KR101122871B1 - 베타 아밀로이드 펩티드를 인식하는 인간화 항체 - Google Patents

베타 아밀로이드 펩티드를 인식하는 인간화 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환자의 뇌내 Aβ의 아밀로이드 침착물과 관련된 질병의 치료를 위한 개선된 제제 및 방법을 제공한다. 바람직한 제제는 인간화 항체를 포함한다.

Description

베타 아밀로이드 펩티드를 인식하는 인간화 항체{HUMANIZED ANTIBODIES THAT RECOGNIZE BETA AMYLOID PEPTIDE}
관련 출원
본 출원은 2002년 3월 12일 출원되고 계류중인 미국 가특허 출원 60/363,751호(베타-아밀로이드 펩티드를 인식하는 인간화 항체)의 우선권 주장 출원이다. 상기 출원의 전체적인 내용은 본원에 참고로 인용한 것이다.
알츠하이머병(AD)은 노인성 치매를 일으키는 진행성 질병이다[참조: 일반적으로 Selkoe, TINS 16: 403 (1993); Hardy 등, WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53: 438 (1994); Duff 등, Nature 373: 476 (1995); Games 등, Nature 373: 523 (1995)]. 개략적으로 언급하면, 상기 질병은 2개 유형, 즉 노령(65세 이상)에 발생하는 늦은 발병 및 노년기 훨씬 이전, 즉 35세에서 60세 사이에 발생하는 초기 발병으로 분류된다. 질병의 2가지 유형에서, 병리학은 동일하나, 비정상적인 성질은 더 젊은 나이에 발병하는 경우가 더 심하고 폭넓다. 상기 질병은 뇌내의 병변, 신경원섬유의 다발성 병변 및 노인성 반점중 2가지 이상의 유형을 특징으로 한다. 신경원섬유엉킴은 거의 서로 쌍으로 꼬인 2개의 필라멘트로 이루어진 tau 단백질과 관련된 미소관의 세포내 침착물이다. 노인성 반점(즉, 아밀 로이드 반점)은 뇌 조직 영역의 현미경 분석에 의해 볼 수 있는 중심부에서의 세포외 아밀로이드 침착물을 가진 횡으로 150 ㎛ 이하의 탈조직화된 신경망 부위이다. 뇌내 아밀로이드 반점의 축적은 다운증후군 및 기타 인식 장애와 관련되어 있다.
반점의 본질적인 구성은 Aβ또는 β-아밀로이드 펩티드라 칭하는 펩티드이다. Aβ펩티드는 아밀로이드 전구 단백질(APP)이라 칭한 단백질인 더 큰 경막 단백질의 39-43 아미노산의 4 kDa 내부 단편이다. 상이한 시크리타제 효소에 의한 APP의 단백질분해 처리 결과, Aβ는 일차적으로 길이가 40 아미노산인 단형태 및 길이가 42-43 아미노산인 장형태로 확인된다. APP의 소수성 경막 도메인의 일부분은 Aβ의 카르복시 단부에서 확인되며, 이는 특히 장형태의 경우 반점으로 응집될 수 있는 Aβ의 능력을 설명할 수 있다. 뇌내 아밀로이드 반점의 축적은 실질적으로 신경세포 사멸을 초래한다. 이러한 유형의 신경 퇴행과 관련된 물리적인 증후는 알츠하이머병의 특징이다.
APP 단백질 내의 몇몇 돌연변이는 알츠하이머 병의 존재와 상관되어 있다[참조: Goate 등, Nature 349: 704 (1991)(발린717 에서 이소루신으로); Chartier Harlan 등, Nature 353: 844 (1991)(발린717에서 글리신으로); Murrell 등, Science 254: 97 (1991)(발린717에서 페닐알라닌으로); Mullan 등, Nature Genet. 1: 345 (1992)(라이신595-메티오닌595에서 아스파라긴595-루신595으로)]. 이러한 돌연변이는 APP에서 Aβ로의 증가된 또는 변경된 프로세싱, 구체적으로 APP에서 증가된 양의 A β의 장형태(즉, Aβ1-42 및 Aβ1-43)로의 증가된 또는 변경된 프로세싱에 의해 알츠하이머병을 유발하는 것으로 생각된다. 다른 유전자, 예를 들어 프레세닐린 유전자, PS1 및 PS2에서의 돌연변이는 증량된 양의 장형태 Aβ를 생성하기 위한 APP의 프로세싱에 간접적으로 영향을 미칠 수 있는 것으로 생각된다[참조: Hardy, TINS 20: 154 (1997)].
마우스 모델은 알츠하이머병에서 아밀로이드 반점의 유의성을 결정하는 데 성공적으로 사용되어 왔다[참조: Games 등, 상기 문헌 참조, Johnson-Wood 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1550 (1997)]. 구체적으로, PDAPP 트랜스게닉 마우스(인간 APP의 성숙 형태를 발현하고 저연령에서 알츠하이머병이 발병됨)에게 Aβ의 장형태를 주사하는 경우, 이들 마우스에서는 알츠하이머병의 진행이 감소되었으며, Aβ펩티드에 대한 항체 역가가 증가하였다[참조: Schenk 등, Nature 400, 173 (1999)]. 상기 논의 내용은 Aβ, 구체적으로 그의 장형태가 알츠하이머병의 원인 요소임을 나타내는 것이다.
따라서, 알츠하이머병을 치료하기 위한 신규한 치료법 및 치료제, 특히 생리적인(예를 들어, 비독성) 투여량에서 치료적 잇점을 제공할 수 있는 치료법 및 치료제에 대한 요구가 존재한다.
발명의 개요
본 발명은 신규한 면역학적 치료제, 구체적으로 아밀로이드형성성 질병(amyloidogenic disease)(예를 들어, 알츠하이머병)의 치료 및 예방을 위한 치료적 항체 제제에 관한 것이다. 본 발명은 Aβ펩티드에 특이적으로 결합하고 아밀로이드형성성 질환과 관련된 신경염성 영양장애 및/또는 반점 존재량을 감소시키는 데 효과적인 모노클로날 항체의 확인 및 특성 규명에 적어도 부분적으로 기초한다. 상기 항체의 구조 분석 및 기능 분석은 예방적 용도 및/또는 치료적 용도를 위한 여러가지 인간화 항체의 디자인을 가능하게 한다. 구체적으로, 본 발명은 상기 항체의 가변부의 인간화를 특징으로 하며, 따라서 인간화 면역글로불린 또는 항체 쇄, 원형(intact) 인간화 면역글로불린 또는 항체, 및 기능적인 면역글로불린 또는 항체 단편, 구체적으로 특정 항체의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 특정 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역을 포함하는 폴리펩티드 뿐만 아니라 상기 폴리펩티드를 암호화하는 데 적합한 폴리뉴클레오티드 제제, 벡터 및 숙주도 포함한다.
또한, 본 발명은 아밀로이드형성성 질병 또는 질환(예를 들어, 알츠하이머병)을 치료하는 방법 뿐만 아니라 상기 용도로 사용하기 위한 약학 조성물 및 키트도 포함한다.
또한, 본 발명은 치료제로 사용되는 경우, 개선된 결합 친화도 및/또는 감소된 면역원성을 보유하는 인간화 항체의 디자인에서 치환될 수 있는 잔기를 확인하기 위해, 그리고 적합한 면역학적 기능을 위해 중요한 특정 모노클로날 항체 내의 잔기를 확인하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 변경된 효과기 기능을 보유하는 항체(예를 들어, 인간화 항체) 및 이의 치료적 용도를 제공한다.
도 1A-B는 마우스 12B4(성숙 펩티드, 서열 번호 2), 인간화 12B4(성숙 펩티드, 서열 번호 6), 카바트 ID 005036(성숙 펩티드, 서열 번호 32) 및 배계열(germline) A19(X63397, 성숙 펩티드, 서열 번호 30) 항체의 경쇄의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. CDR 영역은 점각처리 및 윗줄로 나타냈다. 인간 →마우스 잔기의 단일 역돌연변이는 *로 나타냈다. 빗금친 잔기의 중요성은 도면의 설명 부분에 나타냈다. 최초 메티오닌으로부터 넘버링하였으며, 카바트 넘버링 체계를 이용하지 않았다.
도 2A-B는 마우스 12B4(성숙 펩티드, 서열 번호 4), 인간화 12B4(버젼 1)(성숙 펩티드, 서열 번호 8), 카바트 ID 000333(성숙 단백질, 서열 번호 34) 및 배계열 VH4-39 및 VH4-61 항체(성숙 펩티드, 각각 서열 번호 38 및 36)의 중쇄의 아미노산 서열의 배열을 나타낸다. 주석은 도 1과 같다. 최초 메티오닌으로부터 넘버링하였으며, 카바트 넘버링 체계를 이용하지 않았다.
도 3A-D는 키메라 12B4VL(쥐과동물 12B4VL과 동일한 가변부 서열, 각각 서열 번호 1 및 2); 배계열 A19 서열(각각 서열 번호 29 및 30); 및 카비드 ID 005036(각각, 서열 번호 31 및 32)과 비교된 인간화 12B4VLv1에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 4A-D는 키메라 12B4VH(쥐과동물 12B4VH와 동일한 가변부 서열, 각각 서열 번호 3 및 4); 카바트 ID 000333(각각 서열 번호 33 및 34); 및 배계열 VH4-61(각각 서열 번호 35 및 36)와 비교한 인간화 12B4VLv1에 대한 뉴클레오티드 및 아미노 산 서열을 나타낸다.
도 5는 Aβ에 대한 키메라 12B4, 3D6 및 키메라 3D6의 결합을 측정하는 2개의 독립적인 실험으로부터 얻은 ELISA 결과를 그래프로 나타낸 것이다(각각 패널 A 및 패널 B).
도 6은 3D6, 키메라 3D6 및 10D5와 비교한 12B4 및 키메라 12B4의 기능적 활성을 확인하는 경쟁적 ELISA 결합을 그래프로 나타낸 것이다. 키메라 12B4(△)는 Aβ1-42 펩티드에 대해 비오티닐화된 쥐과동물 12B4의 결합에 대해 그의 비-비오티닐화된 쥐과동물 대응부(▽)와 동일한 능력으로 경쟁한다.
도 7은 PDAPP 뇌 영역 상에서 소신경교 세포에 의한 Aβ의 흡수를 매개하는 키메라 12B4, 13D6 및 인간 IgG1의 능력을 테스트하는 생체외 식세포작용 분석을 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 AD 뇌 영역 상에서 소신경교 세포에 의한 Aβ의 흡수를 매개하는 키메라 12B4, 인간화 3D6 및 인간 IgG1의 능력을 테스트하는 2개의 독립적인 생체외 식세포작용 분석(각각 패널 A 및 패널 B) 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 인간화 12B4 버젼 1의 PCR-매개된 어셈블리의 모식도이다. 도 9A는 VL 영역의 어셈블리를 나타낸다. 도 9B는 VH 영역의 어셈블리를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 알츠하이머병 또는 기타 아밀로이드형성성 질병을 치료 또는 예방하기 위한 신규한 면역학적 제제 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 베타 아밀로이드 단백질(Aβ)에 대한 결합(예를 들어, 가용성 Aβ및/또는 응집된 Aβ에 대한 결 합), 식세포작용 매개(예를 들어, 응집된 Aβ의 식세포작용의 매개), 반점 존재량 감소 및/또는 신경염성 영양장애 감소(예를 들어, 환자에서)에 효과적인 모노클로날 면역글로불린 12B4의 특성 규명에 적어도 부분적으로 기초한다. 본 발명은 또한 12B4 면역글로불린의 가변 경쇄 및 중쇄의 1차 구조 및 2차 구조의 결정 및 구조에 대한 특성 규명과 활성 및 면역원성을 위해 중요한 잔기의 확인에 추가로 기초한다.
면역글로불린은 본원에 기술한 12B4 모노클로날 면역글로불린의 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직한 면역글로불린, 예를 들어 치료용 면역글로불린은 인간화 가변 경쇄 및/또는 인간화 가변 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직한 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄는 12B4 면역글로불린(예를 들어, 공여체 면역글로불린)으로부터 유래한 상보성 결정 영역(CDR) 및 수용체 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래한 가변 프레임웍 영역을 포함한다. "인간 수용체 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래한"이라는 문장은 중요한 프레임웍 잔기의 대부분이 인간 수용체 서열로부터 유래한 것이나, 인간화 면역글로불린의 활성(예를 들어, 활성을 변경시켜 공여체 면역글로불린의 활성을 더 유사하게 모방하도록함)을 개선하기 위해 선택된 잔기 또는 인간화 면역글로불린의 면역원성을 감소시키기위해 선택된 잔기로 특정 위치에서 잔기의 치환을 가능하게 한다.
한 구체예에서, 본 발명은 12B4 가변부 상보성 결정 영역(CDRs)을 포함하고(즉, 서열 번호 2로 나타낸 경쇄 가변부 서열로부터 유래한 1개, 2개, 또는 3개의 CDRs을 포함하거나, 서열 번호 4로 나타낸 중쇄 가변부 서열로부터 유래한 1개, 2 개 또는 3개의 CDRs를 포함하는), 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 서열로부터 실질적으로 유래한 가변 프레임웍 영역을 포함하나, 상기 프레임웍 잔기의 하나 이상의 잔기가 상응하는 쥐과동물 잔기로 역돌연변이되는 인간화 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄에 관한 것인데, 이때 상기 역돌연변이는 Aβ결합을 유도할 수 있는 쇄의 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는다.
다른 구체예에서, 본 발명은 12B4 가변부 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고(예를 들어, 서열 번호 2로 나타낸 경쇄 가변부 서열로부터 유래한 1개, 2개 또는 3개의 CDRs을 포함하고/하거나 서열 번호 4로 나타낸 중쇄 가변부 서열로부터 유래한 1개, 2개 또는 3개의 CDRs을 포함하고), 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 서열로부터 실질적으로 유래한 가변 프레임웍 영역을 포함하나, 하나 이상의 프레임웍 잔기는 마우스 12B4 경쇄 또는 중쇄 가변부 서열로부터 유래한 상응하는 아미노산 잔기로 치환되는 인간화 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄에 관한 것으로, 이때 프레임웍 잔기는 (a) 항원을 직접적으로 비공유결합하는 잔기; (b) CDR에 인접한 잔기; (c) CDR-상호작용 잔기; 및 (d) VL-VH 인터페이스에 참여하는 잔기로 구성되는 군으로부터 선택된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 12B4 가변부 CDR 및 인간 수용체 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 서열로부터 유래한 가변 프레임웍 영역을 포함하나, 하나 이상의 프레임웍 잔기는 마우스 12B4 경쇄 또는 중쇄 가변부 서열로부터 유래한 상응하는 아미노산 잔기로 치환되는 인간화 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄에 관한 것인데, 이때 상기 프레임웍 잔기는 가변부의 3차원 모델 분석에 의해 확인된 바와 같이 경쇄 가변부 형태 또는 기능에 영향을 미칠 수 있는 잔기, 예를 들어 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, 항원 결합 부위의 근위 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR에 인접한 잔기, CDR의 6Å내의 잔기, 정규 잔기, 버니어 대역 잔기, 쇄간 팩킹 잔기(interchain packing residue), 비정상적인 잔기 또는 상기 구조 모델 표면 상의 글리코실화 부위 잔기이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 상기한 치환 이외에 하나 이상의 희귀한 인간 프레임웍 잔기의 치환을 특징으로 한다. 예를 들어, 희귀 잔기는 그 위치에서 인간 가변 쇄 서열에 공통적인 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 또는, 희귀 잔기는 상동성 배계열 가변 쇄 서열로부터 유래한 상응하는 아미노산 잔기로 치환될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 상기한 바와 같은 경쇄 및 중쇄를 포함하는 인간화 면역글로불린 또는 상기 면역글로불린의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 예시적인 구체예에서, 상기 인간화 항체는 107 M-1, 108 M-1 또는 109 M-1 이상의 결합 친화도로 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)에 결합한다(예를 들어, 특이적으로 결합한다). 다른 구체예에서, 면역글로불린 또는 항원 결합 단편은 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ)의 식세포작용을 매개한다(예를 들어, 식세포작용을 유도한다). 또 다른 구체예에서, 면역글로불린 또는 항원 결합 단편은 개체의 혈액-뇌 배리어를 횡단한다. 다른 구체예에서, 면역글로불린 또는 항원 결합 단편은 개체에서 베타 아밀로이드 펩티드(Aβ) 존재량 및 신경염성 영양장애를 감소시킨다.
다른 구체예에서, 본 발명은 12B4 가변부(예를 들어, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 나타낸 가변부 서열)를 포함하는 키메라 면역글로불린에 관한 것이다. 다른 구체예에서, 상기 면역글로불린 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG1으로부터 유래한 불변부를 추가로 포함한다.
본원에 기술한 면역글로불린은 아밀로이드형성성 질병을 예방 또는 치료하는 것이 목적인 치료 방법에 사용하기에 특히 적합하다. 한 구체예에서, 본 발명은 아밀로이드형성성 질병(예를 들어, 알츠하이머병)의 치료 또는 예방 방법에 관한 것인데, 이 방법은 환자에게 본원에 기술한 바와 같은 인간화 면역글로불린의 유효 투여량을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술한 바와 같은 인간화 면역글로불린 및 약학적 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본원에 기술한 바와 같은 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편 또는 쇄를 생성하기 위한 분리된 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포 뿐만 아니라 상기 면역글로불린, 면역글로불린 단편 또는 면역글로불린 쇄를 생성하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 각각 인간화 12B4 면역글로불린을 생성하는 경우, 치환될 수 있는 12B4 잔기를 확인하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 치환될 수 있는 가변부 프레임웍 영역 잔기를 확인하기 위한 방법은 밝혀진 면역글로불린 구조 상의 12B4 가변부의 3차원 구조를 모델링하고, 12B4 면역글로불린 가변부 형태 또는 기능에 영향을 미칠 수 있는 잔기에 대해 상기 모델을 분석하여 치환될 수 있는 잔기를 확인하는 과정을 포함한다. 본 발명은 12B4 면역글로불린, 12B4 면역글로불린 쇄 또는 이의 도메인을 생성하는데 있어서 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 나타낸 가변부 서열 또는 이의 임의의 부분의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 변경된 효과기 기능, 예를 들어 효과기 분자, 예를 들어 효과기 세포 상의 보체 또는 수용체에 결합할 수 있는 능력을 보유한 면역글로불린에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 면역글로불린은 변경된 불변부, 예를 들어 Fc 영역을 보유하는데, 상기 Fc 영역내 하나 이상의 아미노산 잔기는 상이한 잔기 또는 측쇄로 대체되어 왔다. 한 구체예에서, 개질된 면역글로불린은 IgG 부류의 것이며, Fc 영역 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함함으로써 상기 면역글로불린은 예를 들어, 개질되지 않은 면역글로불린과 비교하는 경우 변경된 효과기 기능을 보유하게 된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 면역글로불린은 변경된 효과기 기능을 보유하여 면역원성이 약하게 되며(예를 들어, 원하지 않는 효과기 세포 활성, 분해 또는 보체 결합을 촉발시키지 않는다), 개선된 아밀로이드 제거 특성 및/또는 바람직한 반감기를 갖게 된다.
본 발명을 기술하기 이전에, 본원 명세서에 사용한 용어의 의미를 설명한다.
"면역글로불린" 또는 "항체"(본원에서 호환적으로 사용됨)는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 이루어지는 기본적인 4개의 폴리펩티드 쇄 구조를 보유하는 단백질을 의미하며, 상기 쇄는 예를 들어, 쇄간 이황화결합에 의해 안정화되며 항원을 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유한다. "단일 쇄 면역글로불린" 또는 "단일 쇄 항체"(본원에서 호환적으로 사용됨)는 중쇄 및 경쇄로 이루어진 2개의 폴리펩티드 쇄 구조를 보유하는 단백질을 의미하며, 상기 쇄는 예를 들어 쇄간 단백질 링커에 의해 안정화되며, 항원을 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유한다. "도메인"은 예를 들어, β-병풍 시트 및/또는 쇄내 이황화 결합에 의해 안정화된 펩티드 루프를 포함한다(예를 들어, 3개-4개의 펩티드 루프를 포함한다). 본원에서 도메인은 추가로 "불변" 도메인의 경우 여러 부류 멤버의 도메인내 서열 변이의 상대적인 결핍 또는 "가변" 도메인의 경우 여러 부류 멤버의 도메인내 유의적인 변이에 기초하여 "불변" 또는 "가변"으로 언급된다. 종종 항체 또는 폴리펩티드 "도메인"은 당업계에서 항체 또는 폴리펩티드 "영역"으로서 호환적으로 사용된다. 항체 경쇄의 "불변" 도메인은 "경쇄 불변부", "경쇄 불변 도메인", "CL" 영역 또는 "CL" 도메인으로서 호환적으로 사용된다. 항체 중쇄의 "불변" 도메인은 "중쇄 불변부", "중쇄 불변 도메인", "CH" 영역 또는 "CH" 도메인으로서 호환적으로 사용된다. 항체 경쇄의 "가변" 도메인은 "경쇄 가변부", "경쇄 가변 도메인" "VL" 영역 또는 "VL" 도메인으로서 호환적으로 사용된다. 항체 중쇄의 "가변" 도메인은 "중쇄 불변부", "중쇄 불변 도메인", "CH" 영역 또는 "CH" 도메인으로서 호환적으로 사용된다.
또한, "영역(부)"은 항체 쇄 또는 항체 쇄 도메인의 일부 또는 일부분(예를 들어, 상기 정의한 바와 같이 불변 도메인 또는 가변 도메인의 일부 또는 일부분) 뿐만 아니라 상기 쇄 또는 도메인의 더 불연속인 부분들 또는 일부분들을 의미할 수 있다. 예를 들어, 경쇄 또는 중쇄 또는 경쇄 또는 중쇄 도메인은 상기 정의한 바와 같이 "프레임웍 영역" 또는 "FR" 중에 산재된 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"을 포함한다.
면역글로불린 또는 항체는 단량체 형태 또는 중합체 형태, 예를 들어 오량체 형태로 존재하는 IgM 항체로 존재할 수 있고/있거나 단량체 형태, 이량체 형태 또는 다량체 형태로 존재하는 IgA 항체로 존재할 수 있다. "단편"은 원형의 또는 완전한 항체 또는 항체 쇄 보다 더 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 쇄의 일부 또는 일부분을 의미한다. 단편은 원형의 또는 완전한 항체 또는 항체 쇄의 화학적 처리 또는 효소적 처리에 의해 획득할 수 있다. 또한, 단편은 재조합 수단에 의해 획득할 수도 있다. 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, Fabc 및/또는 Fv 단편을 들 수 있다. "항원-결합 단편"은 항원을 결합하거나 항원 결합(즉, 특이적인 결합)을 위해 원형의 항체(즉, 그들이 유도된 원형의 항체)와 경쟁하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩티드 단편을 의미한다.
"형태(conformation)"는 단백질 또는 폴리펩티드(예를 들어, 항체, 이의 항체 쇄, 도메인 또는 영역)의 3차 구조를 의미한다. 예를 들어, "경쇄(또는 중쇄) 형태"는 경쇄(또는 중쇄) 가변부의 3차 구조를 의미하며, "항체 형태" 또는 "항체 단편 형태"는 항체 또는 이의 단편의 3차 구조를 의미한다.
항체의 "특이적인 결합"은 상기 항체가 항원 또는 바람직한 에피토프에 대한 상당한 친화도를 나타내며, 바람직하게는 유의적인 교차반응성을 나타내지 않는다는 의미이다. "상당한" 또는 바람직한 결합은 106, 107, 108, 109 M-1 또는 1010 M-1 이상의 친화도로 결합하는 것을 포함한다. 107 M-1 이상의 친화도가 바람직하며, 10 8 M-1 이상이 더 바람직하다. 또한, 본원에 기술한 값의 중간 값은 본 발명의 범위내 인 것으로 의도되며, 바람직한 결합 친화도는 친화도의 범위, 예를 들어 106-1010 M -1, 바람직하게는 107-1010 M-1, 더 바람직하게는 108-10 10 M-1로 나타낼 수 있다. "유의적인 교차활성을 나타내지 않는" 항체는 바람직하지 않은 실체(예를 들어, 바람직하지 않은 단백질성 실체)에 상당히 결합하지 않은 것이다. 예를 들어, Aβ에 특이적으로 결합하는 항체는 Aβ에 상당히 결합할 것이지만, 비-Aβ단백질 또는 펩티드(예를 들어, 반점 내에 포함된 비-Aβ단백질 또는 펩티드)와는 유의적으로 반응하지 않을 것이다. 바람직한 에피토프에 대해 특이적인 항체는 예를 들어 동일한 단백질 또는 펩티드 상의 원격 에피토프와 유의적으로 교차반응하지 않을 것이다. 특이적인 결합은 그러한 결합을 결정하기 위한 업계에서 통용되는 임의의 수단에 의해 결정할 수 있다. 바람직하게는, 특이적인 결합은 스캐챠드 분석 및/또는 경쟁 결합 분석에 따라 결정된다.
결합 단편은 재조합 DNA 기법 또는 원형의 면역글로불린을 효소적으로 또는 화학적으로 절단하는 방법에 의해 생성된다. 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, 단일쇄 및 단일쇄 항체를 포함한다. "2특이성" 또는 "2기능성" 면역글로불린 또는 항체 이외에, 면역글로불린 또는 항체는 그의 동일한 각각의 결합 부위를 보유하는 것으로 이해된다. "2특이성" 또는 "2기능성" 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 보유하는 인공 하이브리드 항체이다. 2특이성 항체는 Fab' 단편의 연결 또는 하이브리도마의 융합을 포함하는 여러 가지 방법에 의하여 제조할 수 있다[참조: 예를 들어, Songsivilai & Lachmann, Chin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny 등, J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)].
"인간화 면역글로불린" 또는 "인간화 항체"는 하나 이상의 인간화 면역글로불린 또는 항체 쇄(즉, 하나 이상의 인간화 경쇄 또는 중쇄)를 포함하는 면역글로불린 또는 항체를 의미한다. "인간화 면역글로불린 쇄" 또는 "인간화 항체 쇄"(즉, "인간화 면역글로불린 경쇄" 또는 "인간화 면역글로불린 중쇄")는 인간 면역글로불린 또는 항체로부터 실질적으로 유래한 가변 프레임웍 영역 및 비인간 면역글로불린 또는 항체로부터 실질적으로 유래한 상보성 결정 영역(CDRs)(예를 들어, 하나 이상의 CDR, 바람직하게는 2개의 CDRs, 더 바람직하게는 3개의 CDRs)을 포함하고, 불변부(예를 들어, 경쇄의 경우 하나 이상의 불변부 또는 이의 일부분 및 바람직하게는 중쇄의 경우 3개의 불변부)를 포함하는 가변부를 보유하는 면역글로불린 또는 항체 쇄(즉, 각각 경쇄 또는 중쇄)를 의미한다. "인간화 가변부"(예를 들어, "인간화 경쇄 가변부" 또는 "인간화 중쇄 가변부")는 인간 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래한 가변 프레임웍 영역 및 비인간 면역글로불린 또는 항체로부터 실질적으로 유래한 상보성 결정 영역을 포함하는 가변부를 의미한다.
"인간 면역글로불린 또는 항체로부터 실질적으로 유래한" 또는 "실질적으로 인간"은, 인간 면역글로불린 또는 항체 아미노산 서열을 비교 목적으로 정렬시키는 경우, 상기 영역이 인간 프레임웍 또는 불변부 서열과 90-95% 이상, 더 바람직하게는 95-99% 이상의 동일성(즉, 국부 서열 동일성)을 공유하여 예를 들어 보존적 치환, 컨센서스 서열 치환, 배계열 치환, 역돌연변이 등을 가능하게 함을 의미한다. 보존적 치환, 컨센서스 서열 치환, 배계열 치환, 역돌연변이 등의 도입은 종종 인간화 항체 또는 쇄의 "최적화"를 의미한다. "비인간 면역글로불린 또는 항체로부터 실질적으로 유래한" 또는 "실질적으로 비인간"은 비인간 유기체, 예를 들어 비인간 포유동물의 면역글로불린 또는 항체 서열에 80-95% 이상, 바람직하게는 90-95% 이상, 더 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 면역글로불린 또는 항체 서열을 보유하는 것을 의미한다.
따라서, 가능하게는 CDRs을 제외하고, 인간화 면역글로불린 또는 항체의 모든 영역 또는 잔기, 또는 인간화 면역글로불린 또는 항체 쇄의 모든 영역 또는 잔기는 하나 이상의 천연 면역글로불린 서열의 상응하는 영역 또는 잔기와 실질적으로 동일하다. "상응하는 영역" 또는 "상응하는 잔기"는 제1 서열 및 제2 서열이 비교를 목적으로 최적으로 정렬되는 경우, 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 상의 영역 또는 잔기와 동일한(즉, 균등한) 위치를 점유하는 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 상의 영역 또는 잔기를 의미한다.
"유의적인 동일성(significant identity)"은 예를 들어 디폴트 갭 중량을 이용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적 정렬되는 경우, 2개의 폴리펩티드 서열은 50-60% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 60-70% 이상의 서열 동일성, 더 바람직하게는 70-80% 이상의 서열 동일성, 더 바람직하게는 80-90% 이상의 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 90-95% 이상의 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 99% 이상의 서열 동일성)을 공유한다. "실질적인 동일성"은 예를 들어 디폴트 갭 중량을 이용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적 정렬되는 경우, 2개의 폴리펩티드 서열은 80-90% 이상으 서열 동일성, 바람직하게는 90-95% 이상의 서열 동일성, 및 더 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 99% 이상의 서열 동일성)을 공유한다. 서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 비교하려는 테스트 서열에 대해 참조 서열로 기능한다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우, 테스트 및 참조 서열을 컴뷰터에 입력하고, 하위서열 좌표를 지정하고, 필요에 따라 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수에 기초하여 참조 서열에 대한 테스트 서열(들)에 대한 서열 동일성(%)을 계산한다.
서열 비교를 위한 최적의 정렬은 예를 들어, 스미스 및 워터만의 국부 상동성 알고리즘[참조: Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)], 니들만 및 운쉬의 상동성 정렬 알고리즘[참조: J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)], 피어슨 및 리프만의 유사성 조사 방법[참조: Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)], 이들 알고리즘(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지내 GAP, BESTIFT, FASTA 및 TFASTA, 제네틱스 컴퓨터 그룹, 575 사이언스 드라이브, 매디슨, 위스콘신) 또는 육안 검색[참조: 일반적으로, Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology]에 의해 수행할 수 있다. 서열 동일성 및 서열 유사성을 측정하기 위해 적합한 알고리즘의 한 예로는 BLAST 알고리즘이다[참조: Altschul 등, J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)]. BLAST 분석ㅇ르 수행하기 위한 소프트웨어는 내쇼날 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션을 통해 자유롭게 이용할 수 있다(국립보건원 NCBI 인터넷 서버를 통해 자유롭게 접속할 수 있다). 전형적으로, 주문형 파라미터를 사용할 수도 있지만, 디 폴트 프로그램 파라미터를 이용하여 서열 비교를 수행할 수 있다. 아미노산 서열에 있어서, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어길이(W), 10의 예상(E) 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 사용한다[참조: Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915(1989)].
바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 달라진다. 아미노산 치환을 보존적인지 비보존적인지 분류하기 위해, 아미노산은 다음과 같이 그룹화한다: I 그룹(소수성 측쇄): leu, met, ala, val, leu, ile; II 그룹(중성의 친수성 측쇄): cys, ser, thr: III 그룹(산성 측쇄): asp, glu; IV 그룹(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; V 그룹(측쇄 배향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro: 및 VI 그룹(방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 비보존적 치환은 이들 부류중 한 부류의 구성원을 다른 부류의 구성으로 대체하는 경우를 의미한다.
바람직하게는, 인간화 면역글로불린 또는 항체는 상응하는 비인간화 항체의 결합 친화도의 3배, 4배 또는 5배 내의 결합 친화도로 항원에 결합한다. 예를 들어, 비인간화 항체의 결합 친화도가 109 M-1인 경우, 인간화 항체는 3 x 109 M-1, 4 x 109 M-1 또는 109 M-1의 결합 친화도를 보유할 것이다. 면역글로불린 또는 항체 쇄의 결합 친화도를 기술하는 경우, 상기 쇄는 "항원(예를 들어, Aβ) 결합"을 유도할 수 있는 그의 능력에 기초하여 기술될 수 있다. 원형의 면역글로불린 또는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)에 특이적인 결합 특성 또는 결합 친화도를 부여하는 경우, 쇄는 "항원 결합"을 유도함을 의미한다. 돌연변이(예를 들어, 역돌연변이)는 돌연변이가 결여된 균등의 쇄를 포함하는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 결합 친화도에 비해 몇배 이상으로 상기 쇄를 포함하는 원형의 면역글로불린 또는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 결합 친환도에 영향을 미치는 경우 항원 결합을 유도하는 중쇄 또는 경쇄의 능력에 실질적인 영향을 미치는 것을 의미한다. 돌연변이는 돌연변이가 결여된 균등한 쇄를 포함하는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 결합 친화도의 단지 2배, 3배 또는 4배의 결합 친화도로 상기 쇄를 포함하는 원형의 면역글로불린 또는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 결합 친화도에 영향을 미치는 경우 "항원 결합을 유도할 수 있는 쇄의 능력에 실질적으로 영향을 미치는(예를 들어, 감소시키는) 것은 아니다.
"키메라 면역글로불린" 또는 항체는 가변부가 제1 종으로부터 유래하고 불변부가 제2 종으로부터 유래한 면역글로불린 또는 항체를 의미한다. 키메라 면역글로불린 또는 항체는 예를 들어, 상이한 종에 속하는 면역글로불린 유전자 절편으로부터 유전 공학적 방법에 의해 구성할 수 있다. "인간화 면역글로불린" 또는 "인간화 항체"는 후술하는 바와 같이 키메라 면역글로불린 또는 항체를 포함하는 의도는 아니다. 인간화 면역글로불린 또는 항체는 그들의 구성이 키메라일 수 있음에도 불구하고(즉, 한종류 이상의 단백질로부터 유래한 영역을 포함함), 이들은 본원에서 정의한 바와 같이 키메라 면역글로불린 또는 항체 내에서 확인되지 않은 추가의 잔기(즉, 공여체 CDR 잔기 및 수용체 프레임웍 잔기를 포함하는 가변부)를 포함한다.
"항원"은 항체가 특이적으로 결합하는 실체(예를 들어, 단백질성 실체 또는 펩티드)이다.
"에피토프" 또는 "항원 결정기"는 면역글로불린 또는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 의미한다. 에피토프는 연속적인 아미노산 또는 단백질의 3차원 접힘에 의해 인접하게된 비연속성 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 연속적인 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출시 보유되는 반면, 3차원 접힘에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매로 처리시 전형적으로 상실된다. 에피토프는 전형적으로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 이상의 아미노산을 독특한 공간 형태로 포함한다. 에피토프의 공간 형태를 결정하는 방법의 예로는 X-선 결정분석법 및 2-차원 핵 자기 공명을 들 수 있다[참조: 예를 들어, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E.Morris, Ed. (1996)].
동일한 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합을 차단할 수 있는 한 항체의 능력을 나타내는 간단한 면역분석, 즉 경쟁 결합 분석에서 확인할 수 있다. 경쟁 결합은 테스트중인 면역글로불린인 Aβ와 같은 공통 항원에 대한 참조 항체의 특이적인 결합을 억제하는 분석에서 결정된다. 다수 유형의 경쟁 결합 분석이 공지되어 있으며, 그 예는 다음과 같다: 고형성 직접 또는 간접 방사능면역분석(RIA), 고형상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석[참조: Stahli 등, Methods in Enzymology 9: 242 (1983)]; 고형상 직접 비오틴-아비딘 EIA[참조: Kirkland 등, J. Immunol. 137: 3614 (1986)]; 고형상 직접 표지 분석, 고형상 직접 표지 샌드위치 분석[참조: Harlow 및 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)]; I-125 표지를 이용하는 고 형상 직접 표지 RIA[참조: Morel 등, Mol. Immunol. 25(1): 7 (1988)]; 고형상 직접 결합 비오틴-아비딘 EIA(Cheung 등, Virology 176: 546 (1990)]; 및 직접 표지 RIA[참조: Moldenhauer 등, Scand. J. Immunol. 32: 77 (1990)]. 전형적으로, 이러한 분석은 비표지된 테스트 면역글로불린 및 표지된 참조 면역글로불린중 하나는 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 포함한다. 경쟁 분석은 테스트 면역글로불린의 존재 하에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 통상적으로, 테스트 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 통상적으로, 경쟁하는 항체가 과량으로 존재하는 경우, 이는 공통 항원에 대한 참조 항체의 특이적인 결합을 50-55% 이상, 55-60% 이상, 60-65% 이상, 65-70% 이상, 70-75% 이상으로 억제할 것이다.
또한, 에피토프는 면역학적 세포, 예를 들어 B 세포 및/또는 T 세포에 의해 인식된다. 에피토프의 세포성 인식은 3H-티미딘 혼입, 시토킨 분비, 항체 분비 또는 항원-의존성 사멸(세포독성 T 임파구 분석)에 의해 결정되는 바와 같이, 항원 의존성 증식을 측정하는 시험관내 분석에 의해 결정할 수 있다.
예시적인 에포토프 또는 항원 결정기는 인간 아밀로이드 전구 단백질(APP) 내에서 확인할 수 있으나, APP의 Aβ펩티드내에서 확인되는 것이 바람직하다. APP의 다수의 동형태, 예를 들어 APP695, APP751 및 APP770이 존재한다. APP 내의 아미노산은 APP770 동형태의 서열에 따라 숫자가 할당된다(참조: 예를 들어, 진뱅크 등록 번호 P05067). Aβ(본원에서 베타 아밀로이드 펩티드 및 A-베타라고도 칭함) 펩티 드는 APP의 39-43 아미노산의 약 4 kDa 내부 단편이다(Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 및 Aβ43). 예를 들어, Aβ40은 APP의 잔기 672-711로 구성되며, Aβ42는 APP의 잔기 673-713으로 구성된다. 상이한 시크리타제 효소에 의한 생체내 또는 원위치에서의 APP의 단백질 분해 처리 결과, Aβ는 길이가 40 아미노산인 "단형태"와 길이가 42-43 아미노산인 "장형태" 둘 다로 확인된다. 본원에 기술한 바와 같이, 바람직한 에피토프 또는 항원 결정기는 Aβ펩티드의 N-말단내에 위치하며, Aβ의 아미노산 1-10 내의 잔기, 바람직하게는 Aβ42의 잔기 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 또는 3-7로부터 유래한 잔기를 포함한다. 추가로 언급한 에피토프 또는 항원 결정기는 Aβ의 잔기 2-4, 5, 6, 7 또는 8, Aβ의 잔기 3-5, 6, 7, 8 또는 9 또는 Aβ의 잔기 4-7, 8, 9 또는 10을 포함한다. 항체가 특정 잔기, 예를 들어 Aβ3-7 내의 에피토프에 결합하는 것으로 언급되는 경우, 의미하는 것은 항체가 특정 잔기(즉, 예를 들어 Aβ3-7)를 함유하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 이러한 항체는 Aβ3-7 내의 모든 잔기와 접촉할 필요는 없다. 모든 단일 아미노산 치환 또는 결실이 결합 친화도에 유의적인 영향을 미칠 필요는 없다.
"아밀로이드형성성 질병"은 불용성 아밀로이드 피브릴의 형성 또는 침착과 관련되거나(에 의해 유발되는) 임의의 질병을 포함한다. 아밀로이드형성성 질병의 예로는 전신성 유전분증, 알츠하이머병, 성인 당뇨병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 전두측두엽성 치매, 및 프리온-관련 전염성 스폰지형 뇌질환(각각 인간에서 쿠루병 및 크로이츠펠트-야콥병 및 양과 속에서 BSE)을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 다른 아밀로이드형성성 질병은 침착된 피브릴의 폴리펩티드 성분의 성질에 의 해 정의 되거나 그 성질을 특징으로 한다. 예를 들어, 알츠하이머병을 가진 개체 또는 환자에서, β-아밀로이드 단백질(예를 들어, 야생형, 변이체 또는 절두형 β-아밀로이드 단백질)은 아밀로이드 침착물의 폴리펩티드 성분을 특징으로 한다. 따라서, 알츠하이머병은 예를 들어 개체 또는 환자의 뇌에서 "Aβ의 침착물을 특징으로 하는 질병" 또는 "Aβ의 침착물과 관련된 질병"의 예이다. 본원에서 "β-아밀로이드 단백질", "β-아밀로이드 펩티드", "β-아밀로이드", "Aβ" 및 "Aβ펩티드"는 상호 호환적으로 사용된다.
"면역원성 제제" 또는 "면역원"은 필요에 따라 보조제와 함께 포유동물에게 투여시 그 자체에 대해 면역학적 반응을 유발할 수 있다.
"치료(또는 처치)"는 질병, 질병의 증후 또는 질병에 걸리기 쉬운 소질을 가진 환자에게 치료제를 적용 또는 투여하거나, 상기 환자로부터 분리된 조직 또는 세포주에 치료제를 적용 또는 투여하여 상기 질병, 질병의 증후 또는 질병에 걸리기 쉬운 소질을 치료, 치유, 경감, 완화, 변경, 개량, 개선 또는 영향을 미치게 하는 것으로 정의된다.
"유효량" 또는 "유효 투여량"은 적어도 부분적으로 소정의 효과를 얻거나 얻기에 충분한 양이다. "치료 유효량"은 이미 질병을 앓고 있는 환자에서 질병 및 그 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 그 진행을 정지시키는 데 충분한 양을 의미한다. 이러한 용도에 효과적인 양은 감염의 심각성 및 환자 자신의 면역 체계의 일반적인 상태에 따라 달라질 것이다.
"환자"는 예방적 처치 또는 치료적 처치를 받는 인간 및 다른 포유류 개체를 포함한다.
"가용성" 또는 "분리된" Aβ는 비응집성 또는 분해된 Aβ폴리펩티드를 의미하며, 단량체성의 가용성 Aβ 폴리펩티드 뿐만아니라 올리고머성의 가용성 Aβ폴리펩티드(예를 들어, 가용성 Aβ이량체, 삼량체 등)를 의미한다. "불용성" Aβ는 응집성 Aβ 폴리펩티드, 예를 들어 비공유 결합에 의해 함께 유지되는 Aβ를 의미한다. Aβ(예를 들어, Aβ42)는 상기 펩티드의 C-말단에 존재하는 소수성 잔기(APP의 경막 도메인의 부분)의 존재로 인해 적어도 부분적으로 응집될 것으로 생각된다. 가용성 Aβ는 생체내의 생물학적 유체, 예를 들어 뇌척수액 및/또는 혈청에서 확인할 수 있다. 또는, 가용성 Aβ는 순 DMSO 내의 동결건조된 펩티드를 초음파로 분해함으로써 제조할 수 있다. 생성된 용액은 원심분리하여(예를 들어, 14,000 x g, 4℃, 10분) 임의의 불용성 입자를 제거한다.
"효과기 기능(effector function)"은 항체(예를 들어, IgG 항체)의 Fc 영역 내에 존재하며 예를 들어 효과기 세포 활성, 분해, 보체-매개된 활성, 항체 제거 및 항체 반감기와 같은 항체의 몇몇 면역 기능들을 조절할 수 있는 보체 및/또는 Fc 수용체와 같은 효과기 분자에 결합할 수 있는 항체의 능력을 포함하는 활성을 의미한다.
"효과기 분자(effector molecule)"는 항체(예를 들어, IgG 항체)의 Fc 부분에 결합할 수 있는 분자를 의미하며, 그 예로는 보체 단백질 또는 Fc 수용체를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
"효과기 세포(effector cell)"는 전형적으로 효과기 세포의 표면 상에서 발 현되는 Fc 수용체에 의해 항체(예를 들어, IgG 항체)의 Fc 부분에 결합할 수 있는 세포를 의미하며, 그 예로는 림프쿠, 예를 들어 항원 제시 세포 및 T 세포를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
"Fc 영역"은 IgG 항체의 C-말단 영역, 구체적으로 상기 IgG 항체의 중쇄(들)의 C-말단 영역을 의미한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계는 약간 변화할 수 있음에도 불구하고, Fc 영역은 전형적으로 거의 아미노산 잔기 Cys226으로부터 IgG 중쇄(들)의 카르복시 말단까지 걸치는 것으로 정의된다.
"카바트(Kabat) 넘버링"은 다른 언급이 없으면 본원에 참고로 인용한 문헌[참조: Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, Public Health Service, NIH, 미국 매릴랜드 베데스다 (1991)]에서와 같이 EU 인덱스를 이용하여 예를 들어 IgG 중쇄 항체에서의 잔기 넘버링을 의미한다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 의미한다. 항체(예를 들어, IgG 항체)의 Fc 영역에 결합하는 전형적인 Fc 수용체로는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 아류의 수용체(대립유전자 변이체 또는 이들 수용체의 스플라이싱된 형태를 포함한다)를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. Fc 수용체는 문헌[참조: Ravetch 및 Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel 등, Immunomethods 4: 25-34 (1994); 및 de Haas 등, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)]에서 확인할 수 있다.
I. 면역학적 제제 및 치료제
본 발명의 면역학적 제제 또는 치료제는 본원에 기술한 바와 같은 면역원 또 는 항체, 또는 이의 기능적 단편 또는 항원 결합 단편으로 구성되거나 이를 포함한다. 기본 항체 구조 유닛은 서브유닛의 4량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각각의 4량체는 폴리펩티드 쇄로 이루어진 2개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70 kDa)를 포함한다. 각 쇄의 아미노 단부는 주로 항원 인식을 담당하는 약 100-110 이상의 아미노산으로 이루어진 가변부를 포함한다. 각 쇄의 카르복시 단부는 주로 효과기 기능을 담당하는 불변부를 구성한다.
경쇄는 카파 또는 람다로서 분류되며, 길이는 약 230개의 잔기이다. 중쇄는 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε)으로 분류되며, 항체의 아이소타입은 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 정의된다. 중쇄 및 경쇄 둘 다는 접혀 도메인을 형성한다. "도메인"은 단백질, 예를 들어 면역글로불린 또는 항체의 구형 영역을 의미한다. 면역글로불린 또는 항체는 예를 들어, β-병풍 시트 구조 및 쇄간 이황화 결합에 의해 안정화된 3개 또는 4개의 펩티드 루프를 포함한다. 원형의 경쇄, 예를 들어 2개의 도메인(VL 및 CL) 및 원형의 중쇄는 예를 들어 4개 또는 5개의 도메인(VH, CH1, CH2 및 CH3)을 보유한다.
경쇄 및 중쇄 내에서, 가변부 및 불변부는 약 12개 이상의 아미노산으로 이루어진 "J" 영역에 의해 결합되며, 또한, 중쇄는 약 10개의 아미노산으로 이루어진 "D" 영역을 포함한다[참조: 일반적으로, Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2판, Raven Press, N.Y. (1989), Ch. 7, 본원에 참고로 인용함).
각각 경쇄/중쇄 쌍의 가변부는 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 원형의 항체는 2개의 결합 부위를 보유한다. 2기능성 또는 2특이성 항체의 경우를 제외하고, 2개의 결합 부위는 동일하다. 쇄들은 모두 상보성 결정 영역 또는 CDRs로도 칭하는 3개의 초가변부 영역에 의해 결합된 동일한 일반 구조 또는 상대적으로 보존된 프레임웍 영역(FR)을 나타낸다. 자연 발생 쇄 또는 재조합적으로 생성된 쇄는 성숙 쇄를 생성하기위한 세포성 프로세싱 중에 제거되는 리더 서열과 함께 암호화된다. 또한, 예를 들어, 소정의 특정 쇄의 분비를 증강시키거나 프로세싱을 변경하기 위해 비자연적으로 발생하는 리더 서열을 포함하는 성숙 단백질을 재조합적으로 생성할 수 있다.
각 쌍의 2개의 성숙 쇄의 CDRs은 프레임웍 영역에 의해 정렬되어, 특이적인 에피토프에 결합하는 것을 가능하게 한다. N-말단으로부터 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 둘 다는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 또한, "FR4"는 당업계에서 가변 중쇄의 D/J 영역 및 가변 경쇄의 J 영역으로 칭한다. 각 도메인으로의 아미노산의 할당은 Kabat의 정의[참조: Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH, 미국 매릴랜드 베데스다 (1991)]에 따른 것이다. 대안적인 구조적 정의는 본원에 참고 인용한 문헌[Chothia 등, J. Mol. Biol. 196: 901 (1987); Nature 342: 878 (1989); 및 J. Mol. Biol. 186: 651 (1989), 본원에서는 총괄적으로 Chothia 등이라 칭하며, 이들 모두는 전적으로 참고 인용된 것임]에 제안되어 왔다.
A. Aβ항체
본 발명의 치료제는 Aβ또는 아밀로이드 반점의 다른 성분에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 바람직한 항체는 모노클로날 항체이다. 이러한 일부 항체는 가용성 형태에 결합하지 않고 Aβ의 응집된 형태에 특이적으로 결합한다. 일부는 응집된 형태에 결합하지 않고 가용성 형태에 특이적으로 결합한다. 일부는 응집된 형태 및 가용성 형태 둘 다에 결합한다. 치료 방법에 사용되는 항체는 Fc 수용체와 상호작용하는 원형의 불변부 또는 적어도 충분한 불변부를 보유하는 것이 바람직하다. 바람직한 항체는 반점내 Aβ의 Fc-매개된 식세포작용을 자극하는데 효과적인 것들이다. 인간 아이소타입 IgG1이 바람직한데, 그 이유는 식세포작용 세포 상에서(예를 들어, 뇌에 상주하는 대식세포 또는 소신경교세포 상에서) FcRI 수용체에 대해 인간 아이소타입의 최대 친화성을 보유하기 때문이다. 인간 IgG1은 쥐과동물 IgG2a의 균등물이고, 따라서 후자는 알츠하이머의 동물(예를 들어, 마우스) 모델에서 생체내 효능을 테스트하는 데 효과적이다. 또한, 2특이성 Fab 단편을 사용할 수도 있는데, 항체의 한 아암은 Aβ에 대한 특이성을 보유하며, 다른 아암은 Fc 수용체에 대한 특이성을 보유한다. 바람직한 항체는 약 106, 107, 108, 109 또는 1010 M-1 보다 큰(또는 동일한) 결합 친화도로 Aβ에 결합한다(이들 값의 중간 값의 친화도를 포함함).
모노클로날 항체는 형태적 에피토프 또는 비형태적 에피토프일 수 있는 Aβ내의 특이적인 에피토프에 결합한다. 항체의 치료적 효능 또는 예방적 효능은 실시예에 기술된 트랜스게닉 동물 모델 과정을 이용하여 테스트할 수 있다. 바람직한 모노클로날 항체는 Aβ의 잔기 1-10 내의 에피토프(천연 Aβ지정 1의 첫번째 N 말단 잔기와 함께), 더 바람직하게는 Aβ의 잔기 3-7 내의 에피토프에 결합한다. 몇몇 방법에서, 상이한 에피토프에 대한 반응 특이성을 보유하는 다수의 모노클로날 항체가 사용되며, 예를 들어 Aβ의 잔기 3-7 내의 에피토프에 대해 특이적인 항체에 특이적인 항체는 Aβ의 잔기 3-7의 외부의 에피토프에 대해 특이적인 항체와 함께 동시 투여할 수 있다. 이러한 항체들은 순차적으로 또는 동시에 투여할 수 있다. 또한, Aβ 이외의 다른 아밀로이드 성분에 대한 항체를 사용할 수도 있다(예를 들어, 투여하거나 동시 투여할 수 있다).
항체의 에피토프 특이성은 예를 들어, 상이한 멤버들이 Aβ의 상이한 하위 서열을 디스플레이하는 파지 디스플레이 라이브러리를 형성함으로써 결정할 수 있다. 이어서, 파지 디스플레이 라이브러리는 테스트 중에 항체에 특이적으로 결합하는 멤버에 대해 선택된다. 서열의 패밀리는 분리한다. 전형적으로 이러한 패밀리는 흔한 코어 서열을 함유하며, 상이한 멤버에서 측접 서열의 길이가 달라진다. 상기 항체에 대해 특이적인 결합을 나타내는 가장 짧은 코어 서열은 상기 항체에 의해 한정된 에피토프를 정의한다. 또한, 항체들은 에피토프 특이성이 이미 결정된 항체를 이용하는 경쟁 분석에서 에피토프 특이성에 대해 테스트할 수 있다. 예를 들어, Aβ에 대한 결합에 있어서 12B4 항체와 경쟁하는 항체는 12B4와 동일하거나 유사한 에피토프, 즉 잔기 Aβ3-7내 에피토프에 결합한다. 에피토프 특이성에 대한 항체 스크리닝은 치료 효능의 유용한 예언자이다. 예를 들어, Aβ의 잔기 1-7 내의 에피토프에 결합하는 것으로 결정된 항체는 본 발명의 방법에 따라 알츠하이머병을 예 방 및 치료하는데 효과적인 것으로 생각된다.
Aβ의 다른 영역에 결합하지 않으며 Aβ의 바람직한 절편에 특이적으로 결합하는 항체는 원형의 Aβ에 대해 결합하는 모노클로날 항체 또는 다른 영역 또는 폴리클로날 혈청에 결합하는 항체에 결합하는 모노클로날 항체에 비해 다수의 잇점을 보유한다. 첫째, 동일한 투여량에 있어서, 바람직한 절편에 특이적으로 결합하는 항체의 투여량은 아밀로이드 반점에 효과적인 항체의 더 높은 몰 투여량을 함유한다. 둘째, 바람직한 절편에 특이적으로 결합하는 항체는 원형의 APP 폴리펩티드에 대한 제거 반응을 유도하지 않으면서 아밀로이드 침착물에 대한 제거 반응을 유도함으로써 가능한 부작용을 감소시킬 수 있다.
1. 비인간 항체의 생성
본 발명은 비인간 항체, 예를 들어 본 발명의 바람직한 Aβ 에피토프에 대한 특이성을 보유하는 항체를 특징으로 한다. 이러한 항체는 본 발명의 다양한 치료 조성물을 제제화하는 데 사용할 수 있거나, 바람직하게는 인간화 항체 또는 키메라 항체(후술함)의 생성에 대해 상보성 결정 영역을 제공한다. 비인간 모노클로날 항체, 예를 들어 쥐과동물, 기니 피그, 영장류, 토끼 또는 래트의 모노클로날 항체의 생성은 예를 들어 Aβ를 이용하여 상기 동물을 면역화함으로써 수행할 수 있다. Aβ 또는 Aβ의 면역원성 단편 또는 Aβ에 대한 항체에 대한 항-이디오타입 항체를 포함하는 더 긴 폴리펩티드도 사용할 수 있다(Harlow & Lane, 본원에 참고로 인용한 상기 문헌 참조). 이러한 면역원은 펩티드 합성 또는 재조합 발현에 의해 천연 소스로부터 얻을 수 있다. 필요에 따라, 면역원은 후술하는 바와 같은 담체 단백질 과 융합된 상태 또는 그렇지 않으면 담체 단백질과 복합체를 형성한 상태로 투여할 수 있다. 필요에 따라, 면역원은 보조제와 함께 투여할 수 있다. "보조제"는 항원과 함께 투여하는 경우 항체에 대한 면역 반응을 증가시키나, 단독으로 투여하는 경우 항원에 대한 면역 반응을 생성하지 않는 화합물을 의미한다. 보조제는 림프구 소환, B 세포 및/또는 T 세포 자극 및 대식세포의 자극을 포함하는 몇몇 메카니즘에 의해 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 후술하는 바와 같이 몇몇 유형의 보조제를 사용할 수 있다. 실험 동물의 면역화를 위해서는 프레운트 완전 보조제에 이어 프레운트 불완전 보조제를 사용하는 것이 바람직하다.
전형적으로 토끼 및 기니 피그는 폴리클로날 항체를 생성하기 위해 사용된다. 예를 들어, 수동 보호를 위한 폴리클로날 항체의 예시적인 제조는 다음과 같이 수행할 수 있다. 124마리의 비트랜스게닉 마우스는 Aβ1-42 100 ㎍ + CFA/IFA 보조제로 면역화하고, 4-5개월에 안락사시켰다. 면역화된 마우스로부터 혈액을 수집한다. IgG는 다른 혈액 성분으로부터 분리하였다. 면역원에 대해 특이적인 항체는 친화성 크로마토그래피에 의해 부분적으로 정제할 수 있다. 평균적으로 면역원-특이성 항체 약 0.5-1 mg을 마우스 1 마리당 얻었으며, 총 60-120 mg을 얻었다.
전형적으로 마우스는 모노클로날 항체를 제조하기 위해 사용한다. 모노클로날 항체는 마우스에 Aβ의 단편 또는 더 긴 형태를 주입하고, 하이브리도마를 제조하고, Aβ에 대해 특이적으로 결합하는 항체에 대한 하이브리도마를 스크리닝함으로써 단편에 대해 제조할 수 있다. 필요에 따라, 항체는 Aβ의 다른 비중첩 단편에 결합하지 않으며 Aβ의 특이성 영역 또는 소정 단편에 대한 결합에 대해 스크리닝 한다. 후자의 스크리닝은 Aβ 펩티드의 결실 돌연변이체 수집물에 대한 항체의 결합을 결정하고, 결실 돌연변이체가 항체에 결합하는지 여부를 결정함으로써 수행할 수 있다. 결합은 예를 들어 웨스턴 블롯 또는 ELISA에 의해 평가할 수 있다. 항체에 대한 특이적인 결합을 나타내는 가장 작은 단편은 항체의 에피토프를 의미한다. 또는, 에피토프 특이성은 테스트 항체 및 참조 항체가 Aβ에 대한 결합에 대해 경쟁하는 경쟁 분석에 의해 결정할 수 있다. 테스트 항체 및 참조 항체가 경쟁하는 경우, 이들은 충분히 근접한 동일한 에피토프 또는 에피토프들에 결합하는데, 한 항체의 결합은 다른 항체의 결합을 방해한다. 이러한 항체에 대한 바람직한 아이소타입은 마우스 아이소타입 IgG2a 또는 다른 종의 균등한 아이소타입이다. 마우스 아이소타입 IgG2a는 인간 아이소타입 IgG1의 균등물이다(예를 들어, 인간 IgG1).
2. 키메라 및 인간화 항체
또한, 본 발명은 베타 아밀로이드 펩티드에 대해 특이적인 키메라 항체 및/또는 인간화 항체(즉, 키메라 항체 및/또는 인간화 면역글로불린)에 관한 것이다. 키메라 항체 및/또는 인간화 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체의 구성을 위한 출발 물질을 제공하는 마우스 또는 다른 비인간 항체와 동일하거나 유사한 반응 특이성 및 친화도를 보유한다.
A. 키메라 항체의 생성
"키메라 항체"는 일반적으로 상이한 종에 속하는 면역글로불린 유전자 절편으로부터 유전 공학 기법에 의해 경쇄 및 중쇄 유전자가 구성되는 항체를 의미한다. 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체로부터 유래한 유전자의 가변(V) 절편은 인 간 불변(C) 절편, 예를 들어 IgG1 및 IgG4에 결합할 수 있다. 인간 아이소타입 IgG1이 바람직하다. 따라서, 전형적인 키메라 항체는 마우스 항체로부터 유래한 V 또는 항원 결합 도메인 및 인간 항체로부터 유래한 C 또는 효과기 도메인으로 구성되는 하이브리드 단백질이다.
B. 인간화 항체의 생성
본원에 사용한 용어 "인간화 항체"는 인간 항체(수용체 면역글로불린 또는 항체라 칭함)로부터 실질적으로 유래한 가변부 프레임웍 잔기 및 마우스 항체(공여체 면역글로불린 또는 항체라 칭함)로부터 실질적으로 유래한 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 항체를 의미한다[참조: Queen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989), US 5,530,101, US 5,585,089, US 5,693,761, US 5,693,762, Selick 등, WO 90/07861, 및 Winter, US 5,225,539(이들 문헌 모두는 전적으로 참고 인용한 것이다)]. 또한, 존재하는 경우 불변부(들)는 실질적으로 또는 전체적으로 인간 면역글로불린으로부터 유래한 것이다.
마우스 CDRs의 인간 가변 도메인 프레임웍 내로의 치환은, 인간 가변 도메인 프레임웍이 CDRs이 배향된 마우스 가변 프레임웍에 대해 동일하거나 유사한 형태를 채택하는 경우, 그들의 정확한 공간 배향을 보유할 것으로 생각된다. 이는 프레임웍 서열이 CDRs이 유도되는 쥐과동물 가변 프레임웍 도메인과 높은 정도의 서열 동일성을 나타내는 인간 항체로부터 유래한 인간 가변 도메인을 획득함으로써 달성된다. 중쇄 및 경쇄 가변 프레임웍 영역은 동일하거나 상이한 인간 항체 서열로부터 유래할 수 있다. 인간 항체 서열은 자연 발생하는 인간 항체의 서열일 수 있거나, 몇몇 인간 항체의 컨센선스 서열일 수 있다[참조: Kettleborough 등, Protein Engineering 4: 773 (1991); Kolbinger 등, Protein Engineering 6: 971 (1993) 및 Carter 등, WO 92/22653].
쥐과동물 공여체 면역글로불린 및 적합한 인간 수용체 면역글로불린의 상보성 결정 영역이 확인되었으면, 다음 단계는, 존재하는 경우, 이들 성분들로부터 유래한 잔기가 치환되어 생성된 인간화 항체의 특성을 최적화시켜야만 하는지 여부를 결정한다. 일반적으로, 인간 아미노산 잔기의 쥐과동물 아미노산 잔기로의 치환은 최소화되어야만 하는데, 쥐과동물 잔기의 도입은 인간에서 인간-항-마우스-항체(HAMA) 반응을 유발하는 항체의 위험을 증가시키기 때문이다. 면역 반응을 결정하는 업계 인지된 방법은 특정 환자 또는 임상 시험 중에 HAMA 반응을 모니터링하여 수행할 수 있다. 인간화 항체 투여된 환자는 투여 초기 및 상기 요법 시행 전체를 통해 면역원성 평가를 수행할 수 있다. HAMA 반응은 예를 들어 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 기법(BIACORE) 및/또는 고형 ELISA 분석을 이용하여 환자로부터 취한 혈청 샘플내의 인간화 치료제에 대해 항체를 검출함으로써 측정한다.
인간 가변부 프레임웍 잔기로부터 유래한 특정 아미노산은 CDR 형태 및/또는 항원에 대한 결합에 미치는 그들의 가능한 영향에 기초한 치환에 대해 선택한다. 쥐과동물 CDR과 인간 가변부 영역의 비자연적인 병치는 비자연적인 형태적 구속을 초래할 수 있으며, 이는 특정 아미노산 잔기의 치환에 의해 수정되지 않는 경우, 결합 친화도의 상실을 초래한다.
치환을 위한 아미노산 잔기의 선택은 부분적으로 컴퓨터 모델링에 의해 결정된다. 면역글로불린 분자의 3차원 이미지를 얻기 위한 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어를 본원에 기술한다. 일반적으로, 분자 모델은 면역글로불린 쇄 또는 이의 도메인에 대해 밝혀진 구조로부터 출발하여 제조된다. 모델링하려는 쇄는 밝혀진 3차원 구조의 쇄 또는 도메인과 아미노산 서열 유사성에 대해 비교하고, 가장 큰 서열 유사성을 나타내는 쇄 또는 도메인은 분자 모델의 구성에서 출발점으로 선택된다. 모델링을 위해 50% 이상의 서열 동일성을 공유하는 쇄 또는 도메인을 선택하고, 바람직하게는 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 서열 동일성을 보유하는 서열을 선택한다. 모델링하려는 면역글로불린 쇄 또는 도메인내 실질적인 아미노산과 출발 구조내 아미노산 사이의 차이를 가능하게 하기 위해 밝혀진 출발 구조를 개질한다. 이어서, 개질된 구조는 복합 면역글로불린으로 어셈블링한다. 최종적으로, 상기 모델은 에너지 최소화 및 모든 원자가 서로 적절한 거리 내에 존재하고 결합 길이 및 결합 각이 화학적으로 허용가능한 한계내에 존재하는 것을 확인함으로써 상세히 기술된다.
또한, 치환을 위한 아미노산 잔기의 선택은 특정 위치에서 아미노산의 특성의 조사, 또는 특정 아미노산의 치환 또는 돌연변이유발의 영향의 실험적인 관찰에 의해 부분적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산이 쥐과동물 가변부 프레임웍 잔기와 선택된 인간 가변부 프레임웍 잔기 사이에서 다른 경우, 인간 프레임웍 아미노산 잔기는 상기 아미노산이
(a) 항원을 직접적으로 비공유결합하는 잔기;
(b) CDR에 인접한 잔기;
(c) 그렇지 않으면 CDR 영역(예를 들어, 컴퓨터 모델링에 의해 결정되는 바와 같이 CDR 영역의 약 3-6Å 내)에 상호작용하는 잔기; 및
(d) VL-VH 인터페이스에 참여하는 잔기
인 것이 이성적으로 예견될 때 일반적으로 마우스 항체로부터 균등한 프레임웍 아미노산에 의해 치환되어야 한다.
"항원을 직접적으로 비공유결합하는" 잔기는 예를 들어 수소 결합, 반데르 바알스 힘, 소수성 상호작용 등과 같은 확립된 화학력에 따라 항원 상의 아미노산과 직접적으로 상호작용하는 양호한 가능성을 보유한 프레임웍 영역내 위치의 아미노산을 포함한다.
CDR 및 프레임웍 영역은 문헌(Kabat 등, 또는 Chothia 등, 상기 문헌 참조)에 의해 정해지는 바와 같다. Kabat 등(상기 문헌 참조)에 의해 정의된 바와 같이 프레임웍 잔기가 Chothia 등(상기 문헌 참조)에 의해 정의된 바와 같은 구조 루프 잔기를 구성하는 경우, 마우스 항체 내에 존재하는 아미노산은 인간화 항체내로의 치환을 위해 선택된다. "CDR 영역에 인접한" 잔기는 인간화 면역글로불린 쇄의 1차 서열에 CDRs중 하나 이상에 가장 인접한 위치, 예를 들어 Kabat에 의해 정의된 바와 같은 CDR 또는 Chothia에 의해 정의된 바와 같은 CDR에 가장 인접한 위치에서 아미노산 잔기를 포함한다[참조: 예를 들어, Chothia 및 Lesk JMB 196: 901 (1987)]. 이들 아미노산은 특히 CDRs 내의 아미노산과 상호작용할 것으로 생각되며, 수용체로부터 선택되는 경우, 공여체 CDRs을 뒤틀어 친화도를 감소시킬 것으로 생각된다. 더구나, 인접한 아미노산은 항원과 직접적으로 상호작용할 수 있으며[참조: Amit 등, Science 233: 747 (1986), 본원에 참고로 인용함], 공여체로부터 이들 아미노산을 선택하는 것은 원래의 항체에서 친화도를 제공하는 모든 항원의 접촉을 유지하는 데 바람직할 수 있다.
"그렇지 않으면 CDR 영역과 상호작용하는" 잔기는 CDR 영역에 영향을 미치기에 충분한 공간 배치로 존재하는 제2 구조 분석에 의해 결정된 것을 포함한다. 한 구체예에서, "그렇지 않으면 CDR 영역과 상호작용하는" 잔기는 공여체 면역글로불린의 3차원 모델(예를 들어, 컴퓨터-생성된 모델)을 분석함으로써 확인된다. 전형적으로 원래의 공여체 항체의 3차원 모델은 CDRs 외부의 특정 아미노산이 CDRs에 근접하고, 수소 결합, 반데르 바알스 힘, 소수성 상호작용 등에 의해 CDRs 내의 아미노산과 상호작용하는 양호한 가능성을 보유하는 것을 나타낸다. 이들 아미노산 위치에서, 수용체 면역글로불린 아미노산 보다는 오히려 공여체 면역글로불린 아미노산이 선택될 수 있다. 이 조건에 따른 아미노산은 일반적으로 CDRs내의 일부 원자의 약 3 옹스트롬 단위(Å) 내의 측쇄 원자를 보유할 것이며, 상기 목록화한 것과 같이 확립된 화학력에 따라 CDR 원자와 상호작용할 수 있는 원자를 함유하여야만 한다.
수소 결합을 형성할 수 있는 원자의 경우, 3 Å은 그들의 핵 사이에서 측정하나, 결합을 형성하지 않는 원자들의 경우, 3 Å은 그들의 반데르 바알스 표면 사이에서 측정한다. 따라서, 후자의 경우, 상호작용할 수 있는 것으로 고려되는 원자의 경우 핵은 약 6 Å(3 Å + 반데르 바알스 반경의 합) 내에 존재하는 것이 확실 하다. 다수의 경우, 핵은 4 또는 5-6 Å 떨어져 존재할 것이다. 아미노산이 CDRs과 상호작용할 수 있는지 여부를 결정함에 있어서, CDRs의 부분으로서 중쇄 CDR2의 최종 8개의 아미노산은 고려하지 않는 것이 바람직한데, 그 이유는 구조의 견지에서 이들 8개의 아미노산은 프레임웍의 일부로서 거동하기 때문이다.
CDRs내 아미노산과 상호작용할 수 있는 아미노산은 다른 방법으로 확인할 수도 있다. 각 프레임웍 아미노산의 용매 접근가능한 표면적은 두가지 방법으로 계산된다: (1) 원형의 항체 내에서 및 (2) 제거된 CDRs을 보유하는 항체로 구성되는 가상 분자 내에서. 이들 수치에서 약 10 Å2 이상의 유의적인 차이는 용매에 대한 프레임웍 아미노산의 접근은 CDRs에 의해 적어도 부분적으로 차단되며, 따라서 아미노산은 CDRs과 접촉하게 된다. 아미노산의 용매 접근가능한 표면적은 당업계에 공지된 알고리즘[참조: 예를 들어, Connolly, J. Appl. Cryst. 16: 548 (1983) 및 Lee 및 Richards, J. Mol. Biol. 55: 379 (1971), 둘 다 본원에 참고 인용함]을 이용하여 항체의 3차원 모델에 기초하여 계산할 수 있다. 또한, 프레임웍 아미노산은 CDRs과 접촉하는 다른 프레임웍 아미노산의 형태에 영향을 미침으로써 종종 CDRs와 간접적으로 상호작용한다.
프레임웍내 몇몇 위치에서의 아미노산은 다수의 항체에서 CDRs과 상호작용할 수 있다[참조: Chothia 및 Lesk, 상기 문헌 참조, Chothia 등, 상기 문헌 참조 및 Tramontano 등, J. Mol. Biol. 215: 175 (1990), 모두 본원에 참고 인용함]. 특히 경쇄의 위치 2, 48, 64 및 71 및 중쇄의 위치 26-30, 71 및 94(Kabat 넘버링에 따 름)의 아미노산은 다수의 항체에서 CDRs과 상호작용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 경쇄의 위치 35 및 중쇄의 위치 93 및 103의 아미노산은 CDRs과 상호작용하는 것으로 생각된다. 이들 모든 위치에서, 인간화 면역글로불린내에 존재하는 수용체 아미노산(그들이 상이한 경우) 보다는 오히려 공여체 아미노산을 선택하는 것이 바람직하다. 한편, CDR 영역과 상호작용할 수 있는 특정 잔기, 예를 들어 경쇄의 최초 5개의 아미노산은 종종 인간화 면역글로불린에서 친화도의 상실없이 수용체 면역글로불린으로부터 선택될 수 있다.
"VL-VH 인터페이스에 참여하는" 잔기 또는 "팩킹 잔기"는 예를 들어 문헌[참조: Novotny 및 Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4592-66 (1985) 또는 Chothia 등, 상기 문헌 참조]에 정의된 바와 같이 VL과 VH 사이의 인터페이스에서의 잔기를 포함한다. 일반적으로, 일반적이지 않은 팩킹 잔기는, 이들이 인간 프레임웍내의 잔기와 상이한 경우, 인간 항체내에 보유되어야만 한다.
일반적으로, 상기한 조건을 충족시키는 아미노산중 하나 이상은 치환된다. 몇몇 구체예에서, 상기 조건을 충족시키는 아미노산중 대부분의 아미노산 또는 모든 아미노산은 치환된다. 종종, 특정 아미노산이 상기 조건을 충족시키는지 여부에 관해 약간의 모호성이 존재하며, 대안적인 변이체 면역글로불린이 생성되고, 그중 하나는 특정 치환을 보유하며, 다른 하나는 보유하지 않는다. 이렇게 생성된 대안적인 변이체 면역글로불린은 소정 활성에 대해 본원에 기술된 임의의 분석법으로 테스트하여 바람직한 면역글로불린을 테스트할 수 있다.
통상적으로, 인간화 항체내 CDR 영역은 실질적으로 동일하며, 공여체 항체의 상응하는 CDR 영역과 동일한 것이 더 일반적이다. 일반적으로 바람직하지 않음에도 불구하고, 생성된 인간화 면역글로불린의 결합 친화도에 상당히 영향을 미치지 않고 CDR 잔기의 하나 이상의 보존적 아미노산 치환이 종종 가능하다. 보존적 치환의 조합의 예로는 gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; 및 phe, tyr을 들 수 있다.
다른 치환 후보는 그 위치에서 인간 면역글로불린에 대해 "희귀한" 또는 일반적이지 않은 수용체 인간 프레임웍 아미노산이다. 이들 아미노산은 마우스 공여체 항체의 균등한 위치로부터 유래한 아미노산 또는 더 전형적인 인간 면역글로불린의 균등한 위치로부터 유래한 아미노산으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 치환은, 수용체 면역글로불린의 인간 프레임웍 영역내의 아미노산이 그 위치에 대해 희귀하고, 공여체 면역글로불린내 상응하는 아미노산이 인간 면역글로불린 서열내 그 위치에 대해 통상적인 경우; 또는 수용체 면역글로불린내 아미노산이 그 위치에서 희귀하고, 공여체 면역글로불린내 상응하는 아미노산도 다른 인간 서열에 대해 희귀한 경우, 바람직할 수 있다. 이들 조건은 인간 프레임웍 내에서 전형적이지 않은 아미노산이 항체 구조를 붕괴시키지 않는 것을 보장하는 데 도움을 준다. 더구나, 일반적이지 않은 인간 수용체 아미노산을 인간 항체에 대해 전형적인 것으로 나타나는 공여체 항체로부터 유래한 아미노산으로 치환함으로써 인간화 항체를 더 면역원성으로 만들 수 있다.
"희귀한(rare)"은 대표적인 서열 샘플내 그 위치에서 약 20% 미만, 일반적으로 약 10% 미만으로 발생하는 아미노산을 의미하며, "흔한(common)"은 대표적인 샘 플에서 약 25% 이상, 일반적으로 약 50% 이상 발생하는 아미노산을 의미한다. 예를 들어, 모든 인간 경쇄 및 중쇄 가변부 서열은 각각 특정 임계 위치에서 동일한 아미노산을 보유하고 서로 특이적으로 상동성인 서열의 "하위군"으로 분류된다(Kabat 상기 문헌 참조). 인간 수용체 서열내 아미노산이 인간 서열 중에서 "희귀한" 것인지 "흔한" 것인지 결정하는 경우, 종종 수용체 서열과 동일한 하위군 내에서 인간 서열만을 고려하는 것이 바람직할 수 있다.
추가 치환 후보는 Chothia 등(상기 문헌 참조)에 의해 제안된 대안적인 한정 하에서 CDR 영역의 부분으로서 확인된 수용체 인간 프레임웍 아미노산이다. 추가 치환 후보는 AbM 및/또는 한정 하에서 CDR 영역의 부분으로서 확인된 수용체 인간 프레임웍 아미노산이다.
추가 치환 후보는 희귀하거나 일반적이지 않은 공여체 프레임웍 잔기에 상응하는 수용체 프레임웍 잔기이다. 희귀하거나 일반적이지 않은 공여체 프레임웍 잔기는 그 위치에서 쥐과동물 항체에 대해 (상기 정의한 바와 같은) 희귀하거나 일반적이지 않은 잔기이다. 쥐과동물 항체의 경우, 하위군은 Kabat 및 컨센서스와는 상이한 확인된 잔기 위치에 따라 결정될 수 있다. 이들 공여체 특이성 차이는 활성을 증강시키는 쥐과동물 서열내의 체세포 돌연변이를 의미하는 것일 수 있다. 결합에 영향을 미칠 것으로 예상되는 일반적이지 않은 잔기는 보유되는 반면, 결합을 위해 중요하지 않은 것으로 예상되는 잔기는 치환될 수 있다.
추가 치환 후보는 수용체 프레임웍 영역 내에서 발생하는 비-배계열 잔기이다. 예를 들어, 수용체 항체 쇄(즉, 공여체 항체 쇄와 상당한 서열 동일성을 공유 하는 인간 항체 쇄)가 배계열 항체 쇄(유사하게 공여체 쇄와 상당한 서열 동일성을 공유함)에 정렬되는 경우, 수용체 쇄 프렘임웍과 배계열 쇄 프레임웍 사이에서 정합하지 않는 잔기는 배계열 서열로부터 유래한 상응하는 잔기로 치환될 수 있다.
상기한 특이성 아미노산 치환 이외에, 일반적으로 인간화 면역글로불린의 프레임웍 잔기는 실질적으로 동일하며, 그들이 유도된 인간 항체의 프레임웍 영역에 동일한 것이 더 일반적이다. 물론, 프레임웍 영역내 아미노산중 다수의 아미노산은 항체의 특이성 또는 친화도에 거의 기여하지 않거나 직접적으로 기여하지 않는다. 따라서, 프레임웍 잔기의 다수의 개별적인 보존적 치환은 생성된 인간화 면역글로불린의 특이성 또는 친화도의 상당한 변화 없이 용인될 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 인간화 면역글로불린의 가변 프레임웍 영역은 인간 가변 프레임웍 영역 서열 또는 그러한 서열들의 컨센서스에 대해 85% 이상의 서열 동일성을 공유한다. 다른 구체예에서, 인간화 면역글로불린의 가변 프레임웍 영역은 인간 가변 프레임웍 영역 서열 또는 그러한 서열들의 컨센서스에 대해 90% 이상, 바람직하게는 95%, 더 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다. 그러나, 일반적으로, 이러한 치환이 바람직한 것은 아니다.
인간화 항체는 107, 108, 109 또는 1010 M-1 이상의 항원에 대한 특이적인 결합 친화도를 나타내는 것이 바람직하다. 일반적으로, 항원에 대한 인간화 항체 결합 친화도의 상한은 공여체 면역글로분닌의 결합 친화도의 3배, 4배 또는 5배 내에 있다. 또한, 종종 결합 친화도의 하한은 공여체 면역글로불린의 결합 친화도의 3 배, 4배 또는 5배 내에 있다. 또는, 결합 친화도는 치환을 보유하지 않는 인간화 항체의 결합 친화도와 비교할 수 있다(예를 들어, FR 치환 미보유 항체를 제외하고 공여체 CDRs 및 수용체 FRs을 보유하는 항체). 이러한 경우, 최적화된 항체(치환을 보유함)의 결합은 미치환 항체의 결합 보다 2배 이상 내지 3배 이상, 또는 3배 내지 4배 이상 더 큰 것이 바람직하다. 비교를 위해, 여러가지 항체의 활성은 예를 들어 BIACORE(즉, 미표지 시약을 이용하는 표면 플라스몬 공명) 또는 경쟁 결합 분석에 의해 결정할 수 있다.
C. 인간화 12B4 항체의 생성
본 발명의 바람직한 구체예는 특히 본원에 기술한 치료 및/또는 진단 방법에 사용하기 위해, Aβ의 N-말단에 대한 인간화 항체에 관한 것이다. 인간화 항체를 제조하기 위해 특히 바람직한 출발 물질은 12B4이다. 12B4는 Aβ의 N-말단에 특이적이며, 아밀로이드 반점의 식세포작용을 매개(예를 들어, 식세포작용 유도)하는 것으로 확인되어 왔다. 12B4 항체 중쇄 및 경쇄 가변부를 암호화하는 cDNA의 클로닝 및 서열결정은 실시예 I에 기술하였다.
적합한 인간 수용체 항체 서열은 마우스 가변부의 아미노산 서열과 공지된 인간 항체의 서열을 컴퓨터를 이용하여 비교함으로써 확인한다. 이러한 비교는 중쇄 및 경쇄에 대해 별도로 수행되나, 각각에 대한 원칙은 유사하다. 구체적으로, 프레임웍 서열이 쥐과동물 VL 및 VH 프레임웍 영역과 높은 정도의 서열 동일성을 나타내는 인간 항체로부터 유래한 가변 도메인은 각각의 쥐과동물 프레임웍 서열을 보유한 NCBI BLAST(NIH NCBI 인터넷 서버를 통해 공개적으로 접속가능함)를 이용하 여 Kabat 데이터베이스의 질문란을 통해 확인하였다. 한 구체예에서, 쥐과동물 공여체 서열과 50% 이상의 서열 동일성을 공유하는 수용체 서열을 선택한다. 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 서열 동일성을 공유하는 수용체 항체 서열을 선택하는 것이 바람직하다.
12B4의 서열 비교를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 12B4 경쇄는 아형 카파 II의 인간 경쇄에 대해 가장 큰 서열 동일성을 나타내며, Kabat 등에 의해 정의된 바와 같이, 12B4 중쇄는 아형 II의 인간 중쇄에 대해 가장 큰 서열 동일성을 나타냈다. 따라서, 경쇄 및 중쇄 인간 프레임웍 영역은 이들 아형의 인간 항체 또는 이러한 아형들의 컨센서스 서열로부터 유도하는 것이 바람직하다. 12B4로부터 유래한 상응하는 영역에 대해 가장 큰 서열 동일성을 나타내는 바람직한 경쇄 인간 가변부는 Kabat ID No. 005036을 보유하는 항체로부터 유래한 것이다. 12B4로부터 유래한 상응하는 영역에 대해 가장 큰 서열 동일성을 보유하는 바람직한 중쇄 인간 가변부는 Kabat ID No. 000333을 보유하는 항체로부터 유래한 것이며, 진뱅크 등록 번호 AAB35009를 보유하는 항체, 및 Kabat ID No. 000333을 보유하는 항체를 가진 진뱅크 등록 번호 AAD53816을 보유하는 항체가 더 바람직하다.
다음으로, 치환을 위해 잔기를 다음과 같이 선택한다. 아미노산이 12B4 가변 프레임웍 영역과 균등한 인간 가변 프레임웍 영역 사이에서 상이한 경우, 인간 프레임웍 아미노산은, 상기 아미노산이
(a) 항원을 직접적으로 비공유결합하는 아미노산,
(b) CDR 영역에 인접한 아미노산, Chothia 등(상기 문헌 참조)에 의해 제한 된 대안적인 한정 하에서 CDR 영역의 일부분인 아미노산, 또는 그렇지 않으면 CDR 영역과 상호작용하는 아미노산(예를 들어, CDR 영역의 약 3 Å 내에 존재하는 아미노산) 또는
(c) VL-VH 인터페이스에 참여하는 아미노산
인 경우, 균등한 마우스 아미노산에 의해 일반적으로 치환되어야 한다.
12B4 항체 중쇄 및 경쇄 가변부의 컴퓨터 모델링 및 12B4 항체의 인간화는 실시예 V에 기술하였다. 개략적으로, 3차원 모델은 중쇄 및 경쇄에 대해 가장 최근에 밝혀진 쥐과동물 항체 구조에 기초하여 생성된다. 또한, 상기 모델은 바람직하지 않은 원자 접촉을 완화하고 정전기적 상호작용과 반데르 바알스 상호작용을 최적하기 위한 일련의 에너지 최소화 단계에 의해 추가로 상세히 설명된다.
본원에 기술한 항체에 대한 3차원 구조 정보는 예를 들어, Research Collaboratory for Structural Bioinformatics' Protein Data Bank(PDB)로부터 공개적으로 이용할 수 있다. PDB는 월드 와이드 웹 인터넷을 통해 자유롭게 접속할 수 있으며, 문헌[참조: Berman 등, Nucleic Acids Research, 28: 235 (2000)]에 기술되어 있다. 컴퓨터 모델링은 CDR-상호작용 잔기의 확인을 가능하게 해준다. 12B4의 구조의 컴퓨터 모델은 인간 프레임웍 구조내에 치환된 12B4 상보성 결정 영역을 함유하는 항체의 3차원 구조를 예상하기 위한 출발점으로 작용할 수 있다. 추가의 아미노산 치환이 도입되는 경우, 구조를 나타내는 추가 모델을 구성할 수 있다.
일반적으로, 상기 조건을 충족시키는 아미노산중 하나, 대부분 또는 모두의 치환이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 인간화 항체는 일반적으로 선택된 위치중 1, 2, 3 이상에서 상응하는 12B4 잔기를 가진 인간 경쇄 프레임웍 잔기의 치환을 함유할 것이다. 또한, 일반적으로 인간화 항체는 선택된 위치의 1, 2, 3 이상에서 상응하는 12B4 잔기를 가진 인간 중쇄 프레임웍 잔기의 치환을 함유한다.
그러나, 때로는 특정 아미노산이 상기 조건을 충족시키는 지 여부에 관해 약간의 모호함이 존재하고, 대안적인 변이체 면역글로불린이 생성되며, 이들 중 하나는 특정 치환을 보유하고, 다른 하나는 보유하지 않는다. 쥐과동물 잔기로의 치환이 특정 위치에서 인간 면역글로불린 내에서 희귀한 잔기를 도입하는 경우, 특정 치환을 수반하거나 수반하지 않으면서 활성에 대해 항체를 테스트하는 것이 바람직할 수 있다. 활성(예를 들어, 결합 친화도 및/또는 결합 특이성)이 치환을 수반하거나 수반하지 않으면서 거의 동일한 경우, 치환을 수반하지 않는 항체가 바람직할 수 있는데, 그 이유는 본원에 기술한 바와 같이 HAMA 반응을 덜 유발하는 것으로 생각되기 때문이다.
다른 치환 후보는 그 위치에서 인간 면역글로불린에 있어서 일반적이지 않은 수용체 인간 프레임웍 아미노산이다. 이들 아미노산은 더 전형적인 인간 면역글로불린의 균등한 위치로부터 유래한 아미노산으로 치환될 수 있다. 대안으로, 마우스 12B4내의 균등한 위치로부터 유래한 아미노산은, 그러한 아미노산이 균등한 위치에서 인간 면역글로불린의 전형인 경우, 인간 프레임웍 영역내로 도입될 수 있다.
다른 치환 후보는 프레임웍 영역 내에서 발생하는 비-배계열 잔기이다. 12B4와 공지된 배계열 서열에 대해 컴퓨터를 이용한 비교를 수행함으로써, 중쇄 또는 경쇄에 가장 높은 정도의 서열 동일성을 보유하는 배계열 서열을 확인할 수 있다. 프레임웍 영역과 배계열 서열의 정렬은 어떤 잔기가 상응하는 배계열 잔기로의 치환을 위해 선택될 수 있는지 밝혀줄 것이다. 선택된 경쇄 수용체 프레임웍과 이들 배계열 서열중 하나 사이에서 정합하지 않는 잔기는 상응하는 배계열 잔기로의 치환을 위해 선택될 수 있다.
표 1은 12B4 VH 및 VL 영역의 서열 분석을 요약한 것이다. 12B4 항체 및 추가의 인간 항체의 컴퓨터 모델링을 위해 사용될 수 있는 추가의 마우스 및 인간 구조 뿐만 아니라 아미노산 치환을 선택하는 데 사용할 수 있는 배계열 서열도 하기 표 1에 기술한다. 희귀한 마우스 잔기는 공여체 VL 및/또는 VH 서열과 공여체 VL 및/또는 VH 서열이 속하는(Kabat에 따름) 하위군의 다른 멤버의 서열을 비교하고, 컨센서스와 상이한 잔기 위치를 확인함으로써 확인된다. 이들 공여체 특이적인 차이는 활성을 증가시키는 체세포 돌연변이를 의미할 수 있다. 결합 부위에 근접한 일반적이지 않거나 희귀한 잔기는 항원과 접촉할 수 있으며, 이는 마우스 잔기를 보유하는 것을 바람직하게 만든다. 그러나, 일반적이지 않은 마우스 잔기가 결합을 위해 중요하지 않은 경우, 상응하는 수용체 잔기를 이용하는 것이 바람직한데, 그 이유는 마우스 잔기는 인간화 항체에서 면역원성 신에피토프(neoepitope)를 생성할 수 있기 때문이다. 공여체 서열 내에서 일반적이지 않은 잔기가 실질적으로 상응하는 수용체 서열 내에서 흔한 잔기인 상황에서, 바람직한 잔기는 명백하게 수용체 잔기이다.
12B4V 영역 서열의 요약
쇄 VL VH
마우스 아군 II Ib
인간 아군 II II
희귀 아미노산(%빈도) K107(0.542%) T3, I11, L12, F24, S41, N75, D83, A85
Chothia 정규 부류 L1: ～부류
4[1rmf]
L2: 부류 1[1lmk]
L3: 부류 1[1tet]		 H1: 부류 3[1 ggi]
H2: ～부류 1
최접 마우스 MAb 밝혀진 구조 2PCP(2.2Å) 1ETZ(2.6Å)
모델링 주형과의 상동성 94% 80%
인간 프레임웍 서열 KABID 005036 1-KABID 000333
2-AAB35009/1F7
3-AAD53816
Hu Fr에 대한 배계열 ref A3/x12690 &
A19/X63397		 1: VH4-39/AB019439/
BAA75036.1
2: VH2-5/AB019440/
BAA75057.1
본원에서 참조한 Kabat ID 서열은 예를 들어 Northwest University Biomedical Engineering Department's Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest로부터 공개적으로 이용할 수 있다. 본원에 기술한 항체에 대한 3차원 구조 정보는 예를 들어 Research Collaboratory for Structural Bioinformatics' Protein Data Bank(PDB)로부터 공개적으로 이용할 수 있다. PDB는 월드 와이드 웹 인터넷을 통해 자유롭게 접속할 수 있으며, 문헌[참조: Berman 등, Nucleic Acids Research, 28: 235 (2000)]에 기술되어 있다. 본원에서 참조한 배계열 유전자 서열, 예를 들어 Igh, Ig 카파 및 Ig 람다 배계열 V 유전자를 수집한 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 서열 데이타 베이스로부터 공개적으로 이용할 수 있다(NIH(National Institutes of Health)의 NLM(National Library of Medicine) 디비젼). NCBI "Ig 배계열 유전자" 데이타베이스의 상동성 조사는 IgG BLAST(상표명)에 의해 제공된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 인간화 항체는 (i) 쥐과동물 12B4 VL CDRs을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 경쇄로서, 상기 프레임웍은 상응하는 12B4 잔기로 치환된 하나 이상의 잔기를 보유하는 경쇄 및 (ii) 12B4 VH CDRs 및 인간 수용체 프레임웍을 포함하는 중쇄로서, 상기 프레임웍은 상응하는 12B4 잔기로 치환된 하나 이상, 바람직하게는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개의 잔기 및 필요에 따라 상응하는 인간 배계열 잔기로 치환된 하나 이상, 바람직하게는 2개 또는 3개의 잔기를 보유하는 중쇄를 함유한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 인간화 항체는 기술한 바와 같은 구조적 특성을 보유하며, 또한 후술하는 활성중 하나 이상(바람직하게는 2개, 3개, 4개 또는 모두)의 활성을 보유한다: (1) 가용성 Aβ에 결합하는 활성; (2) 응집된 Aβ1-42에 결합하는 활성(예를 들어, ELISA에 의해 결정된 바와 같음); (3) 반점내 Aβ에 결합하는 활성(예를 들어, AD 및/또는 PDAPP 반점의 염색); (4) 키메라 12b4와 비교하여 2배-3배 더 높은 반응 친화도로 Aβ에 결합하는 활성(예를 들어, 쥐과동물 가변부 서열 및 인간 불변부 서열을 보유하는 12B4); (5) Aβ의 식세포 작용을 매개하는 활성(예를 들어, 본원에 기술한 바와 같이 생체외 식세포작용 분석에서); 및 (6) 혈액-뇌 배리어를 횡단하는 활성(예를 들어, 본원에 기술한 바와 같이, 예를 들어 PDAPP 동물 모델에서 단기 뇌 국부화를 입증함).
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 인간화 항체는 본원에 기술한 바와 같 은 구조적 특징을 보유하는데, 후술하는 생체내 효과중 하나 이상을 유발하기에 충분한 친화도 또는 방식으로 Aβ를 결합한다: (1) Aβ 반점 존재량을 감소시키는 효과; (2) 반점 형성을 예방하는 효과; (3) 가용성 Aβ의 수준을 감소시키는 효과; (4) 아밀로이드형성성 질환과 관련된 신경염성 병리학을 감소시키는 효과; (5) 아밀로이드형성성 질환과 관련된 하나 이상의 생리학적 증후를 감소시키거나 경감하는 효과; 및/또는 (6) 인식 기능을 개선시키는 효과.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 인간화 항체는 본원에 기술한 바와 같은 구조적 특징을 보유하며, Aβ의 잔기 3-7을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 인간화 항체는 본원에 기술한 바와 같은 구조적 특징을 보유하며, Aβ내의 N-말단 에피토프에 결합하며(예를 들어, Aβ의 아미노산 3-7 내의 에피토프에 결합하며), (1) Aβ펩티드 레벨; (2) Aβ 반점 존재량; 및 (3) 아밀로이드형성성 질환과 관련된 신경염성 존재량 또는 신경염성 영양장애를 감소시킬 수 있다.
상기한 활성들은 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 여러 가지 방법중 임의의 방법(예를 들어, 결합 분석, 식세포작용 분석 등)을 이용하여 결정할 수 있다. 활성은 생체내(예를 들어, 표지된 분석 성분 및/또는 영상화 기법을 이용함) 또는 시험관내(예를 들어, 개체로부터 유도된 샘플이나 시험편을 이용함) 분석할 수 있다. 활성들은 직접적으로 또는 간접적으로 분석할 수 있다. 특정의 바람직한 구체예에서, 신경학적 종말점(예를 들어, 아밀로이드 존재량, 신경염성 존재량 등)이 분석된다. 이러한 종말점은 비-침입성 검출 방법을 이용하여 살아있는 개체에서(예를 들어, 알츠하이머병의 동물 모델 또는 인간 개체, 예를 들어 면역요법을 수행중인 인간 개체에서) 분석될 수 있다. 또는, 이러한 종말점은 개체 사후에 분석될 수도 있다. 동물 모델 및/또는 사후 인간 개체에서 이러한 종말점의 분석은 유사한 면역치료적 용도에서 유용한 여러가지 제제(예를 들어, 인간화 항체)의 유효성을 평가하는데 유용하다. 다른 바람직한 구체예에서, 행동 매개변수 또는 신경학적 매개변수는 신경병리학적 활성 또는 종말점의 지시자로서 평가할 수 있다.
3. 가변부의 생성
인간화 면역글로불린의 CDR 및 프레임웍 성분을 개념적으로 선택한 다음, 여러가지 방법을 이용하여 이러한 면역글로불린을 생성할 수 있다. 코드의 축퇴성으로 인해, 다양한 핵산 서열이 각각의 면역글로불린 아미노산 서열을 암호화할 것이다. 소정 핵산 서열은 드 노보 고형상 DNA 합성 또는 소정 폴리뉴클레오티드의 초기 제조된 변이체의 PCR 돌연변이유발에 의해 생성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 매개된 돌연변이유발이 표적 폴리펩티드 DNA의 치환, 결실 및 삽입 변이체를 제조하기 위한 바람직한 방법이다[참조: Adelman 등, DNA 2: 183 (1983)]. 개략적으로, 표적 폴리펩티드 DNA는 1본쇄 DNA 주형에 소정 돌연변이를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 하이브리드화함으로써 변경된다. 하이브리드화후, DNA 폴리머라제를 이용하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 혼입하는 주형의 전체적인 제2 상보성 가닥을 합성하고, 표적 폴리펩티드 DNA 내의 선택된 변경을 암호화한다.
4. 불변부의 선택
상기한 바와 같이 생성된 항체의 가변 절편(예를 들어, 키메라 항체 또는 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 가변부)은 전형적으로 면역글로불린 불변부(Fc 영역), 전형적으로 인간 면역글로불린 불변부의 적어도 일부분에 연결된다. 인간 불변 DNA 서열은 널리 알려진 과정을 이용하여 여러가지 인간 세포로부터 분리할 수 있으나, 불멸화 B 세포로부터 분리하는 것이 바람직하다[참조: Kabat 등, 상기 문헌 참조, 및 Liu 등, WO87/02671, 이들 각각은 본원에 단지 참고로 인용함]. 보통, 상기 항체는 경쇄 및 중쇄 불변부 둘 다를 함유할 것이다. 중쇄 불변부는 일반적으로 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 CH4 영역을 포함한다. 본원에 기술된 항체는 모든 유형의 불변부를 보유하는 항체, 예를 들어 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE 및 임의의 아이소타입, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 항체(예를 들어, 인간화 항체)가 세포독성 활성을 나타내는 것이 바람직한 경우, 불변부는 일반적으로 보체 고정 불변 도메인이며, 전형적으로 IgG1 부류이다. 인간 아이소타입 IgG1이 바람직하다. 경쇄 불변부는 람다 또는 카파일 수 있다. 인간화 항체는 하나 이상의 부류 또는 아이소타입으로부터 유래한 서열을 포함한다. 항체는 별개의 중쇄, 경쇄로서, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv로서 또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 스페이서를 통해 연결된 단일쇄 항체로서 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 함유하는 4량체로서 발현될 수 있다.
5. 재조합 항체의 발현
키메라 및 인간화 항체는 전형적으로 재조합 발현에 의해 생성된다. 경쇄 및 중쇄 가변부를 암호화하며, 필요에 따라 불변부에 연결된 핵산은 발현 벡터 내로 삽입된다. 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터내로 클로닝될 수 있다. 면역글로불린 쇄를 암호화하는 DNA 절편은 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들)내의 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 발현 조절 서열의 예로는 프로모터(예를 들어, 자연적으로 결합된 프로모터 또는 이종 프로모터), 신호 서열, 인핸서 서열 및 전사 종결 서열을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염할 수 있는 벡터내의 진핵 프로모터 시스템이다. 일단 벡터가 적합한 숙주 내로 혼입되면, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 높은 발현 및 교차반응 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에서 유지한다.
이들 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체 내에서 에피좀 또는 숙주 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제할 수 있다. 통상적으로, 발현 벡터는 선택 마커(예를 들어, 앰피실린 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자 또는 네오마이신 내성 유전자)를 함유하여 소정 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 가능하게 한다(참조: 예를 들어, Itakura 등, 미국 특허 제4,704,362호).
이. 콜라이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA 서열)를 클로닝하기 위해 특히 유용한 원핵 숙주이다. 사용하기에 적합한 다른 미생물 숙주로는 바실러스, 예를 들어 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 엔테로박테리아, 예를 들어 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 여러가지 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 들 수 있다. 이들 원핵 숙주에서, 한 숙주는 숙주 세포와 상용 성인 발현 조절 서열(예를 들어, 복제 원점)을 전형적으로 함유할 것이다. 또한, 널리 알려진 다수의 프로모터, 예를 들어 락토즈 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터 유래한 프모모터 시스템이 존재할 것이다. 상기 프로모터는 전형적으로 발현을 조절하는데, 필요에 따라서는 오퍼레이터 서열과 함께 조절하며, 리보좀 전사와 번역을 개시 및 완료하기 위해 리보좀 결합 부위 서열을 보유한다.
또한, 다른 미생물, 예를 들어 효모도 발현을 위해 유용하다. 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터), 복제 원점, 종결 서열 등을 함유하는 벡터를 보유하는 사카로마이세스(Saccharomyces)는 바람직한 효모이다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 당분해 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 다른 것들 중에서 알콜 데히드로게나제, 아이소시토크롬 C 및 말토즈와 갈락토즈 이용에 관여하는 효소로부터 유래한 프로모터를 포함한다.
유기체 이외에, 포유류 조직 세포 배양물을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드(예를 들어, 면역글로불린 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)를 발현하고 생성시킬 수 있다[참조: Winnacker, Form Genes to Clones, VCH 출판 뉴욕 뉴욕 (1987)]. 진핵 세포가 실질적으로 바람직한데, 그 이유는 이종 단백질(예를 들어, 원형의 면역글로불린)을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 당업계에서 개발되어 왔기 때문이며, 그 예로는 CHO 세포주, 여러가지 Cos 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는 골수종 세포주 또는 형질전환된 B-세포 또는 하이브리도마를 들 수 있다. 상기 세포들은 비인간인 것이 바람직하다. 이들 세포를 위한 발현 벡 터는 발현 조절 서열, 예를 들어 복제 원점, 프로모터 및 인핸서를 포함하며[참조: Queen 등, Immunol. Rev. 89: 49 (1986)], 필요한 프로세싱 정보 부위, 예를 들어 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결자 서열을 포함한다. 바람직한 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 사이토메갈로바이러스 등으로부터 유도된 프로모터이다[참조: Co 등, J. Immunol. 148: 1149 (1992)].
또는, 항체-암호 서열은 트랜스게닉 동물의 게놈 내로의 도입 및 트랜스게닉 동물의 밀크 내에서의 발현을 위해 트랜스유전자내에 혼입될 수 있다(참조: 예를 들어, Deboer 등, US 5,741,957, Rosen, US 5,304,489 및 Meade 등, US 5,849,992). 적합한 트랜스유전자는 유선 특이성 유전자, 예를 들어 카제인 또는 베타 락토글로빈으로부터 유래한 프로모터 및 인핸서와의 작동 가능한 연결부에서 경쇄 및/또는 중쇄에 대한 암호 서열을 포함한다.
소정의 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 중쇄 및 경쇄 암호화 서열 및 발현 조절 서열)을 함유하는 벡터는 널리 알려진 방법(사용하는 방법은 세포성 숙주의 유형에 따라 달라짐)에 의해 숙주 세포 내로 전달할 수 있다. 예를 들어, 칼슘 클로라이드 형질감염은 원핵 세포의 경우 흔히 사용되는 방법인 반면, 칼슘 포스페이트 처리, 전기천공법, 리포펙션, 바이오리스틱 또는 바이러스 기초한 형질감염은 다른 세포성 숙주의 경우에 사용되는 방법이다[참조: 일반적으로 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press, 2판, 1989), 본원에 참고 인용함]. 포유동물 세포를 형질전환하기 위해 사용되는 다른 방법으로 는 폴리브렌, 원형질체 융합, 리포좀, 전기천공법 및 미세주입 등을 들 수 있다(참조: Sambrook, 상기 문헌 참조). 트랜스게닉 동물의 생성에 있어서, 트랜스 유전자는 수정된 난모세포 내로 미세주입하거나 배아 줄기 세포의 게놈 내로 혼입시키고, 이러한 세포의 핵을 탈핵 난모세포에 전달한다.
중쇄 및 경쇄가 별도의 발현 벡터 상에서 클로닝되는 경우, 벡터는 동시혈질감염되어 원형의 면역글로불린의 발현 및 어셈블리를 획득한다. 일단 발현되면, 전체적인 항체, 그들의 이량체, 개개의 경쇄 및 중쇄 또는 본 발명의 다른 면역글로불린 형태는 암모늄 설페이트 침전, 친화성 컬럼 크로마토그래피, HPLC 정제, 겔 전기영동 등을 포함하는 당업계에 공지된 표준 방법에 따라 정제할 수 있다[참조: 일반적으로 Scopes, Protein Purification(Springer-Verlag, 뉴욕, 1982)]. 약학적 용도를 위해서 바람직하게는 약 90-95% 이상, 더 바람직하게는 98-99% 이상의 균질성을 가진 실질적으로 순수한 면역글로불린이 사용된다.
6. 항체 단편
또한, 본 발명의 범위내로 고려되는 것은 항체 단편이다. 한 구체예에서, 비인간 및/또는 키메라 항체의 단편이 제공된다. 다른 구체예에서, 인간하 항체의 단편은 제공된다. 전형적으로, 이들 단편은 107 M-1 이상, 더 전형적으로 108 또는 109 M-1의 친화도로 항원에 대해 특이적으로 결합한다. 인간화 항체 단편은 별개의 중쇄, 경쇄, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc 및 Fv를 포함한다. 단편은 재조합 DNA 기법, 또는 원형의 면역글로불린의 효소적 분리 또는 화학적 분리에 의해 생성된다.
7. 동물 모델에서 치료 효과에 대한 항체 테스트
7-9월령 PDAPP 마우스 군 각각에 대해 PBS 중 폴리클로날 항-Aβ또는 특이적인 항-Aβ 모노클로날 항체 0.5 mg을 주입하였다. 모든 항체 제제는 내독소 수준이 낮게 정제하였다. 모노클로날 항체는 마우스에게 Aβ의 단편 또는 더 긴 형태를 주입하고, 하이브리도마를 제조하고, Aβ의 다른 비중첩 단편에 결합하지 않고 Aβ의 소정 단편에 특이적으로 결합하는 항체에 대해 하이브리도마를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다.
마우스는 4개월에 걸쳐 필요할 때마다 복강내로 주입하여 ELISA 적정에 의해 측정된 순환 항체 농도를 Aβ42 또는 다른 면역원에 대한 ELISA에 의해 정의된 1/1000 보다 더 크게 유지하였다. 적정은 모니터링하고, 마우스는 주입 6개월의 말미에 안락사시켰다. 조직화학, Aβ레벨 및 독성학은 사후 수행하였다. 1군당 10 마리의 마우스를 사용하였다.
8. 제거 활성에 대한 항체 스크리닝
또한, 본 발명은, 제거 활성이 요구되는 경우에 있어서, 아밀로이드 침착물 또는 임의의 다른 항원 또는 관련된 생물학적 실체에서 활성에 대해 항체를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 아밀로이드 침착물에 대한 활성에 대해 스크리닝하기 위해, 알츠하이머병 환자의 뇌 또는 특징적인 알츠하이머 병리학을 가진 동물 모델로부터 유래한 조직 샘플은 Fc 수용체를 보유하는 식세포성 세포 및 시험관내 배지에서 테스트 중인 항체와 접촉시킨다. 식세포성 세포는 일차 배양물 또는 세포주일 수 있으며, 쥐과동물에서 기원한 것일 수 있으며(예를 들어, BV-2 또는 C8-B4 세 포) 또는 인간에서 기원한 것일 수 있다(예를 들어, THP-1 세포). 몇몇 방법에서, 상기 성분은 현미경 슬라이드에서 조합하여 현미경 모니터링을 용이하게 한다. 몇몇 방법에서, 미량적정 접시의 웰 내에서 다수의 반응을 병렬적으로 수행한다. 이러한 포맷에서, 별개의 미니 현미경 슬라이드는 별도의 웰 내에 적층할 수 있거나, 비현미경 검출 포맷, 예를 들어 Aβ의 ELISA 검출을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 일련의 측정은 시험관내 반응 혼합물내 아밀로이드 침착물의 양으로 이루어지는데, 검출전의 기본값으로부터 출발하며, 반응중 하나 이상의 테스트 값을 통해 수행한다. 항원은 예를 들어 Aβ 또는 아밀로이드 반점의 다른 성분에 대해 형광 표지된 항체로 염색하여 검출할 수 있다. 염색을 위해 사용된 항체는 제거 항체에 대해 테스트된 항체와 동일한 것일 수도 있고 동일하지 않은 것일수도 있다. 아밀로이드 침착 반응중 기준에 대한 감소는 테스트 중인 항체가 제거 활성을 보유함을 의미한다. 이러한 항체는 알츠하이머병 및 다른 아밀로이드형성성 질병을 예방 또는 치료하는 데 유용하다고 생각된다. 알츠하이머병 및 다른 아밀로이드형성성 질병을 예방 또는 치료하기 위해 특히 유용한 항체는 압착 아밀로이드 반점 및 확산 아밀로이드 반점 둘 다를 제거할 수 있는 것, 예를 들어 본 발명의 12B4 항체 또는 이의 키메라 또는 인간화 버젼을 포함한다.
다른 유형의 생물학적 실체를 제거함에 있어서 활성에 대해 항체를 스크리닝하기 위해 유사한 방법을 사용할 수 있다. 이 분석법은 실질적으로 임의 종류의 생물학적 실체에 대해 제거 활성을 검출하기 위해 사용할 수 있다. 전형적으로 생물학적 실체는 인간 또는 동물 질병에서 일부 역할을 보유한다. 생물학적 실체는 조 직 샘플로서 또는 분리된 형태로 제공될 수 있다. 조직 샘플로서 제공되는 경우, 조직 샘플은 고정시키지 않아 고정에 부수하는 성분들의 형태 와해를 피하기 위해 그리고 조직 샘플의 성분들의 즉각적인 접근을 가능하게 하는 것이 바람직하다. 이 분석법에서 테스트될 수 있는 조직 샘플의 예로는 암 조직, 전암 조직, 양성 성장물을 함유하는 조직, 예를 들어 사마귀 또는 모반, 병원성 미생물에 감염된 조직, 염증성 세포로 침윤된 조직, 세포 사이에 병리학적 매트릭스를 보유하는 조직(예를 들어, 섬유상 심막염), 비정상적인 항원을 보유하는 조직 및 상처 조직을 들 수 있다. 사용될 수 있는 분리된 생물학적 실체의 예로는 Aβ, 바이러스 항원 또는 바이러스, 프로테오글리칸, 다른 병원성 미생물의 항원, 종양 항원 및 접착 분자를 들 수 있다. 이러한 항원들은 다른 방법들 중에서 천연 소스, 재조합 발현 또는 화학 합성에 의해 얻을 수 있다. 조직 샘플 또는 분리된 생물학적 실체는 Fc 수용체를 보유하는 식세포성 세포, 예를 들어 단핵구 또는 소신경교 세포 및 배지 중의 테스트하려는 항체와 접촉시킨다. 항체는 테스트 중에 생물학적 실체에 대해 유도될 수 있거나 또는 상기 실체와 결합된 항원에 대해 유도될 수 있다. 후자의 상황에서, 목적은 생물학적 실체가 항원을 식세포작용하는지 여부를 테스트하는 것이다. 일반적으로, 반드시 필요한 것은 아니지만, 항체 및 생물학적 실체(때로, 항원과 결합된 것임)는 식세포작용 세포에 첨가하기 이전에 서로 접촉한다. 이어서, 존재하는 경우 생물학적 실체 및/또는 배지중에 잔류하는 결합된 항원의 농도를 모니터링한다. 배지중의 항원 또는 결합된 생물학적 실체의 양 또는 농도의 감소는 항체가 식세포작용 세포와 함께 항원 및/또는 결합된 생물학적 실체에 대한 제거 반응을 보 유함을 나타내는 것이다(참조: 예를 들어 실시예 IV).
9. 변경된 효과기 기능을 보유하는 키메라/인간화 항체
불변부(Fc 영역)를 포함하는 본 발명의 상기한 항체에 있어서, 상기 분자의 효과기 기능을 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. 일반적으로, 항체의 효과기 기능은 여러가지 효과기 분자, 예를 들어 보체 단백질 또는 Fc 수용체에 대한 결합을 매개할 수 있는 분자의 불변 영역 또는 Fc 영역에 존재한다. Fc 영역에 대한 보체의 결합은 예를 들어, 세포 병원체의 식균 작용 증진(opsonization)과 분해 및 염증 반응의 활성화에서 중요하다. 예를 들어, 효과기 세포의 표면 상에서 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 다수의 중요하고 다양한 생물학적 반응을 촉발시키는데, 그 예로는 항체 피복된 병원체 또는 입자의 흡입 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 항체-피복된 표적 세포의 킬러 세포에 의한 분해(즉, 항체 의존성 세포 매개 세포독성, 또는 ADCC), 염증 매개자의 방출, 항체의 태반 전달 및 면역글로불린 생성의 조절을 들 수 있다.
따라서, 특정 치료적 적용 또는 진단적 적용에 따라 상기 면역 기능 또는 단지 선택된 면역 기능이 바람직할 수 있다. 항체의 Fc 영역을 변경시킴으로써, 진단 및 치료에서 이로운 효과를 보유하는 면역 시스템의 여러가지 반응을 증강시키거나 억제시키는 것을 포함하는 상기 분자의 여러가지 측면의 효과기 기능이 획득된다.
단지 특정 유형의 Fc 수용체와만 반응하는 본 발명의 항체가 생성될 수 있는데, 예를 들어 본 발명의 항체는 단지 특정 Fc 수용체에 결합하도록 개질될 수 있거나, 또는 필요에 따라 전체적으로 Fc 수용체 결합이 결핍되도록 개질할 수 있는 데, 이는 상기 항체의 Fc 영역내에 위치하는 Fc 수용체 결합 위치의 결실 또는 변경에 의한 것이다. 본 발명의 항체의 Fc 영역의 다른 바람직한 변경은 후술한다. 전형적으로 Kabat 넘버링 시스템을 사용하여 Fc 영역의(예를 들어, IgG 항체의) 어떤 아미노산 잔기(들)이 변경되어(예를 들어, 아미노산 치환에 의해) 효과기 기능에서 원하는 변화를 획득하는지를 나타낼 수 있다. 또한, 상기 넘버링 시스템을 이용하여 종간 항체를 비교함으로써 예를 들어 마우스 항체 내에서 관찰되는 소정의 효과기 기능이 본 발명의 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체로 전체적으로 조작되도록 할 수 있다.
예를 들어, 항체(예를 들어, IgG 항체)는 Fc 수용체(예를 들어, 인간 단핵구상의 Fc 수용체(FcγRI))에 대한 강한 결합, 중간 정도의 결합 또는 약한 결합을 나타내는 것으로 그룹화할 수 있다. 이들 상이한 친화성 군에서 아미노산 서열의 비교에 의해, 힌지-연결부(Leu234-Ser239)내의 단핵구 결합 부위가 확인되어 왔다. 게다가, 인간 FcγRI 수용체는 단량체로서 인간 IgG1 및 마우스 IgG2a에 결합하나, 마우스 IgG2b의 결합은 100배 더 약하다. 힌지-연결부내 이들 단백질의 서열 비교를 통해 확인된 바와 같이, 서열 234-238, 강한 결합제 내의 Leu-Leu-Gly-Gly-Pro는 마우스 감마 2b, 즉 약한 결합제내 Leu-Glu-Gly-Gly-Pro가 된다. 따라서, 감소된 FcγRI 수용체 결합이 요망되는 경우, 인간 항체 힌지 서열내 상응하는 변화를 수행할 수 있다. 다른 변경은 동일하거나 유사한 결과를 얻기 위해 수행할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, FcγRI 결합의 친화도는 잔기의 측쇄 상에 부적합한 작용기를 보유하는 잔기로 특정 잔기를 치환하거나 하전된 작용기(예를 들어, Glu 또는 Asp) 또는 예를 들어 방향족 비극성 잔기(예를 들어, Phe, Tyr 또는 Trp)를 도입함으로써 변경할 수 있다.
이들 변화는 상이한 면역글로불린 사이에 서열 상동성이 있는 쥐과동물, 인간 및 래트 시스템에 동일하게 적용할 수 있다. 인간 FcγRI 수용체에 결합하는 인간 IgG3에 있어서, Leu 235의 Glu로의 변화는 수용체에 대한 돌연변이체의 상호작용을 파괴한다. 따라서, 상기 수용체에 대한 결합 부위는 적합한 돌연변이에 의해 스위치 온 되거나 스위치 오프될 수 있다.
힌지 링크부내 인접 부위 또는 근접 부위 상의 돌연변이(예를 들어, Ala에 의한 잔기 234, 236 또는 237의 치환)은 잔기 234, 235, 236 및 237에서의 변경이 FcγRI 수용체에 대한 친화성에 적어도 영향을 미침을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 항체는 개질되지 않은 항체와 비교하여 FcγRI에 대한 변경된 결합 친화도를 가진 변경된 Fc 영역을 보유할 수 있다. 이러한 항체는 아미노산 잔기 234, 235, 236 또는 237에서 변경을 보유한다.
다른 Fc 수용체에 대한 친화도는 예를 들어 상이한 방식으로 면역 반응을 조절하하기 위해 유사한 방법으로 변경할 수 있다.
추가의 예에서, 보체의 Cl 성분의 결합을 수반하는 IgG 항체의 용균 활성이 변경될 수 있다.
보체 시스템의 제1 성분 Cl은 서로 견고하게 결합하는 Clq, Clr 및 Cls로 알려진 3개의 단백질을 포함한다. 밝혀진 바와 같이, Clq는 항체에 대한 3개의 단백질 복합체의 결합을 담당하는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 항체의 Clq 결합 활성은 중쇄의 아미노산 잔기 318, 320 및 322중 하나 이상이 상이한 측쇄를 보유하는 잔기로 변화된 변경된 CH2 도메인을 가진 항체를 제공함으로써 변경될 수 있다. 중쇄내 잔기의 넘버링은 EU 인덱스의 넘버링이이다(Kabat 등, 상기 문헌 참조). 변경, 예를 들어 항체에 대한 특이적인 Clq-결합을 감소시키거나 폐기하기 위한 다른 적합한 변경은 잔기 318(Glu), 320(Lys) 및 322(Lys)중 한 잔기를 Ala로 변화시키는 것을 포함한다.
또한, 이들 잔기에서 돌연변이를 유발시킴으로써 잔기 318이 수소 결합 측쇄를 보유하고 잔기 320 및 322 둘 다 양으로 하전된 측쇄를 보유하는 한 Clq 결합이 보유되는 것으로 확인되었다.
Clq 결합 활성은 3개의 특정 잔기중 임의의 한 잔기를 측쇄 상에 부적합한 작용기를 보유하는 잔기로 치환함으로써 폐기할 수 있다. Clq 결합을 폐기하기 위해 이온성 잔기를 Ala 만으로 치환할 필요는 없다. 또한, Clq 결합을 폐기하기 위해 3개의 잔기중 임의의 한 잔기 대신에 Phe, Tyr, Trp 및 Pro와 같은 방향족 비극성 잔기 또는 다른 알킬 치환된 비이온성 잔기, 예를 들어 Gly, Ile, Leu 또는 Val을 이용할 수도 있다. 또한, Clq 결합 활성을 폐기하기 위해 잔기 318이 아니라 잔기 320 및 322 대신에 Ser, Thr, Cys 및 Met와 같은 극성 비이온성 잔기를 사용할 수도 있다.
또한, 강조하고 싶은 것은 이온성 또는 비이온성 극성 잔기 상의 측쇄는 Glu 잔기에 의해 형성된 결합과 유사한 방식으로 수소 결합을 형성할 수 있을 것이라는 점이다. 따라서, 극성 잔기에 의한 318(Glu) 잔기의 치환은 Clq 결합 활성을 폐기 하지는 않고 개질시킬 수 있을 것이다.
또한, 잔기 297(Asn)의 Ala로의 치환은 용균 활성의 제거를 초래하는 한편, 단지 Clq에 대한 친화도는 약간 감소시킨다(약 3배 더 약함). 이 변경은 보체 활성화를 위해 필요한 탄수화물의 존재 및 글리코실화 부위를 파괴한다. 또한, 상기 부위에서 임의의 다른 치환은 글리코실화 부위를 파괴할 것이다.
또한, 본 발명은 변경된 효과기 기능을 보유하는 항체를 제공하는데, 상기 항체는 개질된 힌지부를 보유한다. 개질된 힌지부는 CH1 도메인의 부류 또는 아류와 상이한 항체 부류 또는 아류의 항체로부터 유도된 완전한 힌지부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 부류 IgG 항체의 불변부(CH1)는 부류 IgG4 항체의 힌지부에 부착될 수 있다. 또는, 새로운 힌지부는 반복부의 각각의 유닛이 자연적인 힌지부로부터 유래한 반복부 또는 자연적인 힌지의 일부분을 포함할 수 있다. 한 예에서, 자연적인 힌지부는 하나 이상의 시스테인 잔기를 중성 잔기, 예를 들어 알라닌으로 전환하거나, 또는 적절히 배치된 잔기를 시스테인 잔기로 전환함으로써 변경된다. 이러한 변경은 당업계에 인식된 단백질 화학 및 바람직하게는 본원에 기술한 바와 같은 유전 공학 기법을 이용하여 수행된다.
본 발명의 한 구체예에서, 항체의 힌지부내 시스테인 잔기의 수는 예를 들어 1개의 시스테인 잔기로 감소된다. 이러한 개질은 항체, 예를 들어 Fc 부분이 효과기 또는 수용체 분자에 의해 치환된 항체 분자 및 2특이성 항체 분자의 어셈블리를 용이하게 하는 잇점을 보유하는데, 그 이유는 단지 하나의 이황화 결합을 형성하는 것이 필요하기 때문이다. 또한, 이러한 개질은 힌지부를 예를 들어 화학적 수단에 의해서 직접적으로 또는 간접적으로 효과기 또는 수용체 분자 또는 다른 힌지부에 부착시키기 위한 특이적인 표적을 제공한다.
역으로, 상기 항체의 힌지부내 시스테인 잔기의 수는 예를 들어, 정상적으로 발생하는 시스테인 잔기의 수 보다 적어도 하나 이상 많은 수로 증가한다. 시스테인 잔기 수의 증가는 인접한 힌지간의 상호작용을 안정화시키기 위해 사용할 수 있다. 이러한 개질의 다른 장점은 변경된 항체, 예를 들어 방사능표지에 효과기 또는 수용체 분자를 부착시키기 위한 시스테인 티올기의 이용을 용이하게 한다는 것이다.
따라서, 본 발명은 변경된 효과기 기능을 획득하기 위해 항체 부류, 구체적으로 IgG 부류 사이의 힌지부 교환 및/또는 힌지부내 시스테인 잔기수의 증가 또는 감소를 제공한다(참조: 예를 들어, 미국 특허 5,677,425, 본원에 참고 인용함). 변경된 효과기 기능의 결정은 본원에 기술한 분석법 또는 당업계에 인식된 다른 기법을 이용하여 수행된다.
생성된 항체에 대해 출발 항체와 비교된 생물학적 활성에서 임의의 변화를 평가하기 위한 하나 이상의 분석법을 수행할 수 있다는 점이 중요하다. 예를 들어, 보체 또는 Fc 수용체에 결합하는 변경된 Fc 영역을 보유한 항체의 능력은 본원에 기술된 분석법 뿐만 아니라 당업계에 공지된 임의의 분석법을 이용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 항체 생성은 본원에 기술된 기법 및 당업자에게 공지된 기법을 포함하는 임의의 적합한 기법에 의해 수행된다. 예를 들어, 적절히 변경된 잔기(들) 을 포함하는 적합한 단백질 서열, 예를 들어 관련된 불변부, 예를 들어 Fc 영역, 즉 항체의 CH2 및/또는 CH3 도메인(들)의 일부분 또는 모두를 형성하는 단백질 서열을 합성하고, 이어서 항체 분자내 적절한 위치내로 화학적으로 연결할 수 있다.
변경된 항체를 생성하기 위해 유전 공학 기법을 사용하는 것이 바람직하다. 바람직한 기법은 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에서 사용하기 위한 적합한 프라이머를 제조하여 하나 이상의 잔기에서 IgG 중쇄의 적어도 일부분, 예를 들어 Fc 또는 불변부(예를 들어, CH2 및/또는 CH3)를 암호화하는 DNA 서열이 변경되도록 한다. 이어서, 상기 절편은 항체의 나머지 부분, 예를 들어 항체의 가변부 및 세포내 발현을 위해 필요한 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다.
또한, 본 발명은 세포주를 형질전환시키는데 사용된 벡터, 형질전환용 벡터를 생성하는데 사용된 벡터, 형질전환용 벡터로 형질전환된 세포주, 예비 벡터로 형질전환된 세포주 및 이들의 생성 방법을 포함한다.
변경된 Fc 영역을 가진 항체(즉, 변경된 효과기 기능을 가진 항체)를 생성하기 위해 형질전환된 세포주는 불멸화된 포유동물 세포주(예를 들어, CHO 세포)가 바람직하다.
변경된 Fc 영역을 가진 항체를 생성하기 위해 사용된 세포주는 포유동물 세포주에 바람직하지만, 대안으로 임의의 다른 적합한 세포주, 예를 들어 박테리아 세포주 또는 효모 세포주도 사용할 수 있다.
B. 면역학적 제제 및 치료제를 암호화하는 핵산
또한, 아밀로이드 침착물에 대한 면역 반응은 수동 면역화를 위해 사용된 항 체 및 그들의 성분 쇄를 암호화하는 핵산을 투여함으로써 유도할 수도 있다. 이러한 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 면역원을 암호화하는 핵산 절편은 전형적으로 조절 요소, 예를 들어 프로모터 및 인핸서에 연결되는데, 이는 환자의 의도한 표적 세포내에서 DNA 절편의 발현을 가능하게 한다. 면역 반응의 유도를 위해 바람직한 바와 같이, 혈액 세포내에서의 발현을 위해, 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 유전자로부터 유래한 프로모터 및 인핸서 또는 CMV 주 중간 초기 프로모터 및 인핸서는 발현을 유도하기에 적합하다. 연결된 조절 요소 및 암호 서열은 종종 벡터 내로 클로닝된다. 이중 쇄 항체의 투여를 위해, 2개의 쇄는 동일하거나 별개의 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
다수의 바이러스 벡터 시스템을 사용할 수 있으며, 그 예로는 레트로바이러스 시스템[참조: 예를 들어, Lawire 및 Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109 (1993)]; 아데노바이러스 벡터[참조: 예를 들어, Bett 등, J. Virol. 67: 5911 (1993)]; 아데노-관련 바이러스 벡터[참조: 예를 들어, Zhou 등, J. Exp. Med. 179: 1867 (1994)], 백시니아 바이러스 및 계두 바이러스를 포함하는 폭스 패밀리로부터 유래한 바이러스 벡터, 신드비스 및 셈리키 포레스트 바이러스로부터 유도된 것과 같은 알파 바이러스 속으로부터 유래한 바이러스 벡터[참조: 예를 들어, Dubensky 등, J. Virol. 70: 508 (1996)], 베네주엘라 말 뇌염 바이러스(참조: Johnston 등, US5,643,576) 및 라브도바이러스, 예를 들어 소포성 구내염 바이러스(참조: Rose, 6, 168, 943) 및 유두종 바이러스[참조: Ohe 등, Human Gene Therapy 6: 325 (1995); Woo 등, WO 94/12629 및 Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)]를 들 수 있다.
면역원을 암호화하는 DNA 또는 동일물을 함유하는 벡터는 리포좀내로 패키징될 수 있다. 적합한 지질 및 관련 유사체는 문헌(참조: Eppstein 등, US 5,208,036, Felgner 등, US 5,264,618, Rose, US 5,279,833 및 Epand 등, US 5,283,185)에 기술되어 있다. 또한, 벡터 및 면역원을 암호화하는 DNA는 미립자 담체에 부착되거나 미립자 담체와 결합할 수 있는데, 미립자 담체의 예로는 폴리메틸 메타크릴레이트 중합체 및 폴리락티드 및 (락티드-글리콜라이드)공중합체를 들 수 있다[참조: 예를 들어, McGee 등, J. Micro Encap. (1996)].
유전자 요법 벡터 또는 네이키드 폴리펩티드(예를 들어, DNA)는 전형적으로 전신성 투여(예를 들어, 정맥내, 복강내, 비내, 위내, 피내, 근육내, 피하 또는 두개골내 주입) 또는 국소 투여에 의해 개개의 환자에 투여함으로써 생체내로 전달할 수 있다(참조: 예를 들어, Anderson 등, US 5,399,346). "네이키드 폴리뉴클레오티드"는 콜로이드성 물질과 복합체를 형성하지 않은 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 네이키드 폴리뉴클레오티드는 종종 플라스미드 벡터 내로 클로닝된다. 이러한 벡터는 추가로 부피바신과 같은 촉진제(facilitating agent)를 포함할 수 있다(Weiner 등, US 5,593,972). 또한, DNA는 유전자 총으로 투여할 수도 있다(Xiao & Brandsma, 상기 문헌 참조). 면역원을 암호화하는 DNA는 미소 금속 구의 표면 상에 침전된다. 미소투사체는 쇽 웨이브 또는 팽창하는 헬륨 가스로 가속되며, 몇몇 세포 층의 깊이로 조직을 침투한다. 예를 들어, Accel(상표명) 유전자 전달 장치(미국 위스콘신 미들톤의 아그리세투스에서 제조함)가 적합하다. 대안으로, 네이키드 DNA는 피부 상에 화학적인 자극 또는 기계적인 자극에 의해 DNA를 단지 점적함으로써 피부를 통해 혈류 내로 통과시킬 수 있다(Howell 등, WO 95/05853).
또 다른 변법에서, 면역원을 암호화하는 벡터는 생체 외에서 세포, 예를 들어 개개의 환자로부터 외식한 세포(예를 들어, 림프구, 골수 흡인물, 조직 생검) 또는 공통적인 공여체 조혈 줄기 세포에 전달하고, 이어서 벡터를 혼입한 세포에 대해 선택한 후에 환자에게 상기 세포를 재이식한다.
II. 치료 방법 및 예방 방법
본 발명은 특히 알츠하이머병 및 다른 아밀로이드형성성 질병의 치료에 관한 것인데, 이러한 치료는 예를 들어, 아밀로이드형성성 질병의 치료 또는 예방을 위해 환자에서 유익한 치료적 반응(예를 들어, Aβ의 식세포작용의 유도, 반점 존재량의 감소, 반점 형성의 억제, 신경염성 영양장애의 감소, 인식 기능 개선 및/또는 인식 퇴화의 역전, 치료 또는 예방)을 생성하는 조건 하에서 환자에게 Aβ내 특이성 에피토프에 대한 치료적 면역학적 제제(예를 들어, 인간화 면역글로불린)을 투여함으로써 이루어진다. 또한, 본 발명은 아밀로이드형성성 질병의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서 개시된 면역학적 제제(예를 들어, 인간화 면역글로불린)의 용도에 관한 것이다.
한가지 관점에서, 본 발명은 환자의 뇌내 Aβ의 아밀로이드 침착물과 관련된 질병을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 이러한 질병의 예로는 알츠하이머병, 다운증후군 및 인식 장애를 들 수 있다. 후자의 경우는 아밀로이드형성성 질병의 다른 특징과 함께 또는 다른 특징을 동반하지 않고 발생할 수 있다. 본 발명의 몇몇 방법은 환자에게 아밀로이드 침착물의 성분에 특이적으로 결합하는 항체의 유효 투여량을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 인간 환자에서 알츠하이머병을 예방 또는 치료하기 위해 특히 효과적이다. 예시적인 방법은 Aβ에 결합하는 항체의 유효 투여량을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 방법은 Aβ의 잔기 1-10 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 Aβ의 잔기 1-3 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, Aβ의 잔기 1-4 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, Aβ의 잔기 1-5 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, Aβ의 잔기 1-6 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, Aβ의 잔기 1-7 내의 에피토프에 특이적으로 항체 또는 Aβ의 잔기 3-7 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함한다. 다른 관점에서, 본 발명은 Aβ의 자유 N-말단 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 투여하는 것을 특징으로 한다. 다른 관점에서, 본 발명은 Aβ의 잔기 1-10 내의 에피토프에 결합하는 항체를 투여하는 것을 특징으로 하는데, 이때 Aβ의 잔기 1 및/또는 잔기 7은 아스파르트산이다. 다른 관점에서, 본 발명은 전장 아밀로이드 전구 단백질(APP)에 결합하지 않고 Aβ단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 투여하는 것을 특징으로 한다. 다른 관점에서, 상기 항체의 아이소타입은 인간 IgG1이다.
다른 관점에서, 본 발명은 환자 내에서 아밀로이드 침착물에 결합하여 아밀로이드 침착물에 대해 제거 반응을 유도하는 항체를 투여하는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 이러한 제거 반응은 Fc 수용체 매개된 식세포작용에 의해 수행될 수 있다.
전형적으로 본 발명의 치료제는 원하지 않는 오염물을 갖지 않고 실질적으로 순수하다. 이는 치료제가 약 50% w/w(중량/중량) 순도일 뿐만 아니라 방해 단백질 및 오염물을 실질적으로 보유하지 않음을 의미하는 것이다. 종종 상기 치료제는 약 80% w/w, 더 바람직하게는 90% w/w 이상 또는 약 95% w/w 순도를 갖는다. 그러나, 종래의 단백질 정제 기법을 이용하는 경우, 약 99% w/w 이상의 균질한 펩티드가 얻어질 수 있다.
상기 방법들은 질병의 증후를 나타내지 않는 환자 및 현재 질병의 증후를 나타내는 환자에 공히 적용할 수 있다. 이러한 방법들에 사용된 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 비인간 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)일 수 있으며, 본원에 기술한 바와 같이 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 다른 관점에서, 본 발명은 Aβ 펩티드로 면역화된 인간으로부터 제조한 항체를 투여하는 것을 특징으로 하는데, 이때 인간은 항체를 이용하여 치료하려는 환자일 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 약학 조성물로서 약학적 담체와 함께 항체를 투여하는 것을 특징으로 한다. 또는, 상기 항체는 하나 이상의 항체 쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여함으로써 상기 환자에게 투여될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 환자 내에서 항체 쇄를 생성하기 위해 발현된다. 필요에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드는 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 환자 내에서 발현되어 중쇄 및 경쇄를 생성한다. 예시적인 구체예에서, 상기 환자는 환자의 혈액내 투여된 항체의 레벨에 대해 모니터링한다.
이렇게 본 발명은 신경병리학 및 몇몇 환자에서 알츠하이머병과 관련된 인식 장애를 예방 또는 경감시키기 위한 치료법에 대한 오랜 요구를 충족시킨다.
A. 치료할 수 있는 환자
치료할 수 있는 환자는 질병의 위험은 있으나 증후를 나타내지 않는 개체 뿐만 아니라 현재 증후를 나타내고 있는 개체를 포함한다. 알츠하이머병의 경우, 실질적인 환자는 남성이든 여성이든 충분히 산 경우 알츠하이머병에 걸릴 위험이 있는 환자를 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법은 환자로서의 임의의 위험성 평가를 거칠 필요가 없는 일반 집단에 대해 예방적으로 투여할 수도 있다. 본 발명의 방법은 알츠하이머병의 공지된 유전적 위험을 보유하는 개체를 위해 특히 유용하다. 이러한 개체는 이러한 질병을 경험한 친지를 보유한 개체 및 위험이 유전적 또는 생화학적 마커의 분석에 의해 결정된 개체를 포함한다. 알츠하이머병에 대한 위험의 유전적 마커는 APP 유전자내 돌연변이, 특히 각각 Hardy 및 Swedish 돌연변이로 언급되는 위치 717 및 위치 670과 671에서의 돌연변이를 포함한다(Hardy 상기 문헌 참조). 위험에 대한 다른 마커는 프레세닐린 유전자, PS1 및 PS2 및 ApoE4, AD의 가계 병력, 고콜레스테롤혈증 또는 아테롬성 경화증에서의 돌연변이이다. 현재 알츠하이머병을 앓고 있는 개체는 특징적인 치매 뿐만 아니라 상기한 위험 인자가 존재하는 것으로 인식될 수 있다. 또한, 다수의 진단 테스트는 AD를 보유하는 개체를 확인하기 위해 사용할 수 있다. 이들은 CSF tau 및 Aβ42 레벨의 측정을 포함한다. 상승된 tau 및 감소된 Aβ42 레벨은 AD의 존재를 의미한다. 또한, 알츠하이머병을 앓고 있는 개체는 실시예 부분에서 논의되는 바와 같이 ADRDA 기준에 의해 진단할 수 있다.
무증후성 환자에서, 치료는 임의의 연령(예를 들어, 10, 20, 30)에서 시작할 수 있다. 그러나, 일반적으로 환자가 40, 50, 60 또는 70에 이르기까지는 치료를 시작할 필요는 없다. 치료는 시간 경과에 따라 항체 레벨을 분석함으로써 모니터링할 수 있다. 반응이 감소되는 경우, 부스터 투여량을 나타낸다. 잠재 다운 증후군 환자의 경우, 치료는 치료제를 임산부에게 투여하여 출생전에 시작하거나 출산 직추에 투여할 수 있다.
B. 치료법 및 투여량
예방적 용도에서, 약학 조성물 또는 약제는 알츠하이머병에 걸리기 쉬운 환자 또는 알츠하이머병의 위험이 있는 환자에게 투여하는데, 투여하는 양은 위험을 제거 또는 감소시키기에 충분한 양, 혹독함을 경감시키는 양, 또는 발병을 지연시키는 양이며, 상기한 위험에는 질병의 생화학적 증후, 조직학적 증후 및/또는 거동 증후, 합병증 및 질병의 진행중 나타나는 중간 병리학적 표현형이 포함된다. 치료적 용도에서, 조성물 또는 약제는 그러한 질병에 걸린 것으로 의심되는 환자 또는 이미 질병에 걸린 환자에게 그러한 질병의 증후(생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증후), 예를 들어 질병의 진행중 그의 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양을 투여한다.
몇몇 방법에서, 특징적인 알츠하이머 병리학이 아직 발전되지 않은 환자에서 근인식 장애(myocognitive impairment)를 감소 또는 제거시킨다. 치료적 처리 또는 예방적 처치를 수행하기에 적합한 양은 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 양(치 료 유효량 또는 예방 유효량)으로 정의된다. 예방적 처치 또는 치료적 처치 둘 다에서, 제제는 충분한 면역 반응이 달성될 때까지 수회 투여된다. "면역 반응" 또는 "면역학적 반응"은 수용 환자에서 항원에 대해 유도된 체액성 반응(항체 매개됨) 및/또는 세포성 반응(항원 특이성 T 세포 또는 그들의 분비 생성물에 의해 매개됨)의 진전을 포함한다. 이러한 반응은 능동 반응, 즉 면역원의 투여에 의해 유도된 활성 반응, 또는 수동 반응, 즉 면역글로불린 또는 항체 또는 프라이밍된 T-세포의 투여에 의해 유도된 수동 반응일 수 있다. 전형적으로, 면역 반응은 모니터링하며, 면역 반응이 약해지기 시작하면 투여를 반복적으로 수행한다.
상기한 질병 상태를 치료하기 위한 본 발명의 조성물의 유효량은 대수의 상이한 인자, 예를 들어 투여, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태에 따라 달라지며, 환자가 인간인지 동물인지 여부, 투여되는 다른 의약 및 처치가 예방적 처리인지 치료적 처치인지에 따라서도 달라진다. 통상적으로, 환자는 인간이나, 트랜스게닉 포유동물을 포함하는 비인간 포유동물도 처치할 수 있다. 처리 투여량은 안전성과 효능을 최적화하기 위해 적정할 필요가 있다.
항체를 이용한 수동 면역화에서 있어서, 투여량 범위는 약 0.0001-100 mg/kg, 더 일반적으로 0.01-5 mg/kg(예를 들어, 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg 등)인데, 이 양은 숙주 체중 1 kg을 기준한 양이다. 예를 들어, 투여량은 1 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 또는 1-10 mg/kg, 바람직하게는 1 mg/kg 이상일 수 있다. 또한, 상기 투여량의 중간 범위 정도의 투여량도 본 발명의 범위내에 있는 것으로 생각된다. 환자에게는 상기한 바와 같은 투여 량을 매일, 격일, 일주일 또는 실험적인 분석을 통해 결정된 임의의 다른 스케쥴에 따라 투여될 수 있다. 예시적인 처치는 장기간, 예를 들어 6개월 이상의 기간에 걸쳐 다수회 투여하는 것을 포함한다. 추가의 예시적인 처치법은 2주에 1회 또는 1개월에 1회 또는 3-6개월에 1회 투여하는 것을 포함한다. 예시적인 투여 스케쥴은 매일 1-10 mg/kg 또는 15 mg/kg, 격일로 30 mg/kg 또는 1주일에 60 mg/kg 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 방법에서, 상이한 결합 특이성을 보유하는 2개 이상의 모노크로날 항체는 동시에 투여하는데, 이 경우 투여된 각 항체의 투여량은 적시한 범위내에 포함된다.
일반적으로 항체는 다수의 경우에 대해 투여한다. 단일 투여량 사이의 간격은 일주일, 일개월 또는 일년일 수 있다. 또한, 간격은 환자에서 Aβ에 대한 항체의 혈액 레벨을 측정함으로써 나타나는 바와 같이 불규치할 수도 있다. 몇몇 방법에서, 투여량을 조정하여 형장 항체 농도를 1-1000 ㎍/ml로 만들고, 몇몇 방법에서는 25-300 ㎍/ml로 만든다. 대안으로, 항체는 서방형 제제로 투여할 수 있는데, 이 경우 덜 빈번한 투여가 필요하다. 투여량 및 투여 빈도는 환자 내에서 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간화 항체는 가장 긴 반감기를 보이며, 그 다음이 키메라 항체와 비인간 항체이다.
투여량 및 투여 빈도는 수행하는 처치가 예방적 처치인지 치료적 처치인지에 따라 달라질 수 있다. 예방적 적용에서, 본 발명의 항체를 함유하는 조성물 또는 이의 칵테일은 한자의 저항성을 증강시키기 위해 아직 질병 상태에 이르지 않는 환자에게 투여된다. 이러한 양은 "예방적 유효 투여량(예방 유효량)"으로 정의된다. 이 용도에서, 정확한 양은 다시 환자의 건강 상태 및 일반적인 면역성에 따라 달라지나, 일반적으로 1회 투여시 0.1-25 mg, 특히 1회 투여시 0.5-2.5 mg이다. 상대적으로 낮은 투여량은 장기간에 걸쳐 상대적으로 빈번하지 않은 간격으로 투여된다. 몇몇 환자는 그들의 남은 여생 동안 계속하여 처치받는다.
치료적 적용에서, 질병의 진행이 감소되거나 종결될 때 까지 및 바람직하게는 환자가 질병 증후의 부분적인 또는 완전한 경감을 나타낼 때 까지 상대적으로 짧은 간격으로 상대적으로 높은 투여량(예를 들어, 1회 투여시 약 1-200 mg, 5-25 mg의 투여량이 더 흔히 사용됨)이 종종 필요하다. 그후, 환자에게는 예방적 처치를 수행한다.
항체를 암호화하는 핵산의 투여량은 환자 1명당 약 10 ng-1 g, 100 ng-100 mg, 1 ㎍-10 mg, 또는 30-300 ㎍ DNA이다. 감염성 바이러스 벡터의 투여량은 1회 투여당 비리온 10-100 이상이다.
치료제는 예방적 처치 및/또는 치료적 처리를 위해 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개골내, 복강내, 비내 또는 근육내 투여할 수 있다. 면역원성 제제의 가장 전형적인 투여 경로는 피하 투여이나, 다른 경로도 동일하게 효율적일 수 있다. 그 다음으로 흔한 투여 경로는 근육내 주사이다. 이 유형의 주사는 팔 또는 다리 근육내에서 가장 전형적으로 수행된다. 몇몇 방법에서, 제제는 침착물이 축적되는 특별한 조직내로 예를 들어 두개골내 주사에 의해 직접적으로 주입된다. 근육내 주사 또는 정맥내 주입가 항체 투여를 위해 바람직하다. 몇몇 방법에서, 특정 치료 항체는 두개골 내로 직접 주사된다. 몇몇 방법에서, 항체는 서방형 조성물 또는 장치, 예를 들어 Medipad(상표명) 장치로서 투여된다.
본 발명의 제제는 필요에 따라 아밀로이드형성성 질병의 치료에 적어도 부분적으로 효과적인 다른 제제와 함께 투여될 수 있다. 아밀로이드 축적이 뇌 내에서 일어나는 알츠하이머병 및 다운증후군의 경우, 본 발명의 제제는 혈액-뇌 배리어를 횡단하는 본 발명의 제제의 통과를 증가시키는 다른 제제와 함께 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 제제는 표적 세포 또는 조직, 예를 들어 리포좀 등의 접근을 증강시키는 다른 제제와 함께 투여할 수 있다. 이러한 제제들의 동시 투여는 원하는 효과를 획득하기 위해 필요한 치료제(예를 들어, 치료 항체 또는 항체 사슬)의 투여량을 감소시킬 수 있다.
C. 약학 조성물
또한, 본 발명의 제제는 활성 치료제 및 여러가지 다른 약학적으로 허용가능한 성분을 포함하는 약학 조성물로서 투여된다[참조: Remington's Pharmaceutical Science(15판, 미국 펜실베니아 이스톤에 소재하는 맥 퍼블리싱 컴퍼니 (1980)]. 바람직한 형태는 의도된 투여 모드 및 치료적 적용에 따라 달라진다. 또한, 상기 조성물은 원하는 제제에 따라 동물 또는 인간 투여를 위해 약학 조성물을 제형화하기 위해 흔히 사용되는 비히클로서 정의되는 약학적으로 허용가능한 비독성 담체 또는 희석제를 포함한다. 상기 희석제는 배합물의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예로는 증류수, 생리적 인산염 완충처리된 염수, 링거 용액, 덱스트로즈 용액 및 행크 용액을 들 수 있다. 또한, 약학 조성물 또는 약학 제제는 다른 담체, 보조제 또는 비독성, 비치료제, 비면역원성 안정화제 등을 포함할 수 있다.
또한, 약학 조성물은 느리게 대사되는 대형 거대분자, 예를 들어 단백질, 다당류, 예를 들어 키토산, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 공중합체(예를 들어, 라텍스 작용화된 세파로즈(TM), 아가로즈, 셀룰로즈 등), 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 지질 응집체(예를 들어, 유적 또는 리포좀)를 포함할 수 있다. 또한, 이들 담체는 면역자극제(즉, 보조제)로서 기능할 수 있다.
비경구 투여의 경우, 본 발명의 제제는 물, 오일, 염수, 글리세롤 또는 에탄올과 같은 멸균 액체일 수 있는 약학 담체와 함께 생리적으로 허용가능한 희석제중의 상기 물질의 용액 또는 현탁액의 주사할 수 있는 제형으로서 투여될 수 있다. 또한, 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, 계면활성제, pH 완충 물질 등도 상기 조성물 내에 존재할 수 있다. 약학 조성물의 다른 성분들은 석유, 동물, 식물에서 유래한 것이거나 합성한 것이며, 그 예로는 땅콩유, 대두유 및 광유를 들 수 있다. 일반적으로, 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 주사가능한 용액을 위해 특히 바람직한 담체이다. 항체는 디포트 주사액 또는 이식 제제의 형태로 투여될 수 있는데, 이는 활성 성분의 서방을 가능하게 하는 방식으로 제형화될 수 있다. 예시적인 조성물은 모노클로날 항체 5 mg/ml를 포함하며, 50 mM 히스티딘, 150 mM NaCl(HCl을 이용하여 pH 6.0으로 조정함)로 구성되는 수성 완충액 내에서 제형화할 수 있다.
전형적으로, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로의 주사액으로 제조되고; 주사 이전에 액체 비히클 내의 용액 또는 현탁액을 위해 적합한 고체 형태로도 제 조될 수 있다. 또한, 상기 제제는 상기한 바와 같은 증강된 보조 효과를 위해 리포좀 또는 미세 입자, 예를 들어 폴리락티드, 폴리글리콜라이드 또는 공중합체내에 유화되거나 캡슐화될 수도 있다[참조: Langer, Science 249: 1527 (1990) 및 Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97 (1997)]. 본 발명의 제제는 디포트 주사액 또는 이식 제제의 형태로 투여될 수 있으며, 이는 활성 성분의 서방 또는 펄스 형태의 방출을 가능하게 하는 방식으로 제형화될 수 있다.
다른 투여 모드에 적합한 추가 제제는 경구, 비내 및 폐 제제, 좌약 및 경피용 제제를 포함한다. 좌약의 경우, 결합체 및 담체는 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함하며; 이러한 좌약은 0.5%-10%, 바람직하게는 1%-2% 범위 내의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구 제제는 부형제, 예를 들어 약학 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로즈 및 마그네슘 카르보네이트를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 필, 캡슐, 서방 제제 또는 분말 형태를 취하며, 10%-95%, 바람직하게는 25%-70%의 활성 성분을 함유한다.
국소 도포에 의해 경피 전달 또는 피내 전달이 가능하다. 국소 투여는 콜레라 독소 또는 이의 제독 유도체 또는 서브유닛 또는 다른 박테리아 독소와 함께 제제를 동시 투여하면 용이하게 수행할 수 있다[참조: Glenn 등, Nature 391, 851 (1998)]. 동시 투여는 혼합물로서 또는 융합 단백질로서 화학적 가교 또는 발현에 의해 얻은 연결된 분자 또는 혼합물로서 성분을 이용함으로써 달성할 수 있다.
대안으로, 경피 전달은 피부 경로 또는 트랜스페로좀을 이용하여 달성할 수 있다[참조: Paul 등, Eur. J. Immunol. 25: 3521 (1995); Cevc 등, Biochem. Biophys. Acta 1368: 201-15 (1998)].
III. 치료 과정 모니터링
본 발명은 알츠하이머병을 앓고 있거나 알츠하이머병에 걸리기 쉬운 환자에서 처치 과정을 모니터링하는 방법, 즉 환자에게 시행하려는 처치 과정을 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 증후를 나타내는 환자에 대한 치료적 처치 및 증후를 나타내지 않는 환자에 대한 예방적 처치 둘 다를 모니터링하는 데 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 방법은 수동 면역을 모니터링하기 위해 유용하다(예를 들어, 투여된 항체 레벨의 측정).
몇몇 방법은 예를 들어 일정량의 제제를 투여하기 이전에 환자에게 항체 레벨 또는 프로필이 기준 값을 측정하고 처치후 상기 프로필 또는 레벨에 대한 값을 비교하는 과정을 포함한다. 레벨 또는 프로필 값의 유의적인 증가(즉, 동일한 샘플의 반복 측정에서 실험적인 오류의 전형적인 차이 보다 더 크며, 이러한 측정치의 평균으로부터 표준 편차로서 표현함)는 긍정적인 처치 결과를 나타낸다(즉, 상기 제제의 투여로 원하는 결과를 획득함을 나타낸다). 면역 반응에 대한 값이 유의적으로 변화지 않는 경우, 또는 감소되는 경우, 부정적인 처치 결과를 나타내는 것이다.
다른 방법에서, 레벨 또는 프로필의 대조값(즉, 평균 및 표준편차)은 대조 집단에 대해 측정한다. 전형적으로, 대조 집단내 개체에 대해서는 사전 처치를 수행하지 않았다. 치료제의 투여후 환자에서 레벨 또는 프로필의 측정된 값은 대조값 과 비교한다. 대조값에 비해 유의적인 증가(예를 들어, 평균으로부터 표준 편차보다 큼)는 긍정적인 또는 충분한 처치 결과를 나타낸다. 유의적인 증가 또는 감소가 없다는 것은 부정적이거나 불충분한 처치 결과를 나타낸다. 상기 레벨이 대조값에 비해 증가하는 동안 제제의 투여는 일반적으로 계속된다. 이전과 같이, 대조값에 대해 평탄역의 획득은 처치를 중단할 것인지 또는 투여량 및/또는 투여 빈도를 감소시킬 것인지에 대한 지표가 된다.
다른 방법에서, 레벨 또는 프로필의 대조값(예를 들어, 평균 및 표준 편차)는 치료제를 이용하여 처치받은 개체 및 레벨 또는 프로필이 처치에 반응하여 평탄화되는 개체로 이루어진 대조 집단으로부터 결정된다. 환자에서 레벨 또는 프로필의 측정값은 대조값과 비교한다. 환자에서의 측정값이 대조값과 유의적으로 상이하지 않은 경우(예를 들어, 표준 편차 보다 큼), 처치를 중단할 수 있다. 환자에서의 상기 레벨이 대조값 보다 유의적으로 낮은 경우, 제제의 계속적인 투여가 보장되어야 한다. 환자에서의 레벨이 대조값 이하로 지속되는 경우, 처치의 변화를 나타내는 것일 수 있다.
다른 방법에서, 현재 처치받고 있지 않으나 이전에 처치받은 적이 있는 환자는 항체 레벨 또는 프로필에 대해 모니터링하여 처치의 재개 여부를 결정한다. 환자에서 측정된 레벨 또는 프로필은 이전 처치 과정 후 환자에서 이전에 획득된 값과 비교할 수 있다. 이전 측정치에 대한 유의적인 감소(즉, 동일한 샘플의 반복 측정에서 오류의 전형적인 차이 보다 큼)는 처치를 재개할 수 있다는 표시이다. 또는, 환자에서 측정된 값은 처치를 수행한 후 환자의 집단에서 측정한 대조값(평균 + 표준 편차)과 비교할 수 있다. 또는, 환자에서 측정된 값은 질병의 증후가 없는 예방적으로 처치된 환자 집단 또는 질병 특성의 경감을 나타내는 치료적으로 처치된 환자 집단에서의 대조값과 비교할 수 있다. 이들 모든 경우에 있어서, 대조 레벨에 대한 유의적인 감소(즉, 표준 편차 보다 큼)는 환자에서 처치를 재개하여야만 하는 것을 나타내는 지시자이다.
분석을 위한 조직 샘플은 전형적으로 환자로부터 취한 혈액, 혈장, 혈청, 점액 또는 뇌척수액이다. 상기 샘플은 예를 들어 Aβ펩티드에 대한 항체의 레벨 또는 프로필, 예를 들어 인가화 항체의 레벨 또는 프로필에 대해 분석한다. Aβ에 특이적인 항체를 검출하는 ELISA 방법은 실시예 부분에 기술한다. 몇몇 방법에서, 투여된 항체의 레벨 또는 프로필은 예를 들어, 본원에 기술한 바와 같이 시험관내 식세포작용 분석에서 제거 분석을 이용하여 측정하였다. 이러한 방법에서, 테스트중인 환자로부터 유래한 조직 샘플은 아밀로이드 침착물(예를 들어, PDAPP 마우스로부터 유래함) 및 Fc 수용체를 보유하는 식세포작용 세포와 접촉시킨다. 이러서, 아밀로이드 침착물의 후속 제거를 모니터링한다. 제거 반응의 존재 및 정도는 테스트중인 환자의 조직 샘플에서 Aβ를 제거하는 데 효과적인 항체의 존재 및 레벨의 표시를 제공한다.
수동 면역화후 항체 프로필은 전형적으로 항체 농도에서 직접적인 피크를 나타내며, 지수적 감쇠를 수반한다. 추가 투여하지 않으면, 상기 감쇠는 투여된 항체의 반감기에 따라 수일 내지 수개월의 기간내에 예비처치 레벨에 접근한다.
몇몇 방법에서, 환자에서 Aβ에 대한 항체의 기준 측정은 투여 전에 수행하 며, 제2 측정은 직후에 수행하여 피크 항체 레벨을 결정하며, 1회 이상의 추가 측정은 항체 레벨의 감쇠를 모니터링하기 위해 일정한 간격으로 수행한다. 항체의 레벨이 기준 또는 기준 이하 피크의 기결정된 백분율(예를 들어, 50%, 25% 또는 10%)로 감소하는 경우, 항체의 추가 투여량을 투여한다. 몇몇 방법에서, 백그라운드 이하의 피크 또는 후속 측정된 레벨은 이전에 측정된 참조 레벨과 비교하여 다른 환자에서 유익한 예방적 또는 치료적 처지를 구성한다. 측정된 항체 레벨이 참조 레벨 보다 유의적으로 더 적은 경우(예를 들어, 처치받고 있는 환자 집단에서 참조 값의 평균 - 표준 편차 보다 적음), 이는 항체의 추가 투여를 나타내는 것이다.
처치 과정에 걸쳐 당업계에서 인지된 임의의 생리적 증후(예를 들어, 물리적 증후 또는 정신적 증후)의 모니터링을 포함하는 추가의 방법은 일상적으로 아밀로이드형성성 질병(예를 들어, 알츠하이머병)을 진단 또는 모니터링하는 연구원 또는 치료의에 의존한다. 예를 들어, 인식 장애를 모니터링할 수 있다. 후자는 알츠하이머병 및 다운 증후군의 증후가나, 이들 질병중 어느 하나이 다른 특성 없이 발생할 수 있다. 예를 들어, 인식 장애는 처치 과정 전체를 통해 관례에 따라 미니-메탄 스테이트 이그잼에서 환자의 스코어를 측정함으로써 모니터링할 수 있다.
C. 키트
본 발명은 상기한 모니터링 방법을 수행하기 위한 키트를 추가로 제공한다. 전형적으로, 이러한 키트는 Aβ에 대한 항체에 특이적으로 결합하는 제제를 함유한다. 또한, 상기 키트는 표지를 포함한다. Aβ에 대한 항체의 검출을 위해, 상기 표지는 전형적으로 표지된 항-이디오타입 항체의 형태이다. 항체의 검출을 위해, 상 기 제제는 고체 상, 예를 들어 미량적정 접시의 웰에 미리결합된 상태도 제공될 수 있다. 또한, 키트는 전형적으로 키트의 사용을 위한 지침을 제공하는 라벨을 포함한다. 또한, 상기 라벨은 Aβ에 대한 항체의 레벨과 측정된 레벨과의 상관 관계를 나타내는 차트 또는 다른 상응하는 레짐(regime)을 포함할 수 있다. "라벨(또는 표지)"은 키트의 제조, 수송, 판매 또는 사용중 임의의 시간에 키트에 부착되거나 또는 키트에 동봉되는 임의의 쓰여진 재료 또는 기록된 재료를 의미한다. 예를 들어, 라벨은 광고 인쇄물 및 브로셔, 포장재, 지침서, 오디오 또는 비디오카세트, 컴퓨터 디스크 뿐만 아니라 키트 상에 직접 인쇄된 문자를 포함한다.
또한, 본 발명은 진단 키트, 예를 들어 연구, 검출 및/또는 진단 키트(예를 들어, 생체내 영상화를 수행하기 위한 것)를 제공한다. 이러한 키트는 전형적으로 Aβ의 에피토프, 바람직하게는 잔기 1-10 내의 에피토프에 결합하기 위한 항체를 함유한다. 바람직하게는, 상기 항체는 의도된 용도, 예를 들어 생체내 영상화 분석을 수행하기 위한 용도를 수행하기 위한 지침으로 표지된다. 예시적인 항체는 본원에 기술한 항체이다.
D. 생체내 영상화
본 발명은 환자에서 아밀로이드 침착물의 생체내 영상화 방법을 제공한다. 이러한 방법은 알츠하이머병 또는 그에 대한 민감성의 진단 또는 진단을 확인하는 데 유용하다. 예를 들어, 상기 방법은 치매의 증후를 나타내는 환자에게 사용할 수 있다. 환자가 비정상적인 아밀로이드 침착을 보유하는 경우, 환자는 알츠하이머병을 앓을 것으로 생각된다. 또한, 상기 방법은 증후를 나타내지 않는 환자에 대해서 도 사용할 수 있다. 아밀로이드의 이상 침착의 존재는 향후 증후를 나타내는 질병에 대한 민감성을 나타낸다. 또한, 상기 방법은 알츠하이머병으로 이전에 진단된 환자에서 질병의 진행 및/또는 처치에 대한 반응을 모니터링하는 데 유용하다.
상기 방법은 Aβ에 결합하는 항체와 같은 제제을 환자에게 투여하고, 이어서 결합된 후 상기 제제를 검출함으로써 수행된다. 바람직한 항체는 환자에서 전장 APP 폴리펩티드에 결합하지 않고 Aβ침착물에 결합한다. 아미노산 1-10 내의 Aβ의 에피토프에 결합하는 항체가 특히 바람직하다. 몇몇 방법에서, 상기 항체는 Aβ의 아미노산 7-10 내의 에피토프에 결합한다. 이러한 항체들은 전형적으로 실질적인 제거 반응을 유도하지 않고 결합한다. 다른 방법에서, 상기 항체는 Aβ의 아미노산 1-7 내의 에피토프에 결합한다. 이러한 항체는 전형적으로 Aβ에 결합하여 Aβ에 대한 제거 반응을 유도한다. 그러나, 제거 반응은 Fabs와 같은 전장 불변부 영역이 결여된 항체 단편을 이용함으로써 피할 수 있다. 몇몇 방법에서, 동일한 항체는 치료제 및 진단제 둘 다로서 작용할 수 있다. 일반적으로, Aβ의 잔기 10에 대해 C 말단 에피토프에 결합하는 항체는 Aβ의 잔기 1-10 내의 에피토프에 결합하는 항체 만큼 강한 신호를 나타내지 않는데, 그 이유는 아마도 C-말단 에피토프가 아밀로이드 침착물내에 접근할 수 없기 때문이다. 따라서, 이러한 항체는 덜 바람직하다.
진단제는 환자 체내로의 정맥내 주사, 또는 두개골내 주사 또는 두개골 천공에 의해 뇌내로 주입함으로써 투여할 수 있다. 상기 제제의 투여량은 처치 방법에서 기술한 범위와 동일한 범위내이어야 한다. 전형적으로, 상기 제제는 표지되고, 몇몇 방법에서 Aβ에 대한 친화도를 가진 1차 제제는 표지되지 않고 제2 표지화 제 제를 사용하여 일차 제제에 결합한다. 표지의 선택은 검출 수단에 따라 달라진다. 예를 들어, 형광 표지는 광학 검출을 위해 적합하다. 상자성 표지의 이용은 수술하지 않는 토모그래피 검출을 위해 적합하다. 또는, 방사활성 표지는 PET 또는 SPECT를 이용하여 검출할 수 있다.
진단은 상응하는 기준값에 대해 표지된 위치의 수, 크기 및/또는 세기를 비교함으로써 수행한다. 기준값은 병에 걸리지않은 개체로 이루어진 집단에서 평균 레벨을 의미할 수 있다. 또한, 기준값은 동일한 환자에서 결정된 이전 레벨을 의미할 수 있다. 예를 들어, 기준값은 처치를 시작하기 이전에 환자에서 결정될 수 있으며, 그후 측정된 값과 기준값을 비교한다. 기준값에 비해 값이 감소한다는 것은 처치에 대한 긍정적인 반응을 나타내는 것이다.
본 발명은 후술하는 비제한적인 예에 의해 더 구체적으로 기술될 것이다.
하기 서열 확인자는 면역글로불린 쇄 가변부 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 언급하기 위한 실시예 부분 전체에서 사용하였다.
항체 VL 뉴클레오티드 서열 VL 아미노산 서열 VH 뉴클레오티드 서열 VH 아미노산 서열
12B4 서열 번호 1 서열 번호 2 서열 번호 3 서열 번호 4
인간화 12B4v1 서열 번호 5 서열 번호 6 서열 번호 7 서열 번호 8
인간화 12B4v2 서열 번호 1 서열 번호 6 서열 번호 9 서열 번호 10
인간화 12B4v3 서열 번호 1 서열 번호 6 서열 번호 11 서열 번호 12
배계열 A19 서열 번호 29 서열 번호 30
카바트 ID
005036		 서열 번호 31 서열 번호 32
카바트 ID
000333		 서열 번호 33 서열 번호 34
배계열
VH4-61		 서열 번호 35 서열 번호 36
배계열
VH4-39		 서열 번호 37 서열 번호 38

본원에 사용한 바와 같이, 서열 번호 1-12 또는 29-38중 어느 하나에 기술한 바와 같은 VL 및/또는 VH 서열을 포하마는 항체 또는 면역글로불린은 완전 서열을 포함할 수 있거나 또는 성숙 서열(즉, 시그날 펩티드 또는 리더 펩티드가 없는 성숙 펩티드)를 포함할 수 있다.
실시예 I: 마우스 12B4 가변부의 클로닝 및 서열결정
12B4 VH의 클로닝 및 서열 분석
하이브리도마 세포로부터 유래한 12B4의 VH 및 VL 영역은 RT-PCR 및 하이브리도마 세포로부터 유래한 mRNA를 이용하는 5' RACE 및 표준 클로닝 방법을 이용하여 클로닝하였다. 추론된 12B4 VH 도메인을 암호화하는 2개의 독립적인 cDNA 클론으로부터 유도된 뉴클레오티드 서열(서열 번호 3) 및 추론 아미노산 서열(서열 번호 4)은 각각 표 2 및 표 3에 나타냈다.
[표 2]
마우스 12B4 VH DNA 서열
Figure 112004041053988-pct00001
*밑줄친 부분은 리더 펩티드
[표 3]
마우스 12B4 VH 아미노산 서열
Figure 112004041053988-pct00002
*리더 펩티드 및 CDRs(소문자)
12B4 VL의 클로니 및 서열 분석
12B4의 경쇄 가변 VL 영역은 VH 영역과 유사한 방식으로 클로닝하였다. 가정 12B4 VL 도메인을 암호화하는 2개의 독립적인 cDNA 클론으로부터 유도된 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1) 및 추정 아미노산 서열(서열 번호 2)은 각각 하기 표 4 및 표 5에 나타냈다.
[표 4]
마우스 12B4 VL DNA 서열
Figure 112004041053988-pct00003
Figure 112004041053988-pct00004
*밑줄친 부분은 리더 펩티드
[표 5]
마우스 12B4 VL 아미노산 서열
Figure 112004041053988-pct00005
*리더 펩티드 및 CDRs(소문자)
12B4 VL 및 VH 서열은, 이들이 개시 메티오닝으로부터 C-영역에 이르는 연속하는 ORF를 함유하고 면역글로불린 V 영역 유전자의 특징적인 보존된 잔기를 공유하는 한 기능적인 V 영역을 위한 조건을 충족시킨다. N-말단으로부터 C-말단까지 경쇄 및 중쇄 둘 다는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. Kabat 등(상기 문헌 참조)의 넘버링 방법에 따르면 각각의 도메인에 아미노산이 할당된다.
실시예 II: 키메라 12B4 항체의 발현
키메라 12B4 항체의 발현
가변 중쇄 및 경쇄 영역은 각각의 VDJ 또는 VJ 연접부 하류의 스플라이스 공여체 서열을 암호화하도록 재조작하고, 중쇄를 위해서는 포유동물 발현 벡터 pCMV-hγ1 내로 및 경쇄를 위해서는 pCMV-hκ1내\로 클로닝하였다. 이들 벡터들은 삽입된 가변부 카세트 하류의 엑손 단편으로서 인간 γ1 및 Cκ 불변부를 암호화하였다. 서열 확인후, 중쇄 및 경쇄 발현 벡터는 COS 세포 내로 동시 형질감염하였다. 여러가지 중쇄 클론은 상이한 키메라 경쇄 클론을 이용하여 독립적으로 동시 형질감염하여 상기 결과의 재현가능성을 확인하였다. 조정 배지는 형질감염 48 시간후에 수집하고, 항체 생성에 대해서는 웨스턴 블롯 분석으로 또는 Aβ결합에 대해서는 ELISA에 의해 분석하였다. 다수의 형질전환체 모두는 웨스턴 블롯 상에서 염소 항-인간 IgG(H+L) 항체에 의해 인지된 중쇄 + 경쇄 조합물을 별현하였다.
Aβ에 대한 키메라 12B4 항체의 직접 결합은 ELISA 분석으로 테스트하였다. 도 5는 키메라 12B4가 높은 결합 친화성(avidity)으로 Aβ에 대해 결합하는 것으로 확인되었으며, 이는 키메라 및 인간화 3D6에 의해 입증된 것과 유사하다(도 5)(3D6의 클로닝, 특성 규명 및 인간화는 미국 특허 출원 10/010,942(본원에 참고 인용함)에 기술되어 있다). 또한, ELISA 기초한 경쟁 억제 분석을 통해 키메라 12B4 및 쥐광동물 12B4 항체는 Aβ에 대한 결합에서 비오티닐화된 쥐과동물 및 키메라 3D6 뿐만 아니라 10D5(12B4와 동일한 에피토프를 인식하는 IgGγ1 이소타입의 쥐과동물 모노크로날 항체)와 동일하게 경쟁한다. 도 6은 키메라 12B4(점선, △)가 비오티닐화된 쥐과동물 12B4의 Aβ1-42 펩티드에 대한 결합에 있어서 동일한 능력으로 그의 비-비오티닐화된 쥐과동물 상응물(진한선, ▲)과 경쟁하는 것을 입증한다.
실시예 III: PDAPP 마우스에서 여러가지 신경병리학적 종말점에 대한 mAb 12B4의 효능
본 실시예는 여러가지 신경병리학적 종말점에 대한 쥐과동물 mAb 12B4의 효능을 기술한다. 2개의 mAb, 12B4 및 3D6의 비교를 기술한다. 상기 mAb 둘 다는 IgG2a 아이소타입의 것이며 둘 다는 Aβ펩티드의 N-말단내 에피토프에 결합한다.
면역화
PDAPP 마우스는 둘 다 IgGγ2a 이소타입인 mAb 12B4(Aβ3-7을 인식함) 또는 mAb 3D6(Aβ1-5를 인식함)로 수동 면역화하였다. 12B4는 10 mg/kg으로 테스트하였다. 3D6은 3가지의 상이한 투여량, 즉 10 mg/kg, 1 mg/kg 및 10 mg/kg(월 1회, 1 x 4)으로 투여하였다. 관련없는 IgGγ2a 항체(TY 11/15) 및 PBS 주사액은 대조군으로 사용하였다. Aβ펩티드를 이용하는 능동 면역화는 비교를 위해 수행하였다. 각각의 군에서 20-35 마리의 동물을 분석하였다.
분석된 신경병리학적 종말점은 아밀로이드 존재량 및 신경염성 존재량을 포함한다.
아밀로이드 존재량
아밀로이드 침착물이 있는 전두 피질의 정도는 3D6을 이용한 면역염색 후 정량 이미지 분석에 의해 결정하였다. 이 분석의 결과는 표 6에 나타냈다. 모든 면역요법(예를 들어, 12B4, 3D6(테스트한 모든 투여량) 및 Aβ펩티드를 이용하는 면역화)은 아밀로이드 존재량의 유의적인 감소를 초래하였다.
신경염성 존재량
이전에, 10D5는 신경염성 존재량을 유의저으로 감소시킬 수 없는 것으로 관찰되어 왔는데, 이는 다른 이소타입은 아니고 IgGγ2a 이소타입의 항체가 알츠하이머병의 동물 모델에서 신경염성 존재량을 감소시킬 수 있음을 의미하는 것이다(데이타는 제시하지 않음). 12B4 대 3D6(둘 다 IgGγ2a 이소타입임)을 이용한 수동 면역화후 신경염성 존재량은 항-APP 항체 8E5를 이용하여 뇌 부분을 면역염색하고, 이어서 정량적인 영상 분석에 의해 PDAPP 마우스에서 결정할 수 있다. 신경염성 영양장애는 아미로이드 반점의 바로 근처에 위치하는 아밀로이드 반점의 영양실조성 신경돌기(예를 들어, 구형 외관의 신경돌기)이 출현에 의해 확인된다. 이러한 분석 결과는 하기 표 7에 나타냈다. 이들 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 12B4를 이용한 처치가 신경염성 존재량을 유의적으로 감소시킴을 나타낸다. 대조적으로, 3D6은 신경염성 존재량을 유의적으로 감소시키지 않았다.
전두골 피질 아밀로이드 존재량
PBS TY 11/15 12B4 3D6,
10 mg/kg		 3D6,
1 mg/kg		 3D6,
10 mg/kg/4주		 활성
N 31 30 33 29 31 32 24
평균(%AB) 15.182297 13.303288 2.317222 0.865671 2.286513 1.470956 2.162772
범위 0.160-31.961 0-61.706 0-14.642 0-7.064 0.077-63.362 0-10.688 0-30.715
p 값(*M-W) .9425ns ***<.0001 ***.0001 ***<.0001 ***<.0001 ***.0004
변화율(%) N/A 12% 85% 94% 85% 90% 86%

전두골 피질 신경염성 존재량
PBS TY 11/15 12B4 3D6,
10 mg/kg		 3D6,
1 mg/kg		 3D6,
10 mg/kg/4주		 활성
N 31 30 33 29 31 32 24
평균(%AB) 0.3946 0.3958 0.0816 0.4681 0.3649 0.4228 0.2344
범위 0-1.3828 0-2.6800 0-0.8127 0-1.3098 0-1.5760 0-1.8215 0-1.1942
p 값(*M-W) .8967ns ***.0002 .9587ns .6986ns >.9999 ***.0381
변화율(%) 0% 79% 0% 7% 0% 41%

상기 결과는 IgGγ2a 아이소타입의 Aβ 항체를 이용한 치료가 피룡할 수 있 으나, 신경염성 존재량을 감소시키는 데 충분한 것은 아님을 나타낸다. 구별되는 에피토프(즉, Aβ3-7)에 의한 결합은 또한 PDAPP 마우스에서 이 병리적 현상을 감소시키는 데 필수적일 수 있다.
알츠하이머병의 PDAPP 마우스 모델에서 여러가지 신경병리학적 종말점의 특정화는 적합한 인간 치료적 면역화 프로토콜을 디자인하는 당업자에 의해 사용될 수 있는 가치있는 정보를 제공한다. 예를 들어, 신경염성 존재량의 감소는 Aβ의 잔기 3-7 내의 에피토프에 결합하는 IgG1 서브타입의 인간화 버젼(즉, IgGγ2a 서브타입의 인간 균등물)을 이용하여 인간 환자에서 수행할 수 있다.
실시예 IV: 아밀로이드 침착물에 대한 항체의 활성에 대한 생체외 스크리닝 분석
반점 제거에 대한 항체의 효과를 조사하기 위해, 일차 소신경교 세포를 PDAPP 마우스 또는 인간 AD 뇌의 비고정 저온 유지 부분과 함께 배양하는 생체외 분석을 이용하였다. 소신경교 세포는 신생 DBA/2N 마우스(1-3일)의 대뇌 피질로부터 얻었다. 피질은 DNase I(시그마) 50 ㎍/ml를 보유하는 HBSS--(행크의 균형 염 용액, 시그마) 내에서 기계적으로 분해시켰다. 분해된 세포는 100 ㎛ 세포 스트레이너(팔콘)로 여과하고, 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 펠렛은 성장 배지(고 글루코즈 DMEM, 10% FBS, 25 ng/ml 재조합 쥐과동물 GM-CSF(rmGM-CSF)) 내에서 현탁시키고, 세포는 T-75 플라스틱 배양 플라스크 당 2개의 뇌의 밀도로 평판배양하였다. 7-9일후, 상기 플라스크는 궤도 진탕기 상에서 200 rpm, 37℃의 조건에서 2 시간 동안 회전시켰다. 세포 현탁액은 1000 rpm에서 원심분리하고, 분석 배지 내에 재현탁하였다.
PDAPP 마우스 또는 인간 AD 뇌(사후 간격 < 3 시간)의 10-㎛ 저온 유지 부분은 폴리라이신 피복된 원형 유리 커버 슬립 상에서 해동하고, 24 웰 조직 배양 플레이트의 웰 내에 위치시켰다. 커버슬립은 1% FBS를 가진 H-SFM(하이브리도마-무혈청 배지, 기브코 BRL), 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 및 5 ng/ml rmGM-CSF(R&D)로 이루어진 분석 배지로 2회 세척하였다. 대조군 항체 또는 항-Aβ항체(12B4)는 1 시간 동안 2x 농도(5 ㎍/ml 최종)로 첨가하였다. 이어서, 소신경교 세포는 분석 배지 1 ml 당 0.8 x 106 세포의 밀도로 시딩하였다. 배양물은 가습 항온처리기(37℃, 5% CO2) 내에서 24 시간 이상 동안 유지시켰다. 항온처리 말미에 배양물은 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 0.1% 트리톤-X100으로 투과가 가능하도록 만들었다. 부위는 비오티닐화된 3D6, 이어서 스트렙타비딘/Cy3 접합체(잭슨 이뮤노리서치)로 염색하였다. 외인성 소신경교 세포는 핵 염색(DAPI)으로 시각화하였다. 배양물은 역 형광 현미경(니콘 TE300)으로 관찰하고, 현미경 사진은 SPOT 소프트웨어를 이용하는 SPOT 디지탈 카메라(디아그노스틱 인스트루먼츠)로 촬영하였다.
생체내 활성을 보유하지 않은 대조 항체의 존재 하에서 PDAPP 뇌 부분을 이용하여 상기 분석을 수행하는 경우, β-아밀로이드 반점은 원형의 상태로 남아있으며, 식세포작용은 관찰되지 않았다. 대조적으로, 인접 부위가 3D6 또는 12B4의 존재 하에서 배양되는 경우, 아밀로이드 침착물은 거의 없어지며, 소신경교 세포는 A β를 함유하는 다수의 식세포작용성 낭을 나타냈다(도 7). AD 뇌 부분을 이용하는 경우 유사한 결과가 얻어졌으며; 3d6(인간화 버젼) 및 키메라 12B4는 AD 반점의 식세포작용을 유도하는 반면, 대조군 IgG1은 효과가 없었다(도 8A-B).
실시예 II 및 III에 제시한 데이타를 통해 클로닝된 12B4 가변부의 기능을 확인할 수 있다.
실시예 V: 12B4 인간화
A: 12B4 인간화 항체, 버젼 1
상동성/분자 모델링
쥐과동물 12B4 항체 내에서 중요한 구조 프레임웍 잔기를 확인하기 위해, 중쇄 및 경쇄에 대해 가장 가까운 쥐광동물 항체에 기초하여 3차원 모델을 생성하였다. 이 목적으로 위해, 2PCP로 지정된 항체는 12B4 경쇄를 모델링하기 위한 주형으로서 선택하였으며(PDB ID: 2PCP, Lim 등 (1998) J. Biol. Chem. 273: 28576), 1ETZ으로 지정된 항체는 중쇄를 모델링하기 위한 주형으로서 선택하였다(PDB ID: 1ETZ, Guddat 등 (2000) J. Mol. Biol. 302: 853). 12B4와 이들 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열 정렬은 2PCP 및 1ETZ 항체가 12B4와 유의적인 서열 상동성을 공유함을 나타낸다. 또한, 선택된 항체의 CDR 루프는 12B4의 CDR 루프와 동일한 정규 Chothia 구조 부류에 속한다. 따라서, 2PCP 및 1ETZ이 먼저 12B4의 상동성 모델링을 위한 구조가 밝혀진 항체로서 선택되었다.
상기한 항체에 기초한 12B4 가변부의 제1 패스 상동성 모델은 Look & SegMod Modules GeneMine(v3.5) 소프트웨어 패키지를 이용하여 구성하였다. 이 소프트웨어 는 몰큘라 어플리케이션즈 그룹(미국 캘리포니아 팔로알토)으로부터 영구 계약하에 구입하였다. 이 소프트웨어 패키지는 Dr. Michael Levitt 및 Chris Lee에 의해 구성되었으며, 서열 상동성에 기초하여 알려진 구조의 주형 상에서 일차 서열을 구조 모델링하는 것에 관련된 단계를 자동화함으로써 분자 모델링 프로세스를 용이하게 한다. 유닉스 환경에서 실리콘 그래픽스 IRIS 워크스테이션 상에서 작업하는 경우, 모델링된 구조는 바람직하지 않은 원자 접촉을 경감하고 정전기 상호작용 및 반데르 바알스 상호작용을 최적화하는 일련의 에너지 최소화 단계에 의해 자동적으로 구체화된다. 추가의 구체화된 모델은 Quanta(등록상표)의 모델링 용량을 이용하여 생성하였다.
인간 수용체 항체 서열의 선택
적합한 인간 수용체 항체 서열은 마우스 가변부의 아미노산과 공지된 인간 항체의 서열을 컴퓨터 비교함으로써 확인하였다. 비교는 12B4 중쇄 및 경쇄에 대해 별도로 수행하였다. 구체적으로, 프레임웍 서열이 쥐과동물 VL 및 VH 프레임웍 영역과 높은 정도의 서열 동일성을 나타내는 인간 항체로부터 유래한 가변 도메인은 각각의 쥐과동물 프레임웍 서열을 가진 NCBI BLAST(NIH NCBI 인터넷 서버를 통해 공개적으로 접속할 수 있음)을 이용하여 Kabat 데이타베이스의 질의에 의해 확인하였다.
다음과 같은 기준에 기초하여 2개의 후보 서열을 수용체 서열로 선택하였다: (1) 환자 서열과의 상동성; (2) 공여체 서열과 정규 CDR 구조의 공유; 및 (3) 프레임웍 영역내 임의의 희귀한 아미노산 잔기를 함유하지 않음. VL에 대해 선택된 수 용체 서열은 Kabat ID No.(KABID) 005036(진뱅크 등록 번호 X67904) 및 VH에 대해 선택된 서열은 KABID 000333(진뱅크 등록 번호 X54437)이다. 인간화 3D6 항체의 첫번째 버젼은 이들 선택된 수용체 항체 서열을 이용한다.
아미노산 잔기의 치환
상기한 바와 같이, 본 발명의 인간화 항체는 실질적으로 인간 면역글로불린(수용체 면역글로불린)으로부터 유래한 가변 프레임웍 영역 및 실질적으로 12B4라 칭하는 마우스 면역글로불린(공여체 면역글로불린)으로부터 유래한 상보성 결정 영역을 포함한다. 12B4 및 적합한 인간 수용체 면역글로불린이 상보성 결정 영역을 확인한 후, 다음 단계는 생성된 인간화 항체의 특성을 최적화하기 위해 이들 성분으로부터 유래한 잔기를 치환할 필요가 있는지 여부를 결정하였다.
재성형된 경쇄 V 영역:
재성형된 경쇄 V 영역의 아미노산 정렬은 도 1에 나타냈다. 수용체 프레임웍(KABID 005036)의 선택은 쥐과동물 V 영역에 상응하는 것과 동일한 인간 아군으로부터 이루어지며, 일반적이지 않은 프레임웍 잔기를 보유하지 않으며, CDRs은 동일한 Chothia 정규 구조 군에 속한다. 단일 역 돌연변이(I2V)는 이 잔기가 정규 분류 내에 속하는 것을 나타낸다, 재성형된 VL의 버젼 1은 완전히 배계열이다.
재형성된 중쇄 V 영역:
재성형된 중쇄 V 영역의 아미노산 정렬은 도 2에 나타냈다. 수용체 프레임웍(KABID 000333)의 선택은 쥐과동물 V 영역에 상응하는 것과 동일한 인간 아군으로부터 이루어지며, 일반적이지 않은 프레임웍 잔기를 보유하지 않으며, CDRs은 동일 한 Chothia 정규 구조 군에 속한다. 쥐과동물 서열에 대해 KABID 000333의 아미노산 정렬과 함께 쥐과동물 VH 쇄의 구조 모델링은 재성형된 중쇄의 버젼 1(v1)내의 9개의 역 돌연변이를 나타낸다: L2V, V24F, G27F, I29L, I48L, G49A, V67L, V71K & F78V(Kabat 넘버링). 상기 역 돌연변이는 도 2에 나타낸 아미노산 정렬에서 *로 강조하였다.
9개의 역 돌연변이중, 4개는 상기 모델에 의해 해석되는데, 그 이유는 상기 잔기는 정규 잔기(V24F, G27F, I29L & V71K 진한 박스로 나타냄). 즉 CDR 잔기에 인접함으로써 항원 결합에 기열할 수 있는 프레임웍 잔기이기 때문이다. 잔기의 다음으로 중요한 부류에서 필요한 역 돌연변이 VH-VL 팩킹 상호작용에 관련된 계면 잔기(오픈 박스로 표시함)는 존재하지 않는다. 역 돌연변이에 표적화된 남아있는 5개의 잔기(L2V, I48L, G49A, V67L, F78V, Kabat 넘버링) 모두는 버니어 부류에 속한다(CDR 형태에 대한 간접 기여, 도 2에서 진한 점선의 박스).
버젼 2는 최소한의 비-CDR 쥐과동물 잔기를 보유하는 것으로 구성하였다. L2V 역돌연변이는 비-배계열 변화를 도입하며(배계열 참조로서 VH4-61을 사용하는 경우), 이 역돌연변이는 중쇄의 버젼 2 내에서 제거되어 그것을 배계열로 복원시켰다. 또한, 남아있는 4개의 버니어 부류 역 돌연변이는 중쇄의 버젼 2 내에서 복원되었다(I48L, G49A, V67L, F78V). 따라서, 버젼 2는 총 5개의 비-CDR 쥐과동물 잔기(VL내 1개, VH내 4개)를 함유한다. 버젼 3은 5개의 버니어 잔기중 2개의 잔기(I48L & F78V)를 복원하도록 구성하였는데, 이는 상기 모델이 더 중요한 버니어 잔기일 수 있음을 나타내는 것이다. 따라서, 버젼 3은 총 7개의 CDR 쥐과동물 잔기를 함유한다.
인간화 12B4의 버젼 1, 2 및 3내로 혼입된 변화는 하기 표 8에 요약하였다.
인간화 12B4.v1내 변화의 요약
변화 VL(111 잔기) VH(123 잔기)
Hu->Mu: 프레임웍 1/111 9/123
CDR1 8/16 7/7
CDR2 3/7 8/16
CDR3 6/8 10/13
전체 Hu->Mu 18/111(16%) 34/123(28%, v2=23%)
Mu->Hu: 프레임웍 10/111 16/123
역돌연변이 노트 1. I2V: 정규 위치 2. 정규: V24F, G27F, I29L & V71K
3. 팩킹: 없음
4. 버니어: L2V*, I48L*#,
G49A*, V67L*, F78V*#
수용체 노트 5. KABID 005036/진뱅크
Acc#-x67904
6. 공여체 마우스로서 동일한 정규 구조 군으로부터 유래한 CDR
7. SLE 환자로부터 유래한 항-카디오리핀/ss DNA 자가항체		 8. KABID 000333/진뱅크
Acc#x54437
9. 공여체 마우스로서 동일한 정규 구조 군으로부터 유래한 CDR
10. RA 환자로부터 유래한 류마티스양 인자 mAb
* v2 및 v3에서 제거
# v2에서 제거, v3에서 회복

표 10 및 11은 각각 여러가지 경쇄 및 중쇄에 대한 카바트 넘버링 키를 기술한다.
[표 9]
경쇄에 대한 카바트 넘버링 키
Figure 112004041053988-pct00006
Figure 112004041053988-pct00007
Figure 112004041053988-pct00008
Figure 112004041053988-pct00009
[표 10]
중쇄에 대한 카바트 넘버링 키
Figure 112004041053988-pct00010
Figure 112004041053988-pct00011
Figure 112004041053988-pct00012
Figure 112004041053988-pct00013
인간화 항체는 107, 108, 109 또는 1010 M-1 이상의 Aβ에 대한 특이적인 결합 친화도를 나타내는 것이 바람직하다. 통상적으로 Aβ에 대한 인간화 항체의 결합 친화도의 상한은 12B4에 대한 인간화 항체의 결합 친화도(즉, ～109 M-1)의 3배(factor), 4배 또는 5배 내에 있다. 또한, 종종 결합 친화도의 하한치는 12B4의 결합 친화도의 3배, 4배 또는 5배 범위 내에 있다.
인간화 12B4 VH 및 VL, 버젼 1의 어셈블리 및 발현
도 9a는 인간화 VL.v1의 PCR 매개된 어셈블리를 위한 전략을 나타내는 모식도이다. 도 9b는 인간화 VH.v1의 PCR 매개된 어셈블리를 위한 전략을 나타내는 모식도이다. 표 11은 12B4v1의 PCR 매개된 어셈블리를 위해 사용된 프라이머를 나타 낸다.
인간화 12B4 V 영역, v1의 PCR 매개된 어셈블리에 사용된 합성 올리고뉴클레오티드
DNA# 크기 코딩
가닥?		 서열 코멘트
4881 135 예
Figure 112004041053988-pct00014
 올리고스 등에 의해 합성된 hum12B4 VLv1A 프라이머
nts> 1>115 12B4VLv1.cons, 센스 스트랜드. HindIII 부위 + 코작 컨센서스
서열 번호 13
4882 131 아니오
Figure 112004041053988-pct00015
 올리고스 등에 의해 합성된 hum12B4 VLv1B 프라이머
역 보체 DNA
서열 12B4VLv1.cons(85,215)
서열 번호 14
4883 132 예
Figure 112004041053988-pct00016
 올리고스 등에 의해 합성된 hum12B4 VLv1C 프라이머
nts 185>316 12B4VLv1.cons,
센스 스트랜드
서열 번호 15
4884 130 아니오
Figure 112004041053988-pct00017
 올리고스 등에 의해 합성된 hum12B4 VLv1D 프라이머
역 보체 DNA 서열
12B4VLv1.cons(286,397)
스플라이스 공여체+BamHI 부위 첨가
서열 버호 16
4885 143 예
Figure 112004041053988-pct00018
 올리고스 등에 의해 합성된 hum12B4 VHv1A 프라이머
12B4VHv1.cons nts 1-122,
코작 컨센서스 및 HindIII 부위 첨가
서열 번호 17

4886 137 아니오
Figure 112004041053988-pct00019

 올리고스 등에 의해 합성된 hum12B4 VHv1B 프라이머
역 보체 DNA 서열 12B4VHv1.cons(94,230)
서열 번호 18
4887 138 예
Figure 112004041053988-pct00020

 올리고스 등에 의해 합성된 hum12B4 VHv1C 프라이머
12B4VHv1.cons nts201-338
서열 번호 19
4888 139 아니오
Figure 112004041053988-pct00021
 올리고스 등에 의해 합성된 hum12B4 VHv1D 프라이머
역 보체 DNA 서열
12B4VHv1.cons(307,427)
스플라이스 공여체 + BamHI 부위를 3' 단부에 첨가
서열 번호 20
4889 22 예
Figure 112004041053988-pct00022
 hum 12B4 VLv1, A+B For
프라이머% A+T = 45.45
[10]; % C+G = 54.55
[12] Davis, Botstein, Roth
융점(℃) 64.54
서열 번호 21
4890 21 아니오
Figure 112004041053988-pct00023
 hum 12B4 VLv1, A+B bak
프라이머% A+T = 38.10
[8]; % C+G = 61.90
[13] Davis, Botstein, Roth
융점(℃) 66.47
서열 번호 22

4891 20 예
Figure 112004041053988-pct00024
 hum 12B4 VLv1, C+D For
프라이머% A+T = 40.00
[10]; % C+G = 60.00
[12] Davis, Botstein, Roth
융점(℃) 64.50
서열 번호 23
4892 28 아니오
Figure 112004041053988-pct00025
 hum 12B4 VLv1, C+D bak
프라이머% A+T = 57.14
[10]; % C+G = 42.86
[12] Davis, Botstein, Roth
융점(℃) 64.61
서열 번호 24
4893 23 예
Figure 112004041053988-pct00026
 hum 12B4 VHv1, A+B For
프라이머% A+T = 47.83
[10]; % C+G = 52.17
[12] Davis, Botstein, Roth
융점(℃) 64.55
서열 번호 25
4894 24 아니오
Figure 112004041053988-pct00027
 hum 12B4 VHv1, A+B bak
프라이머% A+T = 50.00
[10]; % C+G = 50.00
[12] Davis, Botstein, Roth
융점(℃) 64.57
서열 번호 26
4895 22 예
Figure 112004041053988-pct00028
 hum 12B4 VHv1, C+D For
프라이머% A+T = 45.45
[10]; % C+G = 54.55
[12] Davis, Botstein, Roth
융점(℃) 64.54
서열 번호 27
4896 24 아니오
Figure 112004041053988-pct00029
 hum 12B4 VHv1, C+D For
프라이머% A+T = 50.00
[10]; % C+G = 50.00
[12] Davis, Botstein, Roth
융점(℃) 64.57
서열 번호 28

등몰량의 VHv1A+VHv1B 및 VHv1C+VHv1D 합성 단편은 표준 과정을 이용하여 별도의 반응 튜브 내에서 쌍으로 어닐링시켰다. A+B 어닐링 반응은 프라이머 A+B 순방향 및 프라이머 A+B 역방향을 사용하는 PCR을 이용하여 60℃ 어닐링 25 사이클로 어셈블링시켰다. 유사하게, C+D 어닐링 반응은 동일한 조건 하에서 PCR 프라이머 C+D 순방향 및 프라이머 C+D 역방향을 이용하여 어셈블링시켰다. PCR-어셈블링된 5' A+B 절반 및 3' C+D 절반은 최종 PCR-매개된 어셈블리를 위해 겔 정제하였다. 완전 V 영역 어셈블리는 A+B 어셈블링된 5' 절반과 V-영역의 C+D 3' 절반을 혼합하고, 어닐링하고 VHv1A+B 순방향 프라이머 및 VHv1C+D 역방향 프라이머를 이용하는 PCR에 의해 연장시킴으로써 수행하였다. 상기 방식으로 어셈블링된 전장 VH 및 VL 영역은 겔 정제하고, DNA 서열 확인을 위해 pCRScript 내로 클로닝하였다.
인간화 12B4VL(버젼 1)의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 5) 및 12B4VH1(버젼 1)의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 7)은 각각 하기 표 12 및 표 13에 나타냈다.
[표 12]
인간화 12B4VLv1의 뉴클레오티드 서열
Figure 112004041053988-pct00030
[표 13]
인간화 12B4Vv1의 뉴클레오티드 서열
Figure 112004041053988-pct00031
B. 인간화 12B4 버젼 2 항체
인간화 12B4의 제2 버젼은 버젼 1에 대해 나타낸 각각의 치환을 보유하도록 생성하였으나, 잔기 2에서의 L →V 치환, 잔기 48에서 I →L 치환, 잔기 49에서 G →A 치환, 잔기 67에서 V →L 치환 및 잔기 78에서 F →V 치환은 예외로 하였다. 인간화 3D6 버젼 2 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 9 및 11에 나타냈다. 인간화 12B4 버젼 2 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 5 및 9에 나타냈다. 인간화 12B4 버젼 2 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 6 및 10에 나타냈다.
C. 인간화 12B4 버젼 3 항체
인간화 12B4의 제3 버젼은 버젼 1에 대해 나타낸 각각의 치환을 보유하도록 생성하였으나, 잔기 2에서의 L →V 치환, 잔기 49에서 G →A 치환 및 잔기 67에서 V →L 치환은 예외로 하였다. 인간화 3D6 버젼 2 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 1 및 9에 나타냈다. 인간화 12B4 버젼 3 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 5 및 11에 나타냈다. 인간화 12B4 버젼 3 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 6 및 12에 나타냈다.
실시예 VI. 인간 개체의 치료 및 예방
단일 투여량 단계 I 시험을 수행하여 인간에서의 안전성을 결정하였다. 치료제는 추정 효과의 약 0.01 레벨로부터 출발하여 상이한 환자에게 투여량을 증가시키면서 투여하였고, 약 10배의 효과적인 마우스 투여량 레벨에 다다를 때까지 3배씩 증가시켰다.
단계 II 시험을 수행하여 치료 효능을 측정하였다. 초기-중기 알츠하이머병을 가진 환자는 가능한 AD에 대해 알츠하이머병 및 관련 장애 위원회(ADRDA) 조건 을 이용하여 정했다. 적합한 환자는 미니 정신 상태 시험(Mini-Mental State Exam)에서 12-26의 범위로 평가하였다. 다른 선책 기준은 연구가 진행되는 동안 환자가 생존할 것인지와 방해가 될 수 있는 동시 약물 치료의 사용과 같은 복잡한 문제가 없느냐이다. 환자의 기준 평가는 전통적인 알츠하이머병 상태 및 기능으로 환자를 평가하기 위한 포괄적인 스케일인 MMSE 및 ADAS와 같은 전통적인 정신측정 방법을 이용하여 수행한다. 이들 정신측정 스케일은 알츠하이머 상태의 진행 측정치를 제공한다. 또한, 적합한 정성적인 라이프 스케이리은 처치를 모니터링하는 데 사용할 수 있다. 또한, 질병의 진행은 MRI로 모니터링할 수 있다. 또한, 환자의 혈액 프로필은 면역원 특이성 항체 및 T-세포 반응 분석을 이용하여 모니터링할 수 있다.
기준 측정후, 환자에게 처치를 시행한다. 이들은 무작위화하고 다른 치료제 또는 위약을 이용하여 맹검 방식으로 처치한다. 환자는 적어도 매 6개월 마다 모니터링한다. 효능은 위약 군에 대해 처치 군에서 진행의 유의적인 감소에 의해 측정한다.
제2 단계 II 시험을 수행하여 비-알츠하이머병 초기 기억 상실(종종 연령 관련 기억 장애(AAMI) 또는 양성 인식 장애(MCI)라 침함)로부터 ADRDA 기준에 의해 정해지는 바와 같은 알츠하이머병으로의 전환을 평가한다. 알츠하이머병으로의 전환에 대해 높은 위험을 가진 환자는 기억 상실의 초기 사인 또는 전-알츠하이머 증후학, 알츠하이머병의 가계 병력, 유전적 위험 인자, 연령, 성별 및 알츠하이머병에 대한 높은 위험을 예견하는 것으로 확인된 다른 특징에 대해 참조 집단을 스크리닝함으로써 비임상적인 집단으로부터 선택된다. 더 정상적인 집단을 평가하는것 으로 구성된 다른 메트릭스(metrics)와 함께 MMSE 및 ADAS를 포함하는 적합한 메트릭스에서의 기준 스코어를 수집한다. 이들 환자 집단은 비교를 위해 상기 제제를 투여한 군과 위약을 투여한 군으로 적합하게 분할한다. 이들 환자 집단은 약 6개월 동안의 간격을 두었으며, 각 환자에 대한 종말점은 관찰의 말미에 환자가 ADRDA 조건에 의해 정해지는 바와 같이 가능한 알츠하이머병으로 전환되는지 여부를 결정하는 것이다.
지금까지 이해를 명료하게 할 목적으로 본 발명을 상세하기 기술하였지만, 특정 변경은 첨부한 특허청구의 범위내에서 실시될 수 있음이 명백하다. 본원에 기술한 모든 공보 및 특허 문헌 뿐만 아니라 도면 또는 서열 목록을 나타내는 텍스트는 언급시 마다 일일이 기재한 바와 같이 전적으로 참고로 인용한 것이다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 다수의 용도를 위해 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 아밀로이드형성성 질병의 치료, 예방 또는 진단, 또는 동일한 용도를 위한 약제 또는 진단 조성물의 제조에서의 상기한 Aβ에 대한 항체중 임의의 항체의 용도를 제공한다.
SEQUENCE LISTING <110> Neuralab Limited and Wyeth et al. <120> HUMANIZED ANTIBODIES THAT RECOGNIZE BETA AMYLOID PEPTIDE <130> ELN-004PC <150> US 60/363,751 <151> 2002-03-12 <160> 38 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 393 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> sig_peptide <222> (1)...(57) <220> <221> CDS <222> (1)...(393) <400> 1 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala -15 -10 -5 tcc agc agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96 Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 1 5 10 agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag aac att 144 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile 15 20 25 gtt cat agt aat gga aac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca 192 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 30 35 40 45 ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240 Gly Gln Ser Pro 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Sequence <220> <223> primer <400> 13 gagattaagc ttgccgccac catgaggctc cctgctcagc tcctggggct gctaatgctc 60 tgggtctctg gatccagtgg ggatgttgtg atgactcagt ctccactctc cctgcccgtc 120 acccctggag agccg 135 <210> 14 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 aggagctgtg gagactgccc tggcttctgc aggtaccatt ccaaataggt gtttccatta 60 ctatgaacaa tgttctgact agacctgcag gagatggagg ccggctctcc aggggtgacg 120 ggcagggaga g 131 <210> 15 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tgcagaagcc agggcagtct ccacagctcc tgatctacaa agtttccaac cgattttctg 60 gggtccctga caggttcagt ggcagtggat caggcacaga ttttacactg aaaatcagca 120 gagtggaggc tg 132 <210> 16 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tgatatggat ccactcacgt ttgatctcca gcttggtccc ctgaccgaac gtgagcggaa 60 catgtgaacc ttgaaagcag taataaaccc caacatcctc agcctccact ctgctgattt 120 tcagtgtaaa 130 <210> 17 <211> 143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gagataaagc ttgccgccac catgaagcac ctgtggttct tcctcctgct ggtggcagct 60 cccagatggg tcctgtccca ggtgcagctg caggagtcgg gcccaggact ggtgaagcct 120 tcggagaccc tgtccctcac ctg 143 <210> 18 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tcctcatccc aatagatgtg tgccagccac tccagtccct tccctggggg ctgccggatc 60 cagctcacac ccataccatt agtgctcagg gaaaaaccag agaaagtgca ggtgagggac 120 agggtctccg aaggctt 137 <210> 19 <211> 138 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gtggctggca cacatctatt gggatgagga caagcgctat aacccatccc tcaagagtcg 60 actcaccata tcaaaggaca cgtccaagaa ccaggtatcc ctgaagctga gctctgtgac 120 cgctgcagac acggccgt 138 <210> 20 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tcatatggat ccactcacct gaggagacgg tgaccgtggt cccttggccc cagtagtcaa 60 agtagtcctc aacatcatag atgatcctcc ttctcgcaca gtaatacacg gccgtgtctg 120 cagcggtcac agagctcag 139 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gagattaagc ttgccgccac ca 22 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 aggagctgtg gagactgccc t 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tgcagaagcc agggcagtct 20 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tgatatggat ccactcacgt ttgatctc 28 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gagataaagc ttgccgccac cat 23 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 tcctcatccc aatagatgtg tgcc 24 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gtggctggca cacatctatt gg 22 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 tcatatggat ccactcacct gagg 24 <210> 29 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(360) <220> <221> sig_peptide <222> (1)...(60) <400> 29 atg agg ctc cct gct cag ctc ctg ggg ctg cta atg ctc tgg gtc tct 48 Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser -20 -15 -10 -5 gga tcc agt ggg gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc 96 Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 1 5 10 gtc acc cct gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc 144 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 15 20 25 ctc ctg cat agt aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag 192 Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys 30 35 40 cca ggg cag tct cca cag ctc ctg atc tat ttg ggt tct aat cgg gcc 240 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala 45 50 55 60 tcc ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 aca ctg aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac 336 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 80 85 90 tgc atg caa gct cta caa act cct 360 Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro 95 100 <210> 30 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(20) <400> 30 Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser -20 -15 -10 -5 Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 1 5 10 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 15 20 25 Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys 30 35 40 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala 45 50 55 60 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 80 85 90 Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro 95 100 <210> 31 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(300) <400> 31 gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc ctg cat cgt 96 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Arg 20 25 30 tat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag cca ggg cag tct 144 Tyr Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca cag ctc ctg atc tat ttg ggt tct aat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa atc 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa gct 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 cta caa act ccg 300 Leu Gln Thr Pro 100 <210> 32 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Arg 20 25 30 Tyr Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro 100 <210> 33 <211> 407 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (3)...(407) <220> <221> sig_peptide <222> (3)...(38) <400> 33 tc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc aga tgg gtc ctg tcc cag ctg cag 47 Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Leu Gln -10 -5 1 ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag acc ctg tcc 95 Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser 5 10 15 ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc agc aga ggt agt cac tac 143 Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Gly Ser His Tyr 20 25 30 35 tgg ggc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg att ggg 191 Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 40 45 50 agt atc tat tat agt ggg aac acc tac ttt aac ccg tcc ctc aag agt 239 Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Phe Asn Pro Ser Leu Lys Ser 55 60 65 cga gtc acc ata tct gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg aag 287 Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 70 75 80 ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg gct gtg tat tac tgt gcg aga 335 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 ctc ggc cct gat gac tat acc ctt gac ggt atg gac gtc tgg ggc caa 383 Leu Gly Pro Asp Asp Tyr Thr Leu Asp Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 115 ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 407 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 120 <210> 34 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(12) <400> 34 Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Leu Gln Leu -10 -5 1 Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu 5 10 15 20 Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Gly Ser His Tyr Trp 25 30 35 Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser 40 45 50 Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Phe Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg 55 60 65 Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu 70 75 80 Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu 85 90 95 100 Gly Pro Asp Asp Tyr Thr Leu Asp Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly 105 110 115 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 120 <210> 35 <211> 356 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(356) <220> <221> sig_peptide <222> (1)...(57) <400> 35 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctc ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp -15 -10 -5 gtc ctg tcc cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag 96 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 1 5 10 cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc gtc 144 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val 15 20 25 agc agt ggt ggt tac tac tgg agc tgg atc cgg cag ccc cca ggg aag 192 Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 30 35 40 45 gga ctg gag tgg att ggg tat atc tat tac agt ggg agc acc aac tac 240 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr 50 55 60 aac ccc tcc ctc aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag 288 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 65 70 75 aac cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gct gcg gac acg gcc 336 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 80 85 90 gtg tat tac tgt gcg aga ga 356 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 95 <210> 36 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(19) <400> 36 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp -15 -10 -5 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 1 5 10 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val 15 20 25 Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 30 35 40 45 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 65 70 75 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 80 85 90 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 95 <210> 37 <211> 356 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(356) <220> <221> sig_peptide <222> (1)...(57) <400> 37 atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp -15 -10 -5 gtc ctg tcc cag ctg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag 96 Val Leu Ser Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 1 5 10 cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc 144 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 15 20 25 agc agt agt agt tac tac tgg ggc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag 192 Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 30 35 40 45 ggg ctg gag tgg att ggg agt atc tat tat agt ggg agc acc tac tac 240 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr 50 55 60 aac ccg tcc ctc aag agt cga gtc acc ata tcc gta gac acg tcc aag 288 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 65 70 75 aac cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg gct 336 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 80 85 90 gtg tat tac tgt gcg aga ca 356 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 95 <210> 38 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(19) <400> 38 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp -15 -10 -5 Val Leu Ser Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 1 5 10 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 15 20 25 Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 30 35 40 45 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 65 70 75 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 80 85 90 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 95

Claims (115)

  1. 인간화 경쇄 가변부 및 인간화 중쇄 가변부를 포함하는 인간화 12B4 항체로서,
    인간화 경쇄 가변부는 서열 번호 6의 1-112의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 가지며,
    인간화 중쇄 가변부는 서열 번호 8의 1-123의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열, 서열 번호 10의 1-123의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 12의 1-123의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것인
    인간화 12B4 항체.
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  10. 제1항에 있어서, 인간화 중쇄 가변부가 서열 번호 8의 1-123의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것인 인간화 항체.
  11. 제1항에 있어서, 인간화 중쇄 가변부가 서열 번호 10의 1-123의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것인 인간화 항체.
  12. 제1항에 있어서, 인간화 중쇄 가변부가 서열 번호 12의 1-123의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것인 인간화 항체.
  13. 제1항의 인간화 중쇄 가변부를 암호화하는 분리된 핵산.
  14. 제1항의 인간화 경쇄 가변부를 암호화하는 분리된 핵산.
  15. 제1항의 인간화 중쇄 가변부 및 제1항의 인간화 경쇄 가변부를 각각 암호화하는 분리된 핵산들.
  16. 하기 핵산 또는 핵산들을 포함하는 벡터:
    제1항의 인간화 중쇄 가변부를 암호화하는 분리된 핵산;
    제1항의 인간화 경쇄 가변부를 암호화하는 분리된 핵산; 또는
    제1항의 인간화 중쇄 가변부 및 제1항의 인간화 경쇄 가변부를 각각 암호화하는 분리된 핵산들.
  17. 하기 핵산 또는 핵산들을 포함하는 벡터 또는 벡터들을 포함하는 분리된 숙주 세포:
    제1항의 인간화 중쇄 가변부를 암호화하는 분리된 핵산;
    제1항의 인간화 경쇄 가변부를 암호화하는 분리된 핵산; 또는
    제1항의 인간화 중쇄 가변부 및 제1항의 인간화 경쇄 가변부를 각각 암호화하는 분리된 핵산들.
  18. 인간화 항체의 제조 방법으로서,
    상기 항체가 제조되는 조건 하에서 제17항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포 또는 배양물로부터 항체를 분리하는 단계를 포함하는 것인 인간화 항체 의 제조 방법.
  19. 유효 성분으로서 제1항의 인간화 항체 및 약학적 담체를 포함하는, 아밀로이드형성성 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물.
  20. 키메라 항체 12B4 항체로서, 12B4는 서열 번호 2의 경쇄 가변부 및 서열 번호 4의 중쇄 가변부를 특징으로 하는 마우스 항체인 키메라 항체 12B4 항체.
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