CN101107268A - 针对ngf的特异性结合成员 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对神经生长因子(NGF)的特异性结合成员，尤其是抗NGF抗体分子，特别是人抗体分子，并特别是那些能中和NGF活性的人抗体分子。本发明涉及利用抗NGF抗体分子诊断或治疗NGF相关紊乱的方法，所述NGF相关紊乱包括疼痛、哮喘、慢性阻塞性肺病、肺纤维化、其它气道炎症疾病、糖尿病性神经病、心律失常、HIV、关节炎、牛皮癣和癌症。

Description

针对NGF的特异性结合成员
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本发明涉及特异性结合成员，尤其是抗NGF抗体分子，特别是人抗体分子，并特别是那些能中和NGF(神经生长因子)活性的分子。它进一步涉及利用抗NGF抗体分子诊断或治疗NGF相关疾病的方法，包括疼痛、哮喘、慢性阻塞性肺病、肺纤维化、其它气道炎症疾病、糖尿病性神经病、心律失常、HIV、关节炎、牛皮癣和癌症。
如本文所包括的实验和进一步由提供的支持性技术文献所示，本发明提供了在结合并中和NGF上有特殊价值的抗体分子，及其在各种治疗方法中的用途。
神经生长因子(β-NGF，通常被称为NGF)在神经系统的发育中起着公知的关键作用。可是在成人中，NGF起着较有限的作用，其中它促进一部分中枢和外周神经元的健康和存活(Huang & Reichardt，2001)。NGF也在调节这些神经元的功能特性中发挥作用。作为该后一过程的一部分，NGF对伤害性感受器的敏感性、或兴奋性发挥着增强性控制作用(Priestley等，2002；Bennett，2001)。这些外周神经元感觉各种有害的刺激并将其传递到中枢神经系统，这些刺激最终产生了对疼痛的感知(伤害感受)。因而，降低NGF水平的试剂可有用作止痛治疗剂的效用。
不能适当地治疗疼痛的社会成本进一步支持了基于抗NGF活性的止痛剂的潜在应用。就是说，尽管存在并广泛使用了大量疼痛药物，仍清楚存在有对新止痛剂的需求。疼痛是需要医疗救助的最普通的症状之一，而且是看医生的所有患者中一半的首要抱怨对象。有完备的文件记录了疼痛对社会带来的高额花费。例如在美国，长期疼痛折磨着约3千4百万美国人。疼痛造成每年损失5千万个工作日。仅每年因背痛、关节痛、和偏头痛带来的直接医疗花费总计$400亿。总的疼痛处方药市场每年约有$1 50亿(Pleuvry & Pleuvry)。
如这些统计所暗示的，占大百分比例的疼痛受害者没有能足够缓解疼痛。结果，对于有新作用机理的安全有效的止痛剂仍旧有大量医药需求(Pleuvry & Pleuvry)。
减少分泌的NGF的组织水平或抑制其效应的治疗剂恰好具有成为该新型止痛剂的潜力。皮下注射NGF本身会在人和动物中产生疼痛。因而，注射NGF会造成急性热痛觉过敏，接着会有迟发性的痛觉过敏和机械性异常性疼痛(Petty等，1994；McArthur等，2000)。内源分泌的NGF也相似地倾向于引起伤害性感受。组织损伤诱导的NGF释放及其对外周带来的作用通过‘外周敏化作用’过程在诱导热痛觉过敏中起着主要的作用(Mendell &Arvanian，2002)。组织损伤促进了倾向于引起伤害感受和倾向于引起炎症的细胞因子释放，其继而诱导NGF从角质形成细胞和成纤维细胞中释放出来。该释放的NGF直接作用于伤害感受器从而在有害损伤的几分钟内诱导出疼痛或伤害感受的状态。该NGF也间接作用从而诱导出并维持伤害性感受/疼痛状态。它引发肥大细胞脱粒，释放出造成伤害性感受的试剂(如组胺和5-羟色胺)，而且重要的是，释放出更多NGF，也可以刺激交感神经末梢释放出造成伤害性感受的神经递质，如去甲肾上腺素(Ma & Woolf，1997)。
在注射了CFA和角叉菜聚糖的动物中，NGF的组织水平被抬升了(Ma&Woolf，1997；Amann & Schuligoi，2000)。而且，在遭受类风湿性关节炎(Aloe & Tuveri，1997)或膀胱炎(Lowe等，1997)的患者中记录到了NGF水平的提高。在啮齿动物中，外周神经损伤增加了NGF mRNA在巨噬细胞、成纤维细胞、和施旺细胞中的表达(Heumann等，1987)。在转基因小鼠中过量表达NGF会造成神经损伤后较之野生型小鼠更增多了神经性疼痛行为(Ramer等，1998)。在几小时和几天内，抬高的NGF水平起着促进‘中枢敏化作用’的作用-增强脊髓伤害性感受途径中的突触上的神经传递。中枢敏化作用造成了持久和慢性的痛觉过敏和异常性疼痛。该过程被认为涉及NGF及其高亲和力受体——trkA(酪氨酸受体激酶A)复合物的内化作用。将这些复合物反向输送到背根神经节(DRG)中的伤害性感受器细胞体上，将加强伤害性感受神经肽(如，P物质、CGRP)分泌、PKC活化、以及脊髓背角中的NMDA受体活化(Sah等，2003)——所有促进伤害性感受途径敏化的过程。NGF也在电位依赖性和配体门离子通道(包括钠通道亚型和辣椒素受体、VR1)的上调和重新分配中起作用(Mamet等，1999；Fjell等，1999；Priestley等，2002)。递质、受体、和离子通道的改变了的活性和/或表达成为与神经性疼痛状态相关的伤害性感受器的敏感性和兴奋性增加的基础。
NGF也可促进交感神经神经元的萌芽以及伤害性感受神经元的异常神经支配的形成。该神经支配被认为对慢性伤害性感受/疼痛状态(如交感神经持续性疼痛、或复合区域性疼痛综合症)的诱导和保持有贡献(Ramer等，1999)。
NGF诱导的伤害性感受/疼痛通过高亲和力NGF受体——trkA(酪氨酸受体激酶A)介导(Sah，等，2003)。DRG中约40-45％的伤害性感受器细胞体表达trkA。这些是小直径纤维、或C-纤维的细胞体，其也表达造成分泌的伤害性感受的肽、P物质和CGRP。这些纤维终止于背角层I和II中，其中它们将外周伤害性感受器感受到的有害刺激传输到中枢神经系统。trkA基因中的突变或缺失产生了以人(Indo，2002)和trkA敲除的小鼠(de Castro等，1998)中疼痛感丧失为特征的表现型。值得注意的是，在关节炎(Pozza等，2000)或膀胱疼痛(Qiao & Vizzard，2002)、或完全福氏佐剂(CFA)或角叉菜聚糖注射入爪子而诱导出的炎性疼痛的模型动物中，trkA的表达被上调了(Cho等，1996)。
NGF也结合p75神经营养蛋白受体。p75受体的作用依赖于其细胞环境和据信p75受体在其中起补充或复合受体功能的其他受体的存在。trkA和p75受体间的相互作用造成针对NGF的高亲和力结合位点的形成。该受体相互作用对NGF介导的疼痛信号传导的重要性并不清楚，但最近研究暗示了可能相关的细胞过程中有p75受体(Zhang & Nicol，2004)。可是，尽管p75受体敲除小鼠展示出对有害刺激抬升了阈值，它们仍旧对NGF的痛觉过敏效应有反应，这提示了trkA受体独自就足以介导这些效应(Bergmann等，1998)。
以上引用的证据显示了，NGF介导的过程是诱导急性疼痛、短期疼痛、持续性伤害性感受的疼痛、和持续性或慢性神经性疼痛的成因。因而显示，抗NGF剂具有作为治疗遭受着这些各类疼痛状态之任意或所有的受害者的有效止痛剂的效用。
一种此类抗NGF剂是trkA-Fc，其用作诱饵或清除剂去结合内源NGF，由此使内源NGF失活。TrkA-Fc是融合蛋白，其由连于IgG抗体恒定结构域片段(Fc)的trkA的NGF结合区组成。TrkA-Fc在天然动物中产生痛觉减退，降低伤害性感受器的应答，并减少无髓鞘的疼痛感受神经元的萌芽(Bennett等，1998)。
当局部或全身注射时，抗NGF的抗血清也可减少NGF水平。抗NGF抗血清和trkA-Fc都能在大鼠中缓和角叉菜聚糖或CFA诱导的炎性爪子疼痛(Koltzenberg等，1999)和炎性膀胱应答(Jaggar等，1999)。在神经性疼痛的慢性收缩损伤(chronic constriction injury)(CCI)模型中，抗NGF抗血清阻断了热和冷的痛觉过敏，逆转了已有的热痛觉过敏，并防止侧生芽(collateral sprouting)(Woolf，1996；Ro等，1999)。trkA-NGF相互作用的小分子抑制剂也有报道。在大鼠中，在热诱导的炎性疼痛模型和急性和持续性疼痛的福尔马林测试中，NGF-trkA抑制剂ALE-0540减少了痛觉过敏(Owolabi等，1999)。在神经性疼痛的坐骨神经损伤模型中，ALE-0540也减少了机械性异常性疼痛(Owolabi等，1999)。
治疗性抗体一般有希望达到紧密相关的受体、受体配体、通道、或酶的家族中某种程度的靶位选择性，这很少可用小分子药物达到。NGF介导的疼痛尤其适于用抗体安全有效地进行治疗，这是因为NGF水平在外周增加以应答有害刺激，而抗体具有低血脑屏障通透性。当多克隆抗体显示在疼痛的动物模型中有效时，抗NGF单克隆抗体更可能成功地被开发成人治疗剂，这是因为它有制备出并表征出一致、明确的化学实体的优点。小鼠抗NGF单克隆抗体的抗伤害性感受的效果已有报道(Sammons等，2000)，但是还没有提出过这些抗体的氨基酸序列。
近来的证据提示，除了疼痛，NGF还促进其他病理状况。因而，抗NGF抗体也可具有用于治疗其它NGF介导的疾病的效用，包括但不限于治疗哮喘、慢性阻塞性肺病、肺纤维化、其它气道炎症疾病(Hoyle，2003；Lommatzch等，2003)、糖尿病性神经病(Yasuda等，2003)、心律失常(WO04/032852)、HIV(Garaci等，2003)、关节炎、牛皮癣和癌症(Nakagawara，2001)。
WO02/096458涉及抗NGF抗体，尤其是小鼠单克隆抗体911，并涉及该抗体在治疗各种NGF相关病症中的应用，包括治疗疼痛、哮喘、关节炎和牛皮癣。它声称，抗体911在过敏的实验小鼠模型中对免疫系统没有不利影响。这些抗体在Hongo等2000中也有描述。
WO04/032870描述了手术后疼痛的实验模型中，小鼠单克隆NGF抗体mab9 11和人源化NGF抗体E3有减轻疼痛的效果。E3与人重链γ2a恒定区相差2个氨基酸。
WO04/032852描述了利用NGF拮抗剂防止突发性心脏坏死和治疗心律失常的方法。
WO01/78698描述了针对NGF的多克隆抗血清用于治疗慢性内脏疼痛。
本发明提供了针对NGF、优选是针对人NGF的特异性结合成员。因而，本发明的特异性结合成员可以结合人NGF或非人NGF(如非人灵长类NGF和/或大鼠NGF和/或小鼠NGF)。
本发明的特异性结合成员可以是针对人NGF的抗体，尤其是人抗体，其可以与非人NGF(包括非人灵长类NGF和/或小鼠NGF和/或大鼠NGF)交叉反应。
根据本发明所述的特异性结合成员优选中和NGF。中和指减少或抑制NGF的生物活性，如减少或抑制NGF与一个或多个它的受体(优选是TrkA)的结合。生物活性的减少可以是部分的或是完全的。抗体中和NGF的程度被称作为它的中和效力。利用普通技术人员已知的和/或本文所述或所提及的一个或多个测试可确定或测量效力，例如：
-″FLIPR″钙动员测试(参见本文实施例2)
-PC12存活测试(参见本文实施例5)
-TF-1增殖测试(参见本文实施例6)
-受体结合抑制测试(参见本文实施例9)。
本文其他部分会更详细地描述测试和中和效力。
可以优化本发明的特异性结合成员的中和效力。一般，效力优化包括突变选择的特异性结合成员的序列(通常是抗体的可变结构域序列)以产生特异性结合成员的文库，然后测试其效力并挑选出更有效的特异性结合成员。因此选择的“效力优化的”特异性结合成员倾向于比产生文库的特异性结合成员有更高的效力。然而，不优化也可获得高效特异性结合成员，例如高效特异性结合成员可直接从诸如生化中和测试的初始筛选中得到。本发明提供了效力优化的和未优化的特异性结合成员，以及用于从选择的特异性结合成员中优化效力的方法。因此，本发明能使普通技术人员产生具有高效力的特异性结合成员。
根据本发明所述的特异性结合成员优选能显示出抗痛觉过敏和/或抗异常性疼痛的活性，如抑制角叉菜聚糖诱导的热痛觉过敏。
在一些具体实施方式中，本发明的特异性结合成员包含抗体分子。在其它具体实施方式中，本发明的特异性结合成员包含非抗体分子内的抗原结合位点，如以下进一步所述，如非抗体蛋白骨架中的一组CDR。
在本发明的各方面和具体实施方式中，提供了以下所包括的权利要求主题。
本发明内的优选具体实施方式是抗体分子，而不论是完整抗体(如IgG，如IgG4)还是抗体片段(如scFv、Fab、dAb)。本发明的抗体分子优选是人抗体分子。提供包含抗体抗原结合位点的抗体分子，也提供了抗体VH和VL结构域。VH和VL结构域内也提供了互补决定区，(“CDR”)、和构架区(“FR”)，以形成可以形成的VH或VL结构域。抗体抗原结合位点可由抗体VH结构域和/或VL结构域组成。本文公开的所有VH和VL序列、CDR序列、CDR组和HCDR组和LCDR组代表了本发明的方面和具体实施方式。″一组CDR”包括CDR1、CDR2和CDR3。因而，一组HCDR指HCDR1、HCDR2和HCDR3，而一组LCDR指LCDR1、LCDR2和LCDR3。除非另外规定，″一组CDR”包括HCDR和LCDR。
根据本发明所述的抗体VH和VL结构域和CDR的例子列于所附的序列表中。
本文公开了大量抗体谱系，其根据序列来定义，如一组CDR序列，所述CDR序列任选带有一个或多个(如一个或2个、或2个)替换。优选的亲本谱系是1021E5谱系。1021E5谱系包括优选的抗体分子1133C11和“1133C11谱系”的其他抗体分子，包括1252A5。也在1021E5亲本谱系范围内的有抗体分子1165D4、1230H7和1152H5。本发明人鉴定了1021E5、1083H4并特别鉴定了1133C11谱系，来提供特别有价值的抗NGF的人抗体抗原结合位点。
1133C11谱系根据以下1133C11的一组6个CDR序列来定义：HCDR1SEQ ID NO：193，HCDR2 SEQ ID NO：194，HCDR3 SEQ ID NO：195，LCDR1 SEQ ID NO：198，LCDR2 SEQ ID NO：199，和LCDR3 SEQ ID NO：200。其中HCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：193，HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：194，HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：195，LCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：198，LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：199，而且LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：200的CDR组在本文中被称作为“1133C11组CDR”。1133C11组CDR内的HCDR1、HCDR2和HCDR3被称为“1133C11组HCDR”，而1133C11组CDR内的LCDR1、LCDR2和LCDR3被称为“1133C11组LCDR”。带有1133C11组CDR、1133C11组HCDR或1133C11组LCDR、或其中的一个或2个替换的一组CDR被称为是1133C11谱系的CDR。
其他优选的谱系和CDR组根据本文任意部分所提及的类似CDR来定义，包括作为优选的具体实施方式的表2a中所公开的CDR组(具有表2b中所提及的SEQ ID NO)。表2a和表2b显示了从克隆1021E5衍生的优化克隆的CDR(HCDR和LCDR)组，阐明了优化克隆的CDR序列与1021E5的那些区别为何。来自表2a/2b的一组CDR包括来自表中所示任意克隆的一组HCDR和/或一组LCDR，任选包括1021E5本身。
如所示的，提供了这些CDR组，也提供了带有所公开的含一个或2个氨基酸替换的序列的CDR组。
本发明也提供了特异性结合成员和抗体分子，其包含如本文所公开的定义的CDR组、HCDR组或LCDR组、和在所公开的CDR组范围内带有一个或2个替换的CDR组。如下所述，在抗体构架或其他蛋白骨架(如纤连蛋白或细胞色素B)中(Koide等，1998；Nygren等，1997)中提供相关CDR组。优选使用抗体构架区。例如，可将抗体的一个或多个CDR或一组CDR移植入构架(如人构架)内以提供抗体分子或不同的抗体分子。例如，抗体分子可包含1021E5谱系抗体的CDR和人生殖系基因片段序列的构架区。可以向谱系抗体提供可被“生殖系化”的构架内的一组CDR，其中构架内的一个或多个残基被改变以与最相似的人生殖系构架(如来自VH1家族的DP10)或λ1家族(如DPL5)的构架中相应位置上的残基相匹配。因而，抗体构架区优选是生殖系和/或人的。
本发明提供了特异性针对NGF的分离的人抗体，其具有VH结构域，所述VH结构域包含包括DP10的人生殖系构架中的一组HCDR。通常，特异性结合成员也有VL结构域，其包含一组LCDR，优选处于包括Vλ1、如DPL5的人生殖系构架中。CDR优选是本文所公开的一组CDR。
“实质提及”所指的是，本发明的相关CDR或VH或VL结构域将与本文提及的序列的特定区域一致或高度相似。“高度相似”所预计的是，可以在CDR和/或VH或VL结构域中制备出1至5、优选1至4(如1至3或1或2、或3或4)个氨基酸替换。
在一个方面，本发明提供了针对NGF的特异性结合成员，其包含抗体抗原结合位点，所述位点由人抗体VH结构域和人抗体VL结构域组成，而且所述位点包括一组CDR，其中VH结构域包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，而且VL结构域能包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中HCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：193，HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：194，HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：195，LCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：198，LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：199，而且LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：200；或其中CDR组相对于该组CDR而包含一个或2个氨基酸替换。
因而，本发明提供了针对NGF的特异性结合成员，其包含抗体抗原结合位点，所述位点由人抗体VH结构域和人抗体VL结构域组成，而且所述位点包括一组CDR，其中CDR组是1133C11组CDR或本文公开的其他CDR组、或相对于1133C11组CDR或本文公开的其他CDR组而包含一个或2个替换的一组CDR。
在优选的具体实施方式中，一个或2个替换处于VH和/或VL结构域的CDR内的一个或2个如下残基上，其利用Kabat标准编号(1991)表示。
HCDR1中的31、34
HCDR2中的51、55、56、57、58、65
HCDR3中的96
LCDR1中的26、27、27A、27B、28、29、30
LCDR2中的56
LCDR3中的90、94。
在优选的具体实施方式中，一个或2个替换是根据鉴定出的可能的替换残基组的1133C11组CDR内的以下残基中一个或2个得到的：
替换位置         选自下组的替换残基
HCDR1中的31：    A
HCDR1中的34：    V
HCDR2中的51：    V
HCDR2中的55：    N
HCDR2中的56：    A
HCDR2中的57：    V
HCDR2中的58：    S
HCDR2中的65：    D
HCDR3中的96：    N
LCDR1中的26：    T
LCDR1中的26：    G
LCDR1中的27：    N
LCDR1中的27：    R
LCDR1中的27A：   T
LCDR1中的27A：   P
LCDR1中的27B：   D
LCDR1中的28：    T
LCDR1中的29：    E
LCDR1中的30：    D
LCDR2中的56：    T
LCDR3中的90：    A
LCDR3中的94：    G。
LCDR1内的残基29E是特别优选的具体实施方式。
优选的具体实施方式具有1133C11或1252A5、1152H5、1165D4、1230H7或1021E5组CDR。
在一个具体实施方式中，分离的特异性结合成员包含一组CDR，所述一组CDR包含1133C11组的CDR，其带有替换HCDR3中氨基酸序列LNPSLTA(SEQ ID NO：531)的氨基酸序列FNSALIS(SEQ ID NO：532)或氨基酸序列MISSLQP(SEQ ID NO：533)。
可在VH结构域中提供本文公开的谱系的任意组HCDR，所述VH结构域单独或与VL结构域组合用作特异性结合成员。可给VH结构域提供1133C11、1021E5或其他谱系抗体的一组HCDR，如表2a/2b中所示的一组HCDR，而且如果这样的VH结构域与VL结构域配对，则给VL结构域提供1133C11、1021E5或其他谱系抗体的一组LCDR，如表2a/2b中所示的一组LCDR。一组HCDR和一组LCDR的配对可如表2a/2b所示，提供包含如表2a/2b所示的一组CDR的抗体抗原结合位点。
VH和VL结构域构架包含构架区，其中一个或多个构架区可以是生殖系构架区，通常是人生殖系。VH结构域构架优选是人重链生殖系构架，而且VL结构域构架优选是人轻链生殖系构架。重链结构域的构架区可选自VH-1家族，并且优选的VH-1构架是DP-10构架。轻链构架区可选自λ1家族，并且优选的构架是DPL5。
一个或多个CDR可得自1252A5 VH或VL结构域并整合入合适的构架中。这在本文中将进一步论述。1252A5 HCDR 1、2和3分别显示于SEQ IDNO：393、394、395中。1252A5 LCDR 1、2和3分别显示于SEQ ID NO：398、399、400。
这都同样适用于其他CDR和如本文公开的CDR组，尤其适用于1152H5、1165D4和1230H7。
本发明的具体实施方式运用了1021E5谱系抗体分子，如抗体分子1021E5的抗体VH和/或VL结构域。本发明也提供了特异性结合成员，所述特异性结合成员包含抗体抗原结合位点，所述位点包含该VH和/或VL结构域。
优选的具体实施方式如下：
属于以下的VH结构域、VL结构域、HCDR组、LCDR组、或CDR组：1126F1(VH SEQ ID NO：102；VL SEQ ID NO：107)，1126G5(VH SEQ IDNO：112；VL SEQ ID NO：117)，1126H5(VH SEQ ID NO：122；VL SEQ IDNO：127)，1127D9(VH SEQ ID NO：132；VL SEQ ID NO：137)，1127F9(VHSEQ ID NO：142；VL SEQ ID NO：147)，1131D7(VH SEQ ID NO：152；VLSEQ ID NO：157)，1131H2(VH SEQ ID NO：162；VL SEQ ID NO：167)，1132A9(VH SEQ ID NO：172；VL SEQ ID NO：177)，1132H9(VH SEQ IDNO：182；VL SEQ ID NO：187)，1133C11(VH SEQ ID NO：192；VL SEQID NO：197)，1134D9(VH SEQ ID NO：202；VL SEQ ID NO：207)，1145D1(VH SEQ ID NO：212；VL SEQ ID NO：217)，1146D7(VH SEQ ID NO：222；VL SEQ ID NO：227)，1147D2(VH SEQ ID NO：232；VL SEQ ID NO：237)，1147G9(VH SEQ ID NO：242；VL SEQ ID NO：247)，1150F1(VH SEQ IDNO：252；VL SEQ ID NO：257)，1152H5(VH SEQ ID NO：262；VL SEQ IDNO：267)，1155H1(VH SEQ ID NO：272；VL SEQ ID NO：277)，1158A1(VHSEQ ID NO：282；VL SEQ ID NO：287)，1160E3(VH SEQ ID NO：292；VL SEQ ID NO：297)，1165D4(VH SEQ ID NO：302；VL SEQ ID NO：307)，1175H8(VH SEQ ID NO：312；VL SEQ ID NO：317)，1211G10(VH SEQ IDNO：322；VL SEQ ID NO：327)，1214A1(VH SEQ ID NO：332；VL SEQ IDNO：337)，1214D10(VH SEQ ID NO：342；VL SEQ ID NO：347)，1218H5(VH SEQ ID NO：352；VL SEQ ID NO：357)，和1230H7(VH SEQ ID NO：362；VL SEQ ID NO：367)。
更进一步优选1083H4(VH SEQ ID NO：22；VL SEQ ID NO：27)、1227H8(VH SEQ ID NO：372；VL SEQ ID NO：377)和1230D8(VH SEQ ID NO：382；VL SEQ ID NO：387)的VH结构域、VL结构域、HCDR组、LCDR组、或CDR组。
在非常优选的具体实施方式中，向VH结构域提供氨基酸序列SEQ IDNO：192，这被专门称为“1133C11 VH结构域”。在另外的非常优选的具体实施方式中，向VL结构域提供氨基酸序列SEQ ID NO：197，这被专门称为“1133C11 VL结构域”。根据本发明所提供的非常优选的抗体抗原结合位点由1133C11 VH结构域(SEQ ID NO：192)和1133C11 VL结构域(SEQID NO：197)组成。可在任何所希望的抗体分子形式，如scFv、Fab、IgG、IgG4等内提供该抗体抗原结合位点，这在本文其他部分会进一步论及。
在另外的非常优选的具体实施方式中，向VH结构域提供氨基酸序列SEQ ID NO：392，这被专门称为“1252A5 VH结构域”。在另外的非常优选的具体实施方式中，向VL结构域提供氨基酸序列SEQ ID NO：397，这被专门称为“1252A5 VL结构域”。根据本发明所提供的非常优选的抗体抗原结合位点由1252A5 VH结构域(SEQ ID NO：392)和1252A5 VL结构域(SEQID NO：397)组成。提供的该抗体抗原结合位点在任何所希望的抗体分子形式内，如scFv、Fab、IgG、IgG4等中提供，这在本文其他部分会进一步论及。
在另外的非常优选的具体实施方式中，本发明提供了IgG4抗体分子，其包含1252A5 VH结构域(SEQ ID NO：392)和1252A5 VL结构域(SEQID NO：397)。这在本文中被专门称为“1252A5 IgG4”。
本发明提供了其他IgG或其他抗体分子，其包含1252A5 VH结构域(SEQ ID NO：392)和/或1252A5 VL结构域(SEQ ID NO：397)，也提供了其它抗体分子，其包含抗体VH结构域内的1252A5组HCDR(SEQ ID NO：393、394和395)、和/或抗体VL结构域内的1252A5组LCDR(SEQ ID NO：398、399和400)。
如注意到的，本发明提供了结合人NGF的特异性结合成员，而且其包含1252A5 VH结构域(SEQ ID NO：392)和/或1252A5 VL结构域(SEQ IDNO：397)。本文公开这种特异性结合成员的性质。
一般来说，VH结构域与VL结构域配对来提供抗体抗原结合位点，虽然如下进一步所述的，可单独使用VH结构域来结合抗原。在一个优选的具体实施方式中，1252A5 VH结构域(SEQ ID NO：392)与1252A5 VL结构域(SEQ ID NO：397)配对，由此形成既包含1252A5 VH又包含VL结构域的抗体抗原结合位点。为本文公开的其他VH和VL结构域提供类似的具体实施方式。在其它具体实施方式中，1252A5 VH与除了1252A5 VL之外的VL结构域配对。轻链混杂是本领域早已成熟的。而且，本发明也为本文公开的其他VH和VL结构域提供了类似的具体实施方式。
本发明的VH和VL结构域和CDR的变体，包含那些其氨基酸序列在本文提及、而且可被运用于针对NGF的特异性结合成员中的变体，可通过序列改变或突变和筛选的方法来获得。本发明也提供了这样的方法。
根据本发明的另外的方面，提供了特异性结合成员，其与任何特异性结合成员竞争与抗原的结合，所述任何特异性结合成员既与抗原结合，又包含本文公开的特异性结合成员、VH和/或VL结构域、或本文公开的HCDR3、或这些的任意变体。结合成员间的竞争可在体外容易地检测，  例如可利用ELISA和/或通过将特定报告分子加标签到一种结合成员上，在一种或多种其它未带标签的结合成员存在时可进行检测，从而能够鉴定结合相同表位或重叠表位的特异性结合成员。
因而，本发明的另一方面提供了特异性结合成员，其包含与抗体分子(例如特别是1252A5或其他优选的scFv和/或IgG4)竞争与NGF结合的人抗体抗原结合位点。在本发明的另外方面中，提供了特异性结合成员，其包含与抗体抗原结合位点竞争与NGF结合的人抗体抗原结合位点，其中抗体抗原结合位点由VH结构域和VL结构域组成，而且其中VH和VL结构域包含1133C11、1021E5、1252A5或本文公开的其他谱系的一组CDR。
现有技术已有各种方法来获得抗NGF、而且其与1252A5或其他抗体分子、带有1252A5或其他CDR组的抗体分子、或带有1252A5或其他谱系的一组CDR的抗体分子竞争结合NGF的抗体。
在另一方面中，本发明提供了获得能结合抗原的一个或多个特异性结合成员的方法，该方法包括将根据本发明所述的特异性结合成员的文库与所述抗原接触，并挑选文库中能结合所述抗原的一个或多个特异性结合成员。
文库可以展示在颗粒或分子复合物上，如诸如酵母、细菌或噬菌体(如T7)颗粒的可复制遗传包装体(package)，或共价、核糖体或其它体外展示系统，每种颗粒或分子复合物包含编码展示在它上面的抗体VH可变结构域的核酸，而且如果存在，任选包含展示的VL结构域。
选择出能结合抗原并展示在噬菌体或其他文库颗粒或分子复合物上的特异性结合成员后，核酸可得自展示了所述选出的特异性结合成员的噬菌体或其他颗粒或分子复合物上。通过表达带有得自展示了所述选出的特异性结合成员的噬菌体或其他颗粒或分子复合物上的核酸序列的核酸，该核酸可接着用于生产特异性结合成员或抗体VH或VL可变结构域。
带有所述选出的特异性结合成员的抗体VH可变结构域氨基酸序列的抗体VH可变结构域可以以分离的形式来提供，如可以是包含这样的VH结构域的特异性结合成员。
可进一步测试结合NGF的能力，以及测试与诸如1252A5(如以scFv形式和/或以IgG形式，如IgG4)竞争结合NGF的能力。如以下进一步所述，可测试中和NGF的能力。
根据本发明所述的特异性结合成员可以1252A5或其他抗体分子(如scFv、或优选1252A5或其他IgG4)的亲和力，或更好的亲和力结合NGF。
根据本发明所述的特异性结合成员可以1252A5或其他抗体分子(如scFv、或优选1252A5或其他IgG4)的效力或更好的效力中和NGF。
不同特异性结合成员的结合亲和力和中和效力可在适当的条件下作比较。
本发明的抗体较之现有商业上可获得的抗NGF抗体，具有大量优点。例如，本发明提供了人或生殖系化抗体，预计其在长期或重复向人施用用于治疗或诊断时，显示出较低程度的免疫原性。此外，本发明提供了是更有效的NGF中和剂的抗体，因此可利用较少抗体材料达到所希望的治疗或诊断效果。另外，在本发明的一个具体实施方式中，抑制NGF/TrKA受体相互作用的效力大于所观察到的对NGF/p75受体相互作用的抑制。较之其他明显是非选择性的NGF拮抗剂治疗，这可以在这点上、在达到的治疗效果的数量或性质上、或在减少不希望的副作用中，带来优点。
本发明也提供了包含抗NGF抗体分子的异质性制品。例如，该制品可以是带有全长重链和缺少C-末端赖氨酸的重链、带有各种糖基化程度和/或带有衍生的氨基酸(如N-末端谷氨酸环化形成的焦谷氨酸残基)的抗体的混合物。
在另外的方面中，本发明提供了分离的核酸，其包含编码根据本发明所述的特异性结合成员、VH结构域和/或VL结构域的序列，并提供了制备本发明的特异性结合成员、VH结构域和/或VL结构域的方法，其包括在能产生所述特异性结合成员、VH结构域和/或VL结构域的条件下表达所述核酸，并收获它。
本发明的另一方面提供了核酸，其一般是分离的，其编码本文公开的抗体VH可变结构域和/或VL可变结构域。
本发明的其他方面提供了核酸，其一般是分离的，其编码本文公开的VH CDR或VL CDR序列，特别是选自如下的VH CDR：1133C11(VH CDR1SEQ ID NO：193，VH CDR2 SEQ ID NO：194，和VH CDR3 SEQ ID NO：195)，1152H5(VH CDR1 SEQ ID NO：263，VH CDR2 SEQ ID NO：264，和VH CDR3 SEQ ID NO：265)，和1252A5(VH CDR1 SEQ ID NO：393，VHCDR2 SEQ ID NO：394，和VH CDR3 SEQ ID NO：395)，或选自如下的VLCDR：1133C11(VL CDR1 SEQ ID NO：198，VL CDR2 SEQ ID NO：199，和VL CDR3 SEQ ID NO：200)，1152H5(VL CDR1 SEQ ID NO：268，VLCDR2 SEQ ID NO：269，和VL CDR3 SEQ ID NO：270)，和1252A5(VL CDR1SEQ ID NO：398，VL CDR2 SEQ ID NO：399，和VL CDR3 SEQ ID NO：400)，最优选是1252A5 VH CDR3(SEQ ID NO：395)。本发明也提供了编码1252A5组CDR的核酸、编码1252A5组HCDR的核酸和编码1252A5组LCDR的核酸，如编码1252A5、1133C11或1021E5谱系的个别CDR、HCDR、LCDR和CDR、HCDR、LCDR组的核酸。
另一方面提供了用本发明的核酸转化的宿主细胞。
又一方面提供了生产抗体VH可变结构域的方法，该方法包括使编码核酸表达。该方法可包括在产生所述抗体VH可变结构域的条件下培养宿主细胞。
本发明的另外方面提供了产生VL可变结构域和包含VH和/或VL结构域的特异性结合成员的类似方法。
生产方法可包括分离和/或纯化产物的步骤。生产方法可包括将产物配制入包含至少一种额外成份(如药学上可接受的赋形剂)的组合物中。
本发明的另外方面提供了包含本发明的特异性结合成员的组合物，以及它们在抑制或中和NGF的方法中的用途，包括通过疗法治疗人或动物体的方法。
根据本发明所述的特异性结合成员可用于治疗或诊断人或动物体的方法中，如治疗(其可包括预防性治疗)人患者疾病或病症的方法，其包括向所述患者施用有效量的本发明的特异性结合成员。可根据本发明治疗的病况包括NGF在其中起作用的任何病况，特别是疼痛、哮喘、慢性阻塞性肺病、肺纤维化、其它气道炎症疾病、糖尿病性神经病、HIV、心律失常、关节炎、牛皮癣和癌症。
以下将更详细地描述本发明的这些和其他方面。
术语
此处可以方便地指出，本文所用的“和/或”用作明确公开两个特定的特征或成员之每一个要与另一个在一起或可以不与另一个在一起。例如“A和/或B”用作明确公开下列中的每一个：(i)A、(ii)B和(iii)A和B，就好像这每一个在本文被单独提及过。
NGF
NGF(也被称为β-NGF)是神经生长因子。在本发明的上下文中，NGF通常是人NGF，然而它可以是非人NGF(如非人灵长类NGF和/或大鼠NGF和/或小鼠NGF)。有时NGF也被称为“抗原”。
本文所述的测试中所用的NGF通常是人、大鼠或小鼠NGF，但是可用来自其他非人动物的NGF，如非人灵长类NGF。
疼痛
正如本领域公知的，这里描述了疼痛的感觉，并可以涵盖以下之一个或多个、或全部：
-痛觉过敏(hyperalgesia)(针对正常疼痛刺激的夸大的疼痛反应)；
-异常性疼痛(allodynia)(没有正常疼痛刺激而造成的疼痛感觉)；
-在没有任何明显外部影响时由任何机制而造成的自发的疼痛感觉；
-物理刺激(如热、温、冷、压力、振动、静态或动态接触、或身体姿态和运动)引发的疼痛；
-任何机制造成的躯体和内脏疼痛，例如外伤、感染、炎症、代谢疾病、中风或神经疾病。
疼痛可以例如是急性疼痛、短期疼痛、持续性伤害性感受(nociceptive)疼痛、或持续性或慢性神经性疼痛。
特异性结合成员
这描述了成对分子中具有与另一个结合的特异性的一个成员。特定结合对的成员可以是天然来源的或是完全或部分合成产生的。成对分子的一个成员在其表面有一区域、或腔洞，其特异性结合成对分子的另一个成员，因而与成对分子的另一个成员的特定空间和极性组织互补。因此成对的成员具有互相特异性结合的性质。特异性结合对的类型的例子有抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本发明关注抗原-抗体型反应。
特异性结合成员通常包含具有抗原结合位点的分子。例如，特异性结合成员可以是包含抗原结合位点的抗体分子或非抗体蛋白质。可通过在非抗体蛋白骨架(如纤连蛋白或细胞色素B等)上排列CDR来提供抗原结合位点(Haan & Maggos，2004；Koide等，1998；Nygren等，1997)，或通过随机化或突变蛋白骨架内环上的氨基酸残基来提供针对所希望的靶位结合特异性。用于在蛋白质中工程改造新结合位点的骨架由Nygren等(1997)详细综述了。抗体模拟物的蛋白骨架在WO/0034784中公开了，其中发明人描述了蛋白质(抗体模拟物)，其包含具有至少一个随机化的环的纤连蛋白III型结构域。适于移植入一个或多个CDR(如一组HCDR)的骨架可以通过免疫球蛋白基因超家族的任何结构域成员来提供。骨架可以是人或非人蛋白质。
非抗体蛋白质骨架的优点是，它可以在比至少一些抗体分子更小的和/或更容易制备的骨架分子中提供抗原结合位点。小尺寸的特异性结合成员可带来有用的生理性质，如进入细胞、深度穿透组织或到达其他结构内的靶位、或结合靶抗原的蛋白腔洞的能力。
抗原结合位点在非抗体蛋白骨架中的用途在Wess(2004)中有综述。其典型的是具有稳定主链和一个或多个可变环的蛋白质，在可变环中一个环或多个环的氨基酸序列被特别或随机突变以产生具有结合靶抗原特异性的抗原结合位点。该蛋白质包括来自金黄色葡萄球菌蛋白质A的IgG结合结构域、转铁蛋白、四连接素(tetranectin)、纤连蛋白(如第10纤连蛋白的III型结构域)和脂笼蛋白。其他方法包括合成的“微体”(Selecore GmbH)，其基于cyclotide——具有分子内二硫键的小蛋白质。
除了抗体序列和/或抗原结合位点，根据本发明所述的特异性结合成员可包含其他氨基酸，如形成诸如折叠结构域的肽或多肽，或赋予分子除了结合抗原能力之外的其他功能特征。本发明的特异性结合成员可带有可检测标记，或可与毒素或靶部分或酶缀合(如通过肽键或接头)。例如，特异性结合成员可包括催化位点(如在酶结构域中)以及抗原结合位点，其中抗原结合位点结合抗原，因而将催化位点靶向于抗原。催化位点可抑制抗原的生物功能，如通过裂解。
尽管注意到，骨架(如纤连蛋白或细胞色素B)可带有CDR(Haan&Maggos，2004；Koide等，1998；Nygren等，1997)，但是用于带有本发明的CDR或一组CDR的结构一般将是抗体重或轻链序列或其实质部分的结构，其中CDR或CDR组位于由重排的免疫球蛋白基因编码的天然出现的VH和VL抗体可变结构域的相应CDR或CDR组位置上。免疫球蛋白可变结构域的结构和位置可通过参考文献(Kabat，等，1987，及其更新资料，其现在可在互联网上获得(http://immuno.bme.nwu.edu或利用任何检索引擎查找“Kabat”)来确定。
抗体分子
这描述了免疫球蛋白，不论是天然的还是部分或完全合成产生的。该术语也涵盖任何包含抗体抗原结合位点的多肽或蛋白质。包含抗体抗原结合位点的抗体片段是诸如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd和双抗体的分子。
可用单克隆和其他抗体和应用重组DNA技术来生产保留原始抗体特异性的其他抗体或嵌合分子。该技术可包括将编码抗体免疫球蛋白可变区、或CDR的DNA导入到不同免疫球蛋白的恒定区、或恒定区和构架区中。例如可参见EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400、和大量此后的文献。杂交瘤或产生抗体的其他细胞可进行遗传突变或其他改变，其可以或不改变所产生的抗体的结合特异性。
由于抗体可用大量方式来修饰，术语“抗体分子”应该被解释为涵盖任意特异性结合成员或具有有所需特异性的抗体抗原结合位点的物质。因而，该术语涵盖抗体片段和衍生物，包括任何包含抗体抗原结合位点的多肽，不论是天然的还是完全或部分合成的。所以还包括嵌合分子，其包含与其他多肽融合的抗体抗原结合位点或等价物。嵌合抗体的克隆和表达在EP-A-0120694和EP-A-0125023、和大量此后的文献中有描述。
其他现有可用的抗体工程改造技术使得分离人和人源化抗体成为可能。例如，如Kontermann & Dubel(2001)所述，可制备人杂交瘤。许多公开文献中都详细描述了噬菌体展示——另一种产生特异性结合成员的成熟技术，如Kontermann & Dubel(2001)和WO92/01047(以下将进一步讨论的)。转基因小鼠可用于分离人抗体，其中小鼠抗体基因是失活的并用人抗体基因进行功能性替换而同时小鼠免疫系统的其他成员保留完整(Mendez等，1997)。
例如如Knappik等(2000)或Krebs等(2001)所述，通过从合成并在合适的表达载体中装配的寡核苷酸的方式，可通过表达所产生的基因而产生合成的抗体分子。
已经显示，完整抗体的片段可执行结合抗原的功能。结合片段的例子有：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)dAb片段(Ward，1989；McCafferty等，1990；Holt等，2003)，其由VH或VL结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab′)2片段——包含2个相连的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过接头肽相连，所述接头肽可使2个结构域连接形成抗原结合位点(Bird等，1988；Huston等，1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)“双抗体”——通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；Holliger等，1993)。Fv、scFv或双抗体分子可通过整合连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定(Reiter等，1996)。也可制备微体(minibody)，其包含与CH3结构域连接的scFv(Hu等，1996)。
dAb(结构域抗体)是抗体的小单体抗原结合片段，即抗体重或轻链的可变区(Holt等，2003)。VH dAb天然发生于骆驼类(camelid)中(如骆驼、美洲驼)并可通过用靶抗原免疫骆驼类、分离抗原特异性B细胞以及直接各个B细胞克隆dAb基因来产生。dAb也可在细胞培养基中生产。他们的小尺寸、好的溶解性和温度稳定性使得它们在生理上特别有用并适于进行选择和亲和力成熟。本发明的特异性结合成员可以是dAb，其包含本文实质提及的VH或VL结构域、或包含本文实质提及的一组CDR的VH或VL结构域。
当使用双特异性抗体时，这些可以是常规的双特异性抗体，其可用各种方式制备(Holliger & Winter，1993)，如化学或从杂交瘤中制备，或其可以是上述之任意双特异性抗体片段。双特异性抗体的例子包括BiTETM技术的那些，其中可使用带有不同特异性的2个抗体的结合结构域并直接通过短的柔性肽相连。这在短的单个多肽链上结合了2个抗体。可不带Fc区而仅仅利用可变结构域构建双抗体和scFv，潜在减少了抗独特型反应的影响。
双特异性双抗体，与双特异性完整抗体相反，也是特别有用的，这是因为它们可轻易地被构建并在E.coli中表达。利用噬菌体展示(WO94/13804)可轻易地从文库中选择出具有适当的结合特异性的双抗体(和许多其他多肽6，如抗体片段)。如果双抗体的一个臂保持不变，如带有抗NGF的特异性，则可制备其中另一臂可变的文库，并选择具有适当特异性的抗体。通过knobs-into-holes工程改造可制备双特异性完整抗体(Ridgeway等，1996)。
抗原结合位点
这描述了结合并互补于靶抗原的全部或部分的分子的部分。在抗体分子中，它被称作为抗体抗原结合位点，而且其包含特异性结合于并互补于靶抗原的全部或部分的抗体部分。当是抗原是大抗原时，抗体可仅仅结合抗原的特定部分，该部分被专门称为表位。通过一个或多个抗体可变结构域可提供抗体抗原结合位点。抗体抗原结合位点优选包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
特异性
这可用于指其中特异性结合对的一个成员将不显示出与除了其一个或多个特异性结合配体之外的分子结合的情形。该术语也可用在诸如抗原结合位点特异性针对于大量抗原所带有的特定表位的地方，其中带有抗原结合位点的特异性结合成员将能结合带有表位的各种抗原。
分离的
这指状态，其中本发明的特异性结合成员、或编码该结合成员的核酸一般是本发明所述的。分离的成员和分离的核酸不含或基本不含与它们天然相连的材料，如在它们天然环境中或当该制品通过重组DNA技术在体外或体内制备时，在制备它们的环境中(如细胞培养基)所找到的与它们在一起的其他多肽或核酸。成员和核酸可与稀释剂或佐剂配制在一起，而且为了实用目的它仍旧是分离的——例如，如果用于包被用于免疫测试的微滴定板时，则成员通常与白明胶或其他载体混合在一起，或当用于诊断或治疗时，则将与药学上可接受的载体或稀释剂混合在一起。特异性结合成员可以是天然或通过异源真核细胞(如CHO或NS0(ECACC 85110503)细胞)系统糖基化的，或者它们可以是(例如通过在原核细胞中表达而产生的)未糖基化的。
详细说明
如上所注意到的，根据本发明所述的特异性结合成员优选中和NGF。
抗体中和NGF的程度被称作为它的中和效力。
除非另外规定，效力通常被表示为以nM为单位的IC50值。IC50是抗体分子的中位抑制浓度。在功能性测试中，IC50是将生物学应答减少到其最大值的50％的浓度。在配体结合研究中，IC50是将受体结合减少到最大特异性结合水平的50％的浓度。
例如本文实施例2、5、6或9所述的，通过将％生物学应答(例如由FLIPR测试中的钙离子动员、PC12测试中的存活度、或在TF-1增殖测试中的增殖所代表)或％特异性受体结合绘制为特异性结合成员浓度的对数函数，并利用诸如Prism(GraphPad)的软件程序拟合出数据的S形函数，从而产生IC50值，由此可以计算IC50。
根据本发明所述的特异性结合成员在表达TrkA受体的细胞中优选抑制人NGF引起的细胞内钙动员，例如在重组转染有TrkA基因的细胞中，如HEK细胞。在本文实施例2中所述的“FLIPR”钙动员测试中，根据本发明所述的特异性结合成员优选具有的中和人NGF的效力(IC50)小于600、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10nM。通常，本发明的特异性结合成员具有的效力为5nM或更小，优选2.5nM或更小，更优选1nM或更小。在尤其优选的具体实施方式中，效力为0.5nM或更小，如0.4nM或更小；0.3nM或更小；0.2nM或更小；或0.15nM或更小。在一些具体实施方式中，效力可以约为0.1nM。
效力可以是0.1-100nM、0.1-50nM、0.1-10nM、或0.1-1.0nM。例如，效力可以是0.1-5.0nM、0.2-5.0nM、0.3-5.0nM、或0.3-0.4nM。
在本发明的一些具体实施方式中，本文所述的HEK细胞测试中未经效力优化的特异性结合成员的中和效力针对人NGF约为1.8至560nM，和/或针对大鼠NGF约为2.9至620nM。在一些具体实施方式中，本文所述的HEK细胞测试中效力优化的结合成员的中和效力针对人NGF约为0.12至120nM，针对大鼠NGF约为0.11至37nM，而且针对小鼠NGF约为0.11至71nM。可是，这些仅是举例，还可达到更高的效力。尽管效力优化可用于从给定的特异性结合成员中产生更高效力的特异性结合成员，但也要注意，即使不通过效力优化也可获得高效特异性结合成员。
根据本发明所述的特异性结合成员优选抑制NGF所维持的无血清的PC12细胞存活。本发明特异性结合成员在本文实施例5所述的人NGF的PC12存活测试中的中和效力一般是1500nM或更少，优选是50nM或更少，或10nM或更少。如上所解释的以及如本文所证明的，可用效力优化来得到更高的抗NGF效力。特异性结合成员具有的效力优选小于5nM、4nM、3nM、2nM、1.5nM、1nM或0.5nM。在一些具体实施方式中，效力约为0.1nM或更多，0.2nM或更多。因而，效力可以是0.1或0.2nM至0.5、1.5、5或50nM之间。
在本发明的一些具体实施方式中，在本文所述的PC12存活测试中，效力优化的特异性结合成员的中和效力针对人NGF约为0.2至670nM，而且针对大鼠NGF约为0.2至54nM。
根据本发明所述的特异性结合成员优选抑制NGF刺激的TF-1细胞增殖。本文实施例6所述的TF-1增殖测试中，本发明特异性结合成员(通常是效力优化的特异性结合成员)的中和效力针对人NGF一般是5nM或更少，优选1nM或更少。本发明的特异性结合成员针对人NGF所具有的效力优选是或小于0.7、0.6、0.5、0.45、0.4、0.3、0.2或0.1nM。例如，效力可以为0.05-0.1nm、0.05-0.2nM、0.05-0.3nM、0.05-0.4nM、或0.05-0.5nM。
在本发明的一些具体实施方式中，本文所述的TF-1增殖测试中，效力优化的特异性结合成员的中和效力针对人NGF约为0.08至0.7nM，针对大鼠NGF约为0.07至1.9nM，而且针对小鼠NGF约为0.07至1.4nM。
根据本发明所述的特异性结合成员优选抑制NGF结合于TrkA和/或p75受体，优选是人TrkA和/或p75受体。本发明还更一般地扩大到了特异性结合成员，其较之NGF与p75受体的结合，优先阻断NGF与TrkA受体的结合。本文实施例9所述的TrkA受体结合测试中，本发明特异性结合成员(通常是效力优化的特异性结合成员)用于中和人NGF的中和效力一般是2.5nM或更少，优选1nM或更少。本发明的特异性结合成员所具有的用于中和人NGF与TrkA结合的效力优选是或小于0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或0.075nM。例如，效力可以为0.05-0.1nm、0.05-0.2nM、0.05-0.3nM、0.05-0.4nM、或0.05-0.5nM。
本文实施例9所述的p75受体结合测试中，本发明特异性结合成员(通常是效力优化的特异性结合成员)用于中和人NGF的中和效力一般是1.5nM或更少，优选1nM或更少。本发明的特异性结合成员所具有的用于中和人NGF与p75结合的效力优选是或小于0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1nM。例如，效力可以为0.1-0.2nM、0.1-0.3nM、0.1-0.4nM、0.1-0.5nM、或0.1-0.6nM。
根据本发明所述的一些优选特异性结合成员较之NGF与p75受体的结合，优先抑制NGF(如人和/或大鼠NGF)与TrkA受体的结合。因此，在本发明的具体实施方式中，特异性结合成员具有比NGF与p75结合更低的结合抑制常数(Ki)，来抑制NGF(如人和/或大鼠NGF)与TrkA的结合。利用实施例9提及的公式可计算Ki。可选地，结合抑制常数可表示为pKi，其算作-log10Ki。因而，本发明的特异性结合成员优选以比结合p75更高的pKi值来抑制NGF与TrkA的结合。
根据本发明所述的特异性结合成员优选以是或小于1、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3或0.2nM的亲和力结合人NGF和/或大鼠NGF。例如，特异性结合成员可以约为0.25-0.44nM的亲和力结合人NGF，而结合大鼠NGF的亲和力约为0.25-0.70nM。
如上所注意到的，本发明中可产生和使用本文公开的抗体分子变体。先进行计算化学将多元数据分析技术应用于结构/性质-活性关系中(Wold，等1984)，然后利用公知的数学技术，如，统计回归、模式识别和分类(Norman等1998；Kandel & Backer，1995；Krzanowski，2000；Witten & Frank，1999；Denison(编)，2002；Ghose & Viswanadhan)，得出抗体的定量活性-性质关系。抗体的性质可得自抗体序列、功能和三维结构的经验和理论模型(例如，分析可能的接触残基或计算得出的物理化学性质)，而且这些性质可单独和组合地加以考察。
以下6个多肽环形成了由VH结构域和VL结构域组成的抗体抗原结合位点：3个来自轻链可变结构域(VL)，而且3个来自重链可变结构域(VH)。分析已知原子结构的抗体，阐明了序列和抗体结合性位点的三维结构之间的关系(Chothia等1992；Al-Lazikani，等1997)。这些关系暗示了，除了VH结构域中的第三个区域(环)，结合位点环具有数量不多的主链构象之一：规范结构。已显示，特定环中形成的规范结构可由其大小和在环和构架区关键位点上的某些残基的存在而确定(Chothia等和Al-Lazikani等，同上)。
该序列-结构关系的研究可用于预测序列已知、而三维结构未知的抗体中的那些残基，这些残基对维持抗体CDR环的三维结构并由此维持结合特异性而言是重要的。这些预测可通过将预测与先前优化实验输出结果作比较来得到支持。在结构方法中，可利用可免费使用或和商用的软件包诸如WAM(Whitelegg&Rees，2000)来产生抗体分子的模型(Chothia，等1986)。然后可利用蛋白质可视化和分析软件包，如Insight II(Accelerys，Inc.)或DeepView(Guex & Peitsch，1997)，来评估CDR中每个位置上可能的替换。然后该信息可被用于产生可能对活性产生最小的或有益的效应的替换。
CDR、抗体VH或VL结构域和特异性结合成员的氨基酸序列内进行替换所需的技术一般是本领域可用的。通过预计对活性产生或不产生最小的或有益的效应的替换来制备变体序列，并且测试结合和/或中和NGF的能力和/或任何其他所希望的性质。
如本文所述，根据本发明可利用其序列被本文明确公开的任何VH和VL结构域的可变结构域氨基酸序列变体。特定变体可包含一个或多个氨基酸序列变化(氨基酸残基的添加、缺失、替换和/或插入)，可以有小于约20个变化，小于约15个变化，小于约10个变化或小于约5个变化，可以有5、4、3、2或1个变化。可在一个或多个构架区和/或一个或多个CDR中进行变化。
变化优选不会导致功能丧失，因此包含这样加以改变的氨基酸序列的特异性结合成员优选保持结合和/或中和NGF的能力。更优选，例如如本文所述的测试中所测定的，它与未进行变化的特异性结合成员相比保持了相同的定量结合和/或中和能力。最优选，包含这样加以改变的氨基酸序列的特异性结合成员具有改善的结合或中和NGF的能力。
变化可包含用非天然存在的或非标准氨基酸替换一个或多个氨基酸残基，将一个或多个氨基酸残基修饰成非天然存在的或非标准的形式，或将一个或多个非天然存在的或非标准氨基酸插入到序列中。本发明的序列中优选的变化数量和位置在本文其他部分有描述。天然存在的氨基酸包括20种“标准的”L-氨基酸，通过它们的单字母码可表示为G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E。非标准氨基酸包括可整合入多肽主链或通过现存氨基酸残基的修饰而产生的任何其他残基。非标准氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的。几种天然存在的非标准氨基酸是本领域已知的，如4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、N-乙酰基丝氨酸等(Voet & Voet，1995)。那些在它们N-α位上衍生的氨基酸残基将仅仅位于氨基酸序列的N-末端。通常在本发明中，氨基酸是L-氨基酸，但在一些具体实施方式中，它可以是D-氨基酸。所以，变化可以包括将L-氨基酸修饰成D-氨基酸、或将L-氨基酸其替换为。氨基酸的甲基化、乙酰化和/或磷酸化形式也是已知的，而且本发明中的氨基酸可进行这种修饰。
本发明的抗体结构域和特异性结合成员中的氨基酸序列可包含上述非天然的或非标准氨基酸。在一些具体实施方式中，非标准氨基酸(如D-氨基酸)可在合成过程中整合入氨基酸序列中，而在其他具体实施方式中，可在氨基酸序列合成后通过修饰或替换“初始”标准氨基酸而导入非标准氨基酸。
非标准和/或非天然存在的氨基酸的使用增加了结构和功能多样性，因此可在本发明的特异性结合成员中增加达到所希望的NGF结合和中和性质的潜力。另外由于施用给动物后具有L-氨基酸的多肽的体内降解，D-氨基酸和类似物显示较之标准L-氨基酸具有更好的药物动力学图谱。
如上所注意到的，本文实质提及的CDR氨基酸序列优选作为人抗体可变结构域或其实质部分中的CDR而被携带。本文实质提及的HCDR3序列代表本发明优选的具体实施方式，而且优选这些HCDR3序列中的每一个作为人重链可变结构域或其实质部分中的HCDR3而被携带。
本发明中所用的可变结构域可得自或衍生自任何生殖系或重排的人可变结构域，或可以是基于已知人可变结构域共有或实际序列的合成可变结构域。利用重组DNA技术，可将本发明的CDR序列(如CDR3)导入到缺少CDR(如CDR3)的可变结构域库中。
例如，Marks等(1992)记载了产生抗体可变结构域库的方法，其中针对或邻接于可变结构域区域5′末端的共有引物用于与人VH基因第三个构架区的共有引物结合，以提供缺少CDR3的VH可变结构域库。Marks等进一步记载了该库如何与特定抗体的CDR3结合。利用类似技术，本发明的CDR3衍生的序列可与缺少CDR3的VH或VL结构域库改组，而且改组的完整VH或VL结构域与同类VL或VH结构域组合以提供本发明的特异性结合成员。然后，库可展示在合适的宿主系统中，如WO92/01047或任何后来的大量文献(包括Kay、Winter & McCafferty(1996))的噬菌体展示系统，由此可选择出合适的特异性结合成员。库可由104个个体成员以上的任何成员组成，例如106至108或1010个成员。其他合适的宿主系统包括酵母展示、细菌展示、T7展示、核糖体展示和共价展示。
Stemmer(1994)也公开了类似的改组或组合技术，其描述了与β-内酰胺酶基因相关的技术，但观察到该方法可用于产生抗体。
可另选的是利用随机突变一个或多个选出的VH和/或VL基因来产生整个可变结构域内的突变，由此产生带有本发明的CDR衍生序列的新VH或VL区域。Gram等(1992)描述了该技术，其使用易错PCR。在优选的具体实施方式中，在一组HCDR和/或LCDR中进行一个或2个氨基酸替换。
可用的其他方法是定点诱变VH或VL基因的CDR区域。Barbas等(1994)和Schier等(1996)公开了该技术。
所有上述技术都是现有已知的，而且利用本领域常规方法，普通技术人员将能用该技术来提供本发明的特异性结合成员。
本发明的另一方面提供了获得特异性针对NGF抗原的抗体抗原结合位点的方法，该方法包括通过在本文提及的VH结构域氨基酸序列中添加、缺失、替换或插入一个或多个氨基酸来提供是VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域，任选将这样得到的VH结构域与一个或多个VL结构域组合，并测试VH结构域或VH/VL组合或多个组合以鉴定出特异性针对NGF抗原的特异性结合成员或抗体抗原结合位点，并任选其具有一个或多个优选的性质，优选是中和NGF活性的能力。所述VL结构域可有本文实质提及的氨基酸序列。
可使用类似方法，在该方法中本文公开的VL结构域的一个或多个序列变体与一个或多个VH结构域组合。
在优选的具体实施方式中，1252A5 VH结构域(SEQ ID NO：392)可进行突变以提供一个或多个VH结构域的氨基酸序列变体，任选其与1252A5VL(SEQ ID NO：397)组合。
本发明的另一方面提供了制备特异性针对NGF抗原的特异性结合成员的方法，该方法包括：
(a)提供编码VH结构域的初始核酸库，所述VH结构域包括要被替换的CDR3或缺少CDR3编码区；
(b)将所述库与编码本文实质提及的针对VH CDR3的氨基酸序列的供体核酸组合，由此将所述供体核酸插入到库中的CDR3区域，从而提供编码VH结构域的核酸的产物库；
(c)表达所述产物库的核酸；
(d)选择特异性针对NGF的特异性结合成员；和
(e)回收所述特异性结合成员或编码它的核酸。
另外，可用类似方法，其中本发明的VL CDR3与编码VL结构域的核酸库结合，所述VL结构域包括要被替换的CDR3或缺少CDR3编码区。
相似地，一个或多个、或所有3个CDR可被移植到VH或VL结构域库中，然后筛选这个库中特异性针对NGF的特异性结合成员或多个特异性结合成员。
在优选的具体实施方式中，可以使用1252A5 HCDR1(SEQ ID NO：393)、HCDR2(SEQ ID NO：394)和HCDR3(SEQ ID NO：395)中一个或多个、或1252A5组HCDR，和/或可以使用1252A5 LCDR1(SEQ ID NO：398)、LCDR2(SEQ ID NO：399)和LCDR3(SEQ ID NO：400)中一个或多个、或1252A5组LCDR。
在其他类似的具体实施方式中，用1152H5、1165D4或1230H7替代1252A5。
相似地，可以使用本文公开的其他VH和VL结构域、CDR组和HCDR组和/或LCDR组。
免疫球蛋白可变结构域的实质部分将至少包含3个CDR区域，以及它们的间隔构架区。该部分优选也将包含至少约50％的第一和第四构架区之任一或两者，该50％是第一构架区C-末端的50％和第四构架区N-末端的50％。可变结构域实质部分N-末端或C-末端上的额外残基可以是通常不与天然存在的可变结构域区相关联的那些。例如，通过重组DNA技术进行构建本发明的特异性结合成员，导致通过接头编码的N-或C-末端残基的导入，所述接头被导入以辅助克隆或其他操作步骤。其他操作步骤包括导入接头从而将本发明的可变结构域连接到其他蛋白质序列，所述其他蛋白质序列包含如本文其他部分更详细描述的抗体恒定区、其他可变结构域(例如用于产生双抗体)或可检测/功能性标记。
尽管在本发明的优选方面，包含VH和VL结构域对的特异性结合成员是优选的，但是基于VH或VL结构域序列单个结合结构域形成本发明的另外方面。已知单个免疫球蛋白结构域，特别是VH结构域，能以特定方式结合靶抗原。例如可参考以上dAb的讨论。
在随便哪一个单个特异性结合结构域的情况下，这些结构域可用于筛选能形成能结合NGF的两结构域特异性结合成员的互补结构域。
这可通过利用WO92/01047所公开的所谓分级双重组合方法通过噬菌体展示筛选方法实现，其中含H或L链克隆的单个克隆用于感染编码另一条链(L或H)的克隆的完整文库，并根据噬菌体展示技术，如参考文献所述的那些，选择出产生的双链特异性结合成员。该技术在Marks等(同上)中有描述。
本发明的特异性结合成员可进一步包含抗体恒定区或其部分，优选是人抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可用其C-末端与抗体轻链恒定结构域相连，所述抗体轻链恒定结构域包含人Cκ或Cλ链，优选包含Cλ链。相似地，基于VH结构域的特异性结合成员可以其C-末端与衍生自任何抗体同种型的免疫球蛋白重链的全部或部分(如CH1结构域)相连，所述抗体同种型如IgG、IgA、IgE和IgM和任何同种型亚型，尤其是IgG1和IgG4。IgG4是优选的。IgG4是优选的，这是因为它不结合补体并且不产生效应器功能。具有这些性质并使可变区稳定的任何合成的或其他恒定区变体也优选用于本发明的具体实施方式中。
本发明的特异性结合成员可以用可检测或功能性标记来标记。可检测标记包括放射性标记，如131I或99Tc，其可利用抗体成像领域已知的常规化学与本发明的抗体相连。标记也包括酶标记，如辣根过氧化物酶。标记进一步包括化学部分，如生物素，其可通过结合特定同类可检测部分(如标记的抗生物素蛋白)来检测。
设计本发明的特异性结合成员用于诊断或治疗人或动物个体(优选是人)的方法。
因此，本发明的另外方面提供了治疗方法，其包括施用提供的特异性结合成员、包含该特异性结合成员的药物组合物，和该特异性结合成员在制备用于施用的药物中的应用，例如在制备药物或药物组合物的方法中，所述方法包括将特异性结合成员与药学上可接受的赋形剂配制在一起。
抗NGF抗体可用于为之带来治疗益处的临床指征包括疼痛、哮喘、慢性阻塞性肺病、肺纤维化、其它气道炎症疾病、糖尿病性神经病、关节炎、牛皮癣、心律失常、HIV和癌症。如已经解释过的，抗NGF疗法针对所有这些疾病。
抗NGF疗法可通过口服、注射(例如，皮下、静脉内、腹膜内或肌肉内)、吸入，囊内途径(输注入膀胱)、或局部(例如眼内、鼻内、直肠、伤口内、皮肤上)来进行。施用途径可通过治疗的物理化学特征、通过对疾病的专门考量或通过优化疗效或最小化副作用的需求来确定。
要面对的是，抗NGF疗法将不限于在诊所中应用。所以，也优选用无针设备进行的皮下注射。
可用组合疗法来带来显著的协同效应，尤其用抗NGF特异性结合成员与一个或多个其他药物的组合。根据本发明所述的特异性结合成员可与短或长效止痛、抗炎、抗过敏、抗哮喘、抗纤维化、抗病毒、化学治疗剂和免疫治疗剂组合或叠加使用。
和一个或多个短或长效止痛剂和/或抗炎剂(如阿片样物质和非类固醇抗炎药物(NSAID))一起进行的组合疗法，可用于治疗以疼痛和/或炎症(例如，类风湿性关节炎或外科手术后的疼痛)为特征的病况。本发明的抗体也可与抗哮喘、抗过敏、或抗纤维化疗法组合使用，如与吸入的β肾上腺素受体激动剂、类固醇、细胞因子拮抗剂、或其他新的治疗方法组合，用于治疗哮喘、过敏性哮喘、其他过敏病况、或任何有异常纤维化特征的病况。本发明的抗体也可与抗感染剂例如抗病毒剂组合使用，用于治疗HIV感染。
根据本发明所述，可向个体施用提供的组合物。施用优选以“治疗有效量”进行，这足以对患者显示出益处。该益处可以为至少可改善至少一种症状。实际施用量、和施用速率和时间进程将取决于要治疗的疾病的性质和严重性。治疗处方(如决定剂量等)在普通医生和其他医生的责任范围内，而且其取决于症状的严重性和/或要治疗的疾病进程。适当的抗体剂量是本领域公知的；可参见Ledermann等(1991)和Bagshawe(1991)。可用本文所示的或Physician′s Desk Reference(2003)中的适于施用药物类型的特定剂量。本发明特异性结合成员的治疗有效量或合适的剂量可通过比较它的体外活性和动物模型中的体内活性来确定。将小鼠和其他测试动物的有效剂量外推到人的方法是已知的。
精确剂量将取决于大量因素，包括抗体用于诊断还是用于治疗、要治疗的区域大小和位置、抗体的精确性质(如完整抗体、片段或双抗体)、以及任何与抗体相连的可检测标记或其他分子的性质。对于全身应用，典型的抗体剂量将处于100μg至1g的范围内，而对于局部应用，为1μg至1mg。典型地，抗体将是完整抗体，优选是IgG4同种型。这是用于成人患者的单次治疗的剂量，用于儿童和婴儿可按比例调整，对于其他抗体形式也可按分子量比例调整。根据医师的判断，治疗可以每天、一周两次、每周或每月的间隔进行重复。在优选的本发明的具体实施方式中，治疗是周期性的，施用之间的周期约为2周或更多，优选约为3周或更多，更优选约为4周或更多，或约为每月一次。在本发明的其他优选的具体实施方式中，可在外科手术之前和/或之后进行治疗，更优选直接在外科手术治疗的解剖位点上施用或使用。
本发明的特异性结合成员通常将以药物组合物的形式施用，其除了特异性结合成员之外，可包括至少一种成份。
因此，根据本发明所述的以及根据本发明所述的应用的药物组合物除了活性成分之外，可包括药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或所属领域技术人员公知的其他材料。该材料应当是无毒性的并应当不干扰活性成员的功效。载体或其他材料的精确性质取决于施用途径，其可以是口服的、或通过注射的，如静脉内注射。
口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉剂、液体或半固体的形式。片剂可包括固体载体(如白明胶)或佐剂。液体药物组合物一般包含液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖类溶液或二醇(如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)。
对于静脉内注射、或在患病位点上的注射，活性成员可以是可接受的非肠道水溶液的形式，其无热源并具有合适的pH、等渗性和稳定性。例如，利用等渗媒介物，如氯化钠注射液、Ringer注射液、Lactated Ringer注射液，所属领域技术人员能熟练地制备合适的溶液。如需要，可包括防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其他添加剂。
组合物可单独或与其他疗法联合施用，其可同时或顺序施用，这取决于要治疗的病况。
本发明的特异性结合成员可配制成液体、半固体或固体形式，其取决于分子的物理化学性质和递送的途径。制剂可包括赋形剂、或赋形剂的组合，例如：糖、氨基酸和表面活性剂。液体制剂可包括范围广的抗体浓度和pH。例如，固体制剂可通过冻干法、喷雾干燥、或通过超临界液体技术干燥来生产。抗NGF的制剂将取决于想用的递送途径：例如，用于肺部递送的制剂可由带有物理性质的颗粒组成，所述性质保证其吸入后透入肺的深处；局部制剂可包括黏度改进剂，其延长了药物处于作用位点的时间。在某些具体实施方式中，特异性结合成员与载体一起制备，所述载体将防止特异性结合成员迅速释放，如控释制剂，其包括植入物、透皮贴、和微胶囊递送系统。可使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯基醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。许多用于制备该制剂的方法对于所属领域技术人员来说是已知的。如可参见，Robinson，1978.
本发明提供了包括造成或使得本文所提供的特异性结合成员与NGF结合的方法。如所注意到的，该结合可发生在体内，如在施用特异性结合成员、或编码特异性结合成员的核酸之后，或它可发生在体外，例如在ELISA、蛋白质印迹法、免疫细胞化学法、免疫沉淀法、亲和色谱、或基于细胞的测试(如TF-1测试)中。
可确定特异性结合成员与NGF结合的量。定量可与在测试样品中可具有诊断重要性的抗原的量相关。
本发明的一个方面也提供了试剂盒，其包含根据本发明任何方面或具体实施方式所述的特异性结合成员或抗体分子。在本发明的试剂盒中，如以下进一步所述的，可标记特异性结合成员或抗体分子使得其在样品中的反应性可被测定。试剂盒的成员一般是无菌的，并装于密封的小瓶或其他容器中。试剂盒可用在抗体分子在其中有用的诊断分析或其他方法中。试剂盒可包括在方法(如根据本发明所述的方法)中使用成份的说明书。辅助或使得该方法进行的辅助材料可包括在本发明的试剂盒中。
抗体在样品中的反应性可通过任何合适的方式来确定。放射免疫测试(RIA)是一种可能的方式。放射性标记的抗原与未标记的抗原(测试样品)混合，并使之结合抗体。结合的抗原与未结合的抗原物理分离，并确定与抗体结合的放射性抗原的量。测试样品中存在越多抗原，则越少的放射性抗原将与抗体结合。利用与报告分子相连的抗原或类似物，也可用非放射性抗原进行竞争性结合测试。报告分子可以是具有广谱上分离的吸收或发射特性的荧光染料、磷光剂或激光染料。合适的荧光染料包括荧光素、若丹明、藻红蛋白和得克萨斯红。合适的显色染料包括二氨基联苯胺。
其他报告分子包括大分子胶质颗粒或微粒材料，如有色的、有磁性的或顺磁性的橡胶珠，以及能直接或间接引起检测信号可被直观观察到的、被电子侦测到的或以其他方式被记录的生物或化学活性试剂。例如，这些分子可以是酶，其催化能显示、或改变颜色或造成电性质改变的反应。它们可以是分子上可受激的，由此能量状态间的电子跃迁会造成特有的光谱吸收或发射。它们可包括与生物传感器联用的化学实体。可以使用生物素/抗生物素蛋白或生物素/链霉抗生物素和碱性磷酸酶检测系统。
单个抗体-报告分子缀合物产生的信号可用于在(正常的和测试的)样品中衍生出相关抗体结合的可定量的绝对或相对数据。
本发明也提供了以上特异性结合成员用于在竞争性测试中测量抗原水平的应用，也就是说是通过在竞争性测试中使用本发明提供的特异性结合成员测量样品中抗原水平的方法。这可以不需要从未结合的抗原中物理分离结合的抗原。一种可能性是将报告分子连接到特异性结合成员上，从而在结合时发生物理或光学变化。报告分子可直接或间接产生可检测并优选是可测量的信号。报告分子的连接可以是直接或间接地相连、共价相连，如通过肽键或非共价键相连。通过肽键的连接可以由重组表达编码抗体和报告分子的融合基因而得到。
本发明也提供了利用根据本发明所述的特异性结合成员例如在生物传感器系统中直接测量抗原水平。
确定结合的模式不是本发明的特征，而且所属领域技术人员根据他们的偏好和常识能选择出合适的模式。
如所注意到的，在各个方面和具体实施方式中，本发明延伸到特异性结合成员，其与本文定义的任何特异性结合成员(如1252A5 IgG4)竞争与NGF的结合。结合成员间的竞争可在体外容易地检测，例如可通过将特定报告分子加标签到一种结合成员上，使之在其他一种或多种未标记的结合成员存在的情况下可被检测到，从而能鉴定出结合相同表位或重叠表位的特异性结合成员。
例如，利用ELISA可以确定竞争，其中NGF被固定在板上，而且第一个带标签的结合成员和一个或多个其他未带标签的结合成员一起被加入到板上。通过带标签的结合成员发出的信号的衰减来观察与带标签的结合成员竞争的不带标签的结合成员的存在。
在检测竞争时，可以使用抗原的肽片段，尤其是包含或基本由感兴趣的表位组成的肽。可以使用具有表位序列和在任一端的一个或多个氨基酸的肽。根据本发明所述的特异性结合成员可以是那些它们与抗原的结合会被带有或包含给定序列的肽所抑制的那些成员。在对此进行测试时，可以使用具有任一序列再加上一个或多个氨基酸的肽。
结合特定肽的特异性结合成员可以通过用一个或多个肽淘选而例如分离自噬菌体展示文库。
本发明进一步提供了编码本发明特异性结合成员的分离的核酸。核酸可包括DNA和/或RNA。在优选的方面，如上面所定义的，本发明提供了核酸，其编码本发明的CDR或CDR组或VH结构域或VL结构域或抗体抗原结合位点或抗体分子，如scFv或IgG4。
本发明也提供了包含至少一个以上多核苷酸的构建体，其形式为质粒、载体、转录或表达盒。
本发明也提供了包含一个或多个以上构建体的重组宿主细胞。编码任何CDR或CDR组或VH结构域或VL结构域或抗体抗原结合位点或抗体分子如提供的scFv或IgG4的核酸，其本身就构成了本发明的一个方面，正如生产所编码的产物的方法一样，该方法包括表达其编码核酸。通过在适宜的条件下培养含核酸的重组宿主细胞，可以方便地实现表达。表达VH或VL结构域进行生产后，可利用任何合适的技术来分离和/或纯化特异性结合成员，然后适当地使用。
根据本发明所述的特异性结合成员、VH和/或VL结构域、和编码核酸分子和载体可以以例如从它们的天然环境分离的和/或纯化的形式提供，例如以实质纯的或均一的形式，或者对于核酸，其不含或实质不含编码具有所需功能的多肽的序列之外的核酸或来源的基因。根据本发明所述的核酸可包含DNA或RNA，并可以是完全或部分合成的。本文给出的参考核苷酸序列涵盖了带有特定序列的DNA分子，并涵盖了带有其中U替换T的特定序列的RNA分子，除非上下文需要其他方式。
在各种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是公知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、酵母和杆状病毒系统和转基因植物和动物。在原核细胞中表达抗体和抗体片段是本领域非常成熟的。对于其综述，可参见诸如Plückthun(1991)。常用的细菌宿主优选是E.coli。
真核细胞在培养基中的表达也是所属领域技术人员生产特异性结合成员时可利用的选择，例如Chadd & Chamow(2001)、Andersen & Krummen(2002)、Larrick & Thomas(2001)。本领域可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚肾细胞、人胚视网膜细胞和许多其他的。
可选择或构建合适的载体，其含合适的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷化序列、增强子序列、标记基因和其他合适的序列。载体可以是合适的质粒，如噬菌粒，或是病毒，如噬菌体。进一步详细的内容可参见诸如Sambrook & Russell(2001)。许多操纵核酸的已知技术和规程，例如制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA导入到细胞中以及基因表达、和分析蛋白质，在Ausubel等(1988)和Ausubel等(1999)中有详细描述。
因而，本发明的另一方面提供了包含本文公开的核酸的宿主细胞。该宿主细胞可以是体外的，并可以是在培养物中的。该宿主细胞可以是体内的。宿主细胞出现在体内可以使本发明的特异性结合成员在细胞内表达成“胞内抗体”或细胞内抗体。胞内抗体可用于基因疗法。
又一方面提供了方法，其包括将该核酸导入到宿主细胞中。导入可利用任何可用的技术。对于真核细胞来说，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和利用反转录病毒或其他病毒(如痘苗病毒)的转导，或者对于昆虫细胞来说，可用杆状病毒。可用基于病毒或质粒的系统向宿主细胞尤其是真核细胞中导入核酸。质粒系统可以是保持游离状态的，或可以整合到宿主细胞中或整合到人工染色体中。通过在单个或多个基因座上随机或靶向整合一个或多个拷贝，来进行整合。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和利用噬菌体转染。
导入后可以促使或使得核酸表达，如通过在能表达基因的条件下培养宿主细胞。
在一个具体实施方式中，本发明的核酸整合在宿主细胞的基因组(如染色体)中。根据标准技术，通过引入能促进与基因组重组的序列，可促进整合。
本发明也提供了方法，其包括在表达系统中使用上述构建体，由此表达以上特异性结合成员或多肽。
本发明的方面和具体实施方式现在将通过举例的方式、参考以下实验和所附的附图来加以说明，其中：
图1显示了在人TrkA受体钙动员测试中，抗体中和人(图1A)和大鼠(图1B)NGF的浓度抑制曲线。比较人IgG4 NGF抗体与商品化的NGF抗体G1131、Mab5260Z、和MAB256对由1nM NGF引发的细胞内钙动员的抑制。数据点显示了单个实验的结果，它是每个抗体浓度3次测定的平均值±sd。
图2显示了在重组表达人TrkA受体的HEK-293细胞中的细胞内钙动员的抑制。评估了效力优化的人IgG4抗体对由1nM人(图2A)、大鼠(图2B)、和小鼠(图2C)NGF引发的应答的抑制。数据点显示了单个实验的结果，它是每个抗体浓度3次测定的平均值±sd。
图3显示了在PC12细胞存活测试中人IgG4 NGF抗体的抑制效应。通过1nM人NGF(图3A)或大鼠NGF(图3B)的存在来维持细胞存活。数据点显示了来自单个实验的3次测定的平均值±sd。
图4显示了通过生殖系和非生殖系人IgG4 NGF抗体、和参考NGF抗体(MAB256)抑制的NGF介导的TF-1细胞增殖。用200pM人NGF(图4A)、大鼠NGF(图4B)、或小鼠NGF(图4C)刺激细胞。数据代表来自单个实验的3次测定的平均值±sem。
图5显示了人IgG4 NGF抗体1252A5同神经营养蛋白BDNF、NT-3和NT-4缺少交叉反应性。每个孔吸收100ng神经营养蛋白。每个数据点代表来自单个实验的3次测定的平均值±sd。
图6显示了人125I-NGF与人IgG4 NGF抗体1252A5(图6A)和G1152H5(图6B)结合的饱和结合曲线。计算出的Kd值分别是0.35nM和0.37nM，并且是单个实验的结果。
图7显示了大鼠125I-NGF与人IgG4 NGF抗体1252A5(图7A)和G1152H5(图7B)结合的饱和结合曲线。计算出的Kd值分别是0.44nM和0.50nM，并且是单个实验的结果。
图8显示了通过人IgG4或参考抗体浓度依赖性地抑制人(图8A)或大鼠(图8B)125I-NGF与TrkA受体融合蛋白结合。每个测试孔中的放射性标记的NGF浓度约为150pM。数据显示了单个实验的结果。也参见表6和7。
图9显示了通过人IgG4或参考抗体浓度依赖性地抑制人(图9A)或大鼠(图9B)125I-NGF与p75受体融合蛋白结合。每个测试孔中的放射性标记的NGF浓度约为150pM。数据显示了单个实验的结果。也参见表8和9。
图10显示了全身施用人抗NGF的IgG4(1252A5)后48h，小鼠中对角叉菜多糖诱导的热痛觉过敏的剂量相关的抑制。
实施例1
分离抗NGF的scFv
ScFv抗体库
将3个大的克隆入噬菌粒载体的单链Fv(scFv)人抗体文库用于选择。该文库衍生自(A)脾淋巴细胞(Hutchings，2001)、(B)外周血淋巴细胞、扁桃体B细胞和骨髓B细胞(Vaughan等，1996)的组合、和(C)A的轻链和VH CDR3区域与DP47生殖系重链构架的组合。
选择scFv
所用的噬菌体选择过程基本如Hutchings(同上)所述。以一系列对人和大鼠NGF的选择循环中从噬菌体展示文库分离识别NGF的ScFv。简而言之，将未修饰的抗原包被于Nunc Maxisorb管上。洗涤去除未结合的噬菌体前1h，以500μl的总体积在抗原上孵育噬菌体。然后根据Vaughan等(同上)所述回收(rescue)结合的噬菌体，并重复选择过程。为了帮助分离人/啮齿动物交叉反应性scFv，对NGF的相应物种同工型进行交替轮次的选择。利用这一交替同工型选择策略，对任一文库进行最多4轮选择。将人或大鼠NGF用作第一轮选择的起始抗原。
根据分离的NGF特异性克隆的百分比和这些克隆的序列多样性，区分第2-4轮输出结果的优先次序用于生化筛选。通过噬菌体ELISA确定每种情况下的NGF特异性克隆的百分比。序列多样性通过DNA测序来确定。
噬菌体ELISA规程
导入了噬菌体的细菌培养物在含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的1ml 2xTY培养基中30℃震荡16h制备。通过离心培养物(以3000rpm进行10分钟)并用3％w/v溶于PBS的奶粉封闭1h来制备噬菌体上清液。然后将封闭的噬菌体加入到事先用(1μg/ml)抗原或无关的抗原包被的板上。在每个步骤间洗板，用PBS-吐温20(0.1％v/v)冲洗三次，然后用PBS冲洗三次。通过用在含3％w/v奶粉的PBS中1∶5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)/抗M13缀合物(Amersham英国)孵育1h，并用四甲联苯胺(TMB)底物(Sigma)显色，来检测结合的噬菌体。适当时间后加入0.5M硫酸终止色度反应。在450nm处测量吸光度读数。特异性结合于抗原的克隆被鉴定为针对抗原的信号大于或等于针对无关抗原的信号的5倍。
DNA测序
利用引物FDTETSEQ24(TTTGTCGTCTTTCCAGACGTTAGT-SEQ IDNO：534)和PUC反向(AGCGGATAACAATTTCACACAGG-SEQ ID NO：535)通过scFv的PCR获得用于测序的双链DNA模板。根据厂商推荐意见，利用Macherey-Nagel Nucleofast 96孔PCR板(Millipore)去除首次PCR中的过量引物和dNTP。用引物Lseq(GATTACGCCAAGCTTTGGAGC SEQ IDNO：536)对VH基因进行测序。用引物MYC Seq 10(CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG SEQ ID NO：537)对VL基因进行测序。每个反应混合物包含20-40ng DNA、3-20pmol引物和4μl Big Dye TerminatorV3.0(Applied Biosystems，英国)，体积为20μl。测序反应由25个循环组成，每个循环为96℃ 10秒；50℃，5秒；60℃，4分钟。样品在AppliedBiosystems 3700 DNA分析仪上电泳并分析。利用内部开发的连续性软件(Cambridge Antibody Technology，英国)和SeqEd DNA序列操纵软件(Applied Biosystems，英国)人工分析含糊的区域。
生化筛选中和NGF的scFv
对噬菌体选择过程的输出结果进一步筛选，从而鉴定出抑制NGF与TrkA受体细胞外结构域融合蛋白结合的克隆。
用选出的噬菌体转染的大肠杆菌TG-1细菌的周质溶胞产物制备ScFv粗样品，用以在结合测试中进行评估。Nunc Maxisorb 96孔板用人TrkA受体胞外结构域融合蛋白(R&D Systems；包被浓度：对于人NGF测试，0.25nM；对于大鼠NGF测试，1nM)包被过夜。用PBS/吐温20洗测试板，用含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS封闭2h，再次洗涤。ScFv样品用含1nM人或大鼠重组β-NGF(R&D Systems)的1％BSA预先孵育30分钟。将体积为100μl的样品转移到测试板上并在室温孵育60分钟。洗板，仍结合在板上的NGF用稀释于1％BSA中的0.3μg/ml的抗人NGF生物素(Peprotech)或抗大鼠NGF生物素(R&D Systems)标记，然后在室温孵育60分钟。利用DELFIA(Wallac)时间分辨荧光检测系统检测生物素标记的抗NGF。简而言之，洗板，将100μl链菌抗生物素Eu3+加入到每个孔中，用DELFIA测试缓冲液稀释成1/1000。板在室温继续孵育60分钟，并用DELFIA洗涤缓冲液洗涤，然后向每个孔加入100μl DELFIA增强溶液。用Wallac Victor荧光测量板读数仪对平板进行读数(激发波长314nm；发射波长615nm)。
作为周质溶胞产物scFv制品抑制人和大鼠NGF结合超过70％的克隆以纯化的scFv的形式在结合测试中被再评估。如WO01/66754的实施例3所述制备纯化的scFv制品。利用BCA法(Pierce)确定纯化的scFv制品的蛋白质浓度。再测试突出了以下scFv抗体，它们是人和大鼠NGF与人TrkA受体胞外结构域融合蛋白结合的有效中和剂：
1064F8(VH SEQ ID NO：2；VL SEQ ID NO：7)，
1022E3(VH SEQ ID NO：12；VL SEQ ID NO：17)，
1083H4(VH SEQ ID NO：22；VL SEQ ID NO：27)，
1021E5(VH SEQ ID NO：32；VL SEQ ID NO：37)，
1033G9(VH SEQ ID NO：42；VL SEQ ID NO：47)，
1016A8(VH SEQ ID NO：52；VL SEQ ID NO：57)，
1028F8(VH SEQ ID NO：62；VL SEQ ID NO：67)，
1033B2(VH SEQ ID NO：72；VL SEQ ID NO：77)，
1024C4(VH SEQ ID NO：82；VL SEQ ID NO：87)，和
1057F11(VH SEQ ID NO：92；VL SEQ ID NO：97)。
实施例2
人IgG4抗体的表达和NGF中和效力的体外功能评估
将中和NGF的scFv 1064F8、1022E3、1083H4、1021E5、1033G9、1016A8、1028F8、1033B2、1024C4、和1057F11重构成人IgG4抗体，并在完整细胞测试系统中测试NGF中和效力。
IgG转化
基本如Persic等(1997)所述，为最有效的scFv克隆构建载体，以允许重新表达成完整人IgG4抗体。用表达重链和轻链结构域的构建体共转染维持在条件培养基中的EBNA-293细胞。用蛋白质A亲和色谱(AmershamPharmacia)从培养基中纯化出完整抗体。无菌过滤纯化的抗体制品，并在进行体外效力评估之前储存于4℃磷酸缓冲盐液(PBS)中。根据Mach等(1992)的分光光度测定法来确定蛋白质浓度。
细胞内钙动员的FLIPR测试
在基于细胞的荧光钙动员测试中确定抗人IgG中和NGF的效力和功效。人抗体的效力与小鼠抗人NGF(MAB256；R&D Systems)、大鼠抗小鼠NGF(G1131；Promega)、和小鼠抗小鼠NGF(MAB5260Z；Chemicon)作比较。抗NGF IgG与重组人β-NGF(Calbiochem，480275)或重组大鼠β-NGF(R&D Systems，556-NG-100)共同孵育。然后将复合物加入到负载了钙敏感性染料Fluo-4的、表达重组人TrkA受体的HEK293细胞中，然后监测Ca2+依赖性荧光。
用重组人TrkA(得自M.Chao，Skirball Institute，NY)转染的HEK细胞(peak-S，Edge Biosystems)在Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(MEM，Cellgro，MT10-017-CV)中生长，所述培养基添加了10％胎牛血清(Hyclone，SH30071.03)、1.5μg/ml嘌呤霉素(Edge Biosystems，80018)和1％青霉素-链霉素。通过用Dulbecco氏磷酸缓冲盐液(DPBS)洗下细胞来收集铺满的细胞，然后用含6μM Fluo-4(Molecular Probes)的负载缓冲液在阴离子转运抑制剂(含2.5mM丙磺舒的1％FBS/MEM)存在的条件下于37℃负载1.5h。用测试缓冲液(含2.5mM丙磺舒的0.1％BSA Hank氏/HEPES)洗涤细胞一次后，将细胞铺板于聚-D-赖氨酸包被的、透明底的96孔板(Costar#3904)上，每孔120μl，约60,000个细胞/孔。于室温在暗处孵育细胞30分钟，然后平板以1,200rpm(290xg)离心5分钟。测试前，于35℃预热板20分钟。以7个浓度并以3个重复孔来测试待测IgG。35微升10X抗NGF IgG和等量的10nM人、大鼠或小鼠的2.5S NGF于室温预先孵育约1h。含预先复合的IgG的板和含100μl/孔测试缓冲液的板在35℃预热20分钟，然后在荧光成像板读数仪(FLIPR；Molecular Devices)上进行测试。将80μl/孔测试缓冲液加入到细胞板上并于35℃孵育5分钟，然后将50μl/孔稀释的抗人IgG/NGF复合物加入到FLIPR中的细胞板上，连续监测Ca2+依赖性荧光。NGF诱导的荧光以恰好于NGF加入前的基准荧光强度和NGF加入后2分钟得到的最高荧光强度之间的差计算。没有抗体时NGF诱导的荧光值的3次重复的平均值被定义为100％钙动员。存在抗体时，NGF诱导的荧光值的3次重复的平均值±SD被计算为对照钙动员的百分比。将对照钙动员值的百分比绘成IgG浓度的对数函数图。IC50值通过利用Prism(GraphPad)拟合S形剂量-应答(可变斜率)函数来计算。
所有受试抗体展示出了对人NGF引发的细胞内钙动员的浓度相关性抑制。中和人NGF的效力的等级次序为1064F8＞1022E3＞1083H4≥1033G9≥1016A8≥1028F8≥1021E5≥1033B2＞＞1024C4＞＞1057F11(表1)。进一步评估五种抗体对大鼠NGF的功能性中和，针对两种物种同工型这些抗体大致等效(图1A和1B；表1)。
实施例3
分离优化的人IgG4 NGF抗体
核糖体展示scFv效力优化
基本如Hanes等(2000)所述，产生大核糖体展示文库并筛选特异性识别重组人NGF(R&D Systems)的scFv。最初，克隆1064F8、1022E3、1083H4、1021E5、1033G9、1016A8、1028F8、1033B2、和1024C4被转化成核糖体展示形式，其中随后用模板来创建文库。克隆1057F11不被选择用于效力优化，所以没有制备该抗体的核糖体展示模板。在DNA水平上，将T7启动子加到5’-末端上以有效转录成mRNA。在mRNA水平上，构建体包含原核核糖体结合位点(Shine-Dalgarno序列)。在单链的3’末端，去掉终止密码子，并添加gIII的一部分用作间隔区(Hanes等，同上)。
通过诱变scFv HCDR3来创建源自1064F8、1022E3、1083H4、1021E5、1033G9、1016A8、1028F8、1033B2、和1024C4的核糖体展示文库。用非校读Taq聚合酶进行PCR反应。进行基于亲和力的选择，由此在与文库一起孵育之后，生物素化的人NGF与链菌抗生物素包被的顺磁性珠(Dynal M280)偶连。通过磁性分离回收结合的三级复合物(tertiary complex)(mRNA-核糖体-scFv)，而未结合的复合物被洗去。然后，如Hanes等(见前)所述，通过RT-PCR回收(rescue)编码结合的scFv的mRNA，并以在选择过程中存在的递减浓度的生物素化的人NGF(从100nM至10pM，经5轮)来重复选择过程。
也使用了易错PCR来进一步增加文库的大小。在选择方案中，使用了每1,000bp 7.2个突变的错误率(DiversifyTM，Clontech)。在分别利用1nM和0.1nM的生物素化的人NGF浓度进行的第3和第4轮选择开始前，进行易错PCR反应。
将来自第3、4和5轮选择的输出产物的有代表性的scFv部分连接入pCantab6载体(Vaughan等，1996)，并克隆入E.coli的TG1株中。在体外筛选NGF中和活性前，将这些scFv的样品如实施例1所述进行DNA测序，以确定输出产物的序列多样性。如实施例1所述，以未纯化的scFv形式在NGF/TrkA受体胞外结构域融合蛋白结合测试中筛选克隆。测试中周质溶胞产物的scFv制品浓度减少到最终测试体积的0.5％-5％，并分离抑制人和大鼠NGF结合＞95％的克隆用于进一步研究。用该方式，分离一组效力优化的、有交叉反应性的NGF中和剂。令人惊讶地，最有效的NGF中和剂源自亲本克隆1021E5和1083H4，其并非是亲本抗体中最有效的。如实施例2所述，在重构成人IgG4之前，对优化的克隆进行测序，并以纯化的scFv的形式再测试，以确定效力。
源自亲本克隆1021E5(VH SEQ ID NO：32；VL SEQ ID NO：37)并转化成人IgG4形式的抗体是1126F1(VH SEQ ID NO：102；VL SEQ ID NO：107)，1126G5(VH SEQ ID NO：112；VL SEQ ID NO：117)，1126H5(VHSEQ ID NO：122；VL SEQ ID NO：127)，1127D9(VH SEQ ID NO：132；VL SEQ ID NO：137)，1127F9(VH SEQ ID NO：142；VL SEQ ID NO：147)，1131D7(VH SEQ ID NO：152；VL SEQ ID NO：157)，1131H2(VH SEQ IDNO：162；VL SEQ ID NO：167)，1132A9(VH SEQ ID NO：172；VL SEQID NO：177)，1132H9(VH SEQ ID NO：182；VL SEQ ID NO：187)，1133C11(VH SEQ ID NO：192；VL SEQ ID NO：197)，1134D9(VH SEQ ID NO：202；VL SEQ ID NO：207)，1145D1(VH SEQ ID NO：212；VL SEQ ID NO：217)，1146D7(VH SEQ ID NO：222；VL SEQ ID NO：227)，1147D2(VH SEQID NO：232；VL SEQ ID NO：237)，1147G9(VH SEQ ID NO：242；VLSEQ ID NO：247)，1150F1(VH SEQ ID NO：252；VL SEQ ID NO：257)，1152H5(VH SEQ ID NO：262；VL SEQ ID NO：267)，1155H1(VH SEQ IDNO：272；VL SEQ ID NO：277)，1158A1(VH SEQ ID NO：282；VL SEQID NO：287)，1160E3(VH SEQ ID NO：292；VL SEQ ID NO：297)，1165D4(VH SEQ ID NO：302；VL SEQ ID NO：307)，1175H8(VH SEQ ID NO：312；VL SEQ ID NO：317)，1211G10(VH SEQ ID NO：322；VL SEQ ID NO：327)，1214A1(VH SEQ ID NO：332；VL SEQ ID NO：337)，1214D10(VHSEQ ID NO：342；VL SEQ ID NO：347)，1218H5(VH SEQ ID NO：352；VLSEQ ID NO：357)，和1230H7(VH SEQ ID NO：362；VL SEQ ID NO：367)。
源自亲本克隆1083H4(VH SEQ ID NO：22；VL SEQ ID NO：27)并转化成人IgG4形式的抗体是1227H8(VH SEQ ID NO：372；VL SEQ ID NO：377)和1230D8(VH SEQ ID NO：382；VL SEQ ID NO：387)。将1133C11的构架区生殖系化以衍生出1252A5和其他1021E5变体
针对源自1021E5的优化克隆检查其VH和VL CDR序列信息，发现这些抗体中一大部分在VH CDR3(即根据Kabat编号系统的氨基酸100A至100G)中包含氨基酸序列LNPSLTA(SEQ ID NO：531)。这些克隆列于表2a，强调它们在VH和VL CDR区的氨基酸序列中如何有所不同，并估计了它们以纯化的scFv形式测试时的NGF中和效力。在这些克隆中，如所述，1133C11在CDR区中与1021E5仅在7个保守氨基酸100A至100G上有差异。所以，挑选1133C11进行生殖系化(germlining)，首先为了确认修饰的构架保留了效力，其次如果需要的话为了允许导入随后的CDR突变，以从相同谱系产生其他感兴趣的生殖系抗体，
1133C11的衍生的氨基酸VH和VL序列与VBASE数据库(Tomlinson[1997]，MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，英国)中的已知人生殖系序列比对，并鉴定出最接近的生殖系。针对1133C11的VH的最接近的生殖系被鉴定为DP10-VH1家族的一员。1133C11 VH在构架区内与DP10生殖系有5处氨基酸改变。针对1133C11的VL的最接近的生殖系被鉴定为DPL5-Vλ1家族的一员。1133C11 VL在构架区内与生殖系仅有4处改变。通过定点诱变scFv，将1133C11的构架区回复到生殖系，从而衍生出scFv 1252A5(VH SEQ ID NO：392；VL SEQ ID NO：397)。如实施例2中所述将这转化成人IgG4。通过将CDR突变导入到生殖系化的1252A5 IgG4主链上，实现1021E5衍生的克隆的其他变体的生殖系化。该方法导致产生了生殖系化的抗体G1152H5(VH SEQ ID NO：402；VL SEQID NO：407)、G1165D4(VH SEQ ID NO：412；VL SEQ ID NO：417)和G1230H7(VH SEQ ID NO：422；VL SEQ ID NO：427)。
实施例4
在细胞内钙动员的FLIPR测试中，评估优化的人IgG4抗体
如实施例2所述，在重组表达人TrkA受体的细胞中在NGF引发的细胞内钙动员测试中评估优化的人IgG4 NGF抗体。检测抗体针对人、大鼠、和小鼠NGF的中和活性(图2A，2B，和2C；表3)。
1nM NGF引发的细胞内钙动员被所有受试的优化人抗体所抑制。优化的抗体展示出低于纳摩尔的IC50值，在大多数情况下代表比亲本IgG的NGF中和效力增强超过100倍(表3)。抗人、大鼠、和小鼠NGF同工型的生殖系化人IgG4抗体的中和效力(IC50)分别为：
1252A5-0.33nM，   0.29nM，和0.26nM；
G1152H5-0.22nM，  0.27nM，和0.18nM；
G1165D4-0.32nM，  0.33nM，和0.27nM；
G1230H7-0.31nM，  0.34nM，和0.25nM。
这些结果突出展现了核糖体展示技术在抗体效力优化上的功效和价值。既往抗体优化的更常规方法为产生变体scFv抗体的噬菌体展示文库。该过程是劳动密集型的，而且比核糖体展示法更慢，其经常意味着仅有单个亲本scFv被用作构建文库的起始点。相对容易地产生核糖体展示文库使得多个scFv亲本可同时被优化，而且如实施例3所证明的，这可导致分离出源自亲本克隆的高效抗体，而这些高效抗体可能会被其他优化方式所忽略。
实施例5
在PC12细胞存活测试中，评估优化的人IgG4抗体
在PC12测试中，NGF维持了表达天然TrkA和p75受体的无血清大鼠PC12细胞存活2天。中和NGF抗体减少了用AlamarBlue测定的细胞存活。
大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞在RPMI 1640(Cellgro，18040181)中生长，所述RPMI 1640添加了5％胎牛血清(JRH，12103-78P)、10％热失活的供体马血清(JRH，12446-77P)、和1％青霉素-链霉素。通过研磨收获细胞，然后用含0.01％BSA(Sigma，A7030)的无血清RPMI 1640洗涤2次。细胞铺于用大鼠尾胶原(Biological Technology Institute，BT-274)包被的96孔板上，每孔120μl含0.01％BSA的无血清培养基，50,000个细胞/孔。利用无血清培养基制备连续稀释的5X抗人NGF IgG，并以40μl/孔加入到细胞板上。将40μl/孔的0.5nM人β-NGF(Calbiochem，480275)或大鼠重组NGF(R&DSystems，556-NG-100)加入到板上，并用无血清培养基将总体积提高到200μl/孔。在三个重复的孔中用80μl/孔的无血清培养基来定义最大细胞死亡。在三个重复的孔中用40μl/孔的无血清培养基和40μl/孔0.5nM NGF来定义100％存活。板于37℃在5％CO2的条件下孵育48h。为了测量细胞生存能力，加入22μl/孔AlamarBlue，并立即用荧光板读数仪(BMG)以530nm激发波长和590nm发射波长对板进行读数，以确定每个孔中的背景荧光。于37℃孵育6～7h后，重新对板进行读数以确定总的荧光。Alamar blue荧光算作为背景和总的荧光强度之间的差。存在抗体时，用3次重复的100％存活荧光值的平均值的百分比计算3次重复荧光值的平均值±SD。对照存活值的百分比绘制成IgG浓度的对数函数图。IC50值通过利用Prism(GraphPad)拟合S形的剂量-应答(可变斜率)函数来计算。
PC12测试的结果进一步证实了优化的人IgG4 NGF抗体相较于它们的亲本IgG效力增加。抗体以浓度相关方式抑制人和大鼠NGF维持的PC12细胞存活(图3A和3B；表3)。生殖系化似乎减少了受试抗体的NGF中和效力，尤其是针对大鼠NGF同工型的效力。例如，生殖系抗体G1152H5抑制1nM人或大鼠NGF介导的细胞存活的平均IC50分别为1.1nM和7.3nM。相反，1152H5(即非生殖系抗体)中和1nM人或大鼠NGF的平均IC50分别为0.40nM和0.38nM。
实施例6
在TF-1细胞增殖测试中的NGF中和活性
TF-1细胞系是人前骨髓样(premyeloid)细胞系，其能被外源生长因子和细胞因子刺激而增殖。TF-1细胞表达人TrkA受体，而且响应通过NGF的活化而增殖。用TF-1细胞增殖测试进一步表征中和性人IgG4 NGF抗体的体外功能效力。
TF-1细胞得自R&D Systems并根据所提供的规程来保持。测试培养基由含有GLUTAMAX I(Invitrogen)的RPMI-1640组成，其含5％胎牛血清(Hyclone)和1％丙酮酸钠(Sigma)。每次测试前，TF-1细胞通过于300xg离心5分钟来沉淀，吸去培养基并将细胞重悬于测试培养基中。该过程重复3次，细胞以105/ml的终浓度重悬于测试培养基中，并向96孔平底组织培养测试板的每个孔加入100μl，使得最终细胞密度为1×104/孔。抗体的测试溶液(重复三次)用测试培养基稀释到1μg/ml的最终测试浓度，并通过测试板滴定到1∶5。不针对NGF的无关抗体(CAT-001)用作阴性对照。另外，参考单克隆抗体MAB256(R&D Systems)用作阳性对照。然后将50微升受试抗体加入到每个孔中，然后将50μl天然纯化的鼠(7S型；Invitrogen)、大鼠(Sigma)或人(Sigma)NGF稀释到200pM的最终测试浓度。测试板在潮湿的箱中于37℃在5％CO2的条件下孵育68h。然后将20微升含氚的胸腺嘧啶核苷(5.0μCi/ml，NEN)加入到每个测试孔中，并将测试板放回孵育箱中进一步孵育5h。利用细胞收集器，将细胞收集到96孔玻璃纤维过滤板(Perkin Elmer)上。然后将MicroScint 20TM(50μl)加入到过滤板的每个孔中，并利用Packard TopCount微板液体闪烁计数器定量[3H]-胸腺嘧啶核苷的渗入。存在抗体时，胸腺嘧啶核苷的渗入(量化为每分钟的计数)以每分钟平均背景(即未暴露于NGF的细胞)和平均总的(即用NGF刺激的细胞)计数之间的差来计算，并表示为最大增殖的百分比。最大增殖百分比绘制成IgG浓度的对数函数图。IC50值通过利用GraphPad Prism拟合S形的剂量(可变斜率)函数来计算。
人IgG4 NGF抗体是人、大鼠和小鼠NGF同工型介导的TF-1细胞增殖的有效抑制剂(图4A、4B和4C)。这些结果证实了源自1021E5谱系的抗体可在体外干扰天然人NGF受体活化所介导的NGF信号传导。根据在PC12细胞存活测试(实施例5)中观察到的人NGF抗体活性，在TF-1增殖测试中非生殖系抗体比它们的生殖系对应物更有效(表3)。根据平均IC50数据，受试抗体抑制由200pM人NGF介导的增殖的效力的等级次序为1133C11＞1152H5＞1252A5＝G1152H5＞＞MAB256。
实施例7
抗NGF IgG同其他神经营养蛋白的交叉反应性
进行ELISA以确定抗NGF IgG对其他神经营养蛋白的交叉反应性。ELISA包括：于室温用100ng/孔人NGF(R&D Systems，256-GF)、脑衍生的神经营养因子(BDNF；R&D Systems，248-BD)、神经营养蛋白-3(NT-3；R&D Systems，257-N3)、或神经营养蛋白-4(NT4；R&D Systems，257-N4)包被板5-6h，然后于4℃用0.25％HSA封闭板过夜。以浓度递增的抗NGFIgG(范围是0.03-10nM)，于室温孵育2h，使之结合每种神经营养蛋白。用生物素化的抗人多克隆抗体(1∶300)(Rockland 609-1602)、链菌抗生物素连接的碱性磷酸酶(1∶1000)、和荧光底物A来检测抗NGF IgG。证明神经营养蛋白与板结合的阳性对照使用了商品化的生物素化的抗人多克隆抗体(R&D Systems抗NGF BAF 256、抗BDNF BAM 648、抗NT-3 BAF 267、抗NT-4 BAF 268)，该抗体可利用链菌抗生物素连接的碱性磷酸酶并接着添加底物A直接检测。利用BSA而不是神经营养蛋白包被的孔来确定非特异性结合。加入底物A后在0-60分钟的时间内进行产物显色。用抗NGF IgG1064F8来优化测试。对于1064F8，有15分钟的线性产物显色时间，然后显色随着时间而衰减，这可能归因于底物被消耗掉了。交叉反应性以所有IgG浓度下特异性结合神经营养蛋白相对于特异性结合NGF的百分比来计算。对于高亲和力IgG，例如1064F8，利用15分钟时的产物显色数据来计算交叉反应性百分比。对于低亲和力IgG，例如1016A8，利用60分钟时的产物显色数据来计算交叉反应性百分比。
确定了7种人IgG4 NGF抗体相对于NGF对BDNF、NT-3和NT-4的交叉反应。在受试浓度上，所有7种抗体都显示交叉反应性可以忽略(表4)。例如，对于1252A5，观察到与NT-3、NT-4和BDNF的交叉反应性最高水平分别是1.1％、0.9％和1.4％(图5)。
实施例8
确定人NGF抗体的NGF结合亲和力
用放射性配体结合测试形式来确定人IgG4 NGF抗体的NGF结合亲和力，其在室温下进行。简而言之，闪烁板(Perkin Elmer SMP200)用100μl/孔的含2.2μg/ml山羊抗人IgG(Sigma-Aldrich，英国)的磷酸缓冲盐液(PBS)包被1h。用PBS洗孔，然后用200μl/孔的含3％w/v牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich，英国)的PBS封闭1h。用PBS洗孔，并向每个孔加入10ng人NGF抗体，所述抗体溶于0.1ml体积的含0.5％w/v BSA的PBS中。孵育1h后用PBS洗板。
放射性碘标记的人和大鼠NGF得自Amersham UK(人125I-NGF，Amersham cat.no.IM286；大鼠125I-NGF，定制标记的重组大鼠β-NGF，其购自R&D Systems，cat.no.556-GF-100)。每种125I-NGF同工型用测试缓冲液(含0.5％w/vBSA和0.05％v/v吐温20的PBS)连续稀释，并将一式两份的100μl样品加入到测试板上以测量浓度范围2pM-15nM内的“总结合”。通过在存在过量非放射性标记的NGF的情况下测量结合来确定每种125I-NGF浓度下的非特异性结合(NSB)。NSB孔含125I-NGF(2pM-15nM)，以及含适当时终浓度为500nM的未标记的人β-NGF(R&D Systems Cat.No.256-GF-100)或大鼠β-NGF(R&D Systems Cat.No.556-GF-100)。板孵育过夜，在γ计数仪(TopCount NXT，Perkin Elmer)上对孔计数1分钟。根据公式“特异性结合＝总的结合-非特异性结合”计算特异性结合。利用Prism软件(GraphPad Software Inc.，美国)，根据一位点(one-site)饱和结合模型来绘制结合曲线并确定结合参数。
人和大鼠125I-NGF展示了与人IgG4 NGF抗体1252A5和G1152H5的可饱和的、高亲和力结合(图6和7)。计算出的与人125I-NGF结合相互作用的Kd值对于1252A5是0.35nM，对于G1152H5是0.37nM。大鼠125I-NGF结合的Kd值对于1252A5是0.44nM，对于G1152H5是0.50nM。
实施例9
确定抑制NGF与人TrkA和p75受体结合的Ki值
进行实验以确定抗体1252A5和G1152H5是否展示对NGF与TrkA和p75受体结合的抑制性差异。为了计算结合抑制常数(Ki)值，设计竞争结合实验。计算IC50用于抗体介导的对放射性标记的人或大鼠NGF与人TrkA-或p75受体融合蛋白结合的抑制。然后利用Cheng-Prusoff方程得出Ki值。
人TrkA和p75受体融合蛋白(R&D Systems)用Dulbecco氏PBS(Gibco)分别稀释到10nM和0.6nM的终浓度。Maxisorp Nunc白色96孔微滴定板(Nalge Nunc)用100μl/孔稀释的TrkA或p75受体溶液于4℃包被过夜。用PBS吐温20洗板3次，然后用200μl/孔的含3％w/v牛血清白蛋白(BSA)的PBS封闭。于室温孵育1h后洗板。用测试缓冲液(含0.5％w/vBSA和0.05％v/v吐温20的PBS)将受试的抗体稀释到所希望的浓度。不针对NGF的无关抗体用作阴性对照，而非放射性标记的NGF用作放射性配体结合的参考抑制剂。每个浓度的测试样品用一式两份的孔制备。用测试缓冲液稀释人或大鼠125I-NGF(Amersham Biosciences)，从而使得当与测试样品混合时在测试孔中的终浓度在100μl总测试体积中为150pM。用PBS/吐温20洗涤以去除未结合的125I-NGF之前，测试板于室温孵育2h。通过加入100μl/孔的Microscint 20(Perkin Elmer)然后用Packard TopCount微板液体闪烁计数仪计数来定量结合的放射性标记。利用Graphpad Prism软件对数据作图并分析，从而计算每次实验的IC50值，并根据Cheng-Prusoff方程得出相应的Ki；
Ki＝IC50/(1+D/Kd)
其中：
D＝测试中的NGF浓度(名义上为150pM，但对于每次实验要确定实际测试浓度)
Kd＝在同样测试条件下的NGF对TrkA或p75受体的亲和力。这通过在分开的实验中对125I-NGF与TrkA和p75受体结合的饱和结合分析来确定。
除了人IgG4对照之外，所有被评估的抗体都抑制人和大鼠125I-NGF与人TrkA和p75受体的结合(图8和9；表5)。表6显示了从图8A所示数据计算而来的IC50和Ki值；表7显示了从图8B所示数据计算而来的IC50和Ki值；表8显示了从图9A所示数据计算而来的IC50和Ki值；表9显示了从图9B所示数据计算而来的IC50和Ki值。抗体1252A5一贯地显示出最大的125I-NGF结合抑制效力。有趣的是，1252A5介导的NGF与TrkA和p75受体结合的抑制所确定出的结合抑制常数值有显著差异。因而，计算出的抑制人NGF与TrkA和p75结合的平均pKi分别为10.26±0.08和9.85±0.04(P＜0.01，Student’s T检验；两者的n＝3)。计算出的抑制大鼠NGF与TrkA和p75受体结合的平均pKi分别为9.79±0.04和9.55±0.03(P＜0.05，Student’s T测验；两者的n＝3)。该结果提示了，1252A5是NGF和TrkA受体间相互作用的优选抑制剂，这出人意料地与G1152H5得到的结果相反，在后者中相应pKi值之间没有显著差异(表5)。
实施例10
人IgG4 NGF抗体的抗痛觉过敏活性
在角叉菜聚糖诱导的热超敏反应的小鼠模型中，评估NGF抗体的抗痛觉过敏活性。首先使雄性小鼠(体重20-25g)适应测试设备2h。次日，对两个后爪进行热刺激，确定反应性的测量基线。根据Hargreaves等(1988)的方法，将聚焦的热源施于后脚脚底表面，并记录缩回的反应时间。基线值以每只爪三次重复测定的平均值来计算，记录之间间隔10分钟。然后，小鼠接受腹膜内注射在磷酸缓冲盐液(PBS)媒介物中的中和NGF的人IgG4抗体或对照同种型匹配的无效抗体。24小时后，通过在脚底下注射角叉菜聚糖(2％w/v，溶于PBS；30μl注射体积)来诱导出炎性痛觉过敏。又过了24h后，再对发炎的和未发炎的后爪确定缩回的反应时间。
通过用人IgG4 NGF抗体1252A5预处理小鼠，能剂量依赖性地抑制角叉菜聚糖注射后24h所观察的热痛觉过敏(图10)。
所有引用的文件都纳入本文参考。
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表1
钙动员测试中的人IgG4 NGF抗体的中和效力
    抗体     人NGFIC50(nM)     大鼠NGFIC50(nM)
    Mab2561064F81022E3     0.76±0.15a2.5±0.6c18±6c     0.79±0.08b5.514
    1083H41021E51033G91016A81028F81033B21024C41057F11     307655±20c65±12b7385410±120*c3700*     61e75e2614NDND565*ND
除了an＝14、bn＝12、cn＝3、dn＝4(平均值±sem)和en＝1以外，数据显示了2次分开的测定的平均值。通过外推来确定*值。ND＝未测定。
表2a含有HCDR3序列LNPSLTA(SEQ ID NO：531)的、1021E5衍生的优化克隆的CDR
Figure A20068000240900651
表右侧的栏显示每个克隆的NGF中和效力(IC50)估计值。如实施例3所述在NGF结合测试中测定纯化的scFv。
表2b与表2a中所示克隆的CDR序列对应的SEQ ID NO
 HCDR1  HCDR2  HCDR3  LCDR1  LCDR2  LCDR3
 LOT1021E05  SEQ ID NO：33  SEQ ID NO：34  SEQ ID NO：35  SEQ ID NO：38  SEQ ID NO：39  SEQ ID NO：40
 LOT1131H02  SEQ ID NO：163  SEQ ID NO：164  SEQ ID NO：165  SEQ ID NO：168  SEQ ID NO：169  SEQ ID NO：170
 LOT1132H09  SEQ ID NO：183  SEQ ID NO：184  SEQ ID NO：185  SEQ ID NO：188  SEQ ID NO：189  SEQ ID NO：190
 LOT1133C11  SEQ ID NO：193  SEQ ID NO：194  SEQ ID NO：195  SEQ ID NO：198  SEQ ID NO：199  SEQ ID NO：200
 LOT1134D09  SEQ ID NO：203  SEQ ID NO：204  SEQ ID NO：205  SEQ ID NO：208  SEQ ID NO：209  SEQ ID NO：210
 LOT1146D07  SEQ ID NO：223  SEQ ID NO：224  SEQ ID NO：225  SEQ ID NO：228  SEQ ID NO：229  SEQ ID NO：230
 LOT1147A03  SEQ ID NO：433  SEQ ID NO：434  SEQ ID NO：435  SEQ ID NO：438  SEQ ID NO：439  SEQ ID NO：440
 LOT1147D02  SEQ ID NO：233  SEQ ID NO：234  SEQ ID NO：235  SEQ ID NO：238  SEQ ID NO：239  SEQ ID NO：240
 LOT1147F02  SEQ ID NO：443  SEQ ID NO：444  SEQ ID NO：445  SEQ ID NO：448  SEQ ID NO：449  SEQ ID NO：450
 LOT1147G09  SEQ ID NO：243  SEQ ID NO：244  SEQ ID NO：245  SEQ ID NO：248  SEQ ID NO：249  SEQ ID NO：250
 LOT1149D09  SEQ ID NO：453  SEQ ID NO：454  SEQ ID NO：455  SEQ ID NO：458  SEQ ID NO：459  SEQ ID NO：460
 LOT1150D09  SEQ ID NO：463  SEQ ID NO：464  SEQ ID NO：465  SEQ ID NO：468  SEQ ID NO：469  SEQ ID NO：470
 LOT1150F01  SEQ ID NO：253  SEQ ID NO：254  SEQ ID NO：255  SEQ ID NO：258  SEQ ID NO：259  SEQ ID NO：260
 LOT1150G08  SEQ ID NO：473  SEQ ID NO：474  SEQ ID NO：475  SEQ ID NO：478  SEQ ID NO：479  SEQ ID NO：480
 LOT1152D05  SEQ ID NO：483  SEQ ID NO：484  SEQ ID NO：485  SEQ ID NO：488  SEQ ID NO：489  SEQ ID NO：490
 LOT1152G10  SEQ ID NO：493  SEQ ID NO：494  SEQ ID NO：495  SEQ ID NO：498  SEQ ID NO：499  SEQ ID NO：500
 LOT1156G06  SEQ ID NO：503  SEQ ID NO：504  SEQ ID NO：505  SEQ ID NO：508  SEQ ID NO：509  SEQ ID NO：510
 LOT1160E03  SEQ ID NO：293  SEQ ID NO：294  SEQ ID NO：295  SEQ ID NO：298  SEQ ID NO：299  SEQ ID NO：300
 LOT1165D04  SEQ ID NO：303  SEQ ID NO：304  SEQ ID NO：305  SEQ ID NO：308  SEQ ID NO：309  SEQ ID NO：310
 LOT1215A06  SEQ ID NO：513  SEQ ID NO：514  SEQ ID NO：515  SEQ ID NO：518  SEQ ID NO：519  SEQ ID NO：520
 LOT1218H05  SEQ ID NO：353  SEQ ID NO：354  SEQ ID NO：355  SEQ ID NO：358  SEQ ID NO：359  SEQ ID NO：360
 LOT1219D09  SEQ ID NO：523  SEQ ID NO：524  SEQ ID NO：525  SEQ ID NO：528  SEQ ID NO：529  SEQ ID NO：530
表3
在完整细胞的三次NGF功能测试中，优化的人IgG4抗体的NGF中和效力
IgG FLIPR钙动员IC50(nM) PC12细胞存活IC50(nM) TF-1细胞增殖IC50(nM)
克隆   亲本     人NGF     大鼠NGF 小鼠NGF 人NGF 大鼠NGF 人NGF   大鼠NGF   小鼠NGF
1021E51083H41126F11126G51126H51127D91127F91131D71131H21132A91132H91133C111134D91145D11146D71147D21147G91150F1   --1021E51021E51021E51021E51021E51021E51021E51021E51021E51021E51021E51021E51021E51021E51021E51021E5     76a30a0.350.230.380.400.361170.270.390.350.45a0.31a0.360.380.360.30±0.04b0.32     75610.150.160.150.220.14370.110.250.130.30a0.14a0.170.330.210.21±0.02b0.15   47540.220.160.230.210.20710.120.330.160.28a0.16a0.240.310.240.23±0.02b0.19     1300j1100j2.91.508.70.570.596700.580.900.550.53±0.13b0.540.660.480.510.76±0.06b0.47 0.42±0.07b0.55±0.02b 0.10±0.01d 0.12±0.02d 0.10±0.02d
表3(续)
IgG  FLIPR钙动员IC50(nM) PC12细胞存活IC50(nM) TF-1细胞增殖IC50(nM)
克隆 亲本 人NGF 大鼠NGF 小鼠NGF 人NGF 大鼠NGF 人NGF 大鼠NGF 小鼠NGF
1152H51155H1G1152H51158A11160E31165D4G1165D41175H81211G101214A11214D101218H51227H81230D81230H7G1230H71252A5Mab256 1021E51021E51152H51021E51021E51021E51165D41021E51021E51021E51021E51021E51083H41083H41021E51230H71133C11-     0.22±0.05b0.350.220.340.330.26±0.02b0.32a0.370.370.26a0.290.330.44a0.31a0.27±0.04b0.31a0.33±0.03c0.76±0.15h     0.21±0.05b0.180.270.120.130.15±0.01b0.33a0.150.160.16a0.140.130.43a0.29a0.18±0.03b0.34a0.29±0.06c0.79±0.08g     0.14±0.01b0.180.180.110.120.16±0.04b0.27a0.160.150.14a0.130.150.48a0.37a0.15±0.02b0.25a0.26±0.01c1.4±0.2i     0.40±0.04e0.591.1±0.1b0.480.400.41±0.08e0.86±0.04b1.10.580.52±0.07b0.350.470.70±0.15b0.71±0.14b0.42±0.10c2.5±0.2b0.94±0.13f23±1i     0.38±0.04e7.3±0.9b0.41±0.06e2.63±0.03b0.43±0.07b35±10b37±4b0.32±0.05c7.5±0.4b2.7±0.6f44±7f   0.26±0.25d0.44±0.17d0.42±.15d6±4d   0.08±0.0d1.44±0.27d0.72±0.40d5±3d   0.07±0.0d0.99±0.29d0.55±0.32d7±3d
除了an＝2；bn＝3；cn＝4；dn＝5；en＝6；fn＝7；gn＝12；hn＝14；in＝15；j外推的以外，数据为n＝1。
表4
优化的人IgG4 NGF抗体与其它神经营养蛋白的交叉反应性
 IgG  BDNF，％  NT-3，％  NT-4，％
 1133C111147G91152H51165D41214A11230H71252A5  0.7-3.10-1.30-1.50-1.30-1.40-1.10-1.4  0.9-1.80.1-0.90-0.50-0.70-1.00-0.80-1.1  0-1.70-1.30.2-1.20-1.50-1.00-0.70-0.9
栏中数据显示了计算的抗体交叉反应性的范围。数值以在相同测试抗体浓度下针对每种神经营养蛋白所观察到的信号相对于NGF结合信号的百分比计算。以100ng/孔的浓度将神经营养蛋白包被于测试板上，并在0.03-10nM的浓度范围测量受试抗体的结合。数据代表单个实验的结果。
表5
针对1252A5和G1152H5的结合抑制常数的测定小结。数据代表3次独立实验的平均值±s.e.m.。
  IgG   对人NGF的pKi   对大鼠NGF的pKi
  TrkA   p75   TrkA   p75
  1252A5G1152H5 10.26±0.08*9.59±0.08§ 9.85±0.049.56±0.04 9.79±0.04**9.1 8±0.08§ 9.55±0.039.24±0.05
*相较于人NGF/p75的相互作用P＜0.01
**相较于大鼠NGF/p75的相互作用P＜0.05
§相较于p75 N/S
Student’s未配对的T检验
表6
    IgG     IC50(nM)     Ki(nM)
    NGF1252A5G1152H5MAB256MAB5260Z     2.40.0680.2041.940.368     2.10.0610.1841.760.333
表7
    IgG     IC50(nM)     Ki(nM)
    NGF1252A5G1152H5MAB256MAB5260Z     1.30.1510.5381.480.310     1.20.1400.4991.380.288
表8
    IgG     IC50(nM)     Ki(nM)
    NGF1252A5G1152H5MAB256MAB5260Z     0.6860.1880.3480.3040.570     0.5680.1550.2880.2520.472
表9
    IgG     IC50(nM)     Ki(nM)
    NGF1252A5G1152H5MAB256MAB5260Z     0.7830.3020.7812.940.587     0.7100.2740.7082.670.532
                          序  列  表
<110>剑桥抗体技术有限公司(Cambridge Antibody Technology Limited)
     伊兰医药国际有限公司(Elan Pharma International Limited)
<120>针对NGF的特异性结合成员
<130>SMW/CP6347033
<140>
<141>
<150>US 60/645,587
<151>2005-01-24
<160>537
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>396
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<223>1064F8 VH核苷酸序列
<400>1
gaggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc   60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgctt acacctgggt gcgacaggcc  120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcgtcccca tctttggttc aacaaactac  180
gcacagaagt tccagggcag actcacgatt accgcggacg aattcacgag cacagcccat  240
atggagctga gcagcctgac atctgcggac acggccgtat attactgtgc gggaggcagt  300
gacttatatt gtagtggtgg taactgctac gggggcggtc actactacta ctacatggac  360
gtctgggggc aagggaccac ggtcaccgtc tcgagt                            396
<210>2
<211>132
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<223>1064F8 VH氨基酸序列
<400>2
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30

Claims (72)

1.针对神经生长因子(NGF)的分离的特异性结合成员，其包含抗体抗原结合位点，所述位点由人抗体VH结构域和人抗体VL结构域组成，而且所述位点包括一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中VH结构域包含HCDR1、HCDR2、HCDR3和构架，而且VL结构域包含LCDR1、LCDR2、LCDR3和构架，其中该组CDR由选自下组的一组CDR组成：
1133C11组CDR，其被定义为其中HCDR1具有SEQ ID NO：193的氨基酸序列，HCDR2具有SEQ ID NO：194的氨基酸序列，HCDR3具有SEQ ID NO：195的氨基酸序列，LCDR1具有SEQ ID NO：198的氨基酸序列，LCDR2具有SEQ ID NO：199的氨基酸序列，而且LCDR3具有SEQID NO：200的氨基酸序列；
一组CDR，其与1133C11组CDR比较，包含一个或2个氨基酸取代；
如表2中单个克隆所示的每组CDR；以及
一组CDR，其包含1133C11组的CDR，并用氨基酸序列MISSLQP(SEQID NO：533)或氨基酸序列FNSALIS(SEQ ID NO：532)代替HCDR3中氨基酸序列LNPSLTA(SEQ ID NO：531)。
2.根据权利要求1所述的分离的特异性结合成员，其中一个或两个取代位于CDR中一个或两个如下残基，其利用Kabat标准编号：
HCDR1中的31、34
HCDR2中的51、55、56、57、58、65
HCDR3中的96
LCDR1中的26、27、27A、27B、28、29、30
LCDR2中的56
LCDR3中的90、94。
3.根据权利要求2所述的分离的特异性结合成员，其中在如下位置从对每个位置鉴定出的可能取代物残基的组中进行一个或两个取代：
取代位置         选自下组的取代物残基
HCDR1中的31：    A
HCDR1中的34：    V
HCDR2中的51：    V
HCDR2中的55：    N
HCDR2中的56：    A
HCDR2中的57：    V
HCDR2中的58：    S
HCDR2中的65：    D
HCDR3中的96：    N
LCDR1中的26：    T
LCDR1中的26：    G
LCDR1中的27：    N
LCDR1中的27：    R
LCDR1中的27A：   T
LCDR1中的27A：   P
LCDR1中的27B：   D
LCDR1中的28：    T
LCDR1中的29：    E
LCDR1中的30：    D
LCDR2中的56：    T
LCDR3中的90：    A
LCDR3中的94：    G。
4.根据权利要求3所述的分离的特异性结合成员，其中LCDR1中的残基29是E。
5.根据权利要求1所述的分离的特异性结合成员，其包含一组CDR，所述一组CDR包含1133C11组的CDR，并用氨基酸序列MISSLQP(SEQ IDNO：533)代替HCDR3中氨基酸序列LNPSLTA(SEQ ID NO：531)。
6.根据权利要求1所述的分离的特异性结合成员，其包含一组CDR，所述一组CDR包含1133C11组的CDR，并用氨基酸序列FNSALIS(SEQ IDNO：532)代替HCDR3中氨基酸序列LNPSLTA(SEQ ID NO：531)。
7.根据权利要求1所述的分离的特异性结合成员，其包含1133C11组的CDR。
8.根据权利要求1至7任一项所述的分离的特异性结合成员，其中VH结构域构架是人重链生殖系构架，和/或VL结构域构架是人轻链生殖系构架。
9.根据权利要求8所述的分离的特异性结合成员，其中所述重链生殖系构架包含VH1 DP10。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的分离的特异性结合成员，其中轻链生殖系构架包含VL Vλ1。
11.根据权利要求1至10任一项所述的分离的特异性结合成员，其结合大鼠或小鼠NGF。
12.根据权利要求1至11任一项所述的分离的特异性结合成员，其相对于NGF与p75受体的结合，优先阻断NGF与TrkA受体的结合。
13.根据权利要求9至12任一项所述的特异性结合成员，其包含1252A5 VH结构域(SEQ ID NO：392)。
14.根据权利要求9至13任一项所述的特异性结合成员，其包含1252A5 VL结构域(SEQ ID NO：397)。
15.根据权利要求1至14任一项所述的特异性结合成员，其以等于或优于针对人NGF的由1252A5 VH结构域(SEQ ID NO：392)和1252A5 VL结构域(SEQ ID NO：397)形成的抗原结合位点亲和力的亲和力与人NGF结合，特异性结合成员的亲和力和抗原结合位点的亲和力在相同条件下测定。
16.根据权利要求1至15任一项所述的特异性结合成员，其结合和/或中和人NGF。
17.根据权利要求16所述的特异性结合成员，其以等于或优于由1252A5 VH结构域(SEQ ID NO：392)和1252A5 VL结构域(SEQ ID NO：397)形成的NGF抗原结合位点效力的效力中和人NGF，特异性结合成员的效力和抗原结合位点的效力在相同条件下测定。
18.根据权利要求9至11任一项所述的特异性结合成员，其包含1152H5 VH结构域(SEQ ID NO：262)。
19.根据权利要求9至11任一项或权利要求18所述的特异性结合成员，其包含1152H5 VL结构域(SEQ ID NO：267)。
20.根据权利要求9至11任一项所述的特异性结合成员，其包含1165D4 VH结构域(SEQ ID NO：302)。
21.根据权利要求9至11任一项或权利要求20所述的特异性结合成员，其包含1165D4 VL结构域(SEQ ID NO：307)。
22.根据权利要求9至11任一项所述的特异性结合成员，其包含1230H7 VH结构域(SEQ ID NO：362)。
23.根据权利要求9至11任一项或权利要求22所述的特异性结合成员，其包含1230H7 VL结构域(SEQ ID NO：367)。
24.根据权利要求1至23任一项所述的特异性结合成员，其包含scFv抗体分子。
25.根据权利要求1至23任一项所述的特异性结合成员，其包含抗体恒定区。
26.根据权利要求25所述的特异性结合成员，其包含完整抗体。
27.根据权利要求26所述的特异性结合成员，其中完整抗体是IgG4。
28.根据权利要求1至23任一项所述的特异性结合成员的分离的抗体VH结构域。
29.根据权利要求1至23任一项所述的特异性结合成员的分离的抗体VL结构域。
30.一种组合物，其包含根据权利要求1至29任一项所述的特异性结合成员、抗体VH结构域或抗体VL，和至少一种额外的成份。
31.根据权利要求30所述的组合物，其包含药学上可接受的赋形剂、媒介物或载体。
32.一种分离的核酸，其包含编码根据权利要求1至29任一项所述的特异性结合成员或特异性结合成员的抗体VH或VL结构域的核苷酸序列。
33.用根据权利要求32所述的核酸体外转化的宿主细胞。
34.生产特异性结合成员或抗体VH或VL结构域的方法，该方法包括在产生所述特异性结合成员或抗体VH或VL结构域的条件下，培养根据权利要求33所述的宿主细胞。
35.根据权利要求34所述的方法，其进一步包括分离和/或纯化所述特异性结合成员或抗体VH或VL可变结构域。
36.根据权利要求34或权利要求35所述的方法，其进一步包括将特异性结合成员或抗体VH或VL可变结构域配制入包含至少一种额外成份的组合物中。
37.生产针对NGF的抗体抗原结合结构域的方法，该方法包括：
通过在包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的亲本VH结构域氨基酸序列中添加、缺失、替换或插入一个或多个氨基酸来提供VH结构域，其中亲本VH结构域HCDR1、HCDR2和HCDR3是1252A5组HCDR，其被定义为其中HCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：393，HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：394，HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：395，或是1021E5组HCDR，其被定义为其中HCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：33，HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：34，HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：35，所述VH结构域是亲本VH结构域的氨基酸序列变体，并任选将所提供的VH结构域与一个或多个VL结构域组合起来，从而提供一个或多个VH/VL组合；并
测试所述VH结构域或VH/VL组合或多个组合，所述VH结构域是亲本VH结构域的氨基酸序列变体，从而鉴定出特异性针对NGF的抗体抗原结合结构域。
38.根据权利要求37所述的方法，其中亲本VH结构域氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO：392和SEQ ID NO：32。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的方法，其中通过在包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的亲本VL结构域氨基酸序列中添加、缺失、替换或插入一个或多个氨基酸来提供所述一个或多个VL结构域，其中亲本VL结构域LCDR1、LCDR2和LCDR3是1252A5组LCDR，其被定义为其中LCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：398，LCDR2具有氨基酸序列SEQID NO：399，LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：400，或是1021E5组LCDR，其被定义为其中LCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：38，LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：39，LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：40，产生一个或多个VL结构域，所述VL结构域每一个是亲本VL结构域的氨基酸序列变体。
40.根据权利要求39所述的方法，其中亲本VL结构域氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO：397和SEQ ID NO：37。
41.根据权利要求37至40任一项所述方法，其中NGF是人NGF。
42.生产针对NGF的抗体抗原结合结构域的方法，该方法包括
通过在包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的亲本VH结构域氨基酸序列中添加、缺失、替换或插入一个或多个氨基酸来提供VH结构域，其中亲本VH结构域HCDR1、HCDR2和HCDR3是1152H5组HCDR，其被定义为其中HCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：263，HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：264，HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：265，或是1165D4组HCDR，其被定义为其中HCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：303，HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：304，HCDR3具有氨基酸序列SEQ IDNO：305，或是1230H7组HCDR，其被定义为其中HCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：363，HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：364，HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：365，所述VH结构域是亲本VH结构域的氨基酸序列变体，并任选将所提供的VH结构域与一个或多个VL结构域组合起来，从而提供一个或多个VH/VL组合；并
测试所述VH结构域或VH/VL组合或多个组合，所述VH结构域是亲本VH结构域的氨基酸序列变体，从而鉴定出特异性针对NGF的抗体抗原结合结构域。
43.根据权利要求42所述的方法，其中亲本VH结构域氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO：262、SEQ ID NO：302和SEQ ID NO：362。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的方法，其中通过在包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的亲本VL结构域氨基酸序列中添加、缺失、替换或插入一个或多个氨基酸来提供所述一个或多个VL结构域，其中亲本VL结构域LCDR1、LCDR2和LCDR3是1152H5组LCDR，其被定义为其中LCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：268，LCDR2具有氨基酸序列SEQID NO：269，LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：270，或是1165D4组LCDR，其被定义为其中LCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：308，LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：309，LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：310，或是1230H7组LCDR，其被定义为其中LCDR1具有氨基酸序列SEQID NO：368，LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：369，LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：370，产生一个或多个VL结构域，所述VL结构域每一个是亲本VL结构域的氨基酸序列变体。
45.根据权利要求44所述的方法，其中亲本VL结构域氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：307和SEQ ID NO：367。
46.根据权利要求42至45任一项所述的方法，其中NGF是人NGF。
47.根据权利要求37至46任一项所述的方法，其中通过CDR诱变来提供所述VH结构域，所述VH结构域是亲本VH结构域的氨基酸序列变体。
48.根据权利要求37至47任一项所述的方法，其进一步包括将抗体抗原结合位点生产成IgG、scFv或Fab抗体分子的成份。
49.产生结合NGF的特异性结合成员的方法，该方法包括：
提供编码VH结构域的起始核酸或其中每个核酸都编码VH结构域的起始核酸库，其中VH结构域或多个VH结构域包含要被替代的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3或缺少HCDR1、HCDR2和/或HCDR3编码区；
将所述起始核酸或起始库与编码或通过突变产生氨基酸序列HCDR1SEQ ID NO：193、HCDR2 SEQ ID NO：194、和/或HCDR3 SEQ ID NO：395、265、305、365或35的供体核酸或多个供体核酸组合，从而使所述供体核酸或多个供体核酸插入到起始核酸或起始库的CDR1、CDR2和/或CDR3区中，由此提供编码VH结构域的核酸的产物库；
表达所述产物库的核酸以产生VH结构域产物；
任选将所述VH结构域产物与一个或多个VL结构域组合；
选择针对NGF的特异性结合成员，该特异性结合成员包含VH结构域产物和任选的VL结构域；并
收获所述特异性结合成员或编码它的核酸。
50.根据权利要求49所述的方法，其中通过突变所述HCDR1和/或HCDR2来产生供体核酸。
51.根据权利要求49所述的方法，其中通过突变HCDR3来产生供体核酸。
52.根据权利要求51所述的方法，其包括通过突变编码氨基酸序列1252A5 HCDR3(SEQ ID NO：395)或1021E5 HCDR3(SEQ ID NO：35)的核酸来提供供体核酸。
53.根据权利要求49所述的方法，所述方法包括通过随机突变核酸来提供供体核酸。
54.根据权利要求49至53任一项所述的方法，所述方法进一步包括将包含在回收的特异性结合成员中的VH结构域产物与抗体恒定区相连。
55.根据权利要求49至53任一项所述的方法，所述方法包括提供包含VH结构域和VL结构域产物的IgG、scFv或Fab抗体分子。
56.根据权利要求49至55任一项所述的方法，其中NGF是人NGF。
57.根据权利要求37至56任一项所述的方法，所述方法进一步包括测试抗体抗原结合结构域或结合NGF的特异性结合成员中和NGF的能力。
58.根据权利要求57所述的方法，其中获得了特异性结合成员，所述特异性结合成员包含结合并中和NGF的抗体片段。
59.根据权利要求58所述的方法，其中抗体片段是scFv抗体分子。
60.根据权利要求58所述的方法，其中抗体片段是Fab抗体分子。
61.根据权利要求59或权利要求60所述的方法，其进一步包括在完整抗体中提供抗体片段的VH结构域和/或VL结构域。
62.根据权利要求37至61任一项所述的方法，其进一步包括将结合NGF的特异性结合成员、特异性结合成员的抗体抗原结合位点或抗体VH或VL可变结构域或结合NGF的抗体抗原结合位点配制入包含至少一种额外成份的组合物。
63.根据权利要求37至62任一项所述的方法，其进一步包括将结合NGF的特异性结合成员与NGF或NGF片段结合。
64.一种方法，其包括将根据权利要求1至27任一项所述的结合NGF的特异性结合成员与人NGF或人NGF的片段结合。
65.根据权利要求63或64所述的方法，其中所述结合发生在体外。
66.根据权利要求63至65任一项所述的方法，所述方法包括将特异性结合成员与人NGF或人NGF的片段结合。
67.根据权利要求63至66任一项所述的方法，所述方法包括确定特异性结合成员与NGF或NGF的片段结合的量。
68.根据权利要求37至67任一项所述的方法，所述方法进一步包括特异性结合成员在制备用于治疗NGF在其中发挥作用的疾病或病症的药物中的用途。
69.根据权利要求1至27任一项所述的特异性结合成员在制备用于治疗NGF在其中发挥作用的疾病或病症的药物中的用途。
70.治疗NGF在其中发挥作用的疾病或紊乱的方法，该方法包括向患有所述疾病或紊乱或有发展成疾病或病症风险的患者施用根据权利要求1至27任一项所述的特异性结合成员。
71.根据权利要求68、权利要求69或权利要求70所述的方法或用途，其中所述疾病或病症选自下组：疼痛、哮喘、慢性阻塞性肺病、肺纤维化、其它气道炎症疾病、糖尿病性神经病、心律失常、HIV、关节炎、牛皮癣和癌症。
72.根据权利要求71所述的方法或用途，其中所述治疗是治疗疼痛。
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