humano, que acelera la deposicion de placas de amiloide Ap en el cerebro de raton, que aparecen en el plazo de 1 mes de edad. A un grupo de muestra de 5 ratones TgCRND8 de cinco semanas de edad se les administraron inmunizaciones con el anticuerpo monoclonal 13C3 a una concentracion de 10 mg/kg de raton una vez a la semana en una duracion de siete semanas. A un segundo grupo de 5 ratones TgCRND8 se les administro el ciclo de tratamiento, sin embargo se administro un anticuerpo IgG1 de control de isotipo. Se repitieron los experimentos con tratamientos dos veces a la semana en lugar de una vez a la semana.
Tanto los animales de control como los de experimentacion se sacrificaron a las 12 semanas de edad. Preparaciones histologicas de los cerebros revelaron reducciones de las placas de Ap en los ratones tratados con 13C3.
Se trataron secciones en serie de cerebros crioconservados de ratones TgCRND8 con los anticuerpos monoclonales 13C3 o IgG1.
Las figuras 8A y 8B ilustran las diferencias en el numero de placas de amiloide Ap entre cada anticuerpo respectivo.
Pruebas de la T estadisticas muestran que el tratamiento con el anticuerpo 13C3 una vez a la semana reduce las placas de amiloide Ap en el modelo de enfermedad de Alzheimer (figura 9A). Sin embargo, los tratamientos dos veces a la semana (figura 9B) muestran el mismo nivel de reduccion de placas.
Todos los ratones TgCRND8 anteriores se obtuvieron del Dr. David Westaway de la Universidad de Toronto.
Ejemplo 9: caracterizacion molecular de las regiones variables de AcM 13C3
Se clonaron la region variable de cadena pesada de IgG y la region de cadena ligera Kappa de IgG a partir del hibridoma 13C3. Se analizaron las secuencias de cadena tanto pesada como ligera (figura 10) usando VBASE2

Claims (23)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Anticuerpo monoclonal aislado que interacciona especificamente con y muestra una afinidad de al menos 106 M-1 tal como se mide mediante resonancia de plasmon superficial por un epitopo conformacional de una
    5 forma protofibrilar del peptido Ap, mediante lo cual el epitopo protofibrilar se representa mediante una
    region que queda al descubierto de una forma protofibrilar de Ap que comprende la secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ ID NO: 3, que comprende ademas una cadena ligera variable que comprende una region CDR1 tal como se expone en SEQ ID NO: 13, una region CDR2 tal como se expone en SEQ ID NO: 14 y una CDR3 tal como se expone en SEQ ID NO: 15, y una cadena pesada variable 10 compuesta por una region CDR1 tal como se expone en SEQ ID NO: 20, una region CDR2 tal como se
    expone en SEQ ID NO: 21 y una CDR3 tal como se expone en SEQ ID NO: 22.
  2. 2. Anticuerpo monoclonal aislado segun la reivindicacion 1, en el que la region que queda al descubierto
    comprende ademas la secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ ID NO: 4.
    15
  3. 3. Anticuerpo monoclonal segun la reivindicacion 1 o 2, que se produce mediante un hibridoma disponible con el n.° de registro ATCC PTA-8830.
  4. 4. Anticuerpo monoclonal segun la reivindicacion 1 o 2, que comprende ademas una cadena ligera variable
    20 compuesta por la secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ ID NO: 5 y una cadena pesada
    variable compuesta por la secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ ID NO: 7.
  5. 5. Anticuerpo monoclonal segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado.
    25
  6. 6. Anticuerpo monoclonal segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano.
  7. 7. Metodo de produccion de un anticuerpo monoclonal segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que
    30 comprende:
    (a) inmunizar un mamifero no humano con la forma protofibrilar del peptido p-amiloide;
    (b) recoger celulas B de dicho mamifero;
    35
    (c) crear hibridomas a partir de las celulas B recogidas, en el que dichos hibridomas producen anticuerpos; y,
    (d) seleccionar hibridomas que producen anticuerpos que se unen especificamente a la forma protofibrilar
    40 del peptido p-amiloide al tiempo que muestran una afinidad minima por las formas de monomero o dimero
    del peptido p-amiloide.
  8. 8. Metodo para cuantificar la cantidad de una forma protofibrilar del peptido p-amiloide en una muestra de tejido o liquido, que comprende:
    45
    (a) obtener la muestra de tejido o liquido de un sujeto;
    (b) poner en contacto la muestra de tejido o liquido con un anticuerpo monoclonal segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o fragmento del mismo que se une especificamente a la forma protofibrilar del
    50 peptido p-amiloide al tiempo que muestra una afinidad minima por formas de bajo peso molecular del
    peptido p-amiloide; y,
    (c) cuantificar la cantidad de forma protofibrilar del peptido p-amiloide en la muestra.
    55 9. Kit para detectar la forma protofibrilar del peptido p-amiloide al tiempo que muestra una mayor afinidad por
    una forma protofibrilar del peptido p-amiloide que por una forma de bajo peso molecular del peptido p- amiloide, que comprende:
    (a) un anticuerpo monoclonal segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o un fragmento del mismo,
    60 que puede unirse especificamente in vitro a un epitopo conformacional de repeticion de una forma
    protofibrilar del peptido p-amiloide al tiempo que muestra una afinidad minima por formas de bajo peso molecular del peptido p-amiloide; y,
    (b) un reactivo que se une, directa o indirectamente, a dicho anticuerpo o al fragmento del mismo.
  9. 11.
    10 12.
  10. 13. 15
  11. 14.
  12. 15.
    20
  13. 16.
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  14. 17.
    30
  15. 18.
  16. 19.
    35
  17. 20.
    40
  18. 21.
    45
  19. 22.
  20. 23.
    50
  21. 24.
    55
  22. 25.
    60
  23. 26.
    Composicion farmaceutica que comprende (i) un anticuerpo monoclonal de un fragmento de region variable del mismo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que interacciona especificamente con la forma protofibrilar de Ap-amiloide, y (ii) un portador farmaceuticamente aceptable, en la que dicha interaccion especifica se caracteriza por una razon de la afinidad de un fragmento de region variable de dicho anticuerpo por la forma protofibrilar de Ap con respecto a la afinidad por otras formas de Ap mayor de aproximadamente 2.
    Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 11, en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
    Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 10, metodo segun la reivindicacion 7 o kit segun la reivindicacion 9, en los que el anticuerpo se produce mediante un hibridoma disponible con el n.° de registro ATCC PTA-8830.
    Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 11, en la que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal humanizado o un anticuerpo monoclonal humano.
    Hibridoma disponible con el n.° de registro ATCC PTA-8830.
    Molecula de acido nucleico aislada que codifica para el anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el fragmento de cadena pesada variable comprende la secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ ID NO: 7.
    Molecula de acido nucleico aislada que codifica para el anticuerpo segun una cualquiera de las
    reivindicaciones 1-6, en la que la molecula de acido nucleico comprende la secuencia de nucleotidos tal
    como se expone en SEQ ID NO: 8.
    Vector de expresion para la expresion del anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en una celula huesped recombinante en el que dicho vector de expresion contiene la molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 15 o 16.
    Celula huesped cultivada que expresa el anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dicha celula huesped contiene el vector de expresion segun la reivindicacion 17.
    Molecula de acido nucleico aislada que codifica para el anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el fragmento de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ ID NO: 5.
    Molecula de acido nucleico aislada que codifica para el anticuerpo segun una cualquiera de las
    reivindicaciones 1-6, en la que la molecula de acido nucleico comprende la secuencia de nucleotidos tal
    como se expone en SEQ ID NO: 6.
    Vector de expresion para la expresion del anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en una celula huesped recombinante en el que dicho vector de expresion contiene la molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 19 o 20.
    Celula huesped cultivada que expresa el anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dicha celula huesped contiene el vector de expresion segun la reivindicacion 21.
    Anticuerpo monoclonal segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o fragmento de region variable del mismo, para su uso en un tratamiento de un estado caracterizado por la formacion y deposicion de placas de fibras de p-amiloide.
    Cantidad farmaceuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal o un fragmento de union a antigeno del mismo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso en el tratamiento y/o la prevencion de la deposicion de placa de beta-amiloide asociada con la aparicion y progresion de la enfermedad de Alzheimer.
    Anticuerpo monoclonal segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o fragmento de union a antigeno del mismo, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
    Anticuerpo monoclonal segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o fragmento de union a antigeno del mismo, para su uso en la inhibicion de la formacion y deposicion de placas de fibras de p-amiloide.
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