KR20070089186A - Ｉｌ-15 항원 어레이 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 약제학, 공중 보건, 면역학, 분자 생물학 및 바이러스학의 분야에 있다. 본 발명은 바이러스-유사 입자(VLP) 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 항원은 IL-15 단백질, IL-15 뮤테인 또는 VLP에 각각 링크된 IL-15 단편이다.

본 발명은 또한 조성물을 제조하는 과정을 제공한다. 본 발명의 조성물은 특히, IL-15가 증상을 매개하거나 기여하는 질환의 치료용, 특히, 염증성 또는 만성의 자기면역 질환 치료용 백신의 제조에 유용하다. 더욱이, 본 발명의 조성물은 유효한 면역 반응, 특히, 항원 반응을 유도한다. 더욱이, 본 발명의 조성물은 특히 지시된 문맥 내에서, 자기-특이적 면역 반응을 효과적으로 유도하는 데 유용하다.

Description

ＩＬ-15 항원 어레이 및 그 용도{IL-15 ANTIGEN ARRAYS AND USES THEREOF}

본 발명은 약제학, 공중 보건, 면역학, 분자 생물학 및 바이러스학의 분야에 있다. 본 발명은 바이러스-유사 입자(VLP) 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 항원은 IL-15 단백질, IL-15 뮤테인 또는 VLP에 각각 링크된 IL-15 단편이다.

본 발명은 또한 조성물을 제조하는 과정을 제공한다. 본 발명의 조성물은 백신, 특히, IL-15가 증상을 매개하거나, 기여하는 질환의 치료용, 특히, 염증 및/또는 만성의 자기면역 질환 치료용 백신의 제조에 유용하다. 더욱이, 본 발명의 조성물은 유효한 면역 반응, 특히, 항체 반응을 유도한다. 더욱이, 본 발명의 조성물은 특히 지시된 문맥 내에서, 자기-특이적 면역 반응을 효과적으로 유도하는 데 유용하다.

인터류킨-15 (IL-15)는 전구-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인, 구조적 및 기능적으로 IL-2에 관련된 14-15 kD의 당단백질이다(Tagaya et al., Immunity, 1996; 4:329-336). IL-15는 γ 사슬(γc), IL-2Rβ, 및 IL-15Rα로 구성된 이형삼량(heterotrimeric) 수용체를 통하여 결합하고 신호를 보낸다. IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21는 모두 γ 사슬을 함유하는 수용체를 이용하고, 반면 IL-2 및 IL-15 수용체는 IL-2Rβ도 공유한다. IL-15는 현재 IL-15Rα에 결합하는 유일한 사이토카인으로 보인다. IL-15는 IL-15Rα에만 높은 친화도(Ka= 1x10¹¹M^-1)로 결합하며, 중간 친화도(Ka = 1x 10⁹M^-1)로 IL-2Rβ 및 γ 사슬 복합체에 결합한다.

IL-15의 구조적 발현은 단핵 세포, 대식 세포, 섬유모세포, 각질 세포 및 수상 세포를 함유하는 다양한 세포 및 조직에서 기록되었다(Waldmann and Tagaya, Annu Rev Immunol. 1999; 17:19-49; Fehniger and Caligiuri, Blood. 2001; 97:14-32). 발현은 IFN-γ 및 LPS로 자극되는 단핵 세포에서 기록된 바와 같이 염증 증상 하에서, 또는 바이러스, 박테리아 또는 원생동물의 감염에 의하여 상향 조절된다(Kirman et al., Inflamm Res. 1998; 47:285-9; Waldmann et al., Int Rev Immunol. 1998; 16:205-26. Waldmann and Tagaya, Annu Rev Immunol. 1999; 17:19-49, Fehniger and Caligiuri, Blood. 2001; 97:14-32). 더욱이, 류마티스 관절염과 같은 만성의 염증 질환에서, 국부적으로 생산된 IL-15는 활막의 T-세포 동원 및 활성화에 의하여 염증이 증폭시킬 것이다. 이러한 IL-15-유도된 효과는 질환 발병기전에 중요한 역할을 하는 것으로 제안된다(Kirman et al., Inflamm Res. 1998; 47:285-9.; McInnes et al., Nat. Med. 1996; 2:175-82.; McInnes et al., Nat. Med. 1997; 3:189-95; McInnes and Liew, Immunol Today. 1998; 19:75-9.; Fehniger and Caligiuri, Blood. 2001; 97:14-32.).

IL-15에 대하여 특이적인 단일클론 항체는 많은 수의 만성 염증 질환 및/또는 자기면역 질환을 치료하는 데에서 제안된다. WO0002582는 IL-15 단일클론 항체 를 이용하여 염증성 창자 질환을 치료하는 것을 개시한다. WO03017935는 IL-15 단일클론 항체를 이용하여 전염증 효과를 유도하는 IL-15를 억제하는 것, 특히, 건선 및 관절염을 치료하는 것을 개시한다.

인간 신체에서 단일클론 항체의 반감기가 약 2 내지 4주 뿐이기 때문에, 이에 따라, 단일클론 항체 치료의 결점은 많은 양의 항체를 반복적으로 주입하는 필요를 포함한다는 것이다(Kaplan, Curr Opin Invest. Drugs. 2002; 3:1017-23.). 항체의 높은 투여량은 주입 질환과 같은 부작용에 이르게 할 수 있다. 항-항체는 환자의 유전적 반응에서 생성될 수 있으며, 심지어, 인간 또는 인간화된 항체가 이용될지라도, 치료적 효과를 감소시키거나, 잠재적으로 부작용을 유발하는 영향을 줄 수 있다. 더욱이, 인간화된 단일클론 항체의 높은 제조 비용과 병원에 자주 가야하는 필요에 관련된 비용은 필요에 있는 많은 환자들이 이러한 항체 치료를 이용할 수 없게 한다.

[발명의 요약]

본 발명자들은 놀랍게도 현재, 자기-항원 IL-15에 대하여 높은 항체 적정량에 이르게 하는 강한 면역 반응, 특히, 강한 항체 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 IL-15 단백질, 적어도 하나의 IL-15 뮤테인, 또는 적어도 하나의 IL-15 단편을 포함하는 본 발명의 조성물 및 백신 각각을 발견하였다. 더욱이, 본 발명자들은 놀랍게도, 류마티스 관절염과 같이, IL-15가 중요한 역할을 수행하는 염증성 및/또는 만성 자기면역 질환의 유도 및 발전에 대한 방어적 및/또는 치료적 효과를 갖는 강한 면역 반응, 특히 강한 항체 반응을 유도할 수 있는 본 발명의 조성물 및 백신을 각각 발견하였다. 게다가, 본 발명자들은 놀랍게도, 죽상경화증의 유도 및 발전에 대하여 방어적 및/또는 치료적 효과를 갖는 강한 면역 반응, 특히, 강한 항체 반응을 유도할 수 있는 본 발명의 조성물 및 백신 각각을 발견하였다. 이는 본 발명의 조성물 및 백신 각각에 의하여 생성되는 면역 반응, 특히, 항체가 생체내에서 특이적으로 IL-15를 인지하고, 그것의 기능을 방해할 수 있는 것을 나타낸다.

이에 따라, 첫번째 일면에서, 본 발명은 (a) 적어도 하나의 제1부착 부위를 갖는 바이러스-유사 입자(VLP); 및 (b) 적어도 하나의 제2부착 부위를 갖으며, IL-15 단백질, IL-15 뮤테인 또는 IL-15 단편인 적어도 하나의 항원을 포함하는 조성물을 제공하고, (a) 및 (b)는 상기 적어도 하나의 제1 및 상기 적어도 하나의 제2부착 부위를 통해 링크되고, 바람직하게 정렬되고 반복적인 항원 어레이를 형성한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 용도에 적합한 바이러스-유사 입자는 재조합 단백질, 바람직하게는 바이러스, 바람직하게는 RNA 박테리오파지의 재조합 코트 단백질, 돌연변이 또는 이의 단편을 포함한다.

바람직한 일구체예에서, 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 IL-15 뮤테인을 포함한다. IL-15 뮤테인은 IL-15의 생물학적 활성을 갖지 않는 반면, 바람직하게 IL-15와 거의 동일한 단백질 구조를 보유한다. IL-15는 유력한 T 세포 자극 사이토카인이다. 이에 따라, IL-15 뮤테인을 포함하는 본 발명의 조성물은 전형적으로 생물학적 활성이 있는 IL-15를 신체에 도입하는 것을 피하면서, 치료적으로 효과적인 약제를 제공한다.

또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 IL-15 단편을 포함하며, 여기서, 단편은 적어도 하나의 IL-15 항원성 부위를 포함한다. 강한 방어적 면역 반응, 특히 항체 반응을 지키면서, 본 발명의 IL-15 단편의 이용은 자기-특이적 세포독성 T 세포 반응의 유도 가능성을 줄일 수 있다.

또다른 면에서, 본 발명은 백신 조성물을 제공한다. 게다가, 본 발명은 인간 또는 동물, 바람직하게는 포유동물에 백신 조성물을 투여하는 방법을 제공한다. 본 발명의 백신 조성물은 적어도 하나의 어쥬번트의 존재 없이, 강한 면역 반응, 특히 항체 반응을 유도할 수 있다. 이에 따라, 바람직한 일구체예에서, 백신은 어쥬번트가 제외된다. 어쥬번트 이용의 제외는 원하지 않는 염증성 T 세포 반응의 발생 가능성을 줄일 수 있다.

바람직한 일구체예에서, 조성물 및 백신 조성물 각각을 포함하는 본 발명의 VLP는 숙주 내에서 재조합적으로 생산되며, RNA 파지의 VLP는 숙주 RNA, 또는 숙주 DNA, 바람직하게는 숙주 핵산이 필수적으로 없다. 원하지 않는 T 세포 반응 뿐만 아니라, 열과 같은 다른 원하지 않는 부작용을 피하기 위하여, 숙주 RNA, 또는 숙주 DNA, 바람직하게는 핵산의 양을 줄이거나, 바람직하게는 제거하는 것이 유익하다.

일면에서, 본 발명은 IL-15 단백질이 증상을 매개하거나, 기여하는 죽상동맥경화증, 천식 또는 염증성 및/또는 자기면역성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 백신 조성물 각각을 동물 또는 인간에 투여하는 것을 포함한다. IL-15 단백질이 증상을 매개하거나, 기여하는 염증 성 및/또는 자기면역성 질환은 예를 들어, 류마티스성 관절염, 건선 관절염, 소아 특발성 관절염, 건선, 코론 질환을 포함하나 이에 한정된 것은 아니다.

다른 면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

또다른 면에서, 본 발명은 (a) 적어도 하나의 제1부착 부위를 갖는 VLP를 제공하고; (b) 적어도 하나의 제2부착 부위를 갖으며, IL-15 단백질, IL-15 뮤테인, IL-15 단편인 적어도 하나의 항원을 제공하고; (c) 상기 VLP와 상기 적어도 하나의 항원을 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2부착 부위를 통하여 링크시키는 것을 포함하여, 본 발명의 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

도 1은 Qβ VLP-IL-15로 면역화된 마우스에서 관절염의 임상적 평균 점수를 나타낸다. 도 1A는 50㎍ Qβ VLP-IL-15로 면역화된 마우스 및 PBS만 받아들인 마우스에서 관절염의 임상적 평균 점수를 나타낸다. 도 1B는 Qβ로 면역화된 마우스 및 25㎍ Qβ VLP-IL-15로 면역화된 마우스에서 관절염의 임상적 평균 점수를 나타낸다. 막대는 각 백신화된 군에서, 평균 점수로 그려진다.

도 2는 Apoe ^-/- 마우스에서 적재된 죽상경화성 플라그의 통계적 분석 및 정량화를 나타낸다. 막대는 Qβ-IL-15(검은 막대) 또는 Qβ(흰 막대)로 면역화된 Apoe ^-/-마우스의 대동맥에서 적재된 죽상동맥경화성 플라그 평균을 퍼센트로 나타낸다. 오류 막대는 평균의 표준 오류를 나타낸다.

항원: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "항원"은 MHC 분자에 의해 제시(present)되는 경우 T 세포 수용체(TCR) 또는 항체에 의해 결합할 수 있는 분자를 언급한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "항원"은 또한 T-세포 에피토프를 포함한다. 항원은 또한 면역 시스템에 의해 인식될 수 있고/거나 B- 및/또는 T- 림프구를 활성화시켜, 체액면역반응 및/또는 세포면역반응을 유도할 수 있다. 그러나, 적어도 특별한 경우에는 Th 세포 에피토프를 포함하거나 이에 결합되어 있는 항원이 어쥬번트 중에 제공되는 것이 필요하다. 항원은 하나 이상의 에피토프(B- 및 T-에피토프)를 가질 수 있다. 상기 언급한 특이적 반응은 항원은 바람직하게는 전형적으로 고도로 선택된 방식으로 그에 상응하는 항체 또는 TCR과 반응하지만 다른 항원에 의해 유도되는 다수의 다른 항체 또는 TCR과 반응하지 않는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 항원은 또한 여러 개체 항원의 혼합물일 수 있다.

항원성 부위: 본 발명에서 상호호환적으로 사용되는 용어 "항원성 부위" 및 용어 "항원성 에피토프"는 항체 혹은 MHC 분자의 존재 하에서, T 세포 수용체에 의하여 면역특이적으로 결합될 수 있는 폴리펩티드의 연속적인 또는 비연속적인 부분을 언급한다. 면역특이적 결합은 비-특이적 결합을 배제하나, 교차-반응성을 필수적으로 배제하는 것은 아니다. 항원성 부위는 항원성 부위에 독특한 공간 구조에서 전형적으로 5-10 아미노산을 포함한다.

회합된(associated): 본 발명에서 사용된 용어 "회합된"(또는 이것의 명사형 회합)은 모든 가능한 방법들, 바람직하게는 두개의 분자들이 서로 연결되는 화학적 상호작용을 언급한다. 화학적 상호작용은 공유 및 비-공유 상호작용을 함유한다. 비-공유 상호작용의 전형적인 예는 이온간 상호작용, 소수성 상호작용 또는 수소 결합이 있으며, 반면, 공유 결합은 예를 들면, 에스테르, 에테르, 포스포에스테르, 아미드, 펩티드, 탄소- 인 결합, 탄소-황 결합, 이를 테면, 티오에테르 또는 이미드 결합의 방법에 근거를 둔다.

제1부착 부위: 본 명세서에서 사용되는 바, 어구 "제1부착 부위"는 제2부착 부위가 링크될 수 있는, 전형적이고 바람직하게 자연발생된 혹은 VLP에 인공적으로 부가된 요소를 언급한다. 제1부착 부위는 단백질, 폴리펩티드, 아미노산, 펩티드, 당, 폴리뉴클레오티드, 자연의 또는 인공의 폴리머, 2차 대사물질 또는 화합물(바이오틴, 형광물질, 레티놀, 디곡시게닌, 금속 이온, 페닐메틸설포닐플루오라이드), 또는 화학적 반응 군, 이를 테면, 아미노기, 카르복실기, 설포하이드릴 군, 하이드록실기, 구아니디닐 군, 히스티디닐 군 또는 그의 조합물일 수 있다. 화학적 반응 군의 바람직한 구체예에서, 제1부착 부위는 라이신과 같은 아미노산으로 이루어진 아미노기일 수 있다. 제1부착 부위는 전형적으로 VLP의 표면에, 바람직하게는 VLP의 바깥 표면상에 위치한다. 다중 제1부착 부위는 표면에, 바람직하게, 바이러스-유사 입자의 바깥 표면에, 전형적으로, 반복적 배열로 존재한다. 바람직한 구체예에서, 제1부착 부위는 적어도 하나의 공유 결합, 보다 바람직하게는 적어도 하나의 펩티드 결합을 통하여 VLP와 회합된다.

제2부착 부위: 본 명세서에서 사용되는 바, 어구 "제2부착 부위"는 제1부착 부위에 링크될 수 있는, 전형적이고 바람직하게 본 발명의 IL-15에 인공적으로 부가되거나 자연적으로 발생하는 요소를 언급한다. 본 발명의 IL-15의 제2부착 부위는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 아미노산, 당, 폴리뉴클레오티드, 자연의 또는 인공의 폴리머, 2차 대사물질 또는 화합물(바이오틴, 형광물질, 레티놀, 디곡시게닌, 금속 이온, 페닐메틸설포닐플루오라이드), 또는 화학적 반응 군, 이를 테면, 아미노기, 카르복실기, 설프히드릴기, 하이드록실기, 구아니디닐 군, 히스티디닐 군 또는 그의 조합물일 수 있다. 화학적 반응 군의 바람직한 구체예에서, 제2부착 부위는 설포하이드릴 군, 보다 바람직하게는, 시스테인 아미노산이다. 용어 "적어도 하나의 제2부착 부위를 갖는 IL-15 단백질", "적어도 하나의 제2부착 부위를 갖는 IL-15 뮤테인", "적어도 하나의 제2부착 부위를 갖는 본 발명의 IL-15" 또는 "적어도 하나의 제2부착 부위를 갖는 본 발명의 IL-15"는 적어도 하나의 제2부착 부위와 본 발명의 IL-15를 포함하는 컨스트럭트(construct)를 언급한다. 그러나, 특히 IL-15 단백질, IL-15 뮤테인 또는 IL-15 단편에 자연적으로 발생한 것이 아닌 제2부착 부위의 경우, 컨스트럭트는 전형적이며 바람직하게, 링커를 포함한다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 제2부착 부위는 적어도 하나의 공유 결합을 통하여, 특히, 적어도 하나의 펩티드 결합을 통하여 본 발명의 IL-15와 회합된다. 또다른 구체예에서, 제2부착 부위는 바람직하게 시스테인을 포함하는 링커를 통하여, 본 발명의 IL-15에 인공적으로 부가된다. 바람직하게, 링커는 본 발명의 IL-15에 펩티드에 의하여 융합된다.

코트 단백질: 본 명세서내에서, 용어 "코트 단백질"은 "캡시드 단백질"과 상호호환적으로 사용할 수 있으며, 바이러스 캡시드 또는 VLP에 혼합될 수 있는 바이러스 단백질, 바람직하게는, 바이러스, 바람직하게 RNA-파지의 자연적 캡시드 서브유닛을 언급한다. 전형적이고, 바람직하게 용어 "코트 단백질"은 바이러스, 바람직하게 RNA 박테리오파지의 유전자, 또는 다양한 바이러스, 바람직하게 RNA 박테리오파지의 유전자에 의해 암호화된 코트 단백질을 언급한다. 더욱 바람직하게, 실시예의 방법에 의하면, 용어 "AP205의 코트 단백질"은 서열 번호 14, 또는 서열 번호 14로부터 첫번째 메티오닌이 잘려진 아미노산 서열을 언급한다. 더욱 바람직하게, 실시예의 방법에 의하면, "Qβ의 코트 단백질"은 N-말단의 메티오닌을 갖고 있거나, 갖고 있지 않은, 서열 번호 1("Qβ CP") 및 서열 번호 2(A1)을 언급한다. 박테리오파지 Qβ의 캡시드는 주로 Qβ CP로 구성되어 있으며, 소량의 A1 단백질을 갖고 있다.

본 발명의 IL-15 : 본 발명에서 사용된 용어 "본 발명의 IL-15"는 적어도 하나의 IL-15 단백질, 적어도 하나의 IL-15 뮤테인 또는 본 발명에서 정의된 바, IL-15 단편 또는 이들의 조합물을 언급한다.

IL-15 단백질 : 본 발명에서 사용된, 용어 "IL-15 단백질"은 서열 번호 23의 인간 IL-15, 서열 번호 24의 마우스 IL-15, 서열 번호 25의 랫 IL-15 또는 임의의 다른 동물에 상응하는 오솔로그를 포함하거나 대체적으로 또는 바람직하게 구성되는 임의의 폴리펩티드를 포함할 것이다. 더욱이, 본 발명에서 사용된 용어 "IL-15 단백질"은 또한 서열 번호 23의 인간 IL-15, 서열 번호 24의 마우스 IL-15, 서열 번호 25의 랫 IL-15 또는 임의의 다른 동물에 상응하는 오솔로그에, 70% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 바람직하게는 85% 초과, 보다 바람직하게는 90% 초과, 더욱 바람직하게는 95% 초과, 가장 바람직하게는 97% 초과의 아미노산 서열 상동성을 갖는, 임의의 자연적 또는 유전 공학적 변형체를 포함하거나 대체적으로 또는 바람직하게 구성되는 임의의 폴리펩티드를 포함할 것이다. 본 발명에서 사용된 용어 "IL-15 단백질"은 더욱이 번역-후 변형(post-translational modification)된 것을 포함할 것이며, 상기에서 정의된 바와 같은 IL-15 단백질의 당화, 아세틸화, 인산화를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 본 발명에서 정의된 바와 같은 IL-15 단백질은 최대 500 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 최대 300 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 최대 200 아미노산 길이, 더욱 바람직하게 최대 150, 더욱 바람직하게 130 아미노산 길이로 구성된다. 전형적이며 바람직하게, IL-15 단백질은 예를 들어, ELISA에 의하여 입증되는 것 같이, 생체내에서 IL-15에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도할 수 있다.

IL-15 뮤테인 : 본 발명에서 사용된 바, 용어 "IL-15 뮤테인"은 상기 폴리펩티드가 IL-15 생물학적 활성을 갖지 않는 IL-15 단백질인 임의의 폴리펩티드를 포함할 것이다. 더욱 바람직하게, 용어 "IL-15 뮤테인"은 서열 번호 23의 인간 IL-15, 서열 번호 24의 마우스 IL-15, 서열 번호 25의 랫IL-15 또는 임의의 다른 동물에 상응하는 오솔로그와, 적어도 1 및 최대 6, 바람직하게는 최대 5, 더욱 바람직하게 최대 4, 보다 바람직하게 최대 3, 보다 바람직하게 최대 2, 가장 바람직하게 하나의 아미노산이 다르며, 상기 폴리펩티드는 IL-15 생물학적 활성을 갖지 않는 임의의 폴리펩티드를 언급한다. 전형적이며 바람직하게, IL-15 뮤테인을 포함하는 본 발명의 조성물은 생체내에서 IL-15에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도할 수 있다. 본 발명에서 사용된 바, 용어 "IL-15 생물학적 활성"은 T 림프구 증식 및 분화를 자극하는 능력을 언급한다.

IL-15 생물학적 활성을 측정하는 전형적이며 바람직한 분석은 본 발명에서 참조의 형태로 삽입되는 EP0772624의 실시예 2에 개시되었다. IL-15 단백질은 양성 대조군으로 사용되는 상응하는 야생형 IL-15와 동일한 실험에서 테스트된다. 상응하는 야생형 IL-15는 IL-15 단백질로써 동일한 종의 IL-15를 언급한다. 단백질 농도 분석, 예를 들어, 브래드포드 분석(Bradford assay)은 같은 실험에서 테스트되는 IL-15 단백질의 돌연변이 및 양성 대조군으로 이용된, 그에 상응하는 야생형 IL-15이 화학양론적으로 동일한 양을 유지시키기 위하여 수행된다. 만약 테스트할 IL-15의 양 및 대조군으로 이용되는 상응하는 야생형 IL-15의 양이 3%초과, 바람직하게는 1%초과 만큼 서로 다르지 않다면, 동일한 양으로 간주된다.

만약 그것이 양성 대조군으로 사용된 동일한 양의 상응하는 야생형 IL-15의 IL-15 생물학적 활성의 최대 20%, 바람직하게 10%, 더욱 바람직하게 5%, 더욱 바람직하게 1%, 더욱 바람직하게 0.2%를 갖는다면, 특정 IL-15 단백질은 IL-15 생물학적 활성을 갖지 않는다.

IL-15 단편: 본 발명에서 사용된 바, 용어 "IL-15 단편"은 본 발명에서 정의된 IL-15 단백질 또는 IL-15 뮤테인의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 17, 18, 19, 20, 25, 30 인접한 아미노산을 포함하거나, 대체적으로 또는 바람직하게 구성되는 임의의 폴리펩티드 뿐만 아니라, 상기에 65% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90% 초과 및 더더욱 바람직하게는 95% 초과의 아미노산 서열 상동성을 갖는 임의의 폴리펩티드를 포함할 것이다. 바람직하게, 본 발명에서 사용된 용어 "IL-15 단편"은 본 발명에서 정의된 IL-15 단백질 또는 IL-15 뮤테인의 적어도 6개의 인접한 아미노산을 포함하거나, 대체적으로, 또는 바람직하게 구성되는 임의의 폴리펩티드 뿐만 아니라, 상기에 80% 초과, 85% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 더욱 바람직하게는 95% 초과의 아미노산 서열 상동성을 갖는 임의의 폴리펩티드를 포함할 것이다. IL-15 단편의 바람직한 구체예는 IL-15 단백질 또는 IL-15 뮤테인의 절단 또는 내부 결실된 형태이다. 전형적이며 바람직하게는, IL-15 단편은 생체내에서 IL-15에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도할 수 있다.

폴리펩티드의 아미노산 서열 상동성은 공지된 컴퓨터 프로그램, 이를 테면, Bestfit program을 이용하여 간단하게 측정될 수 있다. Bestfit 또는 다른 서열 정렬 프로그램, 바람직하게는 Bestfit 프로그램을 사용할 때, 특정 서열이 예를 들어 기준 아미노산 서열에 대하여 95% 상동성을 갖는지 아닌지 결정하기 위하여, 파라미터를 세팅하여 일치도(%)를 전장의 기준 아미노산 서열에 대하여 계산하고, 기준 아미노산 서열 중 아미노산 전체수의 5%까지의 상동성 갭은 허용된다. 폴리펩티드 사이의 상동성 퍼센트를 측정하는 상기의 방법은 본 발명에 개시된 모든 단백질들, 폴리펩티드들, 또는 단편들에 적용될 수 있다.

링크된(Linked) : 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "링크된"(명사 형태: 링크(linkage))은 적어도 하나의 제1부착 부위 및 적어도 하나의 제2부착 부위가 서로 연결되도록 하는 모든 가능한 방법들, 보다 바람직하게는 화학적 상호작용을 언급한다. 화학적 상호작용은 공유 및 비공유 상호작용을 포함한다. 비공유 상호작용의 전형적인 예로는, 이온간 상호작용, 소수성 상호작용 또는 수소 결합 등이 있는 반면, 공유 결합은 예를 들면, 에스테르, 에테르, 포스포에스테르, 아미드, 펩티드, 탄소- 인 결합, 탄소- 황 결합, 이를 테면, 티오에테르 또는 이미드 결합 등에 기초한 것이다. 보다 바람직한 특정 구체예에 의하면, 제1부착 부위 및 제2부착 부위는 적어도 하나의 공유 결합을 통하여, 보다 바람직하게는, 적어도 하나의 비-펩티드 결합을 통하여, 더욱 바람직하게는, 오직 비-펩티드 결합을 통하여, 링크된다. 그러나 여기서 사용된 용어 "링크된"은 적어도 하나의 제1부착 부위 및 적어도 하나의 제2부착 부위의 직접적인 링크를 포함할 뿐만 아니라, 대신에 및 바람직하게는 중간에 위치한 분자(들), 및 여기서 전형적이며 바람직하게 적어도 하나, 바람직하게는 하나의 이형 양기능성 교차-링커를 이용한, 적어도 하나의 제1부착 부위 및 적어도 하나의 제2부착 부위의 간적접인 링크도 포함한다.

링커 : 본 발명에서 사용된 바, "링커"는 본 발명의 IL-15의 제2부착 부위와 회합되거나, 사전에 포함하며, 이는 필수적으로 혹은 비필수적으로 제2부착 부위로 구성된다. 바람직하게, 여기서 사용된 "링커"는 반드시 그런 것은 아니지만, 전형적으로는 하나의 아미노산 잔기, 특히 시스테인 잔기로서, 제 2 부착 부위를 포함한다. 여기서 사용된 "링커"는 또한, 본 발명에 따른 링커가 적어도 하나의 아미노산을 포함할 때 "아미노산 링커"라 칭한다. 이에 따라, "링커" 및 "아미노산 링커"라는 용어는 여기서, 상호호환적으로 사용할 수 있다. 그러나 이는, 아미노산 잔기로 이루어진 링커가 본 발명의 바람직한 구체예일지라도, 링커가 아미노산 잔기로만 이루어지는 것을 의미하는 것은 아니다. 링커의 아미노산 잔기는 바람직하게, 본 분야에 공지되어 있는 자연발생 아미노산 또는 비자연발생 아미노산, all-L 또는 all-D 또는 그의 혼합물로 구성된다. 본 발명에 따른 보다 바람직한 링커의 구체예는 설프히드릴기 또는 시스테인 잔기를 포함하는 분자이며, 상기 분자는 또한 본 발명 내에 함유된다. 본 발명에서 유용한 링커는 바람직하게 C1-C6 알킬-; 사이클로알킬, 이를 테면, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실; 사이클로알케닐; 아릴; 또는 헤테로아릴; 부위를 포함하는 분자이다. 더욱이, 바람직하게 C1-C6 알킬-, 사이클로알킬(C5, C6), 아릴, 또는 헤테로아릴 부위를 포함하는 링커 및 추가적인 아미노산(들)은 본 발명에서 링커로 이용될 수 있으며, 본 발명의 범위 내에 포함되어야 한다. 본 발명의 IL-15 및 링커는 바람직하게, 적어도 하나의 공유 결합, 보다 바람직하게는 적어도 하나의 펩티드 결합의 방법으로 회합된다.

정렬된 반복 항원 어레이: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "정렬된 반복 항원 어레이"는 항원의 반복적 패턴을 언급하거나, 전형적이고, 바람직하게는 바이러스-유사 입자에 대하여 항원의 고도로 균일한 공간 배열에 의하여 특성화된다. 본 발명의 일면으로, 반복적 패턴은 기하학적 패턴일 수 있다. RNA-파지의 VLP는 적합한 정렬되고 반복되는 항원 구조의 전형적이고 바람직한 실시예이며, 더욱이, 이는 항원의 엄격하게 반복된 준결정상태를 가지며, 바람직하게는, 1 내지 30 나노미터의 공간, 보다 바람직하게는 2 내지 15 나노미터의 공간, 더욱 바람직하게는 2 내지 10 나노미터, 더더욱 바람직하게는 2 내지 8 나노미터, 특히, 1.6 내지 7 나노미터의 공간을 갖는다.

패킹(Packaged): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "패킹"은 VLP와 관련하여 다중음이온 거대분자의 상태를 언급한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "패킹"은 예를 들어, 화학적 커플링에 의한 공유결합 또는 비공유결합 예를 들면, 이온간 상호작용, 소수성 상호작용, 수소 결합 등 일 수 있는 결합을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 용어는 또한 다중음이온 거대분자의 둘러쌈 또는 일부 둘러쌈을 언급한다. 이에 따라, 다중음이온 거대분자는 실제적인 결합, 특히, 공유 결합없이, VLP에 의하여 둘러싸여질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 다중음이온 거대분자는 VLP의 내측으로 패킹되며, 가장 바람직하게는, 비-공유결합 방법으로 패킹된다.

폴리펩티드 : 본 발명에서 사용된 바, 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합(펩티드 본드로도 알려져 있다)에 의하여 선상으로 링크되는 모노머(아미노산)로 구성되는 분자를 언급한다. 이는 아미노산의 분자 사슬을 나타내며, 생산물의 특정 길이를 언급하는 것이 아니다. 이에 따라, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드 및 단백질은 폴리펩티드의 정의 내에 포함된다. 폴리펩티드의 번역-후 변형, 예를 들면, 당화, 아세틸화, 인산화 등과 같은 것 또한 포함된다.

바이러스 입자: 본 발명에서 사용된 용어 "바이러스 입자"는 바이러스의 형태학상 형상을 언급한다. 몇몇 바이러스 타입에서, 이는 단백질 캡시드에 의해 둘러싸인 유전자를 포함한다; 다른 것들은 추가적인 구조들(예를 들면, 덮개(envelope), 꼬리(tail) 등)을 갖는다.

여기서 사용되는 바, 바이러스-유사 입자(VLP)는 비-복제성 또는 비-감염성, 바람직하게는 비-복제성 및 비-감염성 바이러스 입자를 언급하며, 또는 비-복제성 또는 비-감염성, 바람직하게는 비-복제성 및 비-감염성 바이러스 입자, 바람직하게는 바이러스의 캡시드와 유사한 구조를 언급한다. 여기서 사용된 바, 용어 "비-복제성"은 VLP에 포함된 유전자를 복제할 능력이 없는 것을 언급한다. 여기서 사용된 바, 용어 "비-감염성"은 숙주 세포로 들어갈 능력이 없는 것을 언급한다. 바람직하게 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자는 바이러스 유전자 또는 유전자 기능의 모두 또는 일부가 결여되어, 비-복제성 및/또는 비-감염성이다. 일 구체예에서, 바이러스-유사 입자는 바이러스 유전자가 물리적 또는 화학적으로 비활성화된 바이러스 입자이다. 전형적이며 더욱 바람직하게, 바이러스-유사 입자는 바이러스 유전자의 복제성 및 감염성 성분의 모두 또는 일부가 결여된다. 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자는 그들의 유전자와 다른 핵산을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자의 전형적이며 바람직한 구체예는 바이러스, 박테리오파지, 바람직하게는 RNA-파지에 상응하는 바이러스 캡시드와 같은 바이러스 캡시드이다. 용어 "바이러스 캡시드" 또는 "캡시드"는 바이러스 단백질 서브유닛들로 구성된 거대분자 어셈블리를 언급한다. 전형적으로 60, 120, 180, 240, 300, 360 및 360 초과의 바이러스 단백질 서브유닛들이 존재한다. 전형적이며 바람직하게, 이러한 서브유닛들의 상호작용은 바이러스 캡시드 또는 고유의 반복적 구성을 갖는 바이러스-캡시드 유사 구조의 형성을 이끌며, 상기 구조는 전형적으로 구형이거나, 관형 형상이다.

RNA 파지의 바이러스-유사 입자 : 여기서 사용되는 바, 용어 "RNA 파지의 바이러스-유사 입자"는 바람직하게는, RNA 파지의 코트 단백질, 돌연변이 또는 이의 단편을 포함하거나 필수적으로 구성되거나 구성되는 바이러스-유사 입자를 언급한다. 덧붙여, RNA 파지의 바이러스-유사 입자는 또한 RNA 파지의 구조와 유사하며, 비-복제성 및/또는 비-감염성이며, RNA 파지의 복제 기작을 암호화하는 적어도 하나의 유전자 또는 유전자들이 결여된 것이며, 또한, 전형적으로 숙주에 바이러스가 부착되거나, 숙주 내로 들어가도록 하는 단백질 또는 단백질들을 암호화하는 유전자 또는 유전자들이 결여된 것이다. 그러나 이러한 정의는 또한, 상기 언급된 유전자들이 존재하지만 활성화되지 않은 상태, 더욱이 또한, RNA 파지의 바이러스-유사 입자를 비복제성 및/또는 비감염성으로 이끄는 상태의 RNA 파지 바이러스-유사 입자도 포함한다. 본 발명에서, 용어 "서브유닛" 및 "모노머"는 본 발명에서 상호호환적 및 동등하게 사용된다. 본 발명에서, 용어 "RNA-파지" 및 용어 "RNA-박테리오파지"는 상호호환적으로 사용된다.

하나(One), 한개(a), 또는 한개(an): 본 명세서에서 하나(One), 한개(a), 또는 한개(an)가 사용되는 경우, 이는 달리 언급하지 않는 한 "적어도 하나의" 또는 "하나 이상"을 의미한다.

본 발명에서, 만약, 항체들이 본 발명의 항원, 항원 단백질, 항원의 단편, 항원의 변형체에 10⁶ M^{- 1}이상, 바람직하게는 10⁷ M^{- 1}이상, 보다 바람직하게는 10⁸ M^{- 1}이상, 더욱 바람직하게는 10⁹ M^{- 1}이상의 결합 친화도(Ka)로 결합한다면, 특이적으로 결합하는 것으로 정의된다. 항원의 친화도는 종래에 일반적인 기술을 갖는 자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다.(예를 들면, Scatchard 분석에 의하여)

본 발명은 동물 또는 인간에서 IL-15에 대한 면역 반응을 증가시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 다음을 포함한다: (a) 적어도 하나의 제1부착 부위를 갖는 바이러스-유사 입자(VLP); 및 (b) 적어도 하나의 제2부착 부위를 갖으며, IL-15 단백질, IL-15 뮤테인, 또는 IL-15 단편인 적어도 하나의 항원, 여기서, (a) 및 (b)는 적어도 하나의 제1부착 부위 및 적어도 하나의 제2부착 부위를 통하여 링크된다. 바람직하게, IL-15 단백질, IL-15 뮤테인 또는 IL-15 단편은 VLP에 링크되어, 정렬된 반복적인 항원-VLP 어레이를 형성한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 적어도 20, 바람직하게 적어도 30, 더욱 바람직하게 적어도 60, 보다 바람직하게 적어도 120, 더더욱 바람직하게 적어도 180의 본 발명에 따른 IL-15가 VLP에 링크된다.

종래에 알려진 정렬된 반복적인 구조를 갖는 임의의 바이러스는 본 발명의 VLP로서, 선택될 수 있다. DNA 또는 RNA 바이러스의 예, VLP의 제제에 이용될 수 있는 코트 또는 캡시드 단백질은 WO 2004/009124의 25페이지 10-21번째 줄, 26페이지 11-28번째 줄, 28페이지 4번째 줄 내지 31페이지 4번째 줄에 개시되었다. 이러한 공개물은 참조의 형태로 여기에 삽입된다.

바이러스 또는 바이러스-유사 입자는 바이러스-감염된 세포 배양으로부터 제조 및 정제될 수 있다. 백신용의 결과적인 바이러스 또는 바이러스-유사 입자는 발병력을 제거할 필요가 있다. 발병력이 없는 바이러스 또는 바이러스-유사 입자는 화학적 및/또는 물리적 비활성화, 이를 테면, 자외선 조사, 포름알데히드 처리에 의하여 생성될 수 있다. 대체적으로, 바이러스의 유전자는 바이러스 복제의 능력을 없애는 것을 허용하는 돌연변이 또는 결실에 의하여 유전적으로 조작될 수 있다.

바람직한 일구체예에서, VLP는 재조합 VLP이다. 일반적으로 알려진 거의 모든 바이러스들은 시퀀싱되었으며, 이는 공개되었다. 코트 단백질을 암호화하는 유전자는 숙련자에 의하여 쉽게 확인될 수 있다. 숙주 내에서 재조합적으로 발현하는 코트 단백질에 의한 VLP의 준비는 숙련자의 일반적인 지식 내에 있다.

바람직한 일구체예에서, 바이러스-유사 입자는 a) 내지 o)로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스의 재조합 단백질, 돌연변이 또는 이의 단편을 포함하거나 대체적으로 구성된다: a) RNA 파지; b) 박테리오파지; c) B형 간염 바이러스, 바람직하게는 그것의 캡시드 단백질(Ulrich, et al, Virus Res. 50:141-182 (1998)) 또는 그것의 표면 단백질(WO 92/11291); d) 홍역 바이러스(measles virus)(Warnes, et al., Gene 160:173-178 (1995)); e) 신드비스 바이러스(Sindbis virus); f) 로타바이러스(rotavirus)(US 5,071,651 및 US 5,374,426); g) 구제역 바이러스(foot-and-mouth-disease virus)(Twomey, et al., Vaccine 13:1603 1610, (1995)); h) 노워크 바이러스(Norwalk virus)(Jiang, X., et al., Science 250:1580 1583 (1990); Matsui, S.M., et al., J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991)); i) 알파바이러스(Alphavirus); j) 레트로바이러스(retrovirus), 바람직하게는 그것의 GAG 단백질 (WO 96/30523); k) 레트로트랜스포존 Ty(retrotransposon Ty), 바람직하게는 단백질 p1; l) 인간 파필로마 바이러스(human Papilloma virus) (WO 98/15631); m) 폴리오마 바이러스(Polyoma virus); n) 담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus); 및 o) 플록 하우스 바이러스(Flock House Virus).

바람직한 일구체예에서, VLP는 재조합 단백질, 돌연변이 또는 이의 단편의 하나 초과의 아미노산 서열, 바람직하게는 두개의 아미노산 서열을 포함하거나 구성된다. VLP는 모자이크 VLP로서, 본 발명에서 언급된 하나 초과의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된다.

본 발명에서 사용된 용어 "재조합 단백질의 단편" 또는 용어 "코트 단백질의 단편"은 야생형 재조합 단백질 또는 코트 단백질 각각 길이의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%이며, 이는 바람직하게, VLP를 형성할 능력을 보유하는 폴리펩티드로서 정의된다. 바람직하게 단편은 적어도 하나의 내부 결실, 적어도 하나의 절단, 또는 적어도 하나의 이들 조합에 의하여 얻는다. 용어 "재조합 단백질의 단편" 또는 "코트 단백질의 단편"은 또한 상기에서 정의된 "재조합 단백질의 단편" 또는 "코트 단백질의 단편"각각에 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 95%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 이는 바람직하게 바이러스-유사 입자로 어셈블리할 수 있다.

본 발명에서 상호호환적으로 이용되는 용어 "돌연변이 재조합 단백질" 또는 용어 "재조합 단백질의 돌연변이" 또는 본 발명에서 상호호환적으로 이용되는 용어 "돌여변이 코트 단백질" 또는 "코트 단백질의 돌연변이"는 야생형 재조합 단백질 또는 코트 단백질 각각으로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 언급하며, 상기 아미노산 서열은 야생형 서열에 대하여 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99%의 상동성을 갖고, 바람직하게 이는 VLP로 어셈블리할 수 있다.

재조합 단백질 또는 코트 단백질의 단편 또는 돌연변이가 VLP로 어셈블되는 것은 본 분야의 숙련자에 의하여 E. coli에서 단백질을 발현시키고, 부가적으로 세포 용해물로부터 겔 여과하여 캡시드를 정제하고, 면역확산 분석(Ouchterlony test) 또는 전자현미경법에 의해 테스트하여 캡시드 형성을 분석함으로써 테스트될 수 있다(Kozlovska, T. M.. et al., Gene 137 : 133-37(1993)). 면역확산 분석 및 전자현미경법은 세포 용해물에서 직접적으로 수행될 수 있다.

바람직한 일구체예에서, 본 발명의 바이러스-유사 입자는 B형 간염 바이러스의 것이다. B형 간염 바이러스-유사 입자의 제제는 특히 WO 00/32227, WO 01/85208 및 WO 01/056905에 개시되어 있다. 모든 세개의 문서들은 명시적으로 여기에 참조의 형태로 삽입된다. 본 발명의 실시예에 이용하기에 적합한 HBcAg의 다른 변형체는 WO 01/056905의 34-39페이지에 개시되어 있다.

본 발명의 더욱 바람직한 일구체예에서, HBcAg의 VLP에 본 발명의 IL-15가 링크되는 것을 매개하기 위하여, 라이신 잔기는 HBcAg 폴리펩티드에 도입된다. 더욱 바람직한 구체예에서, VLP 및 본 발명의 조성물은 위치 79 및 80이 Gly-Gly-Lys-Gly-Gly의 아미노산 서열을 갖는 펩티드로 치환된 아미노산이 되도록 변형된 서열 번호 20의 1-144 또는 1-149, 1-185를 포함하거나 대체적으로 구성되는 HBcAg를 이용하여 준비된다. 이러한 변형은 서열 번호 20을 서열 번호 21로 변화시킨다. 더욱 바람직한 구체예에서, 서열 번호 21의 48 및 110 위치, 또는 이에 상응하는 단편들, 바람직하게는 1-144 또는 1-149의 시스테인 잔기는 세린으로 돌연변이된다. 본 발명은 또한 상기 언급된 바에 상응하는 아미노산 변화를 갖는 B형 간염 코어 단백질 돌연변이체를 포함하는 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 서열 번호 21에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 대체적으로 구성된 HBcAg 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 백신 각각을 함유한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 바이러스-유사 입자는 재조합 알파바이러스이며, 더욱 자세하게는 재조합 신드비스 바이러스이다. 알파바이러스는 DNA 매개없이 감염된 세포의 세포질에서 그들 게놈의 RNA를 전체적으로 복제하는 양성 가닥 RNA 바이러스(positive stranded RNA viruse)이다(Strauss, J. and Strauss, E., Microbiol. Rev. 58:491- 562 (1994)). 알파바이러스 과의 몇몇 구성원들, 신드비스(Schlesinger, S., Trends Biotechnol. 11:18-22 (1993)), 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest Virus, SFV) (Liljestrom, P. & Garoff, H., Bio/Technology 9:1356-1361 (1991)) 및 다른 것들(Davis, N.L. et al, Virology 171:189-204 (1989)),은 다양한 다른 단백질들을 위한 바이러스-기초의 발현 벡터(Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8:578-582 (1997))로서, 및 백신 개발을 위한 후보자로서, 이용되는 데 상응한 주목을 받는다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 바이러스-유사 입자는 RNA-파지의 재조합 코트 단백질, 돌연변이 또는 이의 단편들을 포함하거나 필수적으로 구성되거나, 대체적으로 구성된다. 바람직하게, RNA-파지는 a) 박테리오파지 Qβ; b) 박테리오파지 R17; c) 박테리오파지 fr; d) 박테리오파지 GA; e) 박테리오파지 SP; f) 박테리오파지 MS2; g) 박테리오파지 M11; h) 박테리오파지 MX1; i) 박테리오파지 NL95; k) 박테리오파지 f2; l) 박테리오파지 PP7; m) 박테리오파지 AP205로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 일구체예에서, 조성물은 RNA 파지의 코트 단백질, 돌연변이 또는 이의 단편을 포함하며, 상기 코트 단백질은 (a) Qβ CP를 언급하는 서열 번호 1; (b) 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 혼합물(Qβ Al 단백질을 언급); (c) 서열 번호 3; (d) 서열 번호 4; (e) 서열 번호 5; (f) 서열 번호 6, (g) 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 혼합물; (h) 서열 번호 8; (i) 서열 번호 9; G) 서열 번호 10; (k) 서열 번호 11; (1) 서열 번호 12; (m) 서열 번호 13; 및 (n) 서열 번호 14로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 일반적으로 상기에서 언급한 코트 단백질은 N-말단의 메티오닌의 존재 하에서, 또는 존재하지 않아도, VLP로 어셈블리할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일구체예에서, VLP는 RNA 파지의 코트 단백질, 돌연변이 또는 이의 단편 중 하나 초과의 아미노산 서열, 바람직하게는 두개의 아미노산 서열을 포함하거나 대체적으로 구성되는 모자이크 VLP이다.

매우 바람직한 일 구체예에서, VLP는 RNA 파지의 두개의 다른 코트 단백질을 포함하거나 대체적으로 구성되며, 상기 두개의 코트 단백질은 서열 번호 1 및 서열 번호 2 또는 서열 번호 6 및 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 바이러스-유사 입자는 RNA-박테리오파지 Qβ, fr, AP205 또는 GA의 재조합 코트 단백질, 돌연변이 또는 이의 단편을 포함하거나 대체적이며 필수적으로 구성되거나, 대체적으로 구성된다.

바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 VLP는 RNA-파지 Qβ VLP이다. Qβ의 캡시드 또는 바이러스-유사 입자는 정20면체의 파지-유사 캡시드 구조를 나타내며, 이는 25㎚의 직경과 T=3 준대칭(quasi symmetry)을 갖는 것으로 보인다. 캡시드는 180 카피의 코트 단백질을 함유하며, 이는 이황가교(disulfide bridge)에 의해 공유성 펜타머 및 헥사머에 링크되어 (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-5554 (1996)), Qβ 캡시드가 주목할만한 안정성을 갖게 한다. 그러나, 재조합 Qβ 코트 단백질로 만들어진 VLP 또는 캡시드는 캡시드에서 이황연결(disulfide link)을 통해 다른 서브유닛에 링크되지 않거나, 불완전하게 링크된 서브유닛을 함유할 수 있다. Qβ의 캡시드 또는 VLP는 또한, 유기 용매 및 변성제에 대하여 보기 드문 저항성을 나타낸다. 놀랍게도, 우리는 30%나 되는 농도의 DMSO 및 아세토니트릴과, 1M이나 되는 농도의 구아니디늄이 캡시드의 안정성에 영향을 끼치지 않는 것을 발견하였다. Qβ의 캡시드 또는 VLP의 높은 안정성은 특히 본 발명에 따라 동물 및 인간의 면역화 및 백신접종에 그것을 이용하는데, 장점이 있다.

보다 바람직한 RNA-파지, 특히 본 발명에 따른 Qβ 및 fr의 바이러스-유사 입자는 WO 02/056905에 개시되었으며, 이 개시물은 그것의 전체로서 여기에 참조에 의하여 삽입된다. WO 02/056905의 실시예 18은 Qβ로부터 VLP 입자들의 준비에 대한 상세한 설명을 제공한다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 VLP는 RNA 파지 AP205의 VLP이다. 아미노산 5에서 프롤린이 트레오닌으로 치환된 AP205 코트 단백질을 포함하는 AP205 VLP의 어셈블리-능력이 있는 돌연변이 형태는 본 발명의 실시예에서 이용될 수 있으며, 본 발명의 다른 바람직한 구체예를 이끌 수 있다. WO 2004/007538, 특히 실시예 1 및 실시예 2는 AP205 코트 단백질을 포함하는 VLP를 얻는 방법, 특히 여기서, 이들을 발현시키고 정제시키는 방법을 제공한다. WO 2004/007538는 참조의 방법으로 여기에 삽입된다. AP205 VLP는 매우 면역성 있으며, 본 발명의 IL-15에 링크되어 전형적이며 바람직하게 반복적 방식에서 기원된 본 발명의 IL-15를 나타내는 백신 컨스트럭트를 생성할 수 있다. 본 발명에 나타내어진 IL-15에서 이끌어낸 높은 항체 적정량은 본 발명의 링크된 IL-15가 항체 분자와 상호작용할 수 있으며, 면역성 있음을 보여준다.

일 구체예에서, 본 발명의 VLP는 바이러스, 특히 RNA 파지의 돌연변이 코트 단백질을 포함하거나 구성되며, 여기서, 돌연변이 코트 단백질은 치환 및/또는 결실의 방법에 의하여 적어도 하나의 라이신 잔기를 제거함으로써 변형된다. 또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 VLP는 바이러스, 특히 RNA 파지의 돌연변이 코트 단백질을 포함하거나 구성되며, 여기서, 돌연변이 코트 단백질은 치환 및/또는 삽입의 방법에 의하여 적어도 하나의 라이신 잔기의 삽입에 의하여 변형된다. 매우 바람직한 일구체예에서, RNA 파지 Qβ의 돌연변이 코트 단백질은 적어도 하나, 또는 대체적으로 적어도 두개의 라이신 잔기가 치환 또는 결실의 방법에 의하여 제거된다. 대체적인 매우 바람직한 구체예에서, RNA 파지 Qβ의 돌연변이 코트 단백질은 적어도 하나, 또는 대체적으로 적어도 두개의 라이신 잔기가 치환 또는 삽입의 방법에 의하여 삽입된다. 보다 바람직한 일구체예에서, RNA 파지 Qβ의 돌연변이 코트 단백질은 서열 번호 15-19의 임의의 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 적어도 하나의 라이신 잔기의 결실, 치환 또는 삽입은 다양한 커플링의 정도, 예를 들면, 백신의 조건을 매치하고 맞추기 위하여, 바이러스, 특히 RNA-파지의 VLP의 서브유닛당 본 발명의 IL-15의 양을 다양하게 하는 것을 허용한다.

바람직한 일구체예에서, 본 발명의 조성물 및 백신은 본 발명의 조성물들 및 백신들은 0.5 내지 4.0의 항원 밀도를 갖는다. 여기에서 사용된 용어 "항원 밀도"는 서브유닛 당, 여기서 바람직하게 RNA 파지의 VLP인 바람직하게, VLP의 코트 단백질 당, 링크된 본 발명의 IL-15의 평균 수를 언급한다. 이에 따라, 이러한 수치는 본 발명의 조성물 또는 백신들에서 VLP, 특히 RNA-파지의 VLP의 모든 서브유닛들 또는 모노머들에 걸쳐 평균으로써 계산된다.

본 발명의 바람직한 다른 구체예에서, 바이러스-유사 입자는 Qβ의 돌연변이 코트 단백질 Qβ, 또는 돌연변이 또는 이의 단편, 및 이에 상응하는 A1 단백질을 포함하거나 대체적이며 필수적으로 구성되거나, 대체적으로 구성된다. 다른 바람직한 일구체예에서, 바이러스-유사 입자는 아미노산 서열 번호 15, 16, 17, 18 또는 19의 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 코트 단백질 및 상응하는 A1 단백질을 포함하거나, 대체적이며 필수적으로 구성되거나, 대체적으로 구성된다.

아미노산 5에서 프롤린이 트레오닌으로, 아미노산 14에서 아스파라긴이 아스파르트산으로 치환된 AP205 코트 단백질을 포함하는 AP205 VLP의 어셈블리-능력이 있는 돌연변이 형태는 또한 본 발명의 실시예에서 이용되며, 본 발명의 다른 바람직한 구체예를 이끈다. AP205Pro-5-Thr의 클로닝 및 VLP의 정제는 WO 2004/007538, 특히 실시예 1 및 실시예 2에 개시되어 있다. WO 2004/007538, 특히 실시예 1 및 실시예 2의 개시물은 명시적으로 여기에 참조의 형태로 삽입된다.

다른 RNA 파지 코트 단백질은 박테리아 숙주에서 발현에 따라 자기-어셈블리하는 것으로 보여진다(Kastelein, RA. et al., Gene 23:245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986), Adhin, MR. et al., Virology 170:238- 242 (1989), Priano, C. et al., J. MoI. Biol. 249:283-297 (1995)). 특히, GA의 생물학 및 생화학적 특성(Ni, CZ., et al., Protein Sci. 5:2485-2493 (1996), Tars, K et al., J. MoLBiol. 271 :759-773(1997)) 및 fr의 특성(Pushko P. et al., Prot. Eng. 6:883-891 (1993), Liljas, L et al. J MoI. Biol. 244:279-290, (1994))은 개시되었다. 몇몇 RNA 박테리오파지들의 결정 구조가 결정되었다.(Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-554 (1996)). 상기와 같은 정보를 이용하여 표면 노출 잔기들이 확인될 수 있으며, 이에 따라, RNA-파지 코트 단백질은 삽입 또는 치환의 방법으로 하나 이상의 반응성있는 아미노산 잔기가 삽입됨으로써, 변형될 수 있다. RNA 파지로부터 유래된 VLP들의 다른 장점은 박테리아에서 그들의 높은 발현률을 들 수 있으며, 이는 감당할 수 있는 비용으로 많은 양의 물질을 생산하는 것을 허용한다.

바람직한 일구체예에서, 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 항원을 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 항원은 IL-15 단백질, IL-15 단편, 또는 IL-15 뮤테인이다. 바람직한 일구체예에서, IL-15 단백질, IL-15 뮤테인 또는 IL-15 단편은: (a) 인간 기원; (b) 소 기원; (c) 양 기원; (d) 개 기원; (e) 고양이 기원; (f) 마우스 기원 (g) 돼지 기원; (h) 닭 기원 (i) 말 기원; 및 (j) 랫 기원으로 구성된 군에서 선택된 기원으로부터 선택된다.

바람직한 일구체예에서, 적어도 하나의 항원은 IL-15 단백질이다. 더욱 바람직한 일구체예에서, IL-15 단백질은: (a) 서열 번호 22; (b) 서열 번호 23; (c) 서열 번호 24; (d) 서열 번호 25; 및 (e) 서열 번호 22-25 중 임의의 것에 적어도 80% 또는 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 또는 가장 바람직하게 적어도 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된다.

또다른 바람직한 일구체예에서, 적어도 하나의 항원은 IL-15 뮤테인이다. IL-15 뮤테인은 IL-15 생물학적 활성을 갖지 않으나, IL-15에 대하여 특이적인 항체 반응을 유도할 수 있다. 게다가, 본 발명에 따라 항원으로써 IL-15를 이용하는 것은 본 발명에 따른 VLP에 커플된 IL-15의 도입에 기인한 예상하지 못하고 원하지 않는 부작용을 피하도록 한다. US 특허 6013480에서, 개시된 두 뮤테인은 IL-15R α-서브유닛에 결합할 수 있으며, IL-15 수용체 복합체의 β- 또는 γ- 서브유닛을 통하여 신호를 전달할 수 없다. 생물학적인 활성이 없으며, α-서브유닛에 결합할 수 없는 뮤테인 또한 개시되었다(Bernard J. et al. J Biol Chem. (2004);279(23):24313-22). 더욱이, 바람직한 일 구체예에서, IL-15 뮤테인은 아래 (a) 내지 (l)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다: (a) 위치 46이 E가 아닌 서열 번호 23; (b) 위치 50이 I가 아닌 서열 번호 23; (c) 위치 46이 E가 아니고, 위치 50이 I가 아닌 서열 번호 23; (d) 서열 번호 31; (e) 서열 번호 32; (f) 서열 번호 33; (g) 서열 번호 23에 적어도 80%, 또는 바람직하게 적어도 85%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열(여기서, 서열 번호 23의 위치 46에 상응하는 위치는 E가 아니거나, 서열 번호 23의 위치 50에 상응하는 위치가 I가 아니거나, 서열 번호 23의 위치 46에 상응하는 위치가 E가 아니고, 서열 번호 23의 위치 50에 상응하는 위치가 I가 아니다); (h) 아미노산 잔기 Asp8 또는 Gln108 중 하나 또는 둘다는 자연적으로-발생하는 다른 아미노산으로 치환되거나 결실된 서열 번호 23 ; (i) 아미노산 잔기 Gln¹⁰¹ 또는 Gln¹⁰⁸ 중 하나 또는 둘 다가 자연적으로-발생하는 다른 아미노산으로 치환되거나 결실된 서열 번호 23; (j) 서열 번호 42; (j) 위치 8이 Asp이 아니며, 바람직하게는 Asp 또는 Glu이 아닌 서열 번호 23; (k) Asp⁸ 또는 Gln¹⁰⁸ 중 하나 또는 둘 다가 각각 세린 또는 시스테인으로 치환된 서열 번호 23; (l) 8, 101 및 108로부터의 위치에서 적어도 하나의 아미노산이 결실되거나, 바람직하게는 치환된 서열 번호 23.

바람직한 일 구체예에서, IL-15 뮤테인은 위치 46이 Glu; Asp, Gln 또는 Asn이 아닌 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된다. 다른 바람직한 구체예에서, IL-15 뮤테인은 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

바람직한 일 구체예에서, IL-15 뮤테인은 위치 50이 Ile 또는 Leu이 아닌 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된다. 다른 구체예에서, IL-15는 위치 50이 Ile, Leu, Ala, Gly 또는 Val이 아닌 아미노산 서열을 갖는다. 다른 바람직한 구체예에서, IL-15 뮤테인은 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된다.

다른 바람직한 일 구체예에서, IL-15 뮤테인은 위치 46이 Glu; Asp, Gln 또는 Asn이 아니고, 위치 50이 Ile, Leu, Ala, Gly 또는 Val이 아닌 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된다. 다른 바람직한 구체예에서, IL-15 뮤테인은 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된다.

또다른 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 항원은 IL-15 단편이 적어도 하나의 항원성 부위를 포함하거나 대신하여 구성되는 IL-15 단편이다.

면역원성의 소유는 보통 단백질의 전장을 필요로 하지 않으며, 단백질이 예를 들어, 항원성 부위와 같은 하나 이상의 항원성 에피토프를 함유한다는 것이 알려져 있다. 단편 또는 짧은 펩티드는 MHC 분자의 환경 내에서 T-세포 수용체에 의하여, 또는 항체에 의하여 면역특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 항원성 부위를 함유하기에 충분할 수 있다. 항원성 부위 또는 부위들은 본 분야에 숙련자에게 일반적으로 알려진 많은 기술에 의하여 결정될 수 있다. 이는 서열 정렬 및 구조 예측에 의하여 행하여질 수 있다. 예의 방법으로, Rasmol과 같은 프로그램을 이용하여, 가능한 α-나선, 회전, 사슬 사이- 및 내부- 이황화 결합 등을 예측할 수 있다. 분자 내부에 묻힌 서열 또는 분자의 표면에 노출된 서열을 예측할 수 있다. 분자의 표면에 노출된 서열은 자연의 항원성 부위(들)을 더욱 포함하려는 경향이 있으며, 이에 따라, 치료적 항체를 유도하는 데 유용하다. 표면 펩티드 서열이 결정된 다음, 이러한 서열 내에 항원성 부위는 예를 들어 소모적인 돌연변이 생성 방법에 의하여 정의될 수 있다(알라닌 스캔 돌연변이 생성과 같은, Cunningham BC, Wells JA, Science 1989 Jun 2; 244(4908):1081-5). 간단하게, 이러한 서열 내의 아미노산은 하나씩 알라닌으로 돌연변이시키고, 알라닌 돌연변이가 항체에 감소된 결합을 나타내거나, 전체적으로 결합을 잃는 아미노산이 항원성 부위의 성분일 것이다.

항원성 부위(들)을 결정하는 또다른 방법은 IL-15의 전장 서열에 걸쳐 있는 오버래핑 펩티드를 생성시키는 것이다(Geysen, PNAS Vol 81: 3998-4002, (1984) 및 Slootstra, J. W. et al.,(1996) Mol. Divers. 1, 87-96). 보통 초기 스크리닝으로써, 5-10 오버랩 아미노산을 갖는 20-30 아미노산 길이의 펩티드가 화합적으로 합성될 수 있다. 마우스는 각 개개의 펩티드로 면역화되고, 다클론성 혈청을 이러한 마우스로부터 가져온다. 다클론성 혈청이 자연의 IL-15 단백질을 인지할 수 있는지 여부는 예를 들어, ELISA 또는 면역침전법과 같은 다양한 방법을 이용하여 시험할 수 있다. IL-15를 인지하는 혈청에 상응하는 펩티드는 자연과 매우 유사한 항원성 부위를 함유한다.

담체에 링크되거나, 항원으로써 단독으로 이용될 때, 펩티드는 그것이 전장 단백질의 범위 내에 있을 때와 다른 형상에 적용시킬 수 있다. 이에 따라, IL-15로 면역화된 마우스로부터 얻은 다클론성 혈청에 펩티드의 결합은 교차-확인될 것이다.

대신하여, 설치류를 전장 IL-15 단백질로 면역화시킨다. 각 개개의, 부분적으로 오버랩되는 펩티드와 함께 결과된 다클론성 혈청의 교차-활성은 ELISA, 면역침전 또는 질량 분석과 같은 많은 방법에 의하여 테스트될 수 있다(Parker and Tomer, Mol. Biotechnol. 2002, 20, 49-62). 이러한 펩티드는 합성 또는 재조합 기원일 수 있다.

상기 언급된 방법을 단순화시키고 촉진하기 위한 기술이 유용하다. 예를 들어, 펩티드는 파지의 표면에 나타나고 무작위로 생성될 수 있다(Nilsson, Methods Enzymol. 2000;326:480-505; Winter Annu Rev Immunol. 1994;12:433-55; peptide phage display, Smith, Methods Enzymol. 1993;217:228-57). 부분적으로 오버랩되는 펩티드의 필요한 양은 SPOT 기술(Jerini S technology; Sigma-Genosys)을 이용하여 유의적으로 감소시킬 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, IL-15 단편은 IL-15 단백질 또는 여기서 정의된 바와 같은 IL-15 뮤테인의 적어도 5 내지 12 인접한 아미노산을 포함하거나, 대신하여 또는 바람직하게 구성된다.

바람직한 일 구체예에서, IL-15 단편은 60 미만, 바람직하게 50 미만, 더욱 바람직하게 40 미만, 더욱 바람직하게 30 미만, 더더욱 바람직하게 20 미만인 아미노산 길이로 구성된다.

바람직한 다른 구체예에서, IL-15 단편은 서열 번호 23의 아미노산 44-52, 바람직하게 아미노산 44-54, 더욱 바람직하게 아미노산 43-55를 포함한다. 다른 바람직한 일 구체예에서, IL-15 단편은 서열 번호 23의 위치 46이 Glu가 아니며, 바람직하게, Glu; Asp, Gln 또는 Asn이 아닌 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 대신하는 바람직한 구체예에서, IL-15 단편은 서열 번호 23의 위치 50이 Ile가 아닌, 바람직하게는 Ile, Leu, Ala, Gly 또는 Val이 아닌 아미노산 서열을 갖는다.

바람직한 다른 구체예에서, IL-15 단편은 서열 번호 23의 아미노산 64-68, 바람직하게 62-70, 더욱 바람직하게 61-73을 포함한다.

바람직한 구체예에서, IL-15 단편은 (a) 서열 번호 34; (b) 서열 번호 35; (c) 서열 번호 36; (d) 서열 번호 37; (e) 서열 번호 38; (f) 서열 번호 39; (g) 서열 번호 40; 및 (h) 서열 번호 34-40 중 임의의 것에 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 바람직하게 90%, 또는 가장 바람직하게 적어도 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

본 발명은 (a) 적어도 하나의 제1부착 부위를 갖는 VLP를 제공하고; (b) 적어도 하나의 제2부착 부위를 갖는 적어도 하나의 항원을 제공하고; (c) 상기 VLP와 상기 적어도 하나의 항원을 결합시켜, 상기 조성물을 제조하는 것을 포함하는 본 발명의 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 항원은 IL-15 단백질, IL-15 뮤테인 또는 IL-15 단편이며, 상기 적어도 하나의 항원 및 상기 VLP는 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2부착 부위를 통하여 링크된다. 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 제2 부착 부위를 갖는 적어도 하나의 항원, 예를 들어 IL-15 단백질, IL-15 뮤테인 또는 IL-15 단편의 공급은 박테리아 시스템, 바람직하게는 E. coli에서 발현의 방법에 의한다. 보통 His 태그, Myc 태그와 같은 태그를 부가하여, 정제 과정을 촉진시킨다. 또다른 접근에서, 특히 50 아미노산을 넘지 않는 IL-15 단편은 화학적으로 합성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일구체예에서, 적어도 하나의 제1부착 부위를 갖는 VLP는 적어도 하나의 제2부착 부위를 갖는 본 발명의 IL-15와 적어도 하나의 펩티드 결합을 통하여 링크된다. 본 발명의 IL-15, 바람직하게, IL-15 단편, 더욱 바람직하게 50 아미노산 이하, 더욱 바람직하게 30 아미노산 이하의 단편을 암호화하는 유전자는 VLP의 코트 단백질을 암호화하는 유전자의 N- 또는 C-말단에 내부적으로 또는 바람직하게, 프레임 내(in-frame) 링크된다. 융합은 절단 돌연변이로 언급되는 코트 단백질 서열이 결실된 부분의 코트 단백질의 돌연변이에 IL-15 단편의 서열을 삽입하는 것에 의하여 영향을 받을 수 있다. 절단 돌연변이는 코트 단백질의 부분에서, N- 또는 C- 말단 또는 내부 결실을 가질 수 있다. 예를 들어, 특이적 VLP HBcAg를 위하여, 아미노산 79-80은 외부의 에피토프로 대체된다. 융합 단백질은 바람직하게, 전자현미경에 의하여 시험될 수 있는 발현에 따른 VLP로 어셈블리할 능력을 보유할 것이다.

프랭킹(flanking) 아미노산 잔기는 부가되어, 코트 단백질과 외부 에피토프 사이의 거리를 증가시킬 수 있다. 글리신 및 세린 잔기는 특히, 프랭킹 서열에 이용되는 바람직한 아미노산이다. 그러한 프랭킹 서열은 추가적인 유연성을 부여하여, VLP 서브유닛의 서열에 외부 서열을 융합하는 것의 잠재적인 불안정화 효과를 줄일 수 있고, 외부 에피토프의 존재에 의한 어셈블리와의 간섭을 줄일 수 있다.

다른 구체예에서, 적어도 하나의 본 발명의 IL-15, 바람직하게는 50 아미노산 미만으로 구성된 IL-15 단편은 많은 다른 바이러스 코트 단백질들, 예를 들어, Qβ의 A1 단백질의 절단된 형태의 C-말단에(Kozlovska, T.M., et al., Intervirology 39:9-15(1996)), 또는 확장된 CP의 위치 72 및 73 사이에 융합될 수 있다. 또다른 예로써, IL-15 단편은 fr CP의 아미노산 2 및 3 사이에 삽입되어, IL-15-fr CP 융합 단백질이 될 수 있다(Pushko P. et al., Prot. Eng. 6:883-891 (1993)). 더욱이, IL-15 단편은 RNA 파지 MS-2(WO 92/13081)의 코트 단백질의 N-말단 돌출 β-헤어핀에 융합될 수 있다. 대신하여, IL-15 단편은 파필로마바이러스의 캡시드 단백질, 바람직하게 소 파필로마바이러스 1형(BPV-1)의 캡시드 단백질 L1에 융합될 수 있다(Chackerian B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378(1999), WO 00/23955). IL-15 단편으로, BPV-1 L1의 아미노산 130-136의 치환은 또한 본 발명의 구체예이다. WO 2004/009124의 62페이지 20줄에서 68페이지 17페이지까지에 개시된 바이러스의 코트 단백질, 코트 단백질, 돌연변이 또는 이의 단편에 융합된 본 발명의 항체의 다른 구체예는, 본 발명에 참조의 방법으로 삽입된다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 IL-15, 바람직하게는 IL-15 단편, 더욱 바람직하게는 서열 번호 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40 서열의 아미노산을 갖는 IL-15 단편은 RNA 파지 AP205의 코트 단백질, 돌연변이 또는 이의 단편의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 하나의 바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 본 발명의 IL-15 및 AP205의 코트 단백질, 단편 또는 이의 돌연변이 사이에 위치한 스페이서를 포함한다.

본 발명의 바람직한 일구체예에서, 조성물은 적어도 하나의 공유 결합, 바람직하게 비-펩티드 결합인 공유 결합을 통하여 적어도 하나의 제2부착 부위를 갖는 적어도 하나의 본 발명의 IL-15에 링크되는 적어도 하나의 제1부착 부위를 갖는 바이러스-유사 입자를 포함하거나 대신하여 필수적으로 구성된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 제1부착 부위는 아미노기, 바람직하게는 라이신 잔기의 아미노기를 포함하거나, 바람직하게는 이것이다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 제2부착 부위는 설프히드릴기, 바람직하게는 시스테인의 설프히드릴기를 포함하거나, 바람직하게는 이것이다.

본 발명의 매우 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 제1부착 부위는 아미노기, 바람직하게는 라이신 잔기의 아미노기를 포함하거나, 이것이며, 적어도 하나의 제2부착 부위는 설프히드릴기, 바람직하게는 시스테인의 설프히드릴기를 포함하거나, 이것이다.

본 발명의 바람직한 일구체예에서, 본 발명의 IL-15는 화학적 교차-링크, 전형적이며 바람직하게 이형기능성 교차-링크를 통하여 VLP에 링크된다. 바람직한 구체예들에서, 이형기능성 교차-결합은 바람직한 제1부착 부위, 바람직하게는, 아미노기, 보다 바람직하게는 VLP의 라이신 잔기(들)의 아미노기과 반응할 수 있는 기능성 군 및 제2부착 부위, 예를 들면, 바람직하게 고유의 또는 본 발명의 IL-15에 인공적으로 부가된 시스테인 잔기(들)의 설프히드릴기과 반응할 수 있는 다른 기능성 군을 함유하며, 또한 임의로 환원에 의하여 반응에 유효하게 만든다. 몇몇 이형-양기능성 교차-링커는 종래에 알려져 있다. 이들은 바람직한 교차-링커 SMPH(Pierce), 설포-MBS, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-SIAB, 설포-SMPB, 설포-SMCC, SVSB, SIA 및 유효한 다른 교차-링커, 예를 들면, Picerce 화학 회사로부터의 것을 함유하며, 이는 아미노기에 반응성 있는 기능성 군 및 설프히드릴기에 반응성있는 기능성 군을 갖는다. 상기에서 언급한 교차-링커는 모두 아미노기과 반응 후에 아미드 결합 및 설프히드릴기에서 티오에테르 결합의 형성을 이끈다. 본 발명의 실시예에 적합한 교차-링커의 다른 분류는 커플링에 따른, 본 발명의 IL-15와 VLP사이의 이황화 결합의 도입에 의하여 특성화된다. 이러한 분류에 속하는 바람직한 교차-링커는 예를 들어, SPDP 및 설포-LC-SPDP(Pierce)를 함유한다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 링커를 포함한다. 본 발명의 IL-15에 제2부착 부위의 엔지니어링은 링커, 바람직하게는 본 발명에 개시된 것에 따라 제2부착 부위로서 적합한 아미노산을 포함하는 링커의 회합에 의하여 성취된다. 게다가, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 링커는 적어도 하나의 공유 결합의 방법, 바람직하게는 적어도 하나의 전형적인 펩티드 결합에 의하여 본 발명의 IL-15에 회합된다. 바람직하게는, 링커는 제2부착 부위를 포함하거나 이로써 대체적으로 구성된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 링커는 설프히드릴기, 바람직하게는 시스테인 잔기의 설프히드릴기을 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서, 아미노산 링커는 시스테인 잔기이다.

링커의 선택은 등전점(pi), 전하 분포, 글리코실화와 같은 생화학적 특성, 본 발명의 IL-15 본성에 달려있다. 일반적으로, 유연성 있는 아미노산 링커가 바람직하다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 링커는 아미노산으로 구성되며, 바람직하게 링커는 최대 25, 더욱 바람직하게 최대 20, 더더욱 바람직하게 최대 15 아미노산으로 구성된다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 아미노산 링커는 10 아미노산 이하를 함유한다. 링커의 바람직한 구체예는: (a) CGG 또는 CG/GC; (b) N-말단 감마 1-링커 (예를 들면, CGDKTHTSPP, 서열 번호 44); (c) N-말단 감마 3-링커 (예를 들면, CGGPKPSTPPGSSGGAP, 서열 번호: 55); (d) Ig 힌지 영역; (e) N-말단 글리신 링커 (예를 들면, GCGGGG, 서열 번호 45); (f) n=0-12 및 k=0-5인 (G)kC(G)n; (g) 하나의 시스테인을 더 포함하며, n=l-3인 N-말단 글리신-세린 링커((GGGGS)n(예를 들면, n=1인 구체예에 상응하는 서열 번호 46); (h) n=0-3, k=0-5, m=0-10, l=0-2인 (G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n(예를 들면, n=l, k=l, l=1 및 m=l인 구체예에 상응하는 서열 번호 47); (i) GGC; (k) GGC-NH2; (1) C-말단 감마 1-링커 (예를 들면, DKTHTSPPCG, 서열 번호 48); (m) C-말단 감마 3-링커 (예를 들면, PKPSTPPGSSGGAPGGCG, 서열 번호 49); (n) C-말단 글리신 링커 (GGGGCG, 서열 번호 50); (o) n=0-12 및 k=0-5인 (G)nC(G)k; (p) C-말단 글리신-세린 링커 (하나의 시스테인을 포함하며, n=1-3인 (SGGGG)n (예를 들면, n=1인 구체예에 상응하는 서열 번호 51)); (q) n=0-3, k=0-5, m=0-10, l=0-2, 및 o=0-8인 (G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k (예를 들면, n=l, k=l, l=1, o=l 및 m=l인 구체예에 상응하는 서열 번호 52)로 이루어진 군에서 선택된다. 다른 바람직한 구체예에서, 링커는 본 발명의 IL-15 N-말단에 부가된다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 링커는 본 발명의 IL-15 C-말단에 부가된다.

본 발명에 따른 바람직한 링커는 글리신 링커 (G)n이며, N-말단 글리신 링커(GCGGGG) 및 C-말단 글리신 링커(GGGGCG)와 같이 제2부착 부위로서, 시스테인 잔기를 함유한다. 더욱 바람직한 구체예는 C-말단 글리신-라이신 링커(GGKKGC, 서열 번호 53) 및 N-말단 글리신-라이신 링커(CGKKGG, 서열 번호 54), GGCG a GGC, 또는 펩티드의 C-말단에서 GGC-NH2("NH2"는 아미드화를 상징) 링커 또는 그것의 N-말단에서 CGG이다. 일반적으로 글리신 잔기는 커플링 반응에서 더 큰 아미노산의 잠재적인 입체 장애를 피하기 위하여, 부피가 큰 아미노산들과 제2부착 부위로 이용되는 시스테인 사이에 삽입될 것이다.

상기에 나타낸 바람직한 방법에 따라 이형-양기능성 교차-링커를 이용한 본 발명의 IL-15와 VLP의 링크는, 본 발명의 IL-15와 VLP의 커플링을 지향성 방식으로 허용한다. VLP에 본 발명의 IL-15를 링크시키는 다른 방법은 카보디이미드 EDC 및 NHS를 이용하여 VLP에 본 발명의 IL-15를 교차-링크시키는 방법을 포함한다. 본 발명의 IL-15는 또한, 예를 들면, SATA, SATP 또는 이미노티오란을 이용한 반응을 통하여 첫번째 티올화된다. 필요하다면, 해제(deprotection) 후에 본 발명의 IL-15는 다음과 같이, VLP에 커플링될 수 있다. 과도한 티올화 시약의 분리 후에, 본 발명의 IL-15는 VLP와 반응되며, 그에 앞서 시스테인 반응성 일부를 포함하며, 게다가 상기에서 기술한 바와 같이 본 발명의 티올화된 IL-15가 반응할 수 있는 시스테인 잔기에 대하여 반응성 있는 적어도 하나 또는 몇몇 기능성기들을 나타내어, 이형-양기능성 교차-링커와 함께 활성화된다. 다른 방법들에서, 본 발명의 IL-15는 호모-양기능성 교차-결합, 즉, 글루타르알데히드, DSG, BM[PEO]4, BS3, (Pierce) 또는 VLP의 아민기 또는 카르복실기에 반응성 있는 기능성 군을 갖고 있는 다른 알려진 호모-양기능성 교차-링커에 의하여 VLP에 부착된다.

본 발명의 다른 구체예에서, 조성물은 상호작용 중 적어도 하나는 공유 결합이 아닌 화학적 상호작용을 통하여 본 발명의 IL-15에 링크된 바이러스-유사 입자를 포함하거나, 대체적이며 필수적으로 구성된다. 예를 들어, 본 발명의 IL-15와 VLP의 링크는 VLP의 바이오티닐레이션(biotinylating) 및 스트렙트아비딘-융합 단백질로서, 본 발명의 IL-15 발현에 의하여 영향을 받을 수 있다. 리간드-수용체, 항원-항체와 같은 다른 결합 쌍은 또한, 비오틴-아비딘과 유사한 방식의 커플링 시약으로써 사용된다.

US 5,698,424은 캡시드를 형성할 능력을 갖는 박테리오파지 MS-2의 변형된 코트 단백질을 개시하며, 여기서, 코트 단백질은 N-말단 헤어핀 영역에 시스테인 잔기의 삽입 및, N-말단 헤어핀 영역의 외부에 위치한 시스테인 잔기 각각은 비-시스테인 아미노산 잔기에 의하여 치환에 의하여 변형된다. 삽입된 시스테인은 그다음, 에피토프 또는 항원성 단백질과 같이 나타낸 원하는 분자 종들에 직접적으로 링크될 수 있다.

본 발명자들은 그러나 캡시드에서 노출된 자유로운 시스테인 잔기의 존재는 이황화 가교 형성에 의하여 캡시드의 올리고중합화를 일으킬 수 있다는 사실을 알고 있다. 더욱이, 이황화 결합 방법에 의한 캡시드와 항원성 단백질들 사이의 부착은 특히 설프히드릴-일부 함유 분자들에 대하여, 유연성 있으며, (Martin FJ. and Papahadjopoulos D.(1982) Irreversible Coupling of Immunoglobulin Fragments to Preformed Vesicles. J. Biol. Chem. 257: 286-288) 이는 특히 혈청에서, 예를 들어, 티오에테르 부착보다 덜 안정적이다.

게다가, 다른 매우 바람직한 구체예에서, VLP와 적어도 하나의 항원의 링크는 이황화 결합을 포함하지 않는다. 여기서, 더욱 바람직하게 적어도 하나의 제2부착 부위는 설프히드릴기이거나, 이를 포함한다. 더욱이, 다시 본 발명의 매우 바람직한 구체예에서, VLP와 적어도 하나의 항원의 링크는 황-황 결합을 포함하지 않는다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 적어도 하나의 제1부착 부위는 시스테인의 설프히드릴기가 아니거나, 이를 포함하지 않는다. 다시 매우 바람직한 다른 구체예에서, 상기 적어도 하나의 제1부착 부위는 설프히드릴기가 아니거나, 이를 포함하지 않는다.

본 발명의 바람직한 일구체예에서, VLP는 숙주에서 재조합적으로 제조되며, 여기서 VLP에는 필수적으로 숙주 RNA, 바람직하게는 숙주 핵산이 없거나, 여기서, VLP는 필수적으로 핵산 DNA, 바람직하게는 숙주 핵산이 없다. 바람직한 일구체예에서, RNA 파지의 VLP는 필수적으로 숙주 RNA, 바람직하게는 숙주 핵산이 없다.

바람직한 일구체예에서, 조성물은 또한 VLP에 결합하거나, 바람직하게는 내부에 패킹되거나, 둘러싸이는 적어도 하나의 다중음이온 거대분자를 포함한다. 바람직한 다른 구체예에서, 다중음이온 거대분자는 폴리글루탐산 및/또는 폴리아스파르트산이다. 바람직한 일구체예에서, VLP는 RNA 파지의 것이다. 숙주 RNA, 바람직하게는 숙주 핵산의 양을 줄이거나 제거하는 것은 IL-15에 대하여 특이적으로 강한 항체 반응을 유지하는 동안, 원하지 않는 T 세포 반응, 이를 테면 염증성 T 세포 반응 및 세포독성 T 세포 반응 및 발열과 같은 원하지 않는 부작용을 최소화하거나 줄이는 것이다.

필수적으로 숙주 RNA(또는 DNA), 바람직하게 숙주 핵산이 없는: 여기서 사용된 용어 "필수적으로 숙주 RNA(또는 DNA), 바람직하게 숙주 핵산이 없는"은 VLP ㎎당 전형적이며 바람직하게 30㎍ 미만, 보다 바람직하게 20㎍ 미만, 더욱 바람직하게 10㎍ 미만, 더더욱 바람직하게 8㎍ 미만, 더욱 바람직하게 6㎍ 미만, 더욱 바람직하게 4㎍ 미만, 가장 바람직하게 2㎍ 미만으로, VLP에 포함된 숙주 RNA(또는 DNA), 바람직하게 숙주 핵산의 양을 언급한다. 상기-언급된 내용에서 사용된 바, 숙주는 그 안에서 VLP가 재조합적으로 제조되는 숙주를 언급한다. RNA(또는 DNA), 바람직하게는 핵산의 양을 결정하는 간편한 방법은 본 분야의 숙련자에게 알려져 있다. 본 발명에 따라 RNA, 바람직하게는 핵산들의 양을 결정하는 전형적이며 바람직한 방법은 본 출원인에 의하여 2005년 10월 5일에 출원된 PCT/EP2005/055009의 실시예 17에 개시되어 있다. 동일하거나, 유사하거나, 비슷한 환경은 전형적이며 바람직하게 Qβ를 제외한 VLP를 포함하는 본 발명의 조성물을 위하여, RNA, 바람직하게는 핵산의 양의 결정에 이용된다. 필요한 환경의 변형은 본 분야 숙련자의 지식 내에서 이루어질 수 있다.

본 발명에서 사용된, 용어 "다중음이온 거대분자"는 반복적인 음전하를 갖는 군을 포함하며, 비교적 높은 분자량을 갖는 분자를 언급하며, 이의 구조는 실제로 또는 개념적으로 비교적 낮은 분자량의 분자에서 유래된 다중 반복된 유니트를 필수적으로 포함한다.

일면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 백신을 제공한다. 바람직한 일구체예에서, 백신 조성물에서 VLP에 링크되는 본 발명의 IL-15는 동물, 바람직하게는 포유동물 또는 인간 기원이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명의 IL-15는 인간, 소, 개, 고양이, 마우스, 랫, 돼지 또는 말 기원이다.

바람직한 일구체예에서, 백신 조성물은 적어도 하나의 어쥬번트를 포함한다. 적어도 하나의 어쥬번트의 투여는 여기에서, 본 발명의 조성물의 투여 전, 동시 또는 이후에, 발생할 수 있다. 여기서 사용된 용어 "어쥬번트"는 면역 반응의 비-특이적 자극제 또는 백신 및 본 발명의 약제학적 조성물과 각각 결합할 때, 보다 증가된 면역 반응을 제공할 수 있도록 숙주 내에서 데포(depot)의 형성을 허용하는 물질을 언급한다.

또다른 바람직한 구체예에서, 백신 조성물은 어쥬번트를 배제한다. 본 발명의 장점은 심지어 어쥬번트의 부재하에서도, 조성물의 높은 면역생성력에 있다. 게다가, 어쥬번트의 부재는 원하지 않는 염증 T-세포 반응의 출현을 최소화하여, 자기 항원에 대한 백신화에 안정성을 나타내도록 할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 백신은 바람직하게 환자에게 백신의 투여 전에, 동시에 또는 투여 후에 적어도 하나의 어쥬번트를 투여하는 것 없이 투여할 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 백신을 동물 또는 인간에 투여하는 것을 포함하는 면역화 방법을 개시한다. 동물은 바람직하게, 포유동물, 즉 고양이, 양, 돼지, 말, 소, 개, 랫, 마우스 및 특히 인간이다. 백신은 종래에 알려진 다양한 방법에 의하여 인간 또는 동물에 투여될 수 있으나, 일반적으로 주사, 주입, 흡입, 경구투여 또는 다른 적합한 물리적 수단에 의해 정상적으로 투여될 수 있다. 택일적으로, 컨쥬게이트는 근육내, 정맥내, 점막관통, 경피내, 경비적, 복강내, 또는 피하를 통해 투여될 수 있다. 투여용 컨쥬게이트 조성물의 성분은 무균의 수성 (예를 들어, 생리 식염수) 또는 비수성 용액 및 서스펜션을 포함한다. 비수성 용매의 예시는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르이다. 담체 또는 밀봉드레싱 (occlusive dressing)은 피부 투과성을 증가시키고, 항원 흡수를 증진시키는데 사용될 수 있다.

본 발명의 백신은 그들의 투여가 수용하는 개체에 의하여 수용가능하다면, "약제학적으로 허용가능"하다고 일컬어진다. 더욱이, 본 발명의 백신은 "치료상 유효량"(예를 들면, 바람직한 물리적 영향을 생산하는 양)으로 투여될 것이다. 면역 반응의 본성 또는 타입은 본 개시물에서 한정된 요소가 아니다. 다음의 반응적 설명에 의하여 발명을 한정하려는 의도없이, 본 발명의 백신은 본 발명의 IL-15에 결합하는 항체를 유도할 것이며, 이는 그것의 농도를 감소시키고/거나 그것의 물리적 또는 경로적 기능을 방해한다.

일 면에서, 본 발명은 본 발명에서 나타낸 조성물을 포함하는 약제학적 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 제공한다. 본 발명의 백신이 개체에 투여될 때, 그것은 염, 완충액, 어쥬번트, 또는 컨쥬게이트의 효율을 향상시키는 데 바람직한 다른 물질을 함유하는 형태일 수 있다. 약제학적 조성물의 준비에 이용되는 적합한 물질의 예는 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990))를 포함한 다양한 소스에서 제공된다.

본 발명은 본 발명의 조성물을 제조하는 과정을 나타내며, 이는: 적어도 하나의 제1부착 부위를 갖는 VLP를 제공하는 단계; (b) 적어도 하나의 제2부착 부위를 갖는 본 발명의 IL-15 단백질을 제공하는 단계; 및 (c) 조성물을 제조하기 위하여, 제1 및 제2부착 부위의 링크를 통하여 상기 VLP와 상기 IL-15가 결합하는 단계를 포함한다.

더욱 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 제1부착 부위를 갖는 VLP를 제공하는 단계는 다음 단계들을 포함한다: (a) 상기 RNA-박테리오파지의 상기 코트 단백질, 돌연변이 또는 이의 단편과, 상기 바이러스-유사 입자를 디스어셈블시키는 단계; (b) 상기 코트 단백질, 돌연변이 또는 이의 단편을 정제시키는 단계; (c) 상기 RNA-박테리오파지의 정제된 코트 단백질, 돌연변이 또는 이의 단편과 바이러스-유사 입자를 리어셈블시키는 단계(여기서, 바이러스-유사 입자는 필수적으로 숙주 RNA, 바람직하게는 숙주 핵산이 없다). 다른 바람직한 구체예에서, 상기 정제된 코트 단백질의 리어셈블링은 적어도 하나의 다중음이온 거대분자의 존재에 영향을 받는다.

본 발명은 인간 또는 동물에서 IL-15가 중요한 경로적 기능에 관여하는 질환 또는 증상의 예방, 치료 및/또는 약화를 위한 방법을 제공하며, 여기서, 상기 방법은 상기 질환 또는 상기 증상으로부터 고통받는 동물 또는 인간에 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, IL-15가 중요한 경로적 기능에 관여하는 상기 질환 또는 증상은 죽상동맥경화증, 천식, 이식 거부, 예를 들어, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 소아 특발성 관절염, 건선이나 이에 한정되지 않는 염증 및/또는 만성 자기면역 질환으로 이루어진 군에서 선택된다. 대신하여, 본 발명은 동물 또는 바람직하게는 인간에서 죽상동맥경화증, 천식, 이식 거부 및 염증 및/또는 만성 자기면역 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 조성물을 제공한다.

일면에서, 본 발명은 인간 또는 동물에 적어도 하나의 IL-15 길항제를 투여하는 것을 포함하여, 동물 또는 인간에서 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 질환은 죽상동맥경화증 및 천식으로 이루어진 군에서 선택된다. 대신하여, 본 발명은 죽상동맥경화증 및 천식으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 적어도 하나의 IL-15 길항제의 용도를 제공한다.

IL-15 길항제는 (ⅰ) 혈중 IL-15 농도를 낮추고, (ⅱ) IL-15 수용체 복합체에 IL-15가 결합하는 것을 방해하며, 바람직하게는 IL-15 수용체 복합체의 α서브유닛에 IL-15가 결합하는 것을 방해하거나, (ⅲ) IL-15가 IL-15 수용체 복합체의 β 또는 γ 서브유닛을 통하여 세포에 신호를 전달하는 것을 방해하고, 게다가 IL-15 생물학적 활성을 길항시키는 것과 같으나, 이에 한정되지 않는 다양한 수단으로 IL-15 기능을 저지한다. 전형적이며 바람직하게, IL-15가 IL-15 수용체 복합체, 바람직하게는 α서브유닛에 결합하는 것은 예를 들어, J. Biol Chem. 2004 Jun 4;279(23):24313-22에 개시된 대로, 실험상 결합 분석에 의하여 조사할 수 있다. 전형적이며 바람직하게, IL-15 기능, 전형적이고 바람직하게 T-세포 증식의 자극을 위한 그것의 기능은 예를 들어, EP 0772624의 실시예 2에 개시된 바와 같은, 실험상 분석에 의하여 조사될 수 있다.

바람직한 일구체예에서, IL-15 길항제는 IL-15에 특이적으로 결합하는 항체이다. IL-15에 항체의 결합은 형성된 항원-항체 복합체를 제거시키고, 혈중 IL-15 농도를 감소시킬 수 있다. 더욱이, IL-15에 항체의 결합은 그것의 수용체에 IL-15의 결합을 막을 수 있고, 이에 따라, IL-15가 그것의 수용체를 통하여 그것의 활성을 가하는 것을 막을 수 있다. 덧붙여, IL-15에 항체의 결합은 그것의 수용체에 IL-15가 결합하는 것을 막을 수 없으나, 항체의 존재는 IL-15 수용체 복합체의 β 또는 γ 서브유닛에 의하여 매개되는 신호 전달을 막을 수 있다.

IL-15 항체는 다클론성 또는 단일클론성일 수 있으며, 마우스, 랫, 토끼, 또는 인간과 같은 다른 동물 종의 면역화에 의하여 생성될 수 있다. 이용된 기술에 의존하여 단일클론성 항체는 뮤린, 키메라, CDR-이식, 인간화, 인간 또는 합성된 항체일 수 있다. 이에 따라, 용어 "단일클론성 항체"는 동형의 항체 집단을 갖는 항체 조성물을 의미한다. 이는 그것이 만들어진 항원의 소스 또는 제조 방식에 관하여 한정하는 것을 의도하지 않는다. 바람직한 일구체예에서, 상기 IL-15 길항제는 상기 항체의 기능성 단편이거나, 이를 포함한다. IL-15에 특이적으로 결합하는 단일클론성 항체는 본 분야에서 유효하다.

바람직한 일구체예에서, 상기 IL-15 길항제는 10⁷M^{- 1}이상, 바람직하게는 10⁸M^-1이상, 더욱 바람직하게는 10⁹M^{- 1}이상의 결합 친화도(Ka)를 갖는 단일클론성 항체이다.

바람직한 일구체예에서, 상기 IL-15 길항제는 WO03/017935의 실시예 8에 개시된 대로 전형적이며 바람직하게 수행될 수 있는 증식 저해 분석에 의하여 결정되는 바, 100nM 미만, 바람직하게는 10nM 미만의 IC50 수치를 갖는 IL-15 유도된 T-세포 증식을 저해하는 단일클론성 항체이다.

바람직한 일구체예에서, 상기 IL-15 길항제는 J Clin Invest 2003, 112, 1571, in Arthritis & Rheumatism. 2005, 52, 2686 및 WO 03/017935에 개시된 대로, 단일클론성 항체 HuMax-IL-15 (146B7, AMG714라고도 명명) 또는 이의 단편이다.

바람직한 일구체예에서, 상기 IL-15 길항제는: (i) ATCC 수탁 번호 M110; (ii) ATCC 수탁 번호 M111; (iii) ATCC 수탁 번호 M112, ((i)-(iii)는 WO 9626274를 참고로 할 수 있음); 및 (iv) 146H5 ((iv)는 WO03/017935를 참고로 할 수 있음) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 하이브리도마로부터 얻는 단일클론 항체이다.

바람직한 일구체예에서, 상기 IL-15 길항제는 IL-15에 특이적으로 결합하는 항원이며, 여기서, 바람직하게 상기 항원은 본 발명의 조성물에 대한 반응으로 제조된다. 바람직하게, 상기 항원은 본 발명의 조성물 또는 백신을 받은, 바람직하게는 본 발명의 면역화 방법에 따라 동물 또는 인간의 신체 내에서 생성된다. 바람직한 일구체예에서, 항체는 본 발명의 조성물의 면역화 마우스에 의하여 생성된 단일클론 항체이다. 바람직하게, 그렇게 생성된 항체는 최신의 유효한 기술을 이용하여, 인간에 이용하기 위하여, 더욱 변형되거나 엔지니어링될 것이다.

바람직한 일구체예에서, 상기 IL-15 길항제는 IL-15 수용성 수용체, 또는 이의 단편이거나, 이를 포함한다. 바람직한 일구체예에서, 상기 IL-15 길항제는 IL-15 수용성 수용체 α서브유닛 또는 이의 단편이거나, 이를 포함한다. 바람직한 일구체예에서, 상기 IL-15 길항제는 IL-15 수용체 α서브유닛 또는 이의 단편의 세포외 부위이거나, 이를 포함한다. 바람직한 다른 일구체예에서, 상기 IL-15 길항제는 서열 번호 41에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열 번호 41에 적어도 80%, 바람직하게 85%, 더욱 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 95%, 더욱 바람직하게 97%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된다.

바람직한 일구체예에서, 상기 IL-15 길항제는 IL-15 뮤테인이거나, 이를 포함한다. 바람직한 다른 일구체예에서, 상기 IL-15 뮤테인은 IL-15 수용체 α서브유닛에 여전히 결합할 수 있고, IL-15가 β 또는 γ서브유닛을 통하여 세포에 신호를 전달하는 것을 막는다. 바람직한 일구체예에서, 상기 IL-15 뮤테인은 서열 번호 23에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되며, 여기서, 서열 번호 23의 Asp8, Gln101 및 Gln108 중 적어도 하나의 위치, 바람직하게는 두개, 더욱 바람직하게는 셋 모두가 돌연변이, 바람직하게는 치환, 바람직하게는 비-보존성 치환된다. 바람직한 일구체예에서, 상기 IL-15 뮤테인은 서열 번호 23에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되며, 여기서, Gln101 및 Gln108 중 적어도 하나 또는 둘다가 결실되거나, 바람직하게는 치환된다. 바람직한 다른 일구체예에서, 상기 IL-15 뮤테인은 서열 번호 42에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성된다.

바람직한 일구체예에서, 상기 IL-15 뮤테인은 서열 번호 23에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되며, 여기서, Asp8 및 Gln108 중 적어도 하나, 바람직하게 둘다는 결실되거나, 바람직하게는 자연적으로 발생한 다른 아미노산 잔기로, 더욱 바람직하게는 세린 또는 시스테인으로, 바람직하게 치환된다. 대신하는 바람직한 구체예에서, Gln108은 Asp로 치환된다. 대신하는 바람직한 일구체예에서, Asp8은 Arg 또는 Lys으로 치환된다.

바람직한 일구체예에서, 상기 IL-15 뮤테인은 서열 번호 23에 적어도 80%, 바람직하게 적어도 85%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 또는 가장 바람직하게 적어도 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하거나, 이로 구성되며, 여기서, 서열 번호 23의 Asp8, Gln101, 및 Gln108 중 적어도 하나의 위치, 바람직하게는 두개, 더욱 바람직하게는 셋 모두의 위치가 돌연변이, 바람직하게는 치환, 바람직하게는 비-보존성 치환된다. 바람직한 일구체예에서, 상기 IL-15 뮤테인은 서열 번호 42에 대하여 적어도 80%, 바람직하게 적어도 85%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 또는 가장 바람직하게 적어도 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되며, 여기서, 서열 번호 42의 101 및 108에 상응하는 위치는 Asp로 남아있다.

[ 실시예 ]

본 실시예 부분 내에서 이용된 바, Qβ VLP, AP205 VLP 등은 E. coli로부터 재조합적 발현에 의하여 얻고, 그 다음, WO 02/056905, WO 04/007538에 개시된 대로, 정제에 의하여 얻은 VLP를 언급한다.

실시예 1. pM-IL-15-FL-CG의 컨스트럭트 제조

플라스미드 pModEC1 (WO 03/040164 A2)의 BamHI 부위부터 PmeI 부위까지의 서열의 본래의 것을 어닐링된 올리고 B-FL-L-P R (서열 번호 34) 및 B-FL-C-P F (서열 번호 35)로 교체함으로써,

(서열 번호 43)으로 변화시켰다. 만들어진 컨스트럭트를 pMod-FL-CG로 명명하였으며, 이는 그것의 다중 클로닝 부위에 Nde I, BamH I, NheI, XhoI, PmeI 및 NotI 제한 부위를 갖는다.

다음 프라이머를 이용하여 PCR함으로써, 활성화된 수지상 세포의 cDNA 라이브러리로부터 마우스 IL-15를 증폭시켰다: IL-15-F (서열 번호 36) 및 IL-15-Xho-R (서열 번호 37). IL-15-F는 내부의 NdeI 부위를 가지며, IL-15-XhoI는 내부의 XhoI 부위를 갖는다. PCR 산물을 NdeI , XhoI로 소화시키고, 동일한 효소로 소화시킨 pMod-FL-CG에 라이게이션시켰다. 만들어진 플라스미드를 pM-IL-15-FC-CG로 명명하였으며, 이는 마우스 IL-15, 플래그 태그 및 C-말단(서열 번호 30)에 시스테인을 함유하는 링커를 포함하는 융합 단백질을 암호화한다.

실시예 2. pM-IL-15-FL-CG의 발현

컴피턴트 E. coli BL21 (DE3) 세포를 플라스미드 pM-IL-15-FL-CG로 형질전환시켰다. 앰피실린(Amp)-함유된 한천(agar) 플레이트로부터 단일 콜로니를 액상 배양(150 mM MOPS, pH 7.0, 100㎍/ml Amp의 SB)으로 증량시키고, 30℃에서 220 rpm쉐이킹하면서, 오버나이트 인큐베이션시켰다. 그 다음, 오버나이트 배양액을 같은 배지에 1:50으로 희석시키고, 30℃에서 OD₆₀₀=2.8이 될 때까지 배양하였다. 발현은 1mM의 IPTG로 유도시켰다. 4시간의 유도 후, 6000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하였다. 세포 펠렛을 0.8 mg/ml 라이소자임이 있는 용해 완충액(10mM Na₂HPO₄, 30 mM NaCl, 10 mM EDTA 및 0.25% Tween-20)에 현탁시키고, 음파처리(sonicated)하고, 벤조나제를 처리하였다. 48000 RCF에서 20분간 원심분리 한 다음, 상층액을 12% PAGE 겔로 분석하고, 항-마우스 IL-15(R&D system)를 이용한 웨스턴 블롯으로, 마우스 IL-15 발현을 확인하였으며, 이는 예상된 분자량인 14.9kD에서 실행된 IL-15-FL-CG의 발현을 명확하게 나타낸다.

실시예 3. IL-15-FL-CG의 정제

IL-15-FL-CG를 항-FLAG M2 컬럼을 통하여, 첫번째 정제하였다. 간단하게, IL-15-FL-CG 용해물을 항-FLAG M2 컬럼에 로드하였다. 결합되지 않는 오염물들을 TBS (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4)로 씻어냈다. 그 다음, IL-15-FL-CG를 FLAG 펩티드(100㎍/㎖)와 함께 컬럼으로부터 용리하였다. 그 다음 용리물을 Q Fast Flow column으로 정제하였다.

실시예 4. 인간 IL-15 단백질, IL-15 뮤테인 및 IL-15 단편의 제조

인간 IL-15(서열 번호 23)를 실질적으로 실시예 1에 개시된 바와 동일한 프로토콜을 이용한 PCR을 이용하여, 활성화된 수지상 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시키고, PCR 산물을 pMod-FL-CG에 라이게이션시켰다. 만들어진 플라스미드를 pH-IL-15-FC-CG로 명명하였으며, 이는 인간 IL-15, 플래그 태그 및 C-말단에 시스테인을 함유하는 링커를 포함하는 융합 단백질을 암호화한다.

실질적으로 실시예 1에 개시된 바와 같은 프로토콜을, 인간 IL-15 뮤테인(서열 번호 31, 32, 또는 33)을 발현하는 플라스미드를 제조하기 위하여 이용하였다. 실시예 2 및 3에 개시된 바와 실질적으로 동일한 프로토콜을 적용하여, 인간 IL-15 단백질, 인간 IL-15 뮤테인을 발현 및 정제시켰다.

표준 프로토콜을 따라, 다양한 IL-15 단편(서열 번호 34-40)을 화합적으로 합성하였다. 추가적인 시스테인을 IL-15 단편 각각의 서열의 N-말단에 융합시켰다.

실시예 5. 다른 다중 음이온 고분자의 존재하에서 디스어셈블리 / 리어셈블리에 의한 리어셈블된 Qβ VLPs 이 되는 본 발명의 Qβ VLPs 의 준비

(A) Qβ VLP의 디스어셈블리

E.coli 용해물로부터 정제된 PBS (20mM Phosphate, 150mM NaCl, pH7,5)에서 Qβ VLP 45mg (2.5mg/ml, Bradford analysis에 의해 결정된)은 섞어주면서 실온에서 15분 동안 10mM DTT로 환원되었다. 그 후 최종 농도가 0.7M이 되도록 염화마그네슘을 첨가하고, 섞어주면서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였으며, 이것은 캡슐에 쌓인 숙주 세포 RNA의 침전을 유도한다. 용액으로부터 침전된 RNA를 제거하기 위하여 4℃, 4000rpm으로 10분 동안 원심분리하였다 (이후 단계에서 사용된 고정된 앵글 로터 A-4-62에서 에펜도르프 5810 R). 방출된, 이량체의 Qβ VLP를 함유하는 상층액을 크로마토그래피 정제 단계에 이용하였다.

(B) 양이온 교환 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의한 Qβ 코트 단백질의 정제

이량적 코트 단백질, 숙주 세포 단백질 및 잔여 숙주 세포 RNA를 포함하는 디스어셈블리 반응의 상층액을 전도율 10mS/cm 이하로 맞추기 위하여 물에서 1:15로 희석하고, SP-세파로즈 FF 컬럼 (xk16/20, 6ml, Amersham Biosience)에 로딩하였다. 컬럼을 20mM 인산나트륨 완충액 pH 7로 미리 평형화시켰다. 결합 코트 단백질의 용리는 20mM 인산나트륨/500mM 염화나트륨 단계(step) 구배로 달성되었으며 단백질은 대략 25ml의 부피의 단편으로 수집하였다. 크로마토그래피는 5ml/min의 유량으로 실온에서 이루어졌으며, 흡광은 260nm 및 280nm에서 측정하였다.

두 번째 단계에서, 분리된 Qβ 코트 단백질 (양이온 교환 컬럼으로부터 용리된 단편)을 20mM 인산나트륨/250mM 염화나트륨로 pH 6.5로 평형화된 세파아크릴 S-100 HR 컬럼 (xk26/60, 320ml, Amersham Biosience)에 로딩하였다. 크로마토그래피는 5ml/min의 유량으로 실온에서 실행하였며, 흡광은 260nm 및 280nm에서 측정하였다. 5ml의 단편을 수집하였다.

(C1) 투과에 의한 Qβ VLP의 리어셈블리

정제된 Qβ 코트 단백질 (2.2mg/ml in 20mM 인산 나트륨 pH 6.5), 다중 음이온 고분자 (물에서 2mg/ml), 우레아 (물에서 7.2 M), 및 DTT (물에서 0.5 M)를 코트 단백질의 최종 농도가 1.4mg/ml, 각 다중 음이온 고분자의 최종 농도가 0.14mg/ml, 1M 우레아, 2.5mM DTT가 되도록 혼합하였다. 혼합물 (각 1ml)을 3.5kDa 컷 오프의 막을 이용하여 20mM Tris HCl, 150mM NaCl pH 8로 5℃에서 이틀 동안 투과하였다. 다중 음이온 고분자는: 폴리갈락투론산 (25000-50000, Fluka), 덱스트란 설페이트 (MW 5000 및 10000, 시그마), 폴리-L-아스파틱산 (MW 11000 및 33400, 시그마), 폴리-L-글루타믹산 (MW 3000, 13600 및 84600, 시그마) 및 빵효모 및 맥아로부터 tRNAs이다.

(C2) 투석여과에 의한 Qβ VLP의 리어셈블리

정제된 Qβ 코트 단백질 33ml (20mM 인산 나트륨 pH6.5, 250mM NaCl에 1.5㎎/㎖)을 물 및 우레아 (물에서 7.2M), NaCl (물에서 5M) 및 폴리-L-글루타믹산 (물에서 2mg/ml, MW:84600)와 혼합하였다. 혼합물의 부피를 50ml으로 하고, 구성성분의 최종 농도를 코트 단백질 1mg/ml, 300mM NaCl, 1.0M 우레아 및 0.2mg/ml 폴리-L-글루타믹산으로 하였다. 그 후 혼합물을 실온에서 펠리콘 XL 막 카트리지를 이용하는 탄젠셜 플로우 여과 장치 (Biomax 5K. Millipore)에서, 횡류량을 10ml/min, 투과 수량을 2.5ml/min으로 하여 20mM TrisHCl pH 8, 50mM NaCl 500ml에 대하여 투석여과하였다.

실시예 6. AP205 VLPs 의 시험관 내 어셈블리

(A) AP205 코트 단백질의 정제

디스어셈블리(disassembly): 20 ml의 AP205 VLP 용액(PBS 중 1.6 mg/ml, E. coli 추출물로부터 정제)을 0.2 ml의 0.5 M DTT와 혼합하고 실온에서 30 분간 배양하였다. 5 ml의 5 M NaCl을 첨가한 다음 혼합물을 60℃에서 15 분간 배양하여, DTT-환원(reduced) 코트 단백질을 침전시켰다. 혼탁한 혼합물을 원심분리하고(rotor Sorvall SS34, 10000 g, 10 분, 20℃) 상층액을 버리고 펠렛을 20ml의 1 M 우레아/20 mM Na 시트레이트 pH 3.2에 분산시켰다. 실온에서 30 분간 교반한 후, 분산액에 1.5 M Na₂HPO₄를 첨가하여 pH 6.5로 조정한 다음 원심분리하여(rotor Sorvall SS34, 10000 g, 10 분, 20℃) 이량체 코트 단백질을 함유한 상층액을 수득하였다.

양이온 교환 크로마토그래피: 상층액(상기 참조)을 20 ml의 물로 희석하여 약 5 mS/cm의 전도율로 조정하였다. 생성된 용액을 미리 20 mM 인산 나트륨 pH 6.5 완충액과 평형화한 6 ml SP Separose FF의 칼럼(Amersham Bioscience) 상에 적재하였다. 적재 후, 칼럼을 48 ml의 20 mM 소듐 포스페이트 pH 6.5 완충액으로 세척하고 이어서 20 칼럼 부피 이상에서 1 M NaCl까지 선형 기울기에 의해 결합된 코트 단백질을 용리하였다. 주요 피크의 분획을 모아 SDS-PAGE 및 UV 분광법으로 분석하였다. SDS-PAGE에 의하면, 분리된 코트 단백질은 다른 단백질 오염물로부터 실재로 순수하였다. UV 분광법에 의하면, 1 A280 유닛이 1.01 mg/ml의 AP205 코트 단백질을 반영한다는 것을 감안하여, 0.6 mg/ml(총량 12 mg)이었다. 또한, A26의 값(0.291)에 비해 A280의 값(0.5999)은 2이며, 제제가 실질적으로 핵산이 없다는 것을 나타낸다.

(B) AP205 VLPs의 어셈블리

다중 음이온 거대분자의 부재하 어셈블리: 상기로부터 용리된 단백질 분획을 투석여과하고 TFF에 의해 20 mM 인산 나트륨 pH 6.5 중 1 mg/ml의 단백질 농도로 농축하였다. 이 용액 500 ㎕를 50 ㎕의 5 M NaCl 용액과 혼합하고 실온에서 48 시간 동안 배양하였다. 혼합물에서 리어셈블된 VLP의 형성은 비환원(non-reducing) SDS-PAGE에 의해 확인하고 크기 배제 HPLC에 의해 확인하였다. 20 mM 인산 나트륨, 150 mM NaCl pH 7.2와 평형시킨, TSKgel G5000 PWXL 칼럼(Tosoh Bioscience)를 HPLC 분석에 사용하였다.

폴리글루탐산의 존재하에 어셈블리: 375 ㎕의 정제된 AP205 코트 단백질(20 mM 소듐 포스페이트 pH 6.5 중 1 mg/ml)을 50 ㎕의 NaCl 스톡 용액(물에서 5 M), 50 ㎕의 폴리글루탐산 스톡 용액(물에서 2 mg/ml, MW: 86400, Sigma) 및 25 ㎕의 물과 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 48 시간 배양하였다. 혼합물에서 리어셈블된 VLP의 형성은 비환원 SDS-PAGE에 의해 확인하고 크기 배제 HPLC에 의해 확인하였다. 혼합물 중 코트 단백질은 VLP로 거의 완전히 일체화되었고, 어느 다중 음이온 거대분자의 부재하에 어셈블된 AP205 코트 단백질보다 더 높은 어셈블리 효율을 나타냈다.

실시예 7. Qβ VLP 및 리어셈블된 Qβ VLP 에 IL-15-FL-CG의 커플링

실시예 3으로부터 수득한 정제된 마우스 IL-15-FL-CG (153μM)를 TBS pH 7.4에서 등몰의 TCEP로 1시간 동안 환원시켰다. 환원된 IL-15-FL-CG (83μM)를 전체 부피 50㎕에서 SMPH로 유래된 59μM Qβ와 함께 실온에서 오버나이트 인큐베이션시켰다. 커플링 반응은 SDS-PAGE 및 항-FLAG 항체와 함께 웨스턴-블롯으로 분석하였다. 단백질 농도를 브래드포트를 이용하여 측정하였다. 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE의 농도계적 분석에 의하여 커플링 효율을 측정하였다.

실질적으로 동일한 실험적 환경을 인간 IL-15-FL-CG(실시예 4로부터 수득) 를 실시예 6으로부터 수득한 리어셈블된 AP205 VLP, 또는 실시예 5로부터 수득한 리어셈블된 Qβ VLP에 커플링하는 데 적용하였다.

실시예 8. Qβ VLP 및 리어셈블된 Qβ VLP 에 인간 IL-15 뮤테인 의커플링

실시예 4로부터 수득한 정제된 인간 IL-15-뮤테인 (153μM)을 TBS pH 7.4에서 등몰의 TCEP로 1시간 동안 환원시켰다. 환원된 IL-15 뮤테인 (83μM)를 전체 부피 50㎕에서 SMPH로 유래된 59μM Qβ VLP 또는 59μM 리어셈블된 Qβ VLP와 함께 실온에서 오버나이트 인큐베이션시켰다. 커플링 반응은 SDS-PAGE 및 항-FLAG 항체와 함께 웨스턴-블롯으로 분석하였다. 단백질 농도를 브래드포트를 이용하여 측정하였다. 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE의 농도계적 분석에 의하여 커플링 효율을 측정하였다.

실시예 9. HBcAg1 -185- Lys 에 인간 IL-15 단백질의 커플링

HBcAg1-185-Lys의 컨스트럭션, 그것의 발현 및 정제는 실질적으로 WO 03/040164의 실시예 2-5에 개시되어 있다. 20 mM Hepes, 150 mM NaCl pH 7.2 내에서, 120 μM HBcAg1-185-Lys 캡시드의 용액을 DMSO 중 스톡 용액으로부터 희석된 25 배 몰의 SMPH(Pierce)과 함께 25℃ 흔들리는 쉐이커에서 30분 동안 반응시켰다. 그 다음, 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.2, 1ℓ에 대하여 4℃에서 반응 용액을 2시간 동안 2번 투석하였다. 그 다음 투석된 HBcAg1-185-Lys 반응 혼합물을 실시예 4에서 수득한 인간 IL-15 단백질과 반응시켰다. 커플링 반응에서, 인간 IL-15 단백질은 유도된 HBcAg1-185-Lys 캡시드보다 2배를 넘는 몰로 존재한다. 커플링 반응은 25℃ 흔들리는 쉐이커에서 4시간 동안 진행하였다. SDS-PAGE로 커플링 산물을 분석하였다.

실시예 10. 면역원성

마우스의 실험 A 군(n=5)을 임의의 어쥬번트의 부재하에서, 마우스 IL-15-FL-CG에 커플된 Qβ VLP 50㎍으로, 0일, 14일 및 28일에 피하로 면역화시켰다. 음성 대조군으로써, 다섯 마우스를 PBS만으로 면역화시켰다.

마우스의 실험 B 군(n=5)을 임의의 어쥬번트의 부재하에서, 마우스 IL-15-FL-CG에 커플된 Qβ VLP 25㎍으로, 0일, 14일 및 28일에 피하로 면역화시켰다. 음성 대조군으로써, 다섯 마우스를 Qβ VLP만으로 면역화시켰다.

표 1은 Qβ-IL-15-FL-CG로의 면역화가 ELISA에 의하여 나타낸 바, 모든 마우스에서 IL-15 특이적 IgG 항체의 높은 적정량을 이끌어낸 다는 것을 보여준다. 이는 백신이 임의의 어쥬번트의 추가없이 IL-15에 대한 면역 내성을 극복할 수 있는 것을 나타낸다. ELISA 적정량은 혈청 희석으로써 정의되며, 이는 460nm(OD 50%)에서 절반 최대 광학 밀도가 된다. ELISA 플레이트를 재조합 IL-15로 코팅시켰다. 5마리의 동물의 평균을 표준 분포와 함께 나타냈다.

유사한 실험 환경을 리어셈블된 Qβ VLP에 커플된 마우스 IL-15-FL-CG로 마우스를 면역화시키는 데 적용하였으며, ELISA로 항체 적정량을 측정하고, Qβ VLP에 커플된 IL-15-FL-CG와 음성 대조군에 의하여 유도된 항체 적정량을 비교하였다.

[표 1A](실험 A)

면역화후 일수	d0	d14	d21	d42	d56	d70
항-IL-15 항체 적정량	190±253	2043±3249	14487±1212	72131±39347	56772±13403	32531±15247

[표 1B](실험 B)

면역화후 일수	d0	d14	d21	d35	d49
항-IL-15 항체 적정량	0±0	6478±9602	29294±20111	53189±58917	39551±41976

실시예 11. 류마티스 관절염 마우스 모델에서 Qβ VLP -IL-15 백신의 효능

류마티스 관절염(RA)의 마우스 모델에서 생체내 관절염 증후를 감소시키는 Qβ VLP-IL-15 백신의 능력을 평가하였다. 이러한 모델에서 RA는 4가지 다른 항체(Arthrogenic Monoclonal Antibody Cocktail, MD Biosciences)의 조합물의 정맥내 주입과, 그 다음 24시간 후 LPS의 복막 내 주입에 의하여, 유도된다(K. Terato, et al., J. Immunology, 148: 2102-2108, 1992). 이러한 모델에서, 염증은 빠르게 진행되며, 2주 동안 지속되어, 관절 강직 및 지속적인 관절 파괴에 달하게 된다.

실험 A 군에서 마우스(n=5)를 50 μg Qβ VLP-IL-15로 70일, 56일 및 42일째에 면역화시키고, PBS만을 받은 마우스의 군은 음성 대조군이다. 실험 B 군에서 마우스를 25 μg Qβ VLP-IL-15로 42일, 28일 및 14일째에 면역화시키고, Qβ로만 면역화된 마우스의 군은 음성 대조군이다. 세번 면역화 후, 24시간 경과 후에 200μl의 LPS와 함께, 정맥 내에 2mg의 단일클론 항체 칵테일(Arthrogenic Monoclonal Antibody Cocktail, MD Biosciences)을 주입함으로써, 0일째에 마우스에서 RA를 유도하였다. 14-15일에 걸쳐, 염증 과정을 관찰하고, 임상 점수를 각 팔다리에 할당하였다. 관절염의 임상 점수를 15일에 걸쳐 측정하였다. 임상 점수를 다음 정의에 따라 각 팔다리에 0 내지 3의 임상 점수로 할당하였다: 0 정상, 1 온건한 홍반 및/또는 손가락/발의 부기, 2 홍반 및 전체 발/관절에 넓게 걸친 부기, 3 심한 홍반, 강직과 함께 발/관절의 변형. 각 군당 5마리의 마우스의 평균을 평균의 표준 오차와 함께 나타냈다.

도 1A는 실험 A의 결과를 나타낸다. Qβ VLP-IL-15로 백신화된 마우스에서는 거의 0.25의 평균 임상 점수에 달했다. 반면에, PBS를 주입한 마우스에서는 같은 기간 동안 0.97의 평균 임상 정수에 달했다. 도 1B는 실험 B의 결과를 나타낸다. Qβ VLP-IL-15로 백신화된 마우스에서는 거의 0.18의 평균 임상 점수에 달한 반면에, 대조군 마우스에서는 0.51의 평균 수치를 갖는다.

실시예 12. 죽상동맥경화증 마우스 모델에서 Qβ VLP -IL-15 백신의 효능

50㎍ Qβ-IL-15 백신(n=6)(실시예 7로부터 수득함) 또는 50㎍ Qβ(n=6)을 0, 14, 28, 49, 63 및 113일째에 7 내지 8주령 수컷 Apoe -/- 마우스(The Jackson Laboratory, Bar Harbor ME)의 피하내 주입하였다. 초기에, 마우스에게 일반적인 음식 식이를 급여하였으며, 이는 21일째에 웨스턴 식이(20% 지방, 0.15% 콜레스테롤, Provimi Kliba AG)로 바꾸었다. 실험에 걸쳐 통상적인 간격으로 마우스의 피를 채취하였고, IL-15에 대한 항체 반응을 혈청에서 측정하였다. 159일째에 희생시키고, 대동맥을 분리하고,(Tangirala R.K. et al. (1995) J. Lipd. Res. 36: 2320-2328)에 개시된 대로 필수적으로 준비하였다. 심장 뚫기에 의하여 동물의 혈액을 채취하였으며, 차가운 PBS를 쏟아부었다. 그 다음, 대동맥을 제자리에서 제거된 외막의 양만큼 노출시켰으며, 대동맥을 마침내 심장으로부터 제거하였다. 차가운 PBS로 채워진 유리 페트리 디쉬에서 잔존하는 외막으로부터 대동맥을 더욱 깨끗하게 하고, 대동맥의 활의 왼쪽 쇄골밑 동맥으로부터 5mm 아래를 섹션하였다. 동맥을 세로로 자르고, 검은 왁스 표면에 고정하고, 4% 포르말린에서 오버나이트 픽스하였다. 그 다음, oil red O에서 그것들을 오버나이트 염색하였다. 디지털 사진에서, 이미지 소프트웨어 (Motic Image Plus 2.0)로 플라그를 정량화하였다. 플라그 로드는 장골 분기까지 측정된 대동맥의 총 표면에 의하여 나뉜, 장골 분기까지 대동맥의 플라그 전체 표면의 합으로써, 퍼센티지로 표현하였다. Qβ-IL-15 및 Qβ 군 사이의 플라그 로드 평균 또는 중앙값의 차이를 분석하였다.

재조합 IL-15 코팅된 ELISA 플레이트와 함께 전형적인 ELISA로 항체 반응을 측정하였다. 염소 항-마우스 HRP 컨쥬게이트를 이용하여 특이적 항체의 결합을 검출하였다. 0, 14, 28, 56 및 102일에, IL-15에 대한 적정량을 분석에서 절반-최대의 결합이 주어진 혈청 희석으로써 측정하였다.

각 동물에서 죽상동맥경화증의 범위를 Ludewig B. et al. (2000) PNAS 97:12752-12757에 개시된 대로, 대동맥 기원을 통한 교차-섹션의 조직적 분석에 의하여 평가하였다. 모든 세개의 판막첨판의 존재와 함께 시작하여, 대동맥 기원을 통하여 얼린 연속적 교차-섹션을 수집하였다. oil red O로 그들을 염색하고 수를 세었으며, 병반 크기를 정량화하기 위하여 헤마톡실린으로 염색하였다.

항체 반응의 측정 결과는 표 2에 나타냈으며, 면역화전(d0) 혈청에서 적정량이 거의 검출되지 않았기 때문에, Qβ에 커플된 뮤린 IL-15에 대한 면역화는 IL-15에 대하여 강하고 특이적인 항체 반응을 이끈다는 것을 명확하게 나타낸다.

더욱이, IL-15에 특이적인 항체 반응의 유도는 Qβ군과 비교하여, Qβ-IL-15 군의 평균(47%) 및 중앙값(46%) 플라그 로드가 감소되도록 한다(도 2). 이는 IL-15가 죽상동맥경화증의 발병기전에 관여되며, Qβ-IL-15 백신에 의한 항-IL-15 항체의 유도는 바람직하게 죽상동맥경화증을 조절한다는 것을 나타낸다.

[표 2] Qβ-IL-15로 면역화된 Apoe ^-/- 마우스에서 기하학적 평균 항-IL-15 항체 적정량

	d0	d14	d21	d28	d42	d49	d63	d92	d159
평균	10± 0	46± 27	2196± 13376	5767± 13007	25900± 19056	14355± 9978	48000± 31896	36707± 35521	84310± 39546

실시예 13. Qβ VLP 에 마우스 IL-15 단편의 커플링

Qβ 바이러스 유사 입자(㎎/ℓ)를 25℃에서 60분 동안 2.8 mM SMPH (Pierce, Perbio Science)로 유도시킨 다음, PBS에 대하여 투석하였다. IL-15_61-73(250 μM) 및 유도된 Qβ VLP(100 μM)을 PBS 완충액, 15℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. SDS-PAGE를 이용하여 커플링 산물을 분석하였다. 본 발명자들은 하나의 Qβ 모노머에 하나의 IL-15_61-73 분자 및 하나의 Qβ 모노머에 두개의 IL-15_61-73 분자의 커플링 산물을 확인하였다. IL-15_42-55 또한, 유사한 방식으로 Qβ에 커플링된다.

실시예 14. 실험적 천식의 동물 모델에서 백신 효능

생체내에서 Qβ-IL-15로의 백신화 영향을 천식의 뮤린 모델에 기초한 난알부민(OVA)에서 측정하였다. 이러한 실험은 내부 IL-15의 생체내 활성을 하향-조절하기 위한, Qβ-IL-15로 백신화에 의하여 생성된 항-IL-15 항체의 능력을 시험한다. 세 군에서, 각 군당 6마리의 BALB/c 마우스를 분석하였다. 마우스를 7, 21 및 35일째에, 50μg의 Qβ-IL-15(C군, 실시예 7로부터 수득함) 또는 대조군으로서, Qβ VLP만(A 및 B 군)으로 백신화하였다. 두번째 백신화 다음, Qβ 또는 IL-15에 대한 높은 IgG 적정량을 수득하였다. 0일째에 복강 내로 2 mg의 Al₂O₃에 흡수된 50 μg의 OVA (grade V; Sigma-Aldrich)로 B 및 C 군으로부터의 마우스를 민감하게 하였다. 폐의 알러지 염증을 유발하기 위하여, 이러한 마우스들을 OVA 에어로졸(PBS 중 2.5% 용액, Pari TurboBOY; Pari로 30분 분무)로 42 내지 45일에 걸쳐 매일 흡입시켜 시험하였다. 음성 대조군으로써, A군으로부터의 마우스를 0일째에 OVA 및 Al₂O₃로 처리하지 않았으며, 그 다음, OVA 에어로졸로 시험하지 않았다. 46일에, 마우스를 죽이고, 기관지 폐포 세척(BAL)을 수행하고, BAL에서 침투된 세포를 측정하고, 기도과민반응을 측정하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Cytos Biotechnology AG Bachmann, Martin F Zou, Yu Tissot, Alain <120> IL-15 antigen arrays and uses thereof <130> P1039PC00 <150> 60/635,179 <151> 2004-12-13 <160> 55 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 132 <212> PRT <213> Bacteriophage Q-beta <400> 1 Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys 1 5 10 15 Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val 20 25 30 Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val 35 40 45 Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val 50 55 60 Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80 Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe 85 90 95 Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu 100 105 110 Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu 115 120 125 Asn Pro Ala Tyr 130 <210> 2 <211> 329 <212> PRT <213> Bacteriophage Q-beta <400> 2 Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn 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210 215 220 Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr 225 230 235 240 Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu 245 250 255 Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu 260 265 270 Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His 275 280 285 Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly 290 295 300 Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile 305 310 315 320 Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala 325 <210> 3 <211> 129 <212> PRT <213> Bacteriophage R17 <400> 3 Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15 Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 35 40 45 Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val 50 55 60 Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80 Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala 85 90 95 Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu 100 105 110 Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile 115 120 125 Tyr <210> 4 <211> 130 <212> PRT <213> Bacteriophage fr <400> 4 Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr 100 105 110 Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 Ile Tyr 130 <210> 5 <211> 130 <212> PRT <213> Bacteriophage GA <400> 5 Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15 Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45 Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser 65 70 75 80 Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala 85 90 95 Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala 130 <210> 6 <211> 132 <212> PRT <213> Bacteriophage SP <400> 6 Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly 1 5 10 15 Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30 Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45 Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys 50 55 60 Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys 65 70 75 80 Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe 85 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Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly 165 170 175 Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg 180 185 190 Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu 195 200 205 Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp 210 215 220 Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp 225 230 235 240 Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly 245 250 255 Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu 260 265 270 Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Val Thr Ala 275 280 285 Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser 290 295 300 Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro 305 310 315 320 Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser 325 <210> 8 <211> 130 <212> PRT <213> Bacteriophage MS2 <400> 8 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 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Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu 100 105 110 Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu 115 120 125 Asn Pro Ala Tyr 130 <210> 16 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacteriophage Q-beta 243 mutant <400> 16 Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys 1 5 10 15 Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val 20 25 30 Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val 35 40 45 Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val 50 55 60 Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80 Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe 85 90 95 Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu 100 105 110 Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu 115 120 125 Asn Pro Ala Tyr 130 <210> 17 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacteriophage Q-beta 250 mutant <400> 17 Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys 1 5 10 15 Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val 20 25 30 Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val 35 40 45 Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val 50 55 60 Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80 Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe 85 90 95 Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu 100 105 110 Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu 115 120 125 Asn Pro Ala Tyr 130 <210> 18 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacteriophage Q-beta 251 mutant <400> 18 Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg 1 5 10 15 Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val 20 25 30 Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val 35 40 45 Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val 50 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Ile Asp Gln Leu 115 120 125 Asn Pro Ala Tyr 130 <210> 20 <211> 185 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 20 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160 Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175 Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185 <210> 21 <211> 188 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 21 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly 65 70 75 80 Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val 85 90 95 Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr 100 105 110 Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp 115 120 125 Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser 130 135 140 Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser 145 150 155 160 Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro 165 170 175 Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185 <210> 22 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Arg Ile Ser 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Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gln Phe Ile His Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg 50 55 60 Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val 65 70 75 80 Ile Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Asn Phe 85 90 95 Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser <210> 26 <211> 64 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer to change restriction sites <400> 26 gatccgctag ccctcgagga ctacaaggat gacgacgaca agggtggttg cggttaataa 60 gttt 64 <210> 27 <211> 60 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer to change restriciton sites <400> 27 aaacttatta accgcaacca cccttgtcgt cgtcatcctt gtagtcctcg agggctagcg 60 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer to clone IL-15 <400> 28 ggaattccat atgaactgga tagatgtaag ata 33 <210> 29 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer to clone IL-15 <400> 29 cccgctcgag ggacgtgttg atgaacattt g 31 <210> 30 <211> 128 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg 50 55 60 Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val 65 70 75 80 Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe 85 90 95 Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser Leu Glu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Cys Gly 115 120 125 <210> 31 <211> 114 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> human IL-15 E46K <400> 31 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Lys Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser <210> 32 <211> 114 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> human IL-15 I50D <400> 32 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Asp Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser <210> 33 <211> 114 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Human IL-15 E46K, I50D <400> 33 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Lys Leu Gln 35 40 45 Val Asp Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> a fragment of IL-15 <400> 34 Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Leu His Glu Tyr Ser 1 5 10 <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Mouse cytomegalovirus 1 <400> 35 Glu Thr Val Arg Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser Thr 1 5 10 <210> 36 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> human fragment 42-55 <400> 36 Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly 1 5 10 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> human fragment 61-73 <400> 37 Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser 1 5 10 <210> 38 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> human 42-55 E46K <400> 38 Phe Leu Leu Lys Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly 1 5 10 <210> 39 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> human fragment 42-55 I50D <400> 39 Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Asp Ser Leu Glu Ser Gly 1 5 10 <210> 40 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> human fragment 42-55 E46K I50D <400> 40 Phe Leu Leu Lys Leu Gln Val Asp Ser Leu Glu Ser Gly 1 5 10 <210> 41 <211> 176 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> IL-15 soluble receptor <400> 41 Gly Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp 1 5 10 15 Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser 20 25 30 Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser 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17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CGGPKPSTPPGSSGGAP <400> 55 Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala 1 5 10 15 Pro

Claims (24)

1. (a) 적어도 하나의 제1부착 부위를 갖는 바이러스-유사 입자(VLP); 및

   (b) 적어도 하나의 제2부착 부위를 갖는 적어도 하나의 항원을 포함하고,

   여기서, 상기 적어도 하나의 항원은 IL-15 단백질, IL-15 뮤테인, 또는 IL-15 단편이며, (a) 및 (b)는 상기 적어도 하나의 제1 및 상기 적어도 하나의 제2부착 부위를 통하여 링크되는 조성물.
2. 제 1항에 있어서, IL-15 단백질은:

   (a) 서열 번호 22;

   (b) 서열 번호 23;

   (c) 서열 번호 24;

   (d) 서열 번호 25; 및

   (e) 서열 번호 22-25 중 어느 하나에 적어도 80%, 바람직하게 적어도 85%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 또는 가장 바람직하게 적어도 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 IL-15 뮤테인은:

   (a) 위치 46이 E가 아닌 서열 번호 23;

   (b) 위치 50이 I가 아닌 서열 번호 23;

   (c) 위치 46이 E가 아니고, 위치 50이 I가 아닌 서열 번호 23;

   (d) 서열 번호 31;

   (e) 서열 번호 32;

   (f) 서열 번호 33; 및

   (g) 서열 번호 23에 대하여, 적어도 80%, 바람직하게 적어도 85%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 또는 가장 바람직하게 적어도 95%의 상동성을 가지며, 여기서, 서열 번호 23의 위치 46에 상응하는 위치는 E가 아니거나, 서열 번호 23의 위치 50에 상응하는 위치는 I가 아니거나, 서열 번호 23의 위치 46에 상응하는 위치는 E가 아니고, 서열 번호 23의 위치 50에 상응하는 위치는 I가 아닌 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 IL-15 단편은:

   (a) 서열 번호 34,

   (b) 서열 번호 35;

   (c) 서열 번호 36;

   (d) 서열 번호 37;

   (e) 서열 번호 38;

   (f) 서열 번호 39; 및

   (g) 서열 번호 34-39 중 어느 하나에 적어도 65%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더더욱 바람직하게 적어도 90%, 또는 가장 바람직하 게 적어도 95%의 상동성이 있는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, VLP는 RNA-파지의 재조합 코트 단백질, 돌연변이 또는 이의 단편을 포함하는 조성물.
6. 제 5항에 있어서, RNA-파지는 RNA-파지 Qβ, fr, GA 또는 AP205인 조성물.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1부착 부위는 적어도 하나의 공유 결합에 의하여 제2 부착 부위에 링크되며, 여기서 바람직하게 공유 결합은 비-펩티드 결합인 것인 조성물.
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1부착 부위는 아미노기, 바람직하게는 라이신의 아미노기를 포함하는 조성물.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 제2부착 부위는 설프히드릴기, 바람직하게는 시스테인의 설프히드릴기를 포함하는 조성물.
10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 링커를 더 포함하는 조성물.
11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 백신.
12. 제 11항에 있어서, 적어도 하나의 어쥬번트(adjuvant)를 더 포함하는 백신.
13. 제 11항 내지 제12항 중 어느 하나의 백신을 동물 또는 인간에게 투여하는 것을 포함하는 면역화 방법.
14. (a) 제 1항 내지 제 10항 중 어느 하나의 조성물 또는 제 11항 내지 제 12항중 어느 하나의 백신; 및

    (b) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
15. (a) 적어도 하나의 제1부착 부위를 갖는 VLP를 제공하고;

    (b) 적어도 하나의 제2부착 부위를 가지며, IL-15 단백질, IL-15 뮤테인 또는 IL-15 단편인 적어도 하나의 항원을 제공하며,

    (c) 상기 VLP 및 상기 적어도 하나의 항원을 상기 적어도 하나의 제1 및 상기 적어도 하나의 제2부착 부위를 통하여 링크시키는 것을 포함하여, 제 1항 내지 제 10항 중 어느 하나의 조성물을 제조하는 방법.
16. 동물, 또는 바람직하게 인간의 염증성 및/또는 만성 자기면역 질환 치료용 약제를 제조하기 위한, 제 1항 내지 제 10항 중 어느 하나의 조성물 또는 제 11항 내지 제 12항 중 어느 하나의 백신의 용도.
17. 제 16항에 있어서, 염증성 및/또는 만성 자기면역 질환이 류마티스 관절염인 용도.
18. 죽상동맥경화증의 치료용 약제의 제조를 위한, 제 1항 내지 제 10항 중 어느 하나의 조성물 또는 제 11항 내지 제 12항 중 어느 하나의 백신의 용도.
19. 천식 치료용 약제의 제조를 위한, 제 1항 내지 제 10항 중 어느 하나의 조성물 또는 제 11항 내지 제 12항 중 어느 하나의 백신의 용도.
20. 죽상동맥경화증 및 천식으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 치료용 약제의 제조를 위한, 적어도 하나의 IL-15 길항제의 용도.
21. 제 20항에 있어서, 상기 IL-15 길항제가 IL-15에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체인 용도.
22. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, IL-15 길항제는 IL-15에 특이적으로 결합하는 항체이며, 바람직하게 상기 항체는 제 1항 내지 제 10항 중 어느 하나의 조성물 또는 제 11항 내지 제 12항 중 어느 하나의 백신 조성물에 반응하여 생성되는 용 도.
23. 제 20항에 있어서, IL-15 길항제는 IL-15 뮤테인인 용도.
24. 제 23항에 있어서, IL-15 뮤테인은 서열 번호 23에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 서열 번호 23의 Asp8, Gln101, 및 Gln108의 적어도 하나의 위치, 바람직하게는 둘, 더욱 바람직하게는 세 위치 모두가 치환되어 있는 용도.

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