JP2019527535A - Ｉｌ−１３抗体およびその製造方法と使用 - Google Patents

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Abstract

IL-13抗体およびその製造方法と使用である。当該IL-13抗体は、IL-13抗体の重鎖可変領域の重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3のうちの一つまたは複数、ならびに/あるいは、IL-13抗体の軽鎖可変領域の軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3のうちの一つまたは複数を含む。当該IL-13抗体は高親和力を有し、IL-13によって誘導される胸腺および活性化制御ケモカインとペリオスチンの分泌および血管細胞接着分子-1の発現を顕著に抑制し、IL-13によって誘導されるマウスの高い気道反応性を顕著に抑制することができるため、IL-13発現または機能異常に関連する疾患を予防または治療する薬物の製造に使用する。

Description

本願は出願日が2016年5月18日の中国特許出願CN201610333020.Xおよび出願日が2016年6月24日の中国特許出願CN201610474103.0の優先権を要求する。本願は上記中国特許出願の全文を引用する。
本発明は、抗体の分野に関し、具体的に、IL-13抗体およびその製造方法と使用に関する。
気管支喘息（喘息と略する）は、よく見られる慢性気道性炎症疾患で、通常、気道反応性が高くなり、発作を繰り返す喘息、頻呼吸、胸内苦悶および/または咳などの症状が現れる。20世紀70年代以降、喘息が幅広く流行ってきた。2011年では、世界中で約2.35億〜3億の人が影響を受け、約25万人はそれによって亡くなった。臨床において、喘息は通常ステロイドなどの糖質コルチコイドの吸入に長時間作用のβ-アドレナリン受容体作動薬を合わせるような手段によって治療される。しかし、約10％の患者は通常の気道吸入による方法で緩和することができず、多くの場合、副作用の大きいステロイド系薬物を経口投与することによって病状を抑える必要があり、それにしても高い死亡率が伴う。患者は生活品質が大きく影響されるだけでなく、発生する直接的な医療費用と間接的なコストも個人や社会経済の巨大な負担になる。
近年、喘息に対する研究が深くなるにつれ、多くの喘息患者はTh2細胞の可溶性サイトカインの過剰放出によって誘導されるIgEの生成によって、肥満細胞、好酸球の脱顆粒が増えることで、多くの炎症性細胞が関与する気道アレルギー反応や慢性気道炎症につながる。中でも、インターロイキン-13（以下、IL-13と略する）およびインターロイキン-4（以下、IL-4と略する）はこの過程において重要な役割を果たす。IL-13は主にTh2細胞によって分泌される多機能サイトカインで、分子量が約10kDaで、その遺伝子が5番染色体に位置し、IL-4遺伝子と密接に関連する。IL-4とIL-13のいずれもTh2細胞によって生成し、同じ受容体鎖を共有し、機能的に似ているところが多い。近年、多くの動物実験で、IL-4とIL-13のいずれも気道反応性の増加、好酸球の浸潤および粘液分泌の増加につながることがすでに実証された。喘息患者によく見られる血漿IgEレベルの向上は、IL-13の刺激によってB細胞が増殖、分化する結果であることもすでに実証された。近年、IL-13遺伝子の一塩基多型に対する研究が深くなるにつれ、IL-13に一つの天然バリアントR130Qが存在することも発見された。ヒトでは約25％の染色体にこのようなバリアントのコードが現れるが、喘息患者では、この比率が約50％まで高くなる。文献で、R130Qバリアントは喘息の発症と直接関連し、かつアレルギー症状がより生じやすいことが報告された。深く研究したところ、IL-13バリアントR130Qを発現する患者は体内におけるIL-13濃度がより高く、かつ効果がより強く、喘息のような症状がより引き起こしやすいことが見出された（MayおよびFung 2015, Cytokine75:89を参照する）。
従来のハイブリドーマ調製技術はKohlerおよびMilsteinによって40年前に確立され（KohlerおよびMilstein, 1975，Nature 256: 495）、現在、科学研究、診断、治療などの多くのモノクローナル抗体に関連する製造と生産に幅広く使用されている。その基本の方法は今まで変わっていないが、異なる品種、たとえば遺伝子組み換え動物の使用、電気融合技術の導入、高効率スクリーニング技術の設備、たとえばClonePix設備の使用などを含め、多くの面で変更、改善や革新が行われてきた。よって、ハイブリドーマ技術の使用は、より多様化および効率化してきた。通常の動物、たとえばマウスなどによって製造されるモノクローナル抗体は、通常の分子生物学的方法によって抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の遺伝子をクローニングし、可変領域の遺伝子をヒト由来抗体の定常領域の遺伝子につなぐことによってヒト・マウスキメラ抗体を形成し（米国特許文献U.S.特許番号4,816,567を参照する）、人体への使用時の免疫原性を大幅に低下させることができる。また、マウス由来抗体の可変領域のCDRドメインはヒト由来抗体の構造につなぐことによって、マウス由来抗体の成分を5％以下に低下させ、抗体の人体内における使用の安全性を大幅に向上させることができる。このように得られる抗体はヒト化抗体と呼ばれ、かつ現在の抗体薬物市場の主流の製品である（米国特許文献U.S.特許番号5,225,539などを参照する）。
ファージディスプレイ技術が最初に現れたのは1985年で、Smith G P[Smith GP 1985，Science 228 （4705）:1315 ‐ 7を参照する]が初めて外因性遺伝子を糸状ファージf1の遺伝子IIIに導入し、目的の遺伝子がコードするポリペプチドを融合タンパク質の形態でファージの表面にディスプレイさせることによって、ファージディスプレイ技術を確立した。同年、George Pieczenikが発表した特許（米国特許文献U.S.特許番号58663635などを参照する）では、ファージディスプレイ技術によってペプチドライブラリーを構築する方法が紹介された。その後、当該技術は長年の改善と発展を経て、新機能を有するポリペプチドの発見および既存のポリペプチドの性質の改変のための強力なツールになっている。
そのため、IL-13を抑制する薬物、たとえば気管支喘息を予防または治療するためのIL-13抗体の使用が切望されている。
本発明の解決しようとする技術課題は、従来の技術にいまIL-13抗体が欠けているという不足を克服するため、親和力が高く、特異性が強いIL-13抗体およびその製造方法と使用を提供することである。前記のIL-13抗体は高親和力を有し、IL-13によって誘導される胸腺および活性化制御ケモカインの分泌とペリオスチンの分泌および血管細胞接着分子-1の発現を顕著に抑制し、IL-13によって誘導されるマウスの高い気道反応性を顕著に抑制することができる。そのため、気管支喘息などの疾患を予防または治療する薬物の製造に使用することができる。
本発明は組み換えヒトIL-13タンパク質を免疫原とし、従来のハイブリドーマ調製技術（KohlerおよびMilstein，Nature，1975，256: 495を参照する）またはファージディスプレイ技術を使用し、一連の調整および改善によってIL-13抗体のリード抗体を得る。さらに、リード抗体の初期生産、精製および同定によって、ヒトIL-13タンパク質などのタンパク質と高い親和力を有するIL-13抗体を得る。そして、分子生物学的方法による配列決定によって得られたIL-13抗体の重鎖可変領域およびIL-13抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を知り、マウス・ヒトキメラ抗体分子またはヒト由来抗体分子を得る。
本発明は、IL-13抗体の重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3のうちの一つまたは複数、ならびに/あるいは、IL-13抗体の軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3のうちの一つまたは複数を含む、単離されたタンパク質であって、
前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表における配列番号2、配列番号10、配列番号18、配列番号26、配列番号34または配列番号42で示され、
前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表における配列番号3、配列番号11、配列番号19、配列番号27、配列番号35または配列番号43で示され、
前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表における配列番号4、配列番号12、配列番号20、配列番号28、配列番号36または配列番号44で示され、
前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表における配列番号6、配列番号14、配列番号22、配列番号30、配列番号38または配列番号46で示され、
前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表における配列番号7、配列番号15、配列番号23、配列番号31、配列番号39または配列番号47で示され、
前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表における配列番号8、配列番号16、配列番号24、配列番号32、配列番号40または配列番号48で示されるか、
あるいは、
前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表における配列番号2、配列番号10、配列番号18、配列番号26、配列番号34または配列番号42で示されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、
前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表における配列番号3、配列番号11、配列番号19、配列番号27、配列番号35または配列番号43で示されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、
前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表における配列番号4、配列番号12、配列番号20、配列番号28、配列番号36または配列番号44で示されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、
前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表における配列番号6、配列番号14、配列番号22、配列番号30、配列番号38または配列番号46で示されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、
前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表における配列番号7、配列番号15、配列番号23、配列番号31、配列番号39または配列番号47で示されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、
前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表における配列番号8、配列番号16、配列番号24、配列番号32、配列番号40または配列番号48で示されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示される、
タンパク質を提供する。
好ましくは、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号2で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号3で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号4で示されるか、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号10で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号11で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号12で示されるか、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号18で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号19で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号20で示されるか、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号26で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号27で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号28で示されるか、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号34で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号35で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号36で示されるか、あるいは前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号42で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号43で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号44で示され、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号6で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号7で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号8で示されるか、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号14で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号15で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号16で示されるか、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号22で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号23で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号24で示されるか、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号30で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号31で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号32で示されるか、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号38で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号39で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号40で示されるか、あるいは前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号46で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号47で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は配列表の配列番号48で示される。
好ましくは、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号2で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号3で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号4で示され、かつ前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号6で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号7で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号8で示されるか、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号10で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号11で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号12で示され、かつ前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号14で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号15で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号16で示されるか、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号18で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号19で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号20で示され、かつ前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号22で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号23で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号24で示されるか、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号26で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号27で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号28で示され、かつ前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号30で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号31で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号32で示されるか、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号34で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号35で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号36で示され、かつ前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号38で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号39で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号40で示されるか、あるいは前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号42で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号43で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号44で示され、かつ前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号46で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号47で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号48で示される。
本発明は、IL-13抗体の重鎖可変領域および/またはIL-13抗体の軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号1、配列番号9、配列番号17、配列番号25、配列番号33または配列番号41で示され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号5、配列番号13、配列番号21、配列番号29、配列番号37または配列番号45で示される単離されたタンパク質を提供する。
好ましくは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号1で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号5で示されるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号9で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号13で示されるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号17で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号21で示されるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号25で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号29で示されるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号33で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号37で示されるか、あるいは前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号41で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号45で示される。
上記のように、上記アミノ酸配列の番号は表1に示される通りである。
IL-13抗体のアミノ酸配列の番号
ここで、表1における数字は、配列表の「配列番号」で、たとえばP4_4H12の重鎖タンパク質の可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号1で、P4_4H12の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインのアミノ酸配列は、配列表の配列番号2である。
好ましくは、前記のタンパク質は、さらに抗体の重鎖定常領域および/または抗体の軽鎖定常領域を含み、前記抗体の重鎖定常領域は、本分野の通常のもの、好ましくはマウス由来抗体の重鎖定常領域またはヒト由来抗体の重鎖定常領域、より好ましくはヒト由来抗体の重鎖定常領域である。前記抗体の軽鎖定常領域は、本分野の通常のもの、好ましくはマウス由来抗体の軽鎖定常領域またはヒト由来抗体の軽鎖定常領域、より好ましくはヒト由来抗体の軽鎖定常領域である。
前記のタンパク質は、本分野の通常のタンパク質、好ましくはIL-13抗体、より好ましくは抗体の全長タンパク質、抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片、二重特異性抗体、多重特異性抗体、一本鎖抗体（single chain antibody fragment、scFv）、単一ドメイン抗体（single-domain antibody、sdAb）および単一領域抗体（Signle-domain antibody）のうちの一つまたは複数、ならびに上記抗体で製造されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術などを含む、多くのアプローチおよび技術によって研究・製造することができるが、ハイブリドーマ技術によって野生型または遺伝子組み換えマウスからモノクローナル抗体を調製するのは主流である。
前記の抗体全長タンパク質は、本分野の通常の抗体全長タンパク質で、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含む。好ましくは、前記のタンパク質の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、ヒト由来の重鎖定常領域およびヒト由来の軽鎖定常領域と全ヒト由来抗体の全長タンパク質を構成する。あるいは、好ましくは、前記のタンパク質の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、マウス由来の重鎖定常領域およびマウス由来の軽鎖定常領域と抗体の全長タンパク質を構成する。好ましくは、前記の抗体の全長タンパク質はIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4である。
前記の一本鎖抗体は、本分野の通常の一本鎖抗体で、重鎖可変領域、軽鎖可変領域および15〜20アミノ酸の短鎖ペプチドを含む。
前記の抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片は、本分野の通常の抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片で、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域および重鎖定常領域のFd断片を含む。好ましくは、前記の抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片は、FabおよびF(ab')2である。
前記の単一ドメイン抗体は、本分野の通常の単一ドメイン抗体で、重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。
前記の単一領域抗体は、本分野の通常の単一領域抗体で、重鎖可変領域のみを含む。
ここで、前記タンパク質の製造方法は、本分野の通常の製造方法である。前記製造方法は、好ましくは、当該タンパク質を組み換え発現する発現形質転換体から分離すること、またはタンパク質配列を人工合成することによって得るものである。前記の当該タンパク質を組み換え発現する発現形質転換体から分離することによって得る方法は、好ましくは、前記タンパク質をコードし、かつ点突然変異を持つ核酸分子を組み換えベクターにクローニングし、得られた組み換え発現形質転換体を培養し、分離・精製して前記タンパク質を得るものである。
また、本発明は、上記のタンパク質をコードする核酸を提供する。
好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57または配列番号59で示され、ならびに/あるいは、前記軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58または配列番号60で示される。
より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号49で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号50で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号51で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号52で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号53で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号54で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号55で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号56で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号57で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号58で示されるか、あるいは、前記重鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号59で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号60で示される。
上記ヌクレオチド酸配列の番号は、表2に示される通りである。
IL-13抗体のヌクレオチド配列の番号
ここで、表2における数字は配列表の「配列番号」で、たとえばP4_4H12の重鎖タンパク質の可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号49で、P4_4H12の軽鎖タンパク質の可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号50である。
P4_4H12の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号49における91番目〜105番目で、
P4_4H12の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号49における148番目〜198番目で、
P4_4H12の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号49における295番目〜348番目で、
P4_4H12の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号50における70番目〜105番目で、
P4_4H12の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号50における151番目〜171番目で、
P4_4H12の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号50における268番目〜294番目で、
29D9H8の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号51における91番目〜105番目で、
29D9H8の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号51における148番目〜198番目で、
29D9H8の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号51における295番目〜327番目で、
29D9H8の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号52における70番目〜102番目で、
29D9H8の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号52における148番目〜168番目で、
29D9H8の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号52における265番目〜291番目で、
28A2E11の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号53における91番目〜105番目で、
28A2E11の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号53における148番目〜198番目で、
28A2E11の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号53における295番目〜321番目で、
28A2E11の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号54における67番目〜108番目で、
28A2E11の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号54における154番目〜174番目で、
28A2E11の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号54における271番目〜297番目で、
35E2C3の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号55における91番目〜105番目で、
35E2C3の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号55における148番目〜195番目で、
35E2C3の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号55における292番目〜321番目で、
35E2C3の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号56における70番目〜102番目で、
35E2C3の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号56における148番目〜168番目で、
35E2C3の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号56における265番目〜291番目で、
70F10A10の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号57における91番目〜105番目で、
70F10A10の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号57における148番目〜198番目で、
70F10A10の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号57における295番目〜330番目で、
70F10A10の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号58における70番目〜120番目で、
70F10A10の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号58における166番目〜186番目で、
70F10A10の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号58における283番目〜309番目で、
35H6E1の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号59における91番目〜111番目で、
35H6E1の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号59における154番目〜201番目で、
35H6E1の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号59における298番目〜336番目で、
35H6E1の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号60における70番目〜102番目で、
35H6E1の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号60における148番目〜168番目で、
35H6E1の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号60における265番目〜291番目である。前記核酸の製造方法は、本分野の通常の製造方法で、好ましくは、遺伝子クローニング技術によって上記タンパク質をコードする核酸分子を得るか、または全配列を人工的に合成する方法によって上記タンパク質をコードする核酸分子を得る工程を含む。
当業者には、上記タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列に適当に置換、欠失、変更、挿入または添加を導入することによって一つのポリヌクレオチドのホモログを提供することができることがわかる。本発明において、ポリヌクレオチドのホモログは当該タンパク質をコードする遺伝子の一つまたは複数の塩基に対して抗体の活性を保つ範囲で置換、欠失または添加を行うことによって調製することができる。
また、本発明は前記核酸を含む組み換え発現ベクターを提供する。
ここで、前記組み換え発現ベクターは、本分野の通常の方法、すなわち、本発明に記載の核酸分子を様々な発現ベクターに連結して構築することによって得ることができる。前記の発現ベクターは、本分野の通常の様々なベクターで、前記核酸分子を担持することができればよい。前記ベクターは、好ましくは様々なプラスミド、コスミド、ファージやウイルスベクターを含む。
また、本発明は、上記組み換え発現ベクターを含む組み換え発現形質転換体を提供する。
ここで、前記組み換え発現形質転換体の製造方法は、本分野の通常の製造方法で、好ましくは、上記組み換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換させて得る方法である。前記の宿主細胞は、本発明の通常の様々な宿主細胞で、上記組み換え発現形質転換体が安定して自己複製し、かつ担持される前記の核酸が有効に発現されるようにさせることができればよい。好ましくは、前記宿主細胞は、E.coli TG1またはBL21細胞（一本鎖抗体またはFab抗体を発現する）、またはCHO-K1細胞（全長IgG抗体を発現する）である。前記組み換え発現プラスミドを宿主細胞に形質転換させれば、本発明の好適な組み換え発現形質転換体を得ることができる。ここで、前記形質転換方法は、本発明の通常の形質転換方法、好ましくは化学的形質転換法、ヒートショック法または電気的形質転換法である。
本発明は、IL-13抗体の製造方法であって、上記の組み換え発現形質転換体を培養し、培養物からIL-13抗体を得る工程を含む方法を提供する。
また、本発明は、IL-13タンパク質を過剰発現する細胞を検出する方法であって、上記のタンパク質を被験サンプルと体外で接触させ、上記のタンパク質と前記被験サンプルの結合を検出する工程を含む方法を提供する。
前記の過剰発現の意味は本分野の通常のもので、IL-13タンパク質の被験サンプルにおけるRNAまたはタンパク質の過剰発現（転写の増加、転写後修飾、翻訳、翻訳後の修飾およびタンパク質分解による変化）、およびタンパク質の輸送形態の変化（核局在化の増加）による局部の過剰発現と機能活性の向上（たとえば基質の酵素加水分解作用が増加する場合）をいう。
前記結合の検出手段は、本分野の通常の検出手段、好ましくはFACSによる検出である。
本発明は、IL-13タンパク質を過剰発現する細胞を検出する組成物であって、上記のタンパク質を活性成分として含む組成物を提供する。好ましくは、さらに上記のタンパク質の機能断片からなる化合物を活性成分として含む。
本発明は、薬物の製造における上記タンパク質の使用を提供する。
好ましくは、前記の薬物は、気管支喘息を予防または治療するための薬物である。
また、本発明は、活性成分が上記のタンパク質を含む薬物組成物を提供する。
好ましくは、前記の薬物組成物は、気管支喘息を予防または治療するための薬物組成物である。
本発明に記載の薬物組成物の投与経路は、注射投与または経口投与が好ましい。前記注射投与は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射または皮下注射などの経路を含むことが好ましい。前記の薬物組成物は、本分野の通常の様々な剤形で、好ましくは固体、半固体または液体の様態で、水溶液、非水溶液または懸濁液でもよく、より好ましくは錠剤、カプセル、顆粒剤、注射剤または輸液剤などである。
好ましくは、本発明に記載の薬物組成物はさらに1種または複数種の薬用担体を含む。前記の薬用担体は、本分野の通常の薬用担体で、前記の薬用担体は、任意の適切な生理学的にまたは薬学的に許容される薬物助剤でもよい。前記の薬物助剤は、本分野の通常の薬物助剤で、好ましくは薬学的に許容される賦形剤、充填剤または希釈剤などを含む。より好ましくは、前記の薬物組成物は0.01〜99.99％の上記タンパク質および0.01〜99.99％の薬用担体を含み、前記百分率は、前記薬物組成物で占める質量百分率である。
好ましくは、前記の薬物組成物の施用量は、有効量で、前記有効量は疾患、退行性または損傷性病症の進展を緩和または遅延させることができる量である。前記有効量は、個体基礎で測定し、かつ一部として治療しようとする症状および求められる結果を考慮するものでもよい。当業者は、個体基礎などの上記要素および通常範囲内の実験で有効量を決定することができる。
本発明は、IL-13発現または機能異常に関連する疾患を予防または治療する薬物の製造における上記タンパク質の使用を提供する。
本発明において、前記IL-13発現または機能異常に関連する疾患は、本分野の通常のIL-13発現または機能異常に関連する疾患である。好ましくは気管支喘息である。
本発明はIL-13発現または機能異常に関連する疾患を予防または治療する薬物の製造における上記薬物組成物の使用を提供する。
本分野の常識に合うことを前提に、上記各好適な条件を任意に組み合わせれば、本発明の各好適な実例が得られる。
本発明で用いられる試薬および原料はいずれも市販品として得られる。
本発明の積極的な進歩効果は以下のようである。本発明に記載のタンパク質、すなわち、提供されるIL-13抗体は、親和力が高く、ヒトIL-13との親和力がKD＜1×10-8Mに達する。IL-13によって誘導される胸腺および活性化制御ケモカイン（TARC）分泌試験では、IL-13によって誘導された分泌を顕著に抑制することができた。IL-13によって誘導されるペリオスチン（Periostin）分泌試験では、IL-13によって誘導された分泌を顕著に抑制することができた。IL-13によって誘導されるヒト臍帯静脈内皮細胞における血管細胞接着分子-1（VCAM-1）の発現では、IL-13によって誘導された発現を顕著に抑制することができた。フローサイトメトリー分析によって構築される受容体-配位子結合遮断実験では、IL-13とその配位子であるIL-13Ra1/IL-4Raヘテロ二量体の結合を抑制することができた。フローサイトメトリー分析によって構築される受容体-配位子結合遮断実験では、IL-13とその配位子であるIL-13Ra2の結合を抑制することができた。IL-13によって誘導されるマウス気道炎症の動物モデルにおいて、マウス気道呼吸炎症を顕著に抑制し、IL-13によって誘導されるマウス気道の高反応性を抑制することができた。このように、本発明に記載のタンパク質、すなわち、提供されるIL-13抗体は、気管支喘息を予防または治療する薬物の製造に使用することができることがわかる。
図１は、TARC分泌試験におけるIL-13タンパク質の生物学的活性を検出した結果である。 図２は、ELISAによって免疫原Aによる免疫後のマウス血清の抗体価を検出した結果である。 図３-１乃至図３-３は、それぞれELISAによってリード抗体、キメラ抗体および全ヒト由来抗体の免疫原Aとの反応活性を検出した結果である。 図４は、ELISAによってキメラ抗体のIL-13R130Qバリアントとの反応活性を検出した結果で、ここで、横座標0は1％（w/w）BSAのブランク対照を表す。 図５-１および図５-２は、それぞれELISAによってリード抗体、キメラ抗体のサルIL-13との反応活性を検出した結果である。 図６は、ELISAによってリード抗体のマウスIL-13との反応活性を検出した結果である。 図７は、フローサイトメトリー分析方法によって全長ヒトIL-13Ra1を発現するHEK293細胞株におけるhIL-13Ra1タンパク質の発現レベルを検出した結果である。ここで、抗体は、ヒツジ抗ヒトIL-13Ra1抗体（RnD systemsから購入）を、陰性対照は、ヒツジIgG対照を指す。 図８は、フローサイトメトリー分析方法によって全長ヒトIL-4Raを発現するHEK293細胞株におけるhIL-4Raタンパク質の発現レベルを検出した結果である。ここで、抗体は、マウス抗ヒトIL-4Ra抗体（RnD systemsから購入）を、陰性対照はマウスIgG対照を指す。 図９は、フローサイトメトリー分析方法によって全長ヒトIL-13Ra2を発現するHEK293細胞株におけるhIL-13Ra2タンパク質の発現レベルを検出した結果である。ここで、抗体は、ヒツジ抗ヒトIL-13Ra2抗体（RnD systemsから購入）を、陰性対照は、ヒツジIgG対照を指す。 図１０-１乃至図１０-３は、それぞれFACSによってリード抗体、キメラ抗体および全ヒト由来抗体のIL-13と細胞表面受容体IL-13Ra1/IL-4Raヘテロ二量体の結合に対する遮断を検出した結果である。 図１１-１乃至図１１-３は、それぞれFACSによってリード抗体、キメラ抗体および全ヒト由来抗体のIL-13と細胞表面受容体IL-13Ra2の結合に対する遮断を検出した結果である。 図１２-１乃至図１２-３は、それぞれリード抗体、キメラ抗体および全ヒト由来抗体のIL-13によって誘導される胸腺および活性化制御ケモカインの分泌に対する中和の結果である。 図１３は、キメラ抗体のIL-13によって誘導されるペリオスチンの分泌に対する中和の結果である。 図１４は、キメラ抗体のIL-13によって誘導される血管細胞接着分子-1の発現に対する中和の結果である。 図１５は、キメラ抗体がヒトIL-13によって誘導されるマウス呼吸炎症を抑制する実験の結果である。 図１６-１は、キメラ抗体c29D9H8とヒトIL-13の親和力検出実験の結果で、各曲線では上から下へIL-13濃度がそれぞれ12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM、0.78125nM、0.390625nMであり、図１６-２は、キメラ抗体c35E2C3とヒトIL-13の親和力検出実験の結果で、各曲線では上から下へIL-13濃度がそれぞれ100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nMである。
具体的な実施形態
以下、実施例の形によってさらに本発明を説明するが、これによって本発明を記載された実施例の範囲内に限定するわけではない。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常の方法および条件、あるいは商品の説明書に従って選ばれた。
実施例に記載の室温は、本分野の通常の室温で、一般的に20〜25℃である。
実施例において、特別に説明しない限り、前記のPBS緩衝液は、PBSリン酸緩衝液で、pH7.4である。
ヒトIL-13およびヒトIL-13R130Qバリアントの発現と精製
ヒトIL-13タンパク質のアミノ酸配列（GenBankデータベース、登録番号：AAK53823.1を参照する）におけるMet1-Asn132をコードするヌクレオチド配列の3'末端に6つのヒスチジンを加え、Hisタグ組み換えヒトIL-13タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列表の配列番号61で示される）を得た。
あるいは、ヒトIL-13タンパク質バリアントIL-13 R130Qのアミノ酸配列におけるMet1-Asn132をコードするヌクレオチド配列の3'末端に6つのヒスチジンを加え、Hisタグ組み換えヒトIL-13R130Qバリアントをコードするヌクレオチド配列（配列表の配列番号62で示される）を得た。
Hisタグ組み換えヒトIL-13タンパク質をコードするヌクレオチド配列およびHisタグ組み換えヒトIL-13R130Qバリアントをコードするヌクレオチド配列をそれぞれPCPベクター（Invitrogenから購入）にクローニングして既に確立された標準の分子生物学的方法によってプラスミドを調製し、具体的な方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F.およびManiatis T.（1989）. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition（Plainview, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press）を参照する。FreeStyle 293F細胞（Invitrogenから購入）に対して一過性形質移入（PEI、Polysciences）を行ってFreeStyleTM 293（Invitrogen）によって37℃で増幅培養を行った。5〜7日後細胞培養液を収集し、遠心で細胞成分を除去し、Hisタグ含有ヒトIL-13の培養上清液、またはHisタグ含有ヒトIL-13R130Qバリアントの培養上清液を得た。上記培養上清液をそれぞれNi-NTAアフィニティークロマトグラフィーカラム（GEから購入）に仕込み、上清液におけるHisタグ含有ヒトIL-13（すなわち免疫原A）およびHisタグ含有ヒトIL-13R130Qバリアントを精製し、さらに分子篩カラム（GEから購入）によってさらに精製し、大分子重合体などの不純物を除去した。精製された免疫原AおよびHisタグ含有ヒトIL-13R130QバリアントをPBSリン酸塩緩衝液（pH7.4）で保存し、0.22μm無菌膜でろ過した後、分けて-80℃で保存した。
精製された免疫原Aに対してTARC分泌試験を行った。TARC分泌試験の具体的な方法は、Millerら、2008, J Immunol Methods 334(1-2):134-41を参照した。
A549細胞（ATCCから購入）を10％（w/w）牛胎児血清含有F-12k培地（Gibcoから購入）で培養し、T-175細胞が培養瓶で75〜90％コンフルエンスまで増幅培養したら、培地を捨て、PBS緩衝液で1〜2回洗浄した後、トリプターゼ溶液（Trypsin-EDTA、Life technologyから購入）で消化して細胞を収集した。収集された細胞を培地に再懸濁させ、計数後細胞を2×106個細胞/mLに希釈し、細胞を100μL/ウェルで96ウェル細胞培養プレート（2×105個細胞/ウェル）に入れ、培養プレートを37℃、5％（v/v）CO2インキュベーターで一晩培養した。2日目に、勾配希釈された免疫原Aを組み換えヒトTNFα（Peprotechから購入）と混合して混合物I（ここで、混合物IにおけるTNFαの最終濃度は200ng/mLである）を得た。一晩培養された細胞培養プレートから培養上清を捨て、上記混合物Iを入れ、細胞培養プレートを37℃、5％（v/v）CO2インキュベーターで一晩培養した。20時間後、プレートにおける培養上清液を吸い出し、遠心で細胞を除去し、TARC ELISAキット（RnD systemsから購入）によって培養上清液におけるTARCの濃度を検出した。実験の操作は、キット説明書の要求に従って行われた。
具体的な実験は、簡単に下記の通りである。マウス抗ヒトTARC抗体をPBSで2μg/mLに希釈した後、100μL/ウェルで96ウェルマイクロプレートに入れた。4℃で一晩インキュベートした。2日目にプレートを洗浄液[0.05％（w/w）Tween20含有PBS緩衝液]で2回洗浄した後、サンプル希釈液[1％（w/w）BSA含有PBS緩衝液]を300μL/ウェル室温で1時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨て、標準品をサンプル希釈液で500pg/mLに希釈し、さらに6つの点に勾配希釈し、サンプル希釈液をブランク対照として使用し、同時に培養上清液をサンプル希釈液で8倍希釈した。100μL/ウェルで標準品およびサンプルをマイクロプレートに入れ、室温で2時間インキュベートした。洗浄液でプレートを2〜3回洗浄した。ビオチンで標識されたヒツジ抗ヒトTARC抗体をサンプル希釈液で最終濃度0.5ng/mLに希釈し、100μL/ウェルでマイクロプレートに入れた。室温で2時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識（HRP）のストレプトアビジンをサンプル希釈液で体積比が1:200になるように希釈した後100μL/ウェルでマイクロプレートに入れ、室温で30分間インキュベートした後、洗浄液でプレートを2〜3回洗浄した。TMB基質（InnoReagentsから購入）を100μL/ウェル入れ、室温で15分間インキュベートした後、50μL/ウェルで停止液（1.0N HCl）を入れた。ELISAプレートリーダー（SpectraMax M5e、Molecular Deviceから購入）によってOD450nm値を読み取り、かつOD540nm値を背景として吸光度値を計算し、培養上清液におけるTARC濃度を算出した。一部の実験結果を図1および表3に示す。表3は、免疫原AがA549細胞を刺激して胸腺および活性化制御ケモカイン（TARC）を分泌させ、かつ免疫原Aが有する生物学的活性が商業化されたタンパク質の生物学的活性と基本的に一致することを示す。
TARC分泌試験におけるIL-13タンパク質の生物学的活性の検出
ここで、IL-13（Sino生物）は、商業化されたIL-13タンパク質を指し、Sino biologicalから購入、陽性対照とし、IL-13（バッチ1）は上記免疫原Aである。
ファージ技術によるリード抗体の獲得
1．免疫原Aのビオチン標識
Biotin-X-X-NHS（SIGMA-ALDRICHから購入）および実施例1で調製された精製された免疫原Aをモル比3:1の比率で混合し、室温で振とうしながら30分間反応させた後、最終濃度が50mMのNH4Clを入れて反応を停止させ、ビオチンで標識された免疫原Aを得た。その後、ビオチンで標識された免疫原AをPBS緩衝液（pH7.4）に透析させ、Broadford試薬（Pierceから購入）を使用し、BSAを標準品として濃度を測定した（具体的な操作方法は、Bradford，1976，Anal Biochem 72:248-54を参照する）。実験結果は、表4に示す。標準品フィット曲線を使用し、ビオチンで標識された免疫原Aを測定したOD595nm値は0.49であった。計算したところ、ビオチンで標識された免疫原Aの濃度は0.319 mg/mLであった。

ビオチンで標識された免疫原Aの濃度の測定
ビオチンで標識された免疫原Aを0.22μm無菌ろ膜でろ過した後、無菌で分け、さらに-80℃で保存した。
2．ファージライブラリーによるIL-13抗体の選別
（1）ストレプトアビジンで免疫管を処理した。ストレプトアビジン（SIGMA-ALDRICHから購入）をPBS緩衝液で12.5μg/mLに希釈し、1mL/管で免疫管に入れ、4℃で一晩インキュベートした。一晩後、PBS緩衝液で3回洗浄し、処理された免疫管を得た。
（2）処理された免疫管に工程1．で得られたビオチンで標識された免疫原Aを入れ、室温で1時間振とうした後、PBS緩衝液で洗浄し、さらにブロッキング液[ブロッキング液は2％（w/v）脱脂粉乳を含有するPBS緩衝液]によって室温で2時間ブロッキングし、サンプル管を得た。同時に、処理された免疫管にファージScFv抗体ライブラリー（力価約1013pfu/ml、上海睿智化学研究有限公司から購入された。文献McCafferty Jら, Phage antibodies: flamentous phage displaying antibody variable domains, Nature, 1990, 348:552-54；Smith GP, Filamentous fusion phage : novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface, Science, 1985, 228: 1315 ‐ 1317；Scott J Kら, Searching for peptide ligands with an epitope library, Science, 1990, 249: 386.を参照して以下のように自分で調製してもよい。正常のヒト抗体の可変領域の遺伝子をファージミド（phagemid）ベクターにクローニングし、さらに補助ファージを利用し、大腸菌によってファージにパッケジングされる）を入れ、室温で1時間振とうした後、PBS緩衝液で洗浄し、さらにブロッキング液で室温で2時間ブロッキングし、ブロッキングされたファージScFv抗体ライブラリーを得た。そして、サンプル管におけるブロッキング液と等体積のブロッキング液のみを入れた対照管を設けた。サンプル管および対照管におけるブロッキング液を捨て、ブロッキングされたファージScFv抗体ライブラリーを入れ、室温で2時間振とうした。PBST[0.1％（v/v）Tween20を含有するPBS緩衝液]で5回洗浄し、PBS緩衝液で5回洗浄し、ビオチンで標識された免疫原Aと結合しなかったファージを除去し、さらに各サンプル管および各対照管にそれぞれ1mL 10μg/mLのトリプターゼを入れ、37℃で30分間インキュベートし、ビオチンで標識された免疫原Aと結合したファージを溶離させ、トリプターゼ溶離液を得た。
（3）1mLのトリプターゼ溶離液を取って4mLの対数増殖期にある大腸菌TG1（LUCIGENから購入）に入れ、37℃で30分間インキュベートした後、勾配希釈してプレートを塗布し、プレートを37℃で一晩培養し、ビオチンで標識された免疫原Aと結合したクローン数および対照管のクローン数を計算し、かつそれぞれ20〜30個のクローンを選んで配列決定を行い、免疫原Aと結合したファージクローンを得た。
（4）上記免疫原Aと結合したファージクローンを新鮮な2YT培地（ここで、新鮮な2YT培地の調製方法は、10gの酵母抽出物、16gのトリプトンおよび5gのNaClを1Lの水に入れ、さらにNaOHでpHを7.0に調節し、高圧で滅菌する）で洗浄し、収集し、かつ37℃で対数期まで振とう培養した。補助ファージM13KO7（NEBから購入、カタログ番号N0315S）を入れ、37℃で30分間静置した後、37℃で30分間振とう培養し、4000rpmで10分間遠心した後、細菌沈殿を収集した。細菌沈殿を新鮮な培地で再懸濁させ、30℃で4時間振とう培養し、4000rpmで30分間遠心して沈殿を捨て、ファージを含有する上清を収集した。上清に体積が上清の1/4の5×PEGを含有するNaCl溶液（2.5M NaCl）を入れ、氷の上に一晩置き、処理された上清Aを得た。次の日に、処理された上清Aを4000rpmで10分間遠心し、残った細胞、砕片などの不純物を除去し、処理されたファージAを得、ファージAを収集して2回目の選択に使用した。
以上の工程（3）〜（4）を3〜4回繰り返し、3回目または4回目で選択されたプレートから免疫原Aと結合するファージクローンを選び、新鮮な培地で対数生長期まで培養した。ELISAによって処理された上清Aにおける免疫原Aと結合するファージクローンを選別し、かつファージクローンに対して配列決定を行った。強い結合能力（OD450nm＞1.0）を有して唯一の一本鎖抗体配列を含むファージクローンを受容体配位子遮断試験によってさらに選択した。すなわち、強い結合能力（OD450nm＞1.0）を有し、受容体配位子結合遮断実験でヒトIL-13とhIL-13Ra/hIL-4Rヘテロ二量体および/またはヒトIL-13とhIL-13Ra2受容体の結合に対する遮断率が60％に達するファージクローンを陽性として選択し、さらにアミノ酸配列の測定を行った。アミノ酸配列が唯一の陽性クローンを選択し、先に測定されたヌクレオチド配列および相応するアミノ酸配列を参照し、全ヒト由来抗体を調製した（具体的な操作工程および結果は、実施例5、6および7を参照する）。ここで、受容体配位子結合遮断実験の一部の結果を表5に示す。表5において、1:5などの比率の意味は、サンプルの希釈度で、たとえば、1:5とは、被験のサンプル（すなわち、免疫原Aと結合するファージクローンを含有する上清A）を元体積の5倍の体積に希釈することを指す。表5の結果は、クローン番号がP4_4H12のリード抗体が、IL-13と細胞表面受容体IL-13Ra1/IL-4Raヘテロ二量体の結合を遮断することができるが、IL-13と細胞表面受容体IL-13Ra2の結合を遮断することができず、独特な特性を有することを示す。
FACSによるファージクローンのIL-13と細胞表面受容体IL-13Ra1/IL-4Raヘテロ二量体の結合およびIL-13と細胞表面受容体IL-13Ra2の結合に対する遮断の検出
ハイブリドーマ技術によるリード抗体の獲得
1．マウスの免疫
免疫原Aで免疫させた。使用されたのは6〜8週齢のBalb/c、SJL/Jマウスである（上海SLACによって提供される）。マウスを受け取った後、特定病原体除去（Specific pathogen Free、SPF）条件において飼育した。初回の免疫の投与量は、各マウスに50μg/匹の免疫原Aであった。フロインドアジュバント用いたタンパク質を乳化した後、尾部皮下で0.25mL注射した。初回の免疫から2週間後、強化免疫を行った。フロインドアジュバントを用いた免疫原A（各マウスに25μg/匹）を乳化した後、腹腔に0.25mL注射した。その後の毎回の強化免疫は3週間おきに行われた。毎回の強化免疫の1週間後血清サンプルを採集し、ELISAによって血清における抗体価を検出して受容体配位子結合遮断実験によって血清における抗体の活性を検出した。血清の力価が高くて好適に免疫原Aと受容体の結合を遮断できるマウスを優先的に細胞融合およびハイブリドーマ細胞の調製に使用し、残りのマウスを続いて強化免疫に使用した。一部の実験結果を図2および表6に示す。表6は、免疫原Aで免疫されたマウスの血清がいずれも免疫原Aに対して異なる程度の結合があり、抗原抗体反応を現したことを示した。ここで、血清の最高希釈度（すなわち希釈倍数）は十万程度である。表6において、ブランク対照は、1％（w/w）BSAを、バッチTB2は、2回目の強化免疫から7日目のマウス血清を表し、表におけるデータは、OD450nm値である。
ELISAによる免疫原Aによる免疫後のマウス血清の抗体価の検出
遺伝子で免疫させた。実施例1で構築された組み換えヒトIL-13タンパク質を発現するPCP発現ベクターを1.0μm金コロイド弾にコーティングさせ、Heliosジーンガン（Bio-rad）で免疫させた。金コロイド弾の調製および免疫手順は、Heliosジーンガンの説明書に従って行われた。6〜8週齢の雌SJL/Jマウス（上海SLACによって提供される）を受け取った後、SPF条件において飼育した。すべてのマウスは腹部からジーンガンで3〜4回免疫させ、毎回3〜4ショットで、毎ショットは、1.0μgのプラスミドである。初回の免疫と1回目の強化免疫の間は、2週間の間隔で、その後の毎回の強化免疫は、3週間おきに行われた。毎回の強化免疫の7日後、血清サンプルを採集し、ELISAによって血清における抗体価を検出して受容体配位子結合遮断実験によって血清における抗体の活性を検出した。血清の力価が高くて好適に組み換えヒトIL-13タンパク質と受容体の結合を遮断できるマウスを優先的に細胞融合およびハイブリドーマ細胞の調製に使用し、残りのマウスを続いて強化免疫に使用した。
2．ハイブリドーマ細胞の調製とリード抗体の選別
通常、免疫原Aで免疫されたマウスの多くは、2〜3回の免疫後力価が1：1000以上に達し、すなわち、リンパ球を収集して細胞融合およびハイブリドーマの調製に使用することができる。
細胞融合前、最後の免疫でマウスに50〜100μg/匹の免疫原Aを腹腔内に注射した。3〜5日後、マウスを殺処分し、脾臓細胞を収集した。NH4OHを最終濃度が1％（w/w）になるように入れて脾臓細胞の懸濁液における赤血球を分解させ、DMEM基礎培地で遠心して細胞を2〜3回洗浄した後、細胞数5:1の比率でマウス骨髓腫細胞SP2/0と混合し（ATCCから購入）、従来のPEG細胞融合方法または高効率電気融合方法によって細胞融合を行い（METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL. 220を参照する）、融合した細胞はハイブリドーマ細胞であった。
融合した細胞を20％（w/w）牛胎児血清、1×HATを含有するDMEM選択性培地に希釈し、1×105/20μL/ウェルで96ウェルの細胞培養プレートに入れ、5％（v/v）CO2、37℃インキュベーターに置いた。10〜14日後ELISAによって細胞融合プレートの上清を選別し、ELISAにおけるOD450nm＞1.0の陽性クローンを24ウェルプレートで増幅培養し、2〜3日後24ウェルプレートの上清を再検出したが、ELISAによる上清における抗体の免疫原Aに対する結合活性の検出、フローサイトメトリー技術による上清における抗体のヒトIL-13と受容体の結合活性に対する遮断の検出およびA549胸腺および活性化制御ケモカイン（TARC）分泌試験による上清おける抗体の免疫原Aの生物学的活性に対する中和の検出を含む。ELISA実験でOD450nm＞1.0で、受容体配位子結合遮断実験でハイブリドーマ細胞培養上清のヒトIL-13とhIL-13Ra/hIL-4Rヘテロ二量体および/またはヒトIL-13とhIL-13Ra2受容体の結合に対する遮断率が60％に達し、かつ/またはA549胸腺および活性化制御ケモカイン（TARC）分泌試験でハイブリドーマ上清のヒトIL-13によって誘導されたTARC分泌に対する中和の抑制率が60％に達したハイブリドーマ細胞を条件に合致する陽性クローンとして選択した。
24ウェルプレートのサンプルの選別結果によって、条件に合致する陽性クローンを有限希釈法によって96ウェルプレートでサブクローニングを行い、すなわち10％（w/w）FBS含有DMEM培地（invitrogenから購入）で37℃、5％（v/v）CO2の条件において上記陽性クローンを培養した。サブクローニングから7〜10日後、ELISAによって初期選別を行い、3〜4個の単一陽性クローンを選んで24ウェルプレートで培養を続けた。2〜3日後、上清に対してサブクローンの間の検出方法によって再検出したが、ELISA、受容体配位子結合遮断実験、胸腺および活性化制御ケモカイン（TARC）分泌試験を含む。24ウェルプレートのサンプルの検出結果によって、最適なサブクローンを選んで増幅培養、液体窒素による冷凍保存、抗体の生産と精製を行い、リード抗体とした。これらのリード抗体のクローン番号は、それぞれ29D9H8、28A2E11、35E2C3、70F10A10および35H6E1である。
マウスハイブリドーマ細胞のモノクローナル抗体の生産と精製
実施例3で調製されたハイブリドーマ細胞をT-75細胞培養瓶で増幅して生産培地（Hybridoma serum free medium、Invitrogenから購入）で2〜3代馴化継代した。ハイブリドーマ細胞の生長状態が良くなったら、細胞を培養回転瓶に接種した。各2Lの培養回転瓶に200〜500mLの生産培地を入れ、接種細胞密度は、0.5〜1.0×105個/mLである。蓋をしっかりし、回転瓶を37℃インキュベーターにおける回転装置に置き、回転数を3回/分とした。連続して10〜14日間回転培養した後、細胞培養液を収集し、遠心またはろ過で細胞を除去し、0.22〜0.45μmのろ膜でろ過した。処理された細胞培養上清をすぐに精製したか、あるいは-30℃で冷凍保存した。
ハイブリドーマ細胞培養上清におけるモノクローナル抗体は、プロテインG親和クロマトグラフィー（Protein G、プロテインGカラム）カラムによって精製した。サンプル量の大きさによって、相応する体積のクロマトグラフィーカラムを用意した。200〜300mLの小体積精製に対し、1〜2mLのプロテインGカラムが必要である。プロテインGカラムはまず平衡緩衝液（PBS緩衝液、pH7.4）で平衡化した後、培養上清をプロテインGカラムに仕込み、流速を3〜4mL/分に制御した。仕込み終了後、平衡緩衝液でクロマトグラフィーカラムを3〜5倍ベッド体積で洗浄した。溶離液（0.1Mグリシン-塩酸緩衝液、pH2.5）でカラムに結合した抗体を溶離させ、紫外検出器によって溶離状況をモニタリングした。溶離した抗体（A280紫外吸收ピーク）を収集し、10％（v/v）の1.0M Tris-HCl緩衝液を入れてpHを中和した後、すぐPBS緩衝液で一晩透析し、2日目に液置換を1回行い、かつ続いて2〜3時間透析した。透析された抗体を収集し、0.22μmのフィルターによって無菌ろ過を行い、IL-13モノクローナル抗体を得、それを無菌で保存した。サンプルを小分けしてタンパク質の濃度、純度、内毒素などを検出・分析した。検出したところ、IL-13モノクローナル抗体の内毒素濃度は3.0EU/mg未満であった。これらの一部の検出分析結果は表7に示す。
抗体検出分析
リード抗体の同定
実施例2および実施例3でそれぞれファージ技術およびハイブリドーマ技術によって得られたリード抗体に対してそれぞれ以下のような同定試験を行った。
A．酵素結合免疫吸着実験（ELISA）によるリード抗体と免疫原A、IL-13R130Qバリアント、サルIL-13およびマウスIL-13の結合の検出
ストレプトアビジンをPBSで最終濃度が1.0μg/mLになるように希釈した後、100μL/ウェルで96ウェルマイクロプレートに入れた。4℃で一晩インキュベートした。2日目にプレートを洗浄液[0.05％（w/w）Tween20含有PBS緩衝液]で2回洗浄し、ブロッキング液[0.05％（w/w）Tween20および2％（w/w）BSAを含有するPBS緩衝液]を入れて37℃で1〜2時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨て、実施例2で調製されたビオチンで標識された免疫原A、IL-13R130Qバリアント（実施例1で調製された）、サルIL-13（sino biologicalから購入）およびマウスIL-13（sino biologicalから購入）をそれぞれサンプル希釈液[0.05％（w/w）Tween20および0.2％（w/w）BSAを含有するPBS緩衝液]で0.5μg/mLに希釈し、50〜100μL/ウェルでマイクロプレートに入れ、37℃で1時間インキュベートした。洗浄液[0.01％（w/w）Tween20含有PBS緩衝液]でプレートを2〜3回洗浄した。それぞれ勾配希釈された実施例2および実施例3で調製されたリード抗体を50〜100μL/ウェルで入れ、37℃で1時間インキュベートした後、洗浄液でプレートを2〜3回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識（HRP）のヒトまたはマウスIgG二次抗体（Sigmaから購入）を入れ、37℃で1時間インキュベートした後、さらに、洗浄液[0.05％（w/w）Tween20含有PBS緩衝液]でプレートを2〜3回洗浄した。TMB基質を100μL/ウェルで入れ、室温で15分間インキュベートした後、50μL/ウェルで1.0N HClを入れて停止させた。ELISAプレートリーダー（SpectraMax M5e、Molecular Deviceから購入）によってOD450nm値を読み取った。一部の実験結果を図3、5〜6および表8〜10に示した。表8〜10は、リード抗体が組み換えヒトIL-13タンパク質、組み換えヒトIL-13 R130Qバリアント、組み換えサルIL-13とELISAレベルで結合することを示した。しかし、マウスIL-13が結合しなかった。ここで、IgG対照はマウスIgGで、表中のデータはOD450nm値である。
ELISAによるリード抗体の免疫原Aとの反応活性の検出
ELISAによるリード抗体のサルIL-13バリアントとの反応活性の検出
ELISAによるリード抗体のマウスIL-13バリアントとの反応活性の検出
B．受容体配位子結合の遮断実験
1．安定的な発現細胞株の構築：
ヒトIL-13Ra1、ヒトIL-13Ra2およびヒトIL-4Raの全長遺伝子のヌクレオチド配列（配列表の配列番号63〜65で示される）をそれぞれpIRES発現ベクターにクローニングし、かつレンチウイルスにパッケージングした（pIRES発現ベクターおよびレンチウイルスはいずれも上海GenePharma社から購入され、かつ説明書に従って操作された）。同時にヒトIL-13Ra1およびヒトIL-4Ra遺伝子を含むレンチウイルスでHEK293細胞に感染させ、感染後細胞を100μg/mLのハイグロマイシンB（MILLIPOREから購入）と0.25μg/mLのピューロマイシン（Invitrogenから購入）の一方または両方および10％（w/w）牛胎児血清を含有するDMEM培地で、37℃、5％（v/v）CO2において2週間選択培養した。2週間後有限希釈法によって感染後の細胞を96ウェル培養プレートにサブクローニングした。クローンが大きく生長した後、単一のクローンウェルの細胞を6ウェルプレートまたは培養瓶で増幅し、全長ヒトIL-13Ra1を過剰発現するHEK293細胞株およびヒトIL-4Raを過剰発現するHEK293細胞株を得た。増幅されたクローンは、各受容体に相応する特異的抗体（hIL-13Ra1抗体、hIL-4Ra抗体、hIL-13Ra2抗体は、いずれもRnD systemsから購入）でフローサイトメトリー分析法によって受容体の発現レベル、および配位子であるIL-13タンパク質との結合能力を検出した。生長が良く、発現レベルが高く、結合が強い単一クローンの細胞系を選んで続いて増幅培養して液体窒素で冷凍保存した。IL-13Ra2遺伝子を含むレンチウイルス顆粒でHEK293細胞に感染させ、同様の方法によって生長が良く、発現レベルが高く、結合が強い単一クローンの細胞系を選別して続いて増幅培養して液体窒素で冷凍保存し、全長ヒトIL-13Ra2を過剰発現するHEK293細胞株を得た。一部の実験結果を図7〜9および表11〜13に示した。表11〜13の結果は、HEK293細胞クローン4C1が表面に同時にhIL-13Ra1とhIL-4Raの2つの受容体を発現し、HEK293細胞クローン1A1はhIL-13Ra2受容体を発現し、かつ細胞表面の受容体の発現量がいずれも高く、後の試験に使用することができることを示した。
フローサイトメトリー分析方法による全長ヒトIL-13Ra1を過剰発現するHEK293細胞株におけるhIL-13Ra1タンパク質の発現レベルの検出
フローサイトメトリー分析方法による全長ヒトIL-4Raを過剰発現するHEK293細胞株におけるhIL-4Raタンパク質の発現レベルの検出
フローサイトメトリー分析方法による全長ヒトIL-13Ra2を過剰発現するHEK293細胞株におけるhIL-13Ra2タンパク質の発現レベルの検出
2．フローサイトメトリー技術による受容体配位子の結合遮断実験
実施例5の実験Bにおける工程1．で得られた全長ヒトIL-13Ra1とヒトIL-4Raを過剰発現するHEK293細胞株クローン4C1および全長ヒトIL-13Ra2を過剰発現する的HEK293細胞株クローン1A1を、T-175細胞培養瓶で75〜90％コンフルエンスまで増幅培養したら、培地を捨てた。ここで、増幅培養の培地は、100μg/mLのハイグロマイシンB（MILLIPOREから購入）と0.25μg/mLのピューロマイシン（Invitrogenから購入）の一方または両方および10％（w/w）牛胎児血清を含有するDMEM培地であった。増幅培養の条件は37℃、5％（v/v）CO2において培養した。PBS緩衝液で1〜2回洗浄した後、組み換え酵素細胞分解液（TrypLE、Life technologyから購入）で消化して細胞を収集し、PBS緩衝液で細胞を1〜2回洗浄し、細胞を計数した後細胞をブロッキング液[2％（w/w）牛胎児血清含有PBS緩衝液]を1〜2×106個細胞/mLに希釈し、氷の上で20〜30分間インキュベートした後、ブロッキング液[2％（w/w）牛胎児血清含有PBS緩衝液]で2回洗浄した。収集された細胞をブロッキング液で1×106個細胞/mLに懸濁させ、100μL/ウェルで96ウェルFACS反応プレートに入れた（すなわち、1×105個細胞/ウェル）。
勾配希釈された実施例2および実施例3で調製されたリード抗体（以下、「リード抗体」と総称する）を実施例2で調製されたビオチンで標識された免疫原Aと混合した後、100μL/ウェルで細胞に入れ、氷の上で1〜2時間インキュベートした。ここで、実施例5の実験Bにおける工程1．で得られた全長ヒトIL-13Ra1とヒトIL-4Raを過剰発現するHEK293細胞株では、勾配希釈されたリード抗体および最終濃度が30ng/mLのビオチンで標識された免疫原Aを入れ、全長ヒトIL-13Ra2を過剰発現する的HEK293細胞株では、勾配希釈されたリード抗体および最終濃度が20ng/mLのビオチンで標識された免疫原Aを入れた。ブロッキング液で遠心して2回洗浄し、100μL/ウェルの蛍光（Alexa 488）で標識されたストレプトアビジン（Life technologyから購入、カタログ番号S11223）を入れ、氷の上で0.5〜1.0時間インキュベートした。ブロッキング液で遠心して2〜3回洗浄し、100μL/ウェルのPBS緩衝液を入れて細胞を懸濁させ、FACS（FACS Verse、BDから購入）によって結果を検出および分析した。一部の実験結果は図10〜11および表14〜15に示し、表14〜15は、IL-13抗体がヒトIL-13と結合した後、ヒトIL-13と細胞表面の受容体であるヒトIL-13Ra1/hIL-4Raヘテロ二量体の結合、あるいはIL-13と細胞表面のヒトIL-13Ra2受容体の結合を遮断することができることを示した。ここで、IgG対照はマウスIgGで、表におけるデータは平均蛍光強度である。
FACSによるリード抗体のIL-13と細胞表面受容体IL-13Ra1/IL-4Raヘテロ二量体の結合に対する遮断の検出
FACSによるリード抗体のIL-13と細胞表面受容体IL-13Ra2の結合に対する遮断の検出
C．胸腺および活性化制御ケモカイン（TARC）の分泌試験
A549細胞（ATCCから購入）を10％（w/w）牛胎児血清含有F-12k培地（Gibcoから購入）で37℃、5％（v/v）CO2において培養し、T-175細胞が培養瓶で75〜90％コンフルエンスまで増幅培養したら、培地を捨て、PBS緩衝液で1〜2回洗浄した後、トリプターゼ溶液（Trypsin-EDTA、Life technologyから購入）で消化して細胞を収集した。収集された細胞を培地に再懸濁させ、計数後細胞を2×106個細胞/mLに希釈し、細胞を100μL/ウェルで96ウェル細胞培養プレート（2×105個細胞/ウェル）に入れ、培養プレートを37℃、5％（v/v）CO2インキュベーターで一晩培養した。2日目に、勾配希釈された実施例2および実施例3で調製されたリード抗体を実施例1で調製された免疫原Aと混合して混合物Aを得た。組み換えヒトTNFα（Peprotechから購入）を10％（w/w）牛胎児血清含有F-12k培地で、等体積で混合して培地において混合物Bを得た。ここで、混合後の組み換えヒトTNFαの混合物Bにおける最終濃度は、200ng/mLであった。一晩培養した細胞培養プレートの培養上清を捨てた後、当該細胞培養プレートに1:1の体積比で上記混合物Aおよび混合物Bを入れた。ここで、混合物Aと混合物Bの全体積における免疫原Aの最終濃度は、5ng/mLで、混合物Aと混合物Bの全体積における組み換えヒトTNFαの最終濃度は200ng/mLであった。細胞培養プレートを37℃、5％（v/v）CO2インキュベーターで一晩培養した。20時間後、プレートにおける培養上清液を吸い出し、遠心で細胞を除去し、TARC ELISAキット（RnD systemsから購入）によって培養上清液におけるTARCの濃度を検出した。実験の操作は、キット説明書の要求に従って行われた（詳細は実施例1を参照する）。一部の実験結果を図12および表16に示す。表16は、リード抗体がヒトIL-13との結合によって、IL-13とTNFαの協同刺激条件で誘導される549細胞のTARC分泌を中和することができることを示した。表16のデータは、培養上清におけるTARCの濃度（pg/mL）で、ここで、IgG対照はマウスIgGである。
リード抗体のIL-13によって誘導される胸腺および活性化制御ケモカインの分泌に対する中和
軽・重鎖可変領域のアミノ酸配列の測定
全RNA分離：実施例3で調製されたリード抗体が相応するハイブリドーマ細胞を蘇生させ、培養し、遠心で1〜5×107個細胞を収集し、1mLのTrizolを入れて均一に混合して1.5mL遠心管に移し、室温で5分間静置した。0.2mLのクロロホルムを入れ、15秒振とうし、2分間静置した後、4℃で12000gで5分間遠心し、上清を取って新しい1.5mL遠心管に移した。0.5mLのイソプロパノールを入れ、管における液体を軽く均一に混合し、室温で10分間静置した後、4℃で12000gで15分間遠心し、上清を捨てた。1mLの75％（v/v）エタノールを入れ、軽く沈殿を洗浄し、4℃で12000gで5分間遠心した後、上清を捨て、沈殿物を自然乾燥し、DEPCで処理されたH2Oを入れて溶解させ（55℃水浴で溶解を10分間促進した）、全RNAを得た。
逆転写とPCR：1μgの全RNAを取り、20μL系を調製し、逆転写酵素を入れた後42℃で60分間反応させ、7℃で10分間反応させて反応を停止させた。1μLのcDNA、各プライマー25pmol、1μLのDNAポリメラーゼおよび相応する緩衝系、250μmolのdNTPsを含む50μLのPCR系を調製した。予備変性95℃を3分間、変性95℃を30秒間、アニーリング55℃を30秒、伸長72℃を35秒で、35サイクル後、余分に72℃で5分伸長するように、PCRプログラムを設定し、PCR産物を得た。ここで、逆転写に使用されたキットは、PrimeScript RT Master Mixで、Takaraから購入され、カタログ番号は、RR036で、PCRに使用されたキットは、Q5ハイフィデリティーポリメラーゼで、NEBから購入され、カタログ番号は、M0492であった。
クローニングと配列決定：5μLのPCR産物を取ってアガロースゲル電気泳動によって検出し、陽性と検出されたサンプルをカラム回収キットによって精製し、ここで、回収キットは、NucleoSpin（R）Gel & PCR Clean-upで、MACHEREY-NAGELから購入され、カタログ番号は、740609であった。連結反応：サンプル50ng、Tベクター50ng、リガーゼ0.5μL、緩衝液1μL、反応系10μLを16℃で半時間反応させて連結産物を得、ここで、連結のキットはT4 DNAリガーゼで、NEBから購入され、カタログ番号はM0402であった。5μLの連結産物を100μLの感受性細胞（Ecos 101competent cells、Yeasternから購入、カタログ番号FYE607）に入れ、氷浴で5分間置いた。その後、42℃で水浴で1分間ヒートショックheatshockさせ、氷の上に1分間置いた後650μLの抗生物質のないSOC培地を入れ、37℃でチェーカーshakerで200RPMの速度で30分間蘇生させ、200μLを取って抗生物質を含有するLB固体培地に塗布して37℃のインキュベーターで一晩培養した。次の日に、Tベクターを使用してプライマーM13FとM13Rで30μLのPCR系を調製し、集落のPCRを行い、ピペットチップの先端で集落を取ってPCR反応系に吹き込み、かつ0.5μLを取ってもう一つの100nMアンピシリンを含有するLB固体培養シャーレに接種して菌株を保存した。PCR反応終了後、5μLを取ってアガロースゲル電気泳動によって検出し、陽性のサンプルを配列決定した。ここで、配列決定の工程は、Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest，National Institutes of Health, Bethesda, Md.（1991）を参照する。
配列決定の結果は、表17〜18に示す。表17〜18は、さらに実施例2で得られたクローン番号がP4_4H12のIL-13抗体の配列決定の結果を含む。
IL-13抗体のアミノ酸配列の番号
ここで、表17における数字は配列表の「配列番号」で、たとえばP4_4H12の重鎖タンパク質の可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号1で、P4_4H12の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインのアミノ酸配列は、配列表の配列番号2である。
IL-13抗体のヌクレオチド配列の番号
ここで、表18における数字は、配列表の「配列番号」で、たとえばP4_4H12の重鎖タンパク質の可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号49で、P4_4H12の軽鎖タンパク質の可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号50である。
P4_4H12の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号49における91番目〜105番目で、
P4_4H12の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号49における148番目〜198番目で、
P4_4H12の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号49における295番目〜348番目で、
P4_4H12の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号50における70番目〜105番目で、
P4_4H12の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号50における151番目〜171番目で、
P4_4H12の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号50における268番目〜294番目で、
29D9H8の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号51における91番目〜105番目で、
29D9H8の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号51における148番目〜198番目で、
29D9H8の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号51における295番目〜327番目で、
29D9H8の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号52における70番目〜102番目で、
29D9H8の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号52における148番目〜168番目で、
29D9H8の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号52における265番目〜291番目で、
28A2E11の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号53における91番目〜105番目で、
28A2E11の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号53における148番目〜198番目で、
28A2E11の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号53における295番目〜321番目で、
28A2E11の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号54における67番目〜108番目で、
28A2E11の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号54における154番目〜174番目で、
28A2E11の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号54における271番目〜297番目で、
35E2C3の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号55における91番目〜105番目で、
35E2C3の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号55における148番目〜195番目で、
35E2C3の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号55における292番目〜321番目で、
35E2C3の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号56における70番目〜102番目で、
35E2C3の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号56における148番目〜168番目で、
35E2C3の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号56における265番目〜291番目で、
70F10A10の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号57における91番目〜105番目で、
70F10A10の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号57における148番目〜198番目で、
70F10A10の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号57における295番目〜330番目で、
70F10A10の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号58における70番目〜120番目で、
70F10A10の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号58における166番目〜186番目で、
70F10A10の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号58における283番目〜309番目で、
35H6E1の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号59における91番目〜111番目で、
35H6E1の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号59における154番目〜201番目で、
35H6E1の重鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号59における298番目〜336番目で、
35H6E1の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR1ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号60における70番目〜102番目で、
35H6E1の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR2ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号60における148番目〜168番目で、
35H6E1の軽鎖タンパク質の可変領域におけるCDR3ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号60における265番目〜291番目である。
マウス-ヒトキメラIL-13抗体または全ヒト由来IL-13抗体の調製
実施例2は、ファージライブラリーから陽性クローンを得、実施例3は、ハイブリドーマ細胞の培養上清液から精製されたIL-13抗体（リード抗体）を得た。ここで、本実施例に記載の工程に従って操作し、実施例3で得られたリード抗体からマウス-ヒトキメラIL-13抗体を調製し、実施例2で得られた陽性クローンから全ヒト由来IL-13抗体を調製することができる。
1．プラスミドの構築と用意：
実施例6の配列決定の結果から、IL-13抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列が明らかになった。実施例2および実施例3で得られたリード抗体の重鎖可変領域をシグナルペプチドおよびヒト由来重鎖抗体IgG1定常領域を含む発現ベクター（ここで、発現ベクターは、Invitrogenから購入され、組み換え工程も上海睿智化学によって完成された）に組み込み、IL-13抗体の軽鎖可変領域をシグナルペプチドおよびヒト由来軽鎖kappa定常領域を含む発現ベクター（ここで、発現ベクターは、Invitrogenから購入され、組み換え工程も上海睿智化学によって完成された）に組み込み、組み換えプラスミド（上記プラスミド組み換えの実験原理および工程は「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル（第三版）」、（米）J.Sambrookら著）を得て配列決定によって検証した（配列決定方法は実施例6における配列決定方法と同様である）。アルカリ溶解法キット（MACHEREY-NAGELから購入）によって高純度の組み換えプラスミドを中スケールで抽出し、質量が500μg以上で、0.22μmろ膜（Milloporeから購入）でろ過し、形質移入に備えた。
2．細胞形質移入：
培地Freestyle 293 expression medium（Invitrogenから購入）で293E細胞（Invitrogenから購入）を培養した。シェーカーは、37℃、130RPMおよび8％ CO2（v/v）とした。Freestyle 293 expression mediumは、形質移入時10％（v/v）F68（Invitrogen）を最終濃度が0.1％（v/v）になるように入れ、0.1％（v/v）F68含有Freestyle 293発現培地、すなわち、培地Aを得た。5mLの培地Aを取って200μg/mLのPEI（Sigmaから購入）と均一に混合し、培地Bを得た。5mLの培地Aを取って100μg/mLの工程（1）で得られた組換えプラスミド（すなわち、重鎖組み換えプラスミドと軽鎖組み換えプラスミドが通常のように等比率で混合した混合組み換えプラスミド）と均一に混合し、培地Cを得た。5分間後、培地Bと培地Cを合併して混合し、15分間静置し、混合液Dを得た。10mLの混合液Dをゆっくり100mLの293E細胞を含有する培地Freestyle 293 expression mediumに、293Eの細胞密度が1.5×106個/mLになるように入れ、PEIが集中しすぎないように添加しながら振とうし、シェーカーに入れて培養した。翌日に、最終濃度が0.5％（w/v）になるようにペプトンを入れた。5〜7日目に、培養液の抗体価を検出した。6〜7日目に、遠心（3500RPM、30分）で上清を収集し、0.22μmろ膜でろ過し、ろ過された細胞上清液を得て精製に提供した。
3．抗体の精製：
連続して生産された内毒素のないクロマトグラフィーカラムおよびProtein Aフィラー（GEから購入）に対し、5倍カラム体積の0.5M NaOHで洗浄した。その後、5倍カラム体積のPBS（PBS緩衝液、pH7.4）で中性まで平衡化した後、工程（2）で得られたろ過された細胞上清液をカラムにかけ、必要によって通過液を収集した。カラムにかけた後、5倍カラム体積のPBSで洗浄した。5倍カラム体積の0.1M pH 3.0のグリシン-HClで溶離させ、溶離液を収集し、そしてすぐに溶離液に0.1倍体積のpH 8.5の1M Tris-HCl（1.5M NaCl）を入れてIL-13抗体を中和した。上記で使用された溶液は、いずれも新しく調製されたものである。IL-13抗体を得た後、内毒素の汚染を防ぐように、ヒト抗PD-13抗体を1×PBSで4時間透析した。透析終了の後、分光光度計またはキットによって濃度を測定し、HPLC-SECによって抗体の純度を測定し、内毒素検出キット（Lonzaから購入）によって抗体の内毒素含有量を検出した。そして得られたIL-13抗体に対して特性の同定を行った。P4_4H12、29D9H8、28A2E11、35E2C3、70F10A10および35H6E1リード抗体からそれぞれ全ヒト由来抗体hP4_4H12およびキメラ抗体c29D9H8、c28A2E11、c35E2C3、c70F10A10およびc35H6E1を得たが、クローン番号の前のアルファベットのh（human）は、全ヒト由来抗体を、c（chimera）は、マウス-ヒトキメラ抗体（以下キメラ抗体と略する）を表す。
キメラ抗体と全ヒト由来抗体の検証
実施例7で得られたマウス-ヒトキメラIL-13抗体または全ヒト由来IL-13抗体は、それぞれ以下のような検証試験を行った（操作工程は実施例5と同様）。
A．酵素結合免疫吸着実験（ELISA）によるリード抗体と免疫原A、IL-13R130QバリアントおよびサルIL-13の結合の検出
具体的な操作工程は、実施例5の試験Aと同様である。一部の実験結果を図3〜5および表19〜21に示す。表19〜21は、上記抗体が組み換えヒトIL-13タンパク質、組み換えヒトIL-13 R130Qバリアント、組み換えサルIL-13とELISAレベルで結合することを示した。ここで、IgG対照は、マウスIgGで、表中のデータは、OD450nm値である。
ELISAによるキメラ抗体の免疫原Aとの反応活性の検出
ELISAによる全ヒト由来抗体の免疫原Aとの反応活性の検出
ELISAによるキメラ抗体のIL-13R130Qバリアントとの反応活性の検出
ELISAによるキメラ抗体のサルIL-13バリアントとの反応活性の検出
B．受容体配位子結合の遮断実験
具体的な試験工程は、実施例5の試験Bの部分を参照する。一部の実験結果は、図10〜11および表22〜23に示し、表22〜23は、IL-13全ヒト由来抗体およびキメラ抗体がヒトIL-13と結合した後、ヒトIL-13と細胞表面の受容体であるヒトIL-13Ra1/hIL-4Raヘテロ二量体の結合、あるいはIL-13と細胞表面のヒトIL-13Ra2受容体の結合を遮断することができることを示した。ここで、IgG対照は、マウスIgGで、表におけるデータは、平均蛍光強度である。
FACSによるキメラ抗体のIL-13と細胞表面受容体IL-13Ra1/IL-4Raヘテロ二量体の結合に対する遮断の検出
FACSによる全ヒト由来抗体のIL-13と細胞表面受容体IL-13Ra1/IL-4Raヘテロ二量体の結合に対する遮断の検出
FACSによるキメラ抗体のIL-13と細胞表面受容体IL-13Ra2の結合に対する遮断の検出
FACSによる全ヒト由来抗体のIL-13と細胞表面受容体IL-13Ra2の結合に対する遮断の検出
C．胸腺および活性化制御ケモカイン（TARC）の分泌試験
具体的な操作工程は、実施例Cの試験の部分を参照する。一部の実験結果を図12および表24に示す。表24は、キメラ抗体および全ヒト由来抗体がヒトIL-13との結合によって、IL-13とTNFαの協同刺激条件で誘導される549細胞のTARC分泌を中和することができることを示した。表24のデータは培養上清におけるTARCの濃度（pg/mL）で、ここで、IgG対照はマウスIgGである。
キメラ抗体のIL-13によって誘導される胸腺および活性化制御ケモカインの分泌に対する中和
全ヒト由来抗体のIL-13によって誘導される胸腺および活性化制御ケモカインの分泌に対する中和
D．ペリオスチン（periostin）の分泌試験
MRC5細胞（ATCCから購入）を10％（w/w）牛胎児血清含有EMEM培地（Gibcoから購入）で37℃、5％（v/v）CO2の条件において培養した。T-175細胞が培養瓶で75〜90％コンフルエンスまで増幅培養したら、培地を捨て、PBS緩衝液で1〜2回洗浄した後、トリプターゼ溶液（Trypsin-EDTA、Life technologyから購入）で消化して細胞を収集した。計数後細胞を培養液で1×105個細胞/mLに希釈し、細胞を100μL/ウェルで96ウェル細胞培養プレート（1×104個細胞/ウェル）に入れ、培養プレートを37℃、5％（v/v）CO2インキュベーターで一晩培養した。2日目に、培養上清を捨て、勾配希釈された実施例7で調製されたキメラ抗体を実施例1で調製された免疫原Aと混合して混合物C（免疫原Aの混合物Cにおける最終濃度5ng/mL）を得、混合物Cを培養プレートに入れ、細胞培養プレートを37℃、5％（v/v）CO2インキュベーターで一晩培養した。20時間後、ペリオスチンELISAキット（RnD systemsから購入）によって上清におけるペリオスチンの濃度を検出した。実験の操作は、キット説明書の要求に従って行われた。一部の実験結果を図13および表25に示す。表25は、キメラ抗体がヒトIL-13に結合し、ヒトIL-13によって誘導されたMRC5細胞のペリオスチンの分泌を中和することができたことを示した。表25のデータは、培養上清におけるペリオスチンの濃度（pg/mL）で、IgG対照はマウスIgGである。
キメラ抗体のIL-13によって誘導されるペリオスチンの分泌に対する中和
E．血管細胞接着分子-1（VCAM-1）の発現実験
ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）（AllCellsから購入）をHUVEC完全培地で培養し、37℃、5％（v/v）CO2の条件において培養した。T-175細胞が75〜90％コンフルエンスまで増幅培養したら、培地を捨て、PBS緩衝液で1〜2回洗浄した後、トリプターゼ溶液（Trypsin-EDTA、Life technologyから購入）で消化して細胞を収集した。計数後、細胞を培養液で1.5×105個細胞/mLに希釈し、HUVEC細胞を3000個細胞（20μL）/ウェルで384ウェル細胞培養プレートに入れ、勾配希釈された実施例7で調製された抗体を実施例1で調製された免疫原Aおよび組み換えヒトTNFαと体積比1：1：2で混合して混合物Dを得た。混合物Dと培養プレートにおけるHUVEC細胞の体積比が1:1になるように、混合物Dを20μL/ウェルの添加量で培養プレートに添加して混合物D'を得た。ここで、混合物D'における組み換えヒトTNFαの最終濃度は25ng/mLで、混合物D'における免疫原Aの最終濃度は0.5ng/mLであった。
細胞培養プレートを37℃、5％（v/v）CO2インキュベーターで一晩培養した。20時間後、培養液の上清を捨て、マウス抗ヒトVCAM-1（CD106）抗体（Biolegendから購入）を培地で最終濃度が2μg/mLになるように希釈し、20μL/ウェルで培養プレートに入れ、氷の上で2時間インキュベートした。FACS緩衝液[2％（w/w）BSA含有PBS緩衝液]で3回洗浄し、20μL/ウェルの蛍光（Alexa 488）で標識されたロバ抗マウス二次抗体（invitrogenから購入）を入れ、氷の上で0.5〜1.0時間インキュベートした。さらに20μL/ウェルの固定液[4％（w/w）パラホルムアルデヒド]を入れ、5〜10分間後に、PBS緩衝液で3回洗浄した。PBS緩衝液でPI（invitrogenから購入）およびRNAseA（Qiagenから購入）をPIおよびRNAseAの最終濃度がそれぞれ9nMおよび200ng/mLになるように希釈し、20μL/ウェルで384ウェルのプレートに入れ、37℃で30分間インキュベートした後、Acumen（マイクロプレート細胞検出法）によって検出して細胞表面における血管細胞接着分子-1（VCAM-1）の発現レベルを分析した。一部の実験結果を図14および表26に示す。表26は、キメラ抗体がヒトIL-13に結合し、IL-13とTNFαの協同刺激条件で誘導されるHUVEC細胞の表面における血管細胞接着分子-1の発現を中和することができたことを示した。表26におけるデータは平均蛍光強度で、IgG対照は、マウスIgGで、TNFαは、単独でTNFαによって刺激し、IL-13のない場合の背景値である。
キメラ抗体のIL-13によって誘導される血管細胞接着分子-1の発現に対する中和
IL-13抗体がヒトIL-13によって誘導されるマウス呼吸炎症を抑制する実験
雌Balb/cマウス（8〜12週齢、上海霊暢生物科技有限公司から購入）を受け取った後、SPF級で飼育し、1週間慣れさせた後、実験を始めた。マウスは1日目および3日目に実施例7で調製されたキメラ抗体を腹腔内注射し、クローン番号はそれぞれc29D9H8、c28A2E11およびc35E2C3で、各動物に200μLずつ（3mg抗体/kg体重）であった。2日目および4日目に実施例1で調製された免疫原Aで刺激誘導を行い、投与量は、1mg/mLで、各動物に気道噴霧25μLを投与した。5日目にすべての動物をFinePointe全身体積記録システム（すなわちDSI Buxco（R） FinePointe WBPシステム、DSIから購入）によって肺機能を検出した。動物は覚醒・無拘束の状態において噴霧投与の形態でメチルアセチルコリンを投与し、同時に装置についたソフトによって気道収縮指数Penh（呼気間隔の強化）を記録した（検出の具体的な操作工程は装置のマニュアルに記載の方法に従って行われた）。
一部の実験結果を図15および表27に示す。表27は、マウスがヒトIL-13、または免疫原Aによる刺激で気道の高反応性が誘発され、メチルアセチルコリンの刺激により敏感にさせ、penhの読取値が大きくなったことを示した。キメラ抗体がヒトIL-13に結合し、ヒトIL-13によって誘導された気道の高反応性を中和することができた。表におけるデータは、気道収縮指数Penhで、気道の高反応性を表し、IgG対照はヒトIgGである。
ヒトIL-13によって誘導されるマウス呼吸炎症に対する抑制
抗体親和力の検出試験
アミノカップリングによって抗ヒトFc IgG（Genewayから購入）をCM5チップ（GEから購入）の表面に6000〜10000 RUになるようにカップリングさせて固定し、FC1を参照チャネルとした。カップリング固定の過程は、以下の通りである。新しく調製されたモル比1:1の50mM N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）および200mM 1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）の混合物でチップを7分間活性化した。その後、10〜50μg/mLの10mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）に希釈させた抗ヒトFc IgGを注入した。残った活性化部位を1Mエタノールアミンでブロッキングした。その後、HBS含有EP緩衝液で実施例7で調製されたキメラ抗体を5μg/mLに希釈した（捕捉レベルによって適当に調整することができる）。10μL/分の流速でチップに捕捉し、約100〜300RUの応答値を得た。そして、実施例1で調製された精製された免疫原Aを100nM（すなわち最高濃度を一旦100nMとした）に希釈し、30μL/分の流速でチップの表面を通らせた。十分なシグナル値を得たら、実施例1で調製された精製された免疫原Aをいくつかの濃度に勾配希釈し、それぞれチップの表面を通らせた。各サイクルの終了後、チップの表面を10mM、pH 1.5のグリシンで再生させた。反応速度定数はブランク対照を引き、global fit分析方法によって1：1結合モデルでデータのフィッティングを行った（Biacoreマニュアルを参照して行われた）。解離平衡速度定数（KD）は、KD=kd/kaという式で計算し、ここで、Kdは、解離定数で、Kaは結合定数である。一部の実験結果を図16および表28に示す。表28は、実施例7で調製されたキメラ抗体のヒトIL-13との親和力KDが＜9×10-8 Mであったことを示した。
キメラ抗体のヒトIL-13との親和力の検出結果
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるべきである。

Claims (21)

  1. 単離されたタンパク質であって、
    IL-13抗体の重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3のうちの一つまたは複数、ならびに/あるいは、
    IL-13抗体の軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3のうちの一つまたは複数を含み、
    前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表における配列番号2、配列番号10、配列番号18、配列番号26、配列番号34または配列番号42で示され、
    前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表における配列番号3、配列番号11、配列番号19、配列番号27、配列番号35または配列番号43で示され、
    前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表における配列番号4、配列番号12、配列番号20、配列番号28、配列番号36または配列番号44で示され、
    前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表における配列番号6、配列番号14、配列番号22、配列番号30、配列番号38または配列番号46で示され、
    前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表における配列番号7、配列番号15、配列番号23、配列番号31、配列番号39または配列番号47で示され、
    前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表における配列番号8、配列番号16、配列番号24、配列番号32、配列番号40または配列番号48で示されるか、
    あるいは、
    前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表における配列番号2、配列番号10、配列番号18、配列番号26、配列番号34または配列番号42で示されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、
    前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表における配列番号3、配列番号11、配列番号19、配列番号27、配列番号35または配列番号43で示されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、
    前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表における配列番号4、配列番号12、配列番号20、配列番号28、配列番号36または配列番号44で示されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、
    前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表における配列番号6、配列番号14、配列番号22、配列番号30、配列番号38または配列番号46で示されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、
    前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表における配列番号7、配列番号15、配列番号23、配列番号31、配列番号39または配列番号47で示されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、
    前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表における配列番号8、配列番号16、配列番号24、配列番号32、配列番号40または配列番号48で示されるアミノ酸配列と少なくとも80％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示される、
    ことを特徴とするタンパク質。
  2. 前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号2で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号3で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号4で示されるか、
    前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号10で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号11で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号12で示されるか、
    前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号18で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号19で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は配列表の配列番号20で示されるか、
    前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号26で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号27で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号28で示されるか、
    前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は配列表の配列番号34で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は配列表の配列番号35で示されかつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は配列表の配列番号36で示されるか、
    前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号42で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号43で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号44で示されるか、
    前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号6で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号7で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号8で示されるか、
    前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号14で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号15で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号16で示されるか、
    前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号22で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号23で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号24で示されるか、
    前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号30で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号31で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号32で示されるか、
    前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号38で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号39で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号40で示されるか、
    あるいは、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号46で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号47で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は配列表の配列番号48で示される、
    ことを特徴とする請求項1に記載のタンパク質。
  3. 前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号2で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号3で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号4で示され、かつ、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号6で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号7で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号8で示されるか、
    前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号10で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号11で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号12で示され、かつ、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号14で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号15で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号16で示されるか、
    前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号18で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号19で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号20で示され、かつ、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号22で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号23で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は配列表の配列番号24で示されるか、
    前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号26で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号27で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号28で示され、かつ、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号30で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号31で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号32で示されるか、
    前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号34で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号35で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号36で示され、かつ、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号38で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号39で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号40で示されるか、
    あるいは、前記重鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号42で示され、前記重鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号43で示され、かつ前記重鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号44で示され、かつ、前記軽鎖CDR1のアミノ酸配列は、配列表の配列番号46で示され、前記軽鎖CDR2のアミノ酸配列は、配列表の配列番号47で示され、かつ前記軽鎖CDR3のアミノ酸配列は、配列表の配列番号48で示される、
    ことを特徴とする請求項1に記載のタンパク質。
  4. IL-13抗体の重鎖可変領域および/またはIL-13抗体の軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号1、配列番号9、配列番号17、配列番号25、配列番号33または配列番号41で示され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号5、配列番号13、配列番号21、配列番号29、配列番号37または配列番号45で示される、ことを特徴とする単離されたタンパク質。
  5. 前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号1で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号5で示されるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号9で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号13で示されるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号17で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号21で示されるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号25で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号29で示されるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号33で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号37で示されるか、
    あるいは前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号41で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号45で示される、
    ことを特徴とする請求項4に記載のタンパク質。
  6. 前記タンパク質は、さらに抗体の重鎖定常領域および/または抗体の軽鎖定常領域を含むことを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載のタンパク質。
  7. 前記抗体の重鎖定常領域は、ヒト由来抗体またはマウス由来抗体の重鎖定常領域で、前記抗体の軽鎖定常領域は、ヒト由来抗体またはマウス由来抗体の軽鎖定常領域であることを特徴とする請求項6に記載のタンパク質。
  8. 前記抗体の重鎖定常領域は、ヒト由来抗体の重鎖定常領域で、前記抗体の軽鎖定常領域は、ヒト由来抗体の軽鎖定常領域であること、を特徴とする請求項7に記載のタンパク質。
  9. 前記タンパク質は、IL-13抗体のモノクローナル抗体、抗体の全長タンパク質、抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片、二重特異性抗体、多重特異性抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体または単一領域抗体であること、を特徴とする請求項1または4に記載のタンパク質。
  10. 請求項１〜8のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする、ことを特徴とする核酸。
  11. 前記重鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57または配列番号59で示され、
    かつ/あるいは、前記軽鎖可変領域の核酸をコードするヌクレオチドの配列は、配列表の配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58または配列番号60で示される、ことを特徴とする請求項10に記載の核酸。
  12. 前記重鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号49で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号50で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号51で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号52で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号53で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号54で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号55で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号56で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号57で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号58で示されるか、
    あるいは、前記重鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号59で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列表の配列番号60で示される、
    ことを特徴とする請求項11に記載の核酸。
  13. 請求項10〜12のいずれか一項に記載の核酸を含む組み換え発現ベクター。
  14. 請求項13に記載の組み換え発現ベクターを含む組み換え発現形質転換体。
  15. 請求項14に記載の組み換え発現形質転換体を培養し、培養物からIL-13抗体を得る工程を含むIL-13抗体の製造方法。
  16. 請求項1〜8のいずれかに記載のタンパク質を被験サンプルと体外で接触させ、請求項1〜8のいずれか一項に記載のタンパク質と前記被験サンプルの結合を検出する工程を含む、ことを特徴とするIL-13タンパク質を過剰発現する細胞を検出する方法。
  17. 請求項1〜8のいずれかに記載のタンパク質を活性成分として含む、ことを特徴とするIL-13タンパク質を過剰発現する細胞を検出する組成物。
  18. 活性成分として請求項1〜8のいずれか一項に記載のタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、ことを特徴とする薬物組成物。
  19. 前記の薬物組成物は、0.01〜99.99％の請求項1〜8のいずれか一項に記載のタンパク質および0.01〜99.99％の薬用担体を含み、前記百分率は、前記薬物組成物で占める質量百分率である、ことを特徴とする請求項18に記載の薬物組成物。
  20. 請求項1〜8のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項18または19に記載の薬物組成物の、IL-13発現または機能異常に関連する疾患を予防または治療する薬物の製造における使用。
  21. 前記IL-13発現または機能異常に関連する疾患は気管支喘息である、ことを特徴とする請求項20に記載の使用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109776677B (zh) * 2017-11-15 2023-11-03 尚华科创投资管理（江苏）有限公司 一种人源化抗il-13抗体及其制备方法和应用
CN112341543B (zh) * 2021-01-11 2021-04-23 广东赛尔生物科技有限公司 包含间充质干细胞外泌体的药物组合物在治疗疾病中的应用
CN112778419A (zh) * 2021-02-01 2021-05-11 重庆中元汇吉生物技术有限公司 抗ck-mb的抗体或其抗原结合部分及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007537702A (ja) * 2003-07-15 2007-12-27 ケンブリッジ アンティボディー テクノロジー リミテッド Ｉｌ−１３に対するヒト抗体分子
JP2008511542A (ja) * 2004-07-01 2008-04-17 グラクソ グループ リミテッド 免疫グロブリン
JP2008520684A (ja) * 2004-11-17 2008-06-19 アブジェニックス・インコーポレーテッド Ｉｌ−１３に対する完全ヒトモノクローナル抗体
JP2009512656A (ja) * 2005-10-21 2009-03-26 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト Ｉｌ１３に対するヒト抗体および治療的使用
WO2017189805A1 (en) * 2016-04-27 2017-11-02 Abbvie Inc. Methods of treatment of diseases in which il-13 activity is detrimental using anti-il-13 antibodies

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5866363A (en) 1985-08-28 1999-02-02 Pieczenik; George Method and means for sorting and identifying biological information
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
CN100455598C (zh) * 2006-11-29 2009-01-28 中国抗体制药有限公司 功能人源化抗人cd20抗体及其应用
CN104341501B (zh) * 2013-07-29 2019-08-30 上海睿智化学研究有限公司 抗IL-1β人源化单克隆抗体及其制备方法和应用
CN104592388B (zh) * 2015-03-02 2017-05-31 中国人民解放军总医院 一种抗人Tim‑3的单克隆抗体的抗原结合部分
JP2019527535A (ja) 2016-05-18 2019-10-03 上海開拓者生物医薬有限公司Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｐｈａｒｍａｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． Ｉｌ−１３抗体およびその製造方法と使用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007537702A (ja) * 2003-07-15 2007-12-27 ケンブリッジ アンティボディー テクノロジー リミテッド Ｉｌ−１３に対するヒト抗体分子
JP2008511542A (ja) * 2004-07-01 2008-04-17 グラクソ グループ リミテッド 免疫グロブリン
JP2008520684A (ja) * 2004-11-17 2008-06-19 アブジェニックス・インコーポレーテッド Ｉｌ−１３に対する完全ヒトモノクローナル抗体
JP2009512656A (ja) * 2005-10-21 2009-03-26 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト Ｉｌ１３に対するヒト抗体および治療的使用
WO2017189805A1 (en) * 2016-04-27 2017-11-02 Abbvie Inc. Methods of treatment of diseases in which il-13 activity is detrimental using anti-il-13 antibodies

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SCHEERENS H. ET AL., CLIN. EXP. ALLERGY, vol. 44, JPN6021017902, 20 December 2013 (2013-12-20), pages 38 - 46, ISSN: 0004630913 *

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