MXPA06000258A - Moleculas de anticuerpo humano para interleucina-13. - Google Patents

Abstract

Miembros especificos de union en particular moleculas de anticuerpo humano anti-IL-13 y especialmente aquellas que neutralizan la actividad de IL-13. Metodos para usar moleculas de anticuerpo anti-IL-13 en diagnosis o tratamiento de trastornos relacionados con IL-13, incluyendo asma, dermatitis atopica, rinitis alergica, fibrosis, enfermedad inflamatoria de intestino y linfoma de Hodgkin.

Description

MOLECULAS DE ANTICUERPO HUMANO PARA INTERLEUCINA-13 Campo de la Invención La presente invención se refiere a miembros específicos de unión, en particular moléculas de anticuerpo humano anti-IL-13, y especialmente aquellas que neutralizan la actividad de IL-13. Se refiere adicionalmente a métodos para usar moléculas de anticuerpo anti-IL-13 en la diagnosis o tratamiento de trastornos relacionados con IL-13, que incluyen asma, dermatitis atópica, rinitis alérgica, fibrosis, enfermedad inflamatoria del intestino y linfoma de Hodgki .

Antecedentes de la Invención Las modalidades preferidas de la presente invención emplean el dominio VH y/o VL de anticuerpo de la molécula de anticuerpo llamada en la presente BAK502G9 y otras moléculas de anticuerpo del linaje de BAK502G9 y del linaje BAK278D6, como se define en la presente. Las modalidades preferidas adicionales emplean regiones de determinación de complementariedad (CDR) del linaje de BAK278D6, y de manera preferente de BA 502G9, especialmente VH CDR3 , en otras regiones de estructura de anticuerpo. Los aspectos adicionales de la presente invención proporcionan composiciones que contienen miembros específicos de unión de REF:i69218 la invención, y su uso en métodos para inhibir o neutralizar IL-13, incluyendo métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia. La presente invención proporciona moléculas de anticuerpo de valor particular en la unión y neutralización de IL-13, y de esta manera de uso en cualquiera de una variedad de tratamientos terapéuticos, como se indica, por la experimentación contenida en la presente y adicionalmente por la literatura técnica de soporte . La interleucina (IL) -13 es una citocina de 114 aminoácidos con una masa molecular no definida de aproximadamente 12 kDa [1,2]. La IL-13 está más cercanamente relacionada a IL-4 con la cual comparte 30 % de similitud de secuencia a nivel de aminoácidos. El gen de IL-13 humana se localiza en el cromosoma 5q31 adyacente al gen de IL-4 [1] [2] . Esta región del cromosoma 5q contiene secuencias génicas para otras citocinas derivadas de linfocitos Th2 que incluyen GM-CSF e IL-5, cuyos niveles junto con IL-4 se ha mostrado que correlacionan con la severidad de la enfermedad en asmáticos y modelos en roedores de inflamación alérgica [3] [4] [5] [6] [7] [8] . Aunque identificada inicialmente como una citocina derivada de linfocitos Th2 CD4+, la IL-13 también se produce por células T l CD4+, células NK de linfocitos T CD8+, y poblaciones que no son de células T tal como células cebadas, basófilos, eosinófilos, macrófagos, monocitos y células del músculo liso de las vías aéreas. La IL-13 se reporta que media sus efectos a través de un sistema receptor que incluye la cadena a del receptor de IL-4 (IL-4Ra) , que puede unirse por sí mismo a IL-4 pero no a IL-13, y al menos otras dos proteínas de la superficie celular, IL-13 l e IL-13Ra2 [9] [10] . La IL-13Rocl puede unirse a IL-13 con baja afinidad, reclutando subsecuentemente IL-4Ra para formar un receptor funcional de alta afinidad que señala [11] [12] . La base de datos Genbank lista la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácido nucleico de IL-13Rccl como NP_001551 y Y10659, respectivamente. Los estudios en ratones deficientes de STAT6 (transductor de señal y activador de trascripción 6) ha revelado que la IL-13, de una manera similar a IL-4, señala al utilizar la ruta de JA -STAT6 [13] [14] . La IL-13Ra2 comparte 37 % de identidad de secuencia con IL-13Rocl al nivel de aminoácidos y se une a IL-13 con alta afinidad [15] [16] . Sin embargo, IL-13Roc2 tiene una prolongación citoplásmica más corta que carece de las porciones conocidas de señalización. Las células que expresan IL-13Ra2 no son sensibles a IL-13 aun en la presencia de IL-4Ra [17] . Por lo tanto, se postula que IL-13Ra2 actúa como un receptor de señuelo que regula a IL-13 pero no la función de IL-4. Esto se soporta por estudios en ratones deficientes de IL-13Ra2 cuyo fenotipo fue consistente con sensibilidad incrementada a IL-13 [18] [19] . La base de datos Genbank lista la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácido nucleico de IL-13Ra2 como NP_000631 y Y08768 respectivamente. El complejo de receptor de IL-13Rocl/lL-4Ra de señalización se expresa en células B humanas, células cebadas, monocitos/macrófagos , células dendríticas, eosinófilos, basófilos, fibroblastos, células endoteliales , células epiteliales de las vías aéreas y células del músculo liso de las vías aéreas. El asma bronquial es una enfermedad inflamatoria persistente común del pulmón, caracterizada por hiper-sensibilidad de las vías aéreas, producción excesiva de moco, fibrosis y aumento de los niveles séricos de IgE. La hiper-sensibilidad de las vías aéreas (AHR) es una constricción exagerada de las vías aéreas a estímulos no específicos tal como aire frío. Tanto AHR como la producción excesiva de moco se piensa que son responsables de la obstrucción variable de las vías aéreas que conduce a la escasez de respiración característica de los ataques de asma (exacerbaciones) y que es responsable de la mortalidad asociada con esta enfermedad (aproximadamente 2000 muertes/año en el Reino Unido) . La incidencia del asma, junto con otras enfermedades alérgicas, se ha incrementado de manera significativa en los años recientes [20] [21] . Por ejemplo, actualmente, se ha diagnosticado como asmática aproximadamente 10 % de la población del Reino Unido (RU) . Las directrices de la Sociedad Torácica Británica y la iniciativa global contra el asma (GINA, por sus siglas en inglés) actuales sugieren un planteamiento gradual al tratamiento del asma [22, 23]. El asma benigna a moderada se puede controlar usualmente por el uso de corticosteroides inhalados, en combinación con beta-agonistas o inhibidores de leucotrieno. Sin embargo, debido a los efectos secundarios documentados de los corticosteroides, los pacientes tienden a no cumplir con el régimen de tratamiento lo que reduce la efectividad del tratamiento [24-26] . Existe una clara necesidad de nuevos tratamientos para sujetos con la enfermedad más severa, quienes frecuentemente obtienen beneficio muy limitado de ya sea altas dosis de corticosteroides inhalados u orales recomendados por las guías para' el" asma. El tratamiento a largo plazo con corticosteroides orales se asocia con efectos secundarios tal como osteoporosis , velocidades retrazadas de crecimiento en niños, diabetes y candidiasis oral [18] . Puesto que los efectos benéficos, adversos de la corticosteroides se median vía el mismo receptor, el tratamiento es un equilibrio entre seguridad y- eficiencia. La hospitalidad de estos pacientes, quienes representan aproximadamente 6 % de la población asmática de RU, como resultado de exacerbaciones severas da cuenta de la mayoría de la carga económica significativa del asma a las autoridades de cuidado de la salud [89] . Se cree que la patología del asma se provoca por inflamación mediada por linfocitos Th2 corrientes que resulta de respuestas inapropiadas del sistema inmunitario a antígenos inocuos. Se ha acumulado evidencia que implica a IL-13, en lugar de la citocina IL-4 clásica derivada de Th2, como el mediador clave en la patogénesis de la enfermedad establecida de las vías aéreas. La administración de IL-13 recombinante a las vías aéreas de roedores no sensibilizados, Cándidos provocó muchos aspectos del fenotipo de asma que incluyen inflamación de las vías aéreas, producción de moco y AHR [27] [28] [29] [30] . Se observó un fenotipo similar en un ratón transgénico en el cual IL-13 se sobreexpresó específicamente en el pulmón. En este modelo, la exposición más crónica a IL-13 también dio por resultado fibrosis [31] . Adicionalmente, en modelos de roedores de enfermedad alérgica, se han asociado muchos aspectos del fenotipo de asma con IL-13. La IL-13Rcc2 murina soluble, un potente neutralizador de IL-13, se ha mostrado que inhibe a AHR, hipersecreción de moco y el influjo de células inflamatorias que son características de este modelo en roedores [27] [28] [30] . En estudios complementarios, los ratones en los cuales se ha suprimido el gen de IL-13, fallaron en desarrollar AHR inducida por alérgenos. La AHR se puede restaurar en estos ratones deficientes de IL-13 por la administración de IL-13 recombinante . En contraste, ratones deficientes de IL-4 desarrollaron enfermedad de las vías aéreas en este modelo [32] [33] . Usando un modelo de inflamación pulmonar inducida por alérgeno de largo plazo, Taube et al., demostró la eficiencia de IL-12Ra2 murina soluble contra enfermedad establecida de las vías aéreas [34] . La IL-13Roc2 murina soluble inhibió AHR, sobreproducción de moco y a un menor grado la inflamación de las vías aéreas. En contraste, la IL-4Ra que se une y antagoniza a IL-4, tiene efecto en la AHR o la inflamación de las vías aéreas en este sistema [35] . Estos hallazgos se soportaron por Blease et al., quien desarrolló un modelo fungal crónico de asma en el cual los anticuerpos policlonales contra IL-13 pero no IL-4 fueron capaces de reducir la sobreproducción de moco, la AHR y la fibrosis sub-epitelial [36] . También se han enlazado varios polimorfismos genéticos en el gen de IL-13 a la enfermedad alérgica. En particular, una variante del gen de IL-13 en el cual se sustituye el residuo de arginina en el aminoácido 130 con glutamina (Q130R) se ha asociado con asma bronquial, dermatitis atópica y niveles séricos aumentados de IgE [37] [38] [39] [40] . Esta variante particular de IL-13 también se refiere como la variante QllOR (residuo de arginina en el aminoácido 110 se sustituye con glutamina) por algunos grupos que excluyen la secuencia de señal de 20 aminoácidos de la cuenta de aminoácidos. Arima et al, [41] reporta que esta variante se asocia con niveles aumentados en suero de IL-13. La variante de IL-13 (Q130R) y los anticuerpos de esta variante se analizan en la WO 01/62933. Un polimorfismo del promotor IL-13, que altera la producción de IL-13, también se ha asociado con asma alérgica [42] . También se han medido niveles elevados de IL-13 en sujetos humanos con asma, rinitis atópica (fiebre de heno) , dermatitis alérgica (eccema) y sinusitis crónica. Por e emplo, se encontró que los niveles de IL-13 son mayores en biopsias bronquiales, células de lavado de esputo y bronco-alveolar (BAL) de asmáticos en comparación a sujetos de control [43] [44] [45] [46] . Adicionalmente, los niveles de IL-13 en muestras de Bal se incrementaron en individuos asmáticos en la estimulación con alérgeno [47] [48] . La capacidad de producción de IL-13 de las células T CD4 (+) se ha mostrado adicionalmente que es un marcador útil del riesgo para el desarrollo subsiguiente de enfermedad alérgica en recién nacidos [49] . Li et al [114] ha informado recientemente de efectos de un anticuerpo neutralizante anti-IL-13 de ratón en un modelo de asma crónica en ratones. La respuesta tipo asma crónica (tal como AHR, inflamación severa de las vías aéreas, producciones excesivas de moco) , se indujo en ratones sensibilizados con OVA. Li et al, reporta que la administración de un anticuerpo de IL-13 en el momento de cada estímulo con OVA suprime la AHR, la infiltración de eosinófilos, los niveles séricos de IgE, los niveles de citocinas/quimiocinas pro-inflamatorias y el remodelado de las vías aéreas [14] . En resumen, estos datos proporcionan la indicación que IL-13 en lugar de IL-4 es un objetivo más atractivo para el tratamiento de enfermedad alérgica humana. La IL-13 puede jugar un papel en la patogénesis de enfermedad inflamatoria del intestino. Heller et al., [116] reporta que la neutralización de IL-13 por administración de IL-13Ra2 soluble mejora inflamación crónica en un modelo murino de colitis ulcerativa humana [116] . De manera correspondiente, la expresión de IL-13 fue mayor en especímenes de biopsia rectal de pacientes con colitis ulcerativa en comparación a los controles [117] . Además del asma, se ha asociado IL-13 con otras condiciones fibróticas. Se han medido niveles incrementados de IL-13, hasta de 1000 veces mayores que IL-4 en el suero de pacientes con esclerosis sistémicas [50] y en las muestras de BAL de pacientes afectados con otras formas de fibrosis pulmonar [51] . De manera correspondiente, la sobreexpresión de IL-13 pero no de IL-4 en el pulmón de ratón dio por resultado fibrosis pronunciada [52] [53] . La contribución de IL-13 a la fibrosis en tejidos diferentes del pulmón se ha estudiado extensivamente en un modelo en ratón de fibrosis hepática inducida por parásitos. La inhibición específica de IL-13 por administración de IL-13Ra2. soluble o interrupción del gel de IL-13, pero no ablación de la producción de IL-4 impide la fibrogénesis en el hígado [54] [55] [56] . La Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (COPD) incluye poblaciones de pacientes con grados variables de bronquitis crónica, enfermedad pequeña de las vías aéreas y enfisema y se caracteriza por decadencia progresiva irreversible de la función pulmonar que responde pobremente a la terapia actual basada en asma [90] . La incidencia de COPD ha aumentado dramáticamente en los años recientes para llegar a la cuarta causa principal de muerte a nivel mundial (Organización Mundial de la Salud) . Por lo tanto la COPD representa una gran necesidad médica no satisfecha. Las causas fundamentales de la COPD permanecen pobremente entendidas. La "hipótesis Holandesa" propone que hay una susceptibilidad común a la COPD y al asma, y por lo tanto, que mecanismos similares pueden contribuir a la patogénesis de ambos trastornos [57] . Zheng et al [58] ha demostrado que la sobreexpresión de IL-13 en enfisema provocado en pulmón de ratón, producción elevada de moco e inflamación, que reflejan aspectos de COPD humana. Adicionalmente, la AHR, una respuesta dependiente de IL-13 en modelos murinos de inflamación alérgica, se ha mostrado que es predictiva del decaimiento de la función pulmonar en fumadores [59] . También se ha establecido un enlace entre el polimorfismo del promotor de IL-13 y la susceptibilidad a desarrollar COPD [60] . Por lo tanto, las señales son que la IL-13 juega un papel importante en la patogénesis de COPD, particularmente en pacientes con características tipo asma que incluyen AHR y eosinofilia. Se ha mostrado que en los niveles de ARNm de IL-13 son mayores en muestras de tejido de autopsia de sujetos con una historia de COPD en comparación a muestras pulmonares de sujetos que no reportaron enfermedad pulmonar (J. Elias, Oral Communication at American Thoracic Society Annual Meeting 2002) . En otro estudio, se demostraron niveles elevados de IL-13 por inmunohistoquimica en secciones pulmonares periféricas de pacientes con COPD [91] . La . enfermedad de Hodgkin es un tipo común de linfoma, que da cuenta de aproximadamente 7,500 casos por año en los Estados Unidos de América. La enfermedad de Hodgkin es inusual entre malignidades en las cuales las células neoplásticas de Reed-Sternberg, frecuentemente derivadas de células B, constituyen sólo una sola pequeña proporción de la masa clínicamente detectable. Las líneas celulares derivadas de la enfermedad de Hodgkin y las células primarias de Reed-Sternberg expresan frecuentemente IL-13 y su receptor [61] . Puesto que IL-13 promueve la supervivencia y proliferación celular en células B normales, se propuso que ÍL-13 puede actuar como un factor de crecimiento para células de Reed-Sternberg. Skinnider et al., ha demostrado que anticuerpos neutralizantes contra IL-13 puede inhibir el crecimiento de las líneas celulares derivadas de la enfermedad de Hodgkin in vitro [62] . Este hallazgo sugiere que las células de Reed-Sternberg puede mejorar su propia supervivencia por una ruta de citocina autocrina y paracrina de IL-13. Consistente con esta hipótesis, se han detectado valores elevados de IL-13 en el suero de algunos pacientes con la enfermedad de Hodgkin en comparación a controles normales [63] . Los inhibidores de IL-13 por lo tanto pueden prevenir el progreso de la enfermedad al inhibir la proliferación de células malignas de Red-Sternberg. Muchas células de cáncer humano expresan antígenos específicos de tumor inmunogénicos . Sin embargo, aunque muchos tumores retroceden de forma espontánea, varios evaden el sistema inmunitario (inmunosupervisión) al suprimir la inmunidad mediada por células T. Terabe et al. [64] ha demostrado un papel de IL-13 en inmunosupresión en un modelo de ratón en el cual los tumores retroceden espontáneamente después de el crecimiento inicial y entonces se repiten. La inhibición específica de IL-13, con IL-13Ra2 soluble, protegió a estos ratones de la recurrencia del tumor. Terabe et al [64] procedió a mostrar que IL-13 suprime la diferenciación de linfocitos citotóxicos CD8+ específicos de tumor que median las respuestas inmunitarias antitumor. Por lo tanto, se pueden usar inhibidores de IL-13 de manera terapéutica para impedir la recurrencia o metástasis del tumor. La inhibición de IL-13 se ha mostrado que mejora las vacunas antivirales en modelos en animales y puede ser benéfico en el tratamiento del VIH y otras enfermedades infecciosas [65] . Se debe señalar que en general la referencia en la presente a interleucina-13 o IL-13, es, excepto donde lo dicte de otro modo el contexto, con referencia a IL-humana. Esto también se refiere a los lugares como "el antígeno" . La presente invención proporciona anticuerpos a IL-13 humana, especialmente anticuerpos humanos, que son de reactividad cruzada con ;'IL-13 de primate no humano, incluyendo IL-13 de monos cynomolgus y monos rhesus . Los anticuerpos de acuerdo con algunas modalidades de la presente invención reconocen una variante de IL-13 en la cual el residuo de arginina en la posición 130 de aminoácidos se reemplaza por glutamina. En otros aspectos y modalidades, la presente invención proporciona miembros específicos de unión contra IL-13 murina, específicamente IL-13 de ratón.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra la potencia de neutralización (% de inhibición) de BAK167A11 (cuadros cerrados) y su derivado BAK615E3 (cuadros abiertos) como scFv contra 25 ng/ml de IL-13 humana en ensayo de proliferación celular de TF-1. Los triángulos representan un scFv irrelevante. Los datos representan la media con barras de error estándar de determinaciones en triplicado dentro del mismo experimento. La Figura 2 muestra la potencia de neutralización (% de inhibición) de BAK278D6 (cuadros cerrados) y su derivado BAK502G9 (cuadros abiertos) como scFv contra 25 ng/ml de IL-13 humana en ensayo de proliferación de células TF-1. Los triángulos representan un scFv irrelevante. Los datos representan la media con barras de error estándar de determinaciones en triplicado dentro del mismo experimento. La Figura 3 muestra la potencia de neutralización (% de inhibición) de BAK209B11 (cuadros cerrados) como un scFv contra 25 ng/ml de IL-13 murina en el- ensayo de proliferación de células TF-1. Los triángulos representan un scFv irrelevante. Los datos representan la media con barras de error estándar de determinaciones en triplicado dentro del mismo experimento. Las Figuras 4A-4C muestran la potencia de neutralización (% de inhibición) de BAK278D6 (cuadro cerrado) como un scFv contra IL-13 en el ensayo de proliferación de células TF1. Los triángulos representan un scFv irrelevante. Los datos representan la media con barras de error estándar de determinaciones en triplicado dentro del mismo experimento. La Figura 4A muestra la potencia contra 25 ng/ml de IL-13 humana. La Figura 4B muestra la potencia contra 25 ng/ml de IL-13 variante humana. La Figura 4C muestra la potencia contra 50 ng/ml de IL-13 de primate no humano. La Figura 5 muestra la comparación de la potencia de anticuerpos anti-IL-13 humana en el ensayo de proliferación de TF-1. Los datos representan la potencia media de neutralización con barras de error estándar sobre 5-7 experimentos contra 25 ng/ml de IL-13 humana. El desempeño con. relación al anticuerpo comercialmente disponible, B-B13, se evaluó estadísticamente al realizar un ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. * P<0.05, ** P<0.01 en comparación a B-B13. Las Figuras 6A-6C muestran la potencia de neutralización (% de inhibición) de BAK502G9 (cuadros cerrados) BAK1167F2 (triángulos cerrados) y BAK1183H4 (triángulos invertidos cerrados) como IgG4 humana contra IL-13 marcada en el ensayo de proliferación de células TF-1. Los triángulos abiertos representan una IgG4 irrelevante. Los datos representan la media con barras de error estándar de tres experimentos separados. La Figura 6A muestra potencia contra 25 ng/ml de IL-13 humana. La Figura 6B muestra la potencia contra 25 ng/ml de IL-13 variante humana. La Figura 6C muestra potencia contra 50 ng/ml de IL-13 de primate no humano. La Figura 7 muestra la potencia de neutralización (% de inhibición) de BAK502G9 (cuadros cerrados) , BAK1167F2 (triángulos cerrados) , BAK1183H4 (triángulos invertidos cerrados) como IgG4 humana y anticuerpos anti-IL-13 ' humana comerciales (B-B13 -cuadros abiertos; JES10-5A2 - triángulos invertidos abiertos) en el ensayo de proliferación de células HDLM-2 dependientes de IL-13 nativa. Los triángulos abiertos representan una IgG4 irrelevante. Los datos representan la media con las barras de error estándar de determinaciones en triplicado dentro del mismo experimento. La Figura 8 muestra la comparación de la potencia de anticuerpos anti-IL-13 humana en el ensayo de NHLF. Los datos representan la potencia media de neutralización (IC50 pM) con barras de error estándar sobre 4-5 experimentos contra 10 ng/ml de IL-13 humana en el ensayo de liberación de eotaxina de NHLF. El desempeño con relación al anticuerpo comercialmente disponible, B-B13, se evaluó estadís icamente al realizar un ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett . * P<0.05, ** P<0.01 en comparación a B-13. La Figura 9 muestra la potencia de neutralización (% de inhibición) de BAK502G9 (cuadros cerrados) , BAK1167F2 (triángulos cerrados) , BA 1183H4 (triángulos invertidos cerrados) como IgG4 humana contra la expresión de VCAM-1 en la superficie de HUVEC en respuesta a 10 ng/ml de IL-13 humano. Triángulos abiertos representan IgG4 irrelevante. Los datos representan la media con barras de error estándar de determinaciones en triplicado dentro del mismo experimento. Las Figuras 10A-10B muestran la potencia de neutralización (% de inhibición) de BAK502G9 (cuadrados cerrados) , BAK1167F2 (triángulos cerrados) , BAK1183H4 (triángulos invertidos cerrados) como IgG4 humana contra liberación de eotaxina para expresión VCAM-1 en la superficie de HUVEC en respuesta a yá sea 1 ng/ml de IL-4 humana (Figura 10A) o 0.5 ng/ml de IL-?ß humana (Figura 10B) . Los triángulos abiertos representan una IgG4 irrelevante. Los datos representan la media con barras de error estándar de determinaciones en triplicado dentro del mismo experimento. La Figura 11 muestra la potencia de neutralización {% de inhibición) de BAK209B11 (cuadrados) como una IgG4 humana contra 1 ng/ml de IL-13 murina en el ensayo de proliferación de células B9 dependientes de factor. Los triángulos abiertos representan una IgG4 irrelevante. Los datos representan la media con barras de error estándar de determinaciones en triplicado dentro del mismo experimento. La Figura 12 muestra el nivel relativo de IL-13 en homogenados de pulmón de ratones sensibilizados (s) (barra derecha) y no sensibilizados (ns) (barra izquierda) después de la estimulación en un modelo murino de inflamación alérgica pulmonar aguda. El efecto de la sensibilización se evaluó estadísticamente al realizar la prueba t de Student usando la cantidad de datos de IL-13. *<0.05. **<0.01 en comparación a animales de control no sensibilizados (n=5-6 ratones) . Los datos representan la media con barras de error estándar. La Figura 13 ilustra los efectos de la administración i.v. de BAK209B11 como IgG4 humana en diferentes cantidades en comparación a un anticuerpo de control irrelevante de IgG4, correspondido en isotipo en reclutamiento de leucocitos, inducido por ovalbúmina al pulmón en ratones sensibilizados con ovalbúmina. El número de leucocitos se muestra (x 104) . El efecto del tratamiento con anticuerpos se evalúa estadísticamente al mostrar un ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett usando datos de cuenta celular diferencial. *<0.05, **<0.01 en comparación a animales de control de PBS estimulados con ovalbúmina (= 0 % de inhibición; n=5-8 ratones) . Los datos representan la media con barras de error estándar. La Figura 14 ilustra los efectos de la administración .v. de BAK209B11 como IgG4 humana en diferentes cantidades en comparación a un anticuerpo de control irrelevante de IgG4 correspondido en isotipo en reclutamiento de eosinófilos inducido por ovalbúmina al pulmón en ratones sensibilizados con ovalbúmina. El número de eosinófilos se muestra (x 104) . El efecto del tratamiento con anticuerpos se evaluó estadísticamente al realizar un A OVA unidireccional con prueba de Dunnett usando datos de cuenta celular diferencial. *0.05. **<0.01 en comparación a animales de control de PBS estimulados con ovalbúmina (=0% de inhibición; n=5-8 ratones. Los datos representa la media con barras de error estándar. La Figura 15 ilustra los efectos de la administración i.v. de BAK209B11 como IgG4 humana en diferentes cantidades en comparación a un anticuerpo de control irrelevante de IgG 4 correspondido en isotipo en reclutamiento de neutrófilos inducido por ovalbúmina al pulmón en ratones sensibilizados con ovalbúmina. Se muestra el número de neutrófilos (x 104) . El efecto del tratamiento con anticuerpos se evalúo estadísticamente al realizar un ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett usando datos de cuenta celular diferencial. *<0.05. **<0.01 en comparación a animales de control de PBS estimulados con ovalbúmina (=0 % de inhibición; n=5-8 ratones) . Los datos representan la media con barras de error estándar. La Figura 16 ilustra los efectos de la administración i.v. de BAK209B11 como IgG4 humana en diferentes cantidades en comparación a un anticuerpo de control irrelevante de IgG4 correspondido en isotipo en reclutamiento de linfocitos inducido por ovalbúmina al pulmón en ratones sensibilizados con ovalbúmina. La inducción de linfocitos se inhibió dependiente de la dosis por BAK209B11 con inhibición máxima a 3 µg/ml de BAK209B11. El efecto del tratamiento con anticuerpos se evaluó estadísticamente al realizar un ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett usando datos de cuenta celular diferencial. *<0.05. **<0.01 en comparación a animales de control de PBS estimulados con ovalbúmina (=0 % de inhibición; n=5-8 ratones) . Los datos representan la media con barras de error estándar.

La Figura 17 ilustra los efectos de la administración i.v. de BAK209B11 como IgG4 humana en diferentes cantidades en comparación a un anticuerpo de control irrelevante de IgG4 correspondido en isotipo en reclutamiento de monocitos/macrófagos inducido por ovalbúmina al pulmón en ratones sensibilizados con ovalbúmina. No hay-incremento significativo en los niveles de monocitos/macrófagos de animales sensibilizados en comparación con animales de control. Sin embargo, estos niveles de antecedente de estas células se redujeron por =36 g/ml de BAK209B11 en animales sensibilizados. El efecto del tratamiento con anticuerpos se evaluó estadísticamente al realizar un ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett usando datos de cuenta celular diferencial. *<0.05. **<0.01 en comparación a animales de control de PBS estimulados con ovalbúmina (=0% de inhibición; n=5-8' ratones) . Los datos representan la media con barras de error estándar. La Figura 18 muestran los efectos de un anticuerpo JES10-5A2 neutralizante anti-IL-13 comercial en el influjo de células (el número de leucocitos se muestra (x 104) ) en sacos aéreos murinos producidos por administración de IL-13 humana recombinante bacterianamente derivada. El efecto del tratamiento con anticuerpos evaluó estadísticamente al realizar un ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett usando datos de cuenta celular diferencial. *<0.05. **<0.01 en comparación a animales de control de CMC (=0% de inhibición; n=ll-13 ratones) . Los datos representan la media con barras de error estándar. La Figura 19 muestra la alineación de secuencias de aminoácidos de IL-13 de cynomolgus contra IL-13 humana. Los siete residuos de aminoácido que difieren entre IL-13 humano y cynomolgus se sombrean. IL-13 de rhesus y cynomolgus tienen una secuencia idéntica de aminoácidos . La Figura 20A ilustra los efectos de la dosis de bolo i.v de 10 mg/kg individual de BAK502G9 como IgG4 humana en niveles séricos de IgE en 4 primates cynomolgus alérgicos pero no estimulados (2 machos/2 hembras) durante 29 días. Se reduce de manera significativa la concentración sérica de IgE desde 100 % (pre-dosis) a 66 ± 10 % de valores de control (p<0.05), a 4 y 5 días después de la dosificación. Esta disminución de la concentración sérica de IgE se recupera a 88 ± 8 % de niveles de control por el día 22. * = p<0.05 en comparación a niveles de pre-dosis de IgE, A OVA de mediciones repetidas seguido por prueba de comparaciones múltiples de Dunnett (n = 4 animales) . La Figura 20B muestra niveles séricos de IgE relativos de primates cynomolgus machos y hembras versus tiempo seguido por una dosis intravenosa individual de 10 mg/kg de BAK502G9. Los datos de IgE sérica relativa se expresan como media aritmética ± SEM de porcentaje de valor de línea base. La Figura 21A ilustra los efectos de administración intraperitoneal de BAK209B11 en diferentes cantidades (H=237 µg/día, M=23.7 µg/día y L=2.37 µg/día) en comparación con un anticuerpo de control irrelevante de IgGl correspondido en su tipo en la función pulmonar de ratones estimulados y sensibilizados con ovalbúmina. En la Figura 21A se representa la función pulmonar por log PC50s (concentración logarítmica de metacolina requerida para incrementar PenH de línea base por 50 %) antes de cualquier tratamiento (día 0) y después del tratamiento de sensibilización, estimulación y tratamiento con fármaco (día 25) . La Figura 21A muestra los datos al natural usados para calcular el punto final del estudio, mostrados en la Figura 2IB (Delta Log PC5o) . Los datos representan la media con barras de error estándar de n=8. En la Figura 21B, se muestra que el cambio de función pulmonar por un cambio en log PC50 de ratón individual (delta log PC50) . Delta log PC50 se define como un cambio en individuos en log PC50 en el día 25 versus día 0. Los datos representan delta log PC50 media de grupo (cambios individuales promediados dentro de grupos de tratamiento) con barras de error estándar. El efecto del tratamiento con anticuerpo se evaluó estadísticamente al realizar un AOVA unidireccional con prueba de Dunnett usando datos de delta log PC50. **p<0.01 en comparación a animales de control estimulados y sensibilizados con ovalbúmina (n=8 ratones) . Las Figuras 22A-22B ilustran los efectos de administración local (i.po.) y sistémica (i.v.) de BAK502G9 como IgG4 humana en diferentes cantidades en comparación a un anticuerpo de control irrelevante de IgG4 correspondido en isotipo en el reclutamiento total de leucocitos (Figura 22A) y reclutamiento de eosinófilos (Figura 22B) en los sacos aéreos de ratones BALB/C. Los datos representan la media con barra de error estándar de n=10. El efecto del tratamiento con anticuerpo se evaluó estadísticamente al realizar un ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett usando datos transformados en logaritmo. *p<0.05, **p<0.01 en comparación a ratones estimulados con hUlL-13 (n=10) . La Figura 23 ilustra los efectos de la administración i.p. de BAK502G9 como IgG4 humana en comparación a un anticuerpo de control irrelevante de IgG4 correspondido en isotipo en el desarrollo de AHR después de la administración intratraqueal de IL-13 humana a las vías ' aéreas de ratones. El efecto del tratamiento con anticuerpo se evaluó estadísticamente al realizar una ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett usando datos de Metacolina PC2oo *<0.05. **<0.01 en comparación a grupo de control positivo a IL-13 humana (n=6-8 ratones) . Los datos representan la media con barras de error estándar.

La Figura 24 muestran la potencia de neutralización (¾ de respuesta máxima) de BAK502G9 (cuadros cerrados) como IgG4 contra 30 ng/ml de IL-13 en un ensayo de producción de IgE de células B humanas. Los cuadros abiertos representan IgG4 irrelevante. Los datos representan la media con barras de error estándar de seis donadores de experimentos separados . Las Figuras 25A-25B muestran los efectos de BA 502G9 en potenciación inducida por IL-13 de señalización de Ca2+ inducida por agonista en células de músculo liso bronquial. El área bajo la curva (AUC) de la respuesta de señalización de Ca2+ a histamina se determinó para cada condición de pre-tratamiento de anticuerpo +/- IL-13. Los datos combinados de los tres experimentos independientes se muestran para el anticuerpo irrelevante CAT-001 (a) y BAK502G9 (b) como la diferencia en porcentaje versus células no tratadas de AUC±SD (ns=no significativo (p>0.05), *p<0.05, **p<0.01). Los resultados se evaluaron estadísticamente analizando un análisis unidireccional de varianza (A OVA) con pos-prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni . Las Figuras 26A-26D muestran los efectos de BAK502G9 administrada de fase II. La Figura 26A muestra el efecto en AHR como se mide por cambio en el área bajo la curva de respuesta de dosis de histamina (n=14) .

La Figura 26B muestra el efecto en AHR como se midió por cambio en PC30 (n=18) . La Figura 26C muestra el efecto en cebadura con antígeno (n=20) . La Figura 26D muestra el efecto en la inflamación en BAL (n=21) . La Figura 27 muestra el efecto de BAK502G9 en expresión de CD23 inducida por IL-13. Los datos se representan como un porcentaje de la respuesta a IL-13 sola (100 %) y se expresan como media ± % de SEM, control de 6 experimentos separados de 6 donadores individuales, (realizado en triplicado) . La Figura 28 muestra el efecto de BAK502G9 e IgG4 irrelevante en expresión de CD23 en PBMC inducida por IL-13 y/o IL-4. Los datos se representan como un porcentaje de la respuesta de IL-4 sola (100 %) y se expresan como media + % de SEM, control de 4 experimentos separados de 4 donadores individuales, (realizado en triplicado) . La Figura 29A muestra el efecto de BAK502G9 en producción de eotaxina-1 de NHLF inducida por cultivo de 48h en medio que contiene IL-13/ THF-cc/ TGF-ß?. Los datos se muestran como una media aritmética ± SEM de determinaciones en triplicado del medio usado en este estudio para inducir cambio de forma de leucocitos . La Figura 29B muestra el efecto de BAK502G9 en cambio de forma de eosinófilos humanos inducido por dilución 1:16 de medio acondicionado. Los puntos de datos representados son media ± % de SEM, cambio de forma de medio en blanco de experimentos separados de cuatro donadores individuales . La Figura 30 muestra la alineación de IL-13 humana contra IL-13 murina que resalta las mutaciones que se introdujeron en IL-13 humana para producir el primer panel de quimeras de IL-13. Las cuatro alfa-hélices se resaltan en cuadros y se marcan el asa 1 y asa 3. Se produjeron cinco proteínas quiméricas donde se reemplazan las hélices B, C y D, y asa 1 y asa 3 con la secuencia murina. Las cuatro proteínas quiméricas adicionales se produjeron y se numeraron de acuerdo al aminoácido en la pre-proteína humana (no a la numeración de la múltiple alineación anterior) donde arginina en el residuo 30 (posición 34 anterior) se mutó, los residuos 33 y 34 (posición 37 y 38 anterior) se imitaron, los residuos 37 y 38 (VH) se mutaron (posición 41 y 42 anterior) , y los residuos 40 y 41 (TQ) se mutaron (posición 44 y 45 anterior) . La Figura 31 muestra la alineación de IL-13 humana contra IL-13 murina que resalta la alineación de las mutaciones que se introdujeron en IL-13 humana para producir el segundo panel de quimeras de IL-13. Se produjeron seis quimeras donde el (los) residuo (s) humano (s) se sustituyeron por los residuos murinos (resaltado con cuadros) . Se produjeron cuatro proteínas quiméricas adicionales (las numeración es de acuerdo a la posición del aminoácido en la pre-proteína humana) donde leucina en el residuo 58 (62 en figura anterior) se mutó, se mutó leucina en el residuo 119 (residuo 123 anterior), se mutó lisina en la posición 123, residuo 127 anterior) , y se mutó arginina en el residuo 127 (residuo 132 anterior) . La Figura 32 muestra las mutaciones hechas a IL-13 humana. Las mutaciones en gris oscuro redujeron la unión a BAK502G9, las mutaciones en gris claro no alteraron la unión. La secuencia lineal de la IL-13 pre-humana con los residuos mutados se indica .

Descripción Detallada de la Invención En varios aspectos y modalidades de la invención se proporciona la materia de las reivindicaciones incluidas más adelante . La presente invención proporciona miembros específicos de unión para IL-13, en particular para IL 13 humana y/o de primate y/o IL-13 variante (Q130F) , e IL-13 murina. Las modalidades preferidas dentro de la presente invención son moléculas de anticuerpo, ya sea anticuerpo completo (por ejemplo, IgG, tal como IgG4) o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, scFv, Fab dAb) . Las regiones de unión a antígeno del anticuerpo se proporcionan, como son los dominios VH y VL de anticuerpo. Dentro de los dominios VH y VL se proporcionan regiones de determinación de complementariedad, CDR que se proporcionan dentro de diferentes regiones de estructura, FR, para formar los dominios de VH ó VL como pueda ser el caso. Un sitio de unión a antígeno puede consistir de un dominio VH y/o un dominio VL de anticuerpo. Se puede proporcionar un sitio de unión a antígeno por medio del arreglo de la CDR en núcleos moleculares, de proteína no de anticuerpo tal como fibronectina o citocromo B etc., [115, 116]. Los núcleos moleculares para manejar nuevos sitios de unión en las proteínas se han revisado en detalle por Nygren et al [116] . Los núcleos moleculares de proteína para imitadores de anticuerpos se describen en WO/0034784 en la cual los inventores describen proteínas (imitadores de anticuerpos) que incluyen un dominio tipo III de fibronectina que tiene al menos una asa aleatorizada. Un núcleo molecular adecuado en el cual injertar una o más CDR, por ejemplo, un conjunto de HCDR, se puede proporcionar por cualquier miembro de dominio de la superfamilia de genes de inmunoglobulina . Las modalidades preferidas de la presente invención son en lo que se llama la presente el "linaje de BAK278D6" . Esto se define con referencia a un conjunto de seis secuencias de CDR de BAK278D6 como sigue: HCDR1 (SEQ ID NO: 1), HCDR2 (SEQ ID NO: 2), HCDR3 (SEQ ID NO: 3), LCDR1 (SEQ ID NO: 4), LCDR2 (SEQ ID NO: 5) y LCDR3 (SEQ ID NO: 6). En un aspecto, la presente invenció proporciona un miembro específico de unión para IL-13 humana, que comprende un sitio de unión a antígeno de anticuerpo que está compuesto de un dominio VH de anticuerpo humano y un dominio VL de anticuerpo humano y que comprende un conjunto de CDR, en donde el dominio VH comprende HCDR 1, HCDR2 y HCDR3 y el dominio VL comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3 , en donde HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, la HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2, la HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 3, la LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, la LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 5, y la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 6; o en donde el conjunto de CDR contiene una o dos sustituciones de aminoácidos en comparación con el conjunto de CDR, en donde la HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1, la HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2, la HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 3, la LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, la LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 5, y la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 6. El conjunto de CDR en donde la HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1, la HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2, la HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 3, la LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, la LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 5, y la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 6, se refieren a la presente como el "conjunto de CDR de BAK278D6" . La HCDRl, HCDR2, HCDR3 dentro del conjunto de CDR de BAK278D6 se refieren como el "conjunto de HCDRl de BAK278D6" y la LCDR1 , LCDR2- y LCDR3 dentro del conjunto de CDR de BA 278D6 se refieren como el "conjunto de LCDR de BAK278D6" . Un conjunto de CDR dentro del conjunto de CDR de BAK278D6, conjunto de HCDR de BA 278D6 o LCDR de BAK278D6, o una o dos sustituciones en los mismos, se dice que es de linaje de BAK278D6. Como se señala, en un aspecto, la invención proporciona un miembro específico de unión para IL-13 humana, que comprende un sitio de unión a antígeno de anticuerpo que está compuesto de un dominio VH de anticuerpo humano y un dominio VL de anticuerpo humano y que comprende un conjunto de CDR, en donde el conjunto de CDR es el conjunto de CDR de BAK278D6 o un conjunto de CDR que contiene una o dos sustituciones en comparación con el conjunto de CDR de BAK278D6. En modalidades preferidas, una o dos sustituciones están en uno o dos de los siguientes residuos dentro de la CDR de los dominios VH y/o VL, usando la numeración normal de Kabat [107] . 31, 32, 34 en HCDR1 52, 52A, 53, 54, 56, 58, 60, 61, 62, 64, 65 en HCDR2 96, 97, 98, 99, 101 en HCDR3 26, 27, 28, 30, 31 en LCDR1 56 en LCDR2 95A, 97 en LCDR3 Las modalidades preferidas tienen dos sustituciones en comparación con el conjunto de CDR de BAK278D6, el residuo 99 de HCDR3 y el residuo 27 de LCDR1. De estas modalidades, las modalidades preferidas tienen S sustituido por N en el residuo 99 de HCDR3 y/o I sustituido por N en el residuo 27 de LCDR 1. Aun además modalidades adicionales tienen una sustitución en el residuo 29 de HCDR3 del grupo que consiste de S, A, I, R, P y y/o una sustitución en el residuo 27 de LCDR1 seleccionado del grupo que consiste de I, L, M, C, V, K, Y, F, R, T, S, A y G. En modalidades preferidas se hacen una o dos sustituciones en uno o dos de los siguientes residuos dentro del conjunto de CDR de BAK278D6 de acuerdo con los grupos identificados de posibles residuos sustituidos.

Posición de Residuo Sustituido seleccionado del grupo sustitución que consiste de 31 en HCDR1: Q, D, L, G ; y E 32 en HCDR1 : T 34 en HCDR1 : V, I y F 52 en HCDR2 : D, N, A, R, G y E 52A en HCDR2 D, G, T, P, N y Y 53 en HCDR2 : D, L, A, P, T, S, I y R '54 en HCDR2 : S, T, D, G, K e I 56 en HCDR2 : T, E, Q, L, Y, N, v, A, M y G 58 en HCDR2 : I, L, Q, S, , H, D y K 60 en HCDR2: R 61 en HCDR2: R 62 en HCDR2 : K y G 64 en HCDR2 : R 65 en HCDR2 : K 96 en. HCDR3 : R y D 97 en HCDR3 : N, D, T y P 98 en HCDR3 : R 99 en HCDR3 : S, A, I, R, P y K 101 en HCDR3 26 en LCDRl D y S 27 en LCDRl I, L, M, C, V, K, Y, F, R, T, S, A, H y G 28 en LCDRl V 30 en LCDRl G 31 en LCDRl R 56 en LCDR2 : T 95A en LCDR3 : N 97 en LCDR3 : I Las modalidades preferidas tienen el conjunto de CDR de BAK278D6 con una sustitución de S por N en el residuo 99 dentro de HCDR3 e I por N en el residuo 27 dentro de LCDR 1. El conjunto de CDR definido de esta manera es como sigue: HCDR1 - SEQ ID NO: 7; HCDR2 - SEQ ID NO: 8, HCDR3 - SEQ ID NO: 9; LCDRl - SEQ ID NO: 10, LCDR2 - SEQ ID NO: 11; LCDR3 -SEQ ID NO: 12. Este conjunto de CDR se refiere en la presente como el "conjunto de CDR de BAK502G9" . Modalidades preferidas adicionales tienen el conjunto de CDR de BAK278D6 con una o dos sustituciones dentro de la CDR, con la condición que el par de sustituciones de S por N en el residuo 99 dentro de la HCDR3 e I por N en el residuo 27 dentro de la LCDRl se excluye. Otras modalidades preferidas son como sigue: BAK 1166G2: HCDR1 - SEQ ID NO: 67, HCDR2 - SEQ ID NO: 68, HCDR3 - SEQ ID NO: 69, LCDR1 - SEQ ID NO: 70, LCDR2 - SEQ ID NO: 71; LCDR3 - SEQ ID NO: 72. BAK1167F2 HGDR1 - SEQ ID NO: 61, HCDR2 - SEQ ID NO: 62, HCDR3 - SEQ ID NO: 63, LCDR1 - SEQ ID NO: 64, LCDR2 - SEQ ID NO: 65; LCDR3 - SEQ ID NO: 66. BAK1184C8: HCDR1 - SEQ ID NO: 73, HCDR2 - SEQ ID NO: 74, HCDR3 - SEQ ID NO: 75, LCDR1 - SEQ ID NO: 76, LCDR2 - SEQ ID NO: 77; LCDR3 - SEQ ID NO: 78. BA 1185E1: HCDR1 - SEQ ID NO: 79, HCDR2 - SEQ ID NO: 80, HCDR3 - SEQ ID NO: 81, LCDR1 - SEQ ID NO: 82, LCDR2 - SEQ ID NO: 83; LCDR3 - SEQ ID NO: 84. BAK1167F4: HCDR1 - SEQ ID NO: 85, HCDR2 - SEQ ID NO: 86, HCDR3 - SEQ ID NO: 87, LCDR1 - SEQ ID NO: 88, LCDR2 - SEQ ID NO: 89; LCDR3 - SEQ ID NO: 90. BAKllllDlO: HCDR1 - SEQ ID NO: 91, HCDR2 - SEQ ID NO: 92, HCDR3 - SEQ ID NO: 93, LCDR1 - SEQ ID NO: 94, LCDR2 - SEQ ID NO: 95; LCDR3 - SEQ ID NO: 96. BAK1183H4: HCDR1 - SEQ ID NO: 97, HCDR2 - SEQ ID NO: 98, HCDR3 - SEQ ID NO: 99, LCDR1 - SEQ ID NO: 100, LCDR2 - SEQ ID NO: 101; LCDR3 - SEQ ID NO: 102. BAK1185F8: HCDR1 - SEQ ID NO: 103, HCDR2 - SEQ ID NO: 104, HCDR3 - SEQ ID NO: 105, LCDR1 - SEQ ID NO: 106, LCDR2 - SEQ ID NO: 107; LCDR3 - SEQ ID NO: 108. Todos estos se derivan de BAK502G9 por aleatorización de CDR1 y CDR2 de cadena pesada y de esta manera son de linaje de BAK502G9. Un dominio VH que comprende un conjunto de CDR, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de cualquier clon como se muestra en la Tabla 1. La Tabla 1 también se proporciona por la presente invención, puesto que es de manera separada un dominio VL que comprende un conjunto de CDR, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de los clones mostrados en la Tabla 1. De manera preferente, este dominio VH está apareado con ese dominio VL, y de manera más preferente los apareamientos de los dominios VH y VL son los mismos como se exponen en la Tabla 1. Se proporciona adicionalmente por la presente invención- un dominio VH que comprende un conjunto de CDR, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 , en donde el conjunto de CDR corresponde a aquel para cualquier clon mostrado en la Tabla 1 con una o dos sustituciones de aminoácidos. Proporcionado adicionalmente por la presente invención es un dominio VL que comprende un conjunto de CDR LCDR1, LCDR2, y LCDR3 en donde el conjunto de CDR corresponde a aquel para cualquier clon mostrado en la Tabla 1 con una o dos sustituciones de aminoácidos También se proporciona por la presente invención un miembro específico de unión que comprende un dominio de unión a antígeno de anticuerpo que comprende este dominio VH y/o VL. Los presentes inventores han identificado el linaje de BAK278D6 como que proporciona dominios de unión a antígeno de anticuerpo humano contra IL-13 que son de valor particular. Dentro del linaje, se ha identificado que es de valor especial BAK502G9. Los conjuntos de CDR de BAK278D6 y BAK502G9 se han identificado ya anteriormente. Siguiendo la guía de química de computación en la aplicáción de técnicas multi-variables de análisis de datos a las relaciones de estructura/propieda^d-actívidad [94] , se pueden derivar las relaciones de actividad cuantitativa-propiédád ele los anticuerpos" usando técnicas matemáticas bien conocidas tal como regresión estadística, reconocimiento y clasificación de patrones [95-100] . Las propiedades de los anticuerpos se pueden derivar de modelos empíricos y teóricos (por ejemplo, análisis de probables residuos de contacto o propiedad físico-química calculada de la secuencia de anticuerpo, estructuras funcionales y tridimensionales y estas propiedades se pueden considerar de forma individual y en combinación. Un sitio de unión a antígeno de anticuerpo compuesto de un dominio VH y un dominio VL se forma por seis asas de polipéptido; tres del dominio variable (VL) de cadena ligera y tres del dominio variable (VH) de cadena pesada. El análisis de los anticuerpos de estructura atómica conocida ha producido relaciones entre la secuencia y la estructura tridimensional de sitios de combinación del anticuerpo [101, 102] . Estas relaciones implican que, excepto para tercera región (asa) en los dominios VH, las asas del sitio de unión tienen una de un pequeño número de conformaciones de cadena principal; estructuras canónicas. La estructura canónica formada en un asa particular se ha mostrado que se determina por su tamaño y la presencia de ciertos residuos en sitios claves tanto en el asa como en las regiones de estructura [101, 102] . Este estudio de la relación de secuencia-estructura se puede usar para la predicción de aquellos residuos en un anticuerpo de secuencia conocida, pero de una estructura tridimensional desconocida, que son importantes en el mantenimiento de la estructura tridimensional de sus asas de CDR y por lo tanto mantienen la especificidad de unión. Estas predicciones se pueden respaldar por comparación de las predicciones al resultado de los experimentos de optimización de guia. En un planteamiento estructural, se puede crear un modelo de la molécula de anticuerpo [103] usando un paquete libremente disponible o comercial tal como WAM [104] . Un paquete de programa de análisis y visualizacion de proteínas tal como Insight II [105] o Deep View [106] entonces se puede usar para evaluar posibles sustituciones en cada posición en la CDR. Esta información entonces se puede usar para hacer sustituciones probables que tengan un efecto mínimo o benéfico en la actividad. Los presentes inventores analizaron los datos de secuencia del panel de clones para los cuales los conjuntos de CDR se muestran en la Tabla 1. El análisis probó la hipótesis que cualquier combinación binaria de variaciones de aminoácidos listadas en la CDR del conjunto presentado de variantes de scFv conduce a una variante de scFv con al menos la potencia de inicio de la BAK278D6 de scFv de origen. ~ Todas las variantes de scFv en el panel mostrado en la Tabla 1 se han seleccionado para afinidad mejorada y se ha confirmado que exhiben potencia superior. Las variaciones observadas de aminoácidos pueden ser ya sea favorables, no favorables o neutrales en su efecto en la potencia de inició de BAK278D6 de scFv en el ensayo con TF-1 de 44 nM. No se observó enlace entre dos variaciones de aminoácidos que confirman que no hay sinergia, ya sea "positiva" o "negativa" , entre dos variaciones seleccionadas de aminoácidos. Hay cuatro escenarios donde combinación binaria cumple la hipótesis y tres escenarios son de no será válida la hipótesis . Las variantes sinérgicas de aminoácidos no se consideran puesto que no se observó enlace . La hipótesis es válida donde: Al : mutación 1 es favorable y mutación 2 es neutral A2 : mutación 1 es favorable y mutación 2 es neutral A3 : mutación 1 es neutral y mutación 2 es neutral A4 : mutación 1 es favorable y mutación 2 es no favorable (con el efecto de 1 que tiene más valor que el efecto de 2) . La hipótesis no es válida donde: Bl : mutación 1 no es favorable y mutación 2 es neutral B2 mutación 1 es no favorable y mutación 2 es no favorable B3 : mutación 1 es favorable y mutación 2 es no favorable (con el efecto de 2 que pesa más que el efecto de 1) . Para que sea posible A4, la mutación 1 necesita ser altamente favorable para contrarrestar el efecto negativo de la mutación 2 en potencia. Puesto que esta mutación altamente favorable se presentará en la biblioteca de variantes usadas para la selección, se seleccionará y por lo tanto aparecerá frecuentemente en el panel de variantes . Puesto que se puede excluir la sinergia, esta mutación será benéfica en cualquier clase de contexto de secuencia y por lo tanto debe reaparecer en diferentes variantes de scFv. Un ejemplo para este cambio frecuente en aminoácidos es el cambio en Asn27Ile de CDRl de cadena ligera. Sin embargo, esta mutación por si misma (en el clon BAK531E2) sólo tiene un modesto efecto de dos veces en la potencia (IC50 final de 23.2nM) . Por si misma esta mutación no permitirá el escenario representado en A4, puesto que no es una mutación altamente favorable. Esto sugiere que cada clon el conjunto presentado de clones de unión a IL-13 (Tabla 1) que tiene un cambio de Asn27Ile de CDRl de cadena ligera junto con una o más mutaciones adicionales es al menos tan potente como la variante que tiene la mutación de Asn27Ile de CDRl de cadena ligera, individual. Las otras mutaciones son ya sea, neutrales o positivas pero no tienen un efecto negativo o perjudicial . Un ejemplo adicional esta el Asn99Ser de ' CDR3 de cadena pesada (ver .Tabla 1) . Como un clon que tiene esta variación individual particular de aminoácido. Puesto que no se observa un clon que tenga esta variación individual particular de aminoácido, se ha estimado la potencia de este clon que es de aproximadamente 12.0 nM por el siguiente razonamiento : La potencia de BA 278D6 es 44 nM. Las alteraciones de VL CDRl N27I + VH CDR3 N99S conducen a BAK502G9 con potencia de 8nM, es decir una mejora de 5.5 veces. La potencia de BAK278D6 es 44 nM. La alteración de VL CDR1 N27I conduce a BAK531E2 con potencia de 23nM, es decir como lo mej ora 1.9 veces . La potencia de BA 278D6 es 44 n . La alteración de VH CDR3 N99S proporciona un posible clon con potencia de 12.2 nM, es decir una mejora de 2.9 veces (5.5/1.9=2.9). La combinación binaria de Asn99ser de CDR3 de cadena pesa con Asn27Ile de CDR1 de cadena ligera da un BAK0502G9 de scFv en una potencia de 8 nM. Puesto que se excluye la sinergia, la contribución del cambio de Asn99Ser de CDR3 de cadena pesada en BAK502G9 por lo tanto es aditiva. Por lo tanto, cada clon en el conjunto presentado de clones de unión a IL-13 (Tabla 1) que tiene un cambio de de AsnH99Ser de CDR3 de cadena pesada junto con una o más mutaciones adicionales tendrá una potencia de al menos 12nM o mayor, dentro de una ventana permisiva de ensayo de 2.5 veces para n=l-2. De esta manera, los inventores señalan que no se observa una variación altamente favorable de aminoácidos que será seleccionada de manera preferenci l . Como se analiza anteriormente, dos variaciones que se representaron prominentemente en la Tabla 1 de las variantes de scFv se analizaron más de cerca. Cualquier variante de scFv en la Tabla 1 con cualquiera de estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales exhibió una potencia que fue al menos tan mejorada como un clon que contiene cualquiera de estas dos variaciones individuales de aminoácidos en la BAK278D6 de origen. Por lo tanto no hay evidencia que una variación de aminoácidos altamente favorable, que permitirá el escenario A4, este presente en el panel. Esta observación conduce a los inventores a concluir que no hubo mutaciones no favorables presentes en este conjunto de variantes scFv. Esto significa que no son pertinentes los escenarios A4 y Bl a B3 y es válida la hipótesis. Por consiguiente, como se señala ya, la presente invención proporciona miembros de unión especifica que comprenden el conjunto definido de CDR, en particular el conjunto de CDR de BAK278D6, y los conjuntos de CDR de linaje de BAK278D6 con una o dos sustituciones dentro del conjunto de CDR, por ejemplo, el conjunto de CDR de BAK502G9. El conjunto pertinente de CDR se proporciona dentro de las regiones de estructura del anticuerpo u otro núcleo molecular de proteína, por ejemplo, fibronectina o citocromo B [115, 116] . De manera preferente, se emplean regiones de estructura de anticuerpo, y donde se emplean son de manera preferente la línea germinal, de manera más preferente la región de estructura de anticuerpo para la cadena pesada puede ser DP14 de la familia de VH1. La región de la estructura preferida para la cadena ligera puede ser ?3-3?. Para el conjunto de CD de BAK502G9, se prefiere que las regiones de estructura de anticuerpo sean para VH FR1, SEQ ID NO: 27, para VH FR2 , SEQ ID NO: 28, para VH FR3 , SEQ ID NO 29, para cadena ligera FR1, SEQ ID NO: 30, para cadena ligera FR2, SEQ ID NO: 31, para cadena ligera FR3 , SEQ ID NO: 32. En una modalidad altamente preferida, se proporciona un dominio VH con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, esto que se llama "dominio VH de BAK502G9" . En una modalidad altamente preferida, adicional, se proporciona un dominio VL con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, esto que se llama "dominio de VL de BAK502G9" . Un sitio de unión a antígeno de anticuerpo altamente preferido proporcionado de acuerdo con la presente invención se compone del dominio VH de BAK502G9, SEQ ID NO: 15, y el dominio VL de BAK502G9, SEQ NO: 16. Este sitio de unión a antígeno de anticuerpo se puede proporcionar dentro de cualquier formato deseado de molécula de anticuerpo, por ejemplo, scFv, Fab, IgG, IgG4, dAb etc, como se analiza adicionalmente en otra parte de la presente. En una modalidad adicional altamente preferida, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo de IgG4 que comprende el dominio VH de BAK502G9, SEQ ID NO: 15, y el dominio VL de BAK502G9, SEQ NO: 16. Esto se llama en la presente wIgG4 de BAK502G9" .

Se proporcionan por la presente invención otras moléculas de IgG4 o otras moléculas de anticuerpo que comprenden el dominio VH de BAK502G9, SEQ NO: 15, y/o el dominio VL de BAK502G9, SEQ NO: 16, como son otras moléculas de anticuerpo que comprenden el conjunto de HCDR de BAK502G9 (SEQ ID NO: 7, 8 y 9) dentro del dominio VH de anticuerpo y/o el conjunto de LCDR de BAK502G9 (SEQ NO: 10, 11 y 12) dentro de un dominio VL de anticuerpo. Es conveniente señalar que aqui "y/o" donde se usa la presente se va a tomar como descripción específica de cada una de las dos características o componentes específicos con o sin el otro. Por ejemplo "A y/o B" se va a tomar como descripción específica de cada uno de (i) A, (ii) B, (iii) A y B, justo como si cada uno se expusiera de forma individual en la presente. Como se señala la presente invención proporciona un miembro específico de unión que se une a IL-13 humana y que comprende el dominio VH de BAK502G9, (SEQ NO: 15) y/o el dominio VL de BAK502G9, (SEQ NO: 16) . En general, un dominio VH se aparea con un dominio VL para proporcionar un sitio de unión a antígeno al anticuerpo, aunque como se analiza más adelante ' en la presente, se puede usar solo un dominio VH para unirse al antígeno. En una modalidad preferida, el dominio VH de BAK502G9, (SEQ NO: 15) se aparea con el dominio VL de BAK502G9, (SEQ NO: 16) , de modo que el sitio de unión a antígeno de anticuerpos se forma comprendiendo ambos dominios VH y VL de BAK502G9. En otras modalidades, el VH de BAK502G9 se aparea con el dominio VL diferente de VL de BAK502G9. Está bien establecida la técnica la promiscuidad de la cadena ligera. De manera similar, se puede proporcionar cualquier conjunto de HCDR del linaje de BAK278D6 en un dominio VH que se usa como un miembro específico de unión solo o en combinación con--un—dominio VL . — Se- puede proporcionar un dominio VH con un conjunto de HCDR de un anticuerpo del linaje de BAK278D6, por ejemplo como se muestra en la Tabla 1, y si este dominio VH se aparea con un dominio VL, entonces el dominio VL se puede proporcionar con un conjunto de LCDR de un anticuerpo de linaje de BAK278D6, por ejemplo, como se muestra en la Tabla 1. Un apareamiento de un conjunto de HCDR y un conjunto de LCDR puede ser como se muestra en la Tabla 1, proporcionando un sitio de unión a antígeno de anticuerpo que comprende un conjunto de CDR como se muestra en la Tabla 1. Las regiones de estructura de los dominios VH y/o VL pueden ser estructuras de línea germinal. Las regiones de estructura del dominio de cadena pesada se pueden seleccionar de la familia de VH-1, y la estructura de VH-1 preferida es la estructura de DP-14. Las regiones de estructura de la cadena ligera se pueden seleccionar de la familia ?3 , y una estructura preferida es ?3 3H. Una o más CDR se pueden tomar del dominio VH o VL de BAK502G9 e incorporar en una estructura adecuada. Esto se analiza adicionalmente en la presente. Las HCDR 1, 2 y 3 de BAK502G9 se muestran en SEQ ID NO: 7, 8 y 9 respectivamente. Las LCDR 1, 2 y 3 de BAK502G9 se muestran en SEQ ID NO: 10, 11 y 12 respectivamente. Lo mismo aplica para las otras CDR del linaje de BAK278D6 y los conjuntos de CDR como se muestra en la Tabla- 1; Las modalidades adicionales de la invención se refieren a un miembro específico de unión que comprende el dominio VH y/o VL, o un sitio de unión a antígeno que comprende la CDR del dominio VH y/o VL de la molécula de anticuerpo descrita en la presente como 167A11 (VH: SEQ ID NO: 23 y VL : SEQ ID NO: 24) y sus derivados 615E3 (VH: SEQ ID NO: 33 y VL: SEQ ID NO: 34) BAK582F7 (VH CDR SEQ ID 141-143) y BAK612B5 (VH CDR SEQ ID 147-149) . Estos reconocen a IL-13 humana. Los derivados de 167A11 de la aleatorización de CDR3 de VH son potentes moléculas de scFv (5-6nM) . El linaje de 167A11 se puede emplear en cualquier aspecto y modalidad de la presente invención como se describe en la presente para otras moléculas, por ejemplo métodos de mutación y selección de sitios de unión a antígeno, con potencia mejorada.

Las variantes de los dominios VH y VL y la CDR de la presente invención, incluyendo aquellas para las cuales se exponen en la presente las secuencias de aminoácidos, y que se pueden emplear en miembros específicos de unión para IL-13 que pueden obtener por medio de métodos de alteración o mutación y detección de secuencias . Estos métodos también se proporcionan por la presente invención. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cualquiera de los dominios VH y VL cuyas secuencias se describen específicamente en la presente se pueden emplear de acuerdo con la presente invención, como se analiza. Las variantes particulares pueden incluir una o más alteraciones de la secuencia de aminoácidos (adición, supresión, sustitución y/o inserción de un residuo de aminoácidos) , pueden ser menor que aproximadamente 20 alteraciones, menor de aproximadamente 15 alteraciones, menor de aproximadamente 10 alteraciones o menor de aproximadamente 5 alteraciones, 4, 3, 2 o 1. Se pueden hacer alteraciones en una o más regiones de estructura y/o una o más CDR. De acuerdo con aspectos adicionales de la presente invención, se proporciona un miembro específico de unión que compite para la unión a antígeno con cualquier miembro, específico de unión que se una tanto el antígeno como comprenda un miembro específico de unión, un dominio VH y/o VL descrito en la presente, o HCDR3 descrita en la presente, o variante de cualquiera de estos. Se puede valorar fácilmente in vi tro la competencia entre los miembros de unión, por ejemplo usando ELISA y/o marcación de una molécula indicadora específica a un miembro de unión que se puede detectar en la presencia de otro miembro de unión no marcado, para permitir la identificación de miembros específicos de unión que se unen al mismo epítope o un epítope de traslapo. - De esta manera, un aspecto adicional de la presente invención proporciona un miembro específico de unión que comprende un sitio de unión a antígeno de anticuerpo humano que compite con una molécula de anticuerpo de BAK5Q2G9, en particular scFv y/o IgG4, para la unión a IL-13. En aspectos adicionales, la presente invención proporciona un miembro específico de unión que comprende un sitio de unión a antígeno de anticuerpo humano que compite con un sitio de unión a antígeno de anticuerpo para la unión a IL-13, en donde el sitio de unión a antígeno de anticuerpo se compone de un dominio VH y un dominio VL, y en donde los dominios VH y VL comprenden un conjunto de CDR de linaje de BAK278D6. Están disponibles varios métodos en la técnica para obtener anticuerpos contra IL-13 y que compite con una molécula de anticuerpo de BAK502G9, una molécula de anticuerpo con un conjunto de CDR de BAK502G9, o una molécula de anticuerpo con un conjunto de CDR de linaje de BAK278D6, para la unión de IL-13. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para obtener uno o más miembros específicos de unión para permitir la unión al antígeno, el método que incluye poner en contacto una biblioteca de miembros específicos de unión de acuerdo con la invención y el antígeno, y seleccionar uno o más miembros específicos de unión de la biblioteca capaces ~de unirse al antígeno. La biblioteca se puede exhibir en la superficie de las partículas de bacteriófago, cada partícula que contiene ácido nucleico que codifica para el dominio variable VH de anticuerpo exhibido en su superficie, y también opcionalmente un dominio VL exhibido, si está presente. Después de la selección de los ' miembros específicos de unión capaces de unirse al antígeno y exhibidos en las partículas de bacteriófago, el ácido nucleico se puede tomar de una partícula de bacteriófago que exhibe un miembro específico de unión seleccionado. Este ácido nucleico se puede usar en la producción subsiguiente de un miembro específico de unión o un dominio variable VH de anticuerpo (opcionalmente un dominio variable VL de anticuerpo) por la expresión de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico tomada de una partícula de bacteriófago que exhibe un miembro específico de unión seleccionado . Un dominio variable VH de anticuerpo con la secuencian de aminoácidos de un dominio variable VH de anticuerpo de un miembro específico de unión seleccionado se puede proporcionar en forma aislada, como puede ser un miembro específico de unión que comprende este dominio VH. Se puede probar adicionalmente la capacidad para la unión a IL-13, también la capacidad para competir con BAK502G9 (por ejemplo, en el- formato scFv y/o~ forma o" "IgG, por ejemplo IgG4) para la unión a IL-13. Se puede probar la capacidad para neutralizar IL-13, como se analiza de manera adicional más adelante. Un miembro específico de unión de acuerdo a la presente invención puede unirse a IL-13 con la afinidad de una molécula de anticuerpo de BAK502G9, por ejemplo scFv, o de manera preferente IgG4 de BAK502G9, o con una afinidad que es mejor. Un miembro específico de unión de acuerdo a la presente invención puede neutralizar IL-13 con la potencia de una molécula de anticuerpo de BA 502G9, por ejemplo scFv, o de manera preferente IgG4 de BAK502G9, o con una potencia que es mejor. Un miembro específico de unión de acuerdo a la presente invención puede neutralizar IL-13 que se presenta de forma natural con la potencia de una molécula de anticuerpo de BAK502G9, por ejemplo scFv, o de manera preferente IgG4 de BAK502G9, o con una potencia que es mejor. La afinidad de unión y la potencia de neutralización de diferentes miembros específicos de unión se pueden comparar bajo condiciones apropiadas. Los anticuerpos de la presente invención tienen varias ventajas con respecto a los anticuerpos anti-IL-13 comerciales - existentes, en particular tres anticuerpos de roedor comerciales anti-IL-13 humana, específicamente JES10-5A2 (BioSource) , B-B13 (Euroclone) y clon 321166 ( &D Systems) . La potencia de los anticuerpos de la presente invención se comparó con anticuerpos comerciales JES10-A2 y B-B13. El clon 321166 no se evaluó puesto que los experimentos anteriores revelaron que este clon no fue considerablemente menos potente que otros anticuerpos comerciales conocidos. La eficiencia y uso de los anticuerpos de roedor comerciales de IL-13 en el hombre se va a limitar probablemente, debido a su potencial incrementado a inducir respuestas inmunogénicas y por lo tanto una depuración más rápida del cuerpo. El análisis cinético de los anticuerpos de la presente invención en primates no humanos sugiere que estos anticuerpos tienen una velocidad de depuración que es similar a aquella de otros anticuerpos humanizados o humanos conocidos . Los anticuerpos proporcionados por varias modalidades de la presente invención reconocen IL-13 de primate no humano, incluyendo IL-13 de rhesus y cynomolgus . La determinación de los perfiles de seguridad y eficiencia de un anticuerpo en primates no humanos es extremadamente valioso puesto que proporciona un medio para predecir la seguridad del anticuerpo, la farmacocinética y el perfil farmacodinámico en humanos. - — Además, los anticuerpos de varias modalidades de la presente invención reconocen adicionalmente la variante IL-13 humana, Q130R, que' está asociada con asma. La reactividad cruzada con IL-13 variante permite que los anticuerpos de la presente invención y las composiciones que comprenden los anticuerpos de la presente invención se usen para el tratamiento de pacientes con IL-13 variante y tipo silvestre. Una modalidad preferida de la presente invención comprende anticuerpos que neutralizan IL-13 que se presenta de forma natural con una potencia que es igual a o mejor que la potencia de un sitio de unión a antígeno de IL-13 formado por el dominio VH BAK502G9 (SEQ ID NO: 15) y el dominio VL de BAK502G9 (SEQ ID NO: 16) . Por ejemplo, los inventores han demostrado que los clones representativos tal como BAK502G9, 1167F2 y 1183H4 son significativamente más potentes contra IL-13 que se presenta de forma natural que los anticuerpos comerciales conocidos (Figura 7) . Además de las secuencias de anticuerpo, un miembro específico de unión de acuerdo a la presente invención puede comprender otros aminoácidos, por ejemplo que forman un péptido o polipéptido, tal como un domino plegado, o para impartir a la molécula otra característica funcional además de la capacidad de unión al antígeno. Los miembros específicos" de unión~de la~ invención pueden tener una marca detectable, o se pueden conjugar a una toxina o una porción o enzima de selección de objetivo (por ejemplo, vía un enlace peptidílico o ligador. En aspectos adicionales, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica para un mimbro de unión específico, dominio VH y/o dominios VL de acuerdo a la presente invención, y métodos para preparar un miembro específico de unión, un dominio VH y/o o dominio VL de la invención, que comprende expresar el ácido nucleico bajo condiciones para dar pie a la producción del miembro específico de unión, dominio VH y/o o dominio VL, y recuperarlo. Los miembros específicos de unión de acuerdo a la invención se pueden usar en un método de tratamiento o diagnosis del cuerpo humano o animal, este método de tratamiento (que puede incluir tratamiento profiláctico) de una enfermedad o trastorno en un paciente humano que comprende administrar al paciente la cantidad efectiva de un miembro específico de unión de la invención. Las condiciones tratables de acuerdo con la presente invención incluyen cualquiera de las cuales IL-13 juega un papel especialmente asma, dermatitis atópica, rinitis alérgica, fibrosis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, esclerodermia, enfermedad inflamatoria del intestino, y linfoma de Hodgkin. Adicionalmente, los anticuerpos de la presente invención también se pueden usar en el tratamiento de tumores e infecciones- virales puesto que estos anticuerpos inhibirán la inmunosupresión mediada por IL-13 [64, 65] . Un aspecto adicional de la presente invención proporciona ácido nucleico, en general aislado, que codifica para un dominio variable VH de anticuerpo y/o dominio variable VL descrito en la presente. Otro aspecto de la presente invención proporciona ácido nucleico, en general aislado, que codifica para la secuencia VH CDR o VL CDR descrita en la presente, especialmente una VH CDR seleccionada de SEQ ID NOs: 7, 8 y 9 o una VL CDR seleccionada de SEQ ID NOs : 10, 11 y 12, de manera más preferente CDR de VH de BAK502G9 (SEQ ID NO: 9) . El ácido nucleico que codifica para el conjunto de CDR de BAK502G9, ácido nucleico que codifica para el conjunto de HCDR de BAK502G9 y ácido nucleico que codifica para el conjunto de LCDR de BAK502G9 también se proporcionan por la presente invención, puesto que estos ácidos nucleicos se codifican para los CDR, HCDR, LCDR individuales y conjuntos de CDR, HCDR, LCDR del linaje de BAK278D6. Un aspecto adicional proporciona una célula hospedera transformada con el ácido nucleico de la invención. Un aspecto aun adicional proporciona un método de producción de un dominio variable VH de anticuerpo, el método que incluye provocar la expresión de la codificación del ácido nucleico. Este método puede comprender cultivar células hospederas bajo condiciones para la producción del dominio variable VH de anticuerpo. Se proporcionan métodos análogos para la producción de dominios variables VL y miembros específicos de unión que comprenden un dominio VH y/o VL como aspectos adicionales de la presente invención. Un método de producción puede comprender un paso de aislamiento y/o purificación del producto. Un método de producción puede comprender formular el producto en una composición que incluya al menos un componente adicional , tal como un excipiente farmacéuticamente aceptable. Estos y otros aspectos de la invención se describen en detalle adicionalmente más adelante Terminología Miembro específico de unión Este describe un miembro de un par de moléculas que tienen especificidad de unión entre sí. Los miembros de un par de unión específico se pueden derivar de forma natural o completamente o parcialmente producidos de forma sintética. Un miembro del par de moléculas tiene un área en VL'~ superficie, o una - cavidad, que ~se~ une ~~~de~ manera específica a, y por lo tanto es complementaria de, una organización polar y espacial, particular del otro miembro del par de moléculas. De esta manera, los miembros del par tienen la propiedad de unión específica entre sí. Los ejemplos de tipos de pares de unión específicos son antígeno-anticuerpo, biotina-avidina, hormona-receptor de hormona, receptor-ligando, enzima-sustrato . La presente invención se refiere a reacciones tipo antígeno-anticuerpo.

Molécula de anticuerpo Esta describe una inmunoglobulina ya sea natural o parcial o completamente producida de forma- sintética. El término también cubre cualquier péptido o proteína que comprende un dominio de unión a anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo que comprenden un dominio de unión a ant geno son moléculas tal como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; y diacuerpos . Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros y usar técnicas de tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que retienen la especificidad del anticuerpo original. Estas técnicas pueden comprender introducir ADN que codifica para región variable de inmunoglobulina, o las regiones de determinación de complementariedad (CDR) , de un anticuerpo a las regiones constantes, o regiones constantes más regiones de estructura, de una diferente inmunoglobulina. Ver por ejemplo EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400, y ün cuerpo grande de literatura subsiguiente. Un hibridoma u otra célula que produce un anticuerpo se puede someter a mutación genética u otros cambios, que pueden alterar o no la especificidad de unión de los anticuerpos producidos. Puesto que los anticuerpos se pueden modificar de varias maneras, el termino "molécula de anticuerpo" se debe considerar como que cubre cualquier miembro específico de unión o sustancia que tiene un dominio de unión a antígeno de anticuerpo con la especificidad requerida. De esta manera, este término cubre fragmentos de anticuerpos y derivados, incluyendo cualquier polipéptido que comprende un dominio de unión a inmunoglobulina, ya sea natural o completa o parcialmente sintético. Las moléculas quiméricas que comprenden un dominio de unión a inmunoglobulina o equivalente fusionadas a otro polipéptido por lo tanto se incluyen. La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describe en EP-0120694 y EP-A-0125023 , y un gran cuerpo de literatura subsiguiente. Adicionalmente , las técnicas disponibles de manejo de anticuerpos han hecho posible aislar anticuerpos humanos y humanizados. Por ejemplo, se pueden elaborar hibridomas humanos como se describe por Kontermann et al [107] . La exhibición en fagos, otra técnica establecida para generar "miembros específicos" de unión se ha descrito en detalle en muchas publicaciones tal como Kontermann et al [107] y WO92/01047 (analizada adicionalmente más adelante) . Los ratones transgénicos en los cuales se inactivan los genes de anticuerpo de ratón y se remplazan funcionalmente con genes de anticuerpo humanos en tanto que dejan intactos otros componentes del sistema inmunitario del ratón, se pueden usar para aislar anticuerpos humanos a antígenos humanos [108] . Se pueden crear moléculas sintéticas de anticuerpo por la expresión de genes generados por medio de oligonucleótidos sintetizados y montados dentro de vectores de expresión adecuados, por ejemplo como se describe por Knappik et al. J. Mol. Biol . (2000) 296, 57-86 o Krebs et al. Journal of Inmunological Methods 254 2001 67-84. Se ha mostrado que los fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de antígenos de unión. Los ejemplos de fragmentos de unión son (i) el fragmento Fab que consiste de los dominio VL, VH, CL y CHl; (ii) el fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CHl; (iii) el fragmento Fv que consiste de los dominios VL VH de un anticuerpo individual; (iv) el fragmento dAb (Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546 (1989), McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554) que consiste de un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados; (vii) molécülas de Fv de cadena individual (scFv) , en donde un dominio VH y un dominio VL se enlazan por un ligador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno (Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988) ; (viii) dímeros de Fv de cadena individual bi-específico (PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos" , fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión génica (WO94/13804; P. Holliger et al, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993) . Moléculas de Fv, scFv o de diacuerpos se pueden estabilizar por la incorporación de puentes de disulfuro que enlazan los dominios VH y VL (Y. Reiter et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996) . También se pueden elaborar minicuerpos que comprenden una scFv unida a un dominio CH3 (S. Hu et al., C ncer Res., 56, 3055-3061, 1996) . Donde se van a usar anticuerpos bi-especificos , estos pueden ser anticuerpos biespecífieos convencionales, que se pueden elaborar de varias maneras (Holliger, P. y 5 Wint e G. Current Opinión Biotechnol . 4, 446-449 (1993)), por ejemplo preparados químicamente por hibridomas híbridos, o pueden ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpo biespecíficos mencionados anteriormente. Los ejemplos de anticuerpos biespecíficos incluyen aquellos de la tecnología ¦10"~ " BiTEMR " en" la cual los dominios de unión de los dos anticuerpos con diferente especificidad se pueden usar y enlazar directamente vía péptidos cortos flexibles. Esto combina dos anticuerpos en una cadena corta individual de polipép ido. Se pueden construir .diacuerpos y scFy sin una 15 región Fe, usando sólo dominios variables, reduciendo potencialmente los efectos de la reacción anti-adiotípica. Los diacuerpos biespecíficos, como lo opuesto a anticuerpos enteros biespecíficos, pueden ser también particularmente útiles debido a que se pueden construir y 20 expresar fácilmente E. coli. Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos tal como fragmentos de anticuerpo) de especificidades de unión apropiadas se pueden seleccionar fácilmente usando exhibición en fagos usando ( O94/13804) a partir de bibliotecas. Si un brazo del diacuerpo se va a 25 mantener constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra IL-13, entonces se puede elaborar una biblioteca donde el otro brazo se varié y se seleccione un anticuerpo de especificidad apropiada. Los anticuerpos enteros y específicos se pueden elaborar por manejo de protuberancias en agujeros (J. B. B. Ridge ay et al, Protein Eng. , 9, 616-621, 1996) .

Dominio de unión a antígeno Esto describe la parte de una molécula de anticuerpo que comprende el área que "se~ une^ de manera específica a y es complementaria de parte o todo un antígeno. Donde un antígeno es grande, un anticuerpo puede unirse sólo a una parte particular del antígeno, parte que se llama un epítope un dominio de unión a antígeno se puede proporcionar por uno o más dominios variables de anticuerpo (por ejemplo un llamado fragmento de anticuerpo Fd que consiste de un dominio VH) . De manera preferente, un dominio de unión a anticuerpo comprende una región variable (VL) de cadena ligera de anticuerpo y una región variable (VH) de cadena pesada de anticuerpo.

Específico Esto se puede usar para referirse a la situación en la cual un miembro de un par específicos de unión no mostrará ninguna unión específica a moléculas diferentes de su(s) compañero (s) específico (s) de unión. El término también es aplicable donde por ejemplo un dominio de unión a antígeno es específico para un epítope particular que se porta por varios antígenos, caso en el cual el miembro específico de unión que tiene el dominio antígeno será capaz de unirse a los varios antígenos que tienen el epítope.

Comprende Esto se usa en general en el sentido de -incluir, es "decir que" " permite " la " presencia de una" o """más características o componentes.

Aislado Esto se refiere al estado en el cual los miembros específicos de unión de la invención, o ácido nucleico que codifica para estos miembros de unión, estarán en general de acuerdo con la presente invención. Los miembros aislados y el ácido nucleico aislado estará libre o sustancialmente libre de material con el cual están asociados de forma natural tal como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los cuales se encuentran en su ambiente natural, o el ambiente en el cual se preparan (por ejemplo, cultivo celular) cuando esta preparación es por tecnología de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo. Los miembros y el ácido nucleico se pueden formular con diluyentes o adyuvantes y aun para propósitos prácticos ser aislados, por ejemplo los miembros normalmente se mezclaran con gelatina u otros portadores si se usan para revestir placas de microtitulo para el uso en inmunoensayos , o se mezclaran con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se usen en diagnosis o terapia. Los miembros específicos de unión se pueden glicosilar, ya sea de forma natural o por sistemas de células eucariotas heterólogas (por ejemplo células CHO o NSO (ECACC 85110503) , o pueden estar no glicosiladas (por ~ ej emplo, si se" producen por la expresión en una célula procariota) .

IL-13 que se presenta de forma natural Esto se refiere en general a un estado en el cual la proteína de IL-13 o fragmento de la misma puede presentarse. IL-13 que se presenta de forma natural significa la proteína de IL-13 que se produce de forma natural por una célula, sin introducción anterior de ácido nucleico de codificación usando tecnología recombinante . De esta manera, IL-13 que se presenta de forma natural puede estar como se produce de forma natural por ejemplo por células T CD4+ y/o como se aisla de un mamífero, por ejemplo, humano, primate no humano, roedor tal como rata o ratón.

IL-13 recombinante Esto se refiere a un estado en el cual la proteína de IL-13 o fragmentos de la misma pueden presentarse. IL-13 recombinante significa proteína de IL-13 o fragmentos de la misma producida por ADN recombinante en un hospedador heterólogo. IL-13 recombinante puede diferir de IL-13 que se presenta de forma natural por glicosilación. Las proteínas recombinantes expresadas en sistemas de expresión bacterianos, procarióticos no se glicosilan en tanto que aquellas expresadas en sistemas eucarióticos tal como células de insecto de mamífero se glicosilan. Las proteínas expresadas en células de insecto difieren sin embargo en la glicosilación de proteína expresadas en células de mamífero. Por "sustancialmente como se dispone" es para querer decir que el dominio de VHL o VL o CDR pertinente de la invención será ya sea idéntico o altamente similar a las regiones especificadas de la cual se expone la secuencia en la presente. Por "altamente similar" se contempla que de 1 a 5, de manera preferente de 1 a 4 tal como de 1 a 3 o de 1 o 2, o 3 o 4, sustituciones de aminoácido se puedan hacer en la CDR y/o dominio VH o VL. La estructura para portar una CDR o un conjunto de CDR de la invención será en general de una secuencia de cadena ligera o pesada de anticuerpo, o porción sustancial de la misma en la cual la CDR o conjunto de CDR se localiza en una ubicación que corresponde a la CDR o conjunto de CDR de los dominio variables VH y VL de anticuerpo que se presentan de forma natural codificados por genes de inmunoglobulina re-arreglados . Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina se pueden determinar por referencia a (Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest . 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987, y "actualizaciones de "lo ""mismo, ahora " disponibles en la Internet (http://inmuno.bme.nwu.edu o encontrar "Rabat" usando cualquier máquina de búsqueda) . La CDR también se puede portar por otros núcleos moleculares tal como fibronectina o citocromo B [115, 116] . De manera preferente, una secuencia de aminoácidos de CDR sustancialmente como se expone en la presente se porta como una CDR en un dominio variable, humano o una porción sustancial del mismo. Las secuencias de HCDR3 sustancialmente como se expone en la presente representa modalidades preferidas de la presente invención y se prefiere que cada una de estas se porte como una HCDR3 en un dominio variable de cadena pesada, humano o una porción sustancial del mismo. Los dominios variables empleados en la invención se pueden obtener de cualquier línea germinal o dominio variable humano rearreglado, o pueden ser un dominio variable sintético en base a secuencia de contexto de dominios variables usados conocidos. Se puede introducir una secuencia de CDR de la invención (por ejemplo, CDR3) en un repertorio de dominios variables que carecen de una CDR (por ejemplo CDR3), usando tecnología de ADN recombinante. Por ejemplo, Marks et al (Bio/Technology, 1992, 10: 779-783) describe métodos para producir repertorios de dominios variables de anticuerpo en los cuales cebadores de consenso dirigidos en o adyacentes al extremo 5' del área del dominio variable se usan en unión con cebadores de consenso la tercera región de estructura de los genes de VH humanos para proporcionar un repertorio de dominios variables VH que carecen de una CDR. Marks et al describe adicionalmente como este repertorio se puede combinar con una CDR3 de un anticuerpo particular. Usando técnicas análogas, las secuencias derivadas de CDR3 de la presente invención se pueden transportar con repertorios de dominios VH o VL que carecen de una CDR3 , y los dominios VH o VL completos transportados se combinan con un dominio VL o VH afín para proporcionar miembros específicos de unión de la invención. El repertorio entonces se puede exhibir en un sistema hospedador adecuado tal como sistema de exhibición en fagos de la WO92/01047 o cualquiera de un cuerpo grande subsiguiente de literatura, que incluye Kay, B. K. , Winter, J., y McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides y Proteins : A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press, de modo que se pueden seleccionar los miembros específicos de unión adecuados. Un repertorio puede consistir de cualquiera de los 104 miembros individuales hacia arriba, por ejemplo de 106 a 108 o 1010 miembros. Otros sistemas hospedadores adecuados incluyen exhibición en levadura, exhibición bacteriana, exhibición en T7, exhibición en ribosomas y así sucesivamente. Para una revisión de la exhibición en "ribosomas ver "Lo e 'D y Jermutus " L, "2004, Curr. Pharm, Biotech, 517-27, también WO92/01047. También se analizan técnicas de combinación de transporte análogas por Stemmer (Nature, 1994, 370^:389-391), que describe la técnica con relación a un gen de ß-lactamasa pero observa que el planteamiento se puede usar para la generación de anticuerpos. Una alternativa adicional es generar unas regiones VH o VL que tienen secuencias derivadas de CDR de la invención usando mutagénesis aleatoria de uno o más genes seleccionados de VH y/o VL para generar mutaciones dentro del dominio variable completo. Esta técnica se' describe por Gram et al (1992, Proc . Nati. Acad. Sci . , USA, £9:3576-3580), quienes usaron PCR propensa a errores. En modalidades preferidas, se elaboran una o dos sustituciones de aminoácidos dentro de un conjunto de HCDR y/o LCDR.

Otro método que se puede usar es dirigir la muta-génesis a regiones de CDR de los genes VH o VL estas técnicas se describen por Barbas et al, (1994, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 91: 3809-3813) y Schier et al (1996, J. Mol. Biol. 263 : 551-567). Todas las técnicas descritas anteriormente se conocen como tales en la técnica y por si mismas no forman parte de la presente invención. Las personas expertas serán capaces de usar estas técnicas para proporcionar miembros específicos de unión de la invención usando metodología de rutina en la técnica. Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para obtener un dominio de unión a antígeno de anticuerpo específico para el antígeno de IL-13, el método que comprende proporcionar por medio de adición, supresión sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH dispuesto en la presente un dominio de VH que es una secuencia de aminoácidos variante del dominio VH, combinando opcionalmente el dominio VH proporcionado de esta manera con uno o más dominios VL, y probando el dominio VH o combinación o combinaciones de VH/VL para identificar un miembro específico de unión o un dominio de unión a antígeno de anticuerpo específico para el antígeno de IL-13 y opcionalmente con una o más propiedades preferidas, de manera preferente Xa capacidad para neutralizar la actividad de IL-13. Este dominio VL puede tener una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente como se expone en la presente . Se puede emplear un método análogo en el cual se combinen una o más variantes de secuencia de un dominio VL con uno o más dominios VH. En una modalidad preferida, el dominio VH de BAK502G9 (SEQ ID NO: 15) se puede someter a mutación para proporcionar una~'o~má¾ variantes de secuencia de aminoácidos de dominio VH y/o VL de BAK502G9 (SEQ ID NO: 16) . Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para preparar un miembro específico de unión específico para el antígeno IL-13, método que comprende: (a) preparar un repertorio de inicio de ácidos nucleicos que codifican para un dominio VH que incluye ya sea una CDR3 que se va a reemplazar o carece de una región de codificación de CDR3. (b) combinar el repertorio con un ácido nucleico donador que codifica para una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se dispone en la presente para una CDR3 de VH tal que el ácido donador se inserte en la región CDR3 en el repertorio, para proporcionar un repertorio de productos de ácidos nucleicos que codifican para un dominio VH; (c) expresar los ácidos nucleicos del repertorio de productos; (d) seleccionar un miembro específico de unión específico para una IL-13; y (e) recuperar el miembro específico de unión o ácido nucleico que lo codifica. Nuevamente, se puede emplear un método análogo en el cual se combine una CDR3 de VL de la invención con un repertorio de ácido nucleicos que codifican para un dominio VL "que incluye ya sea una CDR3 que se va a reemplazar o carece de una región de codificación dé CDR3. De manera similar, una o más, o las tres CDR se pueden injertar en un repertorio de dominios VH o VL que entonces se detectan para un miembro específico de unión o miembros específicos de unión específicos para IL-13. En una modalidad preferida, uno o más de BAK502G9 CDR1 (SEQ ID NO: 7), HCDR2 (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 (SEQ ID NO: 9) , o conjunto de BAK502G9 se pueden emplear, y/o uno o más de LCDR1 de BAK502G9 (SEQ ID NO: 10), LCDR2 (SEQ ID NO: 11), o conjunto de LCDR de BAK502G9. Una porción sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina comprenderá al menos las tres regiones CDR, junto con sus regiones de estructura de intervención. De manera preferente, la porción también incluirá al menos aproximadamente 50 % de cualquiera o ambas de las primera y cuartas regiones de estructura, y el 50 % que es el 50 % de C-terminal de la primera región de estructura y el 50 % en N-terminal de la cuarta región de estructura. Los residuos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal de la parte sustancial del dominio variable pueden se aquellos no asociados normalmente con regiones de dominio variable que se presentan en forma natural. Por ejemplo -la construcción de miembros específicos de unión de la presente invención elaborados por técnicas de ADN recombinante puede dar resultado la introducción de residuos N- o C-terminales codificados por ligadores introducidos para facilitar la clonación u otros pasos de manipulación. Otros pasos de manipulación incluyen la introducción de ligadores para unir dominios variables de la invención a secuencias adicionales de proteína que incluyen cadenas pasadas de inmunogl bulina, otros dominios variables (por ejemplo en la producción de diacuerpos) o marcas de proteína como se analiza en más detalle más adelante en la presente. Aunque en un aspecto preferido de la invención, se prefieren miembros específicos de unión que comprenden un par de dominios VH y VL, los dominios individuales de unión basados en ya sea las secuencias de unión de VH o VL, forman aspectos adicionales de la invención. Se conoce que los dominios de inmunoglobulina individuales, especialmente dominios VH, son capaces de unirse a antígenos objetivo de una manera específica. En el caso de cualquiera de los dominios de unión, específicos, individuales, estos dominios se pueden usar para detectar dominios complementarios capaces de formar un miembro específico de unión de dos dominios capaz de unirse a IL-13. Esto se puede lograr por métodos de detección de exhibición en fagos usando el llamado planteamiento de combinación dual jerárquico como se describe en la WO92/Ó1047, en el cual una colonia individual qué" contiene ya sea un clon de cadena H o L se usa para infectar una biblioteca completa de clones que codifican para la otra cadena (L o H) y el miembro específico de unión, de dos cadenas, resultante, se selecciona de acuerdo con técnicas de exhibición en fagos tal como aquellas descrita en esa referencia. Esta técnica también se describe en arks et al, ibid. Los miembros específicos de unión de la presente invención pueden comprender además regiones constantes de anticuerpo, o partes de las mismas. Por ejemplo, se puede unir un dominio VL en su extremo C-terminal a los dominios constantes de cadena ligera de anticuerpo que incluyen cadenas C O CX humanas, de manera preferente CA. De manera similar, un miembro específico de unión basado en un dominio VH se puede unir en su extremo C-terminal a toda o parte (por ejemplo un dominio CH1) de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE y IgM y cualquiera de la subclase de isotipo, de manera particular IgGl y IgG4. Se prefiere IgG4. Se prefiere IgG4 debido a que no se une y no crea funciones efectoras . Cualquier variante de región sintética constante que tenga estas propiedades y estabilice regiones variables también se prefiere para el uso en modalidades de la presente invención. Los" miembros específicos"de unión dé~Ta invención se pueden marcar con una marca detectable o funcional . Las marcas detectables incluyen radiomarcas tal como 131I o 99Tc, que se pueden unir a anticuerpos de la invención usando química convencional conocida en la técnica de formación de imágenes de anticuerpos. Las marcas también incluyen marcas enzimáticas tal como peroxidasa de rábano. Las marcas incluyen además porciones químicas tal como biotina que se pueden detectar vía unión a una porción detectable específica afín, por ejemplo, avidina marcada. Los miembros específicos de unión de la presente invención se diseñan para ser usados en métodos de diagnosis o tratamiento en sujetos humanos o animales, de manera preferente humanos . Por consiguiente, los aspectos adicionales de la invención proporcionan método y tratamiento que comprenden administración de un miembro específico de unión como se proporciona, composiciones farmacéuticas que comprenden este miembro especifico de unión, y el uso de este miembro específico de unión en la elaboración de medicamento para administración, por ejemplo, en un método para elaborar un medicamento o composición farmacéutica que comprende formular el miembro específico de unión con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las indicaciones clínicas en las cuales se puede usar un anticuerpo anti-IL-13 para proporcionar un beneficio terapéutico que incluye asma, dermatitis atópica, rinitis alérgica, fibrosis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica enfermedad inflamatoria de intestino, esclerodermia y linfoma de Hodgkin. Como ya se explica, el tratamiento anti-IL-13 es efectivo para todas estas enfermedades. El tratamiento anti-IL-13 se puede dar de forma oral, por inyección (por ejemplo, de forma subcutánea, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular) , por inhalación, o de forma tópica (por ejemplo, intraocular, intranasal, rectal, en heridas, en piel) . La ruta de administración se puede terminar por las características fisicoquímicas del tratamiento, por consideraciones especiales para la enfermedad o por el requerimiento para optimizar la eficacia o para reducir al mínimo los efectos secundarios.

Se contempla que el tratamiento anti-IL-13 no se restringirá al uso en la clínica. Por lo tanto, también se prefiere inyección subcutánea usando un dispositivo libre de aguja. Se pueden usar tratamientos de combinación para proporcionar efecto sinérgico significativo, particularmente la combinación de un miembro específico de unión anti-IL-13 con uno o más fármacos diferentes. Un miembro específico de unión de acuerdo a la presente invención se puede proporcionar en combinación" o^ en adición a beta-agonistas de acción breve o prolongada, corticosteroides, cromoglicato, antagonistas de leucotrieno leucotrieno (receptor) , metil-xantinas y sus derivados, inhibidores de IL-4, antagonistas de receptor muscarínico, inhibidores de IgE, inhibidores histamínicos , inhibidores de IL-5, inhibidores de eotaxina/CCR3 , inhibidores de PDE4, antagonistas de TGF-beta, interferón-gamma, perfenidona, agentes quimioterapéuticos y agentes inmunoterapeuticos. El tratamiento de combinación con uno o más beta-agonistas de acción breve o prolongada, corticosteroides, cromoglicato, antagonistas de leucotrieno (receptor) , xantinas, inhibidores de IgE, inhibidores de IL-4, inhibidores de IL-5, inhibidores de eotaxina/CCR3 , inhibidores de PDE4 se pueden emplear para tratamiento de asma. Los anticuerpos de la presente invención también se pueden usar en combinación con corticosteroides, anti-metabolitos, antagonistas de TGF-beta y su ruta de señalización en etapas posteriores, para el tratamiento de fibrosis. Terapia de combinación de estos anticuerpos con inhibidores de PDE4 xantinas y sus derivados, antagonistas de receptor muscarínico, beta-antagonistas breves y prolongados pueden ser útiles para tratar enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Aplica consideración similar de combinaciones al uso de tratamiento anti-IL-13 para dermatitis atópica, rinitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad inflamatoria de intestino, esclerodermia y linfoma de Hodgkin. De acuerdo con la presente invención, las composiciones proporcionadas se pueden administrar a individuos. La administración es de manera preferente en una "cantidad terapéuticamente efectiva", esto que es suficiente para mostrar beneficio a un paciente. Este beneficio puede ser al menos mejora de al menos un síntoma. La cantidad real administrada, y la velocidad y transcurso de tiempo de administración, dependerá de la naturaleza y seguridad de lo que se este tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, decisiones en cuanto a la dosis, etc, está dentro de la responsabilidad de los practicantes generales y otros doctores médicos. Son bien conocidas las dosis apropiadas de anticuerpo en la técnica; ver Ledermann J.A. et al. (1991) int. J. Cáncer 47: 659-664; Bags awe . D. et al . (1991) Antibody Inmunoconjugates and Radiofarmaceuticals 4: 915-922. La dosis precisa dependerá de varios factores, que incluyen si el anticuerpo es para diagnosis o para tratamiento, el tamaño y ubicación del área que se trate, la naturaleza precisa del anticuerpo (por ejemplo en anticuerpo entero, fragmento, diacuerpo) , y la naturaleza de cualquier marca detectable u otra molécula unida al anticuerpo. Una cVosis^típica de ' anticuerpo estará^en el intervalo de 100 µg a 1 gm para aplicaciones sistémicas, y 1 µg a 1 mg para aplicaciones tópicas. Típicamente, el anticuerpo será un anticuerpo entero, de manera preferente el isotipo IgG4. Esto es una dosis para un tratamiento individual de un paciente adulto, que se puede ajustar en proporción para niños e infantes, y también ajustar para otros formatos de anticuerpos en proporción al peso molecular. Los tratamientos se pueden repetir diario, dos veces por semana, semanalmente o en intervalos mensuales, a la discreción del facultativo. En modalidades preferidas de la presente invención, el tratamiento es periódico y el periodo entre las administraciones es de aproximadamente dos semanas o más, de manera preferente aproximadamente tres semanas o más, de manera preferente aproximadamente cuatro semanas o más, o aproximadamente un mes.

Los miembros específicos de unión de la presente invención usualmente se administrarán en la forma de una composición f rmacéutica, que puede comprender al menos un componente además de miembro específico de unión. De esta manera, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención, y para el uso de acuerdo con la presente invención, pueden comprender, además del ingrediente activo un excipiente, portador, amortiguador, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estos materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador u otro material dependerá de la ruta de administración, que puede ser oral, o por inyección, por ejemplo intravenosa. Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden estar en la forma de tableta, cápsula, polvo o líquido. Una tableta puede comprender un portador sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas comprenden en general un portador líquido tal como agua, petróleo, aceite vegetal o de animal, aceite mineral o aceite sintético. La solución salina fisiológica, solución de dextrosa u otro sacárido, o glicoles tal como etilenglicol , pro ilenglicol o polietilenglicol , se pueden incluir.

Para inyección intravenosa, o inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que está libre de pirógenos y tiene pH adecuado, isotonicidad adecuada y estabilidad adecuada. Aquellos expertos en la técnica serán capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tal como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección Lactada de Ringer. Conservadores, estabilizadores, amortiguadores, ~"ántioxidantes y/o otros aditivos se puedén""incluir, como se requiera . Se puede administrar una composición sola o en combinación con otros tratamientos, ya sea de forma simultánea secuencial dependiendo de la condición que se trate. Los miembros específicos de unión de la presente invención se pueden promulgar en formas líquida o sólida dependiendo de las propiedades físico-químicas de la molécula y la ruta de distribución. Las formulaciones pueden incluir excipientes o combinaciones de excipientes, por ejemplo: azucares, aminoácidos y agentes tensioactivos . Las formulaciones líquidas pueden incluir una amplia variedad de concentraciones de anticuerpo y pH. Las formulaciones sólidas se pueden producir por liofilización, secado por aspersión, o secado por tecnología de fluido supercrítico, a manera de ejemplo. Las formulaciones anti-IL-13 dependerán de la ruta propuesta de distribución; por ejemplo, formulaciones para distribución pulmonar pueden consistir de partículas con propiedades físicas que aseguren la penetración en el pulmón profundo en la inhalación; formulaciones tópicas pueden incluir agentes de modificación de viscosidad, que prolonguen el tiempo que el fármaco está residente en el sitio de acción. La presente invención proporciona un método que comprende provocar o permitir la unión de un miembro específico de- unión como se proporciona en la presente a IL-13. Como se señala esta unión puede tomar lugar in vivo, por ejemplo, después de la administración de un miembro específico de unión, o ácido nucleico que codifica para un miembro específico de unión, o puede tomar lugar in vitro, por ejemplo en ELISA, transferencia Western, inmunocitoquímica, inmunoprecipitación, cromatografía de afinidad, o ensayos basados en células tal como un ensayo TF-1. La cantidad de unión del miembro específico de unión a IL-13 se puede determinar. La cuantificación se puede relacionar a la cantidad del antígeno en una muestra de prueba, que puede ser de interés de diagnóstico. Un equipo que comprende un miembro específico de unión o moléculas de anticuerpo de acuerdo con cualquier aspecto o modalidad de la presente invención también se proporciona como un aspecto de la presente invención. En un equipo de la invención, el miembro específico de unión o molécula de anticuerpo se pueden marcar para permitir que su reactividad en una muestra se determine, por ejemplo, como se describe más adelante en la presente . Los componentes de un equipo en general son estériles y en frascos sellados u otros recipientes. Se pueden emplear equipos en análisis de diagnostico u otros métodos para los cuales son útiles las —mol-éculas —de -anticuerpo"."' - Un equipo- ¦ puede contener instrucciones para el uso de los componentes en un método, por e emplo un método de acuerdo con la presente invención. Los materiales auxiliares para ayudar o permitir a la realización de este método se pueden incluir dentro de un equipo de la invención. Las reactividades de los anticuerpos en una muestra se pueden determinar por cualquier medio apropiado. El radioinmunoensayo (RIA) es una posibilidad. El antígeno marcado radioactivo se mezcla con un antígeno no marcado (la muestra de prueba) y se permite unir al anticuerpo. El antígeno unido se separa físicamente del antígeno no unido y se determina la cantidad del antígeno radioactivo unida al anticuerpo. Entre más antígeno esté en la muestra de prueba menos antígeno radioactivo se unirá al anticuerpo. También se puede usar un ensayo de unión competitiva con antígeno no radioactivo, usando antígeno o un análogo enlazado a una molécula indicadora. La molécula indicadora puede ser un fluorocromo, fósforo o tinte de láser con características de absorción o emisión espectralmente aisladas. Los fluorocromos adecuados incluyen fluoresceína, rodamina, ficoeritrina y rojo de tejas. Los tintes cromogénicos adecuados incluyen diaminobenzidina . Otros indicadores incluyen partículas coloidales macromoleculares o material en forma de partículas tal como cuentas "" de "látex que se colorean, son magnéticas o paramagnéticas y agentes biológica o químicamente activos, que pueden provocar directa o indirectamente señales detectables que son observables visualmente, detectables electrónicamente o se registran de otra manera. Estas moléculas pueden ser enzimas que catalizan reacciones que desarrollan o cambian colores o provocan cambios en las propiedades eléctricas, a manera de ejemplo. Pueden ser moleculármente excitables, tal que las transiciones electrónicas entre los estados de energía dan por resultado absorciones o emisiones espectrales características. Pueden incluir entidades químicas usadas en unión con biosensores . Se pueden emplear sistemas de detección de biotina/avidina o biotina/estreptavidina y fosfatasa alcalina. Las señales generadas por conjugados de anticuerpo individual-indicador se pueden usar para derivar datos cuantificables absolutos o relativos de la unión del anticuerpo pertinente en las muestras (normal y de prueba) . La presente invención también proporciona el uso de un miembro específico de unión como antes para medir los niveles de antígeno en un ensayo de competición, es decir un método para medir el nivel de antígeno de una muestra al emplear un miembro específico de unión como se proporciona por la presente invención en un ensayo de competición. Esto se puede hacer donde no se requiera la separación física del -antígeno"" unido del no "unido. El enlace de una molécula indicadora al miembro específico de unión de modo que exista una posibilidad que se presenten en la unión un cambio físico u óptico. La molécula indicadora puede generar directa o indirectamente señales detectables y de manera preferente medíbles. El enlace de las moléculas indicadoras puede ser directa o indirectamente, de forma covalente, por ejemplo, vía un enlace peptídico o de manera no covalente. El enlace vía un enlace peptídico puede ser como resultado de expresión recombinante de una fusión génica que codifica para el anticuerpo y la molécula indicadora. La presente invención también proporciona para medir niveles de antígeno directamente, al emplear un miembro específico de unión de acuerdo a la invención, por ejemplo, en un sistema de biosensor. El modo para determinar la unión no es una característica de la presente invención y aquellos expertos en la técnica serán capaces de elegir un modo adecuado de acuerdo a su preferencia y conocimiento general . Como se señala, en varios aspectos y modalidades, la presente invención se extiende a un miembro específico de unión que compite para la unión a IL-13 con cualquier miembro específico de unión definido en la presente, por ejemplo IgG4 de BAK502G9. La competición entre los miembros de unión se puede valorar fácilmente i vitro, por ejemplo, - al- marcar una molécula indicadora específica a~ un miembro de unión que se puede detectar en la presencia de otros miembros de unión no marcados, para permitir la identificación de miembros específicos de unión que pueden unirse al mismo isotipo o un epítope de traslapo. Se puede determinar la competencia, por ejemplo, usando a ELISA en la cual se inmoviliza IL-13 a una placa y se adiciona a la placa un primer miembro de unión marcado junto con uno o más miembros de unión, no marcados. Se observa la presencia de un miembro de unión no marcado que compite con el miembro de unión marcado por una disminución en la señal emitida por el miembro de unión marcado. En la prueba para la competencia, se puede emplear un fragmento de péptido del antígeno, especialmente un péptido que incluye un epítope de interés . Un péptido que tiene la secuencia de epítope más uno o más aminoácidos en cualquier extremo, se puede usar. Este péptido se puede decir que "consiste esencialmente" de la secuencia especificada. Los miembros específicos de unión de acuerdo a la presente invención pueden ser tales que se inhibe su unión para el antígeno por un péptido con o que incluye la secuencia dada. En la prueba para esto, se puede usar un péptido con cualquier secuencia más uno o más aminoácidos . Los miembros específicos de unión que se unen a un péptido específico sé pueden" aislar pór^ejemplo a~partir de una biblioteca de exhibición en fagos al desplazarse con el (los) péptido (s). La presente invención proporciona además un ácido nucleico aislado que codifica para un miembro específico de unión de la presente invención. El ácido nucleico puede incluir ADN y/o ARN . En un aspecto preferido, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica para una CDR o un conjunto de CDR o dominio VH o dominio VL o sitio de unión a antígeno de anticuerpo o molécula de anticuerpo, por ejemplo scFv o IgG4, de la invención como se define anteriormente. La presente invención también proporciona construcciones en la forma de plásmidos, vectores, cartuchos de trascripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido como antes.

La presente invención también proporciona una célula hospedera recombinante que comprende una o más construcciones como antes. Un ácido nucleico que codifica para cualquier CDR o conjunto de CDR o dominio VH o dominio VL o sitio de unión a antígeno de anticuerpo o molécula de anticuerpo, por ejemplo, scFv ó IgG4 como se proporciona, forma por sí mismo un aspecto de la presente invención, como lo hace un método de producción del producto codificado, método que comprende la expresión del ácido nucleico de codificación para el mismo. La expresión se puede lograr de manera conveniente al cultivar bajo condiciones apropiadas células hospederas recombinantes que contienen el ácido nucleico. Después de la producción por expresión de un dominio VH o VL, o miembro específico de unión se puede aislar y/o purificar usando cualquier técnica adecuada, entonces se usa como es apropiado. Los miembros específicos de unión, dominios de VH y/o VL, y moléculas de ácido nucleico de codificación y vectores de acuerdo con la presente invención se pueden proporcionar aislados y/o purificados, por ejemplo, de su ambiente natural, en forma sustancialmente pura u homogénea, o, en el caso de ácido nucleico, libres o sustancialmente libres de ácido nucleico o genes de origen diferente de la secuencia que codifica para un polipéptido con la función requerida. El ácido nucleico de acuerdo a la presente invención puede comprender ADN, o ARN o puede ser completa o parcialmente sintético. La referencia a una secuencia de nucleótidos como se expone en la presente abarca una molécula de ADN con la secuencia especificada, que abarca una molécula de ARN con la secuencia especificada en la cual U se sustituye por T, a menos que el contexto requiera lo contrario. Los sistemas para clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de diferentes células hospederas son bien conocidos. Las células hospederas adecuadas incluyen bacterias, células de mamífero, células vegetales, sistemas de levadura y baculovirus y plantas y animales transgénicos . Las líneas de células de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster Chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámster neonato, células de melanoma de ratón NSO, células de mieloma de rata YB2/0, células de riñón embriónicas, humanas, células de retina, embriónicas humanas y muchas otras. Un hospedador bacteriano preferido común es E. coli . La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo en células procarióticas tal como E. coli está bien establecida en la técnica. Para una revisión, ver, por ejemplo Plückthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). La expresión en células eucarióticas en cultivo también está disponible para aquellos expertos en la técnica como una opción para la producción de un miembro especifico de unión por ejemplo Chadd He Chamow SM (2001) 110 Current Opinión in Biotechnology 12: 188-194, Anderson DC y Krummen L (2002) Current Opinión in Biotechnology 13: 117, Larrick JW y Thomas DW (2001) Current opinión in Biotechnology 12:411-418. Los vectores adecuados se pueden elegir o construir, conteniendo secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias intensificadoras, genes marcadores y otras secuencias como sea apropiado los vectores pueden ser plásmidos, virales por ejemplo fagos o fágomidos, como sea apropiado, Para detalles adicionales, ver, por ejemplo Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Sambrook y ussell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press . Muchas técnicas y protocolos conocidos para manipulación de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John iley & Sons, 1988, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al . eds., John Wyley & Sons, 4th edition 1999. Las descripciones de Sambrook et al., y Ausubel et al. (ambas) se incorporan en la presente como referencia. De esta manera, un aspecto adicional de la presente invención proporciona una célula hospedera que contiene ácido nucleico como se describe en la presente. Esta célula hospedera puede estar in vitro o estar en cultivo. Esta célula hospedera puede estar in vivo. La presencia in vivo de la célula hospedera puede permitir la expresión intracelular de los miembros específicos de unión de la presente invención como "intracuerpos" o anticuerpos intracelulares . Se pueden usar intracuerpos para terapia génica [112] . Un aspecto aun adicional proporciona un método que comprende introducir ácido nucleico en una célula hospedera. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para células eucarióticas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia o para células de insecto, baculovirus . La introducción de ácido nucleico en la célula hospedera, en particular una célula eucariótica puede usar un sistema basado en plásmidos o sistema viral. El sistema de plásmido se puede mantener en forma episomal o se puede incorporar en la célula hospedera o en un cromosoma artificial [110, 111] . La incorporación puede ser ya sea por integración aleatoria o dirigida al objetivo de una o más copias en sitios individuales o múltiples. Para células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófagos. La introducción se puede seguir al provocar la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, al cultivar células hospederas bajo condiciones para la expresión del gen. En una modalidad, el ácido nucleico de la invención se integra en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula hospedera. La integración se puede promover por inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con técnicas normales. La presente invención también proporciona un método que comprende usar una construcción como se señala anteriormente en un sistema de expresión a fin de expresar un miembro específico de unión o polipeptido como antes. Los aspectos y modalidades de la presente invención ahora se ilustrarán a manera de ejemplo con referencia a la siguiente experimentación.

Ejemplo 1 Aislamiento de scFv de anti-IL-13 Repertorio de anticuerpo scF Una biblioteca grande de anticuerpos humanos de Fv de cadena individual (scFv) liberada de linfocitos de bazo de 20 donadores y clonados en un vector de fagómido se usó para las selecciones [66] .

Selección de scFv Se aislaron scFv que reconocieron IL-13 de bibliotecas de exhibición en fagos en una serie de ciclos repetidos de selección en IL-13 humana o murina, recombinante, bacterialmente derivada (Peprotech) esencialmente como se describe en [67] . En resumen, después de la incubación con la biblioteca, el antígeno inmovilizado, que se ha pre-acoplado a las cuentas paramagnéticas , y el fago unido se recuperaron por separación magnética en tanto que se lava el fago no unido. Entonces el fago unido se rescata como se describe por Vaughan et al [67] y se repite el proceso de selección. Se usaron diferentes superficies sólidas y diferentes métodos de captura en diferentes rondas de selección para reducir la unión no específica. El antígeno ya sea se acopló covalentemente a las cuentas (ácido carboxílico Dynabeads -270) o se modificó por biotinilación antes de la captura secundaria por cuentas revestidas con estreptavidina (Dynabeads M-280) de acuerdo a los protocolos del fabricante (Dynal) . Una proporción representativa de clones del resultado de las rondas de selección se sometió a secuenciación de ADN, como se describe en Vaughan et al [67] y Osbourn et al [70] . Se valoraron clones únicos para su capacidad para neutralizar IL-13 como preparaciones purificadas de scFv en ensayos de proliferación celular dependientes de IL-13. Se crearon bibliotecas de exhibición en ribosomas y se detectaron para scFv que reconocieron específicamente IL-13 humana o murina, recombinante, bacterialmente derivada (Peprotech) , esencialmente como se describe en Hanes et al [113] . Inicialmente, el clon guía de BAK278D6 ' de las selecciones iniciales se convirtió al formato de exhibición en ribosomas, y esta plantilla se usó subsiguientemente para creación de la biblioteca. Al nivel de ADN, se adicionó un promotor T7 en el extremo 5' para trascripción eficiente a ARNm. Al nivel de ARNm, la construcción contuvo un sitio de unión al ribosoma procariótico (secuencia de Shine-Dalgarno) . En el extremo 3' de la cadena individual, se removió el codón finalizador y una porción de gilí (gen III) se adicionó para actuar como un separador [113] . Las bibliotecas de exhibición en ribosoma derivadas de BAK278D6 se crearon por mutagénesis de regiones de determinación de complementariedad (CDR) de anticuerpo donde se realizaron reacciones de PCR con Taq-poli erasa no a prueba de lectura. Se realizaron de este modo selecciones basadas de afinidad, después de la incubación con la biblioteca, la IL-13 humana, biotinilada se capturó por cuentas paramagnéticas revestidas con es reptavidina (Dynal M280) y complejos terciarios unidos (RMNm-ribosomas-scFv-IL-13) se recuperaron por separación magnética en tanto que se lavaron los complejos no unidos. Entonces se recuperó el ARNm que codifica para las scFv unidas por RT-PCR como se describe en Hanes et al [113] y el proceso de selección se repitió con concentraciones decrecientes (????? - ????? durante 5 rondas) de IL-13 humana biotinilada presente durante la selección. También se usó PCR propensa a error para incrementar adicionalmente el tamaño de la biblioteca. Se emplearon tres intensidades de error (2.0, 3.5 y 7.2 mutaciones por 1,000 pb después de la reacción normal de PCR, como se describe en el protocolo de fabricante (Clontech) ) durante el régimen de selección. Las reacciones de PCR propensas a error, iniciales tomaron lugar antes de las selecciones de la ronda uno comenzadas en ?????. Se realizó una ronda subsiguiente de PCR propensa a error antes de las selecciones de la ronda tres en IL-13 humana, biotinilada 10nM. Como antes, una proporción representativa de clones del resultado de las rondas de selección se sometió a secuenciación de ADN como se describe en Vaughan et al [67] y Osbourn et al [70] . Se valoraron clones únicos para su capacidad para neutralizar IL-13 como preparaciones purificadas de scFv en ensayos de proliferación celular dependientes de IL-13.

Ejemplo 2 Potencia de neutralización de scFv anti-IL-13 en el ensayo de proliferación celular TF-1 dependiente de IL-13 La potencia de neutralización de preparaciones purificadas de scFv contra bioactividad IL-13 humana y murina se aloró usando ensayo de proliferación de células TF-1. Se prepararon preparaciones purificadas de scFv como se describe en el Ejemplo 3 de la WOO1/66754. Se determinaron las concentraciones de proteína de preparaciones purificadas de scFv usando un método de BCA (Pierce) . La TF-1 es una línea de células pre-mieloides humanas, establecida de un paciente con eritroleucemia [68] . La línea de células TF-1 es dependiente de factor para supervivencia y proliferación. A este respecto, las células TF-1 respondieron ya sea a IL-13 humana o murina [69] y se mantuvieron en medio que contiene GM-CSF humano (4 ng/ml, R&D Systems) . Se determinó la inhibición de proliferación dependiente de IL-13 al medir la reducción en la incorporación de timidina tritiada en el ADN recién sintetizado de células eñ división.

Protocolo de ensayo de células TF-1 Se obtuvieron células TF-1 de R& Systems y se mantuvieron de acuerdo a los protocolos suministrados . El medio de ensayo comprendió RPMI-1640 con GLUTAMAX I (Invitrogen) que contiene suero bovino fetal al 5 % (JRH) y piruvato de sodio al 1 % (Sigma) . Antes de cada ensayo, se sedimentaron las células TF-1 por centrifugación a 300 x g durante 5 minutos, los medios se recuperaron por aspiración y las células ser redispersaron en el medio de ensayo. Este proceso se repitió dos veces con células dispersadas a una concentración final de 105 células/ml en medio de ensayo. Las soluciones de prueba del anticuerpo (en triplicado) se diluyeron a la concentración deseada en el medio de ensayo. Se usó un anticuerpo irrelevante no dirigido a IL-13 como un control negativo. Se adicionó IL-13 humana o murina, recombinante, bacterianamente derivada (Peprotech) a una concentración final de 50 ng/ml cuando se mezcla con el anticuerpo de prueba apropiado en un volumen total de 100 µ?/cavidad en una placa de ensayo de 96 cavidades. La concentración de IL-13 usada en el ensayo se seleccionó como la dosis que a la concentración final de ensayo da aproximadamente 80 % de respuesta prolif rativa máxima. Todas las muestras se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces se adicionaron 100 µ? de células suspendidas a cada punto de ensayo para dar un volumen total de ensayo de 200 µ?/cavidad. Las placas de ensayo se incubaron durante 72 horas a 37°C bajo C02 al 5 %. Entonces se adicionaron 25 µ? de timidina tritiada (10 µa/ml, NEN) a cada punto de ensayo y las placas de ensayo se regresaron al incubador durante 4 horas adicionales . Las células -se recolectaron en placas' "filtro de fibra de vidrio (Perkin Elmer) usando un recolector celular. Sé determinó la incorporación de timidina usando un contador de escintilación líquida, de microplaca Packard TopCount. Los datos se analizaron usando el programa Graphpad Prism.

Resultados A pesar de los ciclos alternantes de selección entre antígeno humano y murino, no se obtuvieron anticuerpos neutralizantes de reactividad cruzada. Dos distintas scFv neutralizantes anti-IL-13 humana y anti-IL-13 murina se obtuvieron de las selecciones BAK278D6 (VH SEQ ID NO: 13; VL SEQ ID NO: 14) y BAK167A11 (VH SEQ ID NO: 23; VL SEQ ID NO: 24) reconocieron IL-13 humana en tanto que BAK209B11 (VH SEQ ID NO: 25; VL SEQ ID NO: 26) reconocieron IL-13 murina. BA 278D6 (Figura 2) y BAK167A11 (Figura 1) como scFv neutralizaron 25 ng/ml de IL-13 humana con IC50 de 44 nm y 111 nM respectivamente. BA 209B11 (Figura 3) como una scFv neutralizó 25 ng/ml de IL-13 murina con una IC50 de 185 nm.

Ejemplo 3 Potencia de neutralización de clones guía a partir de optimización seleccionada como objetivo de CDR3 de cadena pesada de clones de origen en el ensayo de proliferación de células TF-1 dependiente de IL-13 -- -Osbourn -~et al.— [70]— ha demostrado que la mutagénesis seleccionada como objetivo de los residuos dentro de CDR3 de cadena pesada puede mejorar significativamente la afinidad de los anticuerpos. Se realizaron selecciones como se describe en el Ejemplo 1, en repertorios de scFv en los cuales se han aleatorizado por mutagénesis los residuos dentro de la CDR3 de cadena pesada de BAK278D6 (SEQ ID NO: 6) BAK167A11 (SEQ ID NO: 57) se identificaron clones únicos del resultado de selección por secuenciación de ADN y su potencia de neutralización se valoró como scFv en el ensayo de proliferación de células TF-1, como se describe en el Ejemplo 2.

Resultados Se lograron ganancias significativas en la potencia para ambos linajes. Los clones más potentes de linaje de BAK167A11 fueron BAK615E3, BAK612B5 y BAK582F7 que como scFv tiene IC50 de 3 nM (Figura 1), 6.6 nm, 6.65 n respectivamente contra 25 ng/ml de IL-13 humana en ensayo de proliferación de células TF-1. Del linaje de BAK278D6, el clon más potente fue BAK502G9, que como scFv tiene IC50 de 8 nM contra 25 ng/ml de IL-13 · humana en el ensayo de proliferación de células TF-1 (Figura 2) .

Ejemplo 4 - -Potencia—de- neutralrzación de los 'lina es" de BAK167A11 y BAK278D6 contra IL-13 de primate no humano y una variante de IL-13 asociada con asma en el ensayo de ~ proliferación de células dependiente de factor TF-1 Ninguno de los linajes de neutralización de IL-13 humanos, BAK167A11 y BAK278D6 fue de reactividad cruzada murina. Por lo tanto, los inventores decidieron de los siguientes criterios para el linaje seleccionado para optimización adicional y desarrollo clínico: debe ser de manera preferente de reactividad cruzada con IL-13 de primate no humano y debe reconocer una variante de IL-13, en la cual arginina en el aminoácido en la posición 130 se sustituye por glutamina (Q130R) . Esta variante se ha asociado de forma genética con asma y otras enfermedades alérgicas [37, 39, 41, 71] . La reactividad cruzada se determinó por la capacidad de las preparaciones purificadas de scFv para unirse a IL-13 de primate no humano y variante de IL-13 por análisis de resonancia de plasmon superficial (BIAcore) . Se determinó la actividad funcional usando el ensayo de proliferación de células TF-1.

Producción de IL-13 tipo silvestre, variante y de primate no humano Se obtuvo un ADNc para IL-13 humana tipo silvestre de InvivoGen y se modificó por mutagénesis dirigida al sitio (equipo Stratagene Quikchange ) para producir un ADNc que codifica para IL-13 variante. La secuencia de codificación tanto para IL-13 de mono rhesus y cynomolgus se obtuvo por PCR en plantilla genómica de ADN usando cebadores degenerados en base a la secuencia de IL-13 humana. Ambas secuencias de primate no humano (rhesus y cynomolgus) fueron idénticas entre sí pero difirieron de la IL-13 humana por siete aminoácidos (Figura 19) . Se expresaron de manera subsiguiente IL-13 recombinante, tipo silvestre, variante y de primate no humano usando el sistema de expresión de baculovirus (Invitrogen) . Las construcciones de expresión adicionaron una marca de afinidad de término carboxilo a la proteína expresada que permitió la purificación del medio acondicionado de células de insecto a casi homogeneidad.

Ensayo de unión cualitativa usando BIAcore La afinidad de unión de las preparaciones purificadas de scFv a IL-13 de primate no humano, variante y tipo silvestre, se determinó por mediciones de resonancia de plasmon superficial usando un Biosensor BIAcore 200 (BIAcore AB) como se describe en Karlsson et al [72] . En resumen, se acopló IL-13 a circuitos sensores CM5 usando un equipo de acoplamiento de amina (BIAcore) a una densidad superficial de aproximadamente 200Ru y tres concentraciones de scFv de prueba-" (aproximadamente 350 nM, 175 nM y 88 nM) en amortiguador HBS-EP pasado sobre la superficie del circuito sensor. Se evaluaron los sensorgramas resultantes usando el programa BIA evaluation BIA 3.1 para proporcionar datos de unión relativa.

Protocolo de ensayo de TF-1 El ensayo se realizó de manera esencial como se describe en el Ejemplo 2 con las siguientes modificaciones: se usaron IL-13 de primate no humano, IL-13 variante humana (Q130R) e IL-13 humana tipo silvestre a concentraciones de 50 ng/ml, 25 ng/ml y 25 ng/ml respectivamente.

Resultados Los datos del ensayo de unión BIAcore sugirieron que el linaje BAK278D6 pero no de BAK167A11 tuvieron el perfil requerido de reactividad cruzada para desarrollo terapéutico adicional (Tabla 2) . Este hallazgo se soportó por datos de bioensayo que demuestran que BA 778D6 (Figura 4) y BAK502G9 (Figura 6) fueron capaces de neutralizar IL-13 humana, la variante de IL-13 humana (Q130R) e IL-13 de primate no humano en el ensayo de proliferación de células TF-1 con casi potencia equivalente. En contraste, aunque BAK615E3 (VH SEQ ID NO: 33; VL SEQ ID NO: 34) tubo una potencia significativamente incrementada contra IL-13 humana -con respecto a su""BAK167All de" origen "(VH SEQ ID "NO":" 23; VL SEQ ID NO: 24) en el ensayo de proliferación de células TF-1 (Figura 1) , ningún clon se unió a IL-13 de primate no humano o variante en el ensayo de unión BIAcore.

Regiones de estructura de línea germinal de BAK278D6 y BAK5Q2G9 La secuencia de aminoácido derivada de VH de BAK278D6 (SEQ ID NO: 13) y VL (SEQ ID NO: 14) se alinearon a las secuencias de línea germinal, humanas, conocidas en la base de datos VBASE [73] y la línea germinal más cercana se identificó por similitud de secuencia. La línea germinal más cercana para el dominio VH de BAK278D6 (SEQ ID NO: 14) y sus derivados, se identificó como DP14, un miembro de la familia VH1. El VH de BAK278D6 tiene 9 cambios de la línea germinal DP14 dentro de las regiones de estructura. La línea germinal más cercana para el VL de la BAK278D6 se identificó como ??3 3h. El dominio VL de BAK278D6 (SEQ ID NO: 14) tubo sólo 5 cambios de la línea germinal dentro de las regiones de estructura. Las regiones de estructura de BAK278D6 y sus derivados se regresaron a la linea germinal por mutagénesis dirigida al sitio (equipo Stratagene Quikchange) para corresponder idénticamente a los anticuerpos humanos nativos .

Ejemp~lo~~5 " ~ - _- Potencia de neutralización de clones guía de optimización buscada como objetivo para CDR1 de cadena pesada y secuencias de CDR2 de cadena pesada de BAK502G9 en el ensayo de proliferación de células TF-1 dependiente de IL-13 humana Se realizó una segunda fase de optimización usando secuencia de BAK502G9, con regiones de estructura de línea germinal, como una plantilla. Se realizaron selecciones esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 en los repertorios de scFv en los cuales cualquiera de los residuos dentro de la CDR1 de cadena pesada o CDR2 de cadena pesada de BAK502G9 se ha aleatorizado por mutagénesis. Se identificaron clones únicos del resultado de selección por secuenciación de ADN y su potencia de neutralización se valoró como preparaciones purificadas de scFv en el ensayo de proliferación de células TF-1 como se describe en el Ejemplo 2. Se construyeron vectores para los clones de scFv más potentes para permitir la re-expresión como anticuerpo IgG¾ humano entero como se describe por Persic et al. (1997 Gene 187; 9-18) con unas pocas modificaciones. Se incluyó el fragmento oriP en los vectores para facilitar el uso con células HEK-EBNA 293 y para permitir replicación . episomal . El dominio variable VH se clonó en el poliligador entre la secuencia guía de secreción y el dominio constante gamma 4 humano del vector de expresión pEU8.1(+). El dominio variable ~VL se" clonó en el poliligador entre la~ secuencia guía de secreción y el dominio constante lambda humano del vector de expresión pEU4.1(-) . Se purificó el anticuerpo entero del medio condicionado de células EBNA-293 co-transfectadas con construcciones que expresan cadenas pesadas y ligeras por cromatografía de afinidad de proteína A (Amersham Pharmacia) . Las preparaciones purificadas de anticuerpo se filtraron estériles y se almacenaron a 4°C en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) antes de la evaluación. Se determinó la concentración en proteína al medir la absorbancia 280 nm usando el método BCA (Pierce) . Se compararon anticuerpos enteros IgG4 humanos reformateados a anticuerpos anti-IL-13 humana comercialmente disponibles en el ensayo de proliferación de TF-1 descrito en el Ejemplo 2.

Resultados Como se demuestra en la Figura 5, el anticuerpo comercial B-B13, (IgGl de ratón -Euroclone 5) se mostró que es significativamente más potente contra IL-13 humana que el anticuerpo comercial JES10-5A2 (IgGl de rata - Biosource) con IC50 de 1021 p y 471 pM, respectivamente. Ocho clones, específicamente BAK1111D10, BAK1166G02, BAK1167F02, BAK1167G04, BAK1183H4, BAK1184C8, BAK1185E1, BAK1185F8, derivados de BAK502G9 (y también "linaje de BAK502G9")/ en los cuales se han seleccionado como objetivo CDR1 ó CDR2 de cadena pesada, mostraron potencia mejorada como scFv con respecto a los anticuerpos comerciales. Estas mejoras se mantuvieron en la conversión al anticuerpo entero, IgG4 humana. Cada uno de estos dominios VH y VL individualmente y en los apareamientos respectivos de las reivindicaciones representa un aspecto o modalidad de la presente invención, como lo hacen miembros específicos de unión para IL-13 que comprenden uno o más de los mismos, también miembros específicos de unión que comprenden uno o más CDR de los clones de linaje BAK502G9, de manera preferente un dominio VH que comprende un conjunto de HCDR de linaje BAK502G9 y/o un dominio VL que comprende un conjunto de LCDR de linaje BAK502G9. Estos se pueden emplear en cualquiera y todos los aspectos de la invención como se describe en otra parte de la presente. Los derivados de BAK502G9 como anticuerpos enteros (IgG4) tienen una IC50 que varía desde 244pM a 283p . BAK502G9 como un anticuerpo entero IgG4 tiene una Ic50 de 384pM. En resumen, se pueden obtener mejoras mayores en la potencia al seleccionar como objetivo CDR1 de cadena pesada (SEQ ID NO: 7) o CDR2 (SEQ ID NO: 8) de BAK502G9. Se hicieron comparaciones estadísticas a B-B13 usando un ANOVA seguido por análisis de pos-prueba de Dunnett (programa InStat) Caracterización adicional Anticuerpos anti-humanos seleccionados de linaje BAK278D6 se sometieron a caracterización adicional para determinar su especificidad. Estos incluyeron BAK502G9 (VH SEQ ID NO: 15; VL SEQ ID NO: 16) y sus derivados BAK1167F2 (VH SEQ ID NO: 35; VL SEQ ID NO: 36) y BAK1183H4 (VH SEQ ID NO: 37; VL SEQ ID NO: 38), que son ejemplos representativos de clones con modificaciones a CDR1 de cadena pesada y CDR2 de cadena pesada de BAK502G9, respectivamente.

Ejemplo 6 Potencia de neutralización de clones guía de optimización seleccionada como objetivo de secuencias de CDR1 de cadena pesada y CDR2 de cadena pesada de BAK502G9 contra IL-13 de primate no humano y una variante de IL-13 asociada con asma en el ensayo de proliferación celular dependiente de factor TF-1 Se determinó la reactividad cruzada de los anticuerpos anti-IL-13 humana por su capacidad para inhibir proliferación de células TF-1 mediada por IL-13 de primate no humano y variante de IL-13 como se describe en el Ejemplo 4.

Resultados Los anticuerpos optimizados anti-IL-13 humana BAK1167F2 {VH SEQ ID NO: 35; VL SEQ ID NO: 36) y BAK1183H4 (VH SEQ ID NO: 37; VL SEQ ID NO: 38} mantuvieron la especificidad de su BA 502G9 de origen (VH SEQ ID NO: 15; VL SEQ ID NO: 16) (Figura 6) . Las ganancias de potencia contra IL-13 tipo silvestre se reflejaron en su capacidad para neutralizar IL-13 de primate no humano y una variante de IL-13 con sustancialmente potencia equivalente. La IC50 para BAK502G9 contra IL-13 humana, variante humana y de primate no humano fueron 1.4 nM, 1.9 nM y 2.0 n , respectivamente. La IC50 para BAK1167F2 contra IL-13, variante humana y de primate no humano fueron 1.0 nM, 1.1 nM y 1.3 nM respectivamente. La IC50 para BAK1183H4 contra IL-13 humana, variante humana, y de primate no humano fueron 0.9 nM, 1.0 nM y 1.6 nM respectivamente. Estos clones son adecuados para uso terapéutico.

Ejemplo 7 Potencia de neutralización de anticuerpos guía anti-IL-13 humana contra IL-13 humana nativa en ensayo de proliferación de células HDLM-2 La secuencia de IL-13 humana tiene cuatro sitios potenciales N-glicosilación. Los inventores han demostrado la capacidad de BAK278D6 y sus derivados para neutralizar IL-13 recombinante expresada ya sea en sistemas de expresión bacterianos o de baculovirus. Aunque, existe evidencia que muchos eventos de procesamiento conocidos en los sistemas de mamífero también se presentan en insectos hay diferencias claves en la glicosilación de proteínas, particularmente en la N-glicosilación [74] . Los inventores investigaron la capacidad de los derivados de BAK278D6 para neutralizar IL-13 nativa liberada de células humanas . Se aislaron células HDLM-2 por Drexler et al [75] de un paciente con la enfermedad de Hodgkin. Skinnider et al [76] demostró que la proliferación de células HDLM-2 fue dependiente en parte de la liberación autócrina y parácrina de IL-13. Los anticuerpos guía anti-IL-13 humana se valoraron para su capacidad para inhibir proliferación de células HDLM-2 mediada por la liberación de IL-13 nativa (o que se presenta de forma natural) .

Protocolo de ensayo de células HDLM-2 Se obtuvieron células HDLM-2 del Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) y se mantuvieron de acuerdo a los protocolos suministrados. El medio de ensayo comprendió RPI-1640 con Glutamax I (Invitrogen) que contiene 20 % de suero bovino fetal. Antes de cada ensayo, las células se sedimentaron por centrifugación a 300x g durante 5 minutos, el medio se removió por aspiración y las células se redispersaron en medio fresco. Este proceso se repitió tres veces y las "células finalmente se redispersaron a una concentración final de 2 x 105 células/ml en medio de ensayo. Se adicionaron 50 µ? de las células redispersadas a cada punto de ensayo en una placa de ensayo de 96 cavidades. Se diluyeron soluciones de prueba de los- anticuerpos (en triplicado) a la concentración deseada en el medio de ensayo. Se usó un anticuerpo de isotipo irrelevante no dirigido a IL-13 como un control negativo. El anticuerpo de prueba apropiado en un volumen total de 50 µ?/cavidad se adicionó a las células, cada punto de ensayo que da un volumen total de ensayo de 100 µ?/cavidad. Las placas de ensayo se incubaron durante 72 horas a 37°C bajo C02 a 5 %. Entonces se adicionaron 25 µ? de timidina tritiada (10 µ??/????, NEN) a cada punto de ensayo y las placas de ensayo se regresaron a la incubadora durante 4 horas adicionales. Se recolectaron las células en placas de filtro de fibra de vidrio (Perkin Elmer) usando un recolector celular. Se determinó la incorporación de timidina usando un contador de escintilación líquida de microplaca Packard TopCount . Los datos se analizaron usando el programa Graphpad Prism.

Resultados Como se demuestra en la Figura 7, BAK502G9 (VH SEQ ID NO: 15; VL SEQ ID NO: 16), y sus derivados BAK1183H4 (VH SEQ ID NO: 37; VL SEQ ID NO: 38) y BAK1167F2 (VH SEQ ID NO: -35; VL SEQ ID- _NO:-- 36) fueron capaces de provocar una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación celular con potencias relativas similares a aquellas observadas en otros bioensayos. La IC50 para BAK502G9, BAK1183H4, BAK1167F2 como IgG4 humana fueron 4.6 nM, 3.5 nM y 1.1 nM, respectivamente. La IC50 para los anticuerpos comerciales JES10-5A2 y B-B13 fueron 10.7 nM y 16.7 nM respecti amente .

Ej emplo 8 Potencia de neutralización de anticuerpos guía anti-IL-13 humana contra respuestas dependientes de IL-13 en células primarias pertinentes de enfermedad Se realizaron bioensayos secundarios usando células primarias y lecturas más pertinentes a la enfermedad de las vías aéreas. Estas incluyeron liberación de eotaxina de fibroblastos de pulmón humano normal (NHLF) y expresión de molécula 1 de adhesión vascular (VCAM-1) en la superficie de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) . Ambas respuestas dependientes de IL-13 pueden contribuir al reclutamiento de eosinófilos, una característica del fenotipo de asma [92] .

Protocolo de ensayo de NHLF Se ha mostrado que IL-13 provoca liberación de eotaxina de - fibroblastos — ulmonares ~ [77] [78] [79] . La liberación de eotaxina dependiente de factor a partir de NHLF se determinó por ELISA. Se obtuvieron NHLF de Biowhittaker y se mantuvieron de acuerdo a los protocolos suministrados . El medio de ensayo fue FGM-2 (Biowhittaker) . Las soluciones de prueba del anticuerpo (en triplicado) se diluyeron a la concentración deseada en el medio de ensayo. Se usó un anticuerpo irrelevante no dirigido a IL-13 como un control negativo. Se adicionó subsiguientemente IL-13 humana recombinante bacterianamente derivada (Peprotech) a una concentración final de 10 ng/ml cuando se mezcló con el anticuerpo apropiado en un volumen total de 200 µ? . La concentración de IL-13 usada en el ensayo se seleccionó como la dosis que da aproximadamente 80 % de la respuesta máxima. Todas las muestras se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces se adicionaron muestras de ensayo a NHLF que se han pre-sembrado a una densidad de 1 x 104 células por cavidad en placas de ensayo de 96 cavidades. Se incubaron las placas de ensayo a 37°C durante 16-24 horas a 37°C bajo C02 al 5 %. Las placas de ensayo se centrifugaron a 300 x g durante 5 minutos para sedimentar las células desprendidas . Se determinaron los niveles de eotaxina en el sobrenadante por ELISA usando reactivos y métodos descritos por el fabricante (R&D Systems). "Se "añalizafón" "los" datos usando el programa Graphpad Prism.

Resultados Los clones de linaje BAK278D6 fueron capaces de inhibir liberación de eotaxina dependiente de IL-13 humana de los NHLF. La potencia relativa fue similar a aquella observada en el ensayo de proliferación de células TF-1 (Figura 8). BAK502G9 (VH SEQ ID NO: 15; VL SEQ ID NO: 16), BAK1183H4 (VH SEQ ID NO: 37; VL SEQ ID NO: 38), BAK1167F2 (VH SEQ ID NO: 35; VL SEQ ID NO: 36) tuvieron una IC50 de 20 7pM, 118 pM y 69 pM respectivamente contra 10 ng/ml de IL-13 humana. Los anticuerpos comerciales JES10-5A2 y B-B13 tuvieron una IC50 de 623 pM y 219 pM respectivamente .

Protocolo de ensayo HUVEC Se ha mostrado que IL-13 favorece la expresión de VCAM-1 en la superficie celular de HUVEC [80, 81] . Se determinó la expresión de VCAM-1 dependiente de factor por detección de favorecimiento de expresión celular de receptor de VCAM-1 usando una lectura de fluorescencia resuelta en tiempo. Se obtuvieron HUVEC de Biowhittaker y se mantuvieron de acuerdo a los protocolos suministrados . El medio" de ensaYO"~fue"EGM"-2""(Biowhittaker)'". Las soluciones de prueba de anticuerpo (en triplicado) se diluyeron a la concentración deseada en el medio de ensayo. Se usó un anticuerpo irrelevante no dirigido a IL-13 como un control negativo. Se adicionó IL-13 humana, recombinante, bacterianamente derivada (Peprotech) a una concentración final de 10 ng/ml cuando se mezcla con el anticuerpo de prueba apropiado en un volumen total de 200 µ? . La concentración de IL-13 usada en el ensayo se seleccionó como la dosis que da aproximadamente 80 % de dosis máxima. Todas las muestras se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las muestras de ensayo entonces se adicionaron a HUVEC que se ha pre-sembrado a 4 x 104 células por cavidad en placas de ensayo de 96 cavidades. Se incubaron las placas de ensayo a 37°C durante 16-20 horas bajo C02 al 5 ¾. Entonces se removió el medio de ensayo por aspiración y se reemplazó con solución de bloqueo (PBS que contiene polvo de leche Marcel""" secado al 4 %) . Se incubaron las placas de ensayo a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavaron las cavidades tres veces con PBST T een antes de que se adicionaran 100 µ? (dilución 1:500 en PBST/Marvel" al 1 %) de anticuerpo anti-VCAM-1 biotinilado (Serotec) a cada cavidad. Se incubaron placas de ensayo a temperatura ambiente durante 1 hora. Las cavidades se lavaron tres veces con amortiguador de lavado Délfiá (Perkin Elmer) antes de que se adicionaran 100 µ? de Streptavidina marcada con Europio o IgGl anti-murino (dilución 1:1000 en amortiguador de ensayo Delfia, Perkin Elmer) a cada cavidad. Entonces se incubaron las placas de ensayo a temperatura ambiente durante 1 hora. Las cavidades se lavaron 7 veces con amortiguador de lavado Delfia, (Perkin Elmer) . Finalmente, se adicionaron 100 µ? de la solución de mejora (Perkin Elmer) a cada cavidad y se determinó la intensidad de fluorescencia usando el lector de placa Wallac 1420 VICTOR2 (protocolo de Europio Normal) . Los datos se analizaron usando el programa Graphpad Prism.

Resultados Los datos típicos para BAK502G9 (VH SEQ ID NO: 15; VL SEQ ID NO: 16), BAK1183H4 (VH SEQ ID NO: 37; VL SEQ ID NO: 38), BAK1167F2 (VH SEQ ID NO: 35; VL SEQ ID NO: 36) como IgG4 humana, anticuerpo entero, se muestran en la Figura 9. La potencia relativa fue similar a la observada en el ensayo de proliferación de células TF-1. La IC50 para BAK502G9, BAK1183H4 y BAK1167F2 fue 235 pM, 58 p y 55 pM respectivamente contra 10 ng/ml de IL-13 humana.

Ej emplo 9 Potencia de neutralización de anticuerpos anti-IL-13 contra favorecimiento de expresión de VCAM—l dependiente de IL-?ß e IL-4 La especificidad de linaje BAK278D6 de los clones se valoró en una modificación del bioensayo HUVEC. Junto con IL-13, tanto IL-4 como IL-?ß se ha mostrado que favorecen la expresión de VCAM-1 en superficie celular de HUVEC ['80, 81] .

Protocolo de ensayo HUVEC El ensayo se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 5 con las siguientes modificaciones. Se usaron IL-?ß e IL-4 humana recombinante (R&D Systems) en lugar de IL-13 humana a 0.5 ng/ml y 1 ng/ml respectivamente y representaron la dosis que dio aproximadamente 80 % de la respuesta máxima.

Resultados Ninguno de los clones evaluado del linaje BAK278D6 neutralizó el favorecimiento de la expresión de VCAM-1 en respuesta a ya se IL-?ß ó IL-4 y de esta manera demuestran especificidad para IL-13 (Figura 10) . IL-4 está más cercanamente relacionada a IL-13, que comparte 30 % de identidad de secuencia al nivel de aminoácidos [82] .

Ejemplo 10 Potencia de neutralización de BAK209B11 como una IgG4 en ensayo de proliferación de células B9 murina dependiente de IL-13 murina Se reformateó BAK209B11, identificado como un clon de neutralización anti-IL-13 murino como una scFv como se describe en el Ejemplo 1, como una IgG4 humana de anticuerpo entero como se describe en el Ejemplo 5 y su potencia se evaluó en el ensayo de proliferación de células B9 dependiente de IL-13 murina. B9 es una línea de células de hibridoma de células B murina [83] . B9 es dependiente de factor para supervivencia y proliferación. A este respecto, las células B responden a IL-13 murina y se mantienen en el medio que contiene IL-6 humana (50 pg/ml, R&D Systems) . Se determinó la inhibición de proliferación dependiente de IL-13 murina al medir la reducción en la incorporación de timidina tritiada en el ADN recién sintetizado de células en división.

Protocolo de ensayo de células B9 Se obtuvieron células B9 de European Collection of Animal Cell Culture ECACC y se mantuvieron de acuerdo a los protocolos suministrados. El ensayo se realizó esencialmente como se describe para el ensayo de TF-1 en el Ejemplo 2 pero con las siguientes modificaciones. El medio de ensayo comprendió RPMI-1640 con GLUTAMAX I (Invitrogen) que contiene suero bovino fetal al 5 % (Hyclone) y 2-mercaptoetanol 50 µ (Invitrogen) . La IL-13 murina recombinante bacterianamente derivada (Peprotech) reemplazó a la IL-13 humana óon una concentración final de ensayo de 1 ng/ml .

Resultados BAK209B11 (VH SEQ ID NO: 25; VL SEQ ID NO : 26) como una IgG4 humana neutralizó 1 ng/ml de IL-13 murina con una IC50 de 776 pM en el ensayo de B9 (Figura 11) . Por lo tanto, BA 209B11 representa una herramienta útil para investigar el papel de IL-13 en modelos murinos de enfermedad. Esto se demuestra claramente en el Ejemplo 12, que demuestra la eficacia de BAK209B11 en un modelo murino de inflamación pulmonar aguda.

Ejemplo 11 Determinación de afinidad de anticuerpos anti-IL-13 por análisis BIAcore La afinidad de BAK502G9 (VH SEQ ID NO: 15; VL SEQ ID NO: 16), BAK1167F2 (VH SEQ ID NO: 35; VL SEQ ID NO: 36) y BAK1183H4 (VH SEQ ID NO: 37; VL SEQ ID NO: 38) para IL-13 humana y BAK209B11 (VH SEQ ID NO: 25; VL SEQ ID NO: 26) para IL-13 murina como IgG4 humana se determinaron por mediciones de resonancia de plasmon superficial usando el Biosensor BIAcore 2G00 (BIAcore AB) esencialmente como se describe en [72] . En resumen, se acoplaron anticuerpos a circuitos sensores CM5 usando un equipo de acoplamiento de amina (BIAcore) a una densidad superficial de aproximadamente 500 Ru y una dilución en serie de IL-13 (entre 50 nM a 0.78 nM) en amortiguador de HBS-EP se hizo pasar sobre la superficie del circuito sensor. Los sensogramas resultantes se evaluaron usando el programa BIA evaluation 3.1 para proporcionar datos cinéticos.

Resultados IgG4 de BAK502G9, BAK1167F2 y BAK1183H4 se unió a IL-13 humana con alta afinidad con Kd de 178 pM, 136 pM y 81 pM respectivamente que corresponde a su potencia relativa en los ensayos basados en célula. BAK209B11 se unió a IL-13 murina con afinidad de 5.1 nM (Tabla 3) .

Ejemplo 12 Eficacia de BAK209B11 en un modelo murino de inflamación pulmonar alérgica aguda Modelo murino de inflamación pulmonar alérgica aguda El efecto de BA 209B11 (VH SEQ ID NO: 25; VL SEQ ID NO: 26) , el anticuerpo IgG4 humano neutralizante anti-IL-13 murina, se investigó en una inflamación pulmonar alérgica aguda murina. Este modelo se realizó esencialmente como se describe por Rif o-Vazquez et al [84] y se caracteriza en su punto final por IL-13 incrementada (Figura 12) de lavado alveolar bronquial (BAL) IL-13 (Figura 12) , niveles séricos incrementados de IgE e hipersensibilidad de las vias aéreas (AHR) .

Protocolo de modelo Se trataron ratones Balb/C hembras (Charles River, RU) con ya sea el anticuerpo anti-IL-13 murino BAK209B11 a 12, 36, 119 o 357 µg de dosis) o un anticuerpo de control correspondido en istipo (357 µg de dosis) . En los días 0 y 7, los ratones en cada grupo se sensibilizaron por inyección intraperitoneal de 10 µg de ovalbúmina (Ova) en 0.2 mi del vehículo (solución salina que contiene AL203 al 2 % (Rehydragel) como un adyuvante) . Un grupo de control separado de ratones no sensibilizados recibió un volumen igual del vehículo. Los ratones se estimularon con ovalbúmina en los días 14, 15 y 16. La ovalbúmina se diluyó a 1 % (w/v) en solución salina estéril antes de la nebulización. Se administraron todos los estímulos de inhalación en una cámara de exposición Plexiglás. Se dio por aerosol Ova usando un nebulizador deVilbiss Ultraneb 2000 (Sunrise Medical) en una serie de tres exposiciones de 20 minutos separadas por intervalos de 1 hora. Se administraron BAK209B11 o una IgG4 humana y relevante de forma intravenosa, un día antes del primer estímulo y luego dé dos horas antes de cada estímulo subsiguiente (4 dosis en total) . El modelo terminó en el día 17, 24 horas después de la estimulación final. Se recolectaron sangre (suero) y BAL. El suero se valoró para IgE total se obtuvo BAL al inyectar tres alícuotas de solución salina (0.3 mi, 0.3 mi y 0.4 mi) y al mezclar las muestras. Se obtuvieron de las células de BAL los leucocitos totales y las cuentas celulares diferenciales.

Resultados El estímulo con ovalbúmina de ratones sensibilizados provocó un incremento significativo (p<0.05) en el reclutamiento rotal de células de BAL con respecto a animales no sensibilizados pero estimulados. Este reclutamiento se inhibió de forma dependiente a la dosis por BAK209B11; se vio una inhibición significativa (p<0.05) con =36 µg BAK209B11, pero no anticuerpo de control (Figura 13) . También se vieron efectos similares en los eosinófilos (Figura 14) y neutrófilos (Figura 15) con inhibición significativa (p<0.05) de influjo celular a una dosis mínima de BAK209B11 de 36 g. Esta inhibición no se vio con el anticuerpo de control. Los linfocitos también de indujeron en ratones sensibilizados pero no sensibilizados en la estimulación. Esta inducción . se inhibió de manera dependiente de la dosis por BAK209B11 con inhibición máxima vista con 36 µg de BAK209B11. El anticuerpo de control no tuvo efecto (Figura 16) . Aunque los monocitos/macróf gos no se indujeron en los animales, sensibilizados en comparación a los animales no sensibilizados, se redujeron los niveles de fondo por = 36 µg de BAK209B11, pero no por el anticuerpo de control (Figura 17) . Los niveles séricos de IgE se incrementaron de manera significativa en animales sensibilizados en comparación a los no sensibilizados después del estimulo (p<0.05). Este incremento se disminuyó después de tratamiento con 36 µg de BAK209B11 pero no por el anticuerpo de control . En resumen, la administración sistémica de de ???209?11 un anticuerpo neutralizante de IL-13 murina, pero no el anticuerpo de control, inhibió el influjo de células inflamatorias y el favorecimiento de la expresión de los niveles séricos de IgE provocado por sensibilización y estimulación subsiguiente con ovalbümina en un modelo murino de inflamación alérgica. Los ejemplos 13 a 20 son proféticos.

Ejemplo 13 Eficacia de BAK209B11 en modelo murino de Lloyd de inflamación pulmonar aguda Modelo murino de inflamación pulmonar alérgica aguda El efecto de BAK209B11 (VH SEQ ID NO: 25; VL SEQ ID NO: 26) , un anticuerpo neutralizante anti-IL-13 murina se investigó en un segundo modelo murino de inflamación pulmonar alérgica aguda. Este modelo se realizó esencialmente como se describe por McMillan et al. [85] y se caracteriza en su punto final por IL-13 de BAL incrementada y de tejido de pulmón infiltración celular en los niveles séricos incrementados de IgE de pulmón y BAL, e hipersensibilidad de las vías aéreas (AHR) .

Protocolo de modelo Se administraron ratones Balb/C hembras (Charles River, RU) con varias dosis de anticuerpo anti-IL-13 murino, BAK209B11 o un anticuerpo de control correspondido en isotipo, como sigue. En los días 0 y 12, se sensibilizaron ratones en cada grupo (SN) por inyección intraperitoneal de 10 g de ovalbúmina (Ova) en 0.2 mi de vehículo (solución salina que contiene 2 mg de Al (OH) 3 como un adyuvante [calculado como se describe en el Ejemplo 12] . Un grupo de control separado de ratones no sensibilizados (NS) recibió un volumen igual del vehículo. Los ratones se estimularon con ovalbúmina durante 20 minutos en los días 19, 20 y 21, 22, 23, y 24. La ovalbúmina se diluyó a 5 % (p/v) en solución salina antes de la nebulización. Todas las estimulaciones por inhalación se administraron en una cámara de exposición Plexiglás. Se distribuyó por aerosol o Ova usando un nebulizador deVilbiss Ultraneb 2000 (Sunrise Medical) . En los días 18, 19, 20, 21, 22, 23, y 24 a los ratones se les administran varias dosis intraperitoneales (237 g, 23.7 µ9 o 2.37 µg,^ denotadas en la Figura 21 por H. M y L) del anticuerpo anti-IL-13 murina BAK209B11 muIgGl o un anticuerpo de control correspondido en su tipo (237 . Se valoró la función de las vías aéreas en los días 0 y 25 al incrementar los estímulos con metacolina y se monitorearon usando pletismografía conciente (Buxco) . Se estimó PC5o (concentración de metacolina requerida para incrementar PenH de línea base por 50 %) para ratones individuales tanto en el día 0 como en el día 25 del ajuste de la curva no fijado de 4 parámetros de curvas de respuesta de dosis de metacolina. El modelo terminado en el día 25, 24 horas después de la estimulación final. Se recolectaron sangre, suero, BAL y tejido pulmonar.

Resultados Se evaluó la función pulmonar para animales individuales en el día 0 (pre-tratamiento) y en el día 25 (pos-estimulación) y se cuantificó al calcular los valores de PC50 (concentración de metacolina para incrementar PenH de línea base por 50 %) (Figura 21A) . Se determinó la hipersensibilidad de las vías aéreas de los individuos (AHR) por el cambio en log PC50 en el día 25 versus día 0 (log día 25 PCso - log día 0 PC50) . Esta delta log PC50 fue el punto final primario del estudio; los datos logarítmicos de PC50 se transformaron debido a los requerimientos de ANOVA de punto final . Se promediaron los cambios individuales dentro de los grupos para generar delta log PC50 promedio por grupo (como se muestra en la Figura 21B) . La estimulación con ovalbúmina de ratones sensibilizados provocó una AHR significativa en comparación a ratones no sensibilizados y estimulados (p<0.01). BAK209B11 provocó una disminución clara y dependiente de la dosis en la AHR en tanto que el anticuerpo de control no tuvo efecto.

Ejemplo 14 Eficacia de BAK209B11 en modelo murino de Gerard de infección pulmonar aguda Modelo murino de inflamación pulmonar alérgica aguda El efecto de BAK209B11 (VH SEQ ID NO: 25; VL SEQ ID NO: 26) , un anticuerpo IgG4 humano, neutralizante anti-IL-13 murina se investigó en un tercer modelo murino de inflamación pulmonar alérgica aguda. Este modelo se realizó de manera esencial como se describe por Humbles et al., [86] y se caracteriza en su punto final por IL-13 incrementada de BAL y de tejido de pulmonar, infiltración celular en el pulmón y BAL, niveles séricos incrementados de IgE e hipersensibílidad de las vías aéreas (AHR) .

Protocolo de modelo Ratones Bal/C hembras (Charles River, RU) se les administró con varias dosis del anticuerpo anti-IL-13 murino, BAK209B11 o un anticuerpo de control correspondido en isotipo. En los días 0, 7 y 14, los ratones en cada grupo se sensibilizaron (SN) por inyección intraperitoneal de 10 µg de ovalbúmina (Ova) en 0.2 mi del vehículo (solución salina que contiene 1.125 de mg de Al (OH) 3 como un adyuvante [calculado como se describe en el ejemplo 12]). Un grupo de control separado de ratones no sensibilizados (NS) recibió un volumen igual del vehículo. Los ratones se estimularon con ovalbúmina durante 20 minutos en los días 21, 22, 23, y 24. La ovalbúmina se diluyó a 5 % (p/v) en solución salina antes de la nebulización. Se administraron todas las estimulaciones de inhalación en una cámara de exposición Plexiglás. Se administró por aerosol Ova usando un nebulizador deVilbiss Ultraneb 2000 (Sunrise Medical) . El modelo terminó en el día 25, 24 horas después de la estimulación. Se recolectaron sangre, suero, BAL y tejido pulmonar.

Ejemplo 15 Eficacia de BAK2Q9B11 en modelo crónico de Lloyd de inflamación pulmonar Modelo murino de inflamación pulmonar alérgica crónica El efecto de BAK209B11 (VH SEQ ID NO: 25; VL SEQ ID NO: 26) , un anticuerpo IgG4 humano, neutralizante anti-IL-13 murina, se investigó en un modelo de inflamación pulmonar alérgica crónica. Este modelo se realizó esencialmente como se describe por Temelkovski et al., [87] y se caracteriza en su punto final por infiltración celular en pulmón y BAL, niveles séricos incrementados de IgE e hipersensibilidad de las vías aéreas (AHR) .

Protocolo de modelo Ratones Bal/C hembras (Charles River, RU) se dosificaron con varias dosis del anticuerpo anti-IL-13 murina, BAK209B11 o un anticuerpo de control correspondido en isotipo. En los días 0 y 11, los ratones en cada grupo se sensibilizaron (SN) por inyección intraperitoneal de 10 µg de ovalbúmina (Ova) en 0.2 mi del vehículo (solución salina que contiene 2 mg de Al (OH) 3 como un adyuvante [calculado como se describe en el Ejemplo 12]) . Un grupo de control separado de ratones no sensibilizados (NS) recibió un volumen igual del vehículo. Los ratones se estimularon con ovalbúmina durante 20 minutos en los días 18, 19, 20, 21, 22, 23, 28, 30, 32, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 49 y 51. La ovalbúmina se diluyó al 5 % (p/v) en solución salina antes de la nebulización. Todas las estimulaciones de inhalación se administraron en una cámara de exposición Plexiglás. La Ova se administró por aerosol o usando un nebulizador deVilbiss Ultraneb 2000 (Sunrise Medical) . El modelo terminó en el día 52, 24 horas después de la estimulación. Se recolectaron sangre, suero, BAL y tej ido pulmonar .

Ejemplo 16 Eficacia de anticuerpos anti-IL-13 humana contra IL-13 humana exógena administrada a modelo de saco aéreo murino El efecto de los anticuerpos anti-IL-13 humana en la acción pro-inflamatoria de IL-13 humana se investigó en un modelo básico murino. Este modelo se realizó esencialmente como se describe por Edwars et al [93] y se caracterizó en su punto final por infiltración celular en los sacos aéreos .

Protocolo de modelo Se creó un saco aéreo en la espalda de los ratones Balb/C hembras por inyección subcutánea de 2.5 mi de aire estéril en el día 0. El saco aéreo se re-infló con otro aire estéril 2.5 mL en el día 3. Se inyectó 2 µ9 huIL-13 en CMC al 0.75 % directamente en el saco en el día 6. 24 horas más tarde los ratones se aniquilaron y el saco aéreo se lavó con solución salina heparinizada 1 mL. Los tratamientos con anticuerpo se dieron ya sea con huIL-13 (en el saco) o se dieron sistemáticamente.

Resultados La IL-13, humana inyectada en el saco aéreo (i. po.), provocó una infiltración significativamente incrementada de leucocitos totales (p<0.01) y eosinófilos (p<0.01) a 24 horas después de la estimulación versus ratones tratados con vehículo (carboximetilcelulosa al 0.75 % (CMC) en solución salina i.po.). El BAK502G9 (localmente administrado ' (200 ~mg, 20 mg o 2 mg intra-saco) inhibió de forma significativa y de manera dependiente de la dosis la infiltración total de leucocitos (p<0.01) y eosinófilos (p<0.01) en el saco aéreo provocado por 2 µg de huIL-13 en CMC al 0.75 %. El BAK209B11 sistémicamente administrado (30 rng/kg, 10 mg/kg y 1 mg/kg) también inhibió de forma significativa y dependiente de la dosis la infiltración total de leucocitos (p<0.01) y eosinófilos (p<0.01) en el saco aéreo provocado por 2 µg de huIL-13 en CMC al Ejemplo 17 Generación de ratones transgénicos con inserción de IL-13 humana/supresión de IL-13 murina para los propósitos de valor la eficacia de anticuerpos anti-IL-13 humana en modelos de inflamación alérgica pulmonar Los presentes inventores han generado ratones que expresan IL-13 humana en lugar de IL-13 murina por selección génica. El gen de IL-13 de ratón se ha remplazado desde el codón de inicio al codón finalizador con la porción pertinente del gen de IL-13 humana. Esta variedad de ratones expresa IL-13 humana en lugar de IL-13 de ratón, en respuesta a los mismos estímulos como en el ratón tipo silvestre, puesto que el promotor de IL-13 endógeno y la prolongación de pA de IL-13 permanecen sin cambio. Se ha mostrado que IL-13 humana puede unirse a y señalar a través de los receptores de IL-13 de ratón para generar las mismas consecuencias fisiológicas como la señalización provocada por IL-13 de ratón que se liga a receptores de IL-13 de ratón. Por ejemplo, la IL-13 humana exógena provocó reclutamiento de células inflamatorias en el saco aéreo murino (Figura 18) . Estos animales transgénicos permiten evaluar anticuerpos anti-IL-13 humana de reactividad cruzada, no murinos, en modelos murinos establecidos de enfermedad. Este ratón se ha usado en los modelos de inflamación alérgica aguda de las vías aéreas (como se describe en los ejemplos 18 y 19) y en los modelos de inflamación alérgica crónica de las vías aéreas (como se describe en el Ejemplo 20) que permite la evaluación de la farmacología del anticuerpo-anti-IL-13 humana en la enfermedad alérgica de las vías aéreas.

E emplo 18 Eficacia de anticuerpos anti-IL-13 humana en modelo murino de Lloyd transgénico de huíL-13 de inflamación pulmonar aguda Modelo murino de inflamación pulmonar alérgica aguda El efecto de los anticuerpos IgG4 humanos neutralizantes anti-IL-13 humana se investigó en un modelo murino de inflamación pulmonar alérgica aguda usando los ratones transgénicos generados en el ejemplo 17. Este modelo se realizó esencialmente como se describe por McMillan et al. [85] y el ejemplo 13. El modelo se caracteriza en su punto final por IL-13 incrementada de BAL y tejido pulmonar infiltración celular en el pulmón y BAL, niveles séricos incrementados de IgE e hipersensibilidad de las vías aéreas (AHR) .

Protocolo de modelo El protocolo para este modelo fue como se describe en el Ejemplo 13 excepto que los anticuerpos anti-IL-13 humanos se dosificaron en lugar de BAK209B11.

Ejemplo 19 Eficacia de anticuerpos anti-IL-13 humana en modelo murino de Gerard transgénico de huIL-13 de inflamación pulmonar aguda Modelo murino de inflamación pulmonar alérgica aguda El efecto de los anticuerpos IgG4 humanos neutralizante anti-IL-13 humana se investigó en otro modelo murino de inflamación pulmonar alérgica aguda usando los ratones transgenicos generados en el ejemplo 17. Este modelo se realizó esencialmente como se describe por Humbles et al., [85] y en el ejemplo 14. El modelo se caracteriza en su punto final por IL-13 de incrementada de BAL y tejido pulmonar, infiltración celular en el pulmón y BAL, niveles séricos incrementados de IgE e hipersensibilidad de las vías aéreas (AHR) .

Protocolo de modelo El protocolo para este modelo fue como se describe en el Ejemplo 14 excepto que se dosificaron anticuerpos anti-IL-13 humana en lugar de BAK209B11.

Ejemplo 20 Eficacia de anticuerpos anti-IL-13 humana en el modelo crónico de Lloyd transgénico de huIL-13 de inflamación pulmonar El efecto de los anticuerpos IgG4 humanos de neutralizantes anti-IL-13 humana se investigó en un modelo de inflamación pulmonar alérgica crónica usando los ratones transgénicos generados en el ejemplo 17. Este modelo se realizó esencialmente como se describe por Temelkovski et al., [87] y en el Ejemplo 15 se caracteriza en su punto final por infiltración celular en pulmón y BAL, niveles séricos incrementados de IgE e hipersensibilidad de las vías aéreas (AHR) .

Protocolo de modelo El protocolo para este modelo fue como se describe en el Ejemplo 15 excepto que se dosificaron anticuerpos anti-IL-13 humanos en lugar de BAK209B11.

Ejemplo 21 Farmacocinética y farmacodinámica de anticuerpos anti-IL-13 humana en monos cynomolgus alérgicos a Ascaris.suum La farmacocinética y farmacodinámica de 502G9 se evaluó en 4 primates cynomolgus alérgicos pero no estimulados (2 machos/2 hembras) después de una dosis de bolo individual i.v 10 mg/kg. El experimento corrió durante 29 días. Los parámetros farmacocinéticos del anticuerpo se determinaron de una curva de concentración de suero-fármaco promedio geo-promedio y se detallan más adelante en la Tabla 4. En el mismo estudio, también se siguieron las concentraciones séricas de IgE usando un equipo dE ELISA de IgE humana (Bethyl laboratories, EUA) .

Resultados Las concentraciones séricas de IgE se redujeron de manera significativa después de dosis individual de bolo i.v de 10 mg/kg de BA 502G9, desde niveles de control de 100 % (pre-dosis) a 66 ± 10 % de valores de control (p<0.05), a los 4 y 5 días después de la dosificación. Esta disminución de la concentración sérica de IgE se recuperó a 88 ± 8 % de niveles de control por el día 22 (ver Figura 20) . Nuevamente estos datos derivaron al normalizar cada concentración sérica de IgE de los animales a los niveles de pre-dosis, donde las concentraciones de pre-dosis fueron de 100 % y luego al promediar las curvas de los 4 animales probados . Los dos monos machos tuvieron IgE sérica total de pre-dosis relativamente baja (60 ng/mL y 67 ng/mL) . Estos niveles de IgE no cambiaron de manera que sugiere una tendencia que sigue el tratamiento con BA 502G9 (Figura 20B) . Los dos monos hembras tuvieron IgE sérica total de pre-dosis relativamente alta (1209 ng/mL y 449 ng/mL) . Estos niveles de IgE se disminuyeron después del tratamiento con BAK502G9, de forma máxima por 60 % en 7 días, y regresando a aproximadamente niveles de pre-dosis por post-administración de 28 días (Figura 20B) . Estos datos proporcionan indicación que BAK502G9 disminuye las concentraciones séricas de IgE en animales con IgE en circulación relativamente alta de la IgE.

Ejemplo 22 Eficacia de anticuerpos anti-IL-13 humana en modelos cynomolgus de alergia dérmica Los efectos de los anticuerpos IgG4 humanos neutralizante anti-IL-13 humana se investigaron en un modelo de primate de inflamación dérmica alérgica aguda. Este modelo se realizó al inyectar IL-13 humana y el antigeno A.suum en monos cynomolgus. 24-96 h más adelante, se tomaron biopsias dérmicas y muestras séricas . El modelo se caracterizó en su punto final por infiltración celular en la piel .

Ejemplo 23 Eficacia de anticuerpos anti-IL-13 humana en modelos cynomolgus de alergia pulmonar El efecto de anticuerpos IgG4 humanos neutralizante anti-IL-13 humanos se investigó en un modelo de primate de inflamación pulmonar alérgica aguda. Este modelo se realizó al exponer primates cynomolgus alérgicos a a.suum a antígeno nebulizado de a.suum generando de este modo una reacción alérgica. Esta alergia se caracterizó en su punto final por infiltración celular en el pulmón y BAL, niveles séricos incrementados de IgE e hipersensibilidad de las vías aéreas. La farmacodinámica se evaluó adicionalmente ex vivo usando un método de citometría de flujo. El CD23 es el receptor de IgE de alta afinidad y se puede expresar en células mononucleares de sangre humana periférica. La expresión de CD23 se puede inducir, en términos del número de células que expresan CD23 y también en cuanto CD23 cada célula expresa tanto por IL-13 como por IL-4. La respuesta mediada por IL-13 pero no por IL-4, se puede inhibir por anticuerpos anti-IL-13 y humana. Se preseleccionaron animales para entrada en este estudio de dos fases en base a la AHR anteriormente establecida después de la estimulación con antígeno nebulizado (extracto de asearas suum) . Se valoró la función de las vías aéreas en la fase I durante la estimulación con histamina intravenosa en los días 1 y 11. La PC30 la dosis de histamina requerida para acelerar un incremento de 30 % en la resistencia pulmonar (RL) por arriba de la línea base, se determinó para curva de respuesta de dosis de histamina. En los días 9 y 10, se estimuló a los animales con dosis individualmente adaptadas de antígeno nebulizado que anteriormente se muestra que genera un incremento de 40 % en RL así como una disminución de 35 % en el acatamiento dinámico (CDyN) . Históricamente en este modelo se ha observado una RL mayor después del segundo estímulo con una dosis dada de alérgeno que el primero; esto es cebadura de antígeno. Los dos estímulos de antígeno provocaron AHR, como se mide por una área incrementada bajo la curva de respuesta de dosis de histamina y/o una caída en PC30, y BAL, así como por eosinofilia en el día 11 en comparación al día 1. Los animales que exhiben un fenotipo de AHR se seleccionaron para entrar a la fase II. La fase II se corrió exactamente como la fase I excepto que todos los animales recibieron una infusión de 30 mg/kg de BAK502G9 en los días 1, 5 y 9. Los efectos de BAK502G9 se valoraron al comparar los cambios vistos en la fase II con los cambios vistos en la fase I para animales individuales . Se recolectaron sangre, suero, BAL y tejido pulmonar. Los niveles séricos de IgE se monitorizaron por ELISA. El suero de ratones cynomolgus tratados con BAK502G9 se mostró que inhibe la expresión de CD23 en células mononucleares de sangre periférica humana inducida por IL-13 pero no por IL-4. La magnitud de esta inhibición fue consistente con los niveles séricos de BA 502G9 previstos por PK ELISA.

Resultados BAK502G9 inhibió de manera significativa como se mide por RL AUC (p<0.05) (Figura 26A; Tabla 7). Se observó un efecto inhibitorio de BAK502G9 en AHR, como se mide por PC30, pero no alcanzó significado estadístico (Figura 26B; Tabla 7) . BAK502G9 también inhibió de manera significativa tanto la cebadura de antigeno (p<0.01) (Figura 26C; Tabla 7) y en la inflamación de BAL. BAK502G9 inhibió significativamente el influjo total de células (p<0.05) y eosinófilos (p<0.05) pero no de macrófagos, linfocitos o células cebadas en el BAL (Figura 26D Tabla 7) .

Ejemplo 24 Eficacia de anticuerpo anti-IL-13 humana contra el fenotipo asmático que se desarrolla cuando se administra IL-13 humana a pulmón de ratón Modelo murino de hipersensibilidad de las vías aéreas La eficacia de BAK502G9 anticuerpo neutralizante anti-IL-13, contra el desarrollo de hipersensibilidad de las vías aéreas (AHR) seguido de la administración de IL-13 humana a pulmón de ratón se investigó. Este modelo se realizó esencialmente como describe por Yang et al [119] con la excepción que se usó IL-13 humana en lugar de IL-13 murina Protocolo del modelo Para desarrollar el fenotipo, se pusieron ratones BALB/c machos a dos dosis de IL-13 humana separadas por un intervalo de 48 horas. En resumen, se anestesiaron ratones con una inyección intravenosa de solución de saffan de 100 µ?? (diluido 1:4 en agua) . Los ratones se intubaron con una aguja de catéter de calibre 22, a través de la cual se instilo IL-13 recombinante humana (25 µ9 disuelto en 20 µ? de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) ) o control de vehículo (PBS) la función de las vías aéreas se valoró a 24 horas después de la última administración de IL-13 al incrementar los estímulos de metacolina y se monitorizó usando pletismografxa consiente (Buxco) . La PC20o (concentración de metacolina requerida para incrementar penH de línea base por 200 %) se determinó de ajuste a la curva no fijado de 4 parámetros de curvas de respuesta de dosis de metacolina. Los tratamientos de anticuerpos se administraron por inyección intra-peritoneal 24 horas antes de cada dosis de IL-13.

Resultados La instalación intratecal de IL-13 humana en ratones Cándidos tipo silvestre dio por resultado desarrollo de hipersensibilidad significativa (p<0.05) de las vías aéreas con relación a los animales de control como se determina por concentraciones de metacolina de PC20o · BAK502G9 administrado de manera sistémica (1 mg/kg) inhibió de manera significativa (p<0.01) el desarrollo de la AHR en tanto que el anticuerpo de control nulo no tuvo efecto (Figura 23) .

Ejemplo 25 Potencia de neutralización de BAK502G9 como una IgG4 humana contra liberación de IgE dependiente de IL-13 humana de células B humanas Protocolo de ensayo de cambio de células B Se ha mostrado que IL-13 induce síntesis de IgE en células B humanas in vitro [120] . La liberación de IgE dependiente de factor de células B humanas se determinó por ELISA. La potencia de neutralización de BAK502G9 como una IgG4 humana se valoró contra liberación de IgE dependiente de IL-13 humana de células B humanas. Se purificaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de capa leucocitaria humana (Blood Transfusión Service) por centrifugación sobre un gradiente de densidad de 1.077 g/L. Las células B se purificaron de PBMC con un equipo II de aislamiento de células B (Miltenyi Biotec) , usando los reactivos y métodos distintos por el fabricante. El medio de ensayo comprendió medio dulbecco modificado de Iscoves (Life Technologies) que comprende el 10 % de suero bovino fetal y 20 g/mL de transferrina humana (Serologicals Proteins Inc) . Después de la purificación, las células B se re-dispersaron a una concentración final de 10s/mL en medio de ensayo. Se adicionaron 50 µ? de células re-dispersadas a cada punto de ensayo en una placa de ensayo de 96 cavidades. Se adicionaron 50 µ? de 4 µg/mL del anticuerpo anti-CD40, EA5 (Biosource) a las cavidades de ensayo como es apropiado. Se diluyeron las soluciones de " prueba"de "los" anticuerpos (seis replicas) a la concentración deseada en el medio de ensayo. Se usó un anticuerpo irrelevante no dirigido a IL-13 como un control negativo. Se adicionaron las células 50 µ?/cavidad del anticuerpo de prueba apropiado. Se adicionó de manera subsiguiente IL-13 humana recombinante bacterianamente derivada de (Peprotech) a una concentración final de 30 ng/ml para dar un volumen total de ensayo de 200 µ?/cavidad. La concentración de IL-13 usada en el ensayo se seleccionó para dar una respuesta máxima. Las placas de ensayo se incubaron durante 14 días a 37° bajo CO2 al 5 %. Se determinaron los niveles IgE en el sobrenadante por ELISA usando reactivos y protocolos suministrados por el fabricante (BD Biosciences, Bethyl Laboratories) . Se analizaron los datos usando el programa Graphpad Prism.

Resultados Como se demuestra en la Figura 24, BAK502G9 (VH SEQ ID NO: 15, VL SEQ ID NO: 16) fue capas de inhibir la producción de IgE dependiente de IL-13 humana por células B humanas. BAK502G9 como IgG4 humana tuvo una IC50 de 1.8 nM contra 30 ng/ml de IL-13 humana.

Ejemplo 26 Eficacia de BAK502G9 contra potenciación mediada por IL-13 de señalización de Ca2* inducida por histamina en células de músculo liso, bronquial, humanas primarias Se ha mostrado que IL-13 modula directamente la contractilidad de músculo liso de las vías aéreas [121, 122] la movilización de calcio intra-celular es un pre-requisito para la contracción de músculo liso. Estudios recientes han mostrado que la capacidad de IL-13 para alterar la contractilidad del músculo liso se media en parte a través de la modulación de señalización de Ca2+ inducida por agonista contráctil [123, 124] . La eficacia de BAK502G9, un anticuerpo anti-IL-13 humana formateado como IgG4, contra alteraciones mediadas por IL-13 en respuestas de señalización de células de músculo liso, bronquiales humanas primarias (BS C) al agonista contráctil, histamina, se investigó en el ensayo de señalización Ca2+.

Protocolo de ensayo de señalización de Ca2+ de BSMC Se obtuvieron BSMC primarias humanas, Medio-2 de Crecimiento de Músculo Liso (SmGM-2) y Medio Basal de Músculo Liso (SmBM) de Bio Whittaker. Las BSMC se mantuvieron en SmGM-2 de acuerdo a las recomendaciones del proveedor. Se colocaron en placa las BSMC a 2 x 104 células/cavidad en una placa de cultivo celular de microtitulo de 96 cavidades y se dejaron unir durante 24 horas luego se re-alimentaron y se incubaron durante 24 horas adicionales. Antes del experimento de señalización de Ca2+, las BSMC se estimularon con IL-13 (Peprotech) a 50 ng/ml de concentración final con o sin anticuerpo y se encubó durante 18-24 horas. BAK502G9 y un anticuerpo monoclonal de control, y relevante, correspondido en isotipo, CAT-001, se evaluaron a una concentración final de 10 µ9/p?1. Los cambios en las concentraciones intracelulares de Ca2+ en la respuesta a histamina (Calbiochem) , titulado de 20 µ?, se midieron usando técnicas normales con tinte sensible a Ca2+ Fluo-4 (Molecular Probes) y un Lector de Placa de Formación de Imágenes por Florescencia de 96 cavidades (FLIPR) (Molecular Devices) . El área bajo la curva (AUC) de la ruta de señalización de Ca2+ a histamina se determinó para cada condición de pre-tratamiento celular. Se realizaron análisis de datos usando GraphPad Prism versión 4 Windows (Graphpad Software) .

Resultados La pre-incubación de BSMC con IL-13 mejoró significativamente la señalización de Ca2+ en respuesta a histamina. La pre-incubación de BAK502G9 (Figura 25B) (pero no un anticuerpo de control de isotipo irrelevante (Figura 25a) ) con IL-13 inhibió de manera significativa la potenciación de la señalización de Ca2+ en respuesta a histamina (Figura 25) .

Ejemplo 27 Potencia de neutralización de anticuerpos anti-IL-13 en ensayo de expresión de CD23 de PBMC dependiente de IL-13 humana La potencia de un anticuerpo de IL-13 representativo se evaluó en el ensayo de expresión de CD23 de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) dependiente de IL-13. Las PBMC responden tanto a IL-13 como a IL-4 al incrementar la expresión superficial celular de CD23 [120] . El CD23 (FceRII) es el receptor de baja afinidad para IgE y se expresa en una variedad de células inflamatorias, incluyendo monocitos. La inhibición del favorecimiento de expresión de CD23 dependiente de IL-13 humana se determinó al medir la reducción en la unión del anticuerpo monoclonal CD23 fluorescentemente marcado a las PBMC por citometría de flujo.

Protocolo de ensayo Se obtuvo sangre humana del Blood Transfusión Service y los eritrocitos se agotaron por sedimentación de dextran-T500 de 40 minutos (Pharmacia) (concentración final de 0.6 %) . La fracción de alto contenido de leucocitos y plaquetas entonces se separó por una centrifugación de 1137 g de 20 minutos sobre un gradiente Percoll discontinuó de 3 mL 64 % y 5 mL 80 % (100 % fue 9 partes de Percoll y 1 parte de lOx PBS) . Las PBMC se recolectaron de la parte superior de la capa de 64 %, se lavaron y re-dispersaron en amortiguador de ensayo (Invitrogen RPMI 1640, 10 % FCS, 200 IU/mL penicilina, 100 µg/mL estreptomicina, L-Glutamina 2 mM) . El ensayo se realizó en placas de 24 cavidades con 2 x 106 células ± 80 pM de IL-13 humana recombinante (Peprotech) o 21 pM de IL-4 humana recombinante (R&D Systems) , ± BAK502G9 o IgG4 irrelevante, en un volumen final de 500 mcL. Las células se cultivaron durante 48 h a 37°C antes de que se recolecten y se tiñan con CD23-PE (BD Pharmingen) durante 20 minutos a 4°C finalmente, se leyeron las células en un citómetro de flujo. Se determinó la expresión de CD23 por la "puntuación" de CD23 el por ciento de células positivas a CD23 se multiplicó por el "brillo" de la mancha (fluorescencia geo-promedio) . No se sustrajo la "puntuación" de CD23 estimulante y los datos presentados como un porcentaje de la respuesta de IL-13 sola (100 %) los datos se han expresado como la media + SEM extraídos de 4-6 experimentos separados, usando células de 4-6 donadores individuales, realizado en triplicado para cada punto.

Resultados La incubación de PBMC con 80 pM IL-13 o 21 pM IL-4 durante 48 horas dio por resultado la expresión clara de CD23 (Figura 27 y Figura 28) . La expresión de CD23 inducida por IL-13 inhibida de manera dependiente de la dosis por BAK502G9 con una media geométrica de 120.2 pM (Figura 27) . En contraste BA 502G9 fue incapaz de inhibir la expresión de CD23 inducida por 21.4 pM IL-4 (n=4 de donadores individuales, Figura 28) . La IgG4 irrelevante no inhibió la expresión de CD23 dependiente de ya sea de IL-13 o IL-4 en las PBMC ( (Figura 27 y Figura 28) . La co-estimulación de PBMC con 80p IL-13 y 21 pM IL-4, produjo una respuesta aditiva de CD23. BAK502G9, pero no CAT-001, redujo los niveles de expresión de CD23 a aquellos vistos en la estimulación de IL-4 sola. (Figura 28) .

Ejemplo 28 Potencia de neutralización de un anticuerpo de IL-13 humana en un ensayo de cambio de forma de eosinófilos dependiente de IL-13 humana Las finalidades de este estudio fueron evaluar el efecto de los anticuerpos de IL-13 en el cambio de forma de eosinófilos inducido por mediadores liberados de NHLF seguido de la estimulación con factores encontrados en los pulmones de asmáticos tal como IL-13 [125, 126] , TNF-a {127], TGF- ? [128]. La sinergia de IL-13 con TNF-a {129] o TGF-ß? [130] para inducir fibroblastos para producir eotaxina-1, que entonces puede actuar para guimioatracar directamente eosinóf los . Se median las respuestas de cambio de forma de leucocito a través de los re-arreglos del cito-esqueleto celular y son esenciales a los procesos de migración de leucocitos de la microcirculación en los sitios de inflamación. La inhibición de la liberación de factor de inducción de cambio de forma dependiente de IL-13 por NHLF se determinó al medir la reducción en la secreción de eotaxina-1 por ELISA y la reducción en le cambio de forma de eosinó ilos por citometría de flujo.

Protocolo de ensayo Se co-cultivaron células de NHLF con medio solo o medio que contiene estimulantes (9.6 nM IL-13, 285.7 p TNF- (R&D Systems) y 160 pM TGF-ß? (R&D Systems) en la ausencia o presencia de BAK502G9 (intervalo de concentración 875 nM-6.84 nM) . Entonces las células se cultivaron durante 48 h adicionales a 37°C antes de que el medio acondicionado resultante se aspirara y almacenará a -80°C. La concentración de eotaxinas-1 en el medio acondicionado se valoró usando el sistema ELISA R&D systems Duoset ELISA (R&D Systems) . Se obtuvo sangre humana del Servicio de Transfusión de sangre y los eritrocitos se agotaron por sedimentación de dextran-T500 de 40 minutos (Pharmacia) (concentración final de 0.6 %) . La fracción de alto ontenido de leucocitos y plaquetas entonces se separó por una centrifugación de 1137 g de 20 minutos sobre un gradiente discontinuó de Percoll de 3 mL 64 % y 5 mL 80 % (100 % fue 9 partes de Percoll y 1 parte de lOx PBS) . Se recolectaron los granulositos de la interfaz 64 %: 80 %, se lavaron y re-dispersaron en amortiguador de ensayo (Sigma PBS, 1 M CaC12, 1 mM gCl2, lOmM HEPES, 10 mM D-glucosa, 0.1 % Sigma BSA, pH 7.3). El ensayo se realzó en tubos FACS con 5 x 105 células, + 3 nM de eotaxina humana recombinante (R&D Systems) o medio acondicionado, en un volumen final de 400 µ??. Las células se encubaron durante 8.5 minutos a 37°C antes de que se transfirieran a 4°C y se fijaran con un agente de fijación (CellFix, BD Biosciences) y finalmente, se leyeron en un citómetro de flujo. Los eosinófilos se identificaron por su autoflorescencia de FL-2 y se leyó el parámetro de dispersión delantera (FCS) . El FCS de los eosinófilos cambio respuesta tanto eotaxina-1 como al medio acondicionado que proporciona medición del cambio de forma. Los tubos se muestrearon con una alta velocidad de flujo y se terminó la adquisición después de 1000 eventos de eosinófilos o 1 minuto, lo que ocurra primero. Se calculó el cambio de forma como un por ciento de FSC por amortiguador de cambio de forma solo (cambio de forma en blanco y 100 %) . Los datos se han expresado como la media del cambio de forma en blanco en % + SEM extraídos de 4 experimentos separados. Cada experimento usó células de la capa leucocitaria individual (y por lo tanto donador individual) , realizado en duplicado para cada punto.

Resultados La células de NHLF co-estimuladas con 9.6 nM IL-13, 285.7 pM TNF-a y 160 pM TGF-ß? y. cultivadas durante 48 horas segregaron 9.6 nM de eotaxina-1 en el medio de cultivo. En contraste, las células NHLF cultivadas únicamente con el medio de mantenimiento segregaron eotaxina-1 0.1 nM en el medio de cultivo, Esta producción de eotaxina-1 fue dependiente de IL-13 puesto que la producción de eotaxina-1 de células NHLF co-estimulada con IL-13/TNF-OÍ/ TGF-ß? se inhibió de manera dependiente de la dosis por BAK502G9 con una IC50 de 32.4 nM (Figura 29A) . La finalidad principal de esta base del estudio fue examinar el cambio de forma de eosinófilos . La magnitud del cambio de forma de eosinófilos en respuesta a eotaxina 3 nM (control positivo) fue 122.2 + 2.1 % (n=4) . El cambio de forma elegido por eotaxina-1 se inhibió completamente por 100 nM de un anticuerpo anti-eotaxina el CAT-213, cambio de forma promedio 101.0 ± 1.0 % (n=4) . Los medios de las células NHLF co-estimuladas con 9.6 nM IL-13, 285.7 pM TNF-a y 160 pM TGF-ß? y cultivadas 48 horas (medio acondicionado) indujo un claro cambio de forma y de eosinófilos (Figura 29B) . En contraste, el medio de las NHLF cultivadas durante 48 h el medio del mantenimiento de NHLF solos no indujo cambio de forma de eosinófilos (Figura 29B) . La adición del anticuerpo anti-IL-13 BAK502G9 a medio co-estimulado antes del cultivo de NHLF, dio por resultado una inhibición dependiente de la dosis del cambio de forma de eosinófilos, con una IC50 media geométrica de 16.8 nM cuando se ensayó a dilución 1:16 (Figura 28B) . La capacidad de los estimulantes (IL-13, TNF-cc y TGF-ß?) no cultivados con células NHLF para inducir cambio de forma de eosinófilos y neutrófilos también se investigó. IL-13 9.6 nM, TNF-a 285.7 pM y TGF-ß? 160 pM no indujeron un cambio de forma claro de eosinófilos. Esto sugiere que la capacidad de cambio de forma de eosinófilos del medio condicionado se desarrolla durante el cultivo de células NHLF con los estimulantes no es debido a alguno de los estimulantes solo o en combinación (Figura 29B) .

Ejemplo 29 Correlación de anticuerpos anti-IL-13 en IL-13 Humana La correlación de epítopes de un anticuerpo de IL-13 representativo BAK502G9 se realizó usando un planteamiento molecular y escisión normal con péptidos.

Planteamiento Molecular Se manejaron quimeras de IL-13 donde se reemplazaron las partes de la secuencia de IL-13 humana con secuencia murina. Estas quimeras se usaron en estudios de unión con anticuerpos de IL-13 representativos para ayudar a identificar el epítope especifico. Se produjeron dos paneles de quimeras de IL-13. El primer panel contuvo nueve quimeras (Figura 30) y se usó para localizar la posición general del epítope y el segundo panel contuvo diez quimeras (Figura 31) y se usó para correlación fina del epítope. Se montaron las secuencias quiméricas de IL-13 usando PCR y se clonaron en un vector de entrada Gatewaymr, que entonces se recombinaron con un vector de destino pDEST8 (modificado para codificar una marca de detección y afinidad en el C-término de la proteína recombinante) . Estos vectores de expresión se usaron para transformar E. coli químicamente competente DHlOBac" que permite la transposición específica del sitio de la IL-13 quimérica marcada, en el vector de transporte de baculovirus (bacmid) . Se aisló el ADN recombinante de bacmid para cada quimera de IL-13 y se transíectó en células de insecto Sf9 (Spodoptera frugiperda) usando el reactivo Cellfectin se recolectó el baculovirus recombinante 72 horas después de la transfección y se pasó a través de células de insecto Sf9 dos veces más . Se purificó el sobrenadante de cultivo de insecto de 200-500 mi en una columna de afinidad y se concentró el material eluido de 16 a 1 mi y se cargó en una columna de exclusión de tamaño Superdex 200 HR10/300GL para intercambio de amortiguador y pulido final. Se desarrolló un ensayo de competición homogénea usando IL-13 humana biotinilada, estreptavidina-antofiocinato BA 502G9 marcado con Europio. El ensayo es como sigue: Eu-BAK502G9 se une a IL-13 human biotinilada, el complejo entonces se reconoce por el conjugado APC de estreptavidina y luego se aplica un centelleo de luz, la energía se transfiere de la marca de APC al Europio por proximidad, y se puede medir la fluorescencia resuelta en tiempo. Se introduce la competición para esta unión por medio de la IL-13 humana no marcada (como control) y las construcciones quiméricas. Esta competición se cuantifica para calculas las afinidades relativas de los mutantes de IL-13 para anticuerpos de IL-13 que permiten mutaciones que alteran la unión que se va a identificar.

Resultados Se encontró que la construcción quimérica IL-13-Hélice D (Tabla 5) es el competidor más débil contra IL-13 humana biotinilada para la unión a BAK502G9, indicando que la héliceD dentro de la molécula de IL-13 está comprendida con la unión del epítope de BAK502G9 (Tabla 5) . También se vio actividad reducida para los mutantes 4041 y 3334 donde los residuos 40, 41 y 33, 34 de la secuencia de origen se cambiaron respectivamente indicando implicación potencial de la héliceA en el reconocimiento de BAK502G9. Las actividades reducidas de la asa 3 se descontaron puesto que esta asa tiene un número reducido de aminoácidos en el mutante en comparación a la molécula humana y es probable que altere la estructura completa de la proteína. No se consideraron otras reducciones en la capacidad de las moléculas quiméricas de IL-13 para competir por la unión a BAK502G9 de manera significativa para estos cambios de aminoácidos. Entonces se probó un conjunto más seleccionado, objetivo de mutaciones dentro de la hélice D (Figura 26) . Los resultados obtenidos se demuestran en la Tabla 6 y son como sigue : Los resultados muestran que las construcciones quiméricas 116117T (donde lisina en la posición 116 se reemplaza con treonina y el aspartato en la posición 117 se reemplaza con lisina) , 123KA (donde lisina en la posición 123 se reemplazó) y 127RA (donde se reemplazó arginina en la posición 127) son al menos capaces de competir para la unión a BAK502G9 (123KA y 127RA no compiten a 1 µ?) . Otros residuos implicados en la unión a BAK502G9 debido a su efectividad reducida en el ensayo de competición incluyen los residuos de la héliceD 124D (donde se ha reemplazado lisina con glutamina) y 120121SY (se ha cambiado un par de histidina-leucina a un par de tirosina-serina) . La mutación de leucina en la posición 58L también reduce la unión y el análisis de las estructuras 3D reveló que estos paquetes de residuo contra héliceD y ya sea se pueden poner en contacto directamente por BA 502G9 o puede afectar la alineación de la héliceD. Estos experimentos demuestran que los residuos dentro de la héliceD son críticos para la unión de BAK502G9 a IL-13. En particular, la lisina en la posición 123 y la arginina en la posición 127 son críticos para esta unión como mutación a cualquiera anula la unión de BA 502G9.

Excisión de Epítope También se realizó la correlación de epítope de BAK502G9 usando el procedimiento normal de escisión de epítope. Aquí se inmovilizó IgG sobre fase sólida y se dejó capturar el ligando de IL-13. El complejo formado entonces se sometió a digestión proteolítica específica, durante lo cual se escinden los enlaces peptídicos accesibles, sin embargo aquellos protegidos por la interconexión IgG: ligando permanecen intactos. De esta manera, un péptido que contiene el epítope permanece unido a IgG. Esto entonces se puede desorber, recolectar e identificar por espectrometría de masas (ms) . Se usaron dos técnicas de complementariedad, la primera hizo uso del espectrómetro de masas Ciphergen ProteinChip Reader MALDI-TOF, donde fue posible enlazar covalentemente la IgG a un circuito de espectrómetro de masa y luego realizar la digestión y extracción in situ. La segunda técnica usó BAK502G9 biotinilada enlazado a cuentas revestidas con estreptavidina y permitió la colección de suficiente péptido para la confirmación de la secuencia por espectrometría de masas en tándem (ms/ms) . Los dos procedimientos aunque difieren en detalle y escala comprendieron esencialmente los mismos pasos, acoplamiento de IgG, bloqueo de' ~ sitios" ~de ~ "unión sin reaccionar, lavado, captura de ligando, remoción de ligando no unido, digestión y un paso final de lavado. El planteamiento de MALDI-TOF ms hizo uso de circuitos ms patentados activados con carbonildiimidazol que se une covalentemente a los grupos amina primarios libres a los cuales la IgG a 1-2 mg/ml en PBS se acopló durante la noche a 4°C. El circuito se bloqueo de manera subsiguiente con una solución de etanolamina a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se lavó extensivamente con PBS o HBS más un detergente adecuado. Entonces se aplicó una alícuota de un picomol de IL-13 al circuito en ya sea PBS o HBS y se dejo unir a la IgG químicamente inmovilizada durante 2 horas a temperatura ambiente. Esto se siguió por lavados adicionales en PBS o HBS con y sin detergente para remover cualquier IL-13 no unida de forma específica. Entonces se aplicó una solución de tripsina que varía de 200 a 3.1 µ9/p?1 en PBS o HBS al complejo de IgG: ligando y la digestión se dejó proseguir durante 30 minutos a temperatura ambiente después de lo cual se lavó el circuito en PBS o HBS más detergente, PBS o HBS y finalmente agua. Después de la aplicación de una matriz adecuada de MALDI-TOF ms, el circuito entonces se colocó directamente en el espectrómetro de masas y se analizó. El planteamiento basado en cuentas inició con la biotinilación de la IgG, usando un compuesto de biotina de NHS, a una relación molar de 1 molécula de IgG a 4 moléculas de biotina. La remoción de biotina no unida y los subproductos de la reacción usando filtración en gel se siguió a esto. Entonces, la IgG biotinilada se dejó unir a cuentas de agarosa revestidas con neutravidina, donde se intentó aumentar al máximo la captura de IgG. Entonces se distribuyeron alícuotas de cuentas revestidas con IgG en columnas giratorias concentradoras y se lavó con PBS de Dulbecco + Tween 20 al 0.05 % seguido por resuspensión en PBS de Dulbecco + Tween 20 al 0.5 %. Entonces se aplicó un impulso de IL-13 a las cuentas de IgG redispersadas y la unión se dejó proseguir durante 10 minutos después de lo cual se removió la fase líquida por centrifugación y las cuentas se lavaron con PBS de Dulbecco + Tween 20 al 0.05 % seguido por resuspensión en PBS de Dulbecco + Tween 20 al 0.05 %. El complejo de cuenta : IgG : ligando entonces se sometió a proteólisis con ya sea tripsina o quimiotripsina con incubación a temperatura ambiente a 37°C. Después de lo cual, las cuentas se lavaron nuevamente en PBS de Dulbecco + Tween 20 al 0.05 % seguido por lavados adicionales en PBS de Dulbecco sin detergente. La cuentas entonces se redispersaron en una mezcla de agua, acetonitrilo y ácido trifluoroacético y el sobrenadante se recuperó. Esto entonces se analizó de forma variada ya sea por MALDI-TOF ms o por espectrometría de masas de HPLC de fase invertida, incluyendo fragmentación en tándem (ms/ms) usando el espectrómetro de masas de trampa iónica ThermoQuest LCQ ESI . Entonces se hizo un intento para hacer corresponder el patrón de fragmentación resultante a la secuencia de IL-13 humana y la secuencia de cadena pesada y ligera separada de IgG de BAK502G9. Durante la secuencia experimental, se emplearon varios controles, superficies principalmente en blanco, IgG únicamente y controles de isotipo para demostrar que los péptidos identificados se derivaron específicamente de IL-13 capturada por IgG y no un producto de BAK502G9 o digestión de IL-13 no unida de forma específica.

Resultados Las series experimentales dieron consistentemente péptidos específicos de IL-13 individuales para cada digestión. Los datos del instrumento de trampa iónica de LCQ revelaron que el fragmento tríptico tuvo una masa monoisotópica de 3258Da (MH+) y el fragmento de quimiotripsina una masa monoisotópica de 3937Da (MH+) . Una búsqueda de estas masas contra la digestión en silicio apropiada de IL-13 humana dio correspondencias cercanas a los péptidos relacionados en la porción C-terminal de la molécula.

Correspondencia para masas de péptido de tripsina: 3258 Da A una tolerancia de 1000 ppm, 3258 Da corresponde a la secuencia de ácido aspártico en la posición 106 de la asparagina C-terminal en la posición 132. No hay otras correspondencias en esta tolerancia. Esta región se resalta en negritas en la secuencia de la forma precursora de IL-13 humana a continuación. MALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGS VWSINLTAGM YCAALESLINVSGCSAIE TQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKK LFREGRFN Correspondencia para masas de péptido de quimiotripsina: 3937 Da A una tolerancia de 1000 ppm, 3937 Da corresponde a la secuencia de serina en la posición 99 de la asparagina C-terminal en la posición 132. Esta región se resalta en negritas en la secuencia de la forma precursora de IL-13 humana a continuación.

ALLLTTVIALTCLGGFASPGPVEPSTALRELIEELV ITQNQKAPLCNGS WSINLTAGM YCAALESLINVSGCSAIEKTQR LSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTl^EVAQFVKDLLLHLKK LFRESRFN Ambas de estas correspondencias muestran que IgG de BAK502G9 retiene la porción C-terminal de la molécula de IL-13 durante la proteólisis del complejo anticuerpo: ligando. La identidad de ambos péptidos se confirmó exitosamente por ms/ms, ninguno de los cuales mostró alguna secuencia significativa paralela con BAK502G9. El mapa de fragmento de ms/ms adaptado para identificar ya sea los iones Y o B correspondió a 26 de 104 iones posibles en un estado de carga para el péptido de tripsina y a 19 de 128 iones posibles para el péptido de quimiotripsina . Una revisión de todos los estados de carga muestra la identificación de 23 de los 27 residuos de aminoácido para el fragmento de tripsina y de 29 de los 33 residuos para el fragmento de quimiotripsina. Esto es suficiente para confirmar la identidad. La secuencia experimental como una totalidad ha identificado que parte del epítope de BAK502G9 en IL-13 humana como está dentro de los veintisiete residuos de aminoácidos C-terminales . Estos hallazgos corroboran el hallazgo del planteamiento molecular detallado anteriormente .

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Cmax 349.04 (t=0.25h) Vdinf 75.03 (mL.kg-1) Clinf 0.23 < 80 mL/kg, infiere no (mL . hr" unión a tejido. 1.kg"1) AUCinf 42.99 (mg.h.mL-1) AUCext 17.34 (%) TQ.5 223.55 < 30 % de modo que debe (h) ser exacta la depuración y volumen de distribución Vdinf = volumen de distribución durante tiempo 0 - infinito, calculado de la AUC extrapolada. Cljnf = depuración durante tiempo 0 - infinito, calculado de la AUC extrapolada. AUCjnf = área bajo la curva (medida de la exposición total a fármaco) durante tiempo 0 infinito, incluyendo un término extrapolado basado en la constante (k) de velocidad de eliminación y la última concentración observada de fármaco en suero . UCext = porcentaje de la AUC total que se extrapoló T0.5 = Vida media de fármaco en la fase de eliminación terminal .

Tabla 5 Primer conjunto de construcciones Quiméricas Construcciones quiméricas IC50 nM BAK502G9 0.17 ± 0.07 asal 0.71 ± 0.35 indic-hum 1.30 ± 0.18 30R 1.76 ± 0.45 3738V 1.89 ± 1.9 éliceB 2.49 ± 0.88 héliceC 4.11 ± 0.70 asa3 5.45 ± 3.96 4041 12.02 + 1.3 334 12.17 ± 1.2 héliceD 110.07 ± 9.9 Tabla 6 Segundo Conjunto de Construcciones Quiméricas Tabla 7 ; Efectos de BAK502G9 en varios puntos terminales predefinidos .

Parámetro Cambio de N Cambio de N Punto fase I fase II terminal AHR (RL AUC) 0.020+0.003 14a 0.004±0.006 14a -0.016+0.006* AHR (PC30) -1.343±318 18b 1.061±0.244 18b 0.282+0.179 Cebadura con antígeno 0.159+0.033 20c 0.033±0.025 20c 0.126+0.043* (RL AUC) Células totales de 20.623+3.160 21d 14.597±1.951 21d -6.026±2.194* BAL Eosinófilos 18.453+3.009 21d 13.412+1.737 21d -5.041i2.090* de BAL Células mononucleares 2.050+0.438 21d 1.176+0. 81 21d -0.874+0,506 de BAL 21 animales que exhibieron AHR (PC30) en la Fase I y un animal adicional con un fenotipo de cebadura de antígeno se llevaron a la prueba en la fase II (22 en total) . Ningún animal tuvo AHR como se mide tanto por AUC como por PC3U. Los únicos animales que exhibieron AHR en la fase I y cuya AHR con se valoró tanto en la Fase I como en la Fase II se incluyeron en los resultados de AHR. Se realizó la prueba estadística usando InStat. La prueba fue una prueba t de student bidireccional contra la hipótesis nula que el punto terminal incluye el número 0 (es decir, no hubo cambio en la fase II en comparación a la fase I); *p<0.05, **p<0.01. Se muestran datos como media aritmética ± SEM (n=14+21) . a5 se excluyeron los animales del análisis de AUC puesto que no exhiben AHR (AUC incrementada) en Fase I . 3 se excluyeron animales adicionales debido a una falla técnica en la recolección de datos de la función de las vías aéreas da Fase II. b3 se excluyeron animales del análisis de PC30 debido a una falla técnica en la recolección de datos de la función de las vías aéreas de Fase II (mismos animales como en a) . El animal adicional con fenotipo de cebadura de antígeno se excluyó puesto que no exhibió PC30 AHR en Fase I . c2 se excluyeron animales del análisis de cebadura de antígeno puesto que hubo una falla técnica en la recolección de datos de función de vías aéreas de Fase I . dl se excluyó el animal del análisis de BAL debido a la inflamación de BAL marcada al inicio del estudio.

BAK278D6 CADENA PESADA- CDRl- SEQ ID NO 1 NYGLS CDR2- SEQ ID NO 2 P?ISANGDTNYGQEFQG CDR3- SEQ ID NO 3 DSSSNWARWFFDL BAK278D6 CADENA LIGERA CDRl- SEQ ID NO 4 GGNNIGS LVH CDR2- SEQ ID NO 5 DDGDRPS CDR3- SEQ ID NO 6 QV DTGSDP BAK502G9 CADENA PESADA CDRl- SEQ ID NO 7: NYGLS CDR2- SEQ ID NO 8: ISANGDTNYGQEFQG CDR3- SEQ ID NO 9: DSSSSWARWFFDL CADENA LIGERA CDR1-SEQ ID NO 10: GGNIIGSKLVH CDR2-SEQ ID NO 11: DDGDRPS CDR3-SEQ ID NO 12: QVWDTGSDPW BA 278D6 DOMINIO DE CADENA PESADA SEQ ID NO Id: EVQLVQSGAEVK PGASV VSC ASGYTFRNYGLSWVRQAPGQGLEW GWISANNGDTN YGQEFQGRITMTTETSTNTAHMELRSLRSDDTAVYYCVRDSSSNWARWFFDLWGKGTMV VSS BAK278D6 DOMINIO DE CADENA LIGERA SEQ ID NO 14: SYVLTQPPSVSVAPGQTARIPCGGNNIGSKLVHWYQQKPGQAPVLWYDDGDRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISRIDAGDEADYYCQVWDTGSDPWFGGGTKLTVL BAK502G9 DOMINIO DE CADENA PESADA SEQ ID NO 15: QVQLVQSGAEVKKPGASV VSCKASGYTFraYGLSWRQAPGQGLEWMGWISANNGDTN YGQEFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDSSSSWARWFFDLWGRGTLV TVSS BAK502G9 DOMINIO DE CADENA LIGERA SEQ ID NO 16: SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNIIGSKLVH YQQKPGQAPVLVIYDDGDRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTGSDPWFGGGTPLTVL BAK278D6 CADENA PESADA FR1- SEQ ID NO 17: EVQLVQSGAEV KPGASV VSC ASGYTFR FR2- SEQ ID NO 18: WVRQAPGQGLE MG FR3- SEQ ID NO 19: RITMTTETSTNTAHMELRSLRSDDTAVYYCVR BAK278D6 CADENA LIGERA FR1- SEQ ID NO 20: SYVLTQPPSVSVAPGQTARIPC FR2- SEQ ID NO 21: WYQQKPGQAPVLWY FR3- SEQ ID NO 22: GI ERFSGSNSGNTATI ISRIDAGDEADYYC BA 167A11 DOMINIO DE CADENA PESADA SEQ ID NO 23: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMS VRQAPGKGLE VSAISGSGGSTY YADSVKGRFTISRDNS NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGAAGEGYYGY GRGTLVTV BAK167A11 DOMINIO DE CADENA LIGERA SEQ ID NO 24: NFMLTQPHSVSES PGKTVTISCTRS SGSIASNYVQ YQQRPGSAPTTVIYDDNQRPSGV PDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSNNDVFGGGTKVTVL BAK209B11 DOMINIO DE CADENA PESADA SEO ID NO 25: QVQLQESGGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLESfVSSISASGDST FYADSVKGRFTISRDNNKNMVFLQVNSLRñDDTAVYFCA DWSQWLVGDAFDVWGRGTT VTVSS BAK209B11 DOMINIO DE CADENA LIGERA SEQ ID NO 26: DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSVSLWVAWYQQRPG APKLLIYDGSTLQSGVP ARFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQY TFSTFGQGTKVEIKRA FR1- SEQ ID NO 27 QVQLVQSGAEVK PGASVKVSCKASGYTFT FR2- SEQ ID NO 28 WYRQAPGQGLEWMG ETR3- SEQ ID NO 29 RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR BAK502G9 CADENA LIGERA FR1- SEQ ID NO 30: SYVLTQPPSVSVAPGKTARITC FR2- SEQ ID NO 31: WYQQKPGQAPVLVIY FR3- SEQ ID NO 32: GIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYC BAK615E3 DOMINIO DE CADENA PESADA SEQ ID NO 33: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG GLE VSAISGSGGSTY YADSVKGRFTISRDNS NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGKATTEEGYYGY GRGTLV IVSS BAK615E3 DOMINIO DE CADENA LIGERA SEQ ID NO 34 NFMLTQPHSVSESPG TVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSAPTTVIYDDNQRPSGV PDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSNNDVFGGGTKVTVL BAK1167F2 DOMINIO DE CADENA PESADA SEQ ID NO 35: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFEQTGVSWRQAPGQGLEW GWISANNGDTN YGQEFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDSSSSWARWFFDLWGRGTLV TVSS BAK1167F2 DOMINIO DE CADENA LIGERA SEQ ID NO 36: SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNIIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDGDRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQ DTGSDPWFGGGT LTVL BAK1183H4 DOMINIO DE CADENA PESADA SEQ ID NO 37: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINYDGGNTQ YGQEFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDSSSSWARWFFDLWGRGTLV VSS BAK1183H4 DOMINIO DE CADENA LIGERA SEQ ID NO 38: SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNIIGS LVHWYQQ PGQAPVLVIYDDGDRPSGIPE BFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTGSDPWFGGGT LTVL BAK1105H3 DOMINIO DE CADENA PESADA SEQ ID NO 39: QVQLVQSGAEV KPGASVPVSCKASGYTFTNYGLSWVRQAPGQGLEWMGWISGLNGETL YGQEFQGRVT TTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDSSSSWARWFFDLWGRGTLV VSS BAK1105H3 DOMINIO DE CADENA LIGERA SEQ ID NO 40: SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNIIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDGDRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTGSDPWFGGGTKLTVL BAK1111D10 DOMINIO DE CADENA PESADA SEQ ID NO 41: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGLS VRQAPGQGLE MG IATPDGQTS YGQEFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDSNSSWARWFFDLWGRGTLV TVSS BAK1111D10 DOMINIO DE CADENA LIGERA SEQ ID NO 42: SYVLTQPPSVSVAPG TARI CGGN11GSKLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDGDRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQV DTGSDPWFGGGTKLTVL BAK1167F4 DOMINIO DE CADENA PESADA SEQ ID NO 43: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFIDTGVSWVRQAPGQGLEWMGWISANNGDTN YGQEFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDSSSSWARWFFDLWGRGTLV TVSS BAK1167F4 DOMINIO DE CADENA LIGERA SEQ ID NO 44: SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNIIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDGDRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTGSDPWFGGGTKLTVL BAK1184C8 DOMINIO DE CADENA PESADA SEQ ID NO 45: QVQLVQSGMVK PGASVKVSCKASGYTFTNYGLS VRQAPGQGLEWMG ISGSNGYTS YGQEFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDSSSSWARWFFDLWGRGTLV TVSS BAK1184C8 DOMINIO DE CADENA LIGERA SEQ ID NO 46: SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNIIGS LVHWYQQKPGQAPVLVIYDDGDRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTGSDPWFGGGTKLTVL BAK1185E1 DOMINIO DE CADENA PESADA SEQ ID NO 47: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINDATGDTQ YGQEFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDSSSSWARWFFDLWGRGTLV TVSS BAK1185E1 DOMINIO DE CADENA LIGERA SEQ ID NO 48: SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNIIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDGDRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTGSDPWFGGGTKLTVL BAK1185F8 DOMINIO DE CADENA PESADA SEQ ID NO 49: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC ASGYTFTDYGLSWVRQAPGQGLE MGWIRNIDGYTI YGQEFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDSSSSWARWFFDLWGRGTLV VSS BAK1185F8 DOMINIO DE CADENA LIGERA SEQ ID NO 50: SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNIIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDGDRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTGSDPWFGGGTKLTVL BAK1187B4 DOMINIO DE CADENA PESADA SEQ ID NO 51: QVQLVQSG¾EV KPGASVKVSCK¾SGyTFTNYGLSWVRQAPGQGLE GWIDDDSGTTI YGQEFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDSSSSWARWFFDLWGRGTLV TVSS BAK1187B4 DOMINIO DÉ CADENA LIGERA SEQ ID NO 52: SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNIIGSKLVHWYQQKPGQAPVLVIYDDGDRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTGSDPWFGGGTKLTVL BAK1166G2 DOMINIO DE CADENA PESADA SEQ ID NO 53: QVQLVQSGAEVKKPGASV VSCKASGYTFANTGIS VRQAPGQGLEWMGWISANNGDTN YGQEFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDSSSSWARWFFDLWGRGTLV TVSS BAK1166G2 DOMINIO DE CADENA LIGERA SEQ ID NO 54: SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNIIGSKLVH YQQKPGQAPVLVIYDDGDRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDTGSDPVVFGGGTKLTVL BAK167A11 CADENA PESADA CDR1- SEQ ID NO 55: SYAMS CDR2- SEQ ID NO 56: AISGSGGSTYYADSV G CDR3- SEQ ID NO 57: VGAAGEGYYGY BAK167A11 CADENA LIGERA CDR1- SEQ ID NO 58 TRSSGSIASNYVQ CDR2- SEQ ID NO 59 DDNQRPS CDR3- SEQ ID NO 60 QSYDSNNDV BAK1167F2 CADENA PESADA CDR1- SEQ ID NO 61: QTGVS CDR2- SEQ ID NO 62: ISANGDTNYGQEFQG CDR3- SEQ ID NO 63: DSSSSWARWFFDL BAK1167F2 CADENA LIGERA CDRl- SEQ ID NO 64: GGNIIGSKLVH CDR2- SEQ ID NO 65: DDGDRPS CDR3- SEQ ID NO 66: QVWDTGSDPVV BA 1166G2 CADENA PESADA CDRl- SEQ ID NO 67: NTGIS CDR2- SEQ ID NO 68: WIS NGDT GQEFQG CDR3- SEQ ID NO 69: DSSSSWARWFFDL BA 1166G2 CADENA LIGERA CDRl- SEQ ID NO 70: GGNIIGSKLVH CDR2- SEQ ID NO 71: DDGDRPS CDR3- SEQ ID NO 72: QVWDTGSDPVV BAK1184C8 CADENA PESADA CDRl- SEQ ID NO 73: NYGLS CDR2- SEQ ID NO 74: WISGNGYTSYGKEFQG CDR3- SEQ ID NO 75: DSSSSWARWFFDL BAK118 C8 CADENA LIGERA CDRl- SEQ ID NO 76: GGNIIGSKLVH CDR2- SEQ ID NO 77: DDGDRPS CDR3- SEQ ID NO 78: QVWDTGSDPVV BAK1185E1 CADENA PESADA CDRl- SEQ ID NO 79: NYGLS CDR2- SEQ ID NO 80: WINDTGDTQYGQEFQG CDR3- SEQ ID NO 81: DSSSSWARWFFDL BA 1185E1 CADENA LIGERA CDR1- SEQ ID NO 82: GGNIIGSKLVH CDR2- SEQ ID NO 83: DDGDRPS CDR3- SEQ ID NO 84: QVWDTGSDPVV BAK1167F4 CADENA PESADA CDR1- SEQ ID NO 85: DTGVS CDR2- SEQ ID NO 86: WISANGDTNYGQEFQG CDR3- SEQ ID NO 87: DSSSSWARWFFDL BAK1167F4 CADERA LIGERA- CDR1- SEQ ID NO.88: GGNIIGSKLVH CDR2- SEQ ID NO 89: DDGDRPS CDR3- SEQ ID NO 90: QVWDTGSDPVV BAK1111D10 CADENA PESADA CDR1- SEQ ID NO 91: NYGLS CDR2- SEQ ID NO 92: WIATDGQTSYGQEFQG CDR3- SEQ ID NO 93: DSSSSWARWFFDL BA 1111D10 CADENA LIGERA CDR1- SEQ ID NO 94: GGNIIGSKLVH CDR2- SEQ ID NO 95: DDGDRPS CDR3- SEQ ID NO 96: QVWDTGSDPVV BAK1183H4 CADENA PESADA CDR1- SEQ ID NO 97: NYGLS CDR2- SEQ ID NO 98: WINYGGNTQYGQEFQG CDR3- SEQ ID NO 99: DSSSSWARWFFDL BAK11B3H4 CADENA LIGERA CDR1- SEQ ID NO 100: GGNIIGSKLVH CDR2- SEQ ID NO 101: DDGDRPS CDR3- SEQ ID NO 102: QVWDTGSDPW BAK1185H8 CADENA PESADA CDR1- SEQ ID NO 103 DYGLS CDR2- SEQ ID NO 104 WRINDGYTIYGQEFQG CDR3- SEQ ID NO 105 DSSSSWARTSFFDL BAK1185H8 CADENA LIGERA CDR1- SEQ ID NO 106: GGNIIGSKLVH CDR2- SEQ ID NO 107: DDGDRPS CDR3- SEQ ID NO 108: QVWDTGSDPW BAK278D6 CADENA PESADA- SEQ ID NO: 109 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT CTCCTGCAAGGC TCTGGTTACACCTTTACAAATTATGGTCTCAGCTGGGTGCGACAGG CCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTAATAATGGCGACACAAAT TATGGACAGGAATTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGATACATCCACGAGCACAGC CTACATGGAGTTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAG ACTCCAGCAGCAACTGGGCCCGCTGGTTTTTCGATCTCTGGGGCCGGGGGACACTGGTC ACCGTCTCCTCA BAK278D6 CADENA LIGERA- SEQ ID NO: 110 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGTAAGACGGCCAGGAT TACCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTAAACTTGTACACTGGTACCAGCAGAAGCCAG GCCAGGCCCCTGTGCTGGTCATCTATGATGATGGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAG CGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAGGC CGGGGATGAGGCCGACTATTATTGTCAGGTGTGGGATACTGGTAGTGATCCCGTGGTAT TCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT BA 502G9 CADENA PESADA- SEQ ID NO: 111 CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT CTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACAAATTATGGTCTCAGCTGGGTGCGACAGG CCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTAATAATGGCGACACAAAT TATGGACAGGAATTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGATACATCCACGAGCACAGC CTACATGGAGTTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAG ACTCCAGCAGCAGCTGGGCCCGCTGGTTTTTCGATCTCTGGGGCCGGGGGACACTGGTC ACCGTCTCCTCA BAK502G9 CADENA LIGERA- SEQ ID NO: 112 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGAT TACCTGTGGGGGAAACATCATTGGAAGTAAACTTGTACACTGGTACCAGCAGAAGCCAG GCCAGGCCCCTGTGCTGGTCATCTATGATGATGGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAG CGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAGGC CGGGGATGAGGCCGACTATTATTGTCAGGTGTGGGATACTGGTAGTGATCCCGTGGTAT TCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT BAK1105H03 CADENA PESADA- ' SEQ ID NO: 113 CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT CTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACAAATTATGGTCTCAGCTGGGTGCGACAGG CCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCTCCGGCTTGAACGGCGAGACATTG TATGGACAGGAATTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGATACATCCACGAGCACAGC CTACATGGAGTTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAG ACTCCAGCAGCAGCTGGGCCCGCTGGTTTTTCGATCTCTGGGGCCGGGGGACACTGGTC ACCGTCTCCTCA BAK1105H03 CADENA LIGERA- SEQ ID NO: 114 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGAT TACCTGTGGGGGAAACATCATTGGAAGTAAACTTGTACACTGGTACCAGCAGAAGCCAG GCCAGGCCCCTGTGCTGGTCATCTATGATGATGGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAG CGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAGGC CGGGGATGAGGCCGACTATTATTGTCAGGTGTGGGATACTGGTAGTGATCCCGTGGTAT TCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT BAK1111D10 CADENA PESADA- SEQ ID NO: 115 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT CTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACAAATTATGGTCTCAGCTGGGTGCGACAGG CCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCGCAACCCCAGACGGCCAGACAAGC TATGGACAGGAATTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGATACATCCACGAGCACAGC CTACATGGAGTTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAG ACTCCAACAGCAGCTGGGCCCGCTGGTTTTTCGATCTCTGGGGCCGGGGGACACTGGTC ACCGTCTCCTCA BAKllllDlQ CADENALIGERA- SEQ ID NO; 116 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGAT TACCTGTGGGGGAAACATCATTGGAAGTAAACTTGTACACTGGTACCAGCAGAAGCCAG GCCAGGCCCCTGTGCTGGTCATCTATGATGATGGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAG CGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAGGC CGGGGATGAGGCCGACTATTATTGTCAGGTGTGGGATACTGGTAGTGATCCCGTGGTAT TCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT BAK 1167F2 ~ " " " CADENA PESADA- SEQ ID NO: 117 CAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT CTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTGAGCAGACCGGCGTCTCCTGGGTGCGACAGG CCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTAATAATGGCGACACAAAT TATGGACAGGAATTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGATACATCCACGAGCACAGC CTACATGGAGTTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAG ACTCCAGCAGCAGCTGGGCCCGCTGGTTTTTCGATCTCTGGGGCCGGGGGACACTGGTC ACCGTCTCCTCA BAK 1167F2 CADENA LIGERA- SEQ ID NO: 118 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGAT TACCTGTGGGGGAAACATCATTGGAAGTAAACTTGTACACTGGTACCAGCAGAAGCCAG GCCAGGCCCCTGTGCTGGTCATCTATGATGATGGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAG CGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAGGC CGGGGATGAGGCCGACTATTATTGTCAGGTGTGGGATACTGGTAGTGATCCCGTGGTAT TCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT BAK 1167F04 CADENA PESADA- SEQ ID NO: 119 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT CTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCrTTATCGACACCGGGGTCTCCTGGGTGCGACAGG CCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTAATAATGGCGACACAAAT TATGGACAGGAATTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGATACATCCACGAGCACAGC CTACATGGAGTTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAG ACTCCAGCAGCAGCTGGGCCCGCTGGTTTTTCGATCTCTGGGGCCGGGGGACACTGGTC ACCGTCTCCTCA BAK 1167F04 CADENA LIGERA- SEQ ID NO: 120 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGAT TACCTGTGGGGGAAACATCATTGGAAGTAAACTTGTACACTGGTACCAGCAGAAGCCAG GCCAGGCCCCTGTGCTGGTCATCTATGATGATGGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAG CGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAGGC CGGGGATGAGGCCGACTATTATTGTCAGGTGTGGGATACTGGTAGTGATCCCGTGGTAT TCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT BAK 1183H4 CADENA PESADA- SEQ ID NO: 121 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT CTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACAAATTATGGTCTCAGCTGGGTGCGACAGG CCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACTACGACGGCGGCAACACACAG TATGGACAGGAATTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGATACATCCACGAGCACAGC CTACATGGAGTTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAG ACTCCAGCAGCAGCTGGGCCCGCTGGTTTTTCGATCTCTGGGGCCGGGGGACACTGGTC ACCGTCTCCTCA BAK 1183H4 CADENA LIGERA- SEQ ID NO: 122 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGAT TACCTGTGGGGGAAACATCATTGGAAG AAACTTGTACACTGGTACCAGCAGAAGCCAG GCCAGGCCCCTGTGCTGGTCATCTATGATGATGGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAG CGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAGGC CGGGGATGAGGCCGACTATTATTGTCAGGTGTGGGATACTGGTAGTGATCCCGTGGTAT TCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT BAK118 C8 CADENA PESADA- SEQ ID NO:123 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT CTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACAAATTATGGTCTCAGCTGGGTGCGACAGG CCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGGGAGCAACGGCTACACATCT TATGGACAGGAATTCCAGGGCAGAGTCACCA GACCACAGATACGTCCACGAGCACAGC CTACATGGAGTTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAG ACTCCAGCAGCAGCTGGGCCCGCTGGTTTTTCGATCTCTGGGGCCGGGGGACACTGGTC ACCGTCTCCTCA BAK118 C8 CADENA LIGERA- SEQ ID NO: 124 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGAT TACCTGTGGGGGAAACATCATTGGAAGTAAACTTGTACACTGGTACCAGCAGAAGCCAG GCCAGGCCCCTGTGCTGGTCATCTATGATGATGGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAG CGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAGGC CGGGGATGAGGCCGACTATTATTGTCAGGTGTGGGATACTGGTAGTGATCCCGTGGTAT TCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT BAK1185E1 CADENA PESADA- SEQ ID NO: 125 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT CTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACAAATTATGGTCTCAGCTGGGTGCGACAGG CCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACGACGCCACCGGCGACACACAG TATGGACAGGAATTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGATACATCCACGAGCACAGC CTACATGGAGTTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAG ACTCCAGCAGCAGCTGGGCCCGCTGGTTTTTCGATCTCTGGGGCCGGGGGACACTGGTC ACCGTCTCCTCA BAK1185E1 CADENA LIGERA- SEQ ID NO: 126 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGAT TACCTGTGGGGGAAACATCATTGGAAGTAAACTTGTACACTGGTACCAGCAGAAGCCAG GCCAGGCCCCTGTGCTGGTCATCTATGATGATGGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAG CGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAGGC CGGGGATGAGGCCGACTATTATTGTCAGGTGTGGGATACTGGTAGTGATCCCGTGGTAT TCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT BA 1185F8 CADENA PESADA- SEQ ID NO: 127 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT CTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACAGATTATGGTCTCAGCTGGGTGCGACAGG CCCCTGGACAAGGGCTAGAGTGGATGGGATGGATCCGCAACATCGACGGCTACACAATT TATGGACAGGAATTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGATACATCCACGAGCACAGC CTACATGGAGTTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAG ACTCCAGCAGCAGCTGGGCCCGCTGGTTTTTCGATCTCTGGGGCCGGGGGACACTGGTC ACCGTCTCCTCA BAK1185F8 CADENA LIGERA- SEQ ID NO: 128 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGAT TACCTGTGGGGGAAACATCATTGGAAGTAAACTTGTACACTGGTACCAGCAGAAGCCAG GCCAGGCCCCTGTGCTGGTCATCTATGATGATGGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAG CGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAGGC CGGGGATGAGGCCGACTATTATTGTCAGGTGTGGGATACTGGTAGTGATCCCGTGGTAT TCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT BAK1187B CADENA PESADA- SEQ ID. NO: 129 CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT CTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACAAATTATGGTCTCAGCTGGGTGCGACAGG CCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCGACGACGACAGCGGCACGACAATA TATGGACAGGAATTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGATACATCCACGAGCACAGC CTACATGGAGTTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAG ACTCCAGCAGCAGCTGGGCCCGCTGGTTTTTCGATCTCTGGGGCCGGGGGACACTGGTC ACCGTCTCCTCA _ ¦ .

BAK1187B4 CADENA LIGERA- SEQ ID NO: 130 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGAT TACCTGTGGGGGAAACATCATTGGAAGTAAACTTGTACACTGGTACCAGCAGAAGCCAG GCCAGGCCCCTGTGCTGGTCATCTATGATGATGGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAG CGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAGGC CGGGGATGAGGCCGACTATTATTGTCAGGTGTGGGATACTGGTAGTGATCCCGTGGTAT TCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT BAK1166G02 CADENA PESADA- SEQ ID NO: 131 CAAGTGCAGTTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT CTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTGCGAACACCGGGATCTCGTGGGTGCGACAGG CCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTAATAATGGCGACACAAAT TATGGACAGGAATTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGATACATCCACGAGCACAGC CTACATGGAGTTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAG ACTCCAGCAGCAGCTGGGCCCGCTGGTTTTTCGATCTCTGGGGTCGGGGGACACTGGTC ACCGTCTCCTCA BAK1166G02 CADENA LIGERA- SEQ ID NO: 132 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGAT TACCTGTGGGGGAAACATCATTGGAAGTAAACTTGTACACTGGTACCAGCAGAAGCCAG GCCAGGCCCCTGTGCTGGTCATCTATGATGATGGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAG CGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAGGC CGGGGATGAGGCCGACTATTATTGTCAGGTGTGGGATACTGGTAGTGATCCCGTGGTAT TCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT BAK165E7 CADENA PESADA-" SEQ ID NO: 133 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGLSWVRQAPGQGLEWMGWISANNGETN YGQEFQGRVT TTETPTNTAHMELRSLTSDDTAVYYCVRDSSSNWAR YFDLWGQGTLV TVSS BAK165E7 CADENA LIGERA- SEQ ID NO: 134 SYVITQPPSVSVAPGQTARIPCGGNNIGSKLVH YQQ PGQAPVLVVYDDGDRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISRIDAGDEADYYCQVWDTGSDPWFGGGTKLTVLG BAK165E7 CADENA PESADA CDR1- SEQ ID NO: 135 NYGLS CDR2- SEQ ID NO: 136 WISANNGETNYGQEFQG CDR3- SEQ ID NO: 137 DSSSNWARWYFDL BA 165E7 CADENA LIGERA CDRl- SEQ ID NO: 138 GGNNIGSKLVH CDR2- SEQ ID NO: 139 DDGDRPS CDR3- SEQ ID NO: 140 QVWDTGSDPW BAK582F7 CADENA PESADA CDR1- SEQ ID NO 141: SYA S CDR2- SEQ ID NO 142: AISGSGGSTYYADSVKG CDR3- SEQ ID NO 143: VGAAGEGYYGY BAK582F7 CADENA LIGERA CDR1-SEQ ID NO 144: TRSSGSIASNYVE CDR2-SEQ ID NO 145: DDNQRPS CDR3-SEQ ID NO 146: QSYDSNNDV BAK612B5 CADENA PESADA CDR1- SEQ ID NO 147: SYAMS CDR2- SEQ ID NO 148: AISGSGGSTYYADSVKG CDR3- SEQ ID NO 149: VGRATTDEGYYGY BAK612B5 CADENA LIGERA CDR1- SEQ ID NO 150: TRSSGSIASNYVQ CDR2- SEQ ID NO 151: DDNQRPS CDR3- SEQ ID NO 152: QSYDSNNDV BAK615E3 CADENA PESADA CDR1- SEQ ID NO 153: SYAMS CDR2- SEQ ID NO 154: AISGSGGSTYYADSVKG CDR3- SEQ ID NO 155: VGKATTEEGYY BA 615E3 CADENA LIGERA CDR1- SEQ ID NO 156: TRSSGSIASNYVQ CDR2- SEQ ID NO 157: DDNQRPS CDR3- SEQ ID NO 158: QSYDSNNDV BAKQ278D6 CADENA PESADA CDRl- SEQ ID NO 159: AATTATGGTCTCAGC CDR2- SEQ ID NO 160: TGGATCAGCGCTAATAATGGCGACACAAATTAT GGACAGGAATTCCAGGGC CDR3- SEQ ID NO 161: GACTCCAGCAGCAACTGGGCCCGCTGGTTTTTC GATCTC BAK278D6 CADENA LIGERA CDRl- SEQ ID NO 162: GGGGGAAACAACATTGGAAGTAAACTTGTACAC CDR2- SEQ ID NO 163: GATGATGGCGACCGGCCCTCA CDR3- SEQ ID NO 164: CAGGTGTGGGATACTGGTAGTGATCCCGTGGTA BAK 02G9 CADENA PESADA CDRl- SEQ ID NO 165: AATTATGGTCTCAGC CDR2- SEQ ID NO 166: TGGATCAGCGCTAATAATGGCGACACAAATTATGGACA GGAATTCCAGGGC CDR3- SEQ ID NO 167 : GACTCCAGCAGCAGCTGGGCCCGCTGGTTTTTCGATCTC BA 502G9 CADENA LIGERA CDR1- SEQ ID NO 168: GGGGGAAACATCATTGGAAGTAAACTTGTACAC CDR2- SEQ ID NO 169: GATGATGGCGACCGGCCCTCA CDR3- SEQ ID NO 170: CAGGTGTGGGATACTGGTAGTGATCCCGTGGTA Dominios de CH - SEQ ID NO: 171 AST GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVES YGPPCPSCPAPEFLGGP SVFLFPPKPKDT1MISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVD S RWQEGNVFSCS'VMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Dominio de CL- SEQ ID NO: 172 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVA KADSSPV AGVETTTPSK QSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Miembro específico de unión, aislado, para IL-13 humana, caracterizado porque comprende un sitio de unión a antígeno de anticuerpo que está compuesto de un dominio VH de anticuerpo humano y un dominio VL de anticuerpo humano y que comprende un conjunto de CDR, HCDRl, HCDR2 y HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 , en donde el domino VH comprende HCDRl , HCDR2 , y HCDR3 y el dominio VL comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3 , en donde el conjunto de CDR consiste de un conjunto de CDR seleccionado del grupo que consiste de : el conjunto de CDR de BAK278D6, definido en la HCDRl tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, la HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2, la HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 3, la LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, la LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 5, y la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 6, un conjunto de CDR que contiene una o dos sustituciones de aminoácido en comparación al conjunto de CDR de BAK278D6, y cada conjunto de CDR como se muestra para clones individuales en la Tabla 1. 2. Miembro específico de unión aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una o dos sustituciones están en uno o dos de los residuos siguientes dentro de la CDR, usando la numeración normal de Kabat . 31, 32, 34 en HCDR1 52, 52A, 53, 54, 56, 58, 60, 61, 62, 64, 65 en HCDR2 96, 97, 98, 99, 101 en HCDR3 26, 27, 28, 30, 31 en LCDR1 56 en LCDR2 95A, 97 en LCDR3 3. Miembro específico de unión aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque una o dos sustituciones están en las siguientes posiciones de entre los grupos identificados de posibles residuos sustituidos para cada posición: Posición de Residuo Sustituido seleccionado del grupo sustitución que consiste de 31 en HCDR1 : Q, D, L, G y E 32 en HCDR1: T 34 en HCDR1: V, I y F 52 en HCDR2 : 52? en HCDR2 53 en HCDR2 : D, L, A, P, T, s, I y R 54 en HCDR2: S, T, D, G, K e I 56 en HCDR2 : T, E, Q, L, Y, N, v, A, y G 58 en HCDR2 : I, L, Q, S, , H, D y K 60 en HCDR2 : R 61 en HCDR2 : R 62 en HCDR2 : K y G 64 en HCDR2 : R 65 en HCDR2 : K 96 en HCDR3 : R y D 97 en HCDR3 : N, D, T y P 98 en HCDR3 : R 99 en HCDR3 : S, A, I, R, P y K 101 en HCDR3 y 26 en LCDRl: D y S 27 en LCDRl: I, L, M, C, V, , Y, F, R, T, 28 en LCDRl: V 30 en LCDRl: G 31 en LCDRl: R 56 en LCDR2 : 95A en LCDR3 : N 97 en LCDR3: I. 4. Miembro especifico de unión aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque hay dos sustituciones en comparación con el conjunto de CDR de BAK278D6, en el residuo 99 de HCDR3 y el residuo 27 de LCDR1. 5. Miembro específico de unión aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende el conjunto de CDR de BAK278D6 con una sustitución en el residuo 99 de HCDR3 seleccionado del grupo que consiste de S, A, I, R, P y K y/o una sustitución en el residuo 27 de LCDR1 seleccionado del grupo que consiste de I, L, M, C, V, K, Y, F, R, T, S, A, H y G. 6. Miembro específico de unión aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende el conjunto de CDR de BAK278D6 con S sustituida por N en el residuo 99 de HCDR3 y/o I sustituida por N en el residuo 27 de LCDR 1. 7. Miembro específico de unión aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque HCDR1, HCDR2 y HCDR3 del dominio VH están dentro de una estructura de línea germinal y/o LCDR1, LCDR2 y LCDR3 del dominio VL están dentro de una estructura de línea germinal . 8. Miembro específico de unión aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque HCDR1, HCDR2 y HCDR3 del dominio VH están dentro de la estructura de línea germinal VH1 DP14. 9. Miembro específico de unión aislado de conformidad con la reivindicación 7 ó la reivindicación 8, caracterizado porque la HCDR1, HCDR2 y HCDR3 del dominio VH están dentro de la estructura de línea germinal VL ??3 3h. 10. Miembro específico de unión aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se une a una variante de IL-13 humana en la cual la arginina en la posición 130 se reemplaza por glutamina . 11. Miembro específico de unión aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones .1 a 10, caracterizado porque se une a IL-13 de primate no humano. 12. Miembro específico de unión aislado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la IL-13 de primate no humano es de rhesus o cynomolgus. 13. Miembro específico de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque comprende el domino VH de BAK502G9 (SEQ ID NO: 15) . 14. Miembro específico de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, caracterizado porque comprende el dominio VL de BAK502G9 (SEQ ID NO: 16) . 15. Miembro específico de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 14, caracterizado porque se une a IL-13 con afinidad igual a, o mejor que, la afinidad de un sitio de unión a antígeno de IL-13 formado por el dominio VH de BAK502G9 (SEQ ID NO: 15) y el dominio VL de BAK502G9 (SEQ ID NO: 16), la afinidad del miembro específico de unión y la afinidad del sitio de unión a antígeno que se determinan bajo las mismas condiciones. 16. Miembro específico de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque neutraliza IL-13 humana. 17. Miembro específico de unión de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque neutraliza IL-13 humana, con una potencia igual a, o mejor que, la potencia de un sitio de unión a antígeno IL-13 formado por el dominio VH de BAK502G9 (SEQ ID NO: 15) y el dominio VL de BAK502G9 (SEQ ID NO: 16) , la potencia del miembro específico de unión y la potencia del sitio de unión a antígeno que es como se determinan bajo las mismas condiciones. 18. Miembro específico de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque comprende una molécula de anticuerpo de scFv. 19. Miembro específico de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque comprende una región constante de anticuerpo. 20. Miembro específico de unión de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque comprende un anticuerpo entero . 21. Miembro específico de unión de conformidad con. la reivindicación 20, caracterizado porque el anticuerpo entero es IgG4. 22. Dominio VH de anticuerpo, caracterizado porque se aisla de un miembro específico de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21. 23. Dominio VL de anticuerpo, caracterizado porque se aisla de un miembro específico de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21. 24. Composición, caracterizada porque comprende un miembro específico de unión, dominio VH de anticuerpo o dominio VL de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 y al menos un componente adicional . 25. Composición de conformidad con la reivindicación 24,' caracterizada porque comprende un excipiente, vehículo o portador farmacéuticamente aceptable. 26. Ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un miembro específico de unión o dominio VH o VL de anticuerpo de un miembro específico de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23. 27. Célula hospedera, caracterizada porque se transforma ir¡ vitro con ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26. 28. Un método para producir un miembro específico de unión o dominio VH o VL de anticuerpo, caracterizado porque comprende cultivar células hospederas de conformidad con la reivindicación 27 bajo condiciones para la producción del miembro específico de unión o dominio VH o VL de anticuerpo . 29. Método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque además comprende aislar y/o purificar el miembro específico de unión o dominio variable VH o VL de anticuerpo. 30. Método de conformidad con la reivindicación 28 o reivindicación 29, caracterizado porque comprende además formular el miembro específico de unión o dominio variable VH o VL de anticuerpo en una composición que incluye al menos un componente adicional . 31. Método para producir un dominio de unión de antígeno de anticuerpo específico para IL-13 humana, el método está caracterizado porque comprende: proporcionar, por medio de adición, supresión, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH de origen que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 , en donde HCDR1, HCDR2 y HCDR3 del domino VH de origen son el conjunto de HCDR de BAK278D6, definido en donde la HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, la HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2, la HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 3, o el conjunto de HCDR de BAK502G9, definido en donde la HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 7, la HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 8, la HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 9, un domino VH que es una variante de secuencia de aminoácidos del domino VH de origen, y combinar opcionalmente el dominio VH proporcionado de esta manera con uno o más dominios VL para proporcionar una o más combinaciones de VH/VL; y probar el dominio VH que es una variante de secuencia de aminoácidos del dominio VH de origen o la combinación de VH/VL o combinaciones para identificar un dominio de unión a antígeno de anticuerpo especifico para IL-13 humana. 32. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del dominio VH de origen se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15. 33. Método de conformidad con la reivindicación 31 o reivindicación 32, caracterizado porque se proporcionan uno o más dominios VL por medio de adición, supresión, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VL de Origen que comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3 , en donde LCDR1, LCDR2 y LCDR3 del dominio VL de origen son el conjunto de LCDR de BAK278D6, definido en donde la LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, la LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 5, la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 6, o el conjunto de LCDR de BAK502G9, definido en donde la LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 10, la LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 11, la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 12, que produce uno o más dominios VL cada uno de los cuales es una variante de secuencia de aminoácidos del dominio VL de origen. 34. Método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del dominio VL de origen se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16. 35. Método para producir un domino de unión a antígeno de anticuerpo específico para IL-13 humana, el método esta caracterizado porque comprende: proporcionar, por medio de adición, supresión, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH de origen que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en donde la HCDR1, HCDR2 y HCDR3 del dominio VH de origen son el conjunto de HCDR de BAK167A11, definido en donde la HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, la HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 56, la HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 57, el conjunto de HCDR de ???615?3, definido en donde la HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 153, la HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 154, la HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 155, el conjunto de HCDR de BAK582F7, definido en donde la HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 141, la HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 142, la HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 143, o el conjunto de HCDR de BAK612B5, definido en donde la HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 147, la HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 148, la HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 149, un dominio VH que es una variante de secuencia de aminoácidos del dominio VH de origen, y qué combina opcionalmente el dominio VH proporcionado de esta manera con uno o más dominios VL para proporcionar una o más combinaciones de VH/VL; y probar el dominio VH que es una variante de secuencia de aminoácidos del dominio VH de origen o la combinación VH/VL o combinaciones para identificar un dominio de unión a antígeno de anticuerpo específico para IL-13 humana. 36. Método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del dominio VH de origen se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 33. 37. Método de conformidad con la reivindicación 35 o la reivindicación 36, caracterizado porque se proporciona uno o más dominios VL por medio de adición, supresión, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VL de origen que comprende LCDRl, LCDR2 y LCDR3 , en donde LCDRl, LCDR2 y LCDR3 del dominio VL de origen son el conjunto de LCDR de BAK167A11, definido en donde la LCDRl tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, la LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 59, la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 60, el conjunto de LCDR de BAK615E3, definido en donde la LCDRl tiene la secuencia de aminoácidos, de SEQ ID NO. 156, la LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 157, la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 158, el conjunto de LCDR de BAK582P7, definido en donde la LCDRl tiene la 'secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 144, la LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 145, la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 146, o el conjunto de LCDR de BAK612B5, definido en donde la LCDRl tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 150, la LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 151, la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 152, que produce uno o más dominios VL cada uno de los cuales es una variante de secuencia de aminoácidos del dominio VL de origen. 38. Método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del dominio VL de origen se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 34. 39. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, caracterizado porque el dominio VH que es una variante de secuencia de aminoácidos del dominio VH de origen se proporciona pór mutagenesis de CDR. 40. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, caracterizado porque el dominio de VH que es una variante de secuencia de aminoácidos del dominio VH de origen se proporciona por mutagénesis de CDR. 41. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 40, caracterizado porque comprende además proporcionar el sitio de unión a antígeno de anticuerpo dentro de la molécula de anticuerpo IgG, scFv o Fab. 42. Método para producir un miembro específico de unión que. se une a IL-13 humana, método que está caracterizado porgue comprende: proporcionar ácido nucleico de inicio que codifica para un dominio VH o repertorio de inicio de ácidos nucleicos cada uno que codifica para un dominio VH, en donde el dominio VH o dominios VH comprenden cada uno, una HCDR1, HCDR2 y/1 HCDR3 que se va a reemplazar o carece de una región de codificación de HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3; combinar el ácido nucleico de inicio o repertorio de inicio con ácido nucleico donador o ácidos nucleicos donadores que codifican o se producen por mutación de la secuencia de aminoácidos de la HCDR1 (SEQ ID NO: 1) o HCDR1 (SEQ ID NO: 7) , HCDR2 (SEQ ID NO: 2) o HCDR2 (SEQ ID NO: 8) y/o HCDR3 (SEQ ID NO: 3) o HCDR3 (SEQ ID NO: 9) tal que el ácido nucleico donador es, o los ácidos nucleicos donadores se insertan en la región CDR1, CDR2- y/o CDR3 en el ácido nucleico de inicio o repertorio de inicio, para proporcionar un repertorio de producto de ácidos nucleicos que codifican para los dominios VH; expresar los ácidos nucleicos del repertorio de producto para producir dominios VH de producto; combinar opcionalmente los dominios VH de producto con uno o más dominios VL; seleccionar un miembro específico de unión específico para IL-13 humana, miembro específico de unión que comprende un dominio VH de producto y opcionalmente un dominio VL; y recuperar el miembro específico de unión o el ácido nucleico que lo codifica. 43. Método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque los ácidos nucleicos donadores se producen por mutación de la HCDR1 y/o HCDR2. 44. Método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el ácido nucleico donador se producen por mutación de HCDR3. 45. Método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque comprende proporcionar el ácido nucleico donador por mutación de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de HCDR3 (SEQ ID NO: 3) o HCDR3 (SEQ ID NO: 9) . 46. Método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque comprende proporcionar el ácido nucleico donador por mutación aleatoria del ácido nucleico. 47. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 46, caracterizado porque además comprende unir un dominio VH de producto que está comprendido dentro del miembro específico de unión recuperado a una región constante de anticuerpo. 48. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 46, caracterizado porque comprende proporcionar una molécula de anticuerpo IgG, scFv o Fab que comprende el dominio VH de producto y un dominio VL. 49. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 48, caracterizado porque además comprende probar el dominio de unión a antígeno de anticuerpo, o miembro específico de unión que se une a 1L-13 humana para la capacidad para neutralizar IL-13 humana. 50. Método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque se obtiene un miembro específico de unión que comprende un fragmento de anticuerpo que se une a, y neutraliza IL-13 humana. 51. Método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es una molécula de anticuerpo de scFv. 52. Método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es una molécula de anticuerpo de Fab. • 53. Método de conformidad con la reivindicación 51 o la reivindicación 52, caracterizado porque además comprende proporcionar el dominio VH y/o el dominio VL del fragmento de anticuerpo en un anticuerpo entero. 54. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 53, caracterizado porque comprende además formular el miembro específico de unión que se une a IL-13, sitio de unión a antígeno de anticuerpo o un dominio variable VH o VL de anticuerpo del miembro específico de unión o sitio de unión a antígeno de anticuerpo que se une a IL-13, en una composición que incluye al menos un componente adicional . 55. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 54, caracterizado porque además comprende la unión de un miembro específico de unión que se une a IL-13 humana, a IL-13 o un fragmento de IL-13. 56. Método, caracterizado porque comprende unir un miembro específico de unión que se une a IL-13 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 a la IL-13 humana o un fragmento de IL-13 humana. 57. Método de conformidad con la reivindicación 55 o la reivindicación 56, caracterizado porque la unión toma lugar in vitro. 58. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 55 a 57, caracterizado porque comprende determinar la cantidad de unión del miembro específico de unión a IL-13 o un fragmento de IL-13. 59. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 58, caracterizado porque además comprende el uso del miembro específico de unión en la elaboración de un medicamento para tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste de asma, dermatitis atópica, rinitis alérgica, fibrosis, enfermedad inflamatoria de intestino y linfoma de Hodgkin. 60. Uso de un miembro específico de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste de asma, dermatitis atópica, rinitis alérgica, fibrosas, enfermedad inflamatoria de intestino y linfoma de Hodgkin. 61. Miembro específico de unión aislado para IL-13 humana, caracterizado porque comprende un sitio de dominio de unión a antígeno de anticuerpo que está compuesto de un dominio VH de anticuerpo humano y un dominio VL de anticuerpo humano y que comprende un conjunto de CDR, HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 , en donde el dominio VH comprende HCDRl, HCDR2 y HCDR3 , y el dominio VL comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3 , en donde HCDRl es una secuencia de aminoácidos que tiene la fórmula en donde HXX se selecciona del grupo que consiste de N, Q, D, L, G y E HX2 se selecciona del grupo que consiste de Y y T, HX3 se selecciona del grupo que consiste de V, I, F y L, HCDR2 es de secuencia de aminoácidos que tiene la fórmula W I HX4 HX5 HXS HX7 G HX8 T HX9 y HX10 HXU HXX2 F HX13 HXi4 en donde HX4 se selecciona del grupo que consiste de S, D, N, A, R, G y E, HX5 se selecciona del grupo que consiste de A, D, G, T, P, N y Y, HXg se selecciona del grupo que consiste de N, D, L, A, P, T, S, I y R, HX7 se selecciona del grupo que consiste de N, S, T, D, G, K e I, HX8 se selecciona del grupo que consiste de D, T, E, Q, L, Y, N, V, A, M y G, HX9 se selecciona del grupo que consiste de N, I, L, Q, S, M, H, D y K, HXio se selecciona del grupo que consiste de G y R, HXn se selecciona del grupo que consiste de Q y R, HX12 se selecciona del grupo que consiste de E, y G, HX13 se selecciona del grupo que consiste de Q y R, HXi4 se selecciona del grupo que consiste de G y K, HCDR3 es de la secuencia de aminoácidos que tiene la fórmula D HX15 HX1S HXiv H is W A R W HXi9 F HX20 L en donde HX15 se selecciona del grupo que consiste de S, R y D, HXi6 se selecciona del grupo que consiste de S, N, D, T y P, HX3.7 se selecciona del grupo que consiste de S y R, HXis se selecciona del grupo que consiste de S, N, A, I, R, P y K, HX19 se selecciona del grupo que consiste de F Y Y, HX2o se selecciona del grupo que consiste de D Y Y, LCDR1 es de la secuencia de aminoácidos que tiene la fórmula G G L i LX2 LX3 G LX4 L V H en donde LXX se selecciona del grupo que consiste de N, D y S, LX2 se selecciona del grupo que consiste de N, I, L, M, C, V, K, Y, F, R, T, S, A, H y G, LX3 se selecciona del grupo que consiste de I y V, LX4 se selecciona del grupo que consiste de S y G, LX5 se selecciona del grupo que consiste de K y R, LCDR2 es de la secuencia de aminoácidos que tiene la fórmula D D G D R P LX6 en donde LX6 se selecciona del grupo que consiste de S y T, LCDR3 es de la secuencia de aminoácidos que tiene fórmula Q V W D T G S LX7 P V LX8 en donde LX7 se selecciona del grupo que consiste de D y N, LX8 se selecciona del grupo que consiste de V e I. 62. Miembro específico de unión aislado de conformidad con la reivindicación 61; caracterizado porque HXi se selecciona del grupo que consiste de D y N, HX2 es Y, HX3 es L, HX4 se selecciona del grupo que consiste de S y G, HXS se selecciona del grupo que consiste de T y A, HX6 es N, HX7 se selecciona del grupo que consiste de N e I, HX8 es D, HX9 se selecciona del grupo que consiste de N, D y K, . HX10 es G, HX12 se selecciona del grupo que consiste de E y G, HX13 es Q, HX13 es F, LXi se selecciona del grupo que consiste de N y S, LX2 se selecciona del grupo que consiste de N, Y, , S e l, LXS es S, LX7 es D. 63. Miembro específico de unión aislado de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque HXi se selecciona del grupo que consiste de N y D, HX2 es ?, HX3 es L, HX4 se selecciona del grupo que consiste de S y G, HX5 se selecciona del grupo que consiste de A y T, HX6 es N, HX7 es N, HX8 se selecciona del grupo que consiste de D y G, HX9 se selecciona del grupo que consiste de I, S, y D, HXii es Q, HX12 es E y K, HX1 es G, HX15 es S, HX1S se selecciona del grupo que consiste de S y N, H i7 es S, HXis se selecciona del grupo que consiste de S y N, HXig es F, HX20 es D, LXi se selecciona del grupo que consiste de N y D, LX3 es I , LX8 es V. 64. Miembro especifico de unión aislado de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque HX7 se selecciona del grupo que consiste de N, S, T, D, G y K, HX8 se selecciona del grupo que consiste de D, T, E, Q, L, Y, M, V, A, M, HX9 se selecciona del grupo que consiste de N, I, L, Q, S, M y H , HX10 es G, HXii es Q, HX12 es F, HX13 es Q, HXi4 es G, HX16 se selecciona del grupo que consiste de N y S, HXX7 es S, H is se selecciona del grupo que consiste de N y S, HX19 es F, HX20 es D , L i es N, LX2 se selecciona del grupo que consiste de M e I, LX3 es I, LX4 es S, LXS es K, LX6 es S, LX7 es D, LX8 es V. 65. Miembro específico de unión aislado de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque H i se selecciona del grupo que consiste de N, Q y D, HX3 se selecciona del grupo que consiste de L, V e I, HX4 se selecciona del grupo que consiste de S, N, A y R, HX5 se selecciona del grupo que consiste de A, D, T, G, N y Y, HX6 se selecciona del grupo que consiste de N, A, P, S , D e I, HX7 se selecciona del grupo que consiste de N, T, D y G, NHs se selecciona del grupo que consiste de D, Q, ? y N, NH9 se selecciona del grupo que consiste de N, Q, S e l. 66. Miembro especifico de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61 a 65, caracterizado porque neutraliza IL-13 humana. 67. Miembro especifico de unión de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque neutraliza IL-13 humana, con una potencia igual o mejor que la potencia de un sitio de unión a antígeno de IL-13 formado por el dominio VH de BAK502G9 (SEQ ID NO: 15) y el dominio VL de BAK502G9 (SEQ ID NO: 16) , la potencia del miembro específico de unión y la potencia del sitio de unión a antigeno que es como se determina bajo las mismas condiciones. 68. Miembro específico de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61 a 67, caracterizado porque comprende una molécula de anticuerpo de scFv. 69. Miembro específico de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61 a 67, caracterizado porque comprende una región constante de anticuerpo . 70. Miembro específico de unión de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque comprende un anticuerpo entero . 71. Miembro específico de unión de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el anticuerpo entero es IgG4. 72. Miembro específico de unión aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61 a 71, caracterizado porque se une a una variante de IL-13 humana en la cual arginina en la posición 130 se reemplaza por glutamina . 73. Miembro específico de unión aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61 a 71, caracterizado porque se unes a IL-13 de primate no humano. 74. Miembro específico de unión aislado de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque la IL-13 de primate no humana es de rhesus o cynomolgus . 75. Dominio VH de anticuerpo, caracterizado porque se aisla de un miembro específico de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61 a 74. 76. Un dominio VL de anticuerpo, caracterizado porque se aisla de un miembro específico de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61 a 74. 77. Composición, caracterizada porque comprende el miembro específico de unión, dominio VH de anticuerpo o dominio VL de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 61 a 76 y al menos un componente adicional. 78. Composición de conformidad con la reivindicación 77, caracterizada porque comprende un excipiente, vehículo o portador farmacéuticamente aceptable. 79. Ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un miembro específico de unión o dominio VH o VL de anticuerpo de un miembro específico de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 61 a 76. 80. Célula hospedera, caracterizada porque se transforma in vitro con ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 79. 81. Método para producir un miembro específico de unión o dominio VH o VL de anticuerpo, caracterizado porque comprende cultivar células hospederas de conformidad con la reivindicación 80 bajo condiciones para la producción del miembro especifico de unión o dominio VH o VL de anticuerpo. 82. Método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque además comprende aislar y/o purificar el miembro específico de unión o dominio variable VH o VL de anticuerpo . 83. Método de conformidad con la reivindicación 81 o la reivindicación 82, caracterizado porque además comprende formular el miembro específico de unión o dominio variable VH o VL de anticuerpo en una composición que incluye al menos un componente adicional . 84. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 81 a 83, caracterizado porque además comprende unir un miembro específico de unión que se une a IL-13 humana a la IL-13 o un fragmento de IL-13. 85. Método, caracterizado porque comprende unir un miembro específico de unión que se une a IL-13 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 61 a 74, a la IL-13 humana o un fragmento de IL-13 humana. 86. Método de conformidad con la reivindicación 84 o la reivindicación 86, caracterizado porque la unión toma lugar in vi tro. 87. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 86, caracterizado porque comprende determinar la cantidad de unión de miembro específico de unión a la IL-13 o un fragmento de IL-13. 88. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 81 a 83, caracterizado porque comprende además el uso del miembro específico de unión en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste de asma, dermatitis atópica, rinitis alérgica, fibrosis, enfermedad inflamatoria de intestino y linfoma de Hodgkin. 89. Uso de un miembro específico de unión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61 a 74 en la elaboración de un medicamento para tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste de asma, dermatitis atópica, rinitis alérgica, fibrosis, enfermedad inflamatoria de intestino y linfoma de Hodgkin.