ES2435691T3 - Anticuerpos humanos contra NGF humano - Google Patents

Abstract

Un miembro de unión específica aislado para factor de crecimiento nervioso (NGF), que comprende un sitio deunión a antígeno del anticuerpo que está compuesto por un dominio VH de anticuerpo humano y un dominio VL deanticuerpo humano y que comprende un conjunto de CDR HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, enel que el dominio VH comprende HCDR1, HCDR2, HCDR3 y una región estructural y el dominio VL comprendeLCDR1, LCDR2, LCDR3 y una región estructural, en el que el conjunto de CDR consiste en un conjunto de CDRseleccionado del grupo que consiste en: el conjunto 1133C11 de CDR, definido en el que la HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 193, laHCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 194, la HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SECID Nº: 195, la LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 198, la LCDR2 tiene la secuencia deaminoácidos de SEC ID Nº: 199 y la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 200; un conjunto de CDR que contiene el conjunto 1133C11 de CDR con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 533o la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 532 sustituida por la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 531dentro de HCDR3; y un conjunto de CDR que contiene una o dos sustituciones de aminoácidos en comparación con el conjunto 1133C11de CDR, en el que la una o dos sustituciones se hacen en las siguientes posiciones de entre los grupos identificadosde posibles residuos sustitutos para cada posición, usando la numeración convencional de Kabat.

Description

Anticuerpos humanos contra NGF humano

5 La presente invención se refiere a miembros de unión específica, en particular a moléculas de anticuerpo anti-NGF, especialmente moléculas de anticuerpo humano y especialmente aquellas que neutralizan la actividad de NGF (factor de crecimiento nervioso). Se refiere además a procedimientos para usar moléculas de anticuerpo anti-NGF en el diagnóstico o tratamiento de trastornos relacionados con NGF, que incluyen dolor, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar, otras enfermedades de inflamación de las vías respiratorias, neuropatía diabética, arritmias cardíacas, VIH, artritis, psoriasis y cáncer.

La presente invención proporciona moléculas de anticuerpo de particular valor en unirse y neutralizar NGF y así de uso en cualquiera de una variedad de tratamientos terapéuticos, como se indica por la experimentación contenida en el presente documento y adicionalmente por la bibliografía técnica de apoyo.

15 El factor de crecimiento nervioso (β-NGF), comúnmente conocido como NGF, desempeña una función crucial muy conocida en el desarrollo del sistema nervioso. En el adulto, sin embargo, el NGF desempeña una función más restringida, promoviendo la salud y supervivencia de un subconjunto de neuronas centrales y periféricas (Huang y Reichardt, 2001). El NGF también contribuye a la modulación de las características funcionales de estas neuronas. Como parte de este último proceso, el NGF ejerce control tónico sobre la sensibilidad, o excitabilidad, de nociceptores (Priestley y col., 2002; Bennett, 2001). Estas neuronas periféricas detectan y transmiten al sistema nervioso central los diversos estímulos perjudiciales que por último lugar dan lugar a percepciones de dolor (nocicepción). Así, agentes que reducen los niveles de NGF pueden poseer utilidad como agentes terapéuticos analgésicos.

25 El coste social del dolor inadecuadamente tratado soporta adicionalmente la posible utilidad de analgésicos basados en actividad anti-NGF. Es decir, a pesar de la existencia y el uso generalizado de numerosas medicaciones para el dolor, existe una clara necesidad de nuevos analgésicos. El dolor es uno de los síntomas más comunes para el que se busca asistencia médica y es la queja primaria de la mitad de todos los pacientes que visitan a un médico. El alto coste del dolor para la sociedad está bien documentado. En los EE.UU., por ejemplo, el dolor crónico aflige a unos 34 millones de estadounidenses. El dolor produce 50 millones de días laborales perdidos cada año. Los costes médicos directos atribuidos a dolor de espalda, dolor artrítico y migraña ascienden a 40 billones de dólares solo anualmente. El mercado total de medicaciones para el dolor de venta con receta es aproximadamente 15 billones de dólares al año (Pleuvry y Pleuvry).

35 Como implican estas estadísticas, un porcentaje sustancial de los enfermos por dolor fracasan en recibir alivio adecuado del dolor. Como consecuencia, sigue existiendo una gran necesidad médica de analgésicos seguros y eficaces con mecanismos de acción novedosos (Pleuvry y Pleuvry).

Agentes terapéuticos que reducen los niveles en tejido o inhiben los efectos de NGF secretado tienen la posibilidad de ser precisamente aquellos analgésicos novedosos. Las inyecciones subcutáneas del propio NGF producen dolor en seres humanos y animales. Así, el NGF inyectado produce una rápida hiperalgesia térmica, seguida de hiperalgesia térmica retardada y alodinia mecánica (Petty y col., 1994; McArthur y col., 2000). El NGF endógenamente secretado es similarmente pro-nociceptivo. La liberación inducida por lesión de tejido de NGF y su

45 posterior acción en la periferia desempeña una función importante en la inducción de hiperalgesia térmica mediante el proceso de 'sensibilización periférica' (Mendell y Arvanian, 2002). La lesión de tejido promueve la liberación de citocinas pro-nociceptivas y pro-inflamatorias que, a su vez, induce la liberación de NGF de queratinocitos y fibroblastos. Este NGF liberado actúa directamente sobre nociceptores para inducir estados dolorosos o nociceptivos en el plazo de minutos desde la lesión perjudicial. Este NGF también actúa indirectamente para inducir y mantener estados nociceptivos/de dolor. Desencadena la desgranulación de mastocitos, liberando agentes pro-nociceptivos tales como histamina y serotonina y lo que es más importante, más NGF y también puede estimular terminaciones nerviosas simpáticas para liberar neurotransmisores pro-nociceptivos tales como noradrenalina (Ma y Wo olf, 1997).

Los niveles en tejido de NGF son elevados en animales inyectados con CFA y carragenina (Ma y Wo olf, 1997;

55 Amann y Schuligoi, 2000). Además, se han documentado elevados niveles de NGF en pacientes que padecen artritis reumatoide (Aloe y Tuveri, 1997) o cistitis (Lowe y col., 1997). En roedores, la lesión nerviosa periférica aumenta la expresión de ARNm de NGF en macrófagos, fibroblastos y células de Schwann (Heumann y col., 1987). La expresión en exceso de NGF en ratones transgénicos produce comportamiento de dolor neuropático potenciado tras la lesión nerviosa superior al de ratones naturales (Ramer y col., 1998). Durante horas y días, niveles de NGF elevados desempeñan una función en promover la 'sensibilización central' - la potenciación de neurotransmisión en sinapsis en las rutas nociceptivas de la médula espinal. La 'sensibilización central produce hiperalgesia persistente y crónica y alodinia. Se cree que este proceso implica la internalización de complejos de NGF y su receptor de alta afinidad, trkA (receptor tirosina cinasa A). El transporte retrógrado de estos complejos a cuerpos de células nociceptoras en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) potencia la secreción de neuropéptidos nociceptivos (por

65 ejemplo, sustancia P, CGRP), activación de PKC y activación de receptores de NMDA en el asta dorsal de la médula espinal (Sah y col., 2003) – todos los procesos que promueven la sensibilización de las rutas nociceptivas. NGF también desempeña una función en la regulación por incremento y re-distribución de canales de iones dependientes de voltaje y seleccionados por ligando, que incluyen subtipos de canales de sodio y el receptor de capsaicina, VR1 (Mamet y col., 1999; Fjell y col., 1999; Priestley y col., 2002). Las actividades alteradas y/o expresión de transmisores, receptores y canales de iones son la base de la elevada sensibilidad y excitabilidad de nociceptores

5 asociados a estados de dolor neuropático.

El NGF también puede promover el brote de neuronas simpáticas y la formación de inervación aberrante de neuronas nociceptivas. Se cree que esta inervación contribuye a la inducción y el mantenimiento de estados nociceptivos/de dolor crónicos, tales como dolor simpáticamente mantenido, o síndrome de dolor regional complejo (Ramer y col., 1999).

La nocicepción/dolor inducido por NGF está mediado por el receptor de NGF de alta afinidad, trkA (receptor tirosina cinasa A) (Sah y col., 2003). Aproximadamente el 40 -45% de los cuerpos de células nociceptoras en DRG expresan trkA. Estos son los cuerpos de células de las fibras de pequeño diámetro, o fibras C, que también

15 expresan los péptidos pro-nociceptivos secretados, sustancia P y CGRP. Estas fibras terminan en láminas I y II del asta dorsal, transfiriendo al sistema nervioso central los estímulos perjudiciales detectados por nociceptores periféricos. Mutaciones o deleciones en el gen trkA producen un fenotipo caracterizado por pérdida de sensación de dolor tanto en seres humanos (Indo, 2002) como en ratones de trkA inactivado (de Castro y col., 1998). Significativamente, la expresión de trkA está regulada por incremento en animales sometidos a modelos de dolor artrítico (Pozza y col., 2000) o cístico (Qiao y Vizzard, 2002), o el dolor inflamatorio inducido por inyección de adyuvante completo de Freund (CFA) o carragenina en la pata (Cho y col., 1996).

NGF también se une al receptor de neurotrofina p75. La función del receptor p75 depende de su entorno celular y la presencia de otros receptores con los que se cree que desempeña una función accesoria o de co-receptor. La

25 interacción entre los receptores trkA y p75 produce la formación de sitios de unión de alta afinidad para NGF. La importancia de tales interacciones de receptores en la señalización del dolor mediado por NGF no está clara, pero estudios recientes han implicado al receptor p75 en procesos celulares que pueden ser relevantes (Zhang y Nicol, 2004). Sin embargo, mientras que los ratones de receptor p75 inactivado muestran elevados umbralas a estímulos perjudiciales, siguen siendo sensibles a los efectos hiperalgésicos de NGF, sugiriendo que los receptores trkA solos son suficientes para mediar en estos efectos (Bergmann y col., 1998).

La prueba citada anteriormente indica que los procesos mediados por NGF son responsables de la inducción de dolor agudo, dolor breve, dolor nociceptivo persistente y dolor neuropático persistente o crónico. Así, los agentes anti-NGF se indican por tener utilidad como analgésicos eficaces para tratar a enfermos de cualquiera o de todos

35 estos diversos estados de dolor.

Un agente anti-NGF tal es trkA-Fc, que actúa de trampa o secuestrante para unirse y así inactivar, NGF endógeno. TrkA-Fc es una proteína de fusión que consiste en la región de unión a NGF de trkA ligada a un fragmento del dominio constante (Fc) de un anticuerpo IgG. TrkA-Fc produce hipoalgesia en animales sin tratamiento anterior, disminuye respuestas nociceptoras y disminuye el brote de neuronas sensibles al dolor sin mielinizar (Bennett y col., 1998).

Los antisueros producidos contra NGF también pueden reducir niveles de NGF cuando se inyectan localmente o sistémicamente. Tanto los antisueros anti-NGF como trkA-Fc atenúan el dolor en las patas inflamatorio inducido por

45 carragenina o CFA (Koltzenberg y col., 1999) y respuestas a vejiga inflamada en ratas (Jaggar y col., 1999). El antisuero anti-NGF bloquea la hiperalgesia por calor y frío, invierte la hiperalgesia térmica establecida y previene el brote colateral en el modelo de lesión por constricción crónica (CCI) de dolor neuropático (Wo olf, 1996; Ro y col., 1999). También se ha informado de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción trkA-NGF. En ratas, el inhibidor de NGF-trkA ALE-0540 reduce la hiperalgesia en un modelo de dolor inflamatorio térmicamente inducido y en la prueba de formalina de dolor agudo y persistente (Owo labi y col., 1999). ALE-0540 también reduce la alodinia mecánica en el modelo de lesión del nervio ciático de dolor neuropático (Owo labi y col., 1999).

Los anticuerpos terapéuticos mantienen en general la promesa de un grado de selectividad diana dentro de una familia de receptores estrechamente relacionados, ligandos de receptores, canales o enzimas que son raramente

55 obtenibles con fármacos de molécula pequeña. El dolor mediado por NGF es particularmente muy adecuado para el tratamiento seguro y eficaz con anticuerpos debido a que los niveles de NGF aumentan en la periferia en respuesta a estímulos perjudiciales y los anticuerpos tienen baja permeabilidad a la barrera hematoencefálica. Aunque se ha mostrado que los anticuerpos policlonales son eficaces en modelos animales de dolor, es más probable que los anticuerpos monoclonales anti-NGF sean satisfactoriamente desarrollados como agentes terapéuticos humanos debido a las ventajas en la fabricación y caracterización de una entidad química bien definida coherente. Se ha informado de los efectos antinociceptivos de anticuerpos monoclonales de ratón anti-NGF (Sammons y col., 2000), pero las secuencias de aminoácidos de estos anticuerpos no se proporcionaron.

Pruebas recientes sugieren que NGF promueve otras patologías, además de dolor. Así, los anticuerpos anti-NGF

65 también pueden poseen utilidad para tratar otras enfermedades mediadas por NGF, que incluyen, pero no se limitan a asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar, otras enfermedades de inflamación de las vías respiratorias (Hoyle, 2003; Lommatzch y col., 2003), neuropatía diabética (Yasuda y col., 2003), arritmias cardíacas (WO 04/032852), VIH (Garaci y col., 2003), artritis, psoriasis y cáncer (Nakagawara, 2001).

El documento WO 02/096458 se refiere a anticuerpos anti-NGF, en particular anticuerpo monoclonal de ratón 911 y

5 al uso de tales anticuerpos en el tratamiento de diversos trastornos relacionados con NGF que incluyen dolor, asma, artritis y psoriasis. Establece que el anticuerpo 911 no tuvo efecto adverso sobre el sistema inmunitario en un modelo de ratón experimental de alergia. Estos anticuerpos también se describieron por Hongo y col., 2000.

El documento WO 04/032870 describe el efecto reductor del dolor del anticuerpo para NGF monoclonal de ratón mab 911 y anticuerpo para NGF humanizado E3 en modelos experimentales de dolor posoperatorio. E3 se diferencia de la región constante gamma2a de la cadena pesada humana en 2 aminoácidos.

El documento WO 04/03285 describe procedimientos para prevenir muerte cardíaca súbita y para tratamiento de arritmias cardíacas usando antagonistas de NGF.

15 El documento WO 01/78698 describe el uso de antisuero policlonal para NGF para tratar dolor visceral crónico.

La presente invención proporciona miembros de unión específica para NGF, según las reivindicaciones adjuntas. Un miembro de unión específica de la invención puede unirse a NGF humano o NGF no humano (por ejemplo, NGF de primate no humano y/o NGF de rata y/o NGF de ratón).

Los miembros de unión específica de la invención pueden ser anticuerpos para NGF humano, especialmente anticuerpos humanos, que pueden reaccionar de forma cruzada con NGF no humano, que incluye NGF de primate no humano y/o NGF de ratón y/o NGF de rata.

25 Un miembro de unión específica según la presente invención neutraliza preferentemente NGF. Neutralización significa la reducción o inhibición de la actividad biológica de NGF, por ejemplo, reducción o inhibición de NGF que se une a uno o más de sus receptores (preferentemente TrkA). La reducción en la actividad biológica puede ser parcial o total. El grado con el que un anticuerpo neutraliza NGF se denomina su potencia neutralizante. La potencia puede determinarse o medirse usando uno o más ensayos conocidos para el experto y/o como se describe o se denomina en el presente documento, por ejemplo:

-

Ensayo de movilización de calcio “FLIPR” (véase el ejemplo 2 en el presente documento)

35 - Ensayo de supervivencia de PC12 (véase el ejemplo 5 en el presente documento)

-

Ensayo de proliferación de TF-1 (véase el ejemplo 6 en el presente documento)

-

Ensayo de inhibición de unión a receptor (véase el ejemplo 9 en el presente documento). Los ensayos y potencias se describen en más detalle en cualquier parte en el presente documento.

Los miembros de unión específica de la presente invención pueden optimizarse para potencia neutralizante. Generalmente, la optimización de la potencia implica mutar la secuencia de un miembro de unión específica seleccionado (normalmente la secuencia del dominio variable de un anticuerpo) para generar una biblioteca de

45 miembros de unión específica, que entonces se ensayan para potencia y se seleccionan los miembros de unión específica más potentes. Así, los miembros de unión específica “optimizados para potencia” seleccionados tienden a tener mayor potencia que el miembro de unión específica del que se generó la biblioteca. Sin embargo, también pueden obtenerse miembros de unión específica de alta potencia sin optimización, por ejemplo, un miembro de unión específica de alta potencia puede obtenerse directamente a partir de un cribado inicial, por ejemplo, un ensayo de neutralización bioquímica. La presente invención proporciona tanto miembros de unión específica de potencia optimizada como no optimizada, además de procedimientos para la optimización de la potencia a partir de un miembro de unión específica seleccionado. Así, la presente invención permite que el experto genere miembros de unión específica que tienen alta potencia.

55 Un miembro de unión específica según la presente invención presenta preferentemente actividad antihiperalgésica y/o antialodínica, por ejemplo, inhibe la hiperalgesia térmica inducida por carragenina.

En algunas realizaciones, un miembro de unión específica de la invención comprende una molécula de anticuerpo.

En diversos aspectos y realizaciones de la invención se proporciona la materia objeto de las reivindicaciones incluidas más adelante.

Realizaciones preferidas dentro de la presente invención son moléculas de anticuerpo, o bien anticuerpo completo (por ejemplo, IgG, tal como IgG4) o bien fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, scFv, Fab). Preferentemente, una 65 molécula de anticuerpo de la invención es una molécula de anticuerpo humano. Se proporcionan moléculas de anticuerpo que comprende sitios de unión a antígeno del anticuerpo, ya que son dominios VH y VL del anticuerpo.

Dentro de los dominios VH y VL se proporcionan regiones determinantes de la complementariedad (“CDR”) y regiones estructurales (“FR”) para formar dominios VH o VL según sea el caso. Un sitio de unión a antígeno del anticuerpo puede consistir en un dominio VH y/o un dominio VL de anticuerpo. Todas las secuencias de VH y VL, secuencias de CDR, conjuntos de CDR y conjuntos de HCDR y conjuntos de LCDR desvelados en el presente

5 documento representan aspectos y realizaciones de la invención. Un “conjunto de CDR” comprende CDR1, CDR2 y CDR3. Así, un conjunto de HCDR significa HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y un conjunto de LCDR significa LCDR1, LCDR2 y LCDR3. A menos que se establezca de otro modo, un “conjunto de CDR” incluye HCDR y LCDR.

Ejemplos de dominios VH y VL y CDR de anticuerpo según la presente invención son como se enumeran en el listado de secuencias adjunto.

En el presente documento se desvelan varios linajes de anticuerpo, definidos con referencia a secuencias, por ejemplo, un conjunto de secuencias de CDR, opcionalmente con una o más, por ejemplo, una o dos, o dos sustituciones. El linaje parental preferido es el linaje 1021E5. El linaje 1021E5 incluye la molécula de anticuerpo

15 preferida 1133C11 y otras moléculas de anticuerpo del “linaje 1133C11”, que incluye 1252A5. También dentro del linaje parental 1021E5 están las moléculas de anticuerpo 1165D4, 1230H7 y 1152H5. Los autores de la presente invención han identificado los linajes 1021E5, 1083H4 y especialmente 1133C11 como que proporcionan sitios de unión a antígeno del anticuerpo humano contra NGF que son de particular valor.

El linaje 1133C11 se define con referencia a un conjunto de seis secuencias de CDR de 1133C11 del siguiente modo: SEC ID Nº: 193 de HCDR1, SEC ID Nº: 194 de HCDR2, SEC ID Nº: 195 de HCDR3, SEC ID Nº: 198 de LCDR1, SEC ID Nº: 199 de LCDR2 y SEC ID Nº: 200 de LCDR3. El conjunto de CDR en el que HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 193, HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 194, HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 195, LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC

25 ID Nº: 198, LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 199 y LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 200 se denominan en el presente documento el “conjunto 1133C11 de CDR”. HCDR1, HCDR2 y HCDR3 dentro del conjunto 1133C11 de CDR se denominan el “conjunto 1133C11 de HCDR” y LCDR1, LCDR2 y LCDR3 dentro del conjunto 1133C11 de CDR se denominan el “conjunto 1133C11 de LCDR”. Un conjunto de CDR con el conjunto 1133C11 de CDR, el conjunto 1133C11 de HCDR o 1133C11 de LCDR, o una o dos sustituciones en su interior, se dice que son del linaje 1133C11.

Otros linajes y conjuntos preferidos de CDR se definen con referencia a las CDR análogas como se explica en cualquier parte en el presente documento, que incluye como realizaciones preferidas los conjuntos de CDR desvelados en la tabla 2a (con SEC ID Nºs como se explica en la tabla 2b). La tabla 2a y la tabla 2b muestran

35 conjuntos de CDR (HCDR y LCDR) de clones optimizados derivados del clon 1021E5, que ilustran cómo las secuencias de CDR de los clones optimizados se diferencian de aquellos de 1021E5. Un conjunto de CDR de la tabla 2a/2b incluye un conjunto de HCDR y/o un conjunto de LCDR de cualquier clon ilustrado en la tabla, que opcionalmente incluye el propio 1021E5.

Se proporcionan conjuntos de CDR de estos, como se indica, ya que son conjuntos de CDR con las secuencias desveladas que contienen una o dos sustituciones de aminoácidos.

La presente invención también proporciona miembros de unión específica y moléculas de anticuerpo que comprenden los conjuntos definidos de CDR, conjunto de HCDR o conjunto de LCDR, como se desvela en el 45 presente documento y conjuntos de CDR con una o dos sustituciones dentro del conjunto desvelado de CDR. El conjunto relevante de CDR se proporciona dentro de una región estructural de anticuerpo. Por ejemplo, una o más CDR o un conjunto de CDR de un anticuerpo pueden injertarse en una región estructural (por ejemplo, región estructural humana) para proporcionar una molécula de anticuerpo o diferentes moléculas de anticuerpo. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo puede comprender CDR de un anticuerpo del linaje 1021E5 y regiones estructurales de secuencias de segmentos de genes humanos de la línea germinal. Un anticuerpo de un linaje puede proveerse de un conjunto de CDR dentro de una región estructural que puede someterse a “mutación de la línea germinal” (“germlining”), cambiándose uno o más residuos dentro de la región estructural para coincidir con los residuos en la posición equivalente en la región estructural de la línea germinal humana más similar (por ejemplo, DP10 de la familia de VH1) o una región estructural de la familia λ1, por ejemplo, DPL5. Así, las regiones

55 estructurales de anticuerpo son preferentemente de la línea germinal y/o humana.

La invención proporciona un anticuerpo humano específico para NGF aislado que tiene un dominio VH que comprende un conjunto de HCDR en una región estructural de la línea germinal humana que comprende DP10. El miembro de unión específica también tiene un dominio VL que comprende un conjunto de LCDR, preferentemente en una región estructural de la línea germinal humana que comprende Vλ1, por ejemplo DPL5. Preferentemente, las CDR son un conjunto de CDR desveladas en el presente documento.

Por “sustancialmente como se explica” se indica que la CDR relevante o dominio VH o VL de la invención será tanto idéntico como altamente similar a las regiones especificadas de las que la secuencia se explica en el presente 65 documento. Por “altamente similar” se contempla que de 1 a 5, preferentemente de 1 a 4, tal como 1 a 3 o 1 o 2, o 3

o 4, sustituciones de aminoácidos pueden prepararse en CDR y/o el dominio VH o VL.

En un aspecto, la presente invención proporciona un miembro de unión específica para NGF, que comprende un

sitio de unión a antígeno del anticuerpo que está compuesto por un dominio VH de anticuerpo humano y un dominio

VL de anticuerpo humano y que comprende un conjunto de CDR, en el que el dominio VH comprende HCDR1,

5 HCDR2 y HCDR3 y el dominio VL comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en el que la HCDR1 tiene la secuencia de

aminoácidos de SEC ID Nº: 193, la HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 194, la HCDR3 tiene

la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 195, la LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 198, la

LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 199 y la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de

SEC ID Nº: 200; o en el que el conjunto de CDR contiene una o dos sustituciones de aminoácidos en comparación 10 con este conjunto de CDR, en el que la una o dos sustituciones están en uno o dos de los siguientes residuos dentro

de las CDR de los dominios VH y/o VL, usando la numeración convencional de Kabat (1991).

31, 34 en HCDR1

15 51, 55, 56, 57, 58, 65 en HCDR2

96 en HCDR3

26, 27, 27A, 27B, 28, 29, 30 en LCDR1 20

56 en LCDR2

90, 94 en LCDR3.

25 En realizaciones preferidas, una o dos sustituciones se hacen en uno o dos de los siguientes residuos dentro del conjunto 1133C11 de CDR según los grupos identificados de posibles residuos sustitutos:

Posición de sustitución Residuo sustituto seleccionado del grupo que consiste en

31 en HCDR1: A

34 en HCDR1: V

51 en HCDR2: V

55 en HCDR2: N

56 en HCDR2: A

57 en HCDR2: V

58 en HCDR2: S

65 en HCDR2: D

96 en HCDR3: N

26 en LCDR1: T

26 en LCDR1: G

27 en LCDR1: N

27 en LCDR1: R

27A en LCDR1: T

27A en LCDR1: P

27B en LCDR1: D

28 en LCDR1: T

29 en LCDR1: E

30 en LCDR1: D

56 en LCDR2: T

90 en LCDR3: A

94 en LCDR3: G

El residuo 29E dentro de LCDR1 es una realización particularmente preferida. 30

Realizaciones preferidas tienen el conjunto 1133C11 o 1252A5, 1152H5, 1165D4 o 1230H7 de CDR.

En una realización, un miembro de unión específica aislado comprende un conjunto de CDR que contiene el conjunto 1133C11 de CDR con la secuencia de aminoácidos FNSALIS (SEC ID Nº: 532) o la secuencia de 5 aminoácidos MISSLQP (SEC ID Nº: 533), sustituido con la secuencia de aminoácidos LNPSLTA (SEC ID Nº: 531) dentro de HCDR3.

Un dominio VH puede proporcionarse con un conjunto de HCDR como se ilustra en la tabla 2a/2b. El dominio VH está emparejado con un dominio VL, el dominio VL puede proporcionarse con un conjunto de LCDR como se ilustra en la tabla 2a/2b. Un emparejamiento de un conjunto de HCDR y un conjunto de LCDR pueden ser como se muestra en la tabla 2a/2b, proporcionando un sitio de unión a antígeno del anticuerpo que comprende un conjunto de CDR como se muestra en la tabla 2a/2b.

Las regiones estructurales del dominio VH y VL comprenden regiones estructurales, una o más de las cuales

15 pueden ser una región estructural mutada en la línea germinal, normalmente línea germinal humana. La región estructural del dominio VH es preferentemente región estructural de la línea germinal de la cadena pesada humana y la región estructural del dominio VL es preferentemente región estructural de la línea germinal de la cadena ligera humana. Pueden seleccionarse regiones estructurales del dominio de la cadena pesada de la familia VH-1 y una región estructural de VH-1 preferida es una región estructural DP-10. Las regiones estructurales de la cadena ligera pueden seleccionarse de la familia λ1 y una región estructural preferida es DPL5.

Una o más CDR pueden tomarse del dominio VH o VL de 1252A5 e incorporarse en una región estructural adecuada. Esto se trata más adelante en el presente documento. Las HCDR 1, 2 y 3 de 1252A5 se muestran en SEC ID Nº: 393, 394, 395 respectivamente. Las LCDR 1, 2 y 3 de 1252A5 se muestran en SEC ID Nº: 398, 399, 400,

25 respectivamente.

Todo esto se aplica igualmente para todas las CDR y conjuntos de CDR como se desvela en el presente documento, especialmente para 1152H5, 1165D4 y 1230H7.

Las secuencias de anticuerpos desveladas en el presente documento incluyen las siguientes:

Un dominio VH, dominio VL, conjunto de HCDR, conjunto de LCDR o conjunto de CDR de: 1126F1 (SEC ID Nº: 102 de VH; SEC ID Nº: 107 de VL), 1126G5 (SEC ID Nº: 112 de VH; SEC ID Nº: 117 de VL), 1126H5 (SEC ID Nº: 122 de VH; SEC ID Nº: 127 de VL), 1127D9 (SEC ID Nº: 132 de VH; SEC ID Nº: 137 de VL), 1127F9 (SEC ID Nº: 142 de 35 VH; SEC ID Nº: 147 de VL), 1131D7 (SEC ID Nº: 152 de VH; SEC ID Nº: 157 de VL), 1131H2 (SEC ID Nº: 162 de VH; SEC ID Nº: 167 de VL), 1132A9 (SEC ID Nº: 172 de VH; SEC ID Nº: 177 de VL), 1132H9 (SEC ID Nº: 182 de VH; SEC ID Nº: 187 de VL), 1133C11 (SEC ID Nº: 192 de VH; SEC ID Nº: 197 de VL), 1134D9 (SEC ID Nº: 202 de VH; SEC ID Nº: 207 de VL), 1145D1 (SEC ID Nº: 212 de VH; SEC ID Nº: 217 de VL), 1146D7 (SEC ID Nº: 222 de VH; SEC ID Nº: 227 de VL), 1147D2 (SEC ID Nº: 232 de VH; SEC ID Nº: 237 de VL), 1147G9 (SEC ID Nº: 242 de VH; SEC ID Nº: 247 de VL), 1150F1 (SEC ID Nº: 252 de VH; SEC ID Nº: 257 de VL), 1152H5 (SEC ID Nº: 262 de VH; SEC ID Nº: 267 de VL), 1155H1 (SEC ID Nº: 272 de VH; SEC ID Nº: 277 de VL), 1158A1 (SEC ID Nº: 282 de VH; SEC ID Nº: 287 de VL), 1160E3 (SEC ID Nº: 292 de VH; SEC ID Nº: 297 de VL), 1165D4 (SEC ID Nº: 302 de VH; SEC ID Nº: 307 de VL), 1175H8 (SEC ID Nº: 312 de VH; SEC ID Nº: 317 de VL), 1211G10 (SEC ID Nº: 322 de VH; SEC ID Nº: 327 de VL), 1214A1 (SEC ID Nº: 332 de VH; SEC ID Nº: 337 de VL), 1214D10 (SEC ID Nº: 342 de

45 VH; SEC ID Nº: 347 de VL), 1218H5 (SEC ID Nº: 352 de VH; SEC ID Nº: 357 de VL), 1230H7 (SEC ID Nº: 362 de VH; SEC ID Nº: 367 de VL), 1083H4 (SEC ID Nº: 22 de VH; SEC ID Nº: 27 de VL), 1227H8 (SEC ID Nº: 372 de VH; SEC ID Nº: 377 de VL) y 1230D8 (SEC ID Nº: 382 de VH; SEC ID Nº: 387 de VL).

En una realización altamente preferida, un dominio VH está provisto de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 192, llamándose este “dominio VH de 1133C11”. En otra realización altamente preferida, un dominio VL está provisto de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 197, llamándose este “dominio VL de 1133C11”. Un sitio de unión a antígeno del anticuerpo altamente preferido proporcionado según la presente invención está compuesto por el dominio VH de 1133C11, SEC ID Nº: 192 y el dominio VL de 1133C11, SEC ID Nº: 197. Este sitio de unión a antígeno del anticuerpo puede proporcionarse dentro de cualquier formato de molécula de anticuerpo deseado, por

55 ejemplo, scFv, Fab, IgG, IgG4 etc., como se trata adicionalmente en cualquier parte en el presente documento.

En otra realización altamente preferida, un dominio VH está provisto de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 392, llamándose este “dominio VH de 1252A5”. En otra realización altamente preferida, un dominio VL está provisto de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 397, llamándose este “dominio VL de 1252A5”. Un sitio de unión a antígeno del anticuerpo altamente preferido proporcionado según la presente invención está compuesto por el dominio VH de 1252A5, SEC ID Nº: 392 y el dominio VL de 1252A5, SEC ID Nº: 397. Este sitio de unión a antígeno del anticuerpo puede proporcionarse dentro de cualquier formato de molécula de anticuerpo deseado, por ejemplo, scFv, Fab, IgG, IgG4 etc., como se trata adicionalmente en cualquier parte en el presente documento.

65 En otra realización altamente preferida, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo IgG4 que comprende el dominio VH de 1252A5, SEC ID Nº: 392 y el dominio VL de 1252A5, SEC ID Nº: 397. Esta se llama en

el presente documento “IgG4 de 1252A5”.

Otra IgG u otras moléculas de anticuerpo que comprenden el dominio VH de 1252A5, SEC ID Nº: 392, y/o el dominio VL de 1252A5, SEC ID Nº: 397, se proporcionan por la presente invención, ya que son otras moléculas de 5 anticuerpo que comprenden el conjunto 1252A5 de HCDR (SEC ID Nºs: 393, 394 y 395) dentro de un dominio VH de anticuerpo, y/o el conjunto 1252A5 de LCDR (SEC ID Nºs: 398, 399 y 400) dentro de un dominio VL de anticuerpo.

Como se observa, la presente invención proporciona un miembro de unión específica que se une a NGF humano y que comprende el dominio VH de 1252A5 (SEC ID Nº: 392) y/o el dominio VL de 1252A5 (SEC ID Nº: 397). Propiedades de un miembro de unión específica tal se desvelan en el presente documento.

Generalmente, un dominio VH está emparejado con un dominio VL para proporcionar un sitio de unión a antígeno del anticuerpo. En una realización preferida, el dominio VH de 1252A5 (SEC ID Nº: 392) está emparejado con el dominio VL de 1252A5 (SEC ID Nº: 397), de manera que se forma un sitio de unión a antígeno del anticuerpo que

15 comprende tanto los dominios VH como VL de 1252A5. Se proporcionan realizaciones análogas para los otros dominios VH y VL desvelados en el presente documento. En otras realizaciones, VH de 1252A5 está emparejado con un dominio VL distinto de VL de 1252A5. La promiscuidad de la cadena ligera está bien establecida en la materia. De nuevo, realizaciones análogas se proporcionan por la invención para los otros dominios VH y VL desvelados en el presente documento.

Están disponibles diversos procedimientos en la materia para obtener anticuerpos contra NGF y que puedan competir con 1252A5 u otra molécula de anticuerpo, una molécula de anticuerpo con 1252A5 u otro conjunto de CDR, o una molécula de anticuerpo con un conjunto de CDR de 1252A5 u otro linaje, para unirse a NGF.

25 Un procedimiento de obtención de uno o más miembros de unión específica capaz de unir el antígeno puede incluir poner en contacto una biblioteca de miembros de unión específica según la invención y dicho antígeno y seleccionar uno o más miembros de unión específica de la biblioteca capaces de unirse a antígeno.

La biblioteca puede expresarse en partículas o complejos moleculares, por ejemplo, paquetes genéticos replicables tales como levadura, partículas bacterianas o de bacteriófago (por ejemplo, T7), o sistema de expresión covalente, ribosómica u otros in vitro, conteniendo cada partícula o complejo molecular ácido nucleico que codifica el dominio variable VH de anticuerpo expresado sobre el mismo y opcionalmente también un dominio VL expresado si está presente.

35 Tras la selección de miembros de unión específica capaces de unirse al antígeno y expresarse sobre bacteriófago u otras partículas o complejos moleculares de biblioteca, puede tomarse ácido nucleico de un bacteriófago u otra partícula o complejo molecular que expresa dicho miembro de unión específica seleccionado. Tal ácido nucleico puede usarse en la posterior producción de un miembro de unión específica o un dominio variable VH o VL de anticuerpo por expresión de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico tomado de un bacteriófago u otra partícula o complejo molecular que expresa dicho miembro de unión específica seleccionado.

La capacidad para unir NGF puede probarse adicionalmente, también la capacidad para competir con, por ejemplo, 1252A5 (por ejemplo, en formato de scFv y/o formato de IgG, por ejemplo IgG4) para unirse a NGF. Puede probarse la capacidad para neutralizar NGF, como se trata adicionalmente más adelante.

45 Un miembro de unión específica según la presente invención puede unirse a NGF con la afinidad de una molécula de anticuerpo 1252A5 u otra molécula de anticuerpo, por ejemplo, scFv, o preferentemente 1252A5 u otra IgG4, o con una afinidad que es mejor.

Un miembro de unión específica según la presente invención puede neutralizar NGF con la potencia de una molécula de anticuerpo 1252A5 u otra molécula de anticuerpo, por ejemplo, scFv, o preferentemente 1252A5 u otra IgG4, o con una potencia que es mejor.

La afinidad de unión y potencia de neutralización de diferentes miembros de unión específica pueden compararse 55 según condiciones apropiadas.

Los anticuerpos de la presente invención tienen varias ventajas con respecto a anticuerpos anti-NGF comercialmente disponibles existentes. Por ejemplo, la presente invención proporciona anticuerpos humanos o mutados en la línea germinal que se espera que muestren un menor grado de inmunogenicidad cuando se administren crónicamente o repetidamente a seres humanos para uso terapéutico o de diagnóstico. Además, la presente invención proporciona anticuerpos que son neutralizadores más potentes de NGF y por tanto, puede lograrse un efecto terapéutico o de diagnóstico deseado usando menos material de anticuerpo. Además, en una realización de la invención, la potencia para la inhibición de la interacción NGF/receptor TrkA es mayor que la observada para la inhibición de la interacción NGF/receptor p75. A este respecto, esto puede conferir ventajas con

65 respecto a otros tratamientos con antagonistas de NGF aparentemente no selectivos, tanto en la magnitud o en la naturaleza del efecto terapéutico alcanzado como en reducir efectos secundarios no deseables.

La invención también proporciona preparaciones heterogéneas que comprenden moléculas de anticuerpo anti-NGF. Por ejemplo, tales preparaciones pueden ser mezclas de anticuerpos con cadenas pesadas de longitud completa y cadenas pesadas que carecen de la lisina del extremo C, con diversos grados de glucosilación y/o con aminoácidos

5 derivatizados, tales como ciclación de un ácido glutámico del extremo N para formar un residuo de ácido piroglutámico.

En otros aspectos, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un miembro de unión específica según la presente invención y procedimientos de preparación de un miembro de unión específica de la invención, que comprenden expresar dicho ácido nucleico en condiciones para provocar la producción de dicho miembro de unión específica y recuperarlo.

En el presente documento se describe ácido nucleico, generalmente aislado, que codifica un dominio variable VH y/o dominio variable VL de anticuerpo desvelado en el presente documento.

15 En el presente documento también se describe ácido nucleico, generalmente aislado, que codifica una secuencia de CDR de VH o CDR de VL desvelada en el presente documento, especialmente una CDR de VH seleccionada de: 1133C11 (SEC ID Nº: 193 de CDR1 de VH, SEC ID Nº: 194 de CDR2 de VH y SEC ID Nº: 195 de CDR3 de VH), 1152H5 (SEC ID Nº: 263 de CDR1 de VH, SEC ID Nº: 264 de CDR2 de VH y SEC ID Nº: 265 de CDR3 de VH) y 1252A5 (SEC ID Nº: 393 de CDR1 de VH, SEC ID Nº: 394 de CDR2 de VH y SEC ID Nº: 395 de CDR3 de VH), o una CDR de VL seleccionada de: 1133C11 (SEC ID Nº: 198 de CDR1 de VL, SEC ID Nº: 199 de CDR2 de VL y SEC ID Nº: 200 de CDR3 de VL), 1152H5 (SEC ID Nº: 268 de CDR1 de VL, SEC ID Nº: 269 de CDR2 de VL y SEC ID Nº: 270 de CDR3 de VL) y 1252A5 (SEC ID Nº: 398 de CDR1 de VL, SEC ID Nº: 399 de CDR2 de VL y SEC ID Nº: 400 de CDR3 de VL), lo más preferentemente CDR3 de VH de 1252A5 (SEC ID Nº: 395). También se desvelan ácido

25 nucleico que codifica el conjunto 1252A5 de CDR, ácido nucleico que codifica el conjunto 1252A5 de HCDR y ácido nucleico que codifica el conjunto 1252A5 de LCDR, ya que son ácidos nucleicos que codifican CDR, HCDR, LCDR individuales y conjuntos de CDR, HCDR, LCDR del linaje 1252A5, 1133C11 o 1021E5.

Otro aspecto proporciona una célula huésped transformada con ácido nucleico de la invención.

Todavía otro aspecto adicional proporciona un procedimiento de producción de miembros de unión específica, procedimiento que incluye provocar la expresión de ácido nucleico codificante. Un procedimiento tal puede comprender cultivar células huésped en condiciones para la producción de dichos miembros de unión.

35 Un procedimiento de producción puede comprender una etapa de aislamiento y/o purificación del producto. Un procedimiento de producción puede comprender formular el producto en una composición que incluye al menos un componente adicional, tal como un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En el presente documento se describen composiciones que contienen miembros de unión específica de la invención y su uso en procedimientos para inhibir o neutralizar NGF, que incluye procedimientos de tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia.

Los miembros de unión específica según la invención puede usarse en un procedimiento de tratamiento o diagnóstico del cuerpo humano o animal, tal como un procedimiento de tratamiento (que puede incluir tratamiento

45 profiláctico) de una enfermedad o trastorno en un paciente humano que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un miembro de unión específica de la invención. Condiciones tratables según la presente invención incluyen cualquiera en la que NGF desempeñe una función, especialmente dolor, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar, otras enfermedades de inflamación de las vías respiratorias, neuropatía diabética, VIH, arritmias cardíacas, artritis, psoriasis y cáncer.

Estos y otros aspectos de la invención se describen en más detalle más adelante.

Terminología

55 Es conveniente señalar aquí que “y/o” cuando se usan en el presente documento debe considerarse divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo “A y/o B” debe considerarse divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, así como si cada uno se explicara individualmente en el presente documento.

NGF

NGF (también conocido como beta-NGF) es factor de crecimiento nervioso. En el contexto de la presente invención, NGF es normalmente NGF humano, aunque puede ser NGF no humano (por ejemplo NGF de primate no humano y/o NGF de rata y/o NGF de ratón). NGF también se denomina en sitios “el antígeno”.

65 El NGF usado en un ensayo descrito en el presente documento es normalmente NGF humano, de rata o de ratón, pero podría usarse NGF de otro animal no humano, por ejemplo, NGF de primate no humano.

Dolor

5 Describe, como es muy conocido en la técnica, sensación de dolor y puede englobar uno o más, o todos, de los siguientes:

-

hiperalgesia (respuesta de dolor exagerado a un estímulo normalmente doloroso);

-

alodinia (sensación de dolor producida por un estímulo que normalmente no es doloroso);

-

sensación espontánea de dolor producida por cualquier mecanismo en ausencia de cualquier influencia externa evidente;

15 - dolor provocado por estímulos físicos, tales como temperatura, calor, frío, presión, vibración, toque estático o dinámico, o postura y movimiento del cuerpo;

-

dolor somático y visceral producido por cualquier mecanismo, por ejemplo, traumatismo, infección, inflamación, enfermedad metabólica, accidente cerebrovascular o enfermedad neurológica.

El dolor puede ser, por ejemplo, dolor agudo, dolor breve, dolor nociceptivo persistente o dolor neuropático persistente o crónico.

Miembro de unión específica

25 Describe un miembro de un par de moléculas que tienen especificidad de unión entre sí. Los miembros de un par de unión específica pueden derivarse naturalmente o producirse completa o parcialmente sintéticamente. Un miembro del par de moléculas tiene un área sobre su superficie, o una cavidad, que se une específicamente a y es, por tanto, complementaria a una organización espacial y polar particular del otro miembro del par de moléculas. Así, los miembros del par tienen la propiedad de unirse específicamente entre sí. Ejemplos de tipos de pares de unión específica son antígeno-anticuerpo, biotina-avidina, hormona-receptor de hormona, receptor-ligando, enzimasustrato. La presente invención se refiere a reacciones del tipo antígeno-anticuerpo.

Un miembro de unión específica normalmente comprende una molécula que tiene un sitio de unión a antígeno. Por 35 ejemplo, un miembro de unión específica puede ser una molécula de anticuerpo.

Además de secuencias de anticuerpos y/o un sitio de unión a antígeno, un miembro de unión específica según la presente invención puede comprender otros aminoácidos, por ejemplo, que forman un péptido o polipéptido, tal como un dominio plegado, o para conferir a la molécula otra característica funcional, además de la capacidad para unirse a antígeno. Los miembros de unión específica de la invención pueden llevar una marca detectable, o pueden conjugarse con una toxina o un resto o enzima que elige diana (por ejemplo, mediante un enlace peptidilo o ligador). Por ejemplo, un miembro de unión específica puede comprender un sitio catalítico (por ejemplo, en un dominio de enzima), además de un sitio de unión a antígeno, en el que el sitio de unión a antígeno se une al antígeno y así elige como diana el sitio catalítico para el antígeno. El sitio catalítico puede inhibir la función biológica del antígeno, por

45 ejemplo, por escisión.

La estructura para llevar una CDR o un conjunto de CDR de la invención será generalmente de una secuencia de la cadena pesada o ligera de anticuerpo o porción sustancial de la misma en la que la CDR o conjunto de CDR están localizados en una localización correspondiente a la CDR o conjunto de CDR de dominios variables de anticuerpos VH y VL que se producen naturalmente codificados por genes de inmunoglobulina reorganizados. Las estructuras y localizaciones del dominio variable de inmunoglobulinas pueden determinarse por referencia a (Kabat y col., 1987 y actualizaciones del mismo, ahora disponibles en internet (http://immuno.bme.nwu.edu o buscar “Kabat” usando cualquier motor de búsqueda).

55 Molécula de anticuerpo

Describe una inmunoglobulina tanto natural como parcialmente o completamente sintéticamente producida. El término también cubre cualquier polipéptido o proteína que comprenda un sitio de unión a antígeno del anticuerpo. Fragmentos de anticuerpos que comprenden un sitio de unión a antígeno del anticuerpo son moléculas tales como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; y diacuerpos.

Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos y usar técnicas de tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que retienen la especificidad del anticuerpo original. Tales técnicas pueden implicar introducir ADN que codifica la región variable de la inmunoglobulina, o las CDR, de un 65 anticuerpo para las regiones constantes, o regiones constantes más regiones estructurales, de una inmunoglobulina diferente. Véanse, por ejemplo, los documentos EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400 y abundante

bibliografía posterior. Un hibridoma u otra célula que produce un anticuerpo puede someterse a mutación genética u otros cambios, que pueden o no pueden alterar la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.

Como los anticuerpos pueden modificarse de varias formas, el término “molécula de anticuerpo” debe interpretarse

5 que cubre cualquier miembro de unión específica o sustancia que tiene un sitio de unión a antígeno del anticuerpo con la especificidad requerida. Así, este término cubre fragmentos de anticuerpos y derivados, que incluyen cualquier polipéptido que comprenda un sitio de unión a antígeno del anticuerpo, tanto natural como completamente

o parcialmente sintético. Por tanto, están incluidas moléculas quiméricas que comprenden un sitio de unión a

antígeno del anticuerpo, o equivalente, fusionado con otro polipéptido. La clonación y expresión de anticuerpos 10 quiméricos se describe en los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023 y abundante bibliografía posterior.

Otras técnicas disponibles en la materia de la ingeniería de anticuerpos han hecho posible aislar anticuerpos humanos y humanizados. Por ejemplo, pueden prepararse hibridomas humanos como se describe por Kontermann y Dubel (2001). La expresión en fago, otra técnica establecida para generar miembros de unión específica, se ha

15 descrito en detalle en muchas publicaciones tales como Kontermann y Dubel (2001) y el documento WO 92/01047 (tratado adicionalmente más adelante). Pueden usarse ratones transgénicos en los que los genes de anticuerpo de ratón se inactivan y sustituyen funcionalmente con genes de anticuerpo humano, mientras que dejen intactos otros componentes del sistema inmunitario del ratón, para aislar anticuerpos humanos (Mendez y col., 1997).

20 Pueden crearse moléculas de anticuerpo sintéticas por expresión de genes generados por medio de oligonucleótidos sintetizados y ensamblarse dentro de vectores de expresión adecuados, por ejemplo, como se describe por Knappik y col. (2000) o Krebs y col. (2001).

Se ha mostrado que fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de unirse a antígenos.

25 Ejemplos de fragmentos de unión son (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un anticuerpo individual; (iv) el fragmento dAb (Ward, 1989; McCafferty y col., 1990; Holt y col., 2003), que consiste en un dominio VH o VL; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados (vii) moléculas Fv monocatenarias (scFv), en las que un dominio VH y un dominio VL

30 están ligados por un péptido ligador que permite que se asocien los dos dominios para formar un sitio de unión a antígeno (Bird y col., 1988; Huston y col., 1988); (viii) dímeros Fv monocatenarios biespecíficos (documento PCT/US92/09965) y (ix) “diacuerpos”, fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión de genes (documento WO 94/1380; Holliger y col., 1993). Las moléculas Fv, scFv o de diacuerpo pueden estabilizarse por la incorporación de puentes disulfuro que enlazan los dominios VH y VL (Reiter y col., 1996). También pueden

35 prepararse minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 (Hu y col., 1996).

Si van a usarse anticuerpos biespecíficos, estos pueden ser anticuerpos biespecíficos convencionales que pueden fabricarse en una variedad de formas (Holliger y Winter, 1993), por ejemplo, prepararse químicamente o a partir de hibridomas híbridos, o pueden ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpos biespecíficos mencionados

40 anteriormente. Ejemplos de anticuerpos biespecíficos incluyen aquellos de la tecnología BiTETM en la que pueden usarse los dominios de unión de dos anticuerpos con diferente especificidad y ligarse directamente mediante péptidos flexibles cortos. Esto combina dos anticuerpos sobre una única cadena de polipéptidos corta. Los diacuerpos y scFv pueden construirse sin una región Fc, usando solamente dominios variables, reduciendo posiblemente los efectos de reacción antiidiotípica.

45 Los diacuerpos biespecíficos, a diferencia de los anticuerpos completos biespecíficos, también puede ser particularmente útiles debido a que pueden construirse fácilmente y expresarse en E. coli. Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos, tales como fragmentos de anticuerpos) de especificidades de unión apropiadas pueden seleccionarse fácilmente usando expresión en fago (documento WO 94/13804) de bibliotecas. Si un brazo del

50 diacuerpo va a mantenerse constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra NGF, entonces puede prepararse una biblioteca en la que el otro brazo se varía y se selecciona un anticuerpo de especificidad apropiada. Los anticuerpos completos biespecíficos pueden prepararse por manipulación de botones en ojales (Ridgeway y col., 1996).

55 Sitio de unión a antígeno

Describe la parte de una molécula que se une a y es complementaria a todo o parte del antígeno diana. En una molécula de anticuerpo se denomina el sitio de unión a antígeno del anticuerpo y comprende la parte del anticuerpo que se une específicamente a y es complementaria a todo o parte del antígeno diana. Si un antígeno es grande, un

60 anticuerpo puede solo unirse a una parte particular del antígeno, parte que se denomina un epítope. Un sitio de unión a antígeno del anticuerpo puede estar provisto de uno o más dominios variables de anticuerpo. Preferentemente, un sitio de unión a antígeno del anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL) y una región variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH).

65 Específico

Puede usarse para referirse a la situación en la que un miembro de un par de unión específica no mostrará ninguna unión significativa a moléculas distintas de su(s) componente(s) de unión específica. El término también es aplicable si, por ejemplo, un sitio de unión a antígeno es específico para un epítope particular que es llevado por varios antígenos, en cuyo caso el miembro de unión específica que lleva el sitio de unión a antígeno podrá unirse a los

5 diversos antígenos que llevan el epítope.

Aislado

Se refiere al estado en el que miembros de unión específica de la invención, o ácido nucleico que codifica tales miembros de unión, estarán generalmente según la presente invención. Miembros aislados y ácido nucleico aislado estarán libres o sustancialmente libres de material con el que están naturalmente asociados tales como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los que se encuentran en su entorno natural, o el entorno en el que se preparan (por ejemplo, cultivo celular) cuando tal preparación es por tecnología de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo. Los miembros y el ácido nucleico pueden formularse con diluyentes o adyuvantes e incluso aislarse para fines

15 prácticos -por ejemplo, los miembros se mezclarán normalmente con gelatina u otros vehículos si se usan para recubrir placas de microtitulación para su uso en inmunoensayos, o se mezclarán con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se usen en diagnóstico o terapia. Los miembros de unión específica pueden estar glucosilados, tanto naturalmente como por sistemas de células eucariotas heterólogas (por ejemplo, células CHO o NS0 (ECACC 85110503), o pueden estar sin glucosilar (por ejemplo, si se producen por expresión en una célula procariota).

Descripción detallada

Como se observa anteriormente, un miembro de unión específica según la presente invención neutraliza 25 preferentemente NGF. El grado al que un anticuerpo neutraliza NGF se denomina su potencia neutralizante.

La potencia se expresa normalmente como un valor de CI50, en nM, a menos que se establezca de otro modo. La CI50 es la concentración inhibidora media de una molécula de anticuerpo. En ensayos funcionales, la CI50 es la concentración que reduce una respuesta biológica el 50% de su máximo. En estudios de unión a ligando, la CI50 es la concentración que reduce la unión del receptor el 50% del nivel de unión específica máxima.

La CI50 puede calcularse representando el % de respuesta biológica (representada, por ejemplo, por movilización de ion calcio en un ensayo FLIPR, por supervivencia en un ensayo de PC12 o por proliferación en un ensayo de proliferación de TF-1) o % de unión de receptor específica en función del logaritmo de la concentración del miembro

35 de unión específica y usando un programa de software tal como Prism (GraphPad) para ajustar una función sigmoide a los datos para generar valores de CI50, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 2, 5, 6 o 9 en el presente documento.

Un miembro de unión específica según la presente invención inhibe preferentemente la movilización de calcio intracelular provocada por NGF humano en células que expresan receptor TrkA, por ejemplo, células recombinantemente transfectadas con un gen TrkA, por ejemplo células HEK. En un ensayo “FLIPR” de movilización de calcio como se describe en el ejemplo 2 en el presente documento, un miembro de unión específica según la invención tiene preferentemente una potencia (CI50) para neutralizar NGF humano de o inferior a 600, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nM. Normalmente, un miembro de unión específica de la invención tiene una potencia de

45 5 nM o menos, preferentemente 2,5 nM o menos, más preferentemente 1 nM o menos. En realizaciones particularmente preferidas, la potencia es 0,5 nM o menos, por ejemplo 0,4 nM o menos; 0,3 nM o menos; 0,2 nM o menos; o 0,15 nM o menos. En algunas realizaciones, la potencia puede ser aproximadamente 0,1 nM.

La potencia puede estar entre 0,1-100 nM, 0,1-50 nM, 0,1-10 nM o 0,1-1,0 nM. Por ejemplo, la potencia puede ser 0,1-5,0 nM, 0,2-5,0 nM, 0,3-5,0 nM o 0,3-0,4 nM.

En algunas realizaciones de la invención, la potencia neutralizante de un miembro de unión específica de potencia no optimizada en un ensayo de células HEK como se describe en el presente documento es aproximadamente 1,8 a 560 nM para NGF humano y/o aproximadamente 2,9 a 620 nM para NGF de rata. En algunas realizaciones, la

55 potencia neutralizante de miembros de unión de potencia no optimizada en ensayos de células HEK como se describe en el presente documento es aproximadamente 0,12 a 120 nM para NGF humano, aproximadamente 0,11 a 37 nM para NGF de rata y aproximadamente 0,11 a 71 nM para NGF de ratón. Sin embargo, estos son solo ejemplos y pueden lograrse mayores potencias. Aunque la optimización de potencia puede usarse para generar miembros de unión específica de mayor potencia de un miembro de unión específica dado, también se observa que pueden obtenerse miembros de unión específica de alta potencia incluso sin optimización de potencia.

Un miembro de unión específica según la presente invención inhibe preferentemente la supervivencia de células PC12 privadas de suero mantenidas en NGF. La potencia neutralizante de un miembro de unión específica de la presente invención en un ensayo de supervivencia de PC12 para NGF humano como se describe en el presente 65 documento en el ejemplo 5 es generalmente 1500 nM o menos y es preferentemente 50 nM o menos, o 10 nM o menos. Como se ha explicado anteriormente y como se demuestra en el presente documento, la optimización de

potencia puede usarse para lograr mayores potencias anti-NGF. Preferentemente, un miembro de unión específica tiene una potencia de o inferior a 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1,5 nM, 1 nM o 0,5 nM. En algunas realizaciones, la potencia es aproximadamente 0,1 nM o más, 0,2 nM o más. Así, la potencia puede estar entre 0,1 o 0,2 nM y 0,5, 1,5, 5 o 50 nM.

5 En algunas realizaciones de la invención, la potencia neutralizante de un miembro de unión específica de potencia optimizada en un ensayo de supervivencia de PC12 como se describe en el presente documento es aproximadamente 0,2 a 670 nM para NGF humano y es aproximadamente 0,2 a 54 nM para NGF de rata.

Un miembro de unión específica según la presente invención inhibe preferentemente la proliferación de células TF-1 estimulada por NGF. La potencia neutralizante de un miembro de unión específica (normalmente un miembro de unión específica de potencia optimizada) de la presente invención en un ensayo de proliferación de TF-1 para NGF humano como se describe en el presente documento en el ejemplo 6 es generalmente 5 nM o menos, preferentemente 1 nM o menos. Preferentemente, un miembro de unión específica de la invención tiene una

15 potencia de o inferior a 0,7, 0,6, 0,5, 0,45, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 nM para NGF humano. Por ejemplo, la potencia puede estar entre 0,05 - 0,1 nm, 0,05 - 0,2 nM, 0,05 - 0,3 nM, 0,05 - 0,4 nM, o 0,05 - 0,5 nM.

En algunas realizaciones de la invención, la potencia neutralizante de un miembro de unión específica de potencia optimizada en un ensayo de proliferación de TF-1 como se describe en el presente documento es aproximadamente 0,08 a 0,7 nM para NGF humano, aproximadamente 0,07 a 1,9 nM para NGF de rata y aproximadamente 0,07 a 1,4 nM para NGF de ratón.

Un miembro de unión específica según la presente invención inhibe preferentemente la unión de NGF a un receptor TrkA y/o p75, preferentemente un receptor TrkA y/o p75 humano. La invención también se extiende más

25 generalmente a un miembro de unión específica que bloquea preferencialmente la unión de NGF a receptor TrkA con respecto a la unión de NGF a receptor p75. La potencia neutralizante de un miembro de unión específica (normalmente un miembro de unión específica de potencia optimizada) de la presente invención en ensayo de unión a receptor TrkA como se describe en el presente documento en el ejemplo 9 es generalmente 2,5 nM o menos, preferentemente 1 nM o menos para neutralizar NGF humano. Preferentemente, un miembro de unión específica de la invención tiene una potencia de o inferior a 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 o 0,075 nM para neutralizar NGF humano que se une a TrkA. Por ejemplo, la potencia puede estar entre 0,05 - 0,1 nm, 0,05 - 0,2 nM, 0,05 - 0,3 nM, 0,05 - 0,4 nM, o 0,05 - 0,5 nM.

La potencia neutralizante de un miembro de unión específica (normalmente un miembro de unión específica de

35 potencia optimizada) de la presente invención en un ensayo de unión a receptor p75 como se describe en el presente documento en el ejemplo 9 es generalmente 1,5 nM o menos, preferentemente 1 nM o menos para neutralizar NGF humano. Preferentemente, un miembro de unión específica de la invención tiene una potencia de o inferior a 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 nM para neutralizar NGF humano que se une a p75. Por ejemplo, la potencia puede estar entre 0,1 - 0,2 nM, 0,1 - 0,3 nM, 0,1 - 0,4 nM, 0,1 - 0,5 nM, o 0,1 - 0,6 nM.

Algunos miembros de unión específica preferidos según la presente invención inhiben NGF (por ejemplo, NGF humano y/o de rata) que se une a receptor TrkA preferencialmente con respecto a la unión de NGF a receptor p75. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un miembro de unión específica de la invención tiene una menor constante de inhibición de la unión, Ki, para la inhibición de NGF (por ejemplo, NGF humano y/o de rata) que se une

45 a TrkA que para la unión de NGF a p75. Ki puede calcularse usando la fórmula explicada en el ejemplo 9. Alternativamente, las constantes de inhibición de la unión pueden expresarse como pKi, que puede calcularse como -log10Ki. Así, un miembro de unión específica de la invención tiene preferentemente un mayor valor de pKi para la inhibición de la unión de NGF a TrkA que a p75.

Preferentemente, un miembro de unión específica según la invención se une a NGF humano y/o NGF de rata con una afinidad de o inferior a 1, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3 o 0,2 nM. Por ejemplo, un miembro de unión específica puede unirse a NGF humano con una afinidad de aproximadamente 0,25-0,44 nM y NGF de rata con una afinidad de aproximadamente 0,25-0,70 nM.

55 Como se observa anteriormente, variantes de moléculas de anticuerpo desveladas en el presente documento pueden producirse y usarse en la presente invención. Siguiendo el camino de la química computacional en la aplicación de técnicas de análisis de datos multifactoriales para las relaciones de estructura/propiedad-actividad (Wo ld y col. 1984), las relaciones de actividad cuantitativa-propiedad de anticuerpos pueden derivarse usando técnicas matemáticas muy conocidas tales como regresión estadística, reconocimiento de patrones y clasificación (Norman y col. 1998; Kandel y Backer, 1995; Krzanowski, 2000; Witten y Frank, 1999; Denison (Ed), 2002; Ghose y Viswanadhan). Las propiedades de anticuerpos pueden derivarse de modelos empíricos y teóricos (por ejemplo, análisis de residuos probablemente de contacto o propiedad fisicoquímica calculada) de secuencia de anticuerpos, estructuras funcionales y tridimensionales y estas propiedades pueden considerarse individualmente y en combinación.

65 Un sitio de unión a antígeno del anticuerpo compuesto por un dominio VH y un dominio VL está formado por seis bucles de polipéptido: tres del dominio variable de la cadena ligera (VL) y tres del dominio variable de la cadena pesada (VH). El análisis de anticuerpos de estructura atómica conocida ha elucidado relaciones entre la secuencia y estructura tridimensional de sitios de unión a anticuerpos (Chothia y col. 1992; Al-Lazikani y col. 1997). Estas relaciones implican que, salvo la tercera región (bucle) en dominios VH, los bucles de sitio de unión tienen uno de un

5 número pequeño de conformaciones de la cadena principal: estructuras canónicas. Se ha mostrado que la estructura canónica formada en un bucle particular se determina por su tamaño y la presencia de ciertos residuos en sitios clave en tanto el bucle como en regiones estructurales (Chothia y col. y Al-Lazikani y col., arriba).

Este estudio de relación secuencia-estructura puede usarse para la predicción de aquellos residuos en un anticuerpo de secuencia conocida, pero de una estructura tridimensional desconocida, que son importantes en el mantenimiento de la estructura tridimensional de sus bucles de CDR y de ahí en mantener la especificidad de unión. Estas predicciones pueden confirmarse por comparación de las predicciones con la salida de los experimentos de optimización realizados. En un enfoque estructural puede crearse un modelo teórico de la molécula de anticuerpo (Chothia y col. 1986) usando cualquier paquete libremente disponible o comercial, tal como WAM (Whitelegg y Rees, 15 2000). Entonces, un paquete de software de visualización y análisis de proteínas tal como Insight II (Accelerys, Inc.)

o Deep View (Guex y Peitsch, 1997) puede usarse para evaluar posibles sustituciones en cada posición en CDR y FR. Esta información puede luego usarse para hacer sustituciones que probablemente tienen un efecto mínimo o beneficioso sobre la actividad.

Las técnicas requeridas para hacer sustituciones dentro de secuencias de aminoácidos de CDR, dominios VH o VL de anticuerpos y anticuerpos específicos están disponibles generalmente en la materia. Pueden hacerse secuencias de variantes, con sustituciones que pueden o pueden no ser predichas por tener un efecto mínimo o beneficioso sobre la actividad y probarse para la capacidad para unirse y/o neutralizar NGF y/o para cualquier otra propiedad deseada.

25 Las variantes de secuencias de aminoácidos del dominio variable de cualquiera de los dominios VH y VL cuyas secuencias se han desvelado específicamente en la presente memoria pueden emplearse según la presente invención, como se trata. Variantes particulares pueden incluir una o más alteraciones de secuencias de aminoácidos (adición, deleción, sustitución y/o inserción de un residuo de aminoácido), pueden ser inferiores a aproximadamente 20 alteraciones, inferiores a aproximadamente 15 alteraciones, inferiores a aproximadamente 10 alteraciones o inferiores a aproximadamente 5 alteraciones, pueden ser 5, 4, 3, 2 o 1. Las alteraciones pueden hacerse en una o más regiones estructurales y/o una o más CDR.

Preferentemente, las alteraciones no producen la pérdida de función, así un miembro de unión específica que

35 comprende una secuencia de aminoácidos así alterada retiene preferentemente una capacidad para unirse a y/o neutralizar NGF. Más preferentemente, retiene la misma capacidad de unión y/o neutralizante cuantitativa que un miembro de unión específica en el que no se hace la alteración, por ejemplo, como se mide en un ensayo descrito en el presente documento. Lo más preferentemente, el miembro de unión específica que comprende una secuencia de aminoácidos así alterada tiene una capacidad mejorada para unirse a o neutralizar NGF.

La alteración puede comprender sustituir uno o más residuos de aminoácidos con un aminoácido que no se produce naturalmente o no convencional, modificar uno o más residuos de aminoácidos en una forma que no se produzca naturalmente o no convencional, o insertar uno o más aminoácidos que no se producen naturalmente o no convencionales en la secuencia. Números y localizaciones preferidos de alteraciones en secuencias de la invención 45 se describen en cualquier parte en el presente documento. Los aminoácidos que se producen naturalmente incluyen los 20 L-aminoácidos “convencionales” identificados G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E por sus códigos de una sola letra convencionales. Los aminoácidos no convencionales incluyen cualquier otro residuo que pueda incorporarse en un esqueleto de polipéptido o resultar de modificación de un residuo de aminoácido existente. Los aminoácidos no convencionales pueden producirse naturalmente o no producirse naturalmente. Varios aminoácidos no convencionales que se producen naturalmente se conocen en la técnica, tales como 4hidroxiprolina, 5-hidroxilisina, 3-metilhistidina, N-acetilserina, etc. (Voet y Voet, 1995). Aquellos residuos de aminoácidos que se derivatizan en su posición N-alfa solo se localizarán en el extremo N de una secuencia de aminoácidos. Normalmente en la presente invención, un aminoácido es un L-aminoácido, pero en algunas realizaciones puede ser un D-aminoácido. Por tanto, la alteración puede comprender modificar un L-aminoácido en,

55 o sustituirlo con, un D-aminoácido. También se conocen formas metiladas, acetiladas y/o fosforiladas de aminoácidos y aminoácidos en la presente invención pueden someterse a tal modificación.

Las secuencias de aminoácidos en dominios de anticuerpo y miembros de unión específica de la invención pueden comprender aminoácidos no naturales o no convencionales descritos anteriormente. En algunas realizaciones, los aminoácidos no convencionales (por ejemplo, D-aminoácidos) pueden incorporarse en una secuencia de aminoácidos durante la síntesis, mientras que en otras realizaciones los aminoácidos no convencionales pueden introducirse por modificación o sustitución de los aminoácidos convencionales “originales” después de la síntesis de la secuencia de aminoácidos.

65 El uso de aminoácidos no convencionales y/o que no se producen naturalmente aumenta la diversidad estructural y funcional y así pueden aumentar las posibilidades de conseguir la unión de NGF deseada y neutralizar propiedades en un miembro de unión específica de la invención. Adicionalmente, se ha mostrado que los D-aminoácidos y análogos tienen mejores perfiles farmacocinéticos en comparación con L-aminoácidos convencionales, debido a la degradación in vivo de polipéptidos que tienen L-aminoácidos después de la administración a un animal.

5 Como se observa anteriormente, una secuencia de aminoácidos de CDR sustancialmente como se explica en la presente memoria es llevada preferentemente como una CDR en un dominio variable humano o una porción sustancial del mismo. Las secuencias de HCDR3 sustancialmente como se explican en la presente memoria representan realizaciones preferidas de la presente invención y se prefiere que cada una de estas sea llevada como una HCDR3 en un dominio variable de la cadena pesada humana o una porción sustancial del mismo.

Los dominios variables empleados en la invención pueden obtenerse o derivarse de cualquier línea germinal o dominio variable humano reorganizado, o puede ser un dominio variable sintético basado en secuencias consenso o reales de dominios variables humanos conocidos. Una secuencia de CDR de la invención (por ejemplo, CDR3) puede introducirse en un repertorio de dominios variables que carece de una CDR (por ejemplo, CDR3) usando

15 tecnología de ADN recombinante.

Por ejemplo, Marks y col. (1992) describen procedimientos de producción de repertorios de dominios variables de anticuerpos en los que cebadores consenso dirigidos a o adyacentes al extremo 5' del área del dominio variable se usan conjuntamente con cebadores consenso para la tercera región estructural de genes de VH humanos para proporcionar un repertorio de dominios variables VH que carece de una CDR3. Marks y col. describen adicionalmente cómo este repertorio puede combinarse con una CDR3 de un anticuerpo particular. Usando técnicas análogas, las secuencias derivadas de CDR3 de la presente invención pueden barajarse con repertorios de dominios VH o VL que carecen de una CDR3 y los dominios VH o VL completos barajados combinarse con un dominio VL o VH relacionado para proporcionar miembros de unión específica de la invención. Entonces, el

25 repertorio puede expresarse en un sistema huésped adecuado, tal como el sistema de expresión en fago del documento WO 92/01047 o cualquiera de la abundante bibliografía posterior, que incluye Kay, Winter y McCafferty (1996), de manera que puedan seleccionarse miembros de unión específica adecuados. Un repertorio puede consistir en de 104 miembros individuales hacia arriba, por ejemplo, de 106 a 108 o 1010 miembros. Otros sistemas huésped adecuados incluyen expresión en levadura, expresión bacteriana, expresión en T7, expresión en ribosomas y expresión covalente.

Técnicas de barajado o combinatorias análogas también se desvelan por Stemmer (1994), que describe la técnica en relación con un gen β-lactamasa, pero observa que el enfoque puede usarse para la generación de anticuerpos.

35 Otra alternativa es generar regiones VH o VL novedosas que llevan secuencias derivadas de CDR de la invención usando mutagénesis al azar de uno o más genes de VH y/o VL seleccionados para generar mutaciones dentro del dominio variable entero. Una técnica tal se describe por Gram y col. (1992), que usó PCR propensa a error. En realizaciones preferidas, una o dos sustituciones de aminoácidos se hacen dentro de un conjunto de HCDR y/o LCDR.

Otro procedimiento que puede usarse es dirigir mutagénesis a regiones CDR de genes de VH o VL. Tales técnicas se desvelan por Barbas y col. (1994) y Schier y col. (1996).

Todas las técnicas anteriormente descritas se conocen como tales en la materia y el experto podrá usar tales 45 técnicas para proporcionar miembros de unión específica de la invención usando metodología rutinaria en la materia.

Un sitio de unión a antígeno del anticuerpo específico para antígeno de NGF puede obtenerse por el procedimiento que comprende proporcionar a modo de adición, deleción, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH explicado en el presente documento un dominio VH que es una variante de secuencia de aminoácidos del dominio VH, combinar el dominio VH así proporcionado con uno o más dominios VL y probar la combinación o combinaciones de VH/VL para identificar un miembro de unión específica o un sitio de unión a antígeno del anticuerpo específico para antígeno de NGF y opcionalmente con una o más propiedades preferidas, preferentemente capacidad para neutralizar actividad de NGF. Dicho dominio VL puede tener una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente como se explica en el presente documento.

55 Puede emplearse un procedimiento análogo en el que una o más variantes de secuencia de un dominio VL desvelado en el presente documento se combinan con uno o más dominios VH.

En una realización preferida, el dominio VH de 1252A5 (SEC ID Nº: 392) puede someterse a mutación para proporcionar una o más variantes de secuencias de aminoácidos del dominio VH, opcionalmente combinadas con VL de 1252A5 (SEC ID Nº: 397).

Una porción sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina comprenderá al menos las tres regiones CDR, junto con sus regiones estructurales intervinientes. Preferentemente, la porción también incluirá al menos 65 aproximadamente el 50% de cualquiera o ambas de la primera y cuarta regiones estructurales, siendo el 50% el 50% del extremo C de la primera región estructural y el 50% del extremo N de la cuarta región estructural. Residuos

adicionales en el extremo N o extremo C de la parte sustancial del dominio variable pueden ser aquellos normalmente no asociados a regiones de dominios variables que se producen naturalmente. Por ejemplo, la construcción de miembros de unión específica de la presente invención hechos por técnicas de ADN recombinante puede producir la introducción de residuos del extremo N o C codificados por ligadores introducidos para facilitar la

5 clonación u otras etapas de manipulación. Otras etapas de manipulación incluyen la introducción de ligadores para unir dominios variables de la invención con secuencias de proteínas adicionales que incluyen regiones constantes de anticuerpos, otros dominios variables (por ejemplo, en la producción de diacuerpos) o marcas detectables/funcionales como se trata en más detalle en cualquier parte en el presente documento.

10 Los miembros de unión específica de la presente invención pueden comprender además regiones constantes de anticuerpos o partes de las mismas, preferentemente regiones constantes de anticuerpos humanos o partes de las mismas. Por ejemplo, un dominio VL puede unirse en su extremo C a los dominios constantes de la cadena ligera del anticuerpo que incluyen cadenas Cκ o Cλ humanas, preferentemente cadenas Cλ. Similarmente, un miembro de unión específica basado en un dominio VH puede unirse en su extremo C a toda o parte (por ejemplo, un dominio

15 CH1) de una cadena pesada de la inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE e IgM y cualquiera de las subclases de isotipo, particularmente IgG1 y IgG4. Se prefiere IgG4. Se prefiere IgG4 debido a que no se une al complemento y no crea funciones efectoras. Cualquier variante de la región sintética u otra constante que tenga estas propiedades y estabilice regiones variables también se prefiere para su uso en realizaciones de la presente invención.

20 Los miembros de unión específica de la invención pueden marcarse con una marca detectable o funcional. Marcas detectables incluyen radiomarcas tales como 131I o 99Tc, que pueden unirse a anticuerpos de la invención usando química convencional conocida en la técnica de obtención de imágenes de anticuerpos. Las marcas también incluyen marcas de enzima tales como peroxidasa de rábano picante. Las marcas incluyen adicionalmente restos

25 químicos tales como biotina que pueden detectarse mediante unión a un resto detectable relacionado específico, por ejemplo, avidina marcada.

Los miembros de unión específica de la presente invención se diseñan para ser usados en procedimientos de diagnóstico o tratamiento en sujetos humanos o animales, preferentemente humanos.

30 Por consiguiente, otros aspectos de la invención proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un miembro de unión específica tal y el uso de un miembro de unión específica tal en la fabricación de un medicamento para administración, por ejemplo, en un procedimiento de preparación de un medicamento o composición farmacéutica que comprende formular el miembro de unión específica con un excipiente farmacéuticamente

35 aceptable.

Indicaciones clínicas en las que un anticuerpo anti-NGF puede usarse para proporcionar beneficio terapéutico incluyen dolor, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar, otras enfermedades de inflamación de las vías respiratorias, neuropatía diabética, artritis, psoriasis, arritmias cardíacas, VIH y cáncer. Como

40 ya se ha explicado, el tratamiento anti-NGF se indica para todas estas enfermedades.

El tratamiento anti-NGF puede administrarse por vía oral, por inyección (por ejemplo, subcutáneamente, intravenosamente, intraperitoneal o intramuscularmente), por inhalación, por la vía intravesicular (instilación en la vejiga urinaria), o tópicamente (por ejemplo, intraocular, intranasal, rectal, en heridas, sobre la piel). La vía de

45 administración puede determinarse por las características fisicoquímicas del producto, por consideraciones especiales para la enfermedad o por el requisito para optimizar la eficacia o para minimizar efectos secundarios.

Se prevé que el tratamiento anti-NGF no se limite al uso en clínica. Por tanto, también se prefiere inyección subcutánea usando dispositivo sin aguja.

50 Los tratamientos de combinación pueden usarse para proporcionar efectos sinérgicos significativos, particularmente la combinación de un miembro de unión específica anti-NGF con uno o varios de otros fármacos. Un miembro de unión específica según la presente invención puede proporcionarse en combinación o adición con agentes analgésicos de acción corta o de acción prolongada, antiinflamatorios, antialérgicos, antiasmáticos, antifibróticos,

55 antivirales, quimioterapéuticos y agentes inmunoterapéuticos.

El tratamiento de combinación con uno o más analgésicos de acción corta o de acción prolongada y/o agentes antiinflamatorios tales como opioides y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) puede emplearse para el tratamiento de afecciones caracterizadas por dolor y/o inflamación, por ejemplo, artritis reumatoide o dolor

60 posquirúrgico. Los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse en combinación con terapias antiasmáticas, antialérgicas o antifibróticas tales como agonistas adrenoceptores beta inhalados, esteroides, antagonistas de citocinas, u otros enfoques terapéuticos novedosos para el tratamiento de asma, asma alérgico, otras afecciones alérgicas, o cualquier afección caracterizada por fibrosis anormal. Los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse en combinación con agentes antiinfecciosos, por ejemplo, agentes antivirales para

65 el tratamiento de infección por el VIH.

Según la presente invención, las composiciones proporcionadas pueden administrarse a individuos. La administración es preferentemente en una “cantidad terapéuticamente eficaz”, siendo esta suficiente para mostrar beneficio a un paciente. Tal beneficio puede ser al menos mejora de al menos un síntoma. La cantidad real administrada y la tasa y transcurso de tiempo de la administración, dependerá de la naturaleza y gravedad de lo que

5 está tratándose. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre la dosificación, etc., está dentro de la responsabilidad de los médicos generales y otros doctores médicos y puede depender de la gravedad de los síntomas y/o progresión de una enfermedad que está tratándose. Dosis apropiadas de anticuerpo son muy conocidas en la técnica; véanse Ledermann y col. (1991) y Bagshawe (1991). Pueden usarse dosificaciones específicas indicadas en el presente documento, o en el vademécum (2003) según convenga para el tipo de medicamento que se administra. Una cantidad terapéuticamente eficaz o dosis adecuada de un miembro de unión específica de la invención puede determinarse comparando su actividad in vitro y actividad in vivo en un modelo animal. Se conocen procedimientos para la extrapolación de dosificaciones eficaces en ratones y otros animales de ensayo a seres humanos.

15 La dosis precisa dependerá de varios factores que incluyen si el anticuerpo es para diagnóstico o para tratamiento, el tamaño y localización del área que va a tratarse, la naturaleza precisa del anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo completo, fragmento o diacuerpo) y la naturaleza de cualquier marca detectable u otra molécula unida al anticuerpo. Una dosis de anticuerpo típica estará en el intervalo 100 μg a 1 g para aplicaciones sistémicas y 1 μg a 1 mg para aplicaciones tópicas. Normalmente, el anticuerpo será un anticuerpo completo, preferentemente el isotipo IgG4. Esto es una dosis para un único tratamiento de un paciente adulto, que puede ajustarse proporcionalmente para niños y lactantes y también ajustarse para otros formatos de anticuerpo en proporción al peso molecular. Los tratamientos pueden repetirse a intervalos diarios, bisemanales, semanales o mensuales, a discreción del médico. En realizaciones preferidas de la presente invención, el tratamiento es periódico y el periodo entre administraciones es aproximadamente dos semanas o más, preferentemente aproximadamente tres semanas o más, más

25 preferentemente aproximadamente cuatro semanas o más, o aproximadamente una vez al mes. En otras realizaciones preferidas de la invención, el tratamiento puede administrarse antes, y/o después de cirugía y más preferentemente, puede administrarse o aplicarse directamente en el sitio anatómico de tratamiento quirúrgico.

Los miembros de unión específica de la presente invención se administrarán normalmente en forma de una composición farmacéutica, que puede comprender al menos un componente, además del miembro de unión específica.

Así, composiciones farmacéuticas según la presente invención y para su uso según la presente invención pueden comprender, además del principio activo, un excipiente farmacéuticamente aceptable, vehículo, tampón,

35 estabilizador u otros materiales muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Tales materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser oral, o por inyección, por ejemplo, intravenosa.

Composiciones farmacéuticas para administración por vía oral pueden estar en forma de comprimido, cápsula, polvo, líquida o semisólida. Un comprimido puede comprender un vehículo sólido, tal como gelatina o un adyuvante. Composiciones farmacéuticas líquidas generalmente comprenden un vehículo líquido, tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Pueden incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u otra disolución de sacáridos o glicoles, tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

45 Para inyección intravenosa, o inyección en el sitio de aflicción, el principio activo estará en forma de una disolución acuosa parenteralmente aceptable que está libre de pirógenos y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Aquellos de experiencia relevante en la materia pueden preparar bien disoluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro sódico, inyección de Ringer, inyección de Ringer con lactato. Pueden incluirse conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según se requiera.

Una composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, tanto simultáneamente como secuencialmente, dependiendo de la afección que vaya a tratarse.

Los miembros de unión específica de la presente invención pueden formularse en formas líquidas, semisólidas o

55 sólidas dependiendo de las propiedades fisicoquímicas de la molécula y la vía de administración. Las formulaciones pueden incluir excipientes, o combinaciones de excipientes, por ejemplo: azúcares, aminoácidos y tensioactivos. Las formulaciones líquidas pueden incluir un amplio intervalo de concentraciones de anticuerpo y pH. Las formulaciones sólidas pueden producirse, por ejemplo, por liofilización, secado por pulverización o secado por tecnología de fluidos supercríticos. Las formulaciones de anti-NGF dependerán de la vía de administración prevista: por ejemplo, formulaciones para administración pulmonar pueden consistir en partículas con propiedades físicas que garantizan la penetración en el pulmón profundo tras la inhalación; formulaciones tópicas pueden incluir agentes modificadores de la viscosidad que prolongan el tiempo que el fármaco es residente en el sitio de acción. En ciertas realizaciones, el miembro de unión específica puede prepararse con un vehículo que protegerá al miembro de unión específica contra la rápida liberación tal como una formulación de liberación controlada que incluye implantes, parches

65 transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biocompatibles biodegradables tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos procedimientos para la preparación de tales formulaciones son conocidos para aquellos expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Robinson, 1978.

La presente invención proporciona un procedimiento que comprende provocar o permitir la unión de un miembro de

5 unión específica como se proporciona en el presente documento a NGF. In vitro, por ejemplo, en ELISA, transferencia Western, inmunocitoquímica, inmunoprecipitación, cromatografía de afinidad o ensayos basados en células tales como un ensayo de TF-1.

La cantidad de unión de miembro de unión específica a NGF puede determinarse. La cuantificación puede relacionarse con la cantidad de antígeno en una muestra de prueba, que puede ser de interés diagnóstico.

Un miembro de unión específica o molécula de anticuerpo según cualquier aspecto o realización de la presente invención se proporciona en un kit. En un kit tal, el miembro de unión específica o molécula de anticuerpo puede marcarse para permitir determinar su reactividad en una muestra, por ejemplo, como se describe adicionalmente

15 más adelante. Los componentes de un kit son generalmente estériles y están en viales cerrados u otros recipientes. Los kits pueden emplearse en análisis de diagnóstico u otros procedimientos para los que son útiles las moléculas de anticuerpo. Un kit puede contener instrucciones para el uso de los componentes en un procedimiento, por ejemplo, un procedimiento según la presente invención. Materiales auxiliares para ayudar en o para permitir realizar un procedimiento tal pueden incluirse dentro de un kit.

Las reactividades de anticuerpos en una muestra pueden determinarse por cualquier medio apropiado. El radioinmunoensayo (RIA) es una posibilidad. El antígeno marcado radiactivo se mezcla con antígeno sin marcar (la muestra de prueba) y se deja unirse al anticuerpo. El antígeno unido se separa físicamente del antígeno sin unir y se determina la cantidad de antígeno radiactivo unido al anticuerpo. Cuanto más antígeno haya en la muestra de

25 prueba, menos antígeno radiactivo se unirá al anticuerpo. También puede usarse un ensayo de unión competitiva con antígeno no radiactivo, usando antígeno o un análogo ligado a una molécula indicadora. La molécula indicadora puede ser un colorante de fluorocromo, fósforo o láser con características de absorción o emisión espectralmente aisladas. Fluorocromos adecuados incluyen fluoresceína, rodamina, ficoeritrina y Texas Red. Colorantes cromogénicos adecuados incluyen diaminobencidina.

Otros indicadores incluyen partículas coloidales macromoleculares o material particulado tal como perlas de látex que están coloreadas, magnéticas o paramagnéticas y agentes biológicamente o químicamente activos que pueden producir directamente o indirectamente señales detectables para ser visualmente observadas, electrónicamente detectadas o registradas de otro modo. Estas moléculas pueden ser enzimas, que catalizan reacciones que, por

35 ejemplo, revelan, o cambian colores o producen cambios en las propiedades eléctricas. Pueden ser molecularmente excitables, de forma que las transiciones electrónicas entre estados de energía produzcan absorciones o emisiones espectrales características. Pueden incluir entidades químicas usadas conjuntamente con biosensores. Pueden emplearse sistemas de detección de biotina/avidina o biotina/estreptavidina y fosfatasa alcalina.

Las señales generadas por conjugados de anticuerpo individual-indicador pueden usarse para derivar datos absolutos o relativos cuantificables de la unión a anticuerpo relevante en muestras (normal y prueba).

La presente invención también proporciona el uso de un miembro de unión específica como antes para medir niveles de antígeno en un ensayo de competencia, es decir, un procedimiento de medición del nivel de antígeno en una

45 muestra empleando un miembro de unión específica como se proporciona por la presente invención en un ensayo de competencia. Esto puede ser cuando no se requiera la separación física de antígeno unido de sin unir. El enlace de una molécula indicadora al miembro de unión específica de manera que se produzca un cambio físico u óptico en la unión es una posibilidad. La molécula indicadora puede generar directamente o indirectamente señales detectables y preferentemente medibles. El enlace de moléculas indicadoras puede ser directamente o indirectamente, covalentemente, por ejemplo, mediante un enlace peptídico o no covalentemente. El enlace mediante un enlace peptídico puede ser como resultado de expresión recombinante de una fusión de gen que codifica anticuerpo y molécula indicadora.

La presente invención también proporciona medir niveles de antígeno directamente, empleando un miembro de 55 unión específica según la invención, por ejemplo, en un sistema de biosensor.

El modo de determinación de la unión no es una característica de la presente invención y aquellos expertos en la materia pueden elegir un modo adecuado según su preferencia y conocimiento general.

La competencia entre miembros de unión puede ensayarse fácilmente in vitro, por ejemplo, marcando una molécula indicadora específica para un miembro de unión que puede detectarse en presencia de otro(s) miembro(s) de unión sin marcar, para permitir la identificación de miembros de unión específica que se unen al mismo o un epítope solapante.

65 La competencia puede determinarse, por ejemplo, usando ELISA en la que NGF se inmoviliza en una placa y un primer miembro de unión marcado junto con uno o varios de otros miembros de unión sin marcar se añaden a la placa. La presencia de un miembro de unión sin marcar que compite con el miembro de unión marcado se observa por una disminución en la señal emitida por el miembro de unión marcado.

En la prueba para la competición puede emplearse un fragmento de péptido del antígeno, especialmente un péptido

5 que incluye o consiste esencialmente de un epítope de interés. Puede usarse un péptido que tiene la secuencia del epítope más uno o más aminoácidos en cualquier extremo. Los miembros de unión específica según la presente invención pueden estar de forma que su unión a antígeno se inhiba por un péptido con o que incluye la secuencia dada. En la prueba de esto puede usarse un péptido con cualquier secuencia más uno o más aminoácidos.

Los miembros de unión específica que se unen a péptido específico pueden aislarse, por ejemplo, de una biblioteca de expresión en fago por inmunopurificación con el (los) péptido(s).

La presente invención proporciona además un ácido nucleico aislado que codifica un miembro de unión específica de la presente invención. El ácido nucleico puede incluir ADN y/o ARN. En un aspecto preferido, la presente

15 invención proporciona un ácido nucleico que codifica una CDR o conjunto de CDR o dominio VH o dominio VL o sitio de unión a antígeno del anticuerpo o molécula de anticuerpo, por ejemplo, scFv o IgG4, de la invención como se ha definido anteriormente.

La presente invención también proporciona construcciones en forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o de expresión que comprenden al menos un polinucleótido como antes.

La presente invención también proporciona una célula huésped recombinante que comprende una o más construcciones como antes. Un ácido nucleico que codifica cualquier CDR o conjunto de CDR o dominio VH o dominio VL o sitio de unión a antígeno del anticuerpo o molécula de anticuerpo, por ejemplo, scFv o IgG4 como se

25 ha proporcionado, forma por sí mismo un aspecto de la presente invención, como un procedimiento de producción del producto codificado, procedimiento que comprende la expresión de ácido nucleico codificante para el mismo. La expresión puede lograrse convenientemente cultivando según condiciones apropiadas células huésped recombinantes que contienen el ácido nucleico. Tras la producción por expresión, un dominio VH o VL, o miembro de unión específica, puede aislarse y/o purificarse usando cualquier técnica adecuada, luego se usa según convenga.

Los miembros de unión específica, dominios VH y/o VL y moléculas de ácidos nucleicos codificantes y vectores según la presente invención, pueden proporcionarse aislados y/o purificados, por ejemplo, de su entorno natural, en forma sustancialmente pura o homogénea, o, en el caso de ácido nucleico, libre o sustancialmente libre de ácido

35 nucleico o genes de distintos orígenes de la secuencia que codifica un polipéptido con la función requerida. El ácido nucleico según la presente invención puede comprender ADN o ARN y puede ser completamente o parcialmente sintético. Referencia a una secuencia de nucleótidos como se explica en el presente documento engloba una molécula de ADN con la secuencia especificada y engloba una molécula de ARN con la secuencia especificada en la que T está sustituido con U, a menos que el contexto lo requiera de otro modo.

Los sistemas para clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de células huésped diferentes son muy conocidos. Células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamífero, células vegetales, sistemas de levadura y de baculovirus y plantas y animales transgénicos. La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en células procariotas está muy establecido en la materia. Para una revisión véase, por ejemplo,

45 Plückthun (1991). Un huésped bacteriano preferido común es E. coli.

La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para aquellos expertos en la materia como una opción para la producción de un miembro de unión específica, por ejemplo, Chadd y Chamow (2001), Andersen y Krummen (2002), Larrick y Thomas (2001). Líneas celulares de mamífero disponibles en la materia para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster bebé, células de melanoma de ratón NS0, células de mieloma de rata YB2/0, células renales embrionarias humanas, células de retina embrionaria humana y muchas otras.

Pueden elegirse o construirse vectores adecuados que contienen secuencias reguladoras apropiadas, que incluyen

55 secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias, según convenga. Los vectores pueden ser plásmidos, por ejemplo, fagémido, o virales, por ejemplo, fago, según convenga. Para más detalles véase, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001). Muchas técnicas conocidas y protocolos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica y análisis de proteínas, se describen en detalle en Ausubel y col., 1988 y Ausubel y col., 1999.

Así, otro aspecto de la presente invención proporciona una célula huésped que contiene ácido nucleico como se ha desvelado en el presente documento. Una célula huésped tal puede estar in vitro y puede estar en cultivo. Una célula huésped tal puede estar in vivo. La presencia in vivo de la célula huésped puede permitir la expresión

65 intracelular de los miembros de unión específica de la presente invención como “intracuerpos” o anticuerpos intracelulares. Los intracuerpos pueden usarse para terapia génica.

Todavía otro aspecto proporciona un procedimiento que comprende introducir tal ácido nucleico en una célula huésped. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para células eucariotas, técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, transfección y transducción 5 mediada por liposomas usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, variolovacuna o, para células de insecto, baculovirus. La introducción de ácido nucleico en la célula huésped, en particular una célula eucariota, puede usar un sistema viral o basado en plásmido. El sistema de plásmido puede mantenerse episómicamente o puede incorporarse en la célula huésped o en un cromosoma artificial. La incorporación puede ser tanto por integración al azar como elegida como diana de una o más copias en un único sitio o en múltiples sitios. Para células bacterianas,

10 técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófago.

La introducción puede ir seguida de provocar o permitir la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, cultivando células huésped en condiciones para la expresión del gen.

15 En una realización, el ácido nucleico de la invención está integrado en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula huésped. La integración puede promoverse por la inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, según técnicas convencionales.

20 La presente invención también proporciona un procedimiento que comprende usar una construcción como se ha establecido anteriormente en un sistema de expresión con el fin de expresar un miembro de unión específica o polipéptido como antes.

Aspectos y realizaciones de la presente invención se ilustrarán ahora, a modo de ejemplo, con referencia a la 25 siguiente experimentación y los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 muestra curvas de concentración-inhibición para la neutralización de anticuerpos de NGF humano (figura 1A) y de rata (figura 1B) en el ensayo de movilización de calcio del receptor TrkA humano. Se compararon anticuerpos IgG4 humana para NGF con los anticuerpos para NGF comerciales G1131, Mab5260Z y MAB256 para

30 la inhibición de la movilización de calcio intracelular provocada por NGF 1 nM. Los puntos de datos indican resultados de un único experimento y son media ± DE de determinaciones por triplicado para cada concentración de anticuerpo.

La figura 2 muestra la inhibición de la movilización de calcio intracelular en células HEK-293 que expresan

35 recombinantemente el receptor humano TrkA. Los anticuerpos IgG4 humana de potencia optimizada se evaluaron para la inhibición de respuestas provocadas por NGF 1 nM humano (figura 2A), de rata (figura 2B) y de ratón (figura 2C). Los puntos de datos indican resultados de un único experimento y son media ± DE de determinaciones por triplicado para cada concentración de anticuerpo.

40 La figura 3 muestra el efecto inhibidor de anticuerpos IgG4 humana para NGF en el ensayo de supervivencia de células PC12. La supervivencia de células se mantuvo por la presencia de NGF humano (figura 3A) o NGF de rata (figura 3B) 1 nM. Los datos indican media ± DE para determinaciones por triplicado de un único experimento.

La figura 4 muestra la inhibición de la proliferación de células TF-1 mediada por NGF por anticuerpos IgG4 humana

45 para NGF de la línea germinal y no de la línea germinal y el anticuerpo para NGF de referencia, MAB256. Las células se estimularon con NGF humano (figura 4A), NGF de rata (figura 4B) o NGF de ratón (figura 4C) 200 pM. Los datos representan la media ± eem de determinaciones por triplicado de un único experimento.

La figura 5 muestra la falta de reactividad cruzada del anticuerpo IgG4 humana para NGF 1252A5 con las

50 neurotrofinas BDNF, NT-3 y NT-4. Se adsorbieron 100 ng de neurotrofina por pocillo. Cada punto de datos representa la medida ± DE de determinaciones por triplicado de un único experimento.

La figura 6 muestra curvas de unión saturantes para unión de 125I-NGF humano con los anticuerpos IgG4 humana para NGF 1252A5 (figura 6A) y G1152H5 (figura 6B). Los valores de Kd calculados son 0,35 nM y 0,37 nM,

55 respectivamente y son el resultado de un único experimento.

La figura 7 muestra curvas de unión saturantes para unión de 125I-NGF de rata con los anticuerpos IgG4 humana para NGF 1252A5 (figura 7A) y G1152H5 (figura 7B). Los valores de Kd calculados son 0,44 nM y 0,50 nM, respectivamente y son el resultado de un único experimento.

60 La figura 8 muestra la inhibición dependiente de la concentración de la unión de 125I-NGF humano (figura 8A) o de rata (figura 8B) a proteína de fusión de receptor TrkA, por anticuerpos IgG4 humana o de referencia. La concentración de NGF radiomarcado en cada pocillo de ensayo fue aproximadamente 150 pM. Los datos indican el resultado de un único experimento. Véanse también las tablas 6 y 7.

65 La figura 9 muestra la inhibición dependiente de la concentración de la unión de 125I-NGF humano (figura 9A) o de rata (figura 9B) a proteína de fusión de receptor p75, por anticuerpos IgG4 humana o de referencia. La concentración de NGF radiomarcado en cada pocillo de ensayo fue aproximadamente 150 pM. Los datos indican el resultado de un único experimento. Véanse también las tablas 8 y 9.

5 La figura 10 muestra la inhibición relacionada con la dosis de hiperalgesia térmica inducida por carragenina en ratón, 48 h después de la administración sistémica de IgG4 humana anti-NGF, 1252A5.

Ejemplo 1

Aislamiento de scFv anti-NGF

Repertorio de anticuerpos scFv

15 Para las selecciones se usaron tres bibliotecas grandes de anticuerpos humanos Fv monocatenarios (scFv) clonadas en un vector de fagémido. Las bibliotecas se derivaron de (A) linfocitos del bazo (Hutchings, 2001), (B) una combinación de linfocitos de sangre periférica, linfocitos B de amígdalas y linfocitos B de médula ósea (Vaughan y col., 1996) y (C) las cadenas ligeras y regiones CDR3 de VH de A combinadas con la región estructural de la cadena pesada de la línea germinal DP47.

Selección de scFv

El procedimiento de selección de fagos usado fue esencialmente como se describe en Hutchings, arriba. scFv que reconocieron NGF se aislaron de bibliotecas de expresión en fago en una serie de ciclos de selección en NGF

25 humano y de rata. En resumen, tubos Nunc Maxisorb se recubrieron con antígeno sin modificar. Los fagos se incubaron en el antígeno en un volumen total de 500 μl durante 1 h antes de lavar eliminando el fago sin unir. Los fagos unidos se rescataron entonces como se describe por Vaughan y col., arriba y se repitió el procedimiento de selección. Ayudando en el aislamiento de scFv con reactividad cruzada por ser humano/roedor se realizaron rondas alternas de selección en las isoformas de especie respectivas de NGF. Se realizó un máximo de cuatro rondas de selección con una biblioteca cualquiera usando esta estrategia de selección de isoformas alternante. Se usaron tanto β-NGF humano como de rata como antígeno inicial para las selecciones de la primera ronda.

Las salidas de las rondas 2-4 se priorizaron para cribado bioquímico basándose en el porcentaje de clones específicos para NGF aislados y la diversidad de secuencias de estos clones. El porcentaje de clones específicos

35 para NGF se determinó en cada caso por ELISA de fagos. La diversidad de secuencias se determinó por secuenciación de ADN.

Protocolo de ELISA de fagos

Se prepararon cultivos de bacterias transducidas con fagos en 1 ml de medio 2xTY que contiene 100 μg/ml de ampicilina y 50 μg/ml de kanamicina con agitación a 30 ºC durante 16 h. Se preparó sobrenadante de fagos por centrifugación del cultivo (10 min a 3000 rpm) y bloqueando con 3% en peso/volumen de leche en polvo en PBS durante 1 h. Entonces se añadieron fagos bloqueados a placas previamente recubiertas con (1 μg/ml) antígeno o antígeno irrelevante. Las placas se lavaron entre cada etapa con tres aclarados en PBS-Tween 20 (0,1% v/v),

45 seguido de tres aclarados en PBS. Se detectaron fagos unidos por incubación con conjugado de peroxidasa de rábano picante (HRP)/anti-M13 (Amersham UK) diluido 1:5000 en 3% en peso/volumen de leche en polvo en PBS durante 1 h y se relevaron por incubación con sustrato de tetrametilbencidina (TMB) (Sigma). La reacción colorimétrica se detuvo después de un periodo apropiado añadiendo ácido sulfúrico 0,5 M. Las lecturas de absorbancia se tomaron a 450 nm. Los clones que se unieron específicamente al antígeno se identificaron por tener una señal en el antígeno superior a o igual a 5x la del antígeno irrelevante.

Secuenciación de ADN

Se obtuvo molde de ADN bicatenario para la secuenciación por PCR de scFv usando los cebadores FDTETSEQ24

55 (TTTGTCGTCTTTCCAGACGTTAGT - SEC ID Nº: 534) y pUCreverse (AGCGGATAACAATTTCACACAGG - SEC ID Nº: 535). El exceso de cebador y dNTP de la PCR primaria se eliminaron usando placas de PCR de 96 pocillos Nucleofast de Macherey-Nagel (Millipore) según las recomendaciones del fabricante. Los genes de VH se secuenciaron con el cebador Lseq (GATTACGCCAAGCTTTGGAGC SEC ID Nº: 536). Los genes de VL se secuenciaron con el cebador MYC Seq 10 (CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG SEC ID Nº: 537). Cada mezcla de reacción contuvo 20-40 ng de ADN, 3-20 pmoles de cebador y 4 μl de Big Dye Terminator V3.0 (Applied Biosystems, RU) en un volumen de 20 μl. Las reacciones de secuenciación consistieron en 25 ciclos de 96 ºC, 10 s; 50 ºC, 5 s; 60 ºC, 4 min. Las muestras se ejecutaron y se analizaron en un analizador de ADN 3700 de Applied Biosystems. Las áreas de ambigüedad se analizaron manualmente usando el software Continuity desarrollado internamente (Cambridge Antibody Technology, RU) y el software de manipulación de secuencias de ADN SeqEd (Applied

65 Biosystems, RU).

Cribado bioquímico para scFv neutralizante de NGF

La salida del procedimiento de selección de fagos se cribó adicionalmente identificando clones que inhibieron la 5 unión de NGF a una proteína de fusión del dominio extracelular de receptor TrkA.

Se prepararon muestras de scFv en bruto a partir de lisados periplásmicos de bacterias TG-1 de E. coli transfectadas con fago seleccionado para la evaluación en el ensayo de unión. Placas de 96 pocillos Nunc Maxisorb se recubrieron durante la noche con proteína de fusión del dominio extracelular de receptor TrkA humano (R&D Systems; concentración de recubrimiento; ensayo de NGF humano, 0,25 nM; ensayo de NGF de rata, 1 nM). Las placas de ensayo se lavaron con PBS / Tween 20, se bloquearon durante 2 h usando 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS y se lavaron de nuevo. Muestras de scFv se preincubaron durante 30 min con β-NGF recombinante humano o de rata 1 nM (R&D Systems) en 1% de BSA. Las muestras se transfirieron a un volumen de 100 μl a placas de ensayo y se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y el NGF

15 que siguió unido a las placas se marcó usando 0,3 μg/ml de tanto biotina anti-NGF humano (Peprotech) como biotina anti-NGF de rata (R&D Systems) diluido en 1% de BSA, seguido de incubación durante 60 min a temperatura ambiente. Anti-NGF marcada con biotina se detectó usando el sistema de detección por fluorescencia resuelta en el tiempo DELFIA (Wallac). Brevemente, las placas se lavaron y se añadieron 100 μl de estreptavidina Eu3+ a cada pocillo, diluida 1/1000 en tampón de ensayo DELFIA. Las placas se incubaron durante otros 60 min a temperatura ambiente y se lavaron con tampón de lavado DELFIA, seguido de la adición de 100 μl de disolución de potenciamiento DELFIA a cada pocillo. Las placas se leyeron usando un lector de placas fluorimétrico Wallac Victor (longitud de onda de excitación 314 nm; longitud de onda de emisión 615 nm).

Los clones que inhibieron tanto la unión de NGF humano como de rata más del 70% como preparaciones de scFv

25 de lisado periplásmico se volvieron a evaluar como scFv purificado en el ensayo de unión. Las preparaciones de scFv purificadas se prepararon como se describe en el ejemplo 3 del documento WO 01/66754. Las concentraciones de proteína de preparaciones de scFv purificadas se determinaron usando el procedimiento BCA (Pierce). El reensayo seleccionó los siguientes anticuerpos scFv que fueron potentes neutralizadores de la unión de NGF humano y de rata a la proteína de fusión del dominio extracelular de receptor TrkA humano:

1064F8 (SEC ID Nº de VH: 2; SEC ID Nº de VL: 7),

1022E3 (SEC ID Nº de VH: 12; SEC ID Nº de VL: 17),

35 1083H4 (SEC ID Nº de VH: 22; SEC ID Nº de VL: 27),

1021E5 (SEC ID Nº de VH: 32; SEC ID Nº de VL: 37),

1033G9 (SEC ID Nº de VH: 42; SEC ID Nº de VL: 47),

1016A8 (SEC ID Nº de VH: 52; SEC ID Nº de VL: 57),

1028F8 (SEC ID Nº de VH: 62; SEC ID Nº de VL: 67),

45 1033B2 (SEC ID Nº de VH: 72; SEC ID Nº de VL: 77),

1024C4 (SEC ID Nº de VH: 82; SEC ID Nº de VL: 87) y

1057F11 (SEC ID Nº de VH: 92; SEC ID Nº de VL: 97).

Ejemplo 2

Expresión de anticuerpos IgG4 humana y evaluación funcional in vitro de potencia neutralizante de NGF

55 Los scFv neutralizantes de NGF 1064F8, 1022E3, 1083H4, 1021E5, 1033G9, 1016A8, 1028F8, 1033B2, 1024C4 y 1057F11 se volvieron a formatear como anticuerpos IgG4 humana y se ensayaron para potencia neutralizante de NGF en un sistema de ensayo de células completas.

Conversión de IgG

Se construyeron vectores para los clones de scFv más potentes permitiendo la re-expresión como anticuerpo completo IgG4 humana, esencialmente como se describe por Persic y col. (1997). Células EBNA-293 mantenidas en medio acondicionado se co-transfectaron con construcciones que expresaban dominios de cadena pesada y ligera. El anticuerpo completo se purificó del medio usando cromatografía de afinidad de proteína A (Amersham 65 Pharmacia). Las preparaciones de anticuerpo purificadas se esterilizaron por filtración y se guardan a 4 ºC en

solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de la evaluación de la potencia in vitro. La concentración de proteína se determinó espectrofotométricamente según Mach y col. (1992).

Ensayo FLIPR de movilización de calcio intracelular

5 La potencia y eficacia de anti-IgG humanas neutralizando NGF se determinaron en un ensayo de movilización de calcio fluorescente basado en células. La potencia de anticuerpos humanos se comparó con anticuerpos de ratón anti-NGF humano (MAB256; R&D Systems), de rata anti-NGF de ratón (G1131; Promega) y de ratón anti-NGF de ratón (MAB5260Z; Chemicon). IgG anti-NGF se co-incubaron con β-NGF humano recombinante (Calbiochem,

10 480275) o β-NGF de rata recombinante (R&D Systems, 556-NG-100). El complejo se añadió entonces a células HEK293 que expresan receptores TrkA humanos recombinantes cargados con el colorante sensible al calcio, Fluo-4 y luego se monitorizó la fluorescencia dependiente de Ca2+.

Células HEK (pico S, Edge Biosystems) transfectadas con TrkA humano recombinante (obtenido de M. Chao,

15 Skirball Institute, NY) se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (MEM, Cellgro, MT10-017-CV) complementado con 10% de suero bovino fetal (Hyclone, SH30071.03), 1,5 μg/ml de puromicina (Edge Biosystems, 80018) y 1% de penicilina-estreptomicina. Se recogieron células confluentes desplazando las células con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) y luego se cargaron con tampón de carga que contenía Fluo-4 6 μM (Molecular Probes) a 37 ºC durante 1,5 h en presencia de un inhibidor del transporte de aniones (probenecid 2,5

20 mM en 1% de SBF/MEM). Después de lavar las células una vez con tampón de ensayo (probenecid 2,5 mM en 0,1% de BSA con Hank / HEPES), las células se sembraron sobre placas de 96 pocillos de fondo transparente recubiertas con poli-D-lisina (Costar nº 3904) a aproximadamente 60.000 células/pocillo en 120 μl. Las células se incubaron en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente y las placas se centrifugaron entonces a 1.200 rpm (290 x g) durante 5 min. Antes de la prueba, las placas se pre-calentaron a 35 ºC durante 20 min. Las IgG de prueba se

25 ensayaron a 7 concentraciones en pocillos por triplicado. Treinta y cinco microlitros de 10X IgG anti-NGF y cantidades iguales de 2.55 NGF humano, de rata o de ratón 10 nM se pre-incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h. Las placas que contienen las IgG pre-complejadas y las placas que contienen 100 μl/pocillo de tampón de ensayo se pre-calentaron a 35 ºC durante 20 min antes de probar en el lector de placas de obtención de imágenes fluorimétricas (FLIPR; Molecular Devices). Tras la adición de 80 μl/pocillo de tampón de

30 ensayo a la placa de células e incubación durante 5 min a 35 ºC, 50 μl/pocillo de complejo anti-IgG humana / NGF diluido se añadieron a la placa de células en el FLIPR con monitorización continua de la fluorescencia dependiente de Ca2+. La fluorescencia inducida por NGF se calculó como la diferencia entre la intensidad de fluorescencia de referencia justo antes de la adición de NGF y la mayor intensidad de fluorescencia se obtuvo en 2 minutos tras la adición de NGF. El promedio de los valores de fluorescencia inducida por NGF por triplicado en ausencia de

35 anticuerpo se definieron como el 100% de movilización de calcio. En presencia de anticuerpo, el promedio ± DE de valores de fluorescencia inducida por NGF por triplicado se calculó como porcentaje de la movilización de calcio de control. El porcentaje de los valores de movilización de calcio de control se representó en función del logaritmo de la concentración de IgG. Los valores de CI50 se calcularon ajustando la función de dosis-respuesta sigmoide (pendiente variable) usando Prism (GraphPad).

40 Todos los anticuerpos probados mostraron inhibición relacionada con la concentración de la movilización de calcio intracelular provocada por NGF humano. El orden de importancia de la potencia para neutralización de NGF humano fue 1064F8 > 1022E3 > 1083H4 ≥ 1033G9 ≥ 1016A8 ≥ 1028F8 ≥ 1021E5 ≥ 1033B2 >> 1024C4 >> 1057F11 (tabla 1). Cinco anticuerpos se evaluaron adicionalmente para neutralización funcional de NGF de rata y estos fueron

45 aproximadamente equipotentes contra ambas isoformas de especies (figuras 1A y 1B; tabla 1).

Ejemplo 3

Aislamiento de anticuerpos IgG4 humana para NGF optimizados 50

Optimización de la potencia de scFv expresada en ribosoma

Se crearon grandes bibliotecas de muestras de ribosomas y se seleccionaron para scFv que reconoció específicamente NGF humano recombinante (R&D Systems), esencialmente como se describe en Hanes y col. 55 (2000). Inicialmente, los clones 1064F8, 1022E3, 1083H4, 1021E5, 1033G9, 1016A8, 1028F8, 1033B2 y 1024C4 se convirtieron en formato de muestra de ribosomas, usándose los moldes posteriormente para la creación de bibliotecas. El clon 1057F11 no se eligió para la optimización de potencia y por tanto no se hizo un molde de muestra de ribosoma para este anticuerpo. Al nivel de ADN, se añadió un promotor T7 al extremo 5' para la eficiente transcripción para ARNm. Al nivel de ARNm, la construcción contuvo un sitio de unión al ribosoma procariota

60 (secuencia de Shine-Dalgarno). En el extremo 3' de la cadena individual, el codón de terminación se eliminó y una parte de gIII se añadió actuando de espaciador (Hanes y col., arriba).

Las bibliotecas de muestras de ribosomas derivadas de 1064F8, 1022E3, 1083H4, 1021E5, 1033G9, 1016A8, 1028F8, 1033B2 y 1024C4 se crearon por mutagénesis de HCDR3 de scFv. Las reacciones de PCR se realizaron 65 con Taq polimerasa de no corrección. Se realizaron selecciones basadas en la afinidad por lo que, tras la incubación

con la biblioteca, NGF humano biotinilado se acopló a perlas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynal M280). Los complejos terciarios unidos (ARNm-ribosoma-scFv) se recuperaron por separación magnética mientras que los complejos sin unir se lavaron. El ARNm que codifica scFv unido se rescató entonces por RT-PCR como se describe en Hanes y col. (arriba) y el procedimiento de selección se repitió con concentraciones decrecientes (100

5 nM - 10 pM durante cinco rondas) de NGF humano biotinilado presente durante la selección.

También se usó PCR propensa a error aumentando adicionalmente el tamaño de la biblioteca. Se empleó una tasa de error de 7,2 mutaciones por 1.000 pb (Diversify ™, Clontech) durante la pauta de selección. Las reacciones de PCR propensa a error se realizaron antes de que comenzaran las selecciones en las rondas tres y cuatro usando concentraciones de NGF humano biotinilado de 1 nM y 0,1 nM, respectivamente.

Una proporción representativa de scFv de la salida de las rondas selección tres, cuatro y cinco se ligó en el vector pCantab6 (Vaughan y col., 1996) y se clonó en la cepa TG1 de E. coli. Una muestra de este scFv se secuenció por ADN como se describe en el ejemplo 1 confirmando la diversidad de secuencias de la salida antes de cribar in vitro

15 para actividad neutralizante de NGF. Los clones se cribaron como scFv sin purificar en el ensayo de unión de proteína de fusión del dominio extracelular de NGF / receptor TrkA, como se describe en el ejemplo 1. La concentración de las preparaciones de scFv de lisado periplásmico en los ensayos se redujo al 0,5% - 5% del volumen de ensayo final y los clones que inhibieron tanto la unión de NGF humano como de rata >95% se aislaron para el posterior estudio. De esta forma se aisló un panel de neutralizadores de NGF de reactividad cruzada de potencia optimizada. Sorprendentemente, los neutralizadores de NGF más potentes se derivaron de los clones 1021E5 y 1083H4 parentales, que no fueron los más potentes de los anticuerpos parentales. Los clones optimizados se secuenciaron y se reensayaron como scFv purificado confirmando la potencia antes de volver a formatear una IgG4 humana como se describe en el ejemplo 2.

25 Los anticuerpos derivados del clon 1021E5 parental (SEC ID Nº de VH: 32; SEC ID Nº de VL: 37) y convertidos en formato de IgG4 humana fueron 1126F1 (SEC ID Nº de VH: 102; SEC ID Nº de VL: 107), 1126G5 (SEC ID Nº de VH: 112; SEC ID Nº de VL: 117), 1126H5 (SEC ID Nº de VH: 122; SEC ID Nº: 127 de VL), 1127D9 (SEC ID Nº de VH: 132; SEC ID Nº de VL: 137), 1127F9 (SEC ID Nº de VH: 142; SEC ID Nº de VL: 147), 1131D7 (SEC ID Nº de VH: 152; SEC ID Nº de VL: 157), 1131H2 (SEC ID Nº de VH: 162; SEC ID Nº de VL: 167), 1132A9 (SEC ID Nº de VH: 172; SEC ID Nº de VL: 177), 1132H9 (SEC ID Nº de VH: 182; SEC ID Nº de VL: 187), 1133C11 (SEC ID Nº de VH: 192; SEC ID Nº de VL: 197), 1134D9 (SEC ID Nº de VH: 202; SEC ID Nº de VL: 207), 1145D1 (SEC ID Nº de VH: 212; SEC ID Nº de VL: 217), 1146D7 (SEC ID Nº de VH: 222; SEC ID Nº de VL: 227), 1147D2 (SEC ID Nº de VH: 232; SEC ID Nº de VL: 237), 1147G9 (SEC ID Nº de VH: 242; SEC ID Nº de VL: 247), 1150F1 (SEC ID Nº de VH: 252; SEC ID Nº de VL: 257), 1152H5 (SEC ID Nº de VH: 262; SEC ID Nº de VL: 267), 1155H1 (SEC ID Nº de VH:

35 272; SEC ID Nº de VL: 277), 1158A1 (SEC ID Nº de VH: 282; SEC ID Nº de VL: 287), 1160E3 (SEC ID Nº de VH: 292; SEC ID Nº de VL: 297), 1165D4 (SEC ID Nº de VH: 302; SEC ID Nº de VL: 307), 1175H8 (SEC ID Nº de VH: 312; SEC ID Nº de VL: 317), 1211G10 (SEC ID Nº de VH: 322; SEC ID Nº de VL: 327), 1214A1 (SEC ID Nº de VH: 332; SEC ID Nº de VL: 337), 1214D10 (SEC ID Nº de VH: 342; SEC ID Nº de VL: 347), 1218H5 (SEC ID Nº de VH: 352; SEC ID Nº de VL: 357) y 1230H7 (SEC ID Nº de VH: 362; SEC ID Nº de VL: 367).

Los anticuerpos derivados del clon parental 1083H4 (SEC ID Nº de VH: 22; SEC ID Nº de VL: 27) y convertidos en formato de IgG4 humana fueron 1227H8 (SEC ID Nº de VH: 372; SEC ID Nº de VL: 377) y 1230D8 (SEC ID Nº de VH: 382; SEC ID Nº de VL: 387).

45 Mutación de la línea germinal de regiones estructurales de 1133C11 derivando 1252A5 y otras variantes de 1021E5

El examen de la información de secuencias de CDR de VH y VL para clones optimizados derivados de 1021E5 resaltó que una gran proporción de estos anticuerpos contuvieron la secuencia de aminoácidos LNPSLTA (SEC ID Nº: 531) en CDR3 de VH (es decir, aminoácidos 100A a 100G según el sistema de numeración de Kabat). Estos clones se muestran en la tabla 2a, resaltando cómo varían en la secuencia de aminoácidos en las regiones CDR de VH y VL, junto con un cálculo estimado de su potencia neutralizante de NGF cuando se ensayaron como scFv purificado. De estos clones, 1133C11 se diferenció en las regiones CDR de 1021E5 solo en los 7 aminoácidos consecutivos 100A a 100G como se ha descrito. Por tanto, 1133C11 se eligió para mutación de la línea germinal, primero confirmando que la potencia era retenida con la región estructural modificada y segundo permitiendo que se

55 introdujeran posteriores mutaciones de CDR, si se desea, con el fin de generar otros anticuerpos de la línea germinal de interés del mismo linaje.

Las secuencias de VH y VL de aminoácidos derivadas de 1133C11 se alinearon con las secuencias de la línea germinal humana conocidas en la base de datos VBASE (Tomlinson [1997], MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, RU) y se identificó la línea germinal más próxima. La línea germinal más próxima para VH de 1133C11 se identificó como DP10, un miembro de la familia VH1. VH de 1133C11 tiene 5 cambios de aminoácidos de la línea germinal de DP10 dentro de regiones estructurales. La línea germinal más próxima para VL de 1133C11 se identificó como DPL5, un miembro de la familia Vλ1. VL de 1133C11 solo tiene 4 cambios de la línea germinal dentro de regiones estructurales. Las regiones estructurales de 1133C11 se devolvieron a la línea germinal por mutagénesis 65 dirigida a sitio de scFv derivando el scFv 1252A5 (SEC ID Nº de VH: 392; SEC ID Nº de VL: 397). Este se convirtió en IgG4 humana como se ha descrito en el ejemplo 2. La mutación de la línea germinal de otras variantes de clones

derivadas de 1021E5 se logró introduciendo mutaciones de CDR en el esqueleto de IgG4 1252A5 de secuencias mutadas en la línea germinal. Este procedimiento produjo la generación de anticuerpos de secuencias minimizadas de la línea germinal G1152H5 (SEC ID Nº de VH: 402; SEC ID Nº de VL: 407), G1165D4 (SEC ID Nº de VH: 412; SEC ID Nº de VL: 417) y G1230H7 (SEC ID Nº de VH: 422; SEC ID Nº de VL: 427).

Ejemplo 4

Evaluación de anticuerpos IgG4 humana optimizados en el ensayo FLIPR de movilización de calcio intracelular

Se evaluaron anticuerpos IgG4 humana para NGF optimizados en un ensayo de movilización de calcio intracelular provocado por NGF en células que expresan recombinantemente el receptor TrkA humano, como se describe en el ejemplo 2. Los anticuerpos se ensayaron neutralizando actividad contra NGF humano, de rata y de ratón (figuras 2A, 2B y 2C; tabla 3).

15 La movilización de calcio intracelular provocada por NGF 1 nM se inhibió por todos los anticuerpos humanos optimizados probados. Anticuerpos optimizados mostraron valores de CI50 subnanomolares, representando en la mayoría de los casos un potenciamiento de más de cien veces de la potencia neutralizante de NGF con respecto a las IgG parentales (tabla 3). Potencias neutralizantes (CI50) de anticuerpos IgG4 humana mutados en la línea germinal contra las isoformas de NGF humano, de rata y de ratón fueron, respectivamente:

1252A5 - 0,33 nM, 0,29 nM y 0,26 nM;

G1152H5 - 0,22 nM, 0,27 nM y 0,18 nM;

25 G1165D4 - 0,32 nM, 0,33 nM y 0,27 nM;

G1230H7 - 0,31 nM, 0,34 nM y 0,25 nM.

Estos resultados resaltan la eficiencia y valor de la técnica de expresión en ribosomas para la optimización de la potencia de anticuerpos. Un enfoque más convencional para la optimización de anticuerpos en el pasado ha sido generar bibliotecas de expresión en fago de anticuerpos scFv de variante. Este procedimiento es laborioso y más lento que el procedimiento de expresión en ribosomas, que frecuentemente significa que solo un único scFv parental se usa como punto de partida para la construcción de bibliotecas. La relativa facilidad de generación de bibliotecas de expresión en ribosomas permite optimizar simultáneamente múltiples padres de scFv y como se demuestra en el

35 ejemplo 3, esto puede conducir al aislamiento de anticuerpos altamente potentes derivados de clones parentales que de otro modo habrían sido ignorados para la optimización.

Ejemplo 5

Evaluación de anticuerpos IgG4 humana optimizados en un ensayo de supervivencia de células PC12

En el ensayo de PC12, NGF mantiene la supervivencia de células PC12 de rata privadas de suero que expresan receptores TrkA y p75 nativos durante dos días. Los anticuerpos para NGF neutralizantes reducen la supervivencia de células medidas con azul de Alamar.

45 Células PC12 de feocromocitoma de rata se cultivaron en RPMI 1640 (Cellgro, 18040181) complementado con 5% de suero bovino fetal (JRH, 12103-78P), 10% de suero de caballo donante inactivado por calor (JRH, 12446-77P) y 1% de penicilina-estreptomicina. Las células se recogieron por trituración y luego se lavaron dos veces con RPMI 1640 sin suero que contiene 0,01% de BSA (Sigma, A7030). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertas con colágeno de cola de rata (Biological Technology Institute, BT-274) a 50.000 células/pocillo en 120 μl de medio sin suero con 0,01% de BSA. Se hicieron diluciones seriadas de 5X IgG anti-NGF humano usando medio sin suero y a la placa de células se añadieron 40 μl/pocillo. Se añadieron 40 μl/pocillo de β-NGF humano 0,5 nM (Calbiochem, 480275) o NGF recombinante de rata (R&D Systems, 556-NG-100) a la placa y el volumen total se llevó hasta 200 μl/pocillo con medio sin suero. La muerte celular máxima se definió por 80 μl/pocillo de medio sin

55 suero en pocillos por triplicado. El 100% de supervivencia se definió por 40 μl/pocillo de medio sin suero y 40 μl/pocillo de NGF 0,5 nM en pocillos por triplicado. Las placas se incubaron a 37 ºC en 5% de CO2 durante 48 h. Midiendo la viabilidad celular se añadieron 22 μl/pocillo de azul de Alamar y las placas se leyeron inmediatamente determinando la fluorescencia de referencia en cada pocillo con un lector de placas fluorimétrico (BMG) a 530 nm de longitud de onda de excitación y 590 nm de longitud de onda de emisión. Tras una incubación durante 6-7h a 37 ºC, la placa se volvió a leer determinando la fluorescencia total. La fluorescencia del azul de Alamar se calculó como la diferencia entre las intensidades de fluorescencia de referencia y total. En presencia de anticuerpo, el promedio ± DE de valores de fluorescencia por triplicado se calculó como porcentaje del promedio de 100% de los valores de fluorescencia de supervivencia por triplicado. El porcentaje de los valores de supervivencia de control se representó en función del logaritmo de la concentración de IgG. Los valores de CI50 se calcularon ajustando la función de dosis

65 respuesta sigmoide (pendiente variable) usando Prism (GraphPad).

Los resultados del ensayo de PC12 confirmaron adicionalmente el aumento de la potencia de anticuerpos IgG4 humana para NGF optimizados con respecto a sus IgG parentales. Los anticuerpos inhibieron NGF humano y la supervivencia de células PC12 mantenidas en NGF de rata de un modo relacionado con la concentración (figuras 3A

5 y 3B; tabla 3). Pareció que la mutación de la línea germinal redujo la potencia neutralizante de NGF de los anticuerpos de prueba, particularmente contra la isoforma de NGF de rata. Por ejemplo, la CI50 media del anticuerpo G1152H5 de la línea germinal para la inhibición de la supervivencia de células mediada por NGF humano o de rata 1 nM fue 1,1 nM y 7,3 nM, respectivamente. A diferencia, la CI50 media para la neutralización de NGF humano o de rata 1 nM por 1152H5 (es decir, anticuerpo no de la línea germinal) fue 0,40 nM y 0,38 nM, respectivamente.

Ejemplo 6

Actividad neutralizante de NGF en un ensayo de proliferación de células TF-1

15 La línea celular TF-1 es una línea celular premieloide humana que puede estimularse para proliferar por factores de crecimiento exógenos y citocinas. Células TF-1 expresan el receptor TrkA humano y proliferan en respuesta a la activación con NGF. Se usó el ensayo de proliferación de células TF-1 caracterizando adicionalmente la potencia funcional in vitro de anticuerpos IgG4 humana para NGF neutralizantes.

Se obtuvieron células TF-1 de R&D Systems y se mantuvieron según protocolos suministrados. Los medios de ensayo comprendieron RPMI-1640 con GLUTAMAX I (Invitrogen) que contiene 5% de suero bovino fetal (Hyclone) y 1% de piruvato de sodio (Sigma). Antes de cada ensayo, las células TF-1 se sedimentaron por centrifugación a 300 x g durante 5 minutos, el medio se eliminó por aspiración y las células se resuspendieron en medio de ensayo. Este procedimiento se repitió tres veces con células resuspendidas a una concentración final de 105 /ml en medio de 25 ensayo y se añadieron 100 μl a cada pocillo de una placa de ensayo de cultivos de tejido de fondo plano de 96 pocillos dando la densidad de células final a 1 x 104/pocillo. Las disoluciones de prueba de anticuerpos (por triplicado) se diluyeron dando una concentración de ensayo final de 1 μg/ml en medio de ensayo y se valoraron 1:5 a través de la placa de ensayo. Como control negativo se usó un anticuerpo irrelevante (CAT-001) no dirigido a NGF. Además, se usó un anticuerpo monoclonal de referencia MAB256 (R&D Systems) como control positivo. Cincuenta microlitros de anticuerpos de prueba se añadieron entonces a cada pocillo, seguido de 50 μl de NGF murino (forma 7S; Invitrogen), de rata (Sigma) o humano (Sigma) purificado nativo diluido dando una concentración de ensayo final de 200 pM. Se incubaron placas de ensayo durante 68 h a 37 ºC en 5% de CO2 en una cámara humidificada. Entonces se añadieron veinte microlitros de timidina tritiada (5,0 μCi/ml, NEN) a cada pocillo de ensayo y las placas de ensayo se devolvieron a la estufa de incubación durante otras 5 h. Las células se recogieron sobre placas de filtro

35 de fibra de vidrio de 96 pocillos (Perkin Elmer) usando un colector de células. Entonces se añadió MicroScint 20TM (50 μl) a cada pocillo de la placa de filtro y se cuantificó la incorporación de [3H]-timidina usando un contador de centelleo líquido de microplacas Packard TopCount. En presencia de anticuerpo, la incorporación de timidina (cuantificada como cuentas por minuto) se calculó como la diferencia entre las cuentas por minuto de referencia promedio (es decir, células no expuestas a NGF) y totales promedio (es decir, células estimuladas con NGF) y se expresó como porcentaje de proliferación máxima. El porcentaje de proliferación máxima se representó en función del logaritmo de la concentración de IgG. Los valores de CI50 se calcularon ajustando la función de dosis sigmoide (pendiente variable) usando GraphPad Prism.

Los anticuerpos IgG4 humana para NGF fueron potentes inhibidores de la proliferación de células TF-1 mediada por

45 isoformas de NGF humano, de rata y de ratón (figuras 4A, 4B y 4C). Estos resultados demuestran que los anticuerpos derivados del linaje 1021E5 pueden alterar la señalización de NGF mediada por la activación de receptores de NGF humano nativos in vitro. Según la actividad observada de anticuerpos para NGF humano en el ensayo de supervivencia de células PC12 (ejemplo 5), los anticuerpos no de la línea germinal fueron más potentes que sus homólogos de la línea germinal en el ensayo de proliferación de TF-1 (tabla 3). Basándose en datos de la CI50 media, el orden de importancia de la potencia de los anticuerpos probados para la inhibición de la proliferación mediada por NGF humano 200 pM fue 1133C11 > 1152H5 > 1252A5 = G1152H5 >> MAB256.

Ejemplo 7

55 Reactividad cruzada de IgG anti-NGF con otras neurotrofinas

Se realizaron ELISA determinando la reactividad cruzada de las IgG anti-NGF para otras neurotrofinas. Los ELISA consistieron en el recubrimiento de placas con 100 ng/pocillo de NGF humano (R&D Systems, 256-GF), factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF; R&D Systems, 248-BD), neurotrofina-3 (NT-3; R&D Systems, 257-N3) o neurotrofina-4 (NT4; R&D Systems, 257-N4) a temperatura ambiente durante 5-6 h, seguido del bloqueo de las placas con 0,25% de HSA a 4 ºC durante la noche. Se incubaron concentraciones crecientes de IgG anti-NGF, que oscilan de 0,03 - 10 nM, a temperatura ambiente durante 2 h permitiendo que se uniera a cada neurotrofina. Las IgG anti-NGF se detectaron con un anticuerpo policlonal anti-humano biotinilado (1:300) (Rockland 609-1602), fosfatasa alcalina ligada a estreptavidina (1:1000) y sustrato A fluorescente. Los controles positivos que demuestran que la 65 neurotrofina se une a la placa utilizaron anticuerpos policlonales anti-humanos biotinilados comerciales (R&D

Systems, BAF 256 anti-NGF, BAM 648 anti-BDNF, BAF 267 anti-NT-3, BAF 268 anti-NT-4), que se detectaron directamente usando fosfatasa alcalina ligada a estreptavidina y posterior adición de sustrato A. la unión no específica se determinó usando pocillos recubiertos con BSA en lugar de neurotrofina. El revelado del producto se siguió con el tiempo 0 - 60 min después de la adición de sustrato A. Se usó IgG anti-NGF 1064F8 optimizando el

5 ensayo. Para 1064F8 hubo revelado de producto lineal durante 15 min, que luego se estabilizó con el tiempo, probablemente debido al agotamiento del sustrato. Las reactividades cruzadas se calcularon como porcentaje de la unión específica a neurotrofina con respecto a NGF para todas las concentraciones de IgG. Para IgG de alta afinidad tales como 1064F8, el porcentaje de reactividades cruzadas se calcularon usando datos de revelado de producto de 15 min. Para IgG de baja afinidad tales como 1016A8, el porcentaje de reactividades cruzadas se calculó usando datos de revelado de producto de 60 min.

Se determinaron las reactividades cruzadas de siete anticuerpos IgG4 humana para NGF para BDNF, NT-3 y NT-4 con respecto a NGF. A las concentraciones probadas, los siete anticuerpos mostraron reactividad cruzada despreciable (tabla 4). Por ejemplo, con 1252A5 los mayores niveles de reactividad cruzada observados con NT-3,

15 NT-4 y BDNF fueron del 1,1%, 0,9% y 1,4%, respectivamente (figura 5).

Ejemplo 8

Determinación de la afinidad de unión a NGF de anticuerpos para NGF humano

Las afinidades de unión a NGF de anticuerpos IgG4 humana para NGF se determinaron usando un formato de ensayo de unión a radioligando realizado a temperatura ambiente. Brevemente, se recubrieron FlashPlates (Perkin Elmer SMP200) con 100 μl/pocillo de 2,2 μg/ml de anticuerpo de cabra dirigido contra IgG humana (Sigma-Aldrich, RU) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 h. Los pocillos se lavaron con PBS y luego se

25 bloquearon durante 1 h con 200 μl/pocillo de PBS que contiene 3% en peso/volumen de albúmina de suero bovino (BSA; Sigma-Aldrich, RU). Los pocillos se lavaron con PBS y se añadieron 10 ng de anticuerpo para NGF humano a cada pocillo en un volumen de 0,1 ml de PBS que contiene 0,5% en peso/volumen de BSA. Tras la incubación durante 1 h, las placas se lavaron con PBS.

Se obtuvieron NGF humano y de rata radioyodado de Amersham UK (125I-NGF humano, nº de cat. de Amersham IM286; 125I-NGF de rata, β-NGF de rata recombinante marcado por el cliente se compró de R&D Systems, nº de cat. 556-GF-100). Cada isoforma de 125I-NGF se diluyó seriadamente en tampón de ensayo (PBS que contiene 0,5% en peso/volumen de BSA y 0,05% en v/v de Tween 20) y se añadieron muestras de 100 μl por duplicado a la placa de ensayo dando una medida de 'unión total ' con respecto al intervalo de concentración 2 pM-15 nM. La unión no

35 específica (UNE) se determinó a cada concentración de 125I-NGF midiendo la unión en presencia de un gran exceso de NGF no radiomarcado. Los pocillos de UNE contuvieron 125I-NGF (2 pM-15 nM) junto con una concentración final de 500 nM de β-NGF humano sin marcar (R&D Systems, nº de cat. 256-GF-100) o β-NGF de rata (R&D Systems, nº de cat. 556-GF-100), según convenga. Las placas se incubaron durante la noche y los pocillos se contaron durante 1 min en un contador gamma (TopCount NXT, Perkin Elmer). La unión específica se calculó según la fórmula 'unión específica = unión total - unión no específica'. Se representaron las curvas de unión y los parámetros de unión se determinaron según un modelo de unión de un sitio de saturación usando el software Prism (GraphPad Software Inc., EE.UU.).

125I-NGF humano y de rata mostraron unión de alta afinidad saturable a los anticuerpos IgG4 humana para NGF

45 1252A5 y G1152H5 (figuras 6 y 7). Los valores de Kd calculados para la interacción por unión con 125I-NGF humano fueron 0,35 nM para 1252A5 y 0,37 nM para G1152H5. Los valores de Kd para la unión de 125I-NGF de rata fueron 0,44 nM para 1252A5 y 0,50 nM para G1152H5.

Ejemplo 9

Determinación de valores de Ki para la inhibición de la unión de NGF a receptores TrkA y p75 humanos

Los experimentos se realizaron determinando si los anticuerpos 1252A5 y G1152H5 mostraban o no inhibición diferencial de la unión de NGF a receptores TrkA y p75. Los experimentos de unión por competencia se diseñaron

55 con el fin de calcular los valores de la constante de inhibición de la unión (Ki). Las CI50 se calcularon para inhibición mediada por anticuerpo de unión de NGF humano o de rata radiomarcado a proteínas de fusión de receptor TrkA o p75 humano. Los valores de Ki se derivaron entonces usando la ecuación de Cheng-Prusoff.

Las proteínas de fusión de receptores TrkA y p75 humanos (R&D Systems) se diluyeron en PBS con Dulbecco (Gibco) a concentraciones finales de 10 nM y 0,6 nM, respectivamente. Placas de microtitulación de 96 pocillos blancas de Maxisorp Nunc (Nalge Nunc) se recubrieron durante la noche a 4 ºC con 100 μl/pocillo de la disolución de receptor TrkA o p75 diluida. Las placas se lavaron 3 veces con PBS-Tween 20 y luego se bloquearon con 200 μl/pocillo de 3% en peso/volumen de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS. Las placas se lavaron después de 1 h de incubación a temperatura ambiente. Los anticuerpos de prueba se diluyeron a la concentración deseada en 65 tampón de ensayo (0,5% en peso/volumen de BSA y 0,05% en v/v de Tween 20 en PBS). Como control negativo se usó un anticuerpo irrelevante, no dirigido hacia NGF, mientras que NGF no radiomarcado se usó como inhibidor de referencia de la unión a radioligando. Se prepararon pocillos por duplicado para cada concentración de muestra de prueba. Se diluyó 125I-NGF humano o de rata (Amersham Biosciences) con tampón de ensayo de forma que la concentración final en los pocillos de ensayo, cuando se mezcló con muestra de prueba, fuera 150 pM en un 5 volumen de ensayo total de 100 μl. Las placas de ensayo se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h antes de lavarse con PBS/Tween 20 eliminando 125I-NGF sin unir. La radiomarca unida se cuantificó mediante la adición de 100 μl/pocillo de Microscint 20 (Perkin Elmer), seguido de recuento usando un contador de centelleo líquido de microplacas Packard TopCount. Los datos se representaron y se analizaron usando el software Graphpad Prism calculando valores de CI50 para cada experimento y derivando Ki correspondiente según la ecuación de Cheng

10 Prusoff:

Ki = CI50/ (1 + D / Kd)

en la que:

15 D = la concentración de NGF en el ensayo (nominalmente 150 pM, pero se determinaron concentraciones de ensayo reales para cada experimento)

Kd = la afinidad de NGF por el receptor TrkA o p75 según condiciones de ensayo idénticas. Esta se determinó por 20 análisis de unión de saturación de la unión de 125I-NGF a receptores TrkA y p75 en experimentos separados.

Todos los anticuerpos evaluados, salvo el control de IgG4 humana, inhibieron la unión de 125I-NGF humano y de rata a receptores TrkA y p75 humanos (figuras 8 y 9; tabla 5). La tabla 6 muestra valores de CI50 y Ki calculados a partir de los datos mostrados en la figura 8A; la tabla 7 muestra valores de CI50 y Ki calculados a partir de los datos 25 mostrados en la figura 8B; la tabla 8 muestra valores de CI50 y Ki calculados a partir de los datos mostrados en la figura 9A; la tabla 9 muestra valores de CI50 y Ki calculados a partir de los datos mostrados en la figura 9B. El anticuerpo 1252A5 mostró coherentemente la mayor potencia de inhibición de la unión a 125I-NGF. De forma interesante, los valores de la constante de inhibición de la unión determinados para la inhibición mediada por 1252A5 de la unión de NGF a receptores TrkA y p75 fueron significativamente diferentes. Así, la pKi media calculada 30 para la inhibición de NGF humano que se une a TrkA y p75 fue 10,26 ± 0,08 y 9,85 ± 0,04, respectivamente (P<0,01, prueba de la t de Student; ambos n=3). La pKi media calculada para la inhibición de NGF de rata a receptores TrkA y p75 fue 9,79 ± 0,04 y 9,55 ± 0,03, respectivamente (P<0,05, prueba de la t de Student; ambos n=3). Este resultado sugiere que 1252A5 es un inhibidor preferencial de la interacción entre NGF y el receptor TrkA, e inesperadamente contrasta con los resultados obtenidos con G1152H5 para los que no hubo diferencia significativa entre valores de

35 pKi correspondientes (tabla 5).

Ejemplo 10

Actividad antihiperalgésica de anticuerpos IgG4 humana para NGF

40 La actividad antihiperalgésica de anticuerpos para NGF se evaluó en un modelo de ratón de hipersensibilidad térmica inducida por carragenina. Ratones macho (20-25 g de peso corporal) se aclimataron inicialmente al aparato de prueba durante 2 h. Al día siguiente se determinaron las mediciones de referencia de la sensibilidad a estimulación térmica de ambas patas traseras. Se aplicó una fuente de calor concentrado sobre la superficie plantar

45 de la pata y se registró la latencia a la retirada, según el método de Hargreaves y col. (1988). Se calcularon valores de referencia como la media de determinaciones por triplicado para cada pata, registrados separados 10 min. Entonces, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de anticuerpo IgG4 humana neutralizante para NGF o anticuerpo nulo del mismo isotipo de control en solución salina tamponada con vehículo de fosfato (PBS). Veinticuatro horas después se indujo hiperalgesia inflamatoria por inyección subplantar de carragenina (2% en

50 peso/volumen en PBS; volumen de inyección de 30 μl). Después de otro periodo de 24 h, las latencias de retirada se determinaron de nuevos para patas traseras inflamadas y no inflamadas.

La hiperalgesia térmica observada 24 h después de la inyección de carragenina se inhibió dependientemente de la dosis por pretratamiento de ratones con el anticuerpo IgG4 humana para NGF 1252A5 (figura 10). 55

Referencias

Al-Lazikani y col. Journal Molecular Biology (1997) 273(4), 927-948

60 Aloe, L. y Tuveri, M.A. (1997) Clin Exp Rheumatol, 15(4): 433-8.

Amann, R. y Schuligoi R. (2000) Neurosci Lett, 278(3): 173-6.

Andersen DC y Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117 65

Ausubel y col. eds., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 4ª edición 1999 Bagshawe K.D. y col. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922 5 Barbas y col., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813 Bennett, D.L. y col. (1998) Eur J Neurosci, 10(4): 1282-91. 10 Bennett, D.L. (2001) Neuroscientist, 7(1): 13-7. Bergmann I. y col., Neurosci Lett., 255(2) 87-90, 1998 Bird y col. Science, 242, 423-426, 1988; 15 de Castro, F. y col. (1998) Eur J Neurosci, 10(1): 146-52. Chadd HE and Chamow SM (2001) Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194 20 Cho, H.J. y col. (1996) Brain Res, 716(1-2): 197-201. Chothia y col. Science, 223,755-758 (1986) Chothia C. y col. Journal Molecular Biology (1992) 227, 799-817 25

Current Protocols in Molecular Biology, segunda edición, Ausubel y col. eds., John Wiley & Sons, 1988 Denison David G. T. (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (julio de

30 2002), ISBN: 0471490369 Fjell, J. y col. (1999) J Neurosci Res, 57(1): 39-47. Garaci, E. y col. (2003) Proc Natl Acad Sci USA, 100(15): 8927-8932.

35 Ghose, Arup K. y Viswanadhan, Vellarkad N.. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-0487-8

Gram y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580 40 Guex, N. y Peitsch, M.C. Electrophoresis (1997) 18, 2714-2723 Hanes y col., Methods in Enzymology, 328: 24, (2000) 45 Hargreaves y col., Pain, 32: 77 (1988) Heumann, R. y col. (1987) J Cell Biol, 104(6): 1623-31. Holliger, P. y Winter G. Current Opinion Biotechnol 4, 446-449 1993 50 Holliger, P. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993 Holt y col. (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490 55 Hongo, J.S. y col. (2000) Hybridoma 19(3): 215-227. Hoyle, G.W. (2003) Cytokine Growth Factor Rev, 14(6): 551-8. Hu, S. y col. Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996. 60 Huang, E.J. y Reichardt, L.F. (2001) Ann Rev Neurosci, 24: 677-736. Huston y col. PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988 65 Hutchings, in Antibody Engineering, Kontermann and Dubel eds., Springer, Berlin, pág. 93-108 [2001]

Indo, Y. (2002) Clin Auton Res, 12 Suppl 1: I20-32. Jagger, S.I. y col. (1999) Br J Anaesth, 83(3): 442-8.

5 Kabat, E.A. y col. Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4ª edición. US Department of Health and Human Services. 1987 Kabat, E.A. y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición. US Department of Health and

Human Services, Public Service, NIH, Washington.

Kandel, Abraham y Backer, Eric. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (11 de mayo de 1995), ISBN: 0133418847 Kay, B.K., Winter, J. y McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San

15 Diego: Academic Press. Knappik y col. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86 Koltzenburg, M. y col. (1999) Eur J Neurosci, 11(5): 1698-704. Kontermann, R y Dubel, S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; 2001, ISBN: 3540413545. Krebs y col. Journal of Immunological Methods 254 2001 67-84

25 Krzanowski, Wo jtek. Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, nº 22 (papel)). Oxford University Press; (diciembre de 2000), ISBN: 0198507089 Larrick JW y Thomas DW (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418. Ledermann J.A. y col. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664 Lommatzsch, M. y col. (2003) Ann NY Acad Sci, 992: 241-9. Lowe, E.M. y col. (1997) Br J Urol, 79(4): 572-577. 35 Ma, Q.P. and Wo olf, C.J. (1997) Neuroreport, 8(4): 807-10. Mach y col., Analytical Biochemistry, 200: 74, (1992) Mamet, J. y col. (2003) J Biol Chem, 278(49): 48907-13. Marks y col., Bio/Technology, 1992, 10:779-783 McArthur, J.C. y col. (2000) Neurology, 54(5): 1080-8. 45 McCafferty y col. (1990) Nature, 348, 552-554 Mendell, L.M. y Arvanian, V.L. (2002) Brain Res Rev, 40(1-3): 230-9. Mendez, M. y col. (1997) Nature Genet, 15(2): 146-156. Nakagawara, A. (2001) Cancer Lett, 169(2): 107-14. Norman y col. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3ª edición (abril de 1998) ISBN: 0471170828 55 Owo labi, J.B. y col. (1999) J Pharmacol Exp Ther, 289(3): 1271-6. Persic y col., Gene, 187: 9, (1997) Petty, B.G. y col. (1994) Ann Neurol, 36(2): 244-6. Pleuvry B. y Pleuvry A., (2000) Analgesia: Markets and Therapies, ISBN 1860674143 Plückthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991) 65 Pozza, M. y col. (2000) J Rheumatol, 27(5): 1121-7.

Priestley, J.V. y col. (2002) Can J Physiol Pharmacol, 80(5): 495-505. Qiao, L.Y. y Vizzard, M.A. (2002) J Comp Neurol, 454(2): 200-11.

5 Ramer, M.S. y col. (1998) Neurosci Lett, 251(1): 53-6. Ramer, M.S. y col. (1999) Pain, Suppl 6: S111-20.

10 Reiter, Y. y col. Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996 Ridgeway, J. B. B. y col. Protein Eng., 9, 616-621, 1996 Ro, L.S. y col. (1999) Pain, 79(2-3): 264-74.

15 Robinson, J. R. ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978

Sah, D.W. y col. (2003) Nat Rev Drug Discov, 2(6): 460-72. 20 Sambrook y Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3ª edición, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press Sammons, M.J. y col. (2000) Brain Res, 876(1-2): 48-54. 25 Schier y col., 1996, J. Mol. Biol. 263:551-567 Stemmer, Nature, 1994, 370:389-391 Vaughan y col., Nature Biotechnology 14 309-314, 1996. 30 Voet y Voet, Biochemistry, 2ª edición, (Wiley) 1995. Ward, E.S. y col., Nature 341, 544-546 (1989)

35 Whitelegg, N.R.u. y Rees, A.R (2000). Prot. Eng., 12, 815-824 Witten, Ian H. y Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (11 de octubre de 1999), ISBN: 1558605525

40 Wo ld y col. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics - Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Los Países Bajos, 1984 (ISBN 90-277-1846-6) Wo olf, C.J. (1996) Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 351(1338): 441-8. 45 Yasuda, H. y col. (2003) Prog Neurobiol, 69(4): 229-85. Zhang YH, Nicol GD. Neurosci Lett. 2004 Aug 12; 366(2):187-92. Tabla 1: Potencia neutralizante de anticuerpos IgG4 humana para NGF en el ensayo de movilización de calcio

Anticuerpo CI50 de NGF humano (nM) CI50 de NGF de rata (nM)

Mab256 0,76 ± 0,15 a 0,79 ± 0,08 b 1064F8 2,5 ± 0,6 c 5,5 1022E3 18 ± 6 c

14 1083H4 30 61 e 1021E5 76 75 e 1033G9 55 ± 20 c

26 1016A8 65 ± 12 b

14 1028F8 73 ND 1033B2 85 ND

1024C4 410 ± 120* c 565* 1057F11 3700* ND

Los datos indican media de dos determinaciones separadas, salvo an=14, bn=12, cn=3, dn=4 (media ± eem) y en=1. *Valores determinados por extrapolación. ND = no determinado.

Tabla 2a: CDR de clones optimizados derivados de 1021E5 que contienen la secuencia LNPSLTA (SEC ID Nº: 531) de HCDR3

Las columnas a la derecha de la tabla muestran un cálculo estimado de las potencias neutralizantes de NGF (CI50) para cada clon. Se ensayaron scFv purificados en un ensayo de unón a NGF como se describió en el ejemplo 3.

Tabla 2b: SEC ID Nºs correspondientes a secuencias de CDR de clones mostrados en la tabla 2a Tabla 3: Potencias neutralizadoras de NGF de anticuerpos IgG4 humana optimizados en tres ensayos de función de NGF en células completas

HCDR1

HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3

LOT1021E05

SEC ID Nº: 33 SEC ID Nº: 34 SEC ID Nº: 35 SEC ID Nº: 38 SEC ID Nº: 39 SEC ID Nº: 40

LOT1131H02

SEC ID Nº: 163 SEC ID Nº: 164 SEC ID Nº: 165 SEC ID Nº: 168 SEC ID Nº: 169 SEC ID Nº: 170

LOT1132H09

SEC ID Nº: 183 SEC ID Nº:184 SEC ID Nº: 185 SEC ID Nº: 188 SEC ID Nº: 189 SEC ID Nº: 190

LOT1133C11

SEC ID Nº: 193 SEC ID Nº: 194 SEC ID Nº: 195 SEC ID Nº: 198 SEC ID Nº: 199 SEC ID Nº: 200

LOT1134D09

SEC ID Nº: 203 SEC ID Nº: 204 SEC ID Nº: 205 SEC ID Nº: 208 SEC ID Nº: 209 SEC ID Nº: 210

LOT1146D07

SEC ID Nº: 223 SEC ID Nº: 224 SEC ID Nº: 225 SEC ID Nº: 228 SEC ID Nº: 229 SEC ID Nº: 230

LOT1147A03

SEC ID Nº: 433 SEC ID Nº: 434 SEC ID Nº: 435 SEC ID Nº: 438 SEC ID Nº: 439 SEC ID Nº: 440

LOT1147D02

SEC ID Nº: 233 SEC ID Nº: 234 SEC ID Nº: 235 SEC ID Nº: 238 SEC ID Nº: 239 SEC ID Nº: 240

LOT1147F02

SEC ID Nº: 443 SEC ID Nº: 444 SEC ID Nº: 445 SEC ID Nº: 448 SEC ID Nº: 449 SEC ID Nº: 450

LOT1147G09

SEC ID Nº: 243 SEC ID Nº: 244 SEC ID Nº: 245 SEC ID Nº: 248 SEC ID Nº: 249 SEC ID Nº: 250

LOT1149D09

SEC ID Nº: 453 SEC ID Nº: 454 SEC ID Nº: 455 SEC ID Nº: 458 SEC ID Nº: 459 SEC ID Nº: 460

LOT1150D09

SEC ID Nº: 463 SEC ID Nº: 464 SEC ID Nº: 465 SEC ID Nº: 468 SEC ID Nº: 469 SEC ID Nº: 470

LOT1150F01

SEC ID Nº: 253 SEC ID Nº: 254 SEC ID Nº: 255 SEC ID Nº: 258 SEC ID Nº: 259 SEC ID Nº: 260

LOT1150G08

SEC ID Nº: 473 SEC ID Nº: 474 SEC ID Nº: 475 SEC ID Nº: 478 SEC ID Nº: 479 SEC ID Nº: 480

LOT1152D05

SEC ID Nº: 483 SEC ID Nº: 484 SEC ID Nº: 485 SEC ID Nº: 488 SEC ID Nº: 489 SEC ID Nº: 490

LOT1152G10

SEC ID Nº: 493 SEC ID Nº: 494 SEC ID Nº: 495 SEC ID Nº: 498 SEC ID Nº: 499 SEC ID Nº: 500

LOT1156G06

SEC ID Nº: 503 SEC ID Nº: 504 SEC ID Nº: 505 SEC ID Nº: 508 SEC ID Nº: 509 SEC ID Nº: 510

LOT1160E03

SEC ID Nº: 293 SEC ID Nº: 294 SEC ID Nº: 295 SEC ID Nº: 298 SEC ID Nº: 299 SEC ID Nº: 300

LOT1165D04

SEC ID Nº: 303 SEC ID Nº: 304 SEC ID Nº: 305 SEC ID Nº: 308 SEC ID Nº: 309 SEC ID Nº: 310

LOT1215A06

SEC ID Nº: 513 SEC ID Nº: 514 SEC ID Nº: 515 SEC ID Nº: 518 SEC ID Nº: 519 SEC ID Nº: 520

LOT1218H05

SEC ID Nº: 353 SEC ID Nº: 354 SEC ID Nº: 355 SEC ID Nº: 358 SEC ID Nº: 359 SEC ID Nº: 360

LOT1219DO9

SEC ID Nº: 523 SEC ID Nº: 524 SEC ID Nº: 525 SEC ID Nº: 528 SEC ID Nº: 529 SEC ID Nº: 530

IgG

CI50 de inmovilización de calcio FLIPR (nM) CI50 de supervivencia de células PC12 (nM) CI50 de proliferación de células TF-1 (nM)

Clon

Parental NGF humano NGF de rata NGF de ratón NGF humano NGF de rata NGF humano NGF de rata NGF de ratón

1021E5

- 76 a 75 47 1300j

1083H4

- 30a 61 54 1100j

1126F1

1021E5 0,35 0,15 0,22 2,9

1126G5

1021E5 0,23 0,16 0,16 1,50

1126H5

1021E5 0,38 0,15 0,23 8,7

1127D9

1021E5 0,40 0,22 0,21 0,57

1127F9

1021E5 0,36 0,14 0,20 0,59

1131D7

1021E5 117 37 71 670

1131H2

1021E5 0,27 0,11 0,12 0,58

1132A9

1021E5 0,39 0,25 0,33 0,90

1132H9

1021E5 0,35 0,13 0,16 0,55

1133C11

1021E5 0,45a 0,30a 0,28a 0,53 ± 0,13b 0,42 ± 0,07b 0,10 ± 001d 0,12 ± 0,02d 0,10 ± 0,02d

1134D9

1021E5 0,31a 0,14a 0,16a 0,54

1145D1

1021E5 0,36 0,17 0,24 0,66

1146D7

1021E5 0,38 0,33 0,31 0,48

1147D2

1021E5 0,36 0,21 0,24 0,51

1147G9

1021E5 0,30 ± 0,04b 0,21 ± 0,02b 0,23 ± 0,02b 0,76 ± 0,06b

1150F1

1021E5 0,32 0,15 0,19 0,47

1152H5

1021E5 0,22 ± 0,05b 0,21 ± 0,05b 0,14 ± 0,01b 0,40 ± 0,04e

1155H1

1021E5 0,35 0,18 0,18 0,59

0,55 ± 0,02b

0,38 0,26 0,08 0,07 ± 0,04e ± 0,25d ± 0,0d ± 0,0d Tabla 4: Reactividad cruzada de anticuerpos IgG4 humana para NGF optimizados con otras neurotrofinas

G1152H5

1152H5 0,22 0,27 0,18 1,1 ± 0,1b 7,3 ± 0,9b 0,44 ± 0,17d 1,44 ± 0,27d 0,99 ± 0,29d

1158A1

1021E5 0,34 0,12 0,11 0,48

1160E3

1021E5 0,33 0,13 0,12 0,40

1165D4

1021E5 0,26 ± 0,02b 0,15 ± 0,01b 0,16 ± 0,04b 0,41 ± 0,08e 0,41 ± 0,06e

G1165D4

1165D4 0,32a 0,33a 0,27a 0,86 ± 0,04b 2,63 ± 0,03b

1175H8

1021E5 0,37 0,15 0,16 1,1

1211G10

1021E5 0,37 0,16 0,15 0,58

1214A1

1021E5 0,26a 0,16a 0,14a 0,52 ± 0,07b 0,43 ± 0,07b

1214D10

1021E5 0,29 0,14 0,13 0,35

1218H5

1021E5 0,33 0,13 0,15 0,47

1227H8

1083H4 0,44a 0,43a 0,48a 0,70 ± 0,15b 35 ± 10b

1230D8

1083H4 0,31a 0,29a 0,37a 0,71 ± 0,14b 37 ± 4b

1230H7

1021E5 0,27 ± 0,04b 0,18 ± 0,03b 0,15 ± 0,02b 0,42 ± 0,10c 0,32 ± 0,05c

G1230H7

1230H7 0,31a 0,34a 0,25a 2,5 ± 0,2b 7,5 ± 0,4b

1252A5

1133C11 0,33 ± 0,03c 0,29 ± 0,06c 0,26 ± 0,01c 0,94 ± 0,13f 2,7 ± 0,6f 0,42 ± ,15d 0,72 ± 0,40d 0,55 ± 0,32d

Mab 256

- 0,76 ± 0,15h 0,79 ± 0,08 g 1,4 ± 0,2i 23 ± 1i 44 ± 7f 6 ± 4d 5 ± 3d 7 ± 3d

Los datos son n=1 salvo; an=2 ; bn=3 ; cn=4 ; dn=5 ; en=6 ; fn=7 ; gn=12 ; hn=14 ; in=15 ; jextrapolado

IgG

BDNF, % NT-3, % NT-4, %

1133C11

0,7-3,1 0,9-1,8 0-1,7

1147G9

0-1,3 0,1-0,9 0-1,3

1152H5

0-1,5 0-0,5 0,2-1,2

1165D4

0-1,3 0-0,7 0-1,5

1214A1

0-1,4 0-1,0 0-1,0

1230H7

0-1,1 0-0,8 0-0,7

1252A5

0-1,4 0-1,1 0-0,9

Los datos en las columnas muestran el intervalo de reactividades cruzadas de anticuerpos calculadas. Los valores se calculan como porcentaje de la señal observada contra cada neurotrofina, con respecto a la señal de unión a NGF a la misma concentración de anticuerpo de prueba. Las neurotrofinas se recubrieron en placas de ensayo a una concentración de 100 ng/pocillo y la unión de anticuerpos de prueba se midió sobre el intervalo de concentración 0,03 – 10 nM. Los datos representan el resultado de un único experimento.

Tabla 5: Resumen de determinaciones de constantes de inhibición de la unión para 1252A5 y G1152H5. Los datos representan media ± e.e.m. de tres experimentos independientes

IgG

pKi frente a NGF humano pKi frente a NGF de rata

TrkA

p75 TrkA p75

1252A5

10,26 ± 0,08* 9,85 ± 0,04 9,79 ± 0,04** 9,55 ± 0,03

G1152H5

9,59 ± 0,08§ 9,56 ± 0,04 9,18 ± 0,08§ 9,24 ± 0,05

* P<0,01 en comparación con interacción de NGF hu / p75 ** P<0,05 en comparación con interacción de NGF de rata / p75 § N/S en comparación con p75 Prueba de la t de Student para datos independientes

Tabla 6

IgG

CI50 (nM) Ki (nM)

NGF

2,4 2,1

1252A5

0,068 0,061

G1152H5

0,204 0,184

MAB256

1,94 1,76

MAB5260Z

0,368 0,333

Tabla 7

IgG

CI50 (nM) Ki (nM)

NGF

1,3 1,2

1252A5

0,151 0,140

G1152H5

0,538 0,499

MAB256

1,48 1,38

MAB5260Z

0,310 0,288

5

Tabla 8

IgG

CI50 (nM) Ki (nM)

NGF

0,686 0,568

1252A5

0,188 0,155

G1152H5

0,348 0,288

MAB256

0,304 0,252

MAB5260Z

0,570 0,472

Tabla 9

IgG CI50 (nM) Ki (nM)

NGF 0,783 0,710 1252A5 0,302 0,274 G1152H5 0,781 0,708 MAB256 2,94 2,67 MAB5260Z 0,587 0,532

10 Listado de secuencias

<110>

Cambridge Antibody Technology Limited

<110>

Elan Pharma International Limited

<120> Miembros de unión específica para NGF 15 <130> SMW/CP6347033

<140>

<141>

<150> Documento US 60/645.587

<151> 20 <160> 537

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 396

<212> ADN 25 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1064F8

<400> 1

<210> 2

<211> 132

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1064F8

<400> 2

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1064F8

<400> 3

<210> 4 20 <211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1064F8 25 <400> 4

<210> 5

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos CDR3 de VH de 1064F8

<400> 5

10 <210> 6

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1064F8

<400> 6

<210> 7

<211> 110 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1064F8

<400> 7

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1064F8

<400> 8

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1064F8

<400> 9

<210> 10 15 <211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1064F8 20 <400> 10

<210> 11

<211> 381

<212> ADN 25 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1022E3

<400> 11

<210> 12

<211> 127

<212> PRT

<213> Homo sapiens 35 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1022E3

<400> 12

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1022E3

<400> 13

10 <210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1022E3

<400> 14

<210> 15

<211> 18 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1022E3

<400> 15

<210> 16

<211> 330

<212> ADN

<213>

Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1022E3

<400> 16

<210> 17

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1022E3

<400> 17

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1022E3

<400> 18

<210> 19 20 <211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1022E3 25 <400> 19

<210> 20

<211> 13

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1022E3

<400> 20

<210> 21

<211> 375

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1083H4

<400> 21

<210> 22

<211> 125

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1083H4

<400> 22

20 <210> 23

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 25 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1083H4

<400> 23

<210> 24

<211> 17 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1083H4

<400> 24

<210> 25

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1083H4

<400> 25

<210> 26 15 <211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1083H4 20 <400> 26

<210> 27

<211>

110 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1083H4

<400> 27

<210> 28

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1083H4

<400> 28

<210> 29

<211>

7 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1083H4

<400> 29

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1083H4

<400> 30

<210> 31 25 <211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1021E5 30 <400> 31

<210> 32

<211> 128

<212> PRT 35 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1021E5

<400> 32

<210> 33

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1021E5

<400> 33

10 <210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1021E5

<400> 34

<210> 35

<211> 19 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1021E5

<400> 35

<210> 36

<211> 330

<212> ADN

<213>

Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1021E5

<400> 36

<210> 37

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1021E5

<400> 37

<210> 38

<211> 13

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1021E5

<400> 38

<210> 39 20 <211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1021E5 25 <400> 39

<210> 40

<211> 11

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1021E5

<400> 40

<210> 41

<211> 366

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1033G9

<400> 41

10 <210> 42

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1033G9

<400> 42

<210> 43

<211> 5 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1033G9

<400> 43

<210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1033G9

<400> 44

<210> 45 5 <211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1033G9 10 <400> 45

<210> 46

<211> 324

<212> ADN 15 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1033G9

<400> 46

20 <210> 47

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 25 <223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1033G9

<400> 47

<210> 48 30 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1033G9

<400> 48

5 <210> 49

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 10 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1033G9

<400> 49

<210> 50

<211> 11 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1033G9

<400> 50

<210> 51

<211> 378

<212> ADN

<213> Homo sapiens 25 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1016A8

<400> 51

<210> 52 30 <211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1016A8 35 <400> 52

<210> 53

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1016A8

<400> 53

10 <210> 54

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1016A8

<400> 54

<210> 55

<211> 17 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1016A8

<400> 55

<210> 56

<211> 330

<212> ADN

<213>

Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1016A8

<400> 56

<210> 57

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1016A8

<400> 57

<210> 58

<211> 13

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1016A8

<400> 58

<210> 59 20 <211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1016A8 25 <400> 59

<210> 60

<211> 11

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1016A8

<400> 60

<210> 61

<211> 366

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1028F8

<400> 61

10 <210> 62

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1028F8

<400> 62

<210> 63 20 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1028F8 25 <400> 63

<210> 64

<211> 17

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1028F8

<400> 64

5 <210> 65

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 10 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1028F8

<400> 65

<210> 66

<211> 324 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1028F8

<400> 66

<210> 67

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1028F8

<400> 67

<210> 68

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1028F8

<400> 68

<210> 69

<211> 7 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1028F8

<400> 69

<210> 70

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1028F8

<400> 70

<210> 71 25 <211> 387

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1033B2 30 <400> 71

<210> 72

<211> 129

<212> PRT 35 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1033B2

<400> 72

<210> 73

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1033B2

<400> 73

10 <210> 74

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1033B2

<400> 74

<210> 75

<211> 20 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1033B2

<400> 75

<210> 76

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1033B2

<400> 76

<210> 77

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1033B2

<400> 77

<210> 78 15 <211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1033B2 20 <400> 78

<210> 79

<211> 7

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1033B2

<400> 79

30 <210> 80

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1033B2

<400> 80

<210> 81

<211> 387

<212> ADN

<213> Homo sapiens 10 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1024C4

<400> 81

<210> 82 15 <211> 129

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1024C4 20 <400> 82

<210> 83

<211> 5 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1024C4

<400> 83

<210> 84

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1024C4

<400> 84

<210> 85

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1024C4

<400> 85

<210> 86 20 <211> 318

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1024C4 25 <400> 86

<210> 87

<211> 106

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1024C4

<400> 87

<210> 88

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1024C4

<400> 88

10 <210> 89

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1024C4

<400> 89

<210> 90

<211> 9 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1024C4

<400> 90

<210> 91

<211> 363

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1057F11

<400> 91

<210> 92

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1057F11

<400> 92

10 <210> 93

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1057F11

<400> 93

<210> 94

<211> 17 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1057F11

<400> 94

<210> 95

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1057F11

<400> 95

10 <210> 96

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1057F11

<400> 96

<210> 97

<211> 107 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1057F11

<400> 97

<210> 98

<211> 11

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1057F11

<400> 98

<210> 99

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1057F11

<400> 99

<210> 100

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1057F11

<400> 100

<210> 101 20 <211> 385

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1126F1 25 <400> 101

<210> 102

<211> 128 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1126F1

<400> 102

<210> 103

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1126F1

<400> 103

10 <210> 104

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1126F1

<400> 104

<210> 105

<211> 19 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1126F1

<400> 105

<210> 106

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1126F1

<400> 106

<210> 107

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1126F1

<400> 107

10 <210> 108

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1126F1

<400> 108

<210> 109

<211> 7 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1126F1

<400> 109

<210> 110

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1126F1

<400> 110

<210> 111

<211> 385

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1126G5

<400> 111

10 <210> 112

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1126G5

<400> 112

<210> 113 20 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1126G5 25 <400> 113

<210> 114

<211> 17

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1126G5

<400> 114

5 <210> 115

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 10 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1126G5

<400> 115

<210> 116

<211> 330 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1126G5

<400> 116

<210> 117

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1126G5

<400> 117

<210> 118

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1126G5

<400> 118

10 <210> 119

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1126G5

<400> 119

<210> 120

<211> 11 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1126G5

<400> 120

<210> 121

<211> 386

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1126H5

<400> 121

<210> 122

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1126H5

<400> 122

10 <210> 123

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1126H5

<400> 123

<210> 124

<211> 17 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1126H5

<400> 124

<210> 125

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1126H5

<400> 125

10 <210> 126

<211> 331

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1126H5

<400> 126

<210> 127

<211> 110 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1126H5

<400> 127

<210> 128

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1126H5

<400> 128

<210> 129

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1126H5

<400> 129

<210> 130 15 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1126H5 20 <400> 130

<210> 131

<211> 378

<212> ADN 25 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1127D9

<400> 131

<210> 132

<211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens 35 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1127D9

<400> 132

<210> 133

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1127D9

<400> 133

10 <210> 134

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1127D9

<400> 134

<210> 135

<211> 17 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1127D9

<400> 135

<210> 136

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1127D9

<400> 136

<210> 137

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1127D9

<400> 137

10 <210> 138

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1127D9

<400> 138

<210> 139

<211> 7 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1127D9

<400> 139

<210> 140

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1127D9

<400> 140

<210> 141

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1127F9

<400> 141

10 <210> 142

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1127F9

<400> 142

<210> 143 20 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1127F9 25 <400> 143

<210> 144

<211> 17

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1127F9

<400> 144

5 <210> 145

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 10 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1127F9

<400> 145

<210> 146

<211> 330 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1127F9

<400> 146

<210> 147

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1127F9

<400> 147

<210> 148

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1127F9

<400> 148

10 <210> 149

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1127F9

<400> 149

<210> 150

<211> 11 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1127F9

<400> 150

<210> 151

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1131D7

<400> 151

<210> 152

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1131D7

<400> 152

10 <210> 153

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1131D7

<400> 153

<210> 154

<211>

17 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1131D7

<400> 154

<210> 155

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1131D7

<400> 155

<210> 156

<211>

330 10 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1131D7

<400> 156

<210> 157

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1131D7

<400> 157

25 <210> 158

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 30 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1131D7

<400> 158

<210> 159

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1131D7

<400> 159

<210> 160 10 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1131D7 15 <400> 160

<210> 161

<211> 384

<212> ADN 20 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1131H2

<400> 161

25 <210> 162

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 30 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1131H2

<400> 162

<210> 163

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1131H2

<400> 163

10 <210> 164

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1131H2

<400> 164

<210> 165

<211> 19 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1131H2

<400> 165

<210> 166

<211> 330

<212> ADN

<213>

Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1131H2

<400> 166

<210> 167

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1131H2

<400> 167

<210> 168

<211> 13

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1131H2

<400> 168

<210> 169 20 <211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1131H2 25 <400> 169

<210> 170

<211> 11 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1131H2

<400> 170

<210> 171

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1132A9

<400> 171

<210> 172

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1132A9

<400> 172

20 <210> 173

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 25 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1132A9

<400> 173

<210> 174

<211> 17 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1132A9

<400> 174

<210> 175

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1132A9

<400> 175

<210> 176 15 <211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1132A9 20 <400> 176

<210> 177

<211> 110

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1132A9

<400> 177

<210> 178

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1132A9

<400> 178

10 <210> 179

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1132A9

<400> 179

<210> 180

<211> 11 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1132A9

<400> 180

<210> 181

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1132H9

<400> 181

<210> 182

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1132H9

<400> 182

10 <210> 183

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1132H9

<400> 183

<210> 184

<211> 17 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1132H9

<400> 184

<210> 185

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1132H9

<400> 185

10 <210> 186

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1132H9

<400> 186

<210> 187

<211> 110 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1132H9

<400> 187

<210> 188

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1132H9

<400> 188

<210> 189

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1132H9

<400> 189

<210> 190 15 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1132H9 20 <400> 190

<210> 191

<211> 384

<212> ADN 25 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1133C11

<400> 191

30 <210> 192

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 35 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1133C11

<400> 192

<210> 193

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1133C11

<400> 193

10 <210> 194

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1133C11

<400> 194

<210> 195

<211> 19 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1133C11

<400> 195

<210> 196

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1133C11

<400> 196

<210> 197 5 <211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1133C11 10 <400> 197

<210> 198

<211> 13

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1133C11

<400> 198

20 <210> 199

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 25 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1133C11

<400> 199

<210> 200

<211> 11 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1133C11

<400> 200

<210> 201

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1134D9

<400> 201

10 <210> 202

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1134D9

<400> 202

<210> 203 20 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1134D9 25 <400> 203

<210> 204

<211> 17

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1134D9

<400> 204

5 <210> 205

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 10 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1134D9

<400> 205

<210> 206 15 <211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1134D9 20 <400> 206

<210> 207

<211> 110

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1134D9

<400> 207

<210> 208

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1134D9

<400> 208

10 <210> 209

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1134D9

<400> 209

<210> 210

<211> 11 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1134D9

<400> 210

<210> 211

<211> 384

<212> ADN

<213>

Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1145D1

<400> 211

<210> 212

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1145D1

<400> 212

<210> 213

<211> 5

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1145D1

<400> 213

<210> 214 20 <211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1145D1 25 <400> 214

<210> 215

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1145D1

<400> 215

<210> 216 10 <211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1145D1 15 <400> 216

<210> 217

<211> 110

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1145D1

<400> 217

<210> 218

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1145D1

<400> 218

<210> 219

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1145D1

<400> 219

10 <210> 220

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1145D1

<400> 220

<210> 221

<211> 384 20 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1146D7

<400> 221

<210> 222

<211> 128

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1146D7

<400> 222

<210> 223

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1146D7

<400> 223

<210> 224

<211> 17

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1146D7

<400> 224

<210> 225 20 <211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1146D7 25 <400> 225

<210> 226

<211> 330

<212> ADN 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1146D7

<400> 226

5 <210> 227

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 10 <223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1146D7

<400> 227

<210> 228

<211> 13 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1146D7

<400> 228

<210> 229

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1146D7

<400> 229

<210> 230 30 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1146D7

<400> 230

<210> 231

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1147D2

<400> 231

<210> 232

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1147D2

<400> 232

20 <210> 233

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 25 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1147D2

<400> 233

<210> 234

<211> 17 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1147D2

<400> 234

<210> 235

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1147D2

<400> 235

<210> 236 15 <211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1147D2 20 <400> 236

<210> 237

<211> 110

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1147D2

<400> 237

<210> 238

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1147D2

<400> 238

10 <210> 239

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1147D2

<400> 239

<210> 240

<211> 11 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1147D2

<400> 240

<210> 241

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1147G9

<400> 241

35 <210> 242

<211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 40 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1147G9

<400> 242

<210> 243

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1147G9

<400> 243

10 <210> 244

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1147G9

<400> 244

<210> 245

<211> 19 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1147G9

<400> 245

<210> 246

<211> 330

<212> ADN

<213>

Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1147G9

<400> 246

<210> 247

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1147G9

<400> 247

<210> 248

<211> 13

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1147G9

<400> 248

<210> 249 20 <211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1147G9 25 <400> 249

<210> 250

<211> 11

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1147G9

<400> 250

<210> 251

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1150F1

<400> 251

<210> 252

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1150F1

<400> 252

20 <210> 253

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 25 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1150F1

<400> 253

<210> 254

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1150F1

<400> 254

<210> 255

<211> 19 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1150F1

<400> 255

<210> 256

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens 20 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1150F1

<400> 256

<210> 257 25 <211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1150F1 30 <400> 257

<210> 258

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1150F1

<400> 258

10 <210> 259

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1150F1

<400> 259

<210> 260

<211> 11 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1150F1

<400> 260

<210> 261

<211> 384

<212> ADN

<213>

Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1152H5

<400> 261

<210> 262

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1152H5

<400> 262

<210> 263

<211> 5

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1152H5

<400> 263

<210> 264 20 <211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1152H5 25 <400> 264

<210> 265

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1152H5

<400> 265

<210> 266

<211> 330 10 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1152H5

<400> 266

<210> 267

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1152H5

<400> 267

25 <210> 268

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 30 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1152H5

<400> 268

<210> 269

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1152H5

<400> 269

<210> 270 10 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1152H5 15 <400> 270

<210> 271

<211> 384

<212> ADN 20 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1155H1

<400> 271

<210> 272

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1155H1

<400> 272

<210> 273

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1155H1

<400> 273

10 <210> 274

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1155H1

<400> 274

<210> 275

<211> 19 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1155H1

<400> 275

<210> 276

<211> 330

<212> ADN

<213>

Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1155H1

<400> 276

<210> 277

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1155H1

<400> 277

<210> 278

<211> 13

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1155H1

<400> 278

<210> 279 20 <211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1155H1 25 <400> 279

<210> 280

<211> 11

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1155H1

<400> 280

<210> 281

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1158A1

<400> 281

<210> 282

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1158A1

<400> 282

20 <210> 283

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 25 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1158A1

<400> 283

<210> 284

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1158A1

<400> 284

<210> 285

<211> 19 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1158A1

<400> 285

<210> 286

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens 20 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1158A1

<400> 286

<210> 287 25 <211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1158A1 30 <400> 287

<210> 288

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1158A1

<400> 288

10 <210> 289

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1158A1

<400> 289

<210> 290

<211> 11 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1158A1

<400> 290

<210> 291

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1160E3

<400> 291

<210> 292

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1160E3

<400> 292

10 <210> 293

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1160E3

<400> 293

<210> 294

<211> 17 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1160E3

<400> 294

<210> 295

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1160E3

<400> 295

10 <210> 296

<211> 327

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1160E3

<400> 296

<210> 297

<211> 109 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1160E3

<400> 297

<210> 298

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1160E3

<400> 298

<210> 299

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1160E3

<400> 299

<210> 300 15 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1160E3 20 <400> 300

<210> 301

<211> 384

<212> ADN 25 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1165D4

<400> 301

30 <210> 302

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 35 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1165D4

<400> 302

<210> 303

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1165D4

<400> 303

10 <210> 304

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1165D4

<400> 304

<210> 305

<211> 19 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1165D4

<400> 305

<210> 306

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1165D4

<400> 306

<210> 307

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1165D4

<400> 307

10 <210> 308

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1165D4

<400> 308

<210> 309

<211> 7 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1165D4

<400> 309

<210> 310

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1165D4

<400> 310

<210> 311

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1175H8

<400> 311

10 <210> 312

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1175H8

<400> 312

<210> 313 20 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1175H8 25 <400> 313

<210> 314

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1175H8

<400> 314

<210> 315

<211> 19

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1175H8

<400> 315

15 <210> 316

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 20 <223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1175H8

<400> 316

<210> 317

<211> 110 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1175H8

<400> 317

<210> 318

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1175H8

<400> 318

10 <210> 319

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1175H8

<400> 319

<210> 320

<211> 11 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1175H8

<400> 320

<210> 321

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1211G10

<400> 321

<210> 322

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1211G10

<400> 322

10 <210> 323

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1211G10

<400> 323

<210> 324

<211>

17 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1211G10

<400> 324

<210> 325

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1211G10

<400> 325

<210> 326

<211>

330 10 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1211G10

<400> 326

<210> 327

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1211G10

<400> 327

25 <210> 328

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 30 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1211G10

<400> 328

<210> 329

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1211G10

<400> 329

<210> 330 10 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1211G10 15 <400> 330

<210> 331

<211> 378

<212> ADN 20 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1214A1

<400> 331

25 <210> 332

<211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 30 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1214A1

<400> 332

<210> 333

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1214A1

<400> 333

10 <210> 334

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1214A1

<400> 334

<210> 335

<211> 17 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1214A1

<400> 335

<210> 336

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1214A1

<400> 336

<210> 337 5 <211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1214A1 10 <400> 337

<210> 338

<211> 13

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1214A1

<400> 338

20 <210> 339

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 25 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1214A1

<400> 339

<210> 340

<211> 11 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1214A1

<400> 340

<210> 341

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1214D10

<400> 341

10 <210> 342

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1214D10

<400> 342

<210> 343 20 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1214D10 25 <400> 343

<210> 344

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1214D10

<400> 344

<210> 345

<211> 19

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1214D10

<400> 345

<210> 346

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens 20 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1214D10

<400> 346

<210> 347 25 <211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1214D10 30 <400> 347

<210> 348

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1214D10

<400> 348

10 <210> 349

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1214D10

<400> 349

<210> 350

<211> 11 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1214D10

<400> 350

<210> 351

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1218H5

<400> 351

<210> 352

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1218H5

<400> 352

10 <210> 353

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1218H5

<400> 353

<210> 354

<211> 17 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1218H5

<400> 354

<210> 355

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1218H5

<400> 355

10 <210> 356

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1218H5

<400> 356

<210> 357

<211> 110 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1218H5

<400> 357

<210> 358

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1218H5

<400> 358

<210> 359

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1218H5

<400> 359

<210> 360 15 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1218H5 20 <400> 360

<210> 361

<211> 384

<212> ADN 25 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1230H7

<400> 361

30 <210> 362

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 35 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1230H7

<400> 362

<210> 363

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1230H7

<400> 363

10 <210> 364

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1230H7

<400> 364

<210> 365

<211> 19 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1230H7

<400> 365

<210> 366

<211> 327

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1230H7

<400> 366

<210> 367 5 <211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1230H7 10 <400> 367

<210> 368

<211> 13

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1230H7

<400> 368

20 <210> 369

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 25 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1230H7

<400> 369

<210> 370

<211> 11 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1230H7

<400> 370

<210> 371

<211> 375

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1227H8

<400> 371

10 <210> 372

<211> 125

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1227H8

<400> 372

<210> 373 20 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1227H8 25 <400> 373

<210> 374

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1227H8

<400> 374

<210> 375

<211> 16

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1227H8

<400> 375

15 <210> 376

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 20 <223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1227H8

<400> 376

<210> 377

<211> 110 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1227H8

<400> 377

<210> 378

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1227H8

<400> 378

10 <210> 379

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1227H8

<400> 379

<210> 380

<211> 11 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1227H8

<400> 380

<210> 381

<211> 375

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1230D8

<400> 381

<210> 382

<211> 125

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1230D8

<400> 382

10 <210> 383

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1230D8

<400> 383

<210> 384

<211> 17 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1230D8

<400> 384

<210> 385

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1230D8

<400> 385

10 <210> 386

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1230D8

<400> 386

<210> 387

<211> 110 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1230D8

<400> 387

<210> 388

<211> 13

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1230D8

<400> 388

<210> 389

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1230D8

<400> 389

<210> 390

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1230D8

<400> 390

<210> 391 20 <211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1252A5 25 <400> 391

<210> 392

<211> 128

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1252A5

<400> 392

<210> 393

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1252A5

<400> 393

10 <210> 394

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1252A5

<400> 394

<210> 395

<211> 19 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1252A5

<400> 395

<210> 396

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1252A5

<400> 396

<210> 397 5 <211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1252A5 10 <400> 397

<210> 398

<211> 13

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1252A5

<400> 398

20 <210> 399

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 25 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1252A5

<400> 399

<210> 400

<211> 11 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1252A5

<400> 400

<210> 401

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de G1152H5

<400> 401

10 <210> 402

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de G1152H5

<400> 402

<210> 403 20 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de G1152H5 25 <400> 403

<210> 404

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de G1152H5

<400> 404

<210> 405

<211> 19

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de G1152H5

<400> 405

<210> 406

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens 20 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de G1152H5

<400> 406

<210> 407 25 <211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de G1152H5 30 <400> 407

<210> 408

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de G1152H5

<400> 408

10 <210> 409

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de G1152H5

<400> 409

<210> 410

<211> 11 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de G1152H5

<400> 410

<210> 411

<211> 385

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de G1165D4

<400> 411

<210> 412

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de G1165D4

<400> 412

10 <210> 413

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de G1165D4

<400> 413

<210> 414

<211> 17 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de G1165D4

<400> 414

<210> 415

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de G1165D4

<400> 415

10 <210> 416

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de nucleótidos de VL de G1165D4

<400> 416

<210> 417

<211> 109 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de G1165D4

<400> 417

<210> 418

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de G1165D4

<400> 418

<210> 419

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de G1165D4

<400> 419

<210> 420 15 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de G1165D4 20 <400> 420

<210> 421

<211> 384

<212> ADN 25 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de G1230H7

<400> 421

30 <210> 422

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 35 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de G1230H7

<400> 422

<210> 423

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de G1230H7

<400> 423

10 <210> 424

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de G1230H7

<400> 424

<210> 425

<211> 19 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de G1230H7

<400> 425

<210> 426

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de G1230H7

<400> 426

<210> 427 5 <211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de G1230H7 10 <400> 427

<210> 428

<211> 13

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de G1230H7

<400> 428

20 <210> 429

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 25 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de G1230H7

<400> 429

<210> 430

<211> 11 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de G1230H7

<400> 430

<210> 431

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1147A3

<400> 431

10 <210> 432

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1147A3

<400> 432

<210> 433 20 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1147A3 25 <400> 433

<210> 434

<211> 17

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1147A3

<400> 434

5 <210> 435

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 10 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1147A3

<400> 435

<210> 436

<211> 327 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1147A3

<400> 436

<210> 437

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1147A3

<400> 437

<210> 438

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1147A3

<400> 438

<210> 439 10 <211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1147A3 15 <400> 439

<210> 440

<211> 11

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1147A3

<400> 440

25 <210> 441

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 30 <223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1147F2

<400> 441

<210> 442 35 <211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1147F2 40 <400> 442

<210> 443

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1147F2

<400> 443

10 <210> 444

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1147F2

<400> 444

<210> 445

<211> 19 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1147F2

<400> 445

<210> 446

<211> 327

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1147F2

<400> 446

<210> 447

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1147F2

<400> 447

<210> 448

<211> 13

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1147F2

<400> 448

20 <210> 449

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 25 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1147F2

<400> 449

<210> 450

<211> 10 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1147F2

<400> 450

<210> 451

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1149D9

<400> 451

<210> 452

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1149D9

<400> 452

20 <210> 453

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 25 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1149D9

<400> 453

<210> 454

<211> 17 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1149D9

<400> 454

<210> 455

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1149D9

<400> 455

<210> 456 15 <211> 327

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1149D9 20 <400> 456

<210> 457

<211> 109 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1149D9

<400> 457

<210> 458

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1149D9

<400> 458

10 <210> 459

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1149D9

<400> 459

<210> 460

<211> 11 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1149D9

<400> 460

<210> 461

<211> 384

<212> ADN

<213>

Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1150D9

<400> 461

<210> 462

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1150D9

<400> 462

<210> 463

<211> 5

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1150D9

<400> 463

<210> 464 20 <211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1150D9 25 <400> 464

<210> 465

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1150D9

<400> 465

<210> 466

<211> 327 10 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1150D9

<400> 466

<210> 467

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1150D9

<400> 467

25 <210> 468

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 30 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1150D9

<400> 468

<210> 469

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1150D9

<400> 469

<210> 470 10 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1150D9 15 <400> 470

<210> 471

<211> 384

<212> ADN 20 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1150G8

<400> 471

<210> 472

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1150G8

<400> 472

<210> 473

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1150G8

<400> 473

10 <210> 474

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1150G8

<400> 474

<210> 475

<211> 19 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1150G8

<400> 475

<210> 476

<211> 327

<212> ADN

<213>

Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1150G8

<400> 476

<210> 477

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1150G8

<400> 477

<210> 478

<211> 13

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1150G8

<400> 478

<210> 479 20 <211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1150G8 25 <400> 479

<210> 480

<211> 11

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1150G8

<400> 480

<210> 481

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1152D5

<400> 481

10 <210> 482

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1152D5

<400> 482

<210> 483 20 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1152D5 25 <400> 483

<210> 484

<211> 17

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1152D5

<400> 484

5 <210> 485

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 10 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1152D5

<400> 485

<210> 486

<211> 327 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1152D5

<400> 486

<210> 487

<211> 109

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 25 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1152D5

<400> 487

<210> 488

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1152D5

<400> 488

<210> 489

<211> 7

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1152D5

<400> 489

<210> 490 20 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1152D5 25 <400> 490

<210> 491

<211> 384

<212> ADN 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1152G10

<400> 491

<210> 492

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1152G10

<400> 492

10 <210> 493

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1152G10

<400> 493

<210> 494

<211> 17 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1152G10

<400> 494

<210> 495

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1152G10

<400> 495

10 <210> 496

<211> 327

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1152G10

<400> 496

<210> 497

<211> 109 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1152G10

<400> 497

<210> 498

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1152G10

<400> 498

<210> 499

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1152G10

<400> 499

<210> 500 15 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1152G10 20 <400> 500

<210> 501

<211> 384

<212> ADN 25 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1156G6

<400> 501

<210> 502

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens 35 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1156G6

<400> 502

<210> 503

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1156G6

<400> 503

10 <210> 504

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1156G6

<400> 504

<210> 505

<211> 19 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1156G6

<400> 505

<210> 506

<211> 327

<212> ADN

<213>

Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1156G6

<400> 506

<210> 507

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1156G6

<400> 507

<210> 508

<211> 13

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1156G6

<400> 508

<210> 509 20 <211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1156G6 25 <400> 509

<210> 510

<211> 11

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1156G6

<400> 510

<210> 511

<211> 384 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1215A06

<220> 10 <221> misc_feature

<222> (1) .. (28)

<223> n = a, c, g o t

<220>

<221> misc_feature 15 <222> (333)..(333)

<223> n = a, c, g o t

<400> 511

<210> 512 20 <211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1215A06 25 <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (10)

<223> Xaa es desconocido

<400> 512

<210> 513

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1215A06

<400> 513

10 <210> 514

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1215A06

<400> 514

<210> 515

<211> 19 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1215A06

<400> 515

<210> 516

<211> 327

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1215A06

<400> 516

<210> 517

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1215A06

<400> 517

<210> 518

<211> 13

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1215A06

<400> 518

20 <210> 519

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 25 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1215A06

<400> 519

<210> 520

<211> 11 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223 > Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1215A06

<400> 520

<210> 521

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VH de 1219D9

<400> 521

<210> 522

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VH de 1219D9

<400> 522

<210> 523 20 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 1219D9 25 <400> 523

<210> 524

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 1219D9

<400> 524

<210> 525

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de 1219D9

<400> 525

<210> 526 15 <211> 327

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de VL de 1219D9 20 <400> 526

<210> 527

<211> 109

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de VL de 1219D9

<400> 527

<210> 528

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL de 1219D9

<400> 528

10 <210> 529

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL de 1219D9

<400> 529

<210> 530

<211> 11 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL de 1219D9

<400> 530

<210> 531

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30 <400> 531

<210> 532

<211> 7

<212> PRT 35 <213> Homo sapiens

<400> 532

<210> 533

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 533

5 <210> 534

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Cebador FDTETSEQ24

<400> 534 tttgtcgtct ttccagacgt tagt 24

<210> 535

<211> 23 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador pUCreverse

<400> 535 20 agcggataac aatttcacac agg 23

<210> 536

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25 <220>

<223> Cebador Lseq

<400> 536 gattacgcca agctttggag c 21

<210> 537 30 <211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador MYC Seq 10

35 <400> 537 ctcttctgag atgagttttt g 21

Claims (33)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un miembro de unión específica aislado para factor de crecimiento nervioso (NGF), que comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo que está compuesto por un dominio VH de anticuerpo humano y un dominio VL de

   5 anticuerpo humano y que comprende un conjunto de CDR HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, en el que el dominio VH comprende HCDR1, HCDR2, HCDR3 y una región estructural y el dominio VL comprende LCDR1, LCDR2, LCDR3 y una región estructural, en el que el conjunto de CDR consiste en un conjunto de CDR seleccionado del grupo que consiste en:

   10 el conjunto 1133C11 de CDR, definido en el que la HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 193, la HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 194, la HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 195, la LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 198, la LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 199 y la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 200;

   15 un conjunto de CDR que contiene el conjunto 1133C11 de CDR con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 533

   o la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 532 sustituida por la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 531 dentro de HCDR3; y

   un conjunto de CDR que contiene una o dos sustituciones de aminoácidos en comparación con el conjunto 1133C11 20 de CDR, en el que la una o dos sustituciones se hacen en las siguientes posiciones de entre los grupos identificados de posibles residuos sustitutos para cada posición, usando la numeración convencional de Kabat:

   Posición de sustitución Residuo sustituto seleccionado del grupo que consiste en 31 en HCDR1: A 34 en HCDR1: V 51 en HCDR2: V 55 en HCDR2: N 56 en HCDR2: A 57 en HCDR2: V 58 en HCDR2: S 65 en HCDR2: D 96 en HCDR3: N 26 en LCDR1: T 26 en LCDR1: G 27 en LCDR1: N 27 en LCDR1: R

   27A en LCDR1: T 27A en LCDR1: P 27B en LCDR1: D 28 en LCDR1: T 29 en LCDR1: E 30 en LCDR1: D

   56 en LCDR2: T

   90 en LCDR3: A 94 en LCDR3: G.
2. 2. Un miembro de unión específica aislado según la reivindicación 1, en el que el residuo 29 dentro de LCDR1 es E. 25
3. 3. Un miembro de unión específica según la reivindicación 1, en el que: HCDR1 es SEC ID Nº: 163, HCDR2 es SEC ID Nº: 164, HCDR3 es SEC ID Nº: 165, LCDR1 es SEC ID Nº: 168, LCDR2 es SEC ID Nº: 169 y LCDR3 es SEC ID Nº: 170;

   HCDR1 es SEC ID Nº: 183, HCDR2 es SEC ID Nº: 184, HCDR3 es SEC ID Nº: 185, LCDR1 es SEC ID Nº: 188, 5 LCDR2 es SEC ID Nº: 189 y LCDR3 es SEC ID Nº: 190

   HCDR1 es SEC ID Nº: 193, HCDR2 es SEC ID Nº: 194, HCDR3 es SEC ID Nº: 195, LCDR1 es SEC ID Nº: 198, LCDR2 es SEC ID Nº: 199 y LCDR3 es SEC ID Nº: 200

   HCDR1 es SEC ID Nº: 203, HCDR2 es SEC ID Nº: 204, HCDR3 es SEC ID Nº: 205, LCDR1 es SEC ID Nº: 208, LCDR2 es SEC ID Nº: 209 y LCDR3 es SEC ID Nº: 210

   HCDR1 es SEC ID Nº: 223, HCDR2 es SEC ID Nº: 224, HCDR3 es SEC ID Nº: 225, LCDR1 es SEC ID Nº: 228, LCDR2 es SEC ID Nº: 229 y LCDR3 es SEC ID Nº: 230

   15 HCDR1 es SEC ID Nº: 433, HCDR2 es SEC ID Nº: 434, HCDR3 es SEC ID Nº: 435, LCDR1 es SEC ID Nº: 438, LCDR2 es SEC ID Nº: 439 y LCDR3 es SEC ID Nº: 440

   HCDR1 es SEC ID Nº: 233, HCDR2 es SEC ID Nº: 234, HCDR3 es SEC ID Nº: 235, LCDR1 es SEC ID Nº: 238, LCDR2 es SEC ID Nº: 239 y LCDR3 es SEC ID Nº: 240

   HCDR1 es SEC ID Nº: 443, HCDR2 es SEC ID Nº: 444, HCDR3 es SEC ID Nº: 445, LCDR1 es SEC ID Nº: 448, LCDR2 es SEC ID Nº: 449 y LCDR3 es SEC ID Nº: 450

   25 HCDR1 es SEC ID Nº: 243, HCDR2 es SEC ID Nº: 244, HCDR3 es SEC ID Nº: 245, LCDR1 es SEC ID Nº: 248, LCDR2 es SEC ID Nº: 249 y LCDR3 es SEC ID Nº: 250

   HCDR1 es SEC ID Nº: 453, HCDR2 es SEC ID Nº: 454, HCDR3 es SEC ID Nº: 455, LCDR1 es SEC ID Nº: 458, LCDR2 es SEC ID Nº: 459 y LCDR3 es SEC ID Nº: 460

   HCDR1 es SEC ID Nº: 463, HCDR2 es SEC ID Nº: 464, HCDR3 es SEC ID Nº: 465, LCDR1 es SEC ID Nº: 468, LCDR2 es SEC ID Nº: 469 y LCDR3 es SEC ID Nº: 470

   HCDR1 es SEC ID Nº: 253, HCDR2 es SEC ID Nº: 254, HCDR3 es SEC ID Nº: 255, LCDR1 es SEC ID Nº: 258, 35 LCDR2 es SEC ID Nº: 259 y LCDR3 es SEC ID Nº: 260

   HCDR1 es SEC ID Nº: 473, HCDR2 es SEC ID Nº: 474, HCDR3 es SEC ID Nº: 475, LCDR1 es SEC ID Nº: 478, LCDR2 es SEC ID Nº: 479 y LCDR3 es SEC ID Nº: 480

   HCDR1 es SEC ID Nº: 483, HCDR2 es SEC ID Nº: 484, HCDR3 es SEC ID Nº: 485, LCDR1 es SEC ID Nº: 488, LCDR2 es SEC ID Nº: 489 y LCDR3 es SEC ID Nº: 490

   HCDR1 es SEC ID Nº: 493, HCDR2 es SEC ID Nº: 494, HCDR3 es SEC ID Nº: 495, LCDR1 es SEC ID Nº: 498, LCDR2 es SEC ID Nº: 499 y LCDR3 es SEC ID Nº: 500

   45 HCDR1 es SEC ID Nº: 503, HCDR2 es SEC ID Nº: 504, HCDR3 es SEC ID Nº: 505, LCDR1 es SEC ID Nº: 508, LCDR2 es SEC ID Nº: 509 y LCDR3 es SEC ID Nº: 510

   HCDR1 es SEC ID Nº: 293, HCDR2 es SEC ID Nº: 294, HCDR3 es SEC ID Nº: 295, LCDR1 es SEC ID Nº: 298, LCDR2 es SEC ID Nº: 299 y LCDR3 es SEC ID Nº: 300

   HCDR1 es SEC ID Nº: 303, HCDR2 es SEC ID Nº: 304, HCDR3 es SEC ID Nº: 305, LCDR1 es SEC ID Nº: 308, LCDR2 es SEC ID Nº: 309 y LCDR3 es SEC ID Nº: 310

   55 HCDR1 es SEC ID Nº: 513, HCDR2 es SEC ID Nº: 514, HCDR3 es SEC ID Nº: 515, LCDR1 es SEC ID Nº: 518, LCDR2 es SEC ID Nº: 519 y LCDR3 es SEC ID Nº: 520

   HCDR1 es SEC ID Nº: 353, HCDR2 es SEC ID Nº: 354, HCDR3 es SEC ID Nº: 355, LCDR1 es SEC ID Nº: 358, LCDR2 es SEC ID Nº: 359 y LCDR3 es SEC ID Nº: 360; o

   HCDR1 es SEC ID Nº: 523, HCDR2 es SEC ID Nº: 524, HCDR3 es SEC ID Nº: 525, LCDR1 es SEC ID Nº: 528, LCDR2 es SEC ID Nº: 529 y LCDR3 es SEC ID Nº: 530.
4. 4. Un miembro de unión específica aislado según la reivindicación 1 que comprende un conjunto de CDR que 65 contiene el conjunto 1133C11 de CDR con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 531 sustituida por la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 533 dentro de HCDR3.
5. 5. Un miembro de unión específica aislado según la reivindicación 1 que comprende un conjunto de CDR que contiene el conjunto 1133C11 de CDR con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 531 sustituida por la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 532 dentro de HCDR3.

6. 6.

   Un miembro de unión específica aislado según la reivindicación 1 que comprende el conjunto 1133C11 de CDR.

7. 7.

   Un miembro de unión específica aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la región

   estructural del dominio VH es región estructural de la línea germinal de la cadena pesada humana y/o la región 10 estructural del dominio VL es región estructural de la línea germinal de la cadena ligera humana.
8. 8. Un miembro de unión específica aislado según la reivindicación 7, en el que la región estructural de la línea germinal de la cadena pesada comprende VH1 DP10.

   15 9. Un miembro de unión específica aislado según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que la región estructural de la línea germinal de la cadena ligera comprende VL Vλ1.
9. 10. Un miembro de unión específica aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que se une a NGF

   de rata o de ratón. 20
10. 11. Un miembro de unión específica aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que bloquea preferencialmente la unión de NGF a receptor TrkA con respecto a la unión de NGF a receptor p75.
11. 12. Un miembro de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 que comprende el dominio 25 VH de 1252A5 con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 392.
12. 13. Un miembro de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 que comprende el dominio VL de 1252A5 con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 397.

    30 14. Un miembro de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 que comprende el dominio VH de G1152H5 con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 402.
13. 15. Un miembro de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 o la reivindicación 14 que

    comprende el dominio VL de G1152H5 con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 407. 35
14. 16. Un miembro de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 que comprende el dominio VH de G1165D4 con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 412.
15. 17. Un miembro de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 o la reivindicación 16 que 40 comprende el dominio VL de G1165D4 con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 417.
16. 18. Un miembro de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 que comprende el dominio VH de G1230H7 con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 422.

    45 19. Un miembro de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 o la reivindicación 18 que comprende el dominio VL de G1230H7 con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 427.
17. 20. Un miembro de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 que comprende una

    molécula de anticuerpo scFv. 50
18. 21. Un miembro de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 que comprende una región constante de anticuerpo.
19. 22. Un miembro de unión específica según la reivindicación 21 que comprende un anticuerpo completo. 55

20. 23.

    Un miembro de unión específica según la reivindicación 22, en el que el anticuerpo completo es IgG4.

21. 24.

    Una molécula de anticuerpo aislado que se une a NGF humano, en la que la molécula de anticuerpo comprende

    un dominio VH y un dominio VL y en la que la secuencia de aminoácidos del dominio VH es SEC ID Nº: 392 y la 60 secuencia de aminoácidos de dominio VL es SEC ID Nº: 397.
22. 25. Una molécula de anticuerpo según la reivindicación 24, en la que la molécula de anticuerpo es IgG4.

23. 26.

    Una composición que comprende un miembro de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 65 1 a 23 o una molécula de anticuerpo según la reivindicación 24 o 25 y al menos un componente adicional.

24. 27. Una composición según la reivindicación 26 que comprende un excipiente, vehículo o soporte farmacéuticamente aceptable.

25. 28.

    Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un miembro de unión 5 específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 o una molécula de anticuerpo según la reivindicación 24 o

26. 25.
27. 29. Una célula huésped in vitro transformada con ácido nucleico según la reivindicación 28.

    10 30. Una célula huésped in vitro transformada con:

    un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica el dominio VH de un miembro de unión específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 o que codifica el dominio VH de una molécula de anticuerpo según la reivindicación 24 o la reivindicación 25, y

    15 un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica el dominio VL de un miembro de unión específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 o que codifica el dominio VL de una molécula de anticuerpo según la reivindicación 24 o la reivindicación 25.

    20 31. Un procedimiento de producción de un miembro de unión específica o molécula de anticuerpo, que comprende el procedimiento de cultivo de células huésped según la reivindicación 29 o la reivindicación 30 en condiciones para la producción de dicho miembro de unión específica o molécula de anticuerpo.
28. 32. Un procedimiento según la reivindicación 31 que comprende además aislar y/o purificar dicho miembro de unión 25 específica o molécula de anticuerpo.
29. 33. Un procedimiento según la reivindicación 31 o la reivindicación 32 que comprende además formular el miembro de unión específica o molécula de anticuerpo en una composición que incluye al menos un componente adicional.

    30 34. Un procedimiento que comprende unir un miembro de unión específica o molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 a NGF humano o un fragmento de NGF humano, teniendo lugar dicha unión in vitro.
30. 35. Un procedimiento según la reivindicación 34 que comprende determinar la cantidad de unión de dicho miembro 35 de unión específica o anticuerpo a NGF o un fragmento de NGF.
31. 36. Uso de un miembro de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, o una molécula de anticuerpo según la reivindicación 24 o la reivindicación 25, en la fabricación de un medicamento para tratamiento de una afección en la que NGF desempeña una función, en el que la afección está seleccionada del grupo que consiste

    40 en dolor, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar, otras enfermedades de inflamación de las vías respiratorias, neuropatía diabética, arritmias cardíacas, VIH, artritis, psoriasis y cáncer.
32. 37. Un miembro de unión específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, o una molécula de anticuerpo según la reivindicación 24 o la reivindicación 25, para su uso en el tratamiento de una afección en la que NGF

    45 desempeña una función, en el que la afección está seleccionada del grupo que consiste en dolor, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar, otras enfermedades de inflamación de las vías respiratorias, neuropatía diabética, arritmias cardíacas, VIH, artritis, psoriasis y cáncer.
33. 38. Uso según la reivindicación 36, o un miembro de unión específica o molécula de anticuerpo según la 50 reivindicación 37, en el que dicho tratamiento es de dolor.