PL215258B1

PL215258B1 - Humanizowane przeciwcialo 12B4, sposób jego wytwarzania, srodek farmaceutyczny je zawierajacy i jego zastosowanie, kwas nukleinowy, zawierajace go wektory i zawierajaca te wektory komórka gospodarz oraz chimeryczne przeciwcialo 12B4

Info

Publication number: PL215258B1
Application number: PL375159A
Authority: PL
Inventors: Guriq Basi; Jose Saldanha
Original assignee: Elan Pharma Int Ltd; Wyeth Corp
Priority date: 2002-03-12
Filing date: 2003-03-12
Publication date: 2013-11-29
Also published as: JP2006503549A; ECSP045314A; AR038953A1; MY139983A; PE20040207A1; NO20043992L; GEP20084474B; TW200307130A; ZA200406616B; TWI328116B; ES2389541T3; EA200401170A1; PL375159A1; BR0308143A; IL163626A; CN1703426B; KR101122871B1; KR20110027846A; KR20050071368A; US20040082762A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest humanizowane przeciwciało 12B4, sposób jego wytwarzania, środek farmaceutyczny je zawierający i jego zastosowanie, kwas nukleinowy, zawierające go wektory i zawierająca te wektory komórka gospodarz oraz chimeryczne przeciwciało 12B4.

Pokrewne zgłoszenia

Zgłoszenie zastrzega korzyści z wcześniej złożonego tymczasowego zgłoszenia patentowego US nr 60/363 751 (z 12 marca 2002 r.), zatytułowanego „Humanized Antibodies That Recognize Beta-Amyloid Peptide” (w trakcie rozpatrywania). Całą zawartość wyżej wspomnianego zgłoszenia wprowadza się niniejszym jako źródło.

Tło wynalazku

Choroba Alzheimera (AD) jest postępującą chorobą prowadzącą do otępienia starczego, patrz ogólnie Selkoe, TINS 16: 403 (1993); Hardy i in., WO nr 92/13069; Selkoe, R Neuropathol. Exp. Neurol. 53: 438 (1994); Duff i in., Nature 373: 476 (1995); Games i in., Nature 373: 523 (1995). Ogólnie choroba dzieli się na dwie kategorie: z późnym początkiem, występującym w starszym wieku (ponad 65 lat) i z wczesnym początkiem, rozwijającym się znacznie przed okresem starczym, czyli w wieku 35-60 lat. W obydwu typach choroby patologia jest taka sama, ale nieprawidłowości wydają się być ostrzejsze i bardziej rozprzestrzenione w przypadku wystąpienia choroby w młodszym wieku. Choroba charakteryzuje się co najmniej dwoma typami uszkodzeń w mózgu, neurofibylarnymi splotami i płytkami starczymi. Sploty neurofibrylarne stanowią wewnątrzkomórkowe złogi białka tau związanego z mikrotubulami składające się z dwóch włókien owiniętych parami wokół siebie. Płytki starcze (czyli płytki amyloidowe) stanowią obszary zdezorganizowanego neuropilu o szerokości do 150 μm, z zewnątrzkomórkowymi złogami amyloidowymi w środku, widoczne podczas mikroskopowej analizy skrawków tkanki mózgowej. Nagromadzanie się płytek amyloidowych w mózgu jest również związane z zespołem Downa i innymi zaburzeniami funkcji poznawczych.

Głównym składnikiem płytek jest peptyd nazywany Αβ lub peptydem β-amyloidowym. Peptyd Αβ jest 4-kDa wewnętrznym fragmentem, zawierającym 39-43 aminokwasy, większej transbłonowej glikoproteiny nazywanej białkiem prekursorowym amyloidu (APP). W wyniku obróbki proteolitycznej APP przez różne enzymy sekretazowe, Αβ występuje przede wszystkim w krótkiej formie o długości 40 aminokwasów, oraz w długiej formie, o długości 42-43 aminokwasów. Część hydrofobowej domeny transbłonowej APP znajduje się na końcu karboksylowym Αβ i może odpowiadać za zdolność Αβ do agregacji w płytki, zwłaszcza w przypadku formy długiej. Nagromadzanie się płytek amyloidowych w mózgu ostatecznie prowadzi do śmierci neuronów. Fizyczne objawy związane z tego typu degradacją komórek nerwowych charakteryzują chorobę Alzheimera.

Szereg mutacji w białku APP powiązano z występowaniem choroby Alzheimera, patrz np. Goate i in., Nature 349: 704) (1991) (walina⁷¹⁷ na izoleucynę); Chartier Harlan i in. Nature 353: 844 717 717 (1991)) (walina⁷¹⁷ na glicynę); Murrell i in., Science 254: 97 (1991) (walina⁷¹⁷ na fenyloalaninę); Mullan i in., Nature Genet. 1: 345 (1992) (podwójna mutacja zmieniająca lizynę⁵⁹⁶-metioninę⁵⁹⁶ na asparaginę⁵⁹⁶-leucynę⁵⁹⁶). Sądzi się, że takie mutacje powodują chorobę Alzheimera przez zwiększoną lub zmienioną obróbkę APP do Αβ, w szczególności obróbkę APP do zwiększonej ilości długiej formy Αβ (czyli Αβ 1-42 i Αβ 1-43). Sądzi się, że mutacje w innych genach, takich jak geny presenilin, PS1 i PS2, pośrednio wpływają na obróbkę APP z wytworzeniem zwiększonej ilości długiej formy Αβ (patrz Hardy, TINS 20: 154 (1997)).

Mysie modele z powodzeniem zastosowano do ustalenia znaczenia płytek amyloidowych w chorobie Alzheimera (Games i in., jak wyżej, Johnson-Wood i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:

1550 (1997)). W szczególności, gdy transgenicznym myszom PDAPP (które eksprymują zmutowaną postać ludzkiego APP i u których choroba Alzheimera rozwija się w młodym wieku), wstrzyknięto długą formę Αβ, wystąpiło u nich zarówno spowolnienie postępu choroby Alzheimera, jak i wzrost miana przeciwciała przeciw peptydowi Αβ (Schenk i in., Nature 400, 173 (1999)). Przedyskutowane powyżej obserwacje wskazują, że Αβ, zwłaszcza w swej długiej formie, jest czynnikiem sprawczym w chorobie Alzheimera.

W związku z tym istniało zapotrzebowanie na nowe terapie i reagenty do leczenia choroby Alzheimera, zwłaszcza terapie i reagenty mogące przynieść korzyści terapeutyczne w dawkach fizjologicznych (czyli nietoksycznych).

PL 215 258 B1

Streszczenie wynalazku

Wynalazek dotyczy humanizowanego przeciwciała 12B4 lub jego fragmentu wiążącego antygen, w którym 12B4 jest mysim przeciwciałem charakteryzującym się zmiennym regionem lekkiego łańcucha o SEQ ID NO:2 i zmiennym regionem ciężkiego łańcucha SEQ ID NO:4;

przy czym CDR lekkiego łańcucha mają następujące sekwencje aminokwasów:

CDR1 lekkiego łańcucha: Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu (reszty 43-58 z SEQ ID NO: 2),

CDR2 lekkiego łańcucha: Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (reszty 74-80 z SEQ ID NO:2),

CDR3 lekkiego łańcucha: Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr (reszty 113-121 z SEQ ID NO:2); i przy czym CDR ciężkiego łańcucha mają następujące sekwencje aminokwasów:

CDR1 ciężkiego łańcucha: Thr Asn Gly Met Gly Val Ser (reszty 50-56 z SEQ ID NO:4),

CDR2 ciężkiego łańcucha: His Ile Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser (reszty 71-86 z SEQ ID NO:4),

CDR3 ciężkiego łańcucha: Arg Arg Ile Ile Tyr Asp Val Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr (reszty 119-131 z SEQ ID NO:4).

Korzystne jest humanizowane przeciwciało lub fragment wiążący antygen, w którym zrąb zmiennego regionu humanizowanego lekkiego łańcucha wykazuje co najmniej 85% identyczności sekwencji ze zrębem zmiennego regionu ludzkiego lekkiego łańcucha z lekkiego łańcucha ludzkiego przeciwciała Kabat ID 005036.

Korzystne jest humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, w którym zrąb zmiennego regionu humanizowanego ciężkiego łańcucha wykazuje co najmniej 85% identyczności sekwencji ze zrębem zmiennego regionu ludzkiego ciężkiego łańcucha z ciężkiego łańcucha ludzkiego przeciwciała Kabat ID 000333.

Korzystne jest humanizowane przeciwciało lub jego część wiążąca antygen według wynalazku, zawierające humanizowany ciężki łańcuch i humanizowany lekki łańcuch, w którym:

a) humanizowany lekki łańcuch zawiera zrąb lekkiego łańcucha z sekwencji zrębowej ludzkiego lekkiego łańcucha, pod warunkiem, że L2, zgodnie z konwencją numeracji Kabata, jest zajęta przez taką samą resztę aminokwasową, która jest obecna w równoważnej pozycji zrębu lekkiego łańcucha mysiej immunoglobuliny 12B4; oraz (b) humanizowany ciężki łańcuch zawiera zrąb ciężkiego łańcucha z sekwencji zrębowej ludzkiego ciężkiego łańcucha, pod warunkiem, że co najmniej jedna pozycja wybrana z grupy obejmującej H2, H24, H27, H29, H48, H49, H67, H71 i H78, zgodnie z konwencją numeracji Kabata, jest zajęta przez taką samą resztę aminokwasową, która jest obecna w równoważnej pozycji zrębu ciężkiego łańcucha mysiej immunoglobuliny 12B4;

przy czym humanizowana immunoglobulina specyficznie wiąże się z peptydem β-amyloidu (Αβ)

-1 z powinowactwem wiązania co najmniej 10⁷ M^-1.

Korzystne jest humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, w którym pozycja L2 w zrębie humanizowanego zmiennego regionu lekkiego łańcucha jest zajęta przez V, zgodnie z konwencją numeracji Kabata.

Korzystne jest humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, w którym pozycje H2, H24, H27, H29, H48, H49, H67, H71 i H78, zgodnie z konwencją numeracji Kabata, w zrębie humanizowanego zmiennego regionu ciężkiego łańcucha, są zajęte odpowiednio przez V, F, F, L, L,

A, L, K i V.

Korzystne jest humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według wynalazku, w którym pozycje H24, H27, H29 i H71 w zrębie humanizowanego zmiennego regionu ciężkiego łańcucha, zgodnie z konwencją numeracji Kabata, są zajęte odpowiednio przez F, F, L i K.

Korzystne jest humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, w którym pozycje H24, H27, H29, H48, H71 i H78 w zrębie humanizowanego zmiennego regionu ciężkiego łańcucha, zgodnie z konwencją numeracji Kabata, są zajęte odpowiednio przez F, F, L, L, K i V.

Korzystne jest humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, w którym zmienny region humanizowanego ciężkiego łańcucha ma sekwencję aminokwasową zawierającą aminokwasy 20-142 z SEQ ID NO: 8, a zmienny region humanizowanego lekkiego łańcucha ma sekwencję aminokwasową zawierającą aminokwasy 21-132 z SEQ ID NO: 6.

Korzystne jest humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, w którym zmienny region humanizowanego ciężkiego łańcucha ma sekwencję aminokwasową zawierającą

PL 215 258 B1 aminokwasy 20-142 z SEQ ID NO: 10, a zmienny region humanizowanego lekkiego łańcucha ma sekwencję aminokwasową zawierającą aminokwasy 21-132 z SEQ ID NO: 6.

Korzystne jest humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, w którym zmienny region humanizowanego ciężkiego łańcucha ma sekwencję aminokwasową zawierającą aminokwasy 20-142 z SEQ ID NO: 12, a zmienny region humanizowanego lekkiego łańcucha ma sekwencję aminokwasową zawierającą aminokwasy 21-132 z SEQ ID NO: 6.

Wynalazek dotyczy ponadto izolowanych kwasów nukleinowych kodujących odpowiednio zmienny region humanizowanego ciężkiego łańcucha i zmienny region humanizowanego lekkiego łańcucha określone powyżej.

Wynalazek dotyczy także wektora lub wektorów zawierających kwas nukleinowy lub kwasy nukleinowe określone powyżej.

Wynalazek dotyczy również izolowanej komórki gospodarza zawierającej wektor lub wektory określone powyżej.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania humanizowanego przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen, obejmujący hodowanie komórki gospodarza określonej powyżej w takich warunkach, że powstaje przeciwciało lub fragment wiążący antygen, oraz wydzielanie przeciwciała z komórki gospodarza lub z hodowli.

Wynalazek dotyczy także środka farmaceutycznego zawierającego humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen określone powyżej i nośnik farmaceutyczny.

Wynalazek dotyczy również zastosowania humanizowanego przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen określonych powyżej do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki choroby amyloidogennej, ewentualnie, w którym chorobę stanowi choroba Alzheimera i/lub w którym dawka mieści się w zakresie 0,01 do 5 mg/kg masy ciała, ewentualnie 1 mg/kg.

Wynalazek dotyczy ponadto chimerycznego przeciwciała 12B4 lub jego fragmentu wiążącego antygen, gdzie 12B4 jest mysim przeciwciałem charakteryzującym się zmiennym regionem lekkiego łańcucha o SEQ ID NO: 2 i zmiennym regionem ciężkiego łańcucha o SEQ ID NO: 4, przy czym chimeryczny region zmienny ciężkiego łańcucha ma sekwencję aminokwasową zawierającą aminokwasy 21-142 z SEQ ID NO: 4, a chimeryczny region zmienny lekkiego łańcucha ma sekwencję aminokwasową zawierającą aminokwasy 20-131 z SEQ ID NO: 2.

Zatem, wynalazek dotyczy nowych immunologicznych reagentów, w szczególności terapeutycznych reagentów w postaci przeciwciał, do profilaktyki i leczenia choroby amyloidogennej (np. choroby Alzheimera). Wynalazek jest oparty, co najmniej częściowo, na zidentyfikowaniu i scharakteryzowaniu dwóch przeciwciał monoklonalnych, które specyficznie wiążą się z peptydem Αβ i skutecznie zmniejszają obciążenie płytkami i/lub zmniejszają dystrofię neurytyczną związaną z zaburzeniami amyloidogennymi. Strukturalna i funkcjonalna analiza tych przeciwciał doprowadziła do zaprojektowania różnych humanizowanych przeciwciał do zastosowania profilaktycznego i/lub terapeutycznego. W szczególności, wynalazek opiera się na humanizacji zmiennych regionów tego przeciwciała i w związku z tym dostarcza humanizowanej immunoglobuliny lub łańcuchów przeciwciał, nienaruszonych humanizowanych immunoglobulin lub przeciwciał oraz funkcjonalnych fragmentów immunoglobuliny lub przeciwciała, w szczególności wiążących antygen fragmentów przeciwciała według wynalazku.

Opisano również polipeptydy zawierające regiony determinujące dopasowanie przeciwciał monoklonalnych według wynalazku, podobnie jak reagenty polinukleotydowe, wektory oraz komórki gospodarze odpowiednie do kodowania takich polipeptydów.

Opisano sposoby leczenia chorób lub zaburzeń amyloidogennych (np. choroby Alzheimera), jak również środki farmaceutyczne i zestawy do takich zastosowań.

Opisano również sposoby identyfikacji reszt w przeciwciałach monoklonalnych według wynalazku, istotnych dla ich prawidłowego funkcjonowania immunologicznego oraz identyfikacji reszt podatnych na podstawienie przy konstruowaniu humanizowanych przeciwciał, o zwiększonym powinowactwie wiązania i/lub o zmniejszonej immunogenności, przy stosowaniu jako reagenty terapeutyczne.

Opisano także przeciwciała (np. humanizowane przeciwciała) o zmienionych funkcjach efektorowych i ich zastosowania.

Krótki opis rysunków

Figura 1A-B przedstawia uliniowienie sekwencji aminokwasów lekkiego łańcucha przeciwciała mysiego 12B4 (dojrzały peptyd, SEQ ID NO:2), humanizowanego 12B4 (dojrzały peptyd SEQ ID NO: 6), Kabat ID 005036 (dojrzały peptyd, SEQ ID NO: 32) oraz zarodkowego A19 (X63397, dojrzały peptyd, SEQ ID NO: 30). Regiony CDR wytłuszczono i obwiedziono kreskowaną linią. Pojedynczą mutację

PL 215 258 B1 wsteczną ludzkiej mysiej reszty wskazano gwiazdką. Istotność zacienionych reszt wskazano w legendzie. Numeracja zaczyna się do pierwszej metioniny, nie jest to numeracja Kabata.

Figura 2A-B przedstawia uliniowienie sekwencji aminokwasów łańcucha ciężkiego przeciwciała mysiego 12B4 (dojrzały peptyd, SEQ ID NO: 4), humanizowanego 12B4 (wersja 1) (dojrzały peptyd, SEQ ID NO: 8), Kabat ID 000333 (dojrzały peptyd, SEQ ID NO: 34) oraz zarodkowych VH4-39 i VH4-61 (dojrzałe peptydy, odpowiednio SEQ ID NO: 38 i 36). Uwagi są takie same jak dla fig. 1. Numeracja zaczyna się do pierwszej metioniny, nie jest to numeracja Kabata.

Figura 3A-D przedstawia sekwencje nukleotydów i aminokwasów humanizowanego 12B4VLv1 w porównaniu z chimerycznym 12B4VL (sekwencje regionu zmiennego identyczne jak w mysim 12B4VL, odpowiednio SEQ ID NO: 1 i 2); sekwencjami zarodkowego A19 (odpowiednio SEQ ID NO: 29 i 30); oraz Kabat ID 005036 (odpowiednio SEQ ID NO: 31 i 32).

Figura 4A-D przedstawia sekwencje nukleotydów i aminokwasów humanizowanego 12B4VHv1 w porównaniu z chimerycznym 12B4VH (sekwencje regionu zmiennego identyczne jak w mysim 12B4VH, odpowiednio SEQ ID NO: 3 i 4); Kabat ID 000333 (odpowiednio SEQ ID NO: 33 i 34); oraz zarodkowym VH4-61 (odpowiednio SEQ ID NO: 35 i 36).

Figura 5 graficznie przedstawia wyniki ELISA z dwóch niezależnych doświadczeń mierzących wiązanie chimerycznego 12B4, 3D6 oraz chimerycznego 3D6 z Αβ (panele, odpowiednio A i B).

Figura 6 graficznie przedstawia wyniki próby współzawodniczego wiązania ELISA potwierdzającego funkcjonalną aktywność 12B4 oraz chimerycznego 12B4 w porównaniu z 3D6, chimerycznym 3D6 oraz 10D5. Chimeryczne 12B4 (puste trójkąty) współzawodniczy z równą siłą ze swoim nie biotynylowanym mysim odpowiednikiem (odwrócone puste trójkąty) o wiązanie biotynylowanego mysiego 12B4 z peptydem Αβ 1-42.

Figura 7 graficznie przedstawia wyniki testu fagocytozy ex vivo w badaniu zdolności chimerycznego 12B4, 3D6 oraz ludzkiej IgG1 do pośredniczenia w wychwycie Αβ przez komórki mikrogleju na skrawkach mózgów PDAPP.

Figura 8 graficznie przedstawia wyniki dwóch niezależnych testów fagocytozy ex vivo (odpowiednio panele A i B) badających zdolność chimerycznego 12B4, humanizowanego 3D6 oraz ludzkiej IgG1 do pośredniczenia w wychwycie Αβ przez komórki mikrogleju na skrawkach mózgów AD.

Figura 9 schematycznie przedstawia złożenie na drodze PCR humanizowanego 12B4, wersja 1. Figura 9A przedstawia złożenie regionów VL. Figura 9B przedstawia złożenie regionów VH.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek dostarcza nowe reagenty immunologiczne i sposoby profilaktyki lub leczenia choroby Alzheimera lub innych chorób amyloidogennych. Wynalazek oparty jest, co najmniej częściowo, na scharakteryzowaniu immunoglobuliny monoklonalnej, 12B4, skutecznej w wiązaniu białka beta amyloidowego (Αβ) (np. w wiązaniu rozpuszczalnego i/lub zagregowanego Αβ), pośredniczeniu w fagocytozie (np. zagregowanego Αβ), zmniejszeniu obciążenia płytkami i/lub zmniejszenia dystrofii neurytycznej (np. u pacjenta). Wynalazek oparty jest ponadto na wyznaczeniu i strukturalnej charakteryzacji pierwszorzędowej i drugorzędowej struktury zmiennych łańcuchów lekkiego i ciężkiego immunoglobuliny 12B4 oraz identyfikacji reszt istotnych dla aktywności i immunogenności.

Przedmiotem wynalazku są immunoglobuliny zawierające zmienny lekki i/lub zmienny ciężki łańcuch opisanej tutaj monoklonalnej immunoglobuliny 12B4. Zgodnie z wynalazkiem immunoglobulinami, np. terapeutycznymi immunoglobulinami, są te, które zawierają humanizowany zmienny lekki i/lub humanizowany zmienny ciężki łańcuch. Korzystny zmienny lekki i/lub zmienny ciężki łańcuch zawiera regiony determinujące dopasowanie (CDR) z immunoglobuliny 12B4 (np. immunoglobuliny donorowej) oraz regiony zrębowe części zmiennej zasadniczo z ludzkiej immunoglobuliny akceptorowej. Określenie „zasadniczo z ludzkiej immunoglobuliny akceptorowej” oznacza, że większość Iub kluczowe reszty zrębowe pochodzą z ludzkiej sekwencji akceptorowej, jednakże z dopuszczalnym podstawieniem reszt w pewnych pozycjach resztami wybranymi tak, aby poprawić aktywność humanizowanej immunoglobuliny (np. zmienić aktywność tak, aby dokładniej naśladowała aktywność immunoglobuliny donorowej) lub wybranymi w celu zmniejszenia immunogenności humanizowanej immunoglobuliny.

W jednej postaci lekki lub ciężki łańcuch humanizowanej immunoglobuliny zawiera regiony determinujące dopasowanie (CDR) regionu zmiennego 12B4 (tj. może zawierać jeden lub dwa, a zgodnie z wynalazkiem zawiera trzy CDR z sekwencji regionu zmiennego łańcucha lekkiego, podanej jako SEQ ID NO: 2 lub może zawierać jeden lub dwa, a zgodnie z wynalazkiem zawiera trzy CDR z sekwencji regionu zmiennego łańcucha ciężkiego, podanej jako SEQ ID NO: 4) oraz zawiera region zrę6

PL 215 258 B1 bowy części zmiennej zasadniczo z sekwencji lekkiego lub ciężkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny akceptorowej, z tym, że co najmniej jedna reszta zrębowa jest wstecznie zmutowana do odpowiedniej reszty mysiej, przy czym ta mutacja wsteczna zasadniczo nie wpływa na zdolność łańcucha do kierowania wiązaniem Αβ.

W innej postaci lekki lub ciężki łańcuch humanizowanej immunoglobuliny zawiera regiony determinujące dopasowanie (CDR) regionu zmiennego 12B4 (tj. może zawierać jeden lub dwa, a zgodnie z wynalazkiem zawiera trzy CDR z sekwencji regionu zmiennego łańcucha lekkiego, podanej jako SEQ ID NO: 2 i/lub może zawierać jeden lub dwa, a zgodnie z wynalazkiem zawiera trzy CDR z sekwencji regionu zmiennego łańcucha ciężkiego, podanej jako SEQ ID NO: 4) oraz zawiera region zrębowy części zmiennej zasadniczo z sekwencji lekkiego lub ciężkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny akceptorowej, z tym, że co najmniej jedna reszta zrębowa jest podstawiona odpowiednią resztą aminokwasową z sekwencji regionu zmiennego lekkiego lub ciężkiego łańcucha mysiego 12B4, przy czym reszta zrębowa jest wybrana z grupy obejmującej (a) resztę, która bezpośrednio niekowalencyjnie wiąże antygen; (b) resztę sąsiadującą z CDR; (c) resztę oddziaływującą z CDR (np. zidentyfikowaną przez modelowanie lekkiego lub ciężkiego łańcucha ustalonej struktury homologicznego łańcucha znanej immunoglobuliny); i (d) resztę występującą w połączeniu VL-VH.

W innej postaci lekki lub ciężki łańcuch humanizowanej immunoglobuliny zawiera CDR regionów zmiennych oraz regiony zrębowe części zmiennej 12B4 z sekwencji lekkiego lub ciężkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny akceptorowej, z tym, że co najmniej jedna reszta zrębowa jest podstawiona odpowiednią resztą aminokwasową z sekwencji zmiennego regionu lekkiego lub ciężkiego łańcucha mysiej 12B4, przy czym resztę zrębową stanowi reszta zdolna do wpływania na konformację lub działanie zmiennego regionu lekkiego łańcucha, zidentyfikowana na podstawie analizy trójwymiarowego modelu regionu zmiennego, przykładowo reszta zdolna do oddziaływania z antygenem, reszta proksymalna względem miejsca wiązania antygenu, reszta zdolna do oddziaływania z CDR, reszta sąsiadująca z CDR, reszta w odległości do 6 A od reszty CDR, reszta kanoniczna, reszta strefy wernierowej, reszta upakowania międzyłańcuchowego, reszta nietypowa lub reszta miejsca glikozylacji na powierzchni modelu strukturalnego.

W innej postaci, dodatkowo poza opisanymi powyżej podstawieniami, możliwe są również podstawienia co najmniej jednej rzadkiej reszty ludzkiego regionu zrębowego. Przykładowo rzadka reszta może być podstawiona resztą aminokwasową, która jest pospolita dla sekwencji ludzkiego łańcucha zmiennego w tej pozycji. Alternatywnie, rzadka reszta może być podstawiona odpowiednią resztą z homologicznej zarodkowej sekwencji łańcucha zmiennego.

W jednej postaci wynalazek dotyczy humanizowanej immunoglobuliny, która zawiera łańcuch lekki i łańcuch ciężki, opisane powyżej, lub wiążący antygen fragment tej immunoglobuliny. W przykładowej postaci humanizowana immunoglobulina wiąże się (np. specyficznie wiąże się) z peptydem β-amyloidu (Αβ) z powinowactwem wiązania co najmniej 10 M^-, 10 M^- lub 10 M^-. W innej postaci immunoglobulina lub fragment wiążący antygen zawierają ciężki łańcuch o izotypie γ1. W innej postaci immunoglobulina lub fragment wiążący antygen wiążą się (np. specyficznie wiążą się) zarówno z rozpuszczalnym peptydem β-amyloidu (Αβ), jak i z zagregowanym Αβ. W innej postaci immunoglobulina lub fragment wiążący antygen pośredniczą w fagocytozie (np. wywołują fagocytozę) peptydu β-amyloidu (Αβ). W jeszcze innej postaci immunoglobulina lub fragment wiążący antygen przekraczają barierę krew-mózg u pacjenta. W jeszcze innej postaci immunoglobulina lub fragment wiążący antygen zmniejszają zarówno obciążenie peptydem β-amyloidu (Αβ), jak i dystrofię neurytyczną u pacjenta.

W innej postaci wynalazek dotyczy chimerycznych immunoglobulin, które zawierają zmienne regiony 12B4 (np. sekwencje zmiennych regionów, podane jako SEQ ID NO: 2 lub SEQ ID NO: 4). W przykładowej postaci immunoglobulina lub jej fragment wiążący antygen zawiera ponadto stałe regiony z IgG1.

Opisane tutaj immunoglobuliny są szczególnie przydatne do stosowania w terapeutycznych metodach, których zadaniem jest profilaktyka lub leczenie chorób amyloidogennych. Zatem, humanizowane przeciwciała według wynalazku można zastosować w sposobie profilaktyki lub leczenia choroby amyloidogennej (np. choroby Alzheimera), polegającym na podawaniu pacjentowi skutecznej dawki opisanej humanizowanej immunoglobuliny. W innej postaci wynalazek dotyczy preparatów farmaceutycznych, zawierających opisaną humanizowaną immunoglobulinę i farmaceutyczny nośnik. Wynalazek dotyczy także izolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego, wektorów i komórek gospodarzy do wytwarzania immunoglobulin lub fragmentów albo łańcuchów opisanych immunoglobulin, a także sposobów wytwarzania takich immunoglobulin, fragmentów immunoglobulin lub łańcuchów immunoglobulin.

PL 215 258 B1

Opisano także sposób identyfikacji reszt 12B4 podatnych na podstawienie przy wytwarzaniu odpowiednio humanizowanej immunoglobuliny 12B4. Przykładowo sposób identyfikacji reszt regionu zrębowego części zmiennej, podatnych na podstawienie, obejmuje modelowanie struktury trójwymiarowej zmiennego regionu 12B4 w oparciu o ustaloną strukturę homologicznej immunoglobuliny oraz analizę tego modelu w aspekcie reszt zdolnych do wpływania na konformację lub działanie zmiennego regionu immunoglobuliny 12B4 tak, że zidentyfikowane zostają reszty podatne na podstawienie. Sekwencje zmiennego regionu, podane jako SEQ ID NO: 2 lub SEQ ID NO: 4, albo dowolną ich część, można zastosować do wytwarzania trójwymiarowego obrazu immunoglobuliny 12B4, łańcucha immunoglobuliny 12B4 lub jej domeny.

Można wytworzyć także immunoglobuliny o zmienionej funkcji efektorowej, takiej jak zdolność do wiązania cząsteczek efektorowych, np. dopełniacza lub receptora na komórce efektorowej. W szczególności, immunoglobulina ma zmieniony region stały, np. region Fc, przy czym co najmniej jedna reszta aminokwasowa w regionie Fc została zastąpiona inną resztą lub innym łańcuchem bocznym. W jednej postaci, zmodyfikowana immunoglobulina należy do klasy IgG, zawiera podstawienie co najmniej jednego aminokwasu w regionie Fc, takie, że ta immunoglobulina ma zmienioną funkcję efektorową, np. w porównaniu z niezmodyfikowaną immunoglobuliną. W szczególnych postaciach, immunoglobulina ma zmienioną funkcję efektorową, tak, że jest mniej immunogenna (np. nie wywołuje niepożądanej aktywności komórki efektorowej, Iizy lub wiązania dopełniacza), ma ulepszone właściwości klirensu amyloidu i/lub ma wskazany okres półtrwania.

Przed opisaniem wynalazku, pomocne w jego zrozumieniu może być przedstawienie definicji pewnych określeń tutaj stosowanych.

Określenia „immunoglobulina” lub „przeciwciało” (stosowane tutaj zamiennie) dotyczą białka mającego podstawową strukturę czterech łańcuchów polipeptydowych, składającą się z dwóch łańcuchów ciężkich i dwóch łańcuchów lekkich, które to łańcuchy są stabilizowane, np. przez międzyłańcuchowe mostki dwusiarczkowe, które mają zdolność specyficznego wiązania antygenu. Określenia „jednołańcuchowa immunoglobulina” lub „jednołańcuchowe przeciwciało” (stosowane tutaj zamiennie) dotyczą białka mającego strukturę dwóch łańcuchów polipeptydowych, składającą się łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego, które to łańcuchy są stabilizowane, np. przez międzyłańcuchowe łączniki peptydowe, które ma zdolność specyficznego wiązania antygenu. Określenie „domena” oznacza globularny region polipeptydu łańcucha ciężkiego lub lekkiego zawierający pętle peptydowe (np. zawierający 3-4 pętle peptydowe), stabilizowany, np. przez β-pofałdowaną strukturę i/lub międzyłańcuchowe wiązanie dwusiarczkowe. Domeny są ponadto określane jako „stałe” lub „zmienne”, w oparciu o względny brak zmienności sekwencji w domenach różnych członków klasy w przypadku domeny „stałej” lub istotną zmienność w domenach różnych członków klasy w przypadku domeny „zmiennej”. „Domeny” przeciwciała lub polipeptydu są często zamiennie nazywane w dziedzinie wynalazku „regionami” przeciwciała lub polipeptydu. Domeny „stałe” łańcucha lekkiego przeciwciała są zamiennie nazywane „regionami stałymi łańcucha lekkiego”, „domenami stałymi łańcucha lekkiego”, regionami „CL” lub domenami „CL”. Domeny „stałe” łańcucha ciężkiego przeciwciała są zamiennie nazywane „regionami stałymi łańcucha ciężkiego”, „domenami stałymi łańcucha ciężkiego”, regionami „CH” lub domenami „CH”. Domeny „zmienne” łańcucha lekkiego przeciwciała są zamiennie nazywane „regionami zmiennymi łańcucha lekkiego”, „domenami zmiennymi łańcucha lekkiego”, regionami „VL” lub domenami „VL”. Domeny „zmienne” łańcucha ciężkiego przeciwciała są zamiennie nazywane „regionami zmiennymi łańcucha ciężkiego”, „domenami zmiennymi łańcucha ciężkiego”, regionami „CH” lub domenami „CH”.

Określenie „region” może także oznaczać część lub fragment łańcucha przeciwciała lub domeny łańcucha przeciwciała (np. część lub fragment łańcucha ciężkiego lub lekkiego albo cześć lub fragment domeny stałej lub zmiennej, jak tutaj zdefiniowano), a także mniejsze części lub fragmenty wspomnianych łańcuchów lub domen. Przykładowo łańcuchy lekkie i ciężkie lub domeny zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego zawierają „regiony determinujące dopasowanie” lub „CDR” rozmieszczone pomiędzy „regionami zrębowymi” lub „FR”, jak tutaj zdefiniowano.

Immunoglobuliny lub przeciwciała mogą występować w postaci monomerycznej lub polimerycznej, np. przeciwciała IgM występują w formie pentamerycznej i/lub przeciwciała IgA występują w formie monomerycznej, dimerycznej lub multimerycznej. Określenie „fragment” dotyczy części lub fragmentu przeciwciała lub łańcucha przeciwciała zwierającego mniejszą liczbę reszt aminokwasowych niż nienaruszone lub kompletne przeciwciało lub łańcuch przeciwciała. Fragmenty można uzyskać przez chemiczną lub enzymatyczną obróbkę nienaruszonego lub kompletnego przeciwciała lub łańcu8

PL 215 258 B1 cha przeciwciała. Fragmenty można także uzyskać metodami rekombinacji. Przykładowe fragmenty obejmują fragmenty Fab, Fab', F(ab')2, Fabc i/lub Fv. Określenie „fragment wiążący antygen” oznacza fragment polipeptydowy immunoglobuliny lub przeciwciała, który wiąże antygen lub współzawodniczy z nienaruszonym przeciwciałem (tj. nienaruszonym przeciwciałem, z którego pochodzi) o wiązanie antygenu (tj. specyficzne wiązanie).

Określenie „konformacja” dotyczy struktury trzeciorzędowej białka lub polipeptydu (np. przeciwciała, łańcucha przeciwciała, jego domeny lub regionu). Przykładowo wyrażenie „konformacja łańcucha lekkiego (lub ciężkiego)” oznacza strukturę trzeciorzędową regionu zmiennego łańcucha lekkiego (lub ciężkiego), a wyrażenie „konformacja przeciwciała” lub „konformacja fragmentu przeciwciała” oznacza strukturę trzeciorzędową przeciwciała lub jego fragmentu.

„Specyficzne wiązanie” przeciwciała oznacza, że przeciwciało wykazuje znaczące powinowactwo do antygenu lub korzystnego epitopu oraz, korzystnie, nie wykazuje znaczącej reaktywności krzyżowej. „Znaczące” lub korzystne wiązanie obejmuje wiązanie z powinowactwem co najmniej 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ lub 10¹⁰ M^-1. Korzystniejsze są powinowactwa powyżej 10⁷ M^-1, korzystnie wyższe niż 10⁸ M^-1. Wartości pośrednie pomiędzy przedstawionymi tutaj powyżej są także objęte zakresem wynalazku, a korzystne powinowactwo wiązania można przedstawić jako zakres powinowactwa, np. 10⁶ do 10¹⁰ M^-1, korzystnie 10⁷ do 10¹⁰ M^-1, korzystniej 10⁸ do 10¹ M^-1. Przeciwciałem, które „nie wykazuje istotnej reaktywności krzyżowej” jest takie, które nie wiąże się znacząco z niepożądanym składnikiem (np. z niepożądanym składnikiem białkowym). Przykładowo przeciwciało, które specyficznie wiąże się z Αβ, będzie znacząco wiązać Αβ, ale nie będzie istotnie reagować z białkami lub peptydami nie-Αβ (np. białkami lub peptydami nie-Αβ, zawartymi w płytkach). Przeciwciało specyficzne względem korzystnego epitopu nie będzie, np. istotnie reagować krzyżowo z odległymi epitopami na tym samym białku lub peptydzie. Specyficzne wiązanie można wyznaczyć znanymi sposobami wyznaczania takiego wiązania. Korzystnie, specyficzne wiązanie wyznacza na podstawie analizy Scatcharda i/lub testów współzawodnictwa o wiązanie.

Fragmenty wiążące wytwarza się technikami rekombinacji DNA lub przez chemiczne albo enzymatyczne rozszczepienie nienaruszonych immunoglobulin. Fragmenty wiążące obejmują Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, pojedyncze łańcuchy oraz jednołańcuchowe przeciwciała. Za immunoglobuliny lub przeciwciała inne niż „bispecyficzne” lub „dwufunkcyjne” uważa się takie immunoglobuliny lub przeciwciała, które mają identyczne każde ze swoich miejsc wiążących . „Bispecyficzne” lub „dwufunkcyjne przeciwciało” jest sztucznym przeciwciałem hybrydowym zawierającym dwie różne pary łańcuchów lekkich/ciężkich i dwa różne miejsca wiążące. Bispecyficzne przeciwciała można wytwarzać różnymi metodami, włącznie z fuzją hybrydom lub połączeniem fragmentów Fab', patrz np. Songsivilai i Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny i in., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

Określenie „humanizowana immunoglobulina” lub „humanizowane przeciwciało” dotyczy immunoglobuliny lub przeciwciała, które zawierają co najmniej jeden humanizowany łańcuch immunoglobuliny lub przeciwciała (tj. co najmniej jeden humanizowany łańcuch lekki lub ciężki). Określenia „humanizowany łańcuch immunoglobuliny” lub „humanizowany łańcuch przeciwciała” (tj. „humanizowany łańcuch lekki immunoglobuliny” lub „humanizowany łańcuch ciężki immunoglobuliny”) dotyczą łańcucha immunoglobuliny lub przeciwciała (tj. odpowiednio łańcucha lekkiego lub ciężkiego) zawierającego zmienny region zawierający region zrębowy części zmiennej, zasadniczo pochodzący z ludzkiej immunoglobuliny lub przeciwciała, oraz regiony determinujące dopasowanie (CDR) (np. co najmniej jeden CDR, korzystnie dwa CDR, korzystniej trzy CDR), zasadniczo pochodzące z immunoglobuliny lub przeciwciała nie pochodzącego od człowieka, oraz ponadto regiony stałe (np. co najmniej jeden region stały lub jego część, w przypadku łańcucha lekkiego oraz korzystnie trzy regiony stałe w przypadku łańcucha ciężkiego). Określenie „humanizowany region zmienny” (np. „humanizowany region zmienny łańcucha lekkiego” lub „humanizowany region zmienny łańcucha ciężkiego”) dotyczy regionu zmiennego zawierającego region zrębowy części zmiennej, zasadniczo pochodzący z ludzkiej immunoglobuliny lub przeciwciała, oraz regiony determinujące dopasowanie (CDR), zasadniczo pochodzące z immunoglobuliny lub przeciwciała nie pochodzącego od człowieka.

Określenie „zasadniczo pochodzący z ludzkiej immunoglobuliny lub przeciwciała” lub „zasadniczo ludzki” oznacza, że przy uliniowieniu z sekwencją aminokwasów ludzkiej immunoglobuliny lub przeciwciała w celu porównania, region wykazuje co najmniej 80-90%, korzystnie 90-95%, korzystniej 95-99% identyczności (tj. lokalnej identyczności sekwencji) z sekwencją ludzkiego regionu zrębowego lub regionu stałego, co zezwala np. na konserwatywne podstawienia, konsensusowe podstawienia

PL 215 258 B1 sekwencji, podstawienia zarodkowe, wsteczne mutacje itp. Wprowadzenie konserwatywnych podstawień, konsensusowych podstawień sekwencji, podstawień zarodkowych, wstecznych mutacji itp. jest często określane „optymalizacją” humanizowanego przeciwciała lub łańcucha. Wyrażenie „zasadniczo nie pochodzące od człowieka immunoglobulina lub przeciwciało” lub „zasadniczo nie-ludzka” oznacza immunoglobulinę lub przeciwciało o sekwencji zasadniczo w 80-95%, korzystnie 90-95%, korzystniej 96%, 97%, 98% lub 99% identyczną z sekwencją immunoglobuliny lub przeciwciała organizmu innego niż człowiek, np. ssaka innego niż człowiek.

Zgodnie z tym, wszystkie regiony lub reszty humanizowanej immunoglobuliny lub przeciwciała lub humanizowanego łańcucha immunoglobuliny lub przeciwciała, ewentualnie za wyjątkiem CDR, są zasadniczo identyczne z odpowiadającymi im regionami lub resztami jednej lub większej liczby sekwencji natywnych immunoglobulin ludzkich. Określenia „region odpowiadający” lub „reszta odpowiadająca” dotyczą regionu lub reszty na drugiej sekwencji aminokwasów lub nukleotydów, które zajmują tą samą (tj. równoważną) pozycję co region lub reszta w pierwszej sekwencji aminokwasów lub nuklelotydów, gdy uzyska się optymalne uliniowienie pierwszej i drugiej sekwencji w celu porównania.

Określenie „zasadnicza identyczność” oznacza, że dwie sekwencje polipeptydowe, przy optymalnym uliniowieniu, np. z zastosowaniem programów GAP lub BESTFIT z domyślną karą za przerwę, wykazują 50-60% identyczności sekwencji, korzystnie 60-70% identyczności sekwencji, korzystniej 70-80% identyczności sekwencji, korzystniej co najmniej 80-90% identyczności, jeszcze korzystniej co najmniej 90-95% identyczności oraz jeszcze korzystniej co najmniej 95% identyczności sekwencji lub powyżej (np. 99% identyczności sekwencji lub powyżej). Określenie „zasadnicza identyczność” oznacza, że dwie sekwencje polipeptydowe, przy optymalnym uliniowieniu, np. z zastosowaniem programów GAP lub BESTFIT z domyślną karą za przerwę, wykazują co najmniej 80-90% identyczności sekwencji, korzystnie 90-95% identyczności sekwencji, a najkorzystniej 95% identyczności sekwencji lub powyżej (np. 99% identyczności sekwencji lub powyżej). Przy porównywaniu sekwencji zazwyczaj jedną sekwencję stosuje się jako sekwencję odniesienia, z którą porównuje się badane sekwencje. Przy stosowaniu algorytmu do porównywania sekwencji, sekwencję badaną i odniesienia wprowadza się do komputera, w razie potrzeby wyznacza się współrzędne podsekwencji i wyznacza się parametry programu algorytmu dla sekwencji. Następnie algorytm porównujący sekwencje oblicza procent identyczności sekwencji dla sekwencji badanej (-ych) względem sekwencji odniesienia, w oparciu o wyznaczone parametry programu.

Optymalne uliniowienie sekwencji w celu porównania można przeprowadzić, np. przy pomocy algorytmu lokalnej homologii Smitha i Watermana, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), przy pomocy algorytmu uliniowienia homologicznego Needlemana i Wunscha, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), przez poszukiwanie podobieństw metodą Pearsona i Lipmana, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), przez komputerową realizację tych algorytmów (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA z Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) lub ocenę wzrokową (patrz ogólnie Ausubel i in., Current Protocols in Molecular Biology). Jednym przykładem algorytmu, który jest odpowiedni do wyznaczania procentu identyczności sekwencji i podobieństwa sekwencji jest algorytm BLAST, który opisano w Altschul i in., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990). Oprogramowanie do przeprowadzenia analiz BLAST jest publicznie dostępne z National Center for Biotechnology Information (publicznie dostępne przez serwer internetowy National Institutes of Health NCBI). Zazwyczaj, do przeprowadzenia porównania sekwencji można stosować domyślne parametry programu, jednak można także stosować dostosowane parametry. Dla sekwencji aminokwasów program BLASTP używa domyślną długość słowa (W) równą 3, oczekiwanie (E) równe 10 i macierz punktującą BLOSUM62 (patrz Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).

Korzystnie, pozycje reszt, które nie są identyczne, różnią się konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi. W celu sklasyfikowania podstawień aminokwasowych jako konserwatywne i niekonserwatywne, aminokwasy pogrupowano następująco: grupa I (hydrofobowe łańcuchy boczne): leu, met, ala, val, Ieu, ile; grupa II (obojętne hydrofilowe łańcuchy boczne): cys, ser, thr; grupa III (kwasowe łańcuchy boczne): asp, glu; grupa IV (zasadowe łańcuchy boczne): asn, gln, his, Iys, arg; grupa V (reszty wpływające na orientację łańcucha): gly, pro oraz grupa VI (aromatyczne łańcuchy boczne): trp, tyr, phe. Konserwatywne podstawienia obejmują podstawienia pomiędzy aminokwasami w tej samej klasie. Niekonserwatywne podstawienia obejmują wymianę składnika jednej z tych klas na składnik innej klasy.

Korzystnie, humanizowane immunoglobuliny lub przeciwciała wiążą antygen z powinowactwem w zakresie trzy-, cztero- lub pięciokrotnie wyższym niż odpowiednie nie-ludzkie przeciwciało. Przykła10

PL 215 258 B1

-1 dowo, gdy nie ludzkie przeciwciało ma powinowactwo wiązania 10⁹ M^-1, humanizowane przeciwciała 9 -1 9 -1 9 -1 mają powinowactwo wiązania 3 x 10⁹ M^-1, 4 x 10⁹ M^-1 lub 10⁹ M^-1. Przy opisywaniu właściwości wiążących łańcucha immunoglobuliny lub przeciwciała, łańcuch można opisać pod względem jego zdolności do „kierowania wiązaniem antygenu (np. przeciw Αβ)”. Łańcuch uważa się za „kierujący wiązaniem antygenu” gdy nadaje on nienaruszonej immunoglobulinie lub przeciwciału (lub jego fragmentowi wiążącemu antygen) właściwości specyficznego wiązania lub powinowactwa wiązania. Mutację (np. mutację wsteczną) uważa się za zasadniczo wpływającą na zdolność łańcucha ciężkiego lub lekkiego do kierowania wiązaniem antygenu, gdy zmienia ona (np. zmniejsza) powinowactwo wiązania nienaruszonej immunoglobuliny lub przeciwciała (lub jego fragmentu wiążącego antygen), zawierającego wspomniany łańcuch, o co najmniej rząd wielkości w porównaniu z przeciwciałem (lub jego fragmentem wiążącym antygen) zawierającym odpowiedni łańcuch nie zawierający wspomnianej mutacji. Mutacja „nie zmienia zasadniczo (np. nie zmniejsza) zdolności łańcucha do kierowania wiązaniem antygenu”, gdy zmienia ona (np. zmniejsza) powinowactwo wiązania nienaruszonej immunoglobuliny lub przeciwciała (lub jego fragmentu wiążącego antygen), zawierającego wspomniany łańcuch, tylko dwu-, trój- lub czterokrotnie w porównaniu z przeciwciałem (lub jego fragmentem wiążącym antygen) zawierającym odpowiedni łańcuch nie zawierający wspomnianej mutacji.

Określenie „chimeryczna immunoglobulina” lub przeciwciało dotyczy immunoglobuliny lub przeciwciała, którego regiony zmienne pochodzą od jednego gatunku oraz którego regiony stałe pochodzą od drugiego gatunku. Chimeryczne immunoglobuliny lub przeciwciała można skonstruować, np. technikami inżynierii genetycznej, z segmentów genu immunoglobuliny należących do różnych gatunków. Określenia „humanizowana immunoglobulina” lub „humanizowane przeciwciało” nie mają na celu obejmować zdefiniowanych powyżej chimerycznych immunoglobulin lub przeciwciał. Chociaż humanizowane immunoglobuliny lub przeciwciała są chimeryczne pod względem swojej konstrukcji (tj. zawierają regiony białka z więcej niż jednego gatunku) mają dodatkowe cechy (tj. regiony zmienne zawierające donorowe reszty CDR oraz akceptorowe regiony zrębowe) nie znajdywane w zdefiniowanych tutaj chimerycznych immunoglobulinach lub przeciwciałach.

„Antygen” jest jednostką (np. jednostką białkową lub peptydem), z którą specyficznie wiąże się przeciwciało.

Określenie „epitop” lub „determinanta antygenowa” dotyczy miejsca na antygenie, z którym immunoglobulina lub przeciwciało (lub jego fragment wiążący antygen) wiążą się specyficznie. Epitopy mogą być utworzone zarówno przez sąsiadujące, jak i nie sąsiadujące aminokwasy umieszczone obok siebie w wyniku trzeciorzędowego fałdowania białka. Epitopy utworzone przez sąsiadujące aminokwasy są zazwyczaj utrzymywane po wystawieniu na działanie rozpuszczalników denaturujących, podczas gdy epitopy utworzone w wyniku trzeciorzędowego pofałdowania są zazwyczaj tracone przy podziałaniu rozpuszczalnikami denaturującymi. Epitop zazwyczaj zawiera 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 lub 15 aminokwasów w unikatowej konformacji przestrzennej. Metody wyznaczania konformacji przestrzennej epitopów obejmują np. krystalografię rentgenowską i dwuwymiarowy magnetyczny rezonans jądrowy, patrz np. Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, tom 66, G. E. Morris, red. (1996).

Przeciwciała rozpoznające ten sam epitop można zidentyfikować w prostym teście immunologicznym wykazującym zdolność przeciwciała do blokowania wiązania innego przeciwciała z docelowym antygenem, tj. w teście współzawodnictwa o wiązanie. Współzawodnictwo o wiązanie wyznacza się w teście, w którym immunoglobulina podczas testu hamuje specyficzne wiązanie przeciwciała odniesienia ze wspólnym antygenem, takim jak Αβ. Znanych jest wiele typów testów współzawodnictwa o wiązanie, np.: bezpośredni lub pośredni test radioimmunologiczny (RIA) na fazie stałej, bezpośredni lub pośredni test immunoenzymatyczny (EIA) na fazie stałej, kanapkowy test współzawodnictwa (patrz Stahli i in., Methods in Enzymology 9: 242 (1983)); bezpośredni EIA na fazie stałej z biotyną-awidyną (patrz, Kirkland i in., J. Immunol. 137: 3614 (1986)); bezpośredni test ze znakowaniem na fazie stałej, bezpośredni test kanapkowy ze znakowaniem na fazie stałej (patrz Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); bezpośredni RIA na fazie stałej ze znakowaniem I-125 (patrz Morel i in., Mol. Immunol. 25(1): 7 (1988)); bezpośredni EIA na fazie stałej z biotyną-awidyną (Cheung i in., Virology 176: 546 (1990)) oraz bezpośredni RIA ze znakowaniem. (Moldenhauer i in., Scand. J. Immunol. 32: 77 (1990)). Zazwyczaj test taki obejmuje zastosowanie oczyszczonego antygenu związanego ze stałą powierzchnią lub niosących go komórek, nieznakowanej immunoglobuliny testowej i znakowanej immunoglobuliny odniesienia. Współzawodnicze hamowanie mierzy się przez ustalenie ilości znacznika związanego ze stałą powierzchnią lub komórkami

PL 215 258 B1 w obecności badanej immunoglobuliny. Zazwyczaj badana immunoglobulina jest obecna w nadmiarze. Zazwyczaj przy współzawodnictwie przeciwciało obecne w nadmiarze hamuje specyficzne wiązanie przeciwciała odniesienia ze wspólnym antygenem co najmniej o 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% lub powyżej.

Epitop jest także rozpoznawany przez immunogenne komórki, np. komórki B i/lub komórki T.

Komórkowe rozpoznawanie epitopu można wyznaczyć w testach in vitro mierzących zależną od anty₃ genu proliferację, co określa się przez włączanie ³H-tymidyny, na podstawie wydzielania cytokin, wydzielania przeciwciał lub przez zależne od antygenu uśmiercanie (test cytotoksyczności limfocytów T).

Przykładowe epitopy lub determinanty antygenowe można znaleźć w ludzkim białku prekursorowym amyloidu (APP), ale korzystnie w peptydzie Αβ APP. Istnieje wiele izoform APP, np. APP⁶⁹⁵, APP⁷⁵¹ i APP⁷⁷⁰. Aminokwasom APP przypisuje się numery według sekwencji izoformy APP⁷⁷⁰ (patrz np. nr dostępu GenBank P05067). Peptyd Αβ (nazywany tutaj także peptydem beta amyloidu i A-beta) jest wewnętrznym fragmentem około 4-kDa APP długości 39-43 aminokwasów (Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 i Αβ43). Przykładowo, Αβ40 składa się z reszt 672-711 APP, a Αβ42 składa się z reszt 673-713 APP. W wyniku proteolitycznej obróbki APP przez różne enzymy sekretazowe in vivo i in situ, Αβ występuje zarówno w „formie krótkiej”, o długości 40 aminokwasów, jak i „formie długiej”, o długości 42-43 aminokwasów. Korzystne epitopy lub determinanty antygenowe, jak tutaj opisano, są umiejscowione na N-końcu peptydu Αβ i zawierają reszty aminokwasów 1-10 Αβ, korzystnie reszty 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 lub 3-7 Αβ42. Dodatkowe stosowne epitopy lub determinanty antygenowe obejmują reszty 2-4, 5, 6, 7 lub 8 Αβ, reszty 3-5, 6, 7, 8 lub 9 Αβ lub reszty 4-7, 8, 9 lub 10 Αβ42. Stwierdzenie, że przeciwciało wiąże się z epitopem w obrębie określonych reszt, takich jak Αβ 3-7 oznacza, że przeciwciało specyficznie wiąże się z polipeptydem zawierającym wyszczególnione reszty (tj. w tym przykładzie Αβ 3-7). Takie przeciwciało nie koniecznie kontaktuje się z każdą resztą w Αβ 3-7, jak również, nie koniecznie każde podstawienie lub delecja pojedynczego aminokwasu w Αβ 3-7 znacząco wpływa na powinowactwo wiązania.

Określenie „choroba amyloidogenna” obejmuje dowolną chorobę związaną z (lub wywołaną przez) tworzenie lub odkładanie nierozpuszczalnych włókien amyloidowych. Przykładowe choroby amyloidogenne obejmują, ale nie tylko, skrobiawicę ogólnoustrojową, chorobę Alzheimera, cukrzycę dorosłych, chorobę Parkinsona, chorobę Huntingtona, otępienie czołowo-skroniowe oraz związane z i przenoszone przez priony encefalopatie gąbczaste (choroby kuru i Creutzfeldta-Jacoba u ludzi i trzęsawka owiec oraz BSE, odpowiednio u owiec i bydła). Różne choroby amyloidogenne definiuje się lub charakteryzuje się na podstawie charakteru składnika polipeptydowego odłożonych włókien. Przykładowo u osobników lub pacjentów cierpiących na chorobę Alzheimera, białko β-amyloidu (np. typu dzikiego, wariant lub skrócone białko β-amyloidu) jest charakteryzującym składnikiem białkowym złogu amyloidowego. Zgodnie z tym, choroba Alzheimera jest przykładem „choroby charakteryzującej się złogami Αβ” lub „choroby związanej ze złogami Αβ”, np. w mózgu osobnika lub pacjenta. Określenia „białko β-amyloidu”, „peptyd β-amyloidowy”, „β-amyloid”, „Αβ” i „peptyd Αβ stosowane” są tutaj zamiennie.

„Środek immunogenny” lub „immunogen” jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciw sobie samemu po podaniu ssakowi, ewentualnie łącznie z adiuwantem.

Określenie „leczenie” w stosowanym tutaj znaczeniu definiuje się jako zastosowanie lub podanie pacjentowi środka terapeutycznego, lub zastosowanie lub podanie środka terapeutycznego do izolowanej tkanki lub linii komórkowej pochodzącej od pacjenta, który cierpi na chorobę, występuje u niego objaw choroby lub predyspozycja do choroby, mające na celu leczenie, wyleczenie, złagodzenie, przyniesienie ulgi, zmienienie, naprawienie, polepszenie, poprawienie lub wpłynięcie na chorobę, objawy choroby lub predyspozycję do choroby.

Określenie „skuteczna dawka” lub „skuteczne dawkowanie” definiuje się jako ilość wystarczającą do osiągnięcia lub co najmniej częściowego osiągnięcia wymaganego efektu. Określenie „terapeutycznie skuteczna dawka” definiuje się jako ilość wystarczającą do wyleczenia lub co najmniej częściowego zahamowania choroby i jej powikłań u pacjenta już cierpiącego na tą chorobę. Ilości skuteczne do tego zastosowania zależą od ostrości zakażenia i ogólnego stanu układu immunologicznego pacjenta.

Określenie „pacjent” obejmuje człowieka i inne osobniki będące ssakami, poddawane leczeniu profilaktycznemu lub terapeutycznemu.

„Rozpuszczalny” lub „zdysocjowany” Αβ oznacza niezagregowany lub zdezagregowany polipeptyd Αβ (np. rozpuszczalne dimery, trimery Αβ itp.). „Nierozpuszczalny” Αβ oznacza agregujący

PL 215 258 B1 polipeptyd Αβ, np. Αβ utrzymywany razem przez wiązania niekowalencyjne. Uważa się, że Αβ (np. Αβ42) ulega agregacji, co najmniej częściowo, ze względu na obecność reszt hydrofobowych na C-końcu peptydu (części transbłonowej domeny APP). Rozpuszczalny Αβ można znaleźć in vivo w płynach biologicznych, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy i/lub surowica. Alternatywnie, rozpuszczalny Αβ można wytworzyć przez rozpuszczenie liofilizowanego peptydu w czystym DMSO z obróbką ultradźwiękami. Powstały roztwór odwirowuje się (np. 14000 x g, 4°C, 10 minut) w celu usunięcia jakichkolwiek nierozpuszczalnych cząstek.

Określenie „funkcja efektorowa” dotyczy aktywności regionu Fc przeciwciała (np. przeciwciała IgG) i obejmuje np. zdolność przeciwciała do wiązania cząsteczek efektorowych, takich jak dopełniacz i/lub receptory Fc, które mogą kontrolować kilka funkcji immunologicznych przeciwciała, takich jak aktywność komórki efektorowej, liza, aktywność kierowana dopełniaczem, klirens przeciwciała oraz okres półtrwania przeciwciała.

Określenie „cząsteczka efektorowa” dotyczy cząsteczki, która jest zdolna do wiązania regionu Fc przeciwciała (np. przeciwciała IgG) włącznie z, ale nie tylko, białkiem dopełniacza lub receptorem Fc.

Określenie „komórka efektorowa” dotyczy komórki zdolnej do wiązania z częścią Fc przeciwciała (np. przeciwciała IgG) zazwyczaj przez receptor Fc wyrażany na powierzchni komórki efektorowej włącznie z, ale nie tylko, limfocytami, np. komórkami prezentującymi antygen lub komórkami T.

Określenie „region Fc” dotyczy C-końcowej części przeciwciała IgG, w szczególności C-końcowego regionu łańcucha(-ów) ciężkiego(-ich) wspomnianego przeciwciała. Pomimo tego, że granice regionu Fc i łańcucha ciężkiego IgG mogą się nieznacznie różnić, region Fc zazwyczaj definiuje się jako obejmujący reszty aminokwasowe od Cys226 do końca karboksylowego łańcucha(-ów) ciężkiego(-ich) IgG.

Określenie „numeracja Kabata” definiuje się, o ile nie zaznaczono tego inaczej, jako numerację reszt np. w łańcuchu ciężkim przeciwciała IgG przy pomocy wskaźnika EU takiego jak w Kabat i in.

(Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 5 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)), co wprowadza się tutaj jako źródło literaturowe.

Określenie „receptor Fc” lub „FcR” dotyczy receptora wiążącego region Fc przeciwciała. Zazwyczaj receptory Fc, które wiążą region Fc przeciwciała (np. przeciwciała IgG) obejmują, ale nie tylko, receptory podklasy FcyRI, FcyRII i FcyRIII, włącznie z allelicznymi wariantami oraz alternatywnie złożonymi formami tych receptorów. Receptory Fc opisano przeglądowo w Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel i in., Immunomethods 4: 25-34 (1994); oraz de Haas i in., J. Lab.

Clin. Med. 126: 330-41 (1995).

I. Reagenty immunologiczne i terapeutyczne

Immunologiczne i terapeutyczne reagenty obejmują lub zawierają immunogeny lub przeciwciała albo ich fragmenty funkcjonalne lub wiążące antygeny, jak tutaj zdefiniowano. Wiadomo, że podstawowa jednostka strukturalna przeciwciała zawiera tetramer podjednostek. Każdy tetramer składa się z dwóch identycznych par łańcuchów polipeptydowych, przy czym każda para zawiera jeden „lekki” (o około 25 kDa) i jeden „ciężki” łańcuch (o około 50-70 kDa). Część N-końcowa każdego łańcucha zawiera zmienny region złożony z około 100-110 lub większej liczby aminokwasów, odpowiedzialny przede wszystkim za rozpoznawanie antygenu. Część C-końcowa każdego łańcucha określa stały region odpowiedzialny przede wszystkim za funkcję efektorową.

Lekkie łańcuchy klasyfikuje się jako kappa lub lambda i mają one długość około 230 reszt. Ciężkie łańcuchy klasyfikuje się jako gamma (γ), mi (μ), alfa (α), delta (δ) lub epsilon (ε), zawierają one około 450-600 reszt i definiują izotyp przeciwciała odpowiednio jako IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. Zarówno ciężkie jak i lekkie łańcuchy są pofałdowane w domeny. Określenie „domena” oznacza globularny region białka, np. immunoglobuliny lub przeciwciała. Domeny immunoglobuliny lub przeciwciała zawierają, np. 3 lub 4 pętle peptydowe stabilizowane np. przez β-pofałdowaną strukturę i międzyłańcuchowe wiązanie dwusiarczkowe. Nienaruszone lekkie łańcuchy zawierają, np. 2 domeny (VL i CL), a nienaruszone ciężkie łańcuchy zawierają np. 4 lub 5 domen (VH, CH1, CH2 i CH3).

W lekkich i ciężkich łańcuchach zmienne i stałe regiony są połączone regionem „J” zawierającym około 12 lub większą liczbę aminokwasów, przy czym ciężki łańcuch zawiera również region „D” długości jeszcze około 10 aminokwasów (patrz ogólnie Fundamental Immunology (Paul W., red., 2 wydanie. Raven Press, N. Y. (1989), rozdz. 7, który wprowadza się w całości jako źródło literaturowe do wszelkich zastosowań).

Zmienne regiony każdej pary lekki/ciężki łańcuch tworzą miejsce wiązania przeciwciała. W związku z tym nienaruszone przeciwciało ma 2 miejsca wiązania. Z wyjątkiem dwufunkcyjnych lub

PL 215 258 B1 bispecyficznych przeciwciał, dwa miejsca wiązania są takie same. Wszystkie łańcuchy mają taką samą ogólną strukturę ze stosunkowo konserwowanymi regionami zrębowymi (FR) połączonymi trzema regionami hiperzmiennymi, określanymi również jako regiony determinujące dopasowanie lub CDR. Naturalnie występujące łańcuchy lub rekombinacyjnie wytworzone łańcuchy mogą być eksprymowane z sekwencją liderową, która jest usuwana podczas obróbki w komórce, z wytworzeniem dojrzałego łańcucha. Można również wytworzyć rekombinacyjnie dojrzałe łańcuchy zawierające nie występującą naturalnie sekwencję liderową, np. w celu wzmocnienia wydzielania lub zmiany obróbki konkretnego interesującego łańcucha.

CDR dwóch dojrzałych łańcuchów w każdej parze są dopasowane regionami zrębowymi, co umożliwia wiązanie z określonym epitopem. Od końca N- do C-końca łańcuchy, zarówno lekki, jak i ciężki łańcuch zawierają domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. „FR4” określa się również jako region D/J części zmiennej ciężkiego łańcucha oraz region J części zmiennej lekkiego łańcucha. Przypisanie aminokwasów do każdej z domen jest zgodne z definicją Kabata, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 i 1991). Alternatywne definicje strukturalne zostały zaproponowane przez Chothia i in., J. Mol. Biol. 196: 901 (1987); Nature 342: 878 (1989); oraz J. Mol. Biol. 186: 651 (1989) (poniżej określane łącznie jako „Chothia i in.”, który wprowadza się w całości jako źródło literaturowe do wszelkich zastosowań).

A. Przeciwciała przeciw Αβ

Środki terapeutyczne według wynalazku zawierają przeciwciała, które specyficznie wiążą się z Αβ lub innymi składnikami płytki amyloidowej. Korzystnymi przeciwciałami są przeciwciała monoklonalne. Pewne takie przeciwciała wiążą się specyficznie z zagregowaną postacią Αβ bez wiązania się z postacią rozpuszczalną. Pewne wiążą się specyficznie z postacią rozpuszczalną bez wiązania się z postacią zagregowaną. Pewne wiążą się zarówno z postacią zagregowaną, jak i rozpuszczalną. Przeciwciała stosowane w sposobach terapeutycznych korzystnie zawierają nienaruszony region stały lub co najmniej część stałego regionu wystarczającą do oddziaływania z receptorem Fc. Korzystnymi przeciwciałami są przeciwciała skuteczne w stymulacji kierowanej Fc fagocytozy Αβ w płytkach. Ludzki izotyp IgG1 jest korzystny z uwagi na to, iż wykazuje najwyższe powinowactwo spośród ludzkich izotypów względem receptora FcRI na komórkach fagocytujących (np. na makrofagach mózgowych lub komórkach mikrogleju). Ludzkie IgG1 jest równoważne mysiemu IgG2a, zatem drugie z nich jest odpowiednie do badania skuteczności in vivo w ssaczych (np. mysich) modelach choroby Alzheimera. Można także stosować bispecyficzne fragmenty Fab, w których jedno ramię przeciwciała wykazuje specyficzność względem Αβ, a drugie względem receptora Fc. Korzystne przeciwciała wiążą się z Αβ z powinowactwem wiązania większym (lub równym) około 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ lub 10¹⁰ M^-1 (w tym z powinowactwami pośrednimi w stosunku do tych wartości).

Przeciwciała monoklonalne wiążą się z określonym epitopem Αβ, którym może być epitop konformacyjny lub niekonformacyjny. Profilaktyczną i terapeutyczną skuteczność przeciwciał można zbadać z zastosowaniem procedur z transgenicznym modeIem zwierzęcym, opisanych w przykładach. Korzystne monoklonalne przeciwciała wiążą się z epitopem pomiędzy resztami 1-10 w Αβ (przy czym pierwszą resztę na końcu N naturalnego Αβ oznaczono jako 1), korzystniej z epitopem pomiędzy resztami 3-7 Αβ. W niektórych sposobach stosuje się wiele przeciwciał monoklonalnych o specyficznościach wiązania różnych epitopów, np. przeciwciało specyficzne względem epitopu pomiędzy resztami 3-7 Αβ można podawać równocześnie z przeciwciałem specyficznym względem epitopu leżącego na zewnątrz reszt 3-7 Αβ. Takie przeciwciała można podawać kolejno lub równocześnie. Można również stosować (np. przez podawanie lub współpodawanie) przeciwciała względem składników amyloidowych innych niż Αβ.

Specyficzność przeciwciała względem epitopu można wyznaczyć, np. przez wytworzenie biblioteki prezentacji fagowej, której różne składniki prezentują różne subsekwencje Αβ. Następnie bibliotekę prezentacji fagowej selekcjonuje się pod względem składników specyficznie wiążących się z badanym przeciwciałem. Wyodrębnia się rodzinę sekwencji. Zazwyczaj różne składniki takiej rodziny zawierają wspólną sekwencję rdzeniową i sekwencje flankujące o zmiennej długości. Najkrótsza sekwencja rdzeniowa, wykazująca specyficzne wiązanie z przeciwciałem, określa epitop związany przez przeciwciało. Przeciwciała można także badać pod względem specyficzności dla epitopów w teście współzawodnictwa z przeciwciałem, którego specyficzność epitopowa już została ustalona. Przykładowo, przeciwciała, które współzawodniczą z przeciwciałem 12B4 o wiązanie się z Αβ, wiążą się z tym samym lub podobnym epitopem co 12B4, np. pomiędzy resztami Αβ 3-7. Przesiewowe badanie przeciwciała pod względem specyficzności epitopowej stanowi skuteczny środek przewidywania sku14

PL 215 258 B1 teczności terapeutycznej. Przykładowo, przeciwciało, odnośnie którego ustalono, że wiąże się z epitopem pomiędzy resztami 1-7 Αβ, będzie prawdopodobnie skuteczne w profilaktyce i leczeniu choroby Alzheimera, zgodnie z metodologią według wynalazku.

Przeciwciała, które specyficznie wiążą się z korzystnym segmentem Αβ bez wiązania się z innymi regionami Αβ, wykazują szereg zalet w porównaniu z monoklonalnymi przeciwciałami wiążącymi się z innymi regionami lub z surowicami poliklonalnymi dla nienaruszonego Αβ. Po pierwsze, przy jednakowych dawkach wagowych, dawki przeciwciał, które specyficznie wiążą się z korzystnymi segmentami zawierają wyższą molowo dawkę przeciwciała skutecznego w klirensie płytek amyloidowych. Po drugie, przeciwciała specyficznie wiążące się z korzystnymi segmentami mogą wywoływać odpowiedź klirensową przeciw złogom amyloidowym bez wywoływania odpowiedzi klirensowej przeciw nienaruszonemu polipeptydowi APP, dzięki czemu maleją potencjalne skutki uboczne.

1. Wytwarzanie nie-ludzkich przeciwciał

Można wytworzyć nie-ludzkie przeciwciała, przykładowo przeciwciał wykazujących specyficzność względem korzystnych epitopów Αβ. Takie przeciwciała można stosować do formułowania różnych środków terapeutycznych lub, korzystnie, dostarczają one regiony determinujące dopasowanie do wytwarzania humanizowanych lub chimerycznych przeciwciał (opisanych szczegółowo poniżej). Wytwarzanie nie-ludzkich monoklonalnych przeciwciał, np. mysich, świnki morskiej, naczelnych, królika lub szczura, można osiągnąć np. poprzez immunizację zwierzęcia z użyciem Αβ. Można także zastosować dłuższy polipeptyd zawierający Αβ lub immunogenny fragment Αβ lub przeciwciała przeciwidiotypowe przeciw przeciwciałom przeciw Αβ. (Patrz Harlow i Lane, jak wyżej, pozycję tą wprowadza się jako źródło literaturowe do wszelkich zastosowań). Taki immunogen można otrzymać z naturalnego źródła, drogą syntezy peptydu lub drogą ekspresji rekombinacyjnej. Immunogen można ewentualnie podawać w postaci połączonej lub w inny sposób skompleksowanej z białkiem nośnikowym, jak to opisano poniżej. Immunogen można ewentualnie podawać z adiuwantem. Określenie „adiuwant” dotyczy związku, który przy podawaniu w połączeniu z antygenem wzmacnia odpowiedź odpornościową na antygen, ale który podawany sam nie wywołuje odpowiedzi odpornościowej na antygen. Adiuwanty mogą wzmacniać odpowiedź odpornościową według szeregu mechanizmów, obejmujących rekrutację limfocytów, stymulację komórek B i/lub T oraz stymulację makrofagów. Można stosować szereg rodzajów adiuwantów, jak to opisano poniżej. Kompletny adiuwant Freunda, po którym stosuje się adiuwant niekompletny, jest korzystny do immunizacji zwierząt laboratoryjnych.

Do otrzymywania przeciwciał poliklonalnych zazwyczaj używa się króliki lub świnki morskie. Przykładowe wytwarzanie poliklonalnych przeciwciał, np. do ochrony biernej, można przeprowadzić w sposób następujący. 125 nietransgenicznych myszy immunizuje się 100 μg Αβ1-42 z adiuwantem CFA/IFA i uśmierca się po 4-5 miesiącach. Zbiera się krew immunizowanych myszy. IgG oddziela się od innych składników krwi. Przeciwciało specyficzne względem immunogenu można częściowo oczyścić metodą chromatografii powinowactwa. Średnio z każdej myszy otrzymuje się około 0,5-1 mg przeciwciała specyficznego względem immunogenu, co daje łącznie 60-120 mg.

Do otrzymywania przeciwciał monoklonalnych zazwyczaj używa się myszy. Przeciwciała monoklonalne można wytworzyć przeciw fragmentowi przez wstrzyknięcie myszy fragmentu lub dłuższej formy Αβ, wytworzenie hybrydom i selekcję hybrydom pod względem przeciwciała, które specyficznie wiąże się z Αβ. Przeciwciała ewentualnie selekcjonuje się pod względem wiązania ze specyficznym regionem lub żądanym fragmentem Αβ bez wiązania się z innymi nie nakładającymi się fragmentami Αβ. To ostatnie selekcjonowanie można przeprowadzić przez określenie wiązania przeciwciała ze zbiorem mutantów delecyjnych peptydu Αβ i określenie, które mutanty delecyjne wiążą się z przeciwciałem. Wiązanie można ocenić, np. techniką Western blotting lub ELISA. Najmniejszy fragment wykazujący specyficzne wiązanie z przeciwciałem określa epitop przeciwciała. Alternatywnie, specyficzność epitopową można wyznaczyć w teście współzawodnictwa, w którym przeciwciała, badane i odniesienia, współzawodniczą o wiązanie z Αβ. Gdy przeciwciała badane i odniesienia współzawodniczą, wiążą się z tym samym epitopem lub epitopami będącymi wystarczająco blisko siebie tak, że wiązanie jednego przeciwciała zakłóca wiązanie drugiego. Korzystnym izotypem takiego przeciwciała jest mysi izotyp IgG2a lub równoważny izotyp innego gatunku. Mysi izotyp IgG2a jest równoważny ludzkiemu izotypowi IgG1 (np. ludzkiej IgG1).

2. Chimeryczne i humanizowane przeciwciała

Wynalazek dotyczy chimerycznych i/lub humanizowanych przeciwciał (np. chimerycznych i/lub humanizowanych immunoglobulin), specyficznych względem peptydu β-amyloidu. Chimeryczne i/lub humanizowane przeciwciała wykazują taką samą lub podobną specyficzność i powinowactwo wiązaPL 215 258 B1 nia, jak mysie lub inne nie-ludzkie przeciwciało, które stanowi wyjściowy materiał do konstruowania chimerycznego lub humanizowanego przeciwciała.

A. Wytwarzanie chimerycznych przeciwciał

Określenie „chimeryczne przeciwciało” dotyczy przeciwciała, którego geny lekkiego i ciężkiego łańcucha zostały skonstruowane, zazwyczaj technikami inżynierii genetycznej, z segmentów genu immunoglobuliny należących do różnych gatunków. Przykładowo segmenty zmienne (V) genów z mysiego monoklonalnego przeciwciała można połączyć z ludzkimi segmentami stałymi (C), takimi jak IgG1 i IgG4. Ludzki izotyp IgG1 jest korzystny. W związku z tym typowe chimeryczne przeciwciało jest białkiem hybrydowym zawierającym domenę V lub wiążącą antygen z mysiego przeciwciała i domenę C lub efektorową z ludzkiego przeciwciała.

B. Wytwarzanie humanizowanych przeciwciał

Określenie „humanizowane przeciwciało” odnosi się do przeciwciała zawierającego co najmniej jeden łańcuch zawierający reszty zrębowe części zmiennej, zasadniczo z łańcucha ludzkiego przeciwciała (określanego jako akceptorowa immunoglobulina lub przeciwciało) i co najmniej jeden region determinujący dopasowanie, zasadniczo z mysiego przeciwciała, (określanego jako donorowa immunoglobulina lub przeciwciało), patrz Queen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989), US nr 5 530 101, US nr 5 585 089, US nr 5 693 761, US nr 5 693 762, SeIick i in., WO 90/07861 oraz Winter, US nr 5 225 539 (które wprowadza się w całości jako źródła literaturowe do wszystkich zastosowań). Jeśli obecny jest stały(-e) region(-y), to pochodzi(-ą) on(-e) również zasadniczo lub wyłącznie z ludzkiej immunoglobuliny.

Wstawienie mysich CDR do ludzkiego zrębu zmiennej domeny najprawdopodobniej doprowadzi do zachowania ich prawidłowej orientacji przestrzennej, jeśli ludzki zrąb zmiennej domeny przyjmuje taką samą lub podobną konformację, jak mysi zrąb części zmiennej, z której pochodzą CDR. Osiąga się to przez zastosowanie ludzkich domen zmiennych z ludzkich przeciwciał, których sekwencje zrębowe wykazują wysoki stopień identyczności sekwencji z mysimi domenami zrębowymi części zmiennej, z których pochodzą CDR. Regiony zrębowe części zmiennej łańcucha ciężkiego i lekkiego mogą pochodzić z tych samych lub różnych sekwencji ludzkiego przeciwciała. Sekwencje ludzkiego przeciwciała mogą być sekwencjami naturalnie występującego ludzkiego przeciwciała, albo mogą być sekwencjami konsensusowymi dla szeregu ludzkich przeciwciał, patrz Kettleborough i in., Protein Engineering 4: 773 (1991); Kolbinger i in., Protein Engineering 6: 971 (1993) oraz Carter i in., WO nr 92/22 653.

Po zidentyfikowaniu regionów determinujących dopasowanie mysiej immunoglobuliny donorowej i odpowiednich akceptorowych immunoglobulin ludzkich, następnym etapem jest ustalenie, które reszty z tych składników powinny być ewentualnie podstawione w celu zoptymalizowania właściwości otrzymanego humanizowanego przeciwciała. Ogólnie, podstawienie ludzkich reszt aminokwasowych mysimi powinno być ograniczone do minimum, gdyż wprowadzenie mysich reszt zwiększa ryzyko otrzymania przeciwciała wywołującego u ludzi odpowiedź ludzkiego-przeciw-mysiego-przeciwciała (HAMA). Znane sposoby wyznaczania odpowiedzi odpornościowej można zastosować do monitorowania odpowiedzi HAMA u konkretnego pacjenta lub podczas prób klinicznych. U pacjentów, którym podano humanizowane przeciwciała, można dokonać oceny immunogenności na początku i w trakcie stosowania takiej terapii. Odpowiedź HAMA mierzy się znanymi sposobami, np. przez wykrywanie przeciwciał względem humanizowanego odczynnika terapeutycznego, w próbkach surowicy pacjenta, w tym techniką powierzchniowego rezonansu plazmonowego (BIACORE) i/lub w analizie ELISA na fazie stałej.

Pewne aminokwasy z ludzkich reszt regionu zrębowego części zmiennej są wybrane do podstawienia w oparciu o ich możliwy wpływ na konformację CDR i/lub wiązanie z antygenem. Nienaturalne nakładanie się mysich regionów CDR z ludzkimi regionami zrębowymi części zmiennej może doprowadzić do nienaturalnych napięć konformacyjnych, co, o ile nie zostanie skorygowane przez podstawienie pewnych reszt aminokwasowych, prowadzi do utraty powinowactwa wiązania.

Dobór reszt aminokwasów do podstawienia ustala się częściowo w oparciu o modelowanie komputerowe. Opisano tutaj sprzęt i oprogramowanie komputerowe do wytwarzania trójwymiarowych obrazów cząsteczek immunoglobuliny. Ogólnie, modele cząsteczek wytwarza się wychodząc z ustalonych struktur łańcuchów immunoglobuliny lub ich domen. Łańcuchy do modelowania porównuje się pod względem podobieństwa sekwencji aminokwasów z łańcuchami lub domenami ustalonych struktur trójwymiarowych i łańcuchy lub domeny wykazujące najwyższe podobieństwo sekwencji wybiera się jako punkty wyjściowe do konstrukcji modelu cząsteczki. Do modelowania wybiera się łańcuchy lub

PL 215 258 B1 domeny wykazujące co najmniej 50% identyczności sekwencji, korzystnie te, które wykazują co najmniej 60%, 70%, 80%, 90% identyczności sekwencji lub powyżej. Opracowane wyjściowe struktury modyfikuje się, aby wprowadzić różnice pomiędzy konkretnymi aminokwasami w modelowanych łańcuchach lub domenach immunoglobuliny i w wyjściowej strukturze. Następnie zmodyfikowane struktury składa się w złożoną immunoglobulinę. Ostatecznie model optymalizuje się pod względem minimum energetycznego i sprawdza się, czy wszystkie atomy znajdują się w odpowiedniej odległości od innych oraz czy długości wiązań i kąty pomiędzy nimi znajdują się w granicach dopuszczalnych chemicznie.

Doboru reszt aminokwasowych do podstawienia można również częściowo dokonać przez badanie charakterystyki aminokwasów w konkretnych miejscach lub empiryczną obserwację wpływu podstawienia lub mutagenezy konkretnych aminokwasów. Przykładowo, gdy aminokwas różni się pomiędzy mysią resztą regionu zrębowego części zmiennej i wybraną ludzką resztą regionu zrębowego części zmiennej, aminokwas ludzkiego zrębu powinien być zazwyczaj równoważnym aminokwasem zrębowym z mysiego przeciwciała, gdy z pewnym prawdopodobieństwem oczekuje się, że aminokwas:

(1) niekowalencyjnie wiąże się bezpośrednio z antygenem, (2) sąsiaduje z regionem CDR, (3) w inny sposób oddziaływuje z regionem CDR (np. znajduje się w obszarze około 3-6 A od regionu CDR, co ustala się na podstawie modelowania komputerowego) lub (4) uczestniczy w połączeniu VL-VH.

Do reszt, które „niekowalencyjnie wiążą się bezpośrednio z antygenem” należą aminokwasy w pozycjach regionów zrębowych, dla których występuje dobre prawdopodobieństwo bezpośredniego oddziaływania z aminokwasami na antygenie poprzez określone siły chemiczne, np. poprzez wiązania wodorowe, siły Van der Waalsa, oddziaływania hydrofobowe itp.

Regiony CDR i zrębowe określone są według definicji Kabata i in. lub Chothia i in., jak wyżej. Gdy reszty zrębowe, według definicji Kabata i in., jak wyżej, stanowią reszty pętli strukturalnej, zdefiniowanej według Chothia i in., jak wyżej, aminokwasy obecne w mysim przeciwciele można wybrać do podstawienia w humanizowanym przeciwciele. Do reszt „sąsiadujących z regionem CDR” należą reszty aminokwasów w pozycjach bezpośrednio sąsiadujących z jednym lub większą liczbą CDR w sekwencji pierwszorzędowej łańcucha humanizowanej immunoglobuliny, np. w pozycjach bezpośrednio sąsiadujących z CDR zgodnie z definicją Kabata lub CDR zgodnie z definicją Chothia (patrz np. Chothia i Lesk, JMB 196: 901 (1987)). Takie aminokwasy ze szczególnym prawdopodobieństwem będą oddziaływać z aminokwasami w CDR oraz, jeśli wybrane są z akceptora, będą zniekształcać donorowe CDR i zmniejszać powinowactwo. Ponadto, sąsiadujące aminokwasy mogą oddziaływać bezpośrednio z antygenem (Amit i in., Science, 233: 747 (1986), publikacja, którą wprowadza się jako źródło literaturowe) i wybranie tych aminokwasów z donora może być pożądane, aby utrzymać kontakty z antygenem, zapewniające powinowactwo w oryginalnym przeciwciele .

Do reszt „w inny sposób oddziaływujących z regionem CDR” należą te, w przypadku których na podstawie analizy struktury drugorzędowej ustalono, że są w przestrzennej orientacji wystarczającej do wpływania na region CDR. W jednej postaci reszty „w inny sposób oddziaływujące z regionem CDR” identyfikuje się na podstawie analizy trójwymiarowego modelu immunoglobuliny donorowej (np. modelu wygenerowanego komputerowo). Trójwymiarowy model, zazwyczaj wyjściowego przeciwciała donorowego, wykazuje, że pewne aminokwasy poza CDR znajdują się blisko CDR i istnieje duże prawdopodobieństwo ich oddziaływania z aminokwasami w CDR poprzez wiązania wodorowe, siły Van der Waalsa, oddziaływania hydrofobowe, itp. W tych pozycjach aminokwasów może być wybrany raczej aminokwas immunoglobuliny donorowej niż aminokwas immunoglobuliny akceptorowej. Aminokwasy według tego kryterium będą zazwyczaj miały atom bocznego łańcucha w odległości do około 3 angstremów (A) od pewnego atomu w CDR i muszą zawierać atom, który może oddziaływać z atomami CDR z wykorzystaniem określonych sił chemicznych, takich jak wymienione powyżej.

W przypadku atomów, które mogą tworzyć wiązanie wodorowe, odległość 3 A mierzy się pomiędzy ich jądrami, ale w przypadku atomów, które nie tworzą wiązania, odległość 3 A mierzy się pomiędzy ich powierzchniami Van der Waalsa. Dlatego też w tym ostatnim przypadku, jądra muszą znajdować się w granicach około 6 A (3 A plus suma promieni Van der Waalsa) w przypadku atomów, które uważa się za zdolne do oddziaływania. W wielu przypadkach jądra będą w odległości 4 lub 5 - 6 A. Przy ustalaniu, czy aminokwas może oddziaływać z CDR, korzystnie nie uwzględnia się ostatnich

PL 215 258 B1 aminokwasów ciężkiego łańcucha CDR2 jako części CDR, gdyż z punktu widzenia struktury tych 8 aminokwasów zachowuje się bardziej jako część zrębu.

Aminokwasy, które są zdolne do oddziaływania z aminokwasami w CDR, można zidentyfikować w jeszcze inny sposób. Dostępną dla rozpuszczalnika powierzchnię każdego zrębowego aminokwasu oblicza się dwoma sposobami: (1) dla nienaruszonego przeciwciała oraz (2) dla hipotetycznej cząsteczki stanowiącej przeciwciało, z którego usunięto jego CDR. Znacząca różnica pomiędzy tymi liczbami, około 10² A lub powyżej, wskazuje, że dostęp zrębowego aminokwasu do rozpuszczalnika jest co najmniej częściowo zablokowany przez CDR, a zatem ten aminokwas kontaktuje się z CDR. Dostępną dla rozpuszczalnika powierzchnię aminokwasu można obliczyć w oparciu o trójwymiarowy model przeciwciała, z użyciem znanych algorytmów (np. Connolly, J. Appl. Cryst. 16: 548 (1983) oraz Lee i Richards, J. Mol. Biol. 55: 379 (1971), publikacje, które wprowadza się jako źródła literaturowe). Aminokwasy zrębowe mogą także czasami oddziaływać z CDR pośrednio, przez wpływanie na konformację innego zrębowego aminokwasu, który z kolei styka się z CDR.

Wiadomo, że aminokwasy w szeregu pozycjach w zrębie są zdolne do oddziaływania z CDR w wielu przeciwciałach (Chothia i Lesk, jak wyżej, Chothia i in., jak wyżej oraz Tramontano i in., J. Mol. Biol. 215: 175 (1990), przy czym wszystkie publikacje wprowadza się jako źródła literaturowe). Należy podkreślić, że wiadomo, iż aminokwasy w pozycjach 2, 48, 64 i 71 łańcucha lekkiego oraz 26-30, 71 i 94 łańcucha ciężkiego (numerowanie według Kabata) są zdolne do oddziaływania z CDR w wielu przeciwciałach. Jest również prawdopodobne, że aminokwasy w pozycji 35 w łańcuchu lekkim oraz 93 i 103 w łańcuchu ciężkim mogą oddziaływać z CDR. W pozycjach o wszystkich tych numerach korzystnie dobiera się raczej aminokwas donorowy niż aminokwas akceptorowy (gdy różnią się one) w humanizowanej immunoglobulinie. Z drugiej strony pewne reszty zdolne do oddziaływania z regionem CDR, takie jak pierwszych 5 aminokwasów łańcucha lekkiego, można czasami wybrać z akceptorowej immunoglobuliny bez utraty powinowactwa w humanizowanej immunoglobulinie.

Do reszt, które „uczestniczą w połączeniu VL-VH” lub „reszt upakowania” należą reszty w miejscu połączenia pomiędzy VL i VH, zdefiniowanym np. w publikacjach Novotny i Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4592-66 (1985) lub Chothia i in., jak wyżej. Zazwyczaj nietypowe reszty upakowania powinny być zachowane w humanizowanym przeciwciele, jeśli różnią się one od odpowiednich reszt w ludzkich zrębach.

Zazwyczaj, jeden lub większa liczba aminokwasów spełniających powyższe kryteria, jest podstawiona. W pewnych postaciach wszystkie lub większość aminokwasów spełniających powyższe kryteria jest podstawiona. Czasami istnieją pewne wątpliwości odnośnie tego, czy konkretny aminokwas spełnia powyższe kryteria, tak że wytwarza się wariantowe immunoglobuliny, z których jedna zawiera określone podstawienie, a inne nie zawierają go. Otrzymane w ten sposób wariantowe immunoglobuliny można zbadać w dowolnym z opisanych tutaj testów w celu ustalenia żądanej aktywności i wybrania korzystnej immunoglobuliny.

Zwykle regiony CDR w humanizowanych przeciwciałach są zasadniczo identyczne, a częściej identyczne z odpowiednimi regionami CDR donorowego przeciwciała. Choć nie jest to zazwyczaj pożądane, czasami można wykonać jedno lub większą liczbę konserwatywnych podstawień aminokwasów w resztach CDR bez znaczącego wpływu na powinowactwo wiązania otrzymanej humanizowanej immunoglobuliny. Konserwatywne podstawienia obejmują połączenia, takie jak gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; Iys, arg; oraz phe, tyr.

Dodatkowymi kandydatami do podstawienia są aminokwasy akceptorowego ludzkiego zrębu, które są nietypowe lub „rzadkie” w ludzkiej immunoglobulinie w tej pozycji. Te aminokwasy można podstawić aminokwasami z odpowiednich pozycji mysiego donorowego przeciwciała lub z odpowiednich pozycji bardziej typowych ludzkich immunoglobulin. Przykładowo, podstawienie może być pożądane, gdy aminokwas w ludzkim regionie zrębowym immunoglobuliny akceptorowej jest rzadki w tej pozycji, a odpowiedni aminokwas w donorowej immunoglobulinie jest powszechny w tej pozycji w sekwencjach ludzkiej immunoglobuliny; albo gdy aminokwas w akceptorowej immunoglobulinie jest rzadki w tej pozycji, a odpowiedni aminokwas w donorowej immunoglobulinie jest również rzadki, w stosunku do innych ludzkich sekwencji. To kryterium ułatwia zapewnienie, że nietypowy aminokwas w ludzkim zrębie nie zaburzy struktury przeciwciała. Ponadto przez zastąpienie nietypowego ludzkiego aminokwasu akceptorowego aminokwasem z donorowego przeciwciała, które jest bardziej typowe dla ludzkiego przeciwciała, humanizowanemu przeciwciału można nadać mniejszą immunogenność.

W opisie określenie „rzadki” oznacza aminokwas występujący w danej pozycji w mniej niż około 20%, a zazwyczaj w mniej niż około 10% sekwencji w reprezentatywnej próbie sekwencji, a użyte

PL 215 258 B1 w opisie określenie „powszechny” oznacza aminokwas występujący w powyżej około 25%, a zazwyczaj w powyżej około 50% sekwencji w reprezentatywnej próbie. Przykładowo, wszystkie sekwencje ludzkiego zmiennego regionu łańcucha lekkiego i ciężkiego są odpowiednio pogrupowane w „podgrupy” sekwencji, które wykazują szczególną homologię pomiędzy sobą i zawierają takie same aminokwasy w pewnych krytycznych pozycjach (Kabat i in., jak wyżej). Przy decydowaniu o tym, czy aminokwas w ludzkiej sekwencji akceptorowej jest „rzadki”, czy też „powszechny” wśród ludzkich sekwencji, często korzystnie uwzględnia się tylko ludzkie sekwencje z tej samej podgrupy, co sekwencja akceptorowa.

Dodatkowymi kandydatami do podstawienia są aminokwasy akceptorowego ludzkiego zrębu, które mogłyby być zidentyfikowane jako część regionu CDR zgodnie z definicją alternatywną, którą zaproponowali Chothia i in., jak wyżej. Dodatkowymi kandydatami do podstawienia są aminokwasy akceptorowego ludzkiego zrębu, które mogłyby być zidentyfikowane jako część regionu CDR zgodnie z definicją AbM i/lub kontaktową.

Dodatkowymi kandydatami do podstawienia są akceptorowe reszty zrębowe, które odpowiadają rzadkiej lub nietypowej donorowej reszcie zrębowej. Rzadkimi lub nietypowymi donorowymi resztami zrębowymi są te, które są rzadkie lub nietypowe (w zdefiniowanym znaczeniu) dla mysiego przeciwciała w tej pozycji. W przypadku mysich przeciwciał, podgrupę można ustalić według Kabata oraz zidentyfikować pozycje reszt, które różnią się od konsensusu. Te specyficzne różnice donorów mogą wskazywać na zwiększające aktywność mutacje somatyczne w mysiej sekwencji. Te nietypowe reszty zachowuje się, w przypadku których przewiduje się wpływ na wiązanie, a reszty, w przypadku których przewiduje się, że nie mają znaczenia dla wiązania, można podstawić.

Dodatkowymi kandydatami do podstawienia są niezarodkowe reszty występujące w akceptorowym regionie zrębowym. Przykładowo, gdy uzyska się ulinowienie łańcucha przeciwciała akceptorowego (np. łańcuch ludzkiego przeciwciała wykazujący znaczącą identyczność sekwencji z łańcuchem przeciwciała donorowego) do zarodkowego łańcucha przeciwciała (również wykazującego znaczącą identyczność sekwencji z łańcuchem donorowym), reszty nie dopasowane pomiędzy akceptorowym zrębem łańcucha i zarodkowym zrębem łańcucha można podstawić odpowiednimi resztami z sekwencji zarodkowej.

Poza specyficznymi podstawieniami aminokwasowymi, przedyskutowanymi powyżej, regiony zrębowe humanizowanych immunoglobulin są zwykle zasadniczo identyczne, a częściej identyczne z regionami zrębowymi ludzkiego przeciwciała, z którego pochodzą. Oczywiście bezpośredni udział w specyficzności lub powinowactwie przeciwciała wielu spośród aminokwasów w regionie zrębowym jest niewielki lub żaden. W związku z tym można zaakceptować wiele poszczególnych konserwatywnych podstawień reszt zrębowych bez znaczącej zmiany specyficzności lub powinowactwa otrzymanej humanizowanej immunoglobuliny. W związku z tym, w jednej postaci region zrębowy części zmiennej humanizowanej immunoglobuliny wykazuje co najmniej 85% identyczności sekwencji z sekwencją ludzkiego regionu zrębowego części zmiennej lub konsensusem takich sekwencji. W innej postaci region zrębowy części zmiennej humanizowanej immunoglobuliny wykazuje co najmniej 90%, korzystnie 95%, korzystniej 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności sekwencji z sekwencją ludzkiego regionu zrębowego części zmiennej lub konsensusem takich sekwencji. Zazwyczaj jednak takie podstawienia są niepożądane.

Humanizowane przeciwciała korzystnie wykazują specyficzne powinowactwo wiązania z antygenem co najmniej 10⁷, 10⁸, 10⁹ lub 10¹⁰ M^-1. Zwykle górna granica powinowactwa wiązania humanizowanego przeciwciała z antygenem jest trzy-, cztero- Iub pięciokrotnie wyższa niż w przypadku immunoglobuliny donorowej. Często dolna granica powinowactwa wiązania jest również trzy-, cztero- lub pięciokrotnie wyższa niż w przypadku immunoglobuliny donorowej. Alternatywnie, powinowactwo wiązania można porównać z powinowactwem humanizowanego przeciwciała nie zawierającego podstawień (czyli przeciwciała zawierającego donorowe CDR i akceptorowe FR, ale bez podstawień FR). W takich przypadkach wiązanie zoptymalizowanego przeciwciała (z podstawieniami) jest korzystnie co najmniej 2-3-krotnie lub 3-4-krotnie wyższe niż niepodstawionego przeciwciała. W celu dokonania porównań aktywność różnych przeciwciał można oznaczyć techniką BIACORE (czyli techniką powierzchniowego rezonansu plazmonowego z użyciem nieznakowanych reagentów) lub w testach konkurencyjnego wiązania.

C. Wytwarzanie humanizowanych przeciwciał 12B4

Korzystna postać wynalazku dotyczy humanizowanego przeciwciała dla N-końca Αβ, w szczególności do stosowania w opisanych tutaj sposobach terapeutycznych i/lub diagnostycznych. Zgodnie

PL 215 258 B1 z wynalazkiem, materiałem wyjściowym do wytwarzania humanizowanych przeciwciał jest 12B4. 12B4 jest specyficzne dla N-końca Αβ oraz, jak wykazano, pośredniczy w fagocytozie (np. wywołuje fagocytozę) płytki amyloidowej. Klonowanie i sekwencjonowanie cDNA kodującego regiony zmienne ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała 12B4 opisano w przykładzie I.

Odpowiednie sekwencje ludzkiego przeciwciała akceptorowego identyfikuje się przez komputerowe porównywanie sekwencji aminokwasów mysich regionów zmiennych z sekwencjami znanych ludzkich przeciwciał. Porównanie przeprowadza się osobno dla ciężkiego i lekkiego łańcucha, z tym, że zasady w każdym przypadku są podobne. W szczególności, zmienne domeny ludzkich przeciwciał, których sekwencje zrębowe wykazują wysoki stopień identyczności sekwencji z mysimi regionami zrębowymi VL i VH zidentyfikowano przez przeszukanie bazy danych Kabat Database z wykorzystaniem NCBI BLAST (dostępnego publicznie przez serwer internetowy National Institutes of Health NCBI) odpowiednimi mysimi sekwencjami zrębowymi. W jednej postaci wybiera się sekwencje akceptorowe wykazujące ponad 50% identyczności sekwencji z mysimi sekwencjami donorowymi. Korzystnie, wybiera się sekwencje przeciwciała akceptorowego wykazujące 60%, 70%, 80%, 90% identyczności lub powyżej.

Komputerowe porównywanie 12B4 potwierdziło, że lekki łańcuch 12B4 wykazuje najwyższą identyczność sekwencji z ludzkimi lekkimi łańcuchami podtypu kappa II, a ciężki łańcuch 12B4 wykazuje najwyższą identyczność sekwencji z ludzkimi ciężkimi łańcuchami podtypu II, według definicji Kabata i in., jak wyżej. W związku z tym ludzkie regiony zrębowe, lekki i ciężki, korzystnie pochodzą z ludzkich przeciwciał tych podtypów lub z sekwencji konsensusowych tych podtypów. Korzystne regiony zmienne ludzkiego łańcucha lekkiego wykazujące najwyższą identyczność sekwencji z odpowiednim regionem z 12B4 pochodzą z przeciwciała o numerze ID Kabata 005036. Korzystne regiony zmienne ludzkiego łańcucha ciężkiego wykazujące najwyższą identyczność sekwencji z odpowiednim regionem z 12B4 pochodzą z przeciwciała o numerze ID Kabata 000333, przeciwciała o numerze dostępu Genbank AAB35009, przeciwciała o numerze dostępu Genbank AAD53816, przy czym przeciwciało o numerze ID Kabata 000333 jest korzystniejsze.

Następnie, reszty wybiera się do podstawienia w sposób następujący. Gdy występuje różnica aminokwasu pomiędzy regionem zrębowym części zmiennej 12B4 i równoważnym ludzkim regionem zrębowym części zmiennej, aminokwas ludzkiego zrębu należy zazwyczaj podstawić równoważne mysim aminokwasem, jeśli z pewną dozą prawdopodobieństwa oczekuje się, że aminokwas:

(1) niekowalencyjnie wiąże się bezpośrednio z antygenem, (2) sąsiaduje z regionem CDR, stanowi część regionu CDR zgodnie z alternatywną definicją, którą zaproponowali Chothia i in., jak wyżej lub w inny sposób oddziaływuje z regionem CDR (czyli znajduje się w obszarze około 3 A od regionu CDR) lub (3) uczestniczy w połączeniu VL-VH.

Komputerowe modelowanie regionów zmiennych łańcuchów ciężkiego i lekkiego przeciwciała 12B4 i humanizację przeciwciała 12B4 opisano w przykładzie V. W skrócie, trójwymiarowy model wygenerowano w oparciu o najbliższe ustalone struktury mysiego przeciwciała dla łańcuchów ciężkiego i lekkiego. Model dokładniej zoptymalizowano w szeregu etapów minimalizacji energii w celu złagodzenia niekorzystnych kontaktów atomowych oraz zoptymalizowania oddziaływań elektrostatycznych i van der Waalsa.

Informacje o trójwymiarowej strukturze opisanych przeciwciał są publicznie dostępne, np. z Research Collaboratory for Structural Bioinformatics' Protein Data Bank (PDB). PDB jest swobodnie dostępny poprzez World Wide Web internet i jest opisany przez Bermana i in. (2000) Nucleic Acids Research, 28: 235. Modelowanie komputerowe umożliwia identyfikację reszt oddziaływujących z CDR. Komputerowy model struktury 12B4 może z kolei służyć jako punkt wyjścia do przewidywania trójwymiarowej struktury przeciwciała zawierającego regiony determinujące dopasowanie 12B4, podstawione w ludzkich strukturach zrębowych. Można konstruować dodatkowe modele reprezentujące strukturę w miarę wprowadzania kolejnych podstawień aminokwasowych.

Ogólnie, pożądane jest podstawienie jednego, większości lub wszystkich aminokwasów spełniających powyższe kryteria. W związku z tym humanizowane przeciwciała według wynalazku będą zazwyczaj zawierać podstawienie w ludzkiej reszcie zrębowej łańcucha lekkiego odpowiednimi resztami 12B4 w co najmniej 1, 2 lub 3 albo większej liczbie wybranych pozycji. Humanizowane przeciwciała zazwyczaj zawierają ponadto podstawienie w ludzkiej reszcie zrębowej łańcucha ciężkiego odpowiednimi resztami 12B4 w co najmniej 1, 2, 3 lub większej liczbie wybranych pozycji.

PL 215 258 B1

Jednakże, czasami występują pewne wątpliwości odnośnie tego, czy konkretny aminokwas spełnia powyższe kryteria, tak że wytwarza się warianty immunoglobuliny, spośród których jeden zawiera to konkretne podstawienie, a inne nie zawierają go. W tych przypadkach, gdy podstawienie mysią resztą mogłoby doprowadzić do wprowadzenia reszty, która jest rzadka w ludzkich immunoglobulinach w konkretnej pozycji, celowe może być zbadanie przeciwciał pod względem aktywności, z tym konkretnym podstawieniem i bez niego. Jeśli aktywność (np. powinowactwo wiązania i/lub specyficzność wiązania) jest w przybliżeniu taka sama w przypadku z podstawieniem i bez niego, korzystne może być przeciwciało bez podstawienia, gdyż należałoby oczekiwać, że wywoła ono słabszą odpowiedź HAMA, jak to opisano.

Innymi kandydatami do podstawienia są aminokwasy akceptorowego ludzkiego zrębu, które są nietypowe dla ludzkiej immunoglobuliny w tej pozycji. Te aminokwasy można podstawić aminokwasami z równoważnych pozycji bardziej typowych ludzkich immunoglobulin. Alternatywnie, aminokwasy z równoważnych pozycji w mysim 12B4 można wprowadzić do ludzkich regionów zrębowych, gdy takie aminokwasy są typowe dla ludzkiej immunoglobuliny w równoważnych pozycjach.

Innymi kandydatami do podstawienia są niezarodkowe reszty występujące w zrębowym regionie. Komputerowe porównywanie 12B4 ze znanymi sekwencjami zarodkowymi można zidentyfikować sekwencje zarodkowe o najwyższym stopniu identyczności sekwencji względem łańcucha ciężkiego lub lekkiego. Uliniowienie regionu zrębowego i sekwencji zarodkowej ujawni, które reszty można wybrać do podstawienia odpowiadającymi resztami zarodkowymi. Reszty niedopasowane pomiędzy wybranym zrębem akceptorowego łańcucha lekkiego i jedną z tych sekwencji zarodkowych można wybrać do podstawienia odpowiednimi resztami zarodkowymi.

W tabeli 1 zestawiono analizę sekwencji regionów VH i VL w 12B4. Podano dodatkowe mysie i ludzkie struktury, które można zastosować do komputerowego modelowania przeciwciała 12B4 i dodatkowych ludzkich przeciwciał, jak również sekwencje zarodkowe, które można zastosować do wybrania podstawień aminokwasów. W tabeli 1 podano również rzadkie mysie reszty. Rzadkie mysie reszty identyfikuje się przez porównywanie donorowych sekwencji VL i/lub VH z sekwencjami innych składników podgrupy, do której należą donorowe sekwencje VL i/lub VH (według Kabata) i identyfikację pozycji reszt różniących się od konsensusu. Te specyficzne różnice donorów mogą wskazywać na somatyczne mutacje wzmacniające aktywność. Nietypowe lub rzadkie reszty w pobliżu miejsca wiązania mogą ewentualnie kontaktować się z antygenem tak, że zachowanie mysiej reszty może okazać się pożądane. Jednakże, jeśli nietypowa mysia reszta nie jest istotna z punktu widzenia wiązania, zastosowanie odpowiedniej reszty akceptorowej jest korzystne, gdyż mysia reszta może tworzyć immunogenne neoepitopy w humanizowanym przeciwciele. W sytuacji, gdy resztę nietypową w sekwencji donorowej w rzeczywistości stanowi reszta powszechna w odpowiedniej sekwencji akceptorowej, korzystną resztę stanowi wyraźnie reszta akceptorowa.

T a b e l a 1

Podsumowanie sekwencji regionów V w 12B4

Łańcuch	VL	VH
Mysia podgrupa	II	Ib
Ludzka podgrupa	II	Il
Rzadkie aminokwasy (% częstość występowania)	K107 (0,542%)	T3, I11, L12, F24, S41, N75, D83, A85
Kanoniczna klasa według Chothia	L1: ~ klasa 4 [1rmf] L2: klasa 1 [1lmk] L3: klasa 1 [1tet]	H1: klasa 3 [1ggi] H2: ~klasa 1
Najbliższa ustalona struktura mysiego MAb	2PCP (2,2 A)	1ETZ (2,6 A)
Homologia z matrycą modelującą	94%	80%

PL 215 258 B1 cd. tabeli 1

Ludzka sekwencja zrębowa	KABID 005036	1- KABID 000333 2- AAB35009/1F7 3-AAD53816
Przywołane geny zarodkowe dla Hu Fr	A3/x12690 oraz A19/x63397	1: VH4- 39/AB019439/BAA75036.1 2: VH2- 5/AB019440/BAA75057.1

Przywoływane tutaj sekwencje ID Kabata są publicznie dostępne np. z Northwestern University Biomedical Engineering Department's Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest. Informacje odnośnie trójwymiarowej struktury opisanych tutaj przeciwciał są publicznie dostępne np. z Research Collaboratory for Structural Bioinformatics' Protein Data Bank (PDB). PDB jest swobodnie dostępna poprzez World Wide Web internet i jest opisana przez Bermana i in. (2000) Nucleic Acids Research, str. 235-242. Przywoływane tutaj sekwencje genów zarodkowych są publicznie dostępne np. z bazy danych National Center for Biotechnology Information (NCBI) dla sekwencji w zbiorach genów zarodkowych V Igh, Ig kappa i Ig lambda (jako część National Library of Medicine (NLM) w National Institutes of Health (NIH)). Poszukiwanie homologii bazy danych NCBI „Ig Germline Genes” jest możliwe dzięki IgG BLAST™.

W korzystnej postaci humanizowane przeciwciało według wynalazku zawiera (i) lekki łańcuch zawierający zmienną domenę zawierającą mysie CDR VL z 12B4 i ludzki zrąb akceptorowy, przy czym zrąb zawiera co najmniej jedną resztę podstawioną odpowiednią resztą 12B4 i (ii) łańcuch ciężki, zawierający CDR VH z 12B4 i ludzki zrąb akceptorowy, przy czym zrąb zawiera co najmniej jedną, korzystnie dwie, trzy, cztery, pięć, sześć, siedem, osiem lub dziewięć reszt podstawionych odpowiednimi resztami 12B4, a także, ewentualnie, co najmniej jedną, korzystnie dwie lub trzy reszty podstawione odpowiednimi resztami ludzkimi resztami zarodkowymi.

W innej korzystnej postaci, humanizowane przeciwciało według wynalazku wykazuje opisane powyżej cechy strukturalne, a ponadto wykazuje co najmniej jedną (korzystnie dwie, trzy, cztery lub wszystkie) z następujących aktywności: (1) wiąże rozpuszczalny Αβ; (2) wiąże zagregowany Αβ 1-42 (np. na podstawie oznaczenia metodą ELISA); (3) wiąże Αβ w płytkach (np. na podstawie wybarwiania płytek AD i/lub PDAPP); (4) wiąże Αβ z 2-3-krotnie wyższym powinowactwem wiązania w porównaniu z chimerycznym 12B4 (np. 12B4 zawierającym mysie sekwencje regionu zmiennego i ludzkie sekwencje regionu stałego); (5) pośredniczy w fagocytozie Αβ (np. w teście fagocytozy ex vivo, jak tutaj opisano); oraz (6) przekracza barierę krew-mózg (np. wykazuje krótkoterminową lokalizację w mózgu, np. w zwierzęcym modelu PDAPP, jak tutaj opisano).

W innej postaci humanizowane przeciwciało według wynalazku wykazuje cechy strukturalne, tutaj opisane, wiąże Αβ w sposób lub z powinowactwem wystarczającym do wywołania co najmniej jednego z następujących efektów in vivo: (1) zmniejsza obciążenie płytkami Αβ; (2) zapobiega tworzeniu się płytek; (3) zmniejsza poziomy rozpuszczalnego Αβ; (4) zmniejsza patologię neurytyczną związaną z zaburzeniem amyloidogennym; (5) zmniejsza lub osłabia co najmniej objaw fizjologiczny związany z zaburzeniem amyloidogennym; i/lub (6) usprawnia funkcje poznawcze.

W innej korzystnej postaci humanizowane przeciwciało według wynalazku wykazuje opisane tutaj cechy strukturalne i specyficznie wiąże się z epitopem zawierającym reszty 3-7 Αβ.

W innej korzystnej postaci, humanizowane przeciwciało według wynalazku wykazuje opisane tutaj cechy strukturalne, wiąże N-końcowy epitop Αβ (np. wiąże epitop zawierający reszty 3-7 Αβ) oraz jest zdolne do zmniejszania (1) poziomu peptydu Αβ; (2) obciążenia płytkami Αβ; i (3) obciążenia nerytycznego lub dystrofii neurytycznej związanej z zaburzeniem amyloidogennym.

Aktywności opisane powyżej można wyznaczyć stosując którykolwiek z wielu testów tutaj opisanych lub znanych w dziedzinie wynalazku (np. testy wiązania, testy fagocytozy itd.). Aktywności można badać in vivo (np. stosując znakowane składniki testów i/lub techniki obrazowania) albo in vitro (np. stosując próby lub próbki pochodzące od pacjenta). Aktywności można badać bezpośrednio lub pośrednio. W pewnych korzystnych postaciach bada się efekty neurologiczne (np. obciążenie amyloidem, obciążenie neurytyczne itd.). Takie efekty można badać u żywych osobników (np. w modelach zwierzęcych choroby Alzheimera lub u ludzi, np. przechodzących immunoterapię) nieinwazyjnymi metodami detekcji. Alternatywnie takie efekty można badać u pacjentów po śmierci. Badanie tych efektów w modelach zwierzęcych i/lub u ludzi po śmierci jest przydatne w ocenianiu skuteczności różnych środków (np. humanizowanych przeciwciał), które mają być stosowane w podobnych zasto22

PL 215 258 B1 sowaniach immunoterapeutycznych. W innych korzystnych postaciach, można oceniać parametry behawioralne lub neurologiczne jako wskaźniki powyższych aktywności lub efektów neuropatologicznych.

3. Wytwarzanie regionów zmiennych

Po koncepcyjnym wybraniu składników CDR i zrębowych humanizowanych immunoglobulin, dostępne są różne sposoby wytwarzania takich immunoglobulin. Z uwagi na degenerację kodu, szereg sekwencji kwasów nukleinowych będzie kodować każdą sekwencję aminokwasów immunoglobuliny. Żądane sekwencje kwasów nukleinowych można otrzymać drogą de novo syntezy DNA na fazie stałej lub drogą mutagenezy PCR wcześniej otrzymanego wariantu żądanego polinukleotydu. Mutageneza z użyciem oligonukleotydu jest korzystnym sposobem wytwarzania wariantów DNA docelowego polipeptydu z podstawieniem, delecją i insercją. Patrz Adelman i in., DNA 2: 183 (1983). W skrócie, DNA docelowego polipeptydu zmienia się drogą hybrydyzacji oligonukleotydu kodującego żądaną mutację z jednoniciową matrycą DNA. Po hybrydyzacji polimerazę DNA stosuje się do syntezy całej drugiej komplementarnej nici matrycy, która zawiera starter oligonukleotydu i koduje wybraną zmianę w docelowym DNA polipeptydu.

4. Wybór regionów stałych

Zmienne segmenty przeciwciał, wytworzone w sposób opisany powyżej (np. zmienne regiony łańcucha ciężkiego i lekkiego chimerycznych lub humanizowanych przeciwciał) zazwyczaj łączy się z co najmniej częścią regionu stałego (Fc) immunoglobuliny, zwykle ludzkiej immunoglobuliny. Sekwencje ludzkiego DNA regionu stałego można wyodrębnić znanymi sposobami z różnych ludzkich komórek, ale korzystnie z unieśmiertelnionych komórek B (patrz Kabat i in., jak wyżej oraz Liu i in., WO 87/02671) (przy czym każdą z tych publikacji wprowadza się w całości jako źródła literaturowe do wszystkich zastosowań). Zazwyczaj, przeciwciało będzie zawierać regiony stałe zarówno lekkiego łańcucha, jak i ciężkiego łańcucha. Region stały łańcucha ciężkiego zazwyczaj zawiera regiony CH1, zawiasowy, CH2, CH3 i CH4. Opisane przeciwciała obejmują przeciwciała zawierające wszystkie typy regionów stałych, w tym IgM, IgG, IgD, IgA i IgE i dowolny izotyp, w tym IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Gdy pożądane jest, aby przeciwciało (np. humanizowane przeciwciało) wykazywało aktywność cytotoksyczną, domenę stałą stanowi zazwyczaj domena stała wiążąca dopełniacz, a klasę stanowi zazwyczaj IgG1. Korzystny jest ludzki izotyp IgG1. Regionami stałymi lekkiego łańcucha mogą być lambda lub kappa. Humanizowane przeciwciało może zawierać sekwencje więcej niż jednej klasy lub izotypu. Przeciwciała mogą być eksprymowane jako tetramery zawierające dwa łańcuchy lekkie i dwa ciężkie, jako odrębne łańcuchy ciężkie, łańcuchy lekkie, jako Fab, Fab', F(ab')2 i Fv, albo jako przeciwciała o pojedynczym łańcuchu, w którym domeny zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego są połączone poprzez łącznik.

5. Ekspresja zrekombinowanych przeciwciał

Chimeryczne i humanizowane przeciwciała wytwarza się zazwyczaj drogą ekspresji rekombinacyjnej. Kwasy nukleinowe kodujące regiony zmienne humanizowanego łańcucha lekkiego i ciężkiego, ewentualnie połączone ze stałymi regionami, wstawia się do wektorów ekspresyjnych. Lekkie i ciężkie łańcuchy można klonować w tych samych lub różnych wektorach ekspresyjnych. Segmenty DNA kodujące łańcuchy immunoglobuliny funkcjonalnie łączy się z sekwencjami kontrolnymi w wektorze(-rach) ekspresyjnym(-ych), co zapewnia ekspresję polipeptydów immunoglobuliny. Sekwencje kontrolujące ekspresję zawierają, ale nie wyłącznie, promotory (np. naturalnie związane lub heterologiczne promotory), sekwencje sygnałowe, elementy wzmacniacza i sekwencje terminacji transkrypcji. Korzystnie, sekwencje kontrolujące ekspresję są eukariotycznymi układami promotorowymi w wektorach zdolnych do transformacji lub transfekcji eukariotycznych komórek gospodarzy. Po wprowadzeniu wektora do odpowiedniego gospodarza, gospodarza utrzymuje się w warunkach odpowiednich do osiągnięcia wysokiego poziomu ekspresji sekwencji nukleotydów oraz zbierania i oczyszczania reagujących krzyżowo przeciwciał.

Takie wektory ekspresyjne zazwyczaj ulegają replikacji w organizmach gospodarzach jako episomy lub jako integralna część DNA chromosomalnego gospodarza. Wektory ekspresyjne zwykle zawierają markery selekcyjne (np. oporności na ampicylinę, oporności na higromycynę, oporności na tetracyklinę, oporności na kanamycynę lub oporności na neomycynę), aby umożliwić wykrycie komórek transformowanych żądanymi sekwencjami DNA (patrz np. Itakura i in., opis patentowy US nr 4 704 362).

E. coli jest jednym z prokariotycznych gospodarzy szczególnie odpowiednich do klonowania polinukleotydów (np. sekwencji DNA) według wynalazku. Do innych gospodarzy drobnoustrojowych,

PL 215 258 B1 które można zastosować, należą laseczki, takie jak Bacillus subtilus i inne pałeczki jelitowe, takie jak Salmonella, Serratia i różne gatunki Pseudomonas. Dla tych gospodarzy prokariotycznych można również wytworzyć wektory ekspresyjne, które będą zazwyczaj zawierać sekwencje kontrolujące ekspresję, zgodne z komórką gospodarzem (np. miejsce startu replikacji). Dodatkowo, obecna może być dowolna liczba różnych dobrze znanych promotorów, takich jak układ promotora laktozowego, układ promotora tryptofanowego (trp), układ promotora β-laktamazowego lub układ promotora z faga lambda. Promotory będą zazwyczaj kontrolować ekspresję, ewentualnie wraz z sekwencją operatora, oraz zawierają sekwencje miejsca wiązania rybosomu itp., do inicjowania i przeprowadzenia transkrypcji i translacji.

Do ekspresji można również wykorzystać inne drobnoustroje, takie jak drożdże. Korzystnym gospodarzem drożdżowym jest Saccharomyces, z odpowiednimi wektorami zawierającymi sekwencje kontrolujące ekspresję (np. promotory), miejsce startu replikacji, sekwencje terminacji itp., zależnie od potrzeb. Typowe promotory zawierają kinazę 3-fosfoglicerynianu i inne enzymy glikolityczne. Do indukowanych promotorów drożdżowych należą, między innymi, promotory dehydrogenazy alkoholowej, izocytochromu C oraz enzymów odpowiedzialnych za wykorzystanie maltozy i galaktozy.

Oprócz drobnoustrojów, do ekspresji i wytwarzania polipeptydów według wynalazku (np. polinukleotydów kodujących immunoglobuliny lub ich fragmenty) można zastosować hodowlę komórek ssaczych tkanek, patrz Winnacker, From Genes to Clons, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Obecnie korzystne są komórki eukariotyczne, gdyż wyprowadzono wiele odpowiednich linii komórek gospodarzy, zdolnych do wydzielania heterologicznych białek (np. nienaruszonych immunoglobulin), takich jak linie komórek CHO, różne linie komórek Cos, komórki HeLa, korzystnie, linie komórek szpiczaka lub transformowane komórki B albo hybrydomy. Korzystnie, komórki nie pochodzą od ludzi. Wektory ekspresyjne dla takich komórek mogą zawierać sekwencje kontrolujące ekspresję, takie jak miejsce startu replikacji, promotor i wzmacniacz (Queen i in., Immunol. Rev. 89: 49 (1986)) oraz miejsca dostarczające niezbędnych informacji do obróbki, takie jak miejsca wiązania rybosomu, miejsca splicingu RNA, miejsca poliadenylacji i sekwencje terminatorów transkrypcji. Korzystnymi sekwencjami kontrolującymi ekspresję są promotory pochodzące z genów immunoglobuliny, SV40, adenowirusa, bydlęcego wirusa brodawczaka, wirusa cytomegalii, itp., patrz Co i in., J. Immunol. 148: 1149 (1992).

Alternatywnie, sekwencje kodujące przeciwciała można wprowadzić w transgenach do wprowadzania do genomu transgenicznego zwierzęcia, a następnie ekspresję w mleku transgenicznego zwierzęcia (patrz np. Deboer i in., US nr 5 741 957, Rosen, US nr 5 304 489 oraz Meade i in., US nr 5 849 992). Do odpowiednich transgenów należą sekwencje kodujące lekkie i/lub ciężkie łańcuchy w funkcjonalnym połączeniu z promotorem i wzmacniaczem z genu specyficznego dla gruczołu sutkowego, takiego jak kazeina lub β-laktoglobulina.

Wektory zawierające interesujące sekwencje polinukleotydowe (np. sekwencje kodujące łańcuch ciężki i lekki oraz sekwencje kontrolujące ekspresję) można przenosić do komórek gospodarzy dobrze znanymi sposobami, różniącymi się w zależności od typu komórki gospodarza. Przykładowo, transfekcję z użyciem chlorku wapnia powszechnie stosuje się w przypadku komórek prokariotycznych, podczas gdy obróbkę fosforanem wapnia, elektroporację, lipofekcję, biolistykę lub transfekcję opartą na wirusach można stosować w przypadku innych komórek gospodarzy (patrz ogólnie Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2 wyd., 1989) (publikacja, którą wprowadza się w całości jako źródło literaturowe do wszystkich zastosowań). Do innych sposobów stosowanych do transformowania ssaczych komórek należy zastosowanie polibrenu, fuzji protoplastów, liposomów, elektroporacji i mikroiniekcji (patrz ogólnie Sambrook i in., jak wyżej). Przy wytwarzaniu transgenicznych zwierząt można dokonać mikroiniekcji transgenów do zapłodnionych komórek jajowych albo można je wprowadzić do genomu embrionalnych komórek macierzystych i jądra, takich komórek przenieść do pozbawionych jąder komórek jajowych.

Gdy łańcuchy ciężkie i lekkie klonuje się w odrębnych wektorach ekspresyjnych, wektory kotransfekuje się w celu osiągnięcia ekspresji i złożenia nienaruszonych immunoglobulin. Po ekspresji pełne przeciwciała, ich dimery, pojedyncze lekkie i ciężkie łańcuchy lub inne postacie immunoglobuliny według wynalazku można oczyścić znanymi sposobami, takimi jak wytrącanie siarczanem amonu, kolumny powinowactwa, chromatografia kolumnowa, oczyszczanie metodą HPLC, elektroforeza w żelu itp. (patrz ogólnie Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Do zastosowań farmaceutycznych korzystne są zasadniczo czyste immunoglobuliny o co najmniej około 90-95% jednorodności, najkorzystniej o jednorodności 98-99% lub powyżej.

PL 215 258 B1

6. Fragmenty przeciwciał

Zakresem wynalazku objęte są również fragmenty przeciwciał. W jednej postaci dostarcza się fragmenty nie-ludzkich i/lub chimerycznych przeciwciał. W innej postaci dostarcza się fragmenty humanizowanych przeciwciał. Zazwyczaj, takie fragmenty wykazują specyficzność wiązania z antygenem z powinowactwem co najmniej 10⁷, częściej 10⁸ lub 10⁹ M^-1. Fragmenty humanizowanych przeciwciał obejmują odrębne łańcuchy ciężkie, łańcuchy lekkie, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc i Fv. Fragmenty wytwarza się technikami rekombinacji DNA lub drogą enzymatycznego lub chemicznego rozdzielania nienaruszonych immunoglobulin.

7. Badanie przeciwciał pod względem skuteczności terapeutycznej na modelach zwierzęcych

Każdej z grupy 7-9 miesięcznych myszy PDAPP wstrzyknięto 0,5 mg przeciwciał poliklonalnych przeciw-Αβ lub specyficznych przeciwciał monoklonalnych przeciw-Αβ, w postaci roztworu w PBS. Wszystkie preparaty przeciwciał oczyszczono do osiągnięcia niskich poziomów endotoksyny. Przeciwciała monoklonalne można wytworzyć przeciw fragmentowi przez wstrzyknięcie myszy fragmentu lub dłuższej formy Αβ, wytworzenie hybrydom i selekcję hybrydom pod względem przeciwciała, które specyficznie wiąże się z żądanym fragmentem Αβ bez wiązania się z innymi nie nakładającymi się fragmentami Αβ.

Myszom wykonuje się iniekcje śródotrzewnowe zależnie od potrzeb w ciągu 4 miesięcy, aby utrzymać w krążeniu stężenie przeciwciała, mierzone jako miano w ELISA, powyżej 1/1000 wartości zmierzonej metodą ELISA dla Αβ42 lub innego immunogenu. Miana monitoruje się i myszy uśmierca się pod koniec 6-miesięcznego okresu iniekcji. Pośmiertnie wykonuje się badania histochemiczne, oznaczanie poziomów Αβ i badania toksykologiczne. Stosuje się grupy liczące po 10 myszy.

8. Selekcja przeciwciał pod względem aktywności klirensowej

Wynalazek dostarcza także sposoby selekcji przeciwciała pod względem aktywności w klirensie złogów amyloidowych lub dowolnego innego antygenu lub zasocjowanego składnika biologicznego, w przypadku którego aktywność klirensowa jest pożądana. W celu wykonania selekcji pod względem aktywności przeciw złogom amyloidowym, próbkę tkanki z mózgu pacjenta z chorobą Alzheimera lub modelowego zwierzęcia z charakterystyczną patologią Alzheimera łączy się z fagocytowymi komórkami przenoszącymi receptor Fc, takimi jak komórki mikrogleju i badanymi przeciwciałami w podłożu in vitro. Komórki fagocytujące może stanowić pierwotna hodowla lub linia komórkowa i mogą być one pochodzenia mysiego (np. komórki BV-2 lub C8-B4) lub ludzkiego (np. komórki THP-1). W pewnych sposobach składniki łączy się na szkiełku mikroskopowym dla ułatwienia monitorowania mikroskopowego. W pewnych sposobach przeprowadza się równolegle wielokrotne reakcje w studzienkach płytki do mikromianowania. W takim formacie odrębne miniaturowe szkiełka mikroskopowe można zamontować w odrębnych studzienkach, albo też można zastosować niemikroskopowy format wykrywania, taki jak wykrywanie Αβ metodą ELISA. Korzystnie, wykonuje się serie pomiarów ilości złogu amyloidowego w mieszaninach reakcyjnych in vitro, wychodząc od wartości podstawowej przed zajściem reakcji oraz jednej lub większej liczby wartości mierzonych w czasie reakcji. Antygen można wykryć przez wybarwianie, np. znakowanym fluorescencyjnie przeciwciałem dla Αβ lub innego składnika płytek amyloidowych. Przeciwciało zastosowane do wybarwiania może, ale nie musi być takie samo, jak przeciwciało, którego aktywność klirensową się bada. Obniżenie w stosunku do wartości podstawowej podczas reakcji złogów amyloidowych oznacza, że badane przeciwciało wykazuje aktywność klirensową. Takie przeciwciała będą prawdopodobnie przydatne w profilaktyce lub leczeniu choroby Alzheimera i innych chorób amyloidogennych. Przeciwciała szczególnie użyteczne w profilaktyce lub leczeniu choroby Alzheimera i innych chorób amyloidogennych obejmują te, które są zdolne do klirensu zarówno zbitych, jak i rozproszonych płytek amyloidowych, np. przeciwciało 12B4 lub jego chimeryczne lub humanizowane wersje według wynalazku.

Analogiczne sposoby można zastosować do selekcji przeciwciał pod względem aktywności w klirensie innych typów składników biologicznych. Taką próbę można zastosować do wykrywania aktywności klirensowej w stosunku do praktycznie dowolnego rodzaju składnika biologicznego. Zazwyczaj składnik biologiczny spełnia pewną rolę w chorobie ludzi i zwierząt. Składnik biologiczny można dostarczyć jako próbkę tkanki lub w postaci wyodrębnionej. Jeśli stosuje się próbkę tkanki, to taka próbka tkanki korzystnie nie jest utrwalona, aby umożliwić łatwy dostęp do składników próbki tkanki i uniknąć zakłócenia konformacji komponentów występującego przy utrwalaniu. Do przykładowych próbek tkanek, które można badać w tej próbie, należy tkanka rakowata, tkanka przedrakowa, tkanka zawierająca łagodne przerosty, takie jak brodawki lub znamiona, tkanka zakażona drobnoustrojem patogennym, tkanka z naciekiem komórek zapalnych, tkanka przenosząca patologiczne subPL 215 258 B1 stancje pomiędzy komórkami (np. włókniste zapalenie osierdzia), tkanka przenosząca nieprawidłowe antygeny i tkanka bliznowata. Do przykładowych wyodrębnionych składników biologicznych, które można zastosować, należy Αβ, antygeny wirusowe lub wirusy, proteoglikany, antygeny patogennych drobnoustrojów, antygeny nowotworów i cząsteczki adhezyjne. Takie antygeny można otrzymać, między innymi, ze źródeł naturalnych, drogą rekombinacyjnej ekspresji lub syntezy chemicznej. Próbkę tkanki lub wyodrębniony składnik biologiczny kontaktuje się w podłożu z fagocytującymi komórkami przenoszącymi receptory Fc, takimi jak monocyty lub komórki mikrogleju, oraz z badanym przeciwciałem. Przeciwciało może być skierowane przeciw badanemu składnikowi biologicznemu lub przeciw antygenowi związanemu z tym składnikiem. W tym ostatnim przypadku celem jest zbadanie, czy składnik biologiczny ulega fagocytozie z antygenem. Zazwyczaj, choć nie zawsze, przeciwciało i składnik biologiczny (czasami ze związanym antygenem), kontaktuje się ze sobą przed dodaniem komórek fagocytujących. Następnie monitoruje się stężenie pozostającego w podłożu składnika biologicznego i/lub związanego antygenu, jeśli jest obecny. Zmniejszenie ilości lub stężenia antygenu lub związanego składnika biologicznego w podłożu wskazuje, że przeciwciało wykazuje odpowiedź klirensową przeciw antygenowi i/lub związanemu składnikowi biologicznemu w połączeniu z komórkami fagocytującymi (patrz np. przykład IV).

9. Przeciwciała chimeryczne/humanizowane o zmienionej funkcji efektorowej

W przypadku opisanych powyżej przeciwciał według wynalazku zawierających region stały (region Fc) korzystne może być zmienienie funkcji efektorowej cząsteczki. Ogólnie, funkcja efektorowa przeciwciała znajduje się w regionie stałym lub Fc cząsteczki i może pośredniczyć w wiązaniu z różnymi cząsteczkami efektorowymi, np. białkami dopełniacza lub receptorami Fc. Wiązanie dopełniacza z regionem Fc jest istotne, np. w opsonizacji i lizie patogenów komórkowych oraz aktywacji odpowiedzi zapalnych. Wiązanie przeciwciała z receptorami Fc, np. na powierzchni komórek efektorowych, może uruchomić kilka istotnych i zróżnicowanych odpowiedzi biologicznych obejmujących, np. pochłonięcie i zniszczenie powleczonych przeciwciałami patogenów lub cząstek, klirens kompleksów immunologicznych, lizę powleczonych przeciwciałami komórek docelowych przez komórki zabójców (tj. zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową lub ADCC), uwalnianie mediatorów zapalnych, przenoszenie przeciwciał przez łożysko oraz kontrolowanie wytwarzania immunoglobulin.

Zgodnie z tym, zależnie od konkretnego zastosowania terapeutycznego lub diagnostycznego pożądane mogą być, wspomniane powyżej funkcje immunologiczne lub tylko wybrane funkcje immunologiczne. Przez zmianę regionu Fc przeciwciała osiąga się różne aspekty funkcji efektorowej cząsteczki, włącznie ze wzmocnieniem lub osłabieniem różnych reakcji w układzie immunologicznym z korzystnymi efektami w diagnozie i terapii.

Można wytwarzać przeciwciała według wynalazku, które reagują tylko z pewnymi typami receptorów Fc, np. przeciwciała według wynalazku można modyfikować tak by wiązały tylko pewne receptory Fc lub, gdy jest to pożądane, w ogóle nie wiązały receptora Fc, przez delecję lub zmianę wiążącego receptor Fc miejsca zlokalizowanego w regionie Fc przeciwciała. Inne pożądane zmiany regionu Fc przeciwciała wymieniono poniżej. Zazwyczaj system numeracji Kabata stosuje się do wskazania, która reszta(-y) aminokwasowa(-e) regionu Fc (np. przeciwciała IgG) jest/są zmieniana(-e) (np. przez podstawienie aminokwasu) w celu osiągnięcia pożądanej zmiany funkcji efektorowej. System numerowania stosuje się także do porównania przeciwciał pomiędzy gatunkami, tak że pożądaną funkcję efektorową obserwowaną, np. dla mysiego przeciwciała, można następnie systematycznie wprowadzić do ludzkiego, humanizowanego lub chimerycznego przeciwciała według wynalazku.

Przykładowo zaobserwowano, że przeciwciała (np. przeciwciała IgG) można pogrupować na te, które wykazują silne, pośrednie i słabe wiązanie z receptorem Fc (np. receptorem Fc na ludzkich monocytach (FcyRI)). Przez porównanie sekwencji aminokwasów w tych różnych grupach powinowactwa zidentyfikowano miejsce wiązania monocytu w regionie zawiasowo-łączącym (Leu234-Ser239). Ponadto ludzki receptor FcyRI wiąże ludzką IgG1 i mysią IgG2a w postaci monomeru, ale wiązanie m ysiej IgG2b jest 100 razy słabsze. Porównanie sekwencji tych białek w regionie zawiasowo-łączącym wykazało, że sekwencja od 234 do 238 reszty, tj. Leu-Leu-Gly-Gly-Pro w przeciwciałach wiążących się silnie, zmienia się na Leu-Glu-Gly-Gly-Pro w mysim γ 2b, tj. wiążącym się słabo. Zgodnie z tym, można wprowadzić odpowiadającą zmianę w sekwencji regionu zawiasowego ludzkiego przeciwciała gdy pożądane jest obniżone wiązanie z receptorem FcyI. Należy rozumieć, że można wprowadzić inne zmiany w celu osiągnięcia takich samych lub podobnych rezultatów. Przykładowo powinowactwo wiązania FcyRI można zmienić przez zastąpienie wyszczególnionej reszty resztą zawierającą w łańcuchu

PL 215 258 B1 bocznym nieodpowiednią grupę funkcyjną lub przez wprowadzenie naładowanej grupy funkcyjnej (np. Glu lub Asp) lub np. aromatycznej reszty niepolarnej (np. Phe, Tyr lub Trp).

Zmiany te można również zastosować w systemach mysich, ludzkich i szczurzych biorąc pod uwagę homologię pomiędzy różnymi immunoglobulinami. Wykazano, że dla ludzkiej IgG3, która wiąże ludzki receptor FcyRI, zmiana Leu 235 na Glu niszczy oddziaływanie mutanta z receptorem. Zatem, miejsce wiążące dla tego receptora można włączać lub wyłączać przez wprowadzenie odpowiedniej mutacji.

Mutacje w miejscach przyległych do lub w pobliżu regionu zawiasowo-łączącego (np. zastąpienie reszt 234, 236 lub 237 przez Ala) wskazują, że zmiany w resztach 234, 235, 236 i 237 co najmniej wpływają na powinowactwo do receptora FcyRI. Zgodnie z tym przeciwciała według wynalazku mogą mieć także zmieniony region Fc ze zmienionym powinowactwem wiązania FcyRI w porównaniu do niezmodyfikowanego przeciwciała. Takie przeciwciało dogodnie zawiera modyfikację reszty aminokwasowej 234, 235, 236 lub 237.

Powinowactwo do innych receptorów Fc można zmienić w podobny sposób w celu kontrolowania odpowiedzi immunologicznej w różny sposób.

W dalszym przykładzie, można zmienić właściwości lityczne przeciwciał IgG składnika C1 dopełniacza.

Pierwszy składnik układu dopełniacza, C1, zawiera trzy białka znane jako C1q, C1r i C1s, które są ściśle ze sobą związane. Wykazano, że C1q odpowiada za wiązanie kompleksu trzech białek z przeciwciałem.

Zgodnie z tym, aktywność wiązania C1q przez przeciwciało można zmienić wprowadzając do przeciwciała zmienioną domenę CH2, w której co najmniej jedną z reszt aminokwasowych 318, 320 i 322 łańcucha ciężkiego zamieniono na resztę zawierająca inny łańcuch boczny. Numeracja reszt w łańcuchu ciężkim jest według wskaźnika EU (patrz Kabat i in., jak wyżej). Inne korzystne zmiany do zmienienia, np. zmniejszenia lub zniesienia specyficznego wiązania C1q z przeciwciałem obejmują zmianę którejkolwiek z reszt 318 (Glu), 320 (Lys) i 322 (Lys) na Ala.

Ponadto, przez wprowadzenie mutacji w tych resztach wykazano, że wiązanie C1q jest zachowane tak długo jak reszta 318 ma łańcuch boczny wytwarzający wiązanie wodorowe oraz reszty 320 i 322 mają łańcuchy boczne naładowane dodatnio.

Aktywność wiązania C1q można znieść przez zastąpienie którejkolwiek z tych trzech wyszczególnionych reszt resztą o nieodpowiedniej funkcyjności w łańcuchu bocznym. Aby znieść wiązanie C1q nie ma potrzeby zastępowania reszt jonowych, tylko Ala. Aby znieść wiązanie C1q możliwe jest także zastosowanie niejonowych reszt podstawionych alkilem, takich jak Gly, Ile, Leu lub Val, lub takimi niepolarnymi resztami aromatycznymi, jak Phe, Tyr, Trp i Pro w miejscu którejkolwiek z tych trzech reszt. Ponadto, aby znieść wiązanie C1q możliwe jest także zastosowanie takich polarnych niejonowych reszt jak Ser, Thr, Cys i Met w miejscu reszt 320 i 322, ale nie w 318.

Należy także zauważyć, że łańcuchy boczne na jonowych lub niejonowych polarnych resztach będą w stanie utworzyć wiązania wodorowe w podobny sposób jak wiązania tworzone przez resztę Glu. Zatem, zastąpienie reszty 318 (Glu) przez resztę polarną może zmodyfikować, ale nie znieść, aktywność wiązania C1q.

Wiadomo także, że zastąpienie reszty 297 (Asn) przez Ala powoduje zniesienie aktywności litycznej przy tylko niewielkim obniżeniu (około trzykrotnie słabsze) powinowactwa do C1q. Zmiana ta znosi miejsce glikozylacji oraz obecność węglowodanu, który jest wymagany do aktywacji dopełniacza. Jakiekolwiek inne podstawienie w tym miejscu także zniszczy miejsce glikozylacji.

Wynalazek także dostarcza przeciwciało o zmienionej funkcji efektorowej, przy czym przeciwciało ma zmodyfikowany region zawiasowy. Zmodyfikowany region zawiasowy może zawierać kompletny region zawiasowy pochodzący z przeciwciała innej, niż domena CH1, klasy lub podklasy przeciwciał. Przykładowo, domenę stałą (CH1) przeciwciała klasy IgG można połączyć z regionem zawiasowym przeciwciała klasy IgG4. Alternatywnie, nowy region zawiasowy może zawierać część naturalnego regionu zawiasowego lub jednostkę powtarzającą się, w której każda jednostka w powtórzeniu pochodzi z naturalnego regionu zawiasowego. W jednym przykładzie, naturalny region zawiasowy jest zmieniony przez przekształcenie jednej lub większej liczby reszt cysteiny w resztę obojętną, taką jak alanina lub przez przekształcenie odpowiednio umiejscowionych reszt w reszty cysteiny. Takie zmiany przeprowadza się stosując znaną chemię białek, korzystnie opisane techniki inżynierii genetycznej.

W jednej postaci, liczba reszt cysteiny w regionie zawiasowym jest zmniejszona, np. do jednej reszty cysteiny. Ta modyfikacja ma zaletę ułatwiania składania przeciwciała, np. cząsteczek przeciwPL 215 258 B1 ciał bispecyficznych oraz cząsteczek przeciwciał, w których część Fc została zastąpiona cząsteczką efektorową lub reporterową, gdyż konieczne jest wytworzenie tylko pojedynczego wiązania disiarczkowego. Modyfikacja ta dostarcza także specyficzne miejsce do połączenia regionu zawiasowego z innym regionem zawiasowym lub z cząsteczką efektorową lub reporterową, bezpośrednio lub pośrednio, np. metodami chemicznymi.

Odwrotnie, liczbę reszt cysteiny w regionie zawiasowym zwiększa się, np. o co najmniej jedną więcej niż liczba naturalnie występujących reszt cysteiny. Zwiększenie liczby reszt cysteiny można zastosować do stabilizacji oddziaływań pomiędzy przyległymi zawiasami. Inną zaletą tej modyfikacji jest to, że ułatwia ona zastosowanie grup tiolowych cysteiny do przyłączenia do zmienionego przeciwciała cząsteczek efektorowych lub reporterowych, np. znacznika radioaktywnego.

Zgodnie z tym, możliwa jest zmiana regionów zawiasowych pomiędzy klasami przeciwciał, w szczególności klasami IgG i/lub zwiększenie lub zmniejszenia liczby reszt cysteiny w regionie zawiasowym w celu uzyskania zmienionej funkcji efektorowej (patrz, np. opis patentowy US nr 5 677 425, który wprowadza się jako źródło literaturowe). Wyznaczenie funkcji efektorowej zmienionego przeciwciała przeprowadza się stosując opisane tutaj testy oraz znane techniki.

Istotne jest, że powstałe przeciwciało można zbadać w jednym lub większej liczbie testów w celu oznaczenia jakiejkolwiek zmiany w aktywności biologicznej w porównaniu z przeciwciałem wyjściowym. Przykładowo, zdolność przeciwciała ze zmienionym regionem Fc do wiązania dopełniacza lub receptorów Fc można zbadać stosując ujawnione tutaj testy, a także jakikolwiek test znany w dziedzinie wynalazku.

Wytwarzanie przeciwciał według wynalazku przeprowadza się jakąkolwiek odpowiednią techniką, włącznie z technikami tutaj opisanymi, jak i technikami znanymi specjalistom. Przykładowo, można zsyntetyzować odpowiednią sekwencję białkową, np. stanowiącą cześć lub całość użytecznej domeny stałej, np. region Fc, tj. domenę(-y) CH2 i/lub CH3 przeciwciała oraz zawierającą odpowiednio zmienioną(-e) resztę(-y), a następnie połączyć ją z cząsteczką przeciwciała w odpowiednim miejscu.

Korzystnie, do wytwarzania zmienionego przeciwciała stosuje się techniki inżynierii genetycznej. Korzystne techniki obejmują, np. przygotowanie odpowiednich starterów do zastosowania w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) takich, że sekwencja DNA kodująca co najmniej część łańcucha ciężkiego IgG, np. Fc lub region stały (np. CH2 i/lub CH3) jest zmieniona, co najmniej w jednej lub większej liczbie reszt. Następnie, segment można funkcjonalnie połączyć z pozostałą częścią przeciwciała, np. regionem zmiennym przeciwciała i elementami regulatorowymi wymaganymi do ekspresji w komórce.

Wynalazek obejmuje także wektory stosowane do transformowania linii komórkowej, wektory stosowane do wytwarzania wektorów transformujących, linie komórkowe transformowane wektorami transformującymi, linie komórkowe transformowane wektorami przygotowywanymi oraz sposoby ich wytwarzania.

Korzystnie, linia komórkowa, która jest transformowana tak, że wytwarza przeciwciało o zmienionym regionie Fc (tj. o zmienionej funkcji efektorowej) jest linią unieśmiertelnionych komórek ssaczych (np. komórką CHO).

Pomimo tego, że linią komórkową stosowaną do wytwarzania przeciwciała o zmienionym regionie Fc korzystnie jest ssacza linia komórkowa, alternatywnie można stosować jakąkolwiek odpowiednią linię komórkową, taką jak bakteryjna linia komórkowa lub drożdżowa linia komórkowa.

B. Kwas nukleinowy kodujący środki immunologiczne i terapeutyczne

Odpowiedzi odpornościowe przeciw złogom amyloidowym można również wywołać przez podawanie kwasów nukleinowych kodujących przeciwciała i ich łańcuchy składowe stosowane w biernej immunizacji. Takim kwasem nukleinowym może być DNA lub RNA. Segment kwasu nukleinowego kodujący immunogen jest zazwyczaj połączony z elementami regulacyjnymi, takimi jak promotor i wzmacniacz, co umożliwia ekspresję segmentu DNA w przewidzianych docelowych komórkach pacjenta. W przypadku ekspresji w krwinkach, co jest pożądane w celu wywołania odpowiedzi odpornościowej, odpowiednie do kierowania ekspresją są elementy promotora i wzmacniacza z łańcuchów lekkich lub ciężkich genów immunoglobuliny albo główny średnio wczesny promotor i wzmacniacz CMV. Połączone elementy regulacyjne i sekwencje kodujące często klonuje się w wektorze. Przy podawaniu dwułańcuchowych przeciwciał, dwa łańcuchy można sklonować w tym samym wektorze lub w różnych wektorach.

Dostępnych jest szereg wirusowych układów wektorowych, obejmujących układy retrowirusowe (patrz np. Lawrie i Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109 (1993)); wektory adenowirusowe

PL 215 258 B1 (patrz np. Bett i in., J. Virol. 67: 5911 (1993)); adenosatelitarne wektory wirusowe (patrz np. Zhou i in., J. Exp. Med. 179: 1867 (1994)), wektory wirusowe z rodziny ospy, obejmujące wirusa krowianki i wirusy ospy ptasiej, wektory wirusowe z rodzaju alfawirusów, takie jak pochodzące z wirusów Sindbis i gorączki Semliki Forest (patrz np. Dubensky i in., J. Virol. 70: 508 (1996)), wirus wenezuelskiego zapalenia mózgu koni (patrz Johnston i in., US nr 5 643 576) i rabdowirusy, takie jak wirus pęcherzykowego zapalenia błony śluzowej jamy ustnej (patrz Rose, nr 6 168 943) i wirusy brodawczaka (Ohe i in., Human Gene Therapy 6: 325 (1995); Woo i in., WO nr 94/12629 oraz Xiao i Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2620-2622 (1996)).

DNA kodujący immunogen lub zawierający go wektor można umieścić w liposomach. Odpowiednie lipidy i zbliżone analogi opisali Eppstein i in., US nr 5 208 036, Felgner i in., US nr 5 264 618, Rose, US nr 5 279 833 oraz Epand i in., US nr 5 283 185. Wektory i DNA kodujący immunogen można również zaadsorbować lub zasocjować z nośnikami w postaci cząstek, których przykłady obejmują polimetakrylany metylu oraz polilaktydy i poli(laktyd-co-glikolid), patrz np. McGee i in., J. Micro. Encap. (1996).

Wektory do terapii genowej lub nagie polipeptydy (np. DNA) można dostarczać in vivo przez podawanie konkretnemu pacjentowi, zazwyczaj drogą podawania doustrojowego (np. dożylnie, śródotrzewnowo, donosowo, do przewodu pokarmowego, śródskórnie, domięśniowo, podskórnie lub drogą infuzji doczaszkowej), albo podawania miejscowego (patrz np. Anderson i in., US nr 5 399 346). Określenie „nagi polinukleotyd” dotyczy polinukleotydu nie skompleksowanego z materiałami koloidalnymi. Nagie polinukleotydy czasami klonuje się w wektorze plazmidowym. Takie wektory mogą ponadto zawierać środki ułatwiające, takie jak bupiwacyna (Weiter i in., US nr 5 593 970). DNA można także podawać z użyciem działa genowego. Patrz Xiao i Brandsma, jak wyżej. DNA kodujący immunogen wytrąca się na powierzchni mikroskopijnych perełek metalowych. Mikropociski przyspiesza się za pomocą fali szokowej lub z użyciem rozprężającego się gazowego helu, tak że wnikają one do tkanki na głębokość kilku warstw komórek. Przydatne jest przykładowo urządzenie The Accel™ Gene Delivery Device, produkowane przez Agrietus, Inc. Middleton WI. Alternatywnie, nagi DNA może przejść przez skórę do krwioobiegu po prostu przez nakroplenie DNA na skórę wraz z chemicznym lub mechanicznym podrażnieniem (patrz Howell i in., WO nr 95/05853).

W kolejnej odmianie wektory kodujące immunogeny można dostarczać do komórek ex vivo, np. do komórek wypreparowanych od konkretnego pacjenta (np. z limfocytów, aspiratów szpiku kostnego, z biopsji tkankowych) lub do uniwersalnych donorowych hematopoetycznych komórek macierzystych, a następnie ponownie wszczepiać komórki pacjentowi, zazwyczaj po wyborze komórek zawierających wprowadzony wektor.

II. Metody profilaktyczne i terapeutyczne

Wynalazek umożliwia, między innymi, leczenie choroby Alzheimera i innych chorób amyloidogennych, przez podawanie pacjentowi terapeutycznych reagentów immunologicznych (np. humanizowanych immunoglobulin) dla specyficznych epitopów Αβ, w warunkach wywołujących u pacjenta korzystną odpowiedź terapeutyczną (np. wywołanie fagocytozy Αβ, zmniejszenie obciążenia płytkami, hamowanie powstawania płytek, zmniejszenie dystrofii neurytycznej, poprawę funkcji poznawczych i/lub odwracanie, leczenie lub profilaktykę osłabienia zdolności poznawczych), np. profilaktykę lub leczenie choroby amyloidogennej. Wynalazek dotyczy także zastosowania ujawnionych reagentów immunologicznych (czyli humanizowanych immunoglobulin) do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki choroby amyloidogennej.

W jednej postaci wynalazek umożliwia sposoby profilaktyki lub leczenia choroby związanej ze złogami amyloidowymi Αβ w mózgu pacjenta. Do takich chorób należy choroba Alzheimera, zespół Downa i osłabienie funkcji poznawczych. To ostatnie może wystąpić z innymi cechami choroby amyloidogennej lub bez nich. Pewne sposoby obejmują podawanie skutecznej dawki przeciwciała, które specyficznie wiąże się ze składnikiem złogu amyloidowego pacjenta. Takie sposoby są szczególnie przydatne w profilaktyce lub leczeniu choroby Alzheimera u ludzi. Przykładowe sposoby obejmują podawanie skutecznej dawki przeciwciała, które wiąże się z Αβ. Korzystne sposoby obejmują podawanie skutecznej dawki przeciwciała, które specyficznie wiąże się z epitopem pomiędzy resztami 1-10 Αβ, przykładowo przeciwciał, które specyficznie wiążą się z epitopem pomiędzy resztami 1-3 Αβ, przeciwciał, które specyficznie wiążą się z epitopem pomiędzy resztami 1-4 Αβ, przeciwciał, które specyficznie wiążą się z epitopem pomiędzy resztami 1-5 Αβ, przeciwciał, które specyficznie wiążą się z epitopem pomiędzy resztami 1-6 Αβ, przeciwciał, które specyficznie wiążą się z epitopem pomiędzy resztami 1-7 Αβ lub przeciwciał, które specyficznie wiążą się z epitopem pomiędzy resztami 3-7 Αβ. W jeszcze

PL 215 258 B1 innej postaci podaje się przeciwciała, które wiążą się z epitopem zawierającym wolną N-końcową resztę Αβ. W jeszcze innej postaci podaje się przeciwciała, które wiążą się z epitopem pomiędzy resztami 1-10 Αβ, przy czym resztę 1 i/lub resztę 7 w Αβ stanowi kwas asparaginowy. W jeszcze innej postaci podaje się przeciwciała, które wiążą się z peptydem Αβ bez wiązania się z pełnej długości białkiem prekursorowym amyloidu (APP). W jeszcze innej postaci izotypem przeciwciała jest ludzka IgG1.

W jeszcze innej postaci podaje się przeciwciała, które wiążą się ze złogiem amyloidowym u pacjenta i wywołują odpowiedź klirensową przeciw złogowi amyloidowemu. Przykładowo taka odpowiedź klirensowa może być wywołana przez fagocytozę za pośrednictwem receptora Fc.

Środki terapeutyczne według wynalazku są zazwyczaj zasadniczo czyste i wolne od niepożądanego zanieczyszczenia. Oznacza to, że czystość środka wynosi zazwyczaj co najmniej około 50% w/w (wag./wag.), a także że środek jest zasadniczo wolny od zakłócających białek i zanieczyszczeń. Czasami czystość środków wynosi co najmniej około 80% w/w, a korzystniej co najmniej 90 lub około 95% w/w. Jednakże przy zastosowaniu zwykłych technik oczyszczania białka można otrzymać homogenne peptydy o czystości co najmniej 99% w/w.

Sposoby te można stosować w przypadku pacjentów zarówno bez objawów, jak i tych, u których już występują objawy choroby. Przeciwciała stosowane w takich sposobach mogą stanowić ludzkie, humanizowane, chimeryczne lub nie-ludzkie przeciwciała lub ich fragmenty (np. fragmenty wiążące antygen) i mogą być monoklonalne lub poliklonalne, jak tutaj opisano. W jeszcze innej postaci możliwe jest podawanie przeciwciał otrzymanych od człowieka immunizowanego peptydem Αβ, przy czym człowiekiem może być pacjent, który ma być leczony przeciwciałami.

W innej postaci podaje się przeciwciała z farmaceutycznym nośnikiem, w postaci środka farmaceutycznego. Alternatywnie, przeciwciało można podawać pacjentowi poprzez podawanie polinukleotydu kodującego co najmniej jeden łańcuch przeciwciała. Polinukleotyd jest wyrażany z wytworzeniem łańcucha przeciwciała u pacjenta. Polinukleotyd ewentualnie koduje łańcuch ciężki i lekki przeciwciała. Polinukleotyd ulega ekspresji z wytworzeniem ciężkiego i lekkiego łańcucha u pacjenta. W przykładowych postaciach u pacjenta monitoruje się poziom podawanego przeciwciała we krwi pacjenta.

W związku z tym wynalazek spełnia od dawna istniejące zapotrzebowanie na tryby terapeutyczne w profilaktyce lub łagodzeniu stanów neuropatologicznych, a u pewnych pacjentów, pogorszenia funkcji poznawczych związanych z chorobą Alzheimera.

A. Pacjenci podatni na leczenie

Do pacjentów podatnych na leczenie należą osobnicy z ryzykiem choroby, ale bez jej objawów, a także pacjenci, u których objawy już występują. W przypadku choroby Alzheimera może to być praktycznie dowolna osoba z ryzykiem wystąpienia choroby Alzheimera, jeśli żyje wystarczająco długo. Z tego względu opisane sposoby można stosować profilaktycznie w przypadku ogólnej populacji pacjentów bez potrzeby jakiejkolwiek oceny ryzyka u pacjenta. Opisane sposoby są szczególnie przydatne w przypadku osób ze znanym genetycznym ryzykiem choroby Alzheimera. Należą do nich osoby mające krewnych, u których wystąpiła ta choroba oraz te, u których ryzyko zostało ustalone na podstawie analizy markerów genetycznych lub biochemicznych. Do genetycznych markerów ryzyka wystąpienia choroby Alzheimera należą mutacje w genie APP, zwłaszcza mutacje w pozycji 717 i pozycjach 670 i 671, określane odpowiednio jako mutacje Hardy'ego i szwedzka (patrz Hardy i in.). Do innych markerów ryzyka należą mutacje w genach preseniliny, PS1 i PS2 oraz w ApoE4, rodzinna historia AD, hipercholesterolemia lub miażdżyca tętnic. Osoby aktualnie cierpiące na chorobę Alzheimera można rozpoznać na podstawie charakterystycznego otępienia, a także obecności opisanych powyżej czynników ryzyka. Dostępnych jest ponadto szereg testów diagnostycznych do identyfikacji osób z AD. Należą do nich pomiary poziomów CSF tau i Αβ42. Podwyższone poziomy tau i zmniejszone poziomy Αβ42 świadczą o obecności AD. Osoby cierpiące na chorobę Alzheimera można również zdiagnozować na podstawie kryteriów ADRDA, opisanych w części przykładów.

W przypadku pacjentów bez objawów leczenie można rozpocząć w dowolnym wieku (np. w wieku 10, 20, 30 lat). Jednakże zazwyczaj nie ma potrzeby rozpoczynania leczenia przed osiągnięciem przez pacjenta 40, 50, 60 lub 70 lat. Leczenie obejmuje zazwyczaj stosowanie wielu dawek w pewnym okresie czasu. Leczenie można monitorować oceniając poziomy przeciwciał w czasie. Gdy odpowiedź spada, wskazana jest dawka przypominająca. W przypadku potencjalnych pacjentów z zespołem Downa, leczenie można rozpocząć przed narodzeniem, przez podawanie środka terapeutycznego matce, albo wkrótce po urodzeniu.

PL 215 258 B1

B. Tryby leczenia i dawki

W zastosowaniach profilaktycznych środki farmaceutyczne lub leki podaje się pacjentowi podatnemu lub takiemu, u którego występuje innego rodzaju ryzyko choroby Alzheimera, w ilości wystarczającej do wyeliminowania lub zmniejszenia ryzyka, złagodzenia ostrości lub opóźnienia pojawienia się choroby, w tym biochemicznych, histologicznych i/lub związa nych z zachowaniem objawów choroby, jej powikłań i pośrednich fenotypów patologicznych obecnych podczas rozwoju choroby. W zastosowaniach terapeutycznych środki lub leki podaje się pacjentowi podejrzewanemu o wystąpienie choroby lub takiemu, u którego już ona występuje, w ilości wystarczającej do wyleczenia lub co najmniej częściowego zatrzymania objawów choroby (biochemicznych, histologicznych i/lub związanych z zachowaniem), w tym jej powikłań i pośrednich fenotypów patologicznych obecnych podczas rozwoju choroby.

W pewnych sposobach podawanie środka zmniejsza lub eliminuje pogorszenie zdolności miopoznawczych u pacjentów, u których nie rozwinęła się jeszcze charakterystyczna patologia choroby Alzheimera. Ilość odpowiednią do osiągnięcia działania terapeutycznego lub profilaktycznego określa się jako terapeutycznie lub profilaktycznie skuteczną dawkę. Zarówno w trybie terapeutycznym, jak i profilaktycznym, środki zazwyczaj podaje się w kilku dawkach aż do osiągnięcia wystarczającej odpowiedzi odpornościowej. Określenie „odpowiedź odpornościowa” lub „odpowiedź immunologiczna” obejmuje pojawienie się u biorcy humoralnej (z udziałem przeciwciał) i/lub komórkowej (z udziałem specyficznych dla antygenu komórek T lub wydzielanych przez nich produktów) odpowiedzi skierowanej przeciw antygenowi. Taka odpowiedź może być odpowiedzią aktywną, czyli wywołaną przez podanie immunogenu, albo odpowiedzią bierną, czyli wywołaną przez podanie immunoglobuliny albo przeciwciała lub stymulowanych komórek T. Zazwyczaj odpowiedź immunologiczną monitoruje się podaje powtórzone dawki gdy odpowiedź immunologiczna zaczyna spadać.

Skuteczne dawki środka według wynalazku w leczeniu wyżej opisanych stanów różnią się w zależności od wielu różnych czynników, obejmujących sposób podawania, docelowe miejsce, stan fizjologiczny pacjenta, od tego, czy pacjentem jest człowiek czy też zwierzę, innych podawanych leków, oraz od tego, czy cel podawania stanowi profilaktyka, czy też leczenie. Zazwyczaj pacjentem jest człowiek, ale leczyć można również ssaki inne niż ludzie, w tym ssaki transgeniczne. Należy oznaczyć miano podawanej dawki w celu zoptymalizowania bezpieczeństwa i skuteczności.

W przypadku biernej immunizacji przeciwciałem, dawka wynosi około 0,0001-100 mg/kg, częściej 0,01-5 mg/kg masy ciała pacjenta (np. 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, mg/kg itd.). Przykładowa dawka może wynosić 1 mg/kg masy ciała lub 10 mg/kg masy ciała albo 1-10 mg/kg, korzystnie co najmniej 1 mg/kg. Dawki pośrednie w powyższych przedziałach są także objęte zakresem wynalazku. Pacjentom można podawać takie dawki codziennie, co drugi dzień, raz w tygodniu lub według dowolnego innego trybu ustalonego na podstawie analizy empirycznej. Przykładowe leczenie obejmuje podawanie wielu dawek w przedłużonym okresie czasu, np. w ciągu co najmniej 6 miesięcy. Dodatkowe przykładowe tryby leczenia obejmują podawanie raz na 2 tygodnie lub raz w miesiącu lub raz na 3-6 miesięcy. Dodatkowe przykładowe tryby dawkowania obejmują podawanie raz na dwa tygodnie lub raz na miesiąc lub raz na 3 do 6 miesięcy. Przykładowe tryby dawkowania obejmują podawanie 1-10 mg/kg lub 15 mg/kg w kolejnych dniach, 30 mg/kg co drugi dzień lub 60 mg/kg raz w tygodniu. W pewnych sposobach równocześnie podaje się dwa lub większą liczbę monoklonalnych przeciwciał o różnej specyficzności wiązania i w takim przypadku dawka każdego podawanego przeciwciała mieści się w podanych zakresach.

Przeciwciało zazwyczaj podaje się wielokrotnie. Przerwy pomiędzy poszczególnymi dawkami mogą być tygodniowe, miesięczne lub roczne. Przerwy mogą być również nieregularne, zależnie od wskazań pomiarów poziomów we krwi przeciwciał dla Αβ u pacjenta. W pewnych sposobach dawkę dopasowuje się, aby osiągnąć w osoczu stężenie przeciwciał 1-1000 μg/ml, a w pewnych sposobach 25-300 μg/ml. Alternatywnie, przeciwciało można podawać jak preparat o przedłużonym uwalnianiu, przy czym w takim przypadku wymagane jest rzadsze podawanie. Dawka i częstość podawania zmieniają się w zależności od okresu półtrwania przeciwciała w organizmie pacjenta. Zazwyczaj humanizowane przeciwciała wykazują najdłuższy okres półtrwania, a następnie chimeryczne przeciwciała i nie-ludzkie przeciwciała.

Dawka i częstość podawania mogą zmieniać się w zależności od tego, czy leczenie jest profilaktyczne, czy też terapeutyczne. W zastosowaniach profilaktycznych środki zawierające przeciwciała według wynalazku lub ich mieszaninę podaje się pacjentowi, u którego jeszcze nie wystąpił stan chorobowy, w celu wzmocnienia odporności pacjenta. Taką ilość określa się jako „profilaktycznie skuPL 215 258 B1 teczną dawkę”. W takim zastosowaniu dokładne ilości również zależą od stanu zdrowia i ogólnej odporności pacjenta, ale zazwyczaj wynoszą 0,1-25 mg/dawkę, zwłaszcza 0,5-2,5 mg/dawkę. Stosunkowo niską dawkę podaje się stosunkowo rzadko przez długi okres czasu. Pewni pacjenci kontynuują leczenie przez resztę swojego życia.

W zastosowaniach terapeutycznych stosunkowo wysoka dawka (np. około 1-200 mg przeciwciał/dawkę, przy czym częściej stosowana dawka wynosi 5-25 mg) w stosunkowo krótkich odstępach czasu jest czasami niezbędna aż do zmniejszenia postępu choroby lub jego zakończenia, a korzystnie do momentu, gdy u pacjenta zaobserwuje się częściowe lub całkowite złagodzenie objawów choroby. Następnie w przypadku pacjenta może być stosowany tryb profilaktyczny.

Dawki kwasów nukleinowych kodujących przeciwciała wynoszą od około 10 ng do 1 g, od 100 ng do 100 mg, od 1 μg do 10 mg lub 30-300 μg DNA/pacjenta. Dawki dla zakaźnych wektorów wirusowych zawierają 10-100 lub więcej wirionów/dawkę.

Środki terapeutyczne można podawać pozajelitowo, miejscowo, dożylnie, doustnie, podskórnie, dotętniczo, doczaszkowo, śródotrzewnowo, donosowo lub domięśniowo, w celach profilaktycznych i/lub terapeutycznych. Najbardziej typową drogą podawania środka immunogennego jest droga podskórna, choć inne drogi mogą być równie skuteczne. Kolejną najbardziej rozpowszechnioną drogą jest iniekcja domięśniowa. Ten typ iniekcji najczęściej wykonuje się do mięśni ramienia lub nogi. W pewnych sposobach środki wstrzykuje się bezpośrednio do określonej tkanki, w której nagromadziły się złogi, np. drogą iniekcji doczaszkowej. Iniekcja domięśniowa lub infuzja dożylna są korzystne przy podawaniu przeciwciał. W pewnych sposobach określone terapeutyczne przeciwciała wstrzykuje się bezpośrednio do czaszki. W pewnych sposobach przeciwciała podaje się w postaci kompozycji lub środka o przedłużonym uwalnianiu, takiego jak środek Medipad™.

Środki według wynalazku można ewentualnie podawać w połączeniu z innymi środkami, które są co najmniej częściowo skuteczne w leczeniu choroby amyloidogennej. W przypadku choroby Alzheimera i zespołu Downa, gdy złogi amyloidowe występują w mózgu, środki według wynalazku można również podawać w połączeniu z innymi środkami, które ułatwiają przechodzenie środków według wynalazku przez barierę krew-mózg. Środki według wynalazku można także podawać w połączeniu z innymi środkami, które zwiększają dostęp środka terapeutycznego do docelowej komórki lub tkanki, np. liposomami itp. Współpodawanie takich środków może zmniejszyć dawkę środka terapeutycznego (np. terapeutycznego przeciwciała lub łańcucha przeciwciała) koniecznego do wywołania pożądanego efektu.

C. Środki farmaceutyczne

Substancje według wynalazku często podaje się jako środki farmaceutyczne, zawierające substancję terapeutycznie czynną, oraz szereg innych farmaceutycznie dopuszczalnych składników, patrz Remington's Pharmaceutical Science (15 wyd., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980)). Korzystna postać zależy od przewidzianego trybu podawania i zastosowania terapeutycznego. Środki te mogą również zawierać, w zależności od wymaganego preparatu, farmaceutycznie dopuszczalne, nietoksyczne nośniki lub rozcieńczalniki, określane jako zaróbki powszechnie stosowane w formułowaniu środków farmaceutycznych do podawania zwierzętom lub ludziom. Rozcieńczalnik dobiera się tak, aby nie wpływał na aktywność biologiczną połączenia. Do takich rozcieńczalników przykładowo należy woda destylowana, fizjologiczny roztwór soli buforowany fosforanem, roztwory Ringera, roztwór dekstrozy i roztwór Hanksa. Dodatkowo środek lub preparat farmaceutyczny mogą również zawierać inne nośniki, adiuwanty lub nietoksyczne, nieterapeutyczne, nieimmunogenne stabilizatory itp.

Środki farmaceutyczne mogą również zawierać duże, powoli metabolizowane makrocząsteczki, takie jak białka, polisacharydy, takie jak chitozan, poli(kwasy mlekowe), poli(kwasy glikolowe) i kopolimery (takie jak funkcjonalizowana lateksem sepharose^(TM), agaroza, celuloza itp.), polimeryczne aminokwasy, kopolimery aminokwasów i agregaty lipidowe (takie jak kropelki oleju lub liposomy). Dodatkowo takie nośniki mogą działać jako środki immunostymulujące (tj. adiuwanty).

W przypadku podawania pozajelitowego środki według wynalazku można stosować jako dawki iniekcyjne roztworu lub zawiesiny substancji w fizjologicznie dopuszczalnym rozcieńczalniku z farmaceutycznym nośnikiem, którym może być jałowa ciecz, taka jak woda, oleje, roztwór soli, gliceryna lub etanol. Dodatkowo środek może zawierać substancje pomocnicze, takie jak środki zwilżające lub emulgujące, środki powierzchniowo czynne, substancje buforujące pH itp. Innymi składnikami środków farmaceutycznych są składniki pochodzenia naftowego, zwierzęcego, roślinnego lub syntetyczne, przykładowo olej arachidowy, olej sojowy i olej mineralny. Zazwyczaj glikole, takie jak glikol propyle32

PL 215 258 B1 nowy lub glikol polietylenowy, są korzystnymi ciekłymi nośnikami, zwłaszcza w przypadku roztworów do iniekcji. Przeciwciała można podawać w postaci iniekcji typu depot lub wszczepianego preparatu, który można formułować tak, aby umożliwić przedłużone uwalnianie substancji czynnej. Przykładowy środek zawiera przeciwciało monoklonalne w ilości 5 mg/ml, formułowane w wodnym buforze zawierającym 50 mM L-histydynę, 150 mM NaCl, doprowadzonym do pH 6,0 za pomocą HCl.

Zazwyczaj środki wytwarza się jako preparaty do iniekcji, w postaci ciekłych roztworów lub zawiesin; można także wytwarzać stałe postacie przydatne do przygotowywania roztworów lub zawiesin w ciekłych nośnikach przed iniekcją. Preparat może być również emulgowany lub kapsułkowany w liposomach albo w mikrocząstkach, np. z polilaktydu, poliglikolidu lub ich kopolimeru, w celu wzmocnienia efektu adiuwantowego, jak to przedstawiono powyżej (patrz Langer, Science 249: 1527 (1990) i Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97 (1997)). Środki według wynalazku można podawać w postaci iniekcji typu depot lub wszczepianego preparatu, który można formułować w taki sposób, aby umożliwić przedłużone lub pulsacyjne uwalnianie substancji czynnej.

Do dodatkowych preparatów, odpowiednich do innych trybów podawania, należą preparaty doustne, donosowe i dopłucne, czopki i preparaty do podawania przezskórnego. W przypadku czopków do środków wiążących i nośników należą przykładowo glikole polialkilenowe lub triglicerydy; takie czopki można wytwarzać z mieszanin zawierających substancję czynną w ilości 0,5-10%, korzystnie 1-2%. Preparaty doustne zawierają zaróbki, takie jak farmaceutyczne gatunki mannitolu, laktozy, skrobi, stearynianu magnezu, sacharyny sodowej, celulozy i węglanu magnezu. Środki te przyjmują postać roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, preparatów o przedłużonym uwalnianiu lub proszków i zawierają 10-95% substancji czynnej, korzystnie 25-70%.

Podawanie miejscowe może prowadzić do dostarczania przezskórnego lub śródskórnego. Podawanie miejscowe można ułatwić przez współpodawanie środka z toksyną cholery lub jej odtoksycznionymi pochodnymi lub jej podjednostkami, albo z innymi podobnymi toksynami bakteryjnymi (patrz Glenn i in., Nature 391, 851 (1998)). Współpodawanie można osiągnąć przez zastosowanie składników w postaci mieszaniny lub w postaci połączonych cząsteczek otrzymanych przez chemiczne sieciowanie lub ekspresję jako białko fuzyjne.

Alternatywnie, przezskórne podawanie można osiągnąć przez zastosowanie plastrów na skórę lub z użyciem transferosomów (Paul i in., Eur. J. Immunol. 25: 3521 (1995); Cevc i in., Biochem. Biophys. Acta 1368: 201-15 (1998)).

III. Monitorowanie przebiegu leczenia

Wynalazek umożliwia sposoby monitorowania leczenia pacjenta cierpiącego lub podatnego na chorobę Alzheimera, tj. monitorowania przebiegu leczenia zastosowanego u pacjenta. Sposób ten można zastosować do monitorowania zarówno leczenia terapeutycznego pacjentów z objawami, jak i profilaktycznego leczenia pacjentów bez objawów. W szczególności, sposoby są przydatne do monitorowania biernej immunizacji (np. do pomiaru poziomu podanego przeciwciała).

Pewne sposoby obejmują wyznaczanie wartości wyjściowej, np. poziomu lub profilu przeciwciał u pacjenta, przed podaniem dawki środka, oraz porównanie jej z wartością profilu lub poziomu po leczeniu. Znaczący wzrost (tj. wyższy niż typowy margines błędu doświadczalnego w powtórzonych pomiarach tej samej próbki, wyrażony jako jedno odchylenie standardowe od wartości średniej takich pomiarów) wartości poziomu lub profilu jest sygnałem dodatniego wyniku leczenia (czyli, że podanie środka wywołało pożądaną odpowiedź). Jeśli wartość odpowiedzi odpornościowej nie zmienia się znacząco lub spada, jest to oznaką ujemnego wyniku leczenia.

W innych sposobach wartość kontrolną (czyli wartość średnią z odchyleniem standardowym) poziomu lub profilu ustala się dla kontrolnej populacji. Zazwyczaj osobnicy w kontrolnej populacji nie byli wcześniej poddawani leczeniu. Zmierzone wartości poziomu lub profilu u pacjenta po podaniu środka terapeutycznego porównuje się następnie z wartością kontrolną. Znaczący wzrost w stosunku do wartości kontrolnej (np. powyżej jednego odchylenia standardowego od średniej) oznacza dodatni lub wystarczający wynik leczenia. Brak znaczącego wzrostu lub spadek oznacza ujemny lub niewystarczający wynik leczenia. Podawanie środka zazwyczaj kontynuuje się aż do osiągnięcia poziomu powyżej wartości kontrolnej. Jak poprzednio, osiągnięcie plateau w stosunku do wartości kontrolnych jest wskazówką, że podawanie środka można przerwać lub zmniejszyć dawkę i/lub częstość podawania.

W innych sposobach wartość kontrolną poziomu lub profilu (np. wartość średnią i odchylenie standardowe) ustala się dla kontrolnej populacji osób poddawanych leczeniu środkiem terapeutycznym i u których poziomy lub profile osiągnęły plateau w odpowiedzi na leczenie. Zmierzone wartości poziomów lub profili u pacjenta porównuje się z wartością kontrolną. Gdy zmierzony poziom u pacjenPL 215 258 B1 ta nie różni się znacząco (np. więcej niż o jedno odchylenie standardowe) od wartości kontrolnej, leczenie można przerwać. Gdy poziom u pacjenta jest znacząco niższy od wartości kontrolnej, kontynuowanie podawania środka jest uzasadnione. Gdy poziom u pacjenta utrzymuje się poniżej wartości kontrolnej, wskazana może być zmiana leczenia.

W innych sposobach u pacjenta, który aktualnie nie jest leczony, ale który przebył leczenie, monitoruje się poziomy lub profile przeciwciała w celu ustalenia, czy konieczne jest wznowienie leczenia. Zmierzony poziom lub profil u pacjenta można porównać z wartością uprzednio osiągniętą u pacjenta, po poprzednim okresie leczenia. Znaczący spadek w stosunku do wcześniejszego pomiaru (tj. większy niż typowy margines błędu w powtarzanych pomiarach tej samej próbki) stanowi oznakę, że leczenie należy wznowić. Alternatywnie, wartość zmierzoną u pacjenta można porównać z wartością kontrolną (wartością średnią plus odchylenie standardowe) oznaczoną dla populacji pacjentów po przebytym leczeniu. Alternatywnie, wartość zmierzoną u pacjenta można porównać z wartością kontrolną dla populacji profilaktycznie leczonych pacjentów bez objawów choroby lub populacji terapeutycznie leczonych pacjentów, u których nastąpiło złagodzenie wskaźników choroby. We wszystkich tych przypadkach znaczące zmniejszenie w porównaniu z poziomem kontrolnym (czyli przekraczaj ącym odchylenie standardowe) stanowi wskazówkę, że należy wznowić leczenie pacjenta.

Próbkę tkanki do analizy stanowi zazwyczaj krew, osocze, surowica, płyn śluzowy lub płyn mózgowo-rdzeniowy pacjenta. Próbkę analizuje się, np. w celu określenia poziomów lub profili przeciwciał dla peptydu Αβ, np. poziomów lub profili humanizowanych przeciwciał. Metody ELISA wykrywania przeciwciał specyficznych dla Αβ opisano w części przykładów. W pewnych metodach poziom lub profil podawanego przeciwciała oznacza się w teście klirensowym, np. w opisanym tutaj teście fagocytozy in vitro. W takich metodach badaną próbkę tkanki od pacjenta kontaktuje się ze złogami amyloidowymi (np. od myszy PDAPP) i fagocytującymi komórkami niosącymi receptory Fc. Następnie monitoruje się klirens złogów amyloidowych. Obecność i zakres odpowiedzi klirensowej dostarcza wskazania odnośnie obecności i poziomu przeciwciał skutecznie powodujących klirens Αβ w badanej próbce tkanki pacjenta.

Profil przeciwciała po biernej immunizacji zazwyczaj wykazuje natychmiastowy pik stężenia przeciwciała, po którym następuje wykładniczy spadek. Bez kolejnej dawki spadek prowadzi do osiągnięcia poziomów sprzed leczenia w okresie od dni do miesięcy, w zależności od okresu półtrwania podanego przeciwciała.

W pewnych metodach pomiar wartości wyjściowej przeciwciał dla Αβ u pacjenta wykonuje się przed podaniem, drugi pomiar wykonuje się wkrótce potem, w celu oznaczenia szczytowego poziomu przeciwciała, oraz jeden lub większą liczbę pomiarów wykonuje się w pewnych odstępach czasu, aby monitorować spadek poziomu przeciwciała. Gdy poziom przeciwciała obniży się do wartości wyjściowej lub o ustalony procent różnicy pomiędzy pikiem a wartością wyjściową (np. 50%, 25% lub 10%), podaje się kolejną dawkę przeciwciała. W pewnych metodach wartość szczytową lub następnie zmierzone poziomy, pomniejszone o wartość tła, porównuje się z uprzednio ustalonymi poziomami odniesienia, odpowiadającymi korzystnemu trybowi leczenia profilaktycznego lub terapeutycznego u innych pacjentów. Gdy zmierzony poziom przeciwciała jest znacząco niższy od poziomu odniesienia (np. niższy od wartości średniej pomniejszonej o odchylenie standardowe wartości odniesienia u populacji pacjentów, u których leczenie przyniosło korzyści), wskazane jest podanie dodatkowej dawki przeciwciała.

Dodatkowe sposoby obejmują monitorowanie w trakcie leczenia dowolnego znanego objawu fizjologicznego (np. objawu fizycznego lub umysłowego) rutynowo wykorzystywanego przez badaczy lub lekarzy do diagnozowania lub monitorowania chorób amyloidogennych (np. choroby Alzheimera). Przykładowo, można monitorować pogorszenie funkcji poznawczych. Są one objawem choroby Alzheimera i zespołu Downa, ale mogą również wystąpić bez innych cech charakterystycznych dla obydwu tych chorób. Przykładowo, pogorszenie funkcji poznawczych w trakcie leczenia można monitorować przez ustalenie oceny pacjenta w teście Mini-Mental State Exam, zgodnie z powszechnie przyjętą konwencją.

C. Zestawy

Można wytworzyć także zestawy do przeprowadzania opisanych powyżej metod monitorowania. Zazwyczaj takie zestawy zawierają środek, który specyficznie wiąże się z przeciwciałami dla Αβ. Zestaw może również zawierać znacznik. Do wykrywania przeciwciał dla Αβ znacznik jest zazwyczaj w postaci znakowanych przeciwciał przeciwidiotypowych. Do wykrywania przeciwciał można stosować środek wstępnie związany z fazą stałą, taką jak studzienki płytki do mikromianowania. Zestawy za34

PL 215 258 B1 zwyczaj zawierają również oznakowania ze wskazówkami odnośnie stosowania zestawu. Oznakowanie może również obejmować kartę lub inne wskazówki umożliwiające skorelowanie poziomów mierzonego znacznika z poziomami przeciwciał dla Αβ. Określenie oznakowanie odnosi się do pisanego lub zarejestrowanego materiału dołączonego lub w inny sposób towarzyszącego zestawowi w dowolnym momencie podczas jego wytwarzania, transportu, sprzedaży lub stosowania. Przykładowo, określenie oznakowanie obejmuje ulotki reklamowe i broszury, materiały opakowaniowe, instrukcje, kasety audio lub video, dyski komputerowe, a także opis nadrukowany bezpośrednio na zestawach.

Można wytworzyć także zestawy diagnostyczne, przykładowo zestawy do badania, wykrywania i/lub diagnozowania (np. do wykonywania obrazowania in vivo). Takie zestawy zazwyczaj zawierają przeciwciało do wiązania z epitopem Αβ, korzystnie w obszarze reszt 1-10. Korzystnie, przeciwciało jest wyznakowane lub do zestawu dołączony jest drugorzędowy odczynnik znakujący. Korzystnie, zestaw jest oznakowany instrukcjami dotyczącymi przeprowadzenia zamierzonego zastosowania, np. do wykonania obrazowania in vivo. Przykłady przeciwciał zostały tutaj opisane.

D. Obrazowanie in vivo

Wynalazek umożliwia sposoby obrazowania in vivo złogów amyloidowych u pacjenta. Takie sposoby są przydatne w diagnozowaniu lub potwierdzaniu diagnozy choroby Alzheimera lub podatności na nią. Przykładowo, sposoby można stosować w przypadku pacjenta z objawami otępienia. Gdy u pacjenta występują nienormalne złogi amyloidowe, to wówczas pacjent prawdopodobnie cierpi na chorobę Alzheimera. Sposoby takie można również stosować w przypadku pacjentów bezobjawowych. Obecność nienormalnych złogów amyloidu wskazuje na podatność na wystąpienie w przyszłości choroby z objawami. Sposoby są także przydatne w monitorowaniu postępu choroby i/lub odpowiedzi na leczenie w przypadku pacjentów, u których uprzednio zdiagnozowano chorobę Alzheimera.

Sposoby obejmują podawanie pacjentowi odczynnika, takiego jak przeciwciało wiążące się z Αβ, a następnie wykrywanie środka po jego związaniu. Korzystne przeciwciała wiążą się ze złogami Αβ u pacjenta bez wiązania się z pełnej długości poIipeptydem APP. Szczególnie korzystne są przeciwciała wiążące się z epitopem Αβ pomiędzy aminokwasami 1-10. W pewnych sposobach przeciwciało wiąże się z epitopem pomiędzy aminokwasami 7-10 w Αβ. Takie przeciwciała zazwyczaj wiążą się bez wywoływania znaczącej odpowiedzi klirensowej. W innych sposobach przeciwciało wiąże się z epitopem pomiędzy aminokwasami 1-7 w Αβ. Takie przeciwciała zazwyczaj wiążą się i wywołują odpowiedź klirensową na Αβ. Jednakże odpowiedzi klirensowej można uniknąć przez zastosowanie fragmentów przeciwciała nie zawierających regionu stałego o pełnej długości, takich jak Fab. W pewnych sposobach to samo przeciwciało może służyć zarówno do leczenia, jak i jako odczynnik diagnostyczny. Ogólnie przeciwciała wiążące się z epitopami od końca C do reszty 10 Αβ nie wykazują tak silnego sygnału, jak przeciwciała wiążące się z epitopami pomiędzy resztami 1-10, prawdopodobnie z uwagi na to, że C-końcowe epitopy są niedostępne w złogach amyloidowych. W związku z tym takie przeciwciała są mniej korzystne.

Odczynniki diagnostyczne można podawać drogą iniekcji dożylnej do organizmu pacjenta, albo bezpośrednio do mózgu drogą iniekcji wewnątrzczaszkowej albo przez wywiercenie otworu przez czaszkę. Dawka odczynnika powinna mieścić się w takich samych granicach jak w sposobach leczenia. Zazwyczaj, odczynnik jest wyznakowany, choć w pewnych sposobach pierwszorzędowy odczynnik z powinowactwem do Αβ jest nieznakowany, przy czym stosuje się drugorzędowy środek znakujący do wiązania się z pierwszorzędowym odczynnikiem. Dobór znacznika zależy od środków wykrywających. Przykładowo, znacznik fluorescencyjny jest przydatny przy wykrywaniu technikami optycznymi. Zastosowanie znaczników paramagnetycznych jest przydatne przy wykrywaniu tomograficznym bez interwencji chirurgicznej. Radioaktywne znaczniki można także wykrywać technikami PET lub SPECT.

Diagnozę wykonuje się przez porównanie liczby, wielkości i/lub natężenia znakowanych miejsc z odpowiednimi wartościami podstawowymi. Wartości podstawowe mogą reprezentować średnie poziomy w populacji osób, które nie są chore. Wartości podstawowe mogą również stanowić poprzednie poziomy oznaczone u tego samego pacjenta. Przykładowo, wartości podstawowe można oznaczyć u pacjenta przed rozpoczęciem leczenia i wartości oznaczone później porównywać z wartościami podstawowymi. Spadek wartości w stosunku do wartości podstawowych oznacza dodatnią odpowiedź na leczenie.

PL 215 258 B1

Wynalazek zostanie dokładniej opisany w poniższych przykładach, nie ograniczających jego zakresu.

P r z y k ł a d y

Poniższe identyfikatory sekwencji zastosowano w części przykłady do odniesienia się do sekwencji nukleotydów i aminokwasów regionu zmiennego łańcucha immunoglobuliny.

Przeciwciało	Sekwencja nukleotydów VL	Sekwencja aminokwasów VL	Sekwencja nukleotydów VH	Sekwencja aminokwasów VH
12B4	SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO: 2	SEQ ID NO: 3	SEQ ID NO: 4
Humanizowane 12B4v1	SEQ ID NO: 5	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 7	SEQ ID NO: 8
Humanizowane 12B4v2	SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO: 10
Humanizowane 12B4v3	SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 11	SEQ ID NO: 12
Linia zarodkowa A19	SEQ ID NO: 29	SEQ ID NO: 30
Kabat ID 005036	SEQ ID NO: 31	SEQ ID NO: 32
Kabat ID 000333			SEQ ID NO: 33	SEQ ID NO: 34
Linia zarodkowa VH4-61			SEQ ID NO: 35	SEQ ID NO: 36
Linia zarodkowa VH4-39			SEQ ID NO: 37	SEQ ID NO: 38

W stosowanym tutaj znaczeniu, sekwencja przeciwciała lub immunoglobuliny zawierająca sekwencję VL i/lub VH przedstawiona przez jeden z SEQ ID NO: 1-12 lub 29-38 może zawierać pełną sekwencję lub może zawierać dojrzałą sekwencję (tj. dojrzały peptyd bez peptydu sygnałowego lub liderowego).

P r z y k ł a d 1. Klonowanie i sekwencjonowanie regionów zmiennych mysiego 12B4

Klonowanie i analiza sekwencji VH 12B4. Regiony VH i VL 12B4 z komórek hybrydoma sklonowano metodą RT-PCR i 5'RACE stosując mRNA z komórek hybrydoma i znaną metodologię klonowania. Sekwencję nukleotydów (SEQ ID NO: 3) oraz wyprowadzoną sekwencję aminokwasów (SEQ ID NO: 4) pochodzące z dwóch niezależnych klonów cDNA kodujących przypuszczalną domenę VH 12B4 przedstawiono odpowiednio w tabeli 2 i tabeli 3.

T a b e l a 2

Sekwencja DNA mysiej VH 12B4

ATGGACAGGCTTACTTCCTCATTCCTGCTGCTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTCCCA

GGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA

CTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTAATGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGT

CAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGAGGACAAGCG

CTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCTAACAATCAGG

TATTCCTCAAGATCACCAATGTGGACACTGCTGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGA

AGGAGGATCATCTATGATGTTGAGGACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCT

CACAGTCTCCTCAG (SEQ ID NO: 3) *podkreślono peptyd liderowy

T a b e l a 3

Sekwencja aminokwasów mysiej VH 12B4 mdrltssflllivpayvlsqVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLStngmgvs WIRQPSGKGLEWLAhiywdedkrynpslksRLTISKDTSNNQVFLKITNVDTADTATYYCA RrriiydvedyfdyWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 4) * peptyd liderowy i CDR przedstawiono małymi literami

Klonowanie i analiza sekwencji VL 12B4. Region zmienny VL łańcucha lekkiego 12B4 sklonowano w sposób analogiczny do klonowania regionu VH. Sekwencję nukleotydów (SEQ ID NO: 1) oraz wyprowadzoną sekwencję aminokwasów (SEQ ID NO: 2) pochodzące z dwóch niezależnych klonów cDNA kodujących przypuszczalną domenę VL 12B4 przedstawiono odpowiednio w tabeli 4 i tabeli 5.

PL 215 258 B1

T a b e l a 4

Sekwencja DNA mysiej VL 12B4.

ATGAAGTTGCCTGTTAOGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGA

TGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCA

TCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTGTTCATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGG

TACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATT TTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGA TCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTT CCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAC (SEQ ID NO: 1) *podkreślono peptyd liderowy

T a b e l a 5

Sekwencja aminokwasów mysiej VL 12B4 mklpvrllvlmfwipasssDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCrssqnivhsngnty leWYLQKPGQSPKLLIYkvsnrfSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCfqgsh vpltFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 2) * peptyd liderowy i CDR przedstawiono małymi literami

Sekwencje VL i VH 12B4 spełniają kryterium funkcjonalnych regionów V tak długo jak zawierają ciągłą ORF od początkowej metioniny do regionu na C-końcu i zawierają konserwowane reszty charakterystyczne dla genów regionu V immunoglobulin. Od N-końca do C-końca zarówno lekki jak i ciężki łańcuch zawierają domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Przypisanie aminokwasów do każdej domeny jest zgodne z numeracją w konwencji Kabata i in., jak wyżej.

P r z y k ł a d II: Ekspresja chimerycznego przeciwciała 12B4

Ekspresja chimerycznego przeciwciała 12B4: Zmienne regiony łańcucha ciężkiego i lekkiego przekonstruowano tak, aby kodowały donorowe sekwencje splicingowe donora w dół od odpowiednich połączeń VDJ lub VJ i wklonowano do ssaczego wektora ekspresyjnego pCMV-hy1 w przypadku ciężkiego łańcucha i pCMV-hK1 w przypadku lekkiego łańcucha. Wektory te kodują ludzkie stałe regiony γ1 i Ck jako eksonowe fragmenty w dół od wstawionej kasety regionu zmiennego. Po weryfikacji sekwencji wektorami do ekspresji łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego kotransfekowano komórki COS. Następnie różne klony łańcucha ciężkiego niezależnie kontransfekowano z różnymi chimerycznymi klonami łańcucha lekkiego w celu potwierdzenia powtarzalności wyniku. Kondycjonowane podłoża zebrano w 48 godzin po transfekcji i wykonano analizę Western blotting w celu ustalenia wytwarzania przeciwciał lub ELISA do ustalenia wiązania Αβ. Spośród wielokrotnych transfektantów wszystkie eksprymowały kombinacje ciężki łańcuch + lekki łańcuch, rozpoznawane przez przeciwciało kozie przeciw ludzkiej IgG (H + L) w metodzie Western blotting.

Bezpośrednie wiązanie chimerycznych przeciwciał 12B4 z Αβ zbadano w teście ELISA. Fig. 5 przedstawia wynik, że chimeryczne 12B4 wiąże Αβ z dużą zachłannością, podobnie do tego co wykazano dla chimerycznego i humanizowanego 3D6 (fig. 5). (Klonowanie, charakteryzację i humanizację 3D6 opisano w zgłoszeniu patentowym US o nr seryjnym 10/010942, którego całą zawartość wprowadza się tutaj jako źródło literaturowe). Dalej, oparty na ELISA test współzawodniczego hamowania ujawnił, że chimeryczne 12B4 i mysie 12B4 współzawodniczą w równym stopniu z biotynylowanym mysim i chimerycznym 3D6, a także 10D5 (mysie przeciwciało monoklonalne izotypu ^Ογ1, które rozpoznaje ten sam epitop co 12B4), o wiązanie z Αβ. Fig. 6 pokazuje, że chimeryczne 12B4 (linia kropkowana, puste trójkąty) współzawodniczy z równą siłą ze swoim niebiotynylowanym mysim odpowiednikiem (linia ciągła, pełne trójkąty) o wiązanie biotynylowanego mysiego 12B4 dla peptydu Αβ 1-42.

P r z y k ł a d III. Skuteczność mAb 12B4 w różnych efektach neuropatologicznych myszy

PDAPP

Przykład ten opisuje wpływ mysiego mAb 12B4 na różne efekty neuropatologiczne. Opisano porównanie dwóch mAb, 12B4 i 3D6. Obydwa mAb należą do izotypu IgG2a i obydwa wiążą epitop w obrębie N-końca peptydu Αβ.

PL 215 258 B1

Immunizacje

Myszy PDAPP biernie immunizowano mAb 12B4 (rozpoznającym Αβ 3-7) lub mAb 3D6 (rozpoznającym Αβ 1-5), obydwoma izotypu IgGy2a. 12B4 zbadano w stężeniu 10 mg/kg. 3D6 podano w trzech różnych dawkach, 10 mg/kg, 1 mg/kg i 10 mg/kg raz na miesiąc (1 x 4). Iniekcje niepokrewnego przeciwciała IgGy2a (TY11/15) i PBS służyły jako kontrole. Czynna immunizacja peptydem Αβ służyła za porównanie. W każdej grupie analizowano 20-35 zwierząt.

Zbadano efekty neuropatologiczne, włącznie z obciążeniem amyloidem i obciążeniem neurytycznym.

Obciążenie amyloidem

Rozmiar kory czołowej zajmowanej przez złogi amyloidowe wyznaczono przez wybarwienie immunologiczne 3D6, a następnie przeprowadzono ilościową analizę obrazu. Wyniki tej analizy przedstawiono w tabeli 6. Wszystkie immunoterapie (np. immunizacja 12B4, 3D6 (wszystkie badane dawki) i peptydem Αβ) doprowadziły do znaczącego obniżenia obciążenia amyloidem.

Obciążenie neurytyczne

Wcześniej obserwowano, że 10D5 nie jest w stanie znacząco obniżyć obciążenia neurytycznego, co sugeruje, że przeciwciała izotypu IgGy2a, ale nie innych izotypów, są w stanie obniżyć obciążenie neurytyczne w zwierzęcych modelach choroby Alzheimera (dane nie prezentowane). Zatem obciążenie neurytyczne po biernej immunizacji 12B4 względem 3D6 (obydwa izotypu IgGy2a) wyznaczono u myszy PDAPP przez wybarwienie immunologiczne skrawków mózgów przeciwciałem 8E5 przeciw-APP, a następnie przeprowadzono ilościową analizę obrazu. Dystrofia neurytyczna jest wskazana przez pojawienie się neurytów dystroficznych (np. neurytów o wyglądzie globularnym) umiejscowionych w bezpośredniej bliskości płytek amyloidowych. Wyniki tej analizy przedstawiono w tabeli 7. Dane te wskazują, że leczenie 12B4 najbardziej znacząco obniżyło obciążenie neurytyczne. W odróżnieniu od tego, 3D6 nie obniżyło znacząco obciążenia neurytycznego.

T a b e l a 6

Obciążenie amyloidem kory czołowej

	PBS	TY 11/15	12B4	3D6, 10 mg/kg	3D6, 1 mg/kg	3D6, 10 mg/kg/4 tygodnie	Aktywne
N	31	30	33	29	31	32	24
Mediana (% AB)	15,182297	13,303288	2,317222	0,865671	2,286513	1,470956	2,162772
Zakres	0,160-31,961	0-61,706	0-14,642	0-7,064	0,077- 63,362	0-10.688	0-30,715
Wartość p (*M-W)		,9425 ns	*** < ,0001	*** ,0001	*** < ,0001	*** < ,0001	*** ,0004
% Zmiany	N/A	12%	85%	94%	85%	90%	86%

T a b e l a 7

Obciążenie neurytyczne kory czołowej

	PBS	TY 11/15	12B4	3D6, 10 mg/kg	3D6, 1 mg/kg	3D6, 10 mg/kg/4 tygodnie	Aktywne
N	31	30	33	29	31	32	24
Mediana (% NB)	0,3946	0,3958	0,0816	0,4681	0,3649	0,4228	0,2344
Zakres	0-1,3828	0-2,6800	0-0,8127	0-1,3098	0-1,5760	0-1,8215	0-1,1942
Wartość p (*M-W)		,8967 ns	*** ,0002	,9587 ns	,6986 ns	> ,9999	*** ,0381
% Zmiany		0%	79%	0%	7%	0%	41%

PL 215 258 B1

Powyższe wyniki wskazują, że leczenie przeciwciałem przeciw Αβ izotypu IgGy2a może być konieczne, ale nie wystarczające, do obniżenia obciążenia neurytycznego. Wiązanie Αβ przez wyraźny epitop (tj. Αβ 3-7) może być zasadnicze dla obniżenia tej patologii u myszy PDPP.

Charakteryzacja różnych efektów neuropatologicznych w mysim PDAPP modelu choroby Alzheimera dostarcza przydatną informację do zastosowania przez specjalistów do zaprojektowania odpowiednich protokołów terapeutycznego szczepienia ludzi. Przykładowo, zmniejszenie obciążenia neurytycznego można osiągnąć u pacjentów będących ludźmi z użyciem humanizowanej wersji 12B4 podtypu IgG1 (tj. ludzkiego odpowiednika mysiego podtypu IgGy2a), które wiąże epitop w obrębie reszt 3-7 Αβ.

P r z y k ł a d IV. Test przesiewowy ex vivo aktywności przeciwciał przeciw złogom amyloidowym

W celu zbadania wpływu przeciwciał na klirens płytek, przeprowadzono test ex vivo, w którym pierwotne komórki mikrogleju hodowano z nieutrwalonymi kriostatowymi skrawkami mózgów mysich PDAPP lub ludzkich AD. Komórki mikrogleju otrzymano z rdzeni mózgowych nowonarodzonych myszy DBA/2N (1-3 dniowych). Kory mechanicznie rozdzielono w HBSS (zrównoważonym roztworze soli Hanksa, Sigma) z 50 μg/ml DNazy I (Sigma). Rozdzielone komórki przesączono przez 100 μm filtr komórkowy (Falcon) i odwirowano z szybkością 1000 obrotów/min przez 5 minut. Osad ponownie przeprowadzono w zawiesinę w podłożu wzrostowym (wysoko glukozowe DMEM, 10% FBS, 25 ng/ml rekombinowanego mysiego GM-CSF (mGM-CSF)) i komórki wysiewano w gęstości 2 mózgi/butelkę T-75 do hodowli, z tworzywa sztucznego. Po 7-9 dniach kolby obracano na wytrząsarce orbitalnej z szybkością 200 obrotów/min przez 2 godziny w 37°C. Zawiesinę komórek odwirowano z szybkością 1000 obrotów/min i przeprowadzono w zawiesinę w podłożu testowym.

μm kriostatowe skrawki mózgów mysich PDAPP lub ludzkich AD (okres od śmierci < 3 godzin) osadzono po rozmrożeniu na powleczonych polilizyną okrągłych szkiełkach nakrywkowych i umieszczono w studzienkach 24-studzienkowych płytek do hodowli tkankowej. Szkiełka nakrywkowe przemyto dwukrotnie podłożem testowym zawierającym H-SFM (podłoże wolne od surowicy dla hybrydom, Gibco BRL) z 1% FBS, glutaminą, penicyliną/streptomycyną i 5 ng/ml rmGM-CSF (R & D). Dodano przeciwciała kontrolne lub przeciw Αβ (12B4) w stężeniu 2x (stężenie końcowe 5 μg/ml) na 1 godzinę. Następnie, komórki mikrogleju wysiano przy gęstości 0,8 x 10⁶ komórek/ml podłoża testowego. Hodowle utrzymywano w inkubatorze z nawilżaniem (37°C, 5% CO2) przez 24 godziny lub dłużej. Pod koniec inkubacji hodowle utrwalono 4% paraformaldehydem i permeabilizowano 0,1% Tritonem-X100. Skrawki wybarwiono biotynylowanym 3D6, a następnie koniugatem streptawidyna/Cy3 (Jackson ImmunoResearch). Egzogenne komórki mikrogleju uwidoczniono przez wybarwienie jąder (DAPI). Hodowle obserwowano pod inwersyjnym mikroskopem fluorescencyjnym (Nikon, TE300) i wykonano mikrofotografie aparatem cyfrowym SPOT z oprogramowaniem SPOT (Diagnostic instruments).

Gdy próbę wykonywano ze skrawkami przekrojami mózgu PDAPP w obecności przeciwciała kontrolnego, nie wykazującego skuteczności in vivo, płytki β-amyloidowe pozostały nienaruszone i nie zaobserwowano fagocytozy. Natomiast gdy sąsiednie skrawki hodowano w obecności 3D6 i 12B4, złogi amyloidowe w znacznym stopniu zanikły, a komórki mikrogleju zawierały liczne pęcherzyki fagocytowe zawierające Αβ (fig. 7). Podobne wyniki otrzymano w przypadku skrawków mózgów AD; 3D6 (humanizowana wersja) i chimeryczne 12B4 wywoływały fagocytozę płytek AD, natomiast kontrolne IgG1 było nieskuteczne (fig. 8A-B).

Dane przedstawione w przykładach II i III potwierdzają działanie sklonowanych regionów zmiennych 12B4.

P r z y k ł a d V. Humanizacja 12B4

A. Humanizowane przeciwciało 12B4, wersja 1

Homologia/Modelowanie cząsteczkowe. W celu zidentyfikowania kluczowych strukturalnych reszt zrębowych w mysim przeciwciele 12B4, wygenerowano trójwymiarowy model na bazie najbardziej zbliżonych mysich przeciwciał dla łańcucha ciężkiego i lekkiego. W tym celu przeciwciało oznaczone jako 2PCP wybrano jako matrycę do modelowania łańcucha lekkiego 12B4 (PDB ID: 2PCP, Lim i in. (1998) J. Biol. Chem. 273: 28576), a przeciwciało oznaczone jako 1ETZ wybrano jako matrycę do modelowania łańcucha ciężkiego. (PDB ID: 1ETZ Guddat i in. (2000) J. Mol. Biol. 302: 853). Uliniowienie sekwencji aminokwasów 12B4 z łańcuchem lekkim i łańcuchem ciężkim tych przeciwciał ujawniło, że przeciwciała 2PCP i 1ETZ wykazują wystarczającą homologię sekwencji z 12B4. Na dodatek pętle CDR wybranych przeciwciał należą do tych samych kanonicznych klas strukturalnych

PL 215 258 B1

Chothia co pętle CDR w 12B4. Z tego względu 2PCP i 1ETZ wybrano wstępnie jako przeciwciała o ustalonej strukturze do homologicznego modelowania 12B4.

Pierwszy model homologiczny regionu zmiennego 12B4 na bazie przeciwciał wspomnianych powyżej skonstruowano z użyciem pakietu oprogramowania Look & SegMod Modules GeneMine (v3.5). Oprogramowanie to zakupiono ze stałą licencją z Molecular Applications Group (Palo Alto, CA). Ten pakiet oprogramowania, którego autorami są dr Michael Levitt i dr Chris Lee, ułatwia proces modelowania cząsteczkowego przez zautomatyzowanie etapów podczas strukturalnego modelowania sekwencji pierwszorzędowej na matrycy znanej struktury, w oparciu o homologię sekwencji. Dzięki pracy z wykorzystaniem stacji roboczej Silicon Graphics IRIS w środowisku UNIX modelowana struktura jest automatycznie optymalizowana w serii etapów minimalizowania energii w celu złagodzenia niekorzystnych kontaktów atomowych i zoptymalizowania oddziaływań elektrostatycznych i van der Wallsa. Kolej_® ny zoptymalizowany model skonstruowano z wykorzystaniem zdolności modelujących Quanta^®.

Selekcja sekwencji ludzkiego przeciwciała akceptorowego. Odpowiednie sekwencje ludzkiego przeciwciała akceptorowego zidentyfikowano drogą komputerowego porównywania sekwencji aminokwasów mysich regionów zmiennych z sekwencjami znanych ludzkich przeciwciał. Porównanie przeprowadzono osobno dla ciężkiego i lekkiego łańcucha 12B4. W szczególności domeny zmienne ludzkich przeciwciał, których sekwencje zrębowe wykazywały wysoki stopień identyczności sekwencji z mysimi regionami zrębowymi VL i VH, zidentyfikowano przez przeszukanie bazy danych Kabat z wykorzystaniem programu NCBI BLAST (ogólnie dostępnego poprzez serwer internetowy National Institutes of Health NCBI) odpowiednimi mysimi sekwencjami zrębowymi.

Dwie potencjalne sekwencje wybrano jako sekwencje akceptorowe, w oparciu o następujące kryteria: (1) homologia z przedmiotową sekwencją; (2) dzielenie kanonicznych struktur CDR z sekwencją donorową; oraz (3) brak jakichkolwiek rzadkich reszt aminokwasowych w regionach zrębowych. Wybraną sekwencją akceptorową dla VL jest numer ID Kabata (KABID) 005036 (nr dostępu Genbank X67904), a dla VH jest KABID 000333 (nr dostępu Genbank X54437). W pierwszych wersjach tego humanizowanego przeciwciała 12B4 wykorzystano te wybrane sekwencje przeciwciał akceptorowych.

Podstawienie reszt aminokwasowych. Jak to zaznaczono powyżej, humanizowane przeciwciała według wynalazku zawierają regiony zrębowe części zmiennej zasadniczo z ludzkiej immunoglobuliny (immunoglobuliny akceptorowej) i regiony determinujące dopasowanie, zasadniczo z mysiej immunoglobuliny (immunoglobuliny donorowej) określanej jako 12B4. Po zidentyfikowaniu regionów determinujących dopasowanie w 12B4 i odpowiednich ludzkich immunoglobulin akceptorowych, następnym etapem było ustalenie, czy ewentualnie jakieś reszty z tych składników nadają się do podstawienia w celu zoptymalizowania właściwości otrzymanego humanizowanego przeciwciała.

Region V łańcucha lekkiego o zmienionym kształcie

Uliniowienie aminokwasów regionu V łańcucha lekkiego o zmienionym kształcie przedstawiono na fig. 1. Wybrany zrąb akceptorowy (Kabid 005036) jest z tej samej ludzkiej podgrupy, co ta, która odpowiada mysiemu regionowi V, nie zawiera nietypowych reszt zrębowych, a CDR należą do tych samych kanonicznych grup strukturalnych Chothia. Pojedyncza mutacja wsteczna (12V) została podyktowana jako reszta należąca do kanonicznej klasyfikacji. Wersja 1 VL o zmienionym kształcie jest w pełni zarodkowa.

Region V łańcucha ciężkiego o zmienionym kształcie

Uliniowienie aminokwasów regionu V łańcucha ciężkiego o zmienionym kształcie przedstawiono na fig. 2. Wybrany zrąb akceptorowy (Kabid 000333) jest z tej samej ludzkiej podgrupy, co ta, która odpowiada mysiemu regionowi V, nie zawiera nietypowych reszt zrębowych, a CDR należą do tych samych kanonicznych grup strukturalnych Chothia. Modelowanie strukturalne mysiego łańcucha VH, w połączeniu z uliniowieniem aminokwasów Kabid 000333 z mysią sekwencją podyktowało 9 mutacji wstecznych w wersji 1 (v1) łańcucha ciężkiego o zmienionym kształcie: L2V, V24F, G27F, I29L, I48L, G49A, V67L, V71K i F78V (numeracja Kabata). Mutacje wsteczne wyróżniono gwiazdkami w porównaniu sekwencji aminokwasów przedstawionym na fig. 2.

Z tych 9 mutacji wstecznych, 4 zostały podyktowane przez model ze względu na to, że reszty są resztami kanonicznymi (V24F, G27F, I29L i V71K, wskazane przez wypełnione ramki), tj. resztami zrębowymi, które mogą wpływać na wiązanie antygenu przez bliskość względem reszt CDR. Brak było mutacji wstecznych w następnej najistotniejszej klasie reszt, reszt połączenia uczestniczących w oddziaływaniach upakowania VH-VL (wskazane przez puste ramki). Wszystkie pozostałe 5 reszt do mutacji wstecznej (L2V, I48L, G49A, V67L, F78V, numeracja Kabata) należało do klasy wernierowej (pośredni wpływ na konformację CDR, gęsto zakropkowane ramki na fig. 2).

PL 215 258 B1

Wersję 2 zaprojektowano tak, by zachowała najniższą liczbę mysich reszt poza CDR. Mutacja wsteczna L2V wprowadza zmianę niezarodkową (przy stosowaniu VH4-61 jako odnośnika zarodkowego) i ta mutacja wsteczna jest wykluczona w wersji 2 łańcucha ciężkiego w celu przywrócenia linii zarodkowej. Pozostałe 4 mutacje wsteczne klasy wernierowej także przywrócono w wersji 2 łańcucha ciężkiego (I48L, G49A, V67L, F78V). Zatem wersja 2 zawiera całkowitą liczbę 5 mysich reszt poza CDR (1 w VL i 4 w VH). Wersję 3 zaprojektowano z zachowaniem 2 z 5 reszt wernierowych (I48L i F78V), który to model wskazuje istotniejsze reszty wernierowe. Zatem wersja 3 zawiera całkowitą liczbę 7 mysich reszt poza CDR.

Podsumowanie zmian wprowadzonych w wersjach 1, 2 i 3 humanizowanego 12B4 przedstawiono w tabeli 8.

T a b e l a 8

Podsumowanie zmian wprowadzonych w humanizowanym 12B4v1

Zmiany	VL (111 reszt)	VH (123 reszty)
Hu Mu: zrąb	1/111	9/123
CDR1	8/16	7/7
CDR2	3/7	8/16
CDR3	6/8	10/13
Całościowo Hu Mu	18/111 (16%)	34/123 (28%, V2 = 23%)
Mu Hu: zrąb	10/111	16/123
Uwagi odnośnie mutacji wstecznych	1. I2V: pozycja kanoniczna	2. Kanoniczne: V24F, G27F, I29L i V71K 3. Upakowanie: żadna 4. Wernierowe: L2V, I48L#; G49A, V67L, F78V*#
Uwagi odnośnie akceptora	5. KABlD 005036/nr Genbank akceptora x67904 6. CDR z tej samej kanonicznej grupy strukturalnej co donorowe mysie 7. przeciw-kardiolipina/ss DNA autoprzeciwciała od pacjenta SLE;	8. KABID 000333/nr Genbank akceptora x54437 9. CDR z tej samej kanonicznej grupy strukturalnej co donorowe mysie 10. reumatoidalny czynnik mAb od pacjenta RA

* wykluczone w v2 i v3;

# wykluczone w v2, zachowane w v3

W tabelach 9 i 10 podano klucze numerowania Kabata odpowiednio dla różnych lekkich i ciężkich łańcuchów.

T a b e l a 9

Klucz do numeracji Kabata dla łańcucha lekkiego

Nr KAB	Nr	Typ	Mysi VL 12B4	Ludzki VL 12B4	KABlD 005036	Linia zarodkowa A19	Uwagi
1	2	3	4	5	6	7	8
1	1	FR1	D	D	D	D
2	2		V	V	I	I	Kanoniczny - mutacja wsteczna w v1, v2 i v3
3	3		L	V	V	V
4	4		M	M	M	M
5	5		T	T	T	T
6	6		Q	Q	Q	Q
7	7		T	S	S	S
8	8		P	P	P	P
9	9		L	L	L	L

PL 215 258 B1 cd. tabeli 9

1	2	3	4	5	6	7	8
10	10		S	S	S	S
11	11		L	L	L	L
12	12		P	P	P	P
13	13		V	V	V	V
14	14		S	T	T	T
15	15		L	P	P	P
16	16		G	G	G	G
17	17		D	E	E	E
18	18		Q	P	P	P
19	19		A	A	A	A
20	20		S	S	S	S
21	21		I	I	I	I
22	22		S	S	S	S
23	23		C	C	C	C
24	24	CDR1	R	R	R	R
25	25		S	S	S	S
26	26		S	S	S	S
27	27		Q	Q	Q	Q
27A	28		N	N	S	S
27B	29		I	I	L	L
27C	30		V	V	L	L
27D	31		H	H	H	H
27E	32		S	S	R	S
28	33		N	N	Y	N
29	34		G	G	G	G
30	35		N	N	Y	Y
31	36		T	T	N	N
32	37		Y	Y	Y	Y
33	38		L	L	L	L
34	39		E	E	D	D
35	40	FR2	W	W	W	W
36	41		Y	Y	Y	Y
37	42		L	L	L	L
38	43		Q	Q	Q	Q
39	44		K	K	K	K
40	45		P	P	P	P
41	46		G	G	G	G
42	47		Q	Q	Q	Q

PL 215 258 B1 cd. tabeli 9

1	2	3	4	5	6	7	8
43	48		S	S	S	S
44	49		P	P	P	P
45	50		K	Q	Q	Q
46	51		L	L	L	L
47	52		L	L	L	L
48	53		I	I	I	I
49	54		Y	Y	Y	Y
50	55	CDR2	K	K	L	L
51	56		V	V	G	G
52	57		S	S	S	S
53	58		N	N	N	N
54	59		R	R	R	R
55	60		F	F	A	A
56	61		S	S	S	S
57	62	FR3	G	G	G	G
58	63		V	V	V	V
59	64		P	P	P	P
60	65		D	D	D	D
61	66		R	R	R	R
62	67		F	F	F	F
63	68		S	S	S	S
64	69		G	G	G	G
65	70		S	S	S	S
66	71		G	G	G	G
67	72		S	S	S	S
68	73		G	G	G	G
69	74		T	T	T	T
70	75		D	D	D	D
71	76		F	F	F	F
72	77		T	T	T	T
73	78		L	L	L	L
74	79		K	K	K	K
75	80		I	I	I	I
76	81		S	S	S	S
77	82		R	R	R	R
78	83		V	V	V	V
79	84		E	E	E	E
80	85		A	A	A	A

PL 215 258 B1 cd. tabeli 9

1	2	3	4	5	6	7	8
81	86		E	E	E	E
82	87		D	D	D	D
83	88		L	V	V	V
84	89		G	G	G	G
85	90		V	V	V	V
86	91		Y	Y	Y	Y
87	92		Y	Y	Y	Y
88	93		C	C	C	C
89	94	CDR3	F	F	M	M
90	95		Q	Q	Q	Q
91	96		G	G	A	A
92	97		S	S	L	L
93	98		H	H	Q	Q
94	99		V	V	T	T
95	100		P	P	P	P
96	101		L	L	Y
97	102		T	T	T
98	103	FR4	F	F	F
99	104		G	G	G
100	105		A	Q	Q
101	106		G	G	G
102	107		T	T	T
103	108		K	K	K
104	109		L	L	L
105	110		E	E	E
106	111		L	I	I
106A	112		K	K	K

T a b e l a 10

Klucz do numeracji Kabata dla ciężkiego łańcucha

Nr KAB	Nr	Typ	Mysi VH 12B4	Ludzki VH 12B4	KABID 000333	Linia zarodkowa VH4-39	Linia zarodkowa VH4-61	Uwagi
1	2	3	4	5	6	7	8	9
1	1	FR1	Q	Q	Q	Q	Q
2	2		V	V	L	L	V	Wernierowa - mutacja wsteczna tylko w v1
3	3		T	Q	Q	Q	Q
4	4		L	L	L	L	L
5	5		K	Q	Q	Q	Q
6	6		E	E	E	E	E

PL 215 258 B1 cd. tabeli 10

1	2	3	4	5	6	7	8	9
7	7		S	S	S	S	S
8	8		G	G	G	G	G
9	9		P	P	P	P	P
10	10		G	G	G	G	G
11	11		I	L	L	L	L
12	12		L	V	V	V	V
13	13		Q	K	K	K	K
14	14		P	P	P	P	P
15	15		S	S	S	S	S
16	16		Q	E	E	E	E
17	17		T	T	T	T	T
18	18		L	L	L	L	L
19	19		S	S	S	S	S
20	20		L	L	L	L	L
21	21		T	T	T	T	T
22	22		C	C	C	C	C
23	23		S	T	T	T	T
24	24		F	F	V	V	V	Kanoniczna - mutacja wsteczna w v1, v2 i v3
25	25		S	S	S	S	S
26	26		G	G	G	G	G
27	27		F	F	G	G	G	Kanoniczna - mutacja wsteczna w v1, v2 i v3
28	28		S	S	S	S	S
29	29		L	L	I	I	V	Kanoniczna - mutacja wsteczna w v1, v2 i v3
30	30		S	S	S	S	S
31	31	CDR1	T	T	R	S	S
32	32		N	N	G	S	G
33	33		G	G	S	S	G
34	34		M	M	H	Y	Y
35	35		G	G	Y	Y	Y
35A	36		V	V	W	W	W
35B	37		S	S	G	G	S
36	38	FR2	W	W	W	W	W
37	39		I	I	I	I	I
38	40		R	R	R	R	R
39	41		Q	Q	Q	Q	Q
40	42		P	P	P	P	P

PL 215 258 B1 cd. tabeli 10

1	2	3	4	5	6	7	8	9
41	43		S	P	P	P	P
42	44		G	G	G	G	G
43	45		K	K	K	K	K
44	46		G	G	G	G	G
45	47		L	L	L	L	L
46	48		E	E	E	E	E
47	49		W	W	W	W	W
48	50		L	L	I	I	I	Wernierowa - mutacja wsteczna tylko w v1 i v3
49	51		A	A	G	G	G	Wernierowa - mutacja wsteczna tylko w v1
50	52	CDR2	H	H	S	S	Y
51	53		I	I	I	I	I
52	54		Y	Y	Y	Y	Y
53	55		W	W	Y	Y	Y
54	56		D	D	S	S	S
55	57		E	E	G	G	G
56	58		D	D	N	S	S
57	59		K	K	T	T	T
58	60		R	R	Y	Y	N
59	61		Y	Y	F	Y	Y
60	62		N	N	N	N	N
61	63		P	P	P	P	P
62	64		S	S	S	S	S
63	65		L	L	L	L	L
64	66		K	K	K	K	K
65	67		S	S	S	S	S
66	68	FR3	R	R	R	R	R
67	69		L	L	V	V	V	Wernierowa - mutacja wsteczna tylko w v1
68	70		T	T	T	T	T
69	71		I	I	I	I	I
70	72		S	S	S	S	S
71	73		K	K	V	V	V	Kanoniczna - mutacja wsteczna w v1, v2 i v3
72	74		D	D	D	D	D
73	75		T	T	T	T	T
74	76		S	S	S	S	S
75	77		N	K	K	K	K

PL 215 258 B1 cd. tabeli 10

1	2	3	4	5	6	7	8	9
76	78		N	N	N	N	N
77	79		Q	Q	Q	Q	Q
78	80		V	V	F	F	F	Wernierowa - mutacja wsteczna w v1 i v3
79	81		F	S	S	S	S
80	82		L	L	L	L	L
81	83		K	K	K	K	K
82	84		I	L	L	L	L
82A	85		T	S	S	S	S
82B	86		N	S	S	S	S
82C	87		V	V	V	V	V
83	88		D	T	T	T	T
84	89		T	A	A	A	A
85	90		A	A	A	A	A
86	91		D	D	D	D	D
87	92		T	T	T	T	T
88	93		A	A	A	A	A
89	94		T	V	V	V	V
90	95		Y	Y	Y	Y	Y
91	96		Y	Y	Y	Y	Y
92	96		C	C	C	C	C
93	97		A	A	A	A	A
94	98		R	R	R	R	R
95	99	CDR3	R	R	L
95A	100		-	-	G
96	101		R	R	P
97	102		I	I	D
98	103		I	I	D
99	104		Y	Y	Y
100	105		D	D	T
100A	106		V	V	L
100B	107		E	E	D
100C	108		D	D	G
100D	109		Y	Y	-
100E	110		F	F	M
101	111		D	D	D
102	112		Y	Y	V
103	113	FR4	W	W	W

PL 215 258 B1 cd. tabeli 10

1	2	3	4	5	6	7	8	9
104	114		G	G	G
105	115		Q	Q	Q
106	116		G	G	G
107	117		T	T	T
108	118		T	T	T
109	119		L	V	V
110	120		T	T	T
111	121		V	V	V
112	122		S	S	S
113	123		S	S	S

Humanizowane przeciwciała korzystnie wykazują specyficzne powinowactwo wiązania względem Αβ, wynoszące co najmniej 10⁷, 10⁸, 10⁹ lub 10¹⁰ M^-1. Zazwyczaj górna granica powinowactwa wiązania humanizowanych przeciwciał dla Αβ mieści się w granicach trzy-, cztero- lub pięciokrotnej

-1 wartości dla 12B4 (czyli ~10⁹ M^-1). Często dolna granica powinowactwa wiązania również mieści się w granicach trzy-, cztero- lub pięciokrotnej wartości dla 12B4.

Składanie i ekspresja humanizowanego VH i VL 12B4, wersja 1. Fig. 9a schematycznie przedstawia strategię składania humanizowanego VL.v1 metodą PCR. Fig. 9b schematycznie przedstawia strategię składania humanizowanego VH.v1 metodą PCR. Tabela 11 przedstawia startery zastosowane do składania 2B4v1 metodą PCR.

PL 215 258 B1

T a b e l a

PL 215 258 B1

Syntetyczne fragmenty VHv1A + VHv11B i VHv1C + VHv1D w równomolowych stosunkach zhybrydyzowano jako pary w osobnych probówkach reakcyjnych stosując znane procedury. Reakcję hybrydyzacji A + B złożono metodą PCR ze starterami A + B for i A + B back z hybrydyzacją w 60°C, 25 cykli (for = do przodu i back = do tyłu, inaczej, rev lub odwrotny). Podobnie złożono reakcję hybryPL 215 258 B1 dyzacji C + D stosując startery PCR C + D for i C + D back w identycznych warunkach. Złożoną metodą PCR 5'połówkę A + B i 3' połówkę C + D oczyszczono w żelu do końcowego złożenia metodą PCR. Złożenie pełnego regionu V przeprowadzono przez zmieszanie złożonej 5'połówki A + B z 3'połówki C + D regionu V, hybrydyzację i wydłużanie metodą PCR z zastosowaniem startera VHv1 A + B for i startera VHv1 C + D back. Pełnej długości regiony VH i VL złożone w ten sposób oczyszczono w żelu i wklonowano do pCRScript w celu potwierdzenia sekwencji DNA.

Sekwencje nukleotydów humanizowanego 12B4VL (wersja 1) (SEQ ID NO: 5) i 12B4VH (wersja 1) (SEQ ID NO: 7) wymieniono powyżej w tabelach, odpowiednio 12 i 13.

T a b e l a 12

Sekwencja nukleotydów humanizowanego 12B4VLv1 ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGG GGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCT CCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAACATTGTTCATAGTAATGGAAACACCTATTTGGAA TGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCG ATTTTCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGA AAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACAT GTTCCGCTCACGTTCGGTCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAC

T a b e l a 13

Sekwencja nukleotydów humanizowanego 12B4VHv1 ATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCA GGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCA CCTGCACTTTCTCTGGTTTTTCCCTGAGCACTAATGGTATGGGTGTGAGCTGGATCCGG CAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGCTGGCACACATCTATTGGGATGAGGACAAGCG CTATAACCCATCCCTCAAGAGTCGACTCACCATATCAAAGGACACGTCCAAGAACCAGG TATCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGA AGGAGGATCATCTATGATGTTGAGGACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGT CACCGTCTCCTCAG

B. Humanizowane przeciwciało 12B4 wersja 2

Drugą wersję humanizowanego przeciwciała 12B4 wytworzono z każdym z podstawień zawartych w wersji 1, za wyjątkiem podstawienia L V w pozycji 2, podstawienia I L w pozycji 48, podstawienia G A w pozycji 49, podstawienia V L w pozycji 67 i podstawienia F V w pozycji 78. Sekwencje nukleotydów łańcuchów lekkiego i ciężkiego humanizowanego 3D6 wersji 2 przedstawiono jako odpowiednio SEQ ID NO: 9 i 11. Sekwencje nukleotydów łańcuchów lekkiego i ciężkiego humanizowanego 12B4 wersji 2 przedstawiono jako odpowiednio SEQ ID NO: 5 i 9. Sekwencje aminokwasów łańcuchów lekkiego i ciężkiego humanizowanego 12B4 wersji 2 przedstawiono jako odpowiednio SEQ ID NO: 6 i 10.

C. Humanizowane przeciwciało 12B4 wersja 3

Trzecią wersję humanizowanego przeciwciała 12B4 wytworzono z każdym z podstawień zawartych w wersji 1, za wyjątkiem podstawienia L V w pozycji 2, podstawienia G A w pozycji 49 i podstawienia V L w pozycji 67. Sekwencje nukleotydów łańcuchów lekkiego i ciężkiego humanizowanego 3D6 wersji 2 przedstawiono jako odpowiednio SEQ ID NO: 1 i 9. Sekwencje nukleotydów łańcuchów lekkiego i ciężkiego humanizowanego 12B4 wersji 3 przedstawiono jako odpowiednio SEQ ID NO: 5 i 11. Sekwencje aminokwasów łańcuchów lekkiego i ciężkiego humanizowanego 12B4 wersji 3 przedstawiono jako odpowiednio SEQ ID NO: 6 i 12.

P r z y k ł a d VI. Profilaktyka i leczenie ludzi

Jednodawkową próbę fazy I przeprowadza się w celu ustalenia bezpieczeństwa dla ludzi. Środek terapeutyczny podawano we wzrastających dawkach różnym pacjentom, wychodząc z około 0,01 przypuszczalnego poziomu skuteczności i zwiększając dawkę trzykrotnie aż do osiągnięcia poziomu odpowiadającego około 10-krotnej skutecznej dawki dla myszy.

Próbę fazy II przeprowadza się w celu ustalenia skuteczności terapeutycznej. Wybiera się pacjentów z wczesnym do średniego stadium choroby Alzheimera, określoną z wykorzystaniem kryte52

PL 215 258 B1 riów Stowarzyszenia choroby Alzheimera i pokrewnych zaburzeń (ADRDA) dla prawdopodobnej AD. Odpowiednich pacjentów ocenia się w skali 12-26 w teście Mini-Mental State Exam (MMSE). Do innych kryteriów należy warunek prawdopodobieństwa przeżycia przez pacjentów okresu badań i brak komplikujących sytuacji, takich jak równoczesne stosowanie innych leków mogących spowodować zakłócenia. Wyjściową ocenę stanu pacjentów wykonuje się z użyciem klasycznych środków psychometrycznych, takich jak MMSE i ADAS, będącą wszechstronną skalą oceny stanu i działania pacjentów z chorobą Alzheimera. Te skale psychometryczne umożliwiają określenie postępu w stanie choroby Alzheimera. Odpowiednie skale jakości życia można również zastosować do monitorowania leczenia. Postęp choroby można również monitorować techniką MRI. Można także monitorować profile krwi u pacjentów w próbach obejmujących specyficzne dla immunogenu przeciwciała i odpowiedzi komórek T.

Po pomiarach podstawowych pacjenci rozpoczynają leczenie. Losowo dzieli się ich na grupy i podaje środek terapeutyczny lub placebo, w trybie ślepym. Pacjentów monitoruje się co najmniej co 6 miesięcy. Skuteczność ustala się w oparciu o znaczące zmniejszenie postępu w grupie leczonej w porównaniu z grupą placebo.

Drugą próbę fazy II przeprowadza się, aby ocenić przejście pacjentów z fazy wczesnej utraty pamięci, nie będącej chorobą Alzheimera, czasami określanej jako osłabienie pamięci związane z wiekiem (AAMI) lub łagodne osłabienie funkcji poznawczych (MCI), do prawdopodobnej choroby Alzheimera, zdefiniowanej kryteriami ADRDA. Pacjentów z wysokim ryzykiem przejścia do choroby Alzheimera wybiera się z nie klinicznej populacji drogą selekcji stosownych populacji pod względem wczesnych objawów utraty pamięci lub innych trudności związanych z objawami pre-alzheimerowskimi, rodzinnej historii choroby Alzheimera, genetycznych czynników ryzyka, wieku, płci i innych cech przydatnych przy ustalaniu wysokiego ryzyka choroby Alzheimera. Zbiera się oceny wyjściowe z odpowiednich pomiarów, obejmujących MMSE i ADAS, wraz z innymi pomiarami zaprojektowanymi do oceny bardziej normalnej populacji. Te populacje pacjentów dzieli się na odpowiednie grupy z placebo do porównywania z grupami z wariantowym podawaniem środka. Te populacje pacjentów bada się co około 6 miesięcy i efektem dla każdego pacjenta jest to czy nastąpiło u niego lub niej przejście do prawdopodobnej choroby Alzheimera, ustalone w oparciu o kryteria ADRDA, pod koniec obserwacji.

Choć powyższy wynalazek opisano szczegółowo dla ułatwienia jego zrozumienia, oczywiste jest, że można dokonać pewnych modyfikacji w ramach zakresu załączonych zastrzeżeń. Wszystkie cytowane publikacje i dokumenty patentowe, a także cały tekst pojawiający się na figurach i w wykazie sekwencji, wprowadza się w całości jako odnośniki do wszystkich zastosowań i w takim stopniu, jakby każda z tych pozycji była indywidualnie wskazana.

Na podstawie powyższego opisu oczywiste jest, że wynalazek dostarcza szereg zastosowań. Przykładowo wynalazek dostarcza zastosowanie dowolnego z przeciwciał dla Αβ, opisanych powyżej, w leczeniu, profilaktyce lub diagnostyce choroby amyloidogennej albo do wytwarzania leku lub środka diagnostycznego do takich zastosowań.

PL 215 258 B1

WYKAZ SEKWENCJI <110> Elan Pharma International Limited i Wyeth LLC <120> Humanizowane przeciwciało 12B4, sposób jego wytwarzania, środek farmaceutyczny je zawierający i jego zastosowanie, kwas nukleinowy, zawierające go wektory i zawierająca te wektory komórka gospodarz oraz chimeryczne przeciwciało 12B4 <130> ELN-004PC <150> US 60/363,751 <151> 2002-03-12 <160> 38 <170> FastSEQ dla Windows wersja 4.0 <210> 1 <211> 393 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> sig_peptide <222> (1) . . (57) <220>

<221> CDS <222> (1)...(393) <400> 1

atg Met

aag Lys

ttg Leu

cct Pro

gtt val -15

agg Arg

ctg Leu

ttg Leu

gtg Val

ctg Leu -10

atg Met

ttc Phe

tgg Trp

att Ile

cct Pro -5

gct Ala

48

tcc

agc

agt

gat

gtt

ttg

atg

acc

caa

act

cca

ctc

tcc

ctg

cct

gtc

96

Ser

Asp 1

Val

Leu

Met

Thr 5

Gln

Thr

Pro

Leu

Ser 10

Leu

Pro

Val

agt

ctt

gga

gat

caa

gcc

tcc

atc

tct

tgc

aga

tct

agt

cag

aac

att

144

Ser

Leu 15

Gly

Asp

Gln

Ala

Ser 20

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser 25

Ser

Gln

Asn

Ile

gtt

cat

agt

aat

gga

aac

acc

tat

tta

gaa

tgg

tac

ctg

cag

aaa

cca

192

Val 30

His

Ser

Asn

Gly

Asn 35

Thr

Tyr

Leu

Glu

Trp 40

Tyr

Leu

Gln

Lys

Pro 45

ggc

cag

tct

cca

aag

ctc

ctg

atc

tac

aaa

gtt

tcc

aac

ega

ttt

tct

240

Gly

Gln

Ser

Pro

Lys 50

Leu

Ile

Tyr

Lys 55

Val

Ser

Asn

Arg

Phe 60

Ser

ggg

gtc

cca

gac

agg

ttc

agt

ggc

agt

gga

tca

ggg

aca

gat

ttc

aca

288

Gly

Val

Pro

Asp 65

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 70

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 75

Phe

Thr

ctc

aag

atc

agc

aga

gtg

gag

gct

gag

gat

ctg

gga

gtt

tat

tac

tgc

336

Leu

Lys

Ile 80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala 85

Glu

Asp

Leu

Gly

Val 90

Tyr

Cys

ttt

ca a

ggt

tca

cat

gtt

ccg

ctc

acg

ttc

ggt

gct

ggg

acc

aag

ctg

384

Phe

Gln 95

Gly

Ser

His

Val

Pro 100

Leu

Thr

Phe

Gly

Ala 105

Gly

Thr

Lys

Leu

PL 215 258 B1 gag ctg aaa 393

Glu Leu Lys 110 <210> 2 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus <220>

<221> SIGNAL <222> (1)... ¢19) <400> 2

Met

Lys

Leu

Pro

Val -15

Arg

Leu

Val

Leu -10

Met

Phe

Trp

Ile

Pro -5

Ala

Ser

Asp

Val

Leu

Met

Thr

Gin

Thr

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

Val

1

5

10

Ser

Leu

Gly

Asp

Gin

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Gin

Asn

Ile

15

20

25

Val

His

Ser

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

Glu

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

30

35

40

45

Gly

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Ile

Tyr

Lys

val

Ser

Asn

Arg

Phe

Ser

50

55

60

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

65

70

75

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gly

Val

Tyr

Cys

80

85

90

Phe

Gin

Gly

Ser

His

val

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

95

100

105

Glu

Leu

Lys

110

<210> 3 <211> 426 <212> DNA <213> Mus musculus

<220> <221> CDS

<222> (1) . . .

(426)

<220>

<22l> sig_jpeptide

<222> (1)...

(57)

<400> 3 atg gac agg

ctt

act

tcc

tca

ttc

ctg

att

gtc

cct

gca

tat

48

Met Asp Arg

Leu

Thr

Ser

Phe

Leu

Ile

Val

Pro

Ala

Tyr

-15

-10

-5

gtc ctg tcc

cag

gtt

act

ctg

aaa

gag

tct

ggc

cct

ggg

ata

ttg

cag

96

Val Leu Ser

Gin

Val

Thr

Leu

Lys

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Ile

Leu

Gin

1

5

10

ccc tcc cag

acc

ctc

agt

ctg

act

tgt

tct

ttc

tct

ggg

ttt

tca

ctg

144

Pro Ser Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

15

20

25

PL 215 258 B1

agc Ser 30

act Thr

aat Asn

ggt Gly

atg Met

ggt Gly 35

gtg val

agc Ser

tgg Trp

att Ile

cgt Arg 40

cag Gln

cct Pro

tea Ser

gga Gly

aag Lys 45

192

ggt

ctg

gag

tgg

ctg

gca

cac

att

tac

tgg

gat

gag

gac

aag

ege

tat

240

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

His

Ile

Tyr

Trp

Asp

Glu

Asp

Lys

Arg

Tyr

50

55

60

aac

cca

tcc

ctg

aag

agc

cgg

ctc

aca

atc

tcc

aag

gat

acc

tct

aac

288

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Asn

65

70

75

aat

cag

gta

ttc

ctc

aag

atc

acc

aat

gtg

gac

act

gct

gat

act

gee

336

Asn

Gln

Val

Phe

Leu

Lys

Ile

Thr

Asn

Val

Asp

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

BO

65

90

aca

tac

tgt

gct

ega

agg

atc

tat

gat

gtt

gag

gac

tac

384

Thr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ile

Tyr

Asp

Val

Glu

Asp

Tyr

95

100

105

ttt

gac

tac

tgg

ggc

caa

ggc

acc

act

ctc

aca

gtc

tcc

tea

426

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Thr

Yal

Ser

110

115

120

<210> 4

<211> 142

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> SIGNAL

<222> (1)...

(19)

<400> 4

Met Asp

Arg

Leu

Thr

Ser

Phe

Leu

Ile

Val

Pro

Ala

Tyr

-15

-10

-5

Val Leu

Ser

Gln

Val

Thr

Leu

Lys

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Ile

Leu

Gln

1

5

10

Pro Ser

Gln

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

15

20

25

Ser Thr

Asn

Gly

Met

Gly

Val

Ser

Trp

Ile

Arg

Gln

Pro

Ser

Gly

Lys

30

35

40

45

Gly Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

His

Ile

Tyr

Trp

Asp

Glu

Asp

Lys

Arg

Tyr

50

55

60

Asn Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Asn

65

70

75

Asn Gln

Val

Phe

Leu

Lys

Ile

Thr

Asn

Val

Asp

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

80

85

90

Thr Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ile

Tyr

Asp

Val

Glu

Asp

Tyr

95

100

105

Phe Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

Thr

Yal

Ser

110 115 120 <210> 5 <211> 396 <212> DNA

PL 215 258 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> humanizowane 12B4VLvl <220>

<221> CDS <222> (1)...(396) <220>

<221> sig_peptide <222> (1)...(60) <400> 5

atg Met -20

agg Arg

ctc Leu

cct Pro

gct Ala

cag Gin -15

ctc Leu

ctg Leu

ggg Gly

ctg Leu

eta Leu -10

atg Met

ctc Leu

tgg Trp

gtc Val

tct Ser -5

48

gga

tcc

agt

999

gat

gtt

gtg

atg

act

cag

tct

cca

ctc

tcc

ctg

ccc

96

Gly

Ser

Gly

Asp

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

1

5

10

gtc

acc

cct

gga

gag

ccg

gcc

tcc

atc

tcc

tgc

agg

tct

agt

cag

aac

144

Val

Thr

Pro

Gly

Glu

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Gin

Asn

15

20

25

att

gtt

cat

agt

aat

gga

aac

acc

tat

ttg

gaa

tgg

tac

ctg

cag

aag

192

Ile

Val

His

Ser

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

Glu

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

30

35

40

cca

939

cag

tct

cca

cag

ctc

ctg

atc

tac

aaa

gtt

tcc

aac

ega

ttt

240

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Gin

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

45

50

55

60

tct

999

gtc

cct

gac

agg

ttc

agt

ggc

agt

gga

tca

ggc

aca

gat

ttt

288

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

aca

ctg

aaa

atc

agc

aga

gtg

gag

gct

gag

gat

gtt

ggg

gtt

tat

tac

336

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

80

85

90

tgc

ttt

caa

ggt

tca

cat

gtt

ccg

ctc

acg

ttc

ggt

cag

ggg

acc

aag

384

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

His

Val

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

95

100

105

ctg

gag

atc

aaa

396

Leu

Glu

Ile

Lys

110

<210>	6
<211>	132
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<221>	SIGNAL
<222>	(1) . . . (20)
<400>	6

PL 215 258 B1

Met -20

Arg Leu

Pro

Ala

Gin -15

Leu

Leu Gly Leu

Leu -10

Met

Leu

Trp

Val

Ser -5

Gly

Ser

Gly

Asp

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

1

5

10

Val

Thr

Pro

Gly

Glu

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Gin

Asn

15

20

25

Ile

Val

His

Ser

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

Glu

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

30

35

40

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Gin

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

45

50

55

60

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

80

85

90

Cys

Phe

Gin

Gly

Ser

His

Val

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

95

100

105

Leu

Glu

Ile

Lys

110

<210> 7 <211> 426 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> humanizowane 12B4VHvl <220>

<221> CDS <222> (1)...(426) <221> sig_jpeptide <222> (1)...(57) <400> 7

atg Met

a ag Lys

cac His

ctg Leu

tgg Trp -15

ttc Phe

ctc Leu

ctg Leu

ctg Leu -10

gtg gca

gct Ala

ccc Pro

aga Arg -5

tgg Trp

48

Val

Ala

gtc

ctg

tcc

cag

gtg

cag

ctg

cag

gag

tcg

ggc

cca

gga

ctg

gtg

aag

96

Val

Leu

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

1

5

10

cct

tcg

gag

acc

ctg

tcc

ctc

acc

tgc

act

ttc

tct

ggt

ttt

tcc

ctg

144

Pro

Ser

Glu

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

15

20

25

agc

act

aat

ggt

atg

ggt

gtg

agc

tgg

atc

cgg

cag

ccc

cca

ggg

aag

192

Ser

Thr

Asn

Gly

Met

Gly

Val

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Gly

bys

30

35

40

45

gga Gly

ctg Leu

gag Glu

tgg Trp

ctg Leu 50

gca Ala

cac His

atc Ile

tat Tyi

tgg Trp 55

gat Asp

gag Glu

gac Asp

aag Lys

ege Arg 60

tat Tyr

240

aac

cca

tcc

ctc

aag

agt

ega

ctc

acc

ata

tea

aag

gac

acg

tcc

aag

288

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

65

70

75

PL 215 258 B1

aac

cag

gta

tcc

ctg

aag

ctg

agc

tct

gtg

acc

gct

gca

gac

acg

gcc

336

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Val

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

80

85

90

gtg

tat

tac

tgt

gcg

aga

agg

atc

tat

gat

gtt

gag

gac

tac

384

Val

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ile

Tyr

Asp

Val

Glu

Asp

Tyr

95

100

105

ttt

gac

tac

tgg

ggc

caa

ggg

acc

acg

gtc

acc

gtc

tcc

tca

426

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

<210> 8 <2Ι1> 142 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<221> SIGNAL <222> (1) . . .(19) <400> 8

Met

Lys

His

Leu

Trp

Phe

Leu

Val

Ala

Pro

Arg

Trp

-15

-10

-5

Val

Leu

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

1

5

10

Pro

Ser

Glu

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

15

20

25

Ser

Thr

Asn

Gly

Met

Gly

Val

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

30

35

40

45

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

His

Ile

Tyr

Trp

Asp

Glu

Asp

Lys

Arg

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

65

70

75

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Val

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

80

85

90

Val

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ile

Tyr

Asp

Val

Glu

Asp

Tyr

95

100

105

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

val

Thr

val

Ser

110

115

120

<210> 9 <211> 426 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<221> CDS <222> (1)...(426) <223> humanizowane 12B4VLv2 <220>

<22l> sig_peptide <222> (1). . . (57)

PL 215 258 B1 <400> 9 atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

-15 -10 -5 gtc ctg tcc cag ctg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag 96

Val Leu Ser Gin Leu Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys

10 cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act ttc tct ggt ttt tcc ctg 144

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu

20 25 agc act aat ggt atg ggt gtg agc tgg atc cgg cag ccc cca ggg aag 192

Ser Thr Asn Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys

35 40 45 gga ctg gag tgg att ggg cac atc tat tgg gat gag gac aag cgc tat 240

Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr

55 60 aac cca tcc ctc aag agt ega gtc acc ata tea aag gac acg tcc aag 288

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys

70 75 aac cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gct gca gac acg gee Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala

85 90

gtg Val

tat Tyr 95

tac Tyr

tgt Cys

gcg Ala

aga Arg

agg Arg 100

agg Arg

atc Ile

tat Tyr

gat Asp 105

gtt Val

gag Glu

gac Asp

tac Tyr

ttt

gac

tac

tgg

ggc

caa

ggg

acc

acg

gtc

acc

gtc

tcc

tea

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Yal

Thr

Yal

Ser

110

115

120

<210> 10 <211> 142 <212> PRT <213> Sekwencja

sztuczna

<220>

<221> SIGNAL

<222> (1) . . .

(19)

<400> 10

Met Lys His

Leu

Trp

Phe

Leu

Val

Ala

Pro

Arg

Trp

-15

-10

-5

Val Leu Ser

Gin

Leu

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

1

5

10

Pro Ser Glu

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

15

20

25

Ser Thr Asn

Gly

Met

Gly

Val

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

θίγ

Lys

30

35

40

45

Gly Leu Glu

Trp

Ile

Gly

His

Ile

Tyr

Trp

Asp

Glu

Asp

Lys

Arg

Tyr

50

55

60

Asn Pro Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Yal

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

65

70

75

PL 215 258 B1

Asn

Gln

Phe 80

Ser

Leu Lys

Leu Ser 85

Ser

Val

Thr Ala Ala Asp Thr 90

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ile

Tyr

Asp

Val

Glu

Asp

Tyr

95

100

105

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

<210> 11 <211> 426 <212> DNA <213> Sekwencja	sztuczna
<220>
<223> humanizowane 12B4VHv2
<220>
<221> CDS
<222> (1) . . .(426)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)...(57)
<400> 11
atg aag cac ctg	tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg
Met Lys His Leu	Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
	-15 -10 -5
gtc ctg tcc cag	ctg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag
Val Leu Ser Gln	Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
1	5 10
cct tcg gag acc	ctg tcc ctc acc tgc act ttc tct ggt ttt tcc ctg
Pro Ser Glu Thr	Leu Ser Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
15	20 25
agc act aat ggt	atg ggt gtg agc tgg atc cgg cag ccc cca ggg aag
Ser Thr Asn Gly	Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
30	35 40 45
gga ctg gag tgg	ctg ggg cac atc tat tgg gat gag gac aag cgc tat
Gly Leu Glu Trp	Leu Gly His Ile Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr
	50 55 60
aac cca tcc ctc	aag agt ega gtc acc ata tca aag gac acg tcc aag
Asn Pro Ser Leu	Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
65	70 75
aac cag gta tcc	ctg aag ctg agc tct gtg acc gct gca gac acg gcc
Asn Gln Val Ser	Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
80	85 90
gtg tat tac tgt	gcg aga agg agg atc atc tat gat gtt gag gac tac
Val Tyr Tyr Cys	Ala Arg Arg Arg Ile Ile Tyr Asp Val Glu Asp Tyr
95	100 105
ttt gac tac tgg	ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca
Phe Asp Tyr Trp	Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

110 115 120

PL 215 258 B1 <210> 12 <211> 142 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<221> SIGNAL <222> (1)...(19)

Met

Lys

His

Leu

Trp -15

Phe

Leu

Leu -10

Val

Ala

Pro

Arg -5

Trp

Val

Leu

Ser

Gin

Leu

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

1

5

10

Pro

Ser

Glu

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

15

20

25

Ser

Thr

Asn

Gly

Met

Gly

Val

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

30

35

40

45

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Gly

His

Ile

Tyr

Trp

Asp

Glu

Asp

Lys

Arg

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Val

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Lys

65

70

75

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Val

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

80

85

90

Val

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ile

Tyr

Asp

Val

Glu

Asp

Tyr

95

100

105

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

<210> 13 <211> 135 <212> DNA <213 > Sekwencja sztuczna <220>

<223> starter <400> 13 gagattaagc ttgccgccac catgaggctc cctgctcagc tcctggggct gctaatgctc 60 tgggtctctg gatccagtgg ggatgttgtg atgactcagt ctccactctc cctgcccgtc 120 acccctggag agccg ¹³^ <210> 14 <211> 131 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> starter <400> 14 aggagctgtg gagactgccc tggcttctgc aggtaccatt ccaaataggt gtttccatta 60 ctatgaacaa tgttctgact agacctgcag gagatggagg ccggctctcc aggggtgacg 120 ggcagggaga g ^13x <210> 15

PL 215 258 B1 <211> 132 <212 > DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> starter <400> 15 tgcagaagcc agggcagtct ccacagctcc tgatctacaa agtttccaac cgattttctg 60 gggtccctga caggttcagt ggcagtggat caggcacaga ttttacactg aaaatcagca 120 gagtggaggc tg 132 <210> 16 <211> 130 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> starter <400> 16 tgatatggat ccactcacgt ttgatctcca gcttggtccc ctgaccgaac gtgagcggaa 60 catgtgaacc ttgaaagcag taataaaccc caacatcctc agcctccact ctgctgattt 120 tcagtgtaaa 130 <210> 17 <211> 143 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> starter <400> 17 gagataaagc ttgccgccac catgaagcac ctgtggttct tcctcctgct ggtggcagct 60 cccagatggg tcctgtccca ggtgcagctg caggagtcgg gcccaggact ggtgaagcct 120 tcggagaccc tgtccctcac ctg 143 <210> 18 <211> 137 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> starter <400> 18 tcctcatccc aatagatgtg tgccagccac tccagtccct tccctggggg ctgccggatc 60 cagctcacac ccataccatt agtgctcagg gaaaaaccag agaaagtgca ggtgagggac 120 agggtctccg aaggctt 137 <210> 19 <211> 138 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> starter <400> 19 gtggctggca cacatctatt gggatgagga caagcgctat aacccatccc tcaagagtcg 60

PL 215 258 B1 actcaccata tcaaaggaca cgtccaagaa ccaggtatcc ctgaagctga gctctgtgac 120 cgctgcagac acggccgt 138 <210> 20 <211> 139 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> starter <400> 20 tcatatggat ccactcacct gaggagacgg tgaccgtggt cccttggccc cagtagtcaa 60 agtagtcctc aacatcatag atgatcctcc ttctcgcaca gtaatacacg gccgtgtctg 120 cagcggtcac agagctcag 139 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> starter <400> 21 gagattaagc ttgccgccac ca <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223 > starter <400> 22 aggagctgtg gagactgccc t <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> starter <400> 23 tgcagaagcc agggcagtct <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> starter <400> 24 tgatatggat ccactcacgt ttgatctc <210> 25

PL 215 258 B1 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> starter <400> 25 gagataaagc ttgccgccac cat <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220=· <223> starter <400> 26 tcctcatccc aatagatgtg tgcc <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220=· <223> starter <400> 27 gtggctggca cacatctatt gg <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223=· starter <400> 28 tcatatggat ccactcacct gagg <210> 29 <211=· 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)...(360) <220>

<221> sig_peptide <222> (1)...(60) <400> 29 atg agg ctc cct gct cag ctc ctg ggg ctg eta atg ctc tgg gtc tct Met Arg Leu Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser -20 -15 -10 -5

PL 215 258 B1

gga Gly

tcc Ser

agt Ser

ggg Gly

gat Asp 1

att Ile

gtg Val

atg Met

act Thr 5

cag Gln

tct Ser

cca Pro

ctc Leu

tcc Ser 10

ctg Leu

ccc Pro

96

gtc

acc

cct

gga

gag

ccg

gcc

tcc

atc

tcc

tgc

agg

tct

agt

cag

agc

144

Val

Thr

Pro

Gly

Glu

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Gln

Ser

15

20

25

ctc

ctg

cat

agt

aat

gga

tac

aac

tat

ttg

gat

tgg

tac

ctg

cag

aag

192

Leu

His

Ser

Asn

Gly

Tyr

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Leu

Gln

Lys

30

35

40

cca

ggg

cag

tct

cca

cag

ctc

ctg

atc

tat

ttg

ggt

tct

aat

cgg

gcc

240

Pro

Gly

Gln

Ser

Pro

Gln

Leu

Ile

Tyr

Leu

Gly

Ser

Asn

Arg

Ala

45

50

55

60

tcc

ggg

gtc

cct

gac

agg

ttc

agt

ggc

agt

gga

tca

ggc

aca

gat

ttt

288

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

aca

ctg

aaa

atc

agc

aga

gtg

gag

gct

gag

gat

gtt

ggg

gtt

tat

tac

336

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

80

85

90

tgc

atg

caa

gct

eta

caa

act

cct

360

Cys

Met

Gln

Ala

Leu

Gln

Thr

Pro

95

100

<210> 30 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> SIGNAL

<222> (1)...

(20)

<400> 30 Met Arg Leu

Pro

Ala

Gln

Leu

Gly

Leu

Met

Leu

Trp

Val

Ser

-20

-15

-10

-5

Gly Ser Ser

Gly

Asp

Ile

Val

Met

Thr

Gln

Ser

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

1

5

10

Val Thr Pro

Gly

Glu

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Gln

Ser

15

20

25

Leu Leu His

Ser

Asn

Gly

Tyr

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp

Tyr

Leu

Gln

Lys

30

35

40

Pro Gly Gln

Ser

Pro

Gln

Leu

Ile

Tyr

Leu

Gly

Ser

Asn

Arg

Ala

45

50

55

60

Ser Gly Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr Leu Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

85 90

Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro

100 <210> 31 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens

PL 215 258 B1 <220>

<221> CDS <222> (1) . . . (300) <400> 31 gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48

Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

10 15 gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc ctg cat cgt 96

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Arg

25 30 tat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag cca ggg cag tct 144

Tyr Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser

40 45 cca cag ctc ctg atc tat ttg ggt tct aat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa atc 240

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa gct 288

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala

90 95 eta caa act ccg ³⁰⁰

Leu Gin Thr Pro

100 <210> 32 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32

Asp 1	Ile	Val	Met	Thr 5	Gin	Ser	Pro
Glu	Pro	Ala	Ser 20	Ile	Ser	Cys	Arg
Tyr	Gly	Tyr 35	Asn	Tyr	Leu	Asp	Trp 40
Pro	Gin 50	Leu	Leu	Ile	Tyr	Leu 55	Gly
Asp 65	Arg	Phe	Ser	Gly	Ser 70	Gly	Ser
Ser Leu	Arg Gin	Val Thr	Glu Pro 100	Ala 85	Glu	Asp	Val

Leu	Ser 10	Leu	Pro	Val	Thr	Pro 15	Gly
Ser 25	Ser	Gin	Ser	Leu	Leu 30	His	Arg
Tyr	Leu	Gin	Lys	Pro 45	Gly	Gin	Ser
Ser	Asn	Arg	Ala 60	Ser	Gly	Val	Pro
Gly	Thr	Asp 75	Phe	Thr	Leu	Lys	Ile 80
Gly	Val 90	Tyr	Tyr	Cys	Met	Gin 95	Ala

<210> 33 <211> 407 <212> DNA <213> Homo sapiens

PL 215 258 B1 <220>

<221> CDS <222> (3) . . .(407) <220>

<221> sig_peptide <222> (3)...(38) <400> 33 tc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc aga tgg gtc ctg tcc cag ctg cag 47

Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Leu Gln

-10 -5 1

ctg cag gag Leu Gln Glu

teg Ser

ggc Gly

cca Pro

gga Gly 10

ctg gtg

aag Lys

cct Pro

teg Ser 15

gag Glu

acc Thr

ctg Leu

tcc Ser

95

Leu

Val

5

ctc

acc

tgc

act

gtc

tct

ggt

ggc

tcc

atc

agc

aga

ggt

agt

cac

tac

143

Leu

Thr

Cys

Thr

val

Ser

Gly

Ser

Ile

Ser

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

20

25

30

35

tgg

ggc

tgg

atc

ege

cag

ccc

cca

ggg

aag

ggg

ctg

gag

tgg

att

ggg

191

Trp

Gly

Trp

Ile

Arg

Gln

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

40

45

50

agt

atc

tat

agt

ggg

aac

acc

tac

ttt

aac

ccg

tcc

ctc

aag

agt

239

Ser

Ile

Tyr

Ser

Gly

Asn

Thr

Tyr

Phe

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

55

60

65

ega

gtc

acc

ata

tct

gta

gac

acg

tcc

aag

aac

cag

ttc

tcc

ctg

aag

287

Arg

Val

Thr

Ile

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gln

Phe

Ser

Leu

Lys

70

75

80

ctg

agc

tct

gtg

acc

gee

gca

gac

acg

gct

gtg

tat

tac

tgt

gcg

aga

335

Leu

Ser

Val

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

Arg

85

90

95

ctc

ggc

cct

gat

gac

tat

acc

ctt

gac

ggt

atg

gac

gtc

tgg

ggc

caa

383

Leu

Gly

Pro

Asp

Tyr

Thr

Leu

Asp

Gly

Met

Asp

Yal

Trp

Gly

Gln

100

105

110

115

ggg

acc

acg

gtc

acc

gtc

tcc

tea

407

Gly

Thr

Yal

Thr

Yal

Ser

120

<210> 34 <211> 135 <212> PRT <213> Homo :	sapiens
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..	. (12)
<400> 34
Leu Leu Leu	Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Leu Gln Leu
-10	-5 1
Gln Glu Ser	Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu
5	10 15 20

PL 215 258 B1

Thr

Cys

Thr Val

Ser 25

Gly

Ser

Ile

Ser 30

Arg

Gly Ser

His

Tyr 35

Trp

Gly

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

Ser

40

45

50

Ile

Tyr

Ser

Gly

Asn

Thr

Tyr

Phe

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

55

60

65

Val

Thr

Ile

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

70

75

80

Ser

Val

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

Arg

Leu

85

90

95

100

Gly

Pro

Asp

Tyr

Thr

Leu

Asp

Gly

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

105

110

115

Thr

Val

Thr

Val

Ser

120

<210> 35 <211> 356 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)...(356) <220>

<221> sig_peptide <222> (1)...(57) <400> 35 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctc ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

-15 -10 -5

gtc Val

ctg Leu

tcc Ser

cag Gin 1

gtg Val

cag Gin

ctg Leu

cag Gin 5

gag Glu

tcg Ser

ggc Gly

cca Pro

gga Giy 10

ctg Leu

gtg Val

aag Lys

cct

tcg

gag

acc

ctg

tcc

ctc

acc

tgc

act

gtc

tct

ggt

ggc

tcc

gtc

Pro

Ser

Glu

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Val

15

20

25

agc

agt

ggt

tac

tgg

agc

tgg

atc

cgg

cag

CCC

cca

ggg

aag

Ser

Gly

Tyr

Trp

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

30

35

40

45

gga ctg gag tgg att ggg tat atc tat tac agt ggg agc acc aac tac Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr

55 60

240

aac Asn

ccc Pro

tcc Ser

ctc Leu 65

aag Lys

agt Ser

ega Arg

gtc Val

acc Thr 70

ata Ile

tea Ser

gta Val

gac Asp

acg Thr 75

tcc Ser

aag Lys

288

aac

cag

ttc

tcc

ctg

aag

ctg

agc

tct

gtg

acc

gct

gcg

gac

acg

gee

336

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Val

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

80

85

90

gtg

tat

tac

tgt

gcg

aga

ga

356

Val

Tyr

Cys

Ala

Arg

PL 215 258 B1 <210> 36 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> SIGNAL <222> (1).,.(19) <400> 36

Met

Lys

His

Leu

Trp -15

Phe

Leu

Leu -10

Val

Ala

Pro

Arg -5

Trp

Val

Leu

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

1

5

10

Pro

Ser

Glu

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Val

15

20

25

Ser

Gly

Tyr

Trp

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

30

35

40

45

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Ser

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

50

55

60

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Val

Thr

Ile

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

65

70

75

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Yal

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

80

85

90

Yal

Tyr

Cys

Ala

Arg

<210> 37 <211> 356 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS

<222> (1) . .

.(356)

<220>

<221> sig_peptide

<222> (1) . .

(57)

<400> 37

atg

aag cac

ctg

tgg

ttc

ctc

ctg

Ctg

gtg

gcg

gct

ccc

aga

tgg

Met

Lys His

Leu

Trp

Phe

phe

Leu

Val

Ala

Pro

Arg

Trp

-15

-10

-5

gtc

ctg tcc

cag

ctg

cag

ctg

cag

gag

tcg

ggc

cca

gga

ctg

gtg

aag

Val

Leu Ser

Gin

Leu

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

1

5

10

cct

tcg gag

acc

ctg

tcc

ctc

acc

tgc

act

gtc

tct

ggt

ggc

tcc

atc

Pro

Ser Glu

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Ile

15

20

25

agc

agt agt

agt

tac

tgg

ggc

tgg

atc

cgc

cag

ccc

cca

ggg

aag

Ser

Ser Ser

Ser

Tyr

Trp

Gly

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

30

35

40

45

593

ctg gag

tgg

att

ggg

agt

atc

tat

agt

ggg

agc

acc

tac

PL 215 258 B1

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile 50

Gly

Ser

Ile

Tyr

Tyr 55

Ser

Gly

Ser

Thr

Tyr 60

Tyr

aac

ccg

tcc

ctc

aag

agt

ega

gtc

acc

ata

tcc

gta

gac

acg

tcc

aag

288

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Val

Thr

Ile

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

65

70

75

aac

cag

ttc

tcc

ctg

aag

ctg

age

tct

gtg

acc

gee

gca

gac

acg

gct

336

Asn

Gin

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Val

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

80

85

90

gtg

tat

tac

tgt

gcg

aga

ca

356

Val

Tyr

Cys

Ala

Arg

95

<210> 38 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> SIGNAL

<222> (1)..

. (19)

<400> 38

Met Lys His

Leu

Trp

Phe

Leu

Val

Ala

Pro

Arg

Trp

-15

-10

-5

Val Leu Ser

Gin

Leu

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

1

5

10

Pro Ser Glu

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Ile

15

20

25

Ser Ser Ser

Ser

Tyr

Trp

Gly

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

30

35

40

45

Gly Leu Glu

Trp

Ile

Gly

Ser

Ile

Tyr

Ser

Gly

Ser

Thr

Tyr

50

55

60

Asn Pro Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Val

Thr

Ile

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Lys

65

70

75

Asn Gin Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Val

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

80

85

90

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

Claims

1. Humanizowane przeciwciało 12B4 lub jego fragment wiążący antygen, w którym 12B4 jest mysim przeciwciałem charakteryzującym się zmiennym regionem lekkiego łańcucha o SEQ ID NO: 2 i zmiennym regionem ciężkiego łańcucha o SEQ ID NO: 4;

przy czym CDR lekkiego łańcucha mają następujące sekwencje aminokwasów:

CDR1 lekkiego łańcucha: Arg Ser Ser Gln Asn He Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu (reszty 43-58 z SEQ ID NO: 2),

CDR2 lekkiego łańcucha: Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (reszty 74-80 z SEQ ID NO: 2),

CDR3 lekkiego łańcucha: Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr (reszty 113-121 z SEQ ID NO: 2); i przy czym CDR ciężkiego łańcucha mają następujące sekwencje aminokwasów:

PL 215 258 B1

CDR1 ciężkiego łańcucha: Thr Asn Gly Met Gly Val Ser (reszty 50-56 z SEQ ID NO: 4),

CDR2 ciężkiego łańcucha: His Ile Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser (reszty 71-86 z SEQ ID NO: 4),

CDR3 ciężkiego łańcucha: Arg Arg Ile Ile Tyr Asp Val Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr (reszty 119-131 z SEQ ID NO: 4).

2. Humanizowane przeciwciało lub fragment wiążący antygen według zastrz. 1, w którym zrąb zmiennego regionu humanizowanego lekkiego łańcucha wykazuje co najmniej 85% identyczności sekwencji ze zrębem zmiennego regionu ludzkiego lekkiego łańcucha z lekkiego łańcucha ludzkiego przeciwciała Kabat ID 005036.

3. Humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, w którym zrąb zmiennego regionu humanizowanego ciężkiego łańcucha wykazuje co najmniej 85% identyczności sekwencji ze zrębem zmiennego regionu ludzkiego ciężkiego łańcucha z ciężkiego łańcucha ludzkiego przeciwciała Kabat ID 000333.

4. Humanizowane przeciwciało lub jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, zawierające humanizowany ciężki łańcuch i humanizowany lekki łańcuch, w którym

7 -1 z powinowactwem wiązania co najmniej 10⁷ M^-1.

5. Humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1-4, w którym pozycja L2 w zrębie humanizowanego zmiennego regionu lekkiego łańcucha jest zajęta przez V, zgodnie z konwencją numeracji Kabata.

6. Humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1-5, w którym pozycje H2, H24, H27, H29, H48, H49, H67, H71 i H78, zgodnie z konwencją numeracji Kabata, w zrębie humanizowanego zmiennego regionu ciężkiego łańcucha, są zajęte odpowiednio przez V, F,

F, L, L, A, L, K i V.

7. Humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1-6, w którym pozycje H24, H27, H29 i H71 w zrębie humanizowanego zmiennego regionu ciężkiego łańcucha, zgodnie z konwencją numeracji Kabata, są zajęte odpowiednio przez F, F, L i K.

8. Humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1-6, w którym pozycje H24, H27, H29, H48, H71 i H78 w zrębie humanizowanego zmiennego regionu ciężkiego łańcucha, zgodnie z konwencją numeracji Kabata, są zajęte odpowiednio przez F, F, L, L, K i V.

9. Humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, w którym zmienny region humanizowanego ciężkiego łańcucha ma sekwencję aminokwasową zawierającą aminokwasy 20-142 z SEQ ID NO: 8, a zmienny region humanizowanego lekkiego łańcucha ma sekwencję aminokwasową zawierającą aminokwasy 21-132 z SEQ ID NO: 6.

10. Humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, w którym zmienny region humanizowanego ciężkiego łańcucha ma sekwencję aminokwasową zawierającą aminokwasy 20-142 z SEQ ID NO: 10, a zmienny region humanizowanego lekkiego łańcucha ma sekwencję aminokwasową zawierającą aminokwasy 21-132 z SEQ ID NO: 6.

11. Humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, w którym zmienny region humanizowanego ciężkiego łańcucha ma sekwencję aminokwasową zawierającą aminokwasy 20-142 z SEQ ID NO: 12, a zmienny region humanizowanego lekkiego łańcucha ma sekwencję aminokwasową zawierającą aminokwasy 21-132 z SEQ ID NO: 6.

12. Izolowane kwasy nukleinowe kodujące odpowiednio zmienny region humanizowanego ciężkiego łańcucha i zmienny region humanizowanego lekkiego łańcucha określone w zastrz. 1-11.

13. Wektor lub wektory zawierające kwas nukleinowy lub kwasy nukleinowe określone w zastrz. 12.

PL 215 258 B1

14. Izolowana komórka gospodarz zawierająca wektor lub wektory określone w zastrz. 13.

15. Sposób wytwarzania humanizowanego przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen, obejmujący hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 14 w takich warunkach, że powstaje przeciwciało lub fragment wiążący antygen oraz wydzielanie przeciwciała z komórki gospodarza lub z hodowli.

16. Środek farmaceutyczny zawierający humanizowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen określone w zastrz. 1-11 i nośnik farmaceutyczny.

17. Zastosowanie humanizowanego przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen określonych w zastrz 1-11 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki choroby amyloidogennej, ewentualnie, w którym chorobę stanowi choroba Alzheimera i/lub w którym dawka mieści się w zakresie 0,01 do 5 mg/kg masy ciała, ewentualnie 1 mg/kg.

18. Chimeryczne przeciwciało 12B4 lub jego fragment wiążący antygen, gdzie 12B4 jest mysim przeciwciałem charakteryzującym się zmiennym regionem lekkiego łańcucha o SEQ ID NO: 2 i zmiennym regionem ciężkiego łańcucha o SEQ ID NO: 4, przy czym chimeryczny region zmienny ciężkiego łańcucha ma sekwencję aminokwasową zawierającą aminokwasy 21-142 z SEQ ID NO: 4, a chimeryczny region zmienny lekkiego łańcucha ma sekwencję aminokwasową zawierającą aminokwasy 20-131 z SEQ ID NO: 2.