EA010902B1

EA010902B1 - Гуманизированный иммуноглобулин, распознающий бета-амилоидный пептид, фармацевтическая композиция и способ получения иммуноглобулина

Info

Publication number: EA010902B1
Application number: EA200401170A
Authority: EA
Inventors: Гарик Бэзи; Джоз Салданха
Original assignee: Элан Фарма Интернэшнл Лимитед; Вайет
Priority date: 2002-03-12
Filing date: 2003-03-12
Publication date: 2008-12-30
Also published as: EP1554311A2; EP1554311A4; TW200307130A; US20040082762A1; IL163626A0; EA200401170A1; JP2006503549A; PL375159A1; HRP20040950A2; HK1085222A1; SG180018A1; US7256273B2; ZA200406616B; PL215258B1; PE20040207A1; WO2003077858A2; EP1554311B1; MXPA04008740A; CN1703426B; MY139983A

Abstract

Описан гуманизированный иммуноглобулин, который специфически связывается с бета-амилоидным пептидом (Aβ), или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий: (i) легкую цепь, содержащую три гипервариабельных участка (CDRs) последовательности вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина 12В4, изображенной как SEQ ID NO: 2, и вариабельную каркасную область последовательности легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; и (ii) тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина 12В4, изображенной как SEQ ID NO: 4, и вариабельную каркасную область тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина. Иммуноглобулин предназначен для лечения амилоидогенных заболеваний.

Description

Болезнь Альцгеймера (АО) представляет собой прогрессирующее заболевание, приводящее к старческой деменции. См., в целом, 8е1кое, ΤΙΝδ 16:403; Нагбу е! а1., международная заявка АО 92/13069; 8е1кое, 1. №игора11ю1. Ехр. №иго1. 53: 438 (1994); ЭиГГ е! а1., №т.1ге 373: 476 (1995); батек е! а1., №Ш1ге 373: 523 (1995). Вообще говоря, это заболевание делится на два типа: с поздним (позже 65 лет) началом и с ранним началом, которое развивается в пресенильный период, т.е. между 35 и 60 годами. При любом типе заболевания патология одинакова, но аномалии обычно более тяжелы и обширны в случаях, начинающихся в более раннем возрасте. Заболевание характеризуют по меньшей мере два типа поражения мозга: нейрофибриллярные клубки и сенильные бляшки. Нейрофибриллярные клубки представляют собой внутриклеточные отложения связывающегося с микротрубочками тау-белка, состоящего из двух нитей, попарно скрученных друг с другом. Сенильные бляшки (например, амилоидные бляшки) представляют собой участки дезорганизованного нейропиля до 150 мкм с внеклеточными амилоидными отложениями в центре, видимые под микроскопом при исследовании срезов тканей мозга. Аккумуляция амилоидных бляшек в тканях мозга связано также с синдромом Дауна и другими когнитивными нарушениями.

Основным составляющим бляшек является белок, называемый Αβ- или β-амилоидный белок. Αβбелок представляет собой состоящий из 39-43 аминокислот размером 4 кДа внутренний фрагмент более протяженного трансмембранного гликопротеина, называемого белком-предшественником амилоидного белка (АРР). Вследствие протеолитического процессинга АРР при участии различных секретаз Αβ первоначально обнаружен как в короткой форме протяженностью 40 аминокислот, так и в длинной форме протяженностью от 42-43 аминокислот. Часть гидрофобного трансмембранного домена АРР обнаружена на карбоксильном конце Αβ, и она может быть ответственна за способность Αβ объединяться в виде бляшек, в особенности в случае длинной формы. Накопление амилоидных бляшек в мозгу, в конечном счете, приводит к некрозу нейронных клеток. Физические симптомы, обусловленные такого рода деградацией нервной системы, характеризуют болезнь Альцгеймера.

Некоторые мутации АРР белка коррелируют с наличием болезни Альцгеймера. См., например, Соа!е е! а1., №!иге 349: 704 (1991) (валин⁷¹⁷ в изолейцин); СНагбег Наг1ап е! а1., №!иге 353: 844 (1991) (валин⁷¹⁷ в глицин); Мигге11 е! а1., 8с1епсе 254: 97 (1991) (валин⁷¹⁷ в фенилаланин); Ми11ап е! а1., №!иге Оепе!. 1: 345 (1992) (двойная мутация с заменой пары лизин⁵⁹⁵-метионин⁵⁹⁶ на пару аспарагин⁵⁹⁵-лейцин⁵⁹⁶). Полагают, что такие мутации вызывают болезнь Альцгеймера за счет повышения или изменения процессинга АРР в Αβ, в частности процессинга АРР в повышенные количества длинной формы Αβ (т.е. Αβ142 и Αβ1-43). Полагают, что мутации в других генах, таких как гены пресенилинов, Р81 и Р82, опосредованно влияют на процессинг АРР, при котором образуются повышенные количества длинной формы Αβ (см. Нагбу, ΤΙΝδ 20: 154 (1997).

Для определения значения амилоидных бляшек для болезни Альцгеймера успешно применялись мышиные модели (батек е! а1., см. выше, 1ойпкоп-Аооб е! а1., Ргос. №111. Αсаб. δει. υδΑ 94: 1550 (1997)). В частности, когда трансгенным мышам ΡΏΑΡΡ (клетки которых экспрессируют мутантную форму человеческого АРР и у которых болезнь Альцгеймера развивается в раннем возрасте) инъецируют длинную форму Αβ, у них наблюдается как замедление развития болезни Альцгеймера, так и повышение титра антител к белку Αβ (8сНете е! а1., №!иге 400, 173 (1999)). Вышеописанные наблюдения показывают, что белок Αβ, в частности его длинная форма, является элементом, вызывающим болезнь Альцгеймера.

Следовательно, существует необходимость в новых лекарственных средствах и реагентах для лечения болезни Альцгеймера, в частности в лекарственных средствах и реагентах, способных вызывать терапевтический эффект при введении в физиологических (например, нетоксических) дозах.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение включает новые иммунологические реагенты, в частности терапевтические антительные реагенты для предупреждения и лечения заболевания с амилоидной (амилоидогенной) этиологией (например, болезни Альцгеймера). В основе данного изобретения, по меньшей мере, частично лежит идентификация и характеристика моноклонального антитела, которое специфически связывается с пептидом Αβ и эффективно уменьшает бляшечную нагрузку и/или нейритную дистрофию, обусловленные амилоидными нарушениями. Структурный и функциональный анализ этого антитела позволяет создать различные гуманизированные антитела для профилактических и/или терапевтических целей. В частности, данное изобретение охватывает гуманизацию вариабельных областей этого антитела и, соответственно, включает цепи гуманизированного иммуноглобулина или антитела, интактные гуманизированные иммуноглобулины или антитела и функциональные фрагменты иммуноглобулина или антитела, в особенности антигенсвязывающие фрагменты характеристичных (заявляемых) антител.

Основный объектом является гуманизированный иммуноглобулин, который специфически связывается с бета-амилоидным пептидом (Αβ), или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий:

(ί) легкую цепь, содержащую три гипервариабельных участка (СЭРк) последовательности вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина 12В4, изображенной как 8ЕО ΙΟ ΝΟ: 2, и вариабельную каркасную область последовательности легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; и

- 1 010902 (ίί) тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок (СБК.) последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина 12В4, изображенной как 8ЕО ГО N0: 4, и вариабельную каркасную область тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина.

Предлагается также способ, фармацевтическая композиция, содержащая указанный иммуноглобулин.

Краткое описание фигур

На фиг. 1А-В показан сравнительный анализ первичной структуры аминокислотных последовательностей легкой цепи антител: мышиного 12В4 (зрелый пептид, 8Е0 ГО N0: 2), гуманизированного КаЬа1 ГО 005036 (зрелый пептид, 8Е0 ГО N0: 32) и зародышевой линии А19 (Х63397, зрелый пептид, 8Е0 ГО N0: 30). Участки СБК. показаны стрелками и обведены. Единичная обратная мутация остаток человеческой последовательности остаток мышиной последовательности показан звездочкой. Значение закрашенных остатков представлено в подписях к фигурам. Нумерация идет от первого метионина, не нумерация по КаЬаЕ

На фиг. 2А-В показан сравнительный анализ первичной структуры аминокислотных последовательностей тяжелой цепи антител: мышиного 12В4 (зрелый пептид, 8Е0 ГО N0: 4), КаЬа1 ГО 000333 (зрелый пептид, 8Е0 ГО N0: 34) и зародышевой линии антител УН4-39 и УН4-61 (зрелый пептид, 8Е0 ГО N05: 38 и 36, соответственно). Пояснения те же, что и для фиг. 1. Нумерация идет от первого метионина, не нумерация по КаЬаЕ

На фиг. 3 А-Б изображены нуклеотидная и аминокислотная последовательность гуманизированного 12В4УЪу1 в сравнении с химерным 12В4УБ (последовательность вариабельной области идентична последовательности вариабельной области мышиной 12В4УБ, 8Е0 ГО N05: 1 и 2, соответственно); последовательности зародышевой линии (8Е0 ГО N05: 29 и 30, соответственно) и КаЬ1Д ГО 005036 (8Е0 ГО N05: 31 и 32, соответственно);

На фиг. 4Α-Ό изображены нуклеотидная и аминокислотная последовательность гуманизированного 12Β4ΑΗν1 в сравнении с химерным 12В4УН (последовательность вариабельной области идентична последовательности вариабельной области мышиной 12В4УН, 8Е0 ГО N05: 3 и 4, соответственно); КаЬа1 ГО 000333 (8Е0 ГО N05: 33 и 34, соответственно) и последовательности зародышевой линии УН4-61 (8Е0 ГО N05: 35 и 36, соответственно).

На фиг. 5 графически показаны результаты двух независимых экспериментов по определению методом ЕЬ18А связывания химерного 12В4, 3Б6 и химерного 3Б6 с Αβ (панели А и В, соответственно).

На фиг. 6 графически показаны полученные методом конкурентного ЕЬ18А связывания результаты, подтверждающие функциональную активность 12В4 и химерного 12В4 по сравнению с 3Б6 и химерным 3Б6 и 10Б5. Химерный 12В4 (незакрашенные треугольники) конкурирует с равной активностью со своей небиотинилированной мышиной копией (перевернутые незакрашенные треугольники) за связывание биотинилированного мышиного 12В4 с Αβ 1-42.

На фиг. 7 графически изображены результаты ех νίνο анализа фагоцитов, в котором изучается способность химерного 12В4, 3Б6 и человеческого 1дС 1 опосредовать усвоение микроглией белка Αβ на участках ΡΌΑΡΡ мозга.

На фиг. 8 графически изображены результаты двух независимых ех νίνο анализов фагоцитов (панели А и В, соответственно), в которых изучается способность химерного 12В4, гуманизированного 3Б6 и человеческого 1дО1 опосредовать усвоение микроглией белка Αβ на участках ΑΌ мозга.

На фиг. 9 схематически показана репрезентация РСВ-опосредованной сборки гуманизированного 12В4, вариант 1. На фиг. 9А показана сборка участков УЪ. На фиг. 9В показана сборка участков УН.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение охватывает новые иммунологические реагенты и способы предупреждения или лечения болезни Альцгеймера или других амилоидогенных заболеваний. Основой данного изобретения, по меньшей мере, частично является определение характеристик моноклонального иммуноглобулина, 12В4, эффективно связывающего бета-амилоидный белок (Αβ) (например, связывающего растворимый и/или агрегированный Αβ), опосредующего фагоцитоз (например, агрегированного Αβ), снижающего содержание (нагрузку) бляшек и/или уменьшающего нейритную дистрофию (например, у больного). Дополнительным основанием для данного изобретения являются определение и структурная характеристика первичной и вторичной структуры вариабельной легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина 12В4 и идентификация остатков, важных для активности и иммуногенности.

Изобретением охватываются иммуноглобулины, которые включают вариабельную легкую и/или вариабельную тяжелую цепь моноклонального иммуноглобулина 12В4, представленного в данном описании, в том числе предпочтительные иммуноглобулины, например терапевтические иммуноглобулины, которые включают гуманизированную вариабельную легкую и/или гуманизированную вариабельную тяжелую цепь. Предпочтительные вариабельная легкая и/или вариабельная тяжелая цепи включают гипервариабельный участок (СБК.) моноклонального иммуноглобулина (например, иммуноглобулина донора) и вариабельные области каркаса, в основном (главным образом), человеческого акцепторного иммуноглобулина. Выражение в основном (главным образом), человеческого акцепторного иммуноглобулина обозначает, что основную часть или ключевые остатки скелета берут из человеческой акцепторной

- 2 010902 последовательности, допуская, однако, замену остатков в определенных положениях на остатки, выбранные с целью увеличения активности гуманизированного иммуноглобулина (например, изменения активности таким образом, чтобы наиболее точно имитировать активность донорного иммуноглобулина), или с целью понижения иммуногенности гуманизированного иммуноглобулина.

В одном варианте изобретение включает легкую или тяжелую цепь гуманизированного иммуноглобулина, которая содержит гипервариабельный участок (СЭВ) вариабельной области 12В4 (т.е. содержит один, два или три СЭВ-участка последовательности вариабельной области легкой цепи, изображенной как 8ЕО ГО N0: 2, или содержит один, два или три СЭВ-участка последовательности вариабельной области тяжелой цепи, изображенной как 8Е0 ГО N0: 4) и включает вариабельную область скелета последовательности легкой или тяжелой цепи, главным образом, человеческого акцепторного иммуноглобулина, при условии, что по меньшей мере один остаток фрагмента скелета претерпевает обратную мутацию в соответствующий остаток мышиной последовательности, при этом указанная обратная мутация практически не влияет на способность цепи управлять Άβ-связыванием.

В другом варианте данное изобретение включает легкую или тяжелую цепь гуманизированного иммуноглобулина, которая содержит гипервариабельные участки (СОВ) вариабельной области 12В4 (например, содержит один, два или три СОВ-участка последовательности вариабельной области легкой цепи, изображенной как 8Е0 ГО N0: 2, и/или содержит один, два или три СЭВ-участка последовательности вариабельной области тяжелой цепи, изображенной как 8Е0 ГО N0: 4) и включает вариабельную область скелета последовательности легкой или тяжелой цепи, главным образом, человеческого акцепторного иммуноглобулина, при условии, что по меньшей мере один остаток фрагмента скелета замещается на соответствующий аминокислотный остаток последовательности вариабельной области легкой или тяжелой цепи мышиного 12В4, при этом фрагмент каркаса выбирают из группы, состоящей из: (а) остатка, который непосредственно связывается нековалентной связью с антигеном; (б) остатка, прилегающего к СОВ; (в) остатка, взаимодействующего с СОВ (например, идентифицированного путем моделирования легкой и тяжелой цепи на разрешенной структуре гомологичной цепи известного иммуноглобулина); и (г) остатка, находящегося на границе раздела (интерфейс) УЪ-УН.

В другом варианте данное изобретение включает легкую или тяжелую цепь гуманизированного иммуноглобулина, которая содержит участки СОВ вариабельной области 12В4 и вариабельные области каркаса последовательности легкой или тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина при условии, что по меньшей мере один остаток каркаса заменяется на соответствующий аминокислотный остаток последовательности вариабельной области легкой или тяжелой цепи мышиного 12В4, где остаток каркаса представляет собой остаток (фрагмент), способный влиять на конформацию вариабельной области легкой цепи или функционировать как фрагмент, идентифицированный с помощью анализа трехмерной модели вариабельной области, например фрагмент (остаток), способный взаимодействовать с антигеном, остаток, проксимальный к сайту связывания антигена, остаток, способный взаимодействовать с СОВ, остаток, прилегающий к СОВ, остаток в пределах бА от остатка СОВ, твердо установленный (канонический) остаток, остаток в верньер-зоне, остаток межцепной упаковки, необычный остаток или остаток сайта гликозилирования на поверхности структурной модели.

В другом варианте изобретение включает, помимо замен, описанных выше, замену по меньшей мере одного минорного остатка человеческого каркаса. Например, минорный остаток может быть заменен на аминокислотный остаток, общий для последовательностей человеческой вариабельной цепи в этом положении. Или же минорный остаток может быть заменен на соответствующий аминокислотный остаток гомологичной последовательности вариабельной цепи зародышевой линии.

В другом варианте данное изобретение включает гуманизированный иммуноглобулин, который содержит легкую цепь и тяжелую цепь, описанные выше, или антигенсвязывающий фрагмент указанного иммуноглобулина. В приведенном в виде примера варианте изобретения гуманизированный иммуноглобулин связывается (например, специфически связывается) с бета-амилоидным пептидом (Αβ) с аффинностью связывания по меньшей мере 10⁷, 10⁸ или 10⁹ М^-1. В другом варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент включает тяжелую цепь, имеющую изотип γ1. В другом варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент связывается (например, специфически связывается) как с растворимым бета-амилоидным белком (Αβ), так и с агрегированным Αβ. В другом варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент опосредует фагоцитоз (например, индуцирует фагоцитоз) бета-амилоидного белка (Αβ). Еще в одном варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент проникает через гематоэнцефалический барьер субъекта. Еще в одном варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент уменьшает как содержание (нагрузку) бета-амилоидного белка (Αβ), так и нейритную дистрофию у субъекта.

В другом варианте изобретение включает химерные иммуноглобулины, содержащие вариабельные области 12В4 (например, последовательности вариабельной области, изображенные как 8Е0 ГО N0: 2 или 8Е0 ГО N0: 4). Еще в одном варианте изобретения иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно включает константные области 1дО1.

Иммуноглобулины, представленные в данном описании, особенно пригодны для использования в

- 3 010902 терапевтических методах, имеющих целью предупреждение или лечение амилоидогенных заболеваний. В одном варианте настоящее изобретение охватывает способ предупреждения или лечения амилоидогенного заболевания (например, болезни Альцгеймера), который включает введение больному эффективной дозы представленного в данном описании гуманизированного иммуноглобулина. В другом варианте изобретение охватывает фармацевтические композиции, которые включают гуманизированный иммуноглобулин по данному описанию и фармацевтический носитель. Кроме того, охватываются молекулы выделенных нуклеиновых кислот, векторы и клетки-хозяева для продуцирования иммуноглобулинов или фрагментов иммуноглобулинов или цепей по данному описанию, а также способы продуцирования указанных иммуноглобулинов, фрагментов иммуноглобулинов или цепей иммуноглобулинов.

Настоящее изобретение включает далее способ идентификации остатков 12В4, подлежащих замене при продуцировании гуманизированного 12В4 иммуноглобулина, соответственно. Например, способ идентификации остатков вариабельной области скелета, подлежащих замене, включает моделирование трехмерной структуры вариабельной области 12В4 на разрешенной структуре гомологичного иммуноглобулина и анализ указанной модели с целью определения остатков, способных влиять на конформацию или функцию вариабельной области иммуноглобулина 12В4, чтобы идентифицировать остатки, подлежащие замене. Данное изобретение далее включает применение последовательности вариабельной области, изображенной как 8ЕО ΙΌ N0: 2 или 8Е0 ΙΌ N0: 4, или какой-либо ее части для создания трехмерного изображения иммуноглобулина 12В4, цепи иммуноглобулина 12В4 или ее домена.

Далее данное изобретение охватывает иммуноглобулины с измененной эффекторной функцией, такой как способность связываться с эффекторными молекулами, например с комплементом или рецептором рецепторной клетки. В частности, иммуноглобулин по данному изобретению содержит измененную константную область, например Ес область, при этом по меньшей мере один аминокислотный остаток в области Ес замещен другим остатком или боковой цепью. В одном варианте изобретения модифицированный иммуноглобулин является представителем класса 1дС. содержит такую замену по меньшей мере одного аминокислотного остатка в Ес области, что иммуноглобулин имеет измененную эффекторную функцию, например, по сравнению с немодифированным иммуноглобулином. В конкретных вариантах изобретения иммуноглобулин по изобретению имеет эффекторную функцию, измененную таким образом, что он становится менее иммуногенным (например, не вызывает нежелательной активности эффекторных клеток, лизиса или связывания комплемента), обладает свойствами повышенного клиренса амилоида и/или имеет желательный период полужизни.

Для лучшего понимания данного изобретения полезно перед его описанием дать определения некоторых терминов, используемых далее по всему описанию.

Термин иммуноглобулин или антитело (применяемые в данном описании как синонимы) относятся к белку, имеющему основную четырехцепную полипептидную структуру, состоящую из двух тяжелых и двух легких цепей, причем указанные цепи стабилизированы, например, межцепными дисульфидными связями, которые способны специфически связываться с антигеном. Термин одноцепочечный иммуноглобулин или одноцепочечное антитело (применяемые как синонимы в данном описании) относится к белку, имеющему двухцепочечную полипептидную структуру, состоящую из тяжелой и легкой цепей, причем указанные цепи стабилизированы, например, межцепными пептидными линкерами, который обладает способностью специфически связываться с антигеном. Термин домен относится к глобулярной области (участку) тяжелой или легкой цепи полипептида, содержащей пептидные петли (например, содержащие 3-4-пептидные петли), стабилизированные, например, с помощью β-складки и/или внутрицепной дисульфидной связи. Кроме того, домены в данном описании определяются как константные или вариабельные в зависимости от относительного отсутствия изменения внутри доменов различных представителей класса в случае константной области или от значительного изменения внутри областей различных представителей класса в случае вариабельной области. В технике часто, вместо термина домены антитела или полипептида, используют в качестве синонима термин области антитела или полипептида. Понятие константные домены легкой цепи антитела можно выразить взаимозаменяемо как константные области легкой цепи, константные домены легкой цепи, СЬ-области или СЬ-домены. Понятие константные области тяжелой цепи выражается взаимозаменяемо как константные области тяжелой цепи, константные домены тяжелой цепи, СН-области или СН-домены. Понятие вариабельные области легкой цепи антитела выражается взаимозаменяемо как вариабельные области легкой цепи, вариабельные домены легкой цепи, УЪ-области или УЬ-домены. Понятие вариабельные области тяжелой цепи антитела выражается взаимозаменяемо как вариабельные области тяжелой цепи, вариабельные домены тяжелой цепи, УН-области или УН-домены.

Термин область может также относиться к части или участку цепи антитела и/или к домену цепи антитела (например, части или участку тяжелой или легкой цепи или к части или участку константного или вариабельного домена по определению в данном описании), а также к более дискретным частям или участкам указанных цепей или доменов. Например, легкие и тяжелые цепи или вариабельные домены легкой и тяжелой цепи включают гипервариабельные участки, или СОЯ, вкрапленные в остовные (каркасные, скелетные) области, или ЕЯ, по определению в данном описании.

Иммуноглобулины или антитела могут существовать в мономерной или полимерной форме, напри

- 4 010902 мер антитела 1дМ, которые существуют в пентамерной форме, и/или антитела 1дА, которые существуют в мономерной, димерной или мультимерной форме. Термин фрагмент относится к части или участку антитела или цепи антитела, содержащим меньшее число аминокислотных остатков по сравнению с интактным или полным антителом или интактной или полной цепью антитела. Фрагменты можно получать химической или ферментативной обработкой интактного или полного антитела или цепи антитела. Фрагменты можно также получать методами рекомбинантной ДНК. Примеры фрагментов включают фрагменты РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂, РаЬс и/или Ρν. Термин антигенсвязывающий фрагмент относится к полипептидному фрагменту иммуноглобулина или антитела, который связывается с антигеном или конкурирует с интактным антителом (т. е. с интактным антителом, из которого они образованы) за связывание с антигеном (специфическое связывание).

Термин конформация относится к третичной структуре белка или полипептида (например, антитела, цепи антитела, его области или участку). Например, выражение конформация легкой (или тяжелой) цепи относится к третичной структуре вариабельной области легкой (или тяжелой) цепи, а выражение конформация антитела или конформация фрагмента антитела относится к третичной структуре антитела или его фрагмента.

Специфическое связываниеантитела означает, что антитело проявляет заметное сродство к антигену или предпочтительному эпитопу и предпочтительно не проявляет ощутимой перекрестной реактивности. Заметное, ощутимое или предпочтительное связывание включает связывание с величиной аффинности по меньшей мере 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ или 10¹⁰ М^-1. Более предпочтительной является аффинность выше 10⁷ М^-1, предпочтительно выше 10⁸ М^-1. Предполагается, что значения, промежуточные между значениями, представленными выше, также входят в объем настоящего изобретения, и предпочтительная аффинность связывания может быть указана в виде интервала величин аффинности, например 10⁶-10¹⁰ М^-1, предпочтительно 10⁷-10¹⁰ М^-1, более предпочтительно, 10⁸-10¹⁰ М^-1. Антитело, которое не проявляет заметной перекрестной реактивности, представляет собой такое антитело, которое не связывается ощутимо (заметно, в значительной степени) с нежелательным организмом (например, нежелательным белковым телом). Например, антитело, которое специфически связывается с Αβ, в заметной степени (ощутимо) связывает Αβ, но не реагирует в значительной степени с не-Ав-белками или пептидами (например, с не-Ав-белками или пептидами, входящими в состав бляшек). Антитело против предпочтительного эпитопа не будет, например, в заметной степени перекрестно реагировать с отдаленными эпитопами того же белка или пептида. Специфическое связывание можно определять любыми признанными в технике способами определения такого связывания. Предпочтительно специфическое связывание определяют методом 8са1сйагб (Скэтчарда) и/или методами конкурентного связывания.

Связывающие фрагменты получают методами рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных иммуноглобулинов. Связывающие фрагменты включают РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂, РаЬс, Ρν, одиночные цепи и одноцепочечные антитела. Понятно, что иммуноглобулин или антитело, иные, нежели биспецифические или бифункциональные иммуноглобулины или антитела, имеют каждый из своих идентичных сайтов связывания. Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различные пары тяжелой/легкой цепей и два различных сайта связывания. Биспецифические антитела можно получать различными способами, включая слияние гибридом или сшивание фрагментов РаЬ'. См., например, 8оидкМ1а1 & Басктаии. С1ш. Ехр. 1ттипо1. 79: 315- 321 (1990); Кок1е1иу е! а1., 1. 1ттипо1. 148, 1547-1553 (1992).

Термин гуманизированный иммуноглобулин или гуманизированное антитело относится к иммуноглобулину или антителу, которое содержит по меньшей мере одну гуманизированную цепь иммуноглобулина или антитела (т.е. по меньшей мере одну гуманизированную легкую или тяжелую цепь). Термин гуманизированная цепь иммуноглобулина или гуманизированная цепь антитела (т.е. гуманизированная легкая цепь иммуноглобулина или гуманизированная тяжелая цепь иммуноглобулина) относится к цепи иммуноглобулина или антитела (т.е. к легкой или тяжелой цепи, соответственно), содержащей вариабельную область, которая включает вариабельный остовной участок, главным образом, человеческого иммуноглобулина или антитела и гипервариабельные участки (СЭК.) (например по меньшей мере один СЭВ, предпочтительно два СЭК, более предпочтительно три СЭК), главным образом, нечеловеческого иммуноглобулина или антитела и дополнительно включает константные области (например по меньшей мере одну константную область или ее часть в случае легкой цепи и предпочтительно три константные области в случае тяжелой цепи).

Термин гуманизированная вариабельная область (участок) (например, гуманизированная вариабельная область легкой цепи или гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи) относится к вариабельной области, которая включает вариабельную остовную область, главным образом, человеческого иммуноглобулина или антитела и гипервариабельные участки (СЭВ), главным образом, нечеловеческого иммуноглобулина или антитела.

Выражение главным образом (в основном, практически, в значительной степени), человеческого иммуноглобулина или антитела или главным образом (и т.д.), человеческий означает, что при сравнении первичной структуры с аминокислотной последовательностью человеческого иммуноглобулина или

- 5 010902 антитела идентичность области с последовательностью человеческой остовной или константной области составляет по меньшей мере 80-90%, предпочтительно 90-95%, более предпочтительно 95-99% (т.е. локальная идентичность последовательности), допуская, например, консервативные замены, замены согласованной последовательности, замены зародышевой линии, обратные мутации и т.п. Введение консервативных замен, замен согласованной последовательности, замен зародышевой линии, обратных мутаций и т.п. часто называют оптимизацией гуманизированного антитела или цепи. Выражение главным образом (в основном, и т.д.), нечеловеческого иммуноглобулина или антитела или главным образом (в основном, и т.д.), нечеловеческий означает наличие последовательности иммуноглобулина или антитела, по меньшей степени на 80-95%, предпочтительно на 90-95%, более предпочтительно на 96-99% идентичной последовательности из иного организма, нежели человек, например иного млекопитающего, нежели человек (не человека).

Соответственно, все области или остатки гуманизированного иммуноглобулина или антитела или иммунизированной цепи иммуноглобулина или антитела, за исключением, возможно, СЭВ, практически идентичны соответствующим областям или остаткам одной или более последовательностей нативного человеческого иммуноглобулина. Термин соответствующая область или соответствующий остаток относится к области или остатку во второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая(ый) занимает то же самое (т.е. эквивалентное) положение, что и область или остаток в первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, когда проводят сравнение первичных структур первой и второй последовательностей при оптимальном их взаимном расположении.

Термин значительная (заметная) идентичность означает, что две полипептидные последовательности при оптимальном способе сравнения первичных структур, например, с помощью программ САР или ΒΕ8ΤΗΤ с применением весов гэпов по умолчанию идентичны по меньшей мере на 50-60%, предпочтительно на 60-70%, более предпочтительно, когда последовательности идентичны по меньшей мере на 70-80%, еще более предпочтительна идентичность последовательностей по меньшей мере 80-90%, еще более предпочтительна идентичность последовательностей по меньшей мере 90-95%, и еще более предпочтительно, когда последовательности идентичны по меньшей мере на 95% или более (например, последовательности идентичны на 99% или более).

Термин практическая идентичность означает, что две полипептидные последовательности при оптимальном способе сравнения первичных структур, например, с помощью программ САР или ΒΕ8ΤΡΊΤ с применением весов гэпов по умолчанию идентичны по меньшей мере на 80-90%, предпочтительно последовательности идентичны по меньшей мере на 90-95% и более предпочтительно, когда последовательности идентичны по меньшей мере на 95% или более (например, последовательности идентичны на 99% или более). При сравнении последовательностей обычно одна последовательность является эталонной, с которой сравнивают испытуемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей испытуемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, если требуется, устанавливают координаты субпоследовательностей и устанавливают параметры алгоритма сравнения последовательностей. Затем, используя алгоритм сравнения последовательностей, вычисляют процент идентичности последовательностей для испытуемой(ых) последовательности(ей) с эталонной последовательностью на основе введенных параметров программы.

Оптимальный сравнительный анализ первичной структуры последовательностей можно осуществлять, например, при использовании локального алгоритма гомологий 8нШ11 & \Уа1сгтап. Αάν. Арр1. Ма111. 2: 482 (1981), алгоритма упорядочивания (выравнивания) гомологий №еб1етап & ХУшъек 1. Мо1. Βίο1. 48: 443 (1970), метода поиска подобия по Реагкоп & Ыртап, Ргос. Νη11. Асаб. 8с1. И8А 85: 2444 (1988), компьютерной реализацией этих алгоритмов (САР, ΒΕ8ΤΕΙΤ, ΕΑ8ΤΑ и ΤΕΑ8ΤΑ в программном обеспечении ХУЕсопЧп Сепебск 8оП\уаге Раскаде, Сепебск СотриГег Сгоир, 575 8с1епсе Όγ., Мабкоп, XVI) и с помощью визуального наблюдения (см., в целом, АикиЬе1 е! а1., СштепГ Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Еюкду). Одним примером алгоритма, пригодного для определения процента идентичности последовательностей и подобия последовательностей, является алгоритм Β^Α8Τ. описанный в А1Гксби1 е! а1., 1. Мо1. Βω1. 215: 403 (1990). Программное обеспечение для осуществления анализа Β^Α8Τ является общедоступным с помощью Ыабопа1 СепГег Гог Β^οΐесЬпο1οду 1иГогтабоп (через интернет-сервер Ыабопа1 1пкбГиГек о! Неабб ΝΟΒΙ). Как правило, для проведения сравнения последовательностей можно использовать параметры программы по умолчанию, хотя можно также применять специальные (приспособленные) параметры (настроить). Для аминокислотных последовательностей программа Β^Α8ΤР по умолчанию использует разрядность (V) 3, ожидание (Е) 10 и оценочную матрицу Β^Ο8υМ62 (см. НешкоГГ & НешкоГГ, Ргос. N311 Асаб. 8с1. И8А 89: 10915 (1989)).

Предпочтительно положения остатков, которые не являются идентичными, различаются консервативными аминокислотными заменами. В целях классификации аминокислотных замен, как консервативных, так и неконсервативных, аминокислоты группируют следующим образом: группа I (гидрофобные боковые цепи): 1еи, теГ, а1а, νа1, 1еи, бе; группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): сук, кег, Гбг; группа III (кислые боковые цепи): акр, д1и; группа IV (основные боковые цепи): акп, д1п, Ык, 1ук, агд; группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): д1у, рго; и группа VI (ароматические боковые цепи): !гр, Гуг, рбе. Консервативные замены включают замены на аминокислоты того же класса. Неконсервативные

- 6 010902 замены представляют собой замену представителя одного из этих классов на представитель другого класса.

Предпочтительно гуманизированные иммуноглобулины или антитела связывают антиген с аффинностью, в 3, 4 или 5 раз большей аффинности соответствующего нечеловеческого антитела. Например, если величина аффинности связывания нечеловеческого антитела составляет 10⁹ М^-1, гуманизированное антитело будет иметь аффинность связывания по меньшей мере 3х10⁹ М^-1, 4х10⁹ М^-1 или 10⁹ М^-1. При описании свойств связывания цепи иммуноглобулина или антитела можно основываться на ее способности контролировать (управлять, направлять) связывание с антигеном (например, с Αβ). Говорят, что цепь контролирует связывание с антигеном, когда она сообщает интактному иммуноглобулину или антителу (или его антигенсвязывающему фрагменту) свойство специфического связывания или аффинность связывания. Говорят, что мутация (например, обратная мутация) существенно (практически) влияет на способность тяжелой или легкой цепи контролировать (направлять и т. д.) связывание с антигеном, если она влияет (например, уменьшает) на аффинность связывания интактного иммуноглобулина или антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего указанную цепь, по меньшей мере, на порядок по сравнению с аффинностью связывания антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего эквивалентную цепь, в которой отсутствует указанная мутация. Мутация практически не влияет (например, в сторону понижения) на способность цепи контролировать (направлять и т.п.) связывание с антигеном, если она влияет (например, в сторону понижения) на аффинность связывания интактного иммуноглобулина или антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего указанную цепь, только в 2, 3 или 4 раза по сравнению с аффинностью связывания антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего эквивалентную цепь, не содержащую указанной мутации.

Термин химерный иммуноглобулин или химерное антитело относится к иммуноглобулину или к антителу, легкая и тяжелая цепи которого образованы из первых видов, а константные области образованы из второго вида. Химерные иммуноглобулины или антитела можно конструировать, например, методами генной инженерии (рекомбинантной ДНК) из сегментов генов иммуноглобулина, принадлежащих к различным видам. Предполагается, что термины гуманизированный иммуноглобулин или гуманизированное антитело не охватывают химерные иммуноглобулины или антитела по нижеприведенному описанию. Хотя гуманизированные иммуноглобулины или антитела являются химерными по своей конструкции (т.е. содержат области из более чем одного вида белка), они имеют дополнительные характерные особенности (т.е. вариабельные области, содержащие донорные СЭР остатки и акцепторные остовные остатки), не обнаруживаемые в химерных иммуноглобулинах или антителах по данному описанию.

Антиген представляет собой объект (например, белковый объект или пептид), с которым специфически связывается антитело.

Термин эпитоп или антигенная детерминанта относится к сайту антигена, с которым специфически связывается иммуноглобулин или антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент). Эпитопы могут быть образованы как из смежных аминокислот, так и несмежных аминокислот, накладывающихся друг на друга при трехмерной (третичной) укладке белка. Эпитопы, образованные из соседних аминокислот, как правило, сохраняются при обработке денатурирующим растворителем, тогда как эпитопы, образованные при третичной укладке, как правило, утрачиваются под действием денатурирующих растворителей. Эпитоп, как правило, содержит по меньшей мере 3-15 аминокислот в единственной (уникальной) пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеноструктурный анализ и двухмерный ядерный магнитный резонанс. См., например, Ерйоре Марршд Рго1оео1к ίη Мебюбк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 66, С.Е. Мотк, Еб. (1996).

Антитела, которые распознают один и тот же эпитоп, можно идентифицировать простым иммуноанализом, показывающим способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью, т.е. методом конкурентного связывания. Конкурентное связывание определяют таким методом анализа, при котором испытуемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном, таким как Αβ. Известно много методов анализа конкурентного связывания (конкурентно-связывающего анализа): твердофазный прямой или непрямой радиоиммуноанализ (РИА, ΚΙΑ), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (ИФА, ΕΙΑ), конкурентный иммуноферментный сэндвич-анализ (см. 81аНН е1 а1., МеЛобк ίη Епхушо1оду 9: 242 (1983)); твердофазный прямой иммуноферментный анализ (ΕΙΑ) с применением биотина-авидина (см. Кйк1апб е1 а1., 1. 1шшипо1. 137: 3614 (1986)); твердофазный прямой анализ с мечением, твердофазный прямой сэндвич-анализ с меткой (см. Наг1оте апб Ьапе, ЛпбЬоб1е5: Α ЬаЬогаФгу Мапиа1., Со1б 8ргшд НагЬог Ргекк (1988)); твердофазный прямой радиоиммуноанализ (ΡΙΑ) с меткой I¹²⁵ (см. Моге1 е1 а1., Мо1. 1шшипо1. 25 (1): 7 (1988)); твердофазный прямой иммуноферментный анализ (ΕΙΑ) с применением биотина-авидина (Сйеипд е1 а1., У1го1оду 176: 546 (1990)) и прямой радиоиммуноанализ (Κ.ΙΑ) с меткой (Мо1бепйаиег е1 а1., 8еапб. 1. 1ттипо1. 32: 77 (1990)). Как правило, такой анализ включает использование очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью, или клеток с каким-либо антигеном, немеченого испытуемого иммуноглобулина и меченого эталонного иммуноглобулина. Конкурентное торможение измеряют, определяя количество метки, связанной с твердой поверхностью или клетками в присутствии испытуемого

- 7 010902 иммуноглобулина. Обычно испытуемый иммуноглобулин присутствует в избытке. И обычно, когда конкурентное антитело присутствует в избытке, оно тормозит специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном по меньшей мере на 50-55%, 55-60%, 60-65%. 65-70%, 70-75% или более.

Эпитоп также распознается иммунокомпетентными клетками, например В-клетками и/или Т-клетками. Клеточное распознавание эпитопа можно определить ίη νίίτο методами анализа, в которых измеряют антигензависимую пролиферацию, такими как включение ³Н-тимидина, секреция цитокинов, секреция антитела или антигензависимый цитолиз (анализ цитотоксических Т-лимфоцитов).

Примеры эпитопов или антигенных детерминант можно обнаружить в человеческом амилоидном белке-предшественнике (АРР), но предпочтительно их находят в Λβ-пептиде АРР. Существует много изоформ АРР, например АРР⁶⁹⁵, АРР⁷⁵¹ и АРР⁷⁷⁰. Аминокислотам в молекуле АРР даются номера в соответствии с последовательностью изоформы АРР⁷⁷⁰ (см., например, СепВапк АсссФоп Νο. Р05067). Пептид Αβ (также в данном описании называемый бета-амилоидный пептид и А-бета) представляет собой внутренний фрагмент АРР (размером примерно 4 кДа), состоящий из 39-43 аминокислот (Αβ39, Ав40, Ав41, Ав42 и Ав43). Ав40, например, состоит из остатков 672-711 АРР, а Αβ42 состоит из остатков 673713 АРР. В результате протеолитического процессинга АРР различными секретазами ίη νίνο или ίη δίΐιι. Αβ обнаруживается как в короткой форме протяженностью в 40 аминокислот, так и в длинной форме протяженностью в 42-43 аминокислоты. Предпочтительные эпитопы или антигенные детерминанты по данному описанию локализованы на Ν-конце Αβ-пептида и включают остатки 1-10 пептида Αβ, предпочтительно остатки 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 или 3-7 пептида Αβ42. Дополнительные эпитопы или антигенные детерминанты включают остатки 2-4, 5, 6, 7 или 8 пептида Αβ, остатки 3-5, 6, 7, 8 или 9 пептида Αβ или остатки 4-7, 8, 9 или 10 пептида Αβ42. Когда говорят, что антитело связывается с эпитопом в указанных остатках, таких как Αβ 3-7, подразумевают, что это антитело специфически связывается с полипептидом, содержащим указанные остатки (т.е. Αβ 3-7 в данном примере). Такое антитело не обязательно контактирует с каждым остатком в Αβ 3-7. Не обязательно каждая единичная замена или делеция в Αβ 37 заметно влияет на аффинность связывания.

Термин амилоидное заболевание включает любое заболевание, ассоциируемое с (или вызываемое) образованием или отложением нерастворимых амилоидных фибрилл. Примеры амилоидных заболеваний включают, но без ограничения, системный амилоидоз, болезнь Альцгеймера, диабет у взрослых, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона (Хантингтона), лобно-височную деменцию и вызванные прионами трансмиссивные губчатые энцефалопатии (куру и болезнь Крейтцфельдта (Кройцфельдта)-Якоба у человека и скрепи и В8Е у овец и крупного рогатого скота, соответственно). Различные амилоидные заболевания определяют или отличают по характеру полипептидного компонента отлагающихся фибрилл. Например, у субъектов или пациентов с болезнью Альцгеймера β-амилоидный белок (например, дикого типа, вариант или усеченный β-амилоидный белок) является отличительным полипептидным компонентом амилоидного отложения. Следовательно, болезнь Альцгеймера является примером заболевания, характеризуемого отложениями белка Αβ'', или заболевания, обусловленного отложениями белка Αβ'', например, в мозгу субъекта или пациента. Термины β-амилоидный белок, β-амилоидный пептид, β-амилоид, Αβ'' и пептид Αβ'' используют в данном описании взаимозаменяемо в качестве синонимов.

Иммуногенный агент или иммуноген способен индуцировать аутоиммунологическую реакцию организма при введении млекопитающему, не обязательно в сочетании с адъювантом.

Термин лечение по данному описанию определяется как применение терапевтического агента в выделенных тканях или клеточной линии пациента или введение терапевтического агента в выделенные ткани или клеточную линию пациента, у которого наблюдается заболевание, симптомы заболевания или предрасположенность к заболеванию, с целью лечения, излечения, ослабления, облегчения, изменения, исправления, уменьшения, достижения положительной динамики в течении заболевания, симптомов заболевания или предрасположенности к заболеванию или влияния на заболевание, симптомы заболевания или предрасположенность к заболеванию.

Термин эффективная доза или эффективная дозировка определяется как количество, достаточное для достижения или по меньшей мере частичного достижения заданного эффекта. Термин терапевтически эффективная доза определяется как количество, достаточное для излечения или по меньшей мере частичного прекращения заболевания и его осложнений у больного, уже страдающего этим заболеванием. Количество, эффективное для такого применения, зависит от тяжести инфекции и общего состояния иммунной системы больного.

Термин пациент, больной включает человека и других млекопитающих, которые получают профилактическое или терапевтическое лечение.

Термин растворимый или диссоциированный Αβ относится к неагрегированному или дезагрегированному Αβ-полипептиду. Термин нерастворимый Αβ относится к агрегированному Αβ-полипептиду, включая мономерный растворимый, а также олигомерный растворимый Αβ-полипептид (например, растворимые Αβ-димеры, тримеры и т.п.). Термин нерастворимый Αβ относится к агрегированному

- 8 010902

Αβ-полипептиду, например к Αβ, ассоциированному за счет нековалентных связей. Полагают, что Αβ (например, Αβ42) агрегирует, по меньшей мере частично, благодаря присутствию гидрофобных остатков на С-конце пептида (часть трансмембранного домена АРР). Растворимый Αβ можно обнаружить ίη νίνο в биологических жидкостях, таких как спинно-мозговая жидкость (ликвор) и/или сыворотка. Или же растворимый Аβ можно получить, растворяя лиофилизированный пептид в чистом ДМСО под действием ультразвука. Образовавшийся раствор центрифугируют (например, при 14000х д, 4°С, 10 мин) для удаления нерастворимых частиц.

Термин эффекторная функция относится к активности, которая наблюдается в Ре области антитела (например, 1дО антитела) и включает, например, способность антитела связываться с эффекторными молекулами, такими как комплемент и/или рецепторы Рс, которые могут контролировать некоторые иммунные функции антитела, такие как активность эффекторных клеток, лизис, опосредованная комплементом активность, клиренс антитела и период полужизни антитела.

Термин эффекторная молекула относится к молекуле, способной связываться с Рс-областью антитела (например, 1дО антитела), включая, но без ограничения, белок комплемента или Рс-рецептор.

Термин эффекторная клетка относится к клетке, способной связываться с Рс-участком антитела (например, 1дО антитела), как правило, с помощью Рс-рецептора, экспрессируемого на поверхности эффекторной клетки, включая, но без ограничения, лимфоциты, например антигенпрезентирующие клетки и Т-клетки.

Термин Рс-область (участок) относится к С-концевой области 1дО антитела, в частности к С-концевой области тяжелой (тяжелых) цепи (цепей) 1дО антитела. Хотя границы области Рс и тяжелой цепи 1дО могут немного меняться, Рс-область, как правило, определяют как область, заполняющую пространство от аминокислотного остатка Сук226 до карбоксильного конца тяжелой (тяжелых) цепи (цепей) 1дО.

Если не указано иначе, термин нумерация по КаЬа! определяется как нумерация остатков, например, в тяжелой цепи 1дО антитела с применением ЕЙ индекса, как указано в КаЬа! е! а1. (Зесщепсек οί Рго!ешк οί 1шшипо1од1са1 1п1сгск1. 5^4Ь Еб. Νηΐίοηηΐ 1пк1би!ек οί Неабб, Ве!бекба, ΜΌ, (1991)), специально введенного в данное описание в качестве ссылки.

Термин Рс-рецептор или РсК. относится к рецептору, который связывается с Рс-областью антитела. Типичные Рс-рецепторы, которые связываются с Рс-областью антитела (например, 1дО антитела), включают, но без ограничения, рецепторы для подклассов РсуШ, РсуКН и РсуКШ, включая аллельные варианты и формы этих рецепторов с альтернативной утратой при сплайсинге. Обзор рецепторов Рс дан в Кауе1сб апб Кше!, Αηη. Κον. Iттиηο1 9: 457-92 (1991); Саре1 е! а1. Iттиηοтеίбοбκ 4: 25-34 (1994); и бе Наак е! а1. 1. ЬаЬ. С1ш. Меб. 126: 330-41 (1995).

Иммунологические и терапевтические реагенты

Иммунологические и терапевтические реагенты по изобретению содержат иммуногены или антитела или их функциональные или антигенсвязывающие фрагменты по данному описанию или состоят из них. Известно, что основная структурная единица антитела состоит из четырех субъединиц (тетрамер). Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара содержит одну легкую (около 25 кДа) и одну тяжелую (около 50-70 кДа) цепь. Аминоконцевой участок каждой цепи включает вариабельную область (домен) протяженностью около 100-110 или более аминокислот, главным образом, ответственных за распознавание антигена. Карбоксиконцевой участок каждой цепи определяет константную область, в первую очередь, отвечающую за эффекторную функцию.

Легкие цепи классифицируют либо как каппа (к), либо как лямбда (λ), и их протяженность составляет около 230 остатков. Тяжелые цепи классифицируют как гамма (у), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) или эпсилон (ε), их протяженность составляет около 450-600 остатков, и они определяют изотип антитела как 1дО, 1дМ, ^Α, 1дЭ и 1дЕ, соответственно. Как тяжелая, так и легкая цепи скручиваются (укладываются) в домены (области). Термин домен, область относится к глобулярной области белка, например иммуноглобулина или антитела. Домены иммуноглобулина или антитела включают, например, три или четыре пептидные петли, стабилизированные за счет β-складки и межцепной дисульфидной связи. Интактные легкие цепи имеют, например, два домена (У_ъ и СЦ, а интактные тяжелые цепи содержат, например, четыре или пять доменов (У_Н, С_Н1, С_Н2 и С_Н3).

Внутри легкой и тяжелой цепей вариабельные и константные области соединяются областью 1, содержащей около 12 или более аминокислот, при этом тяжелая цепь также содержит область Ό, состоящую примерно из 10 аминокислот (см., в целом, Рипбашеп1а1 Iттиηο1οду (Раи1, ^., еб., 2пб еб. Кагеп Ргекк, Ν.Υ. (1989), Сб. 7, вводимую в качестве ссылки во всей полноте для всех целей).

Вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь образуют сайт связывания антитела. Таким образом, интактное антитело имеет два сайта связывания. Два сайта связывания одинаковы, за исключением бифункциональных или биспецифических антител. Все цепи имеют одинаковую общую структуру, состоящую из относительно консервативных остовных областей (РК), соединенных тремя гипервариабельными участками, также называемыми СЭК. Природные цепи или цепи, полученные методом рекомбинантной ДНК, можно экспрессировать при участии лидерной последовательности, которая удаляется в результате клеточного процессинга, и в результате получают цепь зрелого белка. Цепи

- 9 010902 зрелого белка с неприродной (искусственной) лидерной последовательностью можно также получать методами рекомбинантной ДНК, например, с целью повышения секреции или изменения процессинга конкретной интересующей цепи.

СПК-участки двух зрелых цепей каждой пары выравнивают по остовным областям, делающим возможным связывание со специфическим эпитопом. От Ν-конца до С-конца как легкая, так и тяжелая цепи содержат домены РК1, СЭЮ, РК2, ί.ΌΡ2. РК3, СЭР3 и РК4. РК4 в технике также называют областью Ό/1 вариабельного домена тяжелой цепи и областью 1 вариабельного домена легкой цепи. Отнесение аминокислот к каждому домену делают в соответствии с определениями КаЬа!, 8сс.|испсс5 о£ Рго1еш8 о£ 1ттипо1ощса1 1п1сгсз( (Ναΐίοηαΐ 1п51йи1е5 о£ Неа11й, ВеШекба, ΜΌ, 1987 апб 1991). Альтернативное определение структуры предложено Сйо1Ыа е! а1., 1. Μοί. ΒίοΙ. 196: 901 (1987); №1Шге 342: 878 (1989); апб 1. Μοί. Вю1. 186: 651 (1989) (далее в данном описании вместе цитируемые как С’1ю11иа е! а1. и вводимые ссылкой во всей полноте с любой целью).

Антитела к Αβ

Терапевтические агенты по изобретению включают антитела, которые специфически связываются с Αβ или другими компонентами амилоидных бляшек. Предпочтительные антитела являются моноклональными. Некоторые такие антитела специфически связываются с агрегированной формой Αβ, не связываясь с растворимой формой. Некоторые антитела специфически связываются с растворимой формой, не связываясь с агрегированной формой. Некоторые антитела связываются как с агрегированной, так и с растворимой формами. Антитела, используемые для терапевтических целей, предпочтительно имеют интактную константную область или по меньшей мере часть константной области, достаточную для взаимодействия с рецептором Рс. Предпочтительными антителами являются такие антитела, которые эффективно стимулируют Рс-опосредованный фагоцитоз Αβ в бляшках. Предпочтительным является человеческий изотип 1дО1, так как он имеет наивысшую среди человеческих изотипов аффинность к рецептору РсК1 фагоцитов (например, в макрофагах, расположенных в мозгу, или микроглии). Человеческий 1дО1 является эквивалентом мышиного 1§С2а, последний, следовательно, пригоден для испытания ίη у1уо на животных (например, мышиных) моделях болезни Альцгеймера. Также можно использовать биспецифические фрагменты РаЬ, у которых одно плечо антитела специфично в отношении Αβ, а другое - в отношении рецептора Рс. Предпочтительные антитела связываются с Аβ с аффинностью связывания, более высокой, чем (или равной) примерно 10⁶-10¹⁰ Μ^-1 (включая промежуточные значения).

Моноклональные антитела связываются со специфическим эпитопом в Αβ, который может представлять собой конформационный или неконформационный эпитоп. Профилактическую и терапевтическую эффективность антител можно проверять, используя методики работы с трансгенными животными моделями, описанные примерах. Предпочтительные моноклональные антитела связываются с эпитопом в пределах остатков 1-10 Αβ (первый Ν-концевой остаток природного Αβ обозначен 1), более предпочтительно с эпитопом в пределах остатков 3-7 Αβ. В некоторых методах используют множественные моноклональные антитела, обладающие специфичностью связывания с различными эпитопами, например антитело, специфическое к эпитопу, находящемуся в остатках 3-7 Αβ, можно вводить вместе с антителом, специфическим к эпитопу, расположенному вне остатков 3-7 Αβ. Такие антитела можно вводить последовательно или одновременно. Можно также использовать (например, вводить или вводить совместно) антитела к амилоидным компонентам, иным, нежели Αβ.

Эпитопную специфичность антитела можно определить, например, создавая библиотеку фагового дисплея, в которой различные члены библиотека выявляют различные последовательности Αβ. Затем с помощью библиотеки фагового дисплея выбирают ее представители, специфически связывающиеся с испытуемым антителом. Выделяют семейство последовательностей. Как правило, такое семейство содержит общую ядерную последовательность и фланкирующие последовательности различной протяженности у различных ее членов. Наиболее короткая ядерная последовательность, проявляющая специфичность связывания с антителом, определяет эпитоп, связанный антителом. Антитела также можно испытывать на эпитопную специфичность методом конкурентного связывания при использовании антитела, эпитопная специфичность которого определена. Например, антитела, которые конкурируют с антителом 12В4 за связывание с Αβ, связываются с тем же или аналогичным эпитопом, что и 12В4, т.е. находящимся в границах остатков Αβ 3-7. Скрининг антител на эпитопную специфичность помогает прогнозировать терапевтическую эффективность. Например, антитело, для которого определено связывание с эпитопом внутри остатков 1-7 белка Αβ, по-видимому, эффективно предупреждает и лечит болезнь Альцгеймера в соответствии с методологией по данному изобретению.

Антитела, которые специфически связываются с предпочтительным сегментом Αβ, не связываясь с другими областями Αβ, имеют ряд преимуществ в сравнении с моноклональными антителами, связывающимися с другими областями, или с поликлональными сыворотками против интактного Αβ. Вопервых, при равных весовых дозах дозы антител, которые специфически связываются с предпочтительными сегментами, содержат более высокие молярные дозы антител, эффективно очищающих от амилоидных бляшек. Во-вторых, антитела, специфически связывающиеся с предпочтительными сегментами,

- 10 010902 могут инициировать очищение от амилоидных отложений, не вызывая такой реакции очищения у интактного полипептида АРР, тем самым, уменьшая возможные побочные эффекты.

Получение нечеловеческих антител

Настоящее изобретение охватывает нечеловеческие антитела, например антитела, специфические в отношении предпочтительных Αβ эпитопов по изобретению. Такие антитела можно использовать для приготовления различных терапевтических композиций по изобретению, или предпочтительно они предоставляют гипервариабельные участки с целью получения гуманизированных или химерных антител (подробно описанных ниже). Получать нечеловеческие моноклональные антитела можно, например, иммунизируя животное пептидом Αβ. Получение нечеловеческих моноклональных антител, например мышиных, морских свинок, приматов, кроличьих или крысиных, можно осуществлять, например, иммунизацией животных с помощью Αβ. Также можно использовать более протяженный полипептид, содержащий Αβ, или иммуногенный фрагмент Αβ, или антиидиотипические антитела к антителу к Αβ (Наг1оте & Ьаие, см. выше (вводится в качестве ссылки для любых целей)). Такой иммуноген можно получать из природного источника пептидным синтезом или рекомбинантной экспрессией. Необязательно, иммуноген можно вводить в виде слитого белка или в виде полученного иным способом комплекса с белкомносителем, как описано ниже. Необязательно, иммуноген можно вводить с адъювантом. Термин адъювант относится к соединению, которое при введении в сочетании с антигеном усиливает иммунный ответ на антиген, но при индивидуальном введении не вызывает иммунного ответа на антиген. Адъюванты могут усиливать иммунный ответ по нескольким механизмам, включая рекрутинг лимфоцитов, стимуляцию В- и/или Т-клеток и стимуляцию макрофагов. Некоторые типы адъювантов можно использовать, как описано ниже. Для иммунизации лабораторных животных предпочтительным является полный адъювант Фрейнда с последующим неполным адъювантом.

Для получения поликлональных антител обычно используются кролики или морские свинки. Препарат поликлональных антител, например, для пассивной защиты можно приготовить следующим образом. 125 нетрансгенных мышей иммунизируют, вводя 100 мкг Αβ 1-42 плюс адъювант ΟΡΑ/ΙΡΑ, и умерщвляют через 4-5 месяцев. У иммунизированных мышей берут кровь. 1дС отделяют от других компонентов крови. Антитело, специфическое в отношении иммуногена, можно частично очистить аффинной хроматографией. В среднем, от мыши получают около 0,5-1 мг иммуногенспецифического антитела, а всего получают 60-120 мг.

Для получения моноклональных антител, как правило, используют мышей. Можно приготовить моноклональные антитела против фрагмента, инъецируя фрагмент или более протяженную форму Αβ мыши, получая гибридомы и подвергая гибридомы скринингу на антитело, которое специфически связывается с Αβ. Необязательно, антитела подвергают скринингу на связывание со специфической областью заданного фрагмента Αβ в отсутствие связывания с другими неперекрывающимися фрагментами Αβ. Последний скрининг можно осуществлять, определяя связывание антитела с коллекцией делетированных мутантов пептида Αβ и выясняя, какие из делетированных мутантов связываются с антителом. Связывание можно оценивать, например, вестерн-блоттингом или методом ΕΟδΑ. Наименьший фрагмент, у которого обнаружено специфическое связывание с антителом, определяют как эпитоп к антителу. Или же эпитопную специфичность можно определять конкурентным анализом, в котором испытуемое и эталонное антитела конкурируют за связывание с Αβ. Если испытуемое и эталонное антитела конкурируют, тогда они связываются с тем же самым эпитопом или с теми же самыми эпитопами достаточно проксимально, так что связывание одного антитела мешает связыванию другого антитела. Предпочтительным изотипом для таких антител является мышиный изотип 1дС2а или эквивалентный изотип в других видах. Мышиный изотип 1дС2а является эквивалентным человеческому изотипу 1дС 1 (например, человеческому 1дС1).

Химерные и гуманизированные антитела

Настоящее изобретение также охватывает химерные и/или гуманизированные антитела (т.е. химерные и/или гуманизированные иммуноглобулины), специфические в отношении бета-амилоидного пептида. Химерные и/или гуманизированные антитела имеют одинаковую или аналогичную специфичность и аффинность связывания, что и мышиное или другое нечеловеческое антитело, которое предоставляет исходный материал для конструкции химерного или гуманизированного антитела.

Получение химерных антител

Термин химерное антитело относится к антителу, гены легкой и тяжелой цепей которого созданы обычно методом рекомбинантной ДНК из сегментов гена иммуноглобулина, принадлежащих к разным видам. Например, вариабельные (V) сегменты генов мышиного моноклонального антитела могут быть соединены с человеческими константными (С) сегментами, такими как 1дС1 и 1дС4. Предпочтительным является человеческий изотип 1дС1. Таким образом, типичное химерное антитело представляет собой гибридный белок, состоящий из V или антигенсвязывающего домена мышиного антитела и С или эффекторного домена человеческого антитела.

Получение гуманизированных антител

Термин гуманизированное антитело относится к антителу, содержащему по меньшей мере одну

- 11 010902 цепь, включающую остатки остова вариабельной области, главным образом, цепи человеческого антитела (называемого акцепторный иммуноглобулин или акцепторное антитело), и по меньшей мере один гипервариабельный участок, главным образом, мышиного антитела (называемого донорный иммуноглобулин или донорное антитело). См. Циееп е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 86: 10029- 10033 (1989), патенты США 5530101, 5585089, 5693761, 5693762, 8ейск е! а1., международная заявка \'О 90/07861, и \\'ппег. патент США 5225539 (вводимые в качестве ссылок во всей полноте для любых целей). Константная(ые) область(и), если таковая(ые) имее(ю)тся, берут, также в основном или полностью, из человеческого иммуноглобулина.

Наиболее вероятно, что замена мышиных СОЯ на остов человеческой вариабельной области приводит к сохранению их корректной пространственной ориентации, если каркас человеческой вариабельной области принимает ту же конформацию, что и остов мышиной вариабельной области, из которой взяты СЭЯ, или сходную с ней. Этого достигают, получая человеческие вариабельные области из человеческих антител, остовные последовательности которых в высокой степени идентичны вариабельным областям мышиного каркаса, из которых взяты СЭЯ. Вариабельные остовные области тяжелой и легкой цепей могут быть взяты из одной и той же последовательности или из разных последовательностей человеческого антитела. Последовательности человеческого антитела могут представлять собой последовательности природных человеческих антител или согласованные последовательности нескольких человеческих антител. См. КеШеЬотоидй е! а1., Рто!еш Еидшеегшд 4: 773 (1991); Ко1Ьшдет е! а1., Рто!еш Еидшеегшд 6: 971 (1993) и СаЛет е! а1., международная заявка \О 92/22653.

После идентификации гипервариабельных участков мышиного донорного иммуноглобулина и соответствующих человеческих акцепторных иммуноглобулинов следующей стадией является определение, какие остатки, если только есть такие остатки, из этих компонентов следует заместить для оптимизации свойств образующегося в результате гуманизированного антитела. Как правило, замена человеческих аминокислотных остатков на мышиные должна быть сведена к минимуму, так как введение мышиных остатков повышает риск того, что антитело вызовет у людей реакцию антитела человека на антитело козы (НАМА). Мониторинг НАМА ответа у конкретного больного или в ходе клинических испытаний можно осуществлять признанными в технике методами определения иммунного ответа. У больных, которым вводят гуманизированные антитела, можно оценивать иммуногенность в начале и в ходе проведения указанной терапии. НАМА-ответ измеряют, например, определяя антитела к гуманизированному терапевтическому реагенту в образцах сыворотки крови больных известным специалисту в данной области техники методом, включая технологию резонанса на длине волны поверхностного плазмона (В1АСОЯЕ) и/или твердофазный ЕЫ8А анализ.

Некоторые аминокислоты остова вариабельной области человеческой последовательности выбирают для замены, исходя из их возможного влияния на конформацию СЭЯ и/или связывание с антигеном. Неестественное наложение мышиных СЭЯ участков на человеческую вариабельную область может привести к неестественным конформационным затруднениям, которые, если не корректировать с применением аминокислотных замен, приводят к утрате аффинности связывания.

Селекцию аминокислотных остатков для замены частично осуществляют с помощью компьютерного моделирования. Компьютерные аппаратные средства и программное обеспечение для получения трехмерного изображения молекул иммуноглобулина представлены в данном описании. В целом, молекулярные модели получают, исходя из решенных структур иммуноглобулиновых цепей или их доменов. Сравнивают аминокислотные последовательности модельных цепей с цепями или доменами решенных трехмерных структур на предмет нахождения сходства между ними, и цепь(и) или домен(ы) с наибольшим сходством последовательностей выбирается(ются) в качестве отправной точки для построения молекулярной модели. Для моделирования выбирают цепи или модели, последовательности которых идентичны по меньшей мере на 50%, и предпочтительно для моделирования выбирают цепи или модели, последовательности которых идентичны по меньшей мере на 60, 70, 80, 90% или более. Решенные (расшифрованные) исходные структуры модифицируют, чтобы учесть (сделать поправку на) различия между действительными аминокислотами в моделируемых цепях или доменах иммуноглобулина и аминокислотами в исходной структуре. Затем модифицированные структуры собирают в составной иммуноглобулин.

Наконец, модель уточняют по минимуму энергии и проверяют, чтобы все атомы находились на соответствующем расстоянии друг от друга и чтобы длины связей и углы не выходили за допустимые с точки зрения химии пределы.

Селекцию аминокислотных остатков для замены можно также проводить частично, изучая характеристики аминокислот, занимающих конкретное местоположение, или эмпирически, наблюдая на опыте эффекты замены или мутагенеза конкретной аминокислоты. Например, если в остове мышиной вариабельной области и в остове выбираемой человеческой вариабельной области аминокислоты различаются, человеческую остовную аминокислоту обычно следует заменить эквивалентной остовной аминокислотой мышиного антитела, когда логично ожидать, что аминокислота:

(1) непосредственно связывается с антигеном нековалентной связью, (2) прилегает к СЭЯ-участку, (3) иным образом взаимодействует с СЭЯ-участком (например, находится на расстоянии около 3-6 А

- 12 010902 от участка СЭР. как определено компьютерным моделированием) или (4) участвует в УЬ-УН интерфейсе.

Остатки. которые непосредственно связываются с антигеном нековалентной связью. включают аминокислоты в положениях в остовных областях. где имеется высокая вероятность взаимодействия с аминокислотами антигена в соответствии с установленными химическими взаимодействиями. такими. например. как водородная связь. взаимодействие Ван дер Ваальса. гидрофобные взаимодействия и т.п.

СОВ и остовные области определяются по КаЬа! е! а1. или С1о11иа е! а1.. см. выше. Когда остовные остатки. по определению КаЬа! е! а1.. см выше. составляют остатки структурной петли. по определению С1о11иа е! а1.. см. выше. аминокислоты мышиного антитела можно отбирать для замены в гуманизированное антитело. Остатки. которые прилегают к СЭР-участку. включают аминокислотные остатки в положениях. непосредственно прилегающих к одному или более СОВ в первичной последовательности гуманизированной цепи иммуноглобулина. например в положениях. непосредственно прилегающих к СОВ по определению КаЬа! или СОВ по определению С1о11иа (см.. например. С1о!Ыа апб Ьекк. 1ΜΒ 196: 901 (1987)). По-видимому. эти аминокислоты в особенности взаимодействуют с аминокислотами в областях СОВ и. будучи выбраны из акцептора. деформируют СОВ и снижают аффинность. Помимо этого. прилегающие аминокислоты могут взаимодействовать непосредственно с антигеном (Лтй е! а1.. 8е1епее. 233: 747 (1986). вводится в данное описание в качестве ссылки). и выбор этих аминокислот из донора может быть желательным для сохранения всех связей (контактов) антигена. благодаря которым оригинальное антитело обладает аффинностью.

Остатки. которые иным образом взаимодействуют с СИВ-участком (областью). включают такие остатки. для которых с помощью анализа вторичной структуры определена ориентация. подходящая для того. чтобы влиять на участок (область) СОВ. В одном варианте изобретения остатки. которые иным образом взаимодействуют с СИВ-участком. определяют. анализируя трехмерную модель донорного иммуноглобулина (например. компьютерную модель). Трехмерная модель. как правило. оригинального (первоначального) донорного антитела. показывает. что некоторые аминокислоты вне участков СОВ расположены близ участков СОВ и имеют хорошую возможность взаимодействовать с аминокислотами участков СОВ за счет водородных связей. сил Ван дер Ваальса. гидрофобного взаимодействия и т.д. В этих аминокислотных положениях можно выбрать. скорее. аминокислоту донорного иммуноглобулина. нежели аминокислоту акцепторного иммуноглобулина. Аминокислоты. соответствующие этому критерию. как правило. содержат атом в боковой цепи в пределах примерно 3 А от некоего атома в области СОВ и должны иметь некий атом. который мог бы взаимодействовать с атомами СОВ за счет известных химических взаимодействий. таких как перечисленные выше.

В случае атомов. которые могут образовывать водородную связь. 3 А - это расстояние. измеренное между их ядрами. но в случае атомов. которые не образуют связь. 3 А - это расстояние. измеренное между их ван-дер-ваальсовыми поверхностями. Следовательно. в последнем случае расстояние между ядрами составляет около 6 А (3 А плюс сумма ван-дер-ваальсовых радиусов) для атомов. рассматриваемых как способные взаимодействовать. Во многих случаях расстояние между ядрами составляет от 4 или 5 до 6 А. При определении. может ли аминокислота взаимодействовать с участками СЭВ. предпочтительно не рассматривать последние 8 аминокислот тяжелой цепи СЭВ2 как часть СЭВ. так как с точки зрения структуры эти 8 аминокислот ведут себя. скорее. как часть каркаса.

Аминокислоты. которые способны взаимодействовать с аминокислотами в СЭВ. можно идентифицировать еще одним способом. Доступную для растворителя площадь поверхности каждой остовной аминокислоты вычисляют двумя путями: (1) в интактном антителе и (2) в гипотетической молекуле. состоящей из антитела. у которого удалены его СЭВ. Значительная разница между этими значениями. около 10 кв.А или более. показывает. что доступ остовной аминокислоты к растворителю. по меньшей мере. частично блокирован участками СЭВ и. следовательно. у аминокислоты есть контакт с областями СЭВ. Площадь поверхности аминокислоты. доступную для растворителя. можно вычислить. исходя из трехмерной модели антитела. используя алгоритмы. известные в технике (например. Соппо11у. 1. Арр1. Сгуз1. 16: 548 (1983) и Ьее апб В1ейагб8. 1. Мо1. Бю1. 55: 379 (1971). каждая из этих статей вводится в данное описание в качестве ссылки). Остовные аминокислоты могут также иногда взаимодействовать с участками СЭВ опосредованно. влияя на конформацию другой остовной аминокислоты. которая. в свою очередь. контактирует с СЭВ.

Известно. что аминокислоты в некоторых положениях в каркасе способны взаимодействовать с участками СИВ во многих антителах (С1о!Ыа апб Ьекк. см. выше; С1о!Ыа е! а1.. см. выше. и Тгатоп!апо е! а1.. 1. Мо1. Бю1. 215: 175 (1990). каждый из этих документов вводится в данное описание в качестве ссылки). Следует заметить. известно. что аминокислоты в положениях 2. 48. 64 и 71 легкой цепи и 26-30. 71 и 94 тяжелой цепи (нумерация по КаЬа!) способны взаимодействовать с участками СИВ многих антител. Аминокислоты в положениях 35 легкой цепи и 93 и 103 тяжелой цепи. по-видимому. также взаимодействуют с участками СИВ. Во всех перечисленных положениях в гуманизированном иммуноглобулине предпочтительно. чтобы осуществлялся выбор. скорее. донорной аминокислоты. нежели акцепторной аминокислоты (когда они различаются). С другой стороны. некоторые остатки. способные взаимодействовать с участком СИВ. такие как первые 5 аминокислот легкой цепи. иногда можно выбирать из акцеп

- 13 010902 торного иммуноглобулина без утраты аффинности в гуманизированном иммуноглобулине.

Остатки, которые участвуют в УЪ-УН интерфейсе, или остатки упаковки включают эти остатки на границе раздела (интерфейс) между УЪ и УН по определению, например, ΝονοΙπν апб НаЬег, Ргос. Ыа11. Асаб. 8с1. И8А, 82: 4592-16 (1985) или С1о!Ыа е! а1., см. выше. В целом, необычные остатки упаковки следует оставлять в гуманизированном антителе, если они отличаются от остатков в каркасах человеческих антител.

Как правило, заменяются одна или более аминокислот, удовлетворяющих вышеприведенным критериям. В некоторых вариантах изобретения заменяются все или большинство аминокислот, удовлетворяющих вышеприведенным критериям. Иногда, когда имеется некоторая неясность, удовлетворяет ли конкретная аминокислота вышеуказанным критериям, получают альтернативные варианты иммуноглобулинов, один из которых содержит эту конкретную замену, а другие нет. Полученные таким образом альтернативные варианты иммуноглобулинов можно испытывать любым представленным в данном описании методом анализа заданной активности и выбирают предпочтительный иммуноглобулин.

Обычно участки СИЯ в гуманизированных антителах практически идентичны, и более обычно идентичны соответствующим участкам СИЯ донорного антитела. Хотя обычно это нежелательно, иногда возможно сделать одну или более консервативных аминокислотных замен остатков СИЯ, не влияя заметно на аффинность связывания образующегося в результате гуманизированного иммуноглобулина. Под консервативными заменами понимают такие комбинации, как д1у, а1а, уа1, бе, 1еи; акр, д1и; акп, д1п; кет, !1ιγ; 1ук, агд; и рЬе, !уг.

Дополнительными кандидатами на замену являются акцепторные человеческие остовные аминокислоты, необычные или редкие (минорные) для человеческого иммуноглобулина в этом положении. Эти аминокислоты могут быть заменены на аминокислоты, находящиеся в эквивалентном положении мышиного донорного антитела или в эквивалентных положениях более типичных человеческих иммуноглобулинов. Например, замена может быть желательной, когда аминокислота в человеческой остовной области акцепторного иммуноглобулина является редкой (минорной) для этого положения, а соответствующая аминокислота в донорном иммуноглобулине обычна для этого положения в последовательностях человеческого иммуноглобулина; или когда аминокислота в акцепторном иммуноглобулине является минорной для этого положения и соответствующая аминокислота в донорном иммуноглобулине также является редкой по сравнению с другими человеческими последовательностями. Эти критерии помогают гарантировать, что атипическая аминокислота каркаса человеческой последовательности не разрушит структуру антитела. Кроме того, замена необычной человеческой акцепторной аминокислоты на аминокислоту донорного антитела, которая случайно оказывается типичной для человеческих антител, может сделать гуманизированное антитело менее иммуногенным.

Термин редкий (минорный), применяемый в данном описании, показывает, что аминокислота в данном положении встречается в репрезентативной выборке последовательностей примерно менее чем в 20%, но обычно примерно менее чем в 10% последовательностей; а термин обычный, общий, применяемый в данном описании, указывает, что аминокислота в данном положении встречается в репрезентативной выборке последовательностей примерно более чем в 25%, но обычно примерно более чем в 50% последовательностей. Например, все человеческие последовательности вариабельной области легкой и тяжелой цепи делят, соответственно, на подгруппы последовательностей, которые особенно гомологичны друг другу и содержат одинаковые аминокислоты в определенных важных положениях (КаЬа! е! а1., см. выше). При решении вопроса, является ли аминокислота в человеческой акцепторной последовательности редкой, минорной или обычной в человеческих последовательностях, часто предпочтительно рассматривать только человеческие последовательности в той же подгруппе, что и акцепторная последовательность.

Дополнительными кандидатами на замену являются акцепторные человеческие остовные аминокислоты, которые идентифицируют как часть участка СЭЯ по альтернативному определению С1о!Ыа е! а1., см. выше. Дополнительными кандидатами на замену являются акцепторные человеческие остовные аминокислоты, которые идентифицируют как часть участка СЭЯ при определениях АЬМ и/или контактов (соединений).

Дополнительными кандидатами на замену являются акцепторные человеческие остовные остатки, которые соответствуют редкому или необычному донорному остовному остатку. Редкие или необычные донорные остовные остатки представляют собой такие остатки, которые являются редкими или необычными (по данному описанию) для мышиных антител в этом положении. Для мышиных антител подгруппу можно определить по КаЬа! и положения остатков, которые отличаются от консенсусных, идентифицируют. Эти донорспецифические различия могут указать на соматические мутации в мышиной последовательности, которые повышают активность. Сохраняют необычные остатки, которые прогнозируемо влияют на связывание, тогда как остатки, которые, как показывает прогноз, не являются важными для связывания, можно заменить.

Дополнительными кандидатами на замену являются остатки незародышевой линии в акцепторной остовной области. Например, когда цепь акцепторного антитела (например, цепь человеческого антитела, в значительной степени идентичную цепи донорного антитела) выравнивают с цепью антитела заро

- 14 010902 дышевой линии (аналогичным образом в значительной степени идентичной донорной цепи), остатки, не соответствующие каркасу акцепторной цепи и каркасу цепи зародышевой линии, можно заменить на соответствующие остатки из последовательности зародышевой линии.

Иные, нежели специфические аминокислотные замены, обсуждаемые выше, остовные области гуманизированных иммуноглобулинов обычно практически идентичны, и более обычно идентичны остовным областям человеческих антител, из которых они образованы. Конечно, многие аминокислоты остовной области вносят малый непосредственный вклад или не вносят никакого непосредственного вклада в специфичность или в аффинность антитела. Таким образом, многие отдельные консервативные замены остовных остатков могут допускаться без заметного изменения специфичности или аффинности получающегося в результате гуманизированного иммуноглобулина. Так, в одном варианте изобретения вариабельная остовная область гуманизированного иммуноглобулина по меньшей мере на 85% идентична последовательности человеческой вариабельной остовной последовательности или консенсусу таких последовательностей. В другом варианте изобретения вариабельная остовная область гуманизированного иммуноглобулина по меньшей мере на 90%, предпочтительно на 95%, еще более предпочтительно на 96-99% идентична последовательности человеческой вариабельной остовной последовательности или консенсусу таких последовательностей. Однако, в целом, такие замены нежелательны.

Предпочтительно, когда гуманизированные антитела проявляют специфическую аффинность в отношении антигена, составляющую по меньшей мере 10^7-10¹⁰ М^-1. Обычно верхний предел аффинности связывания гуманизированных антител с антигеном в 3, 4 или 5 раз больше верхнего предела аффинности связывания донорного иммуноглобулина. Часто нижний предел аффинности связывания также в 3, 4 или 5 раз больше нижнего предела аффинности связывания донорного иммуноглобулина. Или же аффинность связывания можно сравнить с аффинностью связывания гуманизированного антитела, не содержащего замен (например, антитела, содержащего донорные участки СИК и акцепторные РК, но не содержащего замены РК). В таких примерах предпочтительное связывание оптимизированного антитела (с заменами) по меньшей мере в 2-3 или в 3-4 раза больше, чем связывание незамещенного антитела. С целью сравнения можно определять активность различных антител, например, с помощью В1АСОКЕ (т.е. резонанса на длине волны поверхностного плазмона с применением немеченых реагентов) или анализами конкурентного связывания.

Получение гуманизированных антител 12В4

Предпочтительный вариант настоящего изобретения включает гуманизированное антитело к Ν-концу Αβ, в частности, для применения в терапевтических и/или диагностических методах по данному описанию. Особенно предпочтительным исходным материалом для получения гуманизированных антител является 12В4. 12В4 специфично в отношении Ν-конца Αβ и, как было показано, опосредует фагоцитоз (например, индуцирует фагоцитоз) амилоидных бляшек. Клонирование и секвенирование кДНК, кодирующей вариабельные области тяжелой и легкой цепи антитела 12В4, описано в примере I.

Соответствующие последовательности человеческого акцепторного антитела определяют с помощью компьютерного сравнения аминокислотных последовательностей вариабельных областей мышиного антитела с последовательностями известных человеческих антител. Сравнение осуществляют отдельно для тяжелой и для легкой цепей, но принципы этого сравнения одинаковы. В частности, вариабельные домены человеческих антител, в которых наблюдается высокая степень идентичности остовных последовательностей с мышиными УЪ и УН остовными областями, идентифицируют по запросу к базе данных КаЬа!, используя Νί’ΒΙ ВЬА8Т (доступ через интернет-сервер Ναΐίοηαΐ ИъШШех ο£ НеаИй Νί’ΒΙ). с соответствующими мышиными остовными последовательностями. В одном варианте изобретения выбирают акцепторные последовательности, более чем на 50% идентичные мышиным донорным последовательностям. Предпочтительно выбирают последовательности акцепторных антител с идентичностью 60, 70, 80, 90% или более.

Компьютерное сравнение 12В4 показало, что последовательность легкой цепи 12В4 имеет наибольшую степень идентичности человеческим легким цепям подтипа каппа ΙΙ и что у последовательностей тяжелых цепей 12В4 наиболее высокая степень идентичности человеческим тяжелым цепям подтипа II, по определению КаЬа! е! а1., см. выше. Таким образом, легкие и тяжелые человеческие остовные области предпочтительно получают из человеческих антител этих подтипов или из консенсусных (согласованных) последовательностей таких подтипов. Предпочтительные человеческие вариабельные области легкой цепи, которые наиболее идентичны соответствующей области 12В4, получены из антитела, имеющего по КаЬа! ГО номер 005036. Предпочтительные человеческие вариабельные области тяжелой цепи, которые наиболее идентичны соответствующей области 12В4, получены из антитела, имеющего по КаЬа! ГО номер 000333, антитела, имеющего регистрационный номер в ОепЬапк ААВ35009, и антитела, имеющего регистрационный номер в ОепЬапк ΑΑΌ53816, причем предпочтительным является антитело, имеющее по КаЬа! ΙΌ номер 005036.

Затем остатки для замены выбираются следующим образом. Если в вариабельной остовной области 12В4 и в эквивалентной человеческой вариабельной остовной области аминокислоты различаются, человеческую остовную аминокислоту обычно следует заменить эквивалентной остовной аминокислотой

- 15 010902 мышиного антитела, когда логично ожидать, что аминокислота:

(1) непосредственно связывается с антигеном нековалентной связью, (2) прилегает к СЭВ-участку. является частью участка СОВ по альтернативному определению, предложенному С1о11иа с1 а1., см. выше, или другим способом взаимодействует с участком СОВ (например, в пределах примерно 3 А от участка СОВ), или (3) участвует в УЪ-УН интерфейсе.

Компьютерное моделирование вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела 12В4 и гуманизация антитела 12В4 описаны в примере У. Коротко говоря, трехмерную модель создают на основе наиболее близких решенных структур мышиного антитела для тяжелой и легкой цепей. Модель далее уточняют с помощью нескольких стадий минимизации энергии для выявления нежелательных атомных контактов и оптимизации электростатических и ван-дер-ваальсовых взаимодействий.

Информация о трехмерной структуре антител, представленных в данном описании, является общедоступной, ее можно получить в банке данных Векеагсй Со11аЬога1огу Гог §1гис1ига1 Вю1пГогтайс8' Рго1ст Эа1а Вапк (ΡΌΒ). Свободный доступ в ΡΌΒ можно получить через \Уог1б \У1Не \УеЬ (сеть интернет), и ΡΌΒ описан Вегтап е1 а1. (2000) М1с1е1с Ас1б§ Векеагсй, 28: 235. Компьютерное моделирование позволяет идентифицировать СЭВ-взаимодействующие участки. Компьютерное моделирование структуры 12В4 может, в свою очередь, служить отправной точкой для прогнозирования трехмерной структуры антитела, содержащего гипервариабельные участки 12В4, замещаемые в человеческих остовных структурах. Можно конструировать дополнительные модели, представляющие структуру, получающуюся по мере введения дополнительных аминокислотных замен.

В целом, желательна замена одной, большинства или всех аминокислот, удовлетворяющих вышеуказанным критериям. Соответственно, гуманизированные антитела по настоящему изобретению обычно содержат замену остовного остатка человеческой легкой цепи соответствующим остатком 12В4 по меньшей мере в 1, 2, 3 или более выбранных положений. Гуманизированные антитела также обычно содержат замену остовного остатка человеческой тяжелой цепи соответствующим остатком 12В4 по меньшей мере в 1, 2, 3 или более выбранных положений.

Однако иногда, когда имеется некоторая неясность, соответствует ли конкретная аминокислота вышеуказанным критериям, получают альтернативные варианты иммуноглобулинов, один из которых содержит эту конкретную замену, а другие нет. В примерах, в которых замена на остаток мышиной последовательности вводит остаток, редкий (минорный) для конкретного положения человеческого иммуноглобулина, желательным может быть тестирование антитела на активность с конкретной заменой и без нее. Если активность (например, аффинность связывания и/или специфичность связывания) с заменой и без замены примерно одинакова, может быть предпочтительным антитело без замены, так как полагают, что оно вызывает менее сильный ΗΆΜΆ-ответ по данному описанию.

Другими кандидатами для замены являются человеческие остовные аминокислоты, необычные в данном положении для иммуноглобулинов. Эти аминокислоты могут быть заменены аминокислотами, находящимися в эквивалентном положении более типичных человеческих иммуноглобулинов. Или же аминокислоты в эквивалентных положениях в мышином 12В4 можно вводить в человеческие остовные области, когда такие аминокислоты являются типичными для человеческого иммуноглобулина в эквивалентных положениях.

Другие кандидаты для замены представляют собой остатки незародышевой линии, расположенные в остовной области. Проведенное компьютерное сравнение 12В4 с известными последовательностями зародышевой линии показывает, что можно идентифицировать последовательности зародышевой линии с наибольшей степенью идентичности последовательностей тяжелой или легкой цепи. Совмещение (выравнивание) последовательностей остовной области и последовательности зародышевой линии выявляет, какие остатки можно выбрать для замены на соответствующие остатки зародышевой линии. Остатки выбранного акцепторного каркаса легкой цепи, не совпадающие с остатками одной из этих последовательностей зародышевой линии, можно выбирать для замены на соответствующий остаток зародышевой линии.

В табл. 1 суммированы результаты анализа последовательностей областей УН и УЪ антитела 12В4. Представлены дополнительные мышиные и человеческие структуры, которые можно использовать для компьютерного моделирования антитела 12В4 и дополнительных человеческих антител, а также последовательности зародышевой линии, которые можно использовать при выборе аминокислотных замен. Редкие (минорные) остатки мышиных последовательностей также представлены в табл. 1. Редкие остатки мышиных последовательностей идентифицируют, сравнивая донорные УЪ и/или УН последовательности с последовательностями других членов подгруппы, к которой принадлежат донорные последовательности УЪ и/или УН (по КаЬа1), и определяют положения остатков, которые отличаются от консенсуса. Эти донорспецифические различия могут указывать на соматические мутации, которые повышают активность. Необычные или редкие остатки, расположенные рядом с сайтом связывания, вероятно, могут контактировать с антигеном, тогда желательно сохранить остаток мышиной последовательности. Однако, если необычный остаток мышиной последовательности не является важным для связывания, предпочтительно использовать соответствующий акцепторный остаток, так как остаток мышиной последова

- 1б 010902 тельности может создать иммуногенные неоэпитопы в гуманизированном антителе. В тех ситуациях, когда необычный остаток в донорной последовательности, действительно, является обычным остатком в соответствующей акцепторной последовательности, предпочтительным, естественно, является акцепторный остаток.

Таблица 1

Краткие сведения о последовательности V области антитела 12В4

Цепь	УЬ	УН
Мышиная подгруппа	II	1Ь
Человеческая подгруппа	II	II
Редкие аминокислоты (% встречаемости)	К107 (0.542%)	ТЗД11,Ы2, Г24, 841, N75, ϋ83, А85
Канонический класс по С1обиа	Ь1: -класс 4[1πηί] Ь2: класс 1[11тк] ЬЗ: класс 1[1ίβί]	Н1: класс 3 [1д§1] Н2: -класс 1
Ближайшая разрешённая структура мышиного МАЬ	2РСР (2.2А)	1ΕΤΖ (2.6 А)
Гомология с матрицей для моделирования	94%	80%
Человеческая остовная последовательность	КАВГО 005036	1- КАВГО 000333 2- ААВ3509/1А7 3- ААО53816
Эталонная зародышевая линия для Ни Гг	АЗ/х12690& А19/Х63397	1: УН4-39/АВ019439/ ВАА75036ю1 2: УН2-5/АВ019440/ ВАА75057.1

Последовательности КаЬа! ГО, на которые даны ссылки в данном описании, являются общедоступными, например, через базу данных №г111\ус51сгп ИшусгШу В1отсб1са1 Еидтссгшд ЭсраПтспк КаЬа! Эа1аЬа5С о£ 8сс.|испсс5 о£ Рго1сш8 о£ 1ттипо1од1са1 йИсгсШ. Информацию о трехмерной структуре антител, представленную в данном описании, можно получить из банка данных Ясксагсй Со11аЬога!огу £ог 81гис1ига1 ВюшГогтайск' Рго1ст Эа1а Вапк (ΡΌΒ). Свободный доступ в ΡΌΒ можно получить через интернет (^ог1б \\!бс ^сЬ), путь описан Всгтап с! а1. (2000) ЖсШс Άαάδ Ясксагсй, р.235-242. Доступ к последовательностям гена зародышевой линии, на которые имеются ссылки в данном описании, можно получить через базу данных последовательностей в коллекциях V генов 1дй, 1д каппа аиб 1д лямбда зародышевых линий (Национального Центра информации по биотехнологии (№Пюпа1 Сси!сг £ог В1о1ссйио1оду 1пГогтайои (Ж’В1)) (в качестве отделения Национальной медицинской библиотеки (№1юпа1 ЫЬгагу о£ Мсбюшс (ЖМ)) при Национальном Институте здоровья (№-11юпа1 1иййи1с8 о£ Нсайй (ΝΙΗ)). Поиск гомологий в базе данных NСΒI 1д Ссгтйис Ссиск (Гены 1д зародышевой линии) предоставлен с помощью 1дС ВЬЛ§Т™.

В предпочтительном варианте гуманизированное антитело по настоящему изобретению содержит: (ί) легкую цепь, включающую вариабельный домен, содержащий участки СОЯ АЪ мышиного 12В4, и человеческий акцепторный каркас (остов), причем остов содержит по меньшей мере 1 остаток, замещенный на соответствующий остаток 12В4, и (ίί) тяжелую цепь, включающую участки СОЯ νΗ 12В4 и человеческий акцепторный каркас (остов), причем остов содержит по меньшей мере 1, предпочтительно 29 остатков, замещенных на соответствующий остаток 12В4, и, необязательно, по меньшей мере 1, предпочтительно 2 или 3 остатка, замещенных на соответствующий остаток зародышевой линии человека.

В другом предпочтительном варианте гуманизированное антитело по данному изобретению имеет структурные особенности по данному описанию и, кроме того, проявляет по меньшей мере одну (предпочтительно две, три, четыре или все) из следующих активностей: (1) связывает растворимый Αβ; (2) связывает агрегированный Αβ 1-42 (например, по определению методом ЕЫ8А); (3) связывает Αβ в бляшках (например, окрашивание бляшек АО и/или ΡΌΑΡΡ); (4) связывает Αβ с аффинностью связывания, в 2-3 раза более высокой по сравнению с химерным 12В4 (например, с 12В4, содержащим последовательности мышиных вариабельных областей и последовательности человеческих константных областей); (5) опосредует фагоцитоз Αβ (например, при анализе фагоцитоза сх угуо по данному описанию) и

- 17 010902 (6) преодолевает гематоэнцефалический барьер (например, демонстрирует кратковременную локализацию в мозгу, например, на животной модели ΡΌΑΡΡ по данному описанию).

В другом предпочтительном варианте гуманизированное антитело по данному изобретению имеет структурные особенности по данному описанию, связывает Αβ до такой степени или с аффинностью, достаточной для проявления по меньшей мере одного из следующих ш у1уо эффектов: (1) уменьшение содержания Αβ бляшек; (2) предупреждение образования бляшек; (3) снижение уровней растворимого Αβ; (4) уменьшение нейритной патологии, обусловленной амилоидным нарушением; (5) смягчение или ослабление по меньшей мере одного физиологического симптома, обусловленного амилоидным нарушением; и/или (6) улучшение когнитивной функции.

В другом предпочтительном варианте гуманизированное антитело по данному изобретению имеет структурные особенности по данному описанию и специфически связывается с эпитопом, содержащим остатки 3-7 Αβ.

В другом предпочтительном варианте гуманизированное антитело по данному изобретению имеет структурные особенности по данному описанию, связывается с Ν-концевым эпитопом Αβ (например, связывается с эпитопом, расположенном в аминокислотах 3-7 Αβ) и способно уменьшать: (1) уровни Αβ пептида; (2) содержание (нагрузку) Аβ бляшек и (3) нейритную нагрузку или нейритную дистрофию, обусловленную амилоидным нарушением.

Описанные выше типы активности можно определять, используя любой из множества методов анализа по данному описанию, или известных из уровня техники (например, методы анализа связывания, методы анализа фагоцитов и т.д.). Активности можно анализировать либо ш у1уо (например, используя методы анализа с мечеными компонентами и/или методы анализа изображения), или ш У1!го (например, используя образцы или препараты, полученные от субъекта). Активности можно анализировать либо непосредственно, либо опосредованно. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения анализируют неврологические конечные показатели (точки) (например, амилоидную нагрузку, нейритную нагрузку и т.д.). Такие конечные показатели можно анализировать на живых объектах (например, на животных моделях болезни Альцгеймера или у человека, например, проходящего курс иммунотерапии), используя неинвазивные методы обнаружения. Или же такие конечные показатели можно анализировать в субъектах после смерти. Анализ таких конечных показателей на животных моделях и/или у человека после смерти применим для оценки эффективности различных агентов (например, гуманизированных антител), которые следует использовать для подобного иммунотерапевтического применения. В другом предпочтительном варианте изобретения поведенческие и неврологические параметры можно оценивать как индикаторы вышеописанных типов нейропатологической активности или конечных точек (показателей).

Получение вариабельных областей

Сделанный умозрительный выбор СЭР и остовных компонентов гуманизированных иммуноглобулинов позволяет применять многие методы получения таких иммуноглобулинов. Вследствие вырожденности кода ряд нуклеотидных последовательностей кодирует каждую аминокислотную последовательность иммуноглобулина. Нужные нуклеотидные последовательности можно получать бе поуо твердофазным синтезом ДНК или ПЦР (Ρ0Β) мутагенезом ранее полученного варианта заданного полинуклеотида. Опосредованный олигонуклеотидами мутагенез является предпочтительным методом получения вариантов ДНК с заменами, делециями и инсерциями, кодирующей целевой полипептид. См. Α^πηηη е! а1., ΌΝΑ 2: 183 (1983). Короче говоря, ДНК, кодирующую целевой полипептид, изменяют гибридизацией олигонуклеотида, кодирующего заданную мутацию, с однонитевой ДНК-матрицей. После гибридизации используют ДНК-полимеразу для синтеза полной второй комплементарной нити матрицы, которая вводит олигонуклеотидный праймер и кодирует выбранное изменение в ДНК, кодирующей целевой полипептид.

Отбор константных областей

Вариабельные сегменты антител, получение которых описано выше (например, вариабельные области тяжелой и легкой цепи химерных или гуманизированных антител), как правило, связываются, по меньшей мере, с участком константной области иммуноглобулина (Тс), как правило, человеческого иммуноглобулина. Человеческие последовательности ДНК константной области можно выделить, применяя хорошо известные методы, из ряда человеческих клеток, но предпочтительно иммортализованных Вклеток (КаЬа! е! а1., см. выше, и Ыи е! а1., международная заявка АО87/02671) (каждый из источников вводится ссылкой во всей полноте для любых целей). Обычно антитело содержит константные области как легкой, так и тяжелой цепей. Константная область тяжелой цепи обычно включает участки СН1, шарнирный, СН2, СН3 и СН4. Антитела по данному описанию включают антитела, содержащие все типы константных областей, включая 1дМ, 1дО, Ι§Ό, Ι§Α и 1дЕ, и любой изотип, включая 1дО1, 1дО2, 1дО3 и 1дО4. Когда требуется, чтобы антитело (например, гуманизированное антитело) проявляло цитотоксическую активность, константный домен обычно представляет собой константный домен фиксации комплемента и класса, как правило, 1дО1. Предпочтительным изотипом является изотип 1дО1. Константные области легкой цепи могут быть лямбда или каппа. Гуманизированное антитело может содержать последовательности более чем одного класса или изотипа. Антитела могут экспрессировать в виде тетрамеров,

- 18 010902 содержащих две легкие и две тяжелые цепи, в виде отдельных тяжелых цепей, легких цепей, как ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')₂ и Εν, или в виде одноцепных антител, в которых вариабельные домены тяжелой и легкой цепей связаны через спейсер.

Экспрессия рекомбинантных антител

Химерные и гуманизированные антитела получают обычно рекомбинантной экспрессией. Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепей, необязательно связанные с константными областями, встраивают в векторы экспрессии. Легкую и тяжелую цепи можно клонировать в один и тот же вектор экспрессии или в разные векторы экспрессии. Сегменты ДНК, кодирующие цепи иммуноглобулина, функционально связаны с регуляторными последовательностями в векторе(ах) экспрессии, который(е) обеспечивае(ю)т экспрессию полипептидов иммуноглобулина. Последовательности, контролирующие экспрессию, включают, но без ограничения, промоторы (например, ассоциируемые с природными или гетерологичные промоторы), сигнальные последовательности, энхансерные элементы и последовательности терминации транскрипции. Предпочтительно последовательности, контролирующие экспрессию, представляют собой эукариотические промоторные системы в векторах, способных трансформировать или трансфецировать эукариотические клетки-хозяева. Когда вектор внедрен в подходящий хозяин, хозяин выдерживают в условиях, пригодных для экспрессии нуклеотидных последовательностей на высоком уровне и для сбора и очистки перекрестно реагирующих антител.

Эти векторы экспрессии обычно реплицируются в организмах-хозяевах либо в виде эписом, либо как неотъемлемая часть хромосомной ДНК хозяина. Обычно векторы экспрессии содержат селективные маркеры (например, устойчивости к ампициллину, устойчивости к гигромицину, устойчивости к тетрациклину, устойчивости к канамицину или устойчивости к неомицину) для того, чтобы можно было обнаруживать клетки, трансформированные при использовании заданных ДНК последовательностей (см., например, Йакига еί а1., патент США 4704362).

Е. сой представляет собой один из прокариотических хозяев, особенно пригодный для клонирования полинуклеотидов (например, последовательностей ДНК) по данному изобретению. Другие хозяева микробного происхождения, пригодные для использования, включают бациллы, такие как ВасШик киЬЬЬк, и другие энтеробактерии, такие как 8а1топе11а, 8егга11а и различные виды Ркеиботопак. В этих хозяевахпрокариотах можно также получать векторы экспрессии, которые, как правило, содержат последовательности, контролирующие экспрессию, совместимые с клетками-хозяевами (например, ориджин репликации). Кроме этого, может присутствовать любое количество различных хорошо известных промоторов, таких как промоторная система лактозы, промоторная система триптофана (ίτρ), промоторная система бета-лактамазы или промоторная система фага лямбда. Как правило, промоторы контролируют экспрессию, необязательно при участии оператора, и имеют сайты связывания рибосом и т.п. для инициации и завершения транскрипции и трансляции.

Другие микробы, такие как дрожжи, также применяют для экспрессии. Предпочтительным хозяином среди клеток дрожжей являются 8ассЬаготусек с подходящими векторами, содержащими последовательности, контролирующие экспрессию (например, промоторы), ориджин репликации, терминирующие последовательности и т.п., по желанию. Типичные промоторы включают 3-фосфоглицераткиназу и другие гликолитические ферменты. Индуцибельные промоторы векторов дрожжей включают, наряду с другими, промоторы алкогольдегидрогеназы, изоцитохром С и ферменты, отвечающие за утилизацию мальтозы и галактозы.

Помимо микроорганизмов, для экспрессии и продуцирования полипептидов по данному изобретению (например, полинуклеотидов, кодирующих иммуноглобулины или их фрагменты) можно также использовать клеточные культуры тканей млекопитающих. См. АШпаскег, Егот Сепек 1о С1опек, УСН РиЬНкЬегк, Ν.Υ., Ν.Υ. (1987). На самом деле, предпочтительными являются эукариотные клетки, так как в технике получен ряд подходящих линий клеток-хозяев, способных секретировать гетерологичные белки (например, интактные иммуноглобулины), эти линии клеток-хозяев включают СНО клеточные линии, различные клеточные линии Сок, клетки НеЬа, предпочтительно клеточные линии миеломы или трансформированные В-клетки или гибридомы. Предпочтительно эти клетки являются нечеловеческими клетками. Векторы экспрессии в этих клетках могут включать последовательности, контролирующие экспрессию, такие как ориджин репликации, промотор, энхансер (Онееп еί а1., 1ттипо1. Ксу. 89: 49 (1986)), и необходимые сайты информации о процессинге, такие как сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и последовательности терминации транскрипции. Предпочтительными последовательностями, контролирующими экспрессию, являются промоторы генов иммуноглобулина, 8У40, аденовируса, вируса бычьей папилломы, цитомегаловируса и т.п. См. Со еί а1., 1. 1ттипо1. 148: 1149 (1992).

Или же последовательности, кодирующие антитело, можно встраивать в трансгены для внедрения в геном трансгенного животного и последующей экспрессии в молоке трансгенного животного (см., например, ЭеЬоег еί а1., патент США 5741957, Кокеп, патент США 5304489, и Меабе еί а1., патент США 5849992). Подходящие трансгены включают последовательности, кодирующие легкую и/или тяжелую цепь при функциональном связывании с промотором и энхансером специфического гена молочной железы, такого как казеин или бета-лактоглобулин.

- 19 010902

Векторы, содержащие полинуклеотидные последовательности, представляющие интерес (например, кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей и контролирующие экспрессию), можно перенести в клетку-хозяин хорошо известными методами, которые меняются в зависимости от типа клеткихозяина. Например, в прокариотных клетках обычно используют трансфекцию с хлоридом кальция, тогда как кальций-фосфатный метод, электропорацию, липофекцию, бомбардировку микрочастицами или вирусную трансфекцию можно использовать для других клеток-хозяев (см., в целом, 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Маииа1 (Со1б 8ргшд НагЬог Ргекк, 2иб еб., 1989) (вводится ссылкой во всей полноте для всех целей). Другие методы, применяемые для трансформации клеток млекопитающих, включают применение полибрена, слияние протопластов, липосомы, электропорацию и микроинъекции (8атЬгоок е! а1., см. выше, в целом). С целью получения трансгенных животных можно вводить трансгены в виде микроинъекций в оплодотворенные ооциты или можно внедрять в геном эмбриональных стволовых клеток, а ядра таких клеток переносить в безъядерные (энуклированные) ооциты.

Когда тяжелую и легкую цепи клонируют в раздельные векторы экспрессии, векторы котрансфецируют, достигая экспрессии и упорядоченной структуры интактных иммуноглобулинов. После экспрессии целые антитела, их димеры, отдельные легкие и тяжелые цепи или другие формы иммуноглобулина по данному изобретению можно очищать стандартными методами, известными в технике, включая осаждение сульфатом аммония, аффинную колоночную хроматографию, колоночную хроматографию, ВЭЖХ, гель-электрофорез и т.п. (см., в целом, 8сорек, Рго!ет Рипйса!юи (8ргтдег-Уег1ад, Ν.Υ., (1982)). Для фармацевтических целей предпочтительными являются практически чистые иммуноглобулины с гомогенностью по меньшей мере около 90-95%, а наиболее предпочтительной является гомогенность 98-99% или выше.

Фрагменты антител

В объем настоящего изобретения также включены фрагменты антител. В одном варианте изобретения предлагаются фрагменты нечеловеческих и/или химерных антител. В другом варианте изобретения охватываются фрагменты гуманизированных антител. Как правило, эти фрагменты проявляют специфическое связывание с антигеном с аффинностью по меньшей мере 10⁷, а более обычно 10⁸ или 10⁹ М^-1. Фрагменты гуманизированных антител включают отдельные тяжелые цепи, легкие цепи, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂, РаЬс и Ρν. Фрагменты получают методом рекомбинантной ДНК или ферментативной или химической фрагментацией молекулы интактных иммуноглобулинов.

Испытание терапевтической активности антител на животных моделях

В группах 7-9-месячных мышей РЭАРР каждой мыши инъецируют 0,5 мг поликлональных антител против Ав или специфических моноклональных антител против Ав в РВ8. Все препараты антител очищают, чтобы они имели низкие уровни эндотоксинов. Можно получать моноклональные антитела против фрагмента, инъецируя фрагмент или более протяженную форму Ав мышам, получая гибридомы и проводя скрининг гибридом на антитело, которое специфически связывается с заданным фрагментом Ав, не связываясь с другими неперекрывающимися фрагментами Ав.

Мышам инъецируют внутрибрюшинно (интраперитонеально) количество, необходимое, чтобы поддерживать в течение 4 месяцев в кровотоке концентрации антитела, измеряемые титром ЕЫ8А, более чем 1/1000, по определению методом ЕЫ8А, относительно Ав 42 или другого иммуногена. Осуществляют перманентный контроль титров и мышей умерщвляют по окончании 6-месячного периода инъекций. Гистохимические исследования, определение уровней Ав и токсикологические исследования осуществляют рок! тойет. В каждой группе по 10 мышей.

Скрининг антител на активность очищения

Данное изобретение также охватывает способы скрининга антитела на активность очищения от амилоидного отложения, или любого другого антигена, или ассоциированного биологического объекта, которое требует активности очищения. Для скрининга на активность против амилоидного отложения образец ткани мозга больного болезнью Альцгеймера или животная модель с характерной для болезни Альцгеймера патологией контактирует с фагоцитами, несущими рецептор Рс, такими как микроглия (микроглиоциты), и испытуемым антителом в среде ш νίΙΐΌ. Фагоциты могут быть первичной культурой или клеточной линией и могут быть мышиного (например, клетки ВУ-2 или С8-В4) или человеческого (например, ТНР-1 клетки) происхождения. В некоторых методах компоненты объединяют в микроскопический препарат для упрощения контроля под микроскопом. В некоторых методах многократные реакции осуществляют параллельно в лунках микротитрационного планшета. В таком формате отдельный миниатюрный микроскопический препарат может быть заключен в отдельных лунках, или можно осуществлять детектирование в немикроскопическом формате, например обнаружение Ав методом ЕЫ8А. Предпочтительно делают серийные измерения количества амилоидного отложения в ш ν 11го реакционной смеси, начиная с исходного (базового) значения перед началом реакции, и одно или более измерений делают в ходе реакции. Антиген можно обнаруживать по окрашиванию, например, антителом к Ав или к другому компоненту амилоидных бляшек, содержащим флуоресцентную метку. Антитело, используемое для окрашивания, может быть или не быть тем же самым, что и антитело, проверяемое на активность очищения (выведения). Уменьшение амилоидных отложений относительно базовой линии в ходе реак

- 20 010902 ции указывает, что испытуемое соединение обладает активностью очищения. По-видимому, такие антитела пригодны для предупреждения или лечения болезни Альцгеймера и других амилоидных заболеваний. Антитела, особенно пригодные для предупреждения или лечения болезни Альцгеймера и других амилоидных заболеваний, включают антитела, способные очищать как от компактных, так и диффузных амилоидных бляшек, например антитело 12В4 по данному изобретению или его химерные или гуманизированные версии. Аналогичные методы можно применять для скрининга антител на активность при выведении других типов органических объектов. Этот метод анализа можно применять для обнаружения активности выведения в отношении практически любого рода биологического объекта. Как правило, биологический объект играет некоторую роль в заболевании человека или животного. Биологический объект может быть представлен в виде тканевого образца или в выделенной (изолированной форме). Если он находится в виде тканевого образца, тканевый образец предпочтительно представляет собой нефиксированный тканевый образец, чтобы к компонентам тканевого образца был свободный доступ и чтобы избежать при фиксировании случайного нарушения конформации компонентов. Примеры тканевых образцов, которые можно анализировать этим методом, включают опухолевые ткани, предраковые ткани, ткани, содержащие доброкачественные новообразования, такие как бородавки или родимые пятна, ткани, инфицированные патогенными микроорганизмами, воспалительные инфильтраты, ткани с патологией межклеточного вещества (например, фибринозный перикардит), ткани, несущие аберрантные антигены, и рубцовые ткани. Примеры изолированных биологических объектов, которые можно использовать, включают Αβ, вирусные антигены или вирусы, протеоглиганы, антигены или другие патогенные микроорганизмы, опухолевые антигены и адгезивные молекулы. Такие антигены можно получать из природных источников и, наряду с другими методами, рекомбинантной экспрессией или химическим синтезом. Образец ткани или выделенный биологический объект контактирует в среде с фагоцитами, несущими рецепторы Ес, такими как моноциты или микроглия, и испытуемым антителом. Антитело может быть специфично в отношении испытываемого биологического объекта или антигена, ассоциированного с объектом. В последнем случае осуществляют компенсаторный фагоцитоз испытуемого объекта либо биологического организма (объекта) при использовании антигена. Обычно, хотя и не обязательно, антитело и биологический объект (иногда с ассоциированным антителом) контактируют друг с другом перед добавлением к фагоцитам. Затем проводят мониторинг концентрации биологического объекта и/или ассоциированного антигена, остающегося (если они остаются) в среде. Уменьшение количества или концентрации антигена или ассоциированного биологического объекта в среде указывает на то, что антитело обладает активностью очищения (выведения) в отношении антигена и/или ассоциированного биологического объекта в сочетании с фагоцитами (см., например, пример IV).

Химерные/гуманизированные антитела с измененной эффекторной функцией

Для вышеописанных антител по изобретению, содержащих константную область (Ес-область), также может быть желательным изменять эффекторную функцию молекулы. Как правило, эффекторная функция антитела присуща Ес-области молекулы, которая может опосредовать связывание с различными эффекторными молекулами, например белками комплемента или рецепторами Ес. Связывание комплемента с Ес играет важную роль, например, в опсонизации и лизисе клеточных патогенов и активации воспалительных реакций. Связывание антитела с Ес-рецепторами, например, на поверхности эффекторных клеток может стимулировать ряд важных и разнообразных биологических реакций, включая, например, поглощение и деструкцию покрытых иммуноглобулиновой пленкой патогенов или частиц, клиренс иммунных комплексов, лизис покрытых иммуноглобулиновой пленкой клеток-мишеней клеткамикиллерами (т.е. антитело-обусловленная клеточно-опосредованная цитотоксичность, или Α^СС), выброс воспалительных медиаторов, перенос антител через плаценту и регуляцию продукции иммуноглобулина.

Соответственно, в зависимости от конкретного применения в терапии или диагностике могут быть желательны вышеуказанные иммунные функции или только выбранные иммунные функции. Изменяя область Ес антитела, осуществляют различные аспекты эффекторной функции молекулы, включая активацию или подавление различных реакций иммунной системы, для достижения благотворного воздействия при диагностике и в терапии.

Можно получать такие антитела по изобретению, которые реагируют только с некоторыми типами Ес-рецепторов, например антитела по изобретению можно модифицировать таким образом, чтобы они связывались только с определенными Ес-рецепторами или, если требуется, чтобы совершенно отсутствовало Ес-рецепторное связывание, путем делеции или изменения сайта связывания Ес-рецептора, расположенного в Ес-области антитела. Другие желательные изменения Ес-области антитела по изобретению перечислены ниже. Как правило, для указания, какой(ие) аминокислотный(ые) остаток (остатки) Ес-области (например, 1дС антитела) изменяют (например, заменой аминокислоты) для достижения желаемого изменения эффекторной функции, используют нумерацию КаЬа!. Систему нумерации также применяют для сравнения антител разных видов с тем, чтобы заданную эффекторную функцию, наблюдаемую, например, в мышином антителе, можно было затем методично воссоздать (конструировать) в человеческом, гуманизированном или химерном антителе по данному изобретению.

Например, наблюдали, что антитела (например, 1дС антитела) можно объединять в группы, в которых обнаруживается прочное, промежуточное или слабое связывание с Ес-рецептором (например, Ес

- 21 010902 рецептором на человеческих моноцитах (РсуК!)). Сайт связывания моноцита в шарнирно-связанной области (Ьеи234-§ег239) определяют путем сравнения аминокислотных последовательностей в этих группах с различной аффинностью. Помимо этого, человеческий РсуК! рецептор связывает человеческий 1дС1 и мышиный 1дС2а как мономер, но связывание 1дС2Ь в 100 раз слабее. Сравнение последовательности этих белков в шарнирно-связанной области показывает, что последовательность с 234 по 238 остаток, т.е. Ьеи-Ьеи-С1у-С1у- Рго, обеспечивающая прочное связывание, в мышином гамма 2Ь превращается в (становится) Ьеи-С1и-С1у-С1у-Рго, т.е. обеспечивающую слабое связывание. Таким образом, соответствующее изменение в шарнирной последовательности человеческого антитела можно осуществить, если желательно пониженное Рсу1 рецепторное связывание. Понятно, что для достижения таких же или подобных результатов можно сделать другие изменения. Например, аффинность Рсу1 связывания можно изменить, замещая специфичный остаток на остаток, имеющий в боковой цепи неподходящую функциональную группу, или вводя заряженную функциональную группу (например, С1и или Ακρ) или, например, ароматический неполярный остаток (например, РЬе, Туг или Тгр).

Эти изменения могут аналогично применяться к мышиным, человеческим и крысиным системам при наличии гомологий последовательностей в различных иммуноглобулинах. Было показано, что в случае человеческого РсуК! рецептора изменение Ьеи235 на С1и нарушает взаимодействие мутанта и рецептора. Таким образом, сайт связывания этого рецептора можно включать или выключать с помощью таких мутаций.

Мутации в прилегающих или близких сайтах в области шарнирного связывания (например, замена остатков 234, 236 или 237 на Α1;·ι) указывают на то, что изменения в остатках 234, 235, 236 и 237, по меньшей мере, влияют на аффинность связывания с РсуК! рецептором. Таким образом, антитела по изобретению могут также содержать измененную Рс-область с измененной аффинностью связывания в отношении РсуК! по сравнению с немодифицированным антителом. Такое антитело обычно содержит модификацию (изменение) в остатке аминокислоты в положении 234, 235, 236 или 237.

Аналогично можно изменять аффинность в отношении других Рс-рецепторов, чтобы разными способами регулировать иммунный ответ.

Еще один пример: можно менять литические свойства антител 1дС путем связывания С1 компонента комплемента.

Первый компонент системы комплемента, С1, содержит три белка, известных как С1ц. С1г и С1к, которые связаны вместе прочной связью. Было показано, что С1с| отвечает за связывание комплекса, состоящего из трех белков, с антителом.

Следовательно, С1с.|-связывающую активность антитела можно изменять, создавая антитела с измененным СН2 доменом, в котором по меньшей мере один из аминокислотных остатков 318, 320 и 322 тяжелой цепи заменен на остаток с отличной боковой цепью. Нумерация остатков в тяжелой цепи представляет собой нумерацию по Ευ индексу (см. КаЬа) е) а1., см. выше). Другие подходящие изменения с целью получения различий, например, ослабление или отмену специфического С1с.|-связывания с антителом, включают замену любого из остатков 318 (С1и), 320 (Ьук) и 322 (Ьук) на Α6·ι.

Помимо этого, при проведении мутаций этих остатков было показано, что С1с.|-связывание сохраняется до тех пор, пока остаток 318 содержит боковую цепь, способную связываться водородной связью, а оба остатка, 320 и 322, содержат положительно заряженную боковую цепь.

Активность С1с|-связывания можно отменить, заменяя любой из трех специфичных остатков на остаток с неподходящей (неприсущей) функциональностью в его боковой цепи. Нет необходимости заменять ионные остатки только на ΑΕ, чтобы отменить С1с| связывание. Для отмены С1с| связывания вместо любого из трех остатков можно также использовать другие алкилзамещенные неионные остатки, такие как РЬе, Туг, Тгр и Рго. Кроме того, для отмены С1с| связывания, вместо остатков 320 и 322, но не 318, можно также использовать такие полярные неионные остатки, как 8ег, ТЬг, Сук и Ме1.

Также отмечают, что боковые цепи ионных или неионных полярных остатков могут образовывать водородную связь аналогично остаткам С1и. Следовательно, замена остатка 318 (С1и) на полярный остаток может модифицировать, но не отменить С1с.|-связывающую активность.

Известно также, что замена остатка 297 (Αδη) на Α13 вызывает исчезновение литической активности и в то же время лишь слабое уменьшение (примерно в 3 раза слабее) аффинности в отношении С1с.|. Это изменение нарушает сайт гликозилирования, и исчезает углевод, необходимый для активации комплемента. Любая другая замена в этом сайте также нарушает сайт гликозилирования.

Изобретение также включает антитело с измененной эффекторной функцией, при этом антитело содержит модифицированный шарнирный участок (область). Модифицированная шарнирная область может содержать полную шарнирную область антитела класса или подкласса, отличного от класса или подкласса домена СН1. Например, константный домен (СН1) антитела класса 1дС можно присоединить к шарнирной области антитела класса 1дС4. Или же новая шарнирная область может содержать часть природного шарнира или чередующиеся элементы (единицы), в которых каждый элемент взят из природной шарнирной области. В одном примере природную шарнирную область изменяют, заменяя один или более цистеиновых остатков на нейтральный остаток, такой как аланин, или заменяя соответствующим об

- 22 010902 разом расположенные остатки на цистеин. Такие замены проводят, используя известные в химии белков химические методы, и предпочтительно методы рекомбинантной ДНК по данному описанию.

В одном варианте изобретения число цистеиновых остатков в шарнирной области антитела уменьшают, например, до 1 цистеинового остатка. Преимущество этой модификации состоит в том, что она упрощает сборку антитела, например биспецифических молекул антитела и молекул антитела, в которых Ес-участок заменен на молекулу-эффектор или молекулу-репортер (контрольную, молекулу сравнения), так как необходимо лишь, чтобы образовалась одна дисульфидная связь. Эта модификация также создает специфическую мишень для присоединение шарнирной области либо к другой шарнирной области, либо к эффекторной или репортерной (контрольной) молекуле либо непосредственно, либо опосредованно, например химическими методами. И, напротив, число цистеиновых остатков в шарнирной области антитела увеличивают, например, по меньшей мере на 1 остаток по сравнению с обычно встречающимся числом цистеиновых остатков. Увеличение числа цистеиновых остатков можно использовать для стабилизации взаимодействия между прилегающими шарнирными областями. Другое преимущество этой модификации состоит в том, что она облегчает использование тиольных групп цистеина для присоединения эффекторных или репортерных молекул, например радиоактивной метки, к измененному антителу.

Следовательно, данное изобретение охватывает обмен шарнирными областями между классами антител, в частности ЦС классами, и/или увеличение или уменьшение числа цистеиновых остатков в шарнирной области с целью обретения или изменения эффекторной функции (см., например, патент США 5677425, который специально вводится в данное описание). Определение эффекторной функции измененного антитела проводят методами анализа по данному описанию или другими признанными в технике методами.

Важно отметить, что полученное в результате антитело можно анализировать одним или более методов для оценки любого изменения биологической активности в сравнении с исходным антителом. Например, способность антитела с измененной Ес-областью связываться с комплементом или рецепторами Ес можно оценивать методами анализа по данному описанию, а также любыми известными в технике методами анализа.

Получение антител по изобретению проводят любым подходящим методом, включая методы по данному описанию, а также методами, известными специалистам в данной области техники. Соответствующую аминокислотную (белковую) последовательность, например образующую часть релевантного константного домена или целый релевантный константный домен, например Ес-область, т. е. СН2 и/или СН3 домен(ы), антитела и включающую соответствующим образом измененный(е) (замененный(е)) остаток (остатки), можно синтезировать, а затем химическим методом ввести в нужное место в молекулы антитела.

Предпочтительно для получения измененного антитела используют методы рекомбинантной ДНК. Предпочтительные методы включают, например, получение подходящих праймеров для применения в полимеразной цепной реакции (ПЦР), таких как последовательность ДНК, кодирующая по меньшей мере часть тяжелой цепи 1дО, например Ес или константная область (например, СН2 и/или СН3), изменяется по одному или более остатков. Затем сегмент можно функционально связать с остальной частью антитела, например с вариабельной областью антитела и нужными регуляторными элементами для экспрессии в клетке.

Настоящее изобретение также включает векторы, применяемые для трансформации клеточной линии, векторы, применяемые для продуцирования трансформирующих векторов, клеточные линии, трансформированные трансформирующими векторами, клеточные линии, трансформированные препаративными векторами, и методы их получения.

Предпочтительно клеточная линия, трансформированная таким образом, чтобы продуцировать антитело с измененной Ес-областью (т. е. измененной эффекторной функцией), представляет собой иммортализованную клеточную линию (например, СНО-клетку).

Хотя клеточная линия, используемая для получения антитела с измененной областью Ес, является предпочтительно клеточной линией млекопитающего, в качестве альтернативы можно использовать любую другую подходящую клеточную линию, такую как клеточная линия бактерий или клеточная линия дрожжей.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие иммунологические и терапевтические агенты

Иммунные реакции против амилоидных отложений можно также стимулировать, вводя нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и компоненты их цепей, применяемые для пассивной иммунизации. Такими нуклеиновыми кислотами могут быть ДНК или РНК. Сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий иммуноген, как правило, связан с регуляторными элементами, такими как промотор и энхансер, которые делают возможной экспрессию сегмента ДНК в предполагаемой клетке-мишени больного. Что касается контроля экспрессии в гемоцитах, желательной для индукции иммунного ответа, для этого пригодны промоторный и энхансерный элементы генов легкой или тяжелой цепи генов иммуноглобулина или ранний промотор и энхансер основного интермедиата СМУ. Связанные регуляторные элементы и кодирующие последовательности часто клонируют в вектор. Для введения двухцепочечных антител можно клонировать две цепи в один и тот же вектор или в разные векторы.

- 23 010902

Пригодными являются многие вирусные векторные системы, включая ретровирусные системы (см., например, Ьатебе апб Титш, Сиг. Орт. Сепе1. Эеуе1ор. 3: 102-109 (1993)); аденовирусные векторы (см., например, Вей е! а1., 1. У1го1. 67: 5911 (1993)); аденоассоциированные вирусные векторы (см., например, 21юи е! а1., 1. Ехр. Меб. 179: 1867 (1994)), вирусные векторы семейства поксвирусов, включая вирус коровьей оспы и вирусы оспы птиц, вирусные векторы рода альфа-вирусов, такие как полученные при использовании Синдбис вируса и вируса лесов Семлики (см., например, ЭпЬеикку е! а1., 1. У1го1. 70: 508 (1996)), венесуэльский вирус энцефалита лошадей (см. 1оЕпк1оп е! а1., патент США 5643576) и рабдовирусы, такие как вирус везикулярного стоматита (см. Коке, 6168943) и вирусы папилломы (О1е е! а1., Нитап Оепе Тйегару 6: 325 (1995); \Уоо е! а1., международная заявка \¥О 94/12629 и Х1ао & Вгапбкта, Ыискю Αοι6κ. Кек. 24, 2630-2622 (1996)).

ДНК, кодирующая иммуноген, или содержащий ее вектор могут быть упакованы в липосомы. Соответствующие липиды и родственные аналоги описаны в Еррк1ет е! а1., патент США 5208036, Еефпег е! а1., патент США 5264618, Коке, патент США 5279833, и Ерапб е! а1., патент США 5283185. Векторы и ДНК, кодирующие иммуноген, могут также адсорбироваться или ассоциироваться с конкретными носителями, примеры которых включают полимеры метилметакрилата и полилактиды и сополимеры лактидов с гликолидами (см., например, МсОее е! а1., 1. Мюго Епсар. (1996)).

Векторы генной терапии или оголенные (депротеинизированные) полинуклеотиды (например, ДНК) могут доставляться ш у|уо путем введения отдельному пациенту, как правило, путем системного введения (например, внутривенной, внутрибрюшинной (интраперитонеальной), назальной, желудочной, внутрикожной, внутримышечной, подкожной или интракраниальной инфузией) или путем местного введения (см., например, Αηбе^коη е! а1., патент США 5399346). Термин оголенный (депротеинизированный) полинуклеотид относится к полинуклеотиду, находящемуся не в виде комплекса с коллоидными материалами. Оголенные полинуклеотиды иногда клонируют в плазмидный вектор. Такие векторы могут дополнительно включать вспомогательные (способствующие) агенты, такие как бупивацин (ХУегпег е! а1., патент США 5593970). ДНК можно также вводить, применяя генную пушку. Х1ао & Вгапбкта, см. выше. ДНК, кодирующая иммуноген, осаждается на поверхности микроскопических металлических гранул. Микроснаряды ускоряются за счет ударной волны или за счет расширения газообразного гелия и проникают в ткани на глубину нескольких слоев клеток. Подходящим является, например, устройство доставки гена (Оепе ОеПуегу Ое\зсе) Αссе1™, выпускаемое Α^Γ^ΐ^, 1пс. М1бб1е1оп ^1. Или же депротеинизированная ДНК может проникать в кровоток через кожу при нанесении на кожу пятен ДНК с одновременным химическим или механическим раздражением (см. Нотее11 е! а1., международная заявка \¥О 95/05853).

В дополнительном варианте векторы, кодирующие иммуногены, можно доставлять ех νί\Ό к клеткам, таким как клетки, взятые у отдельного пациента (например, лимфоциты, аспираты костного мозга, биопсия тканей), или универсальные донорные гемопоэтические стволовые клетки, с последующей повторной имплантацией клеток больному, как правило, после отбора клеток, в которые внедрен вектор.

Методы профилактики и лечения

Настоящее изобретение относится, наряду с остальным, к лечению болезни Альцгеймера и других амилоидных заболеваний с помощью терапевтических иммунологических реагентов (например, гуманизированных иммуноглобулинов) к специфическим эпитопам в Αβ в условиях, которые вызывают благотворную терапевтическую реакцию у больного (например, индукцию фагоцитоза Ав, уменьшение содержания (нагрузки) бляшек, ингибирование образования бляшек, уменьшение нейритной дистрофии, улучшение когнитивной функции и/или реверсию, лечение или предупреждение когнитивного заболевания), например, в отношении предупреждения или лечения амилоидного заболевания. Изобретение также относится к применению охватываемых им иммунологических реагентов (например, гуманизированных иммуноглобулинов) для производства лекарственного препарата для лечения и предупреждения амилоидного заболевания.

В одном аспекте данное изобретение охватывает способы предупреждения или лечения заболевания, обусловленного амилоидными отложениями Αβ в тканях мозга больного. Такие заболевания включают болезнь Альцгеймера, синдром Дауна и ухудшение когнитивной функции. Последнее может наблюдаться наряду с другими признаками амилоидного заболевания или в их отсутствие. Некоторые способы по изобретению охватывают применение эффективной дозы антитела, которое специфически связывается с компонентом амилоидных отложений у больного. Такие методы особенно пригодны для лечения болезни Альцгеймера у человека. Приведенные в качестве примеров методы включают введение эффективной дозы антитела, которое связывается с Αβ. Предпочтительные способы включают введение эффективной дозы антитела, которое специфически связывается с эпитопом внутри остатков 1-10 Αβ, например таких антител, которые специфически связываются с эпитопом внутри остатков 1-3 Αβ, антител, которые специфически связываются с эпитопом внутри остатков 1-4 Αβ, антител, которые специфически связываются с эпитопом внутри остатков 1-5 Αβ, антител, которые специфически связываются с эпитопом внутри остатков 1-6 Αβ, антител, которые специфически связываются с эпитопом внутри остатков 1-7 Αβ, или антител, которые специфически связываются с эпитопом внутри остатков 3-7 Αβ. Еще

- 24 010902 в одном аспекте данное изобретение охватывает применение антител, которые связываются с эпитопом, содержащим свободный Ν-концевой остаток Ар. Еще в одном аспекте данное изобретение включает применение антител, которые связываются с эпитопом внутри остатков 1-10 Ар, причем остаток 1 и/или остаток 7 Ар представляет собой аспарагиновую кислоту. Еще в одном аспекте данное изобретение включает применение антител, которые специфически связываются с пептидом Ар, не связываясь с полноразмерным амилоидным белком-предшественником (АРР). Еще в одном аспекте изобретения изотип антитела представляет собой человеческий ^С1.

Еще в одном аспекте данное изобретение включает применение антител, которые связываются с амилоидными отложениями у больного и индуцируют реакцию выведения (клиринга) компонентов амилоидных отложений. Например, на такую реакцию выведения может влиять фагоцитоз, опосредуемый рецептором Ес.

Терапевтические агенты по изобретению, как правило, являются практически очищенными от нежелательных примесей. Это означает, что агент, как правило, имеет чистоту по крайней мере 50 вес.%, а также практически не содержит вредных белков и примесей. Иногда агенты имеют чистоту по меньшей мере около 80 вес.%, и более предпочтительно чистоту по меньшей мере 90 или около 95 вес.%. Однако с помощью обычных методов очистки белков можно получать гомогенные белки с чистотой по меньшей мере 99 вес.%.

Эти способы можно применять как в отношении бессимптомных больных, так и в отношении больных с симптомами заболевания. Антитела, используемые в этих методах, могут быть человеческими, гуманизированными, химерными или нечеловеческими антителами или их фрагментами (например, антигенсвязывающими фрагментами) и могут быть моноклональными или поликлональными, как показано в данном описании. Еще в одном аспекте данное изобретение включает применение антител человека, иммунизированного пептидом Ар, причем этот человек может быть больным, который подлежит лечению с применением антитела.

В другом аспекте изобретение охватывает применение фармацевтической композиции, содержащей антитело и фармацевтический носитель. Или же антитело можно вводить больному, вводя полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одну цепь антитела. Полинуклеотид экспрессирует, продуцируя в организме больного цепь антитела. Необязательно, полинуклеотиды кодируют тяжелую и легкую цепи антитела. Полинуклеотид экспрессирует, продуцируя в организме больного тяжелую и легкую цепи антитела. В примерах вариантов изобретения осуществляют постоянный контроль уровня вводимого антитела в крови больного.

Таким образом, данное изобретение восполняет давно существующую потребность в лечебной схеме для предупреждения или ослабления клинической невропатологии и, у некоторых больных, ослабления познавательных способностей, обусловленных болезнью Альцгеймера.

Больные, подлежащие лечению

Больные, подлежащие лечению, включают людей с повышенным риском заболевания, но без проявления симптомов, а также больных с наблюдаемыми симптомами. Что касается болезни Альцгеймера, фактически, любой человек находится в состоянии повышенного риска заболеть болезнью Альцгеймера, если он или она живет достаточно долго. Следовательно, способы по настоящему изобретению можно применять для профилактики целой популяции, и нет необходимости в какой-либо оценке повышенного риска для подлежащего профилактике пациента. Способы по настоящему изобретению особенно применимы для людей с заведомым повышенным риском заболевания болезнью Альцгеймера. В эту категорию входят пациенты, имеющие родственников, болеющих (болевших) этим заболеванием, и те, у которых повышенный риск заболеть обнаружен анализом генетических и биохимических маркеров. Генетические маркеры повышенного риска заболевания болезнью Альцгеймера включают мутации в гене АРР, в частности мутации в положении 717 и в положениях 670 и 671, называемые мутациями Нагбу и 8\\'еб1к11 (шведская), соответственно (Нагбу, см. выше). Другими маркерами повышенного риска являются мутации в пресенильных генах, Р81 и Р82, и АроЕ4, семейный анамнез относительно АО, гиперхолистеринемия или атеросклероз. Больных болезнью Альцгеймера можно узнать по характерной деменции, а также по наличию вышеописанных факторов повышенного риска. Помимо этого, имеется ряд диагностических методов идентификации людей с АО. Эти методы включают определение уровней С8Е тау и Ар42. Повышенные уровни тау и пониженные уровни описанного Ар42 определяют наличие АО. Диагноз болезнь Альцгеймера можно также установить с помощью критерия АИКИА, как обсуждается в разделе Примеры.

У бессимптомных больных лечение можно начинать в любом возрасте (например, в 10, 20, 30 лет). Обычно, однако, нет необходимости начинать лечение до достижения пациентом 40, 50, 60 или 70 лет. Лечение, как правило, включает многократные дозы в течение некоторого периода времени. Лечение можно контролировать, определяя уровни антител во времени. Если реакция ослабевает, показана бустерная доза. У больных с возможным синдромом Дауна лечение можно начинать в предродовой период, вводя терапевтический агент матери, или вскоре после рождения.

Схемы лечения и дозировки

В профилактических целях фармацевтические композиции или лекарственные вещества вводят

- 25 010902 больному, восприимчивому к болезни Альцгеймера, или с повышенным риском заболевания ею, в количестве, достаточном для ликвидации или уменьшения риска, уменьшения тяжести или задержки начала заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, присутствующие в ходе развития заболевания. В терапевтических целях композиции или лекарственные вещества вводят больному, у которого подозревают такое заболевание или уже страдающему этим заболеванием, в количестве, достаточном для лечения или, по меньшей мере, частичного прекращения симптомов заболевания (биохимических, гистологических и/или поведенческих), включая его осложнения и промежуточные патологические фенотипы в ходе развития заболевания.

В некоторых способах введение агента уменьшает или ликвидирует ухудшение познавательной функции у больных, у которых еще не проявилась патология, характерная для болезни Альцгеймера. Количество, позволяющее адекватно выполнять терапевтическое или профилактическое лечение, называют терапевтически или профилактически эффективной дозой. Как по профилактической, так и по терапевтической схемам агенты обычно вводят в виде нескольких доз до достижения удовлетворительного иммунного ответа. Термин иммунный ответ (иммунная реакция)или иммунологический ответ (или иммунологическая реакция) включает развитие гуморального (опосредуемого антителом) и/или клеточного (опосредуемого антигенспецифическими Т-клетками или другими продуктами секреции) ответа, направленного против антигена в реципиенте. Такой ответ может быть активным ответом, т. е. индуцированным введением иммуногена, или пассивным ответом, т.е. индуцированным введением иммуноглобулина, или антитела, или примированных Т-клеток. Как правило, иммунный ответ контролируют и, когда он начинает ослабевать, дают многократные дозы.

Эффективные дозы композиций по данному изобретению для лечения вышеописанных состояний меняются в зависимости от многих различных; факторов, включая способ применения, нацеленный сайт, физическое состояние больного, вне зависимости от того, человек это или животное, другие вводимые лекарственные вещества, то, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно пациентом является человек, но можно также лечить иных млекопитающих, нежели человек, включая трансгенных млекопитающих. Чтобы достичь оптимальной безопасности и эффективности, нужно определять титр лечебной дозы.

Для пассивной иммунизации антителом интервалы доз составляют около 0,0001-100 мг/кг и более обычно 0,01-5 мг/кг веса тела хозяина (например, 0,02, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2 мг/кг и т.д.) веса тела хозяина. Например, дозы могут составлять 1 или 10 мг/кг веса тела или быть в пределах 1-10 мг/кг, предпочтительно по меньшей мере 1 мг/кг. Дозы, имеющие значение в пределах вышеприведенных интервалов, также входят в объем настоящего изобретения. Дозы субъектам можно вводить ежедневно, через день, еженедельно или по любой другой схеме, определяемой эмпирическим путем. Пример лечения включает введение в виде многократных доз в течение длительного периода, например по меньшей мере в течение 6 месяцев. Другие примеры схемы лечения включают введение 1 раз каждые 2 недели или 1 раз в месяц каждые 3-6 месяцев. Примерные схемы применения лекарственных препаратов включают введение 1-10 или 15 мг/кг ежедневно, 30 мг/кг через день или 60 мг/кг еженедельно. В некоторых способах одновременно вводят два или более моноклональных антител с различной специфичностью связывания, в этом случае вводимая доза каждого антитела находится в указанных интервалах.

Антитело обычно вводят многократно. Интервалы между однократными дозами могут составлять неделю, месяц или год. Интервалы также могут быть нерегулярными, по показаниям измерения уровней антител к Αβ в крови пациента. В некоторых методах дозы корректируют для достижения концентрации антитела в плазме, равной 1-1000 мкг/мл и, в некоторых методах, 25-300 мкг/мл. Или же антитело можно вводить в виде препарата пролонгированного действия, в этом случае требуется менее частое введение. Доза и частота введения меняются в зависимости от полупериода существования (периода полужизни) антитела в организме больного. В целом, гуманизированные антитела имеют самый продолжительный полупериод существования, затем идут химерные антитела и нечеловеческие антитела.

Доза и частота введения могут меняться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. В случае применения в профилактических целях композиции, содержащие антитела по данному изобретению или их смесь (коктейль), вводят пациенту еще не в стадии болезни с целью повысить сопротивляемость его организма. Такое количество называют эффективная профилактическая доза. При таком применении точные количества также зависят от состояния здоровья и общего иммунитета пациента, но, в целом, находятся в пределах 0,1-25 мг на дозу, главным образом, 0,5-2,5 мг на дозу. Относительно низкую дозу вводят через сравнительно продолжительные интервалы в течение продолжительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение до конца жизни.

При применении в терапевтических целях иногда требуются относительно высокие дозы (например, около 1-200 мг антитела на дозу, при этом наиболее употребительными являются дозы 5-25 мг) через сравнительно короткие интервалы до тех пор, пока развитие болезни не замедлится или не прекратится, и предпочтительно до тех пор, пока у больного не будет наблюдаться частичное или полное ослабление симптомов заболевания. Затем больному можно вводить препарат по профилактической схеме.

Интервалы доз нуклеиновых кислот, кодирующих антитела, составляют около 10 нг-1 г, 100 нг-100 мг,

- 26 010902 мкг-10 мг или 30-300 мкг ДНК на одного пациента. Дозы инфицирующих вирусных векторов варьируются от 10 до 100 или более вирионов на дозу. С целью профилактики и/или лечения терапевтические агенты можно вводить парентерально, местно, внутривенно, перорально, подкожно, внутриартериально, интракраниально (внутримозговым способом), внутрибрюшинно (интраперитонеально), назально или внутримышечно. Наиболее обычным способом применения иммуногенного агента является подкожный, хотя другие способы могут оказаться равно эффективными. Следующим наиболее употребительным способом является внутримышечная инъекция. Эти инъекции наиболее часто делают в мышцы руки или ноги. В некоторых способах агенты инъецируют непосредственно в конкретную ткань, в которой аккумулируются отложения, примером является интракраниальная инъекция. Внутримышечная инъекция или внутривенная инфузия предпочтительны для введения антитела. В некоторых способах конкретные терапевтические антитела инъецируют непосредственно в череп. В некоторых способах антитела вводят в виде композиции пролонгированного действия или в виде устройства, такого как устройство Меб1раб™.

Агенты по изобретению можно необязательно вводить в комбинации с другими агентами, которые, по меньшей мере, частично эффективны при лечении амилоидного заболевания. В случае болезни Альцгеймера и синдрома Дауна, при которых в мозгу образуются амилоидные отложения, агенты по изобретению можно также вводить в сочетании с другими агентами, которые повышают способность проникать через гематоэнцефалический барьер. Агенты по изобретению можно также вводить в комбинации с другими агентами, которые повышают доступ терапевтического агента к клетке-мишени или к тканимишени, например, с липосомами. При совместном применении таких агентов может повышаться доза терапевтического агента (например, терапевтического антитела или цепи антитела), необходимого для достижения заданного эффекта.

Фармацевтические композиции

Агенты по изобретению часто применяют в виде фармацевтических композиций, содержащих активный терапевтический агент и ряд других фармацевтически приемлемых компонентов. См. КеттдФп'к Рбагтасеибса1 Заепсе (15!б еб., Маск РиЬНкЫпд ^трапу, ЕакЮп, Реппкукаша (1980)). Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Композиции также могут включать, в зависимости от требуемой рецептуры, фармацевтически приемлемые нетоксические носители или разбавители, которые называют наполнителями, обычно применяемые для приготовления фармацевтических композиций для введения животному или человеку. Разбавитель выбирают таким образом, чтобы не влиять на биологическую активность комбинации. Примерами таких разбавителей (растворителей) являются дистиллированная вода, физиологический раствор с фосфатным буфером (забуференный фосфатом), растворы Рингера, раствор декстрозы и раствор Хэнка (Напк). Помимо этого, фармацевтическая композиция или препарат может также включать другие носители, адъюванты или нетоксические, нетерапевтические, неиммуногенные стабилизаторы и т.п. Фармацевтические композиции могут также включать большие медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, такие как хитозан, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты и сополимеры (такие, как латекс с сефарозой (ТМ), агарозой, целлюлозой и т.п.), полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и липидные агрегаты (такие, как капельки масла или липосомы). Помимо этого, эти носители могут действовать как иммуностимулирующие агенты (т.е. адъюванты).

Для парентерального введения агенты по изобретению можно вводить в инъецируемой лекарственной форме в виде раствора или суспензии вещества в физиологически приемлемом разбавителе с фармацевтическим носителем, который может быть стерильной жидкостью, такой как вода, масла, физиологический раствор, глицерин или этанол. Кроме этого, в композиции могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие вещества или эмульгаторы, поверхностно-активные вещества, рНбуферизующие вещества и т.п. Другими компонентами фармацевтических композиций являются вещества, полученные из нефти, вещества животного, растительного или синтетического происхождения, например арахисовое масло, соевое масло и минеральное масло. В целом, предпочтительными жидкими носителями, особенно для инъецируемых растворов, являются гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль. Антитела можно вводить в форме депо-инъекций или имлантатов препаратов, которые можно готовить таким образом, чтобы сделать возможным пролонгированное выделение активного ингредиента. Примерная композиция содержит 5 мг/мл моноклонального антитела в водном буфере, состоящем из 50 мМ Ь-гистидина, 150 мМ №С1, рН которого с помощью НС1 доводят до 6,0.

Как правило, композиции готовят в виде инъецируемых препаратов, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий; также можно готовить твердые формы для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Препарат можно также эмульгировать или инкапсулировать в липосомы или микрочастицы, такие как полилактидные, полигликолидные или сополимерные микрочастицы, с целью повышенного адъювантного эффекта, как обсуждалось выше (см. Ьапдег, Заепсе 249: 1527 (1990) и Напек, Αбνаηсеб Эгид Эе1гуегу Кеу1е\ук 28: 97 (1997)). Агенты по данному изобретению можно вводить в форме депо-инъекции (инъекции вещества замедленного всасывания) или имплантированного препарата, которые можно приготовить таким образом, чтобы выделение активного ингредиента было пролонгированным или происходило в пульсовом режиме.

- 27 010902

Дополнительные препараты, пригодные для других способов введения, включают препараты для перорального, назального и легочного введения, суппозитории и трансдермальные пластыри. Связующие и носители для суппозиториев включают, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории можно готовить из смесей, содержащих активный ингредиент в пределах 0,5-10%, предпочтительно 1-2%. Пероральные препараты включают эксципиенты, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахариннатрий, целлюлоза и карбонат магния фармацевтической степени чистоты. Эти композиции имеют форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, препаратов пролонгированного действия или порошков и содержат 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%.

Местное применение может осуществляться с помощью трансдермальной (чрескожной) или интрадермальной (внутрикожной) доставки. Местное введение можно облегчить путем совместного введения агента с холерогеном или его производными или субъединицами после детоксикации или с другими аналогичными бактериальными токсинами (см. С1епп е! а1., №ш.1ге 391, 851 (1998)). Совместное введение можно осуществлять, применяя компоненты в виде смеси или в виде связанных молекул, полученных химическим методом сшивания или экспрессией в виде слитого белка.

Или же трансдермальную доставку можно осуществлять, используя кожный пластырь или трансферосомы (Раи1 е! а1., Еиг. I. 1ттипо1. 25: 3521 (1995); Сеус е! а1., ВюсНет. ВюрНук. Ас!а 1368: 201-15 (1998)). Мониторинг курса лечения

Данное изобретение охватывает способы мониторинга в ходе лечения больных, страдающих восприимчивостью к болезни Альцгеймера, т.е. мониторинга курса лечения, проводимого в отношении пациента. Эти способы применимы для контроля как терапевтического лечения пациентов с симптомами, так и профилактического лечения бессимптомных пациентов. В частности, способы применимы для мониторинга пассивной иммунизации (например, измерения уровня вводимого антитела).

Некоторые способы включают определение базового (исходного) значения, например уровня антитела или профиля (характеристик) пациента, перед введением дозы агента и сравнение их со значением для профиля или уровня после лечения. Значительное увеличение (т.е. больше, чем обычный предел экспериментальной ошибки при повторных измерениях того же образца, выраженный как стандартная девиация от среднего значения при измерениях) величины уровня или профиля является показателем положительного результата лечения (т.е. что введение агента достигло желаемого ответа). Если величина иммунного ответа меняется незначительно или уменьшается, это является показателем отрицательного результата.

В других методах контрольное значение (т.е. среднее и стандартное отклонение, средняя и стандартная девиация) уровня или профиля определяют для контрольной популяции. Как правило, пациенты из контрольной популяции ранее не получали лечения. Затем измеренные значения уровня или профиля у больного после введения терапевтического агента сравнивают с контрольным значением. Значительное увеличение относительно контрольного значения (например, более одного стандартного отклонения от среднего) указывает на положительный или удовлетворительный результат лечения. Отсутствие достаточного увеличения или понижение сигнализирует об отрицательном или неудовлетворительном результате лечения. Введение агента, как правило, продолжается, пока уровень повышается относительно контрольного значения. Как и ранее, достижение плато относительно контрольных значений является показателем того, что лечение можно прекратить или уменьшить дозу и/или частоту.

В других способах контрольное значение уровня или профиля (например, среднее плюс стандартное отклонение) определяют у контрольной группы пациентов, которые не подвергались ранее лечению терапевтическим агентом и у которых в ответ на лечение наблюдается плато в значениях уровней или профилей. Измеренные значения уровней или профилей пациента сравнивают с контрольным значением. Если измеренный уровень у пациента незначительно отличается (например, более одного стандартного отклонения) от контрольного значения, лечение можно прекратить. Если уровень у больного значительно ниже контрольного значения, продолжение применения агента является оправданным. Если уровень у больного продолжает оставаться ниже контрольного значения, тогда больному может быть показано другое лечение.

В других способах у пациента, который в настоящее время не получает лечения, но проходил курс лечения ранее, контролируют уровень антител или профили с целью определения, требуется ли возобновление лечения. Измеренный уровень или профиль больного можно сравнить со значением, полученным у больного ранее, после предыдущего курса лечения. Значительное уменьшение относительно предыдущего измерения (т.е. больше, чем обычный предел ошибки при повторных измерениях того же образца (той же выборки)) указывает на то, что лечение можно возобновить. Или же значение, измеренное у больного, можно сравнивать с контрольным значением (среднее плюс стандартное отклонение), определяемым в группе пациентов после проведения курса лечения. Или же измеренное значение можно сравнивать с контрольным значением в популяции профилактически пролеченных пациентов, у которых по-прежнему отсутствуют симптомы заболевания, или в популяции терапевтически пролеченных пациентов, у которых наблюдается уменьшение интенсивности симптомов заболевания. Во всех этих случаях значительное уменьшение относительно контрольного уровня (т.е. более стандартного отклонения) является показателем того, что лечение пациента следует возобновить.

Лабораторным образцом ткани для анализа обычно является кровь, плазма, сыворотка, слизь или

- 28 010902 цереброспинальная жидкость (ликвор) пациента. В образце анализируют. например. уровни или профили антител к пептиду Αβ. например уровни или профили гуманизированных антител. Методы ЕЫ8А для обнаружения антител. специфических в отношении Αβ. описаны в разделе Примеры. В некоторых методах уровень или профиль вводимого антитела определяют. применяя анализ очищения (выведения. клиринга). например анализ фагоцитов ш νίΙΐΌ. как представлено в данном описании. В таких методах анализируемый образец ткани пациента контактирует с амилоидными отложениями (например. мыши ΡΌΑΡΡ) и фагоцитами. несущими рецепторы Ес. Проводят мониторинг последующего выведения амилоидного отложения (очищения от амилоидного отложения). Наличие и величина реакции очищения указывают на присутствие и уровень антител. эффективных для очищения от Αβ в тканевом образце испытуемого пациента.

На кривой концентрации антитела сразу после пассивной иммунизации обычно имеется пик с последующим экспоненциальным спадом. Без дополнительной дозы спад приближается к уровням до начала лечения в течение периода от нескольких дней до нескольких месяцев в зависимости от полупериода существования вводимого антитела.

В некоторых методах перед введением делают базовое (начальное) измерение антитела к Αβ у больного. второе измерение делают вскоре после введения для определения максимального уровня антител и одно или более дополнительных измерений делают с перерывами для контроля падения уровней антител. Когда уровень антитела падает до базовой линии или до более низкого. чем предварительно определенное пиковое. базового значения (например. 50. 25 или 10%). предпринимают введение дополнительной дозы. В некоторых методах максимальное (пик) значение или последующие измеряемые уровни. более низкие. чем базовые. сравнивают с определенными ранее стандартными уровнями с целью найти наиболее подходящую схему профилактического или терапевтического лечения других пациентов. Если измеренный уровень антитела значительно ниже. чем стандартный уровень (например. ниже. чем среднее значение минус стандартное отклонение от эталонного значения в группе пациентов. которым лечение помогло). то показано дополнительное введение дозы антитела.

Другие методы включают мониторинг. в ходе лечения. любого общепризнанного в технике физиологического симптома (например. физического или ментального симптома). на который обычно опираются исследователи или врачи при диагностике или мониторинге амилоидных заболеваний (например. болезни Альцгеймера). Например. можно контролировать когнитивное ухудшение (ослабление умственной деятельности). Последнее является симптомом болезни Альцгеймера и синдрома Дауна. но встречается также при отсутствии других признаков любого из этих заболеваний. Например. когнитивное ухудшение в течение курса лечения можно контролировать. определяя балл больного в мини-экзамене. определяющем его умственное состояние (М1ш-Меп!а1 8!а!е Ехат) в соответствии с принятыми нормами.

Наборы

Данное изобретение охватывает далее наборы для осуществления описанных выше методов мониторинга. Как правило. такие наборы содержат агент. который специфически связывается с антителом к Αβ. Набор может также содержать метку (реагент для мечения). Для обнаружения антител к Αβ метка. как правило. находится в виде меченых антиидиотипических антител. Для обнаружения антител агент может поставляться в виде предварительно связанного с твердой фазой (иммобилизованного на твердой фазе). такой. например. как лунки микротитрационного планшета. Наборы также обычно содержат документацию с сопроводительными инструкциями по применению набора. Документация может также включать таблицу или другую соответствующую схему корреляции уровней определяемой метки с уровнями антител к Αβ. Термин документация относится к любому написанному или зарегистрированному материалу. который к этому прилагается или иным образом сопровождает набор в ходе производства. транспорта. продажи или применения. Например. термин документация. сопроводительные материалы охватывает листовки. брошюры. упаковочные материалы. инструкции. аудио- и видеокассеты. компьютерные диски. а также инструкции. напечатанные непосредственно на наборах.

Данное изобретение также включает диагностические наборы. например наборы для исследования. обнаружения и/или диагностики (например. для визуализации ш У1уо). Такие наборы обычно содержат антитело для связывания с эпитопом Αβ. предпочтительно внутри остатков 1-10. Предпочтительно антитело метят или в набор включают вторичный реагент для мечения. Предпочтительно в набор включают вкладыш или этикетку с инструкциями по соответствующему применению. например по осуществлению визуализации ш у1уо. Примеры антител представлены в данном описании.

1п у1уо визуализация

Данное изобретение охватывает способы ш у1уо визуализации амилоидных отложений у больных. Такие способы применимы для диагностики или подтверждения диагноза болезни Альцгеймера или восприимчивости к ней. Например. можно использовать эти методы в отношении больного с симптомами деменции. Если у больного наблюдаются аномальные амилоидные отложения. он. по-видимому. страдает болезнью Альцгеймера. Эти способы могут также использоваться для бессимптомных пациентов. Наличие аномальных отложений амилоида указывает на предрасположенность к будущему симптомному заболеванию. Способы по изобретению также применимы для мониторинга развития заболевания и/или

- 29 010902 реакции на лечение больных, у которых ранее была диагностирована болезнь Альцгеймера.

Эти методы осуществляют путем введения пациенту реагента, такого как антитело, которое связывается с Αβ, и последующего обнаружения агента после его связывания. Предпочтительные антитела связываются с отложениями Αβ в организме пациента, не связываясь с полноразмерным полипептидом АРР. Антитела, связывающиеся с эпитопом Αβ в аминокислотах 1-10, являются особенно предпочтительными. В некоторых методах антитела связываются с эпитопом, находящимся в аминокислотных остатках 7-10 полипептида Αβ. Такие антитела обычно связываются, не вызывая заметной реакции очищения. В других методах антитело связывается с эпитопом во фрагменте, содержащем аминокислоты 1-7 Αβ. Такие антитела обычно связываются с Αβ и индуцируют клиринг Αβ. Однако реакцию очищения (клиринг) можно избежать, используя фрагменты антитела, у которых отсутствует полноразмерная константная область, такие как РаЬ§. В некоторых методах одно и то же антитело может служить как в качестве терапевтического, так и в качестве диагностического реагента. В целом, антитела, связывающиеся с эпитопами, С-концевыми к остатку 10 Αβ, не показывают такого сильного сигнала, как антитела, связывающиеся с эпитопами внутри остатков 1-10, по-видимому, потому, что С-концевые эпитопы в амилоидных отложениях недоступны. Соответственно, такие антитела являются менее предпочтительными.

Диагностические реагенты можно вводить пациенту внутривенной инъекцией или непосредственно в мозг с помощью интракраниальной инъекции, или просверливая отверстие в черепе. Доза реагента должна быть в тех же пределах, что и для целей терапии. Обычно реагент является меченым, хотя в некоторых методах первичный реагент с аффинностью к Αβ является немеченым, и применяют вторичный реагент с меткой для связывания с первичным реагентом. Выбор метки зависит от способа обнаружения. Например, для оптического обнаружения применима флуоресцентная метка. Применение парамагнитных меток применимо для томографического обнаружения без хирургического вмешательства. Радиоактивные метки могут также обнаруживаться с помощью РЕТ или БРЕСТ.

Диагностику осуществляют, сравнивая количество, величину и/или интенсивность меченых локусов с соответствующими базовыми значениями. Базовые значения (базовая линия) могут представлять собой средние уровни в популяции не болеющих людей. Базовые значения могут также представлять собой предыдущие значения уровней у того же пациента. Например, базовые значения можно определять у пациента перед началом лечения и затем измеряемые значения затем можно сравнивать с базовыми. Уменьшение значений относительно базовой линии свидетельствует о положительной реакции на лечение.

Настоящее изобретение более полно описывается представленными далее не ограничивающими его объем примерами.

Примеры

Следующие последовательности применяются в разделе Примеры для названия нуклеотидных и аминокислотных последовательностей вариабельной области цепи иммуноглобулина.

Антитело	УЬнтклео-	УНаминоки	УЬнуклео-	УНаминоки
	тидная после	слотная после	тилная после	слотная после
12В4	довательность ЗЕр ГО ΝΟ: 1	довательность 8Е<) ГО ΝΟ: 2	довательность ЗЕр ГО N0: 3	довательность ЗЕр ГО ΝΟ: 4
Гуманизиров. 12Β4ν1	ЗЕр ГО МО: 5	ЗЕр ГО N0:6	ЗЕр ГО N0:7	ЗЕр ГО N0: 8
Гуманизиров. 12Β4ν2	ЗЕр ГО ΝΟ: 5	ЗЕр ГО N06	ЗЕр ГО N0: 9	ЗЕр ГО N0:10
Гуманизиров. 12Β4ν3	ЗЕрГОЦО: 5	ЗЕр ГО ΝΟ: 6	ЗЕр ГО N0:11	ЗЕр 10 N0:12
Зародышев. линия А19	ЗЕр ГО N0:29	ЗЕО ГО N0:30
КаЬаМЛ 005036	ЗЕр ГО N0:31	ВЕС} ГО N0:32
КаЬа1ГО 000333			ЗЕр ГО N0:33	ЗЕр ГО N0:34
Зародыыгев. линия УН4- 61			ЗЕр ГО N0:35	ЗЕр ГО N0:36
Зародыш ев. линия. УН4- 39			ЗЕр ГО N0:37	ЗЕр ГО N0:38

- 30 010902

По данному описанию последовательность антитела или иммуноглобулина, содержащая УЪ или УН последовательность, представленную любыми 8Е0 ΙΌ N0: 1-12 или 29- 38, может содержать полную последовательность или может содержать зрелую последовательность (т. е. зрелый пептид без сигнального или лидерного пептида).

Пример Ι. Клонирование и секвенирование вариабельных областей мышиного 12В4.

Клонирование и секвенирование УН 12В4. УН и УЪ области 12В4 клеток гибридомы клонируют с помощью КТ-РСК (ПЦР) и 5' ВАСЕ с применением мРНК клеток гибридомы и стандартной методики клонирования. Нуклеотидная последовательность (8Е(^ ΙΌ N0: 3) и расшифрованная аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 4), образованная с помощью двух независимых клонов кДНК, представлены в табл. 2 и 3, соответственно.

Таблица 2 Последовательность ДНК УН мышиного антитела 12В4

АТССАО^О<ЗСТТАС1Т'ССТСАТТССТССТ(ЗСТОАТТ<?ГСССТССАТАТСТССТСТСССА алтАСТстсиААаАСТСтотссстооедтаттсгас^стссс^^ СТТ(ЗТТСТТТСТСТОООТТТТСАСТ<ЗА6САСТААТ06ТАТОСОТС»ТОАССТООАТТССТ СА<х:с?ттсАасАААа<хп'СТссАатааст®хлсхсАТТТАСтасхзАТСАССАСААасс СТАТААСССЛТСССТСААСАСИгСЗССТСАСААТСТССААОСАТАССТСТААСААТСАОа ТАТТССТСААОАТСАССААТбТОбАСАСТОСТОАТАСТОССАСАТАСТАСТОТОСТСОА АС0АСвАТСАТСТАТСАТС1ТТЗАССАСТА<ПТТСАСТАСТ(Х^ССААОДСАССАСТСТ САСАСТСТССТСАС (ЗЕК) 10 Ы0;3) * Лидерный пептид подчеркнут.

Таблица 3 Аминокислотная последовательность УН мышиного антитела 12В4 пк!г1ез8£1111чрауу18С(\ГП.КЕ5<ЗРС11Х)₽50ТЬЗЫ?С5Ь-ЗСГ31₍ЗСП9тдпгвИ1В 0РеСКСЬЕН1АЪ1уийесЗкгупр81к511ЕТ18КПТеыКС)У₽ЪК1ТМУ15ТА0ТАТ1ЛГСАК гг11убУебу£буНС<Х?ТТЬ'ГУ55 (5Е<2 ΙΟ ΝΟ: 4) * Лидерный пептид и СЭВ области изображаются строчными буквами.

Клонирование и секвенирование УЪ 12В4.

Вариабельную область легкой цепи УЪ 12В4 клонируют аналогично клонированию области УН.

Нуклеотидная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 1) и расшифрованная аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 2), образованная с помощью двух независимых клонов у ДНК, кодирующих предполагаемый УЪ домен 12В4, представлены в табл. 4 и 5, соответственно.

Таблица 4 Последовательность ДНК УЪ мышиного антитела 12В4

АТ6ЛА(ЛТОСС1ХТГТА<ЗС<ЛХЗТТС<Л^СгеАТСТТСТО<^ТТССТ<Х:ТТССАС<^ОТСА

ТбТТТТбАТОАСССЛААСТССАСТСРСССТЭССТвТСАОТСТТООАСАТСААОССТССА

ТСТСТТ6САСАТСТА6ТСАСААСАТГСТТСАТАСТААТССАААСАССТАТТТАСААТСС ТАССТССАСАААССАССССАСТСТССАААССТССТОАТСТАСАААСТТТССААССОАТТ ТГСТСИбаТСССАСАСА(ЮТТСАетС<КЛОТ<ЮАТСАатаСА(ЖТ1ТСЛ»СТСАА^ ТСАЗСАОАСТССА®ХГгеЛ0САТСТС<ЗСАСТТГАТТАС^СС1ТТ'СААаСТТСАСАТСТТ СС?ССТСАСХЗТТС6СТ(?СТССОАССААССТССАССТОАААС (5Е0 Ιϋ N0:1) * Лидерный пептид подчеркнут.

Таблица 5 Аминокислотная последовательность УЪ мышиного антитела 12В4 тк1рУГ11у1т£к1раззз0УЬМТ0ТРЬ5ЬРУЗЬСТ»0А515Сгэздп1УЬзпдпСу1еИ УЪОКРСОЗРКЬЫУОсУВпгГЙСУРОКРЗСебЗОТПЕТЬКТЗКУЕАЕОШУтГСгчдяИ'У р1ЪЕЗАСТКЬЕЬК (ЗЕО Ю N0: 2) * Лидерный пептид и СЭВ области изображаются строчными буквами.

- 31 010902

Последовательности УЪ и УН 12В4 удовлетворяют критериям для функциональных V областей, поскольку они содержат непрерывную ОКЕ (открытую рамку считывания) от начального метионина до С-области и имеют общие консервативные остатки, характерные для V области генов иммуноглобулина. От Ν-конца до С-конца как легкая, так и тяжелая цепи содержат домены ЕК1, СЭКЕ ЕК2, СОК2, ЕК3 и ЕК4. Отнесение аминокислот к каждому домену делается в соответствии с нумерацией по ΚаЬаί еί а1., см. выше.

Пример II. Экспрессия химерного антитела 12В4.

Экспрессия химерного антитела 12В4.

Вариабельные области тяжелой и легкой цепи повторно получают методами генной инженерии (рекомбинантной ДНК), чтобы кодировать донорные последовательности сайта сплайсинга в 5'-3'направлении (в правом элементе оперона) относительно соединений УЭ1 или VI, и клонируют в вектор экспрессии млекопитающих рСМУ- Ьу 1 для тяжелой цепи и рСМУ- Ьк1 для легкой цепи. Эти векторы кодируют человеческие у1 и Ск константные области как экзонные фрагменты в 5'-3'-направлении относительно встроенной кассеты вариабельной области. После проверки последовательностей векторы экспрессии тяжелой цепи и легкой цепи котрансфицируют в клетки СО8. Для подтверждения воспроизводимости результата различные клоны тяжелой цепи независимо котрансфицируют с различными клонами химерной легкой цепи. Кондиционированные среды собирают через 48 ч после трансфекции и анализируют вестерн-блоттингом на продукцию антитела или методом ΕΜδΑ на Αβ-связывание. Все сложные трансфектанты экспрессируют комбинации тяжелая цепь+легкая цепь, которые распознаются антителом козы к человеческому 1дС (Н+Ь) при анализе вестерн-блоттингом.

Непосредственное связывание химерных 12В4 антител с Αβ определяют методом ΕΜ8Α. На фиг. 5 показано, что химерное антитело 12В4 связывается с Αβ с высокой авидностью, аналогичной авидности, демонстрируемой химерным и гуманизированным антителом 3Ό6 (фиг. 5). (Клонирование, характеристики и гуманизация антитела 3Ό6 описаны в патентной заявке США № 10/010942, полное содержание которой вводится в данное описание данной ссылкой.) Кроме того, анализ конкурентного ингибирования методом ΕΜ8Α показывает, что химерное антитело 12В4 и мышиное антитело 12В4 равным образом конкурируют с биотинилированным мышиным и химерным 3Ό6, а также 10Ό5 (мышиное моноклональное антитело изотипа 1§Су1, которое распознает тот же самый эпитоп, что и антитело 12В4) за связывание с Αβ. На фиг. 6 показано, что химерное антитело 12В4 (пунктирная линия, незамкнутые треугольники) конкурирует с равной эффективностью со своим биотинилированным мышиным аналогом (сплошная линия, замкнутые треугольники) за связывание биотинилированного мышиного 12В4 с Αβ 1-42 пептидом.

Пример III. Эффективность тΑЬ 12В4 в конечных точках различных нейропатологических показателей у мышей ΡΌΑΡΡ.

В данном примере описана эффективность мышиного тΑЬ 12В4 в различных нейропатологических конечных точках. Описывается сравнение двух тΑЬ, 12В4 и 3Ό6. Оба тΑЬ являются антителами изотипа [дСЗ, и оба связывают эпитоп на Ν-конце Αβ-пептида.

Иммунизация.

Мышей ΡΌΑΡΡ подвергают пассивной иммунизации либо тΑЬ 12В4 (распознающим Αβ 3-7), либо тΑβ 3Ό6 (распознающим Αβ 1-5), оба принадлежат к изотипу !§Су2а. Антитело 12В4 испытывают при дозе 10 мг/кг. Антитело 3Ό6 вводят в трех различных дозах, 10, 1 и 10 мг/кг 1 раз в месяц (1x4). В качестве контроля служат инъекции неродственного ^Су2а антитела (ΤΥ 11/15) и РВ8. Для сравнения используют активную иммунизацию с помощью Αβ пептида. В каждой группе изучают от 20 до 35 животных.

Исследуемые нейропатологические конечные точки включают амилоидную нагрузку и нейритную нагрузку.

Амилоидная нагрузка.

Зону лобной коры, занятую амилоидными отложениями, определяют с помощью иммуноокрашивания с помощью 3Ό6 с последующим количественным анализом изображения. Результаты этого анализа показаны в табл. 6. Все способы иммунотерапии (например, иммунизация с помощью 12В4, 3Ό6 (при всех испытуемых дозах) и Αβ пептида) приводит к значительному снижению амилоидной нагрузки.

Нейритная нагрузка.

Ранее наблюдали, что антитело 10Ό5 не способно заметно снизить нейритную нагрузку; предполагается, что антитела изотипа но не других изотипов, способны понизить нейритную нагрузку у животных моделей болезни Альцгеймера (данные не показаны). Таким образом, нейритную нагрузку после пассивной иммунизации с помощью 12В4 по сравнению с 3Ό6 (оба изотипа IдСу2а) определяют в мышах ΓΟΑΓΓ иммуноокрашиванием срезов мозга с применением антитела 8Е5 против АРР с последующим количественным анализом изображения. На нейритную дистрофию указывает внешний вид дистрофических нейритов (например, глобулярных нейритов), расположенных в непосредственной близости от амилоидной бляшки. Результаты этого анализа показаны в табл. 7. Эти данные показывают, что обработка антителом 12В4 наиболее значительно снижает нейритную нагрузку. Напротив, антитело 3Ό6 не дает значительного снижения нейритной нагрузки.

- 32 010902

Таблица 6

Амилоидная нагрузка лобной коры (коры лобной доли полушария большого мозга)

	РВ8	ΤΥ 11/15	12В4	ЗП6,10 мг/ кг	3ϋ6.1 мг/ кг	306,10мг/ кг/4 нед.	Актив кость
N	31	30	33	29	31	32	24
Медиана (%АВ)	15.182297	13.303288	2.317222	0.865671	2.286513	1.470956	2.162772
Интервал	0.160- 31.961	0-61.706	0- 14.642	0- 7.064	0.077-63.362	0- 10.688	0-30.715
Значение р (*М-\¥)		.9425 хм	***<000 1	***,0001	***<0001	***<0001	***<0004
% измен.	Н/О	12%	85%	94%	85%	90%	86%

Таблица 7

Нейритная нагрузка лобной коры (коры лобной доли полушария большого мозга)

	РВ8	ΊΎ 11/15	Ι2Β4	306,10 мг/ кг	306,1 мг/кг	306,10мг/ кг/4 нед.	Активность
N	31	30	33	29	31	32	24
Медиана (%ΝΒ)	0.3946	0.3958	0.0816	0.4681	0.3649	0.4228	0.2344
Интервал	0- 1.3828	0- 2.6800	0- 0.8127	0- 1.3098	0-1.5760	0-1.8215	0-1.1942
Значение р (*М- А)		.8967115	***.0002	.9587 П5	.6986 из	>.9999	***.О381
% измен.		0%	79%	0%	7%	0%	41%

Вышеприведенные результаты показывают, что лечение Αβ антителом изотипа 1дСу2а может быть необходимым, но недостаточным для уменьшения нейритной нагрузки. Связывание Αβ У1а определенный эпитоп (т.е. Αβ 3-7) может также являться существенным для уменьшения этой патологии у мышей ΡΌΑΡΡ.

Определение конечных точек различных нейропатологических показателей на мышиной ΡΌΑΡΡ модели болезни Альцгеймера дает опытным специалистам в данной области техники ценную информацию для создания подходящих протоколов терапевтической иммунизации человека. Например, уменьшения нейритной нагрузки у человека можно достичь, используя гуманизированный вариант антитела 12В4 подтипа 1дО1 (т.е. человеческий эквивалент подтипа Ι§Ογ2Α у мышей), который связывается с эпитопом в остатках 3-7 Αβ.

Пример IV. Ех у1уо скрининг на активность антител против амилоидных отложений.

С целью изучения действия антител на клиренс (амилоидных) бляшек мы используем ех у1уо анализ, в котором первичную микроглию культивируют с нефиксированными криостатными срезами ΑΌ мозга мыши ΡΌΑΡΡ или человека. Клетки микроглии (клетки Ортеги, микроглиоциты) получают из коры головного мозга новорожденных мышей (1-3 дня) ΌΒΑ/2Ν. Кору головного мозга механически разрушают в ΗΒδδ^- (сбалансированный солевой раствор Хэнкса, 81дта) с помощью 50 мкг/мл ДНК-азы I (81дта). Разрушенные клетки фильтруют через клеточный фильтр 100 мкм (Ра1соп) и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об./мин. Осадок снова суспендируют в питательной среде (ΌΜΕΜ с высоким содержанием глюкозы, 10% ΡΒδ, 25 нг/мл рекомбинантного мышиного ОМ- С8Р (гтОМ-С8Р)) и клетки помещают в пластиковые колбы Т-75 для культивирования при плотности мозг 2 мышей на колбу. Через 7-9 дней колбы помещают в ротационный шейкер и встряхивают при 200 об/мин при 37°С в течение 2 ч. Клеточную суспензию центрифугируют при 1000 об./мин и снова суспендируют в среде для анализа.

Криостатные срезы 10 мкм ΑΌ мозга мышей ΡΌΑΡΡ или человека (менее чем через 3 ч после смерти) размораживают на круглых покрытых полилизином покровных стеклах и помещают в лунки 24луночных планшетов для тканевых культур. Покровные стекла дважды отмывают средой для анализа, содержащей Н-8РМ (гибридома-бессывороточная среда, О1Ьсо ВРЬ) с 1% ΡΒδ, глутамин, пенициллин/стрептомицин и 5 нг/мл гтОМ-С8Р (Ρ&Ό). Контрольные вещества или антитела против Αβ (12В4) добавляют с концентрацией 2х (конечная 5 мкг/мл) в течение 1 ч. Клетки микроглии затем засевают при плотности 0,8х10⁶ клеток/мл среды для анализа. Культуры выдерживают в увлажняемом инкубаторе (37°С, 5% СО₂) в течение 24 ч или более. По окончании инкубации культуры фиксируют 4% раствором параформа и пермеабилизуют с помощью 0,1% Тп!оп-Х100. Срезы окрашивают биотинилированным 3Ό6, а затем конъюгатом стрептавидин/Су3 Оасккоп 1ттипоКекеагс1). Экзогенные клетки микроглии визуализуют окрашиванием ядер (ΌΑΡΙ). За культурами наблюдают под инвертированным флуоресцентным микроскопом (№соп, ТЕ300) и делают микрофотографии цифровой камерой δΡΟΤ с применением программного обеспечения δΡΟΤ (О1адпок!ю Шкйитеп!).

- 33 010902

Когда проводят анализ срезов мозга РЭАРР в присутствии контрольного антитела, неэффективного ίη у1уо, β-амилоидные бляшки остаются интактными и фагоцитоз не наблюдается. Напротив, когда соседние срезы культивируют в присутствии 3Ό6 или 12В4, амилоидные отложения, в основном, исчезают и в клетках микроглии наблюдаются многочисленные везикулы фагоцитов, содержащие Ав (фиг. 7). Идентичные результаты получены для срезов АО мозга; 3Ό6 (гуманизированная версия) и химерное антитело 12В4 индуцируют фагоцитоз АО бляшек, тогда как контрольный 1дС1 является неэффективным (фиг. 8А-В).

Данные, представленные в примерах II и III, подтверждают функцию вариабельных областей клонированного антитела 12В4.

Пример V. Гуманизация 12В4.

Гомология/молекулярное моделирование.

Для идентификации ключевых остатков структурного каркаса (остова) в мышином 12В4 антителе на основе ближайших мышиных антител создана трехмерная модель тяжелой и легкой цепей. Для этой цели в качестве матрицы для моделирования легкой цепи 12В4 выбирают антитело, обозначенное 2РСР (ΡΌΒ ГО: 2РСР, Ь1т е! а1. (1998) I. Вю1. СНет. 273: 28576), а в качестве матрицы для моделирования тяжелой цепи выбирают антитело, обозначенное 1ЕТ2 (РОВ ГО: 1ЕТ2, Сибба! е! а1. (2000) I. Мо1. Вю1. 302: 853). Сравнение первичной структуры аминокислотной последовательности легкой и тяжелой цепи 12В4 с первичной структурой аминокислотной последовательности легкой и тяжелой цепей этих антител показывает, что антитела 2РСР и 1ΞΤΖ последовательности этих антител в значительной степени гомологичны последовательностям антитела 12В. Помимо этого, петли СОЯ выбранных антител попадают в те же самые канонические структурные классы по Сбо1Ъ1а, что и петли СОЯ антитела 12В4. Поэтому 2РСР и 1ЕΤΖ сначала выбирают в качестве антител с решенной (расшифрованной) структурой для моделирования 12В4 по гомологий.

Первую модель вариабельной области 12В4 по гомологии на основе вышеуказанных антител конструируют с применением программного обеспечения Боок & 8едМоб Моби1е§ СепеМте (ν3.5). Это программное обеспечение приобретено по лицензии на неограниченный срок от Мо1еси1аг Арр1юа!юп8 Сгоир (Ра1о А1!о, СА). Это программное обеспечение, авторы Όγκ. Мюбае1 Бе\'Ш и СЬп§ Бее, упрощает процесс молекулярного моделирования вследствие автоматизации стадий структурного моделирования первичной последовательности на матрице известной структуры на основе гомологий последовательностей. Использование рабочей станции 8111соп СгарЫс БЯК и операционной системы υΝΊΧ позволяет автоматически уточнять моделируемую структуру серией стадий минимизации энергии, чтобы уменьшить неблагоприятные атомные контакты и оптимизировать электростатические и ван-дер-ваальсовы взаимодействия.

Отбор последовательностей человеческого акцепторного антитела.

Соответствующие последовательности человеческого акцепторного антитела идентифицируют, используя компьютерные методы сравнения аминокислотных последовательностей вариабельных областей мышиных антител с последовательностями известных человеческих антител. Сравнение проводят отдельно для легкой и тяжелой цепей 12В4. В частности, вариабельные домены человеческих антител, остовные последовательности которых проявляют высокую степень идентичности с мышиными УБ и УН остовными областями, идентифицируют по запросу базы данных КаЬа! при использовании NСΒI ВБА8Т (доступ через интернет-сервер NСΒI Национального Института здоровья) с соответствующими мышиными остовными последовательностями. Две предполагаемые (кандидатные) последовательности выбирают в качестве акцепторных последовательностей на основе следующих критериев: (1) гомология с последовательностью по изобретению; (2) общие с донорной последовательностью канонические СОЯ структуры и (3) отсутствие каких-либо редких аминокислотных остатков в остовных областях. Выбранная акцепторная последовательность УБ представляет собой последовательность номер КаЬа! ГО (КАВГО) 005036 (СепЬапк Ассе^юп Ыо. Χ67904), а последовательность УН представляет собой КАВГО 000333 (СепЬапк Лссе88юп Ыо. Χ54437). В первых вариантах гуманизированного антитела 12В4 используются эти выбранные последовательности акцепторного антитела.

Замена аминокислотных остатков.

Как отмечается выше, гуманизированные антитела по изобретению содержат вариабельные остовные области, главным образом, человеческого иммуноглобулина (акцепторный иммуноглобулин) и гипервариабельные участки, главным образом, иммуноглобулина мыши (донорный иммуноглобулин), называемого 12В4. После идентификации гипервариабельных участков 12В4 и соответствующих человеческих акцепторных иммуноглобулинов следующей стадией является определение, какие (если таковые имеются) остатки этих компонентов следует заменить, чтобы оптимизировать свойства результирующего гуманизированного антитела.

Измененная область У легкой цепи.

Сравнительный анализ первичных структур (совмещение) аминокислотной последовательности измененной области У легкой цепи показан на фиг. 1. Каркас акцептора (КаЬ1б 005036) выбирают из той же самой человеческой подгруппы, которая соответствует мышиной У области, не содержит необычных остовных остатков, а области СОЯ относятся к тем же самым каноническим структурным группам по С1о11иа. Возможна единственная обратная мутация (12У), так как этот остаток попадает в каноническую классификацию. Вариант 1 измененной области УБ полностью взят из зародышевой линии.

- 34 010902

Измененная область У тяжелой цепи.

Сравнительный анализ первичных структур (совмещение) аминокислотной последовательности измененной области У тяжелой цепи показан на фиг. 1. Каркас акцептора (КаЫб 000333) выбирают из той же самой человеческой подгруппы, которая соответствует мышиной У области, не содержит необычных остовных остатков, а области СОВ относятся к тем же самым каноническим структурным группам по С1о11иа. Моделирование структуры мышиной УН цепи в сочетании со сравнением первичной структуры аминокислотной последовательности КаЫб 000333 с мышиной последовательностью диктует 9 обратных мутаций в версии (варианте) 1 (ν1) измененной тяжелой цепи; Ь2У, У24Р, С27Р, 129Ь, 148Ь, С49А, У67Ь, У71К и Р78У (нумерация КаЬа!). Обратные мутации отмечены звездочками в сравнительном анализе аминокислотной последовательности на фиг. 2.

Из 9 обратных мутаций 4 диктуются моделью, так как эти остатки являются каноническими остатками (У24Р, С27Р, 129Ь и У71К, отмеченные как сплошные закрашенные прямоугольники), т.е. остовными остатками (остатками каркаса), которые могут вносить вклад в связывание с антигеном благодаря близости к СОВ остаткам.

Отсутствуют мутации, необходимые в следующем наиболее важном классе остатков, остатках интерфейса, участвующих во взаимодействиях, ведущих к УН-УЬ упаковке (показаны в виде незакрашенных прямоугольников). Остальные 5 остатков, намеченных в качестве обратных мутаций (Ь2У, 148Ь, С49А, У67Ь, Р78У, нумерация КаЬа!), попадают в верньер-класс (непрямой вклад в конформацию СОВ, прямоугольники, отмеченные пунктиром на фиг. 2).

Вариант (версия) 2 создан для того, чтобы сохранить самое низкое число не-СЭВ мышиных остатков. Обратная мутация Ь2У вводит замену не из зародышевой линии (если использовать УН4-61 в качестве эталона зародышевой линии), и эта обратная мутация исключена в варианте 2 тяжелой цепи, чтобы восстановить тяжелую цепь зародышевой линии. Остальные 4 обратные мутации верньер-класса также восстановлены в варианте (версии) 2 тяжелой цепи (148Ь, С49А, У67Ь, Р78У). Таким образом, вариант 2 содержит всего 5 остатков немышиных СОВ (1 в УЬ и 4 в УН). Вариант 3 создан для того, чтобы восстановить 2 из 5 верньер-остатков (148Ь и Р78У), которые, как видно на модели, могут быть более важными верньер-остатками. Следовательно, вариант 3 содержит всего 7 остатков немышиных СОВ.

Сведения о заменах, введенных в варианты 1, 2 и 3 гуманизированного 12В4, сведены в табл. 8.

Таблица 8 Общие сведения о заменах в гуманизированном 12В4. ν1

Изменения	УЬ (111 остатков)	УН (123 остатка)
Ни->Ми: Остов	1/111	9/123
СОК.1	8/16	7/7
<ΌΓ<2	3/7	8/16
СРЯЗ	6/8	10/13
Всего Ни->Ми	18/111 (16%)	34/123 (28%, ν2=23%)
Ми->Нц: Остов	10/1П	16/123
Обратные мутации: комментарии	1. 12У, каноническое положение	2. Канонические: У24Р, С27Г, 129Ь и У71К
		3. Укладки: нет
		4. Верньер: Ь2У* 148Ь#, (349А. У67Ь Р78 V#
Акцептор:	5. КАВГО 005036/СепЪапк	8. КАВГООООЗЗЗ/ОепЬапк
комментарии	Асе#- Х67904;	Асс#х54437
	6 Участки СПК. из той же канонической структурной группы, что и донорные мышиные;	9. СПК. из той же канонической структурной группы, что и донорные мышиные;
	7. анти-кардиолипин/ антитело с вк (одноцепочечной) ДНК пациента 8ЬЕ;	10. ревматоидный фактор тАЪ пациента КА

* исчезает в ν2 и ν3;

# исчезает в ν2, восстанавливается в ν3.

- 35 010902

В табл. 9 и 10 представлены определители нумерации по КаЬа! для различных легких и тяжелых цепей, соответственно.

Таблица 9

КАВ #

Ключ к нумерации по КаЬа! для легкой цепи мышин. ΗϋΜ А19Ι2Β4 уь

ТИП

12В4

УЪ

ΚΑΒΙΡ

005036

Комментарии

Гк1 каноническая-обратная мутация в νΐ, ν,2 и ν.3

V м т Р

Р ь ь

Р

V т Р о Е Р

А

I 8 С

V м т 9 8 Р ь 8 Ъ Р

V т Р с Е Р А 5 I 8 С

24	24 С0Й.1	К	К.	К	к
25	25	5	5	8	5
26	26	3	5	8	5
27	27	9	<5	9	9
27А	28	N	N	5	8
27В	29	I	I	Ь	Ь
27С	30	V	V	ь	Е
27Э	31	н	н	н	И
27Е	32	5	8	к	8
28	33	N	N	Υ	N
29	34	О	О	с	О
30	35	N	N	Υ	Υ
31	36	Т	Т	N	N
32	37	Υ	Υ	Υ	Υ
33	38	ь	Е	ь	Е
34	39	Е	Е	ϋ	ϋ

35	40 ГК2	V	IV	IV	IV
36	41	Υ	Υ	У	У
37	42	1	Е	Е	Е
38	43	9	б	Ч	9
39	44	К	К	к	к
40	45	Р	Р	Р	Р
41	46	о	о	о	о
42	47	Ω	9	9	9
43	48	$	8	8	5
44	49	Р	Р	Р	Р
45	50	к	9	<Э	9
46	51	ъ	ь	ь	ь
47	52	ь	ь	ь	ь
48	53	I	I	I	I
49	54	У	Υ	Υ	У

50	55 СМ12	К	К	Ъ	Е
51	56	V	V	С	О
52	57	8	8	8	8
53	58	N	N	N	N
54	59	К	Л	К	К
55	60	Г	Г	А	А
56	61	8	8	3	8

- 36 010902

57	62	гкз	6	С	σ	а
58	63		V	V	V	V
59	64		Р	Р	Р	Р
60	65		13	ϋ	о	ϋ
61	66		к.	к	в	в
62	67		Р	г	Р	Р
63	68		8	5	8	8
64	69		0	С	С	а
65	70		5	8	8	8
66	71		σ	σ	σ	о
67	72		5	8	3	8
68	73		Θ	6	6	О
69	74		Т	т	т	Т
70	75		П	σ	о	В
71	76		Р	Р	Р	Р
72	77		т	т	т	т
73	78		ь	Б	Е	Е
74	79		к	К	К	К
75	80		I	I	I	I .
76	81		£	8	8	8
77	82		К	В	К	в
78	83		V	V	V	V
79	84		Е	Е	Е	Е
80	85		А	А	А	А
81	86		Е	Е	Е	Е
82	87		ϋ	В	ϋ	ϋ
83	88		Б	V	V	V
84	89		С	0	с	σ
85	90		V	V	V	ν
86	91		Υ.	Υ	Υ	Υ
87	92		Υ	Υ	Υ	Υ
88	93		с	с	с	с
89	94	сокз	г	Р	м	Μ
90	95		<3	<2	<2	Ω
91	96		6	0	А	Α
92	97		5	8	Б	Ε
93	98		Н	н	<2	Ρ
94	99		V	V	т	τ
95	100'		Р	Р	Р	Ρ
9$	101		Е	Б	Υ
97	102		т	т	т
98	103	РЯ4	Р	Р	Ρ ί
99	104		6	0	о ^!
100	105		А	<2	Ω
ΙΟΙ	106		С	о	с
102	107		т	т	т
103	108		к	к	к
104	109		Б	Б	Б
105	ПО		Е	Е	Е
106	111		Б	I	1
106А	112		К	к	К

- 37 010902

Таблица 10

Ключ к нумерации по КаЬа! для тяжелой цепи мышян. ним УН4-39 УН4-61

КАВ 12В4 Ι2Β4 КАВП) Зарод. Зарод,

	#	ТИП	УН	УНу!	000333	линии линин Комментарии
	1	ЯП	9	9	9	9	9
2	2		V	V	Б	Б	V	верньер-обратная
								мутация только в νΐ
3			т	9	9	9	Ч
4	4		б	ь	Б	Б	Б
5	5		к	0	Ω	9	0
6	6		Е	Е	Е	Е	Е
7	7		3	5	8	8	8
8	8		σ	О	О	О	О
9	9		Р	Р	Р	Р	Р
10	10		о	С	С	О	о
11	И		I	б	Б	Б	Б
12	12		к	V	V	V	V
13	13		9	к	К	к	К
14	14		Р	Р	Р	Р	Р
15	15		5	3	8	8	8
16	16		9	Е	Е	Е	Е
17	17		т	Т	Т	Т	Т
18	18		к	Б	Б	Б	Б
19	19		3	8	8	8	3
20	20		ί	Е	Б	Б	Б
21	21		т	Т	Т	Г	Т
22	22		с	С	С	С	С ,
23	23		5	т	т	т	т
24	24		Р	Р	V	V	V 1	каноническая — обратная
25	25		5	8	8	8	1 8	мутация в ν. 1, ν2 и ν3
26	26		О	О	<3	С	О
27	27		Г	Р	О	6	о	каноническая - обратная
28	28		8	8	8	8	8 .	мутация в ν.1, ν2 и ν3
29	29		Б	Б	I	I	V	каноническая - обратная
30	30 >		3	8	3	5	8	мутация в ν. 1, ν2 и ν3
31	31	С£>Ю 1	т	Т	к	5	5
32	32		N	N	О	8	<3
33	33	/	<3	О	5	8	О
34	34		м	И	И	У	Υ
35	35		с	о	Υ	У	У
35А	36		V	V	ЗУ	ЗУ	ЗУ
35В	37		5	8	о	а	8
36	38	РК2	ЗУ	ЗУ	ЗУ	ЗУ	XV
37	39		I	I	Ϊ	1	I
38	40		в	к	к	в	к
39	41		9	9	Ц	9	9
40	42		Р	Р	Р	Р	Р
41	43		3	Р	Р	Р	Р
42	44		о	о	с	с	<3
43	45		к	к	к	к	к
44	46		с	6	о	с	о
45	47		Е	Б	Б	Б	Б
46	48		Е	Е	Е	Е·	Е
47	49		ЗУ	ЗУ	ЗУ	ЗУ	ЗУ

- 38 010902 вернъср-юбратнэя мутация только в νΐ и ν3 верньер—обратная мутация только в νΐ

50	52
51	53
52	54
53	55
54	56
55	57
56	58
57	59
58	60
59	61
60	62
61	63
62	64
63	65
64	66 .
65	67
66	68
67	69
68	70
69	71
70	72
71	73
72	74
73	75
74	76
75	77
76	78
77	79
78	80
79	81

СОК2

ЕКЗ

Н I Υ о Е Б к к Υ N

Р

Ь К

В. ь т

I

К о т

N N

Ω

V

82А

82В

82С к ь к I т м V о т А υ т А

Т Υ Υ с А К

И

Υ

V

О

Е О

К к

Υ

N

Р ' 3 ь

к

Я

I Υ Υ

О

N Т

Υ г N Р

Б

К.

к

V

I

Υ Υ 5 О т Υ Υ N

Р

Б К к V

Υ ί Υ Ύ а з т N Υ N Р к

к

V

I верн ьер-обратная мутация только в νΐ т ί

К о т

К

N Ω ν

Б К б

V т А А О т

Т

I

Т I

V	V	V
О	О	Р
Т	τ	т
5	3	3
К	к	к

N

Ω

Е

N

Р

Г каноническая - обратная ι мутация в ν. 1, ν2 и ν3

Б К ь

V т

А

О Т б к

V 5 5

V т А А О т

А	А	А
V	V	V
Υ	Υ	Υ
Υ	Υ	Υ
С	С	С
А	А	А
К	К	К

96	102	К	Я	Р
97	103 !	I	I	Б
98	104 1	I	I	Б
99	105 \|	Υ	Υ	Υ
100	106 ί	б	О	т
100А	107 '	V	V	Б
100В	108 '	Е	Е	Б
100С	109 :	Б	Р	О
ιοοϋ	110 ι	Υ	Υ	-
100Е	111	Е	г	м
101	112 ί	О	Б	Б
102	из	Υ	Υ	V
юз	114 ГМ	ЛУ
104	115	с	О	О
Ю5	116	Ώ	9	.9
106	117 \|	6	о	С
107	118	т	т	т
108	119	т	т	т
109	120	ь	V	V
ПО	121 1	т	т '	т
111	122	V	V	V
112	123	5	3 .	5
ИЗ	124 :	3	8	5

верньер-обратная мутация в νΐ и ν3

- 39 010902

Гуманизированные антитела предпочтительно проявляют специфическую аффинность связывания с Αβ по меньшей мере 10⁷-10¹⁰ М^-1. Как правило, верхний предел аффинности связывания гуманизированных антител с Αβ в 3, 4 или 5 раз выше верхнего предела аффинности связывания 12В4 (т.е.~10⁹ М^-1). Часто нижний предел аффинности связывания также в 3, 4 или 5 раз выше нижнего предела аффинности связывания 12В4.

Сборка и экспрессия УН и УЪ гуманизированного 12В4, вариант 1.

На фиг. 9а схематически представлена стратегия опосредованной РСК сборки гуманизированной УЪл4. На фиг. 9Ь схематически представлена стратегия опосредованной РСК сборки гуманизированной ν4.ν1. В табл. 11 представлены праймеры, использованные для опосредованной РСК сборки 12Β4ν1.

Таблица 11 Синтетические олигонуклеотиды, применяемые при опосредованной РСК сборке У области, ν1 гуманизированного 12В4

1 ДНК #	Разм ер	Коди рую щая цепь( ?)	Последовательность	1 Комментарии
4881	135	Да	ί дадасеаадскедседссассАТаАФЗСТ СССТОСТСАаСТССТСВОаСТОСТААТОС тстоаотстстасАтссАотмевАтотт, ОТаАТОАСТСАОТСТССАСТСТСССтеСС СВТСАССССТаВАВАаССО .. .	11ШП12В4 νβνΐ А праймер, синтезиров. с помощью олигону клеотидов и т.д. пГз (нуклеот. поел.) 1>115 12В4УЬу1 коне., смысл, нить. Доп. сайт Нгпс1111 + консенсус, поел. Козака.
			8Ε(?Π)ΝΟ:13
4882	131	Нет	АВСАОСТвТаОАОАСТСЗСССТВаСТТСТО САЯвТАССАТТССАААТАааТОТТТССАТ ТАСТАТайАСААТСГТСТСАСТАОАСеТС САваАОАтсслеоссзостстссАОзаат : САСЗОа САСЗаОАОАв '	Ьшп12В4 УЬу1В праймер, синтезиров. с помощью олиго и т.д. Обратная комплемент, поел. ДНК 12В4УЪу1 коне. (85,215)
			8Εζ)ΙϋΝΟ:14
4883	132	Да	ПЗСАОААОССАОвССАОГСТССАСАвСТС СТВАТСТАСАААОТТТССААСССАТТТТС тязаотссствАслссттСАОТбсзсАате аАТСАааСАСАСАТТТТАСАеТвАААМС м1сАаАсзтасА(5бста	Ьиш12В4 νΐνΙ€ праймер, синтезиров. с помощью олиго и т.д. ηΐ5 185>31б 12В4УЕу1 коне., смысл, нить.
			8ΕφΠ3ΝΟ:15	ί
4884	130	Да	е'дасаеддаессасесасОТТТаАТСТСС: АОСТТЭОТССССТСАССвААСвТВАаСВо'· ААСАТОТОААССТТСАААОСАВГААТААА ССССААСАТССТСАОССТССАСТСгесТО АТТТТСАСТСТААА ;	111Ш112В4 νΐ.ν11) праймер, синтезиров. с помощью олиго и т.д. Обратная комплемент, поел. ДНК 12В4У1л-1 коне. (286,397), доп. консенсус, поел. Козака и сайг Ηΐηά Ш
			8Ε0ΙϋΝΟ:16
4885	143	Да	дадаеааадсьедссдссассАТОААССА. сстстссттсттсстсствстеетвосАа СТСССАОАТвООТССТСТСССАОСТССАО С1ЧСА®ЗАОТС®ЮСССЛаВАСТОаТвАА: вССТТСООАОАСССТОТСССТСАССТО 1	Ьит 12В4 \Ήν 1А праймер, синтезиров. с помощью олиго и т.д. 12В4УЪу1 коне., п1з 1-122, доп. консенсус, поел. Козака и сайт 1Ы III
			5ΕφΙΟΝΟ:17
4886	137	Нет	ТССТСАТСССААТАОАТОТОТОССАаССА стссАатсссттссстаааавстасссоА ТССДССТСАСАСССАТАССАТТАСТССТС АааоАААААССАаАаАДАатасАаотоАа ЗОАСАССвТСТСССААОССТТ .	Ьшп12В4 УНу1 В праймер, синтезиров. с помощью олиго и т.д. Обратная комплемент, поел. ДНК 12Β4νΗν1 коне. (94,230)
			8ЕОГОЬЮ:18
4887	138	Да	СТОаСТСаСАеАСАТСТАТТССвАТОАСО АСАДССССТАТААССОАТСССТСААОАСТ СвАСТСАССАТАТСААЛаВАСАСОТССАА СААССАОСТАТСССТОААОСТОЛаеТСТа ТОАССаСТОСАОАСАССОСССТ -	кип112В4 ΑΈνΙΒ праймер, синтезиров. с помощью олиго и т.д. 12В4УНу1 коне. п1з 201238
			8ΕφΙΟΝΟ:19
4888	139	Нет	есаедедяахсс«съсАсст(ЗА(заА<ЭАС(э. отаАссатсззтсссттсюссссАатАатс АААСТАОТССТСААСАТСАТАО АТСАТСС ТССТТСТСОСАСАОТААГАСАСОйССата . ТСТОСАССССТСАСАСАССТСАС	Ьиш12В4 \Ήν1Π праймер, синтезиров. с помощью олиго и т.д. Обратная комплемент, поел. ДНК 12В4УНу1 коне. (307, 427) доп. донор сплайсинга + сайт ВашН1к 3’ концу
			8Е0 ГО N0:20
4889	22	Да	дад аеь аад ссе дсс дсс асс^_А'	Ьит12В4 УЬу1, А+ В Прямой праймер% А + Т = 45. 45 [10]; %С + <3 =54. 55 [12] ϋανΐ3, ВоЬГеш, В.0Й1 Т. плавл. °С 64.54
			5Ε9Π)ΝΟ:21

- 40 010902

4890	21	Да	АСС АСС ЮТ ССА САС ТСС ССТ	йип112В4 VI-νί Обратный праймер %, А + Т = 38. 10 [8];%С + О =61.90 [13] Оахаз, Βοηίειη, Βοώ Т. плавл. °С 66.47
			8ΕΟ1ΏΝΟ:22
4891	20	Да	ТСС АСА АСС САС ССС АСТ СТ	1шп112В4 νινί, С 1 0 Прямой праймер% А + Т = 40. 00 [8]; % С + 0 = 60. 00 [12] Оа¥1з, Во1з1ет, Βοώ Т. плавл. °С 64.50
			ЗЕО ГО N0:23
4892	28	Нет	Ьда ЬаС дда есс асе сас СТТ ' ТОЛ ТСТ С	Ьит12В4 νί,νΐ С+ϋ Обратный праймер %, А + Т = 57. 14 [16]; %С + 0 =42.86 [12] Оа¥1з, ΒοΝίείη, Κοώ Т. плавл. С 64.61
			ЗЕО ГО N0:24
4893	23	Да	дад аеа аад с£Л дсс дсс асе АТ	Ьит 12В4 νΗνΙ, А + ВПрямой праймер% А + Т = 47. 83 [11]; %С + 0 =52. 14 [12] Оау^з, ΒοΚίεϊη, Βοώ Т. плавл. °С 64.55
			ЗЕО ГО N0:25
4894	24	Нет	ТСС ТСА ТСС САА ТАЗ АТС ТОТ ОСС	ЙШП12В4 ΫΗνΙ, А + В Обратный праймер% А + Т = 50. 00 [12]; % С + 0 = 50. 00 £2] Οανΐ5, ВоШет, Βοώ Т. плавл. “С 64.57
			8Е0 ГО N0:26
4895	22	Да	□та дет ССС АСА САТ СТА ТТС Э	Ьит 12В4 УНт1. С+ Ώ Прямой праймер% А + Т = 45.45 [10]; %С + 6 = 54.55 [12] Оау1з, ΒοΚΙβίη, Βοώ Т. плавл. ®С 64.54
			ЗЕО П> N0:27
4896	24	Нет	Сса еае дда есс асе сас СТС АСС	Ьит 12В4 νΗνΙ, С + О Прямой праймер% А + Т = 50.50 [12]; %С + О =50.00 [12] Оаут.ч, ВоЫеш, Βοώ Т. плавл. ^сС 64.57
			5Е<2 ГО N0:28

Эквимолярные соотношения синтетических фрагментов νΗν1Α+νΗν1Β и УНу1С+УНуШ гибридизуют попарно. в раздельных реакционных пробирках стандартными методами. Гибридизацию А+В проводят. используя ПЦР с праймерами А+В Гог и А+В Ьаск при 60°С. 25 циклов (Гог=прямой и Ьаск=обратный. или же геу или геуегее). Аналогично гибридизацию С+ϋ проводят с ПЦР праймерами С+ЭГог и С+ЭЬаск в таких же условиях. Собранную с помощью ПЦР 5' А+В половину и 3' С+ϋ половину очищают гель-хроматографией для окончательной сборки с помощью ПЦР. Полную сборку ν области осуществляют смешением А+В собранной 5' половины с С+ϋ 3' половиной V области. гибридизацией и наращиванием с помощью ПЦР с применением УНу^+ВГог праймера и УНу1С+ОЬаск праймера. Полноразмерные области УН и УЬ. собранные тем же способом. очищают гель-хроматографией и клонируют в ЕСВ8спр! для проверки последовательности ДНК.

Нуклеотидные последовательности гуманизированных областей 12В4УЬ (вариант 1) (8ЕЦ ГО N0: 5) и 12В4УН (вариант 1) (8ЕЦ ГО N0: 7) представлены ниже в виде табл. 12 и 13. соответственно.

Таблица 12 Нуклеотидная последовательность гуманизированной области 12В4УЬу1

АТСАСССТСССТССТСАССТССТССбССТССТААТССТСТСССТСТСТССАТССАОТСС СЗАТСТТСТСАТСАСТСАСТСТССАСТСТСССТССССОТСАССССТССАСАСССССССТ ССАТСТССТССАССТСТАСТСАСААСАТТСТТСАТАСТААТССАААСАССТАТТТССАА ТСОТАССТССАСААОССАССССДСТСТССАСАССТССТСАТСТАСАААбТТТССААССС АТТТТСТССССТСССТСАСАССТТСАСТСССАСТССАТСАСССАСАСАТТТТАСАСТЗА АААТСАССАСАСТССАСССТСАССАТСТТССССТТТАТТАСТССТТТСААССТТСАСАТ СТТССССТСАССТТСССТСАССССАССААССТССА6АТСАААС

- 41 010902

Таблица 13 Нуклеотидная последовательность гуманизированной области 12Β4νΗν1

АТСААССАССТСТССТТСТТССТССТССТССТСССАССТСССАСАТСССТССТСТСССА ССТССАССТССАССАСТСССССССАССАСТССТСААСССТТСССАСАСССТСТСССТСА ССТССАСТТТСТСТБСТТТТТСССТбАбСАСТААТСбТАТббСТОТСАОСТСбАТССОС САССССССАСССААбСОАСТССАСТСССТ&ССАСАСАТСТАТТС&ЗАТСАССАСААССС СТАТААСССАТСССТСААСАСТССАСТСАССАТАТСАААССАСАССТССААСААССАСС ТАТСССТСААССТЗАОСТСТСТСАССССТССАбАСАСССССбТбТАТТАСТСТССОАСА АССАСОАТСАТСТАТСАТСТТСАССАСТАСТТТбАСТАСТСбССССААСССАССАСООТ САСССТСТССТСАС

Гуманизированное антитело 12В4, вариант 2.

Создают второй вариант гуманизированного антитела 12В4, содержащий все замены, указанные для варианта 1, за исключением замены Ь^-ν в остатке 2, замены 1^Ь в остатке 48, замены С^А в остатке 49, замены ν^-Ь в остатке 67 и замены Ρ^ν в остатке 78. Нуклеотидные последовательности легкой и тяжелой цепей гуманизированного 12В4, вариант 2, представлены как 8Ε0 ΙΌ N0: 1 и 9, соответственно. Аминокислотные последовательности гуманизированного 12В4, вариант 2, представлены как 8Ε0 ΙΌ N0: 2 и 10, соответственно.

Гуманизированное антитело 12В4, вариант 3.

Создают третий вариант гуманизированного антитела 12В4, содержащий все замены, указанные для варианта 1, за исключением замены Б^-ν в остатке 2, замены С^А в остатке 49 и замены ν^Β в остатке 67. Нуклеотидные последовательности легкой и тяжелой цепей гуманизированного 12В4, вариант 2, представлены как 8Ε0 ΙΌ N0: 1 и 9, соответственно. Нуклеотидные последовательности легкой и тяжелой цепей гуманизированного 12В4, вариант 3, представлены как 8Ε0 Ш N0: 1 и 11, соответственно. Аминокислотные последовательности гуманизированного 12В4, вариант 3, представлены как 8Ε0 ΙΌ N0: 2 и 12, соответственно.

Пример νΙ. Предупреждение заболевания у людей и их лечение.

Проводят фазу Ι испытаний с применением разовой дозы, чтобы установить безопасность для человека. Различным пациентам вводят терапевтический агент в увеличивающихся дозах, начиная примерно с уровня 0,01 предполагаемой эффективности и увеличивая в 3 раза до уровня, примерно в 10 раз более высокого, чем эффективная доза для мышей.

Фазу ΙΙ испытаний проводят, чтобы определить терапевтическую эффективность. Отбирают пациентов с начальной средней формы болезнью Альцгеймера по критериям предполагаемой ΑΌ, предложенным Ассоциацией, изучающей Болезнь Альцгеймера и родственные нарушения (ΑΌΒΌΑ). Соответствующих пациентов оценивают в интервале 12-26 баллов, проводя мини-экзамен по оценке умственного состояния (ΜΜ8Ε). Другим критерием отбора является то, что больные предположительно должны перенести период исследования и у них не должно быть осложняющих обстоятельств, таких как применение могущих помешать сопутствующих лекарственных препаратов. Базовые оценки функции больного делают, используя классические психометрические измерения, такие как ΜΜ8Ε и ΑΌΑ8, которые представляют собой полную шкалу для оценки больных со статусом и функцией болезни Альцгеймера. Эти две психометрические шкалы позволяют определять развитие состояния альцгеймеровского типа. Для мониторинга лечения можно также применять соответствующие качественные важные для жизни оценки. Развитие заболевания можно также контролировать с помощью ΜΚΙ. Можно также проверять показатели крови больных, включая анализы иммуногенспецифических антител и Т-клеточные реакции.

После измерения базовых величин больные начинают получать лечение. Их произвольно делят на группы и дают слепым методом либо терапевтический агент, либо плацебо. Мониторинг пациентов проводят по меньшей мере каждые 6 месяцев. Эффективность определяется заметным замедлением развития заболевания в группе, получающей лекарственное вещество, по сравнению с группой, получающей плацебо.

Вторую фазу ΙΙ испытания осуществляют для того, чтобы оценить переход состояния пациентов от ранней потери памяти неальцгеймеровского типа, иногда называемой возрастным ухудшением памяти (ΑΑΜΙ), или мягкого когнитивного снижения (ΜΟ) к возможной болезни Альцгеймера по критериям ΑΌΚΏΑ. Больных с высокой степенью риска превратиться в больных болезнью Альцгеймера отбирают из популяции неклинических пациентов, проводя скрининг стандартных популяций на ранние признаки потери памяти или других затруднений, ассоциированных с предальцгеймеровской симптоматологией, семейный анамнез болезни Альцгеймера, генетические факторы риска, возраст, пол и другие характеристики для того, чтобы прогнозировать риск заболевания болезнью Альцгеймера. Собирают базовые оценки в соответствующих метрических единицах, включая ΜΜ8Ε и ΑΌΑ8, вместе с другими измерениями, предназначенными для оценки более нормальной (здоровой) популяции. Эти популяции пациентов делят на соответствующие группы и сравнивают группы, которым дают плацебо, с группами, которым дают лекарственные агенты в различных дозах. Эти популяции пациентов следуют друг за другом с интервалами около 6 месяцев, а конечной точкой для каждого пациента является, станет ли он или она

- 42 010902 больным(ой) предполагаемой болезнью Альцгеймера по критериям ΑΚΌΚΑ в конце наблюдения.

Несмотря на то, что представленное выше изобретение описано подробно для того, чтобы было ясным и понятным, очевидно, что в практическом применении в объеме прилагаемой формулы изобретения возможны некоторые модификации. Все публикации и документы, касающиеся патентов, а также текст, представленный в фигурах и в перечне последовательностей, вводятся в данное описание в качестве ссылки во всей полноте для всех целей в той степени, в которой отмечено индивидуально.

Из всего вышеприведенного ясно, что данное изобретение охватывает ряд применений. Например, изобретение охватывает применение любого из антител к Αβ, описанных выше, для лечения, профилактики или диагностики амилоидного заболевания, или в производстве лекарственного препарата, или с целью диагностики композиции для аналогичного применения.

Список последовательностей <110> Ньюралаб Лимитед; Вайет <120> ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА, РАСПОЗНАЮЩИЕ БЕТААМИЛОИДНЫЙ ПЕПТИД <130> ЕЫ4-ОО4РС <150> ив 60/363,751 <151> 2002-03-12 <160> 38 <170> ГазкЗЕО £ог Итпбоиз УегзЬоп 4.0 <210> 1 <2И> 393 <212> ДНК <213> Миз тизсиЬиз <220>

<221> сиг. пептид <222> (1) . . . (57) <220>

<221> СРЗ <222> (1}...(393) <400> 1

акд аад

ккд сск

дкк Уа1 -15

адд Агд

скд Ьеи

ккд Ьеи

дкд скд

акд ккс

кдд Тгр

акк Ые

сск Рго -5

ддк А1а

48

Мек

Ьуз

Ьеи

Рго

Уа1

Ьеи -10

Мек

РЬе

ксс

аде

адк

дак

дкк

ккд

акд

асе

саа

аск

сса

скс

ксс

скд

сск

дке

96

Зег

Азр

УаЬ

Ьеи

Мек

ТЬг

61 п

ТЬг

Рго

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

7а1

1

5

10

адк

екк

дда

дак

саа

дсс

ксс

акс

кек

кде

ада

кек

адк

сад

аас

акк

144

Зег

Ьеи

61у

Азр

С1п

А1а

Зег

Ые

Зег

Су.з

Агд

Зег

С1п

Азп

Ые

15

20

25

дкк

сак

адк

аак

дда

аас

асе

как

кка

даа

кдд

кас

скд

сад

ааа

сса

192

Уа1

Н1з

Зег

Азп

О1у

Азп

ТЬг

Туг

Ьеи

<31и

Тгр

Туг

Ьеи

61п

Ьуз

Рго

30

35

40

45

ддс

сад

кек

сса

аад

скс

скд

акс

кас

ааа

дкк

ксс

аас

еда

ккк

кек

240

61У

С1П

Зег

Рго

Ьуз

Ьеи

Ые

Туг

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Агд

РЬе

Зег

50

55

60

ддд

дке

сса

дас

адд

ккс

адк

ддс

адк

дда

кса

ддд

аса

дак

ккс

аса

288

61у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

С1у

Зег

61у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

65

70

75

скс

аад

акс

аде

ада

дкд

дад

дек

дад

дак

скд

дда

дкк

как

кас

кде

336

Ьеи

Ьуз

Не

Зег

Агд

УаЬ

61и

А1а

61и

Азр

Ьеи

61у

Уа1

Туг

Суз

80

85

90

ккк

саа

ддк

кса

сак

дкк

ссд

скс

асд

ккс

ддк

дек

ддд

асе

аад

скд

384

РНе

С1п

61у

Зег

Ηίε

Уа1

Рго

Ьеи

ТЬг

РЬе

61у

А1а

С1у

ТЫ

Ьуз

Ьеи

100 105

- 43 010902 дад сЬд ааа 393 и Ьеи Ьуз

110 <210> 2 <211> 131 <212> БЕЛОК <213> Миз шизси1из <220>

<221> Сигнальный <222> {!)... ί19) <400> 2

МеЬ Ьуз

Ьеи

Рго

Уа1 -15

Агд Ьеи Ьеи

Уа1 Ьеи МеЬ -10

РЬе

Тгр

Не

Рго -5

АЬа

Зег

Азр

Уа1

Ьеи

МеЬ

ТЬг

С1п

ТЬг

Рго

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

Уа1

1

5

10

Зег

Ьеи

61у

Азр

61п

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

61п

Азп

11е

15

20

25

Уа1

Η1Ξ

Зег

Азп

61у

Азп

ТЬг

Туг

Ьеи

61и

Тгр

Туг

Ьеи

61п

Ьуз

Рго

30

35

40

45

С1у

С1п

Зег

Рго

Ьуз

Ьеи

Не

Туг

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Агд

РЬе

Зег

50

55

60

61у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

С1у

Зег

61у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЫ

65

70

75

Ьеи

Ьуз

11е

Зег

Агд

Уа1

61и

А1а

С1и

Азр

Ьеи

С1у

Уа1

Туг

Суз

80

85

90

РЬе

С1п

С1у

Зег

НЬз

Уа1

Рго

Ьеи

ГЬг

РЬе

61у

АЬа

61 у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

100 105

61и Ьеи Ьуз

110 <210> 3 <211> 426 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <220>

<221> СБЗ <222> ¢1)..,(426) <220>

<221> сиг. пептид <222> (1) . . .(57) <400> 3

аьд

дас

адд

СЬЬ

асЬ

Ьсс

Ьса

ЬЬс

сЬд

аЬЬ

дЬс

ССЬ

дса

ЬаЬ

48

МеЬ

Азр

Агд

Ьеи

ТЬг

Зег

РЬе

Ьеи

Не

Уа1

Рго

А1а

Туг

-15

-10

-5

дЬс

сЬд

Ьсс

сад

дЬЬ

асЬ

сЬд

ааа

дад

ЬсЬ

ддс

ссЬ

ддд

аЬа

ЬЬд

сад

96

УаЬ

Ьеи

Зег

61п

Уа1

ТЬг

Ьеи

Ьуз

61и

Зег

61у

Рго

61у

Не

Ьеи

61п

1

5

10

ссс

Ьсс

сад

асе

сЬс

адь

сЬд

асЬ

ЬдЬ

ЬсЬ

ЬЬс

ЬсЬ

ддд

ььь

Ьса

сЬд

144

Рго

Зег

61п

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Зег

РЬе

Зег

61у

РЬе

Зег

Ьеи

15

20

25

- 44 010902

аде асЕ ааЕ ддЕ аЕд ддЕ дЕд аде Едд аЕЕ сдЕ

сад ссЕ

Еса дда

аад Ьуз 45

192

Зег 30

ТЬг

Азп С1у

МеЕ

61у 35

Уа1

Зег

Тгр

Не Агд 40

С1п

Рго

Зег

С1у

ддк

сЕд

дад

тдд

сЕд

дса

сас

аЕЕ

Еас

Едд

даЕ

дад

дас

аад

сдс

ЕаЕ

240

С1у

Ьеи

61и

Тгр

Ьеи

А1а

Низ

11е

Туг

Тгр

Азр

61и

Азр

Ьуз

Агд

Туг

50

55

60

аас

сса

Есс

сЕд

аад

аде

едд

сЕс

аса

аЕс

Есс

аад

даЕ

асе

ЕсЕ

аас

288

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Азп

65

70

75

ааЕ

сад

дЕа

ЕЕС

СЕС

аад

аЕс

асе

ааЕ

дЕд

дас

асЕ

дсЕ

даЕ

асЕ

дсс

336

Азп

61п

Уа1

РЬе

Ьеи

Ьуз

Не

ТЬг

Азп

Уа1

Азр

ТЬг

А1а

АЗр

ТЬг

А1а

80

85

90

аса

Еас

ЕдЕ

деЕ

еда

адд

аЕс

ЕаЕ

даЕ

дЕЕ

дад

дас

Еас

384

ТЕ г

Туг

Суз

А1а

Агд

Не

Туг

Азр

Уа1

С1и

Азр

Туг

95

100

105

ЕЕЕ

дас

Еас

Едд

ддс

саа

ддс

асе

асЕ

сЕс

аса

дЕс

Есс

Еса

426

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

61п

61 у

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Зег

110

115

120

<210> 4 <211> 142 <212> БЕЛОК <213> Миз шизси1из <220>

<221> СИГНАЛЬНЫЙ <222> (1) . . .(19) <400> 4

МеЕ

Азр

Агд

Ьеи

ТЬг Зег Зег РЬе Ьеи Ьеи Ьеи

Не

Уа1

Рго

А1а -5

Туг

-15

-10

Уа1

Ьеи

Зег

61п

Уа1

ТЫ

Ьеи

Ьуз

61и

Зег

61у

Рго

С1у

Не

Ьеи

61п

1

5

10

Рго

Зег

61п

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Зег

РЬе

Зег

61у

РЬе

Зег

Ьеи

15

20

25

Зег

ТЬг

Азп

С1у

МеЕ

6’1 у

Уа1

Зег

Тгр

Не

Агд

61п

Рго

Зег

С1у

ьуз

30

35

40

45

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Ьеи

А1а

Нйз

Не

Туг

Тгр

Азр

61и

Азр

Ьуз

Агд

Туг

50

55

60

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Азп

65

70

75

Азп

С1п

Уа1

РЬе

Ьеи

Ьуз

Не

ТЬг

Азп

Уа1

Азр

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

80

85

90

ТЬг

Туг

Суз

А1а

Агд

Не

Туг

Азр

Уа1

61и

Азр

Туг

95

100

105

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

61 у

ТЬг

Ьеи

ТЬг

7а1

Зег

110 115 120 <210> 5 <211> 396 <212> ДНК

- 45 010902 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> гуманизированный 12В4УЬу1

<220>

<221> СОВ

<222> (1)...(396)

<220>

<221> сиг. пептид

<222> (1)...(60)

<400> 5

аРд Мес -20

адд Агд

сРс Ьеи

ссС Рго

дсР А1а

сад С1п -15

СРС Ьеи

сСд Ьеи

ддд 61у

сед Ьеи

сСа Ьеи -10

аРд МеС

сРс Ьеи

Сдд Тгр

др с Уа1

РсР Зег -5

48

дда

Рсс

адР

ддд

даР

дСС

дед

аСд

асе

сад

СсС

сса

сРс

Ссс

сРд

ссс

96

С1у

Зег

61у

Азр

Уа1

МеС

ТЬг

С1п

Зег

Рго

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

1

5

10

др с

асе

ссС

дда

дад

ссд

дсс

Ссс

аСс

Ссс

Сдс

адд

РсР

а др

сад

аас

144

Уа1

ТЬг

Рго

61у

61и

Рго

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

С1п

Азп

15

20

25

аРР

дСС

саС

адР

ааР

дда

аас

асе

СаС

ССд

даа

Сдд

Сас

сед

сад

аад

192

11е

Уа1

ΗΪ5

Зег

Азп

61у

Азп

ТЬг

Туг

Ьеи

61и

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

30

35

40

сса

ддд

сад

С сС

сса

сад

сСс

ссд

аРс

Сас

ааа

дсс

Ссс

аас

еда

РРР

240

Рго

61 у

61п

Зег

Рго

61п

Ьеи

Не

Туг

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Агд

РЬе

45

50

55

60

РсР

ддд

дрс

ссС

дас

адд

РРс

адС

ддс

адС

дда

Сса

ддс

аса

даР

РРР

288

Зег

С1у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег

С1у

Зег

б1у

ТЬг

Азр

РЬе

65

70

75

аса

сСд

ааа

аСс

аде

ада

дСд

дад

дсс

дад

даС

дрс

ддд

др С

РаР

Рас

336

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

61и

Азр

Уа1

С1у

Уа1

Туг

80

85

90

Где

ССС

саа

ддс

Сса

сас

дСС

ссд

сСс

асд

СРс

ддр

сад

ддд

асе

аад

384

Суз

РЬе

61 η

61 у

Зег

Ηΐε

Уа1

Рго

Ьеи

ТЬг

РЬе

61 у

61п

61 у

ТЬг

Ьуз

95

100

105

сРд дад аРс ааа 396

Ьеи 61и 11е Ъуз

110 <210> б <211> 132 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> СИГНАЛЬНЫЙ <222> (1)...(20) <400> 6

- 46 010902

Мей

Агд

Ьеи

Рго

А1а

С1п

Ьеи

61у

Ьеи

МеТ

Ьеи

Тгр

Уа1

Зег

-20

-15

-10

-5

С1у

Зег

61у

Азр

7а1

Уа1

МеТ

ТЬг

61п

Зег

Рго

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

1

5

10

Уа1

ТЬг

Рго

С1у

61 и

Рго

А1а

Зег

11е

Зег

Суз

Агд

Зег

61п

Азп

15

20

25

11е

Уа1

ΗΪ3

Зег

Азп

61у

Азп

ТЬг

Туг

Ьеи

61и

Тгр

Туг

Ьеи

61 п

Ьуз

30

35

40

Рго

61у

61п

Зег

Рго

61п

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Агд

РЬе

45

50

55

60

Зег

61у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег

61у

Зег

61у

ТЬг

Азр

РЬе

65

70

75

ТНг

Ьеи

Ьуз

Не

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

С1и

Азр

Уа1

61у

7а1

Туг

80

85

90

Суз

РЬе

61п

61у

Зег

ΗΪ3

Уа1

Рго

Ьеи

ТЬг

РЬе

61у

61п

61у

ТЬг

Ьуз

95

100

105

Ьеи 61и 11е Ьуз

110 <210> 7 <211> 426 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> гуманизированный 12Β4νΗν1 <220>

<221> СОЗ <222> (1) . . .(426) <221> сиг. пептид <222> (1)...(57) <400> 7

аТд МеТ

аад сас сТд

Тдд Тгр -15

ТТс ТТс

сТс Ьеи

сТд сТд дТд

дса А1а

дет А1а

ссс Рго

ада Агд -5

Тдд Тгр

48

Ьуз

Н1з

Ьеи

РЬе

Ьеи Ьеи -10

Уа1

дТс

сТд

Тее

сад

дТд

сад

сТд

сад

дад

Тед

ддс

сса

дда

сТд

дрд

аад

96

Уа1

Ьеи

Зег

61п

Уа1

61п

Ьеи

61п

С1и

Зег

61у

Рго

61у

Ьеи

ν₃1

Ьуз

1

5

10

ССТ

Тед

дад

асе

сТд

Тсс

сТс

асе

Тдс

асР

ТТС

ТсТ

ддТ

ΤΤΤ

Тсс

сТд

144

Рго

Зег

С1и

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

РЬе

Зег

61у

РЬе

Зег

Ьеи

15

20

25

аде

аст

ааТ

ддй

аТд

ддТ

дгд

аде

£дд

аТс

едд

сад

ссс

сса

ддд

аад

192

Зег

ТЬг

Азп

61у

МеТ

61у

Уа1

Зег

Тгр

11е

Агд

61п

Рго

61у

Ьуз

30

35

40

45

дда

сТд

дад

Тдд

сТд

дса

сас

аТс

Тар

Тдд

даР

дад

дас

аад

сдс

Таг

240

61 у

Ьеи

61 и

Тгр

Ьеи

А1а

Н1з

11е

Туг

Тгр

Азр

61и

Азр

Ьуз

Агд

Туг

50

55

60

аас

сса

Тсс

СТО

аад

адТ

еда

сТс

асе

аТа

Тса

аад

дас

асд

Тсс

аад

288

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

65

70

75

аас

сад

дТа

Тсс

сТд

аад

сТд

аде

ТсТ

дТд

асе

дет

дса

дас

асд

дсс

336

- 47 010902

Азп 61п ¥а1

Зег

Ьеи Ьуз

Ьеи Зег Зег Уа1 ТЬг А1а А1а Азр

ТЬг А1а

80

85

90

дьд

ОаО

Оас

ОдО

дед

ада

адд

аОс

ОаО

дао

дОО

дад

дас

Оас

384

Уа1

Туг

Суз

А1а

Агд

Не

Туг

Азр

Уа1

С1и

Авр

Туг

95

100

105

ооо

дас

Оас

Одд

ддс

саа

ддд

асе

асд

дОс

аес

дОс

Осс

Оса

426

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

61п

61у

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

110 115 120 <210> 8 <211> 142 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> Сигнальный <222> (1)..·(19) <400> 8

МеО

Ьуз Ηί3 Ьеи

Тгр -15

РЬе РЬе Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 А1а А1а Рго Агд

Тгр

-10

-5

Уа1

Ьеи

Зег

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

С1п

С1и

Зег

С1у

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

1

5

10

Рго

Зег

61и

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

РЬе

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

15

20

25

Зег

ТЬг

Азп

С1у

МеО

С1у

Уа1

Зег

Тгр

Не

Агд

С1п

Рго

С1у

Ьуз

Λ

Э Е

Л ιΛ

Л с

ли

ЛЛ

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Ьеи

А1а

Н1з

Не

Туг

Тгр

Азр

С1и

Азр

Ьуз

Агд

Туг

50

55

60

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

65

70

75

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

7а1

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

80

85

90

Уа1

Туг

Суз

А1а

Агд

Не

Туг

Азр

Уа1

61и

Азр

Туг

95

100

105

РЬе

Азр

Туг

Тгр

61у

С1п

С1у

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

110

115

120

<210> 9 <211> 426 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> СОЗ <222> (1)...(426) <223> гуманизированный 12Β4νίν2 <220>

<221> сиг. пептид <222> (1) ... (57) <400> 9

- 48 010902

аЬд Мек

аад Ьуз

сас ΗΪ3

сЬд Ьеи

едд Тгр -15

еес еес сес

сед Ьеи

сед Ьеи -10

дед Уа1

дса А1а

дсе А1а

ссс Рго

ада Агд -5

едд Тгр

48

РЬе

Ьеи

дес

сед

есс

сад

сед

сад

сЕд

сад

дад

есд

ддс

сса

дда

сБд

дед

аад

96

Уа1

Ьеи

Бег

61п

Ьеи

61п

Ьеи

С1п

61 и

Бег

С1у

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

1

5

10

ссе

есд

дад

асе

сед

есс

сЬс

асе

еде

асе

еес

есе

дде

еее

есс

сСд

144

Рго

Бег

61и

ТЬг

Ьеи

Бег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

РЬе

Бег

61у

РЬе

Бег

Ьеи

15

20

25

аде

асе

аае

дде

аед

дде

дЬд

аде

едд

аЬс

едд

сад

ссс

сса

ддд

аад

192

Бег

ТЬг

Азп

61у

Мее

С1у

Уа1

Бег

Тгр

11е

Агд

С1п

Рго

61у

Ьуз

30

35

40

45

дда

сбд

дад

едд

аее

ддд

сас

аес

еае

^дд

дае

дад

дас

аад

сдс

еае

240

61у

Ьеи

С1и

ΐτρ

Не

61у

Н±з

11е

Туг

Тгр

Азр

С1и

Азр

Ьуз

Агд

Туг

50

55

60

аас

сса

есс

сес

аад

аде

еда

дес

асе

аЬа

еса

аад

дас

асд

есс

аад

288

Азп

Рго

Бег

Ьеи

Ьуз

Бег

Агд

Уа1

ТЬг

Не

Бег

Ьуз

Азр

ТЬг

Бег

Ьуз

65

70

75

аас

сад

еес

есс

сед

аад

сед

аде

есе

дед

аес

дсе

дса

дас

асд

дсс

336

Азп

61п

РЬе

Бег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Бег

Уа1

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

80

85

90

дед

еае

еас

еде

дед

ада

адд

аес

еае

дае

дее

дад

дас

еас

384

Уа1

Туг

Суз

А1а

Агд

Не

Туг

Азр

Уа1

С1и

Азр

Туг

95

100

105

еее

дас

еас

^дд

ддс

саа

ддд

асе

асд

дес

асе

дес

есс

еса

426

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

110

115

120

<210> 10 <211> 142 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> Сигнальный <222> (1) ... (19) <400> 10

Мее Ьуз Нйз Ьеи Тгр

РЬе РЬе

Ьеи

Ьеи Уа1 А1а А1а -10

Рго Агд -5

Тгр

-15

Уа1

Ьеи

Бег

61п

Ьеи

61п

Ьеи

61п

61 и

Бег

61у

Рго

61 у

Ьеи

Уа1

Ьуз

1

5

10

Рго

Бег

61и

ТЬг

Ьеи

Бег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

РЬе

Бег

61у

РЬе

Бег

Ьеи

15

20

25

Зег

ТЬг

Азп

С1у

МеЬ

61у

Уа1

Бег

Тгр

Не

Агд

61п

Рго

61у

Ьуз

30

35

40

45

61 у

Ьеи

61и

Тгр

Не

С1у

Нхз

11е

Туг

Тгр

Азр

61и

Азр

Ьуз

Агд

Туг

50

55

60

Азп

Рго

Бег

Ьеи

Ьуз

Бег

Агд

Уа1

ТЫ

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Бег

Ьуз

65

70

75

Азп

61п

РЬе

Бег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Бег

Уа1

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

- 49 010902

80

85

90

йа1

Туг

Суз

А1а

Агд

Не

Пе

Туг

Азр

Уа1

С1и

95

100

105

Рке

Азр

Туг

Тгр

С1у

ΘΙη

С1у

Ткг

Уа1

Ткг

Уа1

Зег

110

115

120

<210> 11 <211> 426 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> гуманизированный 12Β4νΗν2 <220>

<221> СОЗ <222> (1)...(426) <220>

<221> сиг. пептид <222> (1)... (57) <400> 11

аОд Мек

аад Ъуз

сас ΗΪ3

скд Ъеи

Одд Тгр -15

Оке Рке

00с сОс

скд Ъеи

скд дкд

дса А1а

дсО А1а

ссс Рго

ада Агд -5

одд Тгр

48

Рке

Ъеи

Ъеи -10

Уа1

дке

скд

ксс

сад

скд

сад

скд

сад

дад

кед

ддс

сса

дда

сод

дкд

аад

96

Уа1

Ъеи

Зег

ΘΙη

Ъеи

ΘΙη

Ъеи

С1п

С1и

Зег

51у

Рго

С1у

Ъеи

Уа1

Ъуз

1

5

10

ссО

кед

дад

асе

скд

Осс

скс

асе

Оде

а ск

00с

ОСО

ддО

ООО

Осс

сОд

144

Рго

Зег

С1и

Ткг

Ъеи

Зег

Ьеи

Ткг

Суз

Ткг

Рке

Зег

61у

Рке

Зег

Ъеи

15

20

25

аде

аск

аак

ддк

акд

ддО

дкд

аде

кдд

акс

едд

сад

ссс

сса

ддд

аад

192

Зег

Ткг

Азп

С1у

Мек

С1у

Уа1

Зег

Тгр

11е

Агд

С1п

Рго

б1у

Ъуз

30

35

40

45

дда

скд

дад

кдд

сОд

ддд

сас

акс

как

кдд

дак

дад

дас

аад

сдс

ДаО

240

61у

Ъеи

С1и

Тгр

Ъеи

С1у

НЪз

11е

Туг

Тгр

Азр

С1и

Аэр

Ъуз

Агд

Туг

50

55

60

аас

сса

ксс

скс

аад

адк

еда

дке

асе

ака

Оса

аад

дас

асд

Осс

аад

288

Азп

Рго

Зег

Ъеи

Ъуз

Зег

Агд

Уа1

Ткг

11е

Зег

Ъуз

Азр

Ткг

Зег

Ъуз

65

70

75

аас

сад

дка

Осс

сОд

аад

скд

аде

ОсО

дкд

асе

дсО

дса

дас

асд

дсс

336

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ъеи

Ъуз

Ъеи

Зег

Уа1

Ткг

А1а

Азр

Ткг

А1а

80

85

90

дкд

как

кас

к дк

дед

ада

адд

акс

ОаО

даО

дОО

дад

дас

Оас

384

Уа1

Туг

Суз

А1а

Агд

11е

Туг

Азр

Уа1

С1и

Азр

Туг

95

100

105

кок

дас

кас

Одд

ддс

саа

ддд

асе

асд

дке

асе

дОс

Осс

Оса

426

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

ΘΙη

61у

Ткг

Уа1

Ткг

Уа1

Зег

НО

115

120

<210> 12 <211> 142 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> Сигнальный <222> (1) . . .(19) <400> 12

МеЬ Ьуа

Нхз

Ьеи

Тгр -15

РЬе

РЬе Ьеи

Ьеи Ьеи Уа1 -10

А1а

Рго

Агд -5

Тгр

Уа1

Ьеи

Зег

61п

Ьеи

С1п

Ьеи

С1п

С1и

Зег

01 у

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

1

5

10

Рго

Зег

61и

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

РЬе

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

15

20

25

Зег

ТЬг

Азп

С1у

МеЬ

О1у

Уа1

Зег

Тгр

11е

Агд

61п

Рго

С1 у

Ьуз

30

35

40

45

С1у

Ьеи

61и

Тгр

Ьеи

С1у

Нхз

11е

Туг

Тгр

Азр

61и

Азр

Ьуз

Агд

Туг

50

55

60

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Уа1

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

65

70

75

Азп

61п

Уа1

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

80

85

90

Уа1

Туг

Суз

А1а

Агд

11е

Не

Туг

Азр

Уа1

О1и

Азр

Туг

95

100

105

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

110

115

120

<210> 13 <211> 135 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 13 дадаЕЬаадс ЬЬдссдссас саЬдаддсЬс ссЬдсЬсадс ЪссЬддддсЬ дсЬааЬдсЬс 60

ЬдддЬсЕсЬд даЬссадЬдд ддаЬдЬЬдЬд аЬдасЬсадЬ сЬссасЬсЬс ссЬдсссдЬс 120 ассссЬддад адссд 135 <210> 14 <211> 131 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 14 аддадсЕдЬд дадасЬдссс ЬддсЬЬсЬдс аддЬассаЬЬ ссаааЬаддС дЬЬЬссаЬЬа 60 сЬаьдаасаа ЕдЬЬсЬдасЬ адассЬдсад дадаЬддадд ссддсЬсЬсс аддддЬдасд 120 ддсадддада д 131 <210> 15 <211> 132

- 51 010902 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 15

Ьдсадаадсс адддсадЬсЬ ссасадсЬсс ЬдаЕсЬасаа адЕЕЕссаас сдаЬЬЬЬсЬд 60 ддд£ссс£да саддбйсадЕ ддсадЕддай саддсасада ££££асас£д аааайсадса 120 дадЬддаддс Ьд 132 <210> 16 <211> 130 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 16 £да£а£дда£ ссасЬсасдЬ ЬЬдаЬсЬсса дс££дд£ссс сЬдассдаас дЬдадсддаа 60 са£д£даасс Ь-Ьдааадсад 1аа£ааассс сааса£сс£с адссГссасЕ с£дсЬда£Ь£ 120 £сад£д£ааа 130 <210> 17 <211> 143 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 17 дадаЕааадс ЕЬдссдссас саЬдаадсас с£д£ддЬ£сЬ ЕссЬссЕдсЪ ддЪддсадсЬ 60 сссадаЬддд ЬссЬдЬссса ддЬдсадсСд саддадЕсдд дсссаддасЬ ддЕдаадссЬ 120 Ьсддадассс £д£ссс£сас сЬд 143 <210> 18 <211> 137 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 18

ЕссЬсаЬссс аа£ада£д£д Ьдссадссас СссадЕсссЬ ЬсссЕддддд с£дссдда£с 60 садсСсасас ссаЬассаЬЬ адЬдсЕсадд дааааассад адааадЕдса ддЬдадддас 120 адддЬсЬссд ааддс£Ь 137 <210> 19 <211> 138 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 19 дЬддсЬддса сасайсЕаЬЬ дддаЕдадда саадсдс£а£ аасссаЕссс ЬсаададЬсд 60 асЕсассайа Есаааддаса сдЕссаадаа ссаддЕаЬсс с£даадс£да дсЬс£д1дас 120

- 52 010902 сдскдсадас асддссдЧ: 138 <210> 20 <211> 139 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 20

РсаРаГддаЕ ссасРсассЕ даддадасдд ЕдассдБддЕ сссРкддссс садЕадЕсаа 60 адЕадСссЕс аасаРсаРад аРдаРссксс ЕРсБсдсаса дйааРасасд дссдГдСсЕд 120 садсдд1:сас ададсИсад 139 <210> 21 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 21 дадаРЕаадс РРдссдссас са 22 <210> 22 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 22 аддадскдЕд дадасЁдссс к 21 <210> 23 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 23

Едсадаадсс адддсадЪсБ 20 <210> 24 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 24

РдаЕаЕдда!: ссасЕсасдЕ БРдаБсЕс 28 <210> 25 <211> 23

- 53 010902 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 25 дадабааадс ббдссдссас саб <210> 26 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 26 бссбсабссс аабадабдбд бдсс <210> 27 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 27 дбддсбддса сасабсбабб дд <210> 28 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 28

бсабабддаб	ссас£сасс£ дадд	24
<210>	29
<211>	360
<212>	ДНК
<213>	Ното	зар1епз

<220>

<221> СОЗ <222> (1) . .. (360) <220>

<221> сиг. пептид <222> (1) ... (60) <400> 29

абд адд Меб Агд -20

сбс Ьеи

ссб Рго

дсб А1а

сад С1п -15

сбс Ьеи

сбд ддд сбд

сба Ьеи -10

абд Меб

сбс Ьеи

бдд дбе Тгр Уа1

бсб Зег -5

48

Ьеи С1у

Ъеи

дда

бсс

адб

ддд

даб

абб

дйд

абд

асб

сад

бсб

сса

сбс

бсс

сбд

ссс

96

- 54 010902

С1у

Бег

Зег

О1у

Азр 1

Не Уа1

Мек

ТЬг 5

О1п

Зег

Рго Ьеи

Зег 10

Ьеи

Рго

дке

асе

сек

дда

дад

ссд

дсс

ксс

акс

ксс

кде

адд

кек

адк

сад

аде

144

Уа1

ТЬг

Рго

С1у

С1и

Рго

А1а

Зег

11е

Зег

Суз

Агд

Зег

61п

Зег

15

20

25

скс

скд

сак

адк

аак

дда

кас

аас

как

ккд

дак

кдд

кас

скд

сад

аад

192

Ьеи

Н1з

Зег

Азп

С1у

Туг

Азп

Туг

Ьеи

Азр

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

30

35

40

сса

ддд

сад

кек

сса

сад

скс

скд

акс

как

ккд

ддк

кек

аак

едд

дсс

240

Рго

С1у

С1п

Зег

Рго

01п

Ьеи

11е

Туг

Ьеи

С1 у

Зег

Азп

Агд

А1а

45

50

55

60

ксс

ддд

дке

сск

дас

адд

ккс

адк

ддс

адк

дда

кса

ддс

аса

дак

ккк

288

5ег

С1у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

65

70

75

аса

скд

ааа

акс

аде

ада

дкд

дад

дек

дад

дак

дкк

ддд

дкк

как

кас

336

ТЬг

Деи

Ьуз

Не

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

01и

Азр

Уа1

еьу

Уа1

Туг

80

85

90

кде

акд

саа

дек

ска

саа

аск

сск

360

Суз

Мек

С1п

А1а

Ьеи

01п

ТЬг

Рго

100 <210> 30 <211> 120 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <220>

<221> Сигнальный <222> (1)...(20) <400> 30

Мек -20

Агд Ьеи

Рго

Айа

01п Ьеи Ьеи 01у Ьеи Ьеи

Мек

Ьеи

Тгр

Уа1

Зег -5

-15

-10

01 у

Зег

С1у

Азр

11е

Уа1

Мек

ТЬг

01п

Зег

Рго

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

1

5

10

Уа1

ТЬг

Рго

С1 у

С1и

Рго

А1а

Зег

11е

Зег

Суз

Агд

Зег

01п

Зег

15

20

25

Ьеи

ΗΪ3

Зег

Азп

01 у

Туг

Азп

Туг

Ьеи

Азр

Тгр

Туг

Ьеи

О1п

Ьуз

30

35

40

Рго

61у

О1п

Зег

Рго

01 п

Ьеи

11е

Туг

Ьеи

01 у

Зег

Азп

Агд

А1а

45

50

55

60

Зег

С1у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

65

70

75

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

С1и

Азр

Уа1

01у

Уа1

Туг

80

85

90

Суз

Мек

С1п

А1а

Ьеи

01п

ТЬг

Рго

95

100

<210> 31 <211> 300 <212> ДНК <213> Ното заргепз

- 55 010902 <220>

<221> СБ5 <222> (1)...(300) <400> 31

дай Азр 1

аьь Не

дрд УаЬ

аЬд МеЬ

асЬ ТЬг 5

сад СЬп

ЬсЬ Зег

сса Рго

сйс Ьсс

сЬд Ьеи

ссс Рго

дЬс Уа!

асе ТЬг

ссй Рго 15

дда СЬу

Ьеи

Зег 10

дад

ссд

дсс

Гсс

акс

Ьсс

Где

адд

ГсГ

адЬ

сад

аде

сЬс

ейд

сай

сдй

СЬи

Рго

АЬа

5ег

11е

Бег

Суз

Агд

Зег

СЬп

Зег

Ьеи

НЬз

Агд

20

25

30

ЬаЪ

дда

Гас

аас

ЬаЬ

ЬЬд

даС

Ьдд

Рас

сЬд

сад

аад

сса

ддд

сад

йсй

Туг

СЬу

Туг

Азп

Туг

Ьеи

Азр

Тгр

Туг

Ьеи

СЬп

Ьуз

Рго

СЬу

СЬп

Зег

35

40

45

сса

сад

ей с

сЬд

аЬс

ЬаГ

ЬЬд

ддГ

ЬсГ

ааГ

едд

дсс

Йос

ддд

дйс

ссй

Рго

С1п

Ьеи

11е

Туг

Ьеи

СЬу

Зег

Азп

Агд

АЬа

Зег

СЬу

Уа1

Рго

50

55

60

дас

адд

ЬЬе

адЬ

ддс

адГ

дда

Ьса

ддс

аса

дай

ЬЫ:

аса

ейд

ааа

айс

Азр

Агд

РЬе

Зег

61 у

Зег

С1у

Зег

СЬу

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Ые

65

70

75

80

аде

ада

дгд

дад

дсЬ

дад

дай

дЬЬ

ддд

дЪЬ

Ьай

Ьас

йдс

айд

саа

дей

Зег

Агд

УаЬ

СЬи

АЬа

СЬи

Азр

УаЬ

С1у

УаЬ

Туг

Суз

Мей

СЬп

АЬа

85

90

95

ейа	саа	аей	ссд	300
Ьеи	С2п	ТЬг	Рго
			100

<210> 32 <21Ь> 100 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <400> 32

Азр 11е Уа1 Мер ТЬг СЬп

Зег Рго

Ьеи

Зег 10

Ьеи Рго

УаЬ

ТЬг Рго СЬу 15

1

5

С1и

Рго

АЬа

Зег

ЬЬе

Зег

Суз

Агд

Зег

СЬп

Зег

Ьеи

НЬз

Агд

20

25

30

Туг

СЬу

Туг

Азп

Туг

Ьеи

Азр

Тгр

Туг

Ьеи

СЬп

Ьуз

Рго

СЬу

СЬп

Зег

35

40

45

Рго

СЬп

Ьеи

11е

Туг

Ьеи

СЬу

Зег

Азп

Агд

АЬа

Зег

СЬу

УаЬ

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

СЬу

Зег

СЬу

Зег

СЬу

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

1Ье

65

70

75

80

Зег

Агд

УаЬ

СЬи

АЬа

СЬи

Азр

УаЬ

СЬу

УаЬ

Туг

Суз

Мей

СЬп

АЬа

85

90

95

Ьеи

СЬп

ТЬг

Рго

100

<210> 33 <211> 407 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз

- 56 010902

<220>
<221>	СБВ
<222>	(3) .	. . (407)
<220>
<221>	сиг.	пептид
<222>	(3) .	..(38)
<400>	33
Рс сРс	сРд	сРд дрд дед дсР ссс ада Рдд дРс сРд Рсс сад сРд сад	47

Ьеи Ьеи Ьеи 7а1 А1а А1а Рго Агд Тгр Уа1 Ьеи Вег С1п Ьеи 01п

-5 1

сРд Ьеи

сад дад Ред

ддс С1у

сса Рго

дда С1у 10

сРд Ьеи

дрд аад

ССР Рго

Ред Зег 15

дад 01и

асе ТЬг

сРд Ьеи

Рсс Зег

95

О1п 5

01 и

Зег

Уа1

Ьуз

сРс

асе

Рдс

асР

дРс

РсР

ддр

ддс

Рсс

аРс

аде

ада

ддр

адР

сас

Рас

143

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Вег

С1у

01у

Зег

Не

Вег

Агд

61у

Зег

ΗΪ3

Туг

20

25

30

35

Рдд

ддс

рдд

аРс

сдс

сад

ссс

сса

ддд

аад

ддд

сРд

дад

Рдд

аРР

ддд

191

Тгр

С1у

Тгр

Не

Агд

01п

Рго

01 у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1 и

Тгр

11е

01у

40

45

50

адР

аРс

РаР

адр

ддд

аас

асе

Рас

РРР

аас

ссд

Рсс

сРс

аад

адР

239

Вег

Не

Туг

Зег

01 у

Азп

ТЬг

Туг

РЬе

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

55

60

65

еда

дрс

асе

аРа

РсР

дРа

дас

асд

Рсс

аад

аас

сад

РРс

Рсс

сРд

аад

287

Агд

Уа1

ТЬг

11е

Зег

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

С1п

РЬе

Вег

Ьеи

Ьуз

70

75

80

сРд

аде

РсР

дрд

асе

дсс

дса

дас

асд

дсР

дрд

РаР

Рас

Рдр

дед

ада

335

Ьеи

Вег

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

А1а

Агд

85

90

95

сРс

ддс

ССР

даР

дас

РаР

асе

сее

дас

ддр

аРд

дас

др с

Рдд

ддс

саа

383

Ьеи

С1 у

Рго

Азр

Туг

ТЬг

Ьеи

Азр

01у

Мер

Азр

Уа1

Тгр

С1у

С1п

100

105

110

115

ддд

аес

асд

др с

асе

дрс

Рсс

Рса

407

С1у

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Вег

Зег

120 <210> 34 <211> 135 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <220>

<221> Сигнальный <222> (1) . . . [12) <400> 34

Ьеи Ьеи Ьеи

Уа1

А1а А1а Рго Агд -5

Тгр

Уа1 Ьеи Зег 61п 1

Ьеи

01п

Ьеи

-10

01п

01и

Зег

01 у

Рго

01у

Ьеи

7а1

Ьуз

Рго

Зег

С1и

ТЬг

Ьеи

Вег

Ьеи

5

10

15

20

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

01 у

С1у

Зег

Не

Зег

Агд

61у

Зег

ΗΪ5

Туг

Тгр

- 57 010902

25

30

35

61у

Тгр

Не

Агд

С1п

Рго

61у

Ьуз

51 у

Ьей

С1и

Тгр

Не

С1у

Зег

40

45

50

Не

Туг

Зег

51у

Азп

ТЬг

Туг

РЬе

Азп

Рго

Зег

Ъеи

Ьуз

Зег

Агд

55

60

65

Уа1

ТНг

11е

Зег

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

51п

РЬе

Зег

Ъеи

Ьуз

Ьей

70

75

80

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

А1а

Агд

Ьей

85

90

95

100

С1у

Рго

Азр

Туг

ТЬг

Ъеи

Азр

С1у

МеС

Азр

Уа1

Тгр

С1у

61п

51у

105

но

115

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

120 <210> 35 <211> 356 <212> ДНК <213> Ното зархепз <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(356) <220>

<221> сиг. пептид <222> (1)...(57) <400> 35

аСд Мес

ааа Ьуз

сас Н15

ссд Ьей

Сдд Тгр -15

ССС РЬе

ССс РЬе

сСс ССс

ссд Ьей -10

дСд Уа1

дса А1а

дсС А1а

ссс Рго

ада Агд -5

Сдд Тгр

48

Ъеи

Ьей

дСс

сСд

Ссс

сад

дСд

сад

сСд

сад

дад

Ссд

ддс

сса

дда

сСд

дед

аад

96

Уа1

Ьей

Зег

С1п

Уа1

С1п

Ьей

51п

51и

Зег

51у

Рго

51у

Ьей

Уа1

Ьуз

1

5

10

ссС

Ссд

дад

асе

сСд

Ссс

ССС

асе

Сдс

асС

дСс

СсС

ддС

ддс

Ссс

дСс

144

Рго

Зег

51и

ТЬг

Ьей

Зег

Ьей

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

51у

Зег

Уа1

15

20

25

аде

адС

ддЬ

ддС

Сас

Сдд

аде

Сдд

аСс

сдд

сад

ссс

сса

ддд

аад

192

Зег

С1у

51 у

Туг

Тгр

Зег

Тгр

Не

Агд

61п

Рго

51 у

Ьуз

30

35

40

45

дда

сед

дад

Сдд

аСС

ддд

СаС

аСс

СаС

Сас

адС

ддд

аде

асе

аас

Сас

240

51 у

Ьей

С1и

Тгр

Не

С1у

Туг

Не

Туг

Зег

С1у

Зег

ТЬг

Азп

Туг

50

55

60

аас

ссс

Ссс

сСс

аад

адС

еда

дСс

асе

аСа

Сса

дСа

дас

асд

Ссс

аад

288

Азп

Рго

Зег

Ьей

Ьуз

Зег

Агд

Уа1

ТЬг

Не

Зег

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

65

70

75

аас

сад

ССс

Ссс

сСд

аад

сСд

аде

СсС

дСд

асе

дсС

дед

дас

асд

дсс

336

Азп

С1п

РЬе

Зег

Ьей

Ьуз

Ьей

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

80

85

90

дьд

СаС

Сас

ЬдС

дед

ада

да

356

Уа1

Туг

Суз

А1а

Агд

- 58 010902 <210> 36 <211> 118 <212> БЕЛОК <213> Ното зарЬепз <220>

<221> Сигнальный <222> (1) . ..(19) <400> 36

МеО Ьуз

Н1з Ьеи

Тгр РЬе -15

РЬе

Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 А1а А1а Рго Агд

Тгр

-10

-5

Уа1

Ьеи

Зег

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

С1п

С1и

Зег

01 у

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

1

5

10

Рго

Зег

61и

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

С1у

Зег

Уа1

15

20

25

Зег

5ег

61у

Туг

Тгр

Зег

Тгр

11е

Агд

С1п

Рго

С1у

Ьуз

30

35

40

45

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

11е

61у

Туг

11е

Туг

Зег

61у

Зег

ТЬг

Азп

Туг

50

55

60

Азп

Рго

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Уа1

ТЬг

11е

Зег

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

65

70

75

Азп

С1п

РЬе

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

80

85

90

Уа1

Туг

Суз

А1а

Агд

<210> 37 <211> 356 г» 1 г» ι—гτι ту ДДПГч <213> Ното зараепз <220>

<221> СОЗ <222> (1) . , .(356) <220>

<221> сиг. пептид

<222> (1)..

. (57)

<400> 37

аОд

аад

сас

сОд

Одд

ООс

ООС

сОс

сОд

СОд

дОд

дед

дсО

ССС

ада

Одд

48

МеО

Ьуз

Н15

Ьеи

Тгр

РЬе

Ьеи

Уа1

А1а

Рго

Агд

Тгр

-15

-10

-5

дОс

сОд

Осс

сад

сод

сад

сОд

сад

дад

Осд

ддс

сса

дда

сОд

дОд

аад

96

Уа1

Ьеи

Зег

С1п

Ьеи

С1п

Ьеи

О1п

61и

Зег

С1у

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

1

5

10

ССО

Осд

дад

асе

сОд

Осс

сОс

асе

Оде

асО

дос

ОСО

ддО

ддс

Осс

аОс

144

Рго

Зег

С1и

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

01 у

С1у

Зег

11е

15

20

25

аде

адо

адО

Оас

Одд

ддс

Одд

аОс

сдс

сад

ССС

сса

ддд

аад

192

Зег

Туг

Тгр

С1у

Тгр

11е

Агд

е1п

Рго

С1у

Ьуз

30

35

40

45

ддд

сОд

дад

£дд

аОО

ддд

адО

аОс

ОаО

адО

ддд

аде

асе

Оас

240

С1у

Ьеи

О1и

Тгр

Не

С1у

Зег

11е

Туг

Зег

С1у

Зег

ТЬг

Туг

- 59 010902

50

55

60

аас

ссд

Есс

сЕс

аад

адЕ

еда

дЕс

асе

аЕа

Есс

дЕа

дас

асд

Есс

аад

Азп

Рго

Зег

Беи

Ьуз

Зег

Агд

Уа1

ТЬг

Не

Зег

Уа1

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

65

70

75

аас

сад

ЕЕс

Есс

сЕд

аад

сЕд

аде

ЕСЕ

дйд

асе

дсс

дса

дас

асд

дсЕ

Азп

С1п

Рйе

Бег

Беи

Ьуз

Ьеи

Зег

Уа1

ТЙГ

А1а

Азр

Тйг

А1а

80

85

90

дйд

ЕаЕ

Еас

ЕдЕ

дед

ада

са

Уа1

Туг

Суз

А1а

Агд

95

<210> <211> <212> <213>	38 118 БЕЛОК Ното зарБепз
<220>
<221>	Сигнальный
<222>	(1) -	. (19)

<400> 38

МеЕ Буз ΗΪ3

Беи

Тгр -15

РЬе

Рйе Беи Беи Ьеи Уа1 -10

А1а

Рго

Агд -5

Тгр

Уа1

Ьеи

Зег

С1п

Беи

С1п

Беи

С1п

С1и

Зег

С1у

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

Буз

1

5

10

Рго

Зег

С1и

ТЬг

Беи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

Зег

С1у

Зег

Не

15

20

25

Зег

Туг

Тгр

С1у

Тгр

11е

Агд

С1п

Рго

С1у

Буз

30

35

40

45

С1у

Беи

С1и

Тгр

11е

С1у

Зег

Не

Туг

Зег

С1у

Зег

ТЫ

Туг

50

55

60

Азп

Рго

Зег

Беи

Буз

Зег

Агд

Уа1

ТЬг

11е

Зег

Уа1

Азр

Тйг

Зег

Буз

65

70

75

Азп

61п

Рйе

Зег

Беи

Буз

Беи

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

Азр

Тйг

А1а

80

85

90

Уа1

Туг

Суз

А1а

Агд

95

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

1. Гуманизированный иммуноглобулин, который специфически связывается с бета-амилоидным пептидом (Αβ), или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий:

(ί) легкую цепь, содержащую три гипервариабельных участка (ΕΌΗδ) последовательности вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина 12В4, изображенной как БЕЦ ΙΌ N0: 2, и вариабельную каркасную область последовательности легкой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина; и (ίί) тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок (СОК) последовательности вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина 12В4, изображенной как БЕЦ ΙΌ N0: 4, и вариабельную каркасную область тяжелой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина.

2. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, у которого ΕΌΗδ легкой цепи имеют следующие аминокислотные последовательности:

СЭК.1: Αγ§ Бег Бег 61η Αδη 11е Уа1 Ηίδ Бег Αδη 61у Αδη Тйг Туг Ьеи 61и (остатки 24-39 БЕЦ ΙΌ N0: 2), ί.ΌΗ2: Εγδ Уа1 Бег Αδη Αγ§ Рйе Бег (остатки 55-61 БЕЦ ΙΌ N0: 2),

СЭК3: Рйе 61η 61у Бег Ηίδ Уа1 Рго Ьеи Тйг (остатки 94-102 БЕС) ΙΌ N0: 2).

3. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, содержащий один, два или три СЭКз тяжелой цепи, имеющих следующие аминокислотные последовательности:

СЭК1: Тйг Αδη 61у Ме! 61у Уа1 Бег (остатки 31-37 БЕС) ΙΌ N0: 4),

СЭК2: Ηίδ Не Туг Тгр Αδρ 61и Αδρ Ьл+ Лщ Туг Αδη Рго Бег Ьеи Блъ Бег (остатки 52-67 БЕЦ ΙΌ N0: 4), СЭК3: Αγ§ Αγ§ Не Не Туг Αδρ Уа1 61и Αδρ Туг Рйе Αδρ Туг (остатки 100-112 БЕЦ ΙΌ N0: 4).

4. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из

- 60 010902 предшествующих пунктов. в котором по меньшей мере один аминокислотный остаток каркасной области легкой и тяжелой цепей замещен на соответствующий аминокислотный остаток последовательности вариабельной области легкой или тяжелой цепи антитела мыши 12В4. причем указанный остаток выбран из группы. состоящей из:

(а) остатка. способного взаимодействовать с антигеном;

(б) остатка. который непосредственно связывается нековалентной связью с антигеном;

(в) остатка. проксимального к сайту связывания с антигеном;

(г) остатка. прилегающего к СОВ;

(д) остатка. взаимодействующего с СОВ;

(е) остатка. расположенного в пределах 6 А от остатка СОВ;

(ж) канонического остатка;

(з) остатка из верньер-зоны;

(и) остатка межцепочечной укладки;

(к) редкого (минорного) остатка;

(л) остатка. способного влиять на конформацию или функцию вариабельной области легкой цепи. как показано анализом трехмерной модели вариабельной области; и (м) остатка сайта гликозилирования на поверхности структурной модели.

5. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.4. в котором остаток. взаимодействующий с СОВ. идентифицируют моделированием легкой цепи антитела мыши 12В4 на основе разрешенной структуры легкой цепи мышиного иммуноглобулина. последовательность которой по меньшей мере на 90% идентична последовательности легкой цепи 12В4.

6. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.4. в котором остаток. взаимодействующий с СОВ. идентифицируют моделированием тяжелой цепи 12В4 на основе разрешенной структуры тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина. последовательность которой по меньшей мере на 90% идентична последовательности тяжелой цепи 12В4.

7. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.13. в котором гипервариабельные участки (СОВ) и остаток каркасного участка вариабельной области Ь2 (нумерация по КаЬа!) получены из легкой цепи моноклонального антитела 12В4.

8. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.13. в котором гипервариабельные участки (СОВ) и остатки каркасного участка вариабельной области Н2. Н24. Н27. Н29. Н48. Н49. Н67. Н71 и Н78 (нумерация по КаЬа!) получены из тяжелой цепи моноклонального антитела 12В4.

9. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.13. в котором гипервариабельные участки (СОВ) и остатки каркасного участка вариабельной области Н24. Н27. Н29 и Н71 (нумерация по КаЬа!) взяты из тяжелой цепи моноклонального антитела мыши 12В4.

10. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3. в котором гипервариабельные участки (СОВ₈) и остатки каркасного участка вариабельной области Н24. Н27. Н29. Н48. Н71 и Н78 (нумерация по КаЬа!) получены из тяжелой цепи моноклонального антитела мыши 12В4.

11. Гуманизированный иммуноглобулин по любому из предшествующих пунктов. который содержит область Ес с измененной эффекторной функцией.

12. Фрагмент иммуноглобулина по любому из предшествующих пунктов. который представляет собой ЕаЬ-фрагмент.

13. Иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов. в котором изотип тяжелой цепи представляет собой гамма 1.

14. Иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов. который: (ί) связывается с растворимым бета-амилоидным пептидом (Αβ) и агрегированным бетаамилоидным пептидом (Αβ); (ίί) связывается с эпитопом в остатках 3-7 бета-амилоидного пептида (Αβ); (ш) опосредует фагоцитоз бета-амилоидного пептида (Αβ); (ίν) проникает через гематоэнцефалический барьер в организме субъекта; (ν) уменьшает содержание (нагрузку) бляшек бета-амилоидного пептида (Αβ).

15. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов. в котором вариабельная область легкой цепи представлена остатками 1-112 8ЕО ГО N0: 6.

16. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов. в котором вариабельная область тяжелой цепи является такой. как представлена остатками 1-123 8Е0 ГО N0: 4. 8ЕЦ ГО N0: 8. остатками 1-123 8ЕЦ ГО N0: 10 или остатками 1-123 8ЕО ГО N0: 12.

17. Гумманизированный иммуноглобулин по п.15 или 16. который содержит по меньшей мере одну консервативную аминокислотную замену. при этом сохраняет способность непосредственно специфически связываться с бета-амилоидным пептидом (Αβ) с аффинностью связывания по меньшей мере 10⁷ М^-1.

18. Гуманизированный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из

- 61 010902 пп.1-17, в котором по меньшей мере один остаток каркасной области легкой или тяжелой цепи замещен соответствующим аминокислотным остатком из последовательности вариабельной области легкой или тяжелой цепи антитела мыши 12В4.

19. Фармацевтическая композиция, содержащая иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-17 и фармацевтический носитель.

20. Молекула выделенной нуклеиновой кислоты, выбранная из группы, состоящей из: (ί) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь гуманизированного иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-18; (и) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь гуманизированного иммуноглобулина или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-18; (ΐϊϊ) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-18; или (ίν) молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 5ЕО ГО N0: 1, 5Е0 ГО N0: 5, 8Е0 ГО N0: 3, 5ЕО ГО N0: 7, 8Ер ГО N0: 9 или 8Ер ГО N0: 11.

21. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.20.

22. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.20.

23. Способ получения иммуноглобулина или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-18, заключающийся в культивировании клетки-хозяина по п.22 в условиях, обеспечивающих продуцирование иммуноглобулина или его фрагмента, и выделении иммуноглобулина или его фрагмента из клетки-хозяина или культуральной среды.