JP2010505437A - 塩基性タンパク質タグに融合したプロセシング酵素 - Google Patents
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- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
Abstract
Description
これらのタグの幾つかは同時係属出願のPCT/EP2006/061493に開示されている。
「リボソームタンパク質」とはあらゆる生物におけるmRNA指向性タンパク質合成を触媒する粒子であるリボソームのペプチド又はポリペプチドサブユニットを意味する。リボソームタンパク質は、InterPro及びPrositeのようなドメインデータベースにおいて報告されているようなリボソームサインによりその配列に基づいて定義される。リボソームタンパク質を使用する利点は、それらが殆どは非常に陽性に荷電していることである。
更なる実施態様では、タグは約15から約250、約15から約225、15から約200、約15から約175、約15から約150、15から約75、又は約15から約50のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約15から約250のアミノ酸残基を有する。
一実施態様では、タグは約15から約200のアミノ酸残基を有する。
一実施態様では、タグは約15から約150のアミノ酸残基を有する。
一実施態様では、タグは約15から約100のアミノ酸残基を有する。
一実施態様では、タグは約15から約50のアミノ酸残基を有する。
一実施態様では、タグは約20から約120のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約20から約100のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約20から約90のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約20から約75のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約20から約50のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約50から約250のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約50から約225のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約50から約200のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約50から約175のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約50から約150のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約50から約125のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約50から約100のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約50から約75のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約75から約250のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約75から約225のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約75から約200のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約75から約175のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約75から約150のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約75から約125のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約75から約100のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約100から約250のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約100から約225のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約100から約200のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約100から約175のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約100から約150のアミノ酸残基を含む。
一実施態様では、タグは約100から約125のアミノ酸残基を含む。
他の実施態様では、タグは約20から約50%、約20から約40%又は約20から約30%の塩基性アミノ酸残基を含む。
他の実施態様では、タグは約40%から約60%の塩基性アミノ酸残基,lys及びargを含む。
一実施態様では、タグは15から50%の塩基性アミノ酸残基を含む。
他の実施態様では、タグは15から45%の塩基性アミノ酸残基を含む。
他の実施態様では、タグは15から40%の塩基性アミノ酸残基を含む。
他の実施態様では、タグは15から35%の塩基性アミノ酸残基を含む。
他の実施態様では、タグは15から30%の塩基性アミノ酸残基を含む。
他の実施態様では、タグは15から25%の塩基性アミノ酸残基を含む。
他の実施態様では、タグは15から20%の塩基性アミノ酸残基を含む。
MGKKTVGVKKRLAKAYKQNRRAPVWITVKTKRSVFGSPKRRHWRRSKLKV(配列番号:2);
MKRTYQPSRRKRKRTHGFLARKRTPGGRRVLKNRRRKGRWRLTV(配列番号:3);
MGKGDRRTRRGKIWRGTYGKYRPRKKK(配列番号:4);
MAKVKMKTNRSAAKRFKVTAKGKIKRWKSGGAHYNTKKSSKRKRHLRKHTYVKDNMLKHVKALLKEF(配列番号:5);
MPKHSKRYLEARKLVDRTKYYDLDEAIELVKKTATAKFDETIELHIQTGIDYRKPEQHIRGTIVLPHGTGKEVKVLVFAKGEKAKEALEAGADYVGAEDLVEKIEKEGFLDFDVAIATPDMMRIIGRLGKILGPRGLMPSPKSGTVTQEVAEAVKEFKKGRIEVRTDKTGNIHIPVGKRSFDNEKLKENIIAAIKQIMQMKPAGVKGQFIKKVVLASTMGPGIKLNLQSLLKE(配列番号:6),
MAQVDLLNVKGEKVGTLEISDFVFNIDPNYDVMWRYVDMQLSNRRAGTASTKTRGEVSGGGRKPWPQKHTGRARHGSIRSPIWRHGGVVHGPKPRDWSKKLNKKMKKLALRSALSVKYRENKLLVLDDLKLERPKTKSLKEILQNLQLSDKKTLIVLPWKEEGYMNVKLSGRNLPDVKVIIADNPNNSKNGEKAVRIDGLNVFDMLKYDYLVLTRDMVSKIEEVLGNEAGKALTA(配列番号:7),
MRYEYVPLKDQYEKEIVPALMKEFNYKNIHQVPKLVKIVINMGIGEGSRNYDLIERHANELAKITGQKPIVTRARKSISNFKIRKGMPIGLKVTLRGARMYNFLYKLINIVLPKVRDFRGLDPNSFDGRGNYSFGLSEQLVFPELNPDEVRRIQGMDITIVTTAKTDQEARRLLELFGMPFKRG(配列番号:8),
MSRLAKKPIVLPQGVTVEIKDNVVKVKGPKGELSQEFLPYVKIEVEGNEVWVRPNEEQIIRKSDWRKVKMFQGTYWSLIRNMVVGVTEGYKKELEIVGIGYRAQLQGNTLVMNLGYAHPVVYEIPSDVKIEVPAPNRIIVSGIDKQRVGQVAAEIRAFRPPNVYTGKGIRYVGEVVRQKEGKKA(配列番号:9),
MKVILLRDVPKIGKKGEIKEVSDGYARNYLIPRGFAKEYTEGLERAIKHEKEIEKRKKEREREESEKILKELKKRTHVVKVKAGEGGKIFGAVTAATVAEEISKTTGLKLDKRWFKLDKPIKELGEYSLEVSLPGGVKDTIKIRVEREE(配列番号:10),
MLTRQQKELIVKEMSEIFKKTSLILFADFLGFTVADLTELRSRLREKYGDGARFRVVKNTLLNLALKNAEYEGYEEFLKGPTAVLYVTEGDPVEAVKIIYNFYKDKKADLSRLKGGFLEGKKFTAEEVENIAKLPSKEELYAMLVGRVKAPITGLVFALSGILRNLVYVLNAIKEKKSE(配列番号:11),
MARYFPVQKTTMIKPEEVERKWYVVDASGKVLGRLATRIAKILMGKHKPNYTPHVDTGDYVIVVNADKVVLTGKKLDQKVYYWHSGYPGGLKSLTARQMLEKHPERLIWLAVKRMLPKNRKGRKMLKRLKVYASPEHPHQAQKPEPIEL(配列番号:12),
MRLEDLRPTPGAMKKRKRVGRGPGSGHGKTSGRGHKGQKARGSGKVHIWFEGGQTPLQRRLPKRGFKNINKKVYAVVNVKVLEERFEANEEVTPEKLIERKIIKDLKDGVKILGDGELTKPLVVKAHAFSKSAVEKIESAGGKAEVI(配列番号:13),
MRHRVKRHKLGRYGSHRKSLLRNLSREIVEHGSIVTTTAKAKALKTFMDKLVSKAIEAATTDDRARSVHLRRQINAVLGDRRLTNKLVDEIAKNYVGRRGGYVRVLRIGFRRGDAAEMSLVQLVEASSQEG(配列番号:14),
MDHLVKIIEKKYEKKEIPDFRPGDTVRVHVKVIEGDRERTQVFEGIVIAKRGSGINKTFTVRRIGSHGVGVERIFPVHSPVVEKIEVVRKGKVRRAKLYYLRNVRGKIRIKERRD(配列番号:15),
MRVKRAVHAKKKRKKYLKAAKGYRGALSRRYKLAKQMYVRSKWYSYVGRKQKKRDMRKLWITRINIAARNEGLKYSELIHGLKLAGVSINRKMLSELAVNDPEAFKEYVKIAKEALAS(配列番号:16),
MLYAIVETAGRQYRVEEGKILYTEKQKDYSPGDEIVFDRVVFVRKDGEVLVGKPYVEGAKVVGKVLEHAKARKVKTVKYRPRKNSKVEKGHRQWYTAIKIEKIEL(配列番号:17),
MKQEKLSLHDVLIRPIITEKALILREQRKYVFEVNPLANKNLVKEAVEKLFNVKVEKVNILNMKPKPKRRGIFEGKTRSWKKAVVTLKEGYTIKELEGEH(配列番号:18),
MAHKKSGGVAKNGRDSLPKYLGVKVGDGQIVKAGNILVRQRGTRFYPGKNVGMGRDFTLFALKDGRVKFETKNNKKYVSVYEE(配列番号:19),
MKASELRNYTDEELKNLLEEKKRQLMELRFQLAMGQLKNTSLIKLTKRDIARIKTILRERELGIRR(配列番号:20),
MPKKLKIKLVKSPIGYSWDQKDTVKRLGLKKLNQVVIKDDLPQIRGMIRKVKHLVEVEEIEEGGSNA(配列番号:21),
MPKVKTNRSAAKRFRITKNGKIMRNHAYRSHKTGKKRRNALRALRKKDVVSSADKNRVLRLLGKK(配列番号:22),
MGQKVHPRGFRLGLSADWQAKWFNEKNYKEWLLEDEEIRKIIKNKYYHAGISEIYVERPDAERINITVKTARPGIIIGRKGSEITSLREELERKFNRRVVINIEEIKTPELDAQLVAESIASRIEKRASYKVAMKRAIMNAMRKGAQGIKVMVAGRLGGAEIARREWYLRGRLPLQKIKAIIDYGTATAWTKYGTIGIKVWIYKGDADI(配列番号:23),
METQGVMKEIQYEEFEEKIIEIRRTSKVTKGGKNLSFRVVAIVGNKNGKVGLGIGKAREVPEAIRKAISAAKRNIVEVPVINGTIPHEVIGRQDASKVLLKPAAPGTGIIAGGTVRAVVELAGIQNILTKSLGSTNPLNLALATMNGLKNLLDPRKVAKLRDISVEEVFKGVRRENNA(配列番号:24),
MVSLDPEKKNEIIKEFQIHENDTGSVEVQIALLTARIKHLTEHLRKHPKDFHSRRGLMKMIGRRRKMLKYLRHKKPEVYRELIAKLGIRK(配列番号:25),
MGRSRKKGPYVDRKLLEKIRKLNETGEKKVIKTWSRASMIIPEMVGHTIAVYNGMKHIPVYITENMIGHRLGEFAPTRRFGGHADKKAKKGELKK(配列番号:26)及び
MPNIKSAKKRVRVSEKRRLRNKAYKTFFKNRIKEVLKAIENKEPKEVVLELTRKAQAAIDKAVSKGVIHKNQGARRKARLFEKVNEYLRTLETTQE(配列番号27)。
MKQEKLSLHDVLIRPIITEKALILREQRKYVFEVNPLANKNLVKEAVEKLFNVKVEKVNILNMKPKPKRRGIFEGKTRSWKKAVVTLKEGYTIKELEGEH(配列番号:18)及び
MAHKKSGGVAKNGRDSLPKYLGVKVGDGQIVKAGNILVRQRGTRFYPGKNVGMGRDFTLFALKDGRVKFETKNNKKYVSVYEE(配列番号:19)。
MKVILLRDVPKIGKKGEIKEVSDGYARNYLIPRGFAKEYTEGLERAIKHEKEIEKRKKEREREESEKILKELKKRTHVVKVKAGEGGKIFGAVTAATVAEEISKTTGLKLDKRWFKLDKPIKELGEYSLEVSLPGGVKDTIKIRVEREE(配列番号:10);MDHLVKIIEKKYEKKEIPDFRPGD−TVRVHVKVIEGDRERTQVFEGIVIAKRGSGINKTFTVRRIGSHGVGVERIFPVHSPVVEKIEVVRKGKVRRAKLYYLRNVRGKIRIKERRD(配列番号:15)及びMSKTIVRKNESIDDALRRFKRAVSKTGTLQEVRKREFYEKPSVRRKKKSEAARKRK(配列番号:1)。
MPKHSKRYLEARKLVDRTKYYDLDEAIELVKKTATAKFDETIELHIQTGIDYRKPEQHIRGTIVLPHGTGKEVKVLVFAKGEKAKEALEAGADYVGAEDLVEKIEKEGFLDFDVAIATPDMMRIIGRLGKILGPRGLMPSPKSGTVTQEVAEAVKEFKKGRIEVRTDKTGNIHIPVGKRSFDNEKLKENIIAAIKQIMQMKPAGVKGQFIKKVVLASTMGPGIKLNLQSLLKE(配列番号:6);
MAQVDLLNVKGEKVGTLEISDFVFNIDPNYDVMWRYVDMQLSNRRAGTASTKTRGEVSGGGRKPWPQKHTGRARHGSIRSPIWRHGGVVHGPKPRDWSKKLNKKMKKLALRSALSVKYRENKLLVLDDLKLERPKTKSLKEILQNLQLSDKKTLIVLPWKEEGYMNVKLSGRNLPDVKVIIADNPNNSKNGEKAVRIDGLNVFDMLKYDYLVLTRDMVSKIEEVLGNEAGKALTA(配列番号:7),
MSRLAKKPIVLPQGVTVEIKDNVVKVKGPKGELSQEFLPYVKIEVEGNEVWVRPNEEQIIRKSDWRKVKMFQGTYWSLIRNMVVGVTEGYKKELEIVGIGYRAQLQGNTLVMNLGYAHPVVYEIPSDVKIEVPAPNRIIVSGIDKQRVGQVAAEIRAFRPPNVYTGKGIRYVGEVVRQKEGKKA(配列番号:9),
MGQKVHPRGFRLGLSADWQAKWFNEKNYKEWLLEDEEIRKIIKNKYYHAGISEIYVERPDAERINITVKTARPGIIIGRKGSEITSLREELERKFNRRVVINIEEIKTPELDAQLVAESIASRIEKRASYKVAMKRAIMNAMRKGAQGIKVMVAGRLGGAEIARREWYLRGRLPLQKIKAIIDYGTATAWTKYGTIGIKVWIYKGDADI(配列番号:23)及び
METQGVMKEIQYEEFEEKIIEIRRTSKVTKGGKNLSFRVVAIVGNKNGKVGLGIGKAREVPEAIRKAISAAKRNIVEVPVINGTIPHEVIGRQDASKVLLKPAAPGTGIIAGGTVRAVVELAGIQNILTKSLGSTNPLNLALATMNGLKNLLDPRKVAKLRDISVEEVFKGVRRENNA(配列番号:24)。
MKVILLRDVPKIGKKGEIKEVSDGYARNYLIPRGFAKEYTEGLERAIKHEKEIEKRKKEREREESEKILKELKKRTHVVKVKAGEGGKIFGAVTAATVAEEISKTTGLKLDKRWFKLDKPIKELGEYSLEVSLPGGVKDTIKIRVEREE(配列番号:10);
MKVILLEPLENLGDVGQVVDVKPGYARNYLLPRGLAVLATESNLKALEARIRAQAKRLAERKAEAERLKEILENLTLTIPVRAGETKIYGSVTAKDIAEALSRQHGITIDPKRLALEKPIKELGEYVLTYKPHPEVPIQLKVSVVAQE(配列番号:41);
MKVIFLKDVKGKGKKGEIKDVADGYANNFLFKQGLAIEATPANIKALEAQKQKEQRQAAEELANAKKLKEELEKLTVEIPAKAGEGGRLFGSITSKQIAEALQAQHGLKLDKRKIELADAIRSLGYTNVPVKLHPEVTATLKVHVKEQK(配列番号:42);
MKVVLLKDVSKIGKKGEIKNVSDGYARNYLIPKGLALEATPRVLKRLEAEKR−KKEEEKIQIKTQNEELLKMLKKFLYKIPVKAGESGKLFGALTNSDIAKAVEKIADVNIDKKFIVLEKPIKEIGMYDVLVRLPEGVSGKIKVEVIQEGKN(配列番号:43)及び
MKLILTQEVAGLGGPGDVVEVRDGYGRNYLLPKRLAMPASPGAVKQVALIKRAREVREIRDLDQARALRDQLEALPVTLPARAGSGGRLFGSVTPDDIAAAVHAAGGPKLDKRRIEISGPIKTIGSHQVTVRLHPEVSATVSVEVVPAS(配列番号:44)。
更なる実施態様では、タグは配列MAHKKSGGVAKNGRDSLPKYLGVKVGDGQIVKAGNILVRQRGTRFYPGKNVGMGRDFTLFALKDGRVKFETKNNKKYVSVYEE(配列番号:19)を有している。
更なる実施態様では、タグは配列MKVILLRDVPKIGKKGEIKEVSDGYARNYLIPRGFAKEYTEGLERAIKHEKEIEKRKKEREREESEKILKELKKRTHVVKVKAGEGGKIFGAVTAATVAEEISKTTGLKLDKRWFKLDKPIKELGEYSLEVSLPGGVKDTIKIRVEREE(配列番号:10)を有している。
更なる実施態様では、タグは配列MKVIFLKDVKGKGKKGEIKDVADGYANNFLFKQGLAIEATPANIKALEAQKQKEQRQAAEELANAKKLKEELEKLTVEIPAKAGEGGRLFGSITSKQIAEALQAQHGLKLDKRKIELADAIRSLGYTNVPVKLHPEVTATLKVHVKEQK(配列番号:42)を有している。
更なる実施態様では、タグは配列MKLILTQEVAGLGGPGDVVEVRDGYGRNYLLPKRLAMPASPGAVKQVALIKRAREVREIRDLDQARALRDQLEALPVTLPARAGSGGRLFGSVTPDDIAAAVHAAGGPKLDKRRIEISGPIKTIGSHQVTVRLHPEVSATVSVEVVPAS(配列番号:44)を有している。
更なる実施態様では、リンカーは、2−30、2−25、2−20、2−15、2−14、2−13、2−12、2−11、2−10、2−9、2−8、2−7、2−6、2−5又は2−4のアミノ酸残基を有しうる。
更なる実施態様では、リンカーは、4−30、4−25、4−20、4−15、4−14、4−13、4−12、4−11、4−10、4−9、4−8、4−7、4−6又は4−5のアミノ酸残基を有しうる。
更なる実施態様では、リンカーは、6−30、6−25、6−20、6−15、6−14、6−13、6−12、6−11、6−10、6−9、6−8又は6−7のアミノ酸残基を有しうる。
更なる実施態様では、リンカーは、7−30、7−25、7−20、7−15、7−14、7−13、7−12、7−11、7−10、7−9又は6−8のアミノ酸残基を有しうる。
他の実施態様では、リンカーは15のアミノ酸残基を有している。
他の実施態様では、リンカーは12のアミノ酸残基を有している。
他の実施態様では、リンカーは10のアミノ酸残基を有している。
他の実施態様では、リンカーは9のアミノ酸残基を有している。
他の実施態様では、リンカーは8のアミノ酸残基を有している。
他の実施態様では、リンカーは7のアミノ酸残基を有している。
他の実施態様では、リンカーは6のアミノ酸残基を有している。
他の実施態様では、リンカーは5のアミノ酸残基を有している。
一実施態様では、リンカーは、リンカーを可撓性ある構造にするアミノ酸残基、例えば交互のSer及びGly残基を含むであろう。他のアミノ酸残基、つまりAla及びLeuのようなアルファ螺旋構造を形成しうるアミノ酸は剛性構造を生じる。更に、ある種のアミノ酸残基、例えばProはリンカーに構造的屈曲性を加える。
他の実施態様では、リンカーは配列GGSSGGSS(配列番号:29)を有している。
他の実施態様では、リンカーは配列SSSGSGSG(配列番号:30)を有している。
他の実施態様では、リンカーは配列ALALALA(配列番号:31)を有している。
他の実施態様では、リンカーは配列ALALALAPA(配列番号:32)を有している。
他の実施態様では、リンカーは配列SSSALALALA(配列番号:33)を有している。
他の実施態様では、リンカーは配列SGSGSGSGS(配列番号:34)を有している。
他の実施態様では、リンカーは配列SSSGSGSGSG(配列番号:47)を有している。
他の実施態様では、リンカーは配列GSSGSGS(配列番号:48)を有している。
タグが二つのタグの組合せを含む場合、これらのタグは、一実施態様では、リンカーによって連結される。
本発明はここに開示されたタグ、リンカー及びプロセシング酵素の実施態様の任意の組合せをカバーする。
プロセシング酵素は典型的にはオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼから選択される。
一実施態様では、プロセシングプロテアーゼは、アスパラギン酸、メタロ、セリン及びシステインプロテアーゼからなる群から選択される。
更なる実施態様では、セリンプロテアーゼには、トリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ(EK)、トロンビン、Xa因子及びカリクレインが含まれる。
本発明の更なる態様では、標的タンパク質は、タンパク質の修飾に関連する酵素、例えばトランスグルタミナーゼ、トランスフェラーゼ及びラセマーゼから選択される。
他の実施態様では、本発明は、タグつきHRV14 3Cプロテアーゼ、タグつきHAV18 3Cプロテアーゼ又はタグつきRHDV3Cプロテアーゼでのプロトランスグルタミナーゼ(proTGase)の切断方法に関する。この実施態様では、タグは、配列番号:10、配列番号:41、配列番号:42、配列番号:43又は配列番号:44から選択され得、リンカーは、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:34、配列番号:47及び配列番号:48からなる群から選択されうる。
本発明に係るプロセシング酵素は、高収率でのタグつきプロセシング酵素の可溶型発現を容易にし、単一の陽イオン交換クロマトグラフィー工程を使用する効率的な精製並びに使用後のタグつきプロセシング酵素の簡単な除去を可能にするN末端融合タグを含む。
タグはまた陽イオンカラムへの結合を容易にし、よってタグつきプロセシング酵素用の固定化剤として陽イオン交換クロマトグラフィーマトリックスを使用するオンカラム切断を可能にする。
これらのタグは〜50℃から水の沸点を超えるまでの範囲の至適温度で好熱性細菌株から誘導される。極めて高い温度で生存する株は超好熱菌又は好熱菌と呼ばれ、80℃(176。F)又はそれ以上の至適温度を有する。好熱性細菌は温泉、熱い土壌、地熱火道及び高温が存在する他の場所で天然に生じる。RS21_BACST(配列番号:1)がクローニングされタグとして使用されたバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophillus)は例えば多くの土壌中において65℃以上で増殖することが見出されている。高温で生存するために、これらの生物は中温菌のものよりもより安定な進化したタンパク質を有している。
可溶性はタンパク質の一般に高い表面電荷から得られると考えられている。
プロセシング酵素は次の群の酵素から選択される:酸化/還元反応を触媒しうるオキシドレダクターゼ、官能基(例えばホスフェート基)を転移させうるトランスフェラーゼ、(ペプチド結合を加水分解するプロテアーゼを含む)様々な結合の加水分解を触媒するヒドロラーゼ、加水分解と酸化以外によって結合を切断するリアーゼ、単一分子内の変化を触媒するイソメラーゼ、又は共有結合によって2つの分子を結合させるリガーゼ。
これらの酵素は野生型酵素であるか又はよく知られた変異誘発工程によって改変される変異体又はそのアナログでありうる。
セリンプロテアーゼの非限定的な例には、トリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ(EK)、トロンビン、Xa因子及びカリクレインが含まれる。
システインプロテアーゼの非限定的な例には、コロナウイルス科(Corona viridae)、ピコルナウイルス科(Picorna viridae)、レトロウイルス科(Retro viridae)、アデノウイルス科(Adeno viridae)又はフラビウイルス科(Flavi viridae)の群から得られるウイルスプロテアーゼが含まれる。更なる例には、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、A−D型肝炎ウイルス、デングウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、重度の急性呼吸障害症候群ウイルス(SARS)、メンゴウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)、ヒト泡沫状ウイルス及びアデノウイルスからのプロテアーゼが含まれる。他の非限定的な例には、リーシュマニア属菌種のような細菌又はトリパノソーマ属菌種のような真核微生物から誘導されるシステインプロテアーゼが含まれる。
3Cプロテアーゼの概説は、Krausslich,H.G. & Wimmer,E. ,Viral proteinases, Annual Review of Biochemistry(1988) 57, 701-754に見出される。
他の実施態様にはアスパラギン酸プロテアーゼ、例えばペプシン及びカテプシン、例えばカテプシンD及びキモシンが含まれる。
酵素の他の例には、リパーゼ、ホスファターゼ、グリコシルヒドロラーゼ(例えば、マンノシダーゼ、キシロシダーゼ、フコシダーゼ)、キナーゼ、モノ又はジオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、トランスアミナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミダーゼ、エステラーゼ及びホスファターゼが含まれる。
本発明の一実施態様は、本発明に係るタグつきプロセシング酵素と標的タンパク質前駆体の同時発現を含み、よって標的タンパク質前駆体のインビボプロセシングを容易にし、初期の精製工程中でのプロセシング酵素の除去を容易にする。
プロセシング工程に続く工程、例えば融合タンパク質の切断は、第一工程におけるような陽イオン交換カラム精製を含みうる。切断に続く精製工程はまた他の精製手段、例えば陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを含みうる(例えばScopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982を参照)。
またタグつきプロセシング酵素をコードする核酸コンストラクトは、確立された標準的な方法、例えばBeaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letters 22(1981), 1859 - 1869に記載されたホスホアミダイト(phosphoamidite)法、又はMatthes等, EMBO Journal 3(1984), 801 - 805により記載された方法により合成的に調製することもできる。ホスホアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば自動DNA合成機で合成され、精製され、アニーリングされ、ライゲーションされて、適切なベクター中にクローニングされる。融合タンパク質をコードするDNA配列はまた例えば米国特許第4683202号、Saiki等, Science 239(1988), 487-491又は上掲のSambrook等に記載されたような特定のプライマーを使用し、オーバーラップ伸長PCRによってスプライシングのようなポリメラーゼ連鎖反応によって調製することもできる。
タグつきプロセシング酵素をコードするDNA配列は、通常は、簡便に組換えDNA手順を施しうる任意のベクターであってもよい組換えベクター中に挿入され、多くの場合、ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存する。よって、ベクターは自己複製可能なベクター、すなわちベクターは染色体外体として存在し、その複製が染色体複製とは独立であるベクター、例えばプラスミドでありうる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、宿主細胞ゲノムに組込まれ、それが組込まれた染色体(群)と共に複製されるものであってもよい。
タグつきプロセシング酵素の発現に使用される発現ベクターはクローニングされた遺伝子又はcDNAの転写を方向付けることが可能なプロモーターを含む。プロモーターは、選択の宿主細胞中で転写活性を示す任意のDNA配列であってよく、宿主細胞と相同か又は異種のタンパク質をコードする遺伝子から誘導されうる。
また、ベクターは、選択可能マーカー、例えばその産物が宿主細胞における欠陥を補完する遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)をコードする遺伝子、又は例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、又はメトトレキセート等の薬剤に対して耐性を付与するマーカー遺伝子を含んでいてもよい。
細菌宿主細胞の例は、グラム陽性菌、例えばバチルス属の菌株、例えばバチルス・スブチリス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レンタス(B. lentus)、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアグランス(coagulans)、バチルス・サーキュランス(circulans)、バチルス・ロータス(lautus)、バチルス・メガテリウム又はバチルス・チューリンゲンシスの菌株、又はストレプトマイセス属の菌株、例えばストレプトマイセス・リビダンス又はストレプトマイセス・ムリヌス(murinus)の菌株、又はグラム陰性菌、例えば大腸菌の株である。細菌の形質転換は、プロトプラストの形質転換、又はそれ自体知られている方法でコンピテント細胞を使用することによりなされてもよい(上揚のSambrook等を参照)。
「フロースルー」は精製カラムに結合しない宿主細胞タンパク質と汚染物質を含むアプリケーションの部分を意味する。
「主ピーク」は最も高いUV強度を有し融合タンパク質を含む精製クロマトグラムにおけるピークを意味する。
「UV280強度」は、ミリ吸光度単位で測定される、タンパク質が吸収する280nmの波長での吸光度である。
「UV214」は、ミリ吸光度単位で測定される、タンパク質が吸収する214nmの波長での吸光度である。
「IPTG」はイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシドである。
「TIC」は全イオン計数である。
「HPLC」は高速液体クロマトグラフィーである。
「タンパク質」なる表現はペプチドとポリペプチドの双方をカバーする。
「標的タンパク質」はその意図される形態に達するためにプロセシング酵素によってプロセシングされたタンパク質である。
「LC−MS」は液体クロマトグラフィー質量分析を意味する。
「溶解度%」は宿主細胞可溶化物からの可溶性タンパク質の量を宿主細胞可溶化物からの可溶性+不溶性融合タンパク質の量で割ったもの×100として定義される。
「純度%」は対象タンパク質の量を、対象のタンパク質の量+宿主細胞汚染物の量で割ったもの×100として定義される。
SDS−PAGEはドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動である。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的に使用され、何らの方法においても本発明を限定するものと解すべきではない。
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語(例えば「等」)の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に請求項に記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も請求項に記載していない要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解してはならない。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び/又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。
この発明は、適用される法律に容認される、ここに添付の特許請求の範囲に記載された主題事項の全ての変更例及び均等物を含む。
オーバーラップPCRを使用するHRV14 3Cプロテアーゼコード配列の合成
成熟ヒトライノウイルス株14(HRV14)3Cプロテアーゼのアミノ酸配列は次の通りである:
GPNTEFALSLLRKNIMTITTSKGEFTGLGIHDRVCVIPTHAQPGDDVLVNGQKIRVKDKYKLVDPENINLELTVLTLDRNEKFRDIRGFISEDLEGVDATLVVHSNNFTNTILEVGPVTMAGLINLSSTPTNRMIRYDYATKTGQCGGVLCATGKIFGIHVGGNGRQGFSAQLKKQYFVEKQ(配列番号:35)
大腸菌中での発現のために最適化された配列番号:35をコードするDNA配列及びコドンを生産した。成熟HRV14 3Cプロテアーゼ合成遺伝子断片は、PCRの二つの逐次工程を使用するオーバーラップ伸長PCR法により、スプライシングを使用して得た。第一のPCR反応では、16のオーバーラッププライマー(8つの順方向及び8つの逆方向プライマー)を使用して、可撓性リンカーをコードする5末端領域を含む全HRV14配列を産生させた(配列番号:28)。プライマーは〜50bpのサイズで、プライマー間のオーバーラップは〜20bpであった。第二のPCR反応では、それぞれXhoI及びBamHIクローニング部位を有する末端順方向及び逆方向プライマーを使用し、鋳型として第一PCR反応の産物を使用して全配列を増幅させた。Phusion PCR系(Finnzymes)を使用した。第一PCR反応は、本質的に製造者の指示書に従って好適な量の16全てのプライマーを用いて次のようにして準備した。第一反応のためのPCR条件は次の通りであった;
98℃30秒(初期変性)
98℃10秒(変性)
50℃30秒(アニーリング)
72℃15秒(伸長)
10サイクルの間
72℃5分(最終伸長)
第二のPCR反応において、最も端部の順方向及び逆方向プライマーを使用して、第一反応からのPCR産物から全HRV14 3Cコード配列を増幅させた。条件は、55℃をアニール温度として使用し、20サイクルを10の代わりに使用したことを除いて、第一反応に対して記載したものと同じであった。
第二反応からのPCR産物は、アガロースゲル電気泳動によって判定され予想されたように〜600塩基対のサイズを有している。PCRバンドをアガロースゲルから切除し、PCR産物を、製造者の指示書に従ってGFXTM PCR DNA及びGel Band精製キット(GEヘルスケア)を使用して精製した。精製したPCR産物を、製造者の指示書に従って確立されたTOPOクローニング系(Invitrogen)を使用してプラスミド中にサブクローニングし、ライゲーション産物を、プラスミド増幅のためにTOP10大腸菌細胞(Invitrogen)中に形質転換させた。単離されたTOP10クローンから得られたプラスミドのXhoI/BamHI挿入断片の正しい配列をDNA配列決定によって証明した。
HRV14 3Cプロテアーゼコード領域を含むXhoI/BamHI断片をTOPOプラスミドベクター(Invitrogen)から切除した。ついで、XhoI/BamHI断片を、異なったN末端熱安定アルカリタグをコードする挿入断片がリンカー及びプロテアーゼコード領域の5末端に結合するようにpET11aベクター(Novagen)中にライゲーションさせた。介在リンカーでHRV14 3CプロテアーゼのN末端に融合した異なったタグをコードする16のpET11aベクターを図1に示すようにして生産した。
DNA配列の検証を制限酵素切断及び/又はDNA配列決定によって実施した。
次のタグつき酵素を生産した:
異なったN末端タグを有するHRV143CプロテアーゼをコードするpET11aベクターコンストラクトを、熱ショック又は化学薬品ベースの標準的方法によってRosetta(DE3)(Novagen)大腸菌株に形質転換させた。形質転換した細胞を、150マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンと34マイクログラム/ミリリットルのクロラムフィニコールを含むLB(Luria−Bertani)培地寒天板で一晩増殖させた。アンピシリンとクロラムフィニコールを含む液体LB培地を培養皿から播種し、37℃、240rpmで振盪フラスコで培養した。培地に0.5mMのIPTGを加えてタンパク質の誘導を開始した後、OD600:〜0.4−0.8に達したときに温度を30℃まで低下させた。3時間の誘導後に得られた最終OD600は、1.6−2.8の範囲であった。細胞を遠心分離によって収集した。誘導細胞及び未誘導細胞、並びに誘導細胞の可溶型及び不溶型画分(25mMのNaPO4,pH7からなるバッファー中での超音波処理及び遠心分離によって得た)を含むペレットの可溶化物のSDS−PAGEを実施して、HRV14 3Cプロテアーゼ変異体の発現レベルと溶解性を評価した。発現レベルには差が観察されたが、非常に高い溶解性(〜80%又はそれ以上)がHRV14 3Cプロテアーゼの殆どのタグ付き型について観察された。
pACSH239プロテアーゼの細胞培養ペレット(40mlの培養から)を、pH7の25mMのNaPO4を含むバッファー中での超音波処理によって破壊した。細胞細片を10000gの遠心分離によって遠心沈殿させた。上清を、AKTAエクスプローラー100精製システム(GEヘルスケア)を使用して実施した精製前に滅菌濾過した。5mlのカラム容積のプレパックSPセファロースFF Hiトラップカラム(GEヘルスケア)を、次のバッファーを使用する3ml/分の流量での分離に使用した:
バッファーA: 50mMのリン酸ナトリウム,pH7+1mMのEDTA
バッファーB: 50mMのリン酸ナトリウム,pH7+1MのNaCl+1mMのEDTA
pACSH239に対して記載したようにして80mlの細胞培養物からのpH7の25mMのNaPO4中で超音波処理した細胞培養ペレットから、精製の準備ができた上清を調製した。SPセファロースFFプレパック5mlHiトラップカラム(GEヘルスケア)にアプリケーションを充填した。流量は3ml/分であり、精製に使用したバッファーは:
バッファーA: 50mMのリン酸ナトリウム,pH7
バッファーB: 50mMのリン酸ナトリウム,pH7 + 1MのNaCl
であった。
カラムは最初に7カラム容量のバッファーAに対して平衡にした。7カラム容量のバッファーAを使用する洗浄工程において未結合試料を除去し、20カラム容積に対して0−100%バッファーBの線形勾配を使用して、カラムからpACSH238プロテアーゼを溶離させた。
pACSH238プロテアーゼは〜0.2MのNaCの濃度でカラムから溶離させた。pACSH239プロテアーゼとは対照的に、pACSH238プロテアーゼの主要な部分がこれらの精製条件でカラムに結合した。LC−MSによって、溶離されたプロテアーゼが予想された分子量を有していることがまた証明された。第一の精製工程の回収率はpACSH239プロテアーゼと比較すると4倍高く、純度はHPLC及びSDS−PAGE分析から判断して〜90%であった。
修飾HRV14 3C切断部位SSSGGSEVLFQ(配列番号:36)を持つ介在リンカーを有するS661インスリンレセプターアンタゴニストペプチドを含む融合タンパク質(pACSH294)を切断するために、pACSH239プロテアーゼの活性を、異なった量のプロテアーゼを使用して推定した。
S661ペプチドは次の配列を有している:
GSLDESFYDWFERQLGGGSGGSSLEEEWAQIQCEVWGRGCPSY(配列番号:37)。
pACSH294融合タンパク質基質とpACSH239プロテアーゼの匹敵するタンパク質濃度を、HPLCクロマトグラムの解析からのUV214nmの吸光度ピーク面積の積分によって計算した。酵素と基質を200uLの反応容積で混合し、異なった基質に対する酵素の比(濃度に従って調節)を使用して50mMのTrisHCl、pH7.5、150mMのNaClを含む切断バッファー中で25℃にて6又は12時間、インキュベートした。LC−MS実験は、S661ペプチド(配列番号:37)と放出されたタグ(配列番号:19)+リンカー(配列番号:36)だけが、1:100の酵素対基質比を使用して12時間のインキュベーション後に観察されたことを示している(図2)。非常に少量の融合タンパク質だけが1:200の比を使用して12時間後に残った。従って、該結果は、1:100−1:200の酵素/基質比が一晩のインキュベーションでpACSH294融合タンパク質を完全にプロセシングするために十分であることを示している。
同一量のpACSH238又はpACSH239プロテアーゼを用いて、併行実験において、50mMのTrisHCl pH7.5,150mMのNaClからなるバッファー中のpACSH294基質をプロセシングした。1:25又は1:50の酵素:基質比を二種の酵素に対して評価した。30℃での3時間のインキュベーション後に放出されたS661インスリンレセプターアンタゴニストペプチドの量は、二種の酵素に対して正確に同じであり、N末端に付着したタグが異なったサイズであるにもかかわらず、それらが統一の特異的活性を有していることを示している。pACSH239プロテアーゼと同様に、pACSH238プロテアーゼは陰イオン交換カラムに結合せず、よってそれが標的タンパク質前躯体の消化に続いて適切な精製によって効果的に除去されうることを示している。
タグつきタバコエッチウイルスプロテアーゼのクローニング
成熟タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼは次のアミノ酸配列を有している:
GESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWRLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMN(配列番号:38)
安定化変異(S219V)を持つTEV配列を含む挿入断片を、Phusion PCR系(Finnzymes)、XhoI及びBamHIクローニング部位をそれぞれ含む順方向及び逆方向プライマー及び既存のTEV(Ser219Val)コードプラスミドを鋳型として用いて、標準的PCR法によって得た。PCR産物の5’端は可動性リンカーをコードする配列(配列番号:28)を含んでいた。
pACSH307、pACSH308及びpACSH309プロテアーゼコードプラスミドをRosetta(DE3)(Novagen)大腸菌株中に形質転換させた。形質転換細胞を、150マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンと34マイクログラム/ミリリットルのクロラムフィニコールを含むLB(Luria−Bertani)培地寒天プレートで一晩増殖させた。アンピシリンとクロラムフィニコールを含む液体LB培地を培養プレートから播種し、振盪フラスコで37℃、240rpmで培養した。温度を、OD600:〜0.4−0.5に達したときに30℃に低下させた。この温度への30分の適合化後、培養培地に0.5mMのIPTGを加えることによって、タンパク質誘導を開始させた。3時間の誘導後に得られた最終OD600は1.6の範囲であった。細胞を遠心分離によって収集した。誘導細胞及び非誘導細胞、並びに誘導された細胞の可溶性及び不溶性画分を含むペレットの可溶化物(10mMのNaPO4、pH7からなるバッファー中での超音波処理及び遠心分離によって得られた)のSDS−PAGEを実施して、TEVプロテアーゼ変異体の発現レベル及び溶解性を評価した。発現レベルは3種全てのコンストラクトに対して同様であった。溶解性は、配列番号:10のタグつきTEV変異体(〜70%)(pACSH307)に対して最も高いと推定された。
25mMのNaPO4、pH7中で超音波処理された培養ペレット(80mlの培養から)からの滅菌濾過上清からpACSH307プロテアーゼの精製を、AKTAエクスプローラー100システム(GEヘルスケア)を使用し、実施例1にpACSH238に対して記載したバッファー及び条件を正確に用いて実施した。分離をHiTrap SPセファロースFF5mlカラムで実施したとき、約0.25MのNaClでピークが明らかに溶離した。ピークの最高点からの画分のLC−MS分析により、このコンストラクトに対して正確に予想された分子量が得られ、主ピークの純度は、SDS−PAGE及びHPLC分析によって判断して〜85−90%であった。
pACSH307プロテアーゼの活性を、同じN末端タグ(配列番号:19)を持つが、タバコエッチウイルス切断認識部位SSSGGSENLYFQ(配列番号:39)を含むリンカーを持つ実施例1に記載されたような、S661インスリンアンタゴニストペプチド(配列番号:37)を含む融合タンパク質(pACSH248)を切断するために、異なった量のプロテアーゼを用いて、推定した。消化実験を、50mMのトリスHCl、pH8、0.5mMのEDTAを含む切断バッファー中で実施した。LC−MS実験は、1:1の酵素対基質比での8時間のインキュベーション後に、S661ペプチドの主要な部分がpACSH248融合タンパク質から切り離されたことを示している。これは、タグつきTEVプロテアーゼが活性な酵素として発現され精製され、pACSH248融合タンパク質から配列番号:19のタグを除去するために使用できることを証明している。
proTGaseのクローニングと発現
トランスグルタミナーゼ(tGASE)遺伝子は、シグナルペプチドとプロドメインに成熟tGASE配列が続いてなる。protGASE(シグナルペプチドは伴わないがN末端Met残基は伴う)を、標準的な方法論を用い、Streptomyces mobaraensisのゲノムDNAからPCRによって調製した。プロドメインを変更した結果、HRV14 3C切断部位が成熟tGASE配列のGly53−Pro54N末端伸展の丁度前に含められた。protGASE配列を、標準的なクローニング技術を使用して、pET11aベクター(pNNC130)中にクローニングしたところ、このプラスミドによってコードされたタンパク質は次の配列を有していた(成熟tGASE配列は残基55で始まる):
MDNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAASSAGPSFRAPLEVLFQGPDSDDRVTPPAEPLDRMPDPYRPSYGRAETVVNNYIRKWQQVYSHRDGRKQQMTEEQREWLSYGCVGVTWVNSGQYPTNRLAFASFDEDRFKNELKNGRPRSGETRAEFEGRVAKESFDEEKGFQRAREVASVMNRALENAHDESAYLDNLKKELANGNDALRNEDARSPFYSALRNTPSFKERNGGNHDPSRMKAVIYSKHFWSGQDRSSSADKRKYGDPDAFRPAPGTGLVDMSRDRNIPRSPTSPGEGFVNFDYGWFGAQTEADADKTVWTHGNHYHAPNGSLGAMHVYESKFRNWSEGYSDFDRGAYVITFIPKSWNTAPDKVKQGWP(配列番号40)。
200mlの誘導細胞培養物からの細胞ペレットを40mlの10mM NaPO4バッファー(pH8)に溶解させた。超音波処理と10000gでの遠心分離後に、上清を滅菌濾過し、最終アプリケーション容積を10mMのNaPO4バッファー(pH8)で50mlに調整した。
精製は、3ml/分の流量と次のバッファーを使用して実施例1及び2に記載された機器を使用して実施した:
バッファーA: 25mMのNaPO4バッファー pH8.0
バッファーB: 25mMのNaPO4バッファー pH8.0、0.5MのNaCl
5mlのQセファロース高性能(HP)HiTrapカラム(GEヘルスケア)を、バッファーAを用いて7カラム容積(CV)に平衡化した。protGASEを含むアプリケーションをカラムに充填し、未結合試料を10CVでバッファーAを用いて洗浄した。30カラム容量で0−100%のバッファーBの線形勾配を使用してprotGASEを溶離させた。protGASEを含むピークは、およそ0.05MのNaCl濃度でカラムから溶離させられた。集められた画分をSDS−PAGEによって分析し、protGASEの同一性を、タンパク質の予想された理論質量に非常に近い質量を与えたLC−MS分析によって確認した。
protGASEを含む第一精製工程からの画分をプールし、バッファーを、ダイアフィルトレーションのためにVivaspin20(10000MWCO)(Satorius)を使用し、50mMのトリスHC(pH7.5)、150mMのNaCl及び1mMのDTTを含む切断バッファーに代えた。精製したprotGASEとpACSH239プロテアーゼの量を、HPLCクロマトグラムからのUV214nmの吸光度ピーク面積を推定することによって調整した。異なった酵素対基質比(1:10、1:50、1:100及び1:200)を用いた切断試験を、25℃で一晩、切断バッファー中に1mMのDTTを含めるか含めないで実施した。実験は、pACSH239プロテアーゼが、1:200の酵素基質比と切断バッファー中に1mMのDTTを使用してプロドメインを完全に除去(してGly−Pro伸長成熟tGASEを取得)することができたことを示している。放出された成熟tGASE及びprotGASEの質量はLC−MSを使用して決定した。
同様な試験で、pACSH238プロテアーゼはprotGASEからプロドメインを効果的に切断することができることがまた見出された。
pACSH239プロテアーゼでの消化後に得られたGly−Pro伸長成熟tGASEを25mMのNaPO4(pH6)、1mMのDTT(バッファーA)中で48mlまで希釈し、次のバッファーを使用して5mlのSPセファロース高性能(HP)HiTrapカラム(GEヘルスケア)で分離した:
バッファーA: 25mMのNaPO4バッファー pH6.0+1mMのDTT
バッファーB: 25mMのNaPO4バッファー pH6.0+1mMのDTT+0.5MのNaCl
精製を、3ml/分の流量と30カラム容量に対して0−100%のバッファーBからの線形勾配溶離を使用して、実施した。
精製物からのUV280クロマトグラムは、一つの主ピークがおよそ0.1MのNaCl濃度でSPセファロースHPカラムから溶離させられたことを示していた。LC−MS分析により、溶離されたタンパク質が成熟tGASEと同一であることが確認された。pACSH239プロテアーゼは、N末端に融合した配列番号:19のタグの高電荷のため、成熟tGASEよりも更に遅くカラムから溶離され、よって、第二の精製工程後に標的タンパク質から効果的に除去されうる。
オーバーラップPCRを使用するHAV18 3Cプロテアーゼの合成:
成熟A型肝炎株18(HAV18)3Cプロテアーゼのアミノ酸配列は次の通りである: STLEIAGLVRKNLVQFGVGEKNGCVRWVMNALGVKDDWLLVPSHAYKFEKDYEMMEFYFNRGGTYYSISAGNVVIQSLDVGFQDVVLMKVPTIPKFRDITEHFIKKGDVPRALNRLATLVTTVNGTPMLISEGPLKMEEKATYVHKKNDGTTVDLTVDQAWRGKGEGLPGMCGGALVSSNQSIQNAILGIHVAGGNSILVAKLVTQEMFQNIDKKIESQ(配列番号:45)。
成熟HAV18 3Cプロテアーゼ遺伝子のコドン最適化DNA断片を、HRV14 3Cプロテアーゼに対して実施例1に記載されたようにして、PCRの二つの連続工程を含むオーバーラップ伸長PCRによるスプライシングを使用して、得た。正しい配列を有する最終の断片は、5’端XhoI及び3’端BamHI部位を有しており、これにより、配列番号:10コード化部がリンカー及びプロテアーゼコード領域の5末端に結合するように、pET11aベクター(Novagen)へのライゲーションが可能になった。
Rosetta(DE3)大腸菌株中での発現を、本質的に実施例1に記載されているようにして実施した。配列番号:10タグつきHRV14 3Cプロテアーゼと同様な発現レベルが達成可能であり、少なくとも80%のタンパク質が細胞破壊及び遠心分離後に可溶型画分中にあった。
pACSH239プロテアーゼの細胞培養ペレット(80mlの培養から)を、pH7の25mMのNaPO4を含むバッファー中での超音波処理によって破壊した。細胞片を10000gの遠心分離によって遠心沈殿させた。上清を、AKTAエクスプローラー100精製システム(GEヘルスケア)を使用して実施した精製前に滅菌濾過した。5mlのカラム容積のプレパックSPセファロースFF Hiトラップカラム(GEヘルスケア)を、次のバッファーを使用する3ml/分の流量での分離に使用した:
バッファーA: 50mMのリン酸ナトリウム,pH7
バッファーB: 50mMのリン酸ナトリウム,pH7+1MのNaCl
カラムは最初に7カラム容量のバッファーAに対して平衡にした。アプリケーションの充填後に、7カラム容量のバッファーAを使用する洗浄によって未結合タンパク質を除去した。20カラム容積に対して0−100%バッファーBの線形勾配を使用して、カラムからpACSH362プロテアーゼを溶離させた。pACSH362プロテアーゼは0.2−0.3MのNaClの塩濃度でカラムから溶離させた。pACSH362プロテアーゼの主な部分はこれらの精製条件でカラムに結合した。溶離されたpACSH362プロテアーゼの純度は、単一の陽イオン交換クロマトグラフィー工程後に、HPLC及びSDS−PAGE標準法によって決定して〜85−90%であると推定された。LC−MSによって、溶離されたプロテアーゼが予想された分子量を有していることがまた証明された。
タグつきHAV18 3Cプロテアーゼ(pACSH362)を用いて、N末端タグ(配列番号:19)及び修飾HAV18 3C切断部位SSSGGSELRTQ(配列番号:49)を持つ介在リンカーを備えたS661インスリンレセプターアンタゴニストペプチド(配列番号:37)を含むpACSH360融合タンパク質をプロセシングした。
1:10又は1:50の酵素対基質比のpACSH362プロテアーゼ及びpACSH360融合タンパク質を、37℃での7時間のインキュベーション後にLC−MSによって評価した。放出されたS661ペプチドを表す断片が、実施例1におけるように、双方の比に対して観察され、タグつきHAV18酵素が活性であることが示された。
タグつきウサギ出血病ウイルス3C様プロテアーゼのクローニング
サーマス・サーモフィラス、ジオバチルス・コーストフィラス(Geobacillus kaustophilus)、サーモシフォ・メラネシエンシス(Thermosipho melanesiensis)、BI429及びアシドサーマス・セルロリティカス(Acidothermus cellulolyticus)11Bから由来するリボソームタンパク質L9ファミリーからのタンパク質タグの精製は大腸菌発現に対してコドン最適化され、GENEART GmbH, Regensburg, ドイツから合成遺伝子として得た。タグをコードする遺伝子断片は5’端NdeI部位と3’端XhoI部位を有していた。ウサギ出血病ウイルス3C様プロテアーゼ(RHDV)をコードする3’端BamHI部位及び5’端XhoI部位を有するコドン最適化断片がまた得られた(GENEART GmbH, Regensburg,ドイツ)。
BL21(DE3)大腸菌株での発現を、本質的に実施例1に記載されているようにして実施した。非常に類似した発現レベルが4種全てのコンストラクトに対して得られ、上清のSDS−PAGEにより判定して溶解度は約80%−90%であり、ペレットは細胞破壊及び遠心分離後に取り出された。
配列番号:41,42,43及び44のタグつきHAV18 3Cプロテアーゼの精製
タグつきRHDVプロテアーゼのそれぞれの細胞培養ペレット(80mlの培養から)を超音波処理によって破壊した。既に記載されたものと同じバッファー及び条件を使用して、上清を調製し、予め充填されたSPセファロースFF5mlカラム(GEヘルスケア)を使用して分離した。
捕捉工程後のプロテアーゼの回収量の比較の際に、配列番号:41のタグを含むpACSH433プロテアーゼの場合に最善の結果が得られ、これは残りの変異体の場合よりも〜2−3.5倍のカラム上のタンパク質に結合した。
protGASE(pNNC130)又はpACSH294(S661融合タンパク質)とタグつきHRV14 3Cプロテアーゼ変異体の同時発現
pACYCDuet−1プラスミド(Novagen)は、pET11a(Novagen)プラスミドよりも少ないコピー数を有しており、該プラスミドから生産されたタンパク質の量はpET11aプラスミドより低くなければならない。更に、プラスミドは、pET11aとは異なった選択マーカー(クロラムフィニコール耐性)を含んでおり、同じ宿主株におけるこれら二つのプラスミドの維持及び同時発現を可能にする。pACSH238プロテアーゼの発現に対してpACYCDuet−1ベクターを、またpACSH238プロテアーゼによってプロセシングされうるS661融合タンパク質(pACSH294)又はprotGASE(pNNC130)の発現に対してpET11aベクターを使用して、タグつきプロセシング酵素を使用する標的タンパク質前躯体のプロセシング方法が実施可能かどうかを評価した。
pACSH238プロテアーゼをコードするpET11aプラスミドの断片(実施例1)及び開始コドンの上流のベクター骨格の一部をMluI及びBamHI制限酵素を用いて切除し、MluI/BamHI切断pACYCDuet−1プラスミド骨格(Novagen)中にライゲーションした。
同時発現株を、protGASE又はS661融合タンパク質の何れかだけを発現するコントロール株と平行して、150マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンと34マイクログラム/ミリリットルのクロラムフィニコールを含むLB培地で培養した。発現条件は実施例1において、pACSH238プロテアーゼに対して記載した通りであった。30℃での3時間の発現後、同時発現株とそのコントロールを収集した。SDS−PAGEから、同時発現は、コントロールと比較して誘導protGASE又はS661融合タンパク質に対して、より低い分子量を生じたことが明らかになった。pACSH238プロテアーゼ/protGASE同時発現株からのSDSゲルバンドに存在している切断された誘導タンパク質は、ゲル内(in-gel)消化後の標準的な質量分析ベースの方法を使用してtGASEと同定された。従って、結果は、同時発現されたpACSH238プロテアーゼが、protGASEからプロドメインを、S661融合タンパク質からインビボで配列番号:19の精製タグを切断することができたことを示している。
Claims (15)
- 好熱性細菌由来の高度に塩基性のリボソームタンパク質から誘導されたN末端に結合したタグを含んでなるプロセシング酵素。
- タグがシステイン残基を含まない請求項1に記載のプロセシング酵素。
- タグが、約50から約250、又は約75から約200、約100から約250又は約100から約200のアミノ酸残基を含む請求項1又は2に記載のプロセシング酵素。
- タグ中のアミノ酸残基の約15%から約50%、約20%から約50%、約30%から約50%、約40から約50%又は約35%から約50%が塩基性アミノ酸残基Lys及びArgである請求項1から3の何れか一項に記載のプロセシング酵素。
- タグがリボソームタンパク質L9ファミリーから誘導されている請求項1から4の何れか一項に記載のプロセシング酵素。
- タグが、
MKVILLRDVPKIGKKGEIKEVSDGYARNYLIPRGFAKEYTEGLERAIKHEKEIEKRKKEREREESEKILKELKKRTHVVKVKAGEGGKIFGAVTAATVAEEISKTTGLKLDKRWFKLDKPIKELGEYSLEVSLPGGVKDTIKIRVEREE(配列番号:10);
MKVILLEPLENLGDVGQVVDVKPGYARNYLLPRGLAVLATESNLKALEARIRAQAKRLAERKAEAERLKEILENLTLTIPVRAGETKIYGSVTAKDIAEALSRQHGITIDPKRLALEKPIKELGEYVLTYKPHPEVPIQLKVSVVAQE(配列番号:41);
MKVIFLKDVKGKGKKGEIKDVADGYANNFLFKQGLAIEATPANIKALEAQKQKEQRQAAEELANAKKLKEELEKLTVEIPAKAGEGGRLFGSITSKQIAEALQAQHGLKLDKRKIELADAIRSLGYTNVPVKLHPEVTATLKVHVKEQK(配列番号:42);
MKVVLLKDVSKIGKKGEIKNVSDGYARNYLIPKGLALEATPRVLKRLEAEKR−KKEEEKIQIKTQNEELLKMLKKFLYKIPVKAGESGKLFGALTNSDIAKAVEKIADVNIDKKFIVLEKPIKEIGMYDVLVRLPEGVSGKIKVEVIQEGKN(配列番号:43)及び
MKLILTQEVAGLGGPGDVVEVRDGYGRNYLLPKRLAMPASPGAVKQVALIKRAREVREIRDLDQARALRDQLEALPVTLPARAGSGGRLFGSVTPDDIAAAVHAAGGPKLDKRRIEISGPIKTIGSHQVTVRLHPEVSATVSVEVVPAS(配列番号:44)
からなるペプチド配列群から選択される請求項5に記載のプロセシング酵素。 - タグがリンカー配列によってプロセシング酵素に結合している請求項1に記載のプロセシング酵素。
- リンカー配列が、1から約30、1から約25、1から約20又は1から約15のアミノ酸残基を有する請求項7に記載のプロセシング酵素。
- リンカー配列が、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:34、配列番号:47及び配列番号:48からなる群から選択される請求項7に記載のプロセシング酵素。
- オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼから選択される請求項1に記載のプロセシング酵素。
- 請求項1から10の何れか一項に記載のタグをつけたプロセシング酵素の作製方法において、i)好熱性細菌由来の高度に塩基性のリボソームタンパク質から誘導されたN末端タグを含むプロセシング酵素を適切な発現宿主中で発現させ、ii)発現されたタグをつけたプロセシング酵素を陽イオン交換カラムに充填し、iii)適切な溶離剤でタグをつけたプロセシング酵素を溶離させることを含む方法。
- プロセシング酵素が、HRV14 3Cプロテアーゼ、HAV18 3CプロテアーゼTEV又はRHDV 3Cプロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼである請求項11に記載の方法。
- タグが、
MKVILLRDVPKIGKKGEIKEVSDGYARNYLIPRGFAKEYTEGLERAIKHEKEIEKRKK−EREREESEKILKELKKRTHVVKVKAGEGGKIFGAVTAATVAEEISKTTGLKLDKRWFKLDKPIKELGEYSLEVSLPGGVKDTIKIRVEREE(配列番号:10);
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からなる群から選択される請求項11又は12に記載の方法。 - 標的タンパク質前躯体を修飾する方法において、請求項1から10の何れか一項に記載のN末端にタグがつけられたプロセシング酵素を標的タンパク質前躯体と反応させ、標的タンパク質をプロセシング酵素から分離する工程を含む方法。
- N末端にタグがつけられたプロセシング酵素と標的タンパク質前躯体を、発現後に標的タンパク質の分離を可能にする適切な宿主中で同時発現させる請求項14に記載の方法。
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006096713A (ja) * | 2004-09-30 | 2006-04-13 | Toray Ind Inc | 極小部品材料とその構造制御方法 |
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---|---|---|---|---|
US4880911A (en) | 1982-03-19 | 1989-11-14 | G. D. Searle & Co. | Fused polypeptides and methods for their detection |
US5202239A (en) | 1990-08-07 | 1993-04-13 | Scios Nova Inc. | Expression of recombinant polypeptides with improved purification |
US5532142A (en) * | 1993-02-12 | 1996-07-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method of isolation and purification of fusion polypeptides |
WO2000006343A1 (en) | 1998-07-28 | 2000-02-10 | Noel Roger Wakelin | Handle for trigger operated tool |
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---|---|---|---|---|
JP2006096713A (ja) * | 2004-09-30 | 2006-04-13 | Toray Ind Inc | 極小部品材料とその構造制御方法 |
WO2006108826A1 (en) * | 2005-04-15 | 2006-10-19 | Novo Nordisk A/S | Basic protein purification tags from thermophilic bacteria |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
JPN6012060986; J.Biotechnol.,Vol.96,No.2(2002)p.93-102 * |
JPN6012060987; Protein Expr.Purif.,Vol.47,No.1(2006.May)p.234-240 * |
JPN6012060988; 50S RIBOSOMAL PROTEIN L9,[online],UniProt,2000年2月15日,Acc.No: Q9WZW7,[検索日]平成24 * |
JPN6012060989; LSU ribosomal protein L9P,[online],UniProt,2004年7月5日,Acc.No: Q72GV5,[検索日]平成24年 * |
JPN6012060990; 50S ribosomal protein L9 (BL17),[online],UniProt,2005年2月1日,Acc.No: Q5KU74,[検索日]平成 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019235627A1 (ja) * | 2018-06-08 | 2019-12-12 | 株式会社モダリス | 改変されたCas9タンパク質及びその用途 |
JPWO2019235627A1 (ja) * | 2018-06-08 | 2021-06-24 | 株式会社モダリス | 改変されたCas9タンパク質及びその用途 |
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