CN102333875A - 选择表达异源蛋白质的真核细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于选择至少一个表达目的产物的真核宿主细胞的方法，其包括：(a)提供多个真核宿主细胞，其中该宿主细胞的细胞生存取决于叶酸盐摄取，其中该真核宿主细胞至少包含：(i)编码目的产物的外源多核苷酸；和(ii)编码DHFR酶的外源多核苷酸；(b)在至少包含DHFR的抑制剂和限制浓度的叶酸盐的选择性培养基中培养该多个真核宿主细胞；和(c)选择至少一个表达该目的产物的真核宿主细胞。本发明还提供用于表达目的产物的方法，其基于通过该方法选择的宿主细胞和细胞培养基。

Description

选择表达异源蛋白质的真核细胞的方法
技术领域
本发明涉及选择表达目的产物的真核宿主细胞，尤其是哺乳动物宿主细胞的新方法。此外，本发明涉及用于以高产量有效产生目的产物的方法。
背景技术
大量克隆和表达目的产物如重组肽的能力变得越来越重要。纯化高水平的蛋白质的能力在人用药物和生物技术领域很重要，例如用于产生蛋白质药物，以及在基础研究的背景中，例如用于结晶蛋白质，以允许测定它们的三维结构。可以在宿主细胞中过量表达和随后分离和纯化难于以其他方式批量获得的蛋白质。
用于产生重组蛋白质的表达系统的选择取决于许多因素，其包含细胞生长特征、表达水平、胞内和胞外表达、目的蛋白质的翻译后修饰和生物学活性、以及治疗性蛋白质产生中的监管问题和经济考虑。哺乳动物细胞超越其他表达系统如细菌或酵母的关键优势是进行正确的蛋白质折叠、复杂的N-联糖基化和真正的O-联糖基化，以及广谱的其他翻译后修饰的能力。由于所述优势，真核细胞，尤其是哺乳动物细胞是目前选择用于产生复杂的治疗性蛋白质如单克隆抗体的表达系统。
最常见的获得高表达宿主细胞(也称为高产者)的方法以产生用于表达目的产物的适当的表达载体作为第一步。表达载体驱动编码目的产物的多核苷酸在宿主细胞中表达，并提供至少一个用于产生重组细胞系的选择性标记。哺乳动物表达载体的关键元件通常包含具有强健转录活性的组成型或诱导型启动子；通常包含Kozak序列的优化的mRNA加工和翻译信号、翻译终止密码子、mRNA切割和加A信号、转录终止子及用于制备稳定细胞系和用于基因扩增的选择性标记；此外，表达载体可以提供用于载体在细菌中增殖的原核复制起点和选择性标记。
近年来，研发的焦点集中在用于宿主细胞中的基因表达的改进的载体的设计上。尽管有许多可用的载体，但以高产量在哺乳动物细胞中强健地产生多肽/蛋白质仍具有挑战性。
一种已建立的用于获得以高产量表达目的产物的高产细胞系的方法是宿主细胞的稳定转染。但是，稳定掺入基因组中是罕见事件，且只有小部分稳定转染细胞是高产者。因此，它们的选择具有挑战性。
选择性标记和选择系统广泛用于遗传工程、重组DNA技术和重组产物的产生，以获得以高产量表达目的产物的宿主细胞。各个系统还用于产生和鉴定稳定转染的克隆。使用各个选择性标记和选择系统的主要目的是引入选择性基因，通过暴露于选择性生长条件，该选择性基因允许鉴定能够高水平产生所引入的选择性标记，并因此高水平产生目的产物的细胞。将例如缺乏酶，如二氢叶酸还原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)的细胞系与包含编码这些选择性标记酶的基因的表达载体及诸如氨甲蝶呤(MTX，其抑制DHFR)和甲硫氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoxamine，MSX，其抑制GS)的药剂结合使用，可以例如通过基因扩增来达到提高产物表达的产量。
现有技术中常用的一种突出的选择系统是二氢叶酸还原酶/MTX选择系统。二氢叶酸还原酶(DHFR)催化二氢叶酸至四氢叶酸(THF)的NADP依赖性还原。然后THF内转化为分别用于嘌呤和胸苷酸从头生物合成的10-甲酰基-DHF和5，10-亚甲基-DHF。DHFR是催化dUMP在5，10-亚甲基-DHF依赖性反应中转化为dTMP的胸苷酸合酶(TS)的催化活性的副产物。因此，DHFR对DNA复制所需嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成必需的THF辅因子的回收至关重要。因此，缺乏DHFR基因(即通过定向基因组缺失)的细胞(例如CHO细胞)可用作受体来在无核苷酸的培养基中转染DHFR基因。转染后，使细胞接受浓度逐渐增加的抗叶酸盐剂(antifolate)MTX(最有效的DHFR抑制剂(Kd＝1pM))，从而迫使细胞产生提高水平的DHFR。多轮选择后，选择性标记DHFR常经历显著的扩增。还可以将各个选择性标记的更敏感的突变体形式与野生型宿主细胞结合使用。备选地，已将对MTX具有主要抗性(即较低敏感性)的突变体小鼠DHFR或DHFR的其他突变体形式广泛用作显性选择性标记，其在转染细胞中明显增强高水平MTX抗性的获得。但是，现有技术中使用的DHFR/MTX选择系统的主要劣势是：此技术利用尤其是在高浓度下改变受体细胞基因型的致突变毒性剂MTX。这常产生MTX抗性细胞群体，其中由于例如还原叶酸盐载体(RFC)中的功能突变的丧失/或RFC基因表达的丧失(二者都消除MTX摄取)而不存在目的靶基因的表达。但是，为了达到足够严格的选择条件来分离以足够的产量产生目的产物的宿主细胞，需要提高浓度的/高浓度的MTX。
显而易见，高严格性选择系统对从转染群体富集高产细胞至关重要。选择系统的严格性越高，选择过程后低产者的数目越少，而在转染细胞群体中发现非常罕见的超高产克隆的可能性越高。
因此，本发明的目的是提供用于选择以高产量产生目的产物的宿主细胞的严格选择系统，以及用于以足够的产量产生目的产物的方法。具体而言，本发明的目的是提供需要更少量的毒性剂，尤其是MTX的严格选择系统。此外，本发明的目的是提供用于以高产量产生目的产物的方法。
发明概述
本发明涉及用于选择以高产量表达目的产物的宿主细胞的选择系统，以及涉及各个产物，尤其是多肽，如抗体的产生。
根据一方面，本发明涉及用于选择至少一个表达目的产物的真核宿主细胞的方法，该方法至少包括以下步骤：
(a)提供多个真核宿主细胞，其中该宿主细胞的细胞生存取决于叶酸盐摄取，其中该真核宿主细胞至少包含：
(i)引入的编码目的产物的多核苷酸；和
(ii)引入的编码DHFR酶的多核苷酸；
(b)在至少包含DHFR的抑制剂和限制浓度的叶酸盐的选择性培养基中培养该多个真核宿主细胞；
(c)选择至少一个表达该目的产物的真核宿主细胞。
本发明还涉及用于产生目的产物的方法，其包括在允许表达该目的产物的条件下培养按照本发明选择的宿主细胞。
还提供选择性培养基，其至少包含DHFR的抑制剂和限制浓度的叶酸盐，其可以用于本发明的选择方法中。“选择性培养基”是用于选择宿主细胞的细胞培养基。
对本领域技术人员而言，本申请的其他目的、特征、优势和方面将从以下描述和所附权利要求变得显而易见。但是，应理解，虽然指出了本申请的优选实施方案，但以下描述、所附权利要求和具体的实施例仅以说明的方式给出。对本领域技术人员而言，所公开的发明的精神和范围内的多种改变和修改将从对以下的阅读变得显而易见。
发明详述
本发明涉及用DHFR作为选择性标记的选择系统，其需要更低浓度的毒性剂，如抗叶酸盐剂MTX，但仍提供足以鉴定高产宿主细胞的严格选择条件。
根据本发明的一方面，提供用于选择至少一个表达目的产物的真核宿主细胞的方法，该方法至少包括以下步骤：
(a)提供多个真核宿主细胞，其中该宿主细胞的细胞生存取决于叶酸盐摄取，其中该真核宿主细胞至少包含：
(i)引入的编码目的产物的多核苷酸；和
(ii)引入的编码DHFR酶的多核苷酸；
(b)在至少包含DHFR的抑制剂和限制浓度的叶酸盐的选择性培养基中培养该多个真核宿主细胞；
(c)选择至少一个表达目的产物的真核宿主细胞。
“多核苷酸”是通常从一个脱氧核糖或核糖连接至另一个脱氧核糖或核糖的核苷酸的聚合物，且取决于背景，其指DNA以及RNA。术语“多核苷酸”不包含任意大小限制，且还包含含有修饰，尤其是修饰的核苷酸的多核苷酸。
“目的产物”指待从该宿主细胞表达的产物。目的产物可以是例如多肽或多核苷酸，如RNA。优选地，目的产物是多肽，尤其是免疫球蛋白分子。下文详细描述了目的产物的其他实例。
“引入的多核苷酸”指已例如通过使用诸如转染的重组技术引入宿主细胞中的多核苷酸序列。宿主细胞可以包含或不包含各自对应于与所引入的多核苷酸相同的多核苷酸的内源性多肽。可以例如通过转染可以掺入宿主细胞的基因组中(稳定转染)的适宜载体来实现引入。下文详细描述了允许将多核苷酸引入宿主细胞中的适宜的表达载体。在异源核酸未插入基因组中的情况下，异源核酸可以在随后的阶段，例如在细胞进行有丝分裂时丢失(瞬时转染)。适宜的载体还可以例如通过附加型复制保持在宿主细胞中而不掺入基因组中。但是，现有技术中还已知用于将多核苷酸引入宿主细胞中的其他技术，下文对其进行进一步详述。
“DHFR抑制剂”是抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)活性的化合物。各个抑制剂可以例如与DHFR底物竞争结合DHFR。适宜的DHFR抑制剂是例如抗叶酸盐剂，如氨甲蝶呤(MTX)。其他实例包括但不限于三甲曲沙葡萄糖醛酸酯(trimetrexate glucuronate)(neutrexine)、三甲氧苄二氨嘧啶、乙胺嘧啶(pyrimethamine)和培美曲塞(pemetrexed)。
本文中使用的术语“选择”尤其指用选择性标记和选择性培养条件来选择，并因此获得已掺入本发明的载体或载体组合的宿主细胞的方法。因此，可以从转染宿主细胞的群体分离和/或富集成功转染的宿主细胞。
与已成功掺入本发明的载体或载体组合的宿主细胞相比，未成功掺入本发明的载体或载体组合的宿主细胞优选在选择性培养条件下死亡或生长受损。选择期间，可以从转染宿主细胞的群体将已成功掺入本发明的载体或载体组合的宿主细胞富集为库(pool)。还可以在选择期间从转染宿主细胞的群体分离单个宿主细胞(例如通过克隆选择)。为了获得成功转染的宿主细胞的选择方法的适宜实施方案(例如通过FACS分选或有限稀释)为本领域公知，因此无需详述。
“叶酸盐的限制浓度”指选择性培养基中叶酸盐的浓度，其对宿主细胞提供选择压力。因此，叶酸盐并不大量包含在选择性培养基中，从而对宿主细胞提供选择压力。宿主细胞能够摄入和加工以限制浓度包含于选择性培养基中的叶酸盐。宿主细胞不能加工的叶酸盐且尤其是叶酸盐的衍生物不能构成选择压力，并因此不能构成限制浓度。下文描述了适宜的浓度范围。
“多肽”指包含通过肽键连接在一起的氨基酸的聚合物的分子。多肽包含任意长度的多肽，包含蛋白质(例如具有超过50个氨基酸)和肽(例如具有2-49个氨基酸)。多肽包含任意活性或生物活性的蛋白质和/或肽。下文概述了适宜的实例。
令人惊奇地发现，用于提供能够产生目的产物的重组真核细胞的选择系统可以基于选择性培养基中叶酸盐的有限的可用性，连同DHFR作为选择性标记的使用。该系统广泛应用，即应用于细胞生存取决于叶酸盐的摄取的真核宿主细胞。如上文所述，现有技术必须使用稍高的抗叶酸盐剂/MTX浓度来达到足够的选择压力进行基因扩增，并从而达到目的产物的产生的增加。这是劣势，因为抗叶酸盐剂如MTX具有毒性并可以在遗传上改变宿主细胞。本发明的方法基于DHFR选择性标记与选择性培养基中叶酸盐的限制浓度的组合使用，其具有这样的优势：即使在低DHFR抑制剂浓度下，选择严格性也显著提高。因此，使用本发明的选择系统时，即使在按低浓度将DHFR抑制剂(例如MTX)用于选择性培养基中时也获得高产者。因此，与用于提供允许鉴定高产细胞克隆的严格选择条件的现有技术的方法相比，在使用本发明的教导时，需要更少的DHFR抑制剂，并因此具有更低的毒性剂浓度。由于其独特设计，提供了非常严格的选择系统，其允许从转染宿主细胞群体富集高产细胞。本发明的选择系统的此高严格性降低了在群体中选择后群体中低产者的数目，提高了发现非常罕见的超高产克隆的可能性。
选择性培养基可以包含一种或多种类型的叶酸盐。本发明的叶酸盐(folate)可以是例如氧化叶酸盐(即叶酸(folic acid))或还原叶酸盐或其衍生物。一般而言，叶酸盐可以用于本发明内，只要能够优选通过功能性膜结合叶酸盐受体将这种叶酸盐摄入真核细胞中。氧化叶酸盐(即叶酸)以及叶酸的还原衍生物(称为还原叶酸盐或四氢叶酸盐(THF))是一组B-9维生素，其是真核细胞，尤其是哺乳动物细胞中嘌呤、胸苷酸和某些氨基酸的生物合成必需的辅因子和/或辅酶。THF辅因子对于DNA复制尤其重要，由此对于细胞增殖尤其重要。THF辅因子在一系列涉及嘌呤、胸苷酸和氨基酸的从头生物合成以及甲基代谢(包含DNA的CpG岛甲基化)的互连代谢途径中作为一碳单位发挥作用。THF辅因子包含10-甲酰基-THF(10-CHO-THF)，其在涉及嘌呤从头生物合成的两个关键的从头甲酰基转移酶反应中贡献一碳单位。氧化叶酸盐的优选的实例是叶酸。还原叶酸盐的优选的实例是5-甲基-四氢叶酸盐、5-甲酰基-四氢叶酸盐、10-甲酰基-四氢叶酸盐和5，10-亚甲基-四氢叶酸盐。
选择性培养基中叶酸盐的浓度尤其取决于所使用的真核宿主细胞。500nM或更低、250nM或更低、150nM或更低、100nM或更低、75nM或更低、50nM或更低、25nM或更低、15nM或更低、或甚至10nM或更低，如7，5nM或更低的叶酸盐浓度是适宜的。适宜的范围包含0.1nM-500nM、0.1nM-250nM、5或10nM-250nM、优选1nM-150nM、5或10nM-150nM、1nM-100nM、5或10nM-100nM和更优选1nM-50nM、2.5nM-50nM、10nM-50nM或12.5nM-50nM。在用叶酸作为叶酸盐时，这些范围尤其适宜。
从本发明的意义上说，各浓度是有限的，因此适于对宿主细胞提供选择压力。浓度越低，所施加的选择压力越强，只要细胞仍然是活的。所述浓度范围尤其适合于用CHO细胞作为宿主细胞。
用于选择性培养基中的DHFR抑制剂的浓度也取决于所使用的真核宿主细胞。在假定选择性培养基中DHFR抑制剂的浓度降低的情况下，500nM或更低、400nM或更低、300nM或更低、250nM或更低、200nM或更低、150nM或更低的DHFR抑制剂浓度是有利的。但是，优选地，选择性培养基包含至少10nM的DHFR抑制剂。优选的抗叶酸盐剂(优选MTX)浓度是1nM-500nM、优选10nM-200nM、10nM-150nM和更优选10nM-100nM。选择性培养基中的各浓度尤其适合用于CHO细胞。
上文所述的叶酸盐和抗叶酸盐剂的优选的浓度和浓度范围可以彼此组合。根据一个实施方案，使用选择性培养基，其包含200nM或更低、优选150nM或更低、优选100nM或更低的DHFR抑制剂的浓度，优选MTX的浓度；少于100nM、优选少于75nM的叶酸盐的浓度，优选叶酸的浓度。在一个实施方案中，将12.5nM-50nM的叶酸盐浓度与10nM-100nM的抗叶酸盐剂浓度组合使用。优选地，用叶酸和MTX作为叶酸盐和抗叶酸盐剂。
叶酸和MTX的适宜浓度可以彼此依赖；优选的组合是2.5nM-75nM、2.5nM-50nM或12.5nM-50nM的叶酸浓度与10nM-500nM、优选10nM-100nM的MTX浓度组合。在使用DHFR+(正)细胞时，尤其优选这些浓度。
上述浓度尤其适合用于快速生长的悬浮细胞，其是商业产生细胞系的优选表型。但是，不同细胞系可以具有不同的叶酸消耗特性。此外，限制性/选择性浓度可以取决于所使用的叶酸盐、各自的抗叶酸盐剂而不同。因此，对于不同细胞系，叶酸盐(尤其是叶酸)和抗叶酸盐剂(尤其是MTX)的限制浓度以及叶酸与MTX的适宜比例可以不同。但是，技术人员可以通过实验容易地测定适宜的浓度。
根据一个实施方案，在转染和/或选择之前，在无叶酸盐的培养基中或在包含限制浓度的叶酸盐的培养基中预培养宿主细胞。上文描述了叶酸盐的适宜的限制浓度。优选地，用于预培养宿主细胞的该培养基以50nM或更低的浓度包含叶酸盐，尤其是叶酸。
掺入的选择性标记DHFR的表达为宿主细胞提供了选择性培养条件下的选择优势。例如，缺乏DHFR基因(例如通过定向基因组缺失，也称为DHFR-宿主细胞)的宿主细胞(例如CHO细胞)可以用作受体，用于在无核苷酸的培养基中转染DHFR基因作为选择性标记基因。但是，如果使用适当的选择性培养条件，则在进行DHFR选择时，还可能使用内源性表达DHFR的宿主细胞(DHFR+(正)宿主细胞)。用本发明的多核苷酸转染后，可以使细胞接受浓度逐渐提高的DHFR抑制剂。DHFR抑制剂的一个实例是抗叶酸盐剂如MTX，其是有效的DHFR抑制剂(Kd＝1pM)。抗叶酸盐剂如MTX在培养基中的存在迫使细胞产生提高水平的DHFR来存活。通过多轮选择，选择性标记DHFR常经历显著的基因扩增，以达到产生提高水平的DHFR。
现有技术中已知可以与本发明结合使用的几种适宜的DHFR基因。DHFR可以是野生型DHFR或其功能性变体或衍生物。术语“变体”或“衍生物”包含就各DHFR酶的氨基酸序列而言具有一个或多个氨基酸序列交换(例如缺失、取代或添加)的DHFR酶、包含DHFR酶或其功能性片段的融合蛋白质和已修饰来提供其他结构和/或功能的DHFR酶，以及前述的功能性片段，该片段仍然具有DHFR酶的至少一种功能。DHFR酶/变体可以用作选择性标记，其比野生型DHFR酶对MTX更敏感或更不敏感。根据一个实施方案，所使用的DHFR酶比对应的野生型DHFR酶和/或由宿主细胞内源表达(如果表达)的DHFR酶对抗叶酸盐剂如MTX更敏感。DHFR酶可以源自任意物种，只要它在本发明内是有功能的，即与所利用的宿主细胞相容。例如，对MTX具有主要抗性的突变体小鼠DHFR已广泛用作显性选择性标记，其显著增强转染子细胞中高水平MTX抗性的获得。优选地，使用比内源表达于DHFR+(正)宿主细胞中的DHFR酶对DHFR抑制剂如MTX更不易感并因此更不敏感的DHFR酶。
根据一个实施方案，在DHFR基因可读框的3’端放置内含子或其片段。这对该构建体的表达/扩增速率具有有利作用。用于DHFR表达盒中的内含子导致DHFR基因的更小的非功能性变体(Grillari等，2001，J.Biotechnol.87，59-65)。因此，DHFR基因的表达水平降低，并因此可以进一步提高该选择系统的严格性。因此，宿主细胞可以包含引入的编码DHFR酶的多核苷酸，该多核苷酸包含定位在DHFR编码序列3’的内含子。利用内含子来降低DHFR基因的表达水平的备选方法描述于EP 0724639中，且也可以使用。
与合成其自身叶酸盐的大多数原核生物、植物和真菌不同，哺乳动物和其他真核生物物种缺乏THF辅因子生物合成，因此必须从外源来源，通常是从培养基获得它们。目前已知三个独立的转运系统在哺乳动物细胞中介导叶酸盐和抗叶酸盐剂的摄取，即还原叶酸盐载体(RFC)、质子偶联叶酸盐转运蛋白(PCFT，也称为SLC46A)和叶酸盐受体(FR)。
优选地，真核宿主细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞和植物细胞可以是叶酸盐原养型(即这类细胞可以自主合成其细胞生存(即细胞生长和增殖)必需的其自身的叶酸盐)。本发明尤其包含是叶酸盐营养缺陷型或可以成为叶酸盐营养缺陷型的这类真菌和植物细胞。这可以例如由遗传操作引起，即细胞现在不能合成其细胞生存必需的足量的叶酸盐。例如，可以例如通过适当的靶基因的基因破坏或基因沉默，或关键酶的抑制等来失活这类真菌或植物细胞例如经适当的代谢途径内源性生物合成叶酸盐的能力。优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞。该哺乳动物细胞可以选自啮齿动物细胞、人细胞和猴细胞。尤其优选的是啮齿动物细胞，其优选选自CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、小鼠3T3成纤维细胞和SP2/0细胞。最尤其优选的啮齿动物细胞是CHO细胞。还优选人细胞，优选地，其选自HEK293细胞、MCF-7细胞、PerC6细胞和HeLa细胞。其他优选的是猴细胞，优选地，其选自COS-1、COS-7细胞和Vero细胞。优选地，宿主细胞是DHFR+(正)细胞，尤其是DHFR+(正)CHO细胞。
根据一个实施方案，通过至少一个表达载体来引入编码目的产物的多核苷酸和编码DHFR酶的多核苷酸。用于引入各个载体的适宜的技术描述于下文，且包括例如转染。
本发明的“表达载体”是能够携带至少一个外源核酸片段的多核苷酸。载体像分子运载体一样，将核酸片段各自的多核苷酸递送入宿主细胞中。它包含至少一个表达盒，该表达盒包含用于正确表达掺入其中的多核苷酸的调节序列。可以将多核苷酸(例如编码目的产物或选择性标记)插入表达载体的表达盒中来从该载体表达。本发明的表达载体可以以环状或线性化形式存在。术语“表达载体”还包含允许转移外源核酸片段的人工染色体或类似的各个多核苷酸。
编码目的产物的多核苷酸和编码DHFR酶的多核苷酸可以定位在相同或不同的表达载体上。使用携带两种多核苷酸的表达载体具有仅需将一个表达载体引入宿主细胞中的优势。此外，尤其是在建立稳定表达系时，多核苷酸更有可能一起掺入基因组中，并因此以相似的产量表达。但是，使用至少两个表达载体的组合进行转染也是可能的，且在本发明的范围内，其中各个多核苷酸定位在不同的表达载体上。然后将表达载体的该组合转染入宿主细胞中。
真核宿主细胞可以包含至少一个其他引入的编码另一目的产物的多核苷酸。此实施方案尤其适合用于表达免疫球蛋白分子。根据优选的实施方案，宿主细胞包含分别编码目的产物的至少两个引入的多核苷酸，其中至少一个多核苷酸编码免疫球蛋白分子的重链或其功能性片段，而另一多核苷酸编码免疫球蛋白分子的轻链或其功能性片段。可以通过使用适当的表达载体来引入各个多核苷酸。在使用至少两个表达载体的组合的情况下，该编码免疫球蛋白分子的重链和轻链(或其功能性片段)的多核苷酸可以定位在相同或不同的表达载体上。
宿主细胞和因此用于将多核苷酸引入该宿主细胞中的表达载体可以额外地包含编码一个或多个其他选择性标记的一个或多个其他多核苷酸。因此，在本发明的一个实施方案中，可以应用将本发明的系统与一个或多个不同的选择系统(例如抗生素抗性选择系统，如neo/G418)一起利用的共选择来进一步改善性能。除允许选择真核宿主细胞的其他真核选择性标记外，还可以使用允许真核宿主细胞中的选择的原核选择性标记。各个原核选择性标记的实例是提供对诸如例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素和/或氯霉素的抗生素的抗性的标记。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的载体通常包含诸如例如启动子、增强子、加A信号、转录中止或终止信号的适于驱动转录的转录控制元件作为表达盒的元件。如果希望的产物是蛋白质，则优选适宜的转录控制元件包含于载体中，并与待表达的多核苷酸有效连接，例如，导致适合用于招募核糖体的5’帽结构的5’非翻译区和终止翻译过程的终止密码子。尤其是，可以在存在于适当的启动子中的转录元件的控制下转录作为选择性标记基因的多核苷酸以及编码目的产物的多核苷酸。产生的选择性标记基因的转录物和目的产物的转录物具有便于实质水平的蛋白质表达(即翻译)和正确的翻译终止的功能性翻译元件。能够正确驱动掺入的多核苷酸的表达的功能性表达单位在本文中也称为“表达盒”。
用于将多核苷酸引入真核宿主细胞中的本发明的表达载体或表达载体的组合可以包含至少一个启动子和/或启动子/增强子元件作为表达盒的元件。虽然这两个控制元件间的物理边界并非总是清晰，但术语“启动子”通常指RNA聚合酶和/或任意相关因子与之结合并在其上起始转录的核酸分子上的位点。增强子在时间及空间上增强启动子活性。许多启动子在广范围的细胞类型中具有转录活性。启动子可以划分为两类：组成性发挥作用的启动子和通过诱导或脱阻抑来调节的启动子。两种类型都适合用于本发明的教导。用于在哺乳动物细胞中高水平产生多肽的启动子应是强启动子，且优选在广范围的细胞类型中具有活性。
在许多细胞类型中驱动表达的强组成型启动子包括但不限于腺病毒主要晚期启动子、人巨细胞病毒即时早期启动子、SV40和劳斯肉瘤病毒启动子及鼠3-磷酸甘油酸激酶启动子EF1a。在启动子和/或增强子获自CMV和/或SV40时，用本发明的表达载体达到了良好的结果。转录启动子可以选自SV40启动子、CMV启动子、EF1α启动子、RSV启动子、BROAD3启动子、鼠rosa 26启动子、pCEFL启动子和β-肌动蛋白启动子。
优选地，编码目的产物的多核苷酸和编码DHFR酶的多核苷酸处于不同转录启动子的控制下。一般而言，能够促进必需多核苷酸在真核宿主细胞中表达，尤其是转录的启动子将是适宜的。驱动从多核苷酸表达的不同转录启动子可以是相同的或不同的。
根据一个实施方案，用比驱动编码DHFR酶和/或其他选择性标记(如果存在)的表达的启动子更强的启动子和/或增强子来驱动编码目的产物的多核苷酸的表达。此安排具有产生比选择性标记转录物多的目的产物转录物的作用。目的产物的产生显著超过选择性标记的产生是有利的，因为单个细胞产生异源产物的能力并非是无限的，因此应集中于目的产物。此外，选择过程仅发生在建立表达细胞系的起始阶段，然后其不断产生目的产物。因此，将细胞的资源集中于目的产物的表达/产生是有利的。此外，用较弱的启动子来表达选择性标记，尤其是DHFR进一步提高了选择压力，并因此允许在选择性培养基中使用较低浓度的DHFR抑制剂。
根据一个实施方案，驱动编码目的产物的多核苷酸的表达的启动子是CMV启动子，而驱动编码DHFR酶的多核苷酸的表达的启动子是SV40启动子。已知CMV启动子是可用于哺乳动物表达的最强的启动子之一，且导致非常好的表达速率。认为它比SV40启动子产生显著更多的转录物。
根据另一实施方案，编码目的产物的多核苷酸和编码DHFR酶的多核苷酸处于相同的转录启动子的控制下，并因此从一个表达盒表达。上文描述了适宜的启动子。在此实施方案中，从处于该转录启动子的控制下的各个表达盒获得一个长转录物。根据一个实施方案，将至少一个IRES元件有功能地定位在编码目的产物的多核苷酸和/或编码DHFR酶的多核苷酸之间。从而确保从该转录物获得分开的翻译产物。
表达盒可以包含适当的转录终止位点。从上游启动子连续转录通过第二转录单位可以抑制下游启动子的功能(称为启动子封堵或转录干扰的现象)。在原核生物和真核生物中都已描述了此事件。在两个转录单位之间正确放置转录终止信号可以防止启动子封堵。转录终止位点已得到良好的表征，已显示将它们掺入表达载体中对基因表达具有多种有益作用。
所使用的宿主细胞是真核细胞，尤其是哺乳动物宿主细胞。大多数真核生物新生mRNA在其3’端具有聚腺苷酸尾，其是在涉及初级转录物的切割和偶联的聚腺苷酸化反应的复杂过程期间添加的。聚腺苷酸尾对mRNA稳定性和可转移性是有利的。因此，用于表达编码目的产物和DHFR酶的多核苷酸的表达盒通常包含适合用于转录终止和多聚腺苷化作用的聚腺苷酸化位点。存在几种可以用于哺乳动物表达载体中的有效的加A信号，包含源自牛生长激素(bgh)、小鼠β-珠蛋白、SV40早期转录单位和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的那些。但是，还已知合成的聚腺苷酸化位点(参见例如Promega的pCI-neo表达载体，其基于Levitt等，1989，Genes Dev.3，(7)：1019-1025)。聚腺苷酸化位点可以选自SV40聚腺苷酸化位点，如SV40晚期和早期聚腺苷酸化位点(参见例如Subramani等，1981，Mol.Cell.Biol.854-864中所述的质粒pSV2-DHFR)、合成的聚腺苷酸化位点(参见例如Promega的pCI-neo表达载体，其基于Levitt等，1989，GenesDev.3，(7)：1019-1025)和bgh聚腺苷酸化位点(牛生长激素)。
此外，包含编码目的产物的多核苷酸和编码DHFR酶的多核苷酸的表达盒可以包含至少一个内含子。在用哺乳动物宿主细胞进行表达时，此实施方案尤其适宜。来自高等真核生物的大多数基因包含在RNA加工期间去除的内含子。各个构建体在转基因系统中比缺乏内含子的相同构建体更有效地表达。通常，将内含子放置在可读框的5’端，但也可以放置在3’端。因此，可以将内含子包含于表达盒中来提高表达速率。该内含子可以定位在启动子和/或启动子/增强子元件与待表达的多核苷酸的可读框的5’端之间。现有技术中已知可以与本发明结合使用的几种适宜的内含子。
根据一个实施方案，在用于表达目的产物的表达盒中使用的内含子是合成内含子，如SIS或RK内含子。RK内含子是强的合成内含子，优选将其放置在目的基因的ATG起始密码子前。RK内含子由CMV启动子的内含子供体剪接位点和小鼠IgG重链可变区的受体剪接位点组成(参见例如Eaton等，1986，Biochemistry 25，8343-8347；Neuberger等，1983，EMBOJ.2(8)，1373-1378；它可以获自pRK-5载体(BD PharMingen))。
可以以其环状形式将包含上文所述的多核苷酸和/或表达盒的表达载体转染入宿主细胞中。由于内切核酸酶和外切核酸酶的活性，超螺旋载体分子通常将在核内转化为线性分子。但是，转染前将表达载体线性化通常改善稳定转染的效率。这还因为在转染前线性化表达载体可以控制线性化的点。因此，根据本发明的一个实施方案，表达载体或至少两个表达载体的组合包含至少一个预先确定的限制位点，其可以用于在转染前线性化该载体。根据一个实施方案，这样排列线性化位点，使得通过线性化，编码DHFR酶的多核苷酸定位在编码目的产物的多核苷酸的5’。此排列对基因扩增有利。在额外使用原核选择性标记的情况下，编码该原核标记的多核苷酸定位在编码目的产物的多核苷酸的3’。这具有这样的作用：该原核选择性标记基因处于3’，并因此处于该线性化载体核酸的“哺乳动物”部分“之外”。此排列是有利的，因为推测原核基因对哺乳动物表达不利，因为原核序列可以在哺乳动物细胞中导致增加的甲基化或其他沉默效应。
优选将编码目的产物的多核苷酸和编码DHFR酶的多核苷酸稳定引入该宿主细胞中。稳定引入或转染对表达细胞系的建立，尤其是对目的产物的大规模产生和因此对工业产生是有利的。
现有技术中已知用于将多核苷酸和表达载体引入真核宿主细胞(包含哺乳动物宿主细胞)中的几种适当的方法。各种方法包括但不限于磷酸钙转染、电穿孔、脂质体、生物射弹和聚合物介导的基因转移。除传统的基于随机掺入的方法外，还可以用重组介导法来将编码目的产物的多核苷酸和编码DHFR酶的多核苷酸转移入宿主细胞基因组中。这类重组介导法可以包括使用位点特异性重组酶如Cre、Flp或ΦC31(参见例如Oumard等，Cytotechnology(2006)50：93-108)，其可以介导转基因的定向插入。备选地，可以用同源重组的机制来插入该多核苷酸(综述于Sorrell等，Biotechnology Advances 23(2005)431-469中)。基于重组的基因插入允许最小化包含在转移/引入至宿主细胞的异源核酸中的元件数。例如，可以使用已提供了启动子和聚腺苷酸化位点(外源或内源)的插入基因座，使得仅需将其余元件(例如编码目的产物的多核苷酸和编码DHFR酶的多核苷酸)转移/转染至宿主细胞。上文详细描述了本发明的适宜的表达载体或表达载体的组合的实施方案以及适宜的宿主细胞；我们称之为以上公开内容。
在除DHFR酶外还使用其他选择性标记的情况下，可以在应用用于DHFR酶的选择性条件之前应用用于该选择性标记的选择性条件。例如，在将新霉素磷酸转移酶基因(neo)用作其他选择性标记的情况下，可以首先在例如包含G418的培养基中培养细胞，以选择掺入了本发明的表达载体的细胞。
本发明除DHFR选择性标记外还在选择性培养基中使用限制浓度的叶酸盐的策略具有这样的优势：即使使用较低的DHFR抑制剂浓度也获得非常高的严格性。从这些新的选择条件存活的细胞群体的生产力显著提高。实施例已显示该选择方法后获得的宿主细胞以高产量产生目的产物。单个宿主细胞的平均生产力也提高。因此，提高了以较低的筛选努力发现高产克隆的可能性。因此，本发明的选择系统优于现有技术中使用的选择系统。具体而言，与单独使用各个选择性标记相比，获得了具有更高生产力的宿主细胞。因此，由于选择条件的更高的严格性，优化了选择方法。
一般将从最初的细胞群体的非选择细胞分离并可以富集由于本发明的严格的筛选/选择方法而获得的细胞。它们可以作为单个细胞分离和培养。它们还可以用于一个或多个其他选择周期，可选地进行其他定性或定量分析，或者可以用于例如开发用于蛋白质产生的细胞系。根据一个实施方案，直接将按上文所述选择的产生宿主细胞的富集群体用作用于以高产量产生目的多肽的群体。优选地，选择稳定表达目的产物的宿主细胞。上文详细描述了稳定转染/表达的优势。我们称之为以上公开内容。
还提供用于产生目的产物的方法，其至少包括以下步骤：
(a)进行本发明的选择方法来选择至少一个表达目的产物的真核宿主细胞；和
(b)在允许表达目的产物的条件下培养至少一个选择的真核宿主细胞。
由于本发明的选择方法允许鉴定高产细胞克隆，该选择系统是产生方法的重要的和掺入的部分。可以通过破碎细胞获得目的产物。多肽还可以例如分泌表达在培养基中，并可以从培养基获得。各个方法的组合也是可能的。根据一个实施方案，在无血清的条件下培养该宿主细胞。
因此，可以以高产量有效地产生和获得/分离产物，尤其是多肽。所获得的产物还可以接受其他加工步骤，例如纯化和/或修饰步骤。因此，用于产生目的产物的方法可以包括以下步骤中的至少一个：
-从该细胞培养基和/或从该宿主细胞分离目的产物；和/或
-加工分离的目的产物。
可以通过本领域已知的方法回收和可选地进一步加工，例如进一步纯化、分离和/或修饰按照本发明产生的目的产物，例如多肽。例如，可以通过包括但不限于离心、过滤、超滤、提取或沉淀的常规方法从营养培养基回收产物。可以通过本领域已知的多种方法进行纯化，其包括但不限于层析(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如制备型等电聚焦)、差别溶解度(例如硫酸铵沉淀)或提取。
目的产物可以是能够通过由该多核苷酸编码的遗传信息的转录、翻译或任意其他表达事件产生的任意生物产物。在这方面，产物将是表达产物。目的产物可以选自多肽、核酸，尤其是RNA或DNA。产物可以是具有药物活性或治疗活性的化合物、或将在测定中利用的研究工具等。在特别优选的实施方案中，产物是多肽，优选是具有药物活性或治疗活性的多肽，或是将在诊断或其他测试中使用的利用的研究工具等。因此，多肽不限于任意具体的蛋白质或蛋白质的组，相反，它可以是人们希望通过本文中公开的方法来选择和/或表达的任意大小、功能或来源的任意蛋白质。因此，可以表达/产生几种不同的目的多肽。如上文所述，术语多肽包含任意活性或生物活性的蛋白质和/或肽，其包含例如生物活性多肽，如酶蛋白质或肽(例如蛋白酶、激酶、磷酸酶)、受体蛋白质或肽、转运蛋白质或肽、细菌和/或内毒素结合蛋白质、结构蛋白质或肽、免疫多肽、毒素、抗生素、激素、生长因子、疫苗等。该多肽可以选自肽类激素、白细胞介素、组织纤溶酶原激活物、细胞因子、免疫球蛋白，尤其是抗体或功能性抗体片段或其变体。在最优选的实施方案中，多肽是免疫球蛋白分子或抗体、或其功能性变体，例如嵌合抗体、或部分或完全人源化的抗体。这种抗体可以是诊断抗体，或具有药物活性或治疗活性的抗体。
还提供通过上文和权利要求中定义的本发明的方法获得的产物。优选地，该产物是多肽，尤其是免疫球蛋白分子或其功能性片段。
根据一个实施方案，本发明还提供选择性培养基，其包含限制浓度的叶酸盐和至少一种DHFR抑制剂。优选地，该选择性培养基具有以下特征中的一个或多个：
(a)它以选自以下的浓度包含叶酸盐，优选叶酸：
(aa)500nM或更低；
(bb)250nM或更低；
(cc)150nM或更低；
(dd)100nM或更低；
(ee)75nM或更低；
(ff)50nM或更低；
(gg)25nM或更低；和/或
(hh)15nM或更低；
和/或
(b)它以选自以下的浓度范围包含叶酸盐，优选叶酸：
(aa)0.1nM-500nM；
(bb)0.1nM-250nM，优选2.5nM-250nM或5或10nM-250nM；
(cc)0.1nM-150nM，优选2，5nM-150nM或5或10nM-150nM；
(dd)1nM-100nM，优选2.5nM-100nM或5或10nM-100nM；
(ee)1nM-75nM，优选2.5nM-75nM或5或10nM-75nM；
(ff)1nM-50nM；
(gg)2.5nM-50nM；和/或
(hh)12.5nM-50nM；
和/或
(c)它以选自以下的浓度包含DHFR抑制剂，优选抗叶酸盐剂：
(aa)500nM或更低；
(bb)400nM或更低；
(cc)300nM或更低；
(dd)250nM或更低；
(ee)200nM或更低；
(ff)150nM或更低；和/或
(gg)150nM或更低；
和/或
(d)它以选自以下的浓度包含DHFR抑制剂，其优选是抗叶酸盐剂且更优选是MTX：
(aa)1nM-500nM；
(bb)10nM-200nM；
(cc)10nM-150nM；和/或
(dd)10nM-100nM。
叶酸盐和DHFR抑制剂的所示浓度和浓度范围可以彼此组合。上文结合本发明的选择方法详细描述了浓度范围的优势和其他优选实施方案及选择性培养基中叶酸盐和抗叶酸盐剂的适宜的实施方案；称之为以上公开内容。该选择性培养基可以与本发明的选择系统结合使用。
本文中提到的文本和文件的全部内容在此引用作为参考，并因此构成本公开内容的部分。
以下实施例用于说明本发明，而不以任意方式限制其范围。具体而言，实施例涉及本发明的优选实施方案。
实施例
一般而言，适宜的材料如试剂是技术人员熟悉的、市售的和可以按照厂家的说明使用。按所述进行实验。
用包含用于表达单克隆抗体作为目的产物的表达盒的表达载体进行CHO细胞中的转染实验。作为选择性标记，G418抗性基因(NEO)和DHFR基因在分开的表达盒中存在于表达载体上。此实验表明，在低叶酸条件下用减少的MTX量选择产生高产细胞群体。作为参考，使用了DHFR的标准选择条件，其使用更高的MTX浓度和非限制量的叶酸。
实施例I-DHFR和限制浓度的叶酸
1.1.表达载体
表达载体是哺乳动物表达载体，其包含以相同的方向排列在表达载体上的以下决定性元件：
 CMV启动子/增强子
 内含子
 编码抗体轻链的多核苷酸
 多克隆位点
 SV40聚腺苷酸化位点
 CMV启动子/增强子
 内含子
 编码抗体重链的多核苷酸
 多克隆位点
 SV40聚腺苷酸化位点
 SV40增强子/启动子
 新霉素磷酸转移酶(neo)
 聚腺苷酸化位点(合成的)
 氨苄青霉素抗性基因
 SV40启动子
 比DHFR野生型对MTX更不敏感的DHFR突变体基因
 内含子
 聚腺苷酸化位点
1.2.CHO细胞的转染和选择
用在适合用于CHO细胞的无FCS培养基中悬浮生长的CHO细胞在摇瓶中进行细胞培养、转染和筛选。通过电穿孔用表达载体转染细胞。为了减少宿主细胞中的胞内叶酸库和防止叶酸从预培养培养基共转移至选择培养基，在转染和选择之前，将细胞传代至无叶酸的培养基或具有降低的叶酸含量(例如50nM)的培养基。取决于细胞生存，转染后24-48小时通过向细胞加入含G418和MTX的选择性培养基起始第一选择步骤。在第一选择步骤中，测试了三种不同的MTX浓度(2.5、5和10nM)和叶酸浓度(12.5、25和50nM)。作为参考，使用了包含非限制量(此处为11.3μM，其对应于培养基中的标准浓度)的叶酸盐的培养基。
细胞一恢复至高于80％的生存力，就通过将细胞传代至含有与第一选择步骤中相同量的叶酸但含有10倍的MTX(即25、50和100nM)的无G418培养基中来应用第二选择步骤。在参考培养条件的情况下，向细胞加入500nM MTX。
1.3.库(pool)生产力的测定
通过含非限制量的叶酸(11.3μM)、无G418，但含有与各个选择培养基中相同浓度的MTX的培养基中的过度生长摇瓶分批培养物来在第一选择步骤和最后的选择步骤后分析所选择的细胞群体的生产力。
按50mL工作体积将分批培养接种在具有250mL容量的摇瓶中，并在150转/分和10％CO2下在摇动箱(shaker cabinet)(不增湿)中培养。起始测定时，细胞的生存力必须是＞90％。接种细胞密度通常是约2×105细胞/mL。在第13天进行效价测定。起始培养后13天，通过蛋白A HPLC测定细胞培养物上清液中的抗体效价。
1.4.结果
为了评价限制叶酸浓度下的dhfr/MTX选择的严格性，在此实施例I中进行了用于表达单克隆抗体的DHFR载体表达的转染。载体还包含G418抗性基因(见上文)。首先，通过在不同浓度的叶酸下加入G418和不同浓度的MTX来选择转染细胞群体。在第二选择步骤中应用更高的严格性之前，此最初的第一选择步骤应帮助杀死未转染的细胞，并同时迫使细胞消耗胞内叶酸库。在这些条件下，通常所有转染细胞群体都恢复，并按上文所述评估生产力。
表1总结了所获得的生产力结果：
Figure BDA0000086475350000221
Figure BDA0000086475350000231
表1：第一选择步骤后细胞群体的生产力
在摇瓶分批培养中分析了在具有不同叶酸浓度的含G418和MTX的培养基中选择的转染细胞。在培养的第13天，取培养基的样品并通过蛋白A HPLC分析抗体含量。
结果显示，所有细胞群体都产生抗体。即使在低叶酸浓度下，加入少于10nM MTX也未显示对细胞更多的作用。所产生的抗体的浓度与缺乏MTX的情况下的选择相当。但是，在第一选择步骤中使用10nM MTX时，细胞在低叶酸浓度下的生产力显著提高，且以浓度依赖性方式提高。用最低的叶酸浓度(12.5nM)和10nM MTX选择后，发现与具有标准叶酸浓度的培养基相比，细胞的生产力高10倍。
为了进一步提高选择严格性，下一步是去除G418，但将培养基中的MTX浓度提高10倍，同时保持用于第一选择步骤中的叶酸浓度。在参考的情况下，按现有技术中常用的高浓度(此处按500nM)加入MTX。在这些条件下，许多转染群体的细胞生存力显著下降并停留在低水平，使得不是所有群体都可以恢复。进一步扩大可以恢复的细胞群体并分析生产力(表2)。
Figure BDA0000086475350000241
表2：第二选择步骤后细胞群体的生产力
通过提高MTX浓度来进一步选择G418和MTX选择的细胞群体。在摇瓶分批培养物中分析恢复的群体。在培养的第13天，取培养基的样品，并通过蛋白A HPLC分析抗体含量。
参考细胞群体(500nM MTX，11.3μM FA)的生产力在此选择步骤后提高至约25-30mg/L。在低于100nM的MTX浓度下未观察到益处。但是，100nM MTX与低叶酸含量(12.5或25nM)组合使用时，生产力至多达277mg/L，并因此即使在用低MTX浓度进行扩增/选择的情况下也比参考高10倍。
因此，用DHFR作为选择性标记与选择性培养基中的限制叶酸浓度组合产生即使在低DHFR抑制剂浓度下也高度过量表达目的蛋白质的细胞。结果还显示，此组合优于常规选择系统(例如在选择性培养基中使用标准叶酸浓度的DHFR/G418)。
实施例II-用转染的CHO细胞大规模产生多肽
可以在例如摇袋式细胞培养生物反应器(wave bioreactor)、玻璃生物反应器或不锈钢生物反应器中进行多肽的大规模产生。为了该目的，通常从单个冷冻管，例如来自主细胞库(Master Cell Bank)的管起始扩大细胞。融化细胞并通过几个步骤扩大。用适量细胞接种不同规模的生物反应器。可以通过向生物反应器中加入进料溶液(feed solution)和添加剂来提高细胞密度。使细胞保持在高生存力延长的时间。在大规模条件下，反应器中的产物浓度达到从几百毫克每升至几克每升。可以通过标准层析方法进行纯化，其可以包括亲和、离子交换、疏水相互作用或大小排阻层析步骤。生物反应器的大小在最终的规模中可以高达几千升体积(也参见例如F.Wurm，Nature Biotechnology，第22卷，11，2004，1393-1398)。

Claims (16)

1.用于选择至少一个表达目的产物的真核宿主细胞的方法，其至少包括以下步骤：
(a)提供多个真核宿主细胞，其中所述宿主细胞的细胞生存取决于叶酸盐摄取，其中所述真核宿主细胞至少包含：
(i)引入的编码目的产物的多核苷酸；和
(ii)引入的编码DHFR酶的多核苷酸；
(b)在至少包含DHFR的抑制剂和限制浓度的叶酸盐的选择性培养基中培养所述多个真核宿主细胞；
(c)选择至少一个表达所述目的产物的真核宿主细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述选择性培养基包含浓度为500nM或更低的DHFR抑制剂和浓度为500nM或更低的叶酸盐。
3.权利要求1或2的方法，其中所述选择性培养基包含浓度为200nM或更低的DHFR抑制剂和浓度为2.5nM-100nM的叶酸盐。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述选择性培养基包含浓度为12.5nM-50nM的叶酸盐与浓度为10nM-100nM的MTX的组合。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中与由所述宿主细胞内源表达的DHFR酶相比，所述DHFR酶对DHFR抑制剂具有较低的敏感性。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述真核宿主细胞是CHO宿主细胞，优选DHFR+(正)细胞。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中将DHFR+(正)宿主细胞与引入的DHFR酶结合使用；与所述宿主细胞内源表达的DHFR酶相比，所述引入的DHFR酶对MTX更不敏感。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中已通过至少一个表达载体引入编码目的产物的多核苷酸和编码DHFR酶的多核苷酸。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述宿主细胞包含至少两个引入的编码目的产物的多核苷酸，其中优选至少一个多核苷酸编码免疫球蛋白分子的重链，而另一多核苷酸编码免疫球蛋白分子的轻链。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述引入的编码目的产物的多核苷酸和所述引入的编码DHFR酶的多核苷酸包含在不同的表达盒中，且其中与用于驱动编码DHFR酶的多核苷酸表达的表达盒相比，用于驱动编码目的产物的多核苷酸表达的表达盒包含更强的启动子和/或增强子。
11.用于产生目的产物的方法，其至少包括以下步骤：
(a)进行权利要求1至10中任一项的选择方法来选择至少一个表达所述目的产物的真核宿主细胞；和
(b)在允许表达所述目的产物的条件下培养至少一个选择的真核宿主细胞。
12.权利要求11的方法，其包括以下步骤中的至少一个：
(c)从所述细胞培养基和/或从所述真核宿主细胞分离所述目的产物；和/或
(d)进一步加工所述分离的目的产物。
13.权利要求11或12的方法，其中所述目的产物是免疫球蛋白分子或其功能性片段。
14.选择性培养基，其包含浓度为500nM或更低的DHFR抑制剂和限制浓度为500nM或更低的叶酸盐。
15.权利要求14的选择性培养基，其包含限制浓度为2.5nM-100nM的叶酸盐和/或浓度为200nM或更低的DHFR抑制剂。
16.权利要求14或15的选择性培养基，其包含浓度为12.5nM-50nM的叶酸与浓度为10nM-100nM的MTX。
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