JP2016537974A - エンテロキナーゼ切断性ポリペプチド - Google Patents
エンテロキナーゼ切断性ポリペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016537974A JP2016537974A JP2016529909A JP2016529909A JP2016537974A JP 2016537974 A JP2016537974 A JP 2016537974A JP 2016529909 A JP2016529909 A JP 2016529909A JP 2016529909 A JP2016529909 A JP 2016529909A JP 2016537974 A JP2016537974 A JP 2016537974A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enterokinase
- polypeptide
- cleavable fusion
- amino acid
- fusion polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/57563—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21009—Enteropeptidase (3.4.21.9), i.e. enterokinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
a)式:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) 配列番号1
[式中、
Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、
X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、
X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]
のポリペプチドを含む、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを発現させる工程であり、前記標的ポリペプチドが、式(I)のZ1である、工程と、
b)前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを、切断を容易にする条件下でエンテロキナーゼと接触させる工程と、
c)前記標的ポリペプチドを、任意選択で単離する工程と
を含む方法が提供される。
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) 配列番号1
[式中、
Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、
X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、
X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]
のポリペプチドを含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドであって、
i)Z1が、機能的なポリペプチド、例えば薬学的に活性なポリペプチド又は酵素を含むか、又はii)前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドが、式(I)からなり、Z2が、40個以下のアミノ酸残基を含み、例えばZ2が非存在であるか、Z2が、アミノ酸残基であるか、若しくはZ2が、2個〜40個のアミノ酸残基を含むポリペプチドである、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドが提供される。
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) 配列番号1
[式中、
Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、
X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、
X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]
のポリペプチドを含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドに関する。一実施形態では、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドは、式(I)からなる。
エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドは、組換え核酸技法により作製することができる。一般に、Z2、X6-X5-X4-GDR、及びZ1をコードする核酸配列は、合成により得る(小型のポリペプチドについて)か、又は所望のポリペプチドをコードするように修飾されたクローニングされたDNAとして得る。Z2をコードする核酸配列は、野生型のDNAをクローニングすることにより得ることができることが多いが、Z2が限定されたサイズのポリペプチドである場合はまた、合成により得ることもできる。エンテロキナーゼ部位をコードする核酸配列であって、5個〜6個のアミノ酸残基だけのポリペプチドである、X6-X5-X4-GDRは通例、合成により得られると予想される。特に、Z2が、むしろ小型のポリペプチドである状況では、X6-X5-X4-GDRはなお、Z2をコードする同じ核酸配列によりコードされうる。Z2、X6-X5-X4-GDR、及びZ1の異なる部分をコードする核酸配列は、式(I)の、少なくともエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードする1つの核酸配列を構成するように、インフレームで融合させる。このような融合ポリペプチドは、タグなど、例えばHisタグ、又は可溶化ドメイン(DsbC、RL9、MBP、NusA又はTrxなど)など、N末端又はC末端の伸長部分(Z1及びZ2としての、又はZ1内及びZ2内の)を伴うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド、又はN末端又はC末端の伸長部分を伴わないエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドであり得る。次いで、この修飾核酸配列を発現ベクターへと挿入し、これを順に発現宿主細胞に形質転換又はトランスフェクトする。
a)式:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) 配列番号1
[式中、
Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、
X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、
X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]
のポリペプチドを含む、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを発現させる工程であり、前記標的ポリペプチドが、式(I)のZ1である、工程と、
b)前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを、切断を容易にする条件下でエンテロキナーゼと接触させる工程と
を含む方法を提供する。
a)本発明に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを発現させる工程であり、前記標的ポリペプチドが、式(I)のZ1である、工程と、
b)前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを、切断を容易にする条件下でエンテロキナーゼと接触させる工程と、
c)前記標的ポリペプチドを単離する工程と
を含む方法を提供する。
本発明は、以下の非限定的な実施形態により、更に記載される。
1.式:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) 配列番号1
[式中、
Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、
X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、
X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]
のポリペプチドを含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
2.式:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) 配列番号1
[式中、
Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、
X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、
X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]
のポリペプチドを含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドであって、
i)Z1が、機能的なポリペプチド、例えば薬学的に活性なポリペプチド又は酵素を含むか、ii)前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドが、式(I)からなり、Z2が、40個以下のアミノ酸残基を含むか、又はiii)Z2が、可溶化ドメインを含む、
エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
3.X5が、G、P、A、V、L、M、C、F、Y、W、H、K、R、Q、N、E、D、及びTである、実施形態1又は2に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
4.X4が、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、又はTである、実施形態1〜3のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
5.X4が、E、Q、L、D、G、又はAである、実施形態1〜4のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
6.X4が、Eである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
7.X4が、Qである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
8.X4が、Lである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
9.X4が、Dである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
10.X4が、Gである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
11.X4が、Aである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
12.X5が、D又はEである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
13.X5が、Dである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
14.X5が、Eである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
15.X5-X4が、DEである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
16.X5-X4が、DDである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
17.X5-X4が、DLである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
18.X5-X4が、DQである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
19.X5-X4が、DGである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
20.X5-X4が、DAである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
21.X5-X4が、DSである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
22.X5-X4が、EEである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
23.X5-X4が、EQである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
24.X5-X4が、ELである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
25.X5-X4が、EDである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
26.X5-X4が、EGである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
27.X5-X4が、EAである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
28.X5-X4が、ESである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
29.X5-X4が、QEである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
30.X5-X4が、HEである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
31.X5-X4が、NEである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
32.X5-X4が、MEである、実施形態1〜5のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
33.X6が、I、G、L、T、R、S、M、H、F、P、V、W、K、E、Y、又はQである、実施形態1〜32のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
34.X6が、I、G、L、T、R、S、M、H、F、P、V、又はWである、実施形態33に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
35.X6が、I、G、L、T、R、又はSである、実施形態34に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
36.X6が、Iである、実施形態35に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
37.X6が、Gである、実施形態35に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
38.X6が、非存在である、実施形態1〜32のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
39.Z2が、宿主細胞内の前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの発現を容易にするポリペプチドである、実施形態1〜38のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
40.前記宿主細胞が、大腸菌である、実施形態39に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
41.前記宿主細胞が、酵母である、実施形態39に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
42.前記宿主細胞が、サッカロミセス・セレビシエである、実施形態39〜40に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
43.Z2が、非存在である、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
44.Z2が、0個〜10個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである、実施形態1〜43のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
45.Z2が、2個〜8個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
46.Z2が、少なくとも8個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
47.Z2が、40個以下のアミノ酸残基を含む、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
48.Z2が、アミノ酸残基であるか、又はZ2が、2個〜40個のアミノ酸残基を含むポリペプチドである、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
49.Z2が、約8個〜約200個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
50.Z2が、約10個〜約25個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
51.Z2が、EEK、EEAEK、HK、EEAHK、E(EA)2HK、E(EA)3HK、EEGHK、EHPK、EEGEPK、EEAHELK、EEAHEVK、EEAHEMK、EEAHEFK、EEAHEYK、EEAHEWKEEGNTTPK、及びEELDARLEALKからなる群から選択される、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
52.Z2が、DV、DVKPGQPLA、DVKPGQPEY、DVKPGEPLY、DVKPGQPLY、DVKPGQPLE、及びDVKPGQPMYからなる群から選択される、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
53.Z2が、DVKPGQPLY、DVKPGQELY、DVKPGEPLY、DVKPEQPLY、DVKPGQPEY、DVKEGQPLY、DVKPGQPLA、DVKPGQPLE、及びDVEPGQPLYからなる群から選択される、実施形態1〜42のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
54.Z2が、QPMYKR、GQPMYK、PGQPMY、KPGQPM、LKPGQP、QLKPGQ、LQLKPG、WLQLKP、HWLQLK、WHWLQL、AWHWLQ、EAWHWL、AEAWHW、及びEAEAWHからなる群から選択される配列を含む、実施形態1〜42に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
55.Z2が、可溶化ドメインを含む、実施形態1〜54のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
56.Z1が、機能的なポリペプチド、例えば薬学的に活性なポリペプチド又は酵素を含む、実施形態1〜55のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
57.Z1が、薬学的に活性なポリペプチド、酵素、又はこれらの前駆体である、実施形態1〜56のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
58.Z1が、GLP-1ペプチド又はその機能的な変異体である、実施形態1〜57のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
59.Z1が、K34R-GLP-1(7〜37)又はK34R-GLP-1(9〜37)である、実施形態58に従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
60.Z1が、グルカゴンペプチド又はその機能的な変異体である、実施形態1〜57のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
61.Z1が、インスリン前駆体又はその機能的な変異体である、実施形態1〜57のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
62.Z1が、エキセンディン、PYY、レプチン、及びこれらの機能的な変異体からなる群から選択される、実施形態1〜57のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
63.Z1が、約15個〜約100個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである、実施形態1〜62のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
64.Z1が、約15個〜約50個のアミノ酸残基を有するポリペプチドである、実施形態1〜63のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
65.非自然発生のポリペプチドである、実施形態1〜64のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
66.Z1とZ2とが、異なる起源、すなわち、異なる種に由来するか、又は合成である、実施形態1〜65のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
67.前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドが、式(I)からなる、実施形態1〜66のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
68.実施形態1〜67のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードするDNA配列。
69.上流のプロモーター及び下流のターミネーターに作動的に連結された、実施形態68に従うDNA配列を含む発現ベクター。
70.実施形態69に従う発現ベクターを含む宿主細胞。
71.酵母、細菌、又は真菌である、実施形態70に従う宿主細胞。
72.サッカロミセス属種、ピキア属種、ハンセヌラ属種、及びクルイベロミセス属種からなる群から選択される、実施形態70〜71のいずれかに従う宿主細胞。
73. サッカロミセス・セレビシエである、実施形態70〜72のいずれかに従う宿主細胞。
74.大腸菌及びバチルス属種からなる群から選択される、実施形態70〜71のいずれかに従う宿主細胞。
75.エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを切断するための方法であって、
a)式:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) 配列番号1
[式中、
Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、
X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、
X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]
のポリペプチドを含む、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを発現させる工程であり、前記標的ポリペプチドが、式(I)のZ1である、工程と、
b)前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを、切断を容易にする条件下でエンテロキナーゼと接触させる工程と
を含む方法。
76.標的ポリペプチドを作製するための方法であって、
a)実施形態1〜67のいずれかに従うエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを発現させる工程であり、前記標的ポリペプチドが、式(I)のZ1である、工程と、
b)前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを、切断を容易にする条件下でエンテロキナーゼと接触させる工程と、
c)前記標的ポリペプチドを単離する工程と
を含む方法。
77.工程b)で使用される前記エンテロキナーゼが、ウシエンテロキナーゼ、ウシエンテロキナーゼ軽鎖、又はこれらの機能的な変異体から選択される、実施形態75又は76に従う方法。
78.前記エンテロキナーゼが、ウシエンテロキナーゼ軽鎖変異体(C112A)、(C112A、L134K、I135K)、又はこれらの機能的な変異体である、実施形態75〜78のいずれかに従う方法。
79.工程b)の前記接触させる工程が、有機溶媒を含む水溶液中で実行される、実施形態75〜77のいずれかに従う方法。
80.前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、i-プロパノール、n-プロパノール、アセトン、グリセロール、又はこれらの混合物から選択される、実施形態78に従う方法。
81.前記有機溶媒が、約10%w/w〜約25%w/wの濃度のエタノールである、実施形態79に従う方法。
82.前記工程c)が、任意選択である、実施形態76〜80のいずれかに従う方法。
83.アミノ酸配列Z2-X8-X7を含むペプチドであって、Z2が、実施形態1〜82のいずれかで規定されている通りであり、X8が、非存在であるか、又はエンテロキナーゼ切断部位を含むペプチドであり、X7が、少なくとも1個のアミノ酸を含むポリペプチドである、ペプチド。
84.X8が、非存在である、実施形態83に従うペプチド。
85.X8が、少なくとも3個のアミノ酸、少なくとも4個のアミノ酸、又は少なくとも5個のアミノ酸など、少なくとも2個のアミノ酸を含む、実施形態83に従うペプチド。
86.X8が、3個〜20個のアミノ酸、4個〜15個のアミノ酸、又は少なくとも5個〜10個のアミノ酸など、1個〜30個のアミノ酸を含む、実施形態83に従うペプチド。
87.X7が、少なくとも5個のアミノ酸、少なくとも10個のアミノ酸、又は少なくとも15個のアミノ酸を含む、実施形態83〜86のいずれかに従うペプチド。
88.X7が、10個〜70個のアミノ酸、又は20個〜50個のアミノ酸など、1個〜100個のアミノ酸を含む、実施形態83〜86のいずれかに従うペプチド。
89.X7が、実施形態1〜88のいずれかで規定されたZ1である、実施形態83〜86のいずれかに従うペプチド。
90.Z1が、GLP-1ペプチド又はその機能的な変異体である、実施形態89に従うペプチド。
91.Z2-X8-X7が、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドである、実施形態83〜90のいずれかに従うペプチド。
92.X8が、アミノ酸配列X6-X5-X4-G-D-Rを含み、X6、X5、及びX4が、実施形態1〜91のいずれかで規定されている通りである、実施形態83〜91のいずれかに従うペプチド。
93.X8が、アミノ酸配列DDGDR又はDEGDRを含む、実施形態83〜91のいずれかに従うペプチド。
EK:エンテロキナーゼ又はエンテロキナーゼ軽鎖
D4K:DDDDK
NMP:N-メチル-2-ピロリドン
Abz:2-アミノベンゾイル
Dnp:2,4-ジニトロフェニル
一般的な調製法
方法:SPPS_I(固相ペプチド合成)
C末端Lys(Abz)アミドフルオロフォア及びN末端Lys(Dnp)消光剤を有する、分子内消光型蛍光発光性ペプチド基質を、固相ペプチド合成により合成した。
Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 * 式(II)
[式中、
X6-X5-X4は、式(I)における意味と同じ意味を有し(各々は、アミノ酸であるが、X6は任意選択である)、
Z2 *は、Lys(Dnp)であり、
Z1 *は、Z1-Lys(Abz)アミドであり(式中、Z1は、式(I)で規定される通りである)]
を有する。
精製エンテロキナーゼ酵素の調製物は、WO2013/092855A1において記載されている手順に従い調製した。
方法:EK-反応速度_1
EK-反応速度_1は、式(II)に従う、分子内消光型蛍光発光性ペプチド:Lys(Dnp)-ペプチド-Lys(Abz)アミドの加水分解の初期速度を測定することにより実施した。一般に、1〜50μMの範囲の基質濃度で、ペプチドのバックグラウンド蛍光を測定した後で、加水分解の初期速度、すなわち、30分間で5%未満の加水分解の読取りを可能とする濃度で精製エンテロキナーゼ酵素を添加することにより、加水分解の初期速度を測定した。典型的には、1〜10nMの酵素濃度を使用できる。最長で1時間にわたる加水分解の後、更なる酵素を添加して、総加水分解時における蛍光レベルの測定を可能とした。加水分解速度は一般に、50mMのMOPS緩衝液、1mMのEDTA、pH 7.5中、25℃で、励起のための320nm及び発光のための420nmを使用する、Perkin Elmer Enspire蛍光プレートリーダーを使用して測定した。
EK-反応速度_2は、N末端伸長部分を含む全長GLP-1の加水分解の初期速度を計算することにより実施した。基質濃度は、150〜300μMの範囲とした。加水分解反応は、9.5nMの最終濃度をもたらす量のエンテロキナーゼを添加することにより開始させた。試料は、6.2分後、18.7分後、43.7分後、86.3分後、151.3分後、及び243.8分後に採取し、5%の酢酸中への1+9希釈によりクエンチした。Waters iClass UPLC上で適切な方法を使用して、残りの基質及び解析的逆相カラム上に形成された産物を分離し、ピーク面積を積分することにより、これらを個別に定量化した。以下の形の式:
を、生データへと当てはめた。0.1μMの定数Kiを、全ての反応のために使用した。初期加水分解速度は、全てのペプチドの、1mg/mlの初期基質濃度について決定されたパラメータに基づき計算した。全ての反応は、50mMのトリス緩衝液、1mMのEDTA、pH 8.5中で実施した。
本明細書の実施例のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
GLP-1(7〜37)のN末端を含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度
実施例1〜39の全てについて、基質は、Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *[式中、Z1は、HAEGT(配列番号10)、すなわち、GLP-1(7〜37)に由来するN末端ペンタペプチドであり、X6は、非存在であり、X5-X4は、Table 1(表1)で指定される通りである]である。基質は、SPPS-I法により合成し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度_1法により決定した。実施例1〜39のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
GLP-1(9〜37)変異体のN末端を含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度
実施例40〜59の全てについて、基質は、Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *[式中、Z1は、EGTFT(配列番号13)、すなわち、GLP-1(9〜37)に由来するN末端ペンタペプチドであり、X6は、非存在であり、X5-X4は、Table 2(表2)で指定される通りである]である。基質は、SPPS-I法により合成し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度_1法により決定した。実施例40〜59のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
エキセンディン-4のN末端を含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度
実施例60〜79の全てについて、基質は、Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *[式中、Z1は、HGEGT(配列番号14)、すなわち、エキセンディン-4に由来するN末端ペンタペプチドであり、X6は、非存在であり、X5-X4は、Table 3(表3)で指定される通りである]である。基質は、SPPS-I法により合成し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度_1法により決定した。実施例60〜79のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
グルカゴン類似体のN末端を含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度
実施例80〜83の全てについて、基質は、Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *[式中、Z1は、HGTFT(配列番号15)、すなわち、グルカゴン類似体に由来するN末端ペンタペプチドであり、X5-X4は、Table 4(表4)で指定される通りである]である。基質は、SPPS-I法により合成し、EK精製により精製し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度_1法により決定した。実施例80〜83のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
グルカゴン類似体のN末端を含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度
実施例84〜87の全てについて、基質は、Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *[式中、Z1は、QGTFT(配列番号16)、すなわち、グルカゴン類似体に由来するN末端ペンタペプチドであり、X6は、非存在であり、X5-X4は、Table 5(表5)で指定される通りである]である。基質は、SPPS-I法により合成し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度1_法により決定した。実施例84〜87のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
ヒトグルカゴンのN末端を含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度
実施例88〜91の全てについて、基質は、Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *[式中、Z1は、HSQGT(配列番号17)、すなわち、ヒトグルカゴンに由来するN末端ペンタペプチドであり、X6は、非存在であり、X5-X4は、Table 6(表6)で指定される通りである]である。基質は、SPPS-I法により合成し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度_1法により決定した。実施例88〜91のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
GLP-1(7〜37)のN末端及び異なるX6を含む基準エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度
実施例92〜110の全てについて、基質は、Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *[式中、Z1は、HAEGT(配列番号10)、すなわち、GLP-1(7〜37)に由来するN末端ペンタペプチドであり、X5-X4は、DEであり、X6は、Table 7(表7)で指定される通りである]である。基質は、SPPS-I法により合成し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度_1法により決定した。実施例92〜110のために使用されたエンテロキナーゼ酵素は、WO2013/092855A1において記載されている、ウシ軽鎖変異体(C112A、L134K、I135K)であった。
GLP-1(7〜37)のN末端を含む基準エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度
実施例111〜117の全てについて、基質は、Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *[式中、Z1は、HAEGT(配列番号10)、すなわち、GLP-1(7〜37)に由来するN末端ペンタペプチドであり、X6は、非存在であり、X5-X4-GDRに対応するエンテロキナーゼ部位は、Table 8(表8)で指定される通りである]である。基質は、SPPS-I法により合成し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度_1法により決定した。
全[Arg34]GLP-1(9〜37)配列を含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの相対切断速度、及びN末端伸長部分、及びDDDDKを含む基準エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド
実施例118〜135の全てについて、基質は、Z2 *-X6-X5-X4-GDR-Z1 *[式中、Z2及びZ1は、Table 9(表9)で規定される通りである、すなわち、Z2は、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドのN末端伸長部分であり、Z1は、{Arg34}GLP-1(9〜37)であり、X6は、非存在であり、X5-X4-GDRに対応するエンテロキナーゼ部位は、基準例を除き、Table 9(表9)で指定される通りであった]であり、Table 9(表9)(例えば、実施例118)で指定される通り、基質は、Z2 *-X6-DDDDK-Z1 *であった。基質は、SPPS-I法により合成し、それらの初期エンテロキナーゼ切断速度は、EK-反応速度_2法により決定した。
Claims (15)
- 標的ポリペプチドを作製するための方法であって、
a)式:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) 配列番号1
[式中、
Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、
X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、
X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]
のポリペプチドを含む、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを発現させる工程であり、前記標的ポリペプチドが、式(I)のZ1である、工程と、
b)前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドを、切断を容易にする条件下でエンテロキナーゼと接触させる工程と、
c)前記標的ポリペプチドを、任意選択で単離する工程と
を含む方法。 - X4が、E、Q、L、D、G、又はAである、請求項1に記載の方法。
- X5-X4が、DD、DE、DL、DQ、EE、及びEQからなる群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- X5-X4が、DD又はDEである、請求項1又は2に記載の方法。
- Z2が、宿主細胞内の前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドの発現を容易にするポリペプチドである、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- Z2が、2個〜50個のアミノ酸残基を有するポリペプチドであるか、Z2が、アミノ酸残基であるか、又はZ2が、非存在である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- Z1が、機能的なポリペプチド、例えば薬学的に活性なポリペプチド又は酵素を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- Z1が、GLP-1ペプチド又はその機能的な変異体であり、例えばK34R-GLP-1(7〜37)又はK34R-GLP-1(9〜37)である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- Z1が、グルカゴンペプチド又はその機能的な変異体である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b)の前記接触させる工程が、有機溶媒を含む水溶液中で実行される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 式:
Z2-X6-X5-X4-G-D-R-Z1 (I) 配列番号1
[式中、
Z1は、少なくとも2個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、
X4は、E、Q、L、D、G、A、S、F、H、Y、W、T、又はMであり、
X5は、S及びI以外の、遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
X6は、非存在であるか、又は遺伝子によりコードされるアミノ酸から選択され、
Z2は、任意選択のポリペプチド又はアミノ酸残基である]
のポリペプチドを含むエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドであって、
i)Z1が、機能的なポリペプチド、例えば薬学的に活性なポリペプチド又は酵素を含むか、又はii)前記エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドが、式(I)からなり、Z2が、40個以下のアミノ酸残基を含み、例えばZ2が非存在であるか、Z2が、アミノ酸残基であるか、若しくはZ2が、2個〜40個のアミノ酸残基を含むポリペプチドである、エンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。 - 請求項2から9のいずれか一項に規定される、請求項11に記載のエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチド。
- 請求項11又は12に記載のエンテロキナーゼ切断性融合ポリペプチドをコードするDNA配列。
- 上流のプロモーター及び下流のターミネーターに作動的に連結された、請求項13に記載のDNA配列を含む発現ベクター。
- サッカロミセス属種、ピキア属種、ハンセヌラ属種、及びクルイベロミセス属種からなる群から選択されうる、請求項14に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP13197732 | 2013-12-17 | ||
EP13197732.4 | 2013-12-17 | ||
PCT/EP2014/078165 WO2015091613A1 (en) | 2013-12-17 | 2014-12-17 | Enterokinase cleavable polypeptides |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017136915A Division JP2017184764A (ja) | 2013-12-17 | 2017-07-13 | エンテロキナーゼ切断性ポリペプチド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016537974A true JP2016537974A (ja) | 2016-12-08 |
JP6200087B2 JP6200087B2 (ja) | 2017-09-20 |
Family
ID=49765411
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016529909A Active JP6200087B2 (ja) | 2013-12-17 | 2014-12-17 | エンテロキナーゼ切断性ポリペプチド |
JP2017136915A Withdrawn JP2017184764A (ja) | 2013-12-17 | 2017-07-13 | エンテロキナーゼ切断性ポリペプチド |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017136915A Withdrawn JP2017184764A (ja) | 2013-12-17 | 2017-07-13 | エンテロキナーゼ切断性ポリペプチド |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9982287B2 (ja) |
EP (1) | EP3083701B1 (ja) |
JP (2) | JP6200087B2 (ja) |
CN (1) | CN105829350B (ja) |
ES (1) | ES2754271T3 (ja) |
WO (1) | WO2015091613A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6200087B2 (ja) * | 2013-12-17 | 2017-09-20 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | エンテロキナーゼ切断性ポリペプチド |
EP3960760A1 (en) * | 2015-11-16 | 2022-03-02 | Ubiprotein, Corp. | A method for extending half-life of a protein |
BR112019004314A2 (pt) * | 2016-09-06 | 2019-05-28 | Chemical & Biopharmaceutical Laboratories Of Patras S A | derivados pró-insulina |
EP3534962B1 (en) * | 2016-11-07 | 2020-08-19 | Novo Nordisk A/S | Dchbs-active esters of peg compounds and their use |
CN115786426B (zh) * | 2022-10-31 | 2023-09-08 | 杭州先为达生物科技有限公司 | 高特异性肠激酶酶切方法及乙醇在提高肠激酶酶切特异性中的用途 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004503219A (ja) * | 2000-06-19 | 2004-02-05 | ダイアックス コーポレーション | 新規エンテロキナーゼ開裂配列 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050158838A1 (en) * | 2000-06-19 | 2005-07-21 | Dyax Corp., A Delaware Corporation | Novel enterokinase cleavage sequences |
US7648962B2 (en) * | 2002-11-26 | 2010-01-19 | Biocon Limited | Natriuretic compounds, conjugates, and uses thereof |
GB0407315D0 (en) * | 2003-07-15 | 2004-05-05 | Cambridge Antibody Tech | Human antibody molecules |
EP1827486A2 (en) * | 2004-12-22 | 2007-09-05 | Direvo Biotech AG | Targeted use of engineered enzymes |
US7858338B2 (en) * | 2006-10-13 | 2010-12-28 | Novo Nordisk Health Care Ag | Processing enzymes fused to basic protein tags |
US9238010B2 (en) * | 2011-01-13 | 2016-01-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Vesicles and nanostructures from recombinant proteins |
US20120207743A1 (en) * | 2011-02-14 | 2012-08-16 | Allergan, Inc. | Inhibiting Aberrant Blood Vessel Formation Using Retargeted Endopeptidases |
US20120207734A1 (en) * | 2011-02-14 | 2012-08-16 | Allergan, Inc. | Methods of Inhibiting Aberrant Blood Vessel Formation Using Opioid Retargeted Endpeptidases |
US20120207704A1 (en) * | 2011-02-14 | 2012-08-16 | Allergan, Inc. | Inhibiting Aberrant Blood Vessel Formation Using Growth Factor Retargeted Endopeptidases |
EP2794875B1 (en) * | 2011-12-23 | 2020-07-22 | Novo Nordisk A/S | Modified enterokinase light chain |
JP6200087B2 (ja) * | 2013-12-17 | 2017-09-20 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | エンテロキナーゼ切断性ポリペプチド |
-
2014
- 2014-12-17 JP JP2016529909A patent/JP6200087B2/ja active Active
- 2014-12-17 EP EP14827189.3A patent/EP3083701B1/en active Active
- 2014-12-17 CN CN201480069335.7A patent/CN105829350B/zh active Active
- 2014-12-17 US US15/104,793 patent/US9982287B2/en active Active
- 2014-12-17 WO PCT/EP2014/078165 patent/WO2015091613A1/en active Application Filing
- 2014-12-17 ES ES14827189T patent/ES2754271T3/es active Active
-
2017
- 2017-07-13 JP JP2017136915A patent/JP2017184764A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004503219A (ja) * | 2000-06-19 | 2004-02-05 | ダイアックス コーポレーション | 新規エンテロキナーゼ開裂配列 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY, 2009, VOL.111, PP.757-765, JPN6016039615 * |
PEPTIDES, 2008, 29(2):268-275, JPN6016039613 * |
PNAS, 2006, 103(20):7583-7588, JPN6016039617 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2015091613A1 (en) | 2015-06-25 |
ES2754271T3 (es) | 2020-04-16 |
CN105829350A (zh) | 2016-08-03 |
US20160319321A1 (en) | 2016-11-03 |
CN105829350B (zh) | 2021-01-08 |
US9982287B2 (en) | 2018-05-29 |
EP3083701A1 (en) | 2016-10-26 |
EP3083701B1 (en) | 2019-08-07 |
JP2017184764A (ja) | 2017-10-12 |
JP6200087B2 (ja) | 2017-09-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2017184764A (ja) | エンテロキナーゼ切断性ポリペプチド | |
US7544512B2 (en) | Method of producing insulinotropic GLP-1 (7-36) polypeptide and/or GLP-1 analogs | |
Peng et al. | A simple cost-effective methodology for large-scale purification of recombinant non-animal collagens | |
EP3458472B1 (en) | Method for purification and activation of botulinum neurotoxin | |
JP2004518444A (ja) | 重要なタンパク質の細菌培養上清中への分泌のための融合タンパク質 | |
US11795488B2 (en) | Methods for enzymatic peptide ligation | |
Zhu et al. | Cleavage of fusion proteins on the affinity resins using the TEV protease variant | |
US9611466B2 (en) | Modified enterokinase light chain | |
Austin et al. | The substrate specificity of Metarhizium anisopliae and Bos taurus carboxypeptidases A: Insights into their use as tools for the removal of affinity tags | |
US20030134352A1 (en) | Facilitating protein folding and solubility by use of peptide extensions | |
US20160122793A1 (en) | Fusion Protease | |
Xu et al. | A simplified method to remove fusion tags from a xylanase of Bacillus sp. HBP8 with HRV 3C protease | |
WO2009005140A1 (ja) | 組換えC-末端α-アミド化酵素誘導体 | |
WO2017118752A1 (en) | Modified enterokinase light chain and its preparation method | |
JP2015510770A (ja) | 組換えペプチドの産生方法 | |
KR20110086711A (ko) | 봉입체 형성 단백질의 제조방법 | |
JP4891581B2 (ja) | ポリペプチドの製造方法およびキット | |
Yan et al. | The use of SUMO as a fusion system for protein expression and purification | |
JP4663524B2 (ja) | OmpTプロテアーゼ変異体を用いたポリペプチドの切断方法 | |
EP2867250A2 (en) | Proinsulin with enhanced helper sequence | |
JP2020513834A (ja) | ペプチドの発現および大規模生産 | |
KR20090058219A (ko) | 고농도 우레아하에서 안정된 활성을 갖는 디유비퀴틸레이팅효소를 이용한 펩티드의 제조방법 | |
Makkapati | Recombinant production of peptides using SUMO as a fusion partner | |
WO2012098009A1 (en) | Chimeric polypeptide comprising a membrane protein and an insulin precursor | |
JPWO2021028590A5 (ja) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20160929 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20161017 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170117 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170120 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20170313 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170713 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20170720 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170731 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170824 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6200087 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |