MXPA04008740A

MXPA04008740A - Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloide beta.

Info

Publication number: MXPA04008740A
Application number: MXPA04008740A
Authority: MX
Inventors: Saldanha Jose
Original assignee: Neuralab Ltd
Priority date: 2002-03-12
Filing date: 2003-03-12
Publication date: 2005-07-13
Also published as: JP2006503549A; HK1085222A1; EA200401170A1; PL375159A1; BR0308143A; AU2003214152A1; CA2478049A1; GEP20084474B; ZA200406616B; IL163626A0; HRP20040950A2; KR20050071368A; EP1554311A4; KR101122871B1; IS7499A; US20040082762A1; PE20040207A1; UY27721A1; ES2389541T3; UA89469C2

Abstract

La invencion brinda metodos y agentes perfeccionados para el tratamiento de enfermedades asociadas con los depositos de amiloide Ab almacenados en el cerebro del paciente. Los agentes preferenciales incluyen los anticuerpos humanizados.

Description

ANTICUERPOS HUMANIZADOS QUE RECONOCEN EL PÉPTIDO AMILOIDE BETA Aplicaciones relacionadas Esta aplicación exige el beneficio de la aplicación de patente anteriormente archivada con el número de serie U.S. N. 60/363,75 1 (archivada el 12 de marzo del 2002) con el título de "Anticuerpos humanizados que reconocen el péptido amiloide beta". A continuación se incluye el contenido completo de la aplicación antes mencionada como referencia. Antecedentes del Invento La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad progresiva que conlleva a la demencia senil. ^er Selkoe, TINS 16:403 (1993); Hardy y otros., WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:438 (1994); Duff y otros., Nature 373:476 (1995); Games y otros., Nature 373:523 (1995). En términos generales la enfermedad está incluida en dos categorías: aparición tardía, que sucede durante la vejez (65 o más) y la aparición temprana, que se desarrolla mucho antes del periodo senil, es decir, entro los 35 y 60 años. En ambos casos, la patología es la misma pero las anormalidades tienden a ser más severas y a extenderse más en los casos de aparición temprana. La enfermedad se caracteriza al menos por dos tipos de lesiones en el cerebro, redes neurofibrilares y placas seniles. Las redes neurofibrilares son depósitos intracelulares de proteínas tau de microtúbulo asociado, formados por dos filamentos entrelazados en pares. Las placas seniles (placas amiloides) son áreas de neurópilo desorganizado de hasta 150 µ?t? a lo largo y con depósitos amiloides extracelulares en el centro visibles mediante un análisis a través de microscopio de secciones del tejido cerebral. La acumulación de placas amiloides dentro del cerebro también se asocia con el síndrome de Dawn y otros desórdenes cognitivos. El principal elemento de las placas es un péptido nombrado ?ß o péptido ß amiloide. El péptido ?ß es un fragmento interno 4-kDa de los aminoácidos 39-43 amino de una glucoproteína de transmembrana mayor llamada proteína con el término de proteína amiloide precursora (APP en inglés). Como resultado del procesamiento proteolítico del APP con diferentes enzimas de secretasa, el Ap se encuentra principalmente en una versión corta, 40 aminoácidos de longitud, y en una versión larga, que varía de 42-43 aminoácidos de longitud. Parte del dominio de la transmembrana hidrofóbica del APP se localiza en el extremo carboxilo del ?ß, lo que podría explicar la habilidad del ?ß para agregarse a las placas, especialmente en el caso de la versión larga. La acumulación de placas amiloides en el cerebro podría provocar muerte neuronal. Los síntomas físicos asociados con este tipo de deterioro neuronal caracterizan la enfermedad de Alzheimer. Se ha asociado varias mutaciones dentro de la proteína APP con la enfermedad de Alzheimer. Ver Goate y otros., Nature 349:704) (1991 ) (valina717 por isoleucina); Chartier Harían y otros. Nature 353:844 (1991 )) (valina717 por glicina); Murrell y otros., Science 254:97 (1991 ) (valina717 por fenilalanina); Mullan y otros., Nature Genet. 1 :345 (1992) (una doble mutación, con un cambio de lisina595-metionina596 por L-asparagina595-leucina596). Se considera que dichas mutaciones causan Alzheimer debido al aumento o alteración del procesamiento del APP a ?ß, en particular el procesamiento de APP a cantidades mayores de la versión larga de ?ß (es decir, ?ß1-42 y ?ß1-43). Se cree que las mutaciones en otros genes, como los genes pre-seniles, PS1 y PS2, afectan indirectamente el procesamiento de APP para incrementar las cantidades de la versión larga de ?ß (ver Hardy, TINS 20: 154 (1997)). Se ha empleado con éxito ratones para determinar la importancia de las placas amiloides en el caso de Alzheimer (Games y otros., supra, Johnson-Wood y otros., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:1550 (1997)). En particular, cuando se inyecta ratones transgénicos PDAPP (que expresan forma muíante del APP humana y desarrollan Alzheimer a temprana edad) con la versión larga del ?ß, éstos presentan una disminución en la progresión del Alzheimer y un incremento en los títulos de anticuerpos para péptido ?ß (Schenk y otros., Nature 400, 173 (1999)). Las observaciones anteriormente discutidas indican que el ?ß, específicamente en su versión larga, provoca Alzheimer. Según esto, son necesarias nuevas terapias y reactivos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, especialmente terapias y reactivos que tengan un efecto terapéutico en dosis fisiológicas (por ejemplo, dosis no tóxicas).

Compendio del Invento El presente invento ofrece nuevos reactivos inmunológicos, en especial reactivos de anticuerpos terapéuticos para la prevención y tratamiento de la enfermedad amiloidogénica (por ejemplo Alzheimer). El invento se basa, en parte, en la identificación y caracterización de un anticuerpo monoclonal que específicamente se enlaza al péptido ?ß y que reduce con efectividad la carga de placa y/o la distrofia neurítica asociada con los desórdenes amiloidogénicos. El análisis estructural y funcional de este anticuerpo conlleva al diseño de varios anticuerpos humanizados para el uso profiláctico y/o terapéutico. En particular, el invento presenta la humanización de las regiones variables de este anticuerpo con lo que mantiene inmunoglobulina 'humanizada' o cadenas de anticuerpos, inmunoglobulina 'humanizada' intacta o anticuerpos e inmunoglobulina funcional o fragmentos de anticuerpos, en particular, fragmentos de enlace antígenos del anticuerpo presentado. También se ha hallado polipéptidos que componen el complemento que determina las regiones del anticuerpo monoclonal presentado al igual que los reactivos polinucleótidos, vectores y receptor adecuado para la codificación de los polipéptidos mencionados. Se presenta los métodos de tratamiento de enfermedades o desórdenes aniloidogénicos (por ejemplo Alzheimer) al igual que las composiciones farmacéuticas y los kits a usarse en dichas aplicaciones. También se presentan los métodos de identificación de residuos dentro de los anticuerpos monoclonales presentados, que son importantes para la función inmunológica adecuada y para identificar residuos que se pueden sustituir en el diseño de anticuerpos humanizados que hayan mejorado las afinidades de enlace y/o reducido la inmunogenicidad cuando se usa como reactivos terapéuticos. También se presentan anticuerpos (por ejemplo anticuerpos humanizados que han alterado las funciones efectoras) y los usos terapéuticos de éste.

Descripción de los dibujos La Figura 1A-B representa la alineación de las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera del ratón 12B4, del 12B4 humanizado, de la ID de Kabat 005036 y anticuerpos de la línea de germen A19 (X63397). Las regiones CDR están punteadas y subrayadas. La única mutación regresiva de un residuo humano ? ratón se indica con el asterisco. La importancia de los residuos ensombrecidos se muestra en la leyenda. Están numerados desde la primera metionina, no con la numeración Kabat. La Figura 2A-B representa una alineación de las secuencias de aminoácidos en la cadena pesada del ratón 12B4, del 12B4 humanizado (versión 1 ), ID de Kabat 000333, y anticuerpos de la línea de germen VH4-39 y VH4-61. Las anotaciones son las mismas que para la Figura 1. Están numerados desde la primera metionina, no con la numeración Kabat. La Figura 3A-D representa la secuencia nucleótida y del aminoácido para el 12B4VLv1 humanizado comparado con las secuencias murinas y humanas. La Figura 4A-D representa la secuencia nucleótida y del aminoácido para el 12B4VHv1 humanizado comparado con las secuencias murinas y humanas. La Figura 5 representa gráficamente los resultados de ELISA de dos experimentos independientes que miden el enlace quimérico 12B4, 3D6, y el quimérico 3D6 a ?ß (paneles A y B, respectivamente). La Figura 6 representa gráficamente enlaces competitivos de ELISA que confirman la actividad funcional de 12B4 y 12B4 quimérico comparada con 3D6 y quimérica 3D6 y 10D5. El 12B4 quimérico (triángulos abiertos) compite con igual potencia con su contraparte murina no biotinilatada (triángulos invertidos abiertos) para enlazar el murino biotinilatado 12B4 con el péptido ?ß1-42.

La Figura 7 representa gráficamente un ensayo de fagocitosis ex vivo que prueba el 12B4 quimérico, 3D6 y del lgG1 humano para mediar la absorción de ?ß a través de las células microgliales en secciones del cerebro PDAPP. La Figura 8 representa gráficamente los resultados de dos ensayos independientes de fagocitosis ex vivo (paneles A y B, respectivamente) que prueban la capacidad del 12B4 quimérico, 3D6 humanizado y del lgG1 humano para mediar la absorción de ?ß a través de las células microgliales en secciones del cerebro PDAPP. La Figura 9 es una representación esquemática del conjunto mediado PCR del 12B4 humanizado, versión 1. La Figura 9A representa el conjunto de las regiones VL y la Figura 9B representa el conjunto de las regiones VH.

Descripción detallada del invento El presente invento ofrece nuevos reactivos inmunológicos y métodos para prevenir o tratar el Alzheimer u otras enfermedades amiloidogénicas. El invento se basa, en cierta medida en la caracterización de una inmunoglobulina monoclonal, 12B4, que es efectiva para enlazar la proteína beta amiloide (?ß) (por ejemplo, para enlazar ?ß solubles y/o agregados), lograr la fagocitosis (por ejemplo de ?ß agregado), reducir la carga de placa y/o reducir la distrofia neurítica (por ejemplo en un paciente). El invento además se basa en la determinación y caracterización estructural de la estructura primaria y secundaria de las cadenas variables ligeras y pesadas de la inmunoglobulina 12B4 y la identificación de los residuos importantes para la actividad e inmunogenicidad. La presentación de las inmunoglobulinas incluye una cadena variable ligera y/o cadena variable pesada de la inmunoglobulina monoclonal 12B4 aquí descrita. Se presentan inmunoglobulina preferidas, por ejemplo, inmunoglobulinas terapéuticas, que incluyen una cadena variable ligera y/o cadena variable pesada 'humanizada'. Las cadenas variables ligeras y/o cadenas variables pesadas incluyen una región complementaria determinante (CDR siglas en inglés) de la inmunoglobulina 12B4 {por ejemplo, inmunoglobulina del donante) y regiones de trabajo variables sustancialmente de inmunoglobulina del receptor humano. La frase "sustancialmente de inmunoglobulina de receptor humano" significa que la mayoría de residuos o los residuos claves provienen de la secuencia del receptor humano, permitiendo, sin embargo, la sustitución de residuos en ciertas posiciones por residuos seleccionados para mejorar la actividad de la inmunoglobulina 'humanizada' (por ejemplo al alterar la actividad de modo tal que imite mejor la actividad de la inmunoglobulina del donante) o seleccionada para disminuir la inmunogenicidad de la inmunoglobulina 'humanizada'. En un representación el invento presenta una cadena de inmunoglobulina 'humanizada' ligera o pesada que incluye regiones 12B4 de regiones variables determinantes de la complementación (CDRs siglas en inglés) (por ejemplo, incluye una dos o tres CDRs de la secuencia de la región variable de la cadena ligera presentada como SEQ ID NO:2 o incluye una dos o tres CDRs de la secuencia de la región variable de la cadena pesada presentada como SEQ ID NO:4) e incluye una región con marco variable proveniente de una secuencia de cadena de inmunoglobulina ligera o pesada de receptor humano siempre y cuando al menos un residuo del residuo del marco haya mutado regresivamente a un residuo murino correspondiente, en el que la mutación regresiva mencionada no afecte demasiado la habilidad de la cadena para dirigir el enlace ?ß. En otra representación, el invento presenta una cadena de inmunoglobulina ligera o pesada que incluye regiones 12B4 de regiones variables determinantes de la complementación (CDRs) (por ejemplo, incluye una dos o tres CDRs de la secuencia de la región variable de la cadena ligera presentada como SEQ ID NO:2 y/o incluye una dos o tres CDRs de la secuencia de la región variable de la cadena pesada presentada como SEQ ID NO:4) e incluye una región con marco variable básicamente de una secuencia de cadena de inmunoglobulina pesada o ligera de receptor aceptor humano, siempre y cuando al menos uno de lo residuos del marco sea sustituido por el residuo del aminoácido correspondiente de la secuencia pesada o ligera de región variable del ratón, en donde el residuo del marco sea seleccionado del grupo formado por (a) residuo que de manera no covalente enlace el antígeno directamente, (b) un residuo adyacente a un CDR, (c) un residuo interactivo con el CDR (por ejemplo identificado con el modelado de la cadena ligera o pesada en la estructura resuelta de una cadena homologa de inmunoglobulina conocida) y (d) un residuo que participe en la interíaz VL-VH. En otra representación, el invento presenta una cadena de inmunoglobulina humanizada ligera o pesada que incluye CDRs 12B4 de regiones variables y regiones de marcos de una secuencia de cadena de inmunoglobulina pesada o ligera de receptor humano siempre y cuando al menos uno de los residuos de marco sea sustituido con el residuo del aminoácido correspondiente de la secuencia ligera o pesada de ratón 12B4 de región variable, en la que el residuo del marco sea un residuo capaz de afectar la conformación o función de la región variable de la cadena ligera como se identificó con el análisis de un modelo tridimensional de la región variable, por ejemplo un residuo capaz de interactuar con el antígeno, un residuo próximo al lugar de enlace del antígeno, un residuo capaz de interactuar con un CDR, un residuo adyacente a un CDR, un residuo dentro de 6 Á de un residuo CDR, un residuo canónico, un residuo de zona vernier, un residuo en forma de cadena, un residuo inusual o un residuo del lugar de la glicosilación en la superficie del modelo estructural. En otra representación el invento presenta, además de las sustituciones descritas anteriormente, una sustitución de al menos un residuo extraño del marco humano. Por ejemplo, se puede sustituir un residuo extraño con un residuo de aminoácido que es común para las secuencias de cadenas variables en esa posición. Como alternativa se puede sustituir un residuo extraño por un residuo de aminoácido correspondiente de una secuencia de cadena variable homologa de una línea de gérmenes. En otra representación, el invento presenta una inmunoglobulina humanizada que incluye una cadena ligera y una cadena pesada, tal como se describe anteriormente, o un fragmento enlazador de antígenos de la inmunoglobulina mencionada. En una representación modelo, la inmunoglobulina humanizada se enlaza (por ejemplo, se enlaza específicamente ) al péptido amiloide beta (?ß) con una afinidad de enlace de al 107 M"1, 108 M"\ o 109 M"1. En otra representación, la inmunoglobulina o fragmento enlazador de antígenos incluye una cadena pesada con un isotipo de ?1. En otra representación, la inmunoglobulina o fragmento enlazador de antígeno se enlaza (por ejemplo, se enlaza específicamente) con el péptido amiloide beta soluble (?ß) y el agregado ?ß. En otra representación, la inmunoglobulina o fragmento enlazador de antígenos produce la fagocitosis (por ejemplo induce la fagocitosis) del péptido amiloide beta (?ß). Y, en otra representación, la inmunoglobulina o el fragmento enlazador de antígenos cruza la barrera sangre-cerebro en un sujeto. En otra representación, la inmunoglobulina o fragmento enlazador de antígeno reduce la carga del péptido amiloide beta y la distrofia neurítica en un sujeto. En otra representación, el invento presenta inmunoglobulina quimérica que incluye regiones variables 12B4 (por ejemplo, las secuencias de las regiones variables presentadas como SEQ ID NO:2 ó SEQ ID NO:4). En otra representación, la inmunoglobulina o el fragmento enlazador de antígenos de éste, además incluye las regiones constantes de lgG1. Las inmunoglobulinas aquí descritas son particularmente apropiadas para métodos terapéuticos dirigidos a prevenir o tratar enfermedades amiloidogénicas. En una representación, el invento presenta un método para prevenir o tratar una enfermedad amiloidogénica (por ejemplo Alzheimer) que involucra la administración al paciente de una dosis efectiva de una inmunoglobulina humanizada como aquí se describe. En otra representación, el invento presenta composiciones farmacéuticas que incluyen una inmunoglobulina humanizada tal como aquí se describe y un portador farmacéutico. También se presentan moléculas aisladas de ácido nucleico, vectores y células receptoras para producir las inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulinas o cadenas aquí descritas, así como métodos para producir las inmunoglobulinas mencionadas, fragmentos de inmunoglobulinas o cadenas de inmunoglobulinas.

El presente invento además ofrece un método para la identificación de residuos 12B4 que pueden ser sustituidos cuando se produce una inmunoglobulina 12B4 humanizada, respectivamente. Por ejemplo, un método para identificar residuos de regiones de marcos variables que pueden ser sustituidos involucra el modelado de la estructura tridimensiones de una región 12B4 variable en una estructura homologa resuelta y el análisis de los modelos mencionados para localizar residuos capaces de afectar la conformación o función de la región variable de inmunoglobulina 12B4, de tal modo que los residuos sustituibles sean identificados. Además, el invento presenta el uso de la secuencia de región variable presentada como SEQ ID NO:2 ó SEQ ID NO:4 ó cualquier parte de ésta, en la producción de una imagen tridimensional de una inmunoglobulina 12B4, una cadena de inmunoglobulina 12B4 o el dominio de ésta.

El presente invento también presenta inmunoglobulinas con alteraciones en la función efectora, como por ejemplo la habilidad para enlazar moléculas, en el complemento o en un receptor en una célula efectora. En particular, la inmunoglobulina del invento tiene una región constante alterada, por ejemplo la región Fe, donde al menos una actividad de res 1 de aminoácido, lisis o enlace de complemento) ha mejorado las propiedades de limpieza amiloide, y/o tiene un deseable periodo medio de vida. Antes de la descripción del invento, sería útil para su comprensión presentar definiciones de ciertos términos que se usarán de ahora en adelante. El término "inmunoglobulina" o "anticuerpo" (intercambiable en adelante) se refiera a una proteína que tiene una estructura de cadena básica de cuatro polipéptidos formada por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, siendo dichas cadenas estabilizadas con, por ejemplo, enlaces disulfuros de intercadenas, que tienen la capacidad de enlazar específicamente antígenos. El término "inmunoglobulina de cadena simple" o "anticuerpo de cadena simple" (intercambiable en adelante) se refiere a una proteína que tiene una cadena de dos polipéptidos que consiste en una cadena ligera y una pesada, siendo dichas cadenas estabilizadas por ejemplo con enlaces péptidos de intercadenas que tienen la capacidad de enlazar antígenos específicamente. El término dominio se refiere a una región globular de polipéptido de cadena pesada o ligera que forma espiras de péptidos estabilizados (por ejemplo, formando de 3 a 4 espiras de péptidos), por ejemplo con una capa beta plegada y/o una unión de disulfuro intracadena. Los dominios también son referidos como "constantes" o "variables", basados en la falta relativa de secuencia de variación dentro de los dominios de miembros de varias clases de un dominio "constante" o de la variación significativa dentro de los dominios de miembros de varias clases en el caso de un dominio "variable". Los "dominios" de anticuerpos o polipéptidos se refieren a menudo a la posibilidad e intercambiarse como "regiones" de anticuerpos o polipéptidos. Los dominios "constantes" de una cadena ligera de anticuerpo son referidos como intercambiables como "regiones constantes de cadena ligera", dominios constantes de cadena ligera, regiones "CL" o dominios "CL". Los dominios "constantes" de un anticuerpo de una cadena pesada de anticuerpo se refieren a su posibilidad de intercambio como "regiones constantes de cadena pesada", dominios constantes de cadena pesada", regiones "CH" o dominios "CH". Los dominios "variables" de una cadena ligera de anticuerpo se refieren a posibilidad de intercambio como "regiones variables de cadena ligera", dominios variables de cadena ligera", regiones "VL" o dominios "VL". El dominio "variable" de una cadena ligera de anticuerpos se refiere a la posibilidad de intercambiarse como "regiones variables de cadenas ligeras", "dominios variables de cadena ligera", regiones "VL" o dominios "VL". Los dominios "variables" de una cadena pesada de anticuerpo se refieren la posibilidad de intercambiarse como "regiones constantes de cadena pesada", "dominios constantes de cadena pesada", regiones "CH" o dominios "CH". El término "región" también se puede referir a una parte o porción de una cadena de anticuerpo o dominio de cadena de anticuerpo (por ejemplo una parte o porción de una cadena ligera o pesada o una parte o porción de un dominio constante o variable, tal como aquí se define), así como partes o porciones más discretas de dichas cadenas o dominios. Por ejemplo, las cadenas ligeras y pesadas o los dominios variables de cadenas ligeras o pesadas incluyen "regiones determinantes del complemento" o "CDRs" intercalados entre "regiones de marco" o "FR" como se define en adelante. Las inmunoglobulinas o anticuerpos pueden existir en forma monomérica o polimérica, por ejemplo los anticuerpos IgM que existen en forma pentamérica y/o los anticuerpos IgA que existen en forma monomérica, dimérica multimérica. El término "fragmento" se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o cadena de anticuerpo formado por menos residuos aminoácidos que un anticuerpo completo o una cadena de anticuerpo. Los fragmentos se pueden obtener a través de tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacta o completa. Los fragmentos también se pueden obtener con medios recombinantes. Los fragementos de ejemplo incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fabc y/o fragementos Fv. El término "fragmento enlazador de antígeno" se refiere a un fragmento de polipéptido de una inmunoglobulina o anticuerpo que enlaza antígenos o compite con un anticuerpo intacto (por ejemplo, con el anticuerpo intacto del cual fueron derivados) para el enlace con el antígeno (es decir enlace específico). El término "conformación" se refiere a la estructura terciaria de una proteína o polipéptido (por ejemplo un anticuerpo, cadena de anticuerpo, dominio o región de este). Por ejemplo, la frase "conformación de cadena ligera (o pesada)" se refiere a la estructura terciaria de una región variable de cadena ligera (o pesada), y la frase "conformación de anticuerpos" o "conformación de fragmento de anticuerpo" se refiere a la estructura terciaria de un anticuerpo o fragmento del mismo. "El enlace específico" de un anticuerpo significa que el anticuerpo exhibe una afinidad apreciable por el antígeno o un epítopo predilecto y, preferentemente, no muestra reacción cruzada significativa. El enlace "apreciable" o preferido incluye enlace con una afinidad de al menos 106, 107, 108, 109 M \ ó 1010 M"1. Las afinidades mayores que 107 M"1, preferentemente mayores que 108 M"1 son más deseadas. Los valores intermedios de aquellos aquí representados también estarán dentro del rango del presente invento y se puede señalar una afinidad de enlace preferida como un rango de afinidades, por ejemplo, 106 a 1010 M"1, preferentemente 107 a 1010 M"\ aún más deseado 108 a 1010 M"1. Un anticuerpo que "no exhibe reacción cruzada" es uno que no se enlazará perceptiblemente a una entidad no deseada (por ejemplo una entidad proteinácea no deseada). Por ejemplo, un anticuerpo que se enlaza específicamente con ?ß, se enlazará perceptiblemente con ?ß pero no reaccionará significativamente con proteínas no-?ß o péptidos {por ejemplo, proteínas ??-?ß o péptidos incluidos en placas). Un anticuerpo específico para un epítopo predilecto, por ejemplo, no tendrá reacción cruzada significativa con epítopes en la misma proteína o péptido. El enlace específico se puede determinar a través de cualquier medio reconocido para determinar dicho enlace. De preferencia, el enlace específico se determina según el análisis Scatchard y/o ensayos de enlace competitivos. Los fragmentos de enlace se producen mediante una recombinación de técnicas de ADN, o con la escisión química de inmunoglobulinas intactas. Los fragmentos incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, cadenas simples y anticuerpos de cadenas simples. Aparte de las inmunoglobulinas o anticuerpos "biespecíficas" o "bifuncionales", se entiende que ambos sitios activos de la inmunoglobulina o anticuerpo son idénticos. Un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" es un anticuerpo de híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesadas/ligeras diferentes y dos sitios activos. Los anticuerpos bi-específicos pueden producirse con una variedad de métodos, incluyendo la fusión de hibridomas o enlaces de fragmentos Fab. Ver por ejemplo Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. de Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny y otros, J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). El término "inmunoglobulina humanizada" o "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo o inmunoglobulina que incluye al menos una cadena de inmunoglobulina o anticuerpo humanizada {por ejemplo al menos una cadena humanizada ligera o pesada). El término "cadena de inmunoglobulina humanizada" o "cadena de anticuerpo humanizada" (por ejemplo una cadena de inmunoglobulina humanizada ligera" o "una cadena de inmunoglobulina humanizada pesada") se refiere a una cadena de inmunoglobulina o anticuerpos (por ejemplo una cadena ligera o pesada respectivamente) que tiene un región variable que incluye una región de marco variable básicamente de una inmunoglobulina o anticuerpo humano y de regiones determinantes de complemento (CDRs) (por ejemplo, al menos una CDR, preferentemente dos CDR, aún mejor tres CDRs) básicamente de una inmunoglobulina o anticuerpo no-humano, y además incluye regiones constantes {por ejemplo, al menos una región constante o porción de ésta, en el caso de la cadena ligera, y preferentemente tres regiones constantes en el caso de la región pesada). El término "región variable humanizada" {por ejemplo^ "región variable humanizada de cadena ligera" o "región variable humanizada de cadena pesada) se refiere a una región variable que incluye una región de marco variable básicamente de una inmunoglobulina o anticuerpo y regiones determinantes de complementos (CDRs) básicamente de una inmunoglobulina o anticuerpo no-humano. La frase "básicamente de una inmunoglobulina o anticuerpo humano" o "básicamente humano" significa que cuando se alinea con una secuencia amino de inmunoglobulina o anticuerpo humano para compararlos, la región comparte mínimo 80-90%, preferentemente mínimo 90-95%, mejor mínimo 95-99% de identidad (es decir la identidad de secuencia local) con el marco humano o la secuencia de región constante, por ejemplo, para sustituciones conservadoras, sustituciones de secuencia de consenso, permitiendo por ejemplo sustituciones conservadoras, sustituciones de secuencia de consenso, sustituciones de línea de germen, mutaciones regresivas, etc. La introducción de las sustituciones conservadoras, sustituciones de secuencia de consenso, sustituciones de la línea de germen, mutaciones regresivas y demás, a menudo se conocen como "optimización" de un anticuerpo o cadena humanizada. La frase "básicamente de inmunoglobulina o anticuerpo no-humano" o básicamente no-humano" significa que tiene una secuencia de inmunoglobulina o anticuerpo de al menos 80-90%, preferentemente mínimo 90-95%, mejor mínimo 96%, 97%, 98%, ó 99% idéntico al de un organismo no-humano, por ejemplo a un mamífero no humano.

Según esto, todas las regiones o residuos de una inmunoglobulina o anticuerpo humanizado, o de una cadena de inmunoglobulina o anticuerpo humanizado, excepto los CDRs, son básicamente idénticos a las regiones o residuos correspondientes de una o más secuencias nativas de inmunoglobulina humana. El término "región correspondiente" o "residuo correspondiente" se refiere a la región o residuo en una segunda secuencia aminoácida o nucleótida que ocupa la misma posición (por ejemplo equivalente) que una región o residuo en una primera secuencia aminoácida o nucleótida, cuando la primera y segunda secuencia están óptimamente alineadas por motivos de comparación. El término "identidad significativa" significa que cuando dos secuencias de polipéptidos están alineadas óptimamente como con los programas GAP o BESTFIT que usan pesas de brecha por defecto, comparten al menos 50-60% de la identidad de secuencia, preferentemente al menos 60-70% de la identidad de secuencia, mejor mínimo 70-80% de la identidad de secuencia, mejor mínimo 80-90% de la identidad de secuencia, mejor mínimo 90-95% de la identidad de secuencia, y mucho mejor mínimo 95% o más de la identidad de secuencia (por ejemplo 99% de la secuencia de identidad o más). El término "identidad sustancial" significa que dos secuencias de polipéptidos cuando están alineadas óptimamente, como con los programas GAP o BESTFIT que usan pesas de brecha por defecto, comparten al menos 80-90% de la identidad de secuencia, preferentemente al menos de 90-95% de la identidad de secuencia, y mucho mejor al menos 95% o más de la identidad de secuencia (por ejemplo 99% de la secuencia de identidad o más). En el caso de la comparación de una secuencia, una secuencia actúa típicamente como una secuencia de referencia con la que se compara las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y referencia son ingresadas en una computadora, se diseñan las coordenadas, de ser necesario, y se diseñan los parámetros del programa de algoritmos de secuencia. Luego el algoritmo de comparación de secuencia calcula el porcentaje de la identidad de secuencia para la secuencia (s) prueba relativa a la secuencia de referencia, basado en los parámetros designados en el programa. La alineación óptima de la secuencias para la comparación se puede realizar por ejemplo con el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981 ), con el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), con la búsqueda del método de similitudes Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), con las implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), o con la inspección visual (ver Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology). Un ejemplo de algoritmo apropiado para determinar el porcentaje de la identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que está descrito en Altschul y otros, J. Mol. Biol. 215:403 (1990). El software para realizar los análisis BLAST están a disposición del público en el National Center for Biotechnology Information (con acceso público a través del servidor de internet del National Institutes of Health NCBI). Los parámetros por defecto del programa se pueden usar típicamente para realizar la comparación de secuencia, aunque los parámetros personalizados también pueden ser empleados. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)). Preferentemente, las posiciones de residuos, que no son idénticas, difieren en las sustituciones de aminoácidos conservadores. Por propósitos de clasificación de sustituciones de aminoácidos como conservadores o no conservadores, se agrupa a los aminoácidos como sigue: Grupo I (cadenas laterales hidrofóbicas): leu, met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrofílicas neutrales): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influyen la orientación de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservadoras involucran sustituciones entre aminoácidos en la misma clase. Las sustituciones no conservadoras constituyen el intercambio de un miembro de una de estas clases por el miembro de otra. Preferiblemente, la inmunoglobulina o anticuerpos humanizados enlazan antlgenos con una afinidad que está dentro del factor de tres, cuatro o cinco del anticuerpo no humanizado correspondiente. Por ejemplo, si el anticuerpo no humanizado tiene una afinidad de 109 M"1, los anticuerpos humanizados tendrán una afinidad de enlace de al 3 x 109 M~1, 4 x 109 M"1 ó 109 M"1. Cuando se describen las propiedades de una cadena de inmunoglobulina o anticuerpo, la cadena puede ser descrita basada en su habilidad para "dirigir el enlace de antígenos" (por ejemplo ?ß). Se dice que una cadena "dirige el enlace de antígeno" cuando confiere a una inmunoglobulina o anticuerpo intacto (o fragmento de antígeno enlazador del mismo) una propiedad de enlace específica o afinidad de enlace. Se dice que una mutación (por ejemplo, mutación regresiva) afecta básicamente la capacidad de una cadena ligera o pesada para dirigir el enlace del antígeno si afecta (por ejemplo disminuye) la afinidad de enlace de una inmunoglobulina o anticuerpo intacto (o fragmento de antígeno enlazador del mismo) que forma dicha cadena por al menos un orden de magnitud comparado con el del anticuerpo (o fragmento de antígeno enlazador del mismo) que forma una cadena equivalente a la que le falta dicha mutación. Una mutación "no afecta básicamente (por ejemplo disminuye) la capacidad de una cadena para dirigir un enlace antígeno" si afecta (por ejemplo disminuye) la afinidad de enlace de una inmunoglobulina o anticuerpo intacto (o fragmento de antígeno enlazador del mismo) que forma dicha cadena por sólo un factor de dos, tres o cuatro del anticuerpo (o fragmento de antígeno enlazador del mismo) que forma una cadena equivalente a la que le falta dicha mutación. El término "inmunoglobulina quimérica" o anticuerpo se refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo cuyas regiones variables derivan de una primera especie y cuyas regiones constantes derivan de una segunda especie. Las ¡nmunoglobulinas o anticuerpo quiméricos se pueden construir, por ejemplo, por medio de ingeniería genética, de segmentos de gen de inmunoglobulina perteneciente a diferentes especies. Los términos "inmunoglobulina humanizada" o "anticuerpo humanizado" no pretenden abarcar las inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos, según definido como infra. Aunque las inmunoglobulinas o anticuerpos humanizados son quiméricos en su construcción (por ejemplo comprenden regiones de más de una especie de proteínas) ellos incluyen características adicionales (por ejemplo regiones variables que forman residuos CDR de donante y residuos de marco de receptor) no encontradas en la inmunoglobulina o anticuerpos quiméricos, tal como aquí se define. El antígeno es una entidad (por ejemplo una entidad proteinácea o péptida) a la cual se enlaza específicamente un anticuerpo. El término "epítopo" o "determinante de antígeno" se refiere al lugar en un antígeno al que se enlaza específicamente una inmunoglobulina o anticuerpo (o fragmento de antígeno enlazador del mismo). Los epítopos se pueden formar con aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados con aminoácidos contiguos normalmente son retenidos al ser expuestos a solventes desnaturalizadores, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario normalmente se pierden en el tratamiento con solventes desnaturalizadores. Un epítopo típicamente incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 ó 15 aminoácidos en una conformación especial única. Los métodos para determinar la conformación especial de epítopos incluyen por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear de 2 dimensiones. Ver Epiíope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo se pueden identificar en un inmunoensayo simple que muestre la habilidad de uno de los anticuerpos para bloquear el enlace de otro anticuerpo con un antígeno objetivo, es decir un ensayo de enlace competitivo. El enlace competitivo se determina en un ensayo en el que la inmunoglobulina sometida a prueba inhiba el enlace específico de un anticuerpo de referencia con un antígeno común, como ?ß. Los numerosos tipos de ensayos de enlaces competitivos son conocidos, por ejemplo: el radioimunoensayo de fase sólido directo o indirecto (RIA en inglés), inmunoensayo de enzima de fase sólida directo o indirecto (EIA en inglés) ensayo de competición sandwich (ver Stahli y otros, Methods in Enzymology 9:242 (1983)); biotina-avidina de fase sólida directa EIA (ver Kirkland y otros, J. Immunol. 137:3614 (1986)); ensayo de fase sólida clasificado, ensayo sándwich de fase sólido clasificado (ver Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Press (1988)); RIA de fase sólida usando clasificación 1-125 (ver Morel y otros, Mol. Immunol. 25(1 ):7 ( 988)); EIA biotina-avidina directa de fase sólida (Cheung y otros, Virology 176:546 (1990)); y RIA directo clasificado (Moldenhauer y otros, Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Típicamente, dicho ensayo involucra el uso de un antígeno enlazado a una superficie sólida o células que tengan cualquiera de estas, inmunoglobulina de prueba sin marcar e inmunoglobulina de referencia clasificada. La inhibición competitiva se mide con la determinación de la cantidad de rótulos enlazados a la superficie sólida o células en la presencia de la inmunoglobulina de prueba. Usualmente la inmunoglobulina de prueba está presente en exceso. Usualmente, cuando un anticuerpo competente está presente en exceso, inhibe el enlace específico de un anticuerpo de referencia con un antígeno por al menos 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% o más. Un epítopo también se reconoce por las células inmunológicas, por ejemplo, células B y/o T. El reconocimiento celular de un epítopo se puede determinar con ensayos in vitro que midan la proliferación antígeno dependiente, tal como se determina con la incorporación 3H-timidina, con la secreción de citoquina, con la secreción de anticuerpos o con la desaparición del antígeno-dependiente (ensayo linfocito citotóxico ) Los epítopos ejemplares o determinantes antigénicos se pueden encontrar dentro de la proteína precursora amiloide (APP siglas en inglés) pero preferentemente se encuentran dentro del péptido ?ß de APP. Existen múltiples formas isoformes de APP, por ejemplo APP695 APP751 y APP770. A los aminoácidos dentro de APP se les asigna números según la secuencia de la isoforma APP770 (ver GenBank Accession No. P05067). ?ß péptido (también referido aquí como péptido amiloíde beta y A-beta) es un fragmento interno de aproximadamente 4-kDa de 39-43 aminoácidos de APP (?ß39, ?ß40, ?ß41 , ?ß42 y ?ß43). ?ß40, por ejemplo, está formado por residuos 672-71 1 de APP y ?ß42 está constituido por residuos 673-713 de APP. Como resultados del procesamiento proteolítico de APP con diferentes enzimas de secretasa iv vivo o in situ, se encuentra ?ß en "versión corta", 40 aminoácidos de longitud, y en "versión larga", variando de 42-43 aminoácidos de longitud. Los epítopos preferidos o determinantes antigénicos, como se describen aquí, se encuentran dentro del N-terminal del péptido ?ß e incluye residuos dentro de 1 -10 de ?ß, preferentemente de residuos 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1 -7 ó 3-7 de ?ß42. Epítopos referidos o determinantes antigénicos adicionales incluyen residuos 2-4, 5, 6, 7 ó 8 de ?ß, residuos 3-5, 6, 7, 8 ó 9 de ?ß, o residuos 4-7, 8, 9 ó 10 de ?ß42. Cuando se dice que un anticuerpo se enlaza con un epítopo dentro de los residuos específicos, como ?ß 3-7, se dice que el anticuerpo se enlaza específicamente a un polipéptido que contiene los residuos específicos (por ejemplo ?ß 3-7 en este ejemplo). Tal anticuerpo no contacta necesariamente cada residuo dentro de ?ß 3-7 ni tampoco significa que necesariamente cada sustitución o eliminación del aminoácido en ?ß 3-7 afecta la afinidad de enlace. El término "enfermedad amiloidogénica" incluye cualquier enfermedad asociada con (o causada por) la formación o depósito de fribríllas amiloides insolubles. Enfermedades amiloidogénicas ejemplo incluyen, pero no limitadas a la amiloidosis sistemática, Alzheímer, diabetes de aparición tardía, Parkinson, el mal de Huntington, demencia fronto-temporal, y las encefalopatías espongiformes transmisibles relacionadas con prion (Kuru y Creutzfeldt -el mal de Jacob en humanos y prurito lumbar y BSE en ovejas y ganado, respectivamente). Las diferentes enfermedades amiloidogénicas se definen o caracterizan por la naturaleza del componente polipéptido de las fibrillas depositadas. Por ejemplo, en sujetos o pacientes con Alzheimer, la proteína ß-amiloide (por ejemplo, proteína ß-amiloide del tipo salvaje, variante o truncada) es el componente polipéptido caracterizador del depósito de amiloide. Según esto, el Alzheimer es un ejemplo de una "enfermedad caracterizada por depósitos de ?ß", o una "enfermedad asociada con depósitos de ?ß", por ejemplo, en el cerebro de un sujeto o paciente. Los términos "proteína amiloide ß", "péptido amiloide ß", "amiloide ß", "?ß" y "péptido ?ß" son intercambiados aquí. Un "agente inmunogénico" o "inmunogen" es capaz de inducir una respuesta inmunológica contra sí mismo administrado a un mamífero, opcionalmente en conjunción con un ayudante. El término "tratamiento" como se usa aquí, es definido como la aplicación o administración de un agente terapéutico a un paciente, o la aplicación o administración de un agente terapéutico a un tejido aislado o línea celular de un paciente que tiene una enfermedad, un síntoma de enfermedad o una predisposición hacia una enfermedad, con el propósito de curar, sanar, aliviar, alterar, remediar, mejorar o afectar la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición hacia la enfermedad. El término "dosis efectiva" se define como la cantidad suficiente para lograr o al menos lograr parcialmente el efecto deseado. El término "dosis terapéuticamente efectiva" es definido como la cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermad y sus complicaciones en un paciente que ya sufre de la enfermedad. Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad de la infección y el estado general del sistema inmunológico del paciente. El término "paciente" incluye humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico. El ?ß "soluble" o "disociado" se refiere al polipéptido ?ß no agregante o desagregado, incluyendo el polipéptido ?ß soluble monomérico así como el oligomérico soluble (por ejemplo, dímeros, trímeros solubles ?ß y parecidos). El ?ß "insoluble" se refiere al polipéptido ?ß agregante, por ejemplo, ?ß unido por enlaces no covalentes. Se cree que el ?ß (por ejemplo, ?ß42) se agrega, al menos en parte, debido a la presencia de residuos hidrofóbicos en el C-terminal del péptido (parte del dominio de la transmembrana del APP). El ?ß soluble se puede encontrar in vivo en fluidos biológicos como el fluido cerebroespinal y/o suero. Alternativamente, el ?ß se puede preparar al disolver el péptido liofilizado en DMSO puro con sonicación. La solución resultante es centrifugada (por ejemplo a ?,???? g, 4°C, 10 minutos) para retirar cualquier partícula insoluble. El término "función efectora" se refiere a una actividad que reside en la región Fe de un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo IgG) e incluye por ejemplo, la habilidad del anticuerpo para enlazar moléculas efectoras como los receptores de complemento y/o Fe, que pueden controlar muchas funciones inmunes del anticuerpo como la actividad efectora de la célula, lisis, actividad complemento-mediadora, limpieza del anticuerpo y la vida media del anticuerpo. El término "molécula efectora" se refiere a la molécula capaz de enlazar a la región Fe de un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo IgG) e incluye pero sin limitarse una proteína complementaria o un receptor Fe. El término "célula efectora" se refiere a todas las células capaces de enlazarse a la porción Fe de un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo IgG) típicamente vía un receptor Fe expresado en superficie de la célula efectora, incluyendo pero sin limitarse, linfocitos, por ejemplo, el antígeno que presenta células y célular T. El término "región Fe" se refiere a una región C-terminal de un anticuerpo IgG antibody, en particular, la región C-terminal de la cadena (s) pesada de dicho anticuerpo IgG Aunque los límites de la región Fe de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, una región Fe está típicamente definida como extendiéndose de un residuo aminoácido Cys226 al carboxilo terminal de una cadena pesada de IgG. El término "numeración Kabat" a menos que sea indicado, se define como la numeración de los residuos en, por ejemplo un anticuerpo de cadena pesada de IgG que usa el índice EU como en Kabat y otros (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991 )), expresamente incorporados aquí como referencia. El término "receptor Fe" se refiere a un recepto que se enlaza a la región Fe de un anticuerpo. Los receptores FC típicos que se enlazan con una región Fe de un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo IgG) incluyen pero sin limitarse, receptores de subclases FcyRI, FcyRIl, y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y como alternativa formas de estos receptores. Los receptores son revisados en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991 ); Capel y otros., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas y otros., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995).

I. Reactivos inmunolóqicos y terapéuticos Los reactivos inmunológicos y terapéuticos del invento están formados o consisten de inmunogenes o anticuerpos, o fragmentos de enlaces funcionales o antígenos de los mismos, como aquí se define. Se cree que la unidad estructural básica del anticuerpo conforma un tetrámero de subunidades. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada par contando con una cadena "ligera" (alrededor de 25 kDa) y una cadena pesada (alrededor de 50-70 kDa). La porción amino terminal de cada cadena incluye una región variable de alrededor de 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento antígeno. La porción carboxilo terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función de efecto. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda y tienen aproximadamente 230 residuos de longitud. Las cadenas pesadas se clasifican gamma (?), mu (µ), alpha (a), delta (d), o epsilon (e), tienen aproximadamente 450-600 residuos de longitud y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, respectivamente. Las cadenas pesadas y ligeras se doblan formando dominios. El término dominio se refiere a una región globular, por ejemplo, una inmunoglobulina o anticuerpo. Los dominios de inmunoglobulina o anticuerpos incluyen, por ejemplo 3 o 4 espiras péptidas estabilizados por hojas beta plegadas y un enlace disulfuro de intercadena. Las cadenas ligeras intactas tienen, por ejemplo, dos dominios (VL y CL) y las cadenas pesadas intactas tienen, por ejemplo cuatro o cinco dominios (VH, CH1 , CH2, y CH3). Dentro de las cadenas pesadas y ligeras, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de aprox. 12 o más aminoácidos, teniendo la cadena pesada una región "D" de cerca de 10 o más aminoácidos (ver Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989), Ch. 7, incorporado por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el medio activo del anticuerpo. De esta manera, un anticuerpo intacto tiene dos medios activos. Con excepción de los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos medios activos son los mismos. Todas las cadenas exhiben la misma estructura general de regiones de marco relativamente conservadas (FR en inglés) unidas con tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de complemento o CDRs. Las cadenas que se presentan naturalmente o cadenas que son producidas por recombinación se pueden expresar con una secuencia líder que es retirada duran el procesamiento celular para producir una cadena madura. Las cadenas maduras también se pueden producir por recombinación ya que tienen una secuencia líder que no ocurre naturalmente, por ejemplo, para mejorar la secreción o alterar el procesamiento de una cadena particular de interés. Los CDRs de las dos cadenas maduras de cada par están alineados por las regiones de marco permitiendo el enlace a un epítopo específico. Desde el terminal N al terminal C la cadena ligera y la pesada conforman los dominios FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. "FR4" también es conocido en el medio como la región D/J de la cadena variable y la región J de la cadena ligera. La asignación de aminoácidos a cada dominio va de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991 ). Una definición estructural ha sido propuesta por Chothia y otros, J. Mol. Biol. 196:901 (1987); Nature 342:878 (1989); y J. Mol. Biol. 186:651 (1989) (de aquí en adelante "Chothia y otros" e incorporado por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

A. Anticuerpos ?ß Los agentes terapéuticos del invento incluyen anticuerpos que específicamente se enlazan con ?ß u otros componentes de la placa amiloide. Los anticuerpos preferidos son los anticuerpos monoclonales. Algunos de estos anticuerpos se enlazan específicamente con la forma agregada de ?ß sin enlazarse con la forma soluble. Algunos se enlazan específicamente con la forma soluble sin enlazarse con la forma agregada. Algunos se enlazan con la forma agregada y soluble. Los anticuerpos preferentemente usados en los métodos terapéuticos tienen una región constante intacta o al menos suficiente de la región constante como para interactuar con un receptor Fe. Los anticuerpos preferidos son aquellos eficaces par estimular la fagocitosis Fc-mediada de ?ß en placas. Se prefiere el isotipo humano lgG1 , ya que tiene la más alta afinidad de isotipos humanos para el receptor FcRI en células fagocíticas (por ejemplo, en macrófagos cerebrales residentes o células microgliales). El lgG1 humano es el equivalente lgG2a murino, siendo el último apropiado para pruebas de eficacia in vivo en modelos animales (por ejemplo el ratón) de Alzheimer. Los fragmentos biespecíficos Fab también se pueden usar, en los que un brazo del anticuerpo tiene especificidad por ?ß y el otro por un receptor Fe. Los anticuerpos preferidos se enlazan a ?ß con una afinidad de enlace mayor (o igual) a aproximadamente 106, 107, 108, 109, ó 1010 M"1 (incluyendo afinidades intermedias de estos valores).

Los anticuerpos monoclonales se enlazan a un epítopo específico dentro de ?ß que puede ser un epítopo conformacional o no conformacional. La eficacia de la terapia profiláctica y terapéutica de anticuerpos se puede probar usando los procedimientos de modelos animales transgénicos descritos en los ejemplos. Los anticuerpos monoclonales preferidos se enlazan a un epítopo dentro de los residuos 1-10 de ?ß (con el primer residuo terminal N de ?ß natural designado 1 ), aún mejor a un epítopo dentro de los residuos 3-7 de ?ß. En algunos métodos se usan los anticuerpos monoclonales múltiples que tienen especificidades de enlace a diferentes epítopos, por ejemplo, un anticuerpo específico para un epítopo dentro de los residuos 3-7 de ?ß puede ser coadministrado con un anticuerpo específico para epítopo fuera de los residuos 3-7 de ?ß. Dichos anticuerpos pueden administrarse secuencialmente o simultáneamente. Los anticuerpos para los componentes amiloides aparte de ?ß también se pueden usar (por ejemplo administrados o coadministrados). La especificidad del epítopo de un anticuerpo se puede determinar por ejemplo, formando una biblioteca fago en la cual diferentes miembros presentan diferentes subsecuencias de ?ß. La biblioteca fago es entonces seleccionada por miembros específicamente enlazados a un anticuerpo sometido a prueba. Una familia de secuencias es aislada. Normalmente dicha familia contiene un secuencia base central común y longitudes variables de secuencias flanqueantes en diferentes miembros. La secuencia central más corta que muestra enlaces específicos con los anticuerpos define el epítopo enlazado por el anticuerpo. Los anticuerpos también pueden ser probados para buscar especificidad en un ensayo de competición con un anticuerpo cuya especificidad de epítopo ya haya sido determinada. Por ejemplo, los anticuerpos que compiten con el anticuerpo 12B4 para el enlace con ?ß se enlazan al mismo epítopo o a uno similar al de 12B4, es decir, dentro de los residuos ?ß 3-7. El proceso de selección de anticuerpos buscando especificidad de epítopo ayuda a predecir la eficacia terapéutica. Por ejemplo, un anticuerpo que se haya determinado vaya a enlazarse con un epítopo dentro de los residuos 1-7 de ?ß probablemente prevea y trate con efectividad el Alzheimer según las metodologías del presente invento. Los anticuerpos que se enlazan específicamente a un segmento preferido de ?ß sin enlazarse a otras regiones de ?ß tienen un número de ventajas relativas a los anticuerpos monoclonales que se enlazan a otras regiones o que los sueros policlonales a ?ß intacto. En primer lugar, para dosis de masa iguales, las dosis de los anticuerpos que específicamente se enlazan a los segmentos preferidos contienen una dosis molar más alta de anticuerpos efectiva en la limpieza de placas amiloides. Segundo, los anticuerpos que se enlazan específicamente con los segmentos preferidos pueden inducir una respuesta de limpieza contra los depósitos de amiloides sin inducir una respuesta de limpieza contra el polipéptido APP intacto, reduciendo así los efectos secundarios potenciales. 1. Producción de anticuerpos no humanos El invento presenta anticuerpos no humanos, por ejemplo, anticuerpos que tienen especificidad por los epítopos ?ß preferidos del invento. Dichos anticuerpos se pueden usar en la formulación de varias composiciones terapéuticas del invento o, de preferencia, proporcionar regiones determinantes del complemento para la producción de anticuerpos humanizados o quiméricos (descritos a continuación en detalle). La producción de los anticuerpos monoclonales no humanos, por ejemplo, murinos, conejillos de india, conejos o ratas, se puede lograr, por ejemplo, inmunizando al animal con ?ß. Un polipéptido más largo formado de ?ß o un fragmento inmunogéntico de ?ß o anticuerpos anti-idiotípicos para un anticuerpo para ?ß también se puede usar. Ver Harlow & Lañe, supra, incorporado por referencia para todos los propósitos. Dicho inmunogen se puede obtener de una fuente natural a través de la síntesis de péptido o con una expresión recombinante. Opcionalmente se puede administrar el inmunogen fundido o sino colocado en complejo con una proteína portadora, como se describe a continuación. Otra opción es administrar el inmunogen con un ayudante. El término "ayudante" se refiere a un compuesto que cuando es administrado en conjunción con antígeno aumenta la respuesta inmune al antígeno pero cuando se administra solo no genera una respuesta inmune al antígeno. Los ayudantes pueden aumentar una respuesta inmune con distintos mecanismos incluyendo el recrudecimiento linfocito, estimulación de células B y/o T y la estimulación de macrofagos. Diferentes tipos de ayudantes pueden usarse como se describe a continuación. Se prefiere el ayudante completo de Freund seguido de un ayudante incompleto para la inmunización de animales de laboratorio. Normalmente se usan los conejos o conejillos de india para crear anticuerpos policlonales. La preparación ejemplo de los anticuerpos, por ejemplo, para la protección pasiva, se puede realizar de la siguiente manera: Se inmuniza a 125 ratones no transgénicos con 100 µg ?ß1-42, más ayudante CFA/IFA y se les practica la eutanasia a los 4-5 meses. Se extrae sangre de los ratones inmunizados . Se separa el IgG de los otros componentes sanguíneos. El anticuerpo específico para el inmunogen puede purificarse parcialmente con la cromatografía de afinidad. Se obtiene un promedio de casi 0.5-1 mg de anticuerpo de inmunogen específico por cada ratón, dando un total de 60-120 mg. Los ratones son utilizados típicamente para crear anticuerpos monoclonales. Los monoclonales se pueden preparar contra un fragmento inyectando el fragmento o forma larga de ?ß en un ratón, preparando hibridomas y buscando en los hibrodomas un anticuerpo que se enlace específicamente a ?ß. Opcionalmente, los anticuerpos son sometidos a una selección para buscar una región específica o un fragmento deseado de ?ß sin enlazarse a otros fragmentos no montados de ?ß. La última búsqueda se puede lograr determinando el enlace de un anticuerpo con una colección de mutantes de eliminación de un péptido ?ß y determinando que muíante de eliminación se enlaza con el anticuerpo. El enlace se puede evaluar, por ejemplo, con el Western blot o ELISA. El fragmento más pequeño que muestra el enlace específico con el anticuerpo define el epítopo del anticuerpo. Otra alternativa es determinar la especificidad del epítopo a través de un ensayo de competencia que es una prueba y un anticuerpo de referencia de competencia para el enlace con ?ß. Si los anticuerpos de prueba y de referencia compiten, entonces se enlazan al mismo epítopo o epítopos lo suficientemente cércanosos de modo que el enlace de uno de los anticuerpos interfiere con el enlace del otro. El isotipo preferido para dichos anticuerpos es el isotipo de ratón lgG2a o el isotipo equivalente en otras especies. El isotipo lgG2a del ratón es el equivalente al isotipo humano lgG1 (por ejemplo lgG1 humano). 2. Anticuerpos Quiméricos y humanizados El presente invento también presenta los anticuerpos quiméricos y/o humanizados (por ejemplo, inmunoglobulinas quimérica o humanizada) específica para el péptido amiloide beta. Los anticuerpos quiméricos o humanizados tienen la misma especificidad de enlace y afinidad que un ratón u otros anticuerpos no humanos que proporcionan el material de inicio para la construcción de un anticuerpo quimérico o humanizado.

A. Producción de anticuerpos quiméricos El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo cuyas cadenas de genes ligeras y pesadas hayan sido construidas, típicamente con la ingeniería genética, a partir de segmentos de gen de inmunoglobulina pertenecientes a diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables (V) de los genes de un anticuerpo de ratón monoclonal pueden unirse a segmentos constantes humanos (C) como lgG1 e lgG4. El isotipo humano lgG1 es preferido. Así, un anticuerpo quimérico típico es una proteína híbrida que contiene un dominio V o enlace antígeno de un anticuerpo de ratón y el dominio C o causante de un anticuerpo humano.

B. Producción de anticuerpos humanizados El término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo formado por al menos una cadena compuesta por residuos de marco de región variable básicamente de una cadena de anticuerpos humano (referido como la inmunoglobulina o anticuerpo receptor) y al menos una región determinante de complemento básicamente del anticuerpo de un ratón (referido como la inmunoglobulina del donante o anticuerpo). Ver Queen y otros, Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 86:10029-10033 (1989), US 5,530,101 , US 5,585,089, US 5,693,761 , US 5,693,762, Selick y otros., WO 90/07861 , y Winter, US 5,225,539 (incorporado por referencia en su totalidad para todos los propósitos) Las regiones constantes si están presentes también son básicamente o completamente de una inmunoglobulina humana. La sustitución de los CDRs de ratón por un marco humano de dominio variable es probable que produzca retención de su orientación especial correcta si el marco de dominio variable humano adopta la misma o similar conformación del marco variable del ratón del cual se originó el CDR. Esto se logra obteniendo los dominios variables humanos de los anticuerpos humanos cuyas secuencias de marcos exhiban un alto grado de identificación de secuencia con lo dominios de marco variable murinos de los cuales se derivan los CDRs. Las regiones de marco variable ligeras y pesadas se pueden derivar de la misma o diferentes secuencias de anticuerpos humanos. Las secuencias de anticuerpos humanos pueden ser la secuencia de los anticuerpos humanos que ocurren naturalmente o pueden ser la secuencia consenso de muchos anticuerpos humanos. Ver Kettleborough y otros, Protein Engineering 4:773 (1991 ); Kolbinger y otros., Protein Engineeríng 6:971 (1993) y Cárter y otros., WO 92/22653. Habiendo identificado las regiones determinantes del complemento de la inmunoglobulina de donante murino y las inmunoglobulinas humanas receptoras, el siguiente paso es determinar qué residuos de estos componentes deben sustituirse para optimizar las propiedades del anticuerpo humanizado resultante, si los hay. En general, la sustitución de los residuos aminoácidos humanos con el murino se debe minimizar, debido a que la introducción de los residuos murino incrementa el riesgo de que el anticuerpo provoque una respuesta anticuerpo humano-antiratón (HAMA siglas en inglés) los métodos reconocidos por el medio para determinar la respuesta inmune puede realizarse para monitorear una respuesta HAMA en un paciente particular o durante pruebas clínicas. Los pacientes a los que se les administra con anticuerpos humanizados se les puede realizar una evaluación de inmunogenicidad al comienzo y durante la administración de la terapia mencionada. La respuesta HAMA es medida, por ejemplo, con la detección de anticuerpos para el reactivo terapéutico humanizado, en muestras de suero del paciente que usa un método conocido en el medio incluyendo la tecnología de resonancia de plasmón superficial (BIACORE) y/o el análisis de fase sólida ELISA. Ciertos aminoácidos de los residuos humanos de marco de región variable son seleccionados para la sustitución basándose en su posible influencia en la conformación y/o enlace del CDR al antígeno. La yuxtaposición no natural de las regiones CDR murinas con la región de marco variable humana puede resultar en límites conformacionales no naturales, los que, a menos que sean corregidos con una sustitución de ciertos residuos de aminoácidos, conducen a la pérdida de la afinidad de enlace. La selección de los residuos de aminoácidos es determinada en parte por el modelo de la computadora. Aquí se describe el hardware y software de computadora usados para producir imágenes tridimensionales de las moléculas de inmunoglobulinas. En general, los modelos moleculares son producidos a partir d estructuras resueltas para cadenas de inmunoglobulina o dominios de la misma. Las cadenas a modelarse se comparan para ver la similitud de la secuencia de aminoácido con las cadenas o dominios de las estructuras tridimensionales resueltas, y las cadenas o dominios que muestran las mayores similitudes de secuencia son seleccionadas como puntos de inicio para la construcción del modelo molecular. Las cadenas o dominios que comparten al menos el 50% de la identidad de secuencia son seleccionados para el modelado, y preferentemente aquellos que comparten al menos 60%, 70%, 80%, 90% de identidad de secuencia o más son seleccionados para el modelado. Las estructuras resueltas iniciales se modifican para que permitan las diferencias entre los aminoácidos reales en las cadenas o dominios de inmunoglobulina que están siendo modelados, aquellos en la estructura inicial. Las estructuras modificadas luego son reunidas en una inmunoglobulina compuesta. Finalmente, el modelo es refinado con la minimización de la energía y verificando que todos los átomos estén a una distancia apropiada entre sí y que las longitudes de las uniones y ángulos estén dentro de los límites químicamente aceptables. La selección de los residuos de aminoácidos para la sustitución se puede determinar en parte examinando las características de los aminoácidos en lugares particulares, o con observación empírica de los efectos de la sustitución o mutagénesis de aminoácidos particulares. Por ejemplo, cuando un aminoácido difiere entre un residuo de marco murino de región variable y un residuo de marco humano variable seleccionado, el aminoácido de marco humano debe ser sustituido usualmente por el aminoácido de marco equivalente del anticuerpo del ratón cuando se espera que el aminoácido: (1 ) se enlace directamente con el antígeno de forma no covalente, (2) sea adyacente a una región CDR, (3) interactúe de otro modo con una región CDR (por ejemplo, está dentro del 3-6 Á de la región CDR como se determinó con el modelado de computadora), o (4) participe en la interfase VL-VH.

Los residuos que "se unen directamente al antígeno directamente de forma no covalente" incluyen aminoácidos en posiciones den regiones de marco que tienen gran probabilidad de interactuar directamente con aminoácidos en el antígeno según fuerzas químicas establecidas, por ejemplo con la unión de hidrógeno, fuerzas Van der Waals, interacciones hidrofóbicas y demás. Las regiones CDR y de marco están definidas por Kabat y otros o Chothia y otros, supra. Cuando los residuos de marco, como los definió Kabat y otros, supra, constituyen residuos de espiras estructurales como definidos por Chothia y otros, supra., el aminoácido presente en el anticuerpo del ratón puede ser seleccionado para la sustitución en el anticuerpo humanizado. Los residuos "adyacentes" a una región CDR" incluyen residuos de aminoácidos en posiciones inmediatamente adyacentes a uno o más de los CDRs en la secuencia primaria de la cadena humanizada de inmunoglobulina, por ejemplo, en posiciones inmediatamente adyacentes a un CDR como lo definió Kabat, o un CDR como lo definió Chothia (Ver Chothia y Lesk JMB 196:901 (1987)). Estos aminoácidos son muy propensos a interactuar con los aminoácidos en los CDRs y si lo escoge el receptor distorsiona los CDR donantes y reduce la afinidad. Más aún, los aminoácidos adyacentes pueden interactuar directamente con el antigeno (Amit y otros., Science, 233:747 (1986), que se incorpora aquí por referencia) y seleccionar estos aminoácidos del donante podría ser deseable para mantener todos los contactos antígenos que proporcionan afinidad en el anticuerpo original. Los residuos que "de otro modo interactúan con una región CDR" incluyen aquellos determinados por el análisis estructural secundario para estar en una orientación espacial suficiente como para afectar a la región CDR. En una representación, los residuos que "de otro modo interactúan con una región CDR" son identificaos con el análisis de un modelo tridimensional del donante de inmunoglobulina por ejemplo un modelo generado por computadora). Un modelo de tres dimensiones, típicamente del anticuerpo del donante original, muestra que ciertos aminoácidos fuera de los CDRs están cerca de los CDRs y tiene una buena probabilidad de interactuar con los aminoácidos en los CDRs por medio de uniones con hidrógeno, fuerzas Van der Waals, interacciones hidrofóbicas, etc. En todas esas posiciones de aminoácidos, se puede seleccionar al aminoácido de la inmunoglobulina del donante en vez del aminoácido de la inmunoglobulina del aceptor. Según este criterio los aminoácidos tendrán generalmente un átomo de cadena secundaria dentro de 3 unidades angstrom (Á) de algún átomo en los CDRs y debe contener un átomo que pueda interactuar con los átomos CDR según fuerzas químicas establecidas, como las listadas anteriormente. En el caso de los átomos que pueden formar una unión de hidrógenos, los 3 Á son medidos entre sus núcleos pero para los átomos eso no forma una unión, el 3 Á es medido entre sus superficies Van der Waals. Debido a esto, en el último caso, el núcleo debe estar dentro de aproximadamente 6 Á (3 Á más la suma de los radios Van der Waals) para que los átomos sean considerados capaces de interactuar. En muchos casos, el núcleo será de 4 ó 5 a 6 Á apartados. Para determinar si un aminoácido puede interactuar con los CDRs, es preferible no considerar los últimos 8 aminoácidos de cadenas pesadas CDR 2 como parte de las CDRs, porque desde el punto de vista de una estructura, estos 8 aminoácidos se comportan como parte de un marco. Los aminoácidos que son capaces de interactuar con los aminoácidos en los CDRs, pueden identificarse de otro modo. El área de superficie adecuada solvente de cada aminoácido de marco es calculado de dos modos: (1 ) en el anticuerpo intacto y (2) en una molécula hipotética formada por el anticuerpo con sus CDRs removidas. Una diferencia significativa entre estos números de aproximadamente. 10 angstroms cuadrados o más muestra que el acceso al aminoácido de marco para solventar está al menos parcialmente bloqueado por los CDR y por esta razón es que el aminoácido está teniendo contacto con los CDRs. El área de superficie accesible por solventes de un aminoácido puede calcularse basado en un modelo tridimensional de un anticuerpo, usando algoritmos conocidos en el arte (por ejemplo Connolly, J. Appl. Cryst. 16:548 (1983) y Lee y Richards, J. Mol. Biol. 55:379 (1971 ), los que son incorporados aquí por referencia). Los aminoácidos de marco también podrían interactuar ocasionalmente con los CDR indirectamente afectando la conformación de otro aminoácido de marco que a su vez contacte los CDRs. Los aminoácidos en diferentes posiciones en el marco son reconocidos por ser capaces de interactuar con los CDRs en muchos anticuerpos (Chothia y Lesk, supra, Chothia y otros., supra y Tramontano y otros., J. Mol. Biol. 215:175 (1990), todos los cuales son incorporados aquí por referencia). Notablemente, los aminoácidos en las posiciones 2, 48, 64 y 71 de la cadena ligera 26-30, 71 y 94 de la cadena pesada (numeración según Kabat) son conocidos por ser capaces de interactuar con los CDR en muchos anticuerpos. Los aminoácidos en las posiciones 35 en la cadena ligera y 93 y 103 en la cadena pesada también son propensos a interactuar con los CDRs. En todas esas posiciones numeradas, la elección del aminoácido del donante en lugar del aminoácido del receptor (cuando difieren) para estar en la inmunoglobulina humanizada es preferida. Por otro lado, ciertos residuos capaces de interactuar con la región CDR, como los primeros 5 aminoácidos de la cadena ligera, podrían algunas veces ser escogidos de la inmunoglobulina del receptor sin pérdida de afinidad en la inmunoglobulina humanizada. Los residuos que "participan en la interfase VL-VH" o "los residuos almacenados" incluyen aquellos residuos de la interfase entre VL y VH como está definido, por ejemplo, por Novotny y Haber, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:4592-66 (1985) o Chothia y otros, supra. Generalmente, los residuos almacenados inusuales deben ser retenidos en el anticuerpo humanizado si difieren de aquellos de los marcos humanos. En general, uno o más de los aminoácidos que cumplan los criterios arriba mencionados son sustituidos. En algunas representaciones, todos o la mayoría de los aminoácidos que cumplen con los criterios arriba mencionados son sustituidos. Ocasionalmente existe una ambigüedad acerca de si un aminoácido particular cumple los criterios y se producen inmunoglobulinas alternativas variantes, una de las cuales tiene esa sustitución particular, la otra no la tiene. Las inmunoglobulinas variantes alternativas producidas de esta manera se pueden probar en cualquiera de los ensayos descritos aquí para la actividad deseada, y la inmunoglobulina preferida seleccionada. Usualmente las regiones CDR en los anticuerpos humanizados son sustancialmente idénticas, y con mayor frecuencia, idénticas a las correspondientes regiones CDR del anticuerpo del donante. Aunque no es usualmente deseable, a veces es posible hacer una o más sustituciones más conservadoras de aminoácidos de lo residuos CDR sin afectar la afinidad de enlace de la inmunoglobulina humanizada resultante. Con sustituciones conservadoras se refiere a: gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; y phe, tyr. Los candidatos adicionales para la sustitución son los aminoácidos de marco de receptores humanos que son inusuales o "raros" para una inmunoglobulina humana en esa posición. Estos aminoácidos se pueden sustituir con aminoácidos de la posición equivalente del anticuerpo del ratón donador o de las posiciones equivalentes de inmunoglobulinas humanas más típicas. Por ejemplo, la sustitución puede ser deseable cuando un aminoácido en una región de marco humana de la inmunoglobulina del receptor es rara para esa posición y el correspondiente aminoácido en la inmunoglobulina del donante es común para esa posición en las secuencias de inmunoglobulinas humanas o cuando el aminoácido en la inmunoglobulina del receptor es raro para esa posición y el aminoácido correspondiente a la inmunoglobulina del donante es también raro, relativa a otras secuencias humanas. Estos criterios ayudan a asegurarse que un aminoácido atípico en el marco humano no perturbe la estructura del anticuerpo. Más aún, al reemplazar un aminoácido de aceptor humano inusual con un aminoácido del anticuerpo del donante que de casualidad es típico para los anticuerpos humanos, el anticuerpo humanizado puede ser menos inmunogénico. El término "inusual" como aquí se emplea indica un aminoácido presente en una posición menor a 20% pero usualmente menor a 10% en secuencias en una muestra representativa de las secuencias, y el término "común" como se usa aquí, indica un aminoácido presente en más del 25% pero usualmente más del 50% en las secuencias en una muestra representativa. Por ejemplo, todas las secuencias ligeras y pesadas humanas de región variable están divididas en "subgrupos" de secuencias que son específicamente homologas entre sí y que tienen los mismos aminoácidos en ciertas posiciones críticas (Kabat y otros., supra). Cuando se decide si un aminoácido en una secuencia de receptor humano es "inusual" o "común" entre las secuencias humanas, muchas veces será preferible considerar sólo aquellas secuencias en el mismo subgrupo que la secuencia del receptor . Candidatos adicionales para la sustitución son aminoácidos de marco de aceptor humano que serían identificados como parte de una región CDR bajo la definición alternativa propuesta por Chothia y otros., supra. Candidatos adicionales para la sustituciones son los aminoácidos de marco de aceptr humano que serían identificados como parte de una región CDR bajo el AbM y/o definiciones de contacto. Candidatos adicionales para la sustitución son residuos de marcos de receptores que corresponden a un residuo de marco raro o inusual. Los residuos de marcos raros o inusuales son aquellos que son raros o inusuales (como se define aquí) para anticuerpos murinos en esa posición. En el caso de los anticuerpos murinos, se puede determinar el subgrupo según Kabat y las posiciones de residuo que difieren del consenso. Estas diferencias específicas de donante podrían señalar mutaciones somáticas en la secuencia murina que mejoran la actividad. Los residuos inusuales que se supone afectan los enlaces, son retenidos, mientras que los enlaces que se suponen no son de importancia para los enlaces pueden sustituirse. Candidatos adicionales para la sustitución son residuos de gérmenes no en línea que se presentan en una región de marco receptor. Por ejemplo cuando una cadena de anticuerpo de receptor (es decir una cadena de anticuerpo humano que comparte identidad de secuencia significativa con la cadena de anticuerpo del donante) está alineada con una cadena de anticuerpo de línea de germen (compartiendo del mismo modo identidad de secuencia significativa con la cadena del donante), los residuos que no encajen entre el marco de la cadena receptora y el marco de cadena de línea de germen se puede sustituir con los residuos correspondientes de la secuencia de línea de germen. Además de las sustituciones de aminoácidos específicas ya discutidas, las regiones de marco de inmunoglobulinas humanizadas son usualmente sustancialmente idénticas, y más usualmente, idénticas a las regiones de marco de los anticuerpos humanos de los cuales fueron derivados. Desde luego, muchos de los aminoácidos en la región de marco no contribuyen en nada o casi nada a la especificidad o afinidad de un anticuerpo. Así, muchas sustituciones conservadoras individuales de los residuos de marco se pueden tolerar sin cambio apreciable en la especificidad o afinidad de la inmunoglobulina humanizada resultante. Así, en una representación la región variable del marco de la inmunoglobulina humanizada comparte como mínimo 85% de la identidad de secuencia con una secuencia de región de marco variable o el consenso de dichas secuencias. En otra representación, la región de marco variable de la inmunoglobulina humanizada comparte al menos 90%, de preferencia 95%, mucho mejor 96%, 97%, 98% ó 99% de la identidad de secuencia con una secuencia de región de marco variable o el consenso de dichas secuencias. Sin embargo, tales sustituciones no son deseadas generalmente. Los anticuerpos exhiben preferentemente una afinidad de enlace específica en el caso de antígenos de al menos I07, 108, 109 ó I010 M"1. Usualmente el límite superior de la afinidad de enlace de los anticuerpos para el antígeno está dentro del factor de tres, cuatro o cinco de la de inmunoglobulina del donante. A menudo, el límite inferior de la afinidad de enlace también se encuentra dentro del factor de tres, cuatro o cinco de la de inmunoglobulina del donante. Alternativamente, la afinidad de enlace se puede comparar con la del anticuerpo humanizado sin sustituciones (por ejemplo un anticuerpo que tiene CDRs de donante y FRs del receptor pero no sustituciones FR). En tales casos, el enlace del anticuerpo optimizado (con sustituciones) es preferible al menos dos a tres veces más, o tres a cuatro veces más, que el del anticuerpo no sustituido. Para realizar comparaciones, la actividad de los anticuerpos se puede determinar, por ejemplo, con BIACORE (es decir, con resonancia de plasmón superficial usando reactivos no clasificados) o ensayos de enlace competitivos.

C. Producción de anticuerpos 12B4 humanizados Una representación preferida del invento presenta un anticuerpo humanizado al terminal N de ?ß, en particular, para su uso en las metodologías terapéuticas y/o de diagnóstico aquí descritas. Un material inicial particularmente preferido para la producción de anticuerpos humanizados es el 12B4. El 12B4 es específico para el terminal N de ?ß y ha sido mostrado para lograr fagocitosis (es decir inducir fagocitosis) de una placa amiloide. La clonación y secuencia de cADN codificando las regiones 12B4 de anticuerpo de cadena ligera y pesada se describe en el ejemplo 1. Las secuencias de anticuerpos de aceptor humano apropiadas son identificadas con comparaciones de computadoras de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables con las secuencias de conocidos anticuerpos humanos. La comparación se realiza por separado para las cadenas pesadas y ligeras pero los principios son similares para cada uno. En particular, los dominios de los anticuerpos cuyas secuencias de marco exhiben un alto grado de identidad de secuencia con las regiones de marco murinas VL y VH fueron identificadas por investigación de la base de datos Kabat usando NCBI BLAST (con acceso al público a través del servidor de internet del National Institutes of Health NCBI) con las respectivas secuencias murinas de marco. En una representación, las secuencias del aceptor que compartían más del 50% de la identidad de secuencia con las secuencias murinas del donante son seleccionadas. De preferencia, se seleccionan secuencias de anticuerpo del aceptor que comparten el 60%, 70%, 80%, 90% o más. Una comparación por computadora del 12B4 reveló que la cadena ligera del 12B4 mostraba la mayor identidad de secuencia para las cadenas humanas ligeras del subtipo kappa II, y que la cadena 12B4 pesada muestra gran identidad de secuencia con las cadenas pesadas humanas del suptipo II, como lo definió Kabat y otros, supra. Así, las regiones ligeras y pesadas de marcos humanos se dividen preferentemente de los anticuerpos humanos de esto tipos o de secuencias de dichos subtipos. Las regiones variables humanas de cadena ligera que muestran una gran identidad de secuencia con la región correspondiente región de 12B4 provienen de un anticuerpo que tiene el número Kabat ID Número 005036. Las regiones variables humanas de cadena pesada que muestran una gran identidad de secuencia con la correspondiente región de 12B4 provienen de un anticuerpo con el número Kabat ID Número 000333, un anticuerpo que tiene el número del Genbank N. AAB35009 y un anticuerpo con el número Genbank N.

AAD53816, siendo el anticuerpo de número Kabat ID Numero 000333 el más deseado. Los residuos son seleccionados para sustitución de la siguiente manera: Cuando un aminoácido difiere entre la región variable de marco 12B4 y una región variable humana de marco, el aminoácido de marco humano debe sustituirse usualmente con el equivalente de aminoácido de ratón si se espera que el aminoácido: (1 ) enlace directamente el antígeno de forma no covalente, (2) sea adyacente a una región CDR, sea parte de una región CDR bajo la definición alternativa propuesta por Chothia y otros., supra, o de otro modo, interactúe con una región CDR (es decir, dentro de 3A de una CDR región ), o (3) participe en la interfase VL-VH El diseño por computadora de las regiones variables 12B4 de cadena pesada y ligera, y la humanización del anticuerpo 12B4 se describen en el ejemplo IV. Brevemente, se genera un modelo tridimensional basado en las estructuras de anticuerpos murinos resueltas para las cadenas pesadas y ligeras. El modelo es refinado aún más con una serie de pasos de minimización para aliviar los contactos atómicos desfavorables y optimizar interacciones electrostáticas y de Van der Walls. La información estructural tridemensional para los anticuerpos descrita aquí es pública, por ejemplo, en el Research Collaboratory for Structural Bioinformatics' Protein Data Bank (PDB en inglés). El tiene libre acceso vía de WWW y es descubierto por Berman y otros (2000) Nucleic Acids Research, 28:235. El diseño por computadora permite la identificación de los residuos que interactúan con CDR. El modelo de la computadora de la estructura 12B4 puede servir a su vez como punto de inicio para predecir la estructura tridimensional de un anticuerpo que contiene las regiones 12B4 determinantes de complemento sustituidas en las estructuras humanas. Se puede construir modelos adicionales representando la estructura hasta de cómo se introduce las sustituciones. En general, la sustitución de un, la mayoría o todos los aminoácidos que cumplen los criterio ya mencionados sería deseable. De acuerdo con esto, los anticuerpos humanizados del presente invento contendrá usualmente una sustitución de un residuo de marco humano de cadena ligera con un correspondiente residuo 12B4 en al menos 1 ,2,3 o más de estas posiciones escogidas. Los anticuerpos humanizados también contendrán usualmente una sustitución de un residuo de marco de cadena pesada con un residuo 12B4 correspondiente a al menos 1 ,2,3, o mas de las posiciones escogidas. No obstante, se produce ocasionalmente una ambigüedad acerca de si un aminoácido en particular cumple con los criterios y se produce inmunoglobulinas variantes alternativas, una de las cuales tiene esa sustitución particular, la otra no. En casos donde la sustitución con un residuo murino introduciría un residuo que es raro en inmunoglobulinas humanas en una posición particular, podría ser deseable probar el anticuerpo para la actividad con o sin la sustitución particular. Si la actividad (por ejemplo afinidad de enlace y/o especificidad de enlace) es la misma con o sin la sustitución, el anticuerpo sin la sustitución pueda ser preferida, ya que se esperaría que produjera una respuesta HA A menor, como aquí se describe. Otros candidatos para la sustitución son los aminoácidos de marco de aceptor humano que son inusuales para una inmunoglobulina en esa posición. Estos aminoácidos pueden ser sustituidos con aminoácidos de la posición equivalente de inmunoglobulinas humanas más típicas. De manera alternativa, los aminoácidos de posiciones equivalentes al 12B4 de ratón se pueden introducir en las regiones de marco humanas cuando dichos aminoácidos son típicos de inmunoglobulina humana en las posiciones equivalentes. Otros candidatos para la sustitución son los residuos de germen no en línea que se presentan en una región de marco. Al realizar la comparación por computadora del 12B4 con secuencias conocidas de líneas de germen, se pueden identificar líneas de germen con el mayor grado de identidad de secuencia para la cadena pesada o ligera. La alineación de la región de marco y la secuencia de línea de germen revelará que residuos pueden seleccionarse para la sustitución con las correspondientes líneas de germen. Los residuos que no encajen entre un marco de receptor de cadena ligera seleccionado y una de estas secuencias de línea de germen podría ser seleccionado para sustitución con el correspondiente residuo de línea de germen. El cuadro 1 resume el análisis de secuencia de las regiones 12B4 VH y VL. Las estructuras adicionales de ratones y humanos que se pueden usar para el diseño por computadora del anticuerpo 12B4. Además, anticuerpos adicionales humanos están presentadas también como secuencias de línea de germen que se pueden usar en la selección de sustituciones de aminoácidos. Residuos raros de ratón son también presentados en la Tabla 1. Los residuos raros de ratón están identificados por comparación de VL del donante y/o secuencias VH con las secuencias de otros miembros del subgrupo al que el VL del donante y/o las secuencias VH pertenecen (según Kabat) y la identificación de las posiciones de los residuos que difieren del consenso. Estas diferencias específicas del donante podrían apuntar a mutaciones somáticas que mejoren la actividad. Los residuos inusuales o raros cerca del sitio activo posiblemente podrían contactar el antígeno, haciendo deseable mantener el residuo de ratón. Sin embargo, si el residuo inusual no es importante para el enlace se prefiere el uso del residuo del receptor correspondiente ya que el residuo del ratón podría crear neoepítopos inmunogénicos en el anticuerpo humanizado. En caso un residuo inusual en la secuencia del donante sea en realidad un residuo común en la secuencia del receptor correspondiente, el residuo preferido es claramente el residuo del aceptor.

Cuadro 1 . Resumen de la secuencia de región 12B4 V Las secuencias ID de Kabat tomadas aquí como referencia están disponibles para el público, por ejemplo en la base de datos del Departamento Kabat de Secuencias de Proteínas de intereses Inmunológicos de la Universidad del Noreste de Ingeniería Biomédica. La información estructural tridimensional para los anticuerpos descritos aquí está a disposición del público, por ejemplo en el Research Collaboratory for Structural Bioinformatics' Protein Data Bank (PDB en inglés). Se puede acceder gratis al PDB via Internet y está descrito por Berman y otro (2000) Nucleic Acids Research, p235-242. Las secuencias de genes de línea de germen a las que aquí se hace referencia pueden ser vistas en la base de datos de secuencias del National Center for Biotechnology Information (NCBI siglas en inglés) en colección de Igh, Ig kappa y Ig lambda línea de germen de gene V (como una división de la National Library of Medicine (NLM) en el National Institute of Health (NIH)). La búsqueda de homología de la base de datos "Ig Germline Genes" del NCBI es proporcionada por IgG BLAST™. En una representación preferida, un anticuerpo humanizado del presente invento contiene (i) una cadena ligera formada de un dominio variable formado por CDRs 12B4 VL murinos y un marco de receptor humano, teniendo el marco al menos un residuo sustituido con el residuo 12B4 correspondiente y (ii) una cadena pesada formada por CDRs 12B4 VH y un marco de receptor humano, teniendo el marco al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve residuos sustituidos con el residuo 12B4 correspondiente y opcionalmente al menos uno, preferentemente dos o tres residuos sustituidos con el residuo humano de línea de germen. En una representación preferida, un anticuerpo humanizado del presente invento presenta características estructurales, como se describen aquí, y más aún tiene al menos una (preferentemente dos, tres, cuatro o todas) de las siguientes actividades: (1 ) enlaza ?ß soluble; (2) enlaza ?ß1-42 agregado (por ejemplo, como se determinó por ELISA); (3) enlaza ?ß en placas (por ejemplo tinción de AD y/o placas PDAPP); (4) enlaza ?ß con una afinidad de enlace dos o tres veces mayor comparada con el 12B4 quimérico (por ejemplo, 12B4 con secuencias de región murina variable y secuencias de región humana constante); (5) produce fagocitosis de ?ß (por ejemplo en un ensayo ex vivo de fagocitosis, tal como aquí se describió) y (6) cruza la barrera de la sangre-cerebro (por ejemplo demostrando localización en el cerebro a corto plazo, por ejemplo en un modelo animal PDAPP, como aquí se describió). En otra representación, un anticuerpo humanizado del presente invento tiene características estructurales, tal como aquí se describió, enlaza ?ß de una afinidad suficiente como para al menos provocar uno de los siguientes efectos in vivo: (1 ) reducir la carga de placa ?ß; (2) prevenir la formación de placa; (3) reducir niveles de ?ß soluble; (4) reducir la patología neurítica asociada con el desorden amiloidogénico; (5) disminuir o mejorar al menos los síntomas fisiológicos asociados con el desorden amiloidogénico y/o (6) mejorar la función cognitiva. En otra representación, un anticuerpo humanizado del presente invento tiene características estructurales, tal como aquí se describió, y se enlaza específicamente a un epítopo formado por residuos 3-7 de ?ß. En otra inclusión preferencial, un anticuerpo humanizado elaborado recientemente presenta características estructurales, aquí descritas, se vincula a un epítopo terminal N en ?ß (por ejemplo, se vincula a un epítopo en aminoácidos 3-7 de ?ß), y es capaz de reducir (1 ) los niveles péptidos ?ß; (2) la carga de la placa ?ß; y (3) la carga neurítica o distrofia neurítica asociada a un desorden amiloidogénico. Las actividades arriba descritas se pueden determinar usando cualquiera de los ensayos aquí descritos o en la técnica (por ejemplo, ensayos de vinculación, ensayos de fagocitosis, etc). Las actividades pueden ser ensayadas in vivo (por ejemplo, usando componentes de ensayo etiquetado y/o técnicas de imagen) o in vitro (por ejemplo, usando muestras o especímenes derivados de un sujeto). Las actividades pueden ser ensayadas directa o indirectamente. En ciertas inclusiones preferenciales, los aspectos neurológicos (por ejemplo, carga amiloide, carga neurítica, etc) son probados. Dichos aspectos pueden ser probados en seres vivos (por ejemplo, en cobayos afectados por la enfermedad de Alzheimer o en seres humanos sometidos a inmunoterapia) mediante el uso de metodologías de detección no invasiva. De manera alternativa, dichos aspectos pueden ser probados en sujetos post mortem. Probar dichos aspectos en cobayos y/o en seres humanos post mortem es útil para evaluar la efectividad de diversos agentes (por ejemplo, anticuerpos humanizados) a emplear en aplicaciones inmunoterapéuticas similares. En otras inclusiones preferenciales, los parámetros neurológicos o de comportamiento pueden ser evaluados como indicadores de los aspectos o actividades neuropatológicos arriba mencionados. 3. Producción de regiones variables Habiendo seleccionado el CDR y los componentes del marco de la inmunoglobulina humanizada, están disponibles una variedad de métodos para la producción de tales ¡nmunoglobulinas. Debido a la degeneración del código, una variedad de secuencias de ácido nucleico codificarán cada secuencia de aminoácido de la inmunoglobulina. La secuencias de ácido nucleico deseadas se pueden producir por síntesis de ADN de fase sólida de novo o por mutagénesis del PCR de una variante previamente preparada del polinucleótido deseado. La mutagénesis que logra el oligonucleótido es un método preferido de sustitución, eliminación e inserción del ADN polipéptido. Ver Adelman y otros, DNA 2:183 (1983). En resumen, el ADN del polipéptido objetivo se altera con la hibridización de un oligonucleótido codificando la mutación deseada a una plantilla de ADN de hebra única. Luego de la hibridización, se usa una polimerasa de ADN para sintetizar una hebra secundaria complementaria de la plantilla que incorpora el olgonucleótido primario y codifica la alteración seleccionada en el ADN del polipéptido objetivo. 4. Selección de las repiones constantes Los segmentos variables de los anticuerpos producidos tal como se describen anteriormente (por ejemplo las regiones de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos quiméricos o humanizados) están típicamente enlazados al menos a una parte de la región constante de inmunoglobulina (Fe región), típicamente de la de inmunoglobulina humana. Las secuencias de ADN de región constantes pueden aislarse según procedimientos conocidos de una variedad de células humanas pero preferentemente de células B inmortalizadas (ver Kabat y otros, supra, y Liu y otros., W087/02671 ) (cada uno de los cuales es incorporado por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Normalmente, el anticuerpo contendrá regiones constantes de cadenas ligeras y pesadas. La región constante de la cadena pesada usualmente incluye regiones CH1 , ligamentos, CH2, CH3, y CH4. Los anticuerpos descritos aquí incluyen anticuerpos que tienen todos los tipos de regiones constantes, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA y IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgGI, lgG2, lgG3 y lgG4. Cuando se desea que el anticuerpo (por ejemplo el anticuerpo humanizado) exhiba actividad citotóxica, el dominio constante es usualmente un complemento que crea dominios constantes y la clase es típicamente lgG1. El lgG1 es preferido. Las regiones constantes de cadenas ligeras pueden ser lambda o kappa. El anticuerpo humanizado puede estar formado por secuencias de más de una clase o isotipo. Los anticuerpos pueden expresarse como tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, como cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, como Fab, Fab' F(ab')2, y Fv, o como anticuerpos de cadenas simples en los que dominios variables de cadenas ligeras y pesadas están enlazados a través de un espaciador. 5. Manifestación de anticuerpos recombinantes Los anticuerpos quiméricos y humanizados son producidos típicamente por manifestación recombinante. Los ácidos nucleicos que codifican la luz humanizada y las regiones variables de cadenas pesadas, unidas opcionalmente a regiones constantes, son insertadas en vectores de expresión. La luz y las cadenas pesadas pueden ser clonadas en los mismos o diferentes vectores de expresión. Los segmentos de ADN que codifican las cadenas de inmunoglobulina están ligados de manera operante a secuencias de control en los vectores de expresión, que aseguran la expresión de polipéptidos de inmunoglobulina. Las secuencias de control de manifestación incluyen, pero no están limitados a, promotores (por ejemplo, promotores asociados natural o heterológicamente), secuencias de señal, elementos de ampliación, y secuencias de transmisión. Preferiblemente, las secuencias de expresión de control son sistemas promotores eucarióticos en vectores capaces de transformar o de transferir células eucarióticas huéspedes. Una vez que el vector ha sido incorporado a la célula huésped apropiada, el huésped es mantenido en condiciones adecuadas para el alto nivel de manifestación de las secuencias nucleótidas y la colección y purificación de los anticuerpos de reacción cruzada Estos vectores de expresión son reproducidos típicamente en los organismos huéspedes tales como episomas o como una parte integral del cromosoma huésped de ADN. Comúnmente los vectores de expresión contienen (resistencia a la ampicilina, resistencia a la higromicina, resistencia a la tetraciclina, resistencia a la tetraciclina o resistencia a la kanamicina) permitiendo la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (ver, e.g., Itakura et al., US Patent 4,704,362). E. coli es un huésped procariótico particularmente útil para clonar los polinucleótidos (por ejemplo, secuencias de ADN) del presente invento. Entre otros huéspedes microbianos apropiados para su uso se encuentran bacilos tales como Bacillus subtilis, y otros enterobacterias tales como Salmonella, Serratia y varias especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procarióticos uno también puede hacer vectores de manifestación que contendrán típicamente secuencias de control compatibles con la célula huésped (por ejemplo, origen de replica). Además, se encuentran presentes una gran variedad de promotores bien conocidos tales como el sistema promotor de lactosa, sistema promotor de triptófano. (trp), sistema promotor de beta-lactamasa o sistema promotor de fase lambda. Los promotores controlarán típicamente, con una secuencia de operación opcional y tendrán secuencias ribosómicas y similares para iniciar y completar la transcripción y traslación.

Otros microbios, tales como la levadura, también son útiles para la manifestación. Saccharomyces es un huésped preferido por la levadura, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de manifestación (por ejemplo, promotores), origen de replica, término de secuencias, y similares según lo deseado. Los promotores típicos incluyen fosfogliceratocinasa -3 y otras enzimas glicolíticas. Los promotores de levadura inducible incluyen, entre otros, promotores de alcohol dehidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables del uso de la maltosa y galactosa. Además de los microorganismos, el cultivo de células de tejido de mamíferos también puede ser utilizado para manifestar y producir los polipéptidos del presente invento (por ejemplo, polinucleótidos que decodifican inmunoglobulinas o fragmentos del mismo). Ver Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). En realidad se prefieren las células eucarióticas debido a que varias lineas de células huésped desarrolladas han sido capaces de segregar proteínas heterólogas (por ejemplo, inmunoglobulinas intactas) e incluyen líneas de células CHO, varias líneas de células Cos, células HeLa, preferiblemente, líneas de células mieloma, células B transformadas o hibridomas. De preferencia células no humanas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como el origen de replica, un promotor y un ampliante (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)) y sitios de procesamiento de información tales como enlaces ribosómicos locales, empalme de ARN local, poliadenilación local y secuencias transcripcionales. Las secuencias de control de expresión preferidas son promotores derivados de los genes de inmunoglobulina, SV40, adenovirus, virus de papiloma bovina, vitomegalovirus y similares. Ver Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992). Alternativamente, las secuencias de anticuerpos de codificación pueden ser incorporadas en transgenes para su introducción en el genoma de un animal transgénico y la subsecuente manifestación la leche de un animal transgénico (ver por ejemplo, Deboer et al., US 5,741 ,957, Rosen US 5,304,489, y Meade et al., US 5,849,992). Los transgenes incluyen secuencias de codificación para cadenas de luz y/o cadenas pesadas en el vínculo con un promotor e impulsador de un gen específico de una glándula mamaria como caseína o beta lactoglobulina. Los vectores que contienen las secuencias polinucleótidas de interés (por ejemplo, la cadena pesada y la ligera que codifica secuencias y secuencias de manifestación de control) pueden ser transferidas en la célula huésped por métodos bien conocidos que varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección de cloruro de calcio es comúnmente utilizada en células procarióticas, mientras que el tratamiento de fosfato de calcio, electroporación, lipofección, transfección con base viral o biolística pueden ser utilizadas en otros huéspedes celulares. (Ver generalmente Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2da ed., 1989) (incorporado por referencia en su totalidad para todo propósito). Otros métodos utilizados para transformar las células de los mamíferos incluyen el uso de polibreno, fusión protoplástica, liposomas, electroporación y microinyección (ver generalmente Sambrook er al., supra). Para la producción de animales transgénicos los transgenes pueden ser microinjertados en oocitos fertilizados o pueden ser incorporados en el genoma de células embriónicas y los núcleos de dichas células transferidos en oocitos enucleados. Cuando las cadenas livianas y pesadas son clonadas por separado en vectores de expresión, los vectores son cotransferidos para obtener manifestación y ensamble de inmunoglobulinas intactas. Una vez expresados todos los anticuerpos, sus dímeros, cadenas pesadas y livianas individuales u otras formas de inmunoglobulina del presente invento pueden ser purificados según los procedimientos estándar esta actividad, incluyendo precipitación de sulfato de amonio, columnas de afinidad, columnas cromatográficas, purificación HPLC, gel electroféresis y similares (ver generalmente Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). De manera sustancial, se prefieren inmunoglobulinas puras de por lo menos 90 a 95% de homogeneidad y se prefieren mayormente las de 98 a 99% o más para usos farmacéuticos. 6. Fragmentos de Anticuerpos Asimismo se contempla dentro del ámbito del invento instantánea los fragmentos de anticuerpos. En una representación se cuenta con fragmentos no humanos y/o anticuerpos quiméricos. En otra representación, se cuenta con fragmentos de anticuerpos humanizados. Estos fragmentos exhiben típicamente una unión específica al antígeno con una afinidad de por lo menos 107 y más típicamente de 108 o 109M"1. Los fragmentos de anticuerpo humanizados incluyen cadenas pesadas separadas, cadenas livianas, Fab, F(ab')2, Fabc y Fv. Los fragmentos son producidos por técnicas de ADN recombinante o por la separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. 7. Anticuerpos de prueba para la Efectividad Terapéutica en Animales Modelo Se inyecta 0.5 mg en anticuerpos PBS anti-?ß policlonal o anti-?ß monoclonal específico a grupos de ratones PDAPP de 7 a 9 meses de edad. Todas las preparaciones de anticuerpos son purificados para mantener niveles bajos de endotoxina. Los monoclonales pueden ser preparados contra un fragmento inyectando el fragmento o una forma más larga de ?ß en un ratón, preparando hibridomas y protegiendo los hibridomas para un anticuerpo que se une específicamente a un fragmento deseado de ?ß sin unirse a otros fragmentos montados de ?ß. Los ratones son inyectados intraperitonalmente según lo necesario en un periodo de 4 meses para mantener una concentración de anticuerpo circulante medido por el título ELISA mayor a 1/1000 definido por ELISA a ?ß42 u otro ¡nmunogen Los títulos son monitoreados y se deja morir a los ratones al término de 6 meses de inyecciones. La medición de niveles de ?ß y la toxicología son realizados histoquímicamente durante la autopsia. Se utilizan diez ratones por grupo. 8. Selección los Anticuerpos para la Actividad de Depuración El invento también proporciona métodos de selección de un anticuerpo para la actividad de depuración de un depósito amiloide u otro antígeno o una entidad biológica relacionada para la cual se considera la actividad de depuración. Para ser seleccionado para una actividad en un depósito amiloide, se pone en contacto una muestra de un tejido del cerebro de un paciente con la enfermedad de Alzheimer o un animal modelo que tenga la patología de la enfermedad de Alzheimer con células fagocitas que tenga un receptor Fe, tales como células microglias y el anticuerpo siendo sometidos a una prueba en un medio in vitro. Las células fagocitas pueden ser un cultivo primario o una línea de células y pueden ser de murina, (por ejemplo, BV-2 o células C8-B4) o de origen humano (por ejemplo, células THP-1 ). En algunos métodos, los componentes son combinados en una diapositiva microscópica para facilitar el monitoreo microscópico. En algunos métodos, las reacciones múltiples son realizadas en paralelo en las cavidades de una placa en dicho formato, una diapositiva microscópica en miniatura separada puede ser montada en recintos separados o se puede utilizar un formato de detección no microscópico tal como la detección de ELISA de ?ß. De preferencia se realiza una serie de medidas de la cantidad de depósito de amiloide en la mezcla de reacción in vitro, empezando con un valor de línea base antes de que la reacción haya procedido, siguiendo con uno o más valores de prueba durante la reacción. El antígeno puede ser detectado mediante el teñido, por ejemplo, con un anticuerpo a ?ß con rotulado fluorescente u otro componente de placas de amiloide. El anticuerpo utilizado para el teñido puede o no puede ser el mismo que el anticuerpo que está siendo probado para la actividad de depuración. Una reducción relativa de la línea de base durante la reacción de los depósitos de amiloide indica que el anticuerpo sometido a prueba ha tenido actividad de depuración. Es probable que dichos anticuerpos sean útiles para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades amiloigénicas. Particularmente, los anticuerpos útiles para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades incluyen aquellas capaces de depurar tanto las placas amiloides compactas y difusas, por ejemplo, el anticuerpo 12B4 del presente invento o versiones quiméricas o humanizadas del mismo. Se pueden utilizar métodos análogos para someter a los anticuerpos a la actividad de repurificación de otros tipos de entidades biológicas. El ensayo puede ser utilizado para detectar la actividad de repurificación virtualmente contra cualquier tipo de entidad biológica. La entidad biológica cumple típicamente algún papel en la enfermedad humana o animal. La entidad biológica puede ser provista como una muestra de tejido o en forma asilada. Si es provisto como una muestra de tejido es preferible que la muestra de tejido no esté fija para permitir el acceso fácil a los componentes de la muestra de tejido y evitar la perturbación de la conformación de los componentes para fijar incidentalmente. Ejemplos de muestras de tejido que pueden ser probadas en este ensayo incluyen tejido canceroso, tejido precanceroso, tejido que contiene crecimientos benignos tales como verrugas o lunares, tejido infectado con microorganismos patógenos, tejido infiltrado con células inflamatorias, tejidos que portan matrices patológicas entre células (por ejemplo, fibrinous pericarditis), tejidos que transportan antígenos anómalos y tejido de cicatriz. Ejemplos de entidades biológicas asiladas que pueden ser utilizadas incluyen ?ß, antígenos virales o virus, proteoglicanos, antígenos de otros microorganismos patogénicos, tumores antígenos y adhesión molecular. Dichos antígenos pueden ser obtenidos de fuentes naturales, expresiones recombinantes o síntesis química entre otros medios. La muestra de tejido o la entidad biológica aislada se contacta con células fagocíticas, que transportan receptores Fe, tales como monocitos o células microglias y un anticuerpo a ser probado en un medio. El anticuerpo puede ser dirigido a la entidad biológica estando bajo prueba o a un antígeno asociado con la entidad. En esta última situación, el objetivo es probar si la entidad biológica es fagocitada con el antígeno. Usualmente, aunque no necesariamente, el anticuerpo y la entidad biológica (a veces con un antígeno asociado), son puestos en contacto mutuamente antes de añadir las células fagocitadas. La concentración de la entidad biológica y/o el antígeno asociado que queda en el medio, si está presente, es luego monitoreado. Una disminución en la cantidad o concentración de antígeno o la entidad biológica asociada en el medio indica que el anticuerpo tiene una respuesta de depuración en contra del antígeno y/o la entidad biológica asociada en conjunto con las células fagocíticas (ver ejemplo IV). 9. Anticuerpos Quiméricos / Humanizados que tienen la Función de alterar al efector Para los anticuerpos del invento descritos anteriormente que abarcan una región constante (región Fe), también puede ser deseable alterar la función de efector de la molécula. Generalmente, la función efectora de un anticuerpo reside en la región constante o Fe de la molécula que puede mediar un enlace a varias moléculas efectoras, por ejemplo, proteínas complementarias o receptores Fe. El enlace del complemento a la región Fe es importante, por ejemplo, en la opsonización y la lisis de células patógenas y la activación de respuestas inflamatorias. El enlace del anticuerpo a receptores Fe, por ejemplo, en la superficie de las células efectoras pueden provocar varias respuestas biológicas diversas e importantes, por ejemplo, absorción y destrucción de patógenos o partículas cubiertas de anticuerpos, depuración de complejos inmunes, lisis de células de objetivo cubiertas de anticuerpos por células muertas (es decir, citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo o ADCC), liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria de anticuerpos y control de la producción de inmunoglobulina. En consecuencia, dependiendo de una aplicación particular diagnóstica o terapéutica, las funciones inmunes arriba mencionadas o solo las funciones inmunes seleccionadas pueden ser deseables. Al alterar la región Fe del anticuerpo se logran varios aspectos de la función efectora de la molécula incluyendo el realce o la supresión de varias reacciones del sistema inmune con efectos beneficiosos en el diagnóstico y la terapia. Los anticuerpos del invento pueden producirse reaccionando solo con ciertos tipos de receptores Fe, por ejemplo, los anticuerpos del invento pueden ser modificados para unir solo determinados receptores Fe o si se desea, no unir completamente el receptor Fe mediante la eliminación o la alteración del lugar de unión del receptor Fe ubicado en la región Fe del anticuerpo. Otras alteraciones deseables de la región Fe de un anticuerpo del invento son catalogadas abajo. El sistema de numeración Rabat es utilizado típicamente para indicar que residuo(s) de aminoácidos de la región Fe (por ejemplo, de un anticuerpo IgG) son alterados (por ejemplo, por sustitución de aminoácidos) para lograr un cambio deseado en la función efectora. El sistema de numeración también es empleado para comparar anticuerpos a través de las especies de manera tal que una función efectora deseada observada en un anticuerpo de ratón, por ejemplo, puede ser luego sistemáticamente lograda en un anticuerpo humano, humanizado o quimérico del invento. Por ejemplo, se ha observado que los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos IgG) pueden ser agrupados en aquellos que exhiben uniones fuertes, intermedias o débiles a un receptor Fe (por ejemplo, un receptor Fe en monocitos humanos (FcyRI)). Mediante la comparación de secuencias de aminoácidos en estos grupos diferentes de afinidad, se ha identificado un sitio de unión de monocitos en la región de enlace de gozne (Leu234-Ser239). Además, el receptor FcyRI humano une el lgG1 humano y el lgG2a del ratón como un monómero pero la unión del ratón lgG2b es 100 veces más débil. Una comparación de la secuencia de estas proteínas en la región de enlace de gozne muestra que la secuencia 234 a 238, es decir, Leu-Leu-Gly-Gly-Pro en los aglutinantes fuertes se convierte en Leu-Glu-Gly-Pro en el gamma 2b del ratón, es decir aglutinantes débiles. En consecuencia, se puede producir un cambio correspondiente en una secuencia de gozne de anticuerpo humano si se desea una unión del receptor FcyL reducido. Se entiende que otras alteraciones pueden realizarse para lograr resultados iguales o similares. Por ejemplos, la afinidad de la unión FcyRI puede ser alteradas reemplazando el residuo específico con un residuo que tenga un grupo funcional inapropiado en su cadena colateral, o introduciendo un grupo funcional cargado (por ejemplo, Glu o Asp) o por ejemplo, un residuo no polar aromático (ejemplo, Phe, Tyr o Trp). Estos cambios pueden aplicados igualmente a los sistemas murino, humanos y de ratas dada homología de secuencia entre las diferentes inmunoglobulinas. Se ha demostrado que par el humano lgG3, que se une al receptor FcyRI humano, el cambio de Leu 235 a Glu destruye la interacción del muíante por el receptor. El sitio de unión par este receptor puede ser encendido o apagado realizando la mutación apropiada. Las mutaciones en sitios adyacentes o cerrados en la región de enlace de gozne (ejemplo volviendo a emplear residuos 234, 236 o 237 por Ala) indican que las alteraciones en residuos 234, 235, 236 y 237 por lo menos afectan la afinidad para el receptor FcyRI. En consecuencia los anticuerpos del invento también pueden tener una región Fe alterada con afinidad de unión alterada para el FcyRI como cuando se compara con un anticuerpo no modificado. Dicho anticuerpo tiene convenientemente una modificación en los residuos de aminoácidos 234, 235, 236 o 237. La afinidad para otros receptores Fe puede verse alterada por un enfoque similar, para controlar la respuesta inmune en diferentes maneras. Como un ejemplo adicional, las propiedades líticas de anticuerpos IgC con un enlace de Cl complementario pueden ser alteradas. El primer componente del sistema complementario, Cl, comprende tres proteínas conocidas como Clq, Clr y Cls las que se enlazan entre si. Se has demostrado que Clq es responsable del enlace de estas tres proteínas formando un anticuerpo. En consecuencia, la actividad de enlace Clq de un anticuerpo puede ser alterada a través de un anticuerpo con CH2 modificado, en el que al menos uno de los residuos aminoácidos 318, 320, y 322 de una cadena pesada han sido cambiados a un residuo con una cadena distinta. La numeración de los residuos de la cadena pesada es la del índice EU (Ver Kabat ef al., supra). Otras posibles modificaciones para cambiar, por ejemplo, reducir o abolir el enlace específico Clq para un anticuerpo incluye el cambio de uno de los residuos 318 (Glu), 320 (Lys) y 322 (Lys), a Ala. Adicionalmente, haciendo mutaciones a estos residuos, se ha demostrado que el enlace CIq es retenido hasta que el residuo 318 tenga una cadena de enlace de hidrógeno y residuos 320 y 322, ambos con una cadena de carga positiva. Los enlaces de CIq pueden ser abolidos reemplazando uno de los 3 residuos específicos con una adecuada funcionalidad en ese lado de la cadena. No es necesario reemplazar los residuos iónicos de Ala para abolir el enlace CIq. Es posible, utilizar otros sustitutos alquilos no iónicos, tales como Gly, lle.Leu o Val, algunos residuos aromáticos no polares como Phe, Tyr, Trp y Pro en el lugar de cualquiera de los residuos para abolir el enlace CIq. Además, es posible usar residuos polares no iónicos como Ser.Thr, Cys, y Met en el lugar de los residuos 320 y 322 pero no en el lugar del residuo 318 para abolir la actividad de enlace CIq. Es necesario tomar en cuenta que el lado de las cadenas de residuos polares iónicos y no iónicos podrán formar enlaces de hidrógeno de manera similar a los enlaces formados por el residuo Glu. Sin embargo, el reemplazo del residuo 318 (Glu) por un residuo polar podría modificar pero no abolir la actividad de enlace CIq. También es sabido que al reemplazar el residuo 297 (Asn) con Ala, produce un cambio en la actividad lítica mientras diminuye (cerca de 3 pliegues más débiles) la afinidad por CIq. Esta alteración destruye la glicosilación local y la presencia del carbohidrato necesario para complementar la activación. Cualquier otra sustitución destruirá la glicosilación local. El invento también proporciona un anticuerpo con una función efectora alterada en donde el anticuerpo posee una importante región modificada que puede incluir una importante región completa derivada de un anticuerpo de una clase o subclase de anticuerpo distinta a la del dominio CHI. por ejemplo, el dominio constante (CHI) de un anticuerpo de clase IgG puede estar conectado a una importante región de un anticuerpo de clase lgG4. De manera alternativa, la nueva región importante puede incluir parte de una importante unidad natural o una unidad repetidora en la que cada unidad en repetición deriva de una importante región natural. En un ejemplo, la importante región natural es alterada al convertir uno o más residuos cisteínos en un residuo neutral, como alanina o al convertir residuos adecuadamente colocados en residuos cisteínos. Dichas alteraciones se realizan usando una reconocida proteína química y, de preferencia, técnicas de ingeniería genética como ya se ha descrito aquí. En una inclusión del invento el número de residuos cisteínos en la importante región del anticuerpo disminuye, por ejemplo, a un residuo cisteíno. Esta modificación tiene la ventaja de facilitar la unión del anticuerpo, por ejemplo, las moléculas biespecíficas del anticuerpo con las moléculas del anticuerpo en donde la porción Fe ha sido reemplazada por una molécula efectora o reportadora ya que sólo es necesario formar un simple vínculo de disulfido. Esta modificación también brinda una meta específica para conectar la importante región a otra importante región o a una molécula efectora o reportadora, de manera directa o indirecta, por ejemplo, a través de medios químicos. Contrariamente, el número de residuos cisteínos en la importante región del anticuerpo aumenta, por ejemplo, por lo menos una vez más que el número de los residuos cisteínos que se producen normalmente. Incrementar el número de residuos cisteínos puede usarse para estabilizar la interacción entre los aspectos esenciales adyacentes. Otra ventaja de esta modificación es que facilita el uso de grupos tioles cisteínos para adjuntar las moléculas efectoras o reportadoras al anticuerpo alterado, por ejemplo, una radioetiqueta. Por consiguiente, el invento proporciona para las importantes regiones entre las clases de anticuerpo, en particular, clases IgG, y/o un aumento o reducción en el número de residuos cisteínos en la región importante a fin de alcanzar una función efectora alterada (ver por ejemplo la Patente americana N° 5,677,425 que ha sido expresamente incorporada aquí). Se realiza la determinación de la función efectora alterada del anticuerpo usando los ensayos aquí descritos u otras técnicas reconocidas. Es importante notar que el anticuerpo resultante pueda estar sujeto a uno o más ensayos para evaluar cualquier cambio en la actividad biológica comparada con el anticuerpo inicial. Por ejemplo, la habilidad del anticuerpo con una región Fe alterada para unirse complementariamente o receptores Fe puede ser evaluada a través de diversos tipos de ensayos , La producción de anticuerpos del invento se lleva a cabo mediante técnicas apropiadas descritas en este documento, así como las técnicas conocidas por los expertos en esta materia. Por ejemplo una adecuada secuencia proteica, por ejemplo, formando parte de o siendo todo un relevante dominio constante, por ejemplo, Fe región, es decir, dominio(s) CH2 y/o Ch3 de un anticuerpo y que incluye aproximadamente los residuos alterados que pueden ser sintetizados y unidos químicamente en el lugar apropiado en la molécula del anticuerpo. Las técnicas de ingeniería genética son usadas de preferencia para producir un anticuerpo alterado. Las técnicas preferidas incluyen, por ejemplo, la preparación de iniciadores adecuados para usarse en la cadena de reacción polimerasa (PCR siglas en inglés), tales como la secuencia de ADN que codifica al menos parte de la cadena IgCG pesada, por ejemplo, un FC o una región constante (ejemplo. CH2, y /o CH3) es modificada en uno o mas residuos. El segmento puede ser unido de manera operable manteniendo la porción de anticuerpo, por ejemplo., la variable de región y los elementos regulatorios requeridos para la manifestación en una célula. El presente invento incluye además vectores utilizados para transformar la línea de la célula, vectores usados para producir vectores transformados, líneas de células con vectores transformados, líneas de células con vectores preparatorios, y métodos para su producción. Las líneas de células que son transformadas para producir el anticuerpo, cuando son alteradas en la región Fe (es decir, efectores de funciona alterada) son de preferencia una célula de mamífero inmortalizada (por ejemplo,, célula CHO).

A pesar que la línea de célula empleada para producir el anticuerpo con una región Fe alterada es de preferencia una línea de célula de mamífero, se puede emplear cualquier otro tipo de célula adecuada, tales como la línea de célula bacterial o línea de célula de levadura.

B. Ácido nucleico que codifica agentes inmunolóqicos y terapéuticos Las repuestas inmunes contra los depósitos amiloides también pueden ser inducidas por la administración de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos y sus cadenas de componentes usadas para la inmunización pasiva. Tales ácidos nucleicos pueden ser el ADN o ARN. Un segmento de ácido nucleico que codifica un inmunógeno está asociado comúnmente con elementos reguladores, como por ejemplo un promotor e intensificador, que permiten la expresión del segmento de ADN en las células objetivo de un paciente. En la manifestación en las células sanguíneas, como es deseable para la inducción de una respuesta inmune, los elementos del promotor e intensificador de los genes de la inmunoglobulina de cadena ligera o pesada o el promotor e intensificador inmediato temprano principal de CMV son apropiados para la expresión directa. Los elementos reguladores asociados y las secuencias de codificación se clonan con frecuencia en un vector. En el caso de la administración de anticuerpos de doble cadena, se pueden clonar dos cadenas en el mismo vector o en otro. Está disponible un número de sistemas de vectores virales, incluyendo sistemas retrovirales (ver por ejemplo: Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109 (1993)); vectores adenovirales (ver, por ejemplo, Bett et. al, J Virol 67:5911 (1993)); vectores de virus adeno asociados (ver por ejemplo, Zhou et. al. Exp Med. 179:1867 (1994)), vectores virales de tipo pox incluyendo el virus vaccinia y los poxvirus característicos de las aves, vectores virales del género de virus alfa tales como los derivados del virus Sindbis y del virus del bosque de Semliki (ver por ejemplo, Dubensky et al., J Virol. 70:508 (1996)), virus de la encefalitis equina venezolana (ver Johnston et al, US 5,643,576) y rabdovirus, como el virus de la estomatitis vesicular (ver Rose, 6,168,943) y papilomavirus (Ohe et al., Human Gene Therapy 6:325 (1995); Woo et al., WO 94/12629) y Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)). El ADN que codifica un inmunogen o un vector que contiene al mismo, se puede encapsular en los liposomas. Se describen los lípidos convenientes y análogos relacionados en Eppstein et al., US 5,208,036, Felger et al., US 5,264,618, Rose, US 5,279,833 y Epand et al., US 5,283,185. Los vectores y el ADN que codifican un inmunogen se pueden también absorber o asociar con los portadores de partículas, como por ejemplo polímeros de polimetacrilato de metilo y poliláctidos (y poliláctido-glicólidos), ver por ejemplo, McGee et al., J. Micro Encap. (1996). Los vectores de terapia génica o polipéptidos desnudos (por ejemplo, ADN) pueden ser transmitidos in vivo al administrarle a un paciente sujeto, normalmente por administración sistémica (por ejemplo, intravenosa, intraperitonal, nasal, gástrica, intradérmica, subcutánea, o infusión intracraneal) o aplicación tópica (ver por ejemplo, Anderson et al., US 5,399,346). El término "polinucleótido desnudo" se refiere a un polinucleótido no compuesto de materiales coloidales. Los polinucleótidos desnudos algunas veces se clonan en un vector plásmido. Tales vectores también pueden incluir agentes facilitadores como bupivacina Weiner et al., US 5,593,972). El ADN también se puede administrar usando una pistola génica. Ver Xiao & Brandsma, supra. El ADN que codifica un inmunogen se precipita sobre la superficie de unas esferas metálicas microscópicas. Los microproyectiles son acelerados con una onda de choque o con gas helio expansible y penetran los tejidos en varias capas celulares. Por ejemplo, el dispositivo de transmisión génica de Accel™ fabricado por Agricetus, Inc. Middleton, Wisconsin es adecuado. Una alternativa es que el ADN desnudo pueda traspasar la piel hasta la corriente sanguínea simplemente colocando el ADN en la piel irritada química o mecánicamente (ver Howell et al., WO 95/05853).

Otra variación, los vectores que codifican inmunogenes se pueden transmitir a las células ex vivo, tales como células extraídas de un paciente sujeto (por ejemplo, linfocitos, extracción de médula ósea, biopsia de tejido) o células madre hematopoyéticas de donador universal, seguido por una reimplantación de células a un paciente, normalmente después de una selección de células que se incorporaron al vector. II. MÉTODOS PROFILÁCTICOS Y TERAPÉUTICOS El presente invento está dirigido ínter alia al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades amiloides administrando reagentes inmunológicos terapéuticos (por ejemplo, inmunoglobulinas humanizadas) para epítopos específicos dentro de ?ß a pacientes bajo condiciones que generen una respuesta terapéutica beneficiosa en el paciente (por ejemplo, inducción de fagocitosis de ?ß, reducción de la carga de placas, inhibición de formación de placa, reducción de distrofia neurítica, mejorando la función cognitiva, y/o revirtiendo, tratando o previniendo la disminución cognitiva) por ejemplo para prevenir o tratar una enfermedad amiloide. El invento también está destinado para el uso de reagentes inmunológicos descubiertos (por ejemplo, inmunoglobulinas humanizadas) en la producción de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad amiloide. Por una parte, el invento proporciona métodos para prevenir o tratar una enfermedad asociada con los depósitos amiloides de ?ß en el cerebro del paciente. Tales enfermedades incluyen al mal de Alzheimer, síndrome de Down y deterioro cognitivo. El último puede suceder con o sin la presencia de. otras características de una enfermedad amiloide. Algunos métodos del invento implican administrar al paciente una dosificación efectiva de un anticuerpo que específicamente se enlace a un componente de un depósito amiloide. Tales métodos son útiles particularmente para prevenir o tratar el mal de Alzheimer en pacientes humanos. Los métodos ejemplares implican administrar una dosificación efectiva de un anticuerpo que se enlace a ?ß. Los métodos preferidos implican administrar una dosificación efectiva de un anticuerpo que específicamente se enlace a un epítopo dentro de residuos 1-10 de ?ß, por ejemplo, anticuerpos que específicamente se enlacen a un epítopo dentro de residuos 1-3 de ?ß, anticuerpos que específicamente se enlacen a un epítopo dentro de residuos 1-4 de ?ß, anticuerpos que específicamente se enlacen a un epítopo dentro de residuos 1 -5 de ?ß, anticuerpos que específicamente se enlacen a un epítopo dentro de residuos 1-6 de ?ß, anticuerpos que específicamente se enlacen a un epítopo dentro de residuos 1 -7 de ?ß, anticuerpos que específicamente se enlacen a un epítopo dentro de residuos 3-7 de ?ß. Por otra parte, el invento implica administrar anticuerpos que se enlacen a un epítopo que contenga un residuo terminal N libre de ?ß. Además, el invento implica la administración de anticuerpos que específicamente se enlacen a un epítopo dentro de residuos de 1-10 de ?ß en donde residuo 1 y/o residuo 7 de ?ß sea un ácido aspártico. En otro aspecto, el invento implica la administración de anticuerpos que específicamente se enlacen a un péptido ?ß sin enlace completo a una proteína precursora amiloide (APP, siglas en inglés). En otro aspecto, el isotipo del anticuerpo es lgG1 humano. Por otra parte, el invento implica administrar anticuerpos que se enlacen con un depósito amiloide del paciente e induzcan una respuesta de depuración contra el depósito amiloide. Por ejemplo, una respuesta de limpieza tal puede ser efectuada por fagocitosis mediada por receptor Fe. Los agentes terapéuticos del invento son común y sustancialmente puros de contaminante indeseable. Esto significa que un agente es comúnmente por lo menos 50% peso/peso (w/w, en inglés) de pureza, así como también es sustancialmente libre de proteínas y contaminantes que interfieren. Algunas veces los agentes son de por lo menos 80% w/w y con mayor preferencia de por lo menos 90% o cerca del 95% w/w de pureza. Sin embargo, usando técnicas convencionales de purificación de proteínas se pueden obtener péptidos homogéneos de por lo menos 99% w/w. Los métodos se pueden usar tanto en pacientes asintomáticos y en aquellos que en el presente presentan síntomas de la enfermedad. Los anticuerpos usados en tales métodos pueden ser humanos, humanizados, quiméricos o anticuerpos no humanos, o fragmentos de los mismos (por ejemplo, antígeno enlazando fragmentos) y pueden ser monoclonales o policlonales, como se describió anteriormente. En otro aspecto, el invento implica administrar anticuerpos preparados de un hombre inmunizado con péptido ?ß; ese hombre puede ser el paciente a tratar con anticuerpos. En otro aspecto, el invento implica administrar un anticuerpo como portador farmacéutico en forma de composición farmacéutica. De manera alternativa, el anticuerpo se puede administrar al paciente administrando un polinucleótido que codifica a por lo menos una cadena de anticuerpo. El polinucleótido está formulado para producir la cadena de anticuerpo en el paciente. El polinucleótido codifica opcionalmente cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos. El polinucleótido está formulado para producir cadenas pesadas y ligeras en el paciente. En las incorporaciones, el paciente es monitoreado por nivel de anticuerpo administrado en la sangre del paciente. De esa manera el invento cumple una necesidad de años de regímenes terapéuticos para prevenir o mejorar la neuropatología y, en algunos pacientes, y el deterioro asociado con el mal de Alzheimer.

A. Pacientes sujetos a tratamiento En los pacientes sujetos a tratamiento se incluye a los sujetos con riesgo de enfermedad pero que no muestran síntomas, así como también pacientes que actualmente muestran síntomas. En el caso del mal de Alzheimer, cualquier persona está virtualmente en riesgo de sufrir este mal si es una persona de edad avanzada. Además, los presentes métodos se pueden administrar profilácticamente a la población en general sin la necesidad de ninguna evaluación del riesgo del paciente sujeto. Los presentes métodos son especialmente útiles para los sujetos con riesgo genético conocido del mal de Alzheimer. Entre estos individuos se encuentran aquellos que tienen parientes que han sufrido este mal y aquellos cuyo riesgo se determinó por análisis de marcadores genéticos o bioquímicos. Dentro de los marcadores genéticos de riesgo para el mal de Alzheimer se incluyen las mutaciones en el gen APP, particularmente en mutaciones en la posición 717 y en las posiciones 670 y 671 referidas como las mutaciones Hardy y Swedish respectivamente (ver Hardy, supra). Otros marcadores de riesgo son las mutaciones en los genes de las presenilinas, PS1 y PS2, y ApoE4, historia familiar de AD, hipercolesterolemia o aterosclerosis. Los sujetos que actualmente sufren del mal de Alzheimer se pueden reconocer por la demencia característica, así como también la presencia de factores riesgo descritos anteriormente Además, hay disponible una serie de pruebas diagnósticas para identificar a los sujetos que tienen AD. Entre ellas se incluyen la medida de CSF tau y de los niveles de ?ß42. Niveles elevados de tau y reducidos de ?ß42 significan la presencia de AD. Los sujetos que sufren del mal de Alzheimer también pueden ser diagnosticados por los criterios de ADRDA como se describe en la sección Ejemplos. En pacientes asintomáticos, el tratamiento puede empezar a cualquier edad (por ejemplo, 10, 20, 30). Sin embargo, no es necesario nomalmente empezar el tratamiento hasta que un paciente alcance los 40, 50, 60 ó 70. El tratamiento comúnmente implica múltiples dosificaciones durante un periodo de tiempo. El tratamiento se puede monitorear mediante el análisis de los niveles de anticuerpo todo el tiempo. Si la respuesta falla, debe indicarse una dosificación de refuerzo. En el caso de pacientes con síndrome de Down potencial, el tratamiento puede empezar de manera prenatal administrando agentes terapéuticos a la madre o poco tiempo después del nacimiento.

B. Regímenes v dosificaciones de tratamiento En las aplicaciones profilácticas se administra composiciones o medicamentos farmacéuticos a pacientes susceptibles a, o de lo contrario, con riesgo de sufrir el mal de Alzheimer en cantidades suficientes para eliminar o reducir el riesgo, disminuir la severidad, o retrasar el inicio del mal, incluyendo síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales del mal, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante la evolución del mal. En las aplicaciones terapéuticas, se administran composiciones o medicamentos a pacientes que se sospecha o sufren el mal en cantidades suficientes para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas del mal (bioquímicos, histológicos y/o conductuales), sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante la evolución del mal. En algunos métodos, la administración de agentes reduce o elimina el deterioro miocognitivo en pacientes que aún no han desarrollado la patología característica del mal de Alzheimer. Una cantidad adecuada para cumplir el tratamiento terapéutico o profiláctico es definida como una dosis efectiva terapéuticamente o profilácticamente. En ambos regímenes, los agentes normalmente se administran en diversas dosificaciones hasta que se haya logrado una respuesta inmune. El término "respuesta inmune" o "respuesta inmunológica" incluye el desarrollo de una respuesta humoral (mediada por anticuerpos) y/o una respuesta celular (mediada por una célula T antígeno-específico o sus secreciones) dirigida contra un antígeno en un sujeto receptor. Una respuesta tal puede ser una respuesta activa, es decir, inducida por la administración de inmunógenos, o una respuesta pasiva, es decir, inducida por la administración de inmunoglobulinas, anticuerpos o células T preparadas. Normalmente, la respuesta inmune es monitoreada y las dosificaciones se repiten si la respuesta inmune empieza a disminuir. Las dosis efectivas de las composiciones del presente invento, para el tratamiento de las condiciones descritas anteriormente, varían según muchos factores, incluyendo medio de administración, zona blanco, estado psicológico del paciente, si el paciente es humano o animal, otras medicaciones administradas y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Normalmente, el paciente es humano pero mamíferos no humanos, incluyendo mamíferos transgénicos, pueden ser tratados. Las dosificaciones de tratamiento necesitan ser trituradas para optimizar su seguridad y eficacia. En el caso de la inmunización pasiva con un anticuerpo, la dosificación fluctúa entre 0.0001 y 100mg/kg, y con mayor frecuencia 0.01 a 5mg/kg (por ejemplo, 0.02mg/kg, 0.25mg/kg, 0.5mg/kg, 0.75mg/kg, 1 mg/kg, 2mg/kg, etc.) de peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser 1 mg/kg de peso corporal o 10mg/kg de peso corporal o dentro del rango de 1 -10mg/kg, preferentemente por lo menos 1mg/kg. Las dosis intermedias en los rangos anteriores están también dentro del área de aplicación del invento. Los sujetos se pueden administrar dichas dosis diariamente, interdiaramente, semanalmente o según cualquier otro cronograma determinado por un análisis empírico. Un tratamiento ejemplar implica la administración de múltiples dosificaciones durante un periodo prolongado, por ejemplo, de por lo menos seis meses. Otro régimen de tratamiento ejemplar implica la administración de una vez cada dos semanas o una vez cada mes o una vez cada 3 a 6 meses. Los cronogramas de dosificación ejemplar incluyen 1-10mg/kg o 15mg/kg en días consecutivos, 30mg/kg en días alternados o 60mg/kg semanalmente. En algunos métodos, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de enlace se administran simultáneamente, en ese caso la dosificación de cada anticuerpo administrado entra en los rangos indicados. Normalmente se administra anticuerpos en múltiples ocasiones. Los intervalos entre las dosificaciones simples pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos pueden ser también irregulares como indica la medida de los niveles de sangre de anticuerpos para Ali en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para lograr una concentración plasmática de anticuerpos de 1-1000 g/ml y en otros métodos 25-300 g/ml. Una alternativa es administrar anticuerpos como una fórmula de liberación sostenida, en ese caso se requiere de una administración menos frecuente. La dosificación y frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanizados muestran una vida media más larga, seguidas por los anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. La dosificación y frecuencia de la administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En las aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los anticuerpos o un cóctel de los mismos se administran a un paciente que aún no tiene la enfermedad con el fin de incrementar la resistencia del paciente. Se define dicha cantidad como "una dosis efectiva profiláctica". En ese uso, las cantidades precisas dependen nuevamente del estado de salud del paciente e inmunidad general pero generalmente fluctúa entre 0.1 a 25mg por dosis, especialmente 0.5 a 2.5mg por dosis. Una dosificación relativamente baja se administra en intervalos relativamente infrecuentes durante un largo periodo de tiempo. Algunos pacientes reciben tratamiento de por vida. En las aplicaciones terapéuticas, una dosificación relativamente alta (por ejemplo, de 1 a 200mg de anticuerpo por dosis, con dosificaciones de 5 a 25mg es lo que normalmente se usa) en intervalos relativamente cortos se requiere algunas veces hasta que la progresión de la enfermedad se reduzca o termine y preferentemente hasta que el paciente muestre una reducción parcial o total de los síntomas de la enfermedad. De allí en adelante, el paciente se puede administrar un régimen profiláctico. Las dosis para ácidos nucleicos que codifican anticuerpos varían entre 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 µg a 10 mg o 30-300 µg ADN por paciente. Las dosis para vectores virales infecciosas varían entre 10-100 o más viriones por dosis. Los agentes terapéuticos pueden ser administrados por via parenteral, tópica, intravenosas, oral, subcutánea, intrarterial, intracraneal, intraperitoneal, intranasal o intramuscular para tratamiento terapéutico o profiláctico. La ruta más típica de administración de un agente inmunogénico es subcutánea aunque otras rutas pueden ser igualmente efectivas. La siguiente ruta más común es la inyección intramuscular. Este tipo de inyección se realiza más típicamente en el brazo o en los músculos de la pierna. En algunos métodos, los agentes son inyectados directamente en un tejido particular donde se han acumulado los depósitos, por ejemplo, la inyección intracraneal. Se prefiere la inyección intramuscular o la infusión intravenosa para la administración del anticuerpo. En algunos métodos, los anticuerpos terapéuticos particulares son inyectados directamente en el cráneo. En algunos métodos, los anticuerpos son administrados como una composición o dispositivo de liberación sostenida tal como un dispositivo Medipad™.

Los agentes del invento pueden ser administrados opcionalmente en combinación con otros agentes que son al menos efectivos en parte durante el tratamiento de la enfermedad amiloidogénica. En el caso del síndrome de Alzheimer y Down, en los que los depósitos de amiloide ocurren en el cerebro, los agentes del invento también pueden ser administrados en conjunto con otros agentes que incrementan el paso de los agentes del invento a través de la barrera de sangre-cerebro. Los agentes del invento también pueden ser administrados en combinación con otros agentes que facilitan el acceso del agente terapéutico a una célula o tejido objetivo, por ejemplo, liposomas y similares. La coadministración de dichos agentes puede disminuir la dosis del agente terapéutico (por ejemplo, anticuerpo terapéutico o cadena de anticuerpo) necesario para lograr el efecto deseado.

C. Composiciones farmacéuticas Los agentes del invento a menudo son administrados como composiciones farmacéuticas que comprenden un agente terapéutico activo, es decir, una variedad de otros componentes aceptables en el aspecto farmacéutico. Ver Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980)). La forma preferida depende del modo determinado de administración y de la aplicación terapéutica. Las composiciones también pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, diluyentes o transportadores no tóxicos aceptables farmacéuticamente que son definidos como vehículos comúnmente utilizados para formular composiciones farmacéuticas para administración humana o animal. El diluyente es seleccionado de manera que no afecte la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de dichos diluyentes son el agua destilada, la solución salina de fosfato suavizado, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además la composición farmacéutica o la formulación puede incluir otros transportadores, coayudantes, estabilizadores no inmuogénicos, no terapéuticos y similares.

Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir macromoléculas grandes metabilizadas lentamente como las proteínas, polisacáridos tales como chitosan, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y copolímeros (tales como la sefarosa funcionalizada (T ), agarosa, celulosa y similares), aminoácidos poliméricos, copolímeros aminoácidos y agregados lípidos (tales como gotitas de aceite o liposomas). Además, estos transportadores pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes (es decir, coayudantes). Para la administración parenteral, los agentes del invento pueden ser administrados como dosis inyectables de una solución o suspensión de la sustancias en un diluyente aceptable fisiológicamente con un transportador farmacéutico que puede ser un líquido estéril como aceites de agua, solución salina glicerol o etanol. Adicionalmente, las sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, surfactantes, sustancias suavizantes pH y similares pueden estar presentes en las composiciones. Otros componentes de composiciones farmacéuticas son aquellos del petróleo de origen animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuate, aceite de soya y aceite mineral. En general, los glicoles tales como el glicol de propileno o glicol polietileno son los transportadores preferidos, en particular para soluciones inyectables. Los anticuerpos pueden ser administrados en forma de una inyección de depósito o preparación de implante, que pueden ser formulados de manera que permitan una liberación sostenida del ingrediente activo. Una composición a manera de ejemplo comprende un anticuerpo monoclonal a 5 mg/nL, formulados en suavizador acuoso que contiene 50 mM L- de histidina, 150 mM NaCI, graduados a pH 6.0 con HCI. Las composiciones son preparadas típicamente como inyectables, como soluciones líquidas o suspensiones; también se puede preparar formas sólidas adecuadas para la solución en o la suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede ser emulsificada o encapsulada en liposomas o micropartículas tales como el poliláctido, poliglicólido o copolímero para un efecto coayudante mejorado, según lo tratado arriba (ver Langer, Science 249: 1527 (1990) y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97 (1997)). Los agentes de este invento pueden ser administrados en forma de una inyección depósito o de preparación de implante, que puede ser formulada de manera que permita una liberación pulsátil o sostenida del ingrediente activo. Formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones pulmolares intranasales y orales, supositorios y aplicaciones transdérmicos. Para supositorios, fijadores y transportadores incluyen, por ejemplo, glicoles polialcalinos o triglicéridos; tales supositorios pueden ser formados de mixturas que contengan el ingrediente activo en el rango de 0.5% a 10%, preferiblemente 1 %-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, fórmulas de liberación sostenidas o polvos y contienen 10%-95% de ingrediente activo, preferiblemente 25%-70%. La aplicación tópica puede resultar en envío transdérmico o intradérmico. La administración tópica puede ser facilitada por la coadministración del agente de la toxina del cólera o derivados detoxificados o subunidades del mismo u otras toxina bacterianas similares. (Ver Glenn et al., Nature 391 , 851 (1998)). La coadministración puede lograrse mediante el uso de los componentes como una mixtura o como moléculas ligadas obtenidas por la unión cruzada o la manifestación como una proteína de fusión. Se puede lograr el envío transdérmico como alternativa utilizando una traza dérmica o transferosomas (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25:3521 (1995); Cevc et al. , Biochem. Biophys. Acta 1368:201 -15 (1998)).

III. Monitoreando el Curso del Tratamiento El invento proporciona métodos de monitoreo del tratamiento en un paciente que sufre de Alzheimer o que es susceptible a este, es decir, para monitorear un curso de tratamiento administrándosele al paciente. Los métodos pueden ser utilizados para monitorear tanto el tratamiento terapéutico en pacientes sintomáticos o el tratamiento profiláctico en pacientes asintomáticos. En particular, los métodos son útiles para monitorear la inmunización pasiva (por ejemplo, medición del nivel de anticupero administrado). Algunos métodos motivan la determinación de un valor de línea de base, por ejemplo, de un nivel de anticuerpo o de perfil en un paciente, antes de administrar una dosis de agente así como la comparación de este con un valor para el perfil o nivel después del tratamiento. Un incremento significativo (es decir, mayor que el margen típico de error experimental en mediciones repetitivas de la misma muestra, expresado como una desviación de la norma del promedio de dichas medidas) en el valor de las señales de nivel o perfil indica un resultado positivo del tratamiento (es decir, que la administración del agente ha logrado una respuesta deseada). Si el valor para la respuesta inmune no cambia de manera significativa o disminuye, se indica un resultado negativo del tratamiento. En otros métodos, un valor de control (es decir, una desviación estándar y promedio) del nivel o perfil está determinado por una población de control Normalmente los individuos en la población de control no han recibido tratamiento previo. Los valores medidos del nivel o perfil en un paciente después de la administración de un agente terapéutico son luego comparados con el valor de control. Un incremento significativo relativo al valor de control (por ejemplo, mayor que una desviación de norma del promedio) indica un resultado de tratamiento suficiente o positivo. Una falta de incremento o decrecimiento significativo señala un resultado de tratamiento insuficiente o negativo. La administración del agente generalmente se continúa mientras el nivel se incrementa con relación al valor de control. Como antes, el logro de un valor raso relativo a los valores de control es un indicador de que la administración de tratamiento puede ser descontinuada o reducida en dosis y/o frecuencia. En otros métodos, un valor de control del nivel o del perfil (es decir, un promedio y una desviación estándar) está determinado por una población de control de individuos que han pasado por un tratamiento con agente terapéutico y cuyos niveles han resultado en respuesta al tratamiento. Los valores medidos de los niveles o perfiles en un paciente son comparados con el valor de control. Los valores medidos de niveles o perfiles en un paciente son comparados con el valor de control. Si el nivel medio en un paciente no es significativamente diferente (por ejemplo, más de una desviación estándar) del valor de control, el tratamiento puede ser descontinuado. Si el nivel en un paciente se encuentra significativamente bajo el valor de control, la administración continua de un agente esta garantizada. Si el nivel en un paciente persiste bajo el valor de control, entonces se puede indicar un cambio en el tratamiento. En otros métodos, un paciente que no está recibiendo actualmente tratamiento pero ha pasado por un curso previo de tratamiento es monitoreado para niveles de anticuerpo o perfiles para determinar si se requiere un reanudamiento del tratamiento. El nivel o perfil medido en el paciente puede compararse con un valor previamente logrado en el paciente después de un curso previo de tratamiento. Una disminución significativa relativa a la medición previa (es decir, mayor que el margen típico de error en mediciones repetitivas de la misma muestra) es una indicación de que el tratamiento puede ser reanudado. Alternativamente, el valor medido en un paciente puede ser comparado con un valor de control (desviación estándar mayor promedio) determinado en una población de pacientes luego de pasar un curso de tratamiento. Alternativamente, el valor medido en un paciente puede ser comparado con un valor de control en poblaciones de pacientes tratados de manera profiláctica quienes permanecen libres de síntomas de enfermedad o poblaciones de pacientes tratados terapéuticamente quienes muestran mejoramiento de características de la enfermedad. En todos estos casos, una disminución significativa relativa al nivel de control (es decir, más de una desviación estándar) es un indicador de que el tratamiento deberá ser reanudado en el paciente. La muestra de tejido para análisis es típicamente sangre, plasma, suero, fluido mucoso o fluido cerebroespinal del paciente. La muestra es analizada, por ejemplo, para niveles o perfiles de anticuerpos al péptido ?ß, por ejemplo, niveles o perfiles de anticuerpos humanizados. Los métodos de ELISA para detectar anticuerpos específicos al ?ß son descritos en la sección de ejemplos. En algunos métodos, el nivel o perfil de un anticuerpo administrado está determinado utilizando un ensayo de clarificación, por ejemplo, un ensayo de fagocitosis ¡n vitro, según lo descrito en el presente. En dichos métodos, una muestra de tejido de un paciente que está siendo examinado se pone en contacto con depósitos amiloides (es decir, de un ratón PDAPP) y células fagocíticas que transportan receptores Fe. Luego se monitorea la clarificación subsiguiente del depósito amiloide. La existencia y extensión de la respuesta de depuración proporciona una indicación de la existencia y nivel de anticuerpos efectivos para depurar el ?ß en la muestra de tejido del paciente que se encuentra sometido a prueba. El perfil de anticuerpo que sigue a la inmunización pasiva muestra típicamente un incremento inmediato en la concentración del anticuerpo seguido de un decaimiento exponencial. Sin una dosis mayor, el decaimiento se acerca a los niveles de pretratamiento dentro de un periodo de días a meses dependiendo en la mitad de vida del anticuerpo administrado. En algunos métodos, una medición de línea de base de anticuerpo al ?ß en el paciente es realizado antes de la administración, una segunda medición es realizada rápidamente después para determinar el nivel mayor de anticuerpo y se realizan una o más mediciones posteriores en intervalos para monitorear el decaimiento de los niveles de anticuerpo. Cuando el nivel de anticuerpo ha declinado a la línea de base o un porcentaje predeterminado de la línea de base menor superior (por ejemplo, 50%, 25% or 10%), se administra una dosis mayor de anticuerpo. En algunos métodos, los niveles mayores subsiguientes o superiores de orígenes menores son comparados con niveles de referencia previamente determinados para constituir un régimen de tratamiento terapéutico o profiláctico beneficioso en otros pacientes. Si el nivel de anticuerpo medido es significativamente menor que el nivel de referencia (por ejemplo, menor que la desviación estándar menos un promedio del valor de referencia en una población de pacientes que se benefician del tratamiento) se indica la administración de una dosis adicional de anticuerpo. Los métodos adicionales incluyen el monitoreo, sobre el curso del tratamiento, de cualquier síntoma fisiológico de arte reconocido (por ejemplo síntoma mental o físico) que los investigadores o físicos confían rutinariamente para diagnosticar o monitorear las enfermedades amiloidogénicas (por ejemplo la enfermedad de Alzheimer). Uno puede monitorear por ejemplo el deterioro cognitivo. Este último es un síntoma de la enfermedad de Alzheimer y del síndorme de Down pero también puede ocurrir sin las otras características de alguna de estas enfermedades. Por ejemplo, el deterioro cognitivo puede ser monitoreado mediante la determinación del puntaje de un paciente en el Mini-Mental State Exam (Examen Estatal Mini- ental) conforme al convenio a través del curso del tratamiento.

C. Placas El invento proporciona luego placas para realizar el monitoreo de los métodos descritos arriba. Dichas placas contienen normalmente un agente que une específicamente los anticuerpos al ?ß. La placa también puede incluir una etiqueta. Para la detección de anticuerpos al ?ß, la etiqueta está típicamente en la forma de anticuerpo seleccionado antiidiotípicos. Para la detección de anticuerpos, el agente puede ser preunido a una fase sólida, tales como a la cavidad de un plato de una microconcentración de una solución. Las placas contienen normalmente etiquetas que proporcionan instrucciones de uso de la placa. El etiquetado también puede incluir una carta u otros niveles correlativos de régimen de correspondencia de etiqueta medida con niveles de anticuerpo al ?ß. El término etiquetado se refiere a cualquier material escrito o registrado que se adhiere a, o de otra manera acompaña a la placa en cualquier momento durante su fabricación, transporte, ventas o uso. Por ejemplo, el término etiquetado abarca folletos y hojas de propaganda, materiales de embalaje, instrucciones audio o videocasetes, discos de computadora, así como escritura impresas directamente en las placas. El invento también proporciona placas de diagnóstico, por ejemplo, investigación, detección y/o placas de diagnóstico (por ejemplo, para realizar imágenes in vivo). Dichas placas contienen típicamente un anticuerpo para unir a un epítope de ?ß, preferiblemente dentro de residuos de 1-10. De preferencia, se etiqueta la placa o un reactivo de etiquetado secundario se incluye en la placa. De preferencia, se etiqueta la placa con instrucciones para realizar la aplicación propuesta, por ejemplo, para realizar un ensayo de imagen in vivo. Los anticuerpos ejemplares son aquellos que aquío se encuentran descritos.

D. Imagen In vivo El invento proporciona métodos de depósitos amiloides de imagen in vivo en un paciente. Dichos métodos son útiles para diagnosticar o confirmar un diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer o susceptibilidad a la misma. Por ejemplo, los métodos pueden ser utilizados en un paciente que presenta síntomas de demencia. Si el paciente tiene depósitos de amiloide anormales, es probable que éste sufre de la enfermedad de Alzheimer. Los métodos también pueden ser utilizados en pacientes asintomáticos. La presencia de depósitos anormales de amiloide indican susceptibilidad a una futura enfermedad sintomática.. Los métodos también son útiles para monitorear la progresión de la enfermedad y/o responder al tratamiento en pacientes que han sido previamente diagnosticados con la enfermedad de Alzheimer. Los métodos trabajan mediante la administración de un reactivo, tal como un anticuerpo que une el ?ß al paciente y luego detecta el agente después de que se ha unido. Los anticuerpos preferentes unen depósitos ?ß en un paciente sin unir en toda su longitud el polipéptido APP. Se prefiere en particular los anticuerpos que se unen a un epítope ?ß dentro de aminoácidos 1-10. En dichos métodos, el anticuerpo se une a un epítope dentro de los aminoácidos de 7-10 de ?ß. Dichos anticuerpos se unen típicamente e inducen una respuesta de depuración al ?ß. Sin embargo, la respuesta de depuración puede evitarse por el uso de fragmentos de anticuerpos que no tengan una región constante de longitud total, tal como Fabs. En algunos métodos, el mismo anticuerpo puede servir como tratamiento y reactivo de diagnóstico. En general, los anticuerpos que se unen a epítopes terminal-C al residuo 10 de ?ß no muestran una señal tan fuerte como los anticuerpos que se unen a epítopes dentro de los residuos 1-10, presumiblemente porque los epítopes terminal-C son inaccesibles en depósitos amiloides. Consecuentemente dichos anticuerpos son menos preferidos. Los reactivos de diagnóstico pueden ser administrados por inyección intravenosa en el cuerpo del paciente o directamente en el cerebro mediante una inyección intracraneal o perforando un agujero a través del cráneo. La dosis de reactivo deberá estar dentro de los mismos rangos del los métodos de tratamiento. Normalmente el reactivo es clasificado, aunque en algunos métodos el reactivo primario con afinidad para el ?ß no es clasificado y se utiliza un agente de clasificación secundaria para unir al reactivo primario. La selección de la etiqueta depende del medio de detección. Por ejemplo, una etiqueta fluorescente es adecuada para la detección óptica. El uso de etiquetas paramagnéticas es adecuada para una detección topográfica sin intervención quirúrgica. Las etiquetas radiactivas también pueden ser detectadas utilizando PET or SPECT. El diagnóstico es realizado comparando el número, tamaño y/o intensidad de los lugares seleccionados con los valores de línea de base correspondientes. Los valores de línea de base pueden representar los niveles promedio en una población de individuos sanos. Los valores de línea de base también pueden representar los niveles previos determinados en el mismo paciente. Por ejemplo, los valores de línea de base pueden ser determinados en un paciente antes de iniciar el tratamiento y los valores medidos pueden ser luego comparados con los valores de línea de base. Una disminución en los valores relativos a la línea de base indica una respuesta positiva al tratamiento. El presente invento será descrito con mayor detalle a través de los siguientes ejemplos exhaustivos.

EJEMPLOS Los siguientes identificadores de secuencias son usados en toda la sección de Ejemplos haciendo referencia a las secuencias nucleótidas y de aminoácidos de la región variable de la cadena de inmunoglobulina.

Secuencia Secuencia de Secuencia Secuencia de Anticuerpo nucleótida VL aminoácido VL nucleótida VH aminoácidos VH 12B4 SEQ ED NO: 1 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 humanizado SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO:6 SEQ ED NO:7 SEQ ED NO:8 12B4vl humanizado SEQ ED NO: 1 SEQ ID NO:2 SEQ ED NO:9 SEQ ED NO: 10 12B4v2 humanizado SEQ ED NO: 1 SEQ ED NO:2 SEQ ID NO: 1 1 SEQ ID NO: 12 12B4v3 Ejemplo I. Clonación v Secuencia de las Regiones Variables 12B4 del Ratón Análisis de Clonación y Secuencia del 12B4 VH. Las regiones VH y VL del 12B4 de las células hibridomas fueron clonadas por RT-PCR y 5' RACE usando mARN de las células hibridomas y la metodología de clonación estándar. La secuencia nucleótida (SEQ ID NO:3) y la secuencia de aminoácido deducida (SEQ ID NO:4) derivadas de dos clones con cADN independiente, cuyo código es el supuesto campo 12B4 VH, se presentan en la Tabla 2 y 3, respectivamente.

Tabla 2: Secuencia 12B4 VH ADN del ratón. ATGGACAGGCTTACTTCCTCATTCCTGCTGCTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTCCCAGG TTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTG TTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTAATGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCT TCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGAGGACAAGCGCTATAACC CATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCTAACAATCAGGTATTCCTCAA GATCACCAATGTGGACACTGCTGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGAAGGAGGATCATC TATGATGTTGAGGACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAG (SEQ ID NO: 3) * Péptido líder subrayado.

Tabla 3: Secuencia del aminoácido 12B4 VH del ratón mdrltssfUlivpayvlsqVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLStngmgvsWIRQP SGKGLEWLAhiywdedkrynpslksRLTI^ ydvedyfdyWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 4) * Péptido líder y CDRs en un caso menor.

Análisis de Clonación y Secuencia del 12B4 VL. La región VL variable de la cadena ligera del 12B4 fue clonada de manera análoga a la región VH. La secuencia nucleótida (SEQ ID NO:1 ) y la secuencia de aminoácido deducida (SEQ ID NO:2) derivadas de dos clones con cADN independiente, cuyo código es el supuesto campo 12B4 VL, se presentan en la Tabla 4 y 5, respectivamente.

Tabla 4: Secuencia 12B4 VL ADN del ratón ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATG TTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTC TTGCAGATCTAGTCAGAACATTGTTCATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTG CAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGG TCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGT GGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTC GGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAC (SEQ IDNO:l) * Péptido líder subrayado Tabla 5: Secuencia de aminoácido 12B4 VL del ratón mklpvrllvlmfwipasssDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCrssqnivhsngntyleWYL QKPGQSPKLLIYkvsnrfSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCfqgshvpltF GAGTKLELK (SEQ ID NO: 2) * Péptido líder y CDRs en un caso menor.

Las secuencias 12B4 VL y VH cumplen hasta cierto punto con los criterios de la región funcional V, ya que contienen un ORF contiguo de la metionina iniciadora a la región C, y comparten residuros conservados característicos de los genes de la región V de la imnuglobulina. Del terminal N al terminal C, tanto la cadena ligera como la pesada comprenden los campos FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada campo va de acuerdo a la convención de numeración de Kabat y otros, supra. Ejemplo II: Manifestación del Anticuerpo Quimérico 12B4 Manifestación del Anticuerpo Quimérico 12B4: Las regiones variables de la cadena ligera y pesada fueron nuevamente dirigidas para codificar las secuencias que unen al donante de los cruces VDJ o VJ respectivos, y clonados en el vector pCMV-hDl para la cadena pesada y en el vector pCMV-hDl para la cadena ligera de la expresión mamaria. Estos vectores codifican las regiones humanas continuas ?1 y Ck como fragmentos exónicos del caset de la región variable insertada. Siguiendo a la verificación de la secuencia, los vectores de manifestación de la cadena pesada y de la cadena ligera fueron cotransfectados en células COS. Los diversos clones de la cadena pesada fueron cotransfectados independientemente con diferentes clones quiméricos de la cadena ligera para confirmar la reproductibilidad del resultado. Los medios condicionados fueron reunidos 48 horas después a la transfección, probados mediante el análisis del tachado occidental (western blot) para la producción de anticuerpos o de ELISA para la unión AD. Todos los transfectantes múltiples manifestaron combinaciones de cadena pesada + cadena ligera que son reconocidas por un anticuerpo de cabeza antihumana IgG (H+L) en un tachado occidental (western blot). La vinculación directa de los anticuerpos quiméricos 12B4 para ?ß se evaluó con la prueba de ELISA. La Figura 5 demuestra que se descubrió que el quimérico 12B4 vincula ?ß con gran avidez, similar a la demostrada por la quimérica y humanizada 3D6 (Figura 5). (La clonación, caracterización y humanización del 3D6 es descrita en la Serie No. 10/010,942 de la Aplicación de la Patente Americana, contendió total que se encuentra en la referencia). Asimismo, una prueba de ELISA basada en una inhibición competitiva reveló que el anticuerpo quimérico 12B4 y el murino 12B4 competían igualmente con el quimérico y el murino biotinilatado 3D6 al vincularlo a ?ß. La Figura 6 demuestra que el quimérico 12B4 (rayas, triángulos abiertos) compite con igual potencia con su contraparte murina no biotinilatada (líneas sólidas, triángulos cerrados) al vincular el murino biotinilatado 12B4 al péptido ?ß 1 -42.

Ejemplo III: Eficacia del mAb 12B4 en diversos aspectos neuropatolóqicos en ratones PDAPP Este ejemplo describe la eficacia de mAb 12B4 murino en diversos aspectos neuropatológicos. Se ha descrito la comparación de dos mAbs, 12B4 y 3D6. Ambos mAbs son de isotipo lgG2a y ambos enlazan un epítopo al término N del péptido ?ß.

IMMUNIZA C ION ES Los ratones PDAPP fueron inmunizados pasivamente ya sea con mAb 12B4 (que reconoce ?ß 3-7) o mAb 3D6 (que reconoce ?ß 1-5), ambos de isotipo lgGy2a. 12B4 fue probado a 10 mg/kg. 3D6 fue administrado en tres dosis diferentes, 10 mg/kg, 1 mg/kg y 10 mg/kg una vez al mes (1 x 4). Un anticuerpo no descrito lgGy2a (?? 11/15) y las inyecciones PBS fueron colocadas a modo de control. La inmunización activa con péptido ?ß sirvió de comparación. Entre 20 y 35 animales fueron analizados en cada grupo. Los aspectos neuropatológicos probados incluyen carga amiloide ye arga neurítica.

CARGA AMILOIDE La extensión de la corteza frontal ocupada por depósitos amiloides fue determinada mediante una inmunotinturación con 3D6 seguida de un análisis cuantitativo de la imagen. Los resultados de este análisis se muestran en el Cuadro 6. Todas las inmunoterapias (es decir, inmunización con 12B4, 3D6 (todas ais dosis probadas) y péptido ?ß) conllevan a una importante reducción de la carga amiloide.

CARGA NEURÍTICA Previamente, se ha observado que 10D5, un anticuerpo murino monoclonal de isotipo IgGvl que reconoce el mismo epítopo como 12B4, fue incapaz de reducir de manera significativa la carga neurítica, que sugiere que los anticuerpos de isotipo lgG 2a isotype, pero no de otro isotipos, son capaces de reducir la carga neurítica en cobayos con la enfermedad de Alzheimer (fechas no mostradas). La carga neurítica que sigue a la inmunización pasiva con 12B4 versus 3D6 (ambos de isotipo lgGY2a) fue, por lo tanto, determinada en ratones PDAPP mediante la inmunotinturación de secciones cerebrales con anticuerpo antiAPP 8E5 seguido por análisis cuantitativo de la imagen. La distrofia neurítica es indicada por la apariencia de neuritos distróficos (por ejemplo, neuritos con apariencia globular) localizada en la cercanía inmediata de las placas amiloides. Los resultados de este análisis son mostrados en el Cuadro 7. Estos datos indican que el tratamiento con 12B4 redujo de manera muy significativa la carga neurítica. En contraste, 3D6 no redujo significativamente la carga neurítica.

Cuadro 6: Carga Amiloide de la Corteza Frontal Cuadro 7: Carga Neurítica de la Corteza Frontal Los resultados mostrados indican que el tratamiento con un anticuerpo ?ß de isotipo lgGv2a puede ser necesario, pero no suficiente, para reducir la carga neurítica. El enlace ?ß vía un epítopo diferente (es decir, ?ß 3-7) también puede ser esencial para reducir esta patología en los ratones PDAPP. La caracterización de diversos aspectos neuropatológicos en el ratón PDAPP con la enfermedad de Alzheimer brinda valiosa información que utilizará el especialista para diseñar los protocolos apropiados de inmunización terapéutica humana. Por ejemplo, la reducción de la carga neurítica se puede llevar a cabo en pacientes humanos que emplean una versión humanizada de 12B4 de subtipo lgG1 (es decir, el equivalente humano de subtipo lgGy2A en ratones) que se enlaza a un epítopo en residuos 3-7 de ?ß.

Ejemplo IV. Humanización 12B4 A. Anticuerpo Humanizado 12B4, Versión 1 Modelado de Homología/Molecular. Con el fin de identificar los residuos claves del marco estructural en el anticuerpo murino 12B4, se generó un modelo tridimensional basado en los anticuerpos murínos más cercanos a las cadenas pesadas y ligeras. Para este propósito, se eligió un anticuerpo designado 2PCP como un patrón para modelar la cadena ligera 12B4 (PDB ID: 2PCP, Lim y otros. (1998) J. Biol. Chem. 273:28576) y se eligió un anticuerpo designado 1 ETZ como un patrón para el modelado de la cadena pesada. (PDB ID: 1 ETZ, Guddat y otros. (2000) J. .Mol. Biol. 302:853). La alineación de la secuencia de aminoácido del 12B4 con la cadena ligera y la cadena pesada de estos anticuerpos revelaron que los anticuerpos 2PCP y 1 ETZ comparten una importante homología de secuencia con 12B4. Además, los lazos CDR de los anticuerpos seleccionados encajan en las mismas clases estructurales canónicas de Chothia así como los lazos CDR del 12B4. Por lo tanto, 2PCP y 1ETZ fueron inicialmente seleccionados como anticuerpos de una estructura solucionada para el modelado de homolgía del 12B4. Un primer paso del modelo de homología de la región variable 12B4 basada en los anticuerpos anteriormente señalados, se construyó usando el paquete de software Look & SegMod Modules GeneMine (v3.5). Este software se compró con una licencia perpetua obtenida del Molecular Applications Group (Palo Alto, CA). Este paquete de software, cuya autoría pertenece al Drs. Michael Levitt y Chris Lee, facilita el proceso del modelado molecular automatizando los pasos comprendidos en el modelado estructural de una secuencia primaria en un patrón de una estructura conocida basada en la homología de la secuencia. Trabajando en una estación Silicon Graphics IRIS en un entorno UNIX, la estructura diseñada se refina automáticamente por medio de una serie de pasos de minimización de energía para disipar los contactos atómicos desfavorables y optimizar las interacciones electrostáticas y las interaccioens Van der Walls. Se elaboró un modelo posterior refinado usando la capacidad de diseño del Quanta®.

Selección de las Secuencias del Anticuerpo del Receptor Humano. Las secuencias adecuadas del anticuerpo del receptor humano fueron identificadas mediante comparaciones computarizadas de las secuencias del aminoácido de las regiones variables del ratón con las secuencias de los anticuerpos humanos conocidos. La comparación se realizó por separado en las cadenas pesada y ligera del 12B4. En particular, los campos variables de los anticuerpos humanos, cuyas secuencias marco exhibieron un alto grado de identidad de secuencia con las regiones murinas marco VL y VH fueron identificadas mediante las interrogantes de la Base de Datos de Kabat usando NCBI BLAST (públicamente accesible a través de los servidores de internet de los Institutos Nacionales de Salud NCBI) con las respectivas secuencias murinas marco. Se escogieron dos secuencias de candidatos como secuencias de receptores basadas en los siguientes criterios: (1 ) homología con la secuencia del sujeto; (2) compartir las estructuras canónicas CDR con la secuencia del donante; y (3) no contener ningún residuo raro de aminoácido en las regiones marco. La secuencia del receptor seleccionado para VL es el Número de ID Kabat (KABID) 005036 (Banco de Genes Acceso No. X67904) y para VH es KABID 000333 (Banco de Genes Acceso No. X54437). Las primeras versiones del cuerpo humanizado 3D6 utilizan estas secuencias de anticuerpo del receptor seleccionado.

Sustitución de Residuos Aminoácidos. Como se indicó anteriormenete, los anticuerpos humanizados de las regiones variables del marco comprenden regiones variables marco principalmente de la inmunoglobulina humana (¡mmunoglobulina del receptor) y complementaridad que determina las regiones principalmente de la inmunoglobulina del ratón (¡mmunoglobulina del donante) denominada 12B4. Habiendo identificado la complementaridad que determina las regiones del 12B4 y las inmunoglobulinas apropiadas del receptor humano, el siguiente paso fue determinar qué residuos sustituir, en caso los hubiera, entre estos componentes para optimizar las propiedades del anticuerpo humano resultante.

Región V de la cadena ligera readaptada: En la Figura 1 se muestra la alineación del aminoácido de la región V de la cadena ligera readaptada. La elección del marco del receptor (Kabid 005036) es del mismo subgrupo que el que corresponde a la región murina V, no presenta residuos de marco inusual y los CDRs pertenencen a los mismos grupos de estructura canónica Chothia. Se dicta una simple mutación regresiva (I2V) cuando el residuo encaja en la clasificación canónica. La versión 1 de la región readaptada VL es totalmente germinal.

Región V de la cadena pesada readaptada: En la Figura 2 se muestra la asignación del aminoácido de la región V de la cadena pesada readaptada. La elección del marco del receptor (Kabid 000333) es del mismo subgrupo que el que corresponde a la región murina V, no presenta residuos de marco inusual y los CDRs pertenecen a los mismos grupos canónicos Chothia. El diseño estructural de la cadena murina VH, en conjunto con la alineación del aminoácido del Kabid 000333 a la secuencia murina, dicta 9 retromutaciones en versión 1 (v1 ) de la cadena pesada readaptada: L2V, V24F, G27F 29L, I48L, G49A, V67L, V71 K, & F78V (numeración de Kabat). Las retromutaciones se resaltan con asteriscos en la alineación del aminoácido mostrado en la Figura 2.

De las 9 retromutaciones, 4 las dicta el diseño, porque los residuos son residuos canónicos (V24F, G27F, I29L, & V71 K, indicados con áreas de relleno sólido), es decir, residuos de marco que pueden contribuir a la vinculación del antígeno por virtud de la proximidad a los residuos CDR. No hay retromutaciones necesarias en las siguientes clases más importantes de residuos, los residuos de interefase incluidos en las interacciones de empaque VH-VL (indicadas por cajas abiertas). Los 5 residuos restantes que apuntan a una mutación regresiva (L2V, I48L,G49A, V67L, F78V, numeración de Kabat) recaen en la clase vernier (contribución indirecta para la conformación del CDR, área densamente punteada en la figura 2,). Se diseñó la versión 2 para retener el menor número de residuos murinos no CDR. La mutación regresiva L2V introduce un cambio germinal (cuando se usa VH4-61 como referencia germinal) y esta mutación regresiva es eliminada de la versión 2 de la cadena pesada para restaurarla en germinal. Las 4 retromutaciones restantes de la clase vernier también son restauradas en la versión 2 de la cadena pesada (I48L, G49A, V67L, F78V). Por lo tanto, la versión 2 contiene un total de 5 residuos murinos no CDR (1 en VL, y 4 en VH). La versión 3 se diseñó para restaurar 2 de los 5 residuos vernier (I48L, & F78V), que según el diseño señala que podrían ser los residuos vernier más importantes. De ahí que la versión 3 contenga un total de 7 residuos murinos no CDR.

En el Cuadro 9 se presenta un resumen de los cambios incorporados a las versiones 1 , 2 y 3 de los 12B4 humanizados.

Cuadro 9. Resumen de los cambios en el 12B4.v1 humanizado *elimina en v2 y v3; #elimina en v2, restaura en v3. Los cuadros 10 y 11 presentan las claves de numeración de Kabat para las diversas cadenas ligeras y pesadas, respectivamente.

Cuadro 10: Clave para la Numeración Kabat para la Cadena Ligera 12B4 12B4 A19-KAB# VL vi KABID Germen # TIPO Ratón HUM 005036 Comentario 1 1 FR1 D D D D 2 2 V V I I mutación regresiva - canónica en vi, v2 y v3 3 3 L V V V 4 4 M M M M 5 5 T T T T 6 6 Q Q Q Q 7 7 T s s s 8 8 P P P P 9 9 L L L L 10 10 S s S S 1 1 1 1 L L L L 12 12 P P P P 13 13 V V V V 14 14 s T T T 15 15 L P P P 16 16 G G G G 17 17 D E E E 18 18 Q P P P 19 19 A A A A 20 20 S S S S 21 21 I I I I 22 22 s s s S 23 23 c c c C 24 24 CDRl R R R R 25 25 S S S S 26 26 s S S S 27 27 Q Q Q Q 7A 28 N N s s 7B 29 I I L L 7C 30 V V L L 7D 31 H H H H 7E 32 S S R S 28 33 N N Y N 29 34 G G G G 30 35 N N Y Y 31 36 T T N N 32 37 Y Y Y Y 33 38 L L L L 34 39 E E D D 35 40 FR2 W W w W 36 41 Y Y Y Y 37 42 L L L L 38 43 Q Q Q Q 39 44 K K K K 40 45 P P P P 41 46 G G G G 42 47 Q Q Q Q 43 48 s s s s 44 49 P P P P 45 50 K Q Q Q 46 51 L L L L 47 52 L L L L 48 53 I I I I 49 54 Y Y Y Y 50 55 CDR2 K L L 51 56 V V G G 52 57 s S S S 53 58 N N N N 54 59 R R R R 55 60 F F A A 56 61 S S S S 57 62 FR3 G G G G 58 63 V V V V 59 64 P P P P 60 65 D D D D 61 66 R R R R 62 67 F F F F 63 68 S S S S 64 69 G G G G 65 70 S S S S 66 71 G G G G 67 72 S S S S 68 73 G G G G 69 74 T T T T 70 75 D D D D 71 76 F F F F 72 77 T T T T 73 78 L L L L 74 79 K K K 75 80 I I I I 76 81 S s s s 77 82 R R R R 78 83 V V V V 79 84 E E E E 80 85 A A A A 81 86 E E E E 82 87 D D D D 83 88 L V V V 84 89 G G G G 85 90 V V V V 86 91 Y Y Y Y 87 92 Y Y Y Y 88 93 c c c c 89 94 CD 3 F F M M 90 95 Q Q Q Q 91 96 G G A A 92 97 s S L L 93 98 H H Q Q 94 99 V V T T 95 100 P P P P 96 101 L L Y 97 102 T T T 98 103 FR4 F F F 99 104 G G G 100 105 A Q Q 101 106 G G G 102 107 T T T 103 108 K K K 104 109 L L L 105 110 E E E 106 111 L I I 106A 112 K K K Cuadro 11 . Clave para la Numeración Kabat para la Cadena Pesada 12B4 X2B4 VH4-39 VH4-61 KAB# TIPO VH vHv l KABID Germen Germen # RÜn ¾ 0003 Comentario 1 1 FR1 Q Q Q Q Q 2 2 V V L L V Mutación regresiva vernier sólo en vi 3 3 T Q Q Q Q 4 4 L L L L L 5 5 K Q Q Q Q 6 6 E E E E E 7 7 S S S S S 8 8 G G G G G 9 9 P P P P P 10 10 G G G G G 11 11 I L L L L 12 12 L V V V V 13 13 Q K K K K 14 14 P P P P P 15 15 s s s S S 16 16 Q E E E E 17 17 T T T T T 18 18 L L L L L 19 19 s S S S S 20 20 L L L L L 21 21 T T T T T 22 22 C c C C C 23 23 s T T T T 24 24 F F V V V Mutación regresiva canónica en vi, v2 ) 25 25 S s s s s 26 26 G G G G G 27 27 F F G G G Mutación regresiva canónica en vi , v2 ) 28 28 S S S S S 29 29 L L I I V Mutación regresiva canónica en vi, v2 ) 30 30 S S s s s 31 31 CDR1 T T R s s 32 32 N N G s G 33 33 G G S s G 34 34 M M H Y Y 35 35 G G Y Y Y 5A 36 V V W w w 5B 37 S S G G s 36 38 FR2 w W W w w 37 39 I I I I I 38 40 R R R R R 39 41 Q Q Q Q Q 40 42 P P P P P 41 43 s P P P P 42 44 G G G G G 43 45 K K K K 44 46 G G G G G 45 47 L L L L L 46 48 E E E E E 47 49 W W W W W 48 50 L L I I I Mutación regresiva vernier sólo en vi y 49 51 A A G G G Mutación regresiva vernier sólo en vi 50 52 CDR2 H H S S Y 51 53 I I I I I 52 54 Y Y Y , Y Y 53 55 w W Y Y Y 54 56 D D s s s 55 57 E E G G G 56 58 D D N s s 57 59 K T T T 58 60 R R Y Y N 59 61 Y Y F Y Y 60 62 N N N N N 61 63 P P P P P 62 64 S S s s s 63 65 L L L L L 64 66 K K K K 65 67 s S S s S 66 68 FR3 R R R R R 67 69 L L V V V Mutación regresiva vernier sólo en vi 68 70 T T T T T 69 71 I I I I I 70 72 S s s s s 71 73 K K V V V Mutación regresiva canónica en vi, v2 ) 72 74 D D D D D 73 75 T T T T T 74 76 s s s s s 75 77 N K K K K 76 78 N N N N N 77 79 Q Q Q Q Q Mutación regresiva vernier en vi y v3 79 81 F S S S S 80 82 L L L L L 81 83 K K K K K 82 84 I L L L L 2A 85 T S S S S 2B 86 N S S s s 2C 87 V V V V V 83 88 D T T T T 84 89 T A A A A 85 90 A A A A A 86 91 D D D D D 87 92 T T T T T 88 93 A A A A A 89 94 T V V V V 90 95 Y Y Y Y Y 91 96 Y Y Y Y Y 92 96 c c c c c 93 97 A A A A A 94 98 R R R R R 95 99 CDR3 R R L 95A 100 - - G 96 101 R R P 97 102 I I D 98 103 I I D 99 104 Y Y Y 100 105 D D T 100A 106 V V L 100B 107 E E D 100C 108 D D G 100D 109 Y Y - 100E 110 F F M 101 11 1 D D D 102 112 Y Y V 103 113 FR4 W W W 104 114 G G G 105 115 Q Q Q 106 116 G G G 107 117 T T T 108 1 18 T T T 109 1 19 L V V 1 10 120 T T T 1 1 1 121 V V V 1 12 122 s s s 1 13 123 s s s Los anticuerpos humanizados exhiben preferentemente una afinidad específica de vinculación para ?ß de por lo menos I07, 108, 109 or I010 M"1. Generalmente el límite superior de afinidad de vinculación de los anticuerpos humanizados para ?ß oscila en un factor de tres, cuatro o cinco del de 12B4 (es decir, ~109 M"1). A menudo el límite inferior de la afinidad de vinculación también se encuentra dentro de un factor de tres, cuatro o cinco del de 12B4.

Ensamblaje y Manifestación de 12B4 VH y VL Humanizado, Versión 1 La Figura 9a es una representación esquemática de la estrategia para el ensamblaje mediatizado PCR del VL.humanizado v1. La Figura 9b es una representación esquematizada de la estrategia para el ensamblaje mediatizado PCR de VH.humanizado v1. El Cuadro 12 presenta las cartillas usadas para el ensamblaje mediatizado PCR del 12B4v1 .

Cuadro 12: Oligonucleótidos sintéticos usados en el ensamblaje mediatizado per de las regiones humanizadas SEQ ID NO: 25 4894 24 No TCC TCA TCC CAA TAG 12B4hum VHvl, A+B detrás ATG TGT GCC cartilla% A+T = 50.00 [12] ; % C+G = 50.00 [12] Davis, Botstein, Roth Melting Temp C. 64.57 SEQ ID NO: 26 4895 22 Sí GTG GCT GGC ACA CAT 12B4hum VHvl, C+D delante CTA TTG G cartilla% A+T = 45.45 [10] ; % C+G = 54.55 [12] Davis , Botstein, Roth Melting Temp C. 64.54 SEQ ID NO: 27 4896 24 NO tea tat gga tcc act 12B4hum VHvl, C+D delante cae CTG AGG cartilla?, A+T = 50.00 [12] ; % C+G = 50.00 [12] Davis, Botstein, Roth Melting Temp C. 64.57 SEQ ID NO: 28 Los porcentajes equimolares de los fragmentos sintéticos VHvlA+VHvlB y VHvlC+VHvlD fueron recocidos como pares, en distintos tubos de reacción empleando los procedimientos estándares. La reacción del recocido A+B se ensambló usando PCR con cartillas A+B hacia y A+B desde a 60°C de recocido, 25 ciclos. Igualmente, la reacción de recocido C+D se ensambló usando cartillas PCR C+D delante y C+Ddetrás en condiciones idénticas. La mitad 5' A+B, y la mitad 3' C+D, PCR ensamblado fueron purificadas con gel para un ensamblaje final del PCR medio. El ensamblaje total de la región V se efectuó mezclando la mitad A+B 5 'ensamblada con la mitad C+D 3' de la región V, recociendo, y extendiendo usando cartilla VHvlA+B delante y cartilla VHvlC+D detrás. La longitud total de las regiones VH y VL ensambladas de esta manera fueron purificadas con gel, y clonadas en pCRScript para la verificación de la secuencia de ADN. Las secuencias nucleótidas de 12B4VL humanizado (versión 1 ) (SEQ IDNO:5) y de 12B4VH humanizado (versión 1 ) (SEQ ID NO: 7) han sido listadas a continuación como Tablas 13 y 14, respectivamente.

Tabla 13. Secuencia Nucleótida de 12B4VLv1 humanizado. ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGG ATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCAT CTCCTGCAGGTCTAGTCAGAACATTGTTCATAGTAATGGAAACACCTATTTGGAATGGTAC CTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTG GGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAG AGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACG TTCGGTCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAC Tabla14. Secuencia Nucleótida de 12B4VHv1 humanizado ATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGG TGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTG CACTTTCTCTGGTTTTTCCCTGAGCACTAATGGTATGGGTGTGAGCTGGATCCGGCAGCCC CCAGGGAAGGGACTGGAGTGGCTGGCACACATCTATTGGGATGAGGACAAGCGCTATAACC CATCCCTCAAGAGTCGACTCACCATATCAAAGGACACGTCCAAGAACCAGGTATCCCTGAA GCTGAGCTCTGTGACCGCTGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAGGAGGATCATC TATGATGTTGAGGACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAG B. Anticuerpo de 12B4 Humanizado Versión 2 Una segudna versión de 12B4 humanizado fue creada considerando cada una de las sustituciones indicadas para la versión 1 , excepto para la sustitución L-> V en el residuo 2, la sustitución l- L en el residuo 48, la sustitución G- A en el residuo 49, la sustitución V-> L en el residuo 67 y la sustitución F- V en el residuo 78. Las secuencias nucleótidas de 3D6 humanizado versión 2 de las cadenas ligera y pesada son presentadas como SEQ ID NOs: 9 y 1 1 , respectivamente. Las secuencias nucleótidas de 3D6 humanizada versión 2 de las cadenas ligera y pesada son presentadas como SEQ ID NOs: 1 y 9, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de 3D6 humanizado versión 2 de las cadenas ligera y pesada son presentadas como SEQ ID NOs: 2 y 10, respectivamente.

C. Anticuerpo de 12B4 Humanizado Versión 3 Una tercera versión del 12B4 humanizado se creó considerando cada una de las sustituciones indicadas para la versión 1 , excepto para la sustitución L- V en el residuo 2, la sustitución G-> A en el residuo 49 y la sustitución V-> L en el residuo 67. Las secuencias nucleótidas de 3D6 humanizado versión 2 de las cadenas ligera y pesada son presentadas como SEQ ID NOs: 1 y 9, respectivamente. Las secuencias nucleótidas de 3D6 humanizado versión 3 de las cadenas ligera y pesada son presentadas como SEQ ID NOs: 1 y 1 1 , respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de 3D6 humanizado versión 3 de las cadenas ligera y pesada son presentadas como SEQ ID NOs: 2 y 12, respectivamente.

Ejemplo V. Prevención y Tratamiento de los Pacientes Humanos Se aplica una única dosis en el ensayo de fase I para determinar la seguridad en los humanos. Se administra un agente terapéutico en dosis en aumento a diferentes pacientes comenzando desde aproximadamente el nivel 0.01 de la supuesta eficacia y aumentando por un factor de tres hasta el nivel de aproximadamente 10 veces la dosis efectiva que se obtiene en el ratón. Se realiza un ensayo de fase II para determinar la eficacia terapéutica. Se seleccionan los pacientes que presentan la enfermedad de Alzheimer en su fase temprana o media y que emplean los criterios de la enfermedad de Alzheimer o de los criterios de la Asociación de Desórdenes Relacionados (ADRDA) para casos probables de AD. Los pacientes adecuados obtienen un puntaje en un rango de 12-26 en el Mini-Mental State Exam (MMSE). Otros criterios de selección son que los pacientes tienen una probabilidad de supervivencia igual a la duración del estudio pero no a elementos complicados como el uso de medicinas concomitantes que pueden interferir. Las evaluaciones base de la función de los pacientes se realizan empleando medidas psicométricas clásicas, tales como MMSE, y ADAS, que vienen a ser una escala amplia para evaluar a los pacientes con un nivel y función de la Enfermedad de Alzheimer. Estas escalas psicométricas brindan una medida de progresión de la condición de Alzheimer. Las escalas de vida cualitativa adecuadas también pueden usarse para monitorear el tratamiento. La progresión de la enfermedad también puede ser monitoreada por MRI. Los perfiles de sangre de los pacientes también pueden ser monitoreados incluyendo ensayos de anticuerpos específicos immunógenos y respuestas de las células T. Siguiendo las medidas de base, los pacientes empiezan a recibir tratamiento. Son seleccionados al azar y tratados, ya sea con el agente terapéutico o con el placebo a ciegas. Los pacientes son monitoreados por lo menos cada seis meses. La eficacia se determina por una reducción significativa en la progresión de un grupo de tratamiento relativo al grupo del placebo. Se realiza un segundo ensayo de fase II para evaluar la conversión de pacientes con pérdida de memoria temprana no causada por la Enfermedad de Alzheimer, algunas veces referido como el daño de la memoria asociado con la edad (AAMI) o un daño cognitivo medio (MCI), a la probable enfermedad de Alzheimer según los criterios de definición de ADRDA. Los pacientes con alto grado de riesgo a padecer la Enfermedad de Alzheimer son seleccionados de una población no clínica escogiendo poblaciones de referencia por signos tempranos de pérdida de memoria u otras dificultades asociadas a la sintomatología pre Alzheimer, una historia familiar de la Enfermedad de Alzheimer, factores de riesgo genético, edad, sexo, y otras características halladas para predecir el alto riesgo a la Enfermedad de Alzheimer. Se reúnen los puntajes de base en métricas adecuadas incluyendo el MMSE y el ADAS junto con otras métricas designadas para evaluar una población más normal. Estas poblaciones de pacientes se dividen en grupos adecuados que comparán la función del placebo y la dosificación alternativa con el agente. Estas poblaciones de pacientes están seguidas de intervalos de aproximadamente seis meses, y el punto final para cada paciente es si padecerá o no la Enfermedad de Alzheimer según la definición de los criterios de ADRDA al término de la observación. Aunque el invento anterior fue descrito en detalle para propósitos de claridad y entendimiento, es obvio que ciertas modificaciones se pueden practicar dentro del ámbito de las reivindicaciones anexadas. Todas las publicaciones y documentos patentados aquí citados, así como el texto que aparece en las figuras y en el listado de la secuencia, están incorporados en la presente en su totalidad para todo propósito como si cada uno fuera denotado individualmente. De lo anterior, aparentemente el invento ofrece un número de usos. Por ejemplo, ofrece el uso de cualquiera de los anticuerpos para ?ß anteriormente descritos en el tratamiento, la profilaxis o el diagnóstico de la enfermedad amiloidogénica o en la elaboración de un medicamento o la composición de un diagnóstico para el mismo uso.

Claims

Reivindicaciones Una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada la cual comprende regiones complementarias determinantes de la secuencia de región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina 12B4 establecida como SEQ ID N°2, y que comprende regiones marco variables de una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina de un receptor humano, siempre y cuando al menos un residuo marco sea sustituido con el correspondiente residuo de aminoácido de la secuencia de región variable de la cadena ligera 12B4 del ratón, en donde el residuo marco es seleccionado del grupo, el cual consta de: (a) un residuo que no se une covalentemente al antígeno de manera directa; (b) un residuo adyacente a las regiones complementarias determinantes; (c) un residuo que interactúa con las regiones complementarias determinantes. (d) un residuo que participa en la interfase VL-VH. Una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada que comprende regiones complementarias determinantes de la región variable de la secuencia de región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina 12B4 establecida como SEQ ID N°: 4 y que comprende regiones de marco variable de una cadena pesada de inmunoglobulina de un receptor humano, siempre y cuando al menos un residuo marco sea sustituido con el residuo de aminoácido correspondiente de la secuencia de la región variable de la cadena pesada 12B4 del ratón, en donde el residuo marco es seleccionado de un grupo, el cual consta de: (a) un residuo que no se une covalentemente al antígeno de manera directa (b) un residuo adyacente a las regiones complementarias determinantes; (c) un residuo que participa en la interfase VL-VH. La cadena ligera de la reivindicación 1 , en donde un residuo que interactúa con las regiones complementarias determinantes es identificado al modelar la cadena ligera 12B4 basada en la estructura soluble de una cadena ligera de ¡nmunoglobulina murina que comparte al menos una identidad de secuencia del 70% con la cadena ligera 12B4. La cadena ligera de la reivindicación 1 en donde un residuo que interactúa con las regiones complementarias determinantes es identificado al modelar la cadena ligera 12B4 basada en la estructura soluble de una cadena ligera de ¡nmunoglobulina murina que comparte al menos una identidad de secuencia del 80% con la cadena ligera 12B4. La cadena ligera de la reivindicación 1 , en donde un residuo que interactúa con las regiones complementarias determinantes es identificado al modelar la cadena ligera 12B4 basada en una estructura soluble de una cadena ligera de ¡nmunoglobulina murina que comparte al menos una identidad de secuencia del 90% con la cadena ligera 12B4. La cadena pesada de la reivindicación 2 en donde un residuo que interactúa con las regiones complementarias determinantes es identificado al modelar la cadena pesada 12B4 basada en una estructura soluble de una cadena pesada de ¡nmunoglobulina murina que comparte al menos una identidad de secuencia del 70% con la cadena pesada 12B4. La cadena pesada de la reivindicación 2, en donde un residuo que interactúa con las regiones complementarias determinantes es identificado al modelar la cadena pesada 12B4 basada en una estructura soluble de una cadena pesada de inmunoglobulina murina que comparte al menos una identidad de secuencia del 80% con una cadena pesada 12B4. La cadena pesada de la reivindicación 2, en donde un residuo que interactúa con las regiones complementarias determinantes es identificado al modelar una cadena pesada 12B4 basada en una estructura soluble de una cadena pesada de inmunoglobulina murina que comparte al menos una identidad de secuencia del 90% con la cadena pesada 12B4. Una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada que comprende regiones complementarias determinantes de una secuencia de región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina 12B4 establecida como SEQ ID N:2, y que comprende regiones marco variables de una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina de un receptor humano, siempre y cuando al menos un residuo marco sea sustituido con el residuo de aminoácido correspondiente de la secuencia de región variable de cadena ligera 12B4 de ratón, en donde el residuo marco es un residuo capaz de afectar una función o conformación de región variable de cadena ligera tal cual se identifica mediante el análisis de un modelo tridimensional de una región variable. Una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada que comprende regiones complementarias determinantes de la región variable de la secuencia de región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina establecida como SEQ ID NO:4, y que comprende regiones marco variables de una cadena pesada de inmunoglobulina de receptor humano, siempre y cuando al menos un residuo marco sea sustituido con el residuo correspondiente de aminoácido de la secuencia de región variable de la cadena pesada 12B4 del ratón, en donde el residuo marco es un residuo capaz de afectar la función o conformación de la región variable de la cadena pesada tal como se puede identificar mediante el análisis de un modelo tridimensional de la región variable. La cadena ligera de la reivindicación 9, en donde el residuo marco es seleccionado de un grupo compuesto de unresiduo capaz de interactuar con el antígeno, un residuo próximo al sitio de enlace con el antígeno, un residuo capaz de interactuar con las regiones complementarias determinantes, adyacente a una región complementaria determinante, un residuo en el interior de un 6A de un residuo de una región complementaria determinante, un residuo canónico, de la zona vernier, un residuo en paquete intercadena, un residuo inusual, y un residuo en el sitio de la glicosliación sobre la superficie del modelo estructural. 12. La cadena ligera de la reivindicación 10, en donde el residuo marco es seleccionado de un grupo compuesto de un residuo capaz de interactuar con el antígeno, un residuo próximo al sitio de enlace con el antígeno, un residuo capaz de interactuar con las regiones complementarias determinantes, adyacente a una región complementaria determinante, un residuo en el interior de un 6A de un residuo de una región complementaria determinante, un residuo canónico, de la zona vernier, un residuo en paquete intercadena, un residuo inusual, y un residuo en el sitio de la glicosliación sobre la superficie del modelo estructural. 13. La cadena ligera de la reivindicación 9 u 1 1 , en donde el residuo marco se identifica al modelar la cadena ligera 12B4 basada en una estructura soluble de una cadena ligera de inmunoglobulina murina que comparte al menos la identidad de secuencia del 70% conjuntamente con la cadena ligera 12B4. 14. La cadena ligera de la reivindicación 9 u 11 , en donde el residuo marco se identifica al modelar la cadena ligera 12B4 basada en una estructura soluble de una cadena ligera de inmunoglobulina murina que comparte al menos la identidad de secuencia del 80% conjuntamente con la cadena ligera 12B4. 15. La cadena ligera de la reivindicación 9 u 1 1 , en donde el residuo marco se identifica al modelar la cadena ligera 12B4 basada en una estructura soluble de una cadena ligera de inmunoglobulina murina que comparte al menos la identidad de secuencia del 90% conjuntamente con la cadena ligera 12B4. 16. La cadena ligera de la reivindicación 10 o 12, en donde el residuo marco se identifica al modelar la cadena ligera 12B4 basada en una estructura soluble de una cadena ligera de inmunoglobulina murina que comparte al menos la identidad de secuencia del 70% conjuntamente con la cadena ligera 12B4. 17. La cadena ligera de la reivindicación 10 o 12, en donde el residuo marco se identifica al modelar la cadena ligera 12B4 basada en una estructura soluble de una cadena ligera de inmunoglobulina murina que comparte al menos la identidad de secuencia del 80% conjuntamente con la cadena ligera 12B4. 18. La cadena ligera de la reivindicación 10 o 12, en donde el residuo marco se identifica al modelar la cadena ligera 12B4 basada en una estructura soluble de una cadena ligera de inmunoglobulina murina que comparte al menos la identidad de secuencia del 90% conjuntamente con la cadena ligera 12B4. 19. Una cadena ligera que comprende las regiones complementarias determinantes así como el residuo marco de la región variable L2 (convención de numeración de Kabat) de una cadena ligera 12B4 de un anticuerpo monoclonal, en donde el residuo de la cadena ligera procede de una inmunoglobulina humana. Una cadena pesada que comprende las regiones complementarias determinantes y residuos marco variables H2, H24, H27, H29, H48, H49, H67, H71 y H78 (convención de numeración de Kabat) de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 12B4, en donde el residuo de una cadena pesada procede de una inmunoglobulina humana. Una cadena pesada que comprende tanto las regiones complementarias determinantes como los residuos marco variables H24, H27, H29 y H71 (convención de numeración de Kabat) de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal 12B4 , en donde el residuo de una cadena pesada procede de una inmunoglobulina humana. Una cadena pesada que comprende tanto las regiones complementarias determinantes como los residuos marco variables H24, H27, H29 y H71 y H78 (convención de numeración de Kabat) de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal 12B4, en donde el residuo de una cadena pesada procede de una inmunoglobulina humana. Una inmunoglobulina humanizada que comprende la cadena ligera y la cadena pesada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, o el fragmento de enlace al antígeno de dicha inmunoglobulina. La inmunoglobulina o fragmento de enlace al antígeno de la reivindicación 23, la cual se vincula específicamente a un péptido amiloide beta (?ß) con una afinidad de enlace de al menos 10"7 M. La inmunoglobulina o fragmento de enlace al antígeno de la reivindicación 23, la cual se vincula específicamente a un péptido amiloide beta (?ß) con una afinidad de enlace de al menos 10"8 M. 26. La inmunoglobulina o fragmento de enlace al antígeno de la reivindicación 23, la cual se vincula específicamente a un péptido amiloide beta (?ß) con una afinidad de enlace de al menos 10~9 . 27. La inmunoglobulina o fragmento de enlace al antígeno de la reivindicación 23, en donde el isótopo de la cadena pesada es gama 1. 28. La inmunoglobulina o fragmento de enlace al antígeno de la reivindicación 23, la cual se vincula a un péptido amiloide beta soluble (?ß) . 29. La inmunoglobulina o fragmento de enlace al antígeno de la reivindicación 23, la cual se vincula a un péptido amiloide beta agregado (?ß) . 30. La inmunoglobulina o fragmento de enlace al antígeno de la reivindicación 23, la cual se vincula a un epítopo dentro de los residuos 3.7 de un péptido amiloide beta (?ß) . 31. La inmunoglobulina o fragmento de enlace al antígeno de la reivindicación 23, la cual media la fagocitosis del péptido amiloide beta (?ß). 32. La inmunoglobulina o fragmento de enlace al antígeno de la reivindicación 23, la cual cruza la barrera que impide la circulación de la sangre al cerebro del paciente. 33. La inmunoglobulina o fragmento de enlace al antígeno de la reivindicación 23, que reduce la placa péptido amiloidal (?ß) recargada en el paciente. 4. Un anticuerpo humanizado que comprende las regiones complementarias determinantes (CDR1 , CDR2, y CDR3) de la secuencia de la cadena ligera variable 12B4 establecida como SEQ ID NO:2. Un anticuerpo humanizado que comprende las regiones complementarias determinantes (CDR1 , CDR2, y CDR3) de la secuencia de la cadena pesada variable 12B4 establecida como SEQ ID NO:4. Un anticuerpo humanizado o fragmento de enlace al antígeno de éste, el cual se vincula específicamente a un péptido amiloide beta (?ß) que comprende una región variable correspondiente a regiones complementarias determinantes (CDRs) correspondientes al CDR del anticuerpo 12B4 del ratón. El fragmento de la reivindicación 36 que es un fragmento Fab. Una inmunoglobulina quimérica que comprende sustancialmente la secuencia de región variable como se establece en el SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4, y que comprende secuencias de región constantes de una inmunoglobulina humana. Un método para prevenir o tratar una enfermedad amiloidogénica en un paciente, comprende administrarle a éste una dosis efectiva de la inmunoglobulina humanizada de cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas. Un método para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer en un paciente, consiste en administrarle una dosis efectiva de la inmunoglobulina humanizada de cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas. 41. El método de la reivindicación 40, en donde la dosis efectiva inmunoglobulina humanizada equivale a 1 mg/kg del peso corporal. 42. El método de la reivindicación 40, en donde la dosis efectiva de inmunoglobulina humanizada equivale a 10 mg/kg del peso corporal. 43. Una composición farmacéutica que comprende la inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones precedentes y de un portador farmacéutico. 44. Un polipéptido aislado que comprende un fragmento de SEQ ID NO:2 seleccionado del grupo compuesto de aminoácidos 43-58 de SEQ ID NO:2; aminoácidos 74-80 de SEQ ID NO:2 y aminoácidos 1 3-121 de SEQ ID NO:2. 45. Un polipéptido aislado que comprende aminoácidos 43-48 de SEQ ID NO:2, aminoácidos 74-80 de SEQ ID NO:2 y aminoácidos 113-121 de SEQ ID NO: 2. 46. Un polipéptido aislado que comprende un fragmento de SEQ ID NO:4 seleccionado del grupo compuesto de aminoácidos 50-56 de SEQ ID NO:4, aminoácidos 71-86 de SEQ ID NO:4 y aminoácidos 118-131 de SEQ ID NO:4. 47. Un polipéptido aislado que comprende aminoácidos 50-56 de SEQ ID NO:4, aminoácidos 71-86 de SEQ ID NO:4, y aminoácidos 1 18-131 de SEQ ID NO:4. 48. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo compuesto de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:6. 49. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo compuesto de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO:12. 50. Una variante del polipéptido de la reivindicación 48, dicha variante comprende al menos un sustituto conservativo de aminoácido, en donde la variante retiene la capacidad de dirigir un enlace específico al péptido amiloide beta (?ß) con una afinidad de enlace de al menos 10~7 M. 51. Una variante del polipéptido de la reivindicación 49, dicha variante comprende al menos un sustituto conservativo de aminoácido, en donde la variante retiene la capacidad de dirigir un enlace específico al péptido amiloide beta (?ß) con una afinidad de enlace de al menos 10"7 . 52. Un polipéptido aislado que comprende residuos de aminoácidos 20-131 de SEQ ID NO:2. 53. Un polipéptido aislado que comprende residuos de aminoácidos 20-142 de SEQ ID NO:4. 54. Un polipéptido aislado que comprende residuos de aminoácidos 21-132 de SEQ ID NO:6. 55. Un polipéptido aislado que comprende residuos de aminoácidos 20-142 de SEQ ID NO:8. 56. Un polipéptido aislado que comprende residuos de aminoácidos 20-142 de SEQ ID NO:10. 57. Un polipéptido aislado que comprende residuos de aminoácidos 20-142 de SEQ ID NO:12. 58. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 52 a 57. 59. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 60. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 61. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 62. Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida seleccionada del grupo compuesto de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:5. 63. Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida seleccionada del grupo compuesto de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:1 1. 64. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 65. Una célula receptora que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 66. Un animal transgénico que manifiesta un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 67. El animal transgénico de la reivindicación 66, en donde el polipéptido se manifiesta en la leche de dicho animal. 68. Un método para producir un anticuerpo, o fragmento de éste, lo que incluye cultivar la célula receptora de la reivindicación 51 bajo condiciones tales que el anticuerpo o fragmento se produzca y aislar dicho anticuerpo del cultivo o célula receptora. 69. Un método para producir un anticuerpo, o fragmento de éste, que comprende un fragmento de SEQ ID NO:2 seleccionado del grupo compuesto de aminoácidos 43-58 de SEQ ID NO:2, aminoácidos 74-80 de SEQ ID NO:2 y aminoácidos 113-121 de SEQ ID NO:2; dicho método consiste en cultivar una célula receptora que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo o fragmento de éste bajo condiciones tales que el anticuerpo o fragmento se produzca, y aislar tal anticuerpo del cultivo o célula receptora. 70. Un método para producir un anticuerpo o fragmento de éste, el cual comprende un fragmento de SEQ ID NO:4 seleccionado del grupo compuesto de aminoácidos 50-56 de SEQ ID NO:4, aminoácidos 71-86 de SEQ ID NO:4 y aminoácidos 118-131 de SEQ ID NO:4; dicho método implica el cultivo de una célula receptora que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo o fragmento de éste bajo condiciones tales que el anticuerpo o fragmento se produzca, y aislar dicho anticuerpo del cultivo o célula receptora. 71. Un método para identificar residuos aptos para una sustitución en una región marco variable de inmunoglobulina 12B4 humanizada, que incluye el modelar la estructura tridimensional de la región 12B4 variable basada en una estructura de inmunoglobulina soluble y el análisis de dicho modelo para residuos capaces de afectar la función o conformación de la región de inmunoglobulina 12B4 variable, de manera tal que los residuos aptos para la sustitución sean identificados. El empleo de la secuencia de región establecida como SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 o cualquier porción de ésta, al producir una imagen tridimensional de una inmunoglobulina 12B4, una cadena de inmunoglobulina 12B4 o dominio de ésta. Un método para imaginar depósitos de amiloide en el cerebro del paciente que implica administrarle un agente que se vincula específicamente al ?ß y detecta el anticuerpo ligado al AB. El método de reivindicación 73, en donde el agente es un anticuerpo que comprende una secuencia variable de cadena ligera establecida en SEQ ID NO:2 y una secuencia de región variable de cadena pesada como consta en SEQ ID NO:4 o un fragmento de enlace al antigeno de dicho anticuerpo. El método de la reivindicación 73 en donde el fragmento de enlace al antígeno es un fragmento Fab. Un método para el tratamiento de una enfermedad amiloidogénica que implica administrarle a un paciente con tal padecimiento una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia aminoácida de SEQ ID NO:6 y una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia aminoácida de SEQ ID NO:8, la secuencia aminoácida de SEQ ID NO:10, o la secuencia aminoácida de SEQ ID NO: 12, bajo condiciones tales que dichas cadenas de inmunoglobulina se manifiesten, de manera que se genere una respuesta terapéutica positiva en el paciente. 77. Un método de prevención o de tratamiento de una enfermedad asociada con depósitos amiloides de ?ß en el cerebro de un paciente, incluyendo la administración de una efectiva dosificación de la inmunoglobulina humanizada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 78. El método de la reivindicación 1 , en donde la enfermedad está caracterizada por un daño cognitivo. 79. El método de la reivindicación 1, en donde la enfermedad consiste en la enfermedad de Alzheimer. 80. El método de la reivindicación 1 , en donde la enfermedad es síndrome de Down. 81. El método de la reivindicación 1 , en donde la enfermedad es un daño cognitivo leve. 82. El método de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo es de isotipo humano IgGI. 83. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el paciente es humano. 84. El método de cualquiera de las reivindicaciones 77-83, en donde tras la administración, el anticuerpo se enlaza a un depósito amiloide en el paciente e induce a una respuesta de clarificación con respecto al depósito amiloide. 85. El método de la reivindicación 84, en donde la respuesta de clarificación consiste en una respuesta de fagocitosis mediada del receptor Fe. 86. El método de reivindicación 84 u 85, que incluye además el monitoreo de la respuesta de clarificación. 87. El método de cualquiera de las reivindicaciones 77-83, en donde tras la administración, el anticuerpo se enlaza al ?ß soluble en el paciente. 88. El método de cualquiera de las reivindicaciones 77-83, en donde tras la administración, el anticuerpo se enlaza al ?ß soluble en la sangre o el fluido cerebroespinal del paciente. 89. El método de cualquiera de las reivindicaciones 77-88, en donde el paciente es asintomático. 90. El método de cualquiera de las reivindicaciones 77-89, en donde el paciente se encuentra por debajo de 50. 91. El método de cualquiera de las reivindicaciones 77-90, en donde el paciente posee un factor de riesgo heredado que indica una susceptibilidad a la enfermedad de Alzheimer. 92. El método de cualquiera de las reivindicaciones 77-91 , en donde la dosificación del anticuerpo es de por lo menos 1 mg/kg del peso corporal del paciente. 93. El método de cualquiera de las reivindicaciones 77-91 , en donde la dosificación del anticuerpo es de por lo menos 10 mg/kg del peso corporal del paciente. 94. El método de cualquiera de las reivindicaciones 77-93, en donde el anticuerpo es administrado con un portador como composición farmacéutica. 95. El método de cualquiera de las reivindicaciones 77-94, en donde el anticuerpo es administrado intraperitonealmente, oralmente, intranasalmente, subcutáneamente, intramuscularmente, o intravenosamente. 96. Un método para reducir la carga de la placa en un sujeto con la misma necesidad incluyendo la administración al paciente de una efectiva dosificación de la inmunoglobulina humanizada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 97. El método de la reivindicación 96, en donde tras la administración, el anticuerpo se enlaza a un depósito amiloide en el paciente e induce a una respuesta de clarificación con respecto dicho depósito. 98. El método de la reivindicación 97, en donde la respuesta de clarificación consiste en una respuesta de fagocitosis mediada del receptor Fe. 99. El método de la reivindicación 97 o 98, que incluye además el monitoreo de la respuesta de clarificación. 100. El método de la reivindicación 96, en donde tras la administración, el anticuerpo se enlaza al ?ß soluble en el paciente. 101. El método de la reivindicación 96, en donde tras la administración, el anticuerpo se enlaza al ?ß soluble en la sangre o en el fluido cerebroespinal del paciente. 102. Una inmunoglobulina humanizada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, la cual comprende una región Fe que posee una función de acción alterada. 103. Un método para reducir la carga neurítica en un paciente con la misma necesidad, incluyendo la administración de una efectiva dosis de un anticuerpo humanizado que se vincula a un epítopo en aminoácidos 3-7 del péptido amiloide beta (?ß), en donde el anticuerpo es de isotipo IgGI. 104. El método de reivindicación 103, en donde el paciente tiene una enfermedad amiloidogénica. 105. El método de reivindicación 104, en donde la enfermedad amiloidegénica consiste en la enfermedad de Alzheimer. 106. Un método para tratar una enfermedad amiloidogénica en un paciente, incluyendo la administración de una efectiva dosis de un anticuerpo humanizado capaz de reducir la carga péptida amiloide beta (?ß) y la distrofia neurítica del paciente, en donde el anticuerpo se enlaza a un epítopo en aminoácidos 3-7 de ?ß y es de isotipo IgGI. 107. El método de reivindicación 106, en donde la enfermedad amiloidogénica consiste en la enfermedad de Alzheimer. 108. Un método para reducir la carga péptida amiloide beta (?ß) y la distrofia neurítica en un mamífero, incluyendo la administración de una efectiva dosis de un anticuerpo humanizado capaz de reducir la carga péptida amiloide beta (?ß) y la distrofia neurítica, en donde el anticuerpo se enlaza a un epítopo en aminoácidos 3-7 de ?ß y es de isotipo IgGI. 109. El método de reivindicación 108, en donde el mamífero es un humano. 1 10. El método de reivindicación 108 o 109, en donde el mamífero tiene una enfermedad amiloidogénica. 1 11. El método de reivindicación 1 10, en donde la enfermedad amiloidogénica consiste en la enfermedad de Alzheimer. 1 12. Una composición terapéutica, incluyendo el anticuerpo humanizado de isotipo IgGI que se enlaza a un epítopo en aminoácidos 3-7 del péptido amiloide beta (?ß), en donde el anticuerpo es capaz de reducir la carga neurítica en un paciente. 1 13. Un método para el tratamiento de una enfermedad amiloidogénica en un paciente, incluyendo la administración de una efectiva dosis de un anticuerpo humano que se enlaza a un péptido amiloide beta soluble (?ß) y reduce la distrofia neurítica en el paciente, en donde el anticuerpo se enlaza a un epítopo en aminoácidos 3-7 de ?ß y es de isotipo IgGI. 1 14. El método de reivindicación 1 13, en donde la enfermedad amiloidogénica es la enfermedad de Alzheimer. 1 15. Una composición terapéutica, incluyendo un anticuerpo humanizado de isotipo IgGI que se enlaza a un péptido amiloide beta soluble (?ß), en donde el anticuerpo se enlaza a un epítopo en aminoácidos 3-7 de ?ß y es capaz de reducir la carga neurítica en un paciente. GLOSARIO Antigen: antígeno: cualquier sustancia que resulta extraña o altamente peligrosa para el organismo y contra la cual éste produce o genera un anticuerpo. Blood-brain barrier: mecanismo mediante el cual la sangre circulante es separada de los tejidos o fluidos que rodean las células del cerebro. Es una membrana semipermeable que permite la circulación de líquidos a través de ésta, pero que excluye tanto a las partículas sólidas como a las moléculas grandes. Immunoglobulin: inmunoglobulina: parte de un grupo de proteínas estructuralmente relacionadas que actúan como anticuerpos. Peptide: Péptido : molécula que consiste de dos o más aminoácidos unidos por junturas entre el grupo amino y el grupo carboxil. Polypeptide: polipéptido: molécula conformada por tres o más aminoácidos unidos por junturas de péptido.