DE69733655T2

DE69733655T2 - beta-AMYLOID PEPTIDAGGREGATION REGULIERENDE PEPTIDE MIT D-AMINOSÄUREN

Info

Publication number: DE69733655T2
Application number: DE69733655T
Authority: DE
Inventors: A. Mark FINDEIS; L. Malcolm GEFTER; Gary Musso; R. Ethan SIGNER; James Wakefield; Susan Molineaux; Joseph Chin; Jung-Ja Lee; Michael Kelley; Sonja Komar-Panicucci; C. Christopher ARICO-MUENDEL; Kathryn Phillips; J. Neil HAYWARD
Original assignee: Praecis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Praecis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-08-27
Filing date: 1997-08-27
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2017-08-28
Also published as: ATE298765T1; EP1586584A1; DK0929574T3; EP0929574A1; PT929574E; HK1021741A1; CA2262453A1; ES2245003T3; WO1998008868A1; AU741199B2; JP2001500852A; AU4238797A; EP0929574B1; DE69733655D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Alzheimer-Erkrankung (Alzheimer's disease, AD) wurde erstmals von dem bayerischen Psychiater Alois Alzheimer 1907 entdeckt, und ist eine fortschreitende neurologische Funktionsstörung, die mit kurzzeitigem Gedächtnisverlust beginnt und fortschreitend zu Verwirrung, Beeinträchtigung von Urteilsvermögen und logischem Denkvermögen, und letztenendes zu Demenz führt. Der Verlauf der Krankheit führt gewöhnlich zum Tod in einem schwer geschwächten, regungslosen Zustand zwischen 4 und 12 Jahre nach Beginn der Erkrankung. Es wird geschätzt, dass AD 5 bis 11 Prozent der über 65jährigen Bevölkerung und sogar 47 Prozent der über 85jährigen Bevölkerung betrifft. Die gesellschaftlichen Kosten, die mit AD verbunden sind, belaufen sich auf über 80 Milliarden Dollar jährlich, primär aufgrund der erheblichen pflegerischen Hilfe, die von AD-Patienten benötigt wird. Außerdem wird das Beherrschen und die Behandlung von AD zu einem noch bedeutenderen medizinischen Versorgungsproblem, da die Erwachsenen, die während der Bevölkerungsexplosion in der 1940er und 1950er Jahren geboren wurden, das Alter, in dem AD in verstärktem Maße auftritt, allmählich erreichen. Zur Zeit gibt es keine Behandlung, die das Fortschreiten der Krankheit wesentlich hemmen würde. Für Übersichtsartikel zu AD siehe Selkoe, D.J. Sci. Amer., November 1991, Seiten 68–78 und Yankner, B.A. et al. (1991) N. Eng. J. Med. 325:1849–1857.
Es wurde vor kurzem berichtet (Games et al. (1995) Nature 373:523–527), dass eine Neuropathologie vom Alzheimer-Typ in transgenen Mäusen erzeugt werden konnte. Die transgene Maus exprimierte große Mengen eines humanen mutierten Amyloid-Vorläuferproteins und entwickelte in fortschreitendem Maße viele der pathologischen Zustände, die mit AD verbunden sind.
Pathologisch ist AD durch die Gegenwart bestimmter Läsionen im Gehirn des Opfers gekennzeichnet. Diese Gehirnläsionen umfassen abnormale intrazelluläre Filamente, die als neurofibrillary tangles (NTFs) bezeichnet werden, und extrazelluläre Ablagerungen von amyloidogenen Proteinen in senilen oder amyloiden Plaques. Amyloide Ablagerungen sind auch in den Wänden zerebraler Blutgefäße von AD-Patienten gegenwärtig. Die Hauptprotein-Komponente von Amyloid-Plaques wurde als 4 Kilodalton-Peptid mit dem Namen β-Amyloid-Peptid (β-AP) identifiziert (Glenner, G.G. und Wong, C. W. (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120:885–890; Masters, C. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4245–4249). Diffuse Ablagerungen von β-AP werden häufig in normalen adulten Gehirnen beobachtet, während AD-Hirngewebe durch kompaktere, granulierte β-Amyloid-Plaques gekennzeichnet ist (siehe z. B. Davies, L. et al. (1988) Neurology 38:1688–1693). Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass die Ablagerung von β-AP der Zerstörung von Neuronen, die in AD auftritt, vorangeht und zu dieser beiträgt. Zur weiteren Bestätigung einer direkten pathogenen Rolle von β-AP konnte gezeigt werden, dass β-Amyloid toxisch auf reife Neuronen, sowohl in Kultur als auch in vivo wirkt (Yankner, B.A. et al. (1989) Science 245:417–420; Yankner, B.A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9020–9023; Roher, A.E. et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 174:572–579; Kowall, N.W. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7247–7251). Ferner wurde gezeigt, dass Patienten mit vererbbarer zerebraler Hämorrhagie vom Amyloidose-Dutch-Typ (HCHWA-D), die durch diffuse β-Amyloid-Ablagerungen innerhalb der zerebralen Kortex und Zerebrovaskulatur gekennzeichnet ist, eine Punktmutation aufweisen, die zu einer Aminosäure-Substitution in β-AP führt (Levy, E. et al. (1990) Science 248:1124–1126). Diese Beobachtung zeigt, dass eine spezifische Veränderung der β-AP-Sequenz zur Ablagerung von β-Amyloid führen kann.
Natürliches β-AP wird durch Proteolyse eines viel größeren Proteins mit dem Namen Amyloid-Vorläufer-Protein (amyloid precursor protein, APP) generiert (Kang, J. et al. (1987) Nature 325:733; Goldgaber, D. et al. (1987) Science 235:877; Robakis, N.K. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4190; Tanzi, R.E. et al. (1987) Science 235:880). Das APP-Gen liegt auf Chromosom 21, was die Ablagerung von β-Amyloid, die bei Individuen mit durch Trisomie von Chromosom 21 hervorgerufenem Down-Syndrom, in jungen Jahren erkennbar ist, erklärt (Mann, D.M. et al. (1989) Neuropathol. Appl. Neurobiol. 15:317; Rumble, B. et al. (1989) N. Eng. J. Med. 320:1446). APP enthält eine einzelne membrandurchspannende Domäne mit einer langen aminoterminalen Region (etwa zwei Drittel des Proteins), die sich bis in die extrazelluläre Umgebung erstreckt, und eine kürzere carboxyterminale Region, die ins Cytoplasma ragt. Differenziertes Spleißen der APP-Messenger-RNA führt zu wenigstens 5 APP-Formen, die sich aus entweder 563 Aminosäuren (APP-563), 695 Aminosäuren (APP-695), 714 Aminosäuren (APP-714), 751 Aminosäuren (APP-751) oder 770 Aminosäuren (APP-770) zusammensetzen.
Innerhalb von APP beginnt natürlich vorkommendes β-Amyloid-Peptid an einem Asparaginsäurerest an Aminosäure-Position 672 von APP-770. Natürlich vorkommendes β-AP, das durch Proteolyse von APP generiert wird, weist eine Länge von 39 bis 43 Aminosäureresten auf, abhängig von der carboxyterminalen Endstelle, die Heterogenität zeigt. Die überwiegend vorherrschende zirkuläre Form von β-AP im Blut und der zerebrospinalen Flüssigkeit von sowohl AD-Patienten als auch normalen Erwachsenen ist β1-40 („kurzes β") (Seubert, P. et al. (1992) Nature 359:325; Shoji, M. et al. (1992) Science 258:126). Allerdings sind β1-42 und β1-43 („langes β") ebenfalls Formen, die in β-Amyloid-Plaques vorliegen (Masters, C. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4245; Miller, D. et al. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 301:41; Mori, H. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:17082). Obwohl der genaue molekulare Mechanismus, der zur Aggregation und Ablagerung von β-APP führt, unbekannt ist, wird der Prozess mit dem von keimabhängigen Polymerisationen wie Protein-Kristallisation, Mikrotubuli-Bildung und Actin-Polymerisation verglichen (siehe z. B. Jarrett, J.T. und Landsbury, P.T. (1993) Cell 73:1055–1058). In solchen Prozessen kommt es bis zur Keimbildung zu keiner Polymerisation der Monomer-Komponenten. Daher sind diese Prozesse durch eine Lag-Zeit vor Beginn der Aggregation gekennzeichnet, gefolgt von schneller Polymerisation nach der Keimbildung. Die Keimbildung kann durch die Zugabe eines „Impf-" oder gebildeten Keimes beschleunigt werden, was zu schneller Polymerisation führt. Es konnte gezeigt werden, dass die langen β-Formen von β-AP als Keime fungieren, wodurch die Polymerisation von sowohl langen als auch kurzen β-Formen beschleunigt wird (Jarrett, J.T. et al. (1993) Biochemistry 32:4693).
In einer Studie, bei der Aminosäure-Substitutionen in β-AP eingeführt wurden, konnte gezeigt werden, dass zwei mutierte β-Peptide die Polymerisation von nicht-mutiertem β-AP störten, wenn die mutierten und nicht-mutierten Formen des Peptides gemischt wurden (Hilbich, C. et al. (1992) J. Mol. Biol. 228:460–473). Äquimolare Mengen der mutierten und nicht-mutierten (d. h. natürlichen) β-Amyloid-Peptide wurden eingesetzt, um diesen Effekt zu beobachten, und die mutierten Peptide wurden als für die Verwendung in vivo ungeeignet beschrieben (Hilbich, C. et al. (1992), supra).
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Verbindungen und pharmazeutische Zusammensetzungen daraus, die an natürliche β-Amyloid-Peptide (β-AP) binden können, die Aggregation natürlicher β-AP modulieren und/oder die Neurotoxizität von natürlichen β-APs inhibieren. Die β-Amyloid-Modulator-Verbindungen der Erfindung umfassen eine peptidische Struktur, bevorzugt basierend auf β-Amyloid-Peptid, die vollständig aus D-Aminosäuren besteht. In verschiedenen Ausführungsformen umfasst die peptidische Struktur der Modulator-Verbindung eine D-Aminosäure-Sequenz, die der in natürlichem β-AP vorkommenden L-Aminosäure-Sequenz entspricht, eine D-Aminosäure-Sequenz, die ein Retro-Inverso-Isomer einer in in natürlichem β-AP vorkommenden L-Aminosäure-Sequenz, oder eine D-Aminosäure-Sequenz, die eine zusammengesetzte oder substituierte Version einer in natürlichem β-AP vorkommenden L-Aminosäure-Sequenz, ist. Vorzugsweise ist die peptidische Struktur aus D-Aminosäuren des Modulators auf der Grundlage einer Teilregion von natürlichem β-AP aus den Positionen 17–21 (entsprechend Aβ_17-20 und Aβ_17-21) aufgebaut, die die Aminosäure-Sequenz Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID NO: 3) besitzt.
Eine Modulator-Verbindung der Erfindung umfasst vorzugsweise 3–20 D-Aminosäuren, noch bevorzugter 3–10 D-Aminosäuren und noch mehr bevorzugt 3–5 D-Aminosäuren. Die peptidische Struktur aus D-Aminosäuren des Modulators kann freie Amino- und Carboxytermini aufweisen. Andererseits können der Aminoterminus, der Carboxyterminus oder beide modifiziert sein. Zum Beispiel kann eine N-terminal modifizierende Gruppe verwendet werden, die die Fähigkeit der Verbindung, die Aβ-Aggregation zu inhibieren, verstärkt. Darüber hinaus kann der Amino- und/oder Carboxyterminus des Peptids modifiziert sein, um die pharmakokinetischen Eigenschaften der Verbindung (wie Stabilität, Bioverfügbarkeit und dergleichen) zu verändern. Bevorzugte carboxyterminal modifizierende Gruppen umfassen Amidgruppen, Alkyl- oder Arylamidgruppen (z. B. Phenethylamid) und Hydroxygruppen (d. h. Reduktionsprodukte von Peptidsäuren, wodurch Peptidalkohole entstehen). Außerdem kann eine Modulator-Verbindung modifiziert werden, um die Verbindung mit einer detektierbaren Substanz (z. B. eine radioaktive Markierung) zu markieren.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen sieht die Erfindung eine Verbindung mit der Struktur
A-(Xaa)-B
vor, wobei (Xaa) für eine peptidische Struktur steht, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-Phe-phenethylamid, D-Leu-D-Val-D-Tyr-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-IodoTyr-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Tyr, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Iodotyr, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala, D-Ala-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu, D-Leu-D-Val-D-Tyr-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-IodoTyr-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Tyr-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-IodoTyr-D-Ala, D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Leu, D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Val, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu und D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu besteht.
A steht für eine aminoterminal modifizierende Gruppe, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Phenylacetyl, Diphenylacetyl, Triphenylacetyl, Butanoyl, Isobutanoyl, Hexanoyl, Propionyl, 3-Hydroxybutanoyl, 4-Hydroxybutanoyl, 3-Hydroxypropionyl, 2,4-Dihydroxybutyroyl, 1-Adamantancarbonyl, 4-Methylvaleryl, 2-Hydroxyphenylacetyl, 3-Hydroxyphenylacetyl, 4-Hydroxyphenylacetyl, 3,5-Dihydroxy-2-naphthoyl, 3,7-Dihydroxy-2-naphthoyl, 2-Hydroxycinnamoyl, 3-Hydroxycinnamoyl, 4-Hydroxycinnamoyl, Hydrocinnamoyl, 4-Formylcinnamoyl, 3-Hydroxy-4-methoxycinnamoyl, 4-Hydroxy-3-methoxycinnamoyl, 2-Carboxycinnamoyl, 3,4-Dihydroxyhydrocinnamoyl, 3,4-Dihydroxycinnamoyl, trans-Cinnamoyl, (±)-Mandelyl, (±)-Mandelyl-(±)-mandelyl, Glycolyl, 3-Formylbenzoyl, 4-Formylbenzoyl, 2-Formylphenoxyacetyl, 8-Formyl-1-naphthoyl, 4-(Hydroxymethyl)benzoyl, 3-Hydroxybenzoyl, 4-Hydroxybenzoyl, 5-Hydantoinacetyl, L-Hydroorotyl, 2,4-Dihydroxybenzoyl, 3-Benzoylpropanoyl, (±)-2,4-Dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl, DL-3-(4-Hydroxyphenyl)lactyl, 3-(2-Hydroxyphenyl)propionyl, 4-(2-Hydroxyphenyl)propionyl, D-3-Phenyllactyl, 3-(4-Hydroxyphenyl)propionyl, L- 3-Phenyllactyl, 3-Pyridylacetyl, 4-Pyrdidylacetyl, Isonicotinoyl, 4-Chinolincarboxyl, 1-Isochinolincarboxyl und 3-Isochinolincarboxyl besteht;
und B steht für eine carboxyterminal modifizierende Gruppe, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer Amidgruppe, einer Alkylamidgruppe, einer Arylamidgruppe und einer Hydroxygruppe besteht.
In einer weiteren Ausführungsform steht (Xaa) für eine wie oben beschriebene peptidische Struktur, B für eine wie oben beschriebene carboxyterminal modifizierende Gruppe und A für eine aminoterminal modifizierende Gruppe, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Cholyl, Lithocholyl, Hyodeoxycholyl, Chenodeoxycholyl und Ursodeoxycholyl besteht. In einer bevorzugten untergeordneten Ausführungsform wird A aus der Gruppe ausgewählt, die aus Lithocholyl, Hyodeoxycholyl, Chenodeoxycholyl und Ursodeoxycholyl besteht.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Erfindung werden in den Bei spielen dargelegt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen. Üblicherweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge einer Modulator-Verbindung der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inhibie rung der Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden. Bei diesen Verfahren bringt man natürliche β-Amyloid-Peptide mit einer Modulator-Verbindung der Erfindung in Kontakt, so dass die Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide inhibiert wird.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Detektion von Gegenwart oder Abwesenheit natürlicher β-Amyloid-Peptide in einer biologi schen Probe. Bei diesen Verfahren bringt man eine biologische Probe mit einer Verbindung der Erfindung in Kontakt, wobei die Verbindung mit einer detektierbaren Substanz markiert ist, und detektiert die an die natürlichen β-Amyloid-Peptide gebundene Verbindung, um somit die Gegenwart oder Abwesenheit natürlicher β-Amyloid-Peptide in der biologischen Probe zu detektieren.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Behandlung eines Subjekts, das eine Funktionsstörung, die mit β-Amyloidose in Verbindung steht, aufweist. Bei diesen Verfahren verabreicht man dem Subjekt eine therapeutisch wirksame Menge einer Modulator-Verbindung der Erfindung, so dass das Subjekt gegen eine Funktionsstörung, die mit β-Amyloidose in Verbindung steht, behandelt wird. Bevorzugterweise ist diese Funktionsstörung die Alzheimer-Erkrankung. Die Verwendung der Modulatoren der Erfindung zur Therapie oder Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Funktionsstörung, die mit β-Amyloidose in Verbindung steht, wird ebenfalls von der Erfindung umfasst.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Balkendiagramm, das die Stabilität einer auf L-Aminosäuren basierenden Modulator-Verbindung (PPI-368) und zweier auf D-Aminosäuren basierenden Modulator-Verbindungen (PPI-433 und PPI-457) in zerebrospinaler Flüssigkeit darstellt.
2 ist ein Diagramm, das die Mengen von PPI-558 im Plasma 2, 8 und 24 Stunden nach einer einzelnen subkutanen Injektion von PPI-558 (4,6 mg/kg) in männliche Sprague-Dawley-Ratten darstellt. Jeder Wert ist der Mittelwert ± Standardabweichung von vier Ratten
3 ist ein Graph, der die Mengen von PPI-558 im Hirn-Parenchym (ohne Blut- und Hirnkapillare) 2, 8 und 24 Stunden nach einer einzelnen subkutanen Injektion von PPI-558 (4,6 mg/kg) in männliche Sprague-Dawley-Ratten darstellt. Jeder Wert ist der Mittelwert ± Standardabweichung von vier Ratten.
4 ist ein Graph, der das Verhältnis von im Hirn-Parenchym und Plasma vorhandenen Mengen von PPI-558 2, 8 und 24 Stunden nach einer einzelnen subkutanen Injektion von PPI-558 (4,6 mg/kg) in männliche Sprague-Dawley-Ratten beschreibt. Jeder Wert ist der Mittelwert ± Standardabweichung von vier Ratten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Verbindungen und pharmazeutische Zusammensetzungen davon, die an natürliche β-Amyloid-Peptide binden, die Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide (β-AP) modulieren und/oder die Neurotoxizität natürlicher β-APs inhibieren können. Eine Verbindung der Erfindung, die die Aggregation von natürlichem β-AP moduliert, hier abwechselnd als eine β-Amyloid-Modulator-Verbindung, einen β-Amyloid-Modulator oder einfach einen Modulator bezeichnet, verändert die Aggregation von natürlichem β-AP wenn der Modulator mit natürlichem β-AP in Kontakt gebracht wird. Daher wirkt die Verbindung der Erfindung, indem sie den natürlichen Aggregations-Prozess oder die natürliche Aggregationsgeschwindigkeit von β-AP verändert, und dadurch diesen Prozess unterbricht. Bevorzugterweise inhibiert die Verbindung β-AP-Aggregation. Die Verbindungen der Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine peptidische Struktur umfassen, die vollständig aus D-Aminosäure-Resten aufgebaut ist. Diese peptidische Struktur basiert bevorzugt auf β-Amyloid-Peptid und kann z. B. eine D-Aminosäure-Sequenz, die einer in natürlichem β-AP vorkommenden L-Aminosäuresequenz entspricht, eine D-Aminosäure-Sequenz, die ein Retro-Inverso-Isomer einer in natürlichem β-AP vorkommenden L-Aminosäure-Sequenz oder eine D-Aminosäure-Sequenz, die eine zusammengesetzte oder substituierte Version einer in natürlichem β-AP vorkommenden L-Aminosäure-Sequenz ist, umfassen. Die Erfindung schließt sowohl Modulator-Verbindungen mit ein, die eine peptidische Struktur aus D-Aminosäuren mit freien Amino- und Carboxytermini umfassen, als auch Modulator-Verbindungen, bei denen der Aminoterminus, der Carboxyterminus und/oder Seitenketten der peptidischen Struktur modifiziert sind.
Die β-Amyloid-Modulator-Verbindungen der Erfindung können auf der Grundlage ihrer Fähigkeit an natürliche β-Amyloid-Peptide zu binden, die Aggregation natürlicher β-AP in vitro zu modulieren und/oder die Neurotoxizität natürlicher β-AP-Fibrillen auf kultivierte Zellen zu inhibieren, ausgewählt werden (unter Verwendung eines hierin beschriebenen Assays). Bevorzugte Modulator-Verbindungen verhindern die Aggregation natürlicher β-AP und/oder inhibieren die Neurotoxizität von natürlichem β-AP. Allerdings können Modulator-Verbindungen, die nach einer oder beiden Eigenschaften ausgewählt worden sind, zusätzliche Eigenschaften in vivo aufweisen, die vorteilhaft bei der Behandlung von Amyloidose sind. So kann z. B. die Modulator-Verbindung in vivo störend auf die Prozessierung natürlicher β-AP einwirken (entweder durch direkte oder indirekte Protease-Inhibition) oder Prozesse modulieren, in denen toxisches β-AP oder andere APP-Fragmente hergestellt werden. Wahlweise können die Modulator-Verbindungen auf der Grundlage letztgenannter Eigenschaften ausgewählt werden, statt auf der Inhibierung der Aβ-Aggregation in vitro. Darüber hinaus können die Modulator-Verbindungen der Erfindung, die auf der Grundlage ihrer Interaktion mit natürlichen β-AP ausgewählt werden, auch mit APP oder mit an deren APP-Fragmenten interagieren. Ferner kann eine Modulator-Verbindung der Erfindung durch deren Fähigkeit, an β-Amyloid-Fibrillen zu binden, gekennzeichnet sein (was z. B. bestimmt werden kann, indem man die Verbindung markiert, die Verbindung mit einem β-Amyloid-Plaque in Kontakt bringt und die Verbindung, die an den Plaque bindet, detektiert), ohne die Aggregation der β-Amyloid-Fibrillen signifikant zu verändern. Solch eine Verbindung, die effektiv an β-Amyloid-Fibrillen bindet, ohne die Aggregation der β-Amyloid-Fibrillen zu verändern, kann z. B. verwendet werden, um β-Amyloid-Fibrillen zu detektieren (z. B. zu diagnostischen Zwecken, wie hierin beschrieben). Man sollte sich jedoch vor Augen halten, das die Fähigkeit einer bestimmten Verbindung an β-Amyloid-Fibrillen zu binden und/oder deren Aggregation zu modulieren, in Abhängigkeit von der Konzentration der Verbindung variieren kann. Dementsprechend kann eine Verbindung, die in einer niedrigen Konzentration an β-Amyloid-Fibrillen bindet, ohne deren Aggregation zu verändern, trotzdem in höheren Konzentrationen die Aggregation der Fibrillen verhindern. Es sollen all jene Verbindungen von der Erfindung umfasst werden, die die Eigenschaft besitzen, an β-Amyloid-Fibrillen zu binden und/oder die Aggregation der Fibrillen zu modulieren.
Ein „Modulator" der β-Amyloid-Aggregation, wie hierin verwendet, soll ein Mittel bezeichnen, das die Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide verändert, wenn es mit natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird. Die Bezeichnung „Aggregation von β-Amyloid-Peptiden" bezeichnet einen Prozess, bei dem die Peptide miteinander assoziieren, um einen multimeren, größtenteils unlöslichen Komplex zu bilden. Die Bezeichnung „Aggregation" soll ferner die Bildung von β-Amyloid-Fibrillen umfassen und umfasst außerdem β-Amyloid-Plaques.
Die Bezeichnungen „natürliche β-Amyloid-Peptide", „natürliche β-AP" und „natürliche Aβ-Peptide", die hierin abwechselnd verwendet werden, sollen natürlich vorkommende, proteolytische Spaltprodukte des β-Amyloid-Vorläuferproteins (APP) bezeichnen, die in β-AP-Aggregation und β-Amyloidose verwickelt sind. Diese natürlichen Peptide umfassen β-Amyloid-Peptide, die 39–43 Aminosäuen aufweisen (d. h. Aβ_1-39, Aβ_1-40, Aβ_1-41, Aβ_1-42 und Aβ_1-43). Der aminoterminale Aminosäurerest von natürlichem β-AP entspricht dem Asparaginsäure-Rest an Position 672 der 770 Aminosäurereste langen Form des Amyloid- Vorläuferproteins („APP-770"). Die 43 Aminosäure lange Form von natürlichem β-AP weist die Aminosäure-Sequenz DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAT (auch gezeigt in SEQ ID NO: 1) auf, wohingegen bei den kürzeren Formen 1–4 Aminosäurereste vom carboxyterminalen Ende entfernt sind. Die Aminosäure-Sequenz von APP-770 von Position 672 (d. h. dem Aminoterminus von natürlichem β-AP) bis zu dessen C-terminalen Ende (103 Aminosäuren) ist in SEQ ID NO: 2 gezeigt. Die bevorzugte Form von natürlichem β-AP zur Verwendung in dem hierin beschriebenen Aggregations-Assay ist Aβ_1-40.
In Gegenwart eines Modulators der Erfindung wird die Aggregation des natürlichen β-Amyloid-Peptids „verändert" oder „moduliert". Die unterschiedlichen Arten der Bezeichnung „Veränderung" oder „Modulation" sollen sowohl die Inhibierung der β-AP-Aggregation als auch die Förderung der β-AP-Aggregation umfassen. Aggregation von natürlichem β-AP wird in Gegenwart eines Modulators „inhibiert", wenn es zu einer Abnahme der Menge und/oder Geschwindigkeit der β-AP-Aggregation verglichen mit der Menge und/oder Geschwindigkeit der β-AP-Aggregation bei Abwesenheit des Modulators kommt. Die verschiedenen Arten der Bezeichnung „Inhibierung" sollen sowohl die vollständige als auch die teilweise Inhibierung der β-AP-Aggregation umfassen. Die Inhibierung der Aggregation kann als das Vielfache des Anstiegs der Lag-Zeit bis zur Aggregation, oder als die Abnahme des Gesamthöchstniveaus an Aggregation (d. h. Gesamtmenge der Aggregation) quantifiziert werden, wobei ein Aggregations-Assay verwendet wird, wie er in den Beispielen beschrieben ist. In verschiedenen Ausführungsformen erhöht ein Modulator der Erfindung die Lag-Zeit der Aggregation wenigstens um das 1,2-fache, 1,5-fache, 1,8-fache, 2-fache, 2,5-fache, 3-fache, 4-fache oder 5-fache. In verschiedenen anderen Ausführungsformen inhibiert ein Modulator der Erfindung das Höchstniveau an Aggregation zu wenigstens 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75% oder 100%.
Ein Modulator, der β-AP-Aggregation inhibiert (eine „inhibitorische Modulator-Verbindung"), kann dazu verwendet werden, den Beginn der β-Amyloid-Ablagerung zu verhindern oder zu verzögern. Bevorzugterweise inhibieren inhibitorische Modulator-Verbindungen der Erfindung die Bildung und/oder die Aktivität von neurotoxischen Aggregaten aus natürlichem Aβ-Peptid (d. h. die inhibito rischen Verbindungen können verwendet werden, um die Neurotoxizität von β-AP zu inhibieren). Zusätzlich reduzieren die inhibitorischen Verbindungen der Erfindung bevorzugterweise die Neurotoxizität von vorgebildeten β-AP-Aggregaten, was dafür spricht, dass die inhibitorischen Modulatoren entweder an die vorgebildeten Aβ-Fibrillen oder an lösliches Aggregat binden und ihre inhärente Neurotoxizität modulieren können, oder dass die Modulatoren das Gleichgewicht zwischen monomeren und aggregierten Formen von β-AP zugunsten der nicht-neurotoxischen Form verschieben.
Alternativ fördert eine Modulator-Verbindung der Erfindung in einer weiteren Ausführungsform die Aggregation der natürlichen Aβ-Peptide. Die verschiedenen Arten der Bezeichnung „Förderung" beziehen sich auf eine Erhöhung der Menge an und/oder Geschwindigkeit der β-AP-Aggregation in Gegenwart des Modulators, verglichen mit der Menge an und/oder Geschwindigkeit der β-AP-Aggregation bei Abwesenheit des Modulators. Solche eine Verbindung, die die Aβ-Aggregation fördert, wird als stimulatorisch modulierende Verbindung bezeichnet. Stimulatorisch modulierende Verbindungen können dienlich zur Absonderung von β-Amyloid-Peptiden, z. B. in ein biologisches Kompartiment, sein, wo die Aggregation von β-AP nicht schädlich ist, um dabei β-AP aus einem biologischen Kompartiment, wo Aggregation von β-AP schädlich ist, abzureichern. Ferner können stimulatorisch modulierende Verbindungen dazu verwendet werden, die Aβ-Aggregation in in vitro-Aggregations-Assays (z. B. Assays der Art, wie sie in Beispiel 2 beschrieben sind) zu fördern, z. B. in Screening-Assays nach Test-Verbindungen, die dann diese Aβ-Aggregation inhibieren oder rückgängig machen (d. h. eine stimulatorisch modulierende Verbindung kann als „Impfkeim" fungieren, um die Bildung von Aβ-Aggregaten zu fördern).
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Modulatoren der Erfindung in der Lage, die β-AP-Aggregation zu verändern, wenn man sie mit einem molaren Überschuss an natürlichem β-AP in Kontakt bringt. Ein „molarer Überschuss an natürlichem β-AP" bezeichnet eine Konzentration von natürlichem β-AP in Mol, die höher ist, als die Konzentration des Modulators in Mol. Wenn z. B. der Modulator und β-AP beide in einer Konzentration von 1 μM vorliegen, werden sie als „aquimolar" vorliegend bezeichnet, wohingegen wenn der Modulator in einer Konzentration von 1 μM vorliegt und das β-AP in einer Konzentration von 5 μM vorliegt, dann wird das β-AP als in einem 5-fachen Überschuss gegenüber dem Modulator vorliegend bezeichnet. In bevorzugten Ausführungsformen verändert ein Modulator der Erfindung die natürliche β-AP-Aggregation wirksam, wenn das natürliche β-AP wenigstens in einem 2-fachen, 3-fachen oder 5-fachen molaren Überschuss gegenüber der Konzentration des Modulators vorliegt. In anderen Ausführungsformen verändert ein Modulator der Erfindung die β-AP-Aggregation wirksam, wenn das natürliche β-AP wenigstens in einem 10-fachen, 20-fachen, 33-fachen, 50-fachen, 100-fachen, 500-fachen oder 1000-fachen molaren Überschuss gegenüber der Konzentration des Modulators vorliegt. Hierin verwendet soll die Bezeichnung „β-Amyloid-Peptid, vollständig bestehend aus D-Aminosäuren", das in einem Modulator der Erfindung verwendet wird, Peptide umfassen, die eine Aminosäure-Sequenz aufweisen, die identisch mit der natürlichen Sequenz in APP ist, sowie Peptide, die zulässige Aminosäure-Substitutionen gegenüber der natürlichen Sequenz aufweisen, die jedoch aus D-Aminosäuren und nicht aus den natürlichen L-Aminosäuren, die in natürlichem β-AP vorliegen, bestehen. Zulässige Aminosäure-Substitutionen sind solche, die die Fähigkeit der D-Aminosäuren enthaltenden Peptide, die natürliche β-AP-Aggregation zu verändern, nicht beeinträchtigen. Außerdem können spezifische Aminosäure-Substitutionen ferner zur Fähigkeit des Peptids, die natürliche β-AP-Aggregation zu verändern, beitragen, und/oder dem Peptid zusätzliche vorteilhafte Eigenschaften (z. B. verbesserte Löslichkeit, verminderte Assoziation mit anderen Amyloid-Proteinen, etc.) verleihen. Ein Peptid, das eine identische Aminosäure-Sequenz, zu der in einem Stammpeptid vorliegenden Sequenz aufweist, wobei allerdings alle L-Aminosäuren durch D-Aminosäuren ersetzt wurden, wird auch als „Inverso"-Verbindung bezeichnet. Wenn z. B. ein Stammpeptid Thr-Ala-Tyr ist, dann ist die Inverso-Form D-Thr-D-Ala-D-Tyr.
Hierin verwendet soll die in einem Modulator der Erfindung verwendete Bezeichnung „Retro-Inverso-Isomer eines β-Amyloid-Peptids" Peptide umfassen, bei denen die Sequenz der Aminosäuren im Vergleich zu der Sequenz in natürlichem β-AP umgekehrt ist, und alle L-Aminosäuren durch D-Aminosäuren ersetzt sind. Wenn z. B. ein Stammpeptid Thr-Ala-Tyr ist, dann ist die Retro-Inverso-Form D-Tyr-D-Ala-D-Thr. Verglichen mit dem Stammpeptid weist ein Retro-Inverso-Peptid ein invertiertes Rückgrat auf, während im Wesentlichen die ursprüngliche räumliche Konformation der Seitenketten beibehalten wird, wodurch ein Retro-Inverso-Isomer mit einer Topologie entsteht, die dem Stammpeptid stark ähnelt (siehe Goodman et al. „Perspectives in Peptide Chemistry" S. 283–294 (1981); siehe auch US-Patent Nr. 4,522,752 von Sisto für weiterführende Beschreibung von „Retro-Inverso-" Peptiden).
Verschiedene zusätzliche Aspekte der Modulatoren der Erfindung und deren Verwendungen werden ausführlich in den folgenden Unterkapiteln beschrieben.
I. Modulator-Verbindungen
In einer Ausführungsform umfasst eine Modulator-Verbindung der Erfindung ein β-Amyloid-Peptid, das vollständig aus D-Aminosäuren besteht, wobei die Verbindung an natürliche β-Amyloid-Peptide bindet, oder deren Aggregation moduliert, oder die Neurotoxizität natürlicher β-Amyloid-Peptide inhibiert, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird. Bevorzugterweise besteht das β-Amyloid-Peptid des Modulators aus 3–20 Aminosäuren, bevorzugter aus 3–10 Aminosäuren, und noch mehr bevorzugt aus 3–5 Aminosäuren. In einer Ausführungsform ist das β-Amyloid-Peptid des Modulators aminoterminal modifiziert, z. B. mit einer modifizierenden Gruppe, die eine zyklische, heterozyklische, polyzyklische oder verzweigte Alkyl-Gruppe umfasst. Beispiele für geeignete N-terminal modifizierende Gruppen werden darüber hinaus weiter unten in Unterkapitel II beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform ist das β-Amyloid-Peptid des Modulators carboxyterminal modifiziert, z. B. kann der Modulator ein Peptidamid, ein Peptidalkyl- oder arylamid (z. B. ein Peptidphenethylamid) oder einen Peptidalkohol umfassen. Beispiele für geeignete C-terminal modifizierende Gruppen werden darüber hinaus weiter unten in den Unterkapiteln II und III beschrieben. Das β-Amyloid-Peptid des Modulators kann modifiziert sein, um die Fähigkeit des Modulators zu verstärken, die β-AP-Aggregation oder Neurotoxizität zu verändern. Zusätzlich oder alternativ kann das β-Amyloid-Peptid des Modulators modifiziert sein, um eine pharmakokinetische Eigenschaft des Modulators zu verändern und/oder den Modulator mit einer detektierbaren Substanz zu markieren (darüber hinaus weiter unten in Unterkapitel III beschrieben).
In einer weiteren Ausführungsform umfasst eine Modulator-Verbindung der Erfindung ein Retro-Inverso-Isomer eines β-Amyloid-Peptids, wobei die Verbindung an natürliche β-Amyloid-Peptide bindet, oder deren Aggregation moduliert, oder die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden inhibiert, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird. Bevorzugterweise umfasst das Retro-Inverso-Isomer des β-Amyloid-Peptids 3–20 D-Aminosäuren, noch bevorzugter 3–10 D-Aminosäuren, und noch mehr bevorzugt 3–5 D-Aminosäuren. In einer Ausführungsform ist das Retro-Inverso-Isomer aminoterminal modifiziert, z. B. mit einer modifizierenden Gruppe, die eine zyklische, heterozyklische, polyzyklische oder verzweigte Alkyl-Gruppe umfasst. Beispiele für geeignete N-terminal modifizierende Gruppen werden darüber hinaus weiter unten in Unterkapitel II beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform ist das Retro-Inverso-Isomer carboxyterminal modifiziert, z. B. mit einer Amidgruppe, einer Alkyl- oder Arylamidgruppe (z. B. Phenethylamid) oder einer Hydroxygruppe (d. h. das Reduktionsprodukt einer Peptidsäure, wodurch ein Peptidalkohol entsteht). Beispiele für geeignete C-terminal modifizierende Gruppen werden darüber hinaus weiter unten in den Unterkapiteln II und III beschrieben. Das Retro-Inverso-Isomer kann modifiziert sein, um die Fähigkeit des Modulators zu verstärken, die β-AP-Aggregation oder -N eurotoxizität zu verändern. Zusätzlich oder alternativ kann das Retro-Inverso-Isomer modifiziert sein, um eine pharmakokinetische Eigenschaft des Modulators zu verändern und/oder den Modulator mit einer detektierbaren Substanz zu markieren (weiterführend weiter unten in Unterkapitel III beschrieben).
Die Modulatoren der Erfindung sind bevorzugt auf der Grundlage der Aminosäure-Sequenz einer Teilregion von natürlichem β-AP aufgebaut. Die Bezeichnung „Teilregion eines natürlichen β-Amyloid-Peptids" soll aminoterminale und/oder carboxyterminale Deletionen von natürlichem β-AP umfassen. Der Begriff „Teilregion von natürlichem β-AP" soll nicht-natürliches β-AP in ganzer Länge umfassen (d. h. „Teilregion" umfasst nicht Aβ_1-39, Aβ_1-40, Aβ_1-41, Aβ_1-42 und Aβ_1-43). Eine bevorzugte Teilregion von natürlichem β-Amyloid-Peptid ist eine „Aβ-Aggregation-Kern-Domäne" (Aβ aggregation core domain, ACD). Hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung „Aβ-Aggregations-Kern-Domäne" auf eine Teilregion eines natürlichen β-Amyloid-Peptids, die ausreicht, um die Aggregation von natürlichen β-APs zu modulieren, wenn diese Teilregion in ihrer L-Aminosäure-Form geeignet modifiziert ist (z. B. am Aminoterminus modifiziert), wie in der US-Patent-Anmeldung Serien-Nr. 08/548,998 und der US-Patent-Anmeldung Serien-Nr. 08/616,081 detailliert beschrieben, deren beider vollständiger Inhalt ausdrücklich hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen ist. Bevorzugterweise ist die ACD nach einer Teilregion von natürlichem β-AP ausgebildet, die eine Länge von weniger als 15 Aminosäuren aufweist und noch bevorzugter eine Länge zwischen 3–10 Aminosäuren aufweist. In verschiedenen Ausführungsformen ist die ACD nach einer Teilregion von β-AP ausgebildet, die eine Länge von 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 oder 3 Aminosäuren aufweist. In einer Ausführungsform ist die Teilregion, nach der die ACD ausgebildet ist, eine interne oder carboxyterminale Region von β-AP (d. h. stromabwärts des Aminoterminus an Aminosäure-Position 1). In einer weiteren Ausführungsform ist die ACD nach einer Teilregion des β-AP, die hydrophob ist, ausgebildet. Bevorzugte Aβ-Aggregations-Kern-Domänen umfassen die Aminosäurereste 17–20 oder 17–21 von natürlichem β-AP (entsprechend Aβ_17-20 und Aβ_17-21). Die Aminosäure-Sequenzen von Aβ_17-20 und Aβ_17-21 sind entsprechend Leu-Val-Phe-Phe (SEQ ID NO: 8) und Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID NO: 3).
Wie in den Beispielen gezeigt, sind D-Aminosäuren enthaltende Modulatoren, die auf der Grundlage der Aminosäure-Sequenzen von Aβ_17-20 und Aβ_17-21 aufgebaut sind, besonders wirksame Inhibitoren von Aβ-Aggregation. Diese Modulatoren können eine D-Aminosäure-Sequenz umfassen, die der L-Aminosäure-Sequenz von Aβ_17-20 oder Aβ_17-21 entspricht, eine D-Aminosäure-Sequenz, die ein Retro-Inverso-Isomer der L-Aminosäure-Sequenz von Aβ_17-20 oder Aβ_17-21 darstellt, oder eine D-Aminosäure-Sequenz, die eine zusammengesetzte oder substituierte Version der L-Aminosäure-Sequenz von Aβ_17-20 oder Aβ_17-21 ist. Die auf D-Aminosäuren basierenden Modulatoren können unmodifizierte Amino- oder Carboxytermini aufweisen, oder anderenfalls, können der Aminoterminus, der Carboxyterminus oder beide modifiziert sein (weiter unten beschrieben). Die peptidischen Strukturen von wirksamen Modulatoren sind im Allgemeinen hydrophob und durch die Gegenwart von wenigstens zwei D-Aminosäure-Strukturen gekennzeichnet, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einer D-Leucin-Struktur, einer D-Phenylalanin-Struktur und einer D-Valin-Struktur besteht. Hierin verwendet soll die Bezeichnung eine „D-Aminosäure-Struktur" (wie eine „D-Leucin-Struktur", eine „D-Phenylalanin-Struktur" oder eine „D-Valin-Struktur") die D-Aminosäure, sowie Analoga, Derivate und Mimetika der D-Aminosäure umfassen, die die funktionelle Aktivität der Verbindung aufrechterhalten (weiter unten diskutiert). Die Bezeichnung „D-Phenylalanin-Struktur" soll z. B. D-Phenylalanin sowie D-Pyridylalanin und D-Homophenylalanin umfassen. Die Bezeichnung „D-Leucin-Struktur" soll D-Leucin sowie Substitutionen durch D-Valin oder andere natürliche oder nicht-natürliche Aminosäuren, die eine aliphatische Seitenkette, aufweisen, wie D-Norleucin, umfassen. Die Bezeichnung „D-Valin-Struktur" soll D-Valin sowie Substitutionen durch D-Leucin oder andere natürliche oder nicht-natürliche Aminosäuren, die eine aliphatische Seitenkette aufweisen, umfassen.
In weiteren Ausführungsformen umfasst die peptidische Struktur des Modulators wenigstens zwei D-Aminosäure-Strukturen, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einer D-Leucin-Struktur, einer D-Phenylalanin-Struktur, einer D-Valin-Struktur, einer D-Alanin-Struktur, einer D-Tyrosin-Struktur und einer D-Iodotyrosin-Struktur besteht. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die peptidische Struktur wenigstens drei D-Aminosäure-Strukturen, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einer D-Leucin-Struktur, einer D-Phenylalanin-Struktur und einer D-Valin-Struktur besteht. In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst die peptidische Struktur wenigstens drei D-Aminosäure-Strukturen, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einer D-Leucin-Struktur, einer D-Phenylalanin-Struktur, einer D-Valin-Struktur, einer D-Alanin-Struktur, einer D-Tyrosin-Struktur und einer D-Iodotyrosin-Struktur besteht. In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst die peptidische Struktur wenigstens vier D-Aminosäure-Strukturen, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einer D-Leucin-Struktur, einer D-Phenylalanin-Struktur und einer D-Valin-Struktur besteht. In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst die peptidi sche Struktur wenigstens vier D-Aminosäure-Strukturen, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einer D-Leucin-Struktur, einer D-Phenylalanin-Struktur und einer D-Valin-Struktur besteht. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die peptidische Struktur ein D-Aminosäure-Dipeptid, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus D-Phe-D-Phe, D-Phe-D-Tyr, D-Tyr-D-Phe, D-Phe-D-IodoTyr und D-IodoTyr-D-Phe besteht.
In einer Ausführungsform sieht die Erfindung eine β-Amyloid-Modulator-Verbindung vor, die die Formel (I)
umfasst,
wobei Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃ und Xaa₄ jeweils D-Aminosäure-Strukturen sind und wenigstens zwei von Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃ und Xaa₄ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einer D-Leucin-Struktur, einer D-Phenylalanin-Struktur und einer D-Valin-Struktur besteht;
Y, das vorhanden sein kann oder nicht, eine Struktur darstellt, die der Formel (Xaa)_a entspricht, wobei Xaa eine beliebige D-Aminosäure-Struktur ist und a eine ganze Zahl von 1 bis 15 annimmt;
Z, das vorhanden sein kann oder nicht, eine Struktur darstellt, die der Formel (Xaa)_b entspricht, wobei Xaa eine beliebige D-Aminosäure-Struktur ist und b eine ganze Zahl von 1 bis 15 annimmt;
A, das vorhanden sein kann oder nicht, eine modifizierende Gruppe darstellt, die direkt oder indirekt mit der Verbindung verknüpft ist; und
n eine ganze Zahl von 1 bis 15 annimmt;
wobei Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄, Y, Z, A und n so ausgewählt werden, dass die Verbindung an natürliche β-Amyloid-Peptide bindet oder deren Aggregation verhindert oder die Neurotoxizität natürlicher β-Amyloid-Peptide inhi biert, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird.
In einer untergeordneten Ausführungsform dieser Formel ist ein fünfter Aminosäurerest, Xaa₅, C-terminal zu Xaa₄ angeordnet, und Z, das vorhanden sein kann oder nicht, stellt eine Struktur dar, die der Formel (Xaa)_b entspricht, wobei Xaa eine beliebige D-Aminosäure-Struktur ist und b eine ganze Zahl von 1 bis 14 annimmt. Dementsprechend sieht die Erfindung eine β-Amyloid-Modulator-Verbindung vor, die die Formel (II)
umfasst,
wobei b eine ganze Zahl von 1 bis 14 annimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄ aus Formel (I) auf der Grundlage der Sequenz von Aβ_17-20 oder zulässigen Substitutionen davon ausgewählt. Dementsprechend ist in bevorzugten Ausführungsformen Xaa₁ eine D-Alanin-Struktur oder eine D-Leucin-Struktur, Xaa₂ eine D-Valin-Struktur, Xaa₃ eine D-Phenylalanin-Struktur, eine D-Tyrosin-Struktur oder eine D-Iodotyrosin-Struktur und Xaa₄ eine D-Phenylalanin-Struktur, eine D-Tyrosin-Struktur oder eine D-Iodotyrosin-Struktur.
In einer weiteren Ausführungsform werden Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄ und Xaa₅ aus Formel (II) auf der Grundlage der Sequenz von Aβ_17-21 oder zulässigen Substitutionen davon ausgewählt. Dementsprechend ist in bevorzugten Ausführungsformen Xaa₁ eine D-Alanin-Struktur oder eine D-Leucin-Struktur, Xaa₂ eine D-Valin-Struktur, Xaa₃ eine D-Phenylalanin-Struktur, eine D-Tyrosin-Struktur oder eine D-Iodotyrosin-Struktur, Xaa₄ eine D-Phenylalanin-Struktur, eine D-Tyrosin-Struktur oder eine D-Iodotyrosin-Struktur und Xaa₅ eine D-Alanin-Struktur oder eine D-Leucin-Struktur.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃ und Xaa₄ aus Formel (I) auf der Grundlage des Retro-Inverso-Isomers von Aβ_17-20 oder zulässigen Substitutionen davon ausgewählt. Dementsprechend ist in bevorzugten Ausführungsformen Xaa₁ eine D-Alanin-Struktur, eine D-Leucin-Struktur oder eine D-Phenylalanin-Struktur, Xaa₂ eine D-Phenylalanin-Struktur, eine D-Tyrosin-Struktur oder eine D-Iodotyrosin-Struktur, Xaa₃ eine D-Phenylalanin-Struktur, eine D-Tyrosin-Struktur oder eine D-Iodotyrosin-Struktur und Xaa₄ eine D-Valin-Struktur oder eine D-Leucin-Struktur.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄ und Xaa₅ aus Formel (II) auf der Grundlage des Retro-Inverso-Isomers von Aβ_17-21 oder zulässigen Substitutionen davon ausgewählt. Dementsprechend ist in bevorzugten Ausführungsformen Xaa₁ eine D-Alanin-Struktur, eine D-Leucin-Struktur oder eine D-Phenylalanin-Struktur, Xaa₂ eine D-Phenylalanin-Struktur, eine D-Tyrosin-Struktur oder eine D-Iodotyrosin-Struktur, Xaa₃ eine D-Phenylalanin-Struktur, eine D-Tyrosin-Struktur oder eine D-Iodotyrosin-Struktur, Xaa₄ eine D-Valin-Struktur oder eine D-Leucin-Struktur und Xaa₅ eine D-Leucin-Struktur.
In den Modulatoren der Erfindung mit der oben gezeigten Formel (I) oder (II) ist eine optionale modifizierende Gruppe („A") direkt oder indirekt mit der peptidischen Struktur des Modulators verknüpft (hierin verwendet werden die Bezeichnungen „modulierende Gruppe" und „modifizierende Gruppe" abwechselnd verwendet, um eine chemische Gruppe zu beschreiben, die direkt oder indirekt mit der peptidischen Struktur verknüpft ist). Eine modifizierende Gruppe kann bzw. modifizerende Gruppen können z. B. direkt mit der peptidischen Struktur durch kovalente Kopplung verknüpft sein oder eine modifizierte Gruppe kann bzw. modifizierende Gruppen können indirekt durch eine stabile nicht-kovalente Verbindung verknüpft sein. In einer Ausführungsform der Erfindung ist eine modifizierende Gruppe mit dem Aminoterminus der peptidischen Struktur des Modulators verknüpft. Alternativ ist in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung eine modifizierende Gruppe mit dem Carboxyterminus der peptidischen Struktur des Modulators verknüpft. In noch einer weiteren Ausführungsform ist eine modulierende Gruppe bzw. sind modulierende Gruppen mit der Seitenkette von wenigstens einem Aminosäurerest der peptidischen Struktur des Modulators verknüpft (z. B. über die Epsilon-Aminogruppe eines Lysinrestes/von Lysinresten, über die Carboxylgruppe eines Asparaginsäu rerestes/von Asparaginsäureresten oder eines Glutaminsäurerestes/von Glutaminsäureresten, über die Hydroxygruppe eines Tyrosylrestes/von Tyrosinresten, eines Serinrestes/von Serinresten oder eines Threoninrestes/von Threoninresten oder anderen geeigneten reaktiven Gruppen einer Aminosäure-Seitenkette).
Wenn eine modifizierende Gruppe vorhanden ist bzw. modifizierende Gruppen vorhanden sind, dann wird die modifizierende Gruppe so ausgewählt, dass die Verbindung Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden inhibiert, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird. Da das β-AP-Peptid der Verbindung gegenüber dessen natürlichem Zustand modifiziert ist, soll die modifizierende Gruppe „A", wie hierin verwendet, dementsprechend nicht Wasserstoff mit einschließen. In einem Modulator der Erfindung kann eine einzelne modifizierende Gruppe mit der peptidischen Struktur verknüpft sein, oder mehrere modifizierende Gruppen können mit der peptidischen Struktur verknüpft sein. Die Anzahl der modifizierenden Gruppen wird so gewählt, dass die Verbindung Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden inhibiert, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird. Allerdings ist n bevorzugt eine ganze Zahl zwischen 1 und 60, bevorzugter zwischen 1 und 30 und noch mehr bevorzugt zwischen 1 und 10 oder 1 und 5. In einer bevorzugten Ausführungsform ist A eine aminoterminal modifizierende Gruppe, die eine zyklische, heterozyklische, polyzyklische oder verzweigte Alkyl-Gruppe umfasst, und n = 1. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist A eine carboxyterminal modifizierende Gruppe, die eine Amidgruppe, eine Alkylamidgruppe, eine Arylamidgruppe oder eine Hydroxygruppe umfasst, und n = 1. Geeignete modifizierende Gruppen sind darüber hinaus weiter unten in den Unterkapiteln II und III beschrieben.
In einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung eine β-Amyloid-Modulator-Verbindung vor, die eine Formel (III) A-(Y)-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-(Z)-B (III)umfasst,
wobei Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃ und Xaa₄ jeweils D-Aminosäure-Strukturen sind und wenigstens zwei von Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃ und Xaa₄ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einer D-Leucin-Struktur, einer D-Phenylalanin-Struktur und einer D-Valin-Struktur besteht;
Y, das vorhanden sein kann oder nicht, eine peptidische Struktur darstellt, die der Formel (Xaa)_a entspricht, wobei Xaa eine beliebige Aminosäure-Struktur ist und a eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist;
Z, das vorhanden sein kann oder nicht, eine peptidische Struktur darstellt, die der Formel (Xaa)_b entspricht, wobei Xaa eine beliebige Aminosäure-Struktur ist und b eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist; und
A, das vorhanden sein kann oder nicht, eine modifizierende Gruppe darstellt, die direkt oder indirekt mit dem Aminoterminus der Verbindung verknüpft ist; und
B, das vorhanden sein kann oder nicht, eine modifizierende Gruppe darstellt, die direkt oder indirekt mit dem Carboxyterminus der Verbindung verknüpft ist;
Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄, Y, Z, A und B so ausgewählt werden, das die Verbindung an natürliche β-Amyloid-Peptide bindet oder deren Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden inhibiert, wenn sie mit natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird.
In einer untergeordneten Ausführungsform von Formel (III) ist ein fünfter Aminosäurerest, Xaa₅, C-terminal zu Xaa₄ angeordnet, und Z, das vorhanden sein kann oder nicht, stellt eine Struktur dar, die der Formel (Xaa)_b entspricht, wobei Xaa eine beliebige D-Aminosäure-Struktur ist und b eine ganze Zahl von 1 bis 14 annimmt. Dementsprechend sieht die Erfindung eine β-Amyloid-Modulator-Verbindung vor, die die Formel (IV) A-(Y)-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Xaa₅-(Z)-B (IV)umfasst,
wobei b eine ganze Zahl von 1 bis 14 annimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄ aus Formel (III) auf der Grundlage der Sequenz von Aβ_17-20 oder zulässigen Substitutionen davon ausgewählt. Dementsprechend ist in bevorzugten Ausführungsformen Xaa₁ eine D-Alanin-Struktur oder eine D-Leucin-Struktur, Xaa₂ eine D-Valin-Struktur, Xaa₃ eine D-Phenylalanin-Struktur, eine D-Tyrosin-Struktur oder eine D-Iodotyrosin-Struktur und Xaa₄ eine D-Phenylalanin-Struktur oder eine D-Iodotyrosin-Struktur.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄ und Xaa₅ aus Formel (IV) auf der Grundlage der Sequenz von Aβ_17-21 oder zulässigen Substitutionen davon ausgewählt. Dementsprechend ist in bevorzugten Ausführungsformen Xaa₁ eine D-Alanin-Struktur oder eine D-Leucin-Struktur, Xaa₂ eine D-Valin-Struktur, Xaa₃ eine D-Phenylalanin-Struktur, eine D-Tyrosin-Struktur oder eine D-Iodotyrosin-Struktur, Xaa₄ eine D-Phenylalanin-Struktur, eine D-Tyrosin-Struktur oder eine D-Iodotyrosin-Struktur und Xaa₅ eine D-Alanin-Struktur oder eine D-Leucin-Struktur.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃ und Xaa₄ aus Formel (III) auf der Grundlage des Retro-Inverso-Isomers von Aβ_17-20 oder zulässigen Substitutionen davon ausgewählt. Dementsprechend ist in bevorzugten Ausführungsformen Xaa₁ eine D-Alanin-Struktur, eine D-Leucin-Struktur oder eine D-Phenylalanin-Struktur, Xaa₂ eine D-Phenylalanin-Struktur, eine D-Tyrosin-Struktur oder eine D-Iodotyrosin-Struktur, Xaa₃ eine D-Phenylalanin-Struktur, eine D-Tyrosin-Struktur oder eine D-Iodotyrosin-Struktur und Xaa₄ eine D-Valin-Struktur oder eine D-Leucin-Struktur.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄ und Xaa₅ aus Formel (IV) auf der Grundlage des Retro-Inverso-Isomers von Aβ_17-21 oder zulässigen Substitutionen davon ausgewählt. Dementsprechend ist in bevorzugten Ausführungsformen Xaa₁ eine D-Alanin-Struktur, eine D-Leucin-Struktur oder eine D-Phenylalanin-Struktur, Xaa₂ eine D-Phenylalanin-Struktur, eine D-Tyrosin-Struktur oder eine D-Iodotyrosin-Struktur, Xaa₃ eine D-Phenylalanin-Struktur, eine D-Tyrosin-Struktur oder eine D-Iodotyrosin-Struktur, Xaa₄ eine D-Valin-Struktur oder eine D-Leucin-Struktur und Xaa₅ eine D-Leucin-Struktur.
In einer Ausführungsform der Verbindungen mit den Formeln (III) und/oder (IV) ist A vorhanden und umfasst eine zyklische, heterozyklische, polyzyklische oder verzweigte Alkyl-Gruppe. In einer weiteren Ausführungsform der Verbindungen mit den Formeln (III) und/oder (IV) ist B vorhanden und umfasst eine Amidgruppe, eine Alkylamidgruppe, eine Arylamidgruppe oder eine Hydroxygruppe. In noch einer weiteren Ausführungsform der Verbindungen mit den Formeln (III) und/oder (IV) sind sowohl A als auch B vorhanden.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen sieht die Erfindung eine β-Amyloid-Modulator-Verbindung vor, die eine peptidische Struktur umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe (SEQ ID NO: 9), D-Leu-D-Val-D-Phe-Phenethylamid (SEQ ID NO: 10), D-Leu-D-Val-D-Tyr-D-Phe (SEQ ID NO: 11), D-Leu-D-Val-D-IodoTyr-D-Phe (SEQ ID NO: 12), D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Tyr (SEQ ID NO: 13), D-Leu-D-Val-D-Phe-D-IodoTyr (SEQ ID NO: 14), D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Ala (SEQ ID NO: 15), D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala (SEQ ID NO- 16), D-Ala-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu (SEQ ID NO: 17), D-Leu-D-Val-D-Tyr-D-Phe-D-Ala (SEQ ID NO: 18), D-Leu-D-Val-D-IodoTyr-D-Phe-D-Ala (SEQ ID NO: 19), D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Tyr-D-Ala (SEQ ID NO: 20), D-Leu-D-Val-D-Phe-D-IodoTyr-D-Ala (SEQ ID NO: 21), D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu (SEQ ID NO: 22), D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val (SEQ ID NO: 23), D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu (SEQ ID NO. 4), D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Leu (SEQ ID NO: 5), D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu (SEQ ID NO: 6), D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu (SEQ ID NO: 7), D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Val (SEQ ID NO: 24), D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu (SEQ ID NO: 25) und D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu (SEQ ID NO: 26) besteht. Jede der obengenannten spezifischen, peptidischen Strukturen kann aminoterminal und/oder carboxyterminal modifiziert sein, wie weiterführend weiter unten in den Unterkapiteln II und/oder III beschrieben ist.
Besonders bevorzugte Modulatoren umfassen D-Aminosäure-Peptidamide, die auf der Grundlage des Retro-Inverso-Isomers von Aβ_17-21 oder zulässigen Substitutionen davon aufgebaut sind, einschließlich Verbindungen, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu-Amid (SEQ ID NO: 4; C-terminales Amid), D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D- Leu-Amid (SEQ ID NO: 5, C-terminales Amid), D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu-Amid (SEQ ID NO: 6; C-terminales Amid) und D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu-Amid (SEQ ID NO: 7; C-terminales Amid), D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Val-Amid (SEQ-ID NO: 24; C-terminales Amid), D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu-Amid (SEQ ID NO: 25; C-terminales Amid) und D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu-Amid (SEQ ID NO: 26; C-terminales Amid) besteht.
Die peptidischen Strukturen aus D-Aminosäuren des Modulators der Erfindung sollen ferner andere Peptid-Modifikationen umfassen, einschließlich Analoga, Derivaten und Mimetika, die die Fähigkeit des Modulators die natürliche β-AP-Aggregation zu verändern, wie hierin beschrieben, beibehalten. Eine peptidische Struktur aus D-Aminosäuren eines Modulators der Erfindung kann z. B. ferner modifiziert sein, um deren Stabilität, Bioverfügbarkeit, Löslichkeit, etc. zu erhöhen. Die Bezeichnungen „Analoga", „Derivate" und „Mimetika", die hierin verwendet werden, sollen Moleküle umfassen, die die chemische Struktur einer D-peptidischen Struktur nachahmen und die funktionellen Eigenschaften der D-peptidischen Struktur beibehalten. Ansätze zur Entwicklung von Peptid-Analoga, -Derivaten und -Mimetika sind aus dem Stand der Technik bekannt. Siehe z. B. Farmer, P.S. in Drug Design (E.J. Ariens, Herausgeber) Academic Press, New York, 1980, Band 10, S. 119–143; Ball, J.B. und Alewood, P.F. (1990) J. Mol. Recognition 3:55; Morgan, B.A. und Gainor, J.A. (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24:243; und Freidinger, R.M. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10:270. Siehe auch Sawyer, T.K. (1995) „Peptidomimetic Design and Chemical Approaches to Pepide Metabolism" in Taylor, M.D. und Amidon, G.L. (Herausgeber), peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Kapitel 17; Smith, A.B. III., et al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117:11113–11123; Smith, A.B. III., et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:9947–9962; und Hirschmann, R., et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:12550–12568.
Hierin verwendet bezieht sich ein „Derivat" einer Verbindung X (z. B. ein Peptid oder eine Aminosäure) auf eine Form von X, in der eine oder mehrere reaktive Gruppen der Verbindung mit einer Substituentengruppe derivatisiert worden sind. Beispiele für Peptid-Derivate umfassen Peptide, in denen eine Aminosäure-Seitenkette, das Peptid-Rückgrat oder der Amino- oder Carboxyter minus derivatisiert worden sind (z. B. peptidische Verbindungen mit methylierten Amid-Bindungen). Hierin verwendet bezieht sich ein „Analogon" einer Verbindung X auf eine Verbindung, die chemische Strukturen von X, die für die funktionelle Aktivität von X nötig sind, beibehält, jedoch auch bestimmte chemische Strukturen enthält, die sich von X unterscheiden. Ein Beispiel für ein Analogon eines natürlich vorkommenden Peptids ist ein Peptid, das eine oder mehrere nicht-natürliche Aminosäuren enthält. Hierin verwendet bezieht sich ein „Mimetikum" einer Verbindung X auf eine Verbindung, in der chemische Strukturen von X, die für die funktionelle Aktivität von X nötig sind, durch andere chemische Strukturen, die die Konformation von X nachahmen, ersetzt worden sind. Beispiele für Peptidmimetika umfassen peptidische Verbindungen, bei denen das Peptid-Rückgrat durch eine oder mehrere Benzdiazepin-Moleküle ersetzt worden ist (siehe z. B. James, G.L. et al. (1993) Science 260:1937–1942).
Analoga der Modulator-Verbindungen der Erfindung sollen Verbindungen umfassen, in denen eine oder mehrere D-Aminosäuren der peptidischen Struktur durch eine homologe Aminosäure, ersetzt werden, so dass die Eigenschaften des ursprünglichen Modulators beibehalten werden. Bevorzugterweise werden konservative Aminosäure-Substitutionen an einem oder mehreren Aminosäureresten durchgeführt. Eine „konservative Aminosäure-Substitution" liegt vor, wenn der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest, der eine ähnliche Seitenkette aufweist, ersetzt wird. Familien von Aminosäureresten, die ähnliche Seitenketten aufweisen, wurden durch den Stand der Technik definiert, und umfassen basische Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), saure Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladene polare Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolare Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), β-verzweigte Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatische Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Nicht-einschränkende Beispiele für homologe Substitutionen, die in die peptidischen Strukturen des Modulators der Erfindung eingeführt werden können, umfassen Substitution von D-Phenylalanin durch D-Tyrosin, D-Pyridylalanin oder D-Homophenylalanin, Substitution von D-Leucin durch D- Valin oder andere natürliche oder nicht-natürliche Aminosäuren, die eine aliphatische Seitenkette aufweisen, und/oder Substitution von D-Valin durch D-Leucin oder andere natürliche oder nicht-natürliche Aminosäuren, die eine aliphatische Seitenkette aufweisen.
Die Bezeichnung Mimetika, und im Speziellen, Peptidmimetika, soll Isostere umfassen. Die Bezeichnung „Isostere", die hierin verwendet wird, soll eine chemische Struktur umfassen, die durch eine zweite chemische Struktur ersetzt werden kann, weil die sterische Konformation der ersten Struktur zu einer Bindungsstelle passt, die für die zweite Struktur spezifisch ist. Die Bezeichnung umfasst insbesondere Modifikationen des Peptid-Rückgrats (d. h. Amid-Bindungs-Mimetika), die dem Fachmann gut bekannt sind. Solche Modifikationen umfassen Modifikationen des Amid-Stickstoffs, des α-Kohlenstoff-Atoms, der Amid-Carbonyl-Gruppe, vollständige Ersetzung der Amidbindung, Extensionen, Deletionen, oder Rückgrat-Kopplungen. Mehrere Peptid-Rückgrat-Modifikationen sind bekannt, darunter ψ[CH₂S], ψ[CH₂NH], ψ[CSNH₂], ψ[NHCO], ψ[COCH2] und ψ[(E) oder (Z) CH=CH]. In der oben verwendeten Nomenklatur gibt ψ die Abwesenheit einer Amidbindung an. Die Struktur, die die Amidgruppe ersetzt, ist in den Klammern angegeben.
Weitere mögliche Modifikationen umfassen eine N-Alkyl (oder Aryl)-Substitution (ψ[CONR]) oder Rückgrat-Vernetzung unter Bildung von Lactamen und anderen zyklischen Strukturen. Andere Derivate der Modulator-Verbindungen der Erfindung umfassen C-terminale Hydroxymethyl-Derivate, O-modifizierte Derivate (z. B. C-terminaler Hydroxymethylbenzylether), N-terminal modifizierte Derivate einschließlich substituierter Amide, wie Alkylamide und Hydrazide, und Verbindungen, in denen ein C-terminaler Phenylalanin-Rest durch ein Phenethylamid-Analogon ersetzt wird (z. B. Val-Phe-Phenethylamid als ein Analogon des Tripeptids Val-Phe-Phe).
Die Modulator-Verbindungen der Erfindung können in pharmazeutische Zusammensetzungen eingebracht (weiterführend weiter unten in Unterkapitel V beschrieben) und in Detektions- und Behandlungsverfahren, wie weiterführend weiter unten in Unterkapitel VI beschrieben, verwendet werden.
II. Modifizierende Gruppen
In bestimmten Ausführungsformen der Modulator-Verbindungen der Erfindung ist eine peptidische Struktur aus D-Aminosäuren (wie ein von Aβ abgeleitetes Peptid oder eine Aβ-Aggregations-Kern-Domäne oder eine Aminosäure-Sequenz, die einer umgeordneten Aβ-Aggregations-Kern-Domäne entspricht) direkt oder indirekt mit wenigstens einer modifizierenden Gruppe (abgekürzt als MG) verbunden. Die Bezeichnung „modifizierende Gruppe" soll Strukturen umfassen, die direkt mit der peptidischen Struktur aus D-Aminosäuren verknüpft sind (z. B. durch kovalente Bindung) sowie solche, die indirekt mit der peptidischen Struktur verknüpft sind (z. B. durch eine stabile nicht-kovalente Verbindung oder durch kovalente Bindung mit zusätzlichen Aminosäureresten oder Mimetika, Analoga oder Derivaten davon, die die von Aβ abgeleiteten peptidischen Strukturen aus D-Aminosäuren flankieren). Die modifizierende Gruppe kann z. B. an den Aminoterminus oder den Carboxyterminus einer von Aβ abgeleiteten peptidischen Struktur aus D-Aminosäuren, oder mit einer peptidischen oder peptidmimetischen Region, die die Kerndomäne flankiert, gekoppelt sein. Alternativ kann die modifizierende Gruppe mit einer Seitenkette von wenigstens einem D-Aminosäurerest einer von Aβ abgeleiteten peptidischen Struktur aus D-Aminosäuren, oder mit einer peptidischen oder peptidmimetischen Region, die die Kerndomäne flankiert, gekoppelt sein (z. B. über die Epsilon-Aminogruppe eines Lysinrestes/von Lysinresten, über die Carboxylgruppe eines Asparaginsäurerestes/von Asparaginsäureresten oder eines Glutaminsäurerestes/von Glutaminsäureresten, über eine Hydroxygruppe eines Tyrosylrestes/von Tyrosylresten, eines Serinrestes/von Serinresten oder eines Threoninrestes/von Threoninresten, oder andere geeignete reaktive Gruppen einer Aminosäure-Seitenkette). Modifizierende Gruppen, die kovalent mit den peptidischen Strukturen aus D-Aminosäuren gekoppelt sind, können mit Hilfe und unter Verwendung von Verfahren angefügt werden, die aus dem Stand der Technik zur Verknüpfung chemischer Strukturen, einschließlich z. B. Amid-, Alkylamino-, Carbamat-, Harnstoff- oder Ester-Bindungen, bekannt sind.
Die Bezeichnung „modifizierende Gruppe" soll Gruppen umfassen, die von Natur aus nicht mit natürlich vorkommenden Aβ-Peptiden in ihrer nativen Form gekoppelt sind. Dementsprechend soll die Bezeichnung „modifizierende Gruppe" nicht Wasserstoff umfassen. Die modifizierende Gruppe wird bzw. die modifizierenden Gruppen werden so ausgewählt, dass die Modulator-Verbindung die Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide verändert und bevorzugt inhibiert, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird, oder die Neurotoxizität natürlicher β-Amyloid-Peptide inhibiert, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird. Obwohl nicht beabsichtigt ist, durch den Mechanismus eingeschränkt zu sein, wird angenommen, dass die modifizierende(n) Gruppe(n) in Ausführungsformen, in denen der Modulator eine modifizierende Gruppe bzw. modifizierende Gruppen umfasst, als Schlüssel-Pharmakophor fungiert, das die Fähigkeit des Modulators, Aβ-Polymerisation zu unterbrechen, verstärkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die modifizierende Gruppe bzw. umfassen die modifizierenden Gruppen eine zyklische, heterozyklische, polyzyklische oder verzweigte Alkyl-Gruppe. Die Bezeichnung „zyklische Gruppe", die hierin verwendet wird, soll zyklische gesättigte oder ungesättigte (d. h. aromatische) Gruppen umfassen, die von etwa 3 bis 10, bevorzugt etwa 4 bis 8, und noch mehr bevorzugt etwa 5 bis 7 Kohlenstoff-Atome aufweisen. Beispielhafte zyklische Gruppen umfassen Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und Cyclooctyl. Zyklische Gruppen können unsubstituiert oder an einer oder mehreren Ringpositionen substituiert sein. Somit kann eine zyklische Gruppe mit z. B. Halogenen, Alkylen, Cycloalxylen, Alkenylen, Alkynylen, Arylen, Heterozyklen, Hydroxylen, Aminogruppen, Nitrogruppen, Thiolaminen, Iminen, Amiden, Phosphonaten, Phosphinen, Carbonylen, Carboxylen, Silylen, Ethern, Thioethern, Sulfonylen, Sulfonaten, Selenoethern, Ketonen, Aldehyden, Estern, -CF₃, -CN, oder dergleichen substituiert sein.
Die Bezeichnung „heterozyklische Gruppe" soll zyklische gesättigte oder ungesättigte (d. h. aromatische) Gruppen umfassen, die von etwa 3 bis 10, bevorzugt etwa 4 bis 8, und noch mehr bevorzugt etwa 5 bis 7 Kohlenstoff-Atome aufweisen, wobei die Ringstruktur etwa ein bis vier Heteroatome enthält. Heterozyklische Gruppen umfassen Pyrrolidin, Oxolan, Thiolan, Imidazol, Oxazol, Piperidin, Piperazin, Morpholin und Pyridin. Der heterozyklische Ring kann an einer oder mehreren Positionen mit Substituenten, wie z. B. Halogenen, Alkylen, Cycloalkylen, Alkenylen, Alkynylen, Arylen, anderen Heterozyklen, Hydroxyl, Amino, Nitro, Thiol, Aminen, Iminen, Amiden, Phosphonaten, Phosphinen, Carbonylen, Carboxylen, Silylen, Ethern, Thioethern, Sulfonylen, Selenoethern, Ketonen, Aldehyden, Estern, -CF₃, -CN, oder dergleichen substituiert sein. Heterozyklen können auch mit anderen zyklischen Gruppen, wie weiter unten beschrieben, verbrückt oder fusioniert sein.
Die Bezeichnung „polyzyklische Gruppe" die hierin verwendet wird, soll zwei oder mehr gesättigte oder ungesättigte (d. h. aromatische) zyklische Ringe bezeichnen, in denen zwei oder mehr Kohlenstoff-Atome zwei benachbarten Ringen gemein sind, z. B. sind die Ringe „fusionierte Ringe". Ringe, die durch nicht-benachbarte Atome verbunden sind, werden als „verbrückte Ringe" bezeichnet. Jeder der Ringe der polyzyklischen Gruppe kann mit solchen Substituenten, die oben beschrieben sind, wie z. B. Halogenen, Alkylen, Cycloalkylen, Alkenylen, Alkenylen, Alkynylen, Hydroxyl, Amino, Nitro, Thiol, Aminen, Iminen, Amiden, Phosphonaten, Phosphinen, Carbonylen, Carboxylen, Silylen, Ethern, Thioethern, Sulfonylen, Selenoethern, Ketonen, Aldehyden, Estern, -CF₃, -CN, oder dergleichen, substituiert sein.
Eine bevorzugte polyzyklische Gruppe ist eine Gruppe, die eine cis-Decalin-Struktur enthält. Obwohl nicht beabsichtigt ist, durch den Mechanismus eingeschränkt zu sein, wird angenommen, dass die „gekrümmte" Konformation, die auf die modifizierende Gruppe durch die Gegenwart einer cis-Decalin-Struktur übertragen wird, zur Wirksamkeit der modifizierenden Gruppe beim Unterbrechen der Aβ-Polymerisation beiträgt. Dementsprechend können auch andere Strukturen, die die „gekrümmte" Konformation der cis-Decalin-Struktur nachahmen als modifizierende Gruppen eingesetzt werden. Ein Beispiel für eine cis-Decalin enthaltende Struktur, die als modifizierende Gruppe verwendet werden kann, ist eine Cholanoyl-Struktur, wie eine Cholyl-Gruppe. Eine Modulator-Verbindung kann z. B. an deren Aminoterminus mit einer Cholyl-Gruppe durch Reaktion der Aggregations-Kern-Domäne mit Cholsäure, einer Gallensäure, modifiziert sein. Ferner kann eine Modulator-Verbindung an deren Carboxyterminus mit einer Cholyl-Gruppe entsprechend den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren modifiziert sein (siehe z. B. Wess, G. et al. (1993) Tetrahedron Letters, 34:817–822; Wess, G. et al. (1992) Tetrahedron Letters 33:195–198; und Kramer, W. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:18598–18604). Cholyl-Derivate und -Analoga können ebenfalls als modifizierende Gruppen verwendet werden. Ein bevorzugtes Cholyl-Derivat ist z. B. Aic (3-(Ο-aminoethyl-iso)-cholyl), das eine freie Aminogruppe aufweist, die zur weiteren Modifizierung der Modulator-Verbindung verwendet werden kann (z. B. kann eine chelatbildende Gruppe für ^99mTc über die freie Aminogruppe von Aic eingeführt werden). Hierin verwendet soll die Bezeichnung „Cholanoyl-Struktur" die Cholyl-Gruppe und Derivate und Analoga davon umfassen, besonders solche, die eine Vierring-cis-Decalin-Konfiguration beibehalten. Beispiele für Cholanoyl-Strukturen schließen Gruppen, die sich von anderen Gallensäuren, wie z. B. Deoxycholsäure, Lithocholsäure, Ursodeoxycholsäure, Chenodeoxycholsäure und Hyodeoxycholsäure, ableiten, sowie weitere verwandte Strukturen, wie Cholansäure, Bufalin und Resibufogenin (obwohl die beiden letztgenannten Verbindungen nicht bevorzugt als modifizierende Gruppe eingesetzt werden) mit ein. Ein weiteres Beispiel für eine cis-Decalin enthaltende Verbindung ist 5β-Cholestan-3 -ol (das cis-Decalin-Isomer von (+)-Dihydrocholesterol). Zur weiteren Beschreibung von Gallensäure und Steroid-Struktur sowie Nomenklatur siehe Nes, W.R. und McKean, M.L. Biochemistry of Steroids and Other Isopentanoids, University Park Press, Baltimore, MD, Kapitel 2.
Zusätzlich zu cis-Decalin enthaltenden Strukturen können weitere polyzyklische Gruppen als modifizierende Gruppen verwendet werden. Modifizierende Gruppen, die sich von Steroiden oder β-Lactamen ableiten, können z. B. als modifizierende Gruppen geeignet sein. In einer Ausführungsform ist die modifizierende Gruppe eine „Biotinyl-Struktur", die Biotinyl-Gruppen und Analoga und Derivate davon (wie eine 2-Iminobiotinyl-Gruppe) umfasst. In einer weiteren Ausführungsform kann die modifizierende Gruppe eine „Fluoreszein enthaltende Gruppe" umfassen, wie eine Gruppe, die sich davon ableitet, dass man eine von A abgeleitete peptidische Struktur mit 5-(und 6-)-Carboxyfluorescein, Succinimidylester oder Fluorescein-Isothiocyanat, umsetzt. In verschiedenen weiteren Ausführungsformen kann die modifizierende Gruppe bzw. können die modifizierenden Gruppen eine N-Acetylneuraminyl-Gruppe, eine trans-4-Cotinincarboxyl-Gruppe, eine 2-Imino-1-imidazolidinacetyl-Gruppe, eine (S)-(–)-Indolin-2-carboxyl-Gruppe, eine (–)-Menthoxyacetyl-Gruppe, eine 2-Norbornanacetyl-Gruppe, ein γ-Oxo-5-acenaphthenbutyryl, eine (–)-2-Oxo-4-thiazolidincarboxyl-Gruppe, eine Tetrahydro-3-furoyl-Gruppe, eine 2- Iminobiotinyl-Gruppe, eine Diethylentriaminpentaacetyl-Gruppe, eine 4-Morpholincarbonyl-Gruppe, eine 2-Thiophenacetyl-Gruppe oder eine 2-Thiophensulfonyl-Gruppe umfassen.
Zusätzlich zu den oben diskutierten zyklischen, heterozyklischen und polyzyklischen Gruppen können andere Arten von modifizierenden Gruppen in einem Modulator der Erfindung verwendet werden. Geeignete modifizierende Gruppen können z. B. hydrophobe Gruppen und verzweigte Alkylgruppen sein. Beispiele umfassen Acetylgruppen, Phenylacetyl-Gruppen, Diphenylacetyl-Gruppen, Triphenylacetyl-Gruppen, Isobutanoyl-Gruppen, 4-Methylvaleryl-Gruppen, trans-Cinnamoyl-Gruppen, Butanoyl-Gruppen und 1-Adamantancarbonyl-Gruppen.
Noch eine weitere Art einer modifizierenden Gruppe ist eine Verbindung, die eine nicht-natürliche Aminosäure enthält, die als Beta-Mimetika fungiert, wie eine auf Dibenzofuran basierende Aminosäure, wie bei Tsang, K.Y. et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:3988–4005; Diaz, H. und Kelly J.W. (1991) Tetrahedron Letters 41:5725–5728; und Diaz, H. et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:8316–8318 beschrieben. Ein Beispiel für solch eine modifizierende Gruppe ist eine Peptid-Aminoethyldibenzofuranyl-Propionsäure- (ADP-) Gruppe (z. B. DDIIL-Adp) (SEQ ID NO: 31). Diese Art von modifizierender Gruppe kann eine oder mehrere N-Methyl-Peptidbindungen umfassen, die zur Einführung von zusätzlicher sterischer Hinderung bei der Aggregation von natürlichem β-AP dienen, wenn Verbindungen dieser Art mit natürlichem β-AP interagieren.

Nicht-einschränkende Beispiele geeigneter modifizierender Gruppen, mit ihren dazugehörigen modifizierenden Reagenzien sind nachstehend aufgeführt:

Modifizierende Gruppe	Modifizierendes Reagenz
Cholyl-	Cholsäure
Lithocholyl-	Lithocholsäure
Hyodeoxycholyl-	Hyodeoxycholsäure
Chenodeoxycholyl-	Chenodeoxycholsäure
Ursodeoxycholyl-	Ursodeoxycholsäure
3-Hydrocinnamoyl-	3-Hydroxyzimtsäure
4-Hydroxycinnamoyl-	4-Hydroxyzimtsäure
2-Hydroxycinnamoyl-	2-Hydroxyzimtsäure
3-Hydroxy-4-methoxycinnamoyl-	3-Hydroxy-4-methoxyzimtsäure

4-Hydroxy-3-methoxycinnamoyl-	4-Hydroxy-3-methoxyzimtsäure
2-Carboxycinnamoyl-	2-Carboxyzimtsäure
3-Formylbenzoyl-	3-Carboxybenzaldehyd
4-Formylbenzoyl-	4-Carboxybenzaldehyd
3,4-Dihydroxyhydrocinnamoyl-	3,4-Dihydroxyhydrozimtsäure
3,7-Dihydroxy-2-naphthoyl-	3,7-Dihydroxy-2-naphthoesäure
4-Formylcinnamoyl-	4-Formylzimtsäure
2-Formylphenoxyacetyl-	2-Formylphenoxyessigsäure
8-Formyl-1-naphthoyl-	1,8-Naphthaldehydsäure
4-(Hydroxymethyl)benzoyl-	4-(Hydroxymethyl)benzoesäure
4-Hydroxyphenylacetyl-	4-Hydroxyphenylessigsäure
3-Hydroxybenzoyl-	3-Hydroxybenzoesäure
4-Hydroxybenzoyl-	4-Hydroxybenzoesäure
5-Hydantoinacetyl-	5-Hydantoinessigsäure
L-Hydroorotyl-	L-Hydroorotsäure
4-Methylvaleryl-	4-Methylvaleriansäure
2,4-Dihydroxybenzoyl-	2,4-Dihydroxybenzoesäure
3,4-Dihydroxycinnamoyl-	3,4-Dihydroxyzimtsäure
3,5-Dihydroxy-2-naphthoyl-	3,5-Dihydroxy-2-naphthoesäure
3-Benzoylpropanoyl-	3-Benzoylpropionsäure
trans-Cinnamoyl-	trans-Zimtsäure
Phenylacetyl-	Phenylessigsäure
Diphenylacetyl-	Diphenylessigsäure
Triphenylacetyl-	Triphenylessigsäure
2-Hydroxyphenylacetyl-	2-Hydroxyphenylessigsäure
3-Hydroxyphenylacetyl-	3-Hydroxyphenylessigsäure
4-Hydroxyphenylacetyl-	4-Hydroxyphenylessigsäure
(±)-Mandelyl-	(±)-Mandelsäure
(±)-2,4-Dihydroxy-3,3-	(±)-Pantolacton
dimethylbutanoyl-
Butanoyl-	Buttersäureanhydrid
Isobutanoyl-	Isobuttersäureanhydrid
Hexanoyl-	Hexansäureanhydrid
Propionyl-	Propionsäureanhydrid
3-Hydroxybutyroyl-	β-Butyrolacton
4-Hydroxybutyroyl-	γ-Butyrolacton
3-Hydroxypropionyl-	β-Propiolacton
2,4-Dihydroxybutyroyl-	-Hydroxy-β-butyrolacton
1-Adamantancarbonyl-	1-Adamantancarbonsäure
Glycolyl-	Glykolsäure
DL-3-(4-Hydroxyphenyl)lactyl-	DL-3-(4-Hydroxyphenyl)milchsäure
3-(2-Hydroxyphenyl)propionyl-	3-(2-Hydroxyphenyl)propionsäure
4-(2-Hydroxyphenyl)propionyl-	4-(2-Hydroxyphenyl)propionsäure
D-3-Phenyllactyl-	D-3-Phenylmilchsäure
Hydrocinnamoyl-	Hydrozimtsäure
3-(4-Hydroxyphenyl)propionyl-	3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure
L-3-Phenyllactyl-	L-3-Phenylmilchsäure
4-Methylvaleryl	4-Methylvaleriansäure
3-Pyridylacetyl-	3-Pyridylessigsäure

4-Pyridylacetyl-	4-Pyridylessigsäure
Isonicotinoyl-
4-Chinolincarboxyl-	4-Chinolincarbonsäure
1-Isochinolincarboxyl-	1-Isochinolincarbonsäure
3-Isochinolincarboxyl-	3-Isochinolincarbonsäure

Bevorzugte modifizierende Gruppen umfassen cis-Decalin enthaltende Gruppen, Biotin enthaltende Gruppen, Fluorescein enthaltende Gruppen, eine Diethylentriaminpentaacetyl-Gruppe, eine (–)-Menthoxyacetyl-Gruppe, eine N-Acetylneuraminyl-Gruppe, eine Phenylacetyl-Gruppe, eine Diphenylacetyl-Gruppe, eine Triphenylacetyl-Gruppe, eine Isobutanoyl-Gruppe, eine 4-Methylvaleryl-Gruppe, eine 3-Hydroxyphenylacetyl-Gruppe, eine 2-Hydroxyphenylacetyl-Gruppe, eine 3,5-Dihydroxy-2-naphthoyl-Gruppe, eine 3,4-Dihydroxycinnamoyl-Gruppe, eine (±)-Mandelyl-Gruppe, eine (±)-Mandelyl-(±)-mandelyl-Gruppe, eine Glycolyl-Gruppe, eine Benzoylpropanoyl-Gruppe und eine 2,4-Dihydroxybenzoyl-Gruppe.
III. Zusätzliche chemische Modifikationen von Aβ-Modulatoren
Eine β-Amyloid-Modulator-Verbindung der Erfindung kann weitergehend modifiziert sein, um die spezifischen Eigenschaften der Verbindung zu ändern, wobei die Fähigkeit der Verbindung die Aβ-Aggregation zu verändern und die Aβ-Neurotoxizität zu inhibieren bewahrt bleibt. In einer Ausführungsform ist die Verbindung z. B. weiter modifiziert, um eine pharmakokinetische Eigenschaft der Verbindung, wie z. B. die in vivo-Stabilität oder -Halbwertszeit, zu verändern. In einer weiteren Ausführungsform ist die Verbindung weiter modifiziert, um die Verbindung mit einer detektierbaren Substanz zu markieren. In noch einer weiteren Ausführungsform ist die Verbindung weiter modifiziert, um die Verbindung an eine zusätzliche therapeutisch wirksame Gruppe zu koppeln. Schematisch beschrieben kann ein Modulator der Erfindung, der eine Aβ-Aggregations-Kern-Domäne aus D-Aminosäuren umfasst, die direkt oder indirekt mit wenigstens einer modifizierenden Gruppe verknüpft ist, als MG-ACD beschrieben werden, wohingegen diese, zur Änderung der Eigenschaften des Modulators weiterführend modifizierte Verbindung als MG-ACD-CM beschrieben werden kann, wobei CM eine zusätzliche chemische Modifikation darstellt.
Um die Verbindung weiter chemisch zu modifizieren, so dass die pharmakokinetischen Eigenschaften der Verbindung verändert werden, können reaktive Gruppen derivatisiert werden. Wenn die modifizierende Gruppe z. B. mit dem aminoterminalen Ende der Aggregations-Kern-Domäne verknüpft ist, kann das carboxyterminale Ende der Verbindung weiter modifiziert werden. Bevorzugte carboxyterminale Modifikationen umfassen solche, die die Fähigkeit der Verbindung als ein Substrat für Carboxypeptidasen zu fungieren, reduzieren. Beispiele für bevorzugte C-terminale Modifikatoren umfassen eine Amidgruppe (d. h. ein Peptidamid), eine Alkyl- oder Arylamidgruppe (z. B. eine Ethylamidgruppe oder eine Phenethylamidgruppe), eine Hydroxygruppe (d. h. ein Peptidalkohol) und verschiedene nicht-natürliche Aminosäuren, wie D-Aminosäuren und β-Alanin. Wenn die modifizierende Gruppe mit dem carboxyterminalen Ende der Aggregations-Kern-Domäne verknüpft ist, kann alternativ das aminoterminale Ende der Verbindung weiter modifiziert sein, um z. B. die Fähigkeit der Verbindung als Substrat für Aminopeptidasen zu fungieren, zu reduzieren.
Eine Modulator-Verbindung kann weiter modifiziert sein, um die Verbindung durch Reaktion der Verbindung mit einer detektierbaren Substanz, zu markieren. Geeignete detektierbare Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierende Stoffe, lumineszierende Stoffe und radioaktive Stoffe. Beispiele für geeignete Enzyme umfassen Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Galaktosidase oder Acetylcholinesterase; Beispiele für geeignete Komplexe prosthetischer Gruppen umfassen Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin; Beispiele für geeignete fluoreszierende Stoffe umfassen Umbelliferon, Fluorescein, Fluorescein-Isothiocyanat, Rhodamin, Dichlorotriazinylamin-Fluorescein, Dansylclorid oder Phycoerythrin; ein Beispiel für einen lumineszierenden Stoff umfasst Luminol; und Beispiele für geeignete radioaktive Stoffe umfassen ¹⁴C, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ^99mTc, ³⁵S oder ³H. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Modulator-Verbindung mit ¹⁴C radioaktiv markiert, entweder durch den Einbau von ¹⁴C in die modifizierende Gruppe oder in eine oder mehrere Aminosäure-Strukturen der Modulator-Verbindung. Markierte Modulator-Verbindungen können verwendet werden, um die Pharmakokinetiken der Verbindungen in vivo zu bestimmen sowie die Aβ-Aggregation, z. B. zu diagnostischen Zwecken, zu messen. Aβ-Aggregation kann unter Verwen dung einer markierten Modulator-Verbindung entweder in vivo oder in einer in vitro-Probe, die von einem Subjekt stammt, gemessen werden.
Bevorzugterweise wird die Modulator-Verbindung für die Verwendung als ein in vivo-Diagnosemittel mit radioaktivem Technetium oder Iod markiert. Dementsprechend sieht die Erfindung in einer Ausführungsform eine Modulator-Verbindung vor, die mit Technetium, bevorzugt mit ^99mTc, markiert ist. Verfahren zur Markierung von Peptidverbindungen mit Technetium sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. US-Patent-Nrn. 5,443,815,5,225,180 und 5,405,597, alle von Dean et al., Stepniak-Biniakiewicz, D., et al. (1992) J. Med. Chem. 35:274–279; Fritzberg, A.R., et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4025–4029; Baidoo, K.E., et al. (1990) Cancer Res. Suppl. 50:799s–803s; und Regan, L. und Smith, C.K. (1995) Science 270:980–982). Es kann eine modifizierende Gruppe ausgewählt werden, die eine Stelle bereitstellt, in die eine chelatbildende Gruppe für ^99mTc eingeführt werden kann, wie das Aic-Derivat von Cholsäure, das eine freie Aminogruppe aufweist. In einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung eine Modulator-Verbindung vor, die mit radioaktivem Iod markiert ist. Zum Beispiel kann ein Phenylalanin-Rest innerhalb der Aβ-Sequenz (wie Phe₁₉ oder Phe₂₀) durch radioaktives Iodotyrosyl ersetzt sein. Jedes der verschiedenen Isotope von radioaktivem Iod kann eingebaut werden, um ein Diagnosemittel zu erzeugen. Bevorzugterweise wird ¹²³I (Halbwertszeit = 13,2 Stunden) für Ganzkörper-Szintigraphie, ¹²⁴I (Halbwertszeit = 4 Tage) für Positron-Emissions-Tomographie (PET), ¹²⁵I (Halbwertszeit = 60 Tage) für Stoffwechselumsatz-Untersuchungen und ¹³¹I (Halbwertszeit = 8 Tage) für Ganzkörperzählung und zeitverzögerte niedrigauflösende Imaging-Untersuchungen (low resolution imaging studies) verwendet.
Ferner kann eine zusätzliche Modifikation einer Modulator-Verbindung dazu dienen, der Verbindung eine zusätzliche therapeutische Eigenschaft zu verleihen. Das bedeutet, dass die zusätzliche chemische Modifikation eine zusätzliche funktionelle Gruppe umfassen kann. Zum Beispiel kann eine funktionelle Gruppe, die dazu dient, Amyloid-Plaques abzubauen oder aufzulösen, an die Modulator-Verbindung gekoppelt sein. In dieser Form dient der MG-ACD-Teil des Modulators dazu, die Verbindung auf die Aβ-Peptide anzusteuern und die Polymerisation der Aβ-Peptide zu unterbrechen, wohingegen die zusätzliche funktionelle Gruppe dazu dient, Amyloid-Plaques abzubauen oder aufzulösen, nachdem die Verbindung an diese Stellen gesteuert worden ist.
In einer alternativen chemischen Modifikation wird eine β-Amyloid-Verbindung der Erfindung in Form einer „Medikamentenvorstufe" hergestellt, wobei die Verbindung selbst die Aβ-Aggregation nicht moduliert, sondern vielmehr durch Stoffwechsel in vivo in eine hierin definierte β-Amyloid-Modulator-Verbindung umgewandelt werden kann. Bei dieser Art von Verbindung kann die modulierende Gruppe z. B. in Form einer Medikamentenvorstufe vorliegen, die durch Stoffwechsel in die Form einer aktiv modulierenden Gruppe umgewandelt werden kann. Solch eine Form einer Medikamentenvorstufe einer modifizierenden Gruppe wird hierin als „sekundär modifizierende Gruppe" bezeichnet. Eine Vielzahl an Strategien zur Herstellung von Medikamentenvorstufen auf Peptidbasis sind aus dem Stand der Technik bekannt, die den Stoffwechsel einschränken, um die Zufuhr der aktiven Form des Peptid-basierenden Medikaments zu optimieren (siehe z. B. Moss, J. (1995) in Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Taylor, M.D. und Amidon, G.L. (Herausgeber), Kapitel 18). Zusätzliche Strategien wurden speziell dafür entwickelt, die Versorgung des ZNS auf der Basis von „sequenziellem Stoffwechsel" zu erreichen (siehe z. B. Bodor, N. et al. (1992) Science 257:1698–1700; Prokai, L. et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:2643–2644; Boder, N. und Prokai, L. (1995) in pepide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Taylor, M.D. und Amidon, G.L. (Herausgeber), Kapitel 14). In einer Ausführungsform einer Medikamentenvorstufen-Form eines Modulators der Erfindung umfasst die modifizierende Gruppe einen Alkylester, um Durchlässigkeit durch die Blut-Hirnschranke zu ermöglichen.
Modulator-Verbindungen der Erfindung können mit Standardtechniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden. Die Peptid-Komponente eines Modulators kann mit Standardtechniken, wie sie z. B. in Bodansky, M. Principles of Pepide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) und Grant, G.A. (Herausgeber), Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman and Company, New York (1992) beschrieben sind, hergestellt werden. Automatisierte Peptidsynthese-Apparate sind kommerziell erhältlich (z. B. Advan ced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). Zusätzlich können eine oder mehrere modulierende Gruppen mit der von Aβ abgeleiteten peptidischen Komponente (z. B. einer Aβ-Aggregations-Kern-Domäne) durch Standardverfahren verknüpft sein, z. B. durch Verfahren, bei denen die Reaktion über eine Aminogruppe (z. B. die alpha-Aminogruppe am Aminoterminus eines Peptids), eine Carboxylgruppe (z. B. am Carboxyterminus eines Peptids), eine Hydroxylgruppe (z. B. an einem Tyrosin-, Serin- oder Threoninrest) oder andere geeignete reaktive Gruppen einer Aminosäure-Seitenkette erfolgt (siehe z. B. Greene, T.W. und Wuts, P.G.M. protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Inc., New York (1991)). Beispielhafte Synthesen von β-Amyloid-Modulatoren aus D-Aminosäuren sind weiterführend in Beispiel 1 beschrieben.
IV. Screening-Assays
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auswahl eines Modulators von β-Amyloid-Aggregation. In dem Verfahren wird eine Testverbindung mit natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht, die Aggregation der natürlichen β-AP gemessen und ein Modulator auf der Grundlage der Fähigkeit der Testverbindung die Aggregation von natürlichem β-AP zu verändern (z. B. die Aggregation zu hemmen oder zu fördern), ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform, wird die Testverbindung mit einem molaren Überschuss von natürlichem β-AP in Kontakt gebracht. Die Menge und/oder Geschwindigkeit natürlicher β-AP-Aggregation in Gegenwart der Testverbindung kann durch einen hierin beschriebenen, geeigneten Assay bestimmt werden, der β-AP-Aggregation anzeigt (siehe z. B. Beispiel 2).
In einem bevorzugten Assay wird natürliches β-AP in Gegenwart der Testverbindung gelöst, und die Aggregation von natürlichem β-AP in einem Keimbildungs-Assay (siehe Beispiel 2) bestimmt, wobei man die Trübung der Lösung im Verlauf der Zeit, die durch die scheinbare optische Dichte der Lösung bei 405 nm gemessen werden kann, bestimmt (weiterführend beschrieben in Beispiel 2; siehe auch Jarrett et al. (1993) Biochemistry 32:4693–4697). Bei Abwesenheit eines β-Amyloid-Modulators bleibt die A_405nm der Lösung während einer Lag-Zeit, in der die β-AP in Lösung bleiben, typischerweise relativ konstant, danach steigt allerdings die A_405nm der Lösung schnell an, da die β-AP aggregieren und aus der Lösung ausfallen, wobei schließlich ein Plateauwert erreicht wird (d. h. die A_405nm der Lösung zeigt im Zeitverlauf sigmoidale Kinetik). Im Gegensatz dazu ist die A_405nm der Lösung in Gegenwart einer Testverbindung, die β-AP-Aggregation inhibiert, vermindert, verglichen damit, wenn kein Modulator vorhanden ist. Daher kann die Lösung in Gegenwart des inhibitorischen Modulators eine erhöhte Lag-Zeit, einen geringeren Anstieg an Aggregation und/oder einen niedrigeren Plateauwert zeigen, verglichen damit, wenn kein Modulator vorhanden ist. Dieses Verfahren zur Auswahl eines Modulators von β-Amyloid-Polymerisation kann auf ähnliche Weise verwendet werden, um nach Modulatoren zu selektieren, die die β-AP-Aggregation fördern. Daher ist die A_405nm der Lösung in Gegenwart eines Modulators, der die β-AP-Aggregation fördert, erhöht, verglichen damit, wenn kein Modulator vorhanden ist (z. B. kann die Lösung eine verkürzte Lag-Zeit, einen geringeren Anstieg an Aggregation und/oder einen höheren Plateauwert zeigen, verglichen damit, wenn kein Modulator vorhanden ist).
Ein weiterer Assay, der zur Verwendung in dem Screening-Verfahren der Erfindung geeignet ist, ein „seeded extension assay", ist ebenfalls weiterführend in Beispiel 2 beschrieben. In diesem Assay werden β-AP-Monomer und in einem Impfkeim aggregiertes β-AP in Gegenwart und bei Abwesenheit einer Testverbindung vereinigt, und das Ausmaß der β-Fibrillen-Bildung wird auf der Grundlage erhöhter Emission des Farbstoffs Thioflavin D bei Kontakt mit β-AP-Fibrillen untersucht. Ferner kann die β-AP-Aggregation durch Elektronenmikroskopie (EM) des β-AP-Präparats in Gegenwart oder bei Abwesenheit des Modulators bestimmt werden. Zum Beispiel ist die Bildung von β-Amyloid-Fibrillen, die durch EM detektierbar ist, in Gegenwart eines Modulators, der die β-AP-Aggregation inhibiert, vermindert (d. h. die Menge oder Anzahl an β-Fibrillen in Gegenwart des Modulators ist vermindert), wohingegen die Bildung von β-Fibrillen in Gegenwart eines Modulators, der die β-AP-Aggregation fördert, erhöht ist (d. h. die Menge oder Anzahl an β-Fibrillen in Gegenwart des Modulators ist erhöht).
Ein weiterer bevorzugter Assay zur Verwendung in dem Screening-Verfahren der Erfindung zur Auswahl geeigneter Modulatoren ist der in Beispiel 3 beschriebene Neurotoxizitäts-Assay. Es werden Verbindungen selektiert, die die Bildung von neurotoxischen Aβ-Aggregaten inhibieren und/oder die Neurotoxizität von vorgebildeten Aβ-Fibrillen inhibieren. Dieser Neurotoxizitäts-Assay wird als Neurotoxizität in vivo Prognostizierend betrachtet. Dementsprechend weist eine inhibitorische Aktivität einer Modulator-Verbindung in dem in vitro-Neurotoxizitäts-Assay auf ähnliche inhibitorische Aktivität der Verbindung auf Neurotoxizität in vivo hin.
V. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen aus den β-Amyloid-Modulator-Verbindungen der Erfindung. In einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung eine β-Amyloid-Modulator-Verbindung in einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge, die ausreicht, um die Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden zu verändern, und bevorzugt zu inhibieren, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung eine β-Amyloid-Modulator-Verbindung in einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge, die ausreicht, um die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden zu inhibieren, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Eine „therapeutisch wirksame Menge" verweist auf eine Menge, die in nötigen Dosierungen und über nötige Zeiträume hinweg, wirksam ist, um das gewünschte therapeutische Ergebnis, wie die Reduktion oder Umkehrung der β-Amyloid-Ablagerung und/oder die Reduktion oder Aufhebung der Aβ-Neurotoxizität, zu erreichen. Eine therapeutisch wirksame Menge eines Modulators kann aufgrund von Faktoren wie dem Krankheitsstadium, Alter, Geschlecht und Gewicht des Individuums, und der Fähigkeit des Modulators, eine gewünschte Antwort im Individuum hervorzurufen, variieren. Die Verordnung der Dosis kann so angepasst werden, dass die optimale therapeutische Antwort ausgelöst wird. Eine therapeutisch wirksame Menge zeichnet sich auch dadurch aus, dass jegliche toxischen oder nachteiligen Effekte des Modulators von den therapeutisch vorteilhaften Effekten übertroffen werden. Die mögliche Neurotoxizität des Modu lators der Erfindung kann mit dem auf Zellen basierenden Assay, der in Beispiel 6 beschrieben ist, untersucht, und ein therapeutisch wirksamer Modulator, der keine signifikante Neurotoxizität zeigt, selektiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine therapeutisch wirksame Menge eines Modulators ausreichend, um die Aggregation eines molaren Überschusses natürlicher β-Amyloid-Peptide zu verändern und bevorzugt zu inhibieren. Eine „prophylaktisch wirksame Menge" verweist auf eine Menge, die in nötigen Dosierungen und über nötige Zeiträume hinweg, wirksam ist, um die gewünschten prophylaktischen Ergebnisse zu erhalten, wie die Vorbeugung vor oder der Hemmung der Geschwindigkeit von β-Amyloid-Ablagerung und/oder Aβ-Neurotoxizität in einem Subjekt, das für β-Amyloid-Ablagerung prädisponiert ist. Eine prophylaktisch wirksame Menge kann, wie oben für die therapeutisch wirksame Menge beschrieben, ermittelt werden. Typischerweise wird die prophylaktisch wirksame Menge niedriger sein als die therapeutisch wirksame Menge, da eine prophylaktische Dosis Subjekten vor oder zu einem früheren Krankheitsstadium verabreicht wird.
Ein Faktor, der bei der Ermittlung einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge eines β-Amyloid-Modulators berücksichtigt werden sollte, ist die Konzentration von natürlichem β-AP in einem biologischen Kompartiment eines Subjekts, wie in der zerebrospinalen Flüssigkeit (CSF) des Subjekts. Die Konzentration von natürlichem β-AP in der CSF wurde auf 3 nM geschätzt (Schwartzman (1994) proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8368–8372). Ein nicht-einschränkender Bereich für eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines β-Amyloid-Modulators ist 0,01 nM–10 μM. Es soll angemerkt werden, dass die Dosiswerte mit der Schwere des zu lindernden Zustands variieren können. Es sollte sich ebenfalls verstehen, dass für jedes einzelne Subjekt spezifische Dosis-Verordnungen, entsprechend den individuellen Bedürfnissen und dem professionellen Urteilsvermögen der Person, die die Verabreichung der Zusammensetzungen durchführt oder überwacht, mit der Zeit eingestellt werden sollten, und dass die Dosisbereiche, die hierin dargelegt sind, nur beispielhaft sind und nicht den Rahmen oder die Anwendung der beanspruchten Zusammensetzung einschränken sollen.
Die Menge an der aktiven Verbindung in der Zusammensetzung kann gemäß Faktoren, wie dem Krankheitsstadium, Alter, Geschlecht und Gewicht des Individuums variieren, wobei jeder dieser Faktoren die Menge von natürlichem β-AP in dem Individuum beeinflussen kann. Die Verordnung der Dosis sollte so eingestellt werden, dass die optimale therapeutische Antwort ausgelöst wird. Zum Beispiel können ein einzelner Bolus oder mehrere getrennte Dosen mit der Zeit verabreicht werden, oder die Dosis kann proportional verringert oder gesteigert werden, wie durch die Erfordernisse der therapeutischen Situation indiziert ist. Es ist besonders vorteilhaft, parenterale Zusammensetzungen in Form von Dosiseinheiten aus Gründen der Einfachheit der Verabreichung und Einheitlichkeit der Dosierung zu formulieren. Hierin verwendet verweist Dosiseinheit auf physikalisch getrennte Einheiten, die sich als einheitliche Dosierungen für das zu behandelnde Säuger-Subjekt eignen, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge einer aktiven Verbindung enthält, die so berechnet wird, dass sie die gewünschte therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger hervorruft. Die Spezifizierung der Form der Dosiseinheiten der Erfindung wird vorgeschrieben von und ist abhängig von (a) den einzelnen Charakteristika der aktiven Verbindung und dem speziellen zu erreichenden therapeutischen Effekt, und (b) den Einschränkungen, die sich zwangsläufig aus der Technik des Zusammensetzens solch einer aktiven Verbindung zur Behandlung von Sensitivität in Individuen ergeben.
Hierin verwendet umfasst „pharmazeutisch verträglicher Träger" jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Überzüge, antibakterielle und antifungale Mittel, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel, und dergleichen, die physiologisch verträglich sind. In einer Ausführungsform ist der Träger für die parenterale Verabreichung geeignet. Bevorzugterweise ist der Träger zur Verabreichung in das zentrale Nervensystem geeignet (z. B. intraspinal oder intrazerebral). Alternativ kann der Träger für intravenöse, intraperitoneale oder intramuskuläre Verabreichung geeignet sein. In einer weiteren Ausführungsform ist der Träger für die orale Verabreichung geeignet. Pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver zur Instant-Herstellung von sterilen, injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substan zen ist aus dem Stand der Technik wohlbekannt. Außer insoweit irgendein herkömmliches Medium oder Mittel mit der aktiven Verbindung unverträglich ist, ist dessen Verwendung in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung in Betracht zu ziehen. Zusätzliche aktive Verbindungen können ebenfalls in den Zusammensetzungen enthalten sein.
Therapeutische Zusammensetzungen müssen üblicherweise steril und stabil unter den Bedingungen von Herstellung und Lieferung sein. Die Zusammensetzung kann als eine Lösung, eine Mikroemulsion, ein Liposom, oder eine andere geordnete Struktur, die für hohe Arzneimittelkonzentrationen geeignet ist, formuliert sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, dass z. B. Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerol, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und dergleichen) und geeignete Mischungen davon enthalten kann. Das angemessene Fließvermögen kann zum Beispiel durch die Verwendung eines Films, wie Lecithin, durch die Erhaltung der erforderlichen Teilchengröße im Fall von Dispersionen und durch die Verwendung von Tensiden aufrechterhalten werden. In vielen Fällen wird es bevorzugt sein isotonische Mittel, z. B. Zucker, Polyalkohole, wie Manitol, Sorbitol, oder Natriumchlorid in die Zusammensetzung mit aufzunehmen. Die verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann dadurch herbeigeführt werden, dass man in die Zusammensetzung ein Mittel mit einfügt, dass die Absorption verzögert, z. B. Monostearatsalze und Gelatine. Ferner können die Modulatoren in einer Depot-Formulierung verabreicht werden, z. B. in einer Zusammensetzung, die ein langsam freisetzendes Polymer enthält. Die aktiven Verbindungen können mit Trägern angesetzt sein, die die Verbindung vor schneller Freisetzung schützen, wie eine gesteuerte Freisetzungs-Formulierung, einschließlich Implantaten und mikroverkapselten Abgabesystemen. Biodegradierbare, biologisch verträgliche Polymere, wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglykolsäure, Kollagen, Polyorthoester, Polymilchsäure und Polylaktid, polyglykolische Copolymere (PLG) können eingesetzt werden. Viele Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen sind patentiert oder dem Fachmann bekannt.
Sterile injizierbare Lösungen können durch Einfügen der aktiven Verbindung (z. B. des β-Amyloid-Modulators) in der erforderlichen Menge in ein geeignetes Lösungsmittel, nach Bedarf, mit einem oder einer Kombination der oben aufgeführten Bestandteile, gefolgt von Filter-Sterilisation, hergestellt werden. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einfügen der aktiven Verbindung in ein steriles Medium, das ein Basis-Dispersionsmedium und die erforderliche anderen dieser oben aufgeführten Bestandteile enthält, hergestellt. Für den Fall, dass sterile Pulver für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen verwendet werden, sind die bevorzugten Verfahren zur Herstellung Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung, wobei ein Pulver des aktiven Bestandteils plus zusätzlicher gewünschter Bestandteile aus einer vorher sterilfiltrierten Lösung davon, erhalten wird.
Eine Modulator-Verbindung der Erfindung kann mit einer oder mehreren zusätzlichen Verbindungen formuliert werden, die die Löslichkeit der Modulator-Verbindung erhöhen. Bevorzugte Verbindungen, die zur Formulierungen zugegeben werden können, um die Löslichkeit der Modulatoren zu erhöhen, sind Cyclodextrin-Derivate, bevorzugt Hydroxypropyl-γ-cyclodextrin. Cyclodextrin-Derivat enthaltende Trägersubstanzen für die Medikamentenzufuhr zur Abgabe von Peptiden an das zentrale Nervensystem, sind in Bodor, N. et al. (1992) Science 257:1698–1700 beschrieben. Bei den hierin beschriebenen β-Amyloid-Modulatoren erhöht die Einbeziehung von Hydroxyl-γ-cyclodextrin in einer Konzentration von 50–200 mM in die Formulierung, die Wasserlöslichkeit der Verbindungen. Zusätzlich zur erhöhten Löslichkeit kann die Einbeziehung eines Cyclodextrin-Derivats in die Formulierung andere vorteilhafte Wirkungen haben, da berichtet wurde, dass β-Cyclodextrin selbst mit dem Aβ-Peptid interagiert und die Fibrill-Bildung in vitro inhibiert (Camilleri, P., et al. (1994) FEBS Letters 341:256–258). Dementsprechend kann die Verwendung einer Modulator-Verbindung der Erfindung in Verbindung mit einem Cyclodextrin-Derivat stärkere Inhibierung von Aβ-Aggregation zur Folge haben, als wenn der Modulator alleine eingesetzt wird. Chemische Modifikationen von Cyclodextrinen sind aus dem Stand der Technik bekannt (Hanessian, S., et al. (1995) J. Org. Chem. 60:4786–4797). Zusätzlich zur Verwendung als Additiv in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen Modulator der Erfindung enthält, können Cyclodextrin-Derivate auch als modifizierende Gruppen dienlich sein und dementsprechend auch kovalent an eine Aβ-Peptid-Verbindung gekoppelt werden, um eine Modulator-Verbindung der Erfindung zu bilden.
Eine weitere bevorzugte Formulierung der Modulator-Verbindung zur Steigerung der Aufnahme ins Gehirn umfasst das Detergenz Tween-80, Polyethylenglycol (PEG) und Ethanol in einer Salzlösung. Ein nicht-einschränkendes Beispiel solch einer bevorzugten Formulierung ist 0,16% Tween-80, 1,3% PEG-3000 und 2% Ethanol in Salzlösung.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine pharmazeutische Zusam mensetzung, die einen Modulator der Erfindung enthält, so formuliert, dass der Modulator durch die Blut-Hirn-Schranke (blood-brain barrier, BBB) transportiert wird. Verschiedene Strategien, die aus dem Stand der Technik zur Steigerung des Transports durch die BBB bekannt sind, können an die Modulatoren der Erfindung angepasst werden, um dadurch den Transport der Modulatoren durch die BBB zu steigern (für Übersichtsartikel für solche Strategien siehe z. B. Pardridge, W.M. (1994) Trends in Biotechnol. 12:239–245; Van Bree, J.B. et al. (1993) pharm. World Sci. 15:2–9; und Pardridge, W.M. et al. (1992) Pharmacol. Toxicol. 71:3–10). In einem Ansatz wird der Modulator unter Bildung einer Medikamenten-Vorstufe mit gesteigertem Transmembran-Transport chemisch modifiziert. Geeignete chemische Modifikationen umfassen die kovalente Verknüpfung einer Fettsäure mit dem Modulator über eine Amid- oder Ester-Bindung (siehe z. B. US-Patent 4,933,324 und PCT-Veröffentlichung WO 89/07938, beide von Shashoua; US-Patent 5,284,876 von Hesse et al.; Toth, I. et al. (1994) J. Drug Target 2217–239; und Shashoua, V.E. et al. (1984) J. Med. Chem. 27:659–664) und die Glycosylierung des Modulators (siehe z. B. US-Patent 5,260,308 von Poduslo et al.). Ebenso können N-Acylaminosäure-Derivate in einem Modulator zur Bildung einer „lipidischen" Medikamenten-Vorstufe eingesetzt werden (siehe z. B. 5,112,863 von Hashimoto et al.).
In einem weiteren Ansatz zur Erhöhung des Transportes durch die BBB wird ein peptidischer oder peptidomimetischer Modulator mit einem zweiten Peptid oder Protein unter Bildung eines chimären Proteins konjugiert, wobei das sekundäre Peptid oder Protein Absorptions-vermittelte oder Rezeptor-vermittelte Transzytose durch die BBB erfährt. Dementsprechend kann das chimäre Protein, durch Kopplung des Modulators an dieses zweite Peptid oder Protein, durch die BBB transportiert werden. Das zweite Peptid oder Protein kann ein Ligand für einen Kapillar-Endothelialzell-Rezeptor-Liganden des Gehirns (brain capillary endothelial cell receptor ligand) sein. Zum Beispiel ist ein bevorzugter Ligand ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch an den Transferrin-Rezeptor von Kapillar-Endothelialzellen des Gehirns (brain endothelial cell receptors) bindet (siehe z. B. US-Patente 5,182,107 und 5,154,924 und PCT-Veröffentlichungen WO 93/10819 und WO 95/02421, alle von Friden et al.). Andere geeignete Peptide oder Proteine, die den Transport durch die BBB vermitteln können, umfassen Histone (siehe z. B. US-Patent 4,902,505 von Pardridge und Schimmel) und Liganden wie Biotin, Folat, Niazin, Pantothensäure, Riboflavin, Thiamin, Pyridoxal und Ascorbinsäure (siehe z. B. US-Patente 5,416,016 und 5,108,921, beide von Heinstein). Zusätzlich wurde gefunden, dass der Glucose-Transporter GLUT-1 Glycopeptide (L-Serinyl-β-D-glucosid-Analoga von [Met5]enkephalin durch die BBB transportiert (Polt, R. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7114–7118). Dementsprechend kann eine Modulator-Verbindung an solch ein Glycopeptid gekoppelt werden, um den Modulator auf den GLUT-1-Glucose-Transporter zuzusteuern. Zum Beispiel kann eine Modulator-Verbindung, die an ihrem Aminoterminus mit der modifizierenden Gruppe Aic (3-(Ο-Aminoethyl-iso)-cholyl (einem Derivat von Cholsäure mit einer freien Aminogruppe) modifiziert ist, durch Standardverfahren an ein Glycopeptid über die Aminogruppe von Aic gekoppelt werden. Chimäre Proteine können durch rekombinante DNA-Verfahren (z. B. durch Bildung eines chimären Gens, das für ein Fusionsprotein kodiert) oder durch chemische Kopplung des Modulators mit dem sekundären Peptid oder Protein unter Bildung eines chimären Proteins gebildet werden. Zahlreiche chemische Kopplungsreagenzien sind aus dem Stand der Technik bekannt (z. B. kommerziell erhältlich von Pierce, Rockford, IL). Es kann ein Kopplungsreagenz ausgewählt werden, das die Kopplung des Modulators mit dem zweiten Peptid oder Protein in hohen Ausbeuten, und die nachfolgende Spaltung des Kopplungsreagenzes unter Freisetzung des bioaktiven Modulators erlaubt. Zum Beispiel kann ein auf Biotin-Avidin basierendes Linkersystem verwendet werden.
In noch einem weiteren Ansatz zur Erhöhung des Transports durch die BBB wird der Modulator in einen Träger-Vektor verkapselt, der den Transport durch die BBB vermittelt. Zum Beispiel kann der Modulator in ein Liposom, wie ein positiv geladenes unilammelares Liposom (siehe z. B. PCT- Veröffentlichungen WO 88/07851 und WO 88/07852, beide von Faden), oder in polymerische Microsphären (siehe z. B. US-Patent 5,413,797 von Khan et al., US-Patent 5,271,961 von Mathiowitz et al. und 5,019,400 von Gombotz et al.) verkapselt werden. Ferner kann der Träger-Vektor modifiziert sein, um ihn für den Transport durch die BBB zu markieren. Zum Beispiel kann der Träger-Vektor (z. B. Liposom) kovalent mit einem Molekül modifiziert werden, das aktiv durch die BBB transportiert wird, oder mit einem Liganden für Endothelialzell-Rezeptoren des Gehirns, wie einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch an Transferrin-Rezeptoren bindet (siehe z. B. PCT-Veröffentlichungen WO 91/04014 von Collins et al. und WO 94/02178 von Greig et al.)
In noch einem weiteren Ansatz zur Erhöhung des Transports des Modulators durch die BBB wird der Modulator zusammen mit einem weiteren Mittel verabreicht, das wirkt, indem es die BBB permeabilisiert. Beispiele für solche BBB-„Permeabilisatoren" umfassen Bradykinin und Bradykinin-Agonisten (siehe z. B. US-Patent 5,112,596 von Malfroy-Camine) und peptidische Verbindungen, die im US-Patent 5,268,164 von Kozarich et al. offenbart sind.
Assays, die die in vitro-Stabilität der Modulator-Verbindungen in zerebrospinaler Flüssigkeit (CSF) und das Ausmaß der Aufnahme der Modulator-Verbindung ins Gehirn in Tiermodellen messen, können als Anzeige für die Wirksamkeit der Verbindungen in vivo verwendet werden. Geeignete Assays zur Messung von CSF-Stabilität und Aufnahme ins Gehirn sind in den Beispielen 7 bzw. 8 beschrieben.
Eine Modulator-Verbindung der Erfindung kann in eine pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert werden, wobei der Modulator die einzig aktive Verbindung ist oder, die pharmazeutische Zusammensetzung kann alternativ zusätzliche aktive Verbindungen enthalten. Zum Beispiel können zwei oder mehr Modulator-Verbindungen der Erfindung zusammen eingesetzt werden. Ferner kann eine Modulator-Verbindung der Erfindung mit einem oder mehreren anderen Mitteln, die anti-amyloidogene Eigenschaften besitzen, kombiniert werden. Zum Beispiel kann eine Modulator-Verbindung mit dem unspezifischen Cholinesterase-Inhibitor Tacrine (COGNEX^®, Parke-Davis) kombiniert werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung als eine verpackte Formulierung vorgesehen. Die ver packte Formulierung kann eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung in einem Behälter und gedruckte Anleitungen zur Verabreichung der Zusammensetzung zur Behandlung eines Subjektes mit einer Funktionsstörung, die mit β-Amyloidose in Verbindung steht, z. B. Alzheimer-Erkrankung, umfassen.
VI. Verfahren zur Verwendung von Aβ-Modulatoren
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Veränderung der Aggregation oder Inhibierung der Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden. In den Verfahren der Erfindung werden natürliche β-Amyloid-Peptide mit einem β-Amyloid-Modulator in Kontakt gebracht, so dass die Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide verändert oder die Neurotoxizität der natürlichen β-Amyloid-Peptide unterbunden wird. In einer bevorzugten Ausführungsform inhibiert der Modulator die Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide. In einer weiteren Ausführungsform fördert der Modulator die Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide. Bevorzugterweise wird die Aggregation eines molaren Überschusses von β-AP im Verhältnis zu der Modulatormenge nach dem Kontakt mit dem Modulator verändert.
In dem Verfahren der Erfindung können die natürlichen β-Amyloid-Peptide mit einem Modulator entweder in vitro oder in vivo in Kontakt gebracht werden. Daher soll die Bezeichnung „in Kontakt bringen mit" sowohl die Inkubation eines Modulators mit einem natürlichen β-AP-Präparat in vitro als auch die Zuführung des Modulators an eine Stelle in vivo, an der natürliches β-AP gegenwärtig ist, umfassen. Da die Modulator-Verbindung mit natürlichem β-AP interagiert, kann die Modulator-Verbindung verwendet werden, um natürliches β-AP entweder in vitro oder in vivo zu detektieren. Dementsprechend besteht eine Verwendung der Modulator-Verbindungen der Erfindung darin, als Diagnosemittel zur Detektion der Gegenwart von natürlichem β-AP entweder in einer biologischen Probe oder in vivo in einem Subjekt zu fungieren. Außerdem kann die Detektion von natürlichem β-AP unter Verwendung einer Modulator-Verbindung der Erfindung ferner dazu benutzt werden, Amyloidose in einem Subjekt zu diagnostizieren. Zusätzlich sind die Modulator-Verbindungen der Erfindung, da sie die β-AP-Aggregation unterbrechen und die Neurotoxizität von β-AP inhibieren, entweder prophylaktisch oder therapeutisch zweckmäßig in der Behandlung von Funktionsstörungen, die mit β-Amyloidose in Verbindung stehen. Dementsprechend besteht eine weitere Verwendung der Modulator-Verbindungen der Erfindung darin, als therapeutisches Mittel zu fungieren, das die Aggregation und/oder die Neurotoxizität von natürlichem β-AP verändert.
In einer Ausführungsform wird die Modulator-Verbindung der Erfindung in vitro verwendet, z. B. um natürliches β-AP in einer Probe (z. B. einer Probe mit einer biologischen Flüssigkeit) zu detektieren und zu quantifizieren. Um die Detektion zu erleichtern, kann die Modulator-Verbindung mit einer detektierbaren Substanz modifiziert werden. Die Quelle von in diesem Verfahren eingesetztem natürlichem β-AP kann z. B. eine Probe zerebrospinaler Flüssigkeit sein (z. B. von einem AD-Patienten, einem Erwachsenen, der aufgrund der Familiengeschichte gegenüber AD anfällig ist, oder einem normalen Erwachsenen). Die Probe mit natürlichem β-AP wird mit einem Modulator der Erfindung in Kontakt gebracht und die Aggregation der β-AP, wie z. B. in den in Beispiel 2 beschriebenen Assays, gemessen. Das Ausmaß an Aggregation der β-AP-Probe kann dann mit dem einer Kontrollprobe bzw. von Kontrollproben einer bestimmten Konzentration von β-AP, die auf ähnliche Weise mit dem Modulator in Kontakt gebracht wurde(n), verglichen werden, und die Ergebnisse können als Indikation dafür verwendet werden, ob ein Subjekt anfällig für β-Amyloidose ist oder eine Funktionsstörung, die mit β-Amyloidose in Verbindung steht, aufweist. Außerdem kann β-AP durch Detektion einer modulierenden Gruppe, die in den Modulator eingebaut ist, detektiert werden. Zum Beispiel können die Modulatoren, die, wie hierin beschrieben, eine Biotin-Verbindung enthalten (z. B. ein aminoterminal biotinyliertes β-AP-Peptid) mittels einer Streptavidin- oder Avidin-Probe, die mit einer detektierbaren Substanz markiert ist (z. B. einem Enzym wie Peroxidase) detektiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Modulator-Verbindung der Erfindung in vivo verwendet, um die Ablagerung von natürlichem β-AP in einem Subjekt, zum Beispiel um zur Diagnostizierung von β-Amyloidose in einem Subjekt beizutragen, zu detektieren, und wenn gewünscht zu quantifizieren. Um die Detektion zu erleichtern, kann die Modulator-Verbindung mit einer detek tierbaren Substanz, bevorzugt ^99mTm oder radioaktivem Iod (weiterführend weiter oben beschrieben) modifiziert werden, die in vivo in einem Subjekt detektiert werden kann. Die markierte β-Amyloid-Modulator-Verbindung wird dem Subjekt verabreicht, und nach einer ausreichenden Zeitspanne, um die Akkumulation des Modulators an Stellen der β-Amyloid-Ablagerung zu ermöglichen, wird die markierte Modulator-Verbindung mit Standard-Abbildungstechniken detektiert. Das radioaktive Signal, das durch die markierte Verbindung generiert wird, kann direkt detektiert werden (z. B. Ganzkörper-Zählung) oder in ein Bild auf einem Autoradiographen oder Computer-Bildschirm umgewandelt werden, um die Abbildung von β-Amyloid-Ablagerungen in dem Subjekt zu ermöglichen. Verfahren zur Abbildung von Amyloidose unter Einsatz radioaktiv markierter Proteine sind aus dem Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel wird die mit entweder ¹²³I oder ^99mTc radioaktiv markierte Serum-Amyloid-P-Komponente (SAP) zur Abbildung von systemischer Amyloidose eingesetzt (siehe z. B. Hawkins, P.N. und Pepys, M.B. (1995) Eur. J. Nucl. Med. 22:595–599). Von den verschiedenen Isotypen von radioaktivem Iod wird bevorzugt ¹²³I (Halbwertszeit = 13,2 Stunden) für Ganzkörper-Szintigraphie, ¹²⁴I (Halbwertszeit = 4 Tage) für Positron-Emissions-Tomographie (PET), ¹²⁵I (Halbwertszeit = 60 Tage) für Stoffwechselumsatz-Untersuchungen und ¹³¹I (Halbwertszeit = 8 Tage) für Ganzkörperzählung und zeitverzögerte niedrigauflösende Imaging-Untersuchungen (low resolution imaging studies) eingesetzt. Analog den Untersuchungen unter Verwendung von radioaktiv markiertem SAP kann eine markierte Modulator-Verbindung der Erfindung in ein Subjekt über einen geeigneten Weg (z. B. intravenös, intraspinal, intrazerebral) in einem einzelnen Bolus, der z. B. 100 μg der markierten Verbindung mit etwa 180 MBq Radioaktivität, enthält, eingebracht werden.
Die Erfindung sieht ein Verfahren zur Detektion von Gegenwart oder Abwesenheit von natürlichen β-Amyloid-Peptiden in einer biologischen Probe vor, wobei man eine biologische Probe mit einer Verbindung der Erfindung in Kontakt bringt und die an natürliche β-Amyloid-Peptide gebundene Verbindung detektiert, um so die Gegenwart oder Abwesenheit von natürlichen β-Amyloid-Peptiden in der biologischen Probe zu detektieren. In einer Ausführungsform werden die β-Amyloid-Modulator-Verbindung und die biologische Probe in vitro in Kontakt gebracht. In einer weiteren Ausführungsform wird die β-Amyloid-Modulator-Verbindung mit der biologischen Probe durch die Verabreichung der β-Amyloid-Modulator-Verbindung an ein Subjekt in Kontakt gebracht. Für die in vivo-Verabreichung wird die Verbindung bevorzugt mit radioaktivem Technetium oder radioaktivem Iod markiert.
Die Erfindung sieht auch ein Verfahren zur Detektion von natürlichen β-Amyloid-Peptiden vor, um die Diagnostizierung einer β-amyloidogenen Erkrankung zu ermöglichen, wobei man eine biologische Probe mit der Verbindung der Erfindung in Kontakt bringt, und die an natürliche β-Amyloid-Peptide gebundene Verbindung detektiert, um die Diagnostizierung einer β-amyloidogenen Erkrankung zu ermöglichen. In einer Ausführungsform werden die β-Amyloid-Modulator-Verbindung und die biologische Probe in vitro in Kontakt gebracht. In einer weiteren Ausführungsform wird die β-Amyloid-Verbindung mit der biologischen Probe durch Verabreichung der β-Amyloid-Modulator-Verbindung an ein Subjekt in Kontakt gebracht. Für die in vivo-Verabreichung wird die Verbindung bevorzugt mit radioaktivem Technetium oder radioaktivem Iod markiert. Bevorzugterweise ermöglicht die Verwendung des Verfahrens die Diagnostizierung der Alzheimer-Erkrankung.
In einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung ein Verfahren zur Veränderung von natürlicher β-AP-Aggregation oder Inhibierung von β-AP-Neurotoxizität vor, das prophylaktisch oder therapeutisch zur Behandlung von oder Vorbeugung vor Funktionsstörungen, die mit β-Amyloidose in Verbindung stehen, z. B. der Alzheimer-Erkrankung, eingesetzt werden kann. Modulator-Verbindungen der Erfindung können die Toxizität natürlicher β-AP-Aggregate auf kultivierte neuronale Zellen reduzieren. Ferner besitzen die Modulatoren außerdem die Fähigkeit, die Neurotoxizität vorgebildeter Aβ-Fibrillen zu reduzieren. Dementsprechend können die Modulator-Verbindungen der Erfindung verwendet werden, um die Bildung neurotoxischer Aβ-Fibrillen in Subjekten zu inhibieren oder zu verhindern (z. B. prophylaktisch in einem Subjekt, das für die Ablagerung von β-Amyloid prädisponiert ist), und um therapeutisch β-Amyloidose in Subjekten, die bereits β-Amyloid-Ablagerung zeigen, rückgängig zu machen.
Ein Modulator der Erfindung wird mit natürlichen β-Amyloid-Peptiden, die in einem Subjekt gegenwärtig sind (z. B. in der zerebrospinalen Flüssigkeit oder dem Zerebrum des Subjektes), in Kontakt gebracht, um dadurch die Aggregation der natürlichen β-AP zu verändern und/oder die Neurotoxizität der natürlichen β-APs zu inhibieren. Eine Modulator-Verbindung kann dem Subjekt alleine, oder alternativ in Kombination mit anderen therapeutisch aktiven Mitteln verabreicht werden (z. B. wie oben in Unterkapitel IV diskutiert). Wenn Kombinations-Therapie angewendet wird, können die therapeutischen Mittel zusammen in einer einzigen pharmazeutischen Zusammensetzung, zusammen in getrennten pharmazeutischen Zusammensetzungen oder aufeinander folgend verabreicht werden.
Der Modulator kann dem Subjekt auf jedem geeigneten Weg, der wirksam zur Inhibierung natürlicher β-AP-Aggregation in dem Subjekt ist, verabreicht werden, obwohl in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Modulator parenteral, am bevorzugtesten dem zentralen Nervensystem des Subjekts, verabreicht wird. Mögliche Wege der ZNS-Verabreichung umfassen intraspinale Verabreichung, und intrazerebrale Verabreichung (z. B. intrazerebrovaskuläre Verabreichung). Alternativ kann die Verbindung z. B. oral, intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden. Auf Wegen, bei denen die Verabreichung nicht an das ZNS erfolgt, kann die Verbindung in einer Formulierung verabreicht werden, die den Transport durch die BBB ermöglicht. Bestimmte Modulatoren können ohne zusätzliche weitere Modifikation durch die BBB transportiert werden, wohingegen andere, wie oben in Unterkapitel IV beschrieben, weiterer Modifikation bedürfen können.
Geeignete Methoden und Vorrichtungen zur Zufuhr von therapeutischen Verbindungen an das ZNS eines Subjektes sind aus dem Stand der Technik bekannt, darunter zerebrovaskuläre Reservoire (z. B. Ommaya- oder Rikker-Reservoire; siehe z. B. Raney, J.P. et al. (1988) J. Neurosci. Nurs. 20:23–29; Sundaresan, N. et al. (1989) Oncology 3:15–22), Katheter zur intrathekalen Zufuhr (z. B. Port-a-Cath, Y-Katheter und dergleichen; siehe z. B. Plummer, J.L. (1991) Pain 44:215–220; Yaksh, T.L. et al. (1986) Pharmacol. Biochem. Behav. 25:483–485), injizierbare intrathekale Reservoire (z. B. Spinalgesic; siehe z. B. Brazenor, G.A. (1987) Neurosurgery 21:484–491), implantierbare Infusi onspumpen-Systeme (z. B. Infusaid; siehe z. B. Zierski, J. et al. (1988) Acta Neurochem. Suppl. 43:94–99; Kanoff, R.B. (1994) J. Am. Osteopath. Assoc. 94:487–493) und osmotische Pumpen (verkauft von Alza Corporation). Eine besonders bevorzugte Form der Verabreichung erfolgt über eine implantierbare, extern programmierbare Infusionspumpe. Geeignete Infusionspumpen-Systeme und Reservoir-Systeme sind ebenfalls, im US-Patent Nr. 5,368,562 von Blomquist und US-Patent Nr. 4,731,058 von Doan, entwickelt von Pharmacia Deltec Inc., beschrieben.
Das Verfahren zur Veränderung von β-AP-Aggregation in vivo, und im Speziellen zur Inhibierung von β-AP-Aggregation, kann therapeutisch bei Erkrankungen angewendet werden, die mit abnormaler β-Amyloid-Aggregation und -Ablagerung in Verbindung stehen, um dadurch die Geschwindigkeit der β-Amyloid-Ablagerung zu verlangsamen und/oder das Ausmaß an β-Amyloid-Ablagerung herabzusetzen, um somit den Verlauf der Erkrankung abzuschwächen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Behandlung der Alzheimer-Erkrankung verwendet (z. B. sporadische oder familiäre AD, darunter sowohl Individuen, die AD-Symptome zeigen als auch Individuen, die anfällig für familiäre AD sind). Das Verfahren kann ebenso prophylaktisch oder therapeutisch angewendet werden, um andere klinische Ausprägungen von β-Amyloid-Ablagerung, wie in Individuen mit Down's Syndrom und in Patienten mit vererbbarer zerebraler Hämorrhagie vom Amyloidose-Dutch-Typ (HCHWA-D) zu behandeln. Während die Inhibierung von β-AP-Aggregation eine bevorzugte therapeutische Methode ist, können Modulatoren, die die β-AP-Aggregation fördern, ebenfalls therapeutisch nützlich sein, indem sie den Abbau von β-AP an Stellen, die zu keiner neurologischen Beeinträchtigung führen, ermöglichen.
Zusätzlich ist die abnormale Akkumulation des β-Amyloid-Vorläuferproteins in Muskelfasern in die Pathologie von sporadischer Einschlusskörper-Myositis (inclusion body myositis, IBM) verwickelt (Askana, V. et al. (1996) proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1314–1319; Askanas, V. et al (1995) Current Opinion in Rheumatology 7:486–496). Dementsprechend können die Modulatoren der Erfindung prophylaktisch oder therapeutisch zur Behandlung von Funktionsstörungen, bei denen β-AP oder APP an nicht-neurologischen Stellen abnormal abgelagert sind, eingesetzt werden, wie bei der Behandlung von IBM durch die Abgabe der Modulatoren an Muskelfasern.
Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die nicht als einschränkend ausgelegt werden sollten, weitergehend verdeutlicht. Die Fähigkeit des Modulators, in den unten beschriebenen Assays die Aggregation von natürlichem β-Amyloid-Peptid zu verändern und/oder die Neurotoxizität von natürlichem β-Amyloid-Peptid zu inhibieren, weist auf die Fähigkeit des Modulators hin, die selbe Funktion in vivo zu erfüllen. Die Inhalte aller Literaturangaben, Patente und veröffentlichter Patentanmeldungen, die in dieser Anmeldung zitiert sind, sind hierin durch Verweis umfasst.
BEISPIEL 1: Herstellung von β-Amyloid-Modulator-Verbindungen, die D-Aminosäuren umfassen
β-Amyloid-Modulator-Verbindungen, die D-Aminosäuren umfassen, können durch Festphasenpeptidysnthese, z. B. unter Verwendung einer auf N -9-Fluorenylmethyloxycabonyl (FMOC) als Schutzgruppe basierenden Strategie, hergestellt werden. Ausgehend von 2,5 mmol FMOC-D-Val-Wangharz, wird die sequentielle Addition jeder Aminosäure unter Einsatz eines vierfachen Überschusses geschützter Aminosäuren, von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und von Diisopropylcarbodiimid (DIC) durchgeführt. Wiederverknüpfungen werden durchgeführt, falls dies nötig sein sollte, was durch Ninhydrin-Test des Harzes nach der Kopplung untersucht werden kann. Jeder Synthese-Zyklus lässt sich minimal durch eine dreiminütige Entfernung der Schutzgruppe (25% Piperidin/N-Methyl-pyrrolidon (NMP)), einer 15minütigen Entfernung der Schutzgruppe, fünf einminütigen Waschschritten mit NMP, einem 60minütigen Kopplungszyklus, fünf Waschschritten mit NMP und einem Ninhydrin-Test beschreiben. Zur N-terminalen Modifikation wird eine FMOC-D-Aminosäure durch ein N-terminal modifizierendes Reagenz ersetzt, und mit einer 700 mg-Menge des vollständig ausgebildeten Peptid-Harzes nach dem obigen Protokoll gekoppelt. Das Peptid wird von dem Harz durch Behandlung mit Trifluoressigsäure (TFA) (82,5%), Wasser (5%), Thioanisol (5%), Phenol (5%), Ethandithiol (2,5%) für zwei Stunden entfernt, gefolgt von der Präzipitation des Peptids in kaltem Ether. Der Feststoff wird durch Zentrifugation (2400 Upm × 10 min) pelletiert, und der Ether abdekantiert. Der Feststoff wird in Ether resuspendiert, pelletiert und ein zweites Mal dekantiert. Der Feststoff wird in 10%iger Essigsäure gelöst und zur Trockne lyophilisiert. Zur Strukturanalyse werden 60 mg des Feststoffs in 25% Acetonitril (ACN)/0,1% TFA gelöst und auf eine C18-Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (high performane liquid chromatography, HPLC)-Säule aufgebracht.
Alternativ können β-Amyloid-Modulatoren, die D-Aminosäuren umfassen, mit einem Advanced ChemTech Model 396 Mehrfach-Peptidsynthese-Apparat unter Verwendung eines automatisierten Protokolls, das vom Hersteller für Synthesen im Maßstab von 0,025 mmol etabliert wurde, hergestellt werden. Für allen Zyklen werden Doppelverknüpfungen unter Einsatz von 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorophosphat (HBTU)/N,N-Diisopropylethylamin (DIEA)/HOBt/FMOC-D-Aminosäure in vierfachem Überschuss für 30 Minuten gefolgt von DIC/HOBt/FMOC-D-Aminosäure in vierfachem Überschuss für 45 Minuten, durchgeführt. Das Peptid wird von der Schutzgruppe befreit und von dem Harz durch Behandlung mit TFA/Wasser (95%/5%) für drei Stunden entfernt, und mit Ether, wie oben beschrieben, präzipitiert. Das Pellet wird in 10% Essigsäure resuspendiert und lyophilisiert. Der Stoff wird durch eine präparative HPLC unter Verwendung von 15%–40% Acetonitril 80 Minuten über eine Vydac C18-Säule (21 × 250 mm) gereinigt.
Verschiedene N-terminal modifizierte β-Amyloid-Modulator-Verbindungen können mit Standardverfahren synthetisiert werden. Vollständig geschützte Harz-gebundene Peptide werden, wie oben beschrieben, auf Wangharz hergestellt, um schließlich carboxyterminale Peptidsäuren erzeugen zu können. Kleine Mengen jedes Peptidharzes (z. B. 13–20 μmol) werden in Wells des Reaktionsblock eines Advanced ChemTech Model 396 Mehrfach-Peptid-Synthese-Apparates aliquotiert. Die N-terminale FMOC-Schutzgruppe jeder Probe wird in Standardmanier mit 25% Piperidin in NMP entfernt, gefolgt von ausgiebigem Waschen mit NMP. Die ungeschützte N-terminale -Aminogruppe jeder Peptidharz-Probe kann unter Verwendung von einem der folgenden Verfahren modifiziert werden:
Verfahren A, Kopplung von modifizierenden Reagenzien, die freie Carbonsäuregruppen enthalten: Das modifizierende Reagenz (fünf Äquivalente) wird in NMP, DMSO oder einer Mischung der beiden Lösungsmittel vorgelöst. HOBT und DIC (jeweils fünf Äquivalente) werden dem gelösten Modifikator zugegeben, und die resultierende Lösung wird mit einem Äquivalent des Peptidharzes mit der freien Aminogruppe versetzt. Die Kopplung wird über Nacht fortschreiten gelassen, gefolgt von Waschen. Falls ein Ninhydrin-Test mit einer kleinen Probe des Peptidharzes zeigen sollte, das die Kopplung nicht vollständig ist, wird die Kopplung unter Verwendung von 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol (HOAt) anstelle von HOBt wiederholt.
Verfahren B, Kopplung von modifizierenden Reagenzien, die in voraktivierter Form erhalten werden: Das modifizierende Reagenz (fünf Äquivalente) wird in NMP, DMSO oder einer Mischung der beiden Lösungsmittel vorgelöst und zu einem Äquivalent des Peptidharzes gegeben. Diisopropylethylamin (DIEA; sechs Äquivalente) wird mit der Suspension aus aktiviertem Modifikator und Peptidharz versetzt. Die Kopplung wird über Nacht fortschreiten gelassen, gefolgt von Waschen. Falls ein Ninhydrin-Test mit einer kleinen Probe des Peptidharzes zeigen sollte, dass die Kopplung nicht vollständig ist, wird die Kopplung wiederholt.
Nach der zweiten Kopplung (falls nötig) werden die N-terminal modifizierten Peptidharze unter vermindertem Druck getrocknet und, wie oben beschrieben, vom Harz abgespalten, einhergehend mit der Entfernung von Schutzgruppen von den Seitenketten. Analytische Umkehrphasen-HPLC wird verwendet, um zu bestätigen, dass ein Hauptprodukt in den entstandenen Rohpeptiden, die unter Verwendung von Millipore Sep-Pak-Filtern oder präparativer Umkehrphasen-HPLC gereinigt werden, vorhanden ist. Massenspektrometrie oder Hochfeld Kernmagnetische Resonanzspektrometrie wird verwendet, um die Gegenwart der gewünschten Verbindung in dem Produkt zu bestätigen.
BEISPIEL 2: β-Amyloid-Aggregations-Assay
Die Fähigkeit von β-Amyloid-Modulator-Verbindungen, die Aggregation von natürlichem β -AP zu modulieren (z. B. zu inhibieren oder zu fördern), wenn sie mit den natürlichen β -AP vereinigt werden, kann mit einem oder beiden der unten beschriebenen Aggregations-Assays untersucht werden. Natürliches β-AP (β-AP_1-40), dass in den Aggregations-Assays eingesetzt wird, ist kommerziell von Bachem (Torrance, CA) erhältlich.
A. Keimbildungs-Assay
Der Keimbildungs-Assay wird angewendet, um die Fähigkeit von Testverbindungen zu untersuchen, die frühen Ereignisse bei der Bildung von β-AP-Fasern aus monomerem β-AP zu verändern (z. B. zu inhibieren). Charakteristisch für einen auf Keimbildung beruhenden Polymerisations-Mechanismus ist eine zu beobachtende Lag-Zeit vor der Keimbildung, nach der das Peptid rasch Fasern ausbildet, was sich in einem linearen Anstieg der Trübung zeigt. Die Totzeit vor der Polymerisation von β-AP-Monomeren kann genau wie das Ausmaß an Bildung von unlöslichen Fasern durch Lichtstreuung (Trübung) quantifiziert werden. Die Polymerisation erreicht ein Gleichgewicht, wenn die maximale Trübung ein Plateau erreicht. Die Trübung einer Lösung von natürlichem β-AP in Gegenwart oder bei Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen einer β-Amyloid-Modulator-Verbindung wird durch Messung der scheinbaren optischen Dichte der Lösung bei 405 nm (A_{405 nm}) über die Zeit bestimmt. Der Schwellenwert für die Empfindlichkeit für die Messung der Trübung liegt im Bereich von 15–20 μM β-AP. Eine Abnahme der Trübung über die Zeit in Gegenwart des Modulators, verglichen mit der Trübung bei der Abwesenheit des Modulators, weist darauf hin, dass der Modulator die Bildung von β-AP-Fasern aus monomerem β-AP inhibiert. Dieser Assay kann unter Rühren oder Schütteln durchgeführt werden, um die Polymerisation zu beschleunigen, wodurch sich die Geschwindigkeit des Assays erhöht. Ferner kann der Assay an ein 96-Well-Platten-Format angepasst werden, um mehrere Verbindungen testen zu können.
Um den Keimbildungs-Assay ausführen zu können, wird zunächst Aβ_1-40-Peptid in HFIP (1,1,1,3,3-Hexafluoro-2-propanol; Aldrich 10.522-8) in einer Konzentration von 2 mg Peptid/ml gelöst und bei Raumtemperatur für 30 Minu ten inkubiert. HFIP-solubilisiertes Peptid wird in einem Wasserbad-Sonifikator für 5 Minuten bei höchster Einstellung sonifiziert und anschließend unter Argonstrom bis zur Trockne getrocknet. Der Peptidfilm wird in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 6,9 mg/ml (25x Konzentration) resuspendiert, wie vorher 5 Minuten sonifiziert und anschließend durch einen 0,2-Mikron-Nylon-Spritzenfilter (VWR Katalog-Nr. 28196-050) filtriert. Die Testverbindungen werden in DMSO in einer 100x Konzentration gelöst. Vier Volumina 25x Aβ_1-40-Peptid in DMSO werden mit einem Volumen der Testverbindung in DMSO in einem Glasfläschchen vereinigt, und vermischt, um ein molares Verhältnis von Aβ-Peptid zu Testverbindung von 1:1 herzustellen. Für andere molare Verhältnisse werden die Testverbindungen vor der Zugabe zu Aβ_1-40 mit DMSO verdünnt, um die Endkonzentrationen von DMSO und Aβ_1-40 konstant zu halten. Kontrollproben enthalten keine Testverbindung. Dann werden zehn Mikroliter der Mischung auf den Boden eines Wells einer Corning Costar ultra low binding 96-Well-Platte (Corning Costar, Cambridge, MA; Katalog-Nr. 2500) gegeben. 90 Mikroliter Wasser werden auf das Well gegeben, die Platte wird auf einem Rotationsschüttler bei gleichbleibender Geschwindigkeit bei Raumtemperatur für 30 Sekunden geschüttelt, zusätzliche 100 μl 2x PTL-Puffer (20 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, pH 7,4) werden in das Well gegeben, die Platte wird nochmals für 30 Sekunden geschüttelt, und eine Basislinien-Trübung (t = 0) wird durch Messung der scheinbaren optischen Dichte bei 405 nm mittels eines Bio-Rad Model 450 Microplate Readers, abgelesen. Die Platte wird anschließend wieder auf den Schüttler gestellt und fortlaufend für 5 Stunden geschüttelt. Die Ablesung der Trübung erfolgte in Intervallen von 15 Minuten.
Die Aggregation von β-Amyloid bei Abwesenheit irgendeines Modulators führt zu erhöhter Trübung der natürlichen β-AP-Lösung (d. h. einem Anstieg der scheinbaren optischen Dichte bei 505 nm über die Zeit). Dementsprechend zeigt eine Lösung, die eine wirksame inhibitorische Modulator-Verbindung enthält, geringere Trübung im Vergleich zu einer Kontrollprobe ohne die Modulator-Verbindung (d. h. geringere scheinbare optische Dichte bei 405 nm über die Zeit verglichen mit der Kontrollprobe).
Alternativ zur Ausnutzung von Trübung zur Quantifizierung von β-Amyloid-Aggregation kann auch die Fluoreszenz von Thioflavin T (Th-T) zur Quantifizierung von β-Amyloid-Aggregation in dem Keimbildungs-Assay herangezogen werden (die Anwendung von Th-T-Fluoreszenz zur Quantifizierung von β-Amyloid-Aggregation wird weiterführend unten beim „seeded extension assay" beschrieben).
B. „Seeded Extension Assay"
Der „seeded extension assay" kann verwendet werden, um die Geschwindigkeit zu messen, in der sich Aβ-Fasern in einer Lösung aus Aβ-Monomeren nach der Zugabe von polymeren Aβ-Faser-„Impfkeimen" bilden. Die Fähigkeit der Testverbindungen, die weitere Ablagerung von monomerem Aβ auf vorher abgelagertem Amyloid zu verhindern, wird unter Verwendung eines direkten Indikators von β-Faltblatt-Bildung mittels Fluoreszenz ermittelt. Im Gegensatz zum Keimbildungs-Assay sorgt die Zugabe von Impfkeimen für umnittelbare Keimbildung und fortgesetztes Wachstum von vorgebildeten Fibrillen, ohne dass es fortdauerndem Mischen bedarf, und führt daher zur Abwesenheit einer Lag-Zeit vor dem Start der Polymerisation. Da dieser Assay von feststehenden Polymerisations-Bedingungen Gebrauch macht, kann die Aktivität von positiven Verbindungen in dem Keimbildungs-Assay in diesem zweiten Assay unter anderen Bedingungen und mit einer zusätzlichen Probe einer Amyloid-Struktur bestätigt werden.
In dem „seeded extension assay" wird monomeres Aβ_1-40 in Gegenwart eines „Impf"-Keimes (etwa zehn Molprozent von Aβ, dessen Polymerisation vorher unter kontrollierten feststehenden Bedingungen zugelassen wurde) inkubiert. Proben der Lösung werden dann in Thioflavin T (Th-T) verdünnt. Die Polymer-spezifische Assoziation von Th-T mit Aβ führt zur Bildung eines fluoreszierenden Komplexes, der die Messung des Ausmaßes zu dem die Fibrill-Bildung erfolgt, ermöglicht (Levine, H. (1993) Protein Science 2:404–410). Insbesondere die Assoziation von Th-T mit aggregiertem β-AP, nicht aber mit monomerem oder schwach assoziiertem β-AP führt zu einem neuen Anregungs-(ex-)maximum bei 450 nm und einer erhöhten Emission (em) bei 482 nm, im Ver gleich zu 385 nm (ex) und 445 nm (em) des freien Farbstoffs. Kleine Aliquots der Polymerisations-Mischung enthalten genügend Fibrillen, die mit Th-T gemischt werden können, um die Überwachung der Reaktionsmischung durch wiederholte Probeentnahme zu ermöglichen. Eine lineare Wachstumskurve wird in der Gegenwart eines Überschusses an Monomer beobachtet. Die Bildung von Thioflavin T-zugänglichen β-Faltblatt-Fibrillen entspricht dem Anstieg der Trübung, die beim Keimbildungs-Assay beobachtet werden kann.
Eine Lösung von Aβ-Monomer zur Verwendung beim „seeded extension assay" wird durch Lösen einer zweckmäßigen Menge an Aβ_1-40-Peptid in 1/25 Volumen Dimethylsulfoxid (DMSO) gefolgt von der Zugabe von Wasser auf 1/2 Volumen und 1/2 Volumen 2x PBS (10x PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na₂HPO₄ × 7 H₂O 4,3 mM, KH₂PO₄ 1,4 mM, pH 7,2) und Einstellen auf eine Endkonzentration von 200 μM hergestellt. Zur Herstellung des Stamm-Impfkeims wird 1 ml des Aβ-Monomer-Präparates für etwa 8 Tage bei 37°C inkubiert und der Reihe nach 25, 25, 50 und 100 mal durch jeweils eine 18, 23, 26 und 30 gauge Nadel geschert. 2 μl-Proben des gescherten Materials werden nach jeweils 50 Passagen durch die 30 gauge Nadel Fluoreszenz-Messungen unterzogen, bis ein Fluoreszenz-Unit (FU)-Plateau erreicht wird (etwa 100– 150x). Testverbindungen werden durch Lösen einer geeigneten Menge der Testverbindung in 1x PBS auf eine Endkonzentration von 1 mM (10x-Stamm) präpariert. Falls unlöslich, wird die Verbindung in 1/10 Volumen DMSO gelöst und in 1x PBS auf 1 mM verdünnt. Eine weitere 1/10-Verdünnung wird ebenfalls hergestellt, um jede Probe bei 100 μM und 10 μM zu untersuchen.
Zur Durchführung des „seeded extension assays" wird jede Probe mit 50 μl 200 μM Monomer, 125 FU geschertem Impfkeim (eine variable Menge, abhängig von der Charge des Impfkeims, routinemäßig 3–6 μl) und 10 μl 10x Modulator-Lösung angesetzt. Das Probenvolumen wird dann auf ein Endvolumen von 100 μl mit 1x PBS eingestellt. Zwei Konzentrationen jedes Modulators werden typischerweise untersucht: 100 μM und 10 μM, entsprechend einem molaren Verhältnis von Monomer zu Modulator von 1:1 und 1:10. Die Kontrollen umfassen eine nicht angeimpfte Reaktion zur Bestätigung, dass das frische Monomer keinen Impfkeim enthält, und eine angeimpfte Reaktion bei Abwesenheit irgendeines Modulators als Referenz, um mit Modulator-Kandidaten vergleichen zu können. Der Assay wird bei 37°C für 6 h inkubiert, wobei stündlich 2 μl-Proben für Fluoreszenz-Messungen entnommen werden. Zur Messung der Fluoreszenz wird eine 2 μl-Probe von Aβ zu 400 μl Thioflavin T-Lösung (50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Thioflavin T, pH 7,5) gegeben. Die Proben werden gevortext und die Fluoreszenz wird in einer 0,5 ml Micro-Quartzküvette bei EX 450 nm und EM 482 nm ausgelesen (Hitachi 4500 Fluorimeter).
β-Amyloid-Aggregation führt zu verstärkter Emission von Thioflavin T. Dementsprechend zeigen Proben, die eine wirksame inhibitorische Modulatorverbindung enthalten, reduzierte Emission verglichen mit Kontrollproben ohne die Modulator-Verbindung.
BEISPIEL 3: Analyse von β-Amyloid-Modulator-Verbindungen, die D-Aminosäuren umfassen
In diesem Beispiel wurden D-Aminosäuren enthaltende Modulator-Verbindungen, die auf der Grundlage der Aβ-Aggregations-Kern-Domäne Aβ_17-21 entwickelt wurden, hergestellt, und auf ihre Eigenschaft, die Aggregation von natürlichem β-Amyloid-Peptid zu hemmen, unter Verwendung von in Beispiel 2 beschriebenen Aggregations-Assays, hin untersucht. In diesem Beispiel verwendete Abkürzungen sind: h- (freier Aminoterminus), -oh (freier Carbonsäureterminus), -nh₂ (Amidterminus), CA (Cholyl, der Acylteil von Cholsäure), PEA (Phenethylamid) and d (D-Aminosäure). Verbindungen, bei denen die Aminosäurereste in Klammern stehen und dieser ein „d" vorausgeht, geben an, dass alle Aminosäurereste D-Aminosäuren sind. Zum Beispiel gibt d(LVFFA) D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala an.
Die Ergebnisse einer ersten Reihe von Experimenten, bei denen mit Cholyl N-terminal modifizierte Verbindungen verwendet wurden, sind unten in Tabelle I zusammengefasst. Die Modulator-Verbindungen wurden mit Keimbildungs-Assays ausgewertet, wobei 5 μM Aβ_1-40 und entweder 2 oder 5 μM Testverbindung (d. h. 40 oder 100 Molprozent des Inhibitors) eingesetzt wurden. Die Änderung der Lag-Zeit (Δlag) ist als das Verhältnis von der in Gegenwart der Testverbindung (zu entweder 2 oder 5 μM) beobachtete Lag-Zeit und der Lag-Zeit der Kontrolle dargestellt.
Tabelle I

*ND = nicht bestimmt

Die in Tabelle I gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass alle D-Aminosäuren enthaltenden Modulatoren, die auf der Grundlage der Aβ_17-21-Region entwickelt wurden, wirksame Inhibitoren von Aβ-Aggregation sind. Wirksame Inhibitoren können zum Beispiel alle D-Aminosäure-Verbindungen umfassen, die der vollständigen Aβ_17-21-Region (z. B. PPI-457), einem kleineren Teil davon (z. B. PPI-458, umfassend Aβ_17-20) oder einer neu angeordneten Sequenz davon (z. B. PPI-454) entsprechen. Der Carboxyterminus wirksamer Inhibitoren kann zum Beispiel einen freien Carbonsäureterminus (z. B. PPI-454) oder eine C-terminale Amid-Modifikation (z. B. PPI-457 und PPI-458) umfassen.
In einer zweiten Reihe von Experimenten, in der sämtlich D-Aminosäure-Modulatoren eingesetzt wurden, wurde für die Keimbildungs-Assays eine andere Stammlösung von Aβ_1-40 verwendet, als in den Experimenten, die in Tabelle I gezeigt sind. Diese Stammlösung zeigt eine gewisse Verschiebung der Lag-Zeit auch bei Abwesenheit eines Inhibitors, so dass das Vielfache des Anstiegs der Lag-Zeit in Gegenwart von Testinhibitoren in diesen Experimenten geringer als in den vorangehenden Experimenten war. Trotz dieses Unterschieds war die Fähigkeit einer Vielzahl der vollständig D-Aminosäuren enthaltenden Modulatoren, die Aβ-Aggregation zu inhibieren, im Vergleich zu der Negativkontrolle, ein nur aus D-Alanin bestehendes Peptid (PPI-473), offenkundig. Die Ergebnisse dieser Reihe von Experimenten, bei denen die Testverbindungen in Konzentrationen von 2, 3, 4 oder 5 μM untersucht wurden, sind unten in Tabelle II gezeigt.

*ND = nicht bestimmt

Die in Tabelle II gezeigten Ergebnisse demonstrieren ferner, dass alle D-Aminosäuren enthaltenden Modulatoren, die auf der Grundlage der A_17-21-Region entwickelt wurden, wirksame Inhibitoren von A -Aggregation sind.
BEISPIEL 4: Variation der N-terminal modifizierenden Gruppe der auf D-Aminosäuren basierenden Modulator-Verbindungen
In diesem Beispiel wurde eine Reihe von Modulator-Verbindungen hergestellt, die sich in ihren N-terminal modifizierenden Gruppen unterschieden. Die Fähigkeit der Modulator-Verbindungen, die Aggregation von natürlichem β-Amyloid-Peptid zu hemmen, wurde mittels in Beispiel 2 beschriebenem Aggregations-Assays bestimmt. Die in diesem Beispiel und für die Darstellung der Daten verwendeten Abkürzungen sind die selben wie die in Beispiel 3 beschriebenen. Die Ergebnisse für die Verbindungen, die mit N-terminal modifizierenden Gruppen, die sich von verschiedenen Gallensäuren ableiten, modifiziert wurden, sind unten in Tabelle III gezeigt. Die Ergebnisse für die Verbindungen, die mit hydrophoben N-terminal modifizierenden Gruppen modifiziert worden sind, sind unten in Tabelle IV gezeigt. Die Ergebnisse für Verbindungen, die mit verschiedenen N-terminal hydroxylierten und oxygenierten modifizierenden Gruppen modifiziert worden sind, sind in Tabelle V gezeigt. Verbindungen, die eine Änderung in der Lag-Zeit (Δlag) von 1,3 oder größer zeigen, sind durch Fettdruck hervorgehoben.
Tabelle III: Modifizierende Gruppen, die sich von Gallensäure ableiten
Tabelle IV : Hydrophobe modifizierende Gruppen
Tabelle V: Hydroxylierte und oxygenierte modifizierende Gruppen
Die in den Tabellen III, IV und V gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass für die inhibitorischen Verbindungen der Erfindung eine Vielzahl von verschiedenen N-terminal modifizierenden Gruppen verwendet werden kann.
BEISPIEL 5: Auf D-Aminosäuren basierende Modulator-Verbindungen, die einen freien Aminoterminus aufweisen
In diesem Beispiel wurde die Notwendigkeit einer N-terminal modifizierenden Gruppe für die auf D-Aminosäuren basierenden Modulator-Verbindungen beurteilt. Es wurden Peptide, die völlständig aus D-Aminosäuren bestehen und einen freien Aminoterminus aufweisen, hergestellt, und auf ihre Eigenschaft hin, die Aggregation von natürlichem β-Amyloid-Peptid zu inhibieren, mittels eines in Beispiel 2 beschriebenen Aggregations-Assays untersucht. Die in diesem Beispiel und bei der Darstellung der Daten verwendeten Abkürzungen sind die selben wie die in Beispiel 3 beschriebenen. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle VI gezeigt. Verbindungen, die eine Änderung der Lag-Zeit (Δlag) von 1,3 oder größer zeigen, sind durch Fettdruck hervorgehoben.

*ND = nicht bestimmt

Die in Tabelle VI gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass Modulatoren, die alle D-Aminosäuren umfassen und einen freien Aminoterminus aufweisen, wirksam die Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide inhibieren (d. h. eine N-terminal modifizierende Gruppe ist nicht dafür erforderlich, dass die aus D-Aminosäuren bestehenden Modulatoren wirksam die Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide inhibieren). Eine besonders bevorzugte Modulator-Verbindung aus D-Aminosäuren, die einen freien Aminoterminus aufweist, ist PPI-579, das Retro-Inverso-Isomer von Aβ_17-21 (A₂₁ F) mit einem C-terminalen Amid.
BEISPIEL 6: Neurotoxizitäts-Assay
Die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptid-Aggregaten, entweder in Gegenwart oder bei Abwesenheit eines β-Amyloid-Modulators, kann in einem auf Zellen basierenden Assay untersucht werden, wobei entweder eine neuronale Ratten- oder neuronale humane Zelllinie (PC-12- bzw. NT-2-Zellen), und 3-(4,4-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) als Indikator für Lebensfähigkeit verwendet wird (siehe Shearman, M.S. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1470–1474; Hansen, M.B. et al. (1989) J. Immun. Methods 119:203–210 für eine Beschreibung von ähnlichen auf Zellen basierenden Assays zur Bestimmung der Lebensfähigkeit). PC-12 ist eine adrenale Phäochromozytom-Ratten-Zelllinie und ist erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC CRL 1721). MTT (kommerziell erhältlich von Sigma Chemical Co.) ist ein chromogenes Substrat, dass in lebensfähigen Zellen von Gelb in Blau umgewandelt wird, was spektrophotometrisch detektiert werden kann.
Zur Untersuchung der Neurotoxizität natürlicher β-Amyloid-Peptide werden zunächst Stammlösungen frischer Aβ-Monomere und gealterten Aβ-Aggregaten hergestellt. Aβ_1-40 in 100% DMSO wird aus lyophilisiertem Pulver hergestellt und sofort mit einer Hälfte des Endvolumens an H₂O und danach mit der anderen Hälfte des Endvolumens an 2x PBS verdünnt, so dass eine Endkonzentration von 200 μM Peptid und 4% DMSO erreicht wird. Auf diese Art hergestellte und sofort an Zellen untersuchte Peptide werden als „frisches" Aβ-Monomer bezeichnet. Um „gealterte" Aβ-Aggregate herzustellen, wird Peptidlösung in ein 1,5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß gegeben und bei 37°C für acht Tage inkubiert, um die Bildung von Fibrillen zu ermöglichen. Diese „gealterten" Aβ-Peptide können direkt an Zellen untersucht oder bei –80°C weggefroren werden. Die Neurotoxizität von frischen Monomeren und gealterten Aggregaten wird anhand von PC12- und NT2-Zellen untersucht. PC12-Zellen werden routinemäßig in Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) kultiviert, das 10% Pferdeserum, 5% fötales Kälberserum, 4 mM Glutamin und 1% Gentamycin enthält. NT2-Zellen werden routinemäßig in OPTI-MEM-Medium (GIBCO BRL Katalog-Nr. #31985) kuliviert, das mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 1% Gentamycin supplementiert wurde. Die Zellen wurden zu je 10–15.000 Zellen pro Well in 90 μl frischem Medium in eine 96-Well-Gewebekulturschale 3–4 Stunden vor der Behandlung ausgesät. Die frischen oder gealterten Aβ-Peptidlösungen (10 μl) werden anschließend 1:10 direkt in Gewebekulturmedium verdünnt, so dass die Endkonzentration im Bereich von 1–10 μM Peptid liegt. Die Zellen werden in Gegenwart des Peptids ohne Mediumwechsel für 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Für die letzten drei Stunden, in denen das Aβ-Präparat auf die Zellen einwirkt, wird dem Medium MTT in einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugesetzt und die Inkubation bei 37°C fortgesetzt. Nach der zweistündigen Inkubation mit MTT wird das Medium entfernt und die Zellen werden in 100 μl Isopropanol/0,4 N HCl unter Schütteln lysiert. Jedem Well wird ein gleichgroßes Volumen an PBS zugesetzt und die Platten werden zusätzliche 10 Minuten geschüttelt. Die optische Dichte jedes Wells bei 570 nm wird mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät gemessen, um die lebensfähigen Zellen zu quantifizieren.
Mit diesem Assay wurde die Neurotoxizität von gealterten (5 Tage oder 8 Tage) Aβ_1-40-Aggregaten alleine, nicht aber von frischen Aβ_1-40-Monomeren alleine, bestätigt. Die Experimente zeigten, dass die Inkubation von neuronalen Zellen mit steigenden Mengen frischer Aβ-Monomere nicht signifikant toxisch gegenüber Zellen war, wohingegen die Inkubation von Zellen mit steigenden Mengen 5 Tage oder 8 Tage gealterter Aβ_1-40-Aggregate zu einer ansteigenden Neurotoxizität führte. Der EC₅₀ für Toxizität von gealterten Aβ_1-50-Aggregaten war für sowohl PC12- als auch NT2-Zellen 1–2 μM.
Zur Bestimmung des Effektes einer β-Amyloid-Modulator-Verbindung auf die Neurotoxizität von Aβ_1-40-Aggregaten wird eine Modulator-Verbindung mit Aβ_1-40-Monomeren unter den Bedingungen eines wie in Beispiel 2 beschriebenen Standard-Keimbildungs-Assays vorinkubiert, und in bestimmten Zeitintervallen nach der Inkubation werden Aliquots der β-AP/Modulator-Lösung entfernt und 1) die Trübung der Lösung als Maß der Aggregation bestimmt, und 2) die Lösung auf kultivierte neuronale Zellen für 48 Stunden angewendet, wobei nach dieser Zeit die Lebensfähigkeit der Zellen mittels MTT bestimmt wird, um die Neurotoxizität der Lösung zu ermitteln. Zusätzlich kann die Fähigkeit von β-Amyloid-Modulator-Verbindungen, die Neurotoxizität von vorgebildeten Aβ_1-40-Aggregaten zu reduzieren, untersucht werden. In diesen Experimenten werden Aβ_1-40-Aggregate durch Inkubation der Monomeren in Abwesenheit irgendeines Modulators vorgebildet. Die Modulator-Verbindung wird dann mit den vorgebildeten Aβ_1-40-Aggregaten für 24 Stunden bei 37°C inkubiert, wobei nach dieser Zeit die β-AP/Modulator-Lösung gesammelt und deren Neurotoxizität, wie oben beschrieben, ausgewertet wird.
BEISPIEL 7: Assay zur Messung der Stabilität einer Modulator-Verbindung in zerebrospinaler Flüssigkeit
Die Stabilität einer Modulator-Verbindung in zerebrospinaler Flüssigkeit (cerebrospinal fluid, CSF) kann mit einem in vitro-Assay wie folgt untersucht werden. Eine CSF-Lösung wird hergestellt, die 75% Rhesusaffen-CSF (kommerziell erhältlich von Northern Biomedical Research), 23% sterile Phosphat gepufferte Saline und 2% Dimethylsulfoxid (v/v) (Aldrich Chemical Co., Katalognr. 27.685-5) enthält. Testmodulator-Verbindungen werden der CSF-Lösung in einer Endkonzentration von 40 μM oder 15 μM zugesetzt. Die Handhabung der Proben erfolgt stets unter einer Steribank (laminar flow hood) und die Testlösungen werden während des Assays bei 37°C aufbewahrt. Nach 24 Stunden wird die enzymatische Aktivität in den Lösungen durch Zugabe von Acetonitril in einer Endkonzentration von 25% (v/v) gequencht. Die Proben (zu den Zeitpunkten 0 und nach 24 Stunden) werden bei Raumtemperatur mittels Umkehrphasen-HPLC analysiert. Eine Säule mit einem Mikrodurchmesser wird verwendet, um die Empfindlichkeit zu maximieren. Die Parameter für die analytische HPLC sind die folgenden:
Lösungsmittel-System

A: 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser (v/v)
B: 0,085% TFA/Acetonitril, 1% H₂O (v/v)

Injektion und Gradient

Einspritzung: 100–250 μl der Testprobe
Lauf: 10% B für 5 Minuten, danach 10–70% von B über 60 Minuten.

Die chromatographische Auswertung erfolgt mittels einer Hewlett Packard 1090 Serie II HPLC. Die zur Auftrennung verwendete Säule ist eine C4, 5 μm, 1 × 250 mm (Vydac #214TP51). Die Fliessgeschwindigkeit beträgt 50 μl/min und das Elutionsprofil der Testverbindungen wird bei 214, 230, 260 und 280 nm beobachtet.
Der oben beschriebene CSF-Stabilitäts-Assay wurde verwendet, um die CSF-Stabilität einer auf L-Aminosäuren basierenden Modulator-Verbindung (PPI-368 mit der Struktur Cholyl-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-OH) mit einer analogen auf D-Aminosäuren basierenden Peptidsäure (PPI-433 mit der Struktur Cholyl-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-OH) und einem analogen auf D-Aminosäuren basierenden Peptidamid (PPI-457 mit der Struktur Cholyl-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-NH₂) zu vergleichen. Die Ergebnisse, die in dem Balkendiagramm, das in 1 gezeigt ist, zusammengefasst sind, demonstrieren, dass beide auf D-Aminosäuren basierenden Strukturen signifikant höhere Stabilität in CSF zeigen als die auf L-Aminosäuren basierende Verbindung.
BEISPIEL 8: Brain Uptake Assay
Die Gehirnaufnahme (brain uptake) von Test-Modulator-Verbindungen wird mittels der Technik von Oldendorf gemessen (Brain Research (1970) 24:372–376). In diesem etablierten Modell ist der Gehirnaufnahme-Index (brain uptake index, BUI) eine Abschätzung der relativen Fähigkeit einer bestimmten Verbindung, die Blut-Hirn-Schranke zu durchqueren, die als Prozentsatz dieser Fähigkeit, die bei der frei diffundierbaren Referenz Wasser beobachtet wird, ausgedrückt wird. Radiomarkierte Verbindungen werden einem Versuchstier als schneller Bolus (200 μl) in die linke gemeine Carotidarterie (verbunden mit der linken externen Carotidarterie) verabreicht. Das Tier wird 15 Sekunden später geopfert und der Gehalt an Radioaktivität innerhalb des ipsilateralen Vorderhirns bestimmt. Der BUI wird nach der unten angegebenen Formel berechnet:
Der oben beschriebene Assay wurde verwendet, um die Gehirnaufnahme von vier Cholyl-modifizierten Modulator-Verbindungen zu messen: PPI-382 (mit der Struktur Cholyl-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-NH₂) (SEQ ID NO: 33), PPI-457 (mit der Struktur Cholyl-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-NH₂), PPI-458 (mit der Struktur Cholyl-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-NH₂) und PPI-494 (mit der Struktur Cholyl-D-Leu-D-Val-D-Phe-Phenethylamid). Die radioaktive Markierung wurde in die Testverbindung durch Verwendung von ¹⁴C-markierter Cholsäure für die Modifikation eingeführt. Das Medium für die Testverbindungen war 50 mM Cyclodextrin in 75% Phosphat-gepufferter Saline. Wasser wurde als frei diffundierbare Referenz, Sucrose als Negativkontrolle und Cholsäure als Kontrolle für das Diffusionsvermögen der modifizierenden Gruppe verwendet. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle VII zusammengefasst.
Tabelle VII.
Die Ergebnisse deuten an, dass die auf D-Aminosäuren basierenden Verbindungen (PPI-457, PPI-458, PPI-494) größere Gehirnaufnahme als die auf L-Aminosäuren basierende Verbindung (PPI-382) zeigten. Eine Acetyl-modifizierte, auf D-Aminosäuren basierende Verbindung (PPI-472 mit der Struktur Acetyl-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-NH₂) zeigte einen ähnlichen Gehirnaufnahme-Index wie PPI-458 und PPI-494 (d. h. etwa 4,5).
BEISPIEL 9: Analyse zusätzlicher Verbindungen
Zusätzliche Verbindungen wurden unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren untersucht. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen zusammengefasst:
Tabelle VIII
Tabelle IX
Tabelle X
Tabelle XI

Pal = Pyridylalanin
ND = nicht bestimmt

BEISPIEL 10: Gehirnaufnahme von PPI-558
Ein Gehirnaufnahme-Assay wurde verwendet, um die Gehirnaufnahme von Tritium-markiertem PPI-558 (³H-PPI-558) (mit der Struktur: 4-Hydroxybenzoyl-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala-NH₂) zu messen. Das Tritium-markierte PPI-558 wurde mittels der Synthese des Iodo-Phenylalanin- Analogons von PPI-558, gefolgt von reduktiver Tritiolyse der Markierung und HPLC-Reinigung hergestellt. Diese Markierung kann als kommerzielle Dienstleistung, zum Beispiel von Amersham oder New England Nuclear, hergestellt werden.
Männliche Sprague-Dawley-Ratten (259–280 g) erhielten eine einzelne subkutane Injektion in den Nacken (4,6 mg/kg bei 1 ml/kg = 4,6 mg/ml in 100% Sesamöl). Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung (2, 8 und 24 Stunden; n = 4/Zeitpunkt) wurden die Tiere narkotisiert. Rumpfblut wurde entnommen, um die Plasmalevel der Stammverbindung zu bestimmen, und die linke Gehirnseite wurde mit 1 ml Salzlösung für 30 Sekunden über die linke gemeine Carotid-Arterie durchschwemmt. Das Gehirn wurde rasch entfernt und das linke Vorderhirn (durchströmt) wurde einer Kapillar-Depletion unterzogen. Diese Technik sowie das Durchströmen entfernt Blut und Hirnkapillare vom Parenchym und erlaubt daher die genaue Bestimmung des Levels von PPI-558, der die Blut-Hirn-Schranke in das Parenchym durchschritten hat.
Die Konzentration der Stammverbindung (³H-PPI-558) (Mittelwert±SEM) wurde im Plasma (Ergebnisse im Graph von 2 gezeigt) und im Gehirn-Parenchym (Ergebnisse im Graph von 3 gezeigt) bestimmt.
Wie in 4 hervorgehoben (die das Verhältnis von Gehirn- gegen Plasmalevel von PPI-558 zeigt), zeigen die Daten, dass nach einer einzelnen subkutanen Injektion von 4,6 mg/kg PPI-558 nach 2 Stunden 7,4 nM im Plasma vorhanden waren, während die Menge im Gehirn-Parenchym nahezu das Doppelte betrug (14,1 nM). Ähnliche Profile wurden 8 und 24 Stunden nach der Verabreichung beobachtet.
Die Daten erhärten die Möglichkeit, dass der Abbau im Gehirn langsamer erfolgt als im Plasma (beobachtet in i.v.-Bolus-Untersuchungen) und dass bei Aufrechterhaltung der Plasmalevel auch die Gehirnlevel aufrecht erhalten werden können.
BEISPIEL 11: Sicherheitsprofil für PPI-558
PPI-558 wurde weiblichen Sprague-Dawley-Ratten in Dosen von 3 und 30 mg/kg (in 100% Sesamöl) als einzelne subkutane Injektion jeden Tag über 14 Tage hinweg verabreicht. Am 15. Tag wurden die Ratten 1 Stunden nach der Verabreichung geopfert. Mittels Massenspektroskopie wurden für die Gruppen, denen 3 bzw. 30 mg/kg verabreicht wurden, Plasmalevel von 4,9±1,1 ng/ml bzw. 21,8±2,0 ng/ml beobachtet. Es wurde keine offenkundige Toxizität beobachtet. Blutchemie und Hämatologie waren innerhalb normaler Bereiche und die hisologische Analyse verschiedener Organe machte keine Probleme deutlich.
Die angefügte Sequenzliste, deren Inhalte in der unteren Tabelle zusammengefasst sind, bildet einen Teil dieser Offenbarung.
ENTSPRECHUNGEN
Fachleute werden viele Entsprechungen zu den hierin beschriebenen spezifischen Ausführungsformen der Erfindung erkennen oder, unter Einsatz von nicht mehr als Routine-Untersuchnungen, herausfinden können. Solche Entsprechungen sollen von den folgenden Ansprüche umfasst werden.
Sequenzprotokoll:

Claims

Eine Verbindung mit der Struktur: A-(Xaa)-B worin (Xaa) eine peptidische Struktur ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-Phe-Phenethylamid, D-Leu-D-Val-D-Tyr-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-IodoTyr-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Tyr, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-IodoTyr, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala, D-Ala-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu, D-Leu-D-Val-D-Tyr-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-IodoTyr-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Tyr-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-IodoTyr-D-Ala, D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Leu, D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Val, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu, D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, und D-Leu-D-Val-D-Tyr-D-Tyr-D-Ala; A eine aminoterminal modifizierende Gruppe ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Acetyl, Glycyl, Phenylacetyl, Diphenylacetyl, Triphenylacetyl, Butanoyl, Isobutanoyl, Hexanoyl, Propionyl, 3-Hydroxybutanoyl, 4-Hydroxybutanoyl, 3-Hydroxypropionoyl, 2,4-Dihydroxybutyroyl, 1-Adamantancarbonyl, 4-Methylvaleryl, 2-Hydroxyphenylacetyl, 3-Hydroxyphenylacetyl, 4-Hydroxyphenylaceryl, 3,5-Dihydroxy-2-naphthoyl, 3,7- Dihydroxy-2-napthoyl, 2-Hydroxycinnamoyl, 3-Hydroxycinnamoyl, 4-Hydroxycinnamoyl, Hydrocinnamoyl, 4-Formylcinnamoyl, 3-Hydroxy-4-methoxycinnamoyl, 4-Hydroxy-3-methoxycinnamoyl, 2-Carboxycinnamoyl, 3,4-Dihydroxyhydrocinnamoyl, 3,4-Dihydroxycinnamoyl, trans-Cinnamoyl, (±)-Mandelyl, (±)-Mandelyl-(±)-Mandelyl, Glycolyl, 3-Formylbenzoyl, 4-Formylbenzoyl, 2-Formylphenoxyacetyl, 8-Formyl-1-napthhoyl, 4-(Hydroxymethyl)benzoyl, 3-Hydroxybenzoyl, 4-Hydroxybenzoyl, 5-Hydantoinacetyl, L-Hydroorotyl, 2,4-Dihydroxybenzoyl, 3-Benzoylpropanoyl, (±)-2,4-Dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl, DL-3-(4-Hydroxyphenyl)lactyl, 3-(2-Hydroxyphenyl)propionyl, 4-(2-Hydroxyphenyl)propionyl, D-3-Phenyllactyl, 3-(4-Hydroxyphenyl)propionyl, L-3-Phenyllactyl, 3-Pyridylacetyl, 4-Pyridylacetyl, Isonicotinoyl, 4-Chinolincarboxyl, 1-Isochinolincarboxyl und 3-Isochinolincarboxyl; und B eine carboxyterminal modifizierende Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Amidgruppe, eine Alkylamidgruppe, einer Arylamidgruppe und eine Hydroxygruppe ist.
Eine Verbindung mit der Struktur: A-(Xaa)-B worin (Xaa) eine peptidische Struktur ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-Phe-Phenethylamid, D-Leu-D-Val-D-Tyr-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-IodoTyr-D-Phe, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Tyr, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-IodoTyr, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Ala, D-Ala-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu, D-Leu-D-Val-D-Tyr-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-IodoTyr-D-Phe-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Tyr-D-Ala, D-Leu-D-Val-D-Phe-D-IodoTyr-D-Ala, D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Leu, D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Val, D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu und D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Phe-D-Leu. A eine aminoterminal modifizierende Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cholyl, Lithocholyl, Hyodeoxycholyl, Chenodesoxycholyl und Ursodeoxycholyl ist; und B eine carboxyterminal modifizierende Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Amidgruppe, einer Alkylamidgruppe, einer Arylamidgruppe und einer Hydroxygruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 2, worin A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lithocholyl, Hyodeoxycholyl, Chenodeoxylcholyl und Ursodeoxycholyl.
Eine Verbindung mit einer Struktur ausgewählt aus: 3,5-Dihydroxy-2-Naphthoyl-(D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin)-NH₂; 3,7-Dihydroxy-2-Naphthoyl-(D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin)-NH₂; 4-Hydroxybenzyl-(D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin)-NH₂; und 4-Hydroxyphenylacetyl-(D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin)-NH₂.
Eine β-Amyloid Modulator Verbindung umfassend die peptidische Struktur D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu.
Die β-Amyloid Modulator Verbindung nach Anspruch 5, wobei die Verbindung die Struktur A-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-B umfasst worin A. vorhanden sein kann oder nicht vorhanden sein kann, und falls vorhanden, eine N-terminal modifizierende Gruppe ist; und B. vorhanden sein kann oder nicht vorhanden sein kann, und, falls vorhanden, eine C-terminal modifizierende Gruppe ist.
Die β-Amyloid Modulator Verbindung nach Anspruch 6, worin B vorhanden ist und ein Amid, Alkylamid oder Arylamidgruppe ist.
Eine Verbindung mit einer Struktur ausgewählt aus: Diphenylacetyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-NH₂; Triiphenylacetyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-NH₂; Isobutanoyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-NH₂, 4-Methylvaleryl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-NH₂, 3-Hydroxyphenylacetyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-NH₂, 3,5-Dihydroxy-2-naphthoyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-NH₂, 3,5-Dihydroxy-2-naphthoyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin-NH₂, 2-Hydroxyphenylacetyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-NH₂, 3,4-Dihydroxycinnamoyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-NH₂, (±)-Mandelyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-NH₂, (±)-Mandelyl-(±)-Mandelyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin-NH₂, Glycolyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin-NH₂, Glycolyl-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NF₂, D-Leucin-D-Valin-D-Iodotyrosin-D-Phenylalanin-D-Alanin-NH₂, D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Leucin-D-Leucin-NH₂, D-Leucin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, D-Phenylalanin-D-Phenylanalin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Leucin-D-Valin-NH₂, D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Leucin-NH₂, D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Leucin-NH₂, D-Alanin-D-Homophenylalanin-D-Homophenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, D-Leucin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Leucin-NH₂, D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Leucin-NH₂, D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-NH₂, D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-NH₂, Hyodeoxycholyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin-NH₂, Chenodeoxycholyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin-NH₂, Ursodeoxychlolyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin-NH₂, 2,4-Dihydroxybenzoyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin-NH₂, 2-Hydroxycinnamoyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin-NH₂, 3-Hydroxycinnamoyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin-NH₂, 4-Hydroxycinnamoyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin-NH₂, 5-Hydantoinacetyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin-NH₂, 3,4-Dihydroxycinnamoyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin-NH₂, 3-Formylbenzoyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin-NH₂, 2-Formylphenoxyacetyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin-NH₂, 4-Hydroxy-3-methoxycinnamoyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylenalanin-D-Alanin-NH₂, 3,5-Dihydroxy-2-naphthoyl-D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 3,4-Dihydroxycinnamoyl-D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, (±)-Mandelyl-D-Alanin-D-Phenylalnin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 4-Hydroxycinnamoyl-D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, Glycolyl-D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 3,4-Dihydroxycinnamoyl-D-Leucin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, Glycolyl-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, DL-3-(4-Hydroxyphenyl)lactyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Alanin-NH₂, D-3-Phenyllactyl-D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, L-3-Phenyllactyl-D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 3-(2-Hydroxyphenyl)propionyl-D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 4-(2-Hydroxyphenyl)propionyl-D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, D-3-Phenyllactyl-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 3-(2-Hydroxyphenyl)propionyl-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 3-(4-Hydroxyphenyl)propionyl-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, Hydocinnamoyl-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 4-Hydroxybenzoyl-D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, D-3-Phenyllactyl-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, Hydrocinnamoyl-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-PHenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 4-Hydroxybenzoyl-D-Leucin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Leucin-NH₂, Acetyl-D-Leucin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Leucin-NH₂, 3,7-Dihydroxy-2-Naphthoyl-D-Leucin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 4-Hydroxyphenylacetyl-D-Leucin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 3,7-Dihydroxy-2-napththoyl-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 4-Hydroxyphenylacetyl-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 3,7-Dihydroxy-2-napththoyl-D-Pyridylalanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 4-Hydroxybenzoyl-D-Pyridylalanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 3-Pyridylacetyl-D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, Isonicotinoyl-D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, H-Glycyl-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, H-Glycyl-D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 4-Pyridylacetyl-D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 4-Chinolincarboxyl-D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 1-Isochinolincarboxyl-D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Valin-D-Leucin-NH₂, 3-Isochinolincarboxyl-D-Alanin-D-Phenylalanin-D-Phenylalanin-D-Vain-D-Leucin-NH₂, 4-Hydroxybenzoyl-D-Leucin-D-Valin-D-Phenylalanin-D-Tyrosin-D-Alanin-NH₂, 4-Hydroxybenzoyl-D-Leucin-D-Valin-D-Tyrosin-D-Phenylalanin-D-Alanin-NH₂ und 4-Hydroxybenzoyl-D-Leucin-D-Valin-D-Tyrosin-D-Alanin-NH₂.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung nach Anspruch 1 bis 8 und einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Die Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung in der Therapie.
Verbindung nach Anspruch 10, wobei die Therapie die Behandlung der Alzheimer Erkrankung ist.
Verbindung nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Verbindung mit einer detektierbaren Substanz markiert ist.
Verbindung nach Anspruch 12, worin die detektierbare Substanz radioaktives Technetium oder radioaktives Jod ist.
Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Erkrankung welche mit β-Amyloidosis assoziiert ist.
Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zum Detektieren der Gegenwart oder der Abwesenheit von natürlichen β-Amyloid Peptiden in einem Subjekt durch Verabreichung der Verbindung an das Subjekt, wobei die Verbindung mit einer detektierbaren Substanz markiert ist.
Die Verwendung nach Anspruch 15, wobei die detektierbare Substanz radioaktives Technetium oder radioaktives Jod ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, worin die Behandlung oder Diagnose der Alzheimer Erkrankung gemeint ist.