CN105829350B - 肠激酶可切割的多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含与多肽连接的肠激酶切割位点的肠激酶可切割多肽，及其通过表达制备目标多肽的用途。本发明还涉及用于表达该肠激酶可切割多肽的DNA序列、载体和宿主细胞。

Description

肠激酶可切割的多肽
技术领域
本发明涉及蛋白质表达和蛋白质化学的技术领域，其中将从融合蛋白释放成熟蛋白质。
背景技术
重组蛋白表达技术使得能够产生大量的由于例如其生物活性而可使用的所需蛋白质。这样的蛋白质通常在微生物宿主细胞中表达为重组融合蛋白。感兴趣的蛋白质常常连接至融合伴侣蛋白或较小的氨基酸延伸，以便提高表达水平、促进分泌、增加溶解度、促进蛋白质折叠，以保护该蛋白质免受非故意的蛋白水解或促进感兴趣的蛋白质的纯化。融合伴侣蛋白需要通过蛋白水解从融合蛋白上去除，以获得感兴趣的蛋白质。
一种用于这样的加工的蛋白酶是肠激酶(E.C.3.4.21.9)。该蛋白酶的生物学天然功能是通过在酶原中的DDDDK加工位点(SEQ ID NO:2，以下称为D4K)处进行切割而将胰蛋白酶原转换成胰蛋白酶(Biochim.Biophys Acta 20(1956)443-434)。
类似地，为了能够实现肠激酶催化的融合伴侣蛋白的去除，在融合伴侣蛋白与感兴趣的蛋白质之间插入D4K加工位点。肠激酶催化的融合蛋白加工的特异性和效率现依赖于例如D4K位点的相对水解速率和感兴趣的蛋白质中的潜在内部降解位点。肠激酶不仅对D4K位点，而且对相当多的其他序列具有活性，参见例如，Anal.Biochem.106(1980)199-206。
已经使用了若干种方法来弥补肠激酶具有有限的底物特异性的缺点。
US6906176描述了相对于D4K位点更为有效地被肠激酶切割的若干种肽序列。
PNAS 103(2006)7583-7588描述了比D4K位点更快地被肠激酶切割的肽序列。
Protein Expr.Purif.41(2005)332-340描述了包含肽序列LKGDR(SEQ ID NO:3)的蛋白质在被肠激酶切割方面比D4K位点更加有效。
Protein Expr.Purif.59(2008)314-319描述了通过在尿素的存在下进行切割反应而增强了肠激酶切割的特异性。
需要更加特异性的肠激酶切割反应以用于去除融合伴侣蛋白而不切割成熟蛋白质中的内部位点，并且不在成熟蛋白质上留下任何氨基酸延伸。优选地，该肠激酶切割反应非常适合于在用于制备成熟蛋白质的工业过程中进行。还需要更加特异性的、可以在温和加工条件下用于许多不同的蛋白质的肠激酶切割反应，以使得成熟蛋白质不会发生非故意的化学和物理改变。
发明概述
本发明的目标是提供包含肠激酶切割位点的肠激酶可切割融合多肽，该切割位点比可以在所述肠激酶可切割融合多肽中存在的任何二级切割位点显著更快地被水解。本发明的另一目标是提供包含化学稳定的肠激酶切割位点的肠激酶可切割融合多肽。
根据本发明的第一方面提供了一种用于制备目标多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)表达包含下式的多肽的肠激酶可切割融合多肽：
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1(I)SEQ ID NO:1
其中
Z1是包含至少2个氨基酸残基的多肽；
X4是E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T或M；
X5选自除了S和I之外的遗传编码的氨基酸；
X6不存在或选自遗传编码的氨基酸；
Z2是任选的多肽或氨基酸残基；
其中所述目标多肽是式(I)中的Z1；
b)使所述肠激酶可切割多肽与肠激酶在有利于切割的条件下接触；
以及
c)任选地分离所述目标多肽。
根据本发明的第二方面提供了包含下式的多肽的肠激酶可切割融合多肽：
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1(I)SEQ ID NO:1
其中
Z1是包含至少2个氨基酸残基的多肽；
X4是E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T或M；
X5选自除了S和I之外的遗传编码的氨基酸；
X6不存在或选自遗传编码的氨基酸；并且
Z2是任选的多肽或氨基酸残基；并且
其中i)Z1包含功能性多肽，如药学活性的多肽或酶，或者ii)所述肠激酶可切割融合多肽由式(I)组成，并且Z2包含40个或更少的氨基酸残基，如Z2不存在，Z2是氨基酸残基，或者Z2是包含2-40个氨基酸残基的多肽。
在一个实施方案中，X4是D。在一个实施方案中，X4是E。在另一个实施方案中，X5-X4是DE。在另一个实施方案中，X5-X4是DD。
在另一个实施方案中，Z1是GLP-1肽。
根据本发明的第三个方面提供了编码根据式(I)的肠激酶可切割融合多肽的DNA序列。
根据本发明的第四个方面提供了包含编码根据式(I)的肠激酶可切割融合多肽的DNA序列的表达载体，该DNA序列与上游启动子和下游终止子可操作地连接。
根据本发明的第五个方面提供了包含表达载体的宿主细胞，该表达载体包含编码根据式(I)的肠激酶可切割融合多肽的DNA序列，该DNA序列与上游启动子和下游终止子可操作地连接。
发明详述
在一个实施方案中，本发明涉及包含式(I)的多肽的肠激酶可切割融合多肽：
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1(I)SEQ ID NO:1
其中
Z1是包含至少2个氨基酸残基的多肽；
X4是E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T或M；
X5选自除了S和I之外的遗传编码的氨基酸；
X6不存在或选自遗传编码的氨基酸；并且
Z2是任选的多肽或氨基酸残基。在一个实施方案中，该肠激酶可切割融合多肽由式(I)组成。
如本文所用的术语“肠激酶”意在表示一种胰水解酶，其通过将胰蛋白酶原切割成胰蛋白酶来催化活化，作为参与消化过程的催化级联的一部分。“肠激酶”包括从任何来源分离的天然酶以及通过重组表达产生的酶。肠激酶的一个非限制性实例是天然存在的二聚体，其包含二硫键连接的约115kDa的重链和约35kDa的较小轻链。肠激酶的另一个非限制性实例是包含催化结构域的单独的轻链。据描述，单独的轻链及其功能性变体表现得与肠激酶一样好，参见WO2013/092855A1。
如本文所用的术语“融合多肽”意在表示这样的多肽，其包含例如为了组成非天然存在的多肽而融合在一起的两个或更多个多肽。所融合的多肽的大小可以变化并且取决于融合多肽的目的。为了提高表达，融合多肽经常地在蛋白质的重组表达过程中使用，以促进可溶性表达产物的维持、以促进融合多肽或其部分向细胞外介质的排出、以保护多肽免于被蛋白酶或肽酶非故意地处理，等等。在这样的融合多肽中，至少两个组成多肽中的一个通常被指定为“目标多肽”或“成熟蛋白质”，即，是有待通过重组表达过程制备的多肽。
如本文所用的术语“肠激酶可切割融合多肽”意在表示这样的融合多肽，其包含例如为了组成非天然存在的多肽而在肠激酶切割位点的每一端融合在一起的两个多肽，在合适的条件下，该非天然存在的多肽可以在连接两个多肽的肠激酶切割位点处被肠激酶切割。因此，该肠激酶可切割融合多肽是非天然存在的多肽。应理解，该肠激酶可切割融合多肽所包含的两个多肽中的每一个均可含有也被肠激酶识别并切割的二级位点。但是，这样的二级切割位点将以一定的速率经历肠激酶的切割，该速率低于肠激酶切割根据本发明的预期切割位点的速率。在一个实施方案中，该肠激酶可切割融合多肽中的所有二级肠激酶切割位点均以比切割相应的D4K位点的速率更低的速率被肠激酶切割。
在本文中，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”可以可互换地使用，以表示多肽。应理解，所使用的具体术语对于分子的大小没有限制(除非在特定的情况下直接规定)。
根据按照IUPAC命名法的单字母缩写来指定氨基酸残基，例如，D表示天冬氨酸(Asp)而G表示甘氨酸(Gly)。
如本文所用的“遗传编码的氨基酸”意在表示由以下氨基酸组成的组：G、P、A、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、K、R、Q、N、E、D、S、T以及它们的任何生物学修饰。在一个实施方案中，适合在本发明中使用的氨基酸包括遗传编码的氨基酸的电子等排体。这样的生物学修饰的非限制性实例是例如酰胺化、糖基化和二硫键形成。
如本文所用的“类似物”意在表示这样的蛋白质，其衍生自另一种蛋白质，通过对该蛋白质的一个或多个氨基酸残基的置换、缺失和/或添加而得到。GLP-1(7-37)(SEQ IDNO:4)的类似物的非限制性实例是残基34已被精氨酸残基置换的K34R-GLP-1(7-37)(SEQID NO:5)和残基34已被精氨酸残基置换并且氨基酸残基7-8已经缺失的K34R-GLP-1(9-37)(SEQ ID NO:6)(采用GLP-1肽的氨基酸残基的常用编号)。在一个实施方案中，GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:4)是HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG。
如本文所用的“功能性变体”意在表示某种蛋白质的化学变体，其保留与原始蛋白质基本相同的主要功能。因此，功能性变体通常是蛋白质的修饰形式，其中引入使修饰的蛋白质获得一些期望的性质、同时保留原始蛋白质的基本相同的主要功能所需的尽可能少的修饰。功能性变体的非限制性实例是例如延伸的蛋白质、截短的蛋白质、融合蛋白和类似物。牛肠激酶轻链的功能性变体的非限制性实例是例如C112A牛肠激酶轻链。GLP-1(7-37)的功能性变体的一个非限制性实例是K34R-GLP-1(7-37)。
在一个实施方案中，蛋白质的功能性变体与所述蛋白质相比包含1-2个氨基酸置换、缺失或添加。在另一实施方案中，功能性变体与所述蛋白质相比包含1-5个氨基酸置换、缺失或添加。在另一实施方案中，相对于相应的天然存在的蛋白质或天然存在的蛋白质亚序列，功能性变体包含1-15个氨基酸置换、缺失或添加。
在一个实施方案中，Z2包含增溶结构域。如本文所用的“增溶结构域”意在表示这样的蛋白质，其为融合蛋白的一部分并且使所述融合蛋白在某些条件下比融合伴侣蛋白本身更加可溶。可用作式(I)中的Z2的增溶结构域的非限制性实例是DsbC(巯基：二硫键互换蛋白)、如WO2008/043847中描述的RL9(核糖体蛋白L9)、MPB(麦芽糖结合蛋白)、NusA(转录终止/抗终止蛋白)和Trx(硫氧还蛋白)。
如本文所用的“非天然存在的多肽”意在表示这样的多肽，在没有人为干预的情况下，不知其存在或者其不存在于自然界中。非天然存在的多肽的非限制性实例是例如融合多肽，其中两个来自于不同来源的蛋白质融合在一起成为一个多肽。
如本文所用的术语“GLP-1肽”意在表示GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)酰胺及其类似物，它们能够通过常规重组DNA技术以及常规合成方法产生。这样的GLP-1肽包括但不限于也可被称为人GLP-1的天然胰高血糖素样肽-1，例如，如WO 87/06941中公开的包含GLP-1(7-37)和其功能性变体的这类肽片段；如WO 90/11296中公开的包含GLP-1(7-36)和其功能性衍生物的这类肽片段；如WO 91/11457中公开的活性GLP-1肽7-34、7-35、7-36和7-37的这类类似物；如EP 0699686-A2中公开的GLP-1的这类N-末端截短的片段；以及如EP 0708179-A2中公开的包含N-末端咪唑基团的这类GLP-1类似物和衍生物。GLP-1肽的非限制性实例是GLP-1(7-37)、K34R-GLP-1(7-37)和毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO:7)。在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO:7)是HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS。
如本文所用的“胰高血糖素肽”意在表示来自前胰高血糖素原家族的、对胰高血糖素受体具有亲和性的多肽。胰高血糖素肽的非限制性实例是胰高血糖素(1-29)(SEQ IDNO:8)及其类似物。在一个实施方案中，胰高血糖素(1-29)(SEQ ID NO:8)是HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT。
如本文所用的“胰岛素前体”意在表示包含胰岛素的A链和B链并任选地包含介于其间的C肽的多肽。应理解，该胰岛素可以是人胰岛素或其功能性变体，如类似物或截短的形式。胰岛素前体的一个非限制性实例是例如A(1-21)-AAK-B(1-29)-人胰岛素(SEQ IDNO:9)。A(1-21)-AAK-B(1-29)-人胰岛素(SEQ ID NO:9)是GIVEQCCTSICSLYQLENYCNAAKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK。
如本文所用的术语“毒蜥外泌肽(exendin)”意在表示毒蜥外泌肽及其功能性变体，包括其类似物和片段，例如，毒蜥外泌肽-3和-4。毒蜥外泌肽及其类似物和片段在例如WO 99/43708中描述，其内容通过引用以其全文并入本文。
优选地，肠激酶可切割融合多肽中的肠激酶位点是在化学稳定性方面也稳健的位点。由于肠激酶位点中的氨基酸残基的某些亚序列更加倾向于不太化学稳定，因此通常优选地，肠激酶位点的序列(X6-X5-X4-GDR)是在预期的条件下化学稳定的序列。
在根据式(I)的肠激酶可切割融合多肽中，在一个实施方案中，X4选自E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W或T。在另一个实施方案中，X4选自E、Q、L、D、G或A。X4可以是E。X4可以是Q或L。X4可以是D。X4可以是D、G或A。在另一个实施方案中，X5是D或E。在又一个实施方案中，X5是D。在一个实施方案中，X5不是S或I。在一个实施方案中，X5-X4选自DD、DE、DL、DQ、EE和EQ。在另一个实施方案中，X5-X4是DE或DD。X5-X4可以是DL、DQ或DG。X5-X4可以是DA、DS或EE。X5-X4可以是EQ、EL或ED。X5-X4可以是EG、EA或ES。X5-X4可以是QE、HE、NE或ME。X6的存在和身份是宽松的。在一个实施方案中，X6是I、G、L、T、R或S。在另一个实施方案中，X6不存在。X6可以是I、G、L、T、R、S、M、H、F、P、V、W、K、E、Y或Q。X6可以是I、G、L、T、R、S、M、H、F、P、V或W。X6可以是I或G。
在一个实施方案中，Z2不存在。在另一个实施方案中，Z2是具有0-10个氨基酸残基或具有约8个到约200个氨基酸残基的多肽。当Z2是促进肠激酶可切割融合多肽在宿主细胞中的表达的多肽时，或者当Z2用来保护所表达的多肽不在N-末端被蛋白水解加工时，常使用较小的Z2多肽。在一个实施方案中，Z2选自EEK、EEAEK、HK、EEAHK、E(EA)2HK、E(EA)3HK、EEGHK、EHPK、EEGEPK、EEAHELK、EEAHEVK、EEAHEMK、EEAHEFK、EEAHEYK、EEAHEWKEEGNTTPK和EELDARLEALK。Z2可包含序列EEK、EEAEK或HK。Z2可包含序列EEAHK、E(EA)2HK或E(EA)3HK。Z2可包含序列EEGHK、EHPK或EEGEPK。Z2可包含序列EEAHELK、EEAHEVK或EEAHEMK。Z2可包含序列EEAHEFK、EEAHEYK、EEAHEWKEEGNTTPK或EELDARLEALK。在另一个实施方案中，Z2包含选自DV、DVKPGQPLA、DVKPGQPEY、DVKPGEPLY、DVKPGQPLY、DVKPGQPLE和DVKPGQPMY的序列。在另一个实施方案中，Z2包含选自DVKPGQPLY、DVKPGQELY、DVKPGEPLY、DVKPEQPLY、DVKPGQPEY、DVKEGQPLY、DVKPGQPLA、DVKPGQPLE和DVEPGQPLY的序列。Z2可包含序列DVKPGQPLY、DVKPGQELY或DVKPGEPLY。Z2可包含序列DVKPEQPLY、DVKPGQPEY或DVKEGQPLY。Z2可包含序列DVKPGQPLA、DVKPGQPLE或DVEPGQPLY。在另一个实施方案中，Z2包含选自QPMYKR、GQPMYK、PGQPMY、KPGQPM、LKPGQP、QLKPGQ、LQLKPG、WLQLKP、HWLQLK、WHWLQL、AWHWLQ、EAWHWL、AEAWHW和EAEAWH的序列。Z2可包含序列QPMYKR、GQPMYK或PGQPMY。Z2可包含序列KPGQPM、LKPGQP或QLKPGQ。Z2可包含序列LQLKPG、WLQLKP或HWLQLK。Z2可包含序列WHWLQL、AWHWLQ或EAWHWL。Z2可包含序列AEAWHW或EAEAWH。Z2可以是促进所述肠激酶可切割融合多肽在宿主细胞中的表达的多肽。在一个实施方案中，Z2是具有2到50个氨基酸残基，如3到40个、4到30个或5到20个氨基酸残基的多肽。Z2可以是具有2到8个氨基酸残基的多肽。Z2可以是具有至少8个氨基酸残基的多肽。Z2可包含40个或更少的氨基酸残基，或者由其组成。Z2可以是具有约10个到约25个氨基酸残基的多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及包含氨基酸序列Z2-X8-X7的肽，其中Z2如本文所定义；X8不存在或者是包含肠激酶切割位点的肽；并且X7是包含至少1个氨基酸的多肽。在一个实施方案中，Z2提高Z2-X8-X7的重组表达、有利于可溶性表达产物Z2-X8-X7的保持、促进Z2-X8-X7或其部分向细胞外介质的排出、保护X7或其部分免于被蛋白酶或肽酶非故意地加工，和/或针对Z2-X8-X7的捕获(例如，通过经由色谱法如HPLC的纯化)提供改善的性质。X8可以不存在。X8可包含至少2个氨基酸，如至少3个氨基酸、至少4个氨基酸或至少5个氨基酸。X8可包含1-30个氨基酸，如3-20个氨基酸、4-15个氨基酸或至少5-10个氨基酸。X7可包含至少5个氨基酸、至少10个氨基酸或至少15个氨基酸。X7可包含1-100个氨基酸，如10-70个氨基酸或20-50个氨基酸。X7可以是如本文定义的Z1。例如，Z1可以是GLP-1肽或其功能性变体。在一个实施方案中，Z2-X8-X7是肠激酶可切割融合多肽。X8可包含氨基酸序列X6-X5-X4-G-D-R，其中X6、X5和X4如本文所定义。X8可包含氨基酸序列DDGDR或DEGDR。
在根据式(I)的肠激酶可切割融合多肽中，Z1常常是有待通过重组表达制备的目标多肽。在一个实施方案中，Z1是药学活性的多肽，或药学活性多肽的前体。在一个实施方案中，Z1是具有约15个到约100个氨基酸残基的多肽。在又一个实施方案中，Z1是具有约15个到约50个氨基酸残基的多肽。在另一个实施方案中，Z1是GLP-1肽或其功能性片段，如K34R-GLP-1(7-37)或K34R-GLP-1(9-37)。在一个实施方案中，K34R-GLP-1(7-37)是HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG。在一个实施方案中，K34R-GLP-1(9-37)是EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG。Z1可包含N-末端序列HAEGT或EGTFT。Z1可包含N-末端序列HAEGTFTSDVSSYLE、EGTFTSDVSSYLE或其包含至少5个氨基酸的片段。在另一个实施方案中，Z1是胰高血糖素肽或其功能性变体。Z1可以是胰高血糖素肽或其包含N-末端序列HGTFT的功能性变体。Z1可以是选自下组的GLP-1(7-37)类似物：(des7-8,31H,34Q,37K)；(des7-8,34R,37K,38E)；(des7-8,34R,37K)；(des7-8,9G,34R,37K)；(des7-8,23R,34R,37K)；(31H,34Q,37K)；(9Q,34R,37K)；(30E,34R,37K)；(34R,37K,38G)；(34R,36G,37K)；和(34R,37K,38E)。Z1可以是选自下组的GLP-1(7-37)类似物：(i)des7-8,18K,34R；(ii)des7-8,18K,34Q；(iii)des7-8,18K,22E,34R；(iv)des7-8,18K,22E,34Q；(v)des7-8,12L,18K,34Q；(vi)des7,18K,22E,34Q；(vii)18K,34R；(iix)18K,34Q；(ix)18K,22E,34R；(x)18K,22E,34Q；(xi)18K,26R,31K,34R；(xii)18K,26H,31K,34R；(xiii)18K,26H,27K,34Q；(xiv)18K,22K,26R,34Q；(xv)18K,25V,26R,31K,34R；(xvi)18K,22E,26R,31K,34R；(xvii)18K,22E,26H,27K,34R；(iixx)18K,22E,26H,27K,34Q；(ixx)18K,22E,26H,27K,31H,34R；(xx)18K,22E,26H,27K,31H,34Q；(xxi)18K,22E,25V,26R,31K,34R；(xxii)18K,22E,25V,26R,31K,34Q；(xxiii)18K,22E,25V,26R,31K,34G；(xxiv)18K,22E,25V,26R,27K,34R；(xxv)18K,22E,25V,26R,27K,34Q；(xxvi)18K,22E,25V,26R,27K,31H,34R；(xxvii)18K,22E,25V,26R,27K,31H,34Q；(iixxx)18K,22E,23E,25V,26R,27K,34R；(ixxx)18K,22E,23E,25V,26R,27K,34Q；(xxx)18K,22E,25V,26R,31K,34G,des35-37；(xxxi)18K,22E,25V,26R,31H,des35-37；(xxxii)18K,22E,25V,26R,30K,34G,des35-37；(xxxiii)18K,22E,25V,26R,30K,31H,34G,des35-37；(xxxiv)18K,22E,25V,26R,27L,30K,34G,des35-37)；(xxxv)18K,22E,26R,31K,34G,des35-37；(xxxvi)18K,22E,26R,27K,31H,34G,des35-37；(xxxvii)des7,18K,22E,26R,34R,37K；(iixxxx)des7,18K,22E,26R,27K,31H,34G,des35-37；(ixxxx)7Imp,18K,22E,25V,26R,31K,34G,des35-37；(xxxx)des7-8,18K,22E,25V,26R,31K,34G,des35-37；(xxxxi)8S,18K,22E,25V,26R,31K,34G,des35-37；(xxxxii)des7-8,18K,26V,27K,34R；(xxxxiii)des7-8,18K,26H,30K,34R,des36-37；(xxxxiv)des7-8,18K,25V,26R,31K,34R；(xxxxv)des7-8,18K,22E,34R,des36-37；(xxxxvi)des7-8,18K,22E,26R,34R,37K；(xxxxvii)des7-8,18K,22E,26R,31K,34R；(iixxxxx)des7-8,18K,22E,26R,31K,34G,des35-37；(ixxxxx)des7-8,18K,22E,26R,30K,34R,des36-37；(xxxxx)des7-8,18K,22E,26R,30K,34R；(xxxxxi)des7-8,18K,22E,26R,27K,31H,34R,des36-37；(xxxxxii)des7-8,18K,22E,25V,26R,31K,des34-37；(xxxxxiii)des7-8,18K,22E,25V,26R,31K,34R；(xxxxxiv)des7-8,18K,22E,25V,26R,31K,34G,des35-37；(xxxxxv)des7-8,18K,22E,25V,26R,30E,31K,34G,des35-37；(xxxxxvi)des7-8,18K,22E,25V,26R,27L,des35-37；(xxxxxvii)des7-8,18K,22E,25V,26R,27K,34Q；(iixxxxxx)des7-8,18K,22E,25V,26R,27K,31H,34G,des35-37；(ixxxxxx)des7-8,18K,22E,25V,26R,27H,31K,34G,des35-37；(xxxxxx)des7-8,18K,22E,25V,26H,31K,34G,des35-37；(xxxxxxi)des7-8,18K,22E,23R,25V,26R,31K,34G,des35-37；(xxxxxxii)18K,22E,25V,26R,27L,30K,34G,des35-37；(xxxxxxiii)des7,18K,22E,26R,27K,34Q；(xxxxxxiv)34H；和(xxxxxxv)des7-8,18K,34H。Z1可以是选自下组的GLP-1(7-37)类似物：(i)22E,26R,27K,34R,37K；(ii)22E,26R,27K,30E,34R,36K,38E,39G；(iii)22E,26R,27K,34R,36K,des37；(iv)22E,25V,26R,27K,34R,37K；(v)des7-8,20K,22E,26R,27K,30E,34G,des35-37；(vi)26R,27K,30E,34R,36K,38E；(vii)des7-8,22K,25V,26R,27K,31H,34R；(iix)des7-8,22K,25V,26R,27K,34R,des35-37；(ix)des7-8,22K,25V,26R,27K,34R,des36-37；(x)26H,27K,30E,34R,36K,38E；(xi)22K,25V,26R,27K,30E,34Q；(xii)25V,26R,27K,30E,34R,36K,38Q；(xiii)25V,26R,27K,30E,34Q,36K,38E；(xiv)22K,26R,27K,31H,34G,des35-37；(xv)des7-8,25V,26R,27K,31H,34Q,37K；(xvi)25V,26R,27K,31H,34Q,37K；(xvii)22E,23E,25V,26R,27K,31H,34Q,37K；(iixx)des7-8,12K,22E,26R,27K,31H,34Q；(ixx)des7-8,22K,26R,27K,31H,34G,des35-37；(xx)22E,26H,27K,30E,34R,36K,38E；(xxi)22E,24K,26R,27K,31H,34G,des35-37；(xxii)25V,26R,27K,34Q,36K；(xxiii)22E,24K,25V,26R,27K,31H,34R；(xxiv)22E,24K,25V,26R,27K,34G,des35-37；(xxv)22E,24K,25V,26R,27K,34R；(xxvi)des7-8,22E,24K,25V,26R,27K,31H,34Q；和(xxvii)des7-8,22E,26R,27K,30E,34R,36K,38E,39G。Z1可以是GLP-1(7-37)或是选自(iii)(22E)和(iv)22E,30E的GLP-1(9-37)类似物。Z1可以是选自下组的GLP-1(9-37)类似物：i)(22E,26R,27K,34R,38G,39G,40G,41S,42K)；ii)(22E,26R,31K,34R,38G,39G,40G,41S,42K)；iii)(22E,26R,34R,38K,39G,40G,41S,42K)；iv(22E,23K,26R,34R,38G,39G,40G,41S,42K)；v)(22E,26R,34R,36K,38G,39G,40G,41S,42K)；和vi)(18K,22E,26R,34R,38G,39G,40G,41S,42K)。在又一个实施方案中，Z1是胰岛素前体或其功能性变体，如A(1-21)-AAK-B(1-29)-人胰岛素。在另一个实施方案中，Z1选自毒蜥外泌肽、PYY、瘦素及其功能性变体。
在一个实施方案中，Z1和Z2衍生自不同的来源，即来自不同的物种和/或合成来源。
融合蛋白的制备
肠激酶可切割融合多肽可以借助于重组核酸技术来产生。通常，编码Z2、X6-X5-X4-GDR和Z1的核酸序列以合成方式获得(对于较小的多肽)，或者作为经修饰以编码所需多肽的克隆DNA而获得。编码Z2的核酸序列通常可以通过克隆野生型DNA而获得，但当Z2是有限大小的多肽时，其也可以合成获得。编码肠激酶位点—为仅5-6个氨基酸残基的多肽的X6-X5-X4-GDR—的核酸序列将通常合成获得。其甚至可以由编码Z2的相同核酸序列来编码，特别是在Z2是相当小的多肽的情况下。例如为了构建一个至少编码式(I)的肠激酶可切割融合多肽的核酸序列，编码Z2、X6-X5-X4-GDR和Z1的不同部分的核酸序列符合读码框架地融合。这样的融合多肽可以是肠激酶可切割融合多肽，其具有或不具有N-或C-末端延伸(作为Z1和Z2，或在Z1和Z2之内)如标签等，例如，His-标签或增溶结构域(如DsbC、RL9、MBP、NusA或Trx)。然后将该修饰的核酸序列插入到表达载体中，该表达载体转而转化或转染到表达宿主细胞中。
编码肠激酶可切割融合多肽的核酸构建体可以适当地为基因组、cDNA或合成来源的。经常地，它将包含具有不同来源的核酸序列。通过公知的技术经由遗传密码的修饰来完成氨基酸序列的改变。
在进一步的方面，本发明提供了编码本发明的肠激酶可切割融合多肽的DNA序列。
编码肠激酶可切割融合多肽的DNA序列通常插入到可以是任何载体的重组载体中，该载体可以方便地经历重组DNA程序，并且载体的选择通常将取决于其将被引入到的宿主细胞。因此，该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外的实体存在、其复制与染色体复制无关的载体，例如，质粒。或者，该载体可以是这样的载体，当其引入到宿主细胞中时，其被整合到宿主细胞基因组中并与其所整合至的染色体一起复制。
该载体优选地是表达载体，其中编码肠激酶可切割融合多肽的DNA序列与DNA转录所需的其他区段可操作地连接。术语“可操作地连接”表示这些区段排列成使得它们一致地发挥作用以用于它们的预期目的，例如，转录在启动子中开始并通过编码该多肽的DNA序列继续进行，直至其在终止子内终止。
因此，用于表达肠激酶可切割融合多肽的表达载体将包含能够启动和引导经克隆的基因或cDNA的转录的启动子。该启动子可以是任何DNA序列，其在所选择的宿主细胞中显示出转录活性并且可以衍生自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。
此外，用于表达肠激酶可切割融合多肽的表达载体还将包含终止子序列，即被宿主细胞识别而终止转录的序列。该终止子序列与编码该多肽的核酸序列的3’末端可操作地连接。在所选择的宿主细胞中有功能的任何终止子均可在本发明中使用。
肠激酶可切割融合多肽的表达可以以在宿主细胞的胞质溶胶中的细胞内表达为目标，或者被引导至用于细胞外表达至生长培养基中的分泌途径。或者，肠激酶可切割融合多肽的表达可以针对于细胞器。
细胞内表达是默认的途径并且需要具有DNA序列的表达载体，该DNA序列包含启动子及随后的编码肠激酶可切割融合多肽的DNA序列以及随后的终止子。
为了将肠激酶可切割融合多肽引导至宿主细胞的分泌途径中，需要分泌信号序列(也被称为信号肽或前序列)作为肠激酶可切割融合多肽的N-末端延伸。将编码信号肽的DNA序列与编码肠激酶可切割融合多肽的DNA序列的5’端在正确的读框中连接。该信号肽可以为通常与该蛋白质相关的信号肽或者可以来自编码另一种分泌蛋白的基因。
分别用于连接编码肠激酶可切割融合多肽的DNA序列、启动子、终止子和/或分泌信号序列，以及用于将它们插入到含有复制所需信息的适当载体中的程序是本领域技术人员公知的(参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor,New York,1989)。
引入了编码肠激酶可切割融合多肽的DNA序列的宿主细胞可以是能够在细胞内或细胞外表达该肠激酶可切割融合多肽的任何细胞。如果需要翻译后修饰，合适的宿主细胞包括酵母、真菌、昆虫和高等真核细胞，如哺乳动物细胞。
细菌表达：对于在大肠杆菌中表达，用于引导核酸构建体在细菌宿主细胞中转录的适当启动子的实例是从lac操纵子、trp操纵子及其杂合体trc和tac获得的启动子，它们全部来自大肠杆菌(DeBoer等人,1983,Proceedings of the National Academy ofSciences USA 80:21-25)。用于在大肠杆菌中使用的其他更强的启动子是来自T7和T5噬菌体的噬菌体启动子。T7启动子需要在大肠杆菌宿主中存在T7聚合酶(Studier和Moffatt,J.Mol.Biol.189,113,(1986))。所有这些启动子均通过用IPTG、乳糖或色氨酸诱导来调控，以在细菌生长期中的控制关键点引发转录。大肠杆菌也具有用于连续表达的强启动子，例如，
Figure BDA0001020889820000151
等人,1987,Biotechnology 5,161-164中的用于表达hGH的合成启动子。
对于在芽孢杆菌中表达，来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子均是合适的实例。其他启动子在Scientific American,1980,242:74-94中的"Useful proteins from recombinantbacteria"；和Sambrook等人,1989(同上)中描述。
对于大肠杆菌，细菌宿主细胞的有效的信号肽编码区是从基因DegP、OmpA、OmpF、OmpT、PhoA和肠毒素STII获得的信号肽，它们全部来自大肠杆菌。对于芽孢杆菌，信号肽区从芽孢杆菌NCIB 11837麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA获得。其他信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews57:109-137描述。对于大肠杆菌和芽孢杆菌两者，信号肽可以根据算法SignalP(Nielsen等人,1997,Protein Eng.10,1-6，Emanuelsen等人,2007,Nature Protocols 2,953-971)中概括的规则从头创建。使信号序列适应于给定的情况并检查SignalP得分。
用于转录的强终止子的实例是如在Thiofusion表达系统中的天冬氨酸酶aspA、在pET载体中的T7基因10终止子(Studier等人)以及核糖体RNA基因rrnA、rrnD的终止子。
在一个实施方案中，本发明涉及包含表达载体的宿主细胞，该表达载体包含编码根据式(I)的肠激酶可切割融合多肽的DNA序列。在一个实施方案中，包含该表达载体的宿主细胞是酵母、细菌或真菌。在另一个实施方案中，该宿主细胞选自酵母属的种(Saccharomyces spp.)、毕赤酵母属的种(Pichia spp.)、汉逊酵母属的种(Hansenulaspp.)和克鲁维酵母属的种(Kluyveromyces spp.)。该宿主细胞可以是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在进一步的实施方案中，该宿主细胞选自大肠杆菌和芽孢杆菌属的种(Bacillus spp.)。
优选的表达宿主的实例是通过用噬菌体溶源化而携带T7聚合酶的大肠杆菌K12W3110，具有B踪迹(a trace of B)的大肠杆菌K12MC1061和大肠杆菌B BL21DE3。在用表达质粒转化时，这些宿主是可用抗生素选择的。对于抗生素自由选择，优选的宿主是大肠杆菌B BL21DE3 3xKO，其中例如2个D,L-丙氨酸消旋酶基因alr、dadX缺失，以及对大肠杆菌B具有特异性并且通常与致病行为有关的II组荚膜基因簇(kpsM-kpsF)缺失。II组基因簇的缺失使大肠杆菌B BL21DE3 3xKO进入与大肠杆菌K12相同的安全性类别。选择基于不需要由插入到表达质粒中的alr基因所提供的D-丙氨酸，而不是AmpR基因。
一旦肠激酶可切割融合多肽已在宿主生物体中表达，其可通过常规技术回收并纯化至需要的纯度。这样的常规回收和纯化技术的非限制性实例是离心、溶解、过滤、沉淀、离子交换色谱法、固定化金属亲和色谱法(IMAC)、RP-HPLC、凝胶过滤和冷冻干燥。
HRV14 3C的重组表达和纯化的实例可见于例如Cordingley等人,J.Virol.1989,63,pp5037-5045，Birch等人,Protein Expr Purif.,1995,6,pp609-618，以及WO2008/043847。
来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的XaaProDAP的微生物表达和纯化的实例可见于例如Chich等人,Anal.Biochem,1995,224,pp 245-249和Xin等人,ProteinExpr.Purif.2002,24,pp530-538。
在进一步的方面，本发明提供了用于切割肠激酶可切割融合多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)表达包含下式的多肽的肠激酶可切割融合多肽：
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1(I)SEQ ID NO:1
其中
Z1是包含至少2个氨基酸残基的多肽；
X4是E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T或M；
X5选自除了S和I之外的遗传编码的氨基酸；
X6不存在或选自遗传编码的氨基酸；
Z2是任选的多肽或氨基酸残基；
其中所述目标多肽是式(I)中的Z1；
b)使所述肠激酶可切割融合多肽与肠激酶在有利于切割的条件下接触。
在进一步的方面，本发明提供了用于制备目标多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)表达根据本发明的肠激酶可切割融合多肽，其中所述目标多肽是式(I)中的Z1，
b)使所述肠激酶可切割融合多肽与肠激酶在有利于切割的条件下接触；以及
c)分离所述目标多肽。
对此方法有用的肠激酶是任何哺乳动物肠激酶，如牛肠激酶、人肠激酶或其功能性变体。肠激酶也可以被称为肠肽酶。由于肠激酶的轻链包含催化结构域，并且在不存在重链的情况下具有活性，因此其他有用的肠激酶是牛轻链或其功能性变体。这样的牛轻链变体在例如WO2013/092855A1中公开，例如(C112A)变体和(C112A,L134K,I135K)变体。
根据上述方法的肠激酶切割可以在许多切割条件下进行。在一个实施方案中，实施该方法，其中在步骤b)中的接触在包含有机溶剂的水溶液中进行。例如，该有机溶剂可选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、丙酮、甘油或其混合物。在一个实施方案中，所述有机溶剂是浓度为约10％w/w到约25％w/w的乙醇。在一个实施方案中，所述有机溶剂是浓度为约10％w/w到约25％w/w的甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、丙酮、甘油或其混合物。
本发明的实施方案
通过以下非限制性实施方案进一步描述了本发明：
1.包含下式的多肽的肠激酶可切割融合多肽：
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1(I)SEQ ID NO:1
其中
Z1是包含至少2个氨基酸残基的多肽；
X4是E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T或M；
X5选自除了S和I之外的遗传编码的氨基酸；
X6不存在或选自遗传编码的氨基酸；
Z2是任选的多肽或氨基酸残基。
2.包含下式的多肽的肠激酶可切割融合多肽：
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1(I)SEQ ID NO:1
其中
Z1是包含至少2个氨基酸残基的多肽；
X4是E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T或M；
X5选自除了S和I之外的遗传编码的氨基酸；
X6不存在或选自遗传编码的氨基酸；
Z2是任选的多肽或氨基酸残基；并且
其中i)Z1包含功能性多肽，如药学活性的多肽或酶，ii)所述肠激酶可切割融合多肽由式(I)组成，并且Z2包含40个或更少的氨基酸残基，或者iii)Z2包含增溶结构域。
3.根据实施方案1或2所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5是G、P、A、V、L、M、C、F、Y、W、H、K、R、Q、N、E、D和T。
4.根据实施方案1-3中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X4是E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W或T。
5.根据实施方案1-4中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X4是E、Q、L、D、G或A。
6.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X4是E。
7.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X4是Q。
8.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X4是L。
9.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X4是D。
10.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X4是G。
11.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X4是A。
12.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5是D或E。
13.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5是D。
14.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5是E。
15.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是DE。
16.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是DD。
17.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是DL。
18.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是DQ。
19.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是DG。
20.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是DA。
21.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是DS。
22.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是EE。
23.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是EQ。
24.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是EL。
25.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是ED。
26.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是EG。
27.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是EA。
28.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是ES。
29.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是QE。
30.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是HE。
31.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是NE。
32.根据实施方案1-5中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是ME。
33.根据前述实施方案中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X6是I、G、L、T、R、S、M、H、F、P、V、W、K、E、Y或Q。
34.根据实施方案33所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X6是I、G、L、T、R、S、M、H、F、P、V或W。
35.根据实施方案34所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X6是I、G、L、T、R或S。
36.根据实施方案35所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X6是I。
37.根据实施方案35所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X6是G。
38.根据实施方案1-32中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X6不存在。
39.根据前述实施方案中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2是促进所述肠激酶可切割融合多肽在宿主细胞中的表达的多肽。
40.根据实施方案39所述的肠激酶可切割融合多肽，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
41.根据实施方案39所述的肠激酶可切割融合多肽，其中所述宿主细胞是酵母。
42.根据实施方案39-40所述的肠激酶可切割融合多肽，其中所述宿主细胞是酿酒酵母。
43.根据前述实施方案中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2不存在。
44.根据前述实施方案中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2是具有0到10个氨基酸残基的多肽。
45.根据实施方案1-42中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2是具有2到8个氨基酸残基的多肽。
46.根据实施方案1-42中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2是具有至少8个氨基酸残基的多肽。
47.根据实施方案1-42中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2包含40个或更少的氨基酸残基。
48.根据实施方案1-42中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2是氨基酸残基或者Z2是包含2-40个氨基酸残基的多肽。
49.根据实施方案1-42中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2是具有约8个至约200个氨基酸残基的多肽。
50.根据实施方案1-42中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2是具有约10个至约25个氨基酸残基的多肽。
51.根据实施方案1-42中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2选自EEK、EEAEK、HK、EEAHK、E(EA)2HK、E(EA)3HK、EEGHK、EHPK、EEGEPK、EEAHELK、EEAHEVK、EEAHEMK、EEAHEFK、EEAHEYK、EEAHEWKEEGNTTPK和EELDARLEALK。
52.根据实施方案1-42中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2选自DV、DVKPGQPLA、DVKPGQPEY、DVKPGEPLY、DVKPGQPLY、DVKPGQPLE和DVKPGQPMY。
53.根据实施方案1-42中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2选自DVKPGQPLY、DVKPGQELY、DVKPGEPLY、DVKPEQPLY、DVKPGQPEY、DVKEGQPLY、DVKPGQPLA、DVKPGQPLE和DVEPGQPLY。
54.根据实施方案1-42中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2包含选自QPMYKR、GQPMYK、PGQPMY、KPGQPM、LKPGQP、QLKPGQ、LQLKPG、WLQLKP、HWLQLK、WHWLQL、AWHWLQ、EAWHWL、AEAWHW和EAEAWH的序列。
55.根据前述实施方案中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2包含增溶结构域。
56.根据前述实施方案中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1包含功能性多肽，如药学活性的多肽或酶。
57.根据前述实施方案中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1是药学活性的多肽、酶或其前体。
58.根据前述实施方案中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1是GLP-1肽或其功能性变体。
59.根据实施方案58所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1是K34R-GLP-1(7-37)或K34R-GLP-1(9-37)。
60.根据实施方案1-57中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1是胰高血糖素肽或其功能性变体。
61.根据实施方案1-57中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1是胰岛素前体或其功能性变体。
62.根据实施方案1-57中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1选自毒蜥外泌肽、PYY、瘦素及其功能性变体。
63.根据前述实施方案中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1是具有约15个至约100个氨基酸残基的多肽。
64.根据前述实施方案中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1是具有约15个至约50个氨基酸残基的多肽。
65.根据前述实施方案中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其为非天然存在的多肽。
66.根据前述实施方案中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1和Z2衍生自不同的来源，即不同的物种或合成的。
67.根据前述实施方案中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中所述肠激酶可切割融合多肽由式(I)组成。
68.编码根据实施方案1-67中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽的DNA序列。
69.包含与上游启动子和下游终止子可操作地连接的根据实施方案68所述的DNA序列的表达载体。
70.包含根据实施方案69所述的表达载体的宿主细胞。
71.根据实施方案70所述的宿主细胞，其为酵母、细菌或真菌。
72.根据实施方案70-71中的任一项所述的宿主细胞，其选自酵母属的种、毕赤酵母属的种、汉逊酵母属的种和克鲁维酵母属的种。
73.根据实施方案70-72中的任一项所述的宿主细胞，其为酿酒酵母。
74.根据实施方案70-71中的任一项所述的宿主细胞，其选自大肠杆菌和芽孢杆菌属的种。
75.用于切割肠激酶可切割融合多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)表达包含下式的多肽的肠激酶可切割融合多肽：
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1(I)SEQ ID NO:1
其中
Z1是包含至少2个氨基酸残基的多肽；
X4是E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T或M；
X5选自除了S和I之外的遗传编码的氨基酸；
X6不存在或选自遗传编码的氨基酸；
Z2是任选的多肽或氨基酸残基；
其中所述目标多肽是式(I)中的Z1；
b)使所述肠激酶可切割融合多肽与肠激酶在有利于切割的条件下接触。
76.用于制备目标多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)表达根据实施方案1-67中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中所述目标多肽是式(I)中的Z1，
b)使所述肠激酶可切割融合多肽与肠激酶在有利于切割的条件下接触；以及
c)分离所述目标多肽。
77.根据实施方案75或76所述的方法，其中步骤b)中使用的所述肠激酶选自牛肠激酶、牛肠激酶轻链或其功能性变体。
78.根据实施方案75-78中的任一项所述的方法，其中所述肠激酶是牛肠激酶轻链变体(C112A)、(C112A,L134K,I135K)或其功能性变体。
79.根据实施方案75-77中的任一项所述的方法，其中在步骤b)中的所述接触在包含有机溶剂的水溶液中进行。
80.根据实施方案78所述的方法，其中所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、丙酮、甘油或其混合物。
81.根据实施方案79所述的方法，其中所述有机溶剂是浓度为约10％w/w到约25％w/w的乙醇。
82.根据实施方案76-80中的任一项所述的方案，其中所述步骤c)是任选的。
83.一种包含氨基酸序列Z2-X8-X7的肽，其中Z2如前述实施方案中的任一项所定义；X8不存在或者是包含肠激酶切割位点的肽；并且X7是包含至少1个氨基酸的多肽。
84.根据实施方案83所述的肽，其中X8不存在。
85.根据实施方案83所述的肽，其中X8包含至少2个氨基酸，如至少3个氨基酸、至少4个氨基酸或至少5个氨基酸。
86.根据实施方案83所述的肽，其中X8包含1-30个氨基酸，如3-20个氨基酸、4-15个氨基酸或至少5-10个氨基酸。
87.根据实施方案83-86中的任一项所述的肽，其中X7包含至少5个氨基酸、至少10个氨基酸或至少15个氨基酸。
88.根据实施方案83-86中的任一项所述的肽，其中X7包含1-100个氨基酸，如10-70个氨基酸或20-50个氨基酸。
89.根据实施方案83-86中的任一项所述的肽，其中X7是如前述实施方案中的任一项所定义的Z1。
90.根据实施方案89所述的肽，其中Z1是GLP-1肽或其功能性变体。
91.根据实施方案83-90中的任一项所述的肽，其中Z2-X8-X7是肠激酶可切割融合多肽。
92.根据实施方案83-91中的任一项所述的肽，其中X8包含氨基酸序列X6-X5-X4-G-D-R，其中X6、X5和X4如前述实施方案中的任一项所定义。
93.根据实施方案83-91中的任一项所述的肽，其中X8包含氨基酸序列DDGDR或DEGDR。
本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均在此通过引用以其全文并入本文，并且其程度如同单独地且特别地指出每篇参考文献均通过引用而并入且在本文中以其全文进行阐述(在法律允许的最大程度上)。本文中使用的所有标题和小标题仅仅是为了方便起见，而不应解释为以任何方式限制本发明。除非另有声明，否则任何和全部实例或本文提供的示例性措辞(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并不造成对本发明的范围的限制。说明书中的任何措辞均不应被解释为表示任何未请求保护的要素对本发明的实践是必不可少的。本文中专利文件的引用和并入仅仅是为了方便而做出的，并没有反映关于这些专利文件的有效性、可专利性和/或可执行性的任何观点。如由适用的法律所允许的，本发明包括所附权利要求书中列举的主题的所有修改和等同物。
实施例
缩写列表
EK：肠激酶或肠激酶轻链
D4K：DDDDK
NMP：N-甲基-2-吡咯烷酮
Abz：2-氨基苯甲酰基
Dnp：2,4-二硝基苯基
材料与方法
通用制备方法
方法：SPPS_I(固相肽合成)
通过固相肽合成法合成了含有C-末端Lys(Abz)酰胺荧光体和N-末端Lys(Dnp)猝灭剂的分子内猝灭荧光肽底物。
这些肽底物具有以下的一般结构：
Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *式(II)
其中
X6-X5-X4具有与式(I)中相同的含义(均为氨基酸，但X6是任选的)，
Z2 *是Lys(Dnp)，并且
Z1 *是Z1-Lys(Abz)酰胺，其中Z1如式(I)中所定义。
采用相对于树脂负载例如Rinkamide-Chematrix(0.5mmol/g)2.5倍过量的Fmoc-氨基酸(300mM，在具有300mM Oxyma
Figure BDA0001020889820000261
的NMP中)，在来自Intavis BioanalyticalInstruments AG(Koeln,Germany)的Multipep RSi合成仪上以3μmol的规模平行地进行SPPS_I。采用在NMP中的20％哌啶进行Fmoc-去保护。采用在NMP中的1:1:1:1氨基酸/Oxyma
Figure BDA0001020889820000262
/DIC/可力丁(collidine)进行偶联。所有氨基酸均是“双重或三重偶联的”，这意味着在第一次偶联后(60min)，将树脂排出并添加更多的试剂(氨基酸、
Figure BDA0001020889820000271
DIC和可力丁)，并使反应物再次反应(60min)。
方法：EK纯化
纯化的肠激酶的制备根据WO2013/092855A1中描述的程序进行。
通用检测和表征方法
方法：EK-动力学_1
通过测量根据式(II)的分子内猝灭荧光肽Lys(Dnp)-肽-Lys(Abz)酰胺的初始水解速率来进行EK-动力学_1。在通常在1到50μM范围内的底物浓度下测量肽的背景荧光后，通过添加纯化的肠激酶测量初始水解速率，该肠激酶的浓度为使得能够读取初始水解速率，即在30min内少于5％水解的浓度。通常可以使用1到10nM的酶浓度。在至多一小时的水解后，添加额外的酶以使得能够在完全水解下测量荧光水平。通常使用Perkin ElmerEnspire荧光读板仪，采用320nm激发和420nm发射，在25℃下在50mM MOPS缓冲液，1mMEDTA，pH 7.5中测量水解速率。
方法：EK-动力学_2
通过计算具有N-末端延伸的全长GLP-1的初始水解速率来进行EK-动力学_2。底物浓度在150-300μM的范围内。通过添加一定量的肠激酶使得最终浓度为9.5nM来开始水解反应。在6.2min、18.7min、43.7min、86.3min、151.3min和243.8min后取样，并通过1+9稀释到5％乙酸中来猝灭。在Waters iClass UPLC上使用合适的方法来分离并在分析反相柱上通过积分峰面积单独地定量剩余的底物和形成的产物。用原始数据拟合以下形式的等式：
其中t是时间，cS0是初始底物浓度，cE是酶浓度，cPt是在时间t时的产物浓度，cSt是在时间t时的底物浓度，kcat和Km是水解参数，并且Ki是产物抑制常数。所有反应均采用0.1μM的常数Ki。对于所有的肽均基于对初始底物浓度1mg/ml确定的参数来计算初始水解速率。所有的反应均在50mM Tris缓冲液，1mM EDTA，pH 8.5中进行。
肠激酶
用于本文中实施例的肠激酶是如WO2013/092855A1中描述的牛轻链变体(C112A,L134K,I135K)。
实施例1-39
包含GLP-1(7-37)的N末端的肠激酶可切割融合多肽的相对切割速率。
对于全部的实施例1-39，底物均是Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *，其中Z1是HAEGT(SEQ IDNO:10)，即来自GLP-1(7-37)的N-末端五肽，X6不存在，并且X5-X4如表1中所指定。底物通过SPPS-I法合成，并且其初始肠激酶切割速率通过EK-动力学_1法确定。用于实施例1-39的肠激酶是如WO2013/092855A1中描述的牛轻链变体(C112A,L134K,I135K)。
将肠激酶切割的初始速率对具有D4K位点(替代式(II)中的X5-X4-GDR)的底物进行归一化。
例如，对于实施例1，底物具有以下结构Lys(Dnp)-AEGDR-HAEGT-Lys(Abz)酰胺(SEQ ID NO:11)，该结构是包含肠激酶切割位点AEGDR(SEQ ID NO:12)的肠激酶可切割融合多肽的模型底物。
表1.具有肽HAEGT作为Z1的底物的相对肠激酶切割速率(D4K位点为100％)。
Figure BDA0001020889820000281
Figure BDA0001020889820000291
实施例40-59
包含GLP-1(9-37)变体的N末端的肠激酶可切割融合多肽的相对切割速率。
对于全部的实施例40-59，底物均是Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *，其中Z1是EGTFT(SEQ IDNO:13)，即来自GLP-1(9-37)的N-末端五肽，X6不存在，并且X5-X4如表2中所指定。底物通过SPPS-I法合成，并且其初始肠激酶切割速率通过EK-动力学_1法确定。用于实施例40-59的肠激酶是如WO2013/092855A1中描述的牛轻链变体(C112A,L134K,I135K)。
将肠激酶切割的初始速率对具有D4K位点(替代式(II)中的X5-X4-GDR)的底物进行归一化。
表2.具有肽EGTFT作为Z1的底物的相对肠激酶切割速率(D4K位点为100％)。
Figure BDA0001020889820000301
Figure BDA0001020889820000311
实施例60-79
包含毒蜥外泌肽-4的N末端的肠激酶可切割融合多肽的相对切割速率。
对于全部的实施例60-79，底物均是Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *，其中Z1是HGEGT(SEQ IDNO:14)，即来自毒蜥外泌肽-4的N-末端五肽，X6不存在，并且X5-X4如表3中所指定。底物通过SPPS-I法合成，并且其初始肠激酶切割速率通过EK-动力学_1法确定。用于实施例60-79的肠激酶是如WO2013/092855A1中描述的牛轻链变体(C112A,L134K,I135K)。
将肠激酶切割的初始速率对具有D4K位点(替代式(II)中的X5-X4-GDR)的底物进行归一化。
表3.具有肽HGEGT作为Z1的底物的相对肠激酶切割速率(D4K位点为100％)。
Figure BDA0001020889820000312
Figure BDA0001020889820000321
实施例80-83
包含胰高血糖素类似物的N末端的肠激酶可切割融合多肽的相对切割速率。
对于全部的实施例80-83，底物均是Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *，其中Z1是HGTFT(SEQ IDNO:15)，即来自胰高血糖素类似物的N-末端五肽，并且X5-X4如表4中所指定。底物通过SPPS-I法合成，通过EK纯化来纯化，并且其初始肠激酶切割速率通过EK-动力学_1法确定。用于实施例80-83的肠激酶是如WO2013/092855A1中描述的牛轻链变体(C112A,L134K,I135K)。
将肠激酶切割的初始速率对具有D4K位点(替代式(II)中的X5-X4-GDR)的底物进行归一化。
表4.具有肽HGTFT作为Z1的底物的相对肠激酶切割速率(D4K位点为100％)。
实施例 Z<sub>1</sub> X<sub>5</sub>-X<sub>4</sub> 活性(％)
80 HGTFT DD 402
81 HGTFT DE 392
82 HGTFT DL 216
83 HGTFT DS 172
实施例84-87
包含胰高血糖素类似物的N末端的肠激酶可切割融合多肽的相对切割速率。
对于全部的实施例84-87，底物均是Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *，其中Z1是QGTFT(SEQ IDNO:16)，即来自胰高血糖素类似物的N-末端五肽，X6不存在，并且X5-X4如表5中所指定。底物通过SPPS-I法合成，并且其初始肠激酶切割速率通过EK-动力学_1法确定。用于实施例84-87的肠激酶是如WO2013/092855A1中描述的牛轻链变体(C112A,L134K,I135K)。
将肠激酶切割的初始速率对具有D4K位点(替代式(II)中的X5-X4-GDR)的底物进行归一化。
表5.具有肽QGTFT作为Z1的底物的相对肠激酶切割速率(D4K位点为100％)。
实施例 Z<sub>1</sub> X<sub>5</sub>-X<sub>4</sub> 活性(％)
84 QGTFT DD 338
85 QGTFT DE 411
86 QGTFT DL 222
87 QGTFT DS 125
实施例88-91
包含人胰高血糖素的N末端的肠激酶可切割融合多肽的相对切割速率。
对于全部的实施例88-91，底物均是Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *，其中Z1是HSQGT(SEQ IDNO:17)，即来自人胰高血糖素的N-末端五肽，X6不存在，并且X5-X4如表6中所指定。底物通过SPPS-I法合成，并且其初始肠激酶切割速率通过EK-动力学_1法确定。用于实施例88-91的肠激酶是如WO2013/092855A1中描述的牛轻链变体(C112A,L134K,I135K)。
将肠激酶切割的初始速率对具有D4K位点(替代式(II)中的X5-X4-GDR)的底物进行归一化。
表6.具有肽HSQGT作为Z1的底物的相对肠激酶切割速率(D4K位点为100％)。
实施例 Z<sub>1</sub> X<sub>5</sub>-X<sub>4</sub> 活性(％)
88 HSQGT DD 310
89 HSQGT DE 621
90 HSQGT DL 268
91 HSQGT DS 200
实施例92-110
包含GLP-1(7-37)的N末端和不同X6的参考肠激酶可切割融合多肽的相对切割速率。
对于全部的实施例92-110，底物均是Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *，其中Z1是HAEGT(SEQ IDNO:10)，即来自GLP-1(7-37)的N-末端五肽，X5-X4是DE，并且X6如表7中所指定。底物通过SPPS-I法合成，并且其初始肠激酶切割速率通过EK-动力学_1法确定。用于实施例92-110的肠激酶是如WO2013/092855A1中描述的牛轻链变体(C112A,L134K,I135K)。
将肠激酶切割的初始速率对具有X6-X5-X4＝ADE的底物(100％)进行归一化。
表7.具有作为Z1的肽HAEGT、如表中指定的X6和X5-X4＝DE的底物的相对肠激酶切割速率(X6-X5-X4＝ADE为100％)。
Figure BDA0001020889820000341
Figure BDA0001020889820000351
实施例111-117
包含GLP-1(7-37)的N末端的参考肠激酶可切割融合多肽的相对切割速率。
对于全部的实施例111-117，底物均是Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *，其中Z1是HAEGT(SEQID NO:10)，即来自GLP-1(7-37)的N-末端五肽，X6不存在，并且对应于X5-X4-GDR的肠激酶位点如表8中所指定。底物通过SPPS-I法合成，并且其初始肠激酶切割速率通过EK-动力学_1法确定。
如表8中指定的EK位点指明了对应于X5-X4-GDR序列的五肽。因此，在实施例111中，底物具有结构Lys(Dnp)-IMGDRHAEGT-Lys(Abz)酰胺(SEQ ID NO:18)，而在实施例112中，底物具有结构Lys(Dnp)-INDDRHAEGT-Lys(Abz)酰胺(SEQ ID NO:19)。因此，在实施例112中，肠激酶位点不包含GDR序列而包含DDR序列。用于实施例111-117的肠激酶是如WO2013/092855A1中描述的牛轻链变体(C112A,L134K,I135K)。
将肠激酶切割的初始速率对具有D4K位点(替代式(II)中的X5-X4-GDR)的底物进行归一化。
表8.具有肽HAEGT作为Z1的参考底物的相对肠激酶切割速率(D4K位点为100％)。
Figure BDA0001020889820000361
实施例118-137
包含整个[Arg34]GLP-1(9-37)序列和N-末端延伸的肠激酶可切割融合多肽以及包含DDDDK的参考肠激酶可切割融合多肽的相对切割速率。
对于所有的实施例118-135，底物均是Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *，其中Z2和Z1如表9中所定义，即，Z2是肠激酶可切割融合多肽的N-末端延伸，而Z1是[Arg34]GLP-1(9-37)，X6不存在，并且对应于X5-X4-GDR的肠激酶位点如表9中所指定；除了在参考实施例中，并且如表9中所指定的(例如实施例118)之外，底物是Z2 *-X6-DDDDK-Z1 *。底物通过SPPS-I法合成，并且其初始肠激酶切割速率通过EK-动力学_2法确定。
如表9中指定的EK位点指明了对应于X5-X4-GDR序列的五肽。因此，在实施例119中，底物具有结构DVKPGQPLYDEGDR-[Arg34]GLP-1(9-37)。
用于实施例118-135的肠激酶是如WO2013/092855A1中描述的牛轻链变体(C112A,L134K,I135K)。
将肠激酶切割的初始速率对具有D4K位点(替代式(II)中的X5-X4-GDR)的底物进行归一化。
表9.包含整个[Arg34]GLP-1(9-37)序列作为Z1以及如下定义的N-末端延伸作为Z2的参考底物的相对肠激酶切割速率(在该组中最慢的D4K位点为100％)。
Figure BDA0001020889820000371
虽然本发明的某些特征已在本文中说明和描述，但本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、变化和等同物。因此，应当理解，所附的权利要求书旨在涵盖落在本发明的真正精神内的所有这些修改和变化。
Figure IDA0001020889850000011
Figure IDA0001020889850000021
Figure IDA0001020889850000031
Figure IDA0001020889850000041
Figure IDA0001020889850000051
Figure IDA0001020889850000061
Figure IDA0001020889850000071
Figure IDA0001020889850000081
Figure IDA0001020889850000091
Figure IDA0001020889850000101
Figure IDA0001020889850000111
Figure IDA0001020889850000121
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Figure IDA0001020889850000201
Figure IDA0001020889850000211
Figure IDA0001020889850000221
Figure IDA0001020889850000231

Claims (83)

1.包含下式的多肽的肠激酶可切割融合多肽：
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) SEQ ID NO:1
其中
Z1是包含至少2个氨基酸残基的多肽；
X4是E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W或T；
X5是P、A、V、L、M、F、Y、H、Q、N、E、D或T；
X6不存在或选自遗传编码的氨基酸；
Z2是任选的多肽或氨基酸残基；
其中Z1包含药学活性的多肽、酶、或其前体；
其中X4和X5中的至少一个是E或D；并且
其中X6-X5-X4-G-D-R-为肠激酶切割位点。
2.根据权利要求1所述的肠激酶可切割融合多肽，其中i)所述肠激酶可切割融合多肽由式(I)组成，并且Z2包含40个或更少的氨基酸残基，或者ii) Z2包含增溶结构域。
3.根据权利要求1所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2不存在，Z2是氨基酸残基，或者Z2是包含2-40个氨基酸残基的多肽。
4.根据权利要求1所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X4是E、Q、L、D、G或A。
5.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X4是E。
6.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X4是Q。
7.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X4是L。
8.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X4是D。
9.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X4是G。
10.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X4是A。
11.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5是D或E。
12.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5是D。
13.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5是E。
14.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4选自DD、DE、DL、DQ、EE和EQ。
15.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是DD或DE。
16.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是DE。
17.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是DD。
18.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是DL。
19.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是DQ。
20.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是DG。
21.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是DA。
22.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是DS。
23.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是EE。
24.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是EQ。
25.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是EL。
26.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是ED。
27.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是EG。
28.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是EA。
29.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是ES。
30.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是QE。
31.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是HE。
32.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是NE。
33.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X5-X4是ME。
34.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X6是I、G、L、T、R、S、M、H、F、P、V、W、K、E、Y或Q。
35.根据权利要求34所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X6是I、G、L、T、R、S、M、H、F、P、V或W。
36.根据权利要求35所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X6是I、G、L、T、R或S。
37.根据权利要求36所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X6是I。
38.根据权利要求36所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X6是G。
39.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中X6不存在。
40.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2是促进所述肠激酶可切割融合多肽在宿主细胞中的表达的多肽。
41.根据权利要求40所述的肠激酶可切割融合多肽，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
42.根据权利要求40所述的肠激酶可切割融合多肽，其中所述宿主细胞是酵母。
43.根据权利要求40所述的肠激酶可切割融合多肽，其中所述宿主细胞是酿酒酵母。
44.根据权利要求1所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2是具有2至50个氨基酸残基的多肽，Z2是氨基酸残基，或者Z2不存在。
45.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2不存在。
46.根据权利要求1或2所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2是具有0到10个氨基酸残基的多肽。
47.根据权利要求1或2所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2是具有2到8个氨基酸残基的多肽。
48.根据权利要求1或2所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2是具有至少8个氨基酸残基的多肽。
49.根据权利要求1或2所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2包含40个或更少的氨基酸残基。
50.根据权利要求1或2所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2是氨基酸残基或者Z2是包含2-40个氨基酸残基的多肽。
51.根据权利要求1所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2是具有8个至200个氨基酸残基的多肽。
52.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2是具有10个至25个氨基酸残基的多肽。
53.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2选自EEK、EEAEK、HK、EEAHK、E(EA)2HK、E(EA)3HK、EEGHK、EHPK、EEGEPK、EEAHELK、EEAHEVK、EEAHEMK、EEAHEFK、EEAHEYK、EEAHEWKEEGNTTPK和EELDARLEALK。
54.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2选自DV、DVKPGQPLA、DVKPGQPEY、DVKPGEPLY、DVKPGQPLY、DVKPGQPLE和DVKPGQPMY。
55.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2选自DVKPGQPLY、DVKPGQELY、DVKPGEPLY、DVKPEQPLY、DVKPGQPEY、DVKEGQPLY、DVKPGQPLA、DVKPGQPLE和DVEPGQPLY。
56.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2包含选自QPMYKR、GQPMYK、PGQPMY、KPGQPM、LKPGQP、QLKPGQ、LQLKPG、WLQLKP、HWLQLK、WHWLQL、AWHWLQ、EAWHWL、AEAWHW和EAEAWH的序列。
57.根据权利要求1或2所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z2包含增溶结构域。
58.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1是药学活性的多肽、酶或其前体。
59.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1是GLP-1肽或其功能性变体。
60.根据权利要求59所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1是K34R-GLP-1(7-37)或K34R-GLP-1(9-37)。
61.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1是胰高血糖素肽或其功能性变体。
62.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1是胰岛素前体或其功能性变体。
63.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1选自毒蜥外泌肽、PYY、瘦素及其功能性变体。
64.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1是具有15个至100个氨基酸残基的多肽。
65.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1是具有15个至50个氨基酸残基的多肽。
66.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其为非天然存在的多肽。
67.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中Z1和Z2衍生自不同的物种或为合成的。
68.根据权利要求1-3任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中所述肠激酶可切割融合多肽由式(I)组成。
69.编码根据权利要求1-68中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽的DNA序列。
70.包含与上游启动子和下游终止子可操作地连接的根据权利要求69所述的DNA序列的表达载体。
71.包含根据权利要求70所述的表达载体的宿主细胞。
72.根据权利要求71所述的宿主细胞，其为酵母、细菌或真菌。
73.根据权利要求71所述的宿主细胞，其选自酵母属的种(Saccharomyces spp.)、毕赤酵母属的种(Pichia spp.)、汉逊酵母属的种(Hansenula spp.)和克鲁维酵母属的种(Kluyveromyces spp.)。
74.根据权利要求71所述的宿主细胞，其为酿酒酵母。
75.根据权利要求71所述的宿主细胞，其选自大肠杆菌和芽孢杆菌属的种(Bacillus spp.)。
76.用于切割肠激酶可切割融合多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)表达根据权利要求1-68任一项所述的肠激酶可切割融合多肽；
b)使所述肠激酶可切割融合多肽与肠激酶在有利于切割的条件下接触。
77.用于制备目标多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)表达根据权利要求1-68中的任一项所述的肠激酶可切割融合多肽，其中所述目标多肽是式(I)中的Z1，
b)使所述肠激酶可切割融合多肽与肠激酶在有利于切割的条件下接触；以及
c)分离所述目标多肽。
78.根据权利要求76或77所述的方法，其中步骤b)中使用的所述肠激酶选自牛肠激酶、牛肠激酶轻链或其功能性变体。
79.根据权利要求76或77所述的方法，其中所述肠激酶是牛肠激酶轻链变体(C112A)或牛肠激酶轻链变体(C112A, L134K, I135K)。
80.根据权利要求76或77所述的方法，其中在步骤b)中的所述接触在包含有机溶剂的水溶液中进行。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、丙酮、甘油或其混合物。
82.根据权利要求80所述的方法，其中所述有机溶剂是浓度为10%w/w到25%w/w的乙醇。
83.根据权利要求77所述的方法，其中所述步骤c)是任选的。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6200087B2 (ja) * 2013-12-17 2017-09-20 ノヴォ ノルディスク アー／エス エンテロキナーゼ切断性ポリペプチド
EP3964522A1 (en) * 2015-11-16 2022-03-09 Ubiprotein, Corp. A method for extending half-life of a protein
US11230585B2 (en) * 2016-09-06 2022-01-25 Chemical & Biopharmaceutical Laboratories Of Patra Proinsulin derivatives
WO2018083335A1 (en) * 2016-11-07 2018-05-11 Novo Nordisk A/S Dchbs-active esters of peg compounds and their use
CN117467649A (zh) * 2022-10-31 2024-01-30 杭州先为达生物科技股份有限公司 高特异性肠激酶酶切方法及乙醇在提高肠激酶酶切特异性中的用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005007699A2 (en) * 2003-07-15 2005-01-27 Cambridge Antibody Technology Limited Human antibody molecules for il-13
WO2008043847A1 (en) * 2006-10-13 2008-04-17 Novo Nordisk Health Care Ag Processing enzymes fused to basic protein tags

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050158838A1 (en) * 2000-06-19 2005-07-21 Dyax Corp., A Delaware Corporation Novel enterokinase cleavage sequences
EP1326882A2 (en) * 2000-06-19 2003-07-16 Dyax Corp. Enterokinase cleavage sequences and their use
US7648962B2 (en) * 2002-11-26 2010-01-19 Biocon Limited Natriuretic compounds, conjugates, and uses thereof
WO2006067198A2 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Direvo Biotech Ag Targeted use of engineered enzymes
US9238010B2 (en) * 2011-01-13 2016-01-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vesicles and nanostructures from recombinant proteins
US20120207734A1 (en) * 2011-02-14 2012-08-16 Allergan, Inc. Methods of Inhibiting Aberrant Blood Vessel Formation Using Opioid Retargeted Endpeptidases
WO2012112434A1 (en) * 2011-02-14 2012-08-23 Allergan, Inc. Inhibiting aberrant blood vessel formation using retargeted endopeptidases
WO2012112422A1 (en) * 2011-02-14 2012-08-23 Allergan, Inc. Inhibiting aberrant blood vessel formation using growth factor retargeted endopeptidases
ES2819288T3 (es) * 2011-12-23 2021-04-15 Novo Nordisk As Cadena ligera de enteroquinasa modificada
JP6200087B2 (ja) * 2013-12-17 2017-09-20 ノヴォ ノルディスク アー／エス エンテロキナーゼ切断性ポリペプチド

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005007699A2 (en) * 2003-07-15 2005-01-27 Cambridge Antibody Technology Limited Human antibody molecules for il-13
WO2008043847A1 (en) * 2006-10-13 2008-04-17 Novo Nordisk Health Care Ag Processing enzymes fused to basic protein tags

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Conservation of the function counts:homologous neurons express sequence-related neuropeptides that originate from different genes;Susanne Neupet等;《Journal of Neurochemistry》;20090827;第757-765页 *
Protease specificity determination by using cellular libraries of peptide substrates (CLiPS);Kevin T等;《PNAS》;20060516;第7585页表2、第7586页左栏第1段-右栏第1段 *
The pheromone biosynthesis activating neuropeptide (PBAN) receptor of Heliothis virescens: Identification, functional expression, and structure–activity relationships of ligand analogs;Young-Joon Kim等;《peptides》;20071205;第268-275页 *

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Publication number Publication date
EP3083701A1 (en) 2016-10-26
ES2754271T3 (es) 2020-04-16
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WO2015091613A1 (en) 2015-06-25
EP3083701B1 (en) 2019-08-07
US9982287B2 (en) 2018-05-29
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US20160319321A1 (en) 2016-11-03
JP2017184764A (ja) 2017-10-12

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