TWI328116B - Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide - Google Patents

Description

1328116 (1) 玖、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明關於能辨識θ -澱粉樣蛋白肽之人類化抗體。 相關的申請案 本申請案申稱先前申請的臨時專利申請案U.S.Serial N〇.60/363,75 1 (申請日期2002年3月12日），標題 "Humanized Antibodies That Recognize Beta-Amyloid Peptide”的利益。上述參考文獻全文在此倂入參考文獻。 【先前技術】 阿茲海默氏症（AD)是造成老年痴呆症的進行性疾病》 參閱 Selkoe，TINS 1 6:403 ( 1 993 );Hardy et al.，WO 92/ 1 3 069 ;Selkoe,J.Neuropathol.Exp.Neurol.53:438(1994);Duff et al. ,N ature 3 7 3 : 4 7 6 ( 1 9 9 5 ); Game s et al. ,Nature 3 7 3:523 (1995)。大體而言，此疾病可分成二種範疇：發生在老年 人（65歲以上）之遲發型，以及發生在老年之前，即35至60 歲之間的早發型。在此二類型之疾病中，其病理學雖然相 同，但早發型的異常性似乎更嚴重且散佈更廣。此疾病之 特徵在於至少有二種類型之腦部損害，分別爲神經纖維纏 結以及老年斑。神經纖維纏結是細胞內相關於tau蛋白質 的微管沈澱物，其係由二個成對而相互扭曲的絲狀體組成 。老年斑（即澱粉樣蛋白斑）是多至1 5 0微米的不規則神經 氈區域，腦組織切片透過顯微鏡的分析可看見其中心有細 (2) 1328116 胞外的澱粉樣蛋白沈澱物。腦內澱粉樣蛋白斑堆積亦與唐 氏綜合症及其它認知的病症相關。 蛋白斑的主要組份是一種肽，稱爲A石或/5 -澱粉樣 , 蛋白肽。A/3肽是一種橫越細胞膜之較大型糖蛋白質，稱 爲澱粉樣蛋白前驅物蛋白質（APP)的內部片段，有3 9-43個 %» 胺基酸，4-kDa大小。彼是APP經不同分泌酶酵素水解之 ' 結果，ΑΘ主要可分成短型（長度爲40個胺基酸），及長型 φ (長度爲42-43個胺基酸）。APP厭水性的橫越細胞膜之結 構區部份位於A /3之羧基端，具有使A /3 (尤其是長型）聚 集成蛋白斑之能力。腦部中澱粉樣蛋白斑堆積最後會導致 神經元細胞的死亡。與此類型神經惡化相關的症狀是阿茲 海默氏症。 APP蛋白質內之許多突變與阿茲海默氏症相關。參閱 例如 Goate et al·，Nature 349:704}(1991)(纈胺酸 717 至異 白胺酸）；Chartier Harlan et al.Nature 353:844(1991)(纈 籲胺酸 717 至甘胺酸）；Murrell et al.，Science 254:97( 1 99 1 )( 線胺酸717至苯丙胺酸）；Mullan et al., Nature 4*

Genet. 1:345 ( 1 992)(雙突變改變離胺酸5 9 5 -甲硫胺酸5 9 6至天 1 門冬醯胺酸595-白胺酸5 9 6 )。該突變似乎可因增加或改變 APP至A/5之作用而引起阿茲海默氏症，尤其是加工APP 以增加長型A冷（即A沒1-42以及A/31-43)之含量。其它 基因突變，例如早老因子基因、PSI以及PS2，似可間接 影響APP加工，增加長型A/3之產量（參閱Hardy，TINS 20:154(1997))。 (3) (3)1328116 使用小鼠模式已可成功地測定澱粉樣蛋白斑在老年痴 呆症的顯著性（Games et al.，supra, Johnson-Wood et al·， Proc.Natl. Acad. Sci. USA 94:1 5 50( 1 997))。特定言之，當 對PDAPP導入外來基因的老鼠（表現人類 APP之突變形 式，並在幼年時即產生阿茲海默氏症）注射長型AA時， 彼可降低老年痴呆症的進展以及增加A/3肽之抗體效價 (Schenk et al., Nature 400, 1 7 3 ( 1 999))。以上之觀察指出 A冷（尤其是長型A/3)是阿茲海默氏症的病因。 據此，須要治療阿茲海默氏症之新療法及試劑，特定 言之，能在生理（例如無毒的）劑量下具有治療效應的療法 及試劑。 【發明內容】 本發明特色是一種新的免疫試劑，特定言之是預防及 治療呈澱粉樣疾病（例如阿茲海默氏症）的治療用抗體試劑 。本發明係基於（至少部份）確認及鑑定可專一結合於A冷 肽之單株抗體，且可有效的減少蛋白斑及/或減少與成澱 粉樣病症相關的神經炎性失調。分析此抗體的構造及功能 可導致設計各種用於預防及/或治療的人類化抗體。 特定言之，本發明的特色是人類化此抗體之變異區， 據此提供人類化免疫球蛋白或抗體鏈、完整的人類化免疫 球蛋白或抗體、以及功能性免疫球蛋白或抗體片段，尤其 是此類抗體之抗原結合片段。 文中亦揭示包含此類特定單株抗體之互補性決定區域 的多胜肽、多核苷酸試劑、載體以及適用於編碼該多胜肽 -9- (4) 1328116 之宿主。 本發明揭示治療呈殿粉樣疾病或病症（例如阿茲海默 氏症）之方法、應用於該用途之藥學組成物及組套。 . 本發明亦包括確認此類特定單株抗體內產生適當免疫 功能的重要殘基的方法，以及在設計治療試劑時確認人類 化抗體上可經取代後改良結合親和力及/或降低產生免疫 ~ 性之殘基的方法。 φ 本發明的特色亦爲抗體（例如具有改變致效劑功能的 人類化抗體）以及其治療上的用途。 發明之詳細描述 本發明之特色爲預防或治療阿茲海默氏症或其它呈澱 粉樣疾病之新穎的免疫試劑及方法。本發明係在（至少部 份）特徵化單株免疫球蛋白（12B4)，其可有效結合点澱粉 樣蛋白蛋白質（An)(例如結合可溶性及/或聚集的A沒）、中 介吞噬作用（例如A A的聚集）、降低蛋白斑及/或降低（例 鲁如病患之）神經炎性失調。本發明進一步的係在測定以及 鑑定各種12B4免疫球蛋白之一級及二級結構的輕鏈及重鏈 Μ 以及鑑定對活性及產生免疫性具重要性的殘基。 免疫球蛋白的特色包括在此描述的12Β4單株免疫球蛋 白之各種輕鏈及/或各種重鏈。較佳的免疫球蛋白（例如治 療的免疫球蛋白）之特色包括人類化的各種輕及/或人類化 的各種重鏈。較佳的各種輕鏈及/或各種重鏈包括取自 12Β4免疫球蛋白之互補性決定區域（CDR)(例如供體免疫 球蛋白）以及實質上取自人類受體免疫球蛋白之變異架構 -10- (5) (5)1328116 區域。"取自實質上人類受體免疫球蛋白的"係指取自人類 受體序列的主要或關鍵架構殘基，然而在某些殘基位置上 可選擇性的用殘基取代以改良人類化免疫球蛋白的活性（ 例如改變其活性以更緊密的模仿供體免疫球蛋白之活性） 或選擇性的降低人類化免疫球蛋白之免疫產生性。 在具體實施例之一中，本發明的特色是人類化免疫球 蛋白之輕鏈或重鏈，其係包括12B4變異區之互補性決定區 域（CDRs)(即包括序列確認號碼：2之輕鏈變異區序列的一 '二或三個CDRs或包括序列確認號碼：4之重鏈變異區 序列的一、二或三個CDRs)，以及包括實質上取自人類受 體免疫球蛋白輕鏈或重鏈序列之變異架構區域，其限制條 件爲至少一個架構殘基之殘基返回突變至對應的鼠科動物 殘基，其中該返回突變實質上不影響該鏈直接結合A/5之 能力。 在另一具體實施例中，本發明的特色是人類化免疫球 蛋白之輕鏈或重鏈，其係包括12B4變異區互補性決定區域 (CDRs)(例如包括序列確認號碼：2輕鏈變異區序列之一、 二或三個CDRs及/或包括序列確認號碼：4重鏈變異區序 列之一、二或三個CDRs)，以及包括實質上取自人類受體 免疫球蛋白輕鏈或重鏈序列之變異架構區域，其限制條件 爲至少一個架構殘基係經小鼠12B4之輕鏈或重鏈變異區序 列的對應胺基酸殘基取代，該架構殘基係選自：（a)非直 接共價鍵結合於抗原的殘基；（b)與CDR相鄰的殘基；（c) 與CDR交互作用的殘基（例如以解析結構的同源習知免疫 -11 - (6) 1328116 球蛋白鏈爲基礎模式化輕鏈或重鏈加以確認）；以及（d)參 與VL-VH界面的殘基。 在另一具體實施例中，本發明的特色是人類化免疫球 . 蛋白之輕鏈或重鏈，其係包括12B4變異區CDRs以及各種 取自人類受體免疫球蛋白輕鏈或重鏈序列之架構區域，其 %» 限制條件爲至少一個架構殘基係經小鼠12B4之輕鏈或重鏈 ' 變異區序列的對應胺基酸殘基取代，此架構殘基經變異區 鲁三維模式分析後確認能影響輕鏈變異區構像或功能，例如 能與抗原交互作用之殘基、接近抗原結合部位之殘基、與 CDR交互作用之殘基、與CDR相鄰的殘基、距CDR 6A 以內之殘基、標準殘基、游標區殘基、鏈間裝塡殘基、獨 特的殘基、或結構模型表面之糖化位點殘基" 在另一具體實施例中，本發明的特色除了上述之取代 以外，至少還取代一個稀有之人類架構殘基。例如，稀有 殘基可經各種人類鏈序列在此位置上的共同胺基酸殘基取 鲁代。此外，稀有殘基可經同源種系各種鏈序列之對應胺基 酸殘基取代。 «r 在另一具體實施例中，本發明的特色是人類化免疫球 蛋白，其係包括上述該免疫球蛋白之輕鏈以及重鏈，或抗 原·結合片段。在典型的具體實施例中，人類化免疫球蛋 白結合（例如專一性結合）/3澱粉樣蛋白肽（A yS )之結合親 和力至少爲107m·1、Η^Μ·1、或ΙΟ9]^-1。在另一具體實施 例中’免疫球蛋白或抗原結合片段包括具有同功型r1之 重鏈。在另一具體實施例中，免疫球蛋白或抗原結合片段 -12- (7) (7)1328116 係與可溶性冷澱粉樣蛋白肽（A )3)以及聚集的結合（例 如專一結合）。在另一具體實施例中，免疫球蛋白或抗原 結合片段可間接中介/3-澱粉樣蛋白肽（A/?)之吞噬作用（ 例如誘發吞噬作用）。在另一具體實施例中，免疫球蛋白 或抗原結合片段可通過患者之血腦屏障。在另一具體實施 例中，疫球蛋白或抗原結合片段可降低患者之^澱粉樣蛋 白肽（A々）含量及神經炎性失調。 在另一具體實施例中，本發明的特色是嵌合型免疫球 蛋白，其係包括12B4變異區（例如序列確認號碼：2或序列 確認號碼：4之變異區序列）。在另一具體實施例中，免疫 球蛋白、或其抗原-結合片段進一步的包括免疫球蛋白G1 之恆定區。 在此描述之免疫球蛋白尤其適用於預防或治療呈澱粉 樣疾病的方法。在具體實施例之一中，本發明的特色是預 防或治療呈澱粉樣疾病（例如阿茲海默氏症）的方法，其係 包含對病患投用有效劑量的在此描述的人類化免疫球蛋白 。在另一具體實施例中，本發明之特色爲藥學組成物，其 係包括在此描述之人類化_免疫球蛋白以及醫藥載體。本發 明的特色亦爲產生在此描述之免疫球蛋白或免疫球蛋白片 段或鏈之分離的核酸分子、載體以及宿主細胞，與產生該 免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或免疫球蛋白鏈的方法。 本發明進一步的特色是在產生人類化12B4免疫球蛋白 時，用以確認能取代之1 2B4殘基的方法。例如，確認能取 代之變異架構區域殘基的方法包含以經解析的同源免疫球 -13- (8) 1328116 蛋白結構模式化12B4變異區之三維結構以及分析該模式中 能影響1 2B4免疫球蛋白變異區構像或功能之殘基，藉以確 認能取代之殘基。本發明進一步的特色係使用序列確認號 . 碼：2或序列確認號碼：4之變異區序列，或其任何部份， 產生12B4免疫球蛋白、12B4免疫球蛋白鏈、或其結構區 之三度空間影像。 ~ 本發明進一步的特色爲具有經改變的致效劑功能（例 φ如結合到致效劑分子，例如補體或致效細胞受體之能力） 之免疫球蛋白。特定言之，本發明之免疫球蛋白具有經改 變的恆定區（例如Fc區域），其中Fc區域內至少有一個胺 基酸殘基已被不同殘基或側鏈取代。在具體實施例之一中 ，此經修飾之免疫球蛋白是G型免疫球蛋白，彼在Fc區 域中至少包含一個代替的胺基酸殘基，因此該免疫球蛋白 相較於未經修飾之免疫球蛋白，具有經改變的致效劑功能 。在特定的具體實施例中，本發明免疫球蛋白具有經改變 參的致效劑功能，因此產生免疫性的較低（例如不刺激非所 要求的致效細胞之活性、溶解、或與補體結合），彼具有

A 改良的澱粉樣蛋白清除率性質，及/或具有令人滿意的半 ^生期。 在描述本發明之前’爲了幫助對本發明之了解，因此 對下文所使用之某些術語作出定義。 本文之"免疫球蛋白”或"抗體M (在本文中係可通用）意 指具有由二個重鏈及二個輕鏈組成之四個多胜鍵基本結構 之蛋白質，該鏈係經（例如）鏈間雙硫鍵加以穩定，其具有 -14- (9) (9)1328116 專一結合抗原的能力。本文之’'單鏈免疫球蛋白"或"單鏈 抗體"（在本文中係通用）意指由重鏈及輕鏈組成之二個多 胜鍵結構之蛋白質，該鏈例如經鏈間肽連結子加以穩定’ 其具有專一結合抗原的能力。本文之"結構區"意指重鏈或 輕鏈多肽的球狀區域，其係由例如β-平板及/或鏈內雙硫 鍵組成之肽環（例如包含3至4個肽環形）加以穩定。本文中 之結構區可進一步的分成"固定的"或"變異”結構區，在” 固定的”結構區中各成員之結構區內較無序列變異，而在" 變異"結構區中各類成員之結構區內有顯著的變異。在此 技藝中抗體或多肽"結構區"經常與抗體或多肽"區域"相互 通用。抗體輕鏈的"固定"結構區可與_'輕鏈恆定區"、"輕 鏈固定結構區”、"CL"區域或”CL"結構區相互通用。抗體 重鏈的"固定”結構區可與”重鏈恆定區”、”重鏈固定結構 區"、”CH”區域或"CH"結構區相互通用。抗體輕鏈的"變 異”結構區可與’'輕鏈變異區"、”輕鏈變異結構區”、"VL" 區域或” V L ”結構區相互通用。抗體重鏈”變異”結構區可與 ”重鏈恆定區"、”重鏈固定的結構區"、"V Η "區域或"VH "結 構區相互通用。 本文之"區域"亦可意指一部份或部份之抗體鏈或抗體 鏈結構區（例如本文定義之一部份或部份之重鏈或輕鏈或 一部份或部份之固定的或變異結構區），以及該鏈或結構 區與更多的不連接的部份。例如輕鏈及重鏈或輕鏈及重鐽 變異結構區包括散布在本文定義的"架構區域"或"FRS”間 之''互補性決定區域"或” CDRS"。 -15- (10) 1328116 免疫球蛋白或抗體可爲單體或聚合體的形式，例如 IgM抗體爲五合體的形式及/或IgA抗體爲單體、雙體或 多體的形式。本文之"片段"意指一部份或部份之抗體或抗 _ 體鏈，其所包含之胺基酸殘基比完整的或完全的抗體或抗 體鏈少。完整的或完全的抗體或抗體鏈經化學或酵素的處 理後可得到片段。片段亦可得自重組方法。典型的片段包 ~ 括Fab、Fab·、F(ab')2、Fabc及/或Fv片段。本文之”抗 φ原結合片段"意指免疫球蛋白或抗體結合抗原或與完整的 抗體（即與彼來源之完整的抗體）競爭抗原結合（即專一性 結合）的多肽片段。 本文之”構像”意指蛋白質或多肽（例如抗體、抗體鏈 、結構區或其區域）之三級結構。例如，”輕（或重）鏈構像" 意指輕（或重）鏈變異區之三級結構，以及"抗體構像"或"抗 體片段構像"意指抗體或其片段之三級結構。 抗體"專一性結合”意指抗體對抗原或較佳的抗原決定 鲁部位展現可觀的親和力，且較佳者不展現顯著的交互反應 性。"可觀的"或較佳的結合包括結合親和力至少爲1 〇6、 ίο7、108、1〇9 M·1、或 10IQ M·1。親和力以大於 1〇7 M·1， 較佳者大於108 M·1者爲更佳。上述之中間値亦預期的爲 本發明範圍且親和力範圍的較佳結合親和力爲例如1 〇6至 101Q M·1，較佳者 1〇7 至 ίο10 M·1，更佳者 108 至 101G M·1。 ”不展現顯著的交互反應性"的抗體將不太會結合至非令人 滿意的物質（例如非令人滿意的蛋白質物質）。例如專一性 結合至A0的抗體將會結合A)s但不會與非A/g蛋白質或 -16- (11) (11)1328116 肽類（例如噬菌斑內包括之非A yS蛋白質或肽類）有顯著的 反應。對較佳的抗原決定部位具專一性的抗體將（例如）不 會與相同蛋白質或肽的遠端抗原決定部位有顯著的雜交反 應。專一性結合可依據任何確認之決定該結合的技藝方法 測定。較佳者，專一結合的檢測法係依據Scatchard分析 及/或競爭性結合測定。 結合片段係經重組DNA技藝、或經酵素或化學方法 自完整的免疫球蛋白切除而製成。結合片段包括Fab、 Fab·、F(ab’）2、Fabc、Fv、單鏈、及單鏈抗體。除了，，雙 專一性"或"雙功能性"免疫球蛋白或抗體之外，據瞭解免 疫球蛋白或抗體之各個結合部位是相同的。"雙專一性"或 "雙功能性抗體"是人造的雜化抗體，其具有二種不同的重 鏈/輕鏈對，及二種不同的結合部位。雙專一性抗體可用 各種方法製作，包括融合瘤融合或聯結Fab'片段。參閱例 如 Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315- 32 1 ( 1 990); Kostelny et al., J. Immunol. 1 48, 1 547- 1553(1992)。 本文之"人類化免疫球蛋白"或"人類化的抗體”意指包 括至少一個人類化免疫球蛋白或抗體鏈（即至少一個人類 化的輕鏈或重鏈）的免疫球蛋白或抗體。本文之"人類化免 疫球蛋白鏈’'或"人類化的抗體鏈"（即"人類化免疫球蛋白 輕鏈"或"人類化免疫球蛋白重鏈"）意指一種免疫球蛋白或 抗體鏈（即輕鏈或重鏈），其具有實質上取自人類免疫球蛋 白或抗體變異架構區域的變異區以及實質上取自非人類免 -17- (12) 1328116 疫球蛋白或抗體的互補性決定區域（CDRs)(例如至少一個 CDR，較佳者二個CDRs，更佳者三個CDRs)，且進一步 的包括恆定區（例如，在輕鏈是至少一個恆定區或其部份 _ ，而在重鏈較佳者是三個恆定區）。本文之”人類化的變異 區"（例如"人類化的輕鏈變異區"或"人類化的重鏈變異區"） 意指包括實質上取自人類免疫球蛋白或抗體的變異架構區 '域之變異區，以及實質上取自非人類免疫球蛋白或抗體之 φ互補性決定區域（CDRs)。 "實質上取自人類之免疫球蛋白或抗體"或”實質上人 類”係指在比對時可校整至人類免疫球蛋白或抗體之胺基 酸序列，該區域與人類架構或恆定區序列至少有80-90%相 同，較佳者至少9 0 - 9 5 %相同，更佳者至少9 5 - 9 9 %相同（即 具有局部的序列相似性），允許有例如保留性取代 '共識 性序列取代、種系取代、返回突變等。引入保留性取代、 共識性序列取代、種系取代、返回突變、及其類似者，經 •常稱爲”經最適化"之人類化抗體或鏈。"實質上取自非人 類免疫球蛋白或抗體"或"實質上非人類"係指免疫球蛋白 4 或抗體序列與非人類生物體（例如非人類之哺乳動物）至少 有8 0 - 9 5 %，較佳者至少9 〇 - 9 5 %，更佳者9 6 %、9 7 %、9 8 % 、或9 9 %相同。 據此’人類化免疫球蛋白或抗體之所有區域或殘基， 或人類化免疫球蛋白或抗體鏈，除了可能地CDRs之外， 實質上與一種或多種天然的人類免疫球蛋白序列其對應的 區域或殘基相同。本文之"對應區域"或”對應殘基”意指第 -18- (13) (13)1328116 一種及第二種序列在經過最理想的校整比對後’係與第一 種胺基酸或核苷酸序列佔有相同（即相等）位置之第二種胺 基酸或核苷酸序列的區域或殘基。 本文之M顯著的特性”係指二種多肽序列，經最理想的 校整（例如經程式GAP或BESTFIT以預設隙加權），分享 至少 50-60%之序列相似性，較佳者 60-70%之序列相似 性，更佳者 70-80%之序列相似性，更佳者至少80-90%之 相似性，再更佳者至少 90-95%之相似性，以及最佳者至 少 95%或更多之序列相似性（例如99%或更多之序列相似 性）。本文之"實質上相同”係指二種多肽序列，經過最理 想的校整（例如經程式GAP或BESTFIT以預設隙加權）， 分享至少 80-90%之序列相似性，較佳者90-95%之序列相 似性，更佳者至少 95%或更多之序列相似性（例如 99% 或更多之序列相似性）。在序列比對時，一般是用一個序 列作爲參考序列，以比較測試序列。當使用序列比對算則 時，先將測試及參考序列輸入電腦，指定次序列坐標（若 須要），以及指序列算則程式參數。然後序列比對算則會 基於指定的程式參數計算測試序列相對於參考序列的序列 相似性百分比。 最理想的序列校整比對之進行方法可用例如：局部的 同源現象算貝(Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:48 2 ( 1 98 1 ))、同源現象校整算則（Needleman & Wunsch, J_ Mol. Biol. 48:443(1 970))' 搜尋相似性的方法（pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 5:2444(1 988))' (14) 1328116 完成電腦化的此類算則（GAP、BEST FIT、FASTA、及 TFASTA ， Wisconsin Genetics Software Package,

Genetics Computer Group, 5 7 5 Science Dr., Madison, WI) 、或目視檢驗（一般而言參閱 Ausubel et al·, Current Protocols in Molecular Biology)。用於決定序列相似性百 分比及序列相似性的算則之一個實施例爲BLAST算則， 其係描述於 Altschul et al·, J.. Mol. Biol. 2 1 5:403 ( 1 990) 。進行 BLAST分析之軟體公佈於 National Center for Biotechnology Information(可經由 National Institutes of Health NCBI internet server網際網路伺服器公開地存取） 。雖然自訂的參數亦可使用，一般可是用預設的程式參數 以進行序列比對。比對胺基酸序列時，BLAST程式使用 的預設値：長度（W)爲3、期望値（E) 爲10、以及 BLOSUM62 分數基質（參閱 Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1 09 1 5( 1 989))。 較佳者，不同的殘基位置因保留性胺基酸取代而顯示 出不同。爲了區分成保留性或非守恒性的胺基酸取代， 可將胺基酸分成以下數群：第一群（厭水性的側鏈）：leu、 met、ala、val、leu、ile ;第二群（中性親水性的側鏈）： cys、ser、thr ;第三群（酸性的側鏈）：asp、glu ;第四群（ 鹼性的側鏈）：asn、gin、his、lys、arg ;第五群（影響鏈 方向的殘基）：gly、Pro ;以及第六群（芳香族側鏈）：trp 、tyr、phe。保留性取代包含同群內胺基酸間之取代。非 守恒性的取代則是由不同群之胺基酸間之交換所構成。 -20- (15) (15)1328116 較佳者，人類化免疫球蛋白或抗體結合抗原之親和力 爲對應的非人類化抗體的三、四、或五倍。例如，若非人 類化的抗體具有結合親和力爲1 〇9 1，則人類化的抗體 之結合親和力至少爲 3 X 109 ivr1、4 X 109 VT1或5x 109 ΝΓ1。當描述免疫球蛋白或抗體鏈之結合性質時，可基於 鏈”直接與抗原（例如A ^ )結合”之能力對鏈加以描述。當 完整的免疫球蛋白或抗體（或其抗原結合片段）具有專一性 結合性質或結合親和力時，則該鏈可’'直接地與抗原結合" 。若突變可影響（例如減低）完整的免疫球蛋白或抗體（或 其抗原結合片段）之結合親和力，而該抗體或其抗原結合 片段與缺少該突變之鏈相差至少一個數量級，則該突變（ 例如返回突變）可實質上影響重鏈或輕鏈直接與抗原結合 之能力。若突變可影響（例如減低）完整的免疫球蛋白或抗 體（或其抗原結合片段）之結合親和力，而該抗體或其抗原 結合片段與缺少該突變之鏈僅相差二、三或四倍，則該突 變不會實質上影響重鏈或輕鏈直接與抗原結合之能力。 本文之”嵌合型免疫球蛋白"或抗體意指異區取自第一 種物種以及恆定區取自第二種物種之免疫球蛋白或抗體。 嵌合型免疫球蛋白或抗體可構築（例如用遺傳工程方法）自 屬於不同物種之免疫球蛋白基因片段。本文之’'人類化免 疫球蛋白”或”人類化的抗體”不預期包含上述定義之嵌合 型免疫球蛋白或抗體。雖然人類化免疫球蛋白或抗體是以 嵌合的方式建築（即包含一種蛋白質以上之區域），但彼包 括嵌合型免疫球蛋白或抗體所沒有的額外特色（即包含供 -21 - (16) 1328116 體CDR殘基之變異區以及受體架構殘基）。 ••抗原”是抗體專一結合的實體（例如蛋白質的實體或 肽）。 本文之"抗原決定部位"或”抗原決定位”意指抗原上可 與免疫球蛋白或抗體（或其抗原結合片段）專一性結合的位 點。抗原決定部位可由疊連群胺基酸或鄰近蛋白質之非疊 ’連群胺基酸所形成。疊連群胺基酸形成的抗原決定部位在 φ變性溶劑的曝露下一般仍可保留，而三級摺疊形成的抗原 決定部位用形成變性溶劑處理後一般則會喪失。典型地抗 原決定部位包括在獨特的空間構像中的至少 3、4、5、6 、7、8、9、10' 11、12、13' 14 或 15 個胺基酸。決定 抗原決定部位空間構像）的方法包括，例如：X射線結晶 學以及2維核磁共振。參閱例如 Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66? G. E. Morris，Ed.(1996) o φ 辨識相同抗原決定部位的抗體可用顯示一個抗體阻塞 另一抗體結合至目標抗原能力之簡單免疫檢測法（即競爭 性的結合測定）加以確認。在測試免疫球蛋白可抑制參考 抗體專一性結合至共同的抗原（例如 Αβ)之測定法中可測 定競爭性的結合》許多競.爭性結合測定型態已爲習知的測 定法，例如：直接或間接的固相放射免疫分析法（RIA)、 直接地或間接的固相酵素免疫分析法（ΕΙΑ)、三明治競爭 測定（參閱 Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242( 1 983));直接地固相生物素-卵白素 EIA(參閱 -22- (17) (17)1328116

Kirkland et al.，J. Immunol. 137:3614(1986));直接標記 的固相測定、直接標記的固相三明治測定（參閱Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press( 1 98 8 ));使用 1-125 直接標記的固相 RIA( 參閱 Morel et al·，Mol. bnmunol. 25(1):7(1988)):直接 地固相生物素-卵白素 EIA(Cheung et al_,Virology 176:546(1990));以及直接標記的 RIA(Moldenhaueretal·， Scand. J. Immunol. 3 2:77( 1 990))。典型地，該測定包含使 用結合至固體表面之純化的抗原或帶有此類抗原的細胞、 未標記的測試免疫球蛋白以及標記的參考免疫球蛋白。在 測試免疫球蛋白存在下決定標記物結合至固體表面或細胞 的含量以測量競爭性的抑制。通常測試免疫球蛋白係過量 的存在於測試中。通常當競爭抗體過量的存在時，將至少 抑制 5 0 - 5 5 %、5 5 - 6 0 %、6 0 - 6 5 %、6 5 - 7 0 %、7 0 - 7 5 % 或更多 的參考抗體專一性結合至共同的抗原。 抗原決定部位亦可被免疫細胞（例如 B細胞及/或T 細胞）確認。可用活體外測定法決定抗原決定部位之細胞 辨視作用，其係測定3H-胸腺嘧啶倂入計量抗原依存的增 殖、細胞激動素分泌、抗體分泌、或抗原-依存的殺死作 用（細胞毒性的T淋巴細胞測定）。 在人類澱粉樣蛋白前驅物蛋白質（ApP)中可發現典型 的抗原決定部位或抗原決定位，但較佳者是在APP的Αβ 肽中發現抗原決定位。APP有多重異構形式，例如APP695 、APP751 以及 APP770。 -23- (18) 1328116 APP內的胺基酸係依據 app77()的異構形式序列編號（ 參閱例如 GenBank Accession No. P05067)。Ay5 (在此亦稱 爲/5澱粉樣蛋白肽以及A-召）肽是APP內部39-43個胺基 酸的大約4-kDa的片段（A0 39、ΑΘ40、A冷41、A々42以 及A冷43)。例如A召40是由APP之殘基672-711組成，A 召42是由APP之殘基673-713 ofAPP組成。APP經不同分 ~ 泌酵素在活體或原位中進行蛋白質水解後，發現A /3是" 鲁短型”（長度爲40個胺基酸），以及"長型"（長度介於42-43個 胺基酸）。在此描述的較佳抗原決定部位或抗原決定位， 位於Αβ肽的N-端內以及包括A/S胺基酸1-10的殘基，較 佳者爲 AyS42的殘基 1-3、1-4、1-5、1-6、1-7 或 3-7。額 外的抗原決定部位或抗原決定位包括A0的殘基2-4、5、 6、7或8，A/3的殘基3-5、6、7、8或9，或 AyS42的殘基 4-7、8、9或10。當抗體結合至具有特定殘基的抗原決定 部位（例如 Αβ3·7)時，意指抗體專一性結合至內含特定殘 春基的多肽（即例如Αβ3·7)。該抗體不必然地要與Α冷3-7上 的每個殘基接觸。A03-7上每個單一的胺基酸取代或刪除 不必然地可顯著的影響結合親和力。 本文之"呈澱粉樣疾病”包括與不溶的澱粉樣蛋白細纖 維形成或儲存任何疾病。典型的呈澱粉樣疾病包括（但非 限於）：全身性澱粉樣變性、阿茲海默氏症、成長後開始 發作的糖尿病、帕金森氏病、杭丁頓氏舞蹈病、額顳骨的 痴呆症、及與蛋白質感染素相關的可傳染的海綿狀體腦脊 髓炎病變（人類的庫魯症以及Creutzfeldt-Jacob疾病）以及 -24- (19) 1328116 羊的搔癢症以及牛的BSE)。不同呈澱粉樣疾病之定義或 其特徵在於儲存之細纖維的多肽成份之本質。例如可用 石-澱粉樣蛋白蛋白質儲存之澱粉樣蛋白的多肽成份（例如 野生型、變型、或縮短型/5-澱粉樣蛋白蛋白質）特徵化阿 茲海默氏症的病患或病人。據此，阿茲海默氏症是例如患 者或病患的腦部"其特徵在於A yS沈澱"或"與A /3沈澱相關 的疾病”之疾病的實施例。本文之”/3-澱粉樣蛋白蛋白質" 、”冷-澱粉樣蛋白肽”、"/3 -澱粉樣蛋白”” A 0 ”以及” φ A召肽”在此可相互通用。 "產生免疫性的藥劑"或"抗原"是指投用至哺乳動物後 能誘發免疫反應對抗本身之藥劑，其可視需要併入佐劑。' 本文之"治療"定義成對病患施用或投用治療劑，或對 取自具有疾病、疾病症狀或病室之遺傳傾向的病患之分離 組織或細胞株施用或投用治療劑，以治療、治癒、緩和、 減輕、改變、痊癒、改善、改良或影響疾病、疾病症狀或 疾病之遺傳傾向。 φ 本文之"有效劑量"或"有效劑量”的定義是充分的達成 或至少局部地達成所要求的效應之劑量。本文之"治療上 有效劑量"的定義是充分的治療或至少局部地遏止疾病以 * 及患有該疾病之病患的併發症之劑量。有效劑量將取決 於感染之嚴重性以及病人自身免疫系統的一般狀態。 本文之"病患”包括得到預防性的或治療性的治療之人 類以及其它哺乳動物的病患。 ”可溶性"或π解離的” A /3意指非凝聚或非聚集的A冷 -25- (20) 1328116 多肽’包括單體型可溶性與寡聚型可溶性Αβ多肽（例如 可溶性Αβ二聚物、三聚物、及其類似者）。I，不溶的”Αρ 意指凝聚的Αβ多肽’例如經非共價鍵結合之a /3。據相 信A石（例Αβ42)是經由於至少部份地存在於肽匕端“” 橫越細胞膜之結構區部份）的厭水性殘基而聚集。在活體 內可在生物的體液例如腦脊髓液及/或血清發現可溶性 ‘ A yS。此外，經由純淨的DMSO在音波振盪下溶解冷凍乾 •燥的肽可製備成可溶性Αβ。生成的溶液可用離心（例如 1 4,00 0xg，4°C、1 0分鐘）去除任何不溶的微粒。 本文之"致效劑功能”意指抗體（例如IgG抗體）Fc區域 之活性以及包括例如抗體結合致效劑分子（例如補體及/或 Fc受體）之能力，其可控制抗體的數個免疫功能，例如對 致效細胞之活性、溶解、補體-調節的活性、抗體清除率 、及抗體半生期。 本文之"致效劑分子”意指能結合至抗體（例如IgG抗 •體）Fc區域之分子包括（但非限於）補體蛋白或Fc受體。 本文之"致效細胞”意指能結合至抗體（例如IgG抗體） Fc部份（典型地經致效細胞表面表現的Fc受體）之細胞， 包括（但非限於）淋巴細胞例如抗原呈現細胞以及T細胞。 本文之"Fe區域”意指IgG抗體的C-端區域，特定言 之爲該IgG抗體重鏈之c_端區域。雖然IgG重鏈Fc區域 的邊界可略變化，典型地Fc區域是定義成IGg重鏈之胺 基酸殘基Cys226至羧基端。

本文之"Kabat編號，，除非另行說明，是定義成使用EU -26- (21) 1328116 指數（參見 Kabat et al_ : Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National I n s t i t u t e s o f H e a 11 h, B e t h e s d a，M d . (1 9 9 1)，全文 在此倂入參考文獻），對IgG重鏈抗體的殘基編號。 本文之nFc受體"或"FcR”意指結合至抗體 Fc區域之 受體。結合至抗體（例如IgG抗體）Fc區域之代表性的Fc 受體包括（但非限於）FcyRI、FcyRII、及FcyRIII次級受體 ，包括對偶基因的變型以及此類受體替代接合的形式。Fc 受體之回顧可參見 Ravetch and Kinet，Annu. Rev. Immunol 9:45792(1991); Capel et a 1., Immunomethods 4:25-34 ( 1 994);以及 de Haas et al.，J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)。 I.免疫及治療試劑 本發明的免疫及治療試劑包含或由在此定義之免疫原 或抗體、或其功能的或抗原結合片段組成。基本的抗體構 造單位是習知的包含次單體之四合體。各四合體由二對相 同的多胜鍵組成，各對具有一個”輕"（約25 kD a)以及一個" 重”鏈（約5 0-70 kDa)。各鏈的胺基端部份包括約100至110 或更多個胺基酸之變異區，其可辨視抗原。各鏈的羧基端 部份爲恆定區，其具有致效劑功能》 輕鏈可分成ac或λ，長度約爲230個殘基。重鏈可分 成r 、μ、α ' <5、或ε ，長度約爲 450-600個殘基，以 及抗體之同功型可分別定義成IgG、IgM、Ig A、IgD以及 IgE。重及輕鏈可摺疊成結構區。本文之”結構區”意指蛋 -27- (22) 1328116 白質的球狀區域，例如免疫球蛋白或抗體。免疫球蛋白或 抗體結構區包括例如3或四個經；S -平板穩定的肽環以及鏈 間之雙硫鍵。完整的輕鏈具有例如二個結構區（VL以及 CL)以及完整的重鏈具有例如四或五個結構區（VH、CH1 、（:H2、及 CH3)。 輕鏈及重鏈內，變異及恆定區用大約12個或更多個胺 '基酸之” J "區域相聯，重鏈亦包括約多1 0個胺基酸之"D "區 •域 ° 參閱 Fundamental Immunology (Paul，W ., e d ., 2nd e d . Raven Press, N.Y.(1 989)，Ch. 7，全文在此并入參考文獻 ο 各輕/重鏈對之變異區可形成抗體結合部位。因此， 完整的抗體具有二個結合部位。除了雙功能或雙專一性抗 體之外，此二結合部位均相同》所有鏈均展現具有相對守 恆之架構區域（FR)的一般結構並聯結著三個高變異區（亦 稱爲互補性決定區域或CDR)。天然的鏈或重組製作的鏈 鲁可與前導序列一起表現，經細胞的加工作用移除前導序列 後可產生成熟的鏈。亦可用非天然前導序列重組的製作成 熟的鏈，以增進分泌或改變特定鏈的加工。 ’經架構區域校準之各對取自二個鏈的CDR，可結合 至專一性的抗原決定部位。從N-端至C-端，此輕鏈及重 鏈包含 FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 以及 FR4 結構區。在此技藝中"FR4”亦稱爲變異重鏈之D/J區域以 及變異輕鏈之J區域。各結構區胺基酸的編號係依據 Kabat 之定義（Sequences of Proteins of Immunological -28- (23) (23)1328116

Interest > National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1 98 7 and 199)。另一定義構造的的方法可參見chothia et al., J. Mol. Biol. 1 9 6:90 1 (1 987); Nature 342:878( 1 989); and J· Mol. Biol· 1 86:65 1 ( 1 98 9)(以下統稱"chothia et al.” 以及全文在此并入參考文獻）。 A. A0抗體 本發明治療劑包括專一性結合至AyS或澱粉樣蛋白斑 之其它成份的抗體。較佳的抗體是單株抗體。一些該抗體 可專一性結合至AyS的聚集形式而不會結合至可溶性形式 。一些該抗體可專一性結合至可溶性形式而不會結合至聚 集的形式。一些該抗體可結合至聚集的以及可溶性形式。 用於治療方法的抗體，較佳者具有完整的恆定區或至少可 與Fc受體交互作用之充分的恆定區。較佳的抗體可有效 的刺激經 F c -調節的蛋白斑中a θ之吞噬作用。人類同功 型IgGl是較佳的，因爲它是與吞噬細胞（例如位於腦部之 巨噬細胞或微神經膠質細胞）的FcRI受體具有最高親和力 的人類同功型抗體。人類的IgGl相當於鼠科動物的 IgG2a，如此後者係適用於在老年痴呆症的動物（例如小鼠 )模式中測試活體內功效。亦可用雙專一性Fab片段，其 中抗體的一臂具有ΑΘ的專一性，另一臂具有Fc受體的 專一性。較佳的抗體結合至A0的結合親和力大於（或等 於）1〇6、107、108、1〇9、或1〇1〇 Μ、包括此類數値中間値 的親和力）^ A冷內單株抗體結合的專一性抗原決定部位可爲構像 -29- (24) 1328116 的或非構像的抗原決定部位。可使用導Λ外來基因的動物 模式程序（描述於實施例）測試抗體的預防性及治療性功效 。較佳的單株抗體結合至A /3內殘基1 _ 1 G的抗原決定部位 .(天然A θ N-端的第一個殘基指定爲1)，更佳者結合至A/3 內殘基3-7的抗原決定部位。在一些方法中，可使用對不 同抗原決定部位具結合專一性的多重單株抗體，例如共同 ~ 投用對A/3內殘基3-7的抗原決定部位具有專一性的抗體 φ及對A /3內殘基3-7的抗原決定部位之外具有專一性的抗 體。該抗體可連續地或同時的投用。亦可用對抗A/3澱 粉樣蛋白成份以外之抗體（例如投用或共同投用）。 可用例如形成噬菌體顯示基因庫（其中不同成員顯示 不同Α Θ次序列），測定抗體對抗原決定部位之專一性》 然後選擇噬菌體顯示基因庫中與測試抗體專一結合的成員 。分離該序列之家族。典型地，該家族含有共同的核心序 列’以及不同成員有不同長度的鄰接序列。顯示能專一結 鲁合至抗體之最短核心序列即定義爲抗體抗結合的原決定部 位。抗體亦可用已測定過抗原決定部位專一性的抗體經由 競爭測定測試抗原決定部位之專一性。例如，與1 2 B 4抗體 競爭結合Αβ的抗體，可結合至與12B4相同或相似的抗原 決定部位（即A /3之殘基3 -7)。篩選抗體的抗原決定部位專 一性可用於預測治療的功效。例如經測定可結合至A点殘 基1-7的抗原決定部位之抗體，可有效的依據本發明方法 預防及治療阿茲海默氏症。 專一性結合至Αβ較佳片段而不結合ΑΘ其它區域的 -30- (25) (25)1328116 抗體，相對於結合至其它區域的單株抗體或結合至完整 A召的多株血清有許多優點。第一，在相等質量劑量下， 專一性結合至較佳片段的抗體之劑量含有可有效清除澱粉 樣蛋白斑的較高抗體莫耳濃度劑量。第二，專一性結合至 較佳片段的抗體可誘發清除反應對抗澱粉樣蛋白沈澱物而 不會誘發清除反應對抗完整的APP多肽，從而降低可能 產生的副作用。 1.非人類抗體之生產 本發明的特色是非人類抗體，例如對本發明較佳的 Αβ抗原決定部位具有專一性的抗體。該抗體可用於調製 本發明的各種治療組成物，較佳者提供互補性決定區域以 產生人類化的或嵌合型的抗體（詳細描述於下）。用 Α点對 動物進行免疫可產生非人類單株抗體，例如：鼠科動物、 天竺鼠、靈長類動物、兔子或大白鼠。亦可用包含AyS或 A召產生免疫性的片段之較長多肽或抗AyS抗體特異型的 抗體。參閱上述Harlow & Lane supra之參考文獻，全文 在此并入參考文獻。該抗原可得自天然的來源、肽合成或 重組表現。該抗原視需要可與運載蛋白融合或複合後投用 (敘述如下）。視需要該抗原可與佐劑投用。本文之"佐劑” 意指當與抗原倂用後可增加抗原之免疫反應的化合物，但 當單獨投用時則不會對抗原產生免疫反應。佐劑可增加數 個機制之免疫反應，包括徵募淋巴細胞、刺激B及/或T 細胞、以及刺激巨噬細胞。可使用下述許多類型之佐劑。 免疫實驗動物宜使用完全的Freund's佐劑接著使用不完 -31 - (26) 1328116 全的佐劑。 一般係用兔子或天竺鼠製作多株的抗體。製備多株的 抗體用於例如被動性的保護作用，其進行方法如下β將 125隻非導入外來基因的老鼠用100微克 Α泠1-42、加上 CFA/IF A佐劑進行免疫反應，以及在4-5個月後安樂死。 收集免疫小鼠的血液。從血液中分離IgG。用親和層析法 '局部地純化具有抗原專一性的抗體。每隻小鼠平均得到約 鲁0.5-1毫克之抗原專一性的抗體，總共得到60- 1 20毫克。 一般用小鼠製作單株抗體。對小鼠注射Αβ片段或較 長的形式、製備融合瘤以及篩選產生可專一性結合至Α召 的抗體之融合瘤可製備對抗Αβ片段之單株的抗體。可視 需要篩選結合至Α/5專一性區域或所要求的片段，而不結 合至其它Α0非重疊片段之抗體。後一篩選可經決定抗體 對A 0肽刪除突變體集合之結合以及決定結合至抗體的刪 除突變體而加以完成。結合可用例如西方轉漬法或ELISA •加以評估。顯示專一性結合至抗體的最小片段即可定義抗 體之抗原決定部位。此外，抗原決定部位的專一性可經競 爭測定（測試及參考抗體競爭對A点之結合）加以測定。若 測試以及參考抗體可相互競爭，則彼可結合至相同的抗原 決定部位或近到結合一個抗體可干擾其他抗體結合之抗原 決定部位。該抗體較佳的同功型是小鼠同功型IgG 2a或 其它物種相當的同功型。小鼠同功型IgG 2A相當於人類 同功型IgG 1(例如人類IgG 1)。 2.嵌合型以及人類化的抗體 -32- (27) 1328116 本發明的特色亦是/3殿粉樣蛋白肽專一性嵌合型及/ 或人類化的抗體（即嵌合型及/或人類化免疫球蛋白）。嵌合 型及/或人類化的抗體與提供起始材料構築嵌合型或人類 化抗體的小鼠或其它非人類抗體具有相同或相似的結合專 . 一性及親和力。 • 0 A. 嵌合型抗體之產生 本文之"嵌合的抗體思指經^•傳工程從不同物種之免 疫球蛋白基因片段構築輕鏈及重鏈基因之抗體。例如鼠單 φ 株抗體的變異（V)片段基因可爲相聯至人類例如lgG1以及 IgG4的恒定的（C)片段。較佳者爲人類同功型IgGl。如此 有代表性的嵌合型抗體爲雜種蛋白質，其係由小鼠抗體之 V或抗原結合結構區以及人類抗體之C或致效劑結構區組 成。 B. 人類化抗體的產生 本文之”人類化的抗體”意指包含至少一個包含實質上 取自人類抗體（稱爲受體免疫球蛋白或抗體）鏈變異區架構 鲁 殘基的鏈以及至少一個取自小鼠抗體（稱爲供體免疫球蛋 ψ 白或抗體）實質上之互補性決定區域的抗體。參閱，Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1 0029- 1 003 3 ( 1 98 9) ' US 5,5 3 0,1 0 1 ' US 5,5 8 5,089 ' US 5,693,76 1 ' US 5,69 3,762、Selick et al.、WO 90/0786 1、及 Winter，US 5,225,539(全文在此并入參考文獻）。恆定區（若有的話）亦 實質上或完全地取自人類免疫球蛋白。 若人類的變異結構區架構與小鼠變異架構（原本的 -33- (28) 1328116 C D R s)有相同或相似的構像，則將小鼠c D R s取代成人類 變異結構區架構最能保留正確的空間定向。經由得到人類 抗體變異結構區，可使其架構序列與原本鼠科動物CDRs 之變異架構結構區之序列展現高度相似性。重及輕鏈變異 架構區域可源自相同或不同的人類抗體序列。人類抗體序 列可爲天然人類抗體序列或可爲許多人類抗體的共識性序 歹IJ 。參閱 Kettleborough et a 1., Protein Engineering 4:773(1991)； Kolbinger e t a 1., Protein Engineering 6:97 1 ( 1 993 )以及 Carter et al·，WO 92/22 6 5 3。 確認鼠科動物供體免疫球蛋白及適當的人類受體免疫 球蛋白之互補性決定區域後，下一步驟則是測定此類成份 中是否有任何殘基應經取代以最適化產生的人類化抗體的 性質。一般而言，用人類胺基酸殘基取代鼠科動物胺基酸 殘基應能將副作用減至最低，因爲引入鼠科動物殘基會增 加抗體之風險，引起人類之人類-抗·小鼠-抗體（HAMA)反 鲁應。進行決定免疫反應之技藝確認方法爲監視特定病患或 於臨床試驗期間的HAMA反應。投用人類化抗體的病人 可在該治療開始時及治療期間進行產生免疫性評估。測量 ' 病患血清樣品之HAMA反應（例如偵測抗人類化的治療的 試劑抗體），係使用在此技藝中習知的方法，包括表面電 漿共振技藝（BIACORE)及/或固相 ELISA分析。 可根據某些人類變異區架構殘基之胺基酸對CDR構 像及/或結合至抗原的可能影響而選擇彼進行取代。非天 然的倂列鼠科動物CDR區域與人類變異架構區域可產生 -34- (29) (29)1328116 非天然的構像限制，除非經某些胺基酸殘基取代的校正否 則會導致結合親和力流失》 取代胺基酸殘基之選擇係用電腦模式（部份地）加以測 定。在此將描述產生免疫球蛋白分子三度空間影像之電腦 硬體及軟體。一般而言，製作分子模式是從免疫球蛋白鏈 或其結構區經解析的構造開始。將要進行模式化的鏈與解 析三維結構的鏈或結構區，進行胺基酸序列相似性比較， 以及選擇顯示最大測試序列相似性之鏈或結構區作爲構築 分子模式的起點。選擇至少50%序列相似性，較佳者係選 擇至少 60%、70% ' 80%、90%序歹IJ相似性或90%以上之 鏈或結構區進行模式化。解析後的起始構造經修飾後可允 許與免疫球蛋白鏈或結構區，以及與起始結構中有實際差 異的胺基酸被模式化。然後將經修飾之構造組裝成免疫球 蛋白組合物。 最後’用能量最小化以及證實所有原子相互地位於適 當的距離之內以及鍵長及角度位於化學可接受的限制之 內加以精煉模式。 選擇取代之胺基酸殘基，亦可經檢驗特定位置胺基酸 之特性’或以經驗觀察取代或誘變特定胺基酸的效應加以 測定（部份地）。例如，當鼠科動物變異區架構殘基與選擇 的人類變異區架構殘基胺基酸不同時，通常人類架構胺基 酸應經小鼠抗合理預測之相等的體架構胺基酸取代： (1) 直接經非共價鍵結合抗原的胺基酸， (2) 相鄰CDR區域的胺基酸， -35- (30) 1328116 (3)與CDR區域交互作用（例如經電腦模式測定在CDR區 域內約3-6A)之其它胺基酸，或 (4)參與VL-VH界面的胺基酸。 . ”直接經非共價鍵結合抗原的"殘基包括在架構區域位 置之胺基酸，其有良好的或然率直接與依據建立的化學力 (例如：氫鍵、凡得瓦爾力、疏水性交互作用等）位於抗原 上的胺基酸交互作用。 φ CDR以及架構區域定義於上述之 Kabat et al.或

Chothia et al·。當架構殘基（定義於上述Kabat et al.)構成 構造的環形殘基（定義於上述之Chothia et al.)，可選擇存 在於小鼠抗體之胺基酸對人類化的抗體進行取代。"相鄰 CDR區域的”殘基包括位置立即相鄰人類化免疫球蛋白鏈 一級序列之一個或多個CDR的胺基酸殘基，例如位置立 即相鄰至CDR(定義如Kabat)，或CDR(定義如Chothia)的 殘基（參閱例如 Chothia and Lesk JMB 196:901(1987))。此 •類胺基酸尤其是可能與CDR之胺基酸交互作用，並可扭 曲供體CDR及降低親和力（若其係選自受體）。此外，相 鄰的胺基酸可與抗原直接交互作用（Amit et al., Science， 23 3:747( 1 986)，全文在此倂入參考文獻）且從供體選擇此 類胺基酸可令人滿意的保持所有在原始抗體中提供親和力 的抗原接觸點。 "其它與CDR區域交互作用"的殘基包括那些經二級 結構分析測定顯示空間性定向足以影響CDR區域的殘基 。具體實施例之一中，”其它與CDR區域交互作用”的殘 -36- (31) (31)1328116 基係經供體免疫球蛋白三度空間模式（例如電腦產生之模 式）分析加以確認。三度空間模式（典型之原始的供體抗體 )顯示CDR外面之某些胺基酸緊鄰CDRs，且極易經氫鍵 、凡得瓦爾力、疏水性交互作用力等與CDR胺基酸交互 作用。在那些胺基酸位置上，可選擇供體免疫球蛋白的胺 基酸（而不是受體免疫球蛋白的胺基酸）。依據此標準之胺 基酸一般而言具有之側鏈原子與CDR內之一些原子相鉅 約爲3埃單位（A)之內且必須含有可依據建立的化學力（例 如上述）可與CD R原子交互作用之原子。 當原子可形成氫鍵，其原子核之間相距3 A，但原子 不形成一種鍵結，其凡得瓦爾表面之間相距3 A。因此， 在後者之實例中原子核必須相距約6 A之內（3 A加上凡得 瓦爾半徑之總和）才可考慮原子能交互作用。在許多案例 中原子核將相距4或5至6人。在決定胺基酸是否可與CDR 交互作用時，不宜考慮CDR部份之重鏈CD R2的最後8個 胺基酸’因爲基於結構之觀點，此8個胺基酸更像是架構 的部份。 能與CDR胺基酸交互作用之胺基酸，可用另—方法 確認。各架構胺基酸溶劑可接近的表面積可用二種方法計 算：（1)完整的抗體，以及（2)假設的分子其係由移除CDR 的抗體組成。此類數目之間顯著的差別約爲1 〇埃平方或更 多，顯示架構胺基酸接近溶劑至少部份被CDR阻塞，因 此該胺基酸係與CDR接觸。胺基酸之溶劑可接近的表面 積’可根據抗體三度空間之模式使用技藝上已知的算則（ -37- (32) 1328116 例如 Connolly, J. Appl. Cryst. 16:548(1983)以及 Lee and Richards, J. Mol. Biol. 55:379( 1 97 1 )，全文在此倂入參考 文獻）計算。架構胺基酸亦可偶爾與CDR間接的交互作用 ,，其係經影響另一架構胺基酸之構像因而接觸到CDR。 已知架構上許多位置之胺基酸能與許多抗體之CDR 交互作用（Chothia and Lesk，supra, Chothia et a 1., supra and Tramontano et al.，J. Mol. Biol. 215:175(1990)-全文 φ在此倂入參考文獻）。注意，已知輕鏈位置2、48、64及71 以及重鏈26-3 0、71以及94(依據 Kabat編號）的胺基酸爲 能與許多抗體之CDR交互作用。輕鏈置35以及重鏈93及 103之胺基酸亦可能與CDR交互作用。在所有此類編號的 位置，當供體胺基酸與受體胺基酸彼此不同時，人類化免 疫球蛋白宜選擇供體胺基酸（而不是受體胺基酸）。另一方 面，某些殘基能與CDR區域交互作用，例如有時可選擇 受體免疫球蛋白輕鏈之前5個胺基酸而不喪失人類化免疫 φ球蛋白之親和力。 "參與VL-VH界面"之殘基或"裝塡殘基"包括介於VL 及 VH界面間之殘基，定義於例如Novotny and Haber， Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-66( 1 985)或上述之 Chothia et al。一般而言，人類化的抗體中應保有獨特的 裝塡殘基（若彼與人類架構殘基不同 —般而言，符合上述標準之一個或多個胺基酸已被取 代。在某些具體實施例中，所有或大部份符合上述標準之 胺基酸已被取代。偶爾，特定的胺基酸是否符合上述標準 -38- (33) (33)1328116 仍有一些模糊，所以製作另一變型免疫球蛋白時有的帶有 特定的取代，其他的則否。如此製作之另一變型免疫球蛋 白，可用在此描述之任何測定測試所要求的活性，以及選 擇較佳的免疫球蛋白。 通常人類化抗體的CDR區域實質上相同，以及更通 常的是與供體抗體對應的CDR區域相同。雖然不是必要 ，但有時可能用一個或多個保留性胺基酸取代CDR殘基 而不影響產生的人類化免疫球蛋白之結合親和力。保留性 取代的組合預期爲’例如gly, ala; val, ile, leu; asp, glu ;asn, gin ； ser, thr ； lyS, arg ；以及 phe, tyr〇 其他種取代候選者爲人類免疫球蛋白在此位置獨特的 或”稀少的"人類受體架構胺基酸。此類胺基酸可經小鼠供 體抗體相等位置之胺基酸或經更有代表性的人類免疫球蛋 白相等位置之胺基酸取代。例如，當人類受體免疫球蛋白 架構區域此位置之胺基酸是稀有的胺基酸以及供體免疫球 蛋白對應的胺基酸與此位置之人類免疫球蛋白序列相同時 則適宜進行此取代：或當此位置之受體免疫球蛋白之胺基 酸以及供體免疫球蛋白對應的胺基酸相對的至其它人類序 列亦爲稀有的胺基酸時則適宜進行此取代。此類標準可輔 助確保人類架構中非典型的胺基酸不會破壞抗體結構。此 外’經有代表性的人類抗體之供體抗體胺基酸取代獨特 的人類受體胺基酸，可製作降低產生免疫性之人類化抗體 〇 本文之"稀少的"意指發生在此序列位置之胺基酸約少 -39- (34) I32S116 於代表性序列樣本之20%但通常約少於l〇%，本文之"共同 的"意指發生之胺基酸約大於代表樣本序列之25%但通常 大於約50%。例如，所有人類之輕鏈及重鏈變異區序列可 .分別區分成序列"亞類"，其係相互同源以及在某些關鍵性 的位置具有相同胺基酸（上述之Kabat et al.)。當在人類序 列之中決定人類受體序列胺基酸是否爲”稀少的"或"共同 的"胺基酸時，經常宜僅考慮受體序列中相同亞類之人類 序列。 額外的取代候選者是人類受體架構胺基酸，其爲上述 Chothia et al.定義確認之CDR區域的一部份。額外的取 代候選者是人類受體架構胺基酸，其以AbM及/或接觸之 定義確認的CDR區域之一部份。 額外的取代候選者爲受體架構殘基，其係相應於稀有 的或獨特的供體架構殘基。稀有的或獨特的供體架構殘基 爲鼠科動物抗體此位置稀有的或獨特的（本文之定義）。鼠 擊科動物抗體中，亞類之測定可依據Kabat及確認不同共識 性之殘基位置。此類供體特定的差異可爲增進鼠科動物序 列活性的軀體突變點。保留預測可影響結合的獨特殘基， 而預測爲不重要的結合殘基可經取代》 其他種取代候選者爲發生在受體架構區域之非種系殘 基。例如，當受體抗體鏈（即與供體抗體鏈分享顯著的序 列相似性之人類抗體鏈）校整至種系抗體鏈（同樣地與供 體鏈分享顯著的序列相似性）時，受體鏈架構與種系鏈架 構之間不配對之殘基可經種系序列對應的殘基取代。 -40- (35) (35)1328116 除了以上討論的特定胺基酸取代之外，人類化免疫球 蛋白架構區域通在常實質上相同，以及更通常的是與彼源 自之人類抗體架構區域相同。當然了，許多架構區域之胺 基酸對抗體之專一性或親和力少有或沒有直接地貢獻。因 此，許多架構殘基個別地保留性取代是可耐受而未可觀的 改變產生的人類化免疫球蛋白的專一性或親和力。因此， 在具體實施例之一中人類化免疫球蛋白變異架構區域與 人類變異架構區域序列或該序列之共識性序列共享至少 8 5 %之序列相似性。在另一具體實施例中，人類化免疫球 蛋白變異架構區域與人類變異架構區域序列或該序列之 共識性序列共享至少9 0 %、較佳者9 5 %、更佳者9 6 %、9 7 % 、9 8 °/。或9 9 %之序列相似性。然而一般而言該取代是不必 要的。 人類化的抗體較佳者展現與抗原專一性結合親和力至 少爲1 07、1 08、1 0或1 Ο1%·1。通常人類化的抗體與抗原結 合親和力之上限在供體免疫球蛋白的三、四或五倍之內。 通常結合親和力之下限亦在供體免疫球蛋白的三、四或五 倍之內。此外’其結合親和力與無取代的人類化抗體（例 如具有供體CDR及受體FR，但無FR取代之抗體）相似。 在該實例中，優選的抗體（經取代）之結合較佳者比未經 取代的抗體至少大二至三倍，或大三至四倍。比對時，可 測定各種抗體之活性，例如經B IA C 0 R E (即用未標記的試 劑進行表面電漿共振）或競爭性的結合測定。 C.產生人類化的12B4抗體 -41 - (36) 1328116 本發明較佳的具體實施例的特色是對抗ΑβΝ-端的人 類化抗體，特定言之，應用在此描述的方法進行治療及/ 或診斷。產生人類化的抗體尤佳的起始材料爲12Β4。 12Β4對A/3之Ν-端具有專一性以及已展示可間接中介澱 粉樣蛋白斑之呑噬作用（例如誘發吞噬作用）。編碼12B4抗 體重及輕鏈變異區之選殖及cDNA定序描述於實施例I。 ‘經電腦比對小鼠變異區胺基酸序列與習知的人類抗體 φ序列確認適當的人類受體抗體序列。分別地進行重及輕鏈 之比對，但原理相似。特定言之，經使用 NCBI BLAST( 經 National Institutes of Health NCBI 網際網路伺服器公 開存取）以各鼠科動物架構序列詢問Kabat資料庫以確認 人類抗體其架構序列與鼠科動物VL及VH架構區域展 現高度序列相似性之各種結構區。具體實施例之一中，選 擇與鼠科動物供體序列共享大於50%序列相似性之受體序 列。較佳者，選擇共享6 0 %、7 0 %、8 0 %、9 0 %或以上之受 Φ體抗體序列。 電腦比較12B4後揭露12B4輕鏈與人類輕鏈次型/c II 顯示最大的序列相似，1 2 B 4重鏈與人類重鏈次型11顯示 最大的序列相似，如上述之Kabat et al.定義。因此，人 類架構區域之輕鏈及重鏈宜源自此類次型，或該次型共識 性序列之人類抗體。與1 2B4對應的區域顯示最大的序列相 似的較佳輕鏈人類變異區爲Kabat ID號碼005036之抗體 。與1 2B4對應的區域顯示最大的序列相似的較佳重鏈人類 變異區爲Kabat ID號碼000333之抗體，Genbank寄存編號 -42- (37) (37)1328116 AAB 3 5 009之抗體、及 Genbank寄存編號之抗體，以 Kabat ID號碼0003 3 3之抗體爲最佳的抗體。 接著選擇取代的殘基如下。當12B4變異架構區域與以 及相當之人類變異架構區域之胺基酸不同時，人類架構 胺基酸通常應經以下合理預期之相當的小鼠胺基酸取代： (1) 直接經非共價鍵結合抗原的胺基酸， (2) 相鄰CDR區域、在上述Chothia et al.提出之另 一定義的CDR區域之一部份 '或其它與CDR區域交互作 用（例如約CDR區域3A內）的胺基酸，或 (3) 參與VL-VH界面的胺基酸。 電腦模式化1 2B4抗體重及輕鏈變異區，以及人類化 之12B4抗體描述於實施例IV。簡言之，三度空間模式之 產生係基於最接近的解析鼠科動物抗體重及輕鏈構造。此 模式可經一系列能量最小化步驟以減少不利的原子接觸以 及最適化靜電的及凡得瓦交互作用進一步的精煉。 在此描述的抗體之三度空間構造資料可公開得自例如 Research Collaboratory for Structural Bioinformatics' Protein Data Bank(PDB)。PDB可經網際網路自由存取， 描述於 Berman et al.(2000) Nucleic Acids Research, 28J 3 5 -242。電腦模式化可鑑定與CDR-交互作用之殘基 。電腦模式之1 2B4結構可作爲預測經人類架構構造取代的 內含12B4互補性決定區域之抗體的三維結構之起始點。可 構築額外的模式以代表進一步引入取代胺基酸的結構。 —般而言’須要取代符合上述標準之一個、大多數或 -43- (38) 1328116 所有的胺基酸。據此，本發明的人類化抗體通常將含有 至少對應至1、2、3或更多個12B4選擇位置殘基之取代的 人類輕鏈架構殘基。人類化抗體通常將含有至少對應至 .1、2、3或更多個12B4選擇位置殘基之取代的人類重鏈架 構殘基。 然而偶爾，特定的胺基酸是否符合上述標準仍有一些 ’模糊，所以製作另一變型免疫球蛋白時有的帶有特定的取 •代’其他的則否。例如用鼠科動物殘基取代時將引進在人 類免疫球蛋白特定的位置爲稀有的殘基，其可用含或不含 特定的取代時之活性令人滿意的對抗體進行測試。若含或 不含取代者之活性（例如結合親和力及/或結合專一性）大約 相同’則以未取代之抗體爲爲較佳，因爲其引起之預期的 在此描述之HAMA反應將較小。 其他的取代候選者爲人類免疫球蛋白在此位置獨特的 人類受體架構胺基酸。此類胺基酸可經更有代表性的人類 •免疫球蛋白相當位置之胺基取代。此外，當該胺基酸爲有 代表性的人類免疫球蛋白在相當位置之胺基酸時，則可在 小鼠12B4相當位置可引入此人類架構區域胺基酸。 其它的取代候選者爲發生在架構區域之非種系殘基》 將 1 2B4與習知的種系序列進行電腦比較時可確認與重鏈 或輕鏈具有最大程度序列相似性之種系序列。對準架構區 域與種系序列將透露可選擇那一個殘基可用對應的種系殘 基取代。在選擇性輕鏈受體架構中可選擇與此類種系序 列不配對之殘基並用對應的種系殘基加以取代。 -44- (39) (39)1328116 表1總結1 2 B 4 V Η以及V L區域之序列分析。該表列出 可作爲電腦模式化12B4抗體及額外的人類抗體之額外的小 鼠以及人類構造與可用於進行選擇性胺基酸取代之種系序 列。表1亦提出稀有的小鼠殘基。比較供體V L及/或V Η 序列與其它亞類成員供體VL及/或VH序列之序列（依據 Kabat)可確認稀有的小鼠殘基以及確認不同共識性的殘基 位置。此類供體專一性差異可爲增進活性的軀體突變位點 。接近結合部位之獨特的或稀有的殘基可能與抗原接觸， 所以是小鼠殘基中要保留的殘基。然而，若獨特的小鼠殘 基並非重要的結合殘基，則宜使用對應的受體殘基，因爲 人類化的抗體中小鼠殘基可創造產生免疫性的新抗原決定 部位。在供體序列獨特的殘基實質上是對應的受體序列共 同的殘基之情況下，較佳的殘基是受體的殘基。 -45- (40) 1328116 表1.12B4V區域序列之摘要 鏈 VL VH 小鼠亞類 II lb 人類亞類 II II 稀有的胺基酸 K 1 0 7 (0.5 4 2 %) T3，L11,L12,F24, (頻率％) S4 1 ,N75 ,D83 , A85 Chothia標準的 L1 :-分類 4[lrmf] HI :分類[lggi] 分類 L2 :分類 1 [ 1 lmk] L3 :分類 l[ltet] H2 :-分類1 最接近的小鼠 MAb經解析的 結構 2PCP(2.2 A) 1ETZ(2.6A) 模式化模版之同 源現象 94% 8 0% 人類架構seq KABID 00503 6 1 -KABID 0003 3 3 2-AAB3 5009/ 1 F7 3 -AAD5 3 8 1 6 Hu Fr之參考種 A3/x 12690 & 1 :VH43 9/AB0 1 9439 系 A 1 9/X63 397 /BAA7503 6.1 2 :VH25/AB0 1 9440/ BAA7505 7.1 本文之參考Kabat ID序列可公開取得’例如得自 Northwestern University Biomedical Engineering -46 - (41) (41)1328116

Department's Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest。在此描述的抗體之二度空間構造 資料可公開取自例如 Research Collaboratory for Structural Bioinformatics' Protein Data Bank(PDB)。PDB 可經網際網路自由存取，描述於 Berman et al.(2000) Nucleic Acids Research，p23 5-242。本文之參考種系基因 序列可公開的取得，例如得自收集Igh、Ig /c以及Ig Λ種 系 V 基因之 National Center for Biotechnology Information(NCBI)序歹 U 資料庫（位於 National Institutes of Health(NIH)之 National Library of Medicine(NLM)的部門 )。可用IgG BLASTTM搜尋 N C B I” I g種系基因"資料庫之 同源現象 。 在較佳的具體實施例中，本發明的人類化的抗體含有 ⑴包含各種結構區、包含鼠科動物12B4VLCDR及人類受 體架構、至少一個殘基經對應的1 2B4殘基取代的架構之輕 鏈以及（Π)包含12B4VHCDR及人類受體架構、至少一個， 較佳者二、三、四、五、六、七、八、或九個殘基經對應 的12B4殘基取代的架構、以及可視需要至少—個，較佳者 二或三個殘基經對應的人類種系殘基取代的重鏈。 在尤較佳的具體實施例中，本發明的人類化抗體具有 在此描述的構造特色’並進一步的具有至少一個（較佳者 二、三、四個或所有）下列活性：（1)結合可溶性A)S ; (2) 結合聚集的A点1-42(例如經ELISA測定）：（3)結合蛋白斑 中之A石（例如染色AD及/或PDAPP斑）：（4)當相較於嵌 -47- (42) 1328116 合型12B4(例如具有鼠科動物變異區序列以及人類恆定區 序列之12B4)以二至三倍的較高的結合親和力結合A/3 ; (5)間接中介A ^之吞噬作用（例如在此描述的體外吞噬作 用檢測法）；以及（6)通過血腦屏障（例如於在此描述之 PDAPP動物模式中顯示短期之腦定域作用）。 在另一具體實施例中，本發明的人類化抗體在此描述 ‘的構造特色可結合Αβ或具有足以引起至少一個下列活體 φ內效應之親和力：（1)降低Α/3蛋白斑含量；（2)預防蛋白 斑形成；（3)降低可溶性A /3之含量；（4)降低與成澱粉樣 病症相關的神經病理學；（5)減輕或改善至少一個與成澱 粉樣病症相關的生理症狀；及/或（6)改良認知的功能。 在另一具體實施例中，本發明的人類化抗體具有在此 描述的構造特色，並專一性結合至包含A沒殘基3-7之抗 原決定部位。 在另一較佳的具體實施例中，本發明的人類化抗體具 鲁有在此描述的構造特色結合至八召之N-端抗原決定部位（ 例如結合至A A胺基酸3 -7之抗原決定部位），以及能降低 (1)A々肽之含量；（2)A^S蛋白斑之含量；以及（3)與成澱粉 樣病症相關的神經性負擔或神經炎性失調》 說明如上之活性可利用任何各種在此描述或在此技藝 中之測定方法（例如結合測定、吞噬作用檢測法等）進行測 定。活性測定可爲活體內測定（例如使用標記的測定成份 及/或影像技藝）或活體外測定（例如使用源自患者之樣品或 檢體）°活性測定可直接的或間接的測定。在某些較佳的 -48- (43) (43)1328116 具體實施例中，可測定神經終點（例如澱粉樣蛋白負擔量 、神經負擔等）。該測試終點可使用非侵入性偵測方法測 定活著的病患（例如對阿茲海默氏症之動物模式或人類病 患例如進行免疫療法）。此外該測試終點可在病患死後測 定。動物模式及/或人類病患死後之該測試終點測定可用 於評估各種藥劑（例如人類化的抗體）之療效以用於相似的 免疫治療的用途。其它較佳的具體實施例中，上述神經病 理的活性或測試終點可作爲指示劑以評估行爲或神經參數 〇 3. 產生變異區 槪念性的選擇CDR以及人類化免疫球蛋白的架構成 份後’可用各種方法產生該免疫球蛋白。因爲編碼之退化 現象，許多核酸序列可編碼各免疫球蛋白之胺基酸序列。 經全新固相DNA合成或PCR誘變先前製備的所要求的 多核苷酸變型可製作所要求的核酸序列。寡核苷酸調節的 誘變是製備目標多肽DNA之取代、刪除及插入變型的較 佳方法。參閱 Adelman et al.，DNA 2:183(1983)。簡言之 ，將所要求的突變之寡核苷酸編碼與單鏈DNA模版雜交 可改變多肽DNA。雜化後’使用DNA聚合酶合成該模版 含寡核苷酸引子之全部的第二互補股，以及在目標多肽 DNA編碼選擇的改變》 4. 選擇恆定區 將描述如上製作之抗體各種片段（例如嵌合的或人類 化的抗體之重及輕鏈變異區）一般聯結到至少部份之疫球 -49- (44) 1328116 蛋白恆定區（Fc區域）（一般爲人類免疫球蛋白）。人類恆定 區DNA序列可依據熟知的方法分離自各種人類細胞，但 較佳者爲永生的B細胞（參閱上述之Kabat et al.及Liu et al.，W08 7/0267 1 )(全文在此并入參考文獻）。最初抗體將含 有輕鏈及重鏈恆定區。重鏈恆定區通常包括CH1、樞紐、 CH2、CH3、及CH4區域。本文之抗體包括具有所有恆定 區型態之抗體，包括IgM、IgG、IgD、IgA以及IgE，以 φ及任何之同功型，包括IgGI、IgG2、IgG3以及IgG4。當 要求抗體（例如人類化的抗體）展現細胞毒性的活性時， 固定的結構區通常固定上固定的結構區，一般爲IgGl之 固定結構區。較佳者爲人類同功型IgGl。輕鏈恆定區可 爲A或/C。人類化的抗體可包含一種以上分類或同功型 之序列。表現的抗體可爲內含二個輕及二個重鏈之四合體 、分離之重鏈、輕鏈、Fab、Fab'F(ab')2、以及Fv、或重 及輕鏈各種結構區經由間隔物聯結的單鏈抗體。 • 5.表現重組抗體 嵌合型以及人類化的抗體一般是用重組表現製作。將 編碼人類化的輕鏈及重鏈變異區之核酸（可視需要聯結至 恆定區）插入表現載體。輕鏈及重鏈可選殖入相同或不同 的表現載體》編碼免疫球蛋白鏈之DNA片段可操作地聯 結的至表現載體之控制序列以確保免疫球蛋白多胜肽之表 現。表現控制序列包括（但非限於）：啓動子（例如天然的 相關的或異性的啓動子）、訊息序列、強化子元件、及轉 錄終止序列。較佳之表現控制序列是能轉形或轉染真核宿 -50- (45) (45)1328116 主細胞載體內之真核的啓動子系統。載體一旦倂入適當的 宿主後，將宿主維持在適於高水準表現核苷酸序列之條件 下，並收集及純化雜交反應抗體。 此類表現載體一般可在宿主生物體中以附加體的方式 或是以宿主染色體DN A的整體部份進行複製。通常表現 載體含有選擇標識（例如氨比西林抗性、潮黴素抗性、四 環素抗性、康黴素抗性或新黴素抗性）以偵測到轉形入所 要求的DNA序列的細胞（參閱例如 Itakura et al.，US 專 利 4,704，362)。 大腸桿菌是一種原核的宿主，尤其是可用於選殖本發 明之多核苷酸（例如DNA序列）。其它適用的微生物的宿 主包括芽孢桿菌，例如：枯草芽孢桿菌，以及其它腸桿菌 ，例如：沙門桿菌、沙雷氏菌屬、及各種假單胞菌。在此 類原核的宿主中，亦可使用含有與宿主細胞相容的表現控 制序列（例如複製起始點）之表現載體。此外，可存在有任 何數量之各種習知的啓動子，例如乳糖啓動子系統、色胺 酸（trp)啓動子系統、冷-內醯胺酶啓動子系統、或噬菌體 久之啓動子系統。一般啓動子將可控制表現，可視需要含 操作子序列，以及具有核糖體結合部位序列及其類似者， 啓動及完成轉錄及轉譯作用。 亦可用其它微生物，例如酵母菌進行表現。釀酒酵母 菌是較佳的酵母菌宿主，適當的載體具有所要求的表現控 制序列（例如啓動子）、複製起始點' 終止序列及其類似者 。有代表性的啓動子包括3-磷酸甘油酸激酶以及其它醣解 -51 - (46) I32S116 酵素。其他可誘發的酵母菌啓動子包括乙醇脫氫酶、異細 胞色素C、及利用麥芽糖及半乳糖之酵素的啓動子。 除了微生物，亦可用哺乳動物組織的培養細胞以表現 及產生本發明（例如編碼免疫球蛋白或其片段之多核苷酸） 之多胜肽。參閱 Winnacker，From Genes to Clones，VCH Publishers，N.Y., Ν·Υ·( 1 9 8 7)。真核細實質上較佳，因爲 ' 在此技藝中已發展出許多能分泌異性的蛋白質（例如完整 φ的免疫球蛋白）的適當宿主細胞株，包括CHO細胞株、各 種 Cos細胞株、HeLa細胞，較佳之骨髓癌細胞株、或轉 形的B細胞或融合瘤。較佳者爲非人類細胞。此類細胞之 表現載體可包括表現控制序列，例如複製起始點、啓動子 、及強化子（Queen et al.，Immunol. Rev. 89:49(1986))， 以及必須的加工資料位點，例如核糖體結合部位、RNA 剪接位、聚腺苷酸化作用位點、及轉錄的終止子序列。較 佳的表現控制序列是源自免疫球蛋白基因、SV40、腺病 馨毒、牛乳頭狀瘤病毒、巨細胞病毒等之啓動子。參閱Co et al·，JJ finmunol.1 48:1 1 49( 1 992) 0 此外，編碼抗體之序列可倂入導入基因，引入導入外 * 來基因動物的基因組以及後續的表現在導入外來基因動物 的牛奶中（參閱例如 Deboer et al·，US 5,741，9 5 7, Rosen, US 5,304,489，以及 Meade et al_，US 5,849,992)。適當的 導入基因包括輕及/或重鏈操作聯結乳腺專一性基因（例如 酪蛋白或/3乳球蛋白之啓動子及強化子的編碼序列。 內含重要的聚核苷酸序列（例如重及輕鏈之編碼序列 -52- (47) (47)1328116 以及表現控制序列）載體可取決於宿主細胞之型態用已知 的方法轉移入宿主細胞。例如原核細胞通常利用氯化鈣轉 染作用，而其他細胞宿主可使用磷酸鈣處理、電穿透作用 、轉脂作用、生物投射或病毒性的轉染作用。（參閱一般 而言 Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1 989)(全文在 此并入參考文獻）。其它用以轉形哺乳動物的細胞之方法 包括使用凝聚胺、原生質體融合、脂球體、電穿透作用、 及顯微注射（參閱上述之Sambrook et al·)。爲了產生基因 轉殖動物，導入基因可微注射入受精的卵母細胞，或可倂 入胚胎幹細胞的基因組，並將該細胞之細胞核轉移入除去 細胞核的卵母細胞。 當重及輕鏈分別的選殖入表現載體時，可共轉染載體 以表現及組裝完整的免疫球蛋白。一旦表現後，可依據技 藝之標準方法（包括硫酸銨沉澱、親和力管柱、管柱層析 法、HPLC純化、膠體電泳及其類似者，參閱 Scopes, Protein Puri fication(Springer-Verlag，N.Y. ,(1982))純化本 發明的全部抗體、其二聚物、個別地輕鏈及重鏈、或其它 免疫球蛋白形式。在醫藥學的用途上，較佳者爲至少約90 至95%均一性之相當純的免疫球蛋白，以及最佳者爲98至 99%或更多之均一性。 6.抗體片段 本發明範圍亦包括抗體片段。在具體實施例之一中提 供非人類片段’及/或嵌合型抗體。在另一具體實施例中 -53- (48) 1328116 提供人類化的抗體片段。一般此類片段與抗原專一性結合 之親和力至少爲107，以及更典型者爲108或10 9Μ」。人類 化的抗體片段包括分離之重鏈、輕鏈、Fab、Fab'F(abJ2 、Fabc、及Fv。片段之製作係經重組DNA技藝，或經酵 素的或化學的分離自完整的免疫球蛋白。 7. 在動物模式中測試抗體的治療功效 ^ 將一組7-9個月大的PDAPP小鼠各自注射0.5毫克之 鲁PBS的多株抗-A冷或專一性抗-A石單株抗體。將所有抗體 製劑純化至低內毒素之含量。對小鼠注射Α β片段或較長 的形式，製備融合瘤以及篩選產生可專一性結合至Α石所 要求的片段且不結合至其它ΑΘ非重疊片段的融合瘤以製 備對抗Αβ片段之單株的抗體。 將小鼠進行腹腔內注射4個月，維持血液循環中抗體 濃度經E LI S Α測量效價大於1 / 1 0 0 0 (經E LI S A定義之 A p42或其它抗原）。監測效價並將小鼠在注射6個月後安樂 鲁死。驗屍進行組織化學、Αβ之含量以及毒理學分析。每 組十隻小鼠。 8. 篩選抗體之清除活性 本發明亦提供方法，該方法篩選抗體清除澱粉樣蛋白 儲存物或任何其它抗原、或相關的生物物質所要求的清除 活性。爲了篩選對抗澱粉樣蛋白儲存物一之活性，將阿茲 海默氏症病患或具有老年痴呆症病理學特徵的動物模式的 腦組織樣本與帶有Fc受體的吞噬細胞（例如微神經膠質細 胞）接觸’以及在活體外之培養液中進行抗體測試。吞噬 -54- (49) (49)1328116 菌細胞可爲初級的培養細胞或細胞株，可源自鼠科動物（ 例如BV-2或C8-B4細胞）或人類（例如THP-1細胞）。在一 些方法中，在顯微鏡載玻片上合倂各成份以增進微觀的監 測。在一些方法中，在微孔盤同時進行多重反應。在該方 法中，用不同的小的顯微鏡載玻片覆蓋可不同的孔，或可 用非微觀的偵測方法，例如用E LIS A偵測A /3。較佳者 ，測定一系列活體外反應混合物的澱粉樣蛋白儲存物含量 ，從進行反應前之基線値開始，於反應期間測試一個或多 個測試値。抗原可用染色偵測，例如用螢光標記的A万或 其它澱粉樣蛋白斑成份之抗體。用於染色之抗體可或不可 與測試清除活性的抗體相同。相對於基線，反應期間澱粉 樣蛋白沈澱物降低可顯示測試抗體有清除的活性。該抗體 可能可用於預防或治療老年痴呆症以及其它呈澱粉樣疾病 。尤其適用於預防或治療老年痴呆症以及其它呈澱粉樣疾 病的抗體包括能清除緊密及擴散之澱粉樣蛋白斑的抗體， 例如本發明之12B4抗體、或其嵌合型或人類化的版本。 可用同功的方法以篩選具有清除其它生類型物物質活 性的抗體。該測定可用以偵測對抗實際上任何生物物質的 清除活性。典型地生物物質在人類或動物疾病中具有一些 角色。生物物質可爲組織樣本或分離形式。若爲組織樣本 ，該組織樣本宜未經固定，以允許接近組織樣本成份並避 開固定對成份之構像所造成之干擾。此測定可測試之組織 樣品實施例包括癌症組織、前癌症組織、內含良性的生長 物之組織例如疣或黑痣、感染病理微生物的組織、浸潤發 -55- (50) 1328116 炎性細胞的組織、細胞之間帶有病理介質（例如纖維蛋白 化的心包炎）的組織、帶有異常抗原的組織、以及傷疤組 織。可用之分離生物物質的實施例包括ΑΘ、病毒性的抗 原或病毒、蛋白多糖、其它病理微生物的抗原、腫瘤抗原 、以及黏連分子。該抗原可得盾天然的來源、重組表現或 " 化學的合成等。將組織樣本或分離生物物質與帶有 Fc受 ^ 體的吞噬細胞（例如單核白血球或微神經膠質細胞）接觸， φ並在培養液中測試抗體。在測試中抗體可直接的對抗生物 物質或與生物物質相關的抗原。後一情況下，測試的目標 是生物物質與抗原是否被吞噬。通常，雖然不必然地， 抗體以及生物物質（有時與相關的抗原）在添加入呑噬細胞 之前相互接觸。然後監測生物物質及/或相關的抗原殘留 在培養液中之濃度（若有的話）。降低培養液中抗原或相關 的生物物質之量或濃度，意指抗體與具呑噬細胞具有對抗 抗原及/或相關的生物物質之清除反應（參閱例如實施例 • N) 〇 9.嵌合的/人類化的抗體其具有改變致效劑之功能 包含恆定區（Fc區域）的上述本發明抗體，亦可令人滿 ‘意的改變分子致效劑之功能。一般而言，抗體之致效劑功 能位於分子固定的或Fc區域，其可間接中介各種致效劑 分子（例如補體蛋白或Fc受體）之結合。補體與Fc區域之 結合是重要的，例如調理以及溶解細胞病原體以及活化發 炎反應。抗體結合至Fc受體，例如致效細胞之表面可觸 發許多重要的以及各樣的生物的反應，包括例如卷呑及破 -56- (51) (51)1328116 壞塗覆抗體的病原體或顆粒、清除免疫複合體、經殺手細 胞溶解塗覆抗體的目標細胞（即抗體依存的經細胞調節的 細胞毒性，或ADCC)、釋放發炎性的調控物、胎盤轉移 抗體、及控制免疫球蛋白產生。 據此，取決於特定的治療的或診斷的用途，須要上述 的免疫功能，或僅選擇性的免疫功能。改變抗體之Fc區 域，可達成各種分子致效劑功能之特色，包括提高或抑制 各種免疫系統反應，具有診斷以及治療有利的效應。 本發明製作的抗體可僅與某些Fc受體類型反應，例 如本發明抗體可經修飾刪除或改變抗體Fc區域之Fc受體 結合部位以僅結合至某些 Fc受體，或視需要完全缺少 Fc受體結合。其它本發明抗體Fc區域令人滿意的改變 歸納於下。使用一般Kabat編號系統指定Fc區域（例如 IgG抗體）上改變之胺基酸殘基（例如胺基酸取代）以使致效 功能達成所要求的改變。亦可使用編號系統比較各種抗體 (例如小鼠抗體）以觀察到所要求的致效劑功能，然後可系 統化的用遺傳工程改造本發明的人類、人類化、或嵌合型 抗體。 例如已觀察到抗體（例如IgG抗體）可分成三群，分別 與Fc受體（例如人類單核白血球Fc受體（FcyRI))展現強度 、中間、或弱結合。比較此類不同親和力群之胺基-酸序 列，可確認樞紐聯結區域之單核白血球結合部位（Leu234-Ser2 3 9)。此外，人類FcyRI受體可結合單體人類IgGl以 及小鼠IgG2a，但結合小鼠lgG2b則弱100倍。比較此類 -57- (52) 1328116 蛋白質樞紐聯結區域之序列顯示強烈的結合劑中序列 234 至 23 8，即 Leu-Leu-Gly-Gly-Pro 在小鼠 r 2b(即弱結合 劑）變成Leu-Glu-Gly-Gly-Pro。據此，若須要降低Fcyl受 體之結合的話，可在人類抗體樞紐序列作對應的改變。據 瞭解其它改變亦可達成相同或相似的結果。例如，取代 側鏈具有不適當的官能基之特定的殘基、或引入帶電價的 官能基（例如G1 u或A s p)或例如芳香族非極性殘基（例如 φ Phe、Tyr、或Trp)可改變FcyRI結合親和力。 此類改變亦可適用至鼠科動物、人類、.及老鼠系統， 使不同免疫球蛋白之間具有序列同源現象。據顯示將人類 IgG3(結合至人類FcyRI受體）之Leu 235改變成Glu可破 壞突變者與受體之交互作用。如此製作適當的突變可打開 或關閉此受體之結合部位。 相鄰的或接近樞紐聯結區域位點之突變（例如殘基234 、236或237用Ala取代）顯示改變殘基234、235、236、及 鲁237至少可影響FcyRI受體之親和力。據此，本發明抗體 亦可有改變的F c區域，相較於未經修飾之抗體其係改變 FeyRI之結合親和力。該抗體一般係修飾胺基酸殘基234 、23 5、23 6、$ 23 7 〇 相似的方法可改變其它Fc受體之親和力，用不同方 法控制免疫反應。 在進一步的實施例中，可改變結合補體之C1成份後 IgG抗體之水解性質。 補體系統的第一個成份C1包含三個共同緊密結合的 -58- (53) (53)1328116 已知的蛋白質Clq、Clr以及Cls。據顯示Clq負責此三 個蛋白質之複合體與抗體之結合。 據此，重鍵胺基酸殘基318、32〇、及322中至少有一 個被改變成具有不同側鏈殘基之改變CH2結構區的抗體， 可改變抗體與Clq之結合活性。重鏈殘基編號爲EU指數 (參閱上述之 Kabat et al.)。其它適當的改變，例如降低 或去除Clq與抗體專一性結合，包括將任何一個殘基 318(Glu)、3 20(Lys)以及 322(Lys)改變成 Ala。 此外，在此類殘基製作突變，據顯示只要殘基3 1 8具 有氫鍵側鏈及殘基320以及322均有正電價的側鏈則可保留 與C 1 q之結合。 在三個特定的殘基中將任何一個殘基取代成側鏈具有 不適當的官能性之殘基，則可徹底破壞C 1 q結合活性。 不是僅有將離子的殘基用Ala代替才可破壞Clq之結合。 亦可用其它經烷基取代的非離子殘基，例如Gly、lie、 Leu、或Val、或該芳香族非極性殘基（Phe、Tyr、Trp以 及Pro)代替三個特定的殘基中的任何一個殘基，均可破壞 Clq之結合。此外，亦可使用極性非離子殘基Ser、Thr、 Cys、及Met代替殘基3 20以及3 22(但不是3 18)以破壞Clq 之結合。 亦値得注意的是殘基的離子或非離子極性側鏈將能 夠與GU殘基以相似的鍵結形成方法形成氫鍵。因此’ 318 (Glu)殘基用極性殘基代替可進行修飾但不破壞Clq 結合活性。 -59- (54) 1328116 亦知用 Ala取代殘基297(Asn)可去除水解活性而僅 稍微地降低（約倍弱）對C 1 q之親和力。此改變破壞糖基化ι 作用位點，而補體活化須要碳水化合物之存在。此位點之 _ 任何其它取代亦將破壞糖基化作用位點。 本發明亦提供改變致效劑功能之抗體，其中抗體具有 經修飾之樞紐區域。經修飾之樞紐區域可包含源自不同抗 體種類或源自CH1結構區次分類抗體之完整的樞紐區域。 鲁例如’ IgG抗體的固定結構區（CH1)可附著至lgG4抗體之 樞紐區域。此外，新樞紐區域可包含部份之天然樞紐或源 自天然樞紐區域的重複單位。在實施例之一中，天然的樞 紐區域係將一個或多個半胱胺酸殘基轉換成中性的殘基（ 例如丙胺酸），或將適當位置的殘基轉換成半胱胺酸殘基 而加以改變。該改變可使用蛋白質化學技藝，較佳者爲在 此描述之遺傳工程技藝進行。 在本發明的具體實施例之一中，抗體樞紐區域半胱胺 鲁酸殘基之數目降低，例如降低至一個半胱胺酸殘基。此修 I 飾之優點是可促進抗體，例如雙專一性抗體分子以及Fc $ @ E經致效劑或報導分子取代之抗體分子的組裝，因爲 僅必須形成一個二硫鍵。此修飾亦提供專一性目標使樞紐 胃域附著至另一樞紐區域或致效劑或報導分子（直接的或 間接的）例如經化學的方法。 相反地，可增加抗體樞紐區域半胱胺酸殘基之數目， 例如比至少正常發生的半胱胺酸殘基多一個。增加半胱胺 酸殘基之數目可穩定相鄰的樞紐間之交互作用。此修飾之 -60- (55) (55)1328116 另一優點可增進至致效劑或報導分子使用半胱胺酸硫醇基 附著至改變的抗體，例如放射性標記的抗體。 據此’本發明提供交換樞紐區域之抗體（特定言之 kG) ’及/或增加或降低樞紐區域半胱胺酸殘基之數目以 改變致效劑功能（參閱例如美國專利第5，6 7 7,4 2 5號，全文 在此倂入參考文獻）。測定改變之抗體的致效劑功能係使 用在此描述之測定或其它確認的技藝。 重要的是’產生的抗體可用一種或多種測定以評估相 較於起始抗體之任何生物活性的改變。例如，改變F c區 域之抗體結合補體或Fc受體之能力可使用揭示於在之測 定與任何確認技藝測定評估。 產生本發明抗體可用任何適當的技術進行，包括在此 描述之技藝與熟悉此技藝的專業人士習知的技藝。可合成 例如適當的蛋白質序列，例如抗體形成部份或所有相關的 固定的結構區’例如Fc區域（即CH2，及/或CH3結構區） ，以及包括適當改變殘基抗體，然後化學地相聯至抗體分 子適當的位置。 較佳者用遺傳工程技藝產生改變型抗體。較佳的技藝 包括例如製備適當的引子應用於聚合酶連鎖反應（PCR), 在編碼至少部份之IgG重鏈（例如Fc或愤定區，例如CH2 、及/或CH3)的DNA序列上改變一個或多個殘基。然後 將此片段操作地聯結至抗體的其餘部份，例如抗體變異區 以及細胞表現須要的調控元。 本發明亦包括用以轉形細胞株之載體，用於產生轉形 -61 - (56) 1328116 載體之載體、轉形載體轉形的細胞株、製備的載體轉形的 細胞、以及其生產方法。 較佳者，產生改變Fc區域（即改變致效劑功能）之抗 _ 體的轉形細胞株是永生的哺乳動物細胞株（例如C Η 0細胞 )° 雖然較佳之用於產生改變Fc區域抗體的細胞株者是 哺乳動物的細胞株，此外亦可使用任何其它適當的細胞株 φ ，例如細菌的細胞株或酵母菌細胞株。 B .編碼免疫劑以及治療劑之核酸 亦可投用編碼抗體及其成份鏈之核酸作爲被動免疫法 誘發對抗澱粉樣蛋白沈澱物之免疫反應。該核酸可啓 DNA或RNA。編碼抗原的核酸片段一般聯結至調控元， 例如啓動子以及強化子，其可允許DN A片段在預期的病 患目標細胞中表現。在血液細胞中表現（令人滿意的誘發 免疫反應）時，適於直接表現的啓動子以及強化子元件係 •取自輕鏈或重鏈免疫球蛋白基因或爲CMV V主要的中間 物早期啓動子以及強化子。經常載體選殖入聯結的調控元 與編碼序列。投藥用雙鏈抗體時，二種鏈可選殖入相同 或分離的載體。 可得到的許多病毒性的載體系統包括反轉錄病毒的系 統（參閱例如 Lawrie and Tumin，Cur. Opin. Genet. Develop. 3:1 02- 1 09( 1 993));腺病毒的載體（參閱例如Bett et al.，I Viro 1.67:5911(1993));腺病毒相關的病毒載體（參 閱例如 Zhou et al·, J. Exp. Med. 1 79:1 867(1 994))、取自 -62- (57) 1328116 水痘家族病毒性的載體，包括牛痘病毒以及雞痘病毒、取 自α病毒屬的病毒性載體，例如源自Sindbis and Semliki Forest 病毒（參閱例如 Duben sky e t a 1 ·， J . Virο 1. 70:508(1996))、Venezuelan馬科動物腦炎 病毒（參閱 Johnston et al.，US 5,643,576)以及桿狀病毒，例如水泡性 口炎病毒（參閱Rose, 6,1 68,943)以及乳突瘤病毒（〇he et al., Human Gene Therapy 6:3 2 5 ( 1 995); Woo et al., WO 94/12629 and Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622(1996)) ° 編碼抗原DNA，或內含抗原DNA的載體，可包裝入 脂球體。適當的脂質以及相關的類似物描述於Eppstein et al.、US 5,2 0 8,03 6、Feigner et al.、US 5,264,6 1 8 ' Rose 、US 5,27 9,8 3 3、以及 Epand et al.、US 5,2 83，185。載體 以及抗原DNA編碼亦可吸附或聯結微粒載體，其實施例 包括聚甲基丙烯酸甲酯聚合物以及聚丙內酯以及聚（丙交 醋-共乙父醋），參閱例如 McGee et al., J. Micro Encap.( 1 996) ° 基因療載體或裸露的多胜肽（例如DNA)可藉由對個別 病患活體內遞送投用，一般係經全身性投藥（例如靜脈內 的 '腹腔內的、鼻腔的、胃、皮膚內的、肌肉內的、次真 皮的、或顱內的灌入）或塗覆方式（參閱例如 Anderson et al·' US 5,399,34 6)。本文之"裸露的多核苷酸”意指不與膠 Μ材'14複合的多核苷酸。裸露的多核苷酸有時是選殖入質 °該載體可進一步的包括促進劑例如布比瓦辛 -63- (58) 1328116 (bupivacine)(Weiner et al·，US 5,593,972)。DNA 亦可使 用基因槍投用。參閱上述的 Xiao & Bran dsma。將編碼抗 原的DNA沈澱在微金屬圓珠之表面。微拋體用衝擊波或 擴張氨氣加速，並穿過數層細胞組織。適當的裝置是例如 ，由 Agricetus，Inc. Middleton WI 製作之 AccelTM 基因 傳輸裝置。此外，可簡單地用化學或機械的刺激將DNA ’點在皮膚上，裸露的DNA可經由皮膚進入血流（參閱 • Howell et al.，W0 95/05853)。 在進一步的變體中，編碼免疫原之載體可運送至體外 的細胞，例如植入個別病患的細胞（例如淋巴細胞、骨髓 塊、組織活體檢查）或全適型供血者血液幹細胞，接著將 細胞再植入病患，之後通常選擇帶有倂入載體之細胞。 Π.預防及治療的方法 本發明係關於治療老年痴呆症的以及其它呈澱粉樣疾 病，其係以對病患產生有利治療的反應（例如誘發吞噬A φ /3、降低蛋白斑、抑制蛋白斑形成、降低神經炎性失調、 改進認知的功能、及/或逆轉、治療或預防認知的衰退）之 « 條件投用治療性免疫試劑（例如人類化免疫球蛋白）於Αβ '的專一性抗原決定部位，以預防或治療呈澱粉樣疾病。本 發明亦關於使用揭示的免疫試劑（例如人類化免疫球蛋白） 製作治療或預防呈澱粉樣疾病之藥劑。 特色之一中，本發明提供of預防或治療病患腦部與 A点澱粉樣蛋白沈澱物相關的疾病之方法。該疾病包括阿 茲海默氏症、唐氏綜合症以及認知的受損。發生後者時可 -64 - (59) (59)1328116 含或不含其它呈澱粉樣疾病之特性。本發明的一些方法能 投用有效劑量專一性結合至澱粉樣蛋白儲存物成份的抗體 至病患。該方法尤其是可用於預防或治療人類病患之阿茲 海默氏症。典型的方法能投用有效劑量結合至的抗體 。較佳的方法能投用有效劑量專一性結合至殘基1-10 的抗原決定部位之抗體，例如專一性結合至殘基1-3 的抗原決定部位之抗體，專一性結合至AyS殘基1-4的抗 原決定部位之抗體，專一性結合至AyS殘基1-5的抗原決 定部位之抗體，專一性結合至AyS殘基1-6的抗原決定部 位之抗體，專一性結合至A 殘基1 - 7的抗原決定部位之 抗體，或專一性結合至A/3殘基3-7的抗原決定部位之抗 體抗體。在另一特色中，本發明之特色係投用結合至包含 A召自由 N-端殘基之抗原決定部位的抗體。在另一特色 中，本發明之特色係投用結合至包含A/3殘基1-10之抗原 決定部位其中A々之殘基1及/或Ayg之殘基7爲天門冬 胺酸的抗體。在另一特色中，本發明之特色係投用專一性 結合至 ΑΘ而不結合至全長澱粉樣蛋白前驅物蛋白質 (APP)的抗體。在另一特色中’抗體同功型爲人類IgGl。 在另一特色中，本發明之特色係投用結合至病患澱粉 樣蛋白儲存物的抗體以及誘發對抗澱粉樣蛋白儲存物之清 除反應。例如’該清除反應爲經Fc受體調節的呑噬作 用。 本發明治療劑爲相當純的形式不含不利的污染物。此 係指藥劑一般至少約有50%w/w(重量/重量）之純度，且實 -65- (60) 1328116 質上不含干擾蛋白質及污染物。有時藥劑至少約80% w/w ，更佳者至少90或約95 %w/w純度。然而使用習見的蛋白 質純化技藝，至少可得到99%w/w均質的肽類。 . 此方法可用於無症狀的及目前顯示疾病症狀之病人。 用於該方法之抗體可爲人類、人類化的、嵌合的或非人類 抗體，或其片段（例如抗原結合片段）以及可爲在此描述的 單株或多株抗體。在另一特色中，本發明之特色係投用製 φ備自人類以A沒肽免疫的抗體，人類可爲抗體治療的病患 〇 在另一特色中，本發明之特色是投用含醫藥載體作爲 藥學組成物之抗體。此外，投用至病患的抗體可爲投用至 少編碼一個抗體鏈之多核苷酸。多核苷酸在病患中可表現 產生抗體鏈。視需要，多核苷酸可編碼抗體之重及輕鏈。 多核苷酸在病患中可表現產生重及輕鏈。典型的具體實施 例中，係監測病患血液中投用抗體之水準。 # 如此本發明可滿足治療上長期的需要以預防或改善神 經病理學，以及一些病患相關於阿茲海默氏症的認知受損

I Ο A.能治療的病人 能治療的病人包括有疾病風險但無症狀之個人，與目 前顯示症狀之病人。以阿茲海默氏症爲例，實際上任何人 只要活得夠久都有患有阿茲海默氏症之風險。因此，本發 明方法可預防上地投用至一般的族群而不須要任何病患之 風險評估。本發明方法尤其是可用於已知有阿茲海默氏症 -66- (61) (61)1328116 風險的個人。該類個人包括有親屬經歷此疾病之個人，以 及經基因或生化的標識分析測定有風險之個人。阿茲海默 氏症風險之遺傳標記包括APP基因之突變，尤其是在位 置 717以及位置 67〇及671之突變分別稱爲Hardy及 Swedish突變（參閱上述之Hardy)。其它風險標識爲早老 因子基因、PS1以及PS2、以及Ap〇E4突變，AD、高膽固 酉学血症或動脈粥樣硬化之家族病史。目前確認阿兹海默氏 症之病人的標準是特徵化的痴呆症，以及存在說明如上述 之風險因子。此外，有許多診斷測試可檢驗AD病人。此 類診斷包括測量CSF tau以及 Αβ42之含量。tau上升且 Αβ42之含量減低意味著有AD之存在。ADRDA標準（討論 實施例）亦可用以診斷阿茲海默氏症的病人。 在無症狀的病患中，治療可始於任何年齡（例如：1 〇 、20、30)。然而通常須要等病患到達40、50、60或70歲 才開始治療。一般治療是於一段期間內投用多重劑量。於 一段期間內測定抗體之含量可監測治療成效。若反應下跌 則可加強劑量。對可能產生唐氏綜合症病患，可在產前對 母親投用治療劑或於分娩之後立即治療。 Β.治療療程以及劑量 在預防性的應用上，可對易感的病患，或有阿茲海默 氏症風險的病患投用充分劑量的藥學組成物或藥劑，以排 除或降低風險，降低嚴重性，或遲延疾病的啓動，包括疾 病的生化、組織的及/或行症狀，其倂發症以及於發展疾 病期間呈現之中間物病理的表現型。在治療的用途上，可 -67- (62) 1328116 對可疑的病患，或已患有該疾病的病患投用充分劑量的組 成物或藥劑以治療、或至少局部地遏止疾病症狀（生化的 、組織的及/或行爲的），包括其倂發症以及於發展疾病期 . 間呈現之中間物病理的表現型。 在一些方法中，可對未發展出特徵化之老年痴呆症病 理學的病人投用藥劑以降低或消除肌肉認知的受損。完成 '治療的或預防性的治療之適當量的定義爲治療上或預防上 φ地有效劑量。在預防性的以及治療的療程中，通常投用數 個藥劑劑量直到達成充分的免疫反應爲止。本文之"免疫 反應"或”免疫的反應”包括發展直接對抗接受患者抗原之 體液的（抗體中介的）及/或細胞的（經抗原專一性T細胞 或其分泌產物所調節）反應。該反應可爲主動反應，即經 投用抗原加以誘發，或被動反應，即投用免疫球蛋白或抗 體或先導型T-細胞加以誘發。一般要監測免疫反應，若 免疫反應起始終止時則給予重覆的劑量。 •本發明組成物治療上述描述症狀之有效劑量取決於許 多不同因子而變化，包括投藥方法、目標位點、病患的生 理狀態、病患是否是人類或動物、投用的其它藥物、以及 是否爲預防性的或治療性的治療。通常，病患是人類，但 非人類哺乳動物包括導入外來基因的哺乳動物亦可治療^ 治療劑量須要滴定以最適化安全性及功效。 在抗體被動免疫法中，劑量範圍約0.0001至100毫克/ 公斤，以及更通常約0.01至5毫克/公斤（例如〇.〇2毫克/公 斤、0.25毫克/公斤、〇_5毫克/公斤、〇·75毫克/公斤、1毫 -68- (63) (63)1328116 克/公斤、2臺古/八r- 兄&斤等）之宿主體重。例如劑量可爲1毫克 么斤體重或10毫克/公斤體重或介於110毫克/公斤之內， 較佳者至少玲彳甚& , 倚1罨克/公斤。上述範圍之中間劑量亦預期的 爲本發明範圍。病患可每日、隔天、每週—次或依據任何 其匕貫驗分析流程測定，投用該劑量。典型的治療能長期 的投用多重劑量’例如至少六個月。其他的治療療程是每 —週或每個月一次或每3至6月投藥一次。典型的劑量流程 包括連續投用1-10毫克/公斤或毫克/公斤，隔天投用3〇 晕克/公斤或每週—次投用60毫克/公斤。在一些方法中， 可同時投用兩種或多種不同結合專一性的單株抗體，在各 例中’各抗體投用劑量在本發明的範圍之內。 抗體通常是多重投用。單一劑量之投藥間隔可爲每週 一次、每月一次或每年一次。投藥間隔亦可不規則，經測 量病患血液中A沒抗體之含量而決定。在一些方法中，調 整劑量以達成血漿抗體濃度爲1-1000微克/毫升以及在一 些方法中爲25_300微克/毫升。此外，抗體可以延釋調配 物投用，其係較不須要經常投藥。投用頻率的變化取決於 在病患中抗體之半生期。一般而言，人類化的抗體顯示較 長的半生期、依次是嵌合型抗體以及非人類抗體。 投藥之劑量以及頻率可取決於是否爲預防性的或治療 性的治療而變化°在預防性的應用中’將內t本抗1胃或其 胃合·物之組成物投用至無疾病狀態之病患以增進病人的抗 性。該劑量之定義爲”預防性的有效劑量"。在此用途中’ 精確的劑量再一次取& 態& -69- (64) 1328116 免疫力，但一般而言介於0.1至25毫克/劑量，尤其是0·5至 2.5毫克/劑量。於長期間相對不頻繁的投藥間隔可投用相 對低劑量。一些病人可在有生之年繼續接受治療。 在治療的應用中，有時須要在相對地的投藥間隔內投 用相對地高劑量（例如約1至200毫克抗體/劑量，5至25毫 *' 克之劑量更常用）直到降低或終止疾病進展，較佳者直到 •病患顯示部份的或完全的改善疾病症狀。因此本專利可在 φ預防性的療程中投用。 編碼抗體核酸之劑量約10毫微克至1克、1〇〇毫微克至 100毫克、1微克至10毫克、或30·300微克 DNA/病患。感 染性的病毒性載體劑量之變化爲10-100 (或更多）病毒粒子/ 劑量。 治療劑可非經腸的、塗覆的、靜脈內的、口服的、皮 下的、動脈內的、顱內的 '腹腔內的、鼻腔內的或肌肉內 的投用以進行預防性的及/或治療性的治療。產生免疫性 •的藥劑最有代表性的投藥路徑是皮下的路徑，雖然其它路 徑同樣有效。其次最常見的路徑是肌肉內的注射。此類型 之注射最常見的是在臂或腿肌肉進行。在一些方法中，將 藥劑直接的注射入沈澱物堆積的特定組織，例如顱內的注 射。肌肉內的注射或靜脈內的灌入是抗體較佳的投藥方法 。在一些方法中，特定的治療的抗體是直接的注射入頭蓋 骨。在一些方法中，抗體用延釋組成物或裝置（例如 MedipadTM裝置）投用。 本發明藥劑可視需要結合其它至少可部份有效的治 -70- (65) (65)1328116 療呈澱粉樣疾病之藥劑投用。 在老年痴呆症的以及唐氏綜合症中，澱粉樣蛋白沈澱 物發生在腦部，本發明藥劑亦可倂用其它增加本發明藥劑 通過血腦屏障之藥劑投用。本發明藥劑亦可結合其它增進 治療劑接近目標細胞或組織之藥劑（例如脂球體等）投用。 共投用此藥劑可降低治療劑劑量（例如治療的抗體或抗體 鏈）之須求以達成所要求的效應。 C.藥學組成物 本發明藥劑經常以藥學組成物的型式投用，其係包含 活性的治療劑以及各種其它醫藥學上可接受的成份。參閱 Remington's Pharmaceutical Science( 1 5 th ed ., Mack

Publishing Company, Easton, Pennsylvania(1980))。較佳 的形式取決於投藥的預期模式以及治療的用途。組成物亦 可包括（取決於所要求的調配物）醫藥學上可接受的、無毒 的載體或稀釋劑，其定義爲通常用以調配投藥至動物或人 類之藥學組成物的載劑。選擇的稀釋劑是以不影響組合的 生物活性爲原則。該稀釋劑的實施例爲蒸餾水、磷酸鹽緩 衝的生理食鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、及Hank、 溶液》此外，藥學組成物或調配物亦可包括其它載體、 佐劑、或無毒性的、無治療的、無免疫產生性的穩定劑等 〇 藥學組成物亦可包括大的、緩慢代謝的大分子例如蛋 白質、多糖例如聚乙醯殼多醣、聚乳酸、聚乙醇酸以及共 聚物（例如膠乳功能化的瓊脂糖（TM)、瓊脂糖、纖維素、 -71 - (66) 1328116 及其類似者）、聚合的胺基酸、胺基酸共聚物、及脂質聚 集物（例如油滴或脂球體）。此外，此類載體可作爲免疫刺 激藥劑（即佐劑）。 在不經腸道的方法給藥時，本發明藥劑可以注射投用 內含物質之生理上可接受的稀釋劑與醫藥載體（可爲滅菌 之液體例如水、油類、生理食鹽水、甘油、或乙醇）之溶 '液或懸浮液。此外，組成物中可存在輔助的物質，例如溼 φ化劑或乳化劑、表面活性劑、酸鹼度緩衝物質及其類似者 。藥學組成物的其它成份爲石油、起源自動物、蔬菜、或 合成的例如花生油、大豆油、及礦物油。一般而言，乙 二醇類例如丙二醇或聚乙二醇爲較佳的液體載體，尤其是 用於注射溶液。抗體可以儲藏處注射或植入物製劑的形 式投用，其可用該方法調製成容許有效成份延期釋放。典 型的組成物包含5毫克/毫升之單株抗體，調製於50毫莫耳 濃度L-組織胺酸、150毫莫耳濃度 NaCn、酸鹼度用HC1 φ調至6.0之水溶性緩衝液。 組成物一般是製備成注射液（液體溶液或懸浮液）：亦 可製備成在注射之前適用於溶於或懸浮於溶液或液懸浮、 液體載劑之固體形式。製劑亦可乳化或封包於脂球體或微 顆粒例如：聚丙內酯、聚糖內酯、或共聚物以增強以上討 論之佐劑效應（參閱Langer，Science 249:1 527( 1 990)以及 Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97(1997)) 〇 本發明藥劑可以儲藏處注射或植入物製劑的形式投用，其 可用該方法調製成容許有效成份延期釋放或搏動的釋放。 -72- (67) (67)1328116 適用於其它投藥模式的額外調配物包括口服的、鼻腔 內的、以及肺部的、栓劑、以及經皮用途的調配物。栓劑 、結合劑以及載體包括，例如：聚伸烷基乙二醇類或三酸 甘油酯；該栓劑可形成中內含0.5 %至1 0 %，較佳者 1 % -2%有效成份之混合物》口服的調配物包括賦形劑，例如 醫藥級的甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖 維素、及碳酸鎂。此類組成物之形式爲溶液、懸浮液、藥 片、藥九、膠囊、延釋調配物或粉末以及含有1 0 % - 9 5 %， 較佳者 25%-70%之有效成份。 塗覆的施用可產生經皮的或皮膚內的傳輸。塗覆的投 藥時可共同投用霍亂毒素或解毒的衍生物或次單體其或其 它相似的細菌毒素藥劑以增加效應（參閱 Glenn et al.， Nature 3 9 1, 8 5 1 ( 1 9 98))。可使用混合物成份或化學交聯得 到的聯結分子或表現融合型蛋白達成共同投用之目的。 此外，可使用皮膚路程或使用轉移體達成經皮的傳 輸（Paul et a 1., E u r. J. Immunol. 25:3521(1995); Cevc et a 1., Biochem, Biophys. Acta 1368:201-15(1998))。 III.監測治療療程 本發明提供監測患有或易感老年痴呆症的病患治療療 程的方法，即監測投用病患的治療療程。該方法可用以監 視症候性病人的治療治療以及無症狀病患的預防性治療。 特定言之，該方法係用於監測被動免疫法（例如測量投用 抗體之水準）。 一些方法能決定基線値，例如在投用藥劑前病患抗體 -73- (68) 1328116 之水準或輪廓，以及比較治療後之輪廍或水準的數値。 水準或輪廓訊息之數値顯著的增加（即在相同樣本之重覆 測定中大於試驗誤差’用該測定平均値的一個標準差表示 )代表正性治療結果（即投用藥劑達成所要求的反應）。若 免疫反應數値不顯著的改變、或減低則爲負性的治療結果 〇 在其它方法中，控制組數値（即平均値以及標準差）之 φ水準或輪廓係測定自控制組族群。一般控制組族群的個體 未經過前治療。病患於投用治療劑之後將實測數値之水準 或輪廓與控制組數値相比較。相對於控制組數値顯著增加 (例如大於一個平均値的標準差）的訊息代表正性或充分的 治療結果。缺少顯著的增加或降低訊息代表負性的或不充 分的治療結果。一般而言相對於控制組數値其數增加則繼 續投用藥劑。如前述，達成相對於控制組數値平台代表可 停止治療投藥或降低劑量及/或頻率。 φ 在其它方法中，控制組數値之水準或輪廓（例如平均 値及標準差）係測定自進行治療劑治療之控制組族群的個 體，在治療之反應下其含量或輪廓已達平台。將病患實測 數値之含量或輪廓與控制組數値相比較。若病患之測量水 準與控制組數値顯著的不同（例如大於一個標準差），則可 停止治療。若病患之測量水準顯著的低於控制組數値，則 繼續投用藥劑。若病患之測量水準持續低於控制組數値， 則要改變治療方式。 在其它方法中，對目前未接受治療但以前已進行過 -74- (69) (69)1328116 治療療程之病患，監測其抗體之含量或輪廓以測定是否須 要在中斷後重新開始治療。病患之測量水準或輪廓與已進 行過治療療程之病患的可數値相比較》相對於以前的測量 其數値顯著的降低（即大相同樣本重覆測定之誤差）是代表 可恢復治療。此外，病患測量數値可與控制組數値（平均 値加上標準差）相比較以測定病人族群於進行治療之後的 效果。此外，病患實測數値可與無疾病症狀預防上地處理 的病人族群，或治療處理顯示改善疾病特性之治療族群的 病人之控制組數値相比較。所有此類案例中，相對於控制 水平顯著的降低（即大於一個標準差）是表示病患應恢復治 療。 分析之組織樣本一般爲病患之血液、血漿、血清、黏 液流體或腦脊髓液。分析樣本的例如Α Θ肽抗體之含量或 輪廓，例如人類化的抗體之含量或輪廓。偵測專一性對抗 A/3之抗體的ELISA方法描述於實施例。在一些方法中 ，投用抗體之水準或輪廓係使用清除測定加以測定，例如 在此描述之活體外吞噬作用檢測法。在該方法中將病患之 測試組織樣本與澱粉樣蛋白沈澱物（例如取自P D A P P小鼠 )以及帶有Fc受體之吞噬細胞接觸。然後監測後續澱粉樣 蛋白儲存物的清除。 清除反應之存在及程度代表抗體有效的清除測試病患 的組織樣本中之之存在性及水準。 被動免疫後之抗體輪廓一般顯示抗體濃度之立即吸收 峰接著以指數型式衰變。不須進一步的劑量，在數天至數 -75- (70) 1328116 月（取決於投用抗體之半生期）期間衰退至前處理之含量。 在一些方法中，在投藥之前進行病患中抗體之基 線測量，進行第二個測量測定吸收峰抗體水準，以及在投 藥間隔中進行一個或多個進一步的測定監視抗體含量之衰 退。當抗體之水準衰退至基線或少於基線預定的吸收峰百 分比（例如5 0%、25%或10%)，則進一步的投用抗體劑量。 '在一些方法中’吸收峰或後續測量之少於背景値的含量可 φ與其它病患先前測定構成有利的預防性的或治療性的治療 療程之參考値相比較。若測量之抗體水準顯著的少於參考 値（例如少於平均値減去自治療受益之病人族群參考値的 —個標準差），則要額外的投用抗體劑量。 額外的方法包括經硏究人員或醫生以例行的程序監測 (於治療療程）任何經技藝確認的生理症狀（例如物理或精 神的症狀）’以診斷或監視呈澱粉樣疾病（例如阿茲海默氏 症）。例如可監視認知的受損。後者是阿茲海默氏症以及 鲁唐氏綜合症症狀但亦可爲非此類疾病之症狀。例如，可由 病人在Mini-Mental State Exam上的分數於治療療程中監 測認知的受損。 C ·組套 本發明進一步的提供進行上述監測方法的組套。一般 該組套含有專一性結合至AA抗體的藥劑。組套亦可包括 標記物。爲了偵測到A々抗體，標記物一般是標記的抗_ 特異型抗體的形式。爲了偵測到抗體，提供的藥劑可預先 結合至固相，例如結合至微滴定盤之微孔。組套一般亦可 -76- (71) (71)1328116 含有使用組套之指示。該指示亦可包括測量標記物之a 万抗體含量的圖式或其它相關事物之含量。本文之指示意 指在任何生產、蓮輸、販賣、或使用期間，組套中任何附 帶的書寫或紀錄材料。例如，本文之指示包含廣告卡、以 及小冊子、包裝材料、說明、錄音或錄影卡式塊、電腦 磁碟、與直接書寫在組套上的文字。 本發明亦提供診斷的組套，例如硏究、偵測及/或診 斷的組套（例如進行活體內影像分析的組套）。該組套一 般含有結合Αβ抗原決定部位（較佳者於殘基之抗體 °較佳者’抗體爲標記的抗體或可用組套內之二級標記試 齊IJ標記。較佳者’組套標示進行預期用途的說明，例如進 行活體內影像測定。典型的抗體描述於此。 D ·活體內影像分析 本發明提供病患活體內影像化澱粉樣蛋白沈澱物的方 法。該方法適用於診斷或證實阿茲海默氏症之診斷，或易 感性。例如，該方法可用於呈現痴呆症症狀之病患。若病 患有異常的澱粉樣蛋白沈澱物，則該病患可能患有阿茲海 默氏症。該方法亦可用於無症狀的病患。出現澱粉樣蛋白 異常的沈澱物意指對未來的症候性的疾病具有易感性。該 方法亦可用於監測疾病進展及/或先前已診斷出阿茲海默 氏症病人對治療之反應。 該方法可對病患投用試劑（例如結合至Α沒之抗體）， 然後於結合之後偵測藥劑。較佳的抗體結合至病患的Α β 沈澱物而不結合全長之ΑΡΡ多肽。尤佳的抗體係結合至 -77- (72) 1328116 A召胺基酸1-10的抗原決定部位。在一些方法中，抗體結 合至A0胺基酸7_ 10之抗原決定部位。該抗體可結合而不 誘導實質上的清除反應。在其它方法中，抗體結合至A沒 胺基酸1-7之抗原決定部位。該抗體可結合以及誘發A冷 之清除反應。然而使用缺少全長恆定區（例如Fabs)抗體片 段可避免清除反應反應。在一些方法中，相同抗體可作爲 ‘治療及診斷的試劑。一般而言’結合Αβ(： -端至殘基10之 隹抗原決定部位的抗體和結合至抗原決定部位殘基1_10之抗 體不同’無強烈的訊息，可能因爲殿粉樣蛋白沈澱物不會 露出C-端之抗原決定部位。據此該抗體較差。 診斷的試劑可經靜脈注射，或直接的經顱內注射投用 至腦部或在頭顱鑽孔投用至病患身體。試劑劑量應與治 療方法之範圍相同。一般試劑是標記的，雖然在一些方法 中’具A々親和力的一級試劑是未標記的以及使用二級標 記藥劑結合至一級試劑。標記之選擇取決於偵測裝置。例 鲁如’螢光標記適用於光學偵測。使用順磁性的標記適用於 斷層X線檢驗的偵測而非外科手術。放射性的標記亦可 使用P E T或s P E C T偵測。 診斷係比較對應的基線値與標記的基因座之數量、大 小、及/或強度。基線値可代表族群中無疾病個體的平均 値。基線値亦可代表在相同病患以前測定的含量。例如， 在病患開始治療之前可測定基線値，以及然後比較基線値 與實測數値。相對於基線訊息降低數値代表治療之正性 反應。 -78- (73) (73)1328116 本發明將用下列非限制實施例作更完全的描述。 【實施方式】 實施例 下列序列辨識符號係用於實施例，意指免疫球蛋白鏈變異 區核苷酸以及胺基酸序列。

-79- 1328116 00:膛絜踗摆眾虼!>:酸騌踗摆尿此 9:療鼷'Mia^ft寸：酸蠢I摆S ε :議議· z :療謹摆·(74)尿虼趦gsHA 尿跄氍：a燧ΗΛ 冢此經糊鏗ΊΛ :醛盤踗摆尿虼 :療黯踗M^tt 尿虼鍫：&塔ΊΛ 01 : 1呢| 6 :讓議· 9 :療ii此 S :療黯議1 (Nl :酸黟踗M^ftII :醇黟躂锂尿虼 9 :酸騌踗摆尿虼 ς :酸絜踗摆尿I: TStNi SA3>^Y <N>szl §安驟-< ΙΛ-SfslSA3> 驟 Y 寸PQ31豳运 -80- (75) 1328116 實施例I.小鼠12B4變異區之選殖及定序 1 2 B4VH之選殖以及序列分析。使用融合瘤之傳訊 RNA以及標準選殖方法學經RT-PCR以及YRACE選殖融 合瘤細胞12B4之 VH及 VL區域。源自二種非依存的 cDNA選殖株’編碼假定12B4VH結構區之核苷酸序列（序 列確認號碼：3 )以及推演之胺基酸序列（序列確認號碼： 4 )分別列於表2及表3。

表2 :小鼠1 2B4 VH DNA序列。 ATGGACAGGCTTACTTCCTCATTCCTGCTGCTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTCCCA GGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA CTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTAATGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGT CAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGAGGACAAGCG CTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCTAACAATCAGG TATTCCTCAAGATCACCAATGTGGACACTGCTGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGA AGGAGGATCATCTATGATGTTGAGGACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCT CACAGTCTCCTCAG (SEQ ID NO:3) *在下面劃線的是領導肽。

表3 :小鼠1 2 B 4 V Η胺基酸序列 mdrltssfUlivpayvlsqVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLStngmgvsWIR QPSGKGLEWLAhiywdedkrynpslksRLTISKDTSNNQVFLKITNVDTADTATYYCAR rriiydvedyfdyWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO： 4) *小寫字型是領導肽以及C D R ° 12B4VL之選殖以及序列分析。12B4輕鏈各種VL區 域係用選殖VH區域類似的方法加以選殖。源自一種非依 存的cDNA選殖株，編碼假定12B2 VL結構區之核苷酸序 列（序列確認號碼：1 )以及推演之胺基酸序列（序列確認號 碼：2)分別列於表4及表5。 -81 - (76) 1328116 表4 :小鼠1 2 B 4 V L DN A序列 ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGA TGTTTTQATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCA TCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTGTTCATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGG TACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATT TTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGA TCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTT CCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAC (SEQ ID NO :1) *在下面劃線的是領導肽。 籲表5 :小鼠1 2 B 4 V L胺基酸序列

mklpvrllvlmfwipasssDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCrssqnivhsngntyleW ΥΐΧ2ΚΡΟζ25ΡΚΙ^ΙΥΐ<;ν3ηΓ£5σνΡΟίΙΡ305σ5σΤΟΡΊ^ΚΙ3Η·νΕΑΕΟΙΛνΎ·^933Ϊιν pltFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 2) *小寫字型是領導肽以及CDR。 1 2B4VL以及VH序列符合v區域功能標準從開始的 甲硫胺酸至C-區域含有ORF疊連群，以及分享免疫球蛋 白V區域基因之守恆殘基特徵。從N _端至c _端，此輕鏈 及重鍵包含 FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 以及 ® FR4結構區。各結構區胺基酸之編號係依據上述Kabat et al.之規則。 實施例II:表現嵌合型12B4抗體 表現嵌合型1 2 B 4抗體：將各種重及輕鏈區域分別再構 建入編碼VDJ或VJ接合點接合供體序列下游，以及將重 鏈選殖入哺乳動物的表現載體pCMV-hyl，將輕鏈選殖入 pCMV-hxl。此類載體於插入的變異區卡式塊下游編碼 人類yi以及Ck恆定區之外子片段。序列驗證後，將重 鏈及輕鏈表現載體共轉染COS細胞。將各種重鏈質體分 -82- (77) (77)1328116 別與不同嵌合的輕鏈質體共轉染以證實結果之重現性。轉 染後48小時收集條件化的培養液以及用西方墨點分析測定 抗體之產生或用ELISA測定與Αβ之結合。所有表現的重 鏈+輕鏈結合物之多重轉染株用山羊抗-人類IgG(H + L)抗 體以西方轉漬法確認。 用ELISA測試嵌合型12B4抗體與A/S之直接地結合 。圖5顯示嵌合型12B4以高抗體親抗原性結合至八卢，此 與嵌合的以及人類化的3D6(圖5)相似。（選殖、鑑定及3D6 之人類化爲描述於美國專利申請案序號10/0 10,942，全文 在此倂入參考文獻。）此外，ELIS A競爭性的抑制測定揭 露嵌合型12B4以及鼠科動物12B4抗體對A冷之競爭結合 與生物素化的鼠科動物以及嵌合型3D6相等。圖6顯示在 生物素化的鼠科動物1 2 B 4結合至Α β 1 - 4 2時，嵌合型1 2 B 4 ( 虛線 '空心三角型）對Αβί-42肽競爭結合與其非生物素化 的鼠科動物對應部份（固體線、密封的三角型）相等。 實施例III: mAb 12B4在PDAPP小鼠中對各種神經病理 測試終點之功效 此實施例描述鼠科動物mAb 1 2B4在各種神經病理測 試終點的功效。描述比較二種mAbs，1 2B4以及3D6。此 二mAbs爲IgG2a同功型以及可結合AO肽之N -端抗原決 定部位。 免疫 PDAPP 小鼠是用 mAb 12B4(辨識 或 mAb 3D6(辨識A冷卜5)被動的免疫，二者均爲igGy2a同功型 • 83 · (78) 1328116 。用10毫克/公斤12B4進行測試。3D6係投用不同劑量，每 個月一次每次10毫克/公斤' I毫克/公斤以及10毫克/公斤 (1 x4)。注射不相關的IgG，y2抗體（Τγ 1 1Π 5)以及Pbs作 -爲控制組。用Αβ肽活化免疫以作爲比對。各分析組之動 物爲20及35隻。 神經病理的測試終點測定包括澱粉樣蛋白之含量以及 神經炎的程度。 φ澱粉樣蛋白之含量 澱粉樣蛋白沈澱物占領額骨皮質的程度係用3D6免疫 染色及定量的影像分析測定。分析結果展示於表6。所有 免疫療法（即用12Β4、3D6(所有測試劑量）以及Αβ肽免疫） 均顯著的降低澱粉樣蛋白之含量。 神經炎的程度 先前觀察到l〇D5(鼠科動物IgGyl同功型單株抗體可 確認12B4之相同的抗原決定部位）不能顯著的降低神經炎 參的程度，顯示IgGy2a同功型抗體（但不是其它同功型）能 降低阿茲海默氏症動物模式之神經炎的程度（數據未顯示） "經12B4與3D6(均爲IgG’ca同功型）被動免疫法後用抗· APP抗體8E5免疫染色接著定量的影像分析測定PDAPP小 鼠腦切片神經炎的程度。神經炎性失調之外觀爲位於澱 粉樣蛋白斑旁之去營養的神經炎（例如球狀外觀的神經炎） 。分析結果展示於表 7。此類數據顯示12B4治療可顯著 的降低經炎的程度。相反的3 D 6不會顯著的降低神經炎 的程度。 -84- 1328116 79 活性 2.162772 0-30.715 ***.0004 86% 概 i|) m 窆 2 ^ S S CO OJ cn 1.470956 1 0-10.688 •_<.0001 90% 3D6,1毫克/ 公斤 2.286513 1 1 0.077-63.362 ***<.0001 85% 3D6，10 毫 克/公斤 ON 〇1 0.865671 0-7.064 _.0001 94% 12B4 m CO 2.317222 0-14.642 1 _<.0001 85% TY11/15 13.303288 0-61.706 .9425 ns 12% PBS 15.182297 0.160-31.961 N/A Z 中位數（％AB) 範圆 p 値（M-W) 改變％

-85- 1328116

活性 0.2344 0-1.1942 *◎.0381 41% 3D6,10毫克 /公斤Μ週 CS cn 0.4228 0-1.8215 1 >.9999 Ο 3D6,1毫克/ 公斤 口 0.3649 0-1.5760 .6986 ns 3D6.10 毫 克/公斤 CS 0.4681 0-1.3098 -1 •9587 ns 〇 12B4 CO CO 0.0816 0-0.8127 1 "*•0002 79% TY 11/15 0.3958 0-2.6800 1 .8967 ns 〇 PBS 0.3946 0-1.3828 1 1 Z 中位數（％NB) 範園 p 値（*M-W) I I %改變 -86- (81) (81)1328116 上述結果指出IgG’2a同功型之Αβ抗體治療可以， 但非足以降低神經炎的程度。經顯著的抗原決定部位（即 Αβ3·7)結合Α沒亦可降低PDAPP小鼠之病理現象。 阿兹海默氏症之PDAPP小鼠模式可對熟悉此技藝之 專業人士提供鑑定各種神經病理的測試終點之有價質的資 料以用於設計適當的人類治療的免疫準則。例如對人類 病患使用I g G 1次型1 2 B 4人類化的版本（即相當於小鼠之 IgGy2A次型），結合至A冷殘基3-7之抗原決定部位可降低 神經炎的程度。 實施例IV:對抗澱粉樣蛋白沈澱物抗體活性之體外的篩 選測定 爲了檢視抗體清除蛋白斑之效應，體外的測定係利用 初級微神經膠質細胞與PDAPP小鼠或人類AD腦部未固 定的冷凍切片培養。微神經膠質細胞係得自DBA/2N小鼠 新生兒（1-3天）的大腦皮質。皮質於內含50微克/毫升DNA 酶 I(Sigma)之 HBSS'" (Hanks' Balanced Salt Solution, Sigma)中機械地分離。分離細胞用100微米細胞濾器 (Falcon)過濾，以及在lOOOrpm下離心5分鐘。沈澱塊再懸 浮於生長培養液（高葡萄糖 〇^^1^、10%?83、25毫微克/ 毫升重組鼠科動物 GM-CSF(rmGM-CSF))，以及以2個腦 /T-75塑膠培養燒瓶之密度植入細胞。於7-9天之後，將燒 瓶於軌道的搖動器中在37°C、200rpm下旋轉2h。將細胞 懸浮液在1 OOOrpm下離心以及再懸浮於測定培養液。 將10-微米PDAPP小鼠或人類AD腦部之冷凍切片（ -87- (82) 1328116 屍體檢查間隔<3 hr)解凍，覆蓋上聚·離胺酸塗覆的圓形的 玻璃蓋玻片以及置於24-孔組織培養板之孔內。將蓋玻片 用測定培養液清洗兩次，其係由H-SFM(不含融合瘤-血清 之培養液，Gibco BRL)、1%FBS、麩胺醯胺酸' 青黴素/ 鏈黴素、以及5毫微/毫升rmGM-CSF(R&D)組成。加入2x 濃度（最終5微克/毫升）對照組或抗-AyS抗體（12B4)反應1小 時。然後以〇·8χ 106細胞/毫升之密度將微神經膠質細胞種 φ入測定培養液。維持在濕化的恒溫箱（37°C，5%C02)中培 養24hr或更久。培育終止時，培養物用4%低聚乙醛固定 以及用〇.l%Triton-X100通透。切片依序用生物素化的3D6 、抗生蛋白鏈菌素/Cy3共軛聯結物（Jackson ImmunoResearch)染色。外生性微神經膠質細胞用細胞核 的染色（DAPI)目視。用倒置的螢光顯微鏡（Nikon，TE3 00) 觀察培養細胞以及用SPOT數位攝影機以 SPOT軟體 (Diagnostic instruments)截取顯微照片。 φ 當用PDAPP腦切片在無活體內功效之對照組抗體存 在下進行測定，沒-澱粉樣蛋白斑保持完整以及沒有觀察 到吞噬作用。相反的，在3D6或12B4存在下培養細胞的切 片中，澱粉樣蛋白沈澱物大輻消失以及微神經膠質細胞中 顯示許多內含A石的吞噬小泡（圖7)。用AD腦切片得到相 似的結果；3D6(人類化的版本）以及嵌合型12B4可誘發AD 斑的吞噬作用，而對照組IgGI則不起作用。 實施例II以及ΙΠ中之數據可證實選殖的12B4變異區 之功能。 -88- (83) (83)1328116 實施例V. 12B4之人類化 A. 12B4人類化的抗體，版本！ 同源現象/分子模式化。爲了確認鼠科動物12B4抗體 關鍵構造的架構殘基，以最接近鼠科動物抗體的重及輕鏈 產生三度空間模式。在爲此目的下，選擇2 PCP抗體作模 式化 12B4 輕鏈（PDB ID: 2PCP，Lim et al.(1998)J. Biol. Chem. 27 3:28 5 7 6)之模版，以及選擇IETZ抗體作爲模式 化重鏈之模版。（PDB ID ： 1ETZ ， Guddat et al.(2000)J._Mol. Biol. 302:853)。12B4 與此類抗體輕鏈及 重鏈之胺基酸序列對準揭露2PCP以及1 ETZ抗體與12B4 分享顯著的序列同源現象。此外，選擇抗體的CDR回路 與12B4之CDR回路的標準Chothia構造分類相同。因此 ，最初選擇2PCP以及IETZ作抗體解析12B4同源模式化 之結構。 基於以上之抗體使用 Look & SegMod Modules GeneMine(v3.5)套裝軟體構築12B4變異區第一輪同源現象 模式。此軟體是以授權使用執照購買自 Molecular Applications Group(Palo Alto, CA)。此套裝軟體之作者爲 Drs.Michael Levitt 以及 Chris Lee vitt，經涉及以已知結 構的一級序列作模版基於序列同源現象之結構模型自動化 步驟，其可增進分子模式化之作業。於Silicon Graphics IRIS工作站在UNIX環境下工作，模式化結構經一系列 能量最小化步驟去除不利的原子接觸以及最佳化靜電的及 凡得瓦交互作用可自動地精煉。進一步的精煉的模式係使 -89- (84) 1328116 用Quanta®的模式化能力構建。 選擇人類接受體抗體序列。經電腦比對小鼠變異區胺 基酸序列與習知的人類抗體序列，確認適當的人類接受體 抗體序列。分別進行1 2B4重及輕鏈之比對。特定言之，經 使用 NCBI BLAST(經 National Institutes of Health NCBI 網際網路伺服器公開存取）以各鼠科動物架構序列詢問 Kabat資料庫以確認人類抗體其架構序列與鼠科動物VL φ及VH架構區域展現高度序列相似性之各種結構區。 選擇二種候選序列作爲接受體序列，其標準如下： (1 )與主題序列有同源現象；（2)與供體序列分享標準的 CDR構造；以及（3)架構區域內不含任何稀有的胺基酸殘 基。VL選擇的接受體序列是 Kabat ID號碼（KABID) 005036(Genbank 寄存編號 X67904)，以及 VH 是 KABID 0003 3 3(Genbank寄存編號X54437)。第一版之人類化的 1 2B4抗體是利用此類選擇的接受體抗體序列。 φ 取代之胺基酸殘基。如上述，人類化的本發明抗體包 含實質上取自人類免疫球蛋白（接受體免疫球蛋白）變異架 構區域以及域實質上取自小鼠免疫球蛋白（供體免疫球蛋 白）稱爲12B4之互補性決定區。確認12B4互補性決定區域 及適當的人類接受體免疫球蛋白之互補性決定區域後，下 一步驟是測定是否此類成份中有任何殘基應經取代以最適 化產生的人類化抗體的性質。 重新塑造輕鏈V區域： 重新塑造輕鏈V區域之胺基酸對準展示於圖1。從相 -90- (85) (85)1328116 當於鼠科動物V區域之相同人類亞類選擇受體架構（Kabid 005036)(沒有獨特的架構殘基），以及CDR與Chothia正 則結構群屬於同一類。其爲單一的回復突變（12V)，此殘 基爲標準的分類。重新塑造之VL版本1爲完整的種系。 重新塑造重鏈V區域： 重新塑造重鏈V區域之胺基酸對準展示於圖2。從相 當於鼠科動物V區域之相同人類亞類選擇受體架構（Kabid 00033 3)(沒有獨特的架構殘基），以及CDR與Chothia正 則群屬於同一類。鼠科動物VH鏈結構模型化，合倂 Kabid 00033 3胺基酸對準至鼠科動物序列，在重新塑造之 重鏈版本 1〇1)中找到9 個返回-突變：L2V、V24F、 G27F ' 129L 、 1 48L 、 G49A 、 V67L 、 V71K 、 & F7 8V(Kabat編號）。回復突變在胺基酸對準中用星號標示 並展示於圖2。 在9個回復突變中，4個是由模式所支配，因爲該殘基 爲標準的殘基（V24F、G27F、129L、& V71K，由固體實 心塊表示），即因爲靠近CDR殘基所以是可促成抗原結合 的架構殘基。在次重要的殘基分類上無須回復突變，界面 殘基則涉及VH-VL裝塡之交互作用（由空心塊代表）。標 定回復突變（L2V、148L、G49A、V67L、F78V，Kabat 編 號）的其餘5個殘基均爲游標尺分類（間接的參與CDR構像 ，由圖2中粗的點狀塊表示）。 版本2之設計是保留最低數目之非CDR鼠科動物殘基 "L2V返回突變引進非種系之改變（以VH461作爲種系參 -91 - (86) 1328116 考），以及在重鏈版本 2中消除該返回突變以恢復其種系 。在重鏈版本2亦恢復其餘的4個游標尺分類回復突變 (148L、G49A、V67L、F78V)。如此版本2總共含有5個非 CDR鼠科動物殘基（1個位於VL，以及4個位於VH)°版 本3之設計是恢復5個游標尺殘基中的2個（148L，& F78V) ，此模式指出彼爲較重要的游標尺殘基。因此版本3總共 含有7個非CDR鼠科動物殘基。 倂入版本1、2以及3之人類化的12B4之改變摘要列於 表8。 -92- (87) 1328116 表8 _人類化的1 2 B 4 · v 1中改變之摘要表 改變 V L (1 1 1 殘基） VH(123殘基） Hu->Mu:架構 1/111 9/123 CDR1 8/16 7/7 CDR2 3/7 8/16 CDR3 6/8 10/13 總 Hu->Mu 18/111(16%) 34/ 1 23 (28%,v2 = 23%) Mu->Hu:架構 10/111 16/123 返回突變註 解 1.12V:標準的位置。 2. 標準的：V24F 、 G27F 、 129L 、 &V71K 3. 裝塡：無 4. 游標尺：L2V* 、 I48L# 、 G49A* 、 V67L* ' F78V# 受體註解 5. KABID005036/Gen bankAcc#-x67904 6. 取自相同標準構造 群供體小鼠的 CDR * 7. 取自 SLE病患抗-心肌磷脂/ssDNA之 自體抗體 8. KABID0003 3 3/Genb ank Acc#x54437 9. 取自相同標準構造 群供體小鼠的CDR ; 10. 取自RA病患之類 風濕因子mAb *排除v 2及v 3 ; #排除v2，恢復v3。 表9以及10分別提出各種輕鏈及重鏈之Kabat編號表 -93- (88)1328116

表9 : KAB # 輕鏈Kabat編號表 小氧 12B4 # fiM. VL HUM 12B4 VL KABID 005036 A19 挂_ 評論 1 1 FR1 D D D D 2 2 V V I I vl、v2以及v3標 3 3 L V V V 準的返回突變 4 4 M M M M 5 5 T T T T 6 6 Q Q Q Q 7 7 T s s s 8 8 P P P P 9 9 L L L L 10 10 S S s s II 11 L L L L 12 12 P P P P 13 13 V V V V 14 14 s T T T 15 15 L P P P 16 16 G G G G 17 17 D E E E 18 18 Q P P P 19 19 A A A A 20 20 S S S S 21 21 I I I I 22 22 s s S s 23 23 c c c c -94- (89)1328116 24 24 CDR1 25 25 26 26 27 27 27A 28 27B 29 27C 30 27D 31 27E 32 2S 33 29 34 30 35 31 36 32 37 33 38 34 39 35 40 FR2 36 41 37 42 38 43 39 44 40 45 41 46 42 47 43 48 44 49 45 50 46 51 47 52 48 53 49 54 50 55 CDR2 51 56 52 57 53 58 54 59 55 60 56 61 rssqnivhsngntyle wylqkpgqspklliy kvsnrfs rssqnivhsngntyle wylqkpgqspqlliy kvsnrfs rssqsllhrygynyld wylqkpgqspqlliy lgsnras rssqsllhsngynyld wylqkpgqspqlliy lgsnras -95- (90)1328116 57 62 FR3 58 63 59 64 60 65 61 66 62 67 63 68 64 69 65 70 66 71 67 72 68 73 69 74 70 75

72 77 73 78 74 79 75 80 76 81 77 82 78 83 79 84 80 85 81 86 82 87 83 88 84 S9 85 90

87 92 SS 93 89 94 CDR3 90 95 91 96 92 97 93 98 94 99 95 100 96 101 97 102 gvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyyc fqgshvplt gvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyyc fqgshvplt gvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyyc mqalqtpyt gvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyyc mqalqtp -96- (91) 1328116

98 103 FR4 F F F 99 104 G G G 100 105 A Q Q 101 106 G G G 102 107 T T T 103 10S K K K 104 109 L L L 105 110 E E E 106 111 L I I 106 A 112 K K K -97- (92)1328116

表1 0 :重鍵K a b a t 小鼠 KAB 類型 12B4 # # VH 1 1 FR1 Q 表M 號iu Η 編 2

YHQ 2 3 4567891011121314151617181920212223242526272829% 2 3456789101112131415161718192021222324252627282930

VTLKESGPGILQPSQTLSLTCSF s G F SL S

VQLQESGPGLVKPSETLSLTCTF

KABID 000333Q LQ LQ E S G P G L V K Ps E T L S L T C T V

株 | Q LQLQESGPGLVKPSETLSLTCTV

VH4-61 株Q 評論 僅vl游標尺 的返回突變

s G F

s G G

s G G

s L

S

s I S

s I

S

VQLQESGPGLVKPSETLSLTCTV s G G s V S v 1、v 2以及 v 3標準的返 回突變 v 1、v 2以及 v3標準的返 回突變 v1 ' v2以及 v 3標準的返 回突變 -98- (93)1328116 31 31 CDR1 T 32 32 N 33 33 G 34 34 Μ 35 35 G 35A 36 V 35B 37 S 36 38 FR2 W 37 39 I 38 40 R 39 41 Q 40 42 Ρ 41 43 S 42 44 G 43 45 Κ 44 46 G 45 47 L 46 4S Ε 47 49 W 4S 50 L 49 51 A 50 52 CDR2 Η 51 53 I 52 54 Y 53 55 W 54 56 D 55 57 E 56 58 D 57 59 K 58 60 R 59 61 Y 60 62 N 61 63 P 62 64 s 63 65 L 64 66 K 65 67 s tngmgvswirqppgkglewl a hiywdedkrynpslks rgshywgwirqppgkglewi g siyysgntyfnpslks

s s s G s G Y Y Y Y w W G s W w I I R R Q Q P P P P G G K K G G L L E E W W I I 僅vl及v3游標 尺的返回突變 G G 僅vl游標尺的返 回突變 S Y I I Y Y Y Y s s G G s S T T Y N Y Y N N P P s s L L K K S S -99- (94)1328116

66 68 FR3 R R R R R 67 69 L L V V V 68 70 T T T T T 69 71 I I I I I 70 72 S S S S S 71 73 K K V V V 僅v 1游標尺 的返回突變 v1 、 v2以及 v3標準的返 回突變

72 74 D D D D D 73 75 T T T T T 74 76 S S S S S 75 77 N K K K K 76 78 N N N N N 77 79 Q Q Q Q Q 78 80 V V F F F 及的} vl尺變 v3游標 返回突

79 81 F S S S S 80 82 L L L L L 81 83 K K K K K 82 84 I L L L L 82A 85 T S S S S 82B 86 N S S s S 82C 87 V V V V V 83 88 D T T T T 84 89 T A A A A 85 90 A A A A A 86 91 D D D D D 87 92 T T T T T 88 93 A A A A A 89 94 T V V V V 90 95 Υ Y Y Y Y 91 96 Υ Y Y Y Y 92 97 C c C c c 93 98 A A A A A 94 99 R R R R R -100- (95) 1328116

LGPDDYTLDG -MDVWGQGTTVTVSS R -RIIYDVEDYFDYWGQGTTVTVSS R -RIIYDVEDYFDYWGQGTTLTVSS

95 100 CDR3 95A 96 101 97 102 98 103 99 104 100 105 100A 106 100B 107 100C 108 100D 109 100E 110 101 111 102 112 103 113 FR4 104 114 105 115 106 116 107 117 108 118 109 119 110 120 111 121 112 122 113 123 人類化的抗體較佳者展現與Ap專一性結合親和力至 少爲ΙΟ7、108、10或101G M·1。通常人類化的抗體與Αβ結 合親和力之上限在12Β4的三、四或五倍之內（即約ΙΟ9 Μ·1) °通常結合親和力之下限亦在12Β4的三、四或五倍之內。 組裝以及表現人類化的12B4VH以及VL，版本1 圖9a以圖式呈現PCR調節的組裝人類化的VL.vl之 策略。圖9a以圖式呈現PCR調節的組裝人類化的VH.vl 之策略。表11爲 PCR調節的組裝12B4vl之引子。 -101 - 1328116 96) 鍫：§：逛¾链<ins( ι >ΐί 囤 > 守 az i s^鼷-<s®、s<-frρίυd^E: 一一锻

評論 屮吕 f。 < ^ > h-J " M<S $囤杜3 w juj iy CN tR ^ i画5 3 。 H、 工=-戈 > cd S ^ g <Q S + 1费 Ιίπ Λ 5 逛—C Μ i S 圍。Γ< 。囤 t η πη画 PQ —〇 ^ > > J ^ > Ρ3寸 <ν pq 二 cs ε ^ 3 =7 -c μ?Ν S ft <π ξ 驰Q ^ a |5? 她袈$ 鍵赵巴 Ο 屮。 ο Μ > il κ-Ι „ ΙεΙ 1 ® 2 0 Λ — S J 驰— m s 锨3 賴芒 經寡核苷酸等合成的huml2B4VLvlD引子 。反股互補DNA序列12B4VLvl。固定區， (286,397)加入接合供體+BamHI位點。 經寡核苷酸等合成的huml2B4VHvlA引子 。12B4VHvl。固定區，nts 1-122，加入 Kozak共識性序列，以及Hindlll位點 序列 H U H υ υ ϋ Η υ ο y ο ο ϋ < Η Η < 3 < υ ϋ Η ο ο Eh U U U <0 0£-· U Η Ο U U U Η Η <fl ϋ ϋ U ϋ U U < < U α ο υ ο υ cn ο υ υ ο U Η Η Η < υ υ < υ ϋ 〇) U Ο Η < 〇j η ο ο ο Jj υ Η << ϋ U Ο υ Ο Η 01 < Η Η υ m ϋ ο υ υ nJ Η Η < U Jj u 〇 〇 4J Ο ϋ Η << πί y Ο < Ο σι Ο Η U Η m υ υ Η ο σ> υ η ο υ CO 酸 iM-» 1¾ 罂 ϋ Η ϋ Η Η < Η ϋ U U U Ο Η υ υ ο η £-· < q υ Η Ο Λ： ϋ Η < U ϋ 〇 Η Ο Η Η ϋ Η U ϋ < U υ Ο Ο Η U < Β U ϋ Η Ο ϋ Η < Η ϋ υ ^ ^ α ο <c < ο υ < 〇 〇 Η ϋ ϋ < ϋ < Ο < ϋ Η < < ϋ 〇 Η U ϋ ϋ Η < 5 Ο C2 ο υ < η < Η Ο ϋ ·< U U < Η ϋ ϋ ϋ Η < < ϋ < ϋ Η Ο ϋ Ο ϋ Ο ϋ υ 〇 (¾ < <ί 1¾ < α Ε- υ ο iM-3 SS 摆 u u u u Η H h Η U Η ϋ < U Η < < < η υ < υ < ο < < ο ο ο U υ Η Η U U Ο U Η < < < υ < u υ Η U Ε-» < Ο Ο Ε-* Η < Η Ο Η Ο ϋ Η Ο Η Η ο Η < Η α ϋ Ο ϋ < ο ϋ 5 < ϋ ϋ <ί < ϋ < < υ < Ε-· U Ο ϋ U U < ϋ ϋ < U ϋ Η < Η ϋ ϋ ϋ < U £-· ϋ < ο η α ·< υ ^ < ο υ < υ υ ο η α Ο Η Ο < ϋ Η Ο Η ϋ < uu*> Si iM-3 為 m m w: u 〇 < 〇 . U U < Η η υ 2 u U Ο Η Ο Ο Η Η Eh Ε-» 〇 CD U Η U < < Η < 〇 U Ο < Ο CJ U Ο < Η <t υ < u u u 2 u Jj < ο ο ^ U Ο Η < < αΐ Η Η 〇 < u υ υ Η ^ ϋ U ο ο Η xj u 3 u ο ffl υ < Η Η CTJ Η ο < eg σ> ο Η u < XJ ο Ο < ο η3 Η Η < Η jj Η < 〇 Η m υ u ο Η D) Ο ζ U Η AJ < < U < Ό Ι—Η 朦 jfcJ-3 摆 O U U Ο 〇 <ς ο ο η e 2 ο η ο υ ο η ο ο υ Η Ο Ο Η < < ο <ί Ο U U Η Ο < Ε-< ϋ U U Ο U m ϋ υ ο υ υ Η Η < ο υ ο ο ο Η CD α Η U ο U Η U U Η u CJ Ο Ο U σι u Ε-» ο u ij Η ο u υ 4J Ε-< U U <C U U Ο Η Ο σ Η Η ϋ < (ΰ Η < ·< 〇 ί〇 Ο ο ϋ ϋ «ΰ ο < α υ JJ Η Ο < Η «ο ϋ υ υ Η Η υ ο υ <β U Η Ε-* U cn υ υ υ υ ο UiJi) 摆 m m C/J α) ο Ζ C/3 (U ο % t/5 α> K rn m r < CN ο ro rn f— DN A# 00 GO •^r CS CO oo 'T rn CO CO 00 00 oo CO -102- 1328116 ^画 ·—1 0 ffi > > X 3 > PQ ^r <N CQ Ξ — j S虼 链<; <D Z # Q m m tin w ^ ¥kU 經寡核苷酸等合成的huml2B4VHv〗C引子 。12B4VHV卜固定區 nts201-338 經寡核苷酸等合成的huml2B4VHvlD引子 。反股互補DNA序列12B4VHvl。固定區 (3〇7,42乃加入接合供體+ BamHI位點至3' 端。 huml2B4VLvl > A+B -弓| 子。ΛΑ+Τ = 45.45[10] ； %C+G = 54.55[12] Davis,Botstein,Roth 熔點溫度64.54°C hum 12B4VLvl，A+B bak 引子 0/〇A+T = 38.10[8] ； %C+G = 61.90[13] Davis，Botstein，Roth 熔點溫度66.47°G < < Ο Q Ο 8 U ϋ §BSS O H § < Η ϋ Η Ο Η Η Ο υ ϋ U 〇 Ο U (¾ ϋ §86^3 S Η ϋ < ο Βδδ8δ ΒΒ6|δ Η Η Η 3 ο g§83§ δ868^ U Η < Ο 序列確認號碼：1 8 〇£-«<〇 ϋ Ο <C Η < < U CJ Ο C5 υ Η Η Η U ^ 2 ο 5 〇 υ Ο < C3 Η < Ο ^ υ Ο CJ Η ϋ Η U < CJ CJ η α ο Q 〇 Λ： Η Ο 5 〇 Ε- d； < <3 ϋ υ υ < ο 〇 Η υ Ε-· ^ υ ϋ υ υ α fi η u < < a d； 〇 C3 U Η Η Η < < < < < U U Η υ Η Ο ο υ u υ β 〇 〇 < ο υ Η Ο U < ϋ Ο Ο Η Ο 〇 ϋ < U U Ο !〇<<<< ,Η Ο Ο < 〇 U Ο Ο Ε-* 序列確認號碼：1 9 〇 〇 〇 〇 α η u < ϋ Η Ο ο << ο <ί Η 〇 ο ο Ο Η ο 〇 < < ο ο < Ο ϋ U < ο υ < < U Η U Η υ Η υ υ < < υ υ 〇 〇 μ η « ϋ Η < < ϋ Η 2 Ο 4J Η U Η < ϋ U ϋ U td υ <ί < ϋ U CJ υ υ ϋ Η Η Η ij α υ υ ο Λ ο ο ο ο σι Η Η U ο σι ο ο η ο υ ο < υ <C (Τί υ Η Η U iJ < ϋ Η Ο oJ ϋ ^ Ο Η ϋ Η < U U JJ Ο < Η Η 序列確認號碼：2 0 gag att aag ctt gcc gcc acc A 序列確認號碼：2 1 AGG AGC TGT GGA GAC TGC CCT 序列確認號碼：2 2 Ν ο Yes No CO (U > 〇 卜 cn 〇〇 rn σ\ CM Ό CO CO •^r 卜 CO CO 寸 4S8 8 4 8 8 9 4 8 9 0

-103- 1328-116

hum 12B4VLvl，C+D。弓| 子 0/〇A+T = 40.00[8] ； %C+G = 60.00[12] Davis，Botstein，Roth 溶點溫度64.50°C hum 12B4VLvl，C+D bak 引子 ％A+T = 57.14[16] ； %C+G = 42.86[12] Davis,Botstein,Roth 熔點溫度64.61 °C hum 12B4VHvl ，A+B 弓| 子 ％A+T = 47.83[11] ； %C+G = 52.17[12] Davis，Botstein，Roth 溶點溫度64.55°C hum 12B4VHvl > A+B bak 引子 0/〇A+T = 50.00 [12] ； %C+G = 50.00[12] Davis，Botstein，Roth 熔點溫度64.57°C 11 R + ^ 七寸· H- ^ -ii 3 ^ Mi p Si i +譃 υ u终 .^ JC 一 "S > p< κ ·· a > _s CN 〇 O κη 的 B J ^ Q hum 12B4VHvl，C+D 弓| 子 ％A+T = 50.00[12] ； %C+G = 50.00[12] Davis, Botstein, Roth 熔點溫度64.57°C TGC AGA AGC CAG GGC AGT CT 序列確認號碼：2 3 tga tat gga tcc act cac GTT TGA TCT C 序列確認號碼：2 4 gag ata aag ctt gcc gcc acc AT 序列確認號碼：2 5 TCC TCA TCC CAA TAG ATG TGT GCC 序列確認號碼：2 6 GTG GCT GGC ACA CAT CTA TTG G 序列確認號碼：2 7 tea tat gga tcc act cac CTG AGG 1 序列確認號碼：2 8 CO (U o Z Yes No CO > 〇 〇 cs CO CN Γ勹 CN 寸 <N CN 寸 <N 4 89 1 4 8 9 2 4893 4 8 94 4 8 95 4 8 96 -104- (99) (99)1328116 使用標準方法，在分離反應管中將等莫耳比之 VHvl A + VHvlB以及V Η v 1 C + V Η v 1 D的合成片段成對的徐 徐冷卻。在60°C下使用pcra + B正向以及A + B逆向引子 徐徐冷卻25週期’組裝a + B徐冷反應。同樣地，使用 PCRC + D正向以及C + D逆向引子在相同條件下組裝c + D 徐冷反應。PCR組裝的5ιΑ + Β半部，以及3，C + D半部，用 凝膠純化後進行最終PCR-調節的組裝。混合V-區域a + B 組裝的5'半部份與C + D的3’半部份、徐冷，以及使用 VHvl A + B正向弓f子以及VHvlC + D返向引子用PCR延伸 ，完成完整的V區域之組裝。以此方法組裝的全長vh及 VL區域用凝膠純化，以及選殖入pCRScript進行DNA序 列鑑定。 人類化的12B4VL之核苷酸序列（版本1)(序列確認號 碼：5)以及12B4VH(版本1)(序列確認號碼：7)分別列於以 下之表I2以及13。 表12.人類化的12B4VLvl核苷酸序列。

ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGG

GGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCT

CCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAACATTGTTCATAGTAATGGAAACACCTATTTGGAA

TGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAA.CCG

ATTTTCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGA

AAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACAT

GTTCCGCTCACGTTCGGTCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAC -105- (100) 1328116 表13.人類化的12B4VHV1核苷酸序列

ATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCA GGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCA CCTGCACTTTCTCTGGTTTTTCCCTGAGCACTAATGGTATGGGTGTGAGCTGGATCCGG CAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGCTGGCACACATCTATTGGGATGAGGACAAGCG CTATAACCCATCCCTCAAGAGTCGACTCACCATATCAAAGGACACGTCCAAGAACCAGG TATCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGA ' AGGAGGATCATCTATGATGTTGAGGACTACTTTGACTACTGC-GGCCAAGGGACCACGGT CACCGTCTCCTCAG B. 人類化的12B4版本2抗體 第二版本之人類化的12B4與係對版本1作了以下之取 φ代，除了在殘基2將L取代成V之外，在殘基48將I取代 成L，在殘基49將G取代成A，在殘基67將V取代成L以 及在殘基78將F取代成V。人類化的12B4版本2輕鏈及重 鏈之核苷酸序列分別爲序列確認號碼：5及9。人類化的 12B4版本2輕鏈及重鏈之胺基酸序列分別爲序列確認號碼 :6及 1 0。 C. 人類化的12B4版本3抗體 第三版本之人類化的12B4與係對版本1作了以下之取 鲁代，除了在殘基2將L取代成V之外，在殘基49將G取代 成A以及在殘基67將V取代成L。人類化的12B4版本3輕 鏈及重鏈之核苷酸序列分別爲序列確認號碼：5及1 1。人 類化的12B4版本2輕鏈及重鏈之胺基酸序列分別爲序列確 認號碼：6及12。 實施例VI.預防及治療人類病患 爲了測定藥物對人類的安全性進行單一劑量的相1實 驗。將增加劑量治療劑投用至不同病人。起始自約假定功 效之〇 · 〇 1倍，以及增加三倍直到達成約小鼠有效劑量的1〇 -106- (101) (101)1328116 倍。 爲了測定治療的功效進行相II實驗。選擇具有早期 中期阿茲海默氏症定義（使用阿茲海默氏症以及AD相關 的病症相聯（ADRDA)標準）之病人。適當的病人分數介於 Mini-Mental State Exam(MMSE)12-26 分之範圍。其它選擇 標準爲病人於硏究期間存活，以及例如同時使用可干擾藥 物時無倂發症。病患功能之基線評估係使用典型的精神計 量，例如MMSE、及ADAS，其爲評估病人阿茲海默氏症 狀態及功能的高等標度。此類精神標度提供老年痴呆症症 狀進展的計量。適當的定性的生命標度亦可用監視治療。 疾病進展亦可用MRI監測。亦可監測病人血液輪廓，包 括測定抗原專一性抗體以及T-細胞反應。 基線測定後，病人開始接受治療。彼係用盲目方式以 治療劑或安慰劑隨機的處理。至少每六個月監測病人一次 。相對於安慰劑群，測定治療群的功效顯示顯著降低治療 群之疾病進展。

爲了評估病人從非阿茲海默氏症早期記憶流失，有時 稱爲與年齡相關的記憶受損（AAMI)或輕微的認知的受損 (MCI)轉化至可能的阿茲海默氏症（由ADRDA標準所定義） 所以進行第二相Π實驗。轉化成阿茲海默氏症之高風險 病人，其係選自經篩選記憶流失早期症候或其它難以與前 老年痴呆症的症候學相關的參考族群、阿茲海默氏症家族 病史、基因的風險因子、年齡、性別、以及預測高風險阿 茲海默氏症的其它特色之非臨床的族群。收集包括MMSE -107- (102) 1328116 以及ADAS與其它爲了評估更正常族群而設計的計測法， 測定的適當基線分數。此類病患族群可分成適當的集 團進行投服安慰劑及藥劑之測試。約六個月投藥間隔後觀 . 測此類病患族群，以及觀察各病患之測試終點是否轉變成 可能的阿茲海默氏症（由ADRDA標準加以定義）。 雖然前述的發明已爲了清楚了解之目的加以詳細的描 '述，某些修飾明顯的屬於附加的申請專利範圍之範圍。所 φ有引用之出版以及專利文件與本文出現之圖式以及序列表 ，全文在此并入參考文獻。 從前述的說明將明顯的知道本發明提供許多用途。例 如，本發明提供使用任何說明如上之A /3抗體，治療、預 防或診斷呈澱粉樣疾病，或製作以彼藥劑或診斷的組成物 〇 圖形簡述 圖1A-B 描述小鼠12B4、人類化的12B4、Kabat 鲁ID005036以及種系A 1 9(X63 3 97)抗體輕鏈胺基酸序列之校 整。CDR區域係點狀化以及頂線化。人類至小鼠的單一 返回突變殘基是用星號顯示。重要的陰影化殘基展示於圖 片說明。編號係自第一個甲硫胺酸起算，而非使用Kabat 計數法。 圖2A-B描述小鼠12B4、人類化的12B4(版本1)、 Kabat ID 00033 3以及種系VH4-39以及VH4-61抗體重鏈胺 基酸序列之校整。註解與圖1相同。數目起算自第一個甲 硫胺酸，而非使用Kabat計數法。 -108- (103) (103)1328116 圖3 A-D係比較人類化的1 2B4VLvl核苷酸以及胺基酸 序列與鼠科動物及人類序列。 圖4A-D係比較人類化的12B4VHvl核苷酸以及胺基酸 序列與鼠科動物及人類序列》 圖5以圖形描述二種非依存型實驗測量嵌合型1 2B4、 3D6、及嵌合型3D6結合至A/3之ELISA的結果。其分別 爲板A及B。 圖6以圖形描述競爭型ELISA結合，在與3D6、嵌合 型3D6、及10D5相較下證實12B4及嵌合型12B4的功能活性 。嵌合型12B4(空心三角型）與其非生物素化的鼠科動物對 應部份（空心倒置的三角型）在與生物素化的鼠科動物12B 結合至1-4 2肽的競爭上有相等效用。 圖7之圖形係說明以體外的呑噬作用檢測法測試在 PDAPP腦切片中嵌合型12B4、3D6、及人類IgGl中介微 神經膠質細胞攝入A石之能力。 圖8A-B以圖形說明測試在AD腦切片中嵌合型12B4 、人類化3D6及人類IgGl媒介微神經膠質細胞攝入A冷的 能力之兩個非依存性的體外吞噬作用檢測法之結果。 圖9之圖式呈現經PCR_調節的人類化12B4(版本 1)之 組裝。圖9A描述VL區域之組裝，圖9B描述VH區域之 組裝》 1328116 序列表 <11〇>艾倫法瑪國際有限公司 衛斯公司 <120>能辨識/5 ·澱粉樣蛋白肽之人類化抗體 < 1 40>TW 092105368 <141>2003-03-12 < 1 5 0>US 60/3 63,7 5 1 <151>2002-03-12 < 1 60>2 8 <170>FASTSEQ 視窗版本 4.0 <210> 1 <211>3 93 <21 2>DNA <213>家鼠 <400> 1 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcagat ctagtcagaa cattgttcat agtaatggaa acacctattt agaatggtac 180 ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tacCgctttc aaggttcaca tgttccgctc 360 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 393

<210>2 <211>393 <212>DNA <213>家鼠 <220> <221>CDS 1328116

<222>( 1 )......(3 93) <400>2 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct get Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp lie Pro Ala 15 10 15 tcc age agt gat gtt ttg atg acc caa act cca etc tcc ctg cct gtc Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 agt ett gga gat caa gcc tcc ate tet tgc aga tet agt cag aac att Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn He 3S 40 45 gtt cat agt aat gga aac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 50 55 60 ggc cag tet cca aag etc ctg ate Cac aaa get tcc aac ega ttt tet Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tea ggg aca gat ttc aca Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 etc aag ate age aga gtg gag get gag gat ctg gga gtt tat tac tgc Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 ttt caa ggt tea cat gtt ccg etc aeg ttc ggt get ggg acc aag ctg Phe Gin Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 115 120 125 gag ctg aaa Glu Leu Lys 130

4B 144 192 240 288 336 364 393 <210>3 <211>426 <212>DNA <213>家鼠 <400>3 atggacaggc ttacttcctc attcctgctg ctgattgtcc ctgcatatgt cctgtcccag gttactctga aagagtctgg ccctgggata ttgcagccct cccagaccct cagtctgact tgttccttct ctgggttttc actgagcact aatggtatgg gtgtgagctg gattegteag ccttcaggaa agggtctgga gtggctggca cacatttact gggatgagga caagcgctat aacccatccc tgaagagccg gctcacaatc tccaaggata cctctaacaa tcaggtattc ctcaagatca ccaatgtgga cactgctgat actgccacat actactgtgc tegaaggagg atcatctatg atgttgagga etaetttgae tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 60 120 160 240 .300 360 420 426 -2- 1328116 <210>4 <211>426 <212>DNA <213>家鼠 <220>

<221>CDS <222>( 1 )......(426)

<400>4 atg gac agg ctt act tcc tea ttc ctg ctg ctg att gtc cct gca tat 48

Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu lie Val Pro Ala Tyr IS l〇 15 gtc ctg tcc cag gtt act ctg aaa gag tet ggc cct ggg ata ttg cag 96

Val Leu Ser Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu Gin 20 25 30 ecc tcc cag acc etc agt ctg act tgt tet ttc tet ggg ttt tea ctg 144

Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 age act aat ggt atg ggt gtg age tgg att ege cag cct tea gga aag 192

Ser Thr Asn Gly Met Gly Val Ser Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Lys 50 55 60 ggt ctg gag tgg ctg gca cac att tac tgg gat gag gac aag ege tat 240

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His lie Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr

65 70 75 80 aac cca tcc ctg aag age egg etc aca ate tcc aag gat acc Cct aac 28Θ

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Asn 85 90 95 aat cag gta ttc etc aag ate acc aat gtg gac act get gat act gee 336

Asn Gin Val Phe Leu Lys lie Thr Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala 100 i〇5 110 aca cac tac tgt get ega agg agg acc ate tat gat get gag gac tac 384

Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg He lie Tyr Asp Val Glu Asp Tyr 115 120 125 ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act etc aca gtc tcc tea 426

Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210>5 <211>396 -3- 1328116 <2 1 2>DN A < 2 1 3 >人造序列 <220> <223 >人類化 12B4VLvl <400>5 atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtctctgg atccagtggg 60 gatgttgtga 仁gactcagtic tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 120 atctcctgca ggtctagtca gaacattgtt catagtaatg gaaacaccta tttggaatgg 1Θ0 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 240 tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 200

agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 360 ctcacgttcg gtcaggggac caaqctaaaa atcaaa 396 <2 1 0>6 <211>3 96 <2 1 2>DN A <2 1 3>人造序列

<220> <221>CDS

<2 2 2 > ( 1 )......(3 96) <223〉人類化 12B4VHvl <400>6 atg agg etc cct get cag etc ctg ggg ctg eta atg etc tgg gtc tet 48

Met Arg Leu Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 gga tee agt ggg gat gtt gtg atg act cag tet cca etc tee ctg ccc 96

Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro 2〇 25 30 gtc acc cct gga gag ccg gee tee ate tee tgc agg tet agt cag aac 144

Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Asn 35 40 45 att 9tt: cat agt aat gga aac acc tat ttg gaa tgg tac ctg cag aag 192 lie Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys 50 55 60 -4- 240 cca ggg cag tct cca cag etc ctg ate tac aaa gtt tec aac ega ttt Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 tct ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga tea ggc aca gat ttt Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 aca ctg aaa ate age aga gtg gag get gag gat gtt ggg gtt tat tac Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 tgc ttt caa ggt tea cat gtt ccg etc aeg ttc ggt cag ggg acc aag Cys Phe Gin Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 115 120 125 ctg gag ate aaa Leu Glu lie Lys 130

<210>7 <21 1>426 <2 1 2>DNA <213>人造序列 <220> <223>人類化 12B4VLvl <400>7 atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag gtgcagctgc aggagteggg cccaggactg gtgaageett cggagaccct gtccctcacc tgcactttct ctggtttttc cctgagcact aatggtatgg gtgtgagctg gatccggcag cccccaggga agggactgga gtggctggca cacatctatt gggatgagga caagcgctat aacccatccc tcaagagtcg actcaccata tcaaaggaca cgtccaagaa ccaggtatcc ctgaagctga gctctgtgac cgctgcagac acggccgtgt attactgtgc gagaaggagg atcatctatg atgttgagga etaetttgae tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctca

<210>8 <21 1>426 <2〗2>DNA <213>人造序列 <220>

<22 1 >CDS 2ΘΘ 336 364 396 60 120 180 240 300 360 420 426 48 <222>( 1)......(426) <223>人類化 12B4VHvl <400>8 atg aag cac ctg tgg ttc ttc etc ctg ctg gtg gca get ccc aga egg Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtc ctg tcc cag gtg cag ctg cag gag teg ggc cca gga ctg gtg aag Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 . 30 ect teg gag acc ctg tcc etc acc tgc act ttc tet ggt ttt tec ctg Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 age act aat ggt atg ggt gtg age tgg ate egg cag ccc cca ggg aag Ser Thr Asn Gly Met Gly Val Ser Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys 50 55 6〇 gga ctg gag tgg ctg gca cac ate tat tgg gat gag gac aag ege tat Gly Leu Glu Trp Leu Ala His lie Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr 65 70 75 80 aac cca tcc etc aag agt ega etc acc ata tea aag gac aeg tec aag Asn. Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys 85 90 95 aac cag gta tcc ctg aag ctg age tet gtg acc get gca gac aeg gee Asn Gin Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 gtg tat tac tgt geg aga agg agg ate ate tat gat gtt gag gac Cac Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg lie He Tyr Asp Val Glu Asp Tyr 115 120 125 ttt gac tac tgg ggc caa ggg acc aeg gtc acc gtc tcc tea Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 96 144 192 240

2SS 336 384 426 <2 1 0>9 <21 1>426 <2 1 2>DNA <213>人造序列 <220> <223>人類化 12B4VHv2 <400>9 -6 - 1328116 atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag ctgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct gtccctcacc tgcactttct ctggtttttc cctgagcact aatggtatgg gtgtgagctg gatccggcag cccccaggga agggactgga gtggattggg cacatctatt gggatgagga caagcgctat aacccatccc tcaagagtcg agtcaccata tcaaaggaca cgtccaagaa ccagttctcc ctgaagctga gctctgtgac cgctgcagac acggccgtgt attactgtgc gagaaggagg atcatctatg atgttgagga ctactttgag: tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctca 60 120 180 240 300 360 420 426 <2 1 0> 1 0 <211>426 <2 1 2>DNA <2 1 3>人造序列 <220> <223>人類化 1 2B4VHv2 <220> <221>CDS <222>( 1 )......(426) <400> 1 0 atg aag cac ctg tgg ttc etc etc ctg ctg gtg gca get ccc aga tgg Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp IS 10 15 gtc ctg tcc cag ctg cag ctg cag gag teg ggc cca gga ctg gtg aag Val Leu- Ser Gin Leu Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 48 ect teg gag acc ctg tcc etc acc tgc act ttc tet ggt ttt tec ctg Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 age act aat ggt atg ggt gtg age tgg ate egg cag ccc cca ggg aag Ser Thr Asn Gly Met Gly Val Ser Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys 50 5S 60 gga ctg gag tgg att ggg cac ate tat tgg gat gag gac aag ege tat Gly Leu Glu Trp lie Gly His lie Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr 65 70 75 80 aac cca tcc etc aag agt ega gtc acc ata tea aag gac aeg tee aag Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys 85 90 95 aac cag ttc tcc ctg aag ctg age tet gtg acc get gca gac aeg gee Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 144 192 240 283 -7 326 3841328116 gtg tat tac Val Tyr Tyr 115 tgt gcg aga agg agg ate ate tat gat gtt gag gac tac Cys Ala Arg Arg Arg He lie Tyr Asp Val Glu Asp Tyr 120 125 ttt gac tac Phe Asp Tyr 130 tgg ggc caa ggg acc aeg gtc acc gtc tee tea Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 135 140 426

<210>11 <211>426 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223> 人類化 12B4VHv3 <400>11 atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt cctgccccag 60 ctgcagctgc aggagteggg cccaggactg gtgaageett cggagaccct gtccctcacc 120 tgcactttct ctggtttttc cctgagcact aatggtatgg gtgtgagctg gatccggcag 130 cccccaggga agggactgga gtggctgggg cacatctatt gggatgagga caagcgctat 240 aacccatccc tcaagagtcg agtcaccata tcaaaggaca cgtccaagaa ccaggtatcc 300 ctgaagctga getetg匕gac cgctgcagac acggccgtgt attactgtgc gagaaggagg 360 atcatctatg atgttgagga etaetttgae tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 420 tcctca 426

<210>12 <211>426 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>人類化 1 2B4VHv3 <220> <221>CDS <222>(1)......(426) <400> 1 2 atg aag cac ctg tgg ttc ttc etc ctg ctg gtg gca get ccc aga tgg Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtc ctg tcc cag ctg cag ctg cag gag teg ggc cca gga ctg gtg aag Val Leu Ser Gin Leu Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 ect teg gag acc ctg tcc etc acc tgc act ttc tet ggt ttt tec ctg Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 age act aat ggt atg ggt gtg age tgg ate egg cag ccc cca ggg aag Ser Thr Asn Gly Met Gly Val Ser Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys 50 55 60 gga ctg gag tgg ctg ggg cac ate tat tgg gat gag gac aag ege tat Gly Leu Glu Trp Leu Gly His lie Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr 65 70 75 80 aac cca tcc etc aag agt ega gtc acc ata tea aag gac aeg tcc aag Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys 85 90 95 aac cag gta tcc ctg aag ctg age tet gtg acc get gca gac aeg gee Asn Gin Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 HO gtg tat tac tgt geg aga agg agg ate ate tat gat gtt gag gac tac Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg lie lie Tyr Asp Val Glu Asp Tyr 115 120 125 ttt gac tac tgg ggc caa ggg acc aeg gtc acc gtc tcc tea Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 4Θ 96 144 192 240 288 336 384

42S <210>13 <211> 1 35 <2 1 2>DNA < 2 1 3 >人造序列 <220> <223>弓|子 <400> 1 3 gagattaage ttgccgccac catgaggctc cctgctcagc tcctggggct gctaatgctc tgggtctctg gatccagtgg ggatgttgtg atgactcagt ctccactctc cctgcccgtc acccctggag ageeg 60 120 135 <210>14 9 - 1328116 <211>131 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>弓|子 <400> 1 4

aggagctgtg gagactgccc tggcttctgc aggtaccatt ccaaataggt gtttccatta 60 ctatgaacaa tgttctgact agacctgcag gagatggagg ccggctctcc aggggtgacg 120 ggcagggaga g 131 <2 1 0> 1 5 <21 1>132

<212>DNA <213>人造序列 <220> <223 >弓丨子 <400>1 5

tgcagaagcc agggcagtct ccacagctcc tgatctacaa agtttccaac cgattttctg GO gggtccctga caggttcagt ggcagtggat caggcacaga ttttacactg aaaatcagca 120 gagtggaggc tg 132 <210> 1 6 <211> 1 3 0 <2 1 2>DNA <2 13>人造序列 <220> <223>引子 <400> 1 6 10- 1328116 tgatatggat ccactcacgt ttgatctcca gcttggtccc ctgaccgaac gtgagcggaa 60 catgtgaacc ttgaaagcag taataaaccc caacatcctc agcctccact ctgctgattt 120 tcagtgtaaa

<210>17 <211>143 <21 2>DNA <2 13>人造序列 <220> <223>弓丨子 <400> 1 7 gagataaagc ttgccgccac catgaagcac ctgtggttct tcctcctgct ggtggcagct' 60 cccagatggg tcctgtccca ggtgcagctg caggagtcgg gcccaggact ggtgaagcct： 120 tcggagaccc tgtccctcac ctg 143 <210> 1 8 <211> 1 3 7 <2 12>DNA <213>人造序列 <220> <223>弓丨子 <400>18 tcctcatccc aatagatgtg tgccagccac tccagtcccC tccctggggg ctgccggatc 60 cagctcacac ccacaccatt agtgctcagg gaaaaaccag agaaagtgca ggtgagggac 120 agggtctccg aaggctt 137 <210> 1 9

<211> 1 3 8 <2 1 2>DNA <2 13>人造序列 -11 - <220> 1328116 <223>弓丨子 <400> 1 9 gtggctggca cacatctatt gggatgagga caagcgctat aacccatccc tcaagagtcg GO actcaccata tcaaaggaca cgtccaagaa ccaggtatcc ctgaagctga gctctgtgac 120 cgctgcagac acggccgt 138

<210>20 <211>139 <2 1 2>DNA <213>人造序列 <220> <223>弓丨子 <400>2 0 tcatatggat ccactcacct gaggagacgg tgaccgtggt cccttggccc cagtagtcaa €0 agtagccctc aacatcatag atgatcctcc ttctcgcaca gtaatacacg gccgtgtctg 120 cagcggtcac agagcUcag 139 <210>21 <211>22 <2 12>DN A <213>人造序列 <220> <：223>弓| 子 <4〇〇>21 gagattaagc ttgccgccac ca <21〇>22 <211>21 <212>DNA <2 13>人造序列 -12- 22 <220> <220>1328116 <223>弓丨子 <400>22 aggagctgtg gagactgccc t 21 <2 1 0>23 <2 1 1>20 <2 1 2>DNA <2 13>人造序列 <220> <223>弓|子 <400>23 tgcagaagcc agggcagtct 2〇 <2 1 0>24 <2 1 1>2 8 <2 1 2>DNA <2 13>人造序列 <220> <223>引子 <400>24 2 8 tgatatggat ccactcacgt ttgatctc <210>25 <211>23 <2 1 2>DNA <2 13>人造序列 -13- <220> 1328116 <223>弓|子 <400>25 23 gagataaagc ttgccgccac cat

<2 1 0>26 <211>24 <2 1 2>DNA <2 13>人造序列 <220> <223>弓|子 <400>26 24 tcctcatccc aatagatgtg tgcc <210>27 <21 1>22 <212>DNA <2 13>人造序列 <220> <2 2 3 ：>弓丨子 <400>27 gtggctggca cacatctatt gg

<2 1 0>28 <2 1 1>24 <2 1 2>DNA <213>人造序列 -14- 22 <220>1328116 <223>弓丨子 <400>28 tcatatggat ccactcacct gagg 24

-15-

Claims (1)

1. T328116 拾、申請專利範圍 1-—種人類化12Β4抗體或其抗原結合片段，其包含 人類化輕鏈變異區和人類化重鏈變異區，該人類化輕鏈變 異區包含序列確認號碼：2的3個輕鏈互補決定區域 (CDR)且該人類化重鏈變異區包含序列確認號碼：4的3 個重鏈CDR，該人類化12Β4抗體或其抗原結合片段結合 沒澱粉樣蛋白（Α万）的殘基3-7之抗原決定部位。 2 ·如申請專利範圍第1項之人類化抗體或其抗原結合 片段，其中該人類化輕鏈變異區架構與源自 Kabat編號 005036之人類抗體輕鏈的人類輕鏈變異區架構具有至少 85%之序列同一性。 Kabat 編號 005036 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRYGYNYLDWYLQKP GQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCMQALQTPYTFGQGTKLEIK 3 .如申請專利範圍第1項之人類化抗體或其抗原結合 片段，其中該人類化重鏈變異區架構與源自 Kabat編號 0003 3 3之人類抗體重鏈的人類重鏈變異區架構具有至少 8 5 %之序列同一性。 Kabat 編號 000333 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISRGSHYWGWIRQPPGK GLEWIGSIYYSGNTYFNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAA DTAVYYCARLGPDDYTLDGMDVWGQGTTVTVSS. 1328116 合 結 原 抗 其 或中 體其 抗， 化鏈 類輕 人化 之類 項人 1 和 第鏈 圍重 範化 利類 專人 請含 申包 如其 4.， 段 片 (a) 該人類化輕鏈包含3個具有源自命名爲序列確認 號碼：2之小鼠12B4免疫球蛋白輕鏈變異結構區 之對應 CDR的胺基酸序列之 CDR (CDRI、CDR2 ' 及CDR3)及1個源自人類輕鏈變異區架構序列之 變異區架構，唯其依據Kabat編號規則，該變異 φ 區架構內之L2係被存在於小鼠12B4免疫球蛋白 輕鏈變異區架構之對等位置上的相同胺基酸殘基 占據；且 (b) 該人類化重鏈包含3個具有源自命名爲序列確認 號碼：4之小鼠12B4免疫球蛋白重鏈變異結構區 之對應CDR的胺基酸序列之CDR(CDR1、CDR2 及CDR3)及1個源自人類重鏈變異區架構序列之 變異區架構，唯其依據Kabat編號規則，該變異 # 區架構內之至少1個選自H2'H24、H27、H29、 H48、H49、H67、H71或H78之位置係被存在於 小鼠12B4免疫球蛋白重鏈變異區架構之對等位置 上的相同胺基酸殘基占據；且 其中該人類化抗體或其抗原結合片段係以至少1 07 M·1 之結合親和力專一性結合/3澱粉樣蛋白（A /3 )。 5.如申請專利範圍第4項之人類化抗體或其抗原結合 片段’其中依據Kabat編號規則，該人類化輕鏈變異區架 構位置L2係被V占據。 -2 - (3) 1328116 6.如申請專利範圍第〗至5項中任一項之人類 或其抗原結合片段，其中依據Kabat編號規則，該 重鏈變異區架構位置H2、H24、H27、H29、H48、 H67、H71 及 H78 係分別被 V、F、F、L·、L·、A、L V占據。 7_如申請專利範圍第丨至5項中任—項之人類 或其抗原結合片段，其中依據Kabat編號規則，該 重鏈變異區架構位置H24、H27、H29及H71係分 、F、L及K占據。 8 ·如申請專利範圍第1至5項中任一項之人類 或其抗原結合片段，其中依據Kabat編號規則，該 重鏈變異區架構位置H24、H27、H29、H48、H71 係分別被F、F、L、L、K及V占據。 9 ·如申請專利範圍第1項之人類化抗體或其抗 片段，其中該人類化重鏈變異區具有序列確認號碼 胺基酸序列且該人類化輕鏈變異區具有序列確認弱 的胺基酸序列。 10.如申請專利範圍第1項之人類化抗體或其 合片段，其中該人類化重鏈變異區具有序列確認號 的胺基酸序列且該人類化輕鏈變異區具有序列確認 6的胺基酸序列。 1 1 .如申請專利範圍第1項之人類化抗體或其 合片段，其中該人類化重鏈變異區具有序列確認號 的胺基酸序列且該人類化輕鏈變異區具有序列確認 化抗體 人類化 H49、 '、K及 化抗體 人類化 別被F 化抗體 人類化 及H78 原結合 :8的 E碼：6 抗原結 碼：10 號碼： 抗原結 碼：12 號碼： -3- (4) 1328116 6的胺基酸序列。 1 2 ·如申請專利範圍第1至5項中任一項之人類化抗 體或其抗原結合片段，其中該重鏈同型爲γΐ。 ， . 1 3.如申請專利範圍第1至5項中任一項之人類化抗 體或其抗原結合片段，其結合可溶性/3澱粉樣蛋白（Α沒） 〇 14.如申請專利範圍第丨至5項中任一項之人類化抗 •體或其抗原結合片段，其結合聚集的冷澱粉樣蛋白（Α；0) 〇 1 5 ·如申請專利範圍第1至5項中任一項之人類化抗 體或其抗原結合片段，其媒介沒澱粉樣蛋白（Α/3)之呑噬 作用。 1 6 ·如申請專利範圍第1至5項中任一項之人類化抗 體或其抗原結合片段，其跨越個體之血腦屏障。 17.如申請專利範圍第1至5項中任一項之人類化抗 鲁體或其抗原結合片段，其降低個體之冷澱粉樣蛋白（Α/3) 斑量。 1 8 · —種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至 12項中任—項之人類化抗體或其抗原結合片段及藥學載 體。 19.—種嵌合型12 Β4抗體或其抗原結合片段，其中 12Β4係一種特徵爲含有序列確認號碼：2之輕鏈變異區及 序列確認號碼：4之重鏈變異區的小鼠抗體。 2〇·—種經分離之核酸，其編碼如申請專利範圍第1 _ 4 - (5) (5)1328116 至11項中任一項之人類化重鏈變異區。 21. —種經分離之核酸，其編碼如申請專利範圍第1 至1 1項中任一項之人類化輕鏈變異區。 2 2.—種經分離之核酸，其分別編碼如申請專利範圍 第1至11項中任一項之人類化重鏈變異區及如申請專利 範圍第1至1 1項中任一項之人類化輕鏈變異區。 2 3.—種載體，其包含如申請專利範圍第20至22項 中任一項之核酸。 24. —種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第23項之 載體。 25. —種產製人類化抗體或其抗原結合片段之方法， 其包含於致使該抗體或其抗原結合片段產製之條件下培養 如申請專利範圍第24項之宿主細胞，及自該宿主細胞或 培養物分離該抗體或其抗原結合片段。 26. —種一核酸分子和另一核酸分子於製備供治療哺 乳動物之呈澱粉樣疾病的藥物上之用途，該核酸分子編碼 包含序列確認號碼：6之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈且 該另一核酸分子編碼包含選自序列確認號碼：8、序列確 認號碼：1 0或序列確認號碼：1 2之胺基酸序列的免疫球 蛋白重鏈，且該等核酸分子係於表現該等免疫球蛋白鏈之 條件下供製備藥物。 27. —種如申請專利範圍第1至12項中任一項之人類 化抗體或其抗原結合片段於製備供預防或治療與沒澱粉樣 蛋白肽有關之呈澱粉樣疾病的藥物上之用途。 -5- 1328116 (6) 2 8 _ —種如申請專利範圍第1至1 2項中任一項之人類 化抗體或其抗原結合片段於製備供預防或治療與病患腦部 A/3澱粉樣蛋白沈澱相關之疾病的藥物上之用途。 29.如申請專利範圍第27或28項之用途，其中該疾 病是阿茲海默氏症。 3〇.如申請專利範圍第27或28項之用途，其中劑量 係介於0.01至5毫克/公斤體重。 3 1 ·如申請專利範圍第3 〇項之用途，其中劑量係1毫克 /公斤體重。