KR101706399B1

KR101706399B1 - 이종성 단백질을 발현하는 진핵 세포의 선택 방법

Info

Publication number: KR101706399B1
Application number: KR1020117022540A
Authority: KR
Inventors: 토마스 요스토크; 한스-페터 크노프
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2009-02-27
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2017-02-13
Also published as: AU2010219088A1; CN102333875A; IL214620A0; JP2012518991A; KR20110123783A; BRPI1008762B1; CN102333875B; RU2551229C2; IL214620A; SG173457A1; DK2401383T3; JP5745431B2; PL2401383T3; EP2401383B1; JP2015107120A; BRPI1008762A2; RU2011139183A; PT2401383E; US20140154739A1; CA2753813A1

Abstract

본 발명은 (a) 세포 생존율이 폴레이트 흡수에 의존적이고, 적어도 (i) 관심 대상의 산물을 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드, 및 (ii) DHFR 효소를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드를 포함하는 다수의 진핵 숙주 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 다수의 진핵 숙주 세포를 적어도 DHFR의 억제제 및 한계 농도의 폴레이트를 포함하는 선택 배양 배지 중에서 배양하는 단계; 및 (c) 관심 대상의 산물을 발현하는 하나 이상의 진핵 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 관심 대상의 산물을 발현하는 하나 이상의 진핵 숙주 세포를 선택하는 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 방법 및 세포 배양 배지에 의해 선택된 숙주 세포를 기초로 하여 관심 대상의 산물을 발현시키는 방법이 제공된다.

Description

이종성 단백질을 발현하는 진핵 세포의 선택 방법 {METHODS FOR SELECTING EUKARYOTIC CELLS EXPRESSING A HETEROLOGOUS PROTEIN}

" 진핵 숙주 세포의 선택 방법"

발명의 분야

본 발명은 관심 대상의 산물을 발현하는 진핵 숙주 세포, 특히 포유동물 숙주 세포의 신규 선택 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 관심 대상의 산물을 고수율로 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

관심 대상의 산물, 예컨대 재조합 펩티드 및 단백질을 대량으로 클로닝하고 발현시키는 능력은 점점 더 중요해지고 있다. 단백질을 높은 수준으로 정제하는 능력은, 예를 들어 단백질 약제를 생산하기 위해 인간 제약 및 생명공학 분야에서, 뿐만 아니라 예를 들어 단백질을 결정화시켜 그의 3차원 구조의 결정을 가능케 하기 위해 기초 연구 세팅에서 중요하다. 달리 대량으로 수득하기 어려운 단백질을 숙주 세포 내에서 과다발현시키고, 후속적으로 단리 및 정제할 수 있다.

재조합 단백질의 생산을 위한 발현 시스템의 선택은 관심 대상의 단백질의 세포 성장 특징, 발현 수준, 세포내 및 세포외 발현, 번역-후 변형 및 생물학적 활성, 뿐만 아니라 치료 단백질의 생산에서 조절 문제 및 경제적 고려사항을 비롯한 수많은 요인에 의존한다. 다른 발현 시스템, 예컨대 박테리아 또는 효모에 비해 포유동물 세포의 주요 이점은 적절한 단백질 폴딩, 복잡한 N-연결된 글리코실화 및 정확한 O-연결된 글리코실화, 뿐만 아니라 광범위한 다른 번역-후 변형을 수행하는 능력이다. 기재된 이점으로 인해, 진핵 및 특히 포유동물 세포는 현재 복잡한 치료 단백질, 예컨대 모노클로날 항체를 생산하기 위해 선택되는 발현 시스템이다.

고발현 숙주 세포 (또한 고생산자로도 불림)를 수득하기 위한 가장 통상적인 접근은 제1 단계로서 관심 대상의 산물을 발현시키기 위한 적절한 발현 벡터를 생성한다. 발현 벡터는 숙주 세포에서 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 추진하고, 재조합 세포주를 생성하기 위한 하나 이상의 선택 마커를 제공한다. 통상적으로, 포유동물 발현 벡터의 핵심 요소는 확고한 전사 활성 능력이 있는 구성적이거나 유도가능한 프로모터; 안정한 세포주의 제조 및 유전자 증폭을 위한, 통상적으로 코작(Kozak) 서열을 포함하는 최적화된 mRNA 가공 및 번역 신호, 번역 종결 코돈, mRNA 절단 및 폴리아데닐화 신호, 전사 종결인자 및 선택 마커를 포함하며; 또한 박테리아에서의 벡터 증식을 위한 원핵 복제원점 및 선택 마커가 발현 벡터에 의해 제공될 수 있다.

최근 몇 년 동안 개발의 초점은 숙주 세포에서의 유전자 발현을 위한 개선된 벡터의 설계에 집중되고 있었다. 그러나, 이용가능한 벡터의 과잉에도 불구하고, 포유동물 세포에서 고수율을 갖는 확고한 폴리펩티드/단백질 생산은 여전히 과제로 남아 있다.

관심 대상의 산물을 고수율로 발현하는 고생산 세포주를 수득하기 위한 확립된 한 절차는 숙주 세포의 안정한 형질감염이다. 그러나, 게놈으로의 안정한 통합은 희귀한 사건이고, 안정하게 형질감염된 세포 중 단지 작은 하위세트만이 고생산자이다. 따라서, 이들의 선택은 과제로 남아 있다.

선택 마커 및 선택 시스템은 관심 대상의 산물을 고수율로 발현하는 숙주 세포를 수득하기 위해 유전 공학, 재조합 DNA 기술, 및 재조합 산물의 생산에 널리 이용된다. 각각의 시스템은 또한 안정하게 형질감염된 클론을 생성 및 확인하는 데 유용하다. 각각의 선택 마커 및 선택 시스템을 이용하는 일차적 목표는, 선택 성장 조건에 노출되었을 때 도입된 선택 마커 및 그에 따라 관심 대상의 재조합 산물을 높은 수준으로 생산할 수 있는 세포의 확인을 가능케 하는 선택 유전자를 도입시키는 것이다. 예를 들어, 산물 발현의 수율을 증가시키는 것은, 예를 들어 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 또는 글루타민 신테타제 (GS)와 같은 효소가 결여된 세포주를 이들 선택 마커 효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 발현 벡터, 및 DHFR을 억제하는 메토트렉세이트 (MTX) 및 GS를 억제하는 메티오닌 술폭사민 (MSX)과 같은 작용제와 함께 사용하는 유전자 증폭에 의해 달성될 수 있다.

선행 기술에서 통상적으로 사용되는 한 유명한 선택 시스템은 디히드로폴레이트 리덕타제/MTX 선택 시스템이다. 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)는 디히드로폴산의 테트라히드로폴산 (THF)으로의 NADP-의존성 환원을 촉매화한다. 이어서, THF는 각각 퓨린 및 티미딜레이트의 신생 생합성에 사용되는 10-포르밀-DHF 및 5,10-메틸렌-DHF로 상호 전환된다. DHF는 5,10-메틸렌-THF 의존성 반응에서 dUMP의 dTMP로의 전환을 촉매화하는 티미딜레이트 신타제 (TS)의 촉매 활성의 부산물이다. 따라서, DHFR은 DNA 복제에 필요한 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드의 생합성에 필수적인 THF 보조인자의 재순환을 위해 결정적이다. 따라서, DHFR 유전자가 결여된 (즉, 표적화된 게놈 결실에 의함) 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 뉴클레오티드가 없는 배지에서 DHFR 유전자의 형질감염을 위한 수용자로서 사용될 수 있다. 형질감염 후, 가장 강력한 DHFR 억제제 (Kd = 1 pM)인 항폴레이트제 MTX 농도의 점진적인 증가를 세포에 적용시켜, 그로 인해 세포가 DHFR을 증가된 수준으로 생산하도록 강요할 수 있다. 다회의 선택 라운드 후, 선택 마커 DHFR은 유의한 증폭을 빈번히 겪는다. 또한, 각각의 선택 마커의 더 민감성인 돌연변이 형태가 야생형 숙주 세포와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, MTX에 대하여 주된 내성을 갖는, 즉, 덜 민감성인 돌연변이 마우스 DHFR 또는 DHFR의 다른 돌연변이 형태는 또한 형질감염된 세포에서 높은 수준의 MTX-내성 획득을 현저히 증진시키는 우성 선택 마커로서 광범위하게 사용되어 왔다. 그러나, 선행 기술에서 이용된 DHFR/MTX 선택 시스템의 주요 단점은, 이러한 기술은 특히 더 높은 농도에서 수용자 세포의 유전자형을 쉽게 변경시킬 수 있는 돌연변이유발성 세포독성제인 MTX를 사용한다는 점이다. 이는 빈번하게, 예를 들어 환원된 폴레이트 캐리어 (RFC)에서의 기능 손실 돌연변이/또는 RFC 유전자 발현의 상실 (둘 다 MTX 흡수를 완전히 막음)로 인해 관심 대상의 표적 유전자가 발현되지 않는 MTX-내성 세포 집단을 초래한다. 그러나, 관심 대상의 산물을 충분한 수율로 생산하는 숙주 세포를 단리하기 위한 충분히 엄격한 선택 조건을 달성하기 위해, 증가하거나 높은 농도의 MTX가 필요하다.

명백해진 것처럼, 높은 엄격도 선택 시스템은 형질감염된 집단으로부터 고생산 세포를 풍부화시키는 데 결정적이다. 선택 시스템의 엄격도가 높을수록 선택 과정 후에 저생산자의 수가 더 적어지고, 형질감염된 세포 집단에서 매우 희귀한 초고생산 클론을 발견할 기회가 더 많아진다.

따라서, 본 발명의 목적은 관심 대상의 산물을 고수율로 생산하는 숙주 세포를 선택하기 위한 엄격한 선택 시스템, 뿐만 아니라 관심 대상의 산물을 충분한 수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 더 적은 양의 독성 작용제 (특히, MTX)를 요구하는 엄격한 선택 시스템을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 관심 대상의 산물을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 관심 대상의 산물을 고수율로 발현하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 시스템, 및 각각의 산물, 특히 폴리펩티드, 예컨대 항체의 생산에 관한 것이다.

한 측면에 따르면, 본 발명은 적어도

(a) 세포 생존율이 폴레이트 흡수에 의존적이고, 적어도

(i) 관심 대상의 산물을 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드, 및

(ii) DHFR 효소를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드

를 포함하는 다수의 진핵 숙주 세포를 제공하는 단계;

(b) 적어도 DHFR의 억제제 및 한계 농도의 폴레이트를 포함하는 선택 배양 배지 중에서 상기 다수의 진핵 숙주 세포를 배양하는 단계;

(c) 관심 대상의 산물을 발현하는 하나 이상의 진핵 숙주 세포를 선택하는 단계

를 포함하는, 관심 대상의 산물을 발현하는 하나 이상의 진핵 숙주 세포를 선택하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 관심 대상의 산물의 발현을 가능케 하는 조건 하에 본 발명에 따라 선택된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 관심 대상의 산물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명에 따른 선택 방법에 사용될 수 있는, DHFR의 억제제 및 한계 농도의 폴레이트를 포함하는 선택 배양 배지가 제공된다. "선택 배양 배지"는 숙주 세포의 선택에 유용한 세포 배양 배지이다.

본 출원의 다른 목적, 특성, 장점 및 측면은 하기 상세한 설명 및 첨부된 청구범위로부터 당업자에게 분명해질 것이다. 그러나, 하기 상세한 설명, 첨부된 청구범위 및 구체적 실시예는 본 출원의 바람직한 실시양태를 나타내지만, 단지 예시할 의도로 주어지는 것임이 이해되어야 한다. 개시된 발명의 취지 및 범위 내에서의 다양한 변화 및 변형은, 하기 내용을 읽음으로써 쉽게 당업자에게 분명해질 것이다.

본 발명은 독성 작용제, 예컨대 항폴레이트제 MTX를 더 낮은 농도로 요구하지만 여전히 고생산 숙주 세포를 확인하기에 충분한 엄격한 선택 조건을 제공하는, 선택 마커로서 DHFR을 사용하는 선택 시스템에 관한 것이다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 적어도

(a) 세포 생존율이 폴레이트 흡수에 의존적이고, 적어도

(ii) DHFR 효소를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드

를 포함하는 다수의 진핵 숙주 세포를 제공하는 단계;

를 포함하는, 관심 대상의 산물을 발현하는 하나 이상의 진핵 숙주 세포를 선택하는 방법이 제공된다.

"폴리뉴클레오티드"는 통상적으로 하나의 데옥시리보스 또는 리보스로부터 또 다른 데옥시리보스 또는 리보스에 연결된 뉴클레오티드의 중합체이며, 문맥에 따라서는 DNA뿐만 아니라 RNA를 지칭한다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 어떠한 크기 제한도 포함하지 않고, 또한 변형, 특히 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

"관심 대상의 산물"은 상기 숙주 세포로부터 발현될 산물을 지칭한다. 관심 대상의 산물은, 예를 들어 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 RNA일 수 있다. 바람직하게는, 관심 대상의 산물은 폴리펩티드, 특히 이뮤노글로불린 분자이다. 관심 대상의 산물의 추가의 예가 하기 상세히 기재되어 있다.

"도입된 폴리뉴클레오티드"는, 예를 들어 재조합 기술, 예컨대 형질감염을 이용하여 숙주 세포에 도입된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 숙주 세포는 도입된 폴리뉴클레오티드에 상응하는, 구체적으로는 이와 동일한 내생 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 도입은, 예를 들어 숙주 세포의 게놈에 통합 (안정한 형질감염)될 수 있는 적합한 벡터를 형질감염시킴으로써 달성될 수 있다. 숙주 세포로의 폴리뉴클레오티드 도입을 가능케 하는 적합한 발현 벡터가 하기에 상세히 기재되어 있다. 이종성 핵산이 게놈에 삽입되지 않는 경우에, 이종성 핵산은 이후 단계에서, 예를 들어 세포가 유사분열을 겪을 때 상실될 수 있다 (일시적 형질감염). 적합한 벡터는 또한 게놈에 통합되지 않고, 예를 들어 에피좀 복제에 의해 숙주 세포에서 유지될 수도 있다. 그러나, 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입시키기 위한 다른 기술들이 또한 선행 기술에서 공지되어 있으며, 이는 하기에 더욱 상세히 기재되어 있다.

"DHFR의 억제제"는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)의 활성을 억제하는 화합물이다. 각각의 억제제는, 예를 들어 DHFR에 결합하기 위해 DHFR 기질과 경쟁할 수 있다. 적합한 DHFR 억제제로는, 예를 들어 항폴레이트제, 예컨대 메토트렉세이트 (MTX)가 있다. 추가의 예에는 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트 (뉴트렉신), 트리메토프림, 피리메타민 및 페메트렉세드가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "선택하는" 또는 "선택"은, 특히 본 발명에 따른 벡터 또는 벡터 조합을 혼입시킨 숙주 세포를 선택 및 그에 따라 수득하기 위해 선택 마커 및 선택 배양 조건을 이용하는 과정을 지칭한다. 그로 인해, 성공적으로 형질감염된 숙주 세포는 형질감염된 숙주 세포의 집단으로부터 단리 및/또는 풍부화될 수 있다.

본 발명에 따른 벡터 또는 벡터 조합을 성공적으로 혼입시키지 않은 숙주 세포는 선택 배양 조건 하에 사멸하거나, 또는 본 발명에 따른 벡터 또는 벡터 조합을 성공적으로 혼입시킨 숙주 세포에 비해 성장이 감쇠된다. 선택 동안, 본 발명에 따른 벡터 또는 벡터 조합을 성공적으로 혼입시킨 숙주 세포는 형질감염된 숙주 세포의 집단으로부터 풀(pool)로서 풍부화될 수 있다. 또한, 개별 숙주 세포는 선택 동안에 (예를 들어, 클론 선택에 의해) 형질감염된 숙주 세포의 집단으로부터 단리될 수 있다. (예를 들어, FACS 분류 또는 한계 희석에 의해) 형질감염된 숙주 세포를 성공적으로 수득하기 위한 선택 절차의 적합한 실시양태는 선행 기술에서 널리 공지되어 있고, 따라서 상세한 설명이 필요하지 않다.

"폴레이트의 한계 농도"는 숙주 세포에 선택 압력을 제공하는 선택 배양 배지 중 폴레이트의 농도를 지칭한다. 따라서, 폴레이트는 선택 배양 배지에 풍부하게 포함되지 않고, 그로 인해 숙주 세포에 선택 압력을 제공한다. 선택 배양 배지에 한계 농도로 포함된 폴레이트는 숙주 세포에 흡수될 수 있고, 숙주 세포에 의해 가공될 수 있다. 숙주 세포에 의해 가공되지 않을 폴레이트 및 특히 폴레이트의 유도체는 선택 압력에 기여하지 않을 것이고, 따라서 한계 농도에 기여하지 않을 것이다. 적합한 농도 범위는 하기 기재되어 있다.

"폴리펩티드"는 펩티드 결합(들)에 의해 함께 연결된 아미노산 중합체를 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리펩티드에는 단백질 (예를 들어, 50개 초과의 아미노산을 가짐) 및 펩티드 (예를 들어, 2 내지 49개의 아미노산을 가짐)를 비롯한 임의의 길이의 폴리펩티드가 포함된다. 폴리펩티드에는 임의의 활성 또는 생물활성의 단백질 및/또는 펩티드가 포함된다. 적합한 예가 하기 개괄되어 있다.

놀랍게도, 관심 대상의 산물을 생산할 수 있는 재조합 진핵 세포를 제공하기 위한 선택 시스템이, 선택 마커로서의 DHFR의 사용과 관련하여 선택 배양 배지 중 폴레이트의 제한된 이용가능성을 기초로 할 수 있다는 것이 발견되었다. 시스템은 광범위하게, 즉, 세포 생존율이 폴레이트의 흡수에 의존하는 것인 진핵 숙주 세포에 적용가능하다. 상기 기재된 바와 같이, 선행 기술은 유전자 증폭을 위한 충분한 선택 압력을 달성하고 그에 따라 관심 대상의 산물의 생산의 증가를 달성하기 위해, 오히려 높은 항폴레이트제/MTX 농도를 이용하여야 한다. 항폴레이트제, 예컨대 MTX가 독성이고, 숙주 세포를 유전적으로 변경시킬 수 있기 때문에 이는 단점이다. 선택 배양 배지에서 DHFR 선택 마커와 한계 농도의 폴레이트의 조합된 사용을 기초로 하는 본 발명의 접근법은, 심지어 낮은 DHFR 억제제 농도에서도 선택 엄격도가 상당히 증가되는 장점을 갖는다. 따라서, 본 발명의 선택 시스템을 이용하는 경우, 심지어 선택 배양 배지 중 DHFR 억제제 (예를 들어, MTX)의 낮은 농도를 이용하는 경우에도 고생산자가 수득된다. 따라서, 본 발명의 교시를 이용하는 경우에는, 고생산 세포 클론의 확인을 가능케 하는 엄격한 선택 조건을 제공하기 위하여 선행 기술의 접근법에 비해 더 적은 DHFR 억제제 및 그에 따른 더 적은 독성 작용제 농도가 필요하다. 그의 고유한 설계로 인해, 형질감염된 숙주 세포 집단으로부터 고생산 세포의 풍부화를 가능케 하는 매우 엄격한 선택 시스템이 제공된다. 본 발명에 따른 선택 시스템의 이러한 높은 엄격도는 집단에서의 선택 후의 집단에서 저생산자의 수를 낮추고, 매우 희귀한 초고생산 클론을 발견할 기회를 증가시킨다.

선택 배양 배지는 하나 이상의 폴레이트 유형을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 폴레이트는, 예를 들어 산화된 폴레이트 (즉, 폴산) 또는 환원된 폴레이트 또는 이들의 유도체일 수 있다. 일반적으로, 폴레이트는 이러한 폴레이트가 바람직하게는 기능적 막-결합 폴레이트 수용체에 의해 진핵 세포로 흡수될 수 있을 것인 한, 본 발명 내에서 유용할 수 있다. 산화된 폴레이트, 즉 폴산, 뿐만 아니라 폴산의 환원된 유도체 (환원된 폴레이트 또는 테트라히드로폴레이트 (THF)로 알려져 있음)는 진핵, 특히 포유동물 세포에서 퓨린, 티미딜레이트 및 특정 아미노산 생합성을 위한 필수 보조인자 및/또는 조효소인 B-9 비타민 군이다. THF 보조인자는 특히 DNA 복제 및 그에 따른 세포 증식에 결정적이다. 특히, THF 보조인자는 퓨린 및 티미딜레이트, 아미노산의 신생 생합성, 뿐만 아니라 DNA의 CpG 섬 메틸화를 비롯한 메틸 기 대사를 포함하는 일련의 상호 연결된 대사 경로에서 1-탄소 단위의 공여자로서의 기능을 한다. 특히, 10-포르밀-THF (10-CHO-THF)를 비롯한 THF 보조인자는 퓨린의 신생 생합성에 관련된 2개의 주요 신생 포르밀트랜스퍼라제 반응에서 1-탄소 단위를 제공한다. 산화된 폴레이트의 바람직한 예로는 폴산이 있다. 환원된 폴레이트의 바람직한 예로는 5-메틸-테트라히드로폴산, 5-포르밀-테트라히드로폴산, 10-포르밀-테트라히드로폴산 및 5,10-메틸렌-테트라히드로폴산이 있다.

선택 배지 중 폴레이트의 농도는 사용되는 진핵 숙주 세포에 특히 의존한다. 500 nM 이하, 250 nM 이하, 150 nM 이하, 100 nM 이하, 75 nM 이하, 50 nM 이하, 25 nM 이하, 15 nM 이하, 또는 심지어 10 nM 이하, 예컨대 7.5 nM 이하의 폴레이트 농도가 적합하다. 적합한 범위에는 0.1 nM 내지 500 nM, 0.1 nM 내지 250 nM, 5 또는 10 nM 내지 250 nM, 바람직하게는 1 nM 내지 150 nM, 5 또는 10 nM 내지 150 nM, 1 nM 내지 100 nM, 5 또는 10 nM 내지 100 nM, 및 보다 바람직하게는 1 nM 내지 50 nM, 2.5 nM 내지 50 nM, 10 nM 내지 50 nM, 또는 12.5 nM 내지 50 nM이 포함된다. 이들 농도는 폴레이트로서 폴산을 사용하는 경우에 특히 적합하다.

각각의 농도는 본 발명의 관점에서 및 그에 따라 숙주 세포에 선택 압력을 제공하는 데 적합하게 제한된다. 세포가 여전히 살아있는 한, 농도가 낮을수록 가해지는 선택 압력은 더 강해진다. 기재된 농도 범위는 숙주 세포로서 CHO 세포를 사용하기에 특히 적합하다.

선택 배양 배지에 사용되는 DHFR 억제제의 농도는 또한 사용되는 진핵 숙주 세포에 의존한다. 선택 배지 중 DHFR 억제제의 농도가 감소될 것으로 가정되어 있는 경우에, 500 nM 이하, 400 nM 이하, 300 nM 이하, 250 nM 이하, 200 nM 이하, 150 nM 이하의 DHFR 억제제 농도가 유리하다. 그러나, 바람직하게는, 선택 배지는 10 nM 이상의 DHFR 억제제를 포함한다. 바람직한 항폴레이트제 (바람직하게는, MTX) 농도는 1 nM 내지 500 nM, 바람직하게는 10 nM 내지 200 nM, 10 nM 내지 150 nM이며, 10 nM 내지 100 nM이 보다 바람직하다. 선택 배양 배지 중 각각의 농도는 CHO 세포에 특히 적합하다.

상기 기재된 폴레이트 및 항폴레이트제의 바람직한 농도 및 농도 범위는 서로 조합될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 200 nM 이하, 바람직하게는 150 nM 이하, 바람직하게는 100 nM 이하의 DHFR 억제제 (바람직하게는, MTX) 농도, 및 100 nM 미만, 바람직하게는 75 nM 미만의 폴레이트 (바람직하게는, 폴산) 농도를 포함하는 선택 배양 배지가 사용된다. 한 실시양태에서, 12.5 nM 내지 50 nM의 폴레이트 농도가 10 nM 내지 100 nM의 항폴레이트제 농도와 함께 사용된다. 바람직하게는, 폴레이트 및 항폴레이트제로서 폴산 및 MTX가 사용된다.

폴산 및 MTX의 가능한 농도는 서로 의존적일 수 있고; 바람직한 조합은 10 nM 내지 500 nM, 바람직하게는 10 nM 내지 100 nM의 MTX 농도와 조합하여 2.5 nM 내지 75 nM, 2.5 nM 내지 50 nM 또는 12.5 nM 내지 50 nM의 폴산 농도이다. 이들 농도는 DHFR + (플러스) 세포를 사용하는 경우에 특히 바람직하다.

상기 기재된 농도는 상업적 생산 세포주를 위한 바람직한 표현형인 현탁 세포를 빠르게 성장시키기에 특히 적합하다. 그러나, 상이한 세포주는 상이한 폴산 소모 특성을 가질 수 있다. 또한, 한계/선택 농도는 사용되는 폴레이트, 구체적으로는 항폴레이트제에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 폴레이트, 특히 폴산 및 항폴레이트제, 특히 MTX의 한계 농도, 뿐만 아니라 적합한 폴산 대 MTX 비율은 상이한 세포주에 대해 상이할 수 있다. 그러나, 적합한 농도는 당업자에 의해 실험적으로 쉽게 결정될 수 있다.

한 실시양태에 따르면, 숙주 세포는 형질감염 및/또는 선택 전에 폴레이트 무함유 배양 배지 중에서 또는 한계 농도의 폴레이트를 포함하는 배양 배지에서 사전-배양된다. 폴레이트의 적합한 한계 농도는 상기 기재되어 있다. 바람직하게는, 숙주 세포를 사전-배양하기 위한 상기 배양 배지는 폴레이트, 특히 폴산을 50 nM 이하의 농도로 포함한다.

혼입된 선택 마커 DHFR의 발현은 선택 배양 조건 하에 선택적 이점을 숙주 세포에 제공한다. 예를 들어, DHFR 유전자가 결여된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포) (예를 들어, 표적화된 게놈 결실에 의함, 또한 DHFR ^- 숙주 세포로도 불림)는 뉴클레오티드가 없는 배지에서 선택 마커 유전자로서의 DHFR 유전자의 형질감염을 위한 수용자로서 이용될 수 있다. 그러나, 적절한 선택 배양 조건이 이용된다면, DHFR 선택을 수행할 때 DHFR을 내생적으로 발현하는 숙주 세포 (DHFR ⁺ (플러스) 숙주 세포)를 사용하는 것도 또한 가능하다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 사용하여 형질감염시킨 후, 세포에 DHFR 억제제 농도의 점진적인 증가를 적용시킬 수 있다. DHFR 억제제의 한 예로는 강력한 DHFR 억제제인 항폴레이트제, 예컨대 MTX가 있다 (Kd=1 pM). 배지 중 항폴레이트제, 예컨대 MTX의 존재는 세포가 생존하기 위해 DHFR를 증가된 수준으로 생산하도록 강요한다. 다회의 선택 라운드에서, 선택 마커 DHFR은 이를 달성하기 위해 중요한 유전자 증폭을 빈번히 겪는다.

본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 몇몇 적합한 DHFR 유전자가 당업계에 공지되어 있다. DHFR은 야생형 DHFR 또는 그의 기능성 변이체 또는 유도체일 수 있다. 용어 "변이체" 또는 "유도체"는 각각의 DHFR 효소의 아미노산 서열에 관하여 하나 이상의 아미노산 서열 교체 (예를 들어 결실, 치환 또는 부가)를 갖는 DHFR 효소, DHFR 효소 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 융합 단백질, 및 추가의 구조 및/또는 기능을 제공하도록 변형된 DHFR 효소, 뿐만 아니라 여전히 하나 이상의 DHFR 효소 기능을 갖는 상기한 것들의 기능적 단편을 포함한다. DHFR 효소/변이체는 야생형 DHFR 효소보다 MTX에 더 민감성이거나 덜 민감성인 선택 마커로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 사용되는 DHFR 효소는 야생형 DHFR 효소 및/또는 발현되는 경우에는 숙주 세포에 의해 내생적으로 발현된 DHFR 효소보다 항폴레이트제, 예컨대 MTX에 대해 더 민감성이다. DHFR 효소는 본 발명 내에서 기능적인 한, 즉, 사용되는 숙주 세포와 상용성인 한, 임의의 종으로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, MTX에 대하여 주된 내성을 갖는 돌연변이 마우스 DHFR은 형질감염된 세포에서 높은 수준의 MTX-내성 획득을 현저히 증진시키는 우성 선택 마커로서 광범위하게 사용되어 왔다. 바람직하게는, DHFR ⁺ (플러스) 숙주 세포에서 내생적으로 발현된 DHFR 효소보다 DHFR 억제제, 예컨대 MTX에 덜 영향받기 쉽고 그에 따라 덜 민감성인 DHFR 효소가 사용된다.

한 실시양태에 따르면, 인트론 또는 그의 단편은 DHFR 유전자의 오픈 리딩 프레임의 3' 말단에 위치한다. 이는 구축물의 발현/증폭 속도에 있어서 유리한 효과를 갖는다. DHFR 발현 카세트에 사용된 인트론은 DHFR 유전자의 더 작은 비기능적 변이체를 유발한다 (문헌 [Grillari et al., 2001, J. Biotechnol. 87, 59-65]). 그로 인해 DHFR 유전자의 발현 수준이 저하되고, 따라서 선택 시스템의 엄격도를 추가로 증가시킬 수 있다. 따라서, 숙주 세포는 DHFR 효소를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드 (DHFR 코딩 서열의 3'에 위치하는 인트론을 포함함)를 포함할 수 있다. 인트론을 사용하여 DHFR 유전자의 발현 수준을 감소시키는 대안적인 방법이 EP 0 724 639에 기재되어 있으며, 또한 이용될 수 있다.

그 자신의 폴레이트를 합성하는 대부분의 원핵생물, 식물 및 진균과는 대조적으로, 포유동물 및 다른 진핵생물 종은 THF 보조인자 생합성이 결여되어 있고, 따라서 외생 공급원, 통상적으로 배양 배지로부터 이들을 수득하여야 한다. 3종의 독립적인 수송 시스템, 즉 환원된 폴레이트 캐리어 (RFC), 양성자-커플링된 폴레이트 수송체 (PCFT, SLC46A로도 알려져 있음) 및 폴레이트 수용체 (FR)가 포유동물 세포에서 폴레이트 및 항폴레이트제의 흡수를 매개하는 것으로 현재 알려져 있다.

진핵 숙주 세포는, 바람직하게는 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 진균 세포 및 식물 세포는 폴레이트에 대해 독립영양적이다 (즉, 이러한 세포는 그의 세포 생존능, 즉 세포 성장 및 증식에 필요한 그 자신의 폴레이트를 자율적으로 합성할 수 있음). 본 발명은 특히 폴레이트에 대해 영양요구성이거나 영양요구성이 될 수 있는 이러한 진균 및 식물 세포를 포함한다. 이는 예를 들어, 유전자 조작에 기인하는 것일 수 있다 (즉, 세포가 이제 그의 세포 생존능에 필요한 충분한 양의 폴레이트를 합성할 수 없음). 예를 들어, 적절한 대상 경로를 통해 폴레이트를 내생적으로 생합성하는 이러한 진균 또는 식물 세포의 능력은, 예를 들어 적절한 표적 유전자의 유전자 파괴 또는 유전자 침묵, 또는 핵심 효소의 억제 등에 의해 불활성화될 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 상기 포유동물 세포는 설치류 세포, 인간 세포 및 원숭이 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 설치류 세포가 특히 바람직하며, 이는 바람직하게는 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, 마우스 3T3 섬유모세포 세포 및 SP2/0 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 특히 바람직한 설치류 세포는 CHO 세포이다. 또한, 인간 세포가 바람직하며, 이는 바람직하게는 HEK293 세포, MCF-7 세포, PerC6 세포 및 HeLa 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가로 원숭이 세포가 바람직하며, 이는 바람직하게는 COS-1, COS-7 세포 및 베로(Vero) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 숙주 세포는 바람직하게는 DHFR ⁺ (플러스) 세포, 특히 DHFR ⁺ (플러스) CHO 세포이다.

한 실시양태에 따르면, 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 DHFR 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 벡터에 의해 도입되었다. 각각의 벡터를 도입시키기 위한 적합한 기술은 하기 기재되어 있고, 예를 들어 형질감염을 포함한다.

본 발명에 따른 "발현 벡터"는 하나 이상의 외래 핵산 단편을 보유할 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. 벡터는 핵산, 구체적으로는 폴리뉴클레오티드의 단편을 숙주 세포 내로 전달하는, 분자 캐리어와 유사한 기능을 한다. 이것은 그 속에 혼입된 폴리뉴클레오티드를 적절하게 발현시키기 위한 조절 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 관심 대상의 산물 또는 선택 마커를 코딩함)는 발현 벡터의 발현 카세트(들)에 삽입되어 그로부터 발현될 수 있다. 본 발명에 따른 발현 벡터는 원형 또는 선형화된 형태로 존재할 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 또한 외래 핵산 단편의 이동을 가능케 하는 인공 염색체 또는 유사한 각각의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 DHFR 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일하거나 상이한 발현 벡터 상에 위치할 수 있다. 두 폴리뉴클레오티드 모두를 운반하는 발현 벡터를 사용하는 것은 단 하나의 발현 벡터만이 숙주 세포에 혼입될 필요가 있다는 장점을 갖는다. 또한, 특히 안정한 발현 세포주를 확립하는 경우에, 폴리뉴클레오티드가 게놈에 함께 통합되고 그에 따라 유사한 수율로 발현될 가능성이 더 높다. 그러나, 각각의 폴리뉴클레오티드가 상이한 발현 벡터 상에 위치하는, 형질감염을 위한 2종 이상의 발현 벡터의 조합을 사용하는 것 또한 가능하고, 본 발명의 범주 내에 있다. 이어서, 발현 벡터의 상기 조합은 숙주 세포로 형질감염된다.

진핵 숙주 세포는 추가의 관심 대상의 산물을 코딩하는 하나 이상의 추가의 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태는 이뮤노글로불린 분자를 발현시키기에 특히 적합하다. 바람직한 실시양태에 따르면, 숙주 세포는 각각 관심 대상의 산물을 코딩하는 2종 이상의 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 또는 그의 기능적 단편을 코딩하고, 다른 폴리뉴클레오티드는 이뮤노글로불린 분자의 경쇄 또는 그의 기능적 단편을 코딩한다. 각각의 폴리뉴클레오티드는 적절한 발현 벡터를 사용하여 도입될 수 있다. 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄 (또는 이들의 기능적 단편)를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는, 2종 이상의 발현 벡터의 조합이 사용되는 경우에 동일한 발현 벡터 상에 또는 상이한 발현 벡터 상에 위치할 수 있다.

숙주 세포, 및 그에 따라 폴리뉴클레오티드를 상기 숙주 세포에 도입시키기 위한 발현 벡터는 하나 이상의 추가 선택 마커(들)을 코딩하는 하나 이상의 추가 폴리뉴클레오티드(들)을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 시스템을 하나 이상의 상이한 선택 시스템(들) (예를 들어, 항생제 내성 선택 시스템, 예컨대 neo/G418)과 함께 이용하는 동시-선택이 성능을 추가로 개선하기 위해 적용될 수 있다. 진핵 숙주 세포에서의 선택을 가능케 하는 추가의 진핵 선택 마커 외에, 또한 원핵 숙주 세포에서의 선택을 가능케 하는 원핵 선택 마커가 사용될 수 있다. 각각의 원핵 선택 마커의 예로는 항생제, 예컨대 예를 들어 암피실린, 카나마이신, 테트라시클린 및/또는 클로람페니콜에 대한 내성을 제공하는 마커가 있다.

폴리펩티드를 숙주 세포에 도입시키기 위해 사용되는 벡터는 통상적으로 발현 카세트의 요소로서 전사를 추진하기에 적합한 전사 제어 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 전사 중지 또는 종결 신호를 함유한다. 목적 산물이 단백질인 경우에, 바람직하게는, 예를 들어 리보좀을 보충하기에 적합한 5' 캡 구조로 이어지는 5' 비번역 영역, 및 번역 과정을 종결시키는 종결 코돈과 같은 적합한 번역 제어 요소가 벡터에 포함되고, 발현될 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 특히, 선택 마커 유전자로서의 역할을 하는 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적절한 프로모터 내에 존재하는 전사 요소의 제어 하에 전사될 수 있다. 선택 마커 유전자의 및 관심 대상의 산물의 생성된 전사체는 실질적인 수준의 단백질 발현 (즉, 번역) 및 적절한 번역 종결을 용이하게 하는 기능적 번역 요소를 보유한다. 혼입된 폴리뉴클레오티드의 발현을 적절하게 일으킬 수 있는 기능적 발현 단위는 또한 본원에서 "발현 카세트"로서 지칭된다.

폴리뉴클레오티드를 진핵 숙주 세포에 도입시키기 위해 사용되는 본 발명에 따른 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합은, 발현 카세트의 요소로서 하나 이상의 프로모터 및/또는 프로모터/인핸서 요소를 포함할 수 있다. 이들 두 조절 요소 사이의 물리적인 경계가 항상 명확한 것은 아니지만, 용어 "프로모터"는 통상적으로 RNA 폴리머라제 및/또는 임의의 관련된 인자가 결합하고 그곳에서 전사가 개시되는 핵산 분자 상의 부위를 지칭한다. 인핸서는 일시적으로, 뿐만 아니라 공간적으로 프로모터 활성을 증진시킨다. 수많은 프로모터가 광범위한 세포형에서 전사 활성을 갖는다. 프로모터는 구성적으로 기능하는 부류, 및 유도 또는 탈억제에 의해 조절되는 부류의 2가지 부류로 분류될 수 있다. 둘 모두가 본 발명의 교시에 적합하다. 포유동물 세포에서 높은 수준의 폴리펩티드 생산을 위해 사용되는 프로모터는 강력해야 하고, 바람직하게는 광범위한 세포형에서 활성이어야 한다.

수많은 세포형에서 발현을 추진하는 강한 구성적 프로모터에는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 인간 시토메갈로바이러스 극초기 프로모터, SV40 및 라우스 육종(Rous Sarcoma) 바이러스 프로모터, 및 뮤린 3-포스포글리세레이트 키나제 프로모터, EF1a가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 프로모터 및/또는 인핸서가 CMV 및/또는 SV40으로부터 수득되는 경우에, 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 우수한 결과가 달성된다. 전사 프로모터는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, EF1알파 프로모터, RSV 프로모터, BROAD3 프로모터, 뮤린 로사 26 프로모터, pCEFL 프로모터 및 β-액틴 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

바람직하게는, 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 DHFR 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 별개의 전사 프로모터의 제어 하에 있다. 일반적으로, 진핵 숙주 세포에서 필수적인 폴리뉴클레오티드의 발현, 특히 전사를 촉진할 수 있는 프로모터가 적합할 것이다. 폴리뉴클레오티드로부터 발현을 추진하는 별개의 전사 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다.

한 실시양태에 따르면, DHFR 효소 및/또는 존재하는 경우에는 추가의 선택 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 추진하기 위해서보다는 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 추진하기 위해서 더 강한 프로모터 및/또는 인핸서가 사용된다. 이러한 배열은 선택 마커를 위해서보다는 관심 대상의 산물을 위해 더 많은 전사체가 생성되는 효과를 갖는다. 이종성 산물을 생산하기 위한 개별 세포 수용량이 비제한적이지 않고, 따라서 관심 대상의 산물로 집중되어야 하기 때문에, 관심 대상의 산물의 생산이 선택 마커의 생산에 대해 우세한 것이 유리하다. 또한, 선택 과정은 단지 발현 세포주 확립의 초기 단계에서만 일어나고, 그 다음에는 변함없이 관심 대상의 산물을 생산한다. 따라서, 관심 대상의 산물의 발현/생산에 세포의 자원을 집중시키는 것이 유리하다. 또한, 선택 마커(들), 특히 DHFR를 발현시키기 위해 덜 강력한 프로모터를 사용하는 것은, 선택 압력을 추가로 증가시키고 그에 따라 선택 배양 배지 중 DHFR 억제제의 더 낮은 농도를 이용하게 한다.

한 실시양태에 따르면, 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 추진하는 프로모터는 CMV 프로모터이고, DHFR 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 추진하는 프로모터는 SV40 프로모터이다. CMV 프로모터는 포유동물 발현을 위해 이용가능한 가장 강력한 프로모터 중 하나인 것으로 알려져 있고, 매우 우수한 발현 속도를 유발한다. 이것은 SV40 프로모터보다 현저히 더 많은 전사체를 제공하는 것으로 간주된다.

추가 실시양태에 따르면, 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 DHFR 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 전사 프로모터의 제어 하에 있고, 따라서 하나의 발현 카세트로부터 발현된다. 적합한 프로모터는 상기 기재되어 있다. 이러한 실시양태에서, 하나의 긴 전사체가 상기 전사 프로모터의 제어 하에 있는 각각의 발현 카세트로부터 수득된다. 한 실시양태에 따르면, 하나 이상의 IRES 요소가 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 DHFR 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 기능적으로 위치한다. 그로 인해, 분리된 번역 산물이 상기 전사체로부터 수득된다는 것이 보증된다.

발현 카세트는 적절한 전사 종결 부위를 포함할 수 있다. 상류 프로모터로부터 제2 전사 단위를 통해 계속되는 전사가 하류 프로모터의 기능을 억제할 수 있기 때문에, 이러한 현상은 프로모터 차단 또는 전사 간섭으로 알려져 있다. 이러한 사건은 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 보고되어 왔다. 두 전사 단위 사이에 전사 종결 신호가 적절히 위치하는 것이 프로모터 차단을 방지할 수 있다. 전사 종결 부위는 잘 특성화되어 있고, 그의 발현 벡터에의 도입은 유전자 발현에 대해 여러 유익한 효과를 갖는 것으로 나타났다.

사용되는 숙주 세포는 진핵, 특히 포유동물 숙주 세포이다. 대부분의 진핵 발생기 mRNA는 1차 전사체의 절단 및 연결된 폴리아데닐화 반응을 포함하는 복잡한 과정 동안에 첨가되는 폴리A 꼬리를 그의 3' 말단에 소유한다. 폴리A 꼬리는 mRNA 안정성 및 이동성을 위해 유리하다. 따라서, 관심 대상의 산물 및 DHFR 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 발현 카세트는 통상적으로 전사 종결 및 폴리아데닐화에 적합한 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 소 성장 호르몬 (bgh), 마우스 베타-글로빈, SV40 초기 전사 단위 및 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자로부터 유래된 것을 비롯하여, 포유동물 발현 벡터에 사용될 수 있는 몇몇 효과적인 폴리A 신호가 있다. 그러나, 합성 폴리아데닐화 부위도 또한 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Levitt et al., 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025]를 기초로 한 프로메가(Promega)의 pCI-neo 발현 벡터 참조). 폴리아데닐화 부위는 SV40폴리A 부위, 예컨대 SV40 후기 및 초기 폴리A 부위 (예를 들어, 문헌 [Subramani et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 854-864]에 기재된 바와 같은 플라스미드 pSV2-DHFR 참조), 합성 폴리A 부위 (예를 들어, 문헌 [Levitt et al., 1989, Genes Dev. 3, (7): 1019-1025]를 기초로 한 프로메가의 pCI-neo 발현 벡터 참조) 및 bgh 폴리A 부위 (소 성장 호르몬)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 DHFR 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트는 하나 이상의 인트론을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태는 포유동물 숙주 세포가 발현을 위해 사용되는 경우에 특히 적합하다. 고등 진핵세포로부터의 대부분의 유전자는 RNA 가공 동안에 제거되는 인트론을 함유한다. 각각의 구축물은 트랜스제닉 시스템에서 인트론이 결여된 동일한 구축물보다 더 효율적으로 발현된다. 통상적으로, 인트론은 오픈 리딩 프레임의 5' 말단에 위치하지만, 3' 말단에도 또한 위치할 수 있다. 따라서, 인트론은 발현 카세트(들)에 포함되어 발현 속도를 증가시킬 수 있다. 상기 인트론은 프로모터 및/또는 프로모터/인핸서 요소(들), 및 발현될 폴리펩티드의 오픈 리딩 프레임의 5' 말단 사이에 위치할 수 있다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 몇몇 적합한 인트론이 선행 기술에서 공지되어 있다.

한 실시양태에 따르면, 관심 대상의 산물을 발현시키기 위한 발현 카세트에 사용되는 인트론은 합성 인트론, 예컨대 SIS 또는 RK 인트론이다. RK 인트론은, 바람직하게는 관심 대상의 유전자의 ATG 개시 코돈 앞에 위치하는 강력한 합성 인트론이다. RK 인트론은 CMV 프로모터의 인트론 공여자 스플라이스 부위, 및 마우스 IgG 중쇄 가변 영역의 수용자 스플라이스 부위로 구성된다 (예를 들어, 문헌 [Eaton et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347], [Neuberger et al., 1983, EMBO J. 2(8), 1373-1378] 참조; 이것은 pRK-5 벡터 (BD 파밍겐(PharMingen))로부터 수득될 수 있음).

상기 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 및/또는 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터는 그의 원형 형태로 숙주 세포에 형질감염될 수 있다. 수퍼코일 벡터 분자는 통상적으로 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제의 활성으로 인해 핵 내에서 선형 분자로 전환될 것이다. 그러나, 형질감염 전의 발현 벡터의 선형화는 종종 안정한 형질감염의 효율을 개선한다. 이는 또한 발현 벡터가 형질감염 전에 선형화되는 경우에, 선형화 지점이 제어될 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에 따르면, 발현 벡터 또는 2종 이상의 발현 벡터의 조합은 형질감염 전에 벡터(들)의 선형화를 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 예정된 제한 부위를 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 선형화되었을 때, DHFR 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5'에 위치하도록 선형화 부위가 배열된다. 상기 배열은 유전자 증폭을 위해 유리하다. 원핵 선택 마커가 추가로 사용되는 경우에, 상기 원핵 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3'에 위치한다. 이는 원핵 선택 마커 유전자가 3'에 위치하여 선형화된 벡터 핵산의 "포유동물" 부분의 "바깥쪽"에 있는 효과를 갖는다. 원핵 서열이 포유동물 세포에서 증가된 메틸화 또는 다른 침묵 효과를 유발할 수 있기 때문에, 원핵 유전자가 아마도 포유동물 발현을 위해 유리하지 않을 것이므로, 상기 배열이 바람직하다.

관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 DHFR 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 상기 숙주 세포에 안정하게 도입된다. 안정한 도입, 구체적으로는 형질감염은 발현 세포주의 확립, 및 특히 관심 대상의 산물의 대규모 및 그에 따른 산업적 생산을 위해 유리하다.

폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포를 비롯한 진핵 숙주 세포에 도입하기 위한, 선행 기술에서 공지된 몇몇 적절한 방법이 있다. 각각의 방법에는 인산칼슘 형질감염, 전기천공, 리포펙션(lipofection), 유전자총(biolistic)- 및 중합체-매개 유전자 이동법이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 종래의 랜덤 통합 기반 방법 또한 재결합 매개 접근법이, 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 DHFR 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 게놈 내로 이동시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 재조합 방법은 트랜스진의 방향성 삽입을 매개할 수 있는 부위 특이적 리콤비나제, 예컨대 Cre, Flp 또는 ΦC31 (예를 들어, 문헌 [Oumard et al., Cytotechnology (2006) 50: 93 - 108] 참조)의 사용을 포함할 수 있다. 대안적으로, 상동성 재조합의 메카니즘이 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 데 사용될 수 있다 (문헌 [Sorrell et al., Biotechnology Advances 23 (2005) 431 - 469] 참조). 재조합 기반 유전자 삽입은 숙주 세포에 이동/도입되는 이종성 핵산에 포함될 요소의 수를 최소화하는 것을 가능케 한다. 예를 들어, 단지 나머지 요소 (예를 들어, 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 DHFR 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)만이 숙주 세포에 이동/형질감염될 필요가 있도록, 이미 프로모터 및 폴리A 부위 (외생 또는 내생)를 제공하는 삽입 유전자좌가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 적합한 발현 벡터 또는 발현 벡터의 조합의 실시양태, 뿐만 아니라 적합한 숙주 세포가 상기 상세히 기재되어 있고; 본 발명자들은 상기 개시내용을 인용한다.

DHFR 효소 외에 추가의 선택 마커가 사용되는 경우에, 상기 선택 마커를 위한 선택 조건은 DHFR 효소를 위한 선택 조건을 적용하기 전에 적용될 수 있다. 예를 들어, 추가의 선택 마커로서 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (neo)가 사용되는 경우에, 본 발명에 따른 발현 벡터(들)을 혼입시킨 세포를 선택하기 위해 세포는 우선, 예를 들어 G418을 함유하는 배지 중에서 성장할 수 있다.

DHFR 선택 마커 외에 선택 배양 배지 중 폴레이트의 한계 농도를 이용하는 본 발명의 전략은, 심지어 더 낮은 DHFR 억제제 농도가 사용되는 경우에도 매우 높은 엄격도가 얻어진다는 장점을 갖는다. 이들 신규 선택 조건에서 생존하는 세포 집단의 생산성은 현저하게 증가된다. 실시예는 선택 방법 후에 수득된 숙주 세포가 관심 대상의 산물을 고수율로 생산한다는 것을 보여주었다. 또한, 개별 숙주 세포의 평균 생산성이 증가된다. 따라서, 더 적은 스크리닝 노력으로 고생산자 클론을 발견할 기회가 향상된다. 따라서, 본 발명에 따른 선택 시스템은 선행 기술에서 사용된 선택 시스템에 비해 월등하다. 특히, 각각의 선택 마커의 단독 사용에 비해 더 높은 생산성을 갖는 숙주 세포가 수득된다. 따라서, 선택 조건의 더 높은 엄격도로 인해, 선택 절차는 최적화된다.

본 발명의 스크리닝/선택 절차의 결과로서 수득된 세포는 일반적으로 원래의 세포 집단의 선택되지 않은 세포로부터 단리될 것이고 풍부화될 수 있다. 이들은 개별 세포로서 단리 및 배양될 수 있다. 이들은 또한, 임의로 추가의 정량 또는 정성 분석을 위한 1회 이상의 추가 선택 라운드에 사용될 수 있거나, 또는 예를 들어 단백질 생산을 위한 세포주의 개발에 사용될 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 상기 기재된 바와 같이 선택된 생산성 숙주 세포의 풍부화된 집단은 관심 대상의 폴리펩티드를 우수한 수율로 생산하기 위한 집단으로서 직접 이용된다. 바람직하게는, 관심 대상의 산물을 안정하게 발현하는 숙주 세포가 선택된다. 안정한 형질감염/발현의 장점은 상기 상세히 기재되어 있다. 본 발명자들은 상기 개시내용을 인용한다.

또한, 적어도

(a) 관심 대상의 산물을 발현하는 하나 이상의 진핵 숙주 세포를 선택하기 위해 본 발명에 따른 선택 방법을 수행하는 단계; 및

(b) 하나 이상의 선택된 진핵 숙주 세포를 관심 대상의 산물의 발현을 가능케 하는 조건 하에 배양하는 단계

를 포함하는, 관심 대상의 산물을 생산하는 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 선택 방법이 고생산 세포 클론의 확인을 가능케 하기 때문에, 상기 선택 시스템은 생산 과정의 중요하고 필수 불가결한 부분이다. 발현된 관심 대상의 산물은 숙주 세포를 파열시킴으로써 수득될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 발현, 예를 들어 배양 배지로 분비될 수 있고, 그로부터 수득될 수 있다. 또한, 각각의 방법의 조합이 가능하다. 한 실시양태에 따르면, 상기 숙주 세포는 혈청-무함유 조건 하에 배양된다.

그로 인해 산물, 특히 폴리펩티드는 고수율로 효율적으로 생산되고 수득/단리될 수 있다. 수득된 산물은 또한 추가의 가공 단계, 예컨대 예를 들어 정제 및/또는 변형 단계에 적용될 수 있다. 따라서, 관심 대상의 산물을 생산하는 방법은 하기 단계 중 적어도 하나를 포함할 수 있다:

- 상기 세포 배양 배지로부터 및/또는 상기 숙주 세포로부터 관심 대상의 산물을 단리하는 단계; 및/또는

- 단리된 관심 대상의 산물을 가공하는 단계.

본 발명에 따라 생산된 관심 대상의 산물, 예를 들어 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해 회수되고, 임의로 추가로 가공, 예를 들어 추가로 정제, 단리 및/또는 변형될 수 있다. 예를 들어, 산물은 원심분리, 여과, 한외-여과, 추출 또는 침전을 비롯한 (이에 제한되지 않음) 통상적인 절차에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다. 정제는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱, 및 크기 배제), 전기영동 절차 (예를 들어, 정제용 등전점 포커싱), 차등적 용해도 (예를 들어, 황산암모늄 침전) 또는 추출을 비롯한 (이에 제한되지 않음) 당업계에 공지된 다양한 절차에 의해 수행될 수 있다.

관심 대상의 산물은 전사, 번역 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 유전자 정보의 임의의 다른 발현 사건에 의해 생산될 수 있는 임의의 생물학적 산물일 수 있다. 이러한 점에서, 산물은 발현 산물일 것이다. 관심 대상의 산물은 폴리펩티드, 핵산, 특히 RNA 또는 DNA로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 산물은 제약상 또는 치료학적으로 활성인 화합물, 또는 검정 등에 사용될 연구용 도구일 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 산물은 폴리펩티드, 바람직하게는 제약상 또는 치료학적으로 활성인 폴리펩티드, 또는 진단 또는 다른 검정 등에 사용될 연구용 도구이다. 폴리펩티드는 따라서 임의의 특정 단백질 또는 단백질 군으로 제한되지 않으며, 그 반대로 본원에 기재된 방법에 의해 선택 및/또는 발현하기를 원하는, 임의의 크기, 기능 또는 기원의 임의의 단백질일 수 있다. 따라서, 몇몇 상이한 관심 대상의 폴리펩티드가 발현/생산될 수 있다. 상기 개괄된 바와 같이, 용어 폴리펩티드는, 예를 들어 생물활성 폴리펩티드, 예컨대 효소 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 프로테아제, 키나제, 포스파타제), 수용체 단백질 또는 펩티드, 수송체 단백질 또는 펩티드, 살균 및/또는 내독소-결합 단백질, 구조 단백질 또는 펩티드, 면역 폴리펩티드, 독소, 항생제, 호르몬, 성장 인자, 백신 등을 비롯하여, 임의의 활성 또는 생물활성의 단백질 및/또는 펩티드를 포함한다. 상기 폴리펩티드는 펩티드 호르몬, 인터류킨, 조직 플라스미노겐 활성화제, 시토카인, 이뮤노글로불린, 특히 항체 또는 그의 기능적 항체 단편 또는 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 가장 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 분자 또는 항체, 또는 그의 기능적 단편, 예를 들어 키메라, 또는 부분적으로 또는 전체적으로 인간화된 항체이다. 이러한 항체는 진단용 항체, 또는 제약상 또는 치료학적으로 활성인 항체일 수 있다.

또한, 상기 및 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득되는 산물이 제공된다. 상기 산물은 바람직하게는 폴리펩티드, 특히 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 기능적 단편이다.

한 실시양태에 따르면, 본 발명은 또한 한계 농도의 폴레이트 및 1종 이상의 DHFR 억제제를 포함하는 선택 배양 배지를 제공한다. 바람직하게는, 상기 선택 배양 배지는 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다:

(a) 이것은

(aa) 500 nM 이하;

(bb) 250 nM 이하;

(cc) 150 nM 이하;

(dd) 100 nM 이하;

(ee) 75 nM 이하;

(ff) 50 nM 이하;

(gg) 25 nM 이하; 및/또는

(hh) 15 nM 이하

로부터 선택된 농도의 폴레이트, 바람직하게는 폴산을 포함하고/거나;

(b) 이것은

(aa) 0.1 nM 내지 500 nM;

(bb) 0.1 nM 내지 250 nM, 바람직하게는 2.5 nM 내지 250 nM, 또는 5 또는 10 nM 내지 250 nM;

(cc) 0.1 nM 내지 150 nM, 바람직하게는 2.5 nM 내지 150 nM, 또는 5 또는 10 nM 내지 150 nM;

(dd) 1 nM 내지 100 nM, 바람직하게는 2.5 nM 내지 100 nM, 또는 5 또는 10 nM 내지 100 nM;

(ee) 1 nM 내지 75 nM, 바람직하게는 2.5 nM 내지 75 nM, 또는 5 또는 10 nM 내지 75 nM;

(ff) 1 nM 내지 50 nM;

(gg) 2.5 nM 내지 50 nM; 및/또는

(hh) 12.5 nM 내지 50 nM

로부터 선택된 농도 범위의 폴레이트 바람직하게는 폴산을 포함하고/거나;

(c) 이것은

(aa) 500 nM 이하;

(bb) 400 nM 이하;

(cc) 300 nM 이하;

(dd) 250 nM 이하;

(ee) 200 nM 이하;

(ff) 150 nM 이하; 및/또는

(gg) 100 nM 이하

로부터 선택된 농도의, 바람직하게는 항폴레이트제인 DHFR 억제제를 포함하고/거나;

(d) 이것은

(aa) 1 nM 내지 500 nM;

(bb) 10 nM 내지 200 nM;

(cc) 10 nM 내지 150 nM; 및/또는

(dd) 10 nM 내지 100 nM

로부터 선택된 농도의, 바람직하게는 항폴레이트제, 및 보다 바람직하게는 MTX인 DHFR 억제제를 포함한다.

폴레이트 및 DHFR 억제제의 제시된 농도 및 농도 범위는 서로 조합될 수 있다. 농도 범위의 장점 및 추가의 바람직한 실시양태, 및 선택 배양 배지 중의 폴레이트 및 항폴레이트제를 위한 적합한 실시양태가, 본 발명에 따른 선택 방법과 관련하여 상기 상세히 개괄되어 있고; 이것은 상기 개시내용에 인용된다. 상기 선택 배양 배지는 본 발명의 선택 시스템과 함께 사용될 수 있다.

본원에 언급된 텍스트 및 문서의 전문이 본원에 참조로 포함되고, 따라서 본 개시내용의 일부를 형성한다.

하기 실시예는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서 본 발명을 예시하는 역할을 한다. 특히, 본 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태에 관한 것이다.

실시예

일반적으로, 적합한 물질, 예컨대 시약은 당업자에게 익숙하고, 시판되며, 제조업체의 설명서에 따라 사용될 수 있다. 본 실시예를 기재된 바와 같이 수행하였다.

CHO 세포에서의 형질감염 실험을, 관심 대상의 산물로서의 모노클로날 항체를 발현시키기 위한 발현 카세트를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 수행하였다. 선택 마커로서, G418 내성 유전자 (NEO) 및 DHFR 유전자를 분리된 발현 카세트의 발현 벡터 상에서 발현시켰다. 상기 실험은 낮은 폴산 농도 하에 감소된 MTX 양을 이용한 선택이 고생산 세포 집단을 생성하였음을 입증하였다. 기준으로서, 더 높은 MTX 농도 및 비제한적인 양의 폴산을 사용하는, DHFR을 위한 표준 선택 조건을 사용하였다.

실시예 I - DHFR, 및 폴산의 한계 농도

1.1. 발현 벡터

발현 벡터는, 발현 벡터 상에 동일한 방향(orientation)으로 배열되는 하기 결정적인 요소를 포함하는 포유동물 발현 벡터이다:

1.2. CHO-세포의 형질감염 및 선택

세포 배양, 형질감염 및 스크리닝을, FCS 없이 CHO 세포에 적절한 배양 배지 중에서 성장하는 CHO 세포의 현탁액을 사용하여 진탕 플라스크에서 수행하였다. 세포를 전기천공에 의해 발현 벡터로 형질감염시켰다. 숙주 세포에서 세포내 폴산 저장소를 감소시키고 사전-배양 배지로부터 선택 배지로의 폴산의 동시-이동을 방지하기 위해, 형질감염 및 선택 전에 폴산 무함유 배지 또는 감소된 폴산 함량 (예를 들어, 50 nM)을 갖는 폴산 배지로 세포를 통과시켰다. 세포 생존율에 따라, 형질감염 24 내지 48시간 후에 G418 및 MTX 함유 선택 배양 배지를 세포에 첨가하여 제1 선택 단계를 시작하였다. 제1 선택 단계에서, 3가지 상이한 MTX (2.5, 5 및 10 nM) 및 폴산 농도 (12.5, 25 및 50 nM)를 시험하였다. 기준으로서, 비제한적인 양의 폴산 (여기서는 11.3 μM - 이는 배양 배지 중의 표준 농도에 상응함)을 포함하는 배양 배지를 사용하였다.

세포가 80％ 초과의 생존율로 복구되자마자, 제1 선택 단계에서와 동일한 양의 폴산, 반면에 10배만큼 많은 MTX (즉, 25, 50 및 100 nM)를 함유하는 G418 무함유 배지로 세포를 통과시켜 제2 선택 단계를 적용시켰다. 기준 배양 조건의 경우에는, 500 nM MTX를 세포에 첨가하였다.

1.3. 풀 생산성의 측정

선택된 세포 집단의 생산성을, G418 없이 비제한적인 양의 폴산 (11.3 μM)을 함유하지만 각각의 선택 배지에서와 동일한 농도의 MTX를 함유하는 배지 중에서 과다성장시킨 진탕 플라스크 회분식 배양물을 통해, 제1 및 최종 선택 단계 후에 분석하였다.

회분식 배양물을 50 ml 작업 부피로 250 mL 용량을 갖는 진탕 플라스크에 시딩하고, 진탕기 캐비넷 (습윤화되지 않음)에서 150 rpm 및 10％ CO₂ 하에 배양하였다. 세포의 생존율은 검정을 시작할 때 >90％여야 한다. 시딩 세포 밀도는 통상적으로 약 2x10⁵ c/ml였다. 역가 측정을 제13일에 수행하였다. 세포 배양 상청액의 항체가를 배양을 시작한지 13일 후에 단백질-A HPLC에 의해 측정하였다.

1.4. 결과

한계 폴산 농도 하에 dhfr/MTX 선택의 엄격도를 평가하기 위해, 모노클로날 항체를 발현하는 DHFR 벡터의 형질감염을 본 실시예 I에서 수행하였다. 벡터는 또한 G418 내성 유전자를 함유하였다 (상기 참조). 우선, 다양한 폴산 농도에서 G418 및 다양한 농도의 MTX를 첨가함으로써 형질감염된 세포 집단을 선택하였다. 상기 초기 제1 선택 단계는 형질감염되지 않은 세포를 사멸시키는 것을 도와야 하고, 동시에 제2 선택 단계에서 더 높은 엄격도를 적용시키기 전에 세포내 폴산 저장소를 소모하도록 강요하여야 한다. 이들 조건 하에서, 통상적으로 모든 형질감염된 세포 집단이 복구되었고, 생산성을 상기 기재된 바와 같이 평가하였다.

표 1은 얻은 생산성 결과를 요약한다:

<표 1>

다양한 폴산 농도를 갖는 G418 및 MTX 함유 배지 중에서 선택된 형질감염된 세포를 진탕 플라스크 회분식 배양물에서 분석하였다. 배양 제13일에, 배양 배지의 샘플을 취하고, 단백질-A HPLC에 의해 항체 함량에 대해 분석하였다.

결과는 모든 세포 집단이 항체를 생산하였음을 보여주었다. 10 nM 미만의 MTX 첨가는 심지어 낮은 폴산 농도에서도 세포에 대해 많은 효과를 나타내지 않았다. 생산된 항체의 농도는 MTX의 부재 하에서의 선택과 비교할 만했다. 그러나, 제1 선택 단계에서 10 nM MTX를 사용한 경우에, 낮은 폴산 농도에서 세포의 생산성은 유의하게, 및 농도 의존적인 식으로 증가하였다. 가장 낮은 폴산 농도 (12.5 nM) 및 10 nM MTX로 선택한 후, 세포의 생산성은 표준 폴산 농도를 갖는 배지에 비해 10배를 초과하여 더 높은 것으로 밝혀졌다.

선택 엄격도를 추가로 증가시키기 위해, 다음 단계는 제1 선택 단계에서 사용된 폴산 농도를 유지하면서, G418을 제거하고, 반면에 배양 배지 중의 MTX 농도는 10배 증가시키는 것이다. 기준의 경우에는, MTX를 선행 기술에서 통상적인 높은 농도, 여기서는 500 nM로 첨가하였다. 이들 조건 하에, 수많은 형질감염된 집단의 세포 생존율은 이들 모두가 복구되지는 못할 만큼 극적으로 하락하고 낮은 수준에 머물렀다. 복구될 수 있었던 세포 집단은 추가로 증량시키고, 생산성을 분석하였다 (표 2).

<표 2>

G418 및 MTX 선택된 세포 집단을, MTX 농도를 증가시킴으로써 추가로 선택하였다. 복구된 집단을 진탕 플라스크 회분식 배양물에서 분석하였다. 배양 제13일에, 배양 배지의 샘플을 취하고, 단백질-A HPLC에 의해 항체 함량에 대해 분석하였다.

상기 선택 단계 후에 기준 세포 집단 (500 nM MTX, 11.3 μM FA)의 생산성은 대략 25 내지 30 mg/L로 증가하였다. 100 nM 미만의 MTX 농도에서는 어떠한 이득도 보이지 않았다. 그러나, 낮은 폴산 함량 (12.5 또는 25 nM)과 함께 100 nM MTX를 사용한 경우에, 심지어 증폭/선택을 위해 낮은 MTX 농도를 사용했음에도 불구하고 생산성은 277 mg/L로, 및 따라서 기준보다 10배 더 높아졌다.

따라서, 선택 배지 중 한계 폴산 농도와 함께 선택 마커로서 DHFR을 사용하는 것은, 심지어 낮은 DHFR 억제제 농도에서도 관심 대상의 단백질을 고도로 과다발현하는 세포를 생성하였다. 결과는 또한 상기 조합이 통상적인 선택 시스템 (예를 들어, 선택 배지 중 표준 폴산 농도를 이용하는 DHFR/G418)에 비해 월등함을 보여주었다.

실시예 II - 형질감염된 CHO 세포를 사용한 폴리펩티드의 대규모 생산

폴리펩티드의 대규모 생산은, 예를 들어 웨이브(wave), 유리 또는 스테인리스 스틸 생물반응기에서 수행할 수 있었다. 상기 목적을 위해 세포를 통상적으로 단일 냉동 바이알, 예를 들어 마스터 세포 은행(Master Cell Bank)으로부터의 바이알로부터 출발하여 증량시켰다. 세포를 해동시키고 여러 단계를 통해 증량시켰다. 상이한 규모의 생물반응기에 적절한 양의 세포를 접종시켰다. 세포 밀도는 생물반응기에 공급액 및 첨가제를 첨가함으로써 증가시킬 수 있었다. 세포는 장시간 동안 높은 생존율로 유지되었다. 1 리터당 수백 밀리그램 내지 1 리터당 수 그램 범위의 반응기 내의 산물 농도가 대규모로 달성되었다. 친화성, 이온 교환, 소수성 상호작용 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있는, 표준 크로마토그래피 방법에 의해 정제를 수행할 수 있었다. 생물반응기의 크기는 최종 규모로 수천 리터의 부피까지 가능하다 (또한 예를 들어, 문헌 [F. Wurm, Nature Biotechnology Vol. 22, 11, 2004, 1393-1398] 참조).

Claims

적어도
(a) 세포 생존율이 폴레이트 흡수에 의존적이고, 적어도
(i) 관심 대상의 산물을 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드, 및
(ii) DHFR 효소를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 다수의 진핵 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b) 적어도 DHFR의 억제제 및 한계 농도의 폴레이트를 포함하는 선택 배양 배지 중에서 상기 다수의 진핵 숙주 세포를 배양하는 단계;
(c) 관심 대상의 산물을 발현하는 하나 이상의 진핵 숙주 세포를 선택하는 단계
를 포함하는, 관심 대상의 산물을 발현하는 하나 이상의 진핵 숙주 세포를 선택하는 방법.
제1항에 있어서, 선택 배양 배지가 500 nM 이하의 농도의 DHFR 억제제 및 500 nM 이하의 농도의 폴레이트를 포함하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 선택 배양 배지가 200 nM 이하의 농도의 DHFR 억제제 또는 2.5 nM 내지 100 nM 농도의 폴레이트, 또는 이들 둘 다를 포함하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 선택 배양 배지가 폴레이트로서 12.5 nM 내지 50 nM 농도의 폴산을, DHFR 억제제로서 10 nM 내지 100 nM 농도의 MTX와 조합하여 포함하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, DHFR 효소가 숙주 세포에 의해 내생적으로 발현된 DHFR 효소보다 DHFR 억제제에 대해 더 낮은 민감성을 갖는 DHFR 효소인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 진핵 숙주 세포가 CHO 숙주 세포인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, DHFR ⁺ (플러스) 숙주 세포를, 숙주 세포에 의해 내생적으로 발현된 DHFR 효소보다 MTX에 덜 민감성인 도입된 DHFR 효소와 함께 사용하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 DHFR 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 발현 벡터에 의해 도입시키는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 숙주 세포가 관심 대상의 산물을 코딩하는 2종 이상의 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 관심 대상의 산물을 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드 및 DHFR 효소를 코딩하는 도입된 폴리뉴클레오티드가 상이한 발현 카세트에 포함되며, 관심 대상의 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 추진하기 위한 발현 카세트가 DHFR 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 추진하기 위한 발현 카세트보다 더 강한 프로모터 또는 인핸서, 또는 이들 둘 다를 포함하는 것인 방법.
적어도
(a) 관심 대상의 산물을 발현하는 하나 이상의 진핵 숙주 세포를 선택하기 위해 제1항 또는 제2항에 따른 선택 방법을 수행하는 단계; 및
(b) 하나 이상의 선택된 진핵 숙주 세포를 관심 대상의 산물의 발현을 가능케 하는 조건 하에 배양하는 단계
를 포함하는, 관심 대상의 산물을 생산하는 방법.
제11항에 있어서,
(c) 상기 세포 배양 배지 또는 상기 진핵 숙주 세포, 또는 이들 둘 다로부터 관심 대상의 산물을 단리하는 단계; 및
(d) 관심 대상의 단리된 산물을 추가로 가공하는 단계
중 적어도 하나를 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 관심 대상의 산물이 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 기능적 단편인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 500 nM 이하의 농도의 DHFR 억제제 및 500 nM 이하의 한계 농도의 폴레이트를 포함하는 선택 배양 배지를 사용하는 방법.
제14항에 있어서, 선택 배양 배지가 하기 특성 중 하나 이상을 갖는 것인 방법:
a) 2.5 nM 내지 100 nM의 한계 농도의 폴레이트 또는 200 nM 이하의 농도의 DHFR 억제제, 또는 이들 둘 다를 포함하고;
b) 12.5 nM 내지 50 nM 농도의 폴산을 10 nM 내지 100 nM 농도의 MTX와 조합하여 포함함.
제6항에 있어서, CHO 숙주 세포가 DHFR ⁺ (플러스) 세포인 방법.
제9항에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 이뮤노글로불린 분자의 중쇄를 코딩하고 다른 폴리뉴클레오티드가 이뮤노글로불린 분자의 경쇄를 코딩하는 것인 방법.