JPWO2019235627A1 - 改変されたCas9タンパク質及びその用途 - Google Patents
改変されたCas9タンパク質及びその用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2019235627A1 JPWO2019235627A1 JP2020523211A JP2020523211A JPWO2019235627A1 JP WO2019235627 A1 JPWO2019235627 A1 JP WO2019235627A1 JP 2020523211 A JP2020523211 A JP 2020523211A JP 2020523211 A JP2020523211 A JP 2020523211A JP WO2019235627 A1 JPWO2019235627 A1 JP WO2019235627A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- amino acid
- protein according
- dsacas9
- domain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 title description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 142
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 117
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 46
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 39
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 39
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 114
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 61
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 59
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 59
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 59
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 43
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 22
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 20
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 20
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 11
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 claims description 4
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003584 silencer Effects 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 19
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 abstract description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 17
- 102200044418 rs1114167491 Human genes 0.000 description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 10
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 10
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 9
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 206010051066 Gastrointestinal stromal tumour Diseases 0.000 description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 201000011243 gastrointestinal stromal tumor Diseases 0.000 description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 5
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 5
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 101710172824 CRISPR-associated endonuclease Cas9 Proteins 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 101150053046 MYD88 gene Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004500 stellate cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 3
- 206010061692 Benign muscle neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010004593 Bile duct cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101710160287 Heterochromatin protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000003893 Histone acetyltransferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000246 Histone acetyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 2
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 2
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 201000004458 Myoma Diseases 0.000 description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- -1 VP64 and VP160 Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000004192 dipotassium guanylate Substances 0.000 description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 208000030776 invasive breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220631830 AH receptor-interacting protein_E42R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 102220490385 Adenosylhomocysteinase 3_D73R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 244000099147 Ananas comosus Species 0.000 description 1
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Chemical group OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102100031437 Cell cycle checkpoint protein RAD1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012287 DNA Binding Assay Methods 0.000 description 1
- 102100033934 DNA repair protein RAD51 homolog 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010061825 Duodenal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006168 Ewing Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010053717 Fibrous histiocytoma Diseases 0.000 description 1
- 208000008051 Hereditary Nonpolyposis Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000017095 Hereditary nonpolyposis colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000008157 Histone Demethylases Human genes 0.000 description 1
- 108010074870 Histone Demethylases Proteins 0.000 description 1
- 102000011787 Histone Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010036115 Histone Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001130384 Homo sapiens Cell cycle checkpoint protein RAD1 Proteins 0.000 description 1
- 101001132307 Homo sapiens DNA repair protein RAD51 homolog 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000600434 Homo sapiens Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Proteins 0.000 description 1
- 206010021042 Hypopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010056305 Hypopharyngeal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 208000005726 Inflammatory Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010021980 Inflammatory carcinoma of the breast Diseases 0.000 description 1
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000032271 Malignant tumor of penis Diseases 0.000 description 1
- 208000005450 Maxillary Sinus Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Natural products O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101100219625 Mus musculus Casd1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 102100024134 Myeloid differentiation primary response protein MyD88 Human genes 0.000 description 1
- 201000007224 Myeloproliferative neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010028729 Nasal cavity cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000007571 Ovarian Epithelial Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000008900 Pancreatic Ductal Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000821 Parathyroid Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002471 Penile Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010034299 Penile cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000009565 Pharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010034811 Pharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100037401 Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Human genes 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010054184 Small intestine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000021712 Soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 102000005747 Transcription Factor RelA Human genes 0.000 description 1
- 108010031154 Transcription Factor RelA Proteins 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006593 Urologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220469605 Voltage-dependent L-type calcium channel subunit beta-2_I64K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 208000001119 benign fibrous histiocytoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 208000026900 bile duct neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 201000006392 childhood kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000013549 childhood kidney neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000000312 duodenum cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 201000008819 extrahepatic bile duct carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 206010016629 fibroma Diseases 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003897 hepatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000006866 hypopharynx cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 201000004653 inflammatory breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004966 intestinal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000244 kidney pelvis Anatomy 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000025036 lymphosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 208000026045 malignant tumor of parathyroid gland Diseases 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000010879 mucinous adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001665 muscle stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 208000025189 neoplasm of testis Diseases 0.000 description 1
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 208000023833 nerve sheath neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 201000008129 pancreatic ductal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000004019 papillary adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000002325 somatostatin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical group [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 208000037965 uterine sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
- C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Cas9タンパク質は、RECローブ(REC:recognition)とNUCローブ(NUC:nuclease)という2つのローブからなり、RECローブはアルギニン残基に富むαヘリックス、REC1ドメイン及びREC2ドメインから構成され、NUCローブはRuvCドメイン、HNHドメイン及びPIドメイン(PI:PAMinteracting)から構成されている。RuvCドメインには3つのモチーフ(RuvC-I〜RuvC-III)が存在する。小型化されたCas9タンパク質として、各機能的ドメインの全部又は部分が除去されリンカーで連結されたSaCas9(即ち、mini−SaCas9)が報告されている。リンカーとしては、GS−リンカー(GGGGSGGGG:配列番号10)、R−リンカー(KRRRRHR:配列番号11)及びGSKリンカー(GSK)が知られている(特許文献4、非特許文献1)。
従って、本発明者らは、全長タンパク質と実質的に同等のDNA結合親和性を有しながら、より小型化されたdCas9タンパク質の変異体を提供することを目的とする。
欠失及び置換を併せて変異とも称する。
本明細書中、変異を導入する前のdSaCas9タンパク質を野生型dSaCas9(タンパク質)、変異を導入した後のdSaCas9タンパク質をdSaCas9変異体(タンパク質)と称する場合がある。
即ち、本発明は以下の通りである。
[1]配列番号2で表されるアミノ酸配列において、
481〜649位の間に連続した欠失領域を有し、該欠失領域が、
(i)L1ドメイン(481〜519位)の全部または一部、及び
(ii)HNHドメイン(520〜628位)の全部を含み、さらに任意で該欠失領域は
(iii)L2ドメイン(629〜649位)の全部または一部を含み、
該欠失領域にそれぞれ隣接したアミノ酸が3乃至10個のアミノ酸残基からなるリンカーによって連結しているアミノ酸配列を含む配列からなり、
且つ、ガイドRNAとの結合能を有するタンパク質。
[2]該欠失領域が、
(i)L1ドメインの全部(481〜519位)、
(ii)HNHドメイン領域の全部(520〜628位)、及び
(iii)L2ドメインの全部(629〜649位)
である、上記[1]記載のタンパク質。
[3]該欠失領域が、
(i)L1ドメインの一部(482〜519位)、
(ii)HNHドメインの全部(520〜628位)、及び
(iii)L2ドメインの一部(629〜647位)
である、上記[1]記載のタンパク質。
[4]該欠失領域が、
(i)L1ドメインの一部(482〜519位)、及び
(ii)HNHドメインの全部(520〜628位)
である、上記[1]記載のタンパク質。
[5]配列番号2で表されるアミノ酸配列において、45位及び/又は163位のグルタミン酸(E)が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドRNAとの結合能を有するタンパク質。
[6]他のアミノ酸が塩基性アミノ酸である、上記[5]記載のタンパク質。
[7]塩基性アミノ酸が、リジン(K)である、上記[6]記載のタンパク質。
[8]さらに、45位及び/又は163位のグルタミン酸(E)が他のアミノ酸に置換されている、上記[1]〜[4]のいずれかに記載のタンパク質。
[9]他のアミノ酸が塩基性アミノ酸である、上記[8]記載のタンパク質。
[10]塩基性アミノ酸がリジン(K)である、上記[9]記載のタンパク質。
[11]リンカーが、グリシン(G)及びセリン(S)で構成される、5〜9アミノ酸長のリンカーである、上記[1]〜[8]のいずれかに記載のタンパク質。
[12]リンカーが、以下から選択される、上記[1]〜[11]のいずれかに記載のタンパク質:
−SGGGS−
−GGSGGS−
−SGSGSGSG−
−SGSGSGSGS−。
[13]配列番号2の変異及び/又は欠失が施された位置以外の部位において80%以上の同一性を有する、上記[1]〜[12]のいずれかに記載のタンパク質。
[14]配列番号2の変異及び/又は欠失が施された位置以外の部位において1〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加された、上記[1]〜[12]のいずれかに記載のタンパク質。
[15]転写制御因子タンパク質又はドメインを連結した、上記[1]〜[14]のいずれかに記載のタンパク質。
[16]転写制御因子が転写活性化因子である、上記[15]記載のタンパク質。
[17]転写制御因子が転写サイレンサー又は転写抑制因子である、上記[15]記載のタンパク質。
[18]上記[1]〜[17]のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。
[19]上記[1]〜[18]のいずれかに記載のタンパク質と、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のPAM(Proto-spacer Adjacent Motif)配列の1塩基上流から20塩基以上24塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドRNAと、を備えるタンパク質−RNA複合体。
[20]標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドRNAとを混合し、インキュベートする工程と、
前記タンパク質が、PAM配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを改変する工程と、を備え、
前記タンパク質は、上記[1]〜[17]のいずれかに記載のタンパク質であり、
前記ガイドRNAは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記PAM配列の1塩基上流から20塩基以上24塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法。
[21]細胞の標的遺伝子の発現を増大させる方法であって、前記細胞内で上記[16]に記載のタンパク質と、前記標的遺伝子に対する1つ又は複数のガイドRNAとを発現させることを含む、方法。
[22]細胞の標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、前記細胞内で上記[17]に記載のタンパク質と、前記標的遺伝子に対する1つ又は複数のガイドRNAとを発現させることを含む、方法。
[23]細胞が真核細胞である、上記[21]又は[22]に記載の方法。
[24]細胞が酵母細胞、植物細胞又は動物細胞である、上記[21]又は[22]に記載の方法。
本発明のdSaCas9変異体は、ガイドRNAとの結合能を有しながら、より小型化されたdSaCas9タンパク質である。小型化されたdSaCas9変異体を用いれば、より多くの遺伝子をベクターに搭載することができる。
ガイドRNAは、本発明のdSaCas9変異体と結合して、該タンパク質を標的DNAに導く機能を有する。ガイドRNAは、その5’末端に標的DNAに相補的な配列を有し、該相補的な配列を介して標的DNAに結合することにより、本発明のdSaCas9変異体を標的DNAに導く。dSaCas9変異体はDNAエンドヌクレアーゼを有さない為、標的DNAに結合はするが切断することはない。
ガイドRNAは、標的DNAの配列情報に基づき設計され調製される。具体的には実施例で用いられるような配列が挙げられる。
本明細書中において、「PAM配列」とは、標的二本鎖ポリヌクレオチド中に存在し、Cas9タンパク質により認識可能な配列を意味し、PAM配列の長さや塩基配列は細菌種によって異なる。
481〜649位の間に連続した欠失領域を有し、該欠失領域が、
(i)L1ドメイン(481〜519位)の全部または一部、及び
(ii)HNHドメイン(520〜628位)の全部を含み、さらに任意で該欠失領域は
(iii)L2ドメイン(629〜649位)の全部または一部を含み、
該欠失領域にそれぞれ隣接したアミノ酸が3乃至10個のアミノ酸残基からなるリンカーによって連結しているアミノ酸配列を含む配列からなり、
且つ、ガイドRNAとの結合能を有するタンパク質(態様1)を提供する。
(i)L1ドメインの全部(481〜519位)、
(ii)HNHドメインの全部(520〜628位)、及び
(iii)L2ドメインの全部(629〜649位)
である(態様1−1)。
(i)L1ドメインの一部(482〜519位)、
(ii)HNHドメインの全部(520〜628位)、及び
(iii)L2ドメインの一部(629〜647位)
である(態様1−2)。
該欠失領域が、
(i)L1ドメインの一部(482〜519位)、及び
(ii)HNHドメインの全部(520〜628)
である(態様1−3)。
45位及び/又は163位における変異は、具体的には、グルタミン酸の塩基性アミノ酸への置換、好ましくはリジン、アルギニン又はヒスチジンへの置換、より好ましくはリジンへの置換である。
45位及び/又は163位における変異は、具体的には、グルタミン酸の塩基性アミノ酸への置換、好ましくはリジン、アルギニン又はヒスチジンへの置換、より好ましくはリジンへの置換である。
「アミノ酸の置換、欠失、挿入及び/又は付加」を人為的に行う場合の手法としては、例えば、所定のアミノ酸配列をコードするDNAに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法(ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984))、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。また、Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (NEB)を用いて、マニュアルに従い簡便に実施することができる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも1残基、具体的には1若しくは数個、またはそれ以上である。また前記置換、欠失、挿入または付加のうち、特にアミノ酸の置換が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、pK、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、i)グリシン、アラニン;ii)バリン、イソロイシン、ロイシン;iii)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン;iv)セリン、スレオニン;v)リジン、アルギニン;vi)フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
−SGGGS−(配列番号3)
−GGSGGS−(配列番号4)
−SGSGSGSG−(配列番号5)
−SGSGSGSGS−(配列番号6)
宿主としては、特に限定されず、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、又は、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物が挙げられる。好ましくは動物細胞である。
一実施形態において、本発明は、上述の<dSaCas9変異体>において示されたタンパク質と、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のPAM(Proto−spacer Adjacent Motif)配列の1塩基上流から20塩基以上24塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドRNAと、を備えるタンパク質−RNA複合体を提供する。
一実施形態において、本発明は、上述の<dSaCas9変異体>において示されたタンパク質をコードする遺伝子を含む第1のベクターと、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のPAM配列の1塩基上流から20塩基以上24塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドRNAを含む第2のベクターと、を備えるCRISPR−Casベクターシステムを提供する。
別の一実施形態において、本発明は上述の<dSaCas9変異体>において示されたタンパク質をコードする遺伝子と、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のPAM配列の1塩基上流から20塩基以上24塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドRNAとを同一のベクター中に有するCRISPR−Casベクターシステムを提供する。
[第1実施形態]
一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドRNAとを混合し、インキュベートする工程と、前記タンパク質が、PAM配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを改変する工程と、を備え、
前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、PAM配列を有し、
前記タンパク質は、上述の<dSaCas9変異体>において示されたタンパク質であり、
前記ガイドRNAは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記PAM配列の1塩基上流から20塩基以上24塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法を提供する。
まず、前記タンパク質及び前記ガイドRNAを温和な条件で混合し、インキュベートする。温和な条件とは、上述のとおりである。インキュベートする時間は、0.5時間以上1時間以下が好ましい。前記タンパク質及び前記ガイドRNAによる複合体は、安定しており、室温で数時間静置しても安定性を保つことができる。
次に、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド上において、前記タンパク質及び前記ガイドRNAは複合体を形成する。前記タンパク質は、PAM配列を認識し、PAM配列の上流に位置する結合部位で、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合する。続いて、前記ガイドRNAと前記二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、目的に応じた改変が施された標的二本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。
本発明のdSaCas9変異体は、エンドヌクレアーゼ活性を有さないので該タンパク質はPAM配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができるが、そこにとどまって切断することができない。従って、例えば該タンパク質に蛍光タンパク質(例、GFP)等の標識タンパク質を融合させておくと、dSaCas9変異体タンパク質−ガイドRNAを介して標識タンパク質を標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合させることができる。dSaCas9変異体に結合させる物質を適宜選択することによって多様な機能を標的二本鎖ポリヌクレオチドに与えることが可能となる。
さらに、dSaCas9変異体タンパク質のN末端あるいはC末端に転写制御因子タンパク質又はドメインを連結することができる。転写制御因子又はそのドメインとしては、転写活性化因子又はそのドメイン(例、VP64、VP160、NF−κB p65)及び転写サイレンサー又はそのドメイン(例、ヘテロクロマチンタンパク質1(HP1))又は転写抑制因子又はそのドメイン(例、クルッペル関連ボックス(KRAB)、ERFリプレッサードメイン(ERD)、mSin3A相互作用ドメイン(SID))が挙げられる。
DNAのメチル化状態を修飾する酵素(例、DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)、TET)やヒストンサブユニットを修飾する酵素(例、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ)を連結することもできる。
本実施形態において、インキュベート工程の前に、さらに、上述のCRISPR−Casベクターシステムを用いて、上述の<dSaCas9変異体>において示されたタンパク質と、ガイドRNAとを発現させる発現工程を備えていてもよい。
一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において部位特異的に改変するための方法であって、
上述のCRISPR−Casベクターシステムを細胞に導入し、上述の<dSaCas9変異体>において示されたタンパク質と、ガイドRNAとを発現させる発現工程と、
前記タンパク質が、PAM配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合する工程と、
前記ガイドRNAと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、改変された前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程と、を備え、
前記ガイドRNAは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記PAM配列の1塩基上流から20塩基以上24塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法を提供する。
本実施形態における標的二本鎖ポリヌクレオチドの修飾により、標的二本鎖ポリヌクレオチドが改変された細胞を得ることができる。
(方法)
1.クローニング
NEB Q5 Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、dSaCas9遺伝子内に、所定の欠失領域を作り、リンカーをコードする遺伝子を導入し、さらに転写制御因子であるKRAB遺伝子を融合させて種々のdSaCas9変異体を作製した(図1)。これらの変異体について、MYD88遺伝子を用いてその発現抑制活性を調べた。全てのdSaCas9変異体の遺伝子構築物をpX601ベクターに組み込んだ(F. Ann Ran et al., Nature 2015; 520(7546); pp.186-191)。DNA結合アッセイには、crRNA配列;GGAGCCACAGTTCTTCCACGG(配列番号7)をtracrRNA配列;GTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCACGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTT(配列番号8)と融合させガイドRNA(sgRNA)を形成させベクターから発現させるようにした。
尚、コントロールのガイドRNA(コントロールsgRNA)配列としては、以下の配列を用いた:ACGGAGGCTAAGCGTCGCAA(配列番号9)。
2.細胞トランスフェクション
HEK293FT細胞をトランスフェクションの24時間に1ウェルあたり75,000細胞の密度で24ウェルプレートに播種し、10%FBS、2mMの新鮮なL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム及び非必須アミノ酸を添加したDMEM培地で培養した。細胞を500ngの各dSaCas9変異体(レプレッサー)発現ベクター及び各sgRNA発現ベクターを1.5μlのリポフェクトアミン2000(Life technologies)を用い、取扱説明書に従ってトランスフェクトした。遺伝子発現解析の為に、トランスフェクション後48〜72時間で細胞を回収しRLTバッファー(Qiagen)に溶解しRNeasy kit (Qiagen)を用いて全RNAを抽出した。
3.遺伝子発現解析
Taqman解析の為に、1.5μgの全RNAから、20μlの容量でTaqManTM High-Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems)を用いてcDNAを調製した。調製されたcDNAを20倍に希釈し、Taqman反応あたり6.33μlを用いた。MYD88遺伝子に対するTaqmanプライマー及びプローブはApplied Biosystemsより入手した。Roche LightCycler 96又はLightCycler 480中、Taqman gene expression master mix (ThermoFisher)を用いてTaqman反応を reaction was run using Taqman gene expression master mix (ThermoFisher)行い、LightCycler 96 analysisソフトウェアを用いて解析した。
Taqman probe product IDs:
MYD88: Hs01573837_g1 (FAM)
HPRT: Hs99999909_m1 (FAM, VIC)
Taqman QPCR condition:
Step 1; 95C 10 min
Step 2; 95C 15 sec
Step 3; 60C 30 sec
Repeat Step 2 and 3; 40 times
本発明のdSaCas9変異体における遺伝子発現レベルはコントロールに比べ野生型dSaCas9に匹敵する程度に低かった(図2)。この結果より、本発明のdSaCas9変異体は、欠失領域が存在し、全長のdSaCas9に比べて80%程度の大きさに縮小されているにもかかわらず、ガイドRNAとの結合能、ひいてはDNA結合親和性が維持されていることが示された。
上記結果において、特にDNA結合親和性が高かったT1について、さらに様々な点変異を導入し、その効果を確認した。結果を図3に示す。
M12(45位のグルタミン酸がリジンに置換されたT1変異体)にT1よりも優れたDNA結合親和性が確認された。
M12について、さらに様々な点変異を導入し、その効果を確認した。結果を図4に示す。
M15(163位のグルタミン酸がリジンに置換されたM12変異体)にM12よりも優れたDNA結合親和性が確認された。
本出願は、米国で出願された米国仮特許出願第62/682,244(出願日:2018年6月8日)を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (24)
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列において、
481〜649位の間に連続した欠失領域を有し、該欠失領域が、
(i)L1ドメイン(481〜519位)の全部または一部、及び
(ii)HNHドメイン(520〜628位)の全部を含み、さらに任意で該欠失領域は
(iii)L2ドメイン(629〜649位)の全部または一部を含み、
該欠失領域にそれぞれ隣接したアミノ酸が3乃至10個のアミノ酸残基からなるリンカーによって連結しているアミノ酸配列を含む配列からなり、
且つ、ガイドRNAとの結合能を有するタンパク質。 - 該欠失領域が、
(i)L1ドメインの全部(481〜519位)、
(ii)HNHドメイン領域の全部(520〜628位)、及び
(iii)L2ドメインの全部(629〜649位)
である、請求項1記載のタンパク質。 - 該欠失領域が、
(i)L1ドメインの一部(482〜519位)、
(ii)HNHドメインの全部(520〜628位)、及び
(iii)L2ドメインの一部(629〜647位)
である、請求項1記載のタンパク質。 - 該欠失領域が、
(i)L1ドメインの一部(482〜519位)、及び
(ii)HNHドメインの全部(520〜628位)
である、請求項1記載のタンパク質。 - 配列番号2で表されるアミノ酸配列において、45位及び/又は163位のグルタミン酸(E)が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドRNAとの結合能を有するタンパク質。
- 他のアミノ酸が塩基性アミノ酸である、請求項5記載のタンパク質。
- 塩基性アミノ酸が、リジン(K)である、請求項6記載のタンパク質。
- さらに、45位及び/又は163位のグルタミン酸(E)が他のアミノ酸に置換されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 他のアミノ酸が塩基性アミノ酸である、請求項8記載のタンパク質。
- 塩基性アミノ酸がリジン(K)である、請求項9記載のタンパク質。
- リンカーが、グリシン(G)及びセリン(S)で構成される、5〜9アミノ酸長のリンカーである、請求項1〜8のいずれか1項に記載のタンパク質。
- リンカーが、以下から選択される、請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質:
−SGGGS−
−GGSGGS−
−SGSGSGSG−
−SGSGSGSGS−。 - 配列番号2の変異及び/又は欠失が施された位置以外の部位において80%以上の同一性を有する、請求項1〜12のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 配列番号2の変異及び/又は欠失が施された位置以外の部位において1〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加された、請求項1〜12のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 転写制御因子タンパク質又はドメインを連結した、請求項1〜14のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 転写制御因子が転写活性化因子である、請求項15記載のタンパク質。
- 転写制御因子が転写サイレンサー又は転写抑制因子である、請求項15記載のタンパク質。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする核酸。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載のタンパク質と、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のPAM(Proto-spacer Adjacent Motif)配列の1塩基上流から20塩基以上24塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドRNAと、を備えるタンパク質−RNA複合体。
- 標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドRNAとを混合し、インキュベートする工程と、
前記タンパク質が、PAM配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを改変する工程と、を備え、
前記タンパク質は、請求項1〜17のいずれか1項に記載のタンパク質であり、
前記ガイドRNAは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記PAM配列の1塩基上流から20塩基以上24塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法。 - 細胞の標的遺伝子の発現を増大させる方法であって、前記細胞内で請求項16に記載のタンパク質と、前記標的遺伝子に対する1つ又は複数のガイドRNAとを発現させることを含む、方法。
- 細胞の標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、前記細胞内で請求項17に記載のタンパク質と、前記標的遺伝子に対する1つ又は複数のガイドRNAとを発現させることを含む、方法。
- 細胞が真核細胞である、請求項21又は22に記載の方法。
- 細胞が酵母細胞、植物細胞又は動物細胞である、請求項21又は22に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862682244P | 2018-06-08 | 2018-06-08 | |
US62/682,244 | 2018-06-08 | ||
PCT/JP2019/022795 WO2019235627A1 (ja) | 2018-06-08 | 2019-06-07 | 改変されたCas9タンパク質及びその用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2019235627A1 true JPWO2019235627A1 (ja) | 2021-06-24 |
JP7412001B2 JP7412001B2 (ja) | 2024-01-12 |
Family
ID=68770337
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020523211A Active JP7412001B2 (ja) | 2018-06-08 | 2019-06-07 | 改変されたCas9タンパク質及びその用途 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220017881A1 (ja) |
EP (1) | EP3805386A4 (ja) |
JP (1) | JP7412001B2 (ja) |
KR (1) | KR20210025046A (ja) |
CN (1) | CN112513266A (ja) |
AU (1) | AU2019281158A1 (ja) |
BR (1) | BR112020024992A2 (ja) |
CA (1) | CA3103088A1 (ja) |
IL (1) | IL279178A (ja) |
MX (1) | MX2020013158A (ja) |
SG (1) | SG11202012228QA (ja) |
WO (1) | WO2019235627A1 (ja) |
ZA (1) | ZA202100092B (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20220233721A1 (en) | 2019-05-28 | 2022-07-28 | Astellas Pharma Inc. | Method for treating muscular dystrophy by targeting dmpk gene |
WO2021230385A1 (en) | 2020-05-15 | 2021-11-18 | Astellas Pharma Inc. | Method for treating muscular dystrophy by targeting utrophin gene |
JP2023539631A (ja) * | 2020-08-31 | 2023-09-15 | 株式会社モダリス | Dux4遺伝子を標的とした顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーの治療方法 |
AR124143A1 (es) | 2020-11-25 | 2023-02-15 | Astellas Pharma Inc | Método para tratar la distrofia muscular mediante el direccionamiento al gen dmpk |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008008523A1 (en) * | 2006-07-14 | 2008-01-17 | Regents Of The University Of Minnesota | COMPOUNDS THAT BIND α5β1 INTEGRIN AND METHODS OF USE |
JP2010505437A (ja) * | 2006-10-13 | 2010-02-25 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー | 塩基性タンパク質タグに融合したプロセシング酵素 |
JP2016533332A (ja) * | 2013-09-24 | 2016-10-27 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 自己集合型ナノ粒子ワクチン |
WO2016196655A1 (en) * | 2015-06-03 | 2016-12-08 | The Regents Of The University Of California | Cas9 variants and methods of use thereof |
WO2016205759A1 (en) * | 2015-06-18 | 2016-12-22 | The Broad Institute Inc. | Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation |
JP2017527284A (ja) * | 2014-09-01 | 2017-09-21 | ブイアイビー ブイゼットダブリュVib Vzw | 変異体ポア |
WO2017217768A1 (ko) * | 2016-06-15 | 2017-12-21 | 주식회사 툴젠 | 온타겟 및 오프타겟의 다중 타겟 시스템을 이용하는, 표적 특이적 유전자 가위 스크리닝 방법 및 이의 용도 |
JP2018502572A (ja) * | 2015-01-02 | 2018-02-01 | ダイアックス コーポレーション | 血漿カリクレインおよび第xii因子に対する二重特異性抗体 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107532161A (zh) | 2015-03-03 | 2018-01-02 | 通用医疗公司 | 具有改变的PAM特异性的工程化CRISPR‑Cas9核酸酶 |
WO2016205613A1 (en) * | 2015-06-18 | 2016-12-22 | The Broad Institute Inc. | Crispr enzyme mutations reducing off-target effects |
US20180201912A1 (en) | 2015-07-14 | 2018-07-19 | The University Of Tokyo | Modified fncas9 protein and use thereof |
SG10201913505WA (en) | 2016-10-17 | 2020-02-27 | Univ Nanyang Tech | Truncated crispr-cas proteins for dna targeting |
CN110662835B (zh) | 2017-05-19 | 2023-04-28 | 清华大学 | 工程化改造用于由增强的指导RNA优化的基因编辑和转录调节的最小化SaCas9 CRISPR/Cas系统 |
WO2019089910A1 (en) * | 2017-11-01 | 2019-05-09 | Ohio State Innovation Foundation | Highly compact cas9-based transcriptional regulators for in vivo gene regulation |
JP7069426B2 (ja) * | 2018-11-16 | 2022-05-17 | アステラス製薬株式会社 | ユートロフィン遺伝子を標的とした筋ジストロフィーの治療方法 |
-
2019
- 2019-06-07 KR KR1020217000588A patent/KR20210025046A/ko unknown
- 2019-06-07 US US16/972,920 patent/US20220017881A1/en active Pending
- 2019-06-07 JP JP2020523211A patent/JP7412001B2/ja active Active
- 2019-06-07 CA CA3103088A patent/CA3103088A1/en active Pending
- 2019-06-07 SG SG11202012228QA patent/SG11202012228QA/en unknown
- 2019-06-07 EP EP19815297.7A patent/EP3805386A4/en active Pending
- 2019-06-07 WO PCT/JP2019/022795 patent/WO2019235627A1/ja unknown
- 2019-06-07 AU AU2019281158A patent/AU2019281158A1/en not_active Abandoned
- 2019-06-07 CN CN201980037466.XA patent/CN112513266A/zh active Pending
- 2019-06-07 BR BR112020024992-0A patent/BR112020024992A2/pt unknown
- 2019-06-07 MX MX2020013158A patent/MX2020013158A/es unknown
-
2020
- 2020-12-03 IL IL279178A patent/IL279178A/en unknown
-
2021
- 2021-01-06 ZA ZA2021/00092A patent/ZA202100092B/en unknown
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008008523A1 (en) * | 2006-07-14 | 2008-01-17 | Regents Of The University Of Minnesota | COMPOUNDS THAT BIND α5β1 INTEGRIN AND METHODS OF USE |
JP2010505437A (ja) * | 2006-10-13 | 2010-02-25 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー | 塩基性タンパク質タグに融合したプロセシング酵素 |
JP2016533332A (ja) * | 2013-09-24 | 2016-10-27 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 自己集合型ナノ粒子ワクチン |
JP2017527284A (ja) * | 2014-09-01 | 2017-09-21 | ブイアイビー ブイゼットダブリュVib Vzw | 変異体ポア |
JP2018502572A (ja) * | 2015-01-02 | 2018-02-01 | ダイアックス コーポレーション | 血漿カリクレインおよび第xii因子に対する二重特異性抗体 |
WO2016196655A1 (en) * | 2015-06-03 | 2016-12-08 | The Regents Of The University Of California | Cas9 variants and methods of use thereof |
WO2016205759A1 (en) * | 2015-06-18 | 2016-12-22 | The Broad Institute Inc. | Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation |
WO2017217768A1 (ko) * | 2016-06-15 | 2017-12-21 | 주식회사 툴젠 | 온타겟 및 오프타겟의 다중 타겟 시스템을 이용하는, 표적 특이적 유전자 가위 스크리닝 방법 및 이의 용도 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MA, DACHENG ET AL.: "Rational Design of Mini-Cas9 for Transcriptional Activation", ACS SYNTH. BIOL., vol. 7, JPN6019032999, 21 March 2018 (2018-03-21), pages 978 - 985, ISSN: 0005044913 * |
NISHIMASU, HIROSHI ET AL.: "Crystal structure of staphylococcus aureus Cas9", CELL, vol. 162, JPN6019033003, 2015, pages 1113 - 1126, XP055304450, ISSN: 0005044914, DOI: 10.1016/j.cell.2015.08.007 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3805386A4 (en) | 2022-03-23 |
JP7412001B2 (ja) | 2024-01-12 |
CA3103088A1 (en) | 2019-12-12 |
EP3805386A1 (en) | 2021-04-14 |
MX2020013158A (es) | 2021-04-29 |
WO2019235627A1 (ja) | 2019-12-12 |
KR20210025046A (ko) | 2021-03-08 |
AU2019281158A1 (en) | 2021-01-14 |
ZA202100092B (en) | 2021-10-27 |
SG11202012228QA (en) | 2021-01-28 |
BR112020024992A2 (pt) | 2021-03-23 |
CN112513266A (zh) | 2021-03-16 |
IL279178A (en) | 2021-01-31 |
US20220017881A1 (en) | 2022-01-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11702645B2 (en) | Polynucleotide encoding modified CAS9 protein | |
JPWO2020085441A1 (ja) | 改変されたCas9タンパク質及びその用途 | |
JP7412001B2 (ja) | 改変されたCas9タンパク質及びその用途 | |
US20230279374A1 (en) | Modified cas9 protein, and use thereof | |
JPWO2018221685A6 (ja) | 改変されたCas9タンパク質及びその用途 | |
WO2017010543A1 (ja) | 改変されたFnCas9タンパク質及びその使用 | |
WO2019026976A1 (ja) | 改変されたCas9タンパク質及びその用途 | |
CN115052986A (zh) | 包含核酸酶的组合物及其用途 | |
WO2024041653A1 (zh) | 一种CRISPR-Cas13系统及其应用 | |
JP2023539569A (ja) | ヌクレアーゼを含む組成物及びその使用 | |
CN118159650A (zh) | 一种CRISPR-Cas13系统及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220601 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230425 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230623 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230711 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231011 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20231122 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20231212 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20231219 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7412001 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |