BRPI0606933B1 - membro de ligação específico isolado para fator de crescimento de nervos, molécula de anticorpo isolado, composição e uso de um membro de ligação específico - Google Patents

Abstract

membro de ligação específico isolado para fator de crescimento de nervos, molécula de anticorpo isolado que se liga a ngf humano, comiposição, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, método para produzir um membro de ligação específico ou molécula de anticorpo, e, uso de um membro de ligação específico ou uma molécula de anticorpo. os membros de ligação específicos para fator de crescimento de nervos (ngf) particularmente moléculas de anticorpo anti-ngf, especialmente moléculas de anticorpo humano, e especialmente os que neutralizam a atividade de ngf. os métodos para usar as moléculas de anticorpo anti-ngf em diagnóstico ou tratamento de distúrbios relacionados com ngf, incluindo dor, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose pulmonar, outras doenças de inflamação das vias aéreas, neuropatia diabética, arritmias cardíacas, mv, artrite, psoríase e câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MEMBRO DE LIGAÇÃO ESPECÍFICO ISOLADO PARA FATOR DE CRESCIMENTO DE NERVOS, MOLÉCULA DE ANTICORPO ISOLADO, COMPOSIÇÃO E USO DE UM MEMBRO DE LIGAÇÃO ESPECÍFICO".

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL APRESENTADO EM UM DISQUETE

[001] Uma cópia em disquete da Listagem de Seqüências de seqüências 1 a 537, que é salvada como seqüência listing.txt e tem 253 KB, é apresentada com o presente e incorporada aqui por referência em sua totalidade para todos os fins.

[002] A presente invenção refere-se a membros de ligação específicos, em particular moléculas de anticorpo anti-NGF, especialmente moléculas de anticorpo humano, e especialmente as que neutralizam atividade de NGF (fator de crescimento de nervos). Ela ainda se refere a métodos para usar moléculas de anticorpo anti-NGF em diagnose ou tratamento de distúrbios relacionados com NGF, incluindo dor, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose pulmonar, outras doenças de inflamação das vias aéreas, neuropatia diabética, arritmias cardíacas, HIV, artrite, psoríase e câncer.

[003] A presente invenção provê moléculas de anticorpo de valor particular em ligação e neutralização de NGF, e assim de uso dentre uma variedade de tratamentos terapêuticos, como indicado pela experimentação aqui contida e ainda pela literatura técnica de suporte.

[004] Fator de crescimento de nervos (β-NGF, comumente conhecido como NGF) desempenha um papel pivotante bem conhecido no desenvolvimento do sistema nervoso. No adulto, no entanto, NGF desempenha um papel mais limitado, onde ele promove a saúde e sobrevivência de um subconjunto de neurônios centrais e periféricos (Huang & Reichardt, 2001). NGF também contribui para a modulação das características funcionais destes neurônios. Uma parte deste último processo, NGF exerce um controle tônico sobre a sensibilidade ou excitabilidade de nociceptores (Priestley et al., 2002; Bennett, 2001). Estes neurônios periféricos sentem e transmitem para o sistema nervoso central os vários estímulos danosos que por fim dão lugar a percepções de dor (nocicepção). Assim, agentes que reduzem os níveis de NGF podem possuir utilidade como agentes terapêuticos analgésicos.

[005] O custo para sociedade de dor tratada de modo inadequado ainda suporta a utilidade potencial de analgésicos com base em uma atividade anti-NGF. Isto é, apesar da existência e uso difundido de numerosas medicações para a dor, existe a necessidade clara de novos analgésicos. A dor é um dos sintomas mais comuns para os quais um auxílio médico é procurado e é a queixa primaria de metade de todos os pacientes que visitam um médico. O custo elevado de dor para a sociedade é bem documentado. Nos Estados Unidos, por exemplo, a dor crônica afeta 34 milhões de americanos. A dor resulta em 50 milhões de dias de trabalho perdidos a cada ano. Os custos médicos diretos atribuídos à dor nas costas, dor artrítica, e enxaqueca chegam a $ 40 bilhões de dólares anualmente apenas. O mercado de medicações para dor de prescrição total é de aproximadamente $ 15 bilhões por ano. (Pleuvry & Pleuvry).

[006] Como estas estatísticas sugerem, uma porcentagem substancial de sofredores de dor deixam de receber um alívio adequado da dor. Como uma conseqüência, permanece uma grande necessidade médica de analgésicos seguros e efetivos com novos mecanismos de ação (Pleuvry & Pleuvry).

[007] Os agentes terapêuticos que reduzem os níveis de tecido ou inibem os efeitos de NGF secretado tem o potencial se serem tais analgésicos novos. As injeções subcutâneas do próprio NGF produz dor em humanos e animais. Assim, NGF injetado causa uma hiperalgesia térmica rápida, seguido por hiperalgesia térmica retardada e alodinina mecânica (Petty et al., 1994; McArthur et al., 2000). NGF endogenamente secretado é similarmente pro-nociceptivo. A liberação induzida por dano ao tecido e NGF e sua subseqüente ação na periferia desempenha um papel principal na indução hiperalgesia térmica através do p de "sensitização periférica' (Mendell & Arvanian, 2002). O dano ao tecido promove a liberação de citocinas pro-nociceptivas e pro-inflamatórias, que, por sua vez, induzem a liberação de NGF de queratinócitos e fibroblastos. Este NGF liberado atua diretamente em nociceptores para induzir um estado doloroso e nociceptivo dentro de minutos do insulto danoso. Este NGF também atua indiretamente para induzir estados nociceptivos/dolorosos. Ele aciona a desgranulação de células -tronco, liberando agentes pro-nociceptivos como histamina e serotonina e importantemente, mais NGF, e também pode estimular os terminais nervosos simpatéticos para liberar neurotransmissores pro-nociceptivos, como noradrenalina (Ma & Woolf, 1997).

[008] Os níveis de tecidos de NGF são elevados em animais injetados com CFA- e carragenano (Ma & Woolf, 1997; Amann & Schuligoi, 2000). Além disso, níveis aumentados de NGF foram documentados em pacientes sofrendo de artrite reumatóide (Aloe & Tuveri, 1997) ou cistite (Lowe et al., 1997). Em roedores, o dano ao nervo periférico aumenta a expressão de NGF mRNA em macrófagos, fibroblastos e células de Schwann (Heumann et al., 1987). A super-expressão de NGF em camundongos transgênicos resulta em melhorado comportamento de dor neuropática após um dano aos nervosos acima do camundongo de tipo selvagem (Ramer et al., 1998) . Durante horas e dias, níveis de NGF elevados desempenham um papel na promoção de sensibilização central" - a melhora de neurotransmissão em sinapses nas vias nociceptivas da medula espinhal. A sensitização central resulta em hiperalgesia e alodinia persistentes e crônicas. Este processo envolve, como se pensa, a internalização de complexos de NGF e seu receptor de afinidade elevada , trkA (receptor de tirosina quinase A). O transporte retrogrado destes complexos para corpos de células nociceptoras nos gânglios da raiz dorsal (DRG) potencia a secreção de neuropeptídeos nociceptivos (por exemplo, substância P, CGRP), ativação de PKC, e ativação de receptor de NMDA no cifre frosal da medula espinhal (Sah et al., 2003) - todos processos que promovem a sensitização das vias nociceptivas. NGF também desempenha um papel na regulação positiva e re-distribuição canais de íons dependentes de voltagem e ligados a ligandos, incluindo subtipos de canal de sódio e o receptor de capsaicina, VR1 (Mamet et al., 1999; Fjell et al., 1999; Priestley et al., 2002).

[009] As atividades e/ou expressão alteradas de transmissores, receptores e canais de íon estão subjacentes às aumentadas sensibilidade e excitabilidade de nociceptores associados com estados de dor neuropática.

[0010] NGF também pode promover a brotação de neurônios simpatéticos e a formação de inervação aberrante de neurônios nociceptivos. Pensa-se que esta inervação contribui para a indução e manutenção de estados crônicos nociceptivos dor, como dor mantida simpateticamente ou síndrome de dor regional complexa (Ramer et al., 1999) .

[0011] Nocicepção/dor induzidas por NGF é mediada pelo receptor de NGF de alta afinidade, trkA (receptor de tirosina quinase A) (Sah, et al., 2003). Cerca de 40 - 45% corpos celulares nociceptores em DRGs expressam trkA. Estes são os corpos celulares das fibras de diâmetro pequeno ou fibras C-, que também expressam os peptídeos pro-nociceptivos secretados, substância P e CGRP. Estas fibras terminam em laminas I e II do chifre dorsal, onde elas transferem para o sistema nervoso central os estímulos danos sentidos pelos nociceptores periféricos. Mutações ou deleções em gene trkA produzem um fenótipo caracterizado por perda da sensação de dor tanto em humanos (Indo, 2002) como em camundongo trkA de abate (de Castro et al., 1998). Significantemente, a expressão de trkA é regulada de modo positivo em animais submetidos a modelos de dor artrítica (Pozza et al., 2000) ou cistítica (Qiao & Vizzard, 2002), ou a dor inflamatória induzida por injeção de adjuvante completo de Freund (CFA) ou carragenano na pata (Cho et al., 1996).

[0012] NGF também liga ao receptor de neurotrofina p75. O papel do receptor de p75 é dependente de seu meio celular e a presença de outros receptores com os quais se acredita eles desempenham uma função acessória ou de co-receptor. Interação entre os receptores de trkA e de p75 resulta na formação sítios de ligação de alta afinidade para NGF. A importância de interações de receptor em sinalização de dor mediada por NGF não é evidente, mas estudos recentes tem implicado o receptor de p75 em processos celulares que podem ser relevantes (Zhang & Nicol, 2004). No entanto, apesar dos camundongos de abate de receptor de p75 demonstrarem limiares elevados aos estímulos danosos, eles permanecem respondentes aos efeitos hiperalgésicos de NGF, sugerindo que os receptores de trkA sozinhos são suficientes para mediar estes efeitos (Bergmann et al., 1998).

[0013] A evidência citada acima indica que os processos mediados por NGF são responsáveis pela indução de dor aguda, dor a curto prazo, dor nociceptiva persistente, e dor neuropática persistente a crônica. Assim, os agentes anti-NGF são indicados como tendo utilidade como analgésicos efetivos para o tratamento das pessoas que sofrem de qualquer um destes vários estados de dor.

[0014] Um tal agente anti-NGF é trkA-Fc, que atua como uma isca ou chamariz para ligar, e assim inativar, o NGF endógeno. TrkA-Fc é uma proteína de fusão consistindo da região de ligação de NGF de trkA ligada a um fragmento de domínio constante (Fc) de um anticorpo IgG. TrkA-Fc produz hipoalgesia em animais nativos, diminui as respostas nociceptoras, e diminui a brotação de neurônios sensíveis a dor não mielinados (Bennett et al., 1998).

[0015] Os anti-soros criados contra NGF também podem reduzir os níveis de NGF quando injetados localmente ou sistemicamente. Ambos os anti-soros anti-NGF como trkA-Fc atenuam a dor na pata inflamatória induzida por carragenano ou CFA (Koltzenberg et al., 1999) e respostas de bexiga inflamada em ratos (Jaggar et al., 1999). O anti-soro anti-NGF bloqueia hiperalgesia por calor e frio, reverte a hiperalgesia térmica estabelecida e evita a brotação colateral em modelo de dano por constrição crônica de dor neuropática (Woolf, 1996; Ro et al., 1999). Inibidores de molécula pequena da interação trkA-NGF também foram relatados. Em ratos, o inibidor de NGF-trkA ALE-0540 reduz a hiperalgesia em um modelo de dor inflamatória termicamente e no teste com formalina de dor aguda e persistente (Owolabi et al., 1999). ALE-0540 também reduz a alodinia mecânica em modelo de dano ao nervo ciático (Owolabi et al., 1999).

[0016] Os anticorpos terapêuticos em geral mantém a promessa de um grau de seletividade de marcação dentro da família de receptores intimamente relacionados, ligandos de receptor, canais ou enzimas, o que é raramente atingido com fármacos de moléculas pequenas. A dor mediada por NGF é particularmente bem apropriada para o tratamento seguro e efetivo com anticorpos porque os níveis de NGF aumenta na periferia em resposta a estímulos nocivos e os anticorpos tem uma baixa permeabilidade na barreira sangue-cérebro. Enquanto os anticorpos policlonais tem demonstrado ser efetivos em modelos animais de dor, os anticorpos monoclonais anti- NGF são mais prováveis de serem desenvolvidos com sucesso como agentes terapêuticos para humanos devido às vantagens na fabricação e caracterização de uma entidade química consistente, bem definida. Os efeitos anti-nociceptivos de anticorpos monoclonais NGF anti-camundongos (Sammons et al., 2000) foram relatados, mas as seqüências de e aminoácidos destas anticorpos não foram obtidas. [0017] Evidência recente sugere que NGF promove outras patologias além de dor. Assim, os anticorpos anti-NGF também podem possuir utilidade para o tratamento além das doenças mediadas por NGF, incluindo mas não limitadas a asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose pulmonar, outras doenças de inflamação das vias aéreas (Hoyle, 2003; Lomatzch et al., 2003), neuropatia diabética (Yasuda et al., 2003), arritmias cardíacas (WO04/032852), HIV (Garaci et al., 2003), artrite, psoríase e câncer (Nakagawara, 2001).

[0018] WO02/096458 refere-se a anticorpos anti-NGF, em particular anticorpo monoclonal 911, de camundongos, e o uso destes anticorpos em tratamento de vários distúrbios relacionados com NGF, incluindo dor, asma, artrite e psoríase. Afirma que o anticorpo 911 não tem efeito adverso sobre o sistema imune em um modelo de camundongo experimental de alergia. Estes anticorpos foram também descritos por Hongo et al., 2000.

[0019] WO04/032870 descreve o efeito redutor de dor anticorpo monoclonal NGF de camundongo mab 911 e anticorpo de NGF humanizado E3 em modelos experimentais de dor pós-operação. E3 difere de região constante gama2a de cadeia pesada para 2 aminoácidos.

[0020] WO04/032852 descreve métodos para prevenir dor cardíaca súbita e para o tratamento arritmias cardíacas usando antagonistas de NGF.

[0021] WO 01/78698 descreve o uso de anti-soro policlonal a NGF para tratar dor visceral crônica.

[0022] A presente invenção provê membros de ligação específicos para NGF, preferivelmente NGF humano. Assim, um membro de ligação específico da invenção pode ligar NGF humano ou NGF não humano (por exemplo NGF de primata não humano e/ou NGF de rato e/ou NGF de camundongo).

[0023] Membros de ligação específicos da invenção podem ser anticorpos para NGF humano, especialmente anticorpos humanos, que podem ser reativos cruzados com NGF não humano, incluindo NGF de primata não humano e/ou NGF de camundongo e/ou NGF de rato.

[0024] Membro de ligação específico de acordo com a presente invenção preferivelmente neutraliza NGF. Neutralização significa redução ou inibição de atividade biológica de NGF, por exemplo redução ou inibição de ligação de NGF a uma ou mais de seus receptores (preferivelmente TrkA). A redução em atividade biológica pode ser parcial ou total. O grau em que um anticorpo neutraliza NGF é referido como sua potência neutralizante. Potência pode ser determinada ou medida usando uma ou mais testes bem conhecidos dos versados e/ou como descritos ou referidos aqui, por exemplo: - "FLIPR" teste de mobilização de cálcio (ver Exemplo 2 aqui) - PC12 teste de sobrevivência (ver Exemplo 5 aqui ) - TF-1 teste de proliferação (ver Exemplo 6 aqui ) - Teste de inibição de ligação de receptor (ver Exemplo 9 aqui).

[0025] Testes e potências são descritos em maiores detalhes em outras partes.

[0026] Membros de ligação específicos da presente invenção podem ser otimizados para potência neutralizante. Geralmente otimização da potência envolve mutação da seqüência de um membro de ligação específico selecionado (normalmente a seqüência de domínio variável de um anticorpo) para gerar uma biblioteca de membros de ligação específicos, que são então testados para potência e os membros de ligação específicos mais potentes são selecionados. Assim, os membros de ligação específicos "otimizados em potência" selecionados tendem a ter uma maior potência do que o membro de ligação específico a partir do qual a biblioteca foi gerada. Mesmo assim, membros de ligação específicos de potência elevada podem ser também obtidos sem otimização, por exemplo um membro de ligação específico de potência elevada pode ser obtido diretamente de uma triagem inicial, por exemplo um teste de neutralização bioquímico. A presente invenção provê membros de ligação específicos tanto otimizados em potência como não otimizados, assim como métodos para otimização da potência a partir de um membro de ligação específico selecionado. A presente invenção assim permite ao versado na arte gerar membros de ligação específicos tendo potência elevada. [0027] Um membro de ligação específico de acordo com a presente invenção preferivelmente demonstra atividade anti-hiperalgésica e/ou antialodínica, por exemplo inibe a hiperalgesia térmica induzida por carragenano.

[0028] Em algumas formas de realização, um membro de ligação específico da invenção compreende uma molécula de anticorpo. Em outras formas de realização, um membro de ligação específico da invenção compreende um sítio de ligação de antígeno dentro de uma molécula não anticorpo, por exemplo um conjunto de CDRs em um andaime de uma proteína não anticorpo, como discutido ainda abaixo. [0029] Em vários aspectos e formas de realização da invenção provê-se o assunto das reivindicações incluídas abaixo.

[0030] As formas de realização preferidas dentro da presente invenção são moléculas de anticorpo, seja de anticorpo completo (por exemplo IgG, como IgG4) ou de fragmentos de anticorpo (por exemplo scFv, Fab, dAb). Preferivelmente, uma molécula de anticorpo da invenção é uma molécula de anticorpo humano. Moléculas de anticorpo compreendendo sítios de ligação de anticorpo - antígeno são providas, assim como o são domínios VH e VL de anticorpos. Dentro de domínios VH e VL são providas regiões de determinação de complementaridade, ("CDRs"), e regiões de estrutura principal, ("FRs"), para formar domínios VH ou VL, conforme for o caso. Um sítio de ligação de anticorpo - antígeno pode consistir de um domínio VH e/ou um domínio VL de anticorpo. Todas as seqüências de VH e VL, seqüências de CDR, conjuntos de CDRs e conjuntos de HCDRs e conjuntos de LCDRs descritos aqui representam aspectos e formas de realização da invenção. Um "conjunto de CDRs" compreende CDR1, CDR2 e CDR3. Assim, um conjunto de HCDRs significa HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e um conjunto de LCDRs significa LCDR1, LCDR2 e LCDR3. Salvo especificado em contrário, um "conjunto de CDRs" inclui HCDRs e LCDRs.

[0031] Exemplos de domínios VH e VL de anticorpo e CDRs de acordo com a presente invenção são como listados na listagem de seqüências anexa.

[0032] Várias linhagens de anticorpos são descritas aqui, definidas com referência às seqüências, por exemplo um conjunto de seqüências de CDR, opcionalmente com uma ou mais, por exemplo uma ou duas, ou duas substituições. A linhagem original preferida é a linhagem 1021E5. A linhagem 1021E5 inclui a molécula de anticorpo 1133C11 preferida e outras moléculas de anticorpo da " linhagem 1133C11 ", incluindo 1252A5. Também dentro da linhagem original 1021E5 estão as moléculas de anticorpo 1165D4, 1230H7 e 1152H5. Os presentes inventores identificaram as linhagens 1021E5, 1083H4 e especialmente 1133C11 de modo a prover um sítio de ligação anticorpo - antígeno contra NGF que são de valor particular.

[0033] A linhagem de 1133C11 é definida com referência a um conjunto de seis seqüências de CDR de 1133C11 como a seguir: HCDR1 SEQ ID NO: 193, HCDR2 SEQ ID NO: 194, HCDR3 SEQ ID NO: 195, LCDR1 SEQ ID NO: 198, LCDR2 SEQ ID NO: 199, e LCDR3 SEQ ID NO: 200. Os conjuntos de CDRs em que o HCDR1 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193, o HCDR2 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 194, o HCDR3 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 195, o LCDR1 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 198, o LCDR2 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 199, e o LCDR3 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 200, são aqui referidos como o "conjunto 113C11 de CDRs". Os HCDR1, HCDR2 e HCDR3 dentro do conjunto 113C11 de CDRs são referidos como o "conjunto 113C11 de HCDRs" e os LCDR1, LCDR2 e LCDR3 dentro do conjunto 113C11 de CDRs são referidos como o "conjunto 113C11 de LCDRs". Um conjunto de CDRs com o conjunto 113C11 de CDRs, conjunto 113C11 de HCDRs ou 1133C11 LCDRs, ou uma ou duas substituições no mesmo, é referido como sendo da linhagem 1133C11.

[0034] Outras linhagens preferidas e conjuntos de CDRs são definidos com referência aos CDRs análogos, como especificado aqui, incluindo, como formas de realização preferidas, os conjuntos de CDRs descritos em Tabela 2a (com SEQ ID NOS como especificado em Tabela 2b). Tabela 2a e Tabela 2b mostram conjuntos de CDRs (HCDRs e LCDRs) de clones otimizados derivados de clone 1021E5, ilustrando como as seqüências de CDR dos clones otimizados diferem das de 1021E5. Um conjunto de CDRs da Tabela 2a/2b inclui um conjunto de HCDRs e/ou um conjunto de LCDRs de qualquer clone ilustrado na tabela, opcionalmente incluindo o próprio 1021E5.

[0035] Conjuntos de CDRs dos mesmos são providos, como indicado, assim como são conjuntos de CDRs com as seqüências descritas contendo uma ou mais substituições de aminoácidos.

[0036] A presente invenção também provê membros de ligação específicos e moléculas de anticorpo compreendendo os conjuntos de CDRs definidos, conjunto de HCDRs ou conjunto de LCDRs, como descrito aqui, e conjuntos de CDRs de uma ou duas substituições dentro do conjunto descrito de CDRs. O conjunto relevante de CDRs é provido dentro de uma estrutura principal de anticorpo ou outro andaime de proteína, por exemplo fibronectina ou citocromo B (Koide et al., 1998; Nygren et al., 1997), como discutido abaixo. Preferivelmente regiões de estrutura principal de anticorpo são empregadas. Por exemplo, um ou mais CDRs ou um conjunto de CDRs de um anticorpo podem ser enxertados em uma estrutura principal (por exemplo estrutura principal humana) para prover uma molécula de anticorpo ou moléculas de anticorpo diferentes. Por exemplo, uma molécula de anticorpo pode compreender CDRs de um anticorpo da linhagem 1021E5 e regiões de estrutura principal das seqüências de segmento de gene de linhagem germinativa humana. Um anticorpo de uma linhagem pode ser provido com um conjunto de CDRs dentro de uma estrutura principal que pode ser submetida "à formação da linhagem germinativa", onde um ou mais resíduos dentro da estrutura principal são mudados para se igualar aos resíduos na posição equivalente na estrutura principal de linhagem germinativa humana mais similar (por exemplo DP10 da família VH1) ou uma estrutura principal da família λ1 por exemplo DPL5. Assim, regiões de estrutura principal de anticorpo são preferivelmente de linhagem germinativa e/ou humanas.

[0037] A invenção provê um anticorpo isolado humano especifico para NGF, tendo um domínio VH compreendendo um conjunto de HCDRs em uma estrutura principal de linhagem germinativa compreendendo DP10. Normalmente, o membro de ligação específico também tem um domínio VL compreendendo um conjunto de LCDRs, preferivelmente em uma estrutura principal de linhagem germinativa de linhagem germinativa humana compreendendo um Vl1, por exemplo DPL5. Preferivelmente, os CDRs são um conjunto de CDRs descrito aqui.

[0038] Por "substancialmente como especificado, significa-se que o domínio [0039] CDR ou VH ou VL relevante da invenção será ou idêntico ou altamente similar às regiões especificadas das quais a seqüência é especificada aqui . Por "altamente similar", contempla-se que de 1 a 5, preferivelmente de 1 a 4 como 1 a 3 ou 1 ou 2, ou 3 ou 4, substituições de aminoácidos podem ser feitas no domínio CDR e/ou VH ou VL. [0040] Em um aspecto, a presente invenção provê um membro de ligação específico para NGF, compreendendo um sítio de ligação anticorpo - antígeno que é composto de um domínio VH de anticorpo humano e um domínio VL de anticorpo humano e que compreende um conjunto de CDRs, em que o domínio VH compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 e o domínio VL compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que o HCDR1 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193, o HCDR2 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 194, o HCDR3 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 195, o LCDR1 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 198, o LCDR2 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 199, e o LCDR3 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 200; ou em que o conjunto de CDRs contém uma ou duas substituições de aminoácidos comparadas com este conjunto de CDRs.

[0041] Assim, a invenção provê um membro de ligação específico para NGF, compreendendo um sítio de ligação anticorpo - antígeno que é composto de um domínio VH de anticorpo humano e um domínio VL de anticorpo humano e que compreende um conjunto de CDRs, em que o conjunto de CDRs é o conjunto 113C11 de CDRs ou outro conjunto de CDRs descrito aqui, ou um conjunto de CDRs contendo uma ou duas substituições comparadas com o conjunto 113C11 de CDRs ou outro conjunto de CDRs descrito aqui .

[0042] Em formas de realização preferidas, a uma ou duas substituições estão em um ou dois dos seguintes resíduos dentro dos CDRs dos domínios VH e/ou VL, usando a numeração padrão de Kabat (1991). 31, 34 em HCDR1 51,55, 56, 57, 58, 65 em HCDR2 96 em HCDR3 26, 27, 27A, 27B, 28, 29, 30 em LCDR1 56 em LCDR2 90, 94 em LCDR3.

[0043] Em formas de realização preferidas, uma ou duas substituições são feitas em um ou dois dos seguintes resíduos dentro do conjunto 113C11 de CDRs de acordo com os grupos identificados de resíduos substitutos possíveis: Posição de Resíduo substituto substituição selecionado dentre o grupo ____________________consistindo de 31 em HCDR1: A

34 em HCDR1: V

51 em HCDR2: V

55 em HCDR2: N

56 em HCDR2: A

57 em HCDR2: V

58 em HCDR2: S

65 em HCDR2: D

96 em HCDR3: N

26 em LCDR1: T

26 em LCDR1: G

27 em LCDR1: N

27 em LCDR1: R

27A em LCDR1: T

27A em LCDR1: P

27B em LCDR1: D

28 em LCDR1: T

29 em LCDR1: E

30 em LCDR1: D

56 em LCDR2: T

90 em LCDR3: A 94 em LCDR3: G.

[0044] Resíduo 29E dentro de LCDR1 é uma forma de realização particularmente preferida.

[0045] As formas de realização preferidas tem o conjunto 1133C11 ou 1252A5, 1152H5, 1165D4, 1230H7 ou 1021E5 de CDRs.

[0046] Em uma forma de realização, um membro de ligação específico isolado compreende um conjunto de CDRs que contém o conjunto 113C11 de CDRs com a seqüência de aminoácidos FNSALIS (SEQ ID NO: 532) ou a seqüência de aminoácidos MISSLQP (SEQ ID NO: 533), substituída pela seqüência de aminoácidos LNPSLTA (SEQ ID NO: 531) dentro de HCDR3.

[0047] Qualquer conjunto de HCDRs das linhagens descritas aqui pode ser provido em um domínio VH que é usado como um membro de ligação específico sozinho ou em combinação com um domínio VL. Um domínio VH pode ser provido com um conjunto de HCDRs de um 1133C11, 1021E5 ou anticorpo de outra linhagem, por exemplo um conjunto de HCDRs, como ilustrado em Tabela 2a/2b, e se tal domínio VH é estiver em par com um domínio VL, então o domínio VL pode ser provido com um conjunto de LCDRs de um anticorpo 1133C11, 1021E5 ou outra linhagem, por exemplo um conjunto de LCDRs, como ilustrado em Tabela 2a/2b. A formação de par de um conjunto de HCDRs e um conjunto de LCDRs pode ser como mostrada em Tabela 2a/2b, provendo um sítio de ligação anticorpo - antígeno compreendendo um conjunto de CDRs como mostrado em Tabela 2a/2b.

[0048] As estruturas principais de domínio VH e VL compreendem regiões de estrutura principal, uma ou mais das mesmas podendo ser uma região de estrutura principal de linhagem germinativa, normalmente linhagem germinativa humana. A estrutura principal de domínio VH é preferivelmente estrutura principal de linhagem germinativa de cadeia pesada humana e o estrutura principal de domínio VL é preferivelmente estrutura principal de linhagem germinativa de cadeia leve humana. Regiões de estrutura principal do domínio de cadeia pesada podem ser selecionadas dentre a família VH-1, e uma estrutura principal VH-1 preferidos é uma estrutura principal DP-10. Regiões de estrutura principal da cadeia leve podem ser selecionadas dentre a família 11, e uma estrutura principal preferida é DPL5.

[0049] Um ou mais CDRs podem ser tomados de domínio VH ou VL de 1252A5 e incorporados em uma estrutura principal apropriada. Isto é ainda discutido aqui. 1252A5 HCDRs 1, 2 e 3 são mostrados em SEQ ID NO: 393, 394, 395 respectivamente. 1252A5 LCDRs 1, 2 e 3 são mostrados em SEQ ID NO: 398, 399, 400, respectivamente.

[0050] Tudo isto se aplica igual para outros CDRs e conjuntos de CDRs como descrito aqui, especialmente para 1152H5, 1165D4 e 1230H7.

[0051] Formas de realização da presente invenção empregam o domínio VH e/ou VL de anticorpo de uma molécula de anticorpo da linhagem 1021E5, por exemplo a molécula de anticorpo 1021E5. Membro de ligação específico compreendendo um sítio de ligação anticorpo - antígeno compreendendo este domínio VH e/ou VL é também provido pela presente invenção.

[0052] As formas de realização preferidas são como a seguir: [0053] Um domínio VH, domínio VL, conjunto de HCDRs, conjunto de LCDRs, ou conjunto de CDRs de: 1126F1 (VH SEQ ID NO: 102; VL SEQ ID NO: 107), 1126G5 (VH SEQ ID NO: 112; VL SEQ ID NO: 117), 1126H5 (VH SEQ ID NO: 122; VL SEQ ID NO: 127), 1127D9 (VH SEQ ID NO: 132; VL SEQ ID NO: 137), 1127F9 (VH SEQ ID NO: 142; VL SEQ ID NO: 147), 1131D7 (VH SEQ ID NO: 152; VL SEQ ID NO: 157), 1131H2 (VH SEQ ID NO: 162; VL SEQ ID NO: 167), 1132A9 (VH SEQ ID NO: 172; VL SEQ ID NO: 177), 1132H9 (VH SEQ ID NO: 182; VL SEQ ID NO: 187), 1133C11 (VH SEQ ID NO: 192; VL SEQ ID NO: 197), 1134D9 (VH SEQ ID NO: 202; VL SEQ ID NO: 207), 1145D1 (VH SEQ ID NO: 212; VL SEQ ID NO: 217), 1146D7 (VH SEQ ID NO: 222; VL SEQ ID NO: 227), 1147D2 (VH SEQ ID NO: 232; VL SEQ ID NO: 237), 1147G9 (VH SEQ ID NO: 242; VL SEQ ID NO: 247), 1150F1 (VH SEQ ID NO: 252; VL SEQ ID NO: 257), 1152H5 (VH SEQ ID NO: 262; VL SEQ ID NO: 267), 1155H1 (VH SEQ ID NO: 272; VL SEQ ID NO: 277), 1158A1 (VH SEQ ID NO: 282; VL SEQ ID NO: 287), 1160E3 (VH SEQ ID NO: 292; VL SEQ ID NO: 297), 1165D4 (VH SEQ ID NO: 302; VL SEQ ID NO: 307), 1175H8 (VH SEQ ID NO: 312; VL SEQ ID NO: 317), 1211G10 (VH SEQ ID NO: 322; VL SEQ ID NO: 327), 1214A1 (VH SEQ ID NO: 332; VL SEQ ID NO: 337), 1214D10 (VH SEQ ID NO: 342; VL SEQ ID NO: 347), 1218H5 (VH SEQ ID NO: 352; VL SEQ ID NO: 357), e 1230H7 (VH SEQ ID NO: 362; VL SEQ ID NO: 367).

[0054] Ainda mais preferidos são os domínio VH, domínio VL conjunto de HCDRs, conjunto de LCDRs, ou conjunto de CDRs de 1083H4 (VH SEQ ID NO: 22; VL SEQ ID NO: 27), 1227H8 (VH SEQ ID NO: 372; VL SEQ ID NO: 377) e 1230D8 (VH SEQ ID NO: 382; VL SEQ ID NO: 387).

[0055] Em uma forma de realização altamente preferida, um domínio VH é provido com uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 192, esta sendo chamada "domínio VH de 1133C11". Em uma outra forma de realização altamente preferida, um domínio VL é provido com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 197, esta sendo chamada "domínio VL de 1133C11". Um sítio de ligação de anticorpo - antígeno altamente preferido provido de acordo com a presente invenção é composto do domínio VH1de 133C11, SEQ ID NO: 192, e o 1133C11 domínio VL , SEQ ID NO: 197. Este sítio de ligação de anticorpo - antígeno pode ser provido dentro de qualquer molécula desejada de formato de anticorpo, por exemplo scFv, Fab, IgG, IgG4 etc., como é discutido ainda em outras partes aqui.

[0056] Em uma outra forma de realização altamente preferida, um domínio VH é provido com uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 392, esta sendo chamada "domínio VH de 1252A5". Em uma outra forma de realização altamente preferida, um domínio VL é provido com uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 397, esta sendo chamada "domínio VL de 1252A5". Um sítio de ligação de anticorpo - antígeno altamente preferido provido de acordo com a presente invenção é composto do domínio VH de 1252A5, SEQ ID NO: 392, e o domínio VL de 1252A5, SEQ ID NO: 397. Este sítio de ligação de anticorpo - antígeno pode ser provido dentro de qualquer molécula desejada de formato de anticorpo, por exemplo scFv, Fab, IgG, IgG4 etc., como é discutido ainda em outras partes aqui .

[0057] Em uma outra forma de realização altamente preferida, a presente invenção provê uma molécula de anticorpo IgG4 compreendendo o domínio VH de 1252A5, SEQ ID NO: 392, e o domínio VL de 1252A5, SEQ ID NO: 397. Este é chamado aqui "1252A5 IgG4".

[0058] Outros IgG ou outras moléculas de anticorpo compreendendo o domínio VH de 1252A5, SEQ ID NO: 392, e/ou o domínio VL de 1252A5, SEQ ID NO: 397, são providos por a presente invenção, como o são outras moléculas de anticorpo compreendendo o conjunto 1252A5 de HCDRs (SEQ ID NOS: 393, 394 e 395) dentro de um domínio VH de anticorpo, e/ou o conjunto 1252A5 de LCDRs (SEQ ID NOS: 398, 399 e 400) dentro de um domínio VL de anticorpo. [0059] Como notado, a presente invenção provê um membro de ligação específico que liga o NGF humano e que compreende o domínio VH de 1252A5 (SEQ ID NO: 392) e/ou o domínio VL de 1252A5 (SEQ ID NO: 397). Propriedades deste membro de ligação específico são descritas aqui.

[0060] Geralmente, um domínio VH é formado em pares com um domínio VL para prover um sítio de ligação antígeno - anticorpo, apesar de que, como discutido ainda abaixo, um domínio VH sozinho pode ser usado para ligar antígeno. Em uma forma de realização preferida, o domínio VH de 1252A5 (SEQ ID NO: 392) é formado em par com o domínio VL de 1252A5 (SEQ ID NO: 397), de modo que um sítio de ligação anticorpo - antígeno é formado, compreendendo ambos os domínios VH e VL de 1252A5. Formas de realização análogas são providas para os outros domínios VH e VL descritos aqui . Em outras formas de realização, o VH 1252A5 é formado em par com um domínio VL diferente de VL 1252A5. A promiscuidade de cadeia leve é bem estabelecida na arte. Novamente, formas de realização análogas são providas pela invenção para os outros domínios VH e VL descritos aqui.

[0061] Variantes dos domínios VH e VL e CDRs da presente invenção, incluindo para os quais as seqüências de aminoácidos são especificadas aqui, e que podem ser empregados em membros de ligação específicos para NGF podem ser obtidos por meios de métodos de alteração ou mutação de seqüências e triagem. Estes métodos são também providos para a presente invenção.

[0062] De acordo com outros aspectos da presente invenção é provido um membro de ligação específico que compete para ligação a antígeno com qualquer membro de ligação específico que tanto o antígeno como compreende um membro de ligação específico, domínio VH e/ou VL descrito aqui, ou HCDR3 descrito aqui, ou variante de qualquer um destes. A competição entre os membros de ligação pode ser testada facilmente in vitro, por exemplo usando ELISA e/ou por etiquetagem de uma molécula de repórter específica a um membro de ligação que pode ser detectado na presença de um ou mais de outros membros de ligação não etiquetados, para permitir a identificação de membros de ligação específicos que ligam o mesmo epítopo ou um epítopo sobrejacente.

[0063] Assim, um outro aspecto da presente invenção provê um membro de ligação específico compreendendo um sítio de ligação anticorpo - antígeno humano que compete com uma molécula de anticorpo, por exemplo especialmente 1252A5 ou outros scFv e/ou IgG4 preferidos, para ligação a NGF. Em outros aspectos a presente invenção provê um membro de ligação específico compreendendo um sítio de ligação anticorpo - antígeno humano que compete com um sítio de ligação anticorpo - antígeno para ligação a NGF, em que o sítio de ligação de anticorpo - antígeno é composto de um domínio VH e um domínio VL , e em que os domínios VH e VL compreendem um conjunto de CDRs de 1133C11, 1021E5, 1252A5 ou outra linhagem, como descrito aqui .

[0064] Vários métodos são disponíveis na arte para obter anticorpos contra NGF e que podem competir com um 1252A5 ou outra molécula de anticorpo, uma molécula de anticorpo com um 1252A5 ou outro conjunto de CDRs, ou uma molécula de anticorpo com um conjunto de CDRs de 1252A5 ou outra linhagem, para ligação a NGF.

[0065] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método de obter um ou mais membros de ligação específicos capazes de ligar o antígeno, o método incluindo levar ao contato uma biblioteca de membros de ligação específicos de acordo com a invenção e referido antígeno, e selecionar um ou mais membros de ligação específicos da biblioteca capazes de ligar referido antígeno.

[0066] A biblioteca pode ser exibida em n partículas ou complexos moleculares, por exemplo pacotes genéticos replicáveis, como partículas de levedura, bacterianas ou bacteriófago (por exemplo T7), ou sistemas de exibição covalentes, ribossômicos ou outro in vitro, cada partícula ou complexo molecular contendo ácido nucleico codificando o domínio variável VH de anticorpo exibido no mesmo, e opcionalmente também um domínio VL exibido se presente.

[0067] Após a seleção de membros de ligação específicos capazes de ligar o antígeno e exibido em bacteriófagos ou outras partículas de biblioteca ou complexos moleculares, ácido nucleico pode ser retirado de um bacteriófago ou outra partícula ou complexo molecular exibindo um referido membro de ligação específico selecionado. Este ácido nucleico pode ser usado em subseqüente produção de um membro de ligação específico ou um domínio variável VH ou VL de anticorpo para expressão de ácido nucleico com a seqüência de ácido nucleico tomada de um bacteriófago ou outra partícula ou complexo molecular exibindo um referido membro de ligação específico selecionado.

[0068] Um domínio variável VH de anticorpo com a seqüência de aminoácidos de um domínio variável VH de anticorpo do referido membro de ligação específico selecionado pode ser provido em forma isolada, como pode um membro de ligação específico compreendendo tal domínio VH.

[0069] A capacidade de ligar NGF pode ser ainda testada, também a capacidade para o competir com por exemplo 1252A5 (por exemplo em formato scFv e/ou formato IgG, por exemplo IgG4) para ligação a NGF. A capacidade para neutralizar NGF pode ser testada, como discutido ainda abaixo.

[0070] Um membro de ligação específico de acordo com a presente invenção pode ligar NGF com a afinidade de um 1252A5 ou outra molécula de anticorpo, por exemplo scFv, ou preferivelmente 1252A5 ou outro IgG4, ou com uma afinidade que é melhor.

[0071] Um membro de ligação específico de acordo com a presente invenção pode neutralizar NGF com a potência de um 1252A5 ou outra molécula de anticorpo, por exemplo scFv, ou preferivelmente 1252A5 ou outro IgG4, ou com uma potência que é melhor.

[0072] A afinidade de ligação e potência de neutralização de diferentes membros de ligação específicos pode ser comparada sob condições apropriadas.

[0073] Os anticorpos da presente invenção tem várias vantagens sobre os anticorpos anti-NGF comercialmente disponíveis. Por exemplo, a presente invenção provê anticorpos de linhagem germinativa ou humanos, que são esperados como exibindo um menor grau de imunogenicidade quando administrado de modo crônico ou repetido a humanos para uso terapêutico ou diagnóstico. Além disso, a presente invenção provê anticorpos que são neutralizadores mais potentes de NGF e assim um efeito terapêutico ou diagnóstico pode ser obtido usando menos material de anticorpo. Além disso, em uma forma de realização da invenção, a potência para inibição da interação de receptor NGF/TrKA é maior do que a observada para a inibição da interação de receptor NGF/p75. Isto pode conferir vantagens sobre outros tratamentos com antagonista de NGF aparentemente não seletivos neste aspecto, ou na grandeza ou natureza do efeito terapêutico obtido, ou na redução de efeitos laterais indesejáveis. [0074] A invenção também provê preparações heterogenias compreendendo moléculas de anticorpo anti-NGF. Por exemplo, estas preparações podem ser misturas de anticorpos com cadeias pesadas de comprimento completo e cadeias pesadas faltando a lisina C-terminal, com vários graus de glicosilação e/ou com aminoácidos derivados, como ciclização de um ácido glutâmico N-terminal para formar um resíduo de ácido piroglutâmico.

[0075] Em outros aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende a seqüência codificando um membro de ligação específico, domínio VH e/ou domínios VL de acordo com a presente invenção, e métodos de preparar um membro de ligação específico, um domínio VH e/ou um domínio VL da invenção, que compreendem expressar referido ácido nucleico sob condições para ocasionar a produção de referido membro de ligação específico, domínio VH e/ou domínio VL, e recuperar o mesmo.

[0076] Um outro aspecto da presente invenção provê ácido nucleico, geralmente isolado, codificando um domínio variável VH e/ou domínio variável VL de anticorpo descrito aqui.

[0077] Outro aspecto da presente invenção provê ácido nucleico, geralmente isolado, codificando uma seqüência de VH CDR ou VL CDR descritos aqui , especialmente um VH CDR selecionado dentre: 1133C11 (VH CDR1 SEQ ID NO: 193, VH CDR2 SEQ ID NO: 194, e VH CDR3 SEQ ID NO: 195), 1152H5(VH CDR1 SEQ ID NO: 263, VH CDR2 SEQ ID NO: 264, e VH CDR3 SEQ ID NO: 265), e 1252A5 (VH CDR1 SEQ ID NO: 393, VH CDR2 SEQ ID NO: 394, e VH CDR3 SEQ ID NO: 395), ou um VL CDR selecionado dentre: 1133C11(VL CDR1 SEQ ID NO: 198, VL CDR2 SEQ ID NO: 199, e VL CDR3 SEQ ID NO: 200), 1152H5 (VL CDR1 SEQ ID NO: 268, VL CDR2 SEQ ID NO: 269, e VL CDR3 SEQ ID NO: 270), e 1252A5 (VL CDR1 SEQ ID NO: 398, VL CDR2 SEQ ID NO: 399, e VL CDR3 SEQ ID NO: 400), mais preferivelmente 1252A5 VH CDR3 (SEQ ID NO: 395). Ácido nucléico codificando o conjunto 1252A5 de CDRs, ácido nucleico codificando o conjunto 1252A5 de HCDRs e ácido nucleico codificando o conjunto 1252A5 de LCDRs são também providos para a presente invenção, como o são ácido nucleicos codificando CDRs, HCDRs, LCDRs individuais e conjuntos de CDRs, HCDRs, LCDRs da linhagem 1252A5, 1133C11 ou 1021E5.

[0078] Um outro aspecto provê uma célula hospedeira transformada com ácido nucleico da invenção.

[0079] Ainda outro aspecto provê um método de produção de um domínio variável VH de anticorpo, o método incluindo causar a expressão do ácido nucleico codificando. Este método pode compreender cultivar células hospedeiras sob condições para produção de referido domínio variável VH de anticorpo.

[0080] Os métodos análogos para produção de domínios variáveis VL e membros de ligação específicos compreendendo um domínio VH e/ou VL são providos como outros aspectos da presente invenção. [0081] Método de produção pode compreender uma etapa de isolamento e/ou purificação do produto. Método de produção pode compreender formular o produto em uma composição incluindo pelo menos um componente adicional, como um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0082] Outros aspectos da presente invenção provêem composições contendo membros de ligação específicos da invenção, e seu uso em métodos de inibição ou neutralização de NGF, incluindo métodos de tratamento de corpo humano ou animal para terapia.

[0083] Membros de ligação específicos de acordo com a invenção podem ser usados em um método de tratamento ou diagnóstico de corpo humano ou animal, como um método de tratamento (que pode incluir tratamento profilático) de uma doença ou distúrbio em paciente humano que compreende administrar ao referido paciente uma quantidade efetiva de um membro de ligação específico da invenção. Condições tratáveis de acordo com a presente invenção incluem qualquer uma em que NGF desempenha um papel, especialmente dor, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose pulmonar, outra doenças de inflamação das vias aéreas, neuropatia diabética, HIV, arritmias cardíacas, artrite, psoríase e câncer.

[0084] Estes e outros aspectos da invenção são descritos em mais detalhes abaixo.

TERMINOLOGIA

[0085] É conveniente apontar aqui que "e/ou " quando usado aqui deve ser tomado como uma descrição específica de cada um de dois aspectos ou componentes especificados com ou sem o outro. Por exemplo "A e/ou B" deve ser tomado com uma descrição específica de cada de (i) A, (ii) B e (iii) A e B, apenas como se cada fosse especificado individualmente aqui.

NGF

[0086] NGF (também conhecido como beta-NGF) é fator de crescimento de nervos. No contexto da presente invenção, NGF é normalmente NGF humano , apesar de poder ser NGF não humano (por exemplo NGF de primata não humano e/ou NGF de rato e/ou NGF de camundongo). NGF é também referido em locais como "o antígeno".

[0087] NGF usado nos testes descritos aqui é normalmente humano, NGF de rato ou camundongo , mas NGF de outro animal não humano pode ser usado, por exemplo NGF de primata não humano.

Dor [0088] Isto descreve, como é bem conhecido na arte, sensação de dor, e pode englobar um ou mais, ou todos, dos seguintes : - hiperalgesia (resposta a dor exagerada a um estímulo normalmente doloroso); - alodinia (sensação de dor causada por um estímulo que não é normalmente doloroso); - sensação de dor espontânea causada por qualquer mecanismo na ausência de qualquer influência externa aparente; - dor evocada por estímulos físicos, como calor, aquecimento, frio, pressão , vibração, toque estático ou dinâmico, ou postura do corpo e movimento; - dor somática e visceral causada por qualquer mecanismo, por exemplo, trauma, infecção, inflamação, doença metabólica, derrame ou doença neurológica.

[0089] Dor pode por exemplo ser dor aguda, dor a curto prazo, dor persistente nociceptiva, ou dor persistente ou neuropática crônica.

Membro de ligação específico [0090] Isto descreve um membro de um par de moléculas que tem especificidade de ligação uma com a outra. Os membros de um par de ligação específica podem ser naturalmente derivados ou produzidos total ou parcialmente sinteticamente. Um membro de um par de moléculas tem uma área em sua superfície, ou cavidade, que especificamente liga e é assim complementar a uma organização espacial e polar particular do outro membro de um par de moléculas. Assim, os membros do par tem a propriedade de ligação especificamente uns nos outros. Os exemplos de tipos de pares de ligação específicos são antígeno-anticorpo, biotina-avidina, hormônio-receptor de hormônio, receptor-ligando, enzima-substrato. A presente invenção refere-se a uma reação de tipo anticorpo - antígeno.

[0091] Um membro de ligação específico normalmente compreende uma molécula tendo um sítio de ligação de antígeno. Por exemplo, um membro de ligação específico pode ser uma molécula de anticorpo ou uma proteína não anticorpo que compreende um sítio de ligação de antígeno. Um sítio de ligação de antígeno pode ser provido por meio de disposição de CDRs ou andaimes de proteína não anticorpo, como fibronectina ou citocromo B etc. (Haan & Maggos, 2004; Koide et al., 1998; Nygren et al., 1997), ou por randomização ou mutação de resíduos de aminoácido de um laço dentro de um andaime de proteína para conferir especificidade de ligação para uma marcação desejada. Os andaimes para engenharia de novos sítios de ligação em proteínas foram estudados em detalhes por Nygren et al. (1997). Andaimes de proteína para miméticos de anticorpos são descritos em WO/0034784 em que os inventores descrevem proteínas (miméticos de anticorpos) que incluem um domínio tipo III de fibronectina tendo pelo menos um laço randomizado. Um andaime apropriado em que enxertar um ou mais CDRs, por exemplo um conjunto de HCDRs, pode ser provido por qualquer membro de domínio da superfamília de genes de imunoglobulina. O andaime pode ser uma proteína humana ou não humana.

[0092] Uma vantagem de um andaime de proteína não anticorpo é que ele pode [0093] Prover um sítio de ligação de antígeno em uma molécula de andaime que é menor e/ou mais fácil de fabricar do que pelo menos algumas moléculas de anticorpo. O tamanho pequeno de um membro de ligação específico pode conferir propriedades fisiológicas apropriadas, como a capacidade de entrar nas células, penetrar profundo nos tecidos ou alcançar alvos dentro de outras estruturas, ou ligar dentro das cavidades de proteína os antígenos de marcação. [0094] O uso de sítio de ligação de antígenos em andaimes de proteína não anticorpo é estudado em Wess, 2004. São típicas as proteínas tendo uma estrutura dorsal estável e um ou mais laços variáveis, em que a seqüência de aminoácidos do laço ou laços é mutada de modo específico ou aleatório para criar um sítio de ligação de antígeno tendo especificidade para ligação do antígeno de marcação. Estas proteínas incluem os domínios de ligação de IgG de proteína A a partir de S. aureus, transferrina, tetranectina, fibronectina (por exemplo 10°. domínio tipo III de fibronectina) e lipocalinas. Outras abordagens incluem "Microbodies" sintéticos (Selecore GmbH), que são baseados em ciclotídeos - proteínas pequenas tendo ligações dissulfeto intra-moleculares.

[0095] Além das seqüências de anticorpo e/ou um sítio de ligação de antígeno, um membro de ligação específico de acordo com a presente invenção pode compreender outros aminoácidos, por exemplo formar um peptídeo ou polipeptídeo, como um domínio duplicado, ou para conferir à molécula outra característica funcional além da capacidade de ligar antígeno. Membros de ligação específicos da invenção podem transportar um rótulo detectável, ou podem ser conjugados a uma toxina ou uma porção de marcação ou enzima (por exemplo via uma ligação ou ligador de peptidila). Por exemplo, um membro de ligação específico pode compreender um sítio catalítico (por exemplo em um domínio de enzima) assim como um sítio de ligação de antígeno, em que o sítio de ligação de antígeno liga ao antígeno e assim marca o sítio catalítico para o antígeno. O sítio catalítico pode inibir a função biológica do antígeno, por exemplo por clivagem.

[0096] Apesar de que, como notado, CDRs poderem ser transportados por andaimes como fibronectina ou citocromo B (Haan & Maggos, 2004; Koide et al., 1998; Nygren et al., 1997), a estrutura para transportar um CDR ou um conjunto de CDRs da invenção será geralmente de uma seqüência de cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou porção substancial do mesmo, em que o CDR ou conjunto de CDRs está localizado em um local correspondendo ao CDR ou conjunto de CDRs de domínios variáveis VH e VL de anticorpo codificado por genes de imunoglobulina rearranjados. As estruturas e locais de domínios variáveis de imunoglobulina podem ser determinados por referência a (Kabat, et al., 1987, e suas atualizações, agora disponíveis em Internet (http://immuno.bme.nwu.edu ou encontrar "Kabat" usando ferramenta de busca).

Molécula de Anticorpo [0097] Isto descreve uma imunoglobulina seja natural ou parcial ou totalmente produzida sinteticamente. O termo também cobre qualquer polipeptídeo ou proteína compreendendo um sítio de ligação antígeno - anticorpo. Fragmentos de anticorpo que compreendem um sítio de ligação anticorpo - antígeno são moléculas como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; e diacorpos.

[0098] É possível tomar anticorpos monoclonais e outros e usar técnicas de tecnologia de DNA recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que retém a especificidade do anticorpo original. Estas técnicas podem envolver a introdução de DNA codificando a região variável de imunoglobulina, ou os CDRs, de um anticorpo para as regiões constantes ou regiões constantes mais regiões de estrutura principal, de uma diferente imunoglobulina. Ver, por exemplo, EP-A-184187, GB 2188638A ou EP-A-239400, e um grande corpo de literatura subseqüente. Um hibridoma ou outra célula produzindo um anticorpo pode ser submetido a mutação genética ou outra mudança, que pode ou não alterar a especificidade de ligação dos anticorpos produzidos.

[0099] Como os anticorpos podem ser modificados de vários modos, o termo "molécula de anticorpo" deve ser construindo como cobrindo qualquer membro de ligação específico ou substância tendo um sítio de ligação anticorpo - antígeno com a especificidade requerida. Assim, este termo cobre fragmentos de anticorpos e derivados, incluindo qualquer polipeptídeo compreendendo um sítio de ligação antígeno - anticorpo, seja natural ou total ou parcialmente sintético. As moléculas quiméricas compreendendo um sítio de ligação antígeno - anticorpo, ou equivalente, fundidas em outro polipeptídeo são assim incluídas. A clonagem e expressão de anticorpos quiméricos são descritas em EP-A-0120694 e EP-A-0125023, e um grande corpo de subseqüente literatura.

[00100] Outras técnicas disponíveis na arte de engenharia de anticorpos tornaram possível isolar os anticorpos humanos e humanizados. Por exemplo, hibridomas humanos podem ser feitos como descritos por Kontermann & Dubel (2001). Exibição de fagos, outra técnica estabelecida para gerar membros de ligação específicos foi descrita em detalhes em muitas publicações como Kontermann & Dubel (2001) e WO92/01047 (discutido ainda abaixo). Os camundongos transgênicos em que os genes de anticorpos de camundongos são inativados e funcionalmente substituídos com genes de anticorpos humanos, enquanto deixando intactos outros componentes do sistema imune dos camundongos podem ser usados para isolar anticorpos humanos (Mendez et al., 1997).

[00101] As moléculas de anticorpo sintéticas podem ser criadas por expressão de genes gerados por meio de oligonucleotídeos sintetizados e montados dentro de vetores de expressão apropriados,por exemplo como descritos por Knappik et al. (2000) ou Krebs et al. (2001).

[00102] Verificou-se que os fragmentos de um anticorpo completo podem realizar a função de antígenos de ligação. Exemplos de fragmentos de ligação são (i) o fragmento Fab consistindo de domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) o fragmento Fd consistindo dos domínios VH e CH1; (iii) o fragmento Fv consistindo de domínios VL e VH de um único anticorpo; (iv) o fragmento dAb (Ward, 1989; McCafferty et al., 1990; Holt et al., 2003), que consiste de um domínio VH ou um VL ; (v) regiões de CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados (vii) moléculas Fv de cadeia única (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL são ligados por um ligador de peptídeo que permite que os dois domínios se associem para formar um sítio de ligação de antígeno (Bird et al., 1988; Huston et al., 1988); (viii) dímeros Fv de cadeia única específica (PCT/US92/09965) e (ix) "diacorpos", fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão de gene (WO94/13804; Holliger et al., 1993). Moléculas de Fv, scFv ou diacorpo podem ser estabilizadas pela incorporação de pontes dissulfeto ligando os domínios VH e VL (Reiter et al., 1996). Minicorpos compreendendo um scFv unido a um domínio CH3 também podem ser feitos (Hu et al., 1996).

[00103] Um dAb (anticorpo de domínio) é um fragmento de ligação de antígeno monomérico pequeno de um anticorpo, ou seja a região variável de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo (Holt et al., 2003). VH dAbs ocorrem naturalmente em camelídeos (por exemplo camelos, lhama) e podem ser produzidos por imunização de um camelídeo com um antígeno de marcação, isolamento das células B específicos do antígeno e clonagem direta dos genes dAb das células B individuais. dAbs são também produzidos em cultura de células. Seu tamanho pequeno, boa solubilidade e estabilidade em temperatura os tornam particularmente fisiologicamente utilizáveis e apropriado para a seleção e maturação por afinidade. O membro de ligação específico da presente invenção pode ser um dAb compreendendo um domínio VH ou VL substancialmente como especificado aqui, ou um domínio VH ou VL compreendendo um conjunto de CDRs substancialmente como especificado aqui.

[00104] Quando anticorpos bi-específicos devem ser usados, estes podem ser anticorpos bi-específicos convencionais que podem ser fabricados de vários modos (Holliger & Winter, 1993), por exemplo preparados quimicamente ou de hibridomas híbridos, ou eles podem ser de qualquer um dos fragmentos de anticorpo bi-específicos acima mencionados. Os exemplos de anticorpos bi-específicos incluem os de tecnologia BiTETM em que os domínios de ligação de dois anticorpos com diferente especificidade podem ser usados e diretamente ligados via peptídeos flexíveis curtos. Isto combina dois anticorpos em uma cadeia de polipeptídeo única curta. Os diacorpos e scFv podem ser construídos sem uma região Fc, usando somente domínios variáveis, potencialmente reduzindo os efeitos de uma reação anti-idiotípica. [00105] Os diacorpos bi-específicos, em oposição a anticorpos totais bi-específicos podem ser também particularmente utilizáveis porque eles podem ser prontamente construídos e expressados em E. coli. Os dicorpos (e muitos outros polipeptídeos como fragmentos de anticorpos) de especificidades de ligação apropriadas podem ser prontamente selecionados usando exibição de fagos (WO94/13804) de bibliotecas. Se um braço do diacorpo for mantido constante, por exemplo com uma especificidade dirigida contra NGF, então uma biblioteca pode ser feita onde o outro braço é variado e um anticorpo de especificidade apropriada selecionado. Os anticorpos totais bi-específicos podem ser feitos por engenharia de "nós-em-orifícios" (Ridgeway et al., 1996). Sítio de ligação de antígenos [00106] Isto descreve a parte de uma a molécula que liga a e é complementar a todo ou parte de um antígeno de marcação. Em uma molécula de anticorpo, é referido como um sítio de ligação de anticorpo - antígeno, e compreende a parte do anticorpo que especificamente liga a e é complementar a todo ou parte do antígeno de marcação. Onde um antígeno é grande, um anticorpo pode somente ligar a uma parte particular do antígeno, cuja parte é chamada um epítopo. Um sítio de ligação de anticorpo - antígeno pode ser provido por uma ou mais domínios variáveis de anticorpo. Preferivelmente, um sítio de ligação anticorpo - antígeno compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e região variável de cadeia pesada de anticorpo (VH).

Específico [00107] Este pode ser usados para se referir à situação em que um membro de um par de ligação específico não irá mostrar qualquer ligação significante a moléculas diferentes de seus parceiro(s) de ligação específico(s). O termo é também aplicável onde, por exemplo, um sítio de ligação de antígeno é específico para um epítopo particular que é transportado por vários antígenos, em cujo caso o membro de ligação específico transportando o sítio de ligação de antígeno será capaz de ligar os vários antígenos transportando o epítopo.

Isolado [00108] Isto de refere ao estado em que membros de ligação específicos da invenção, ou ácido nucleico codificando estes membros de ligação irão geralmente estar de acordo com a presente invenção. Membros isolados e ácido nucleico isolado serão livres ou substancialmente livres de material com o qual eles são naturalmente associados com outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos com que eles são encontrados em seu meio natural, ou o meio em que eles são preparados (por exemplo cultura de células) quando esta preparação é por tecnologia de DNA recombinante praticada in vitro ou in vivo. Membros e ácido nucleico podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e ainda por fins práticos isolados - por exemplo os membros serão normalmente misturados com gelatina ou outros veículos se usados para revestir placas de microtitulação para uso em imunoensaios, ou ser misturados com veículos diluentes farmaceuticamente aceitáveis ou quando usados em diagnóstico ou terapia. Membros de ligação específicos podem ser glicosilados, ou naturalmente ou por sistemas de células eucarióticas heterólogas (por exemplo células CHO ou NS0 (ECACC 85110503), ou eles podem ser (por exemplo se produzidos por expressão em uma célula procariótica) não glicosilados.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00109] Como notado acima, um membro de ligação específico de acordo com a presente invenção preferivelmente neutraliza NGF. O grau em que um anticorpo neutraliza NGF é referido como sua potência neutralizante.

[00110] Potência é normalmente expressada como um valor IC50, em nM, salvo especificado em contrário. IC50 é a concentração inibidora mediana de uma molécula de anticorpo. Em testes funcionais, IC50 é a concentração que reduz uma resposta biológica em 50 % de seu máximo. Em estudos de ligação de ligando, IC50 é a concentração que reduz a ligação do receptor por 50 % de nível de ligação específica máximo.

[00111] IC50 pode ser calculado traçando em gráfico a resposta biológica percentual (representada por exemplo por mobilização de íons cálcio em um teste FLIPR, por sobrevivência em um teste PC12, ou por proliferação em um teste [00112] TF-1 de proliferação) ou % de ligação de receptor específico como uma função do log da concentração de membro de ligação específico, e usando um programa software como Prism (GraphPad) para configurar uma função sigmoidal aos dados para gerar valores de IC50, por exemplo como descritos em Exemplo 2, 5, 6 ou 9 aqui.

[00113] O membro de ligação específico de acordo com a presente invenção preferivelmente inibe a mobilização de cálcio intracelular evocada por NGF humano em células expressando receptor de TrkA, por exemplo células recombinantemente transfectadas com um gene TrkA gene, por exemplo células HEK. Em um teste de mobilização de cálcio " FLIPR" como descritos em Exemplo 2 aqui, um membro de ligação específico de acordo com a invenção preferivelmente tem uma potência (IC50) para neutralizar NGF humano de ou menos do que 600, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 ou 10 nM. Normalmente, um membro de ligação específico da invenção tem uma potência de 5 nM ou menos, preferivelmente 2,5 nM ou menos, more preferivelmente 1 nM ou menos. Em formas de realização particularmente preferidas, a potência é 0,5 nM ou menos, por exemplo 0,4 nM ou menos; 0,3 nM ou menos; 0,2 nM ou menos; ou 0,15 nM ou menos. In some formas de realização, a potência podem ser cerca de 0,1 nM.

[00114] Potência pode estar entre 0,1-100 nM, 0,1-50 nM, 0,1-10 nM, ou 0,1-1,0 nM. Por exemplo, potência podem ser 0,1-5,0 nM, 0,25,0 nM, 0,3-5,0 nM, ou 0,3-0,4 nM.

[00115] Em algumas formas de realização da invenção, a potência neutralizante de um membro de ligação específico não otimizado em potência em um teste de células HEK, como descrito aqui, é cerca de 1,8 a 560 nM para NGF humano e/ou cerca de 2,9 a 620 nM para NGF de rato. Em algumas formas de realização, a potência neutralizante de membros de ligação otimizados em potência em testes de células HEK, como descritos aqui, são cerca de 0,12 a 120nM para NGF humano, cerca de 0,11 a 37 nM para NGF de rato e cerca de 0,11 a 71 nM para NGF de camundongo. No entanto, estes são exemplos apenas e maiores potências podem ser obtidas. Apesar da otimização da potência poder ser usada para gerar membros de ligação específicos de maior potência de um dado membro de ligação específico, também é notado que membros de ligação específicos de potência elevada podem ser obtidos mesmo sem a otimização de potência.

[00116] Um membro de ligação específico de acordo com a presente invenção preferivelmente inibe a sobrevivência de células PC12 exauridas em soro mantido em NGF. A potência neutralizante de um membro de ligação específico da presente invenção em um teste de sobrevivência PC12para NGF humano, como descrito aqui em Exemplo 5, é geralmente 1500 nM ou menos, e é preferivelmente 50 nM ou menos, ou 10 nM ou menos. Como explicado acima e como demonstrado aqui , otimização de potência pode ser usada para obter potências anti-NGF maiores. Preferivelmente, um membro de ligação específico tem uma potência de ou menos que 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1,5 nM, 1 nM ou 0,5 nM. Em algumas formas de realização, potência é cerca de 0,1 nM ou mais, 0,2 nM ou mais. Assim, potência pode estar entre 0,1 ou 0,2 nM e 0,5, 1,5, 5 ou 50 nM.

[00117] Em algumas formas de realização da invenção, a potência neutralizante de um membro de ligação específico otimizado em potência em um teste de sobrevivência PC12, como descrito aqui, é cerca de 0,2 a 670nM para NGF humano e é cerca de 0,2 a 54 nM para NGF de rato.

[00118] Um membro de ligação específico de acordo com a presente invenção preferivelmente inibe a proliferação de células TF-1 estimulada por NGF. A potência neutralizante de um membro de ligação específico (normalmente um membro de ligação específico otimizado em potência) da presente invenção em um teste TF-1 de proliferação para NGF humano como descrito aqui em Exemplo 6 é geralmente 5 nM ou menos, preferivelmente 1 nM ou menos. Preferivelmente, um membro de ligação específico da invenção tem uma potência de ou menor do que 0,7, 0,6, 0,5, 0,45, 0,4, 0,3, 0,2 ou 0,1 nM para NGF humano . Por exemplo, potência pode estar entre 0,05 - 0,1 nm, 0,05 - 0,2 nM, 0,05 - 0,3 nM, 0,05 - 0,4 nM, ou 0,05 - 0,5 nM.

[00119] Em algumas formas de realização da invenção, a potência neutralizante de um membro de ligação específico otimizado em potência em um teste TF-1 de proliferação como descrito aqui é cerca de 0,08 a 0,7nM para NGF humano , cerca de 0,07 a 1,9 nM para NGF de rato e cerca de 0,07 a 1,4nM para NGF de camundongo.

[00120] Um membro de ligação específico de acordo com a presente invenção preferivelmente inibe a ligação de NGF a um receptor de TrkA e/ou p75, preferivelmente um receptor humano de TrkA e/ou p75. A invenção também se estende mais geralmente a um membro de ligação específico que preferivelmente bloqueia a ligação de NGF a receptor de TrkA sobre a ligação de NGF a um receptor de p75. A potência neutralizante de um membro de ligação específico (normalmente um membro de ligação específico otimizado em potência) da presente invenção em um teste de ligação de receptor de TrkA como descrito aqui em Exemplo 9 é geralmente 2,5 nM ou menos, preferivelmente 1 nM ou menos para neutralizar NGF humano. Preferivelmente, um membro de ligação específico da invenção tem uma potência de ou menor do que 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 ou 0,075 nM para neutralizar ligação de NGF humano a TrkA. Por exemplo, potência pode estar entre 0,05 - 0,1 nm, 0,05 - 0,2 nM, 0,05 - 0,3 nM, 0,05 - 0,4 nM, ou 0,05 - 0,5 nM.

[00121] A potência neutralizante de um membro de ligação específico (normalmente um membro de ligação específico otimizado em potência) da presente invenção em um teste de ligação de receptor de p75 como descrito aqui em Exemplo 9 é geralmente 1,5 nM ou menos, preferivelmente 1 nM ou menos para neutralizar NGF humano. Preferivelmente, um membro de ligação específico da invenção tem uma potência de ou menor do que 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 ou 0,1 nM para neutralizar ligação de NGF a p75 humano. Por exemplo, potência pode estar entre 0,1 - 0,2 nM, 0,1 - 0,3 nM, 0,1 - 0,4 nM, 0,1 - 0,5 nM, ou 0,1-0,6 nM.

[00122] Alguns membros de ligação específicos preferidos de acordo com a presente invenção inibem a ligação de NGF (por exemplo NGF humano e/ou de rato) ao receptor de TrkA preferivelmente sobre a ligação de NGF a receptor de p75. Conseqüentemente, em algumas formas de realização, um membro de ligação específico da invenção tem uma constante de inibição de ligação menor, Ki, para inibição de ligação de NGF (por exemplo NGF humano e/ou de rato) a TrkA do que para ligação de NGF a p75. Ki pode ser calculado usando a fórmula especificada em Exemplo 9. Alternativamente, as constantes de inibição de ligação podem ser expressadas como pKi, que pode ser calculado como -log10Ki. Assim, um membro de ligação específico da invenção preferivelmente tem um valor de pKi maior para inibição de ligação de NGF a TrkA do que a p75.

[00123] Preferivelmente, um membro de ligação específico de acordo com a invenção liga NGF humano e/ou NGF de rato com uma afinidade de ou menor do que 1, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3 ou 0,2 nM. Por exemplo, um membro de ligação específico pode ligar NGF humano com uma afinidade de cerca de 0,25-0,44nM e NGF de rato com uma afinidade de cerca de 0,25-0,70 nM.

[00124] Como notado acima, variantes de moléculas de anticorpo descritos aqui podem ser produzidos e usados na presente invenção. Seguindo as linhas de química computacional na aplicação de técnicas de análise de dados multivariados para as relações estrutura/ propriedade- atividade (Wold, et al. 1984) relações de atividade-propriedade quantitativas de anticorpos podem ser derivadas usando técnicas matemáticas bem conhecidas, como regressão estatística, reconhecimento de padrão e classificação (Norman et al. 1998; Kandel & Backer, 1995; Krzanowski, 2000; Witten & Frank, 1999; Denison (Ed), 2002; Ghose & Viswanadhan). As propriedades de anticorpos podem ser derivadas de modelos empíricos e teóricos (por exemplo, análise de resíduos de contato parecidos ou propriedade fisicoquímica calculada) de seqüência de anticorpos, estruturas funcionais e tridimensionais e estas propriedades podem ser consideradas sozinhas ou em combinação.

[00125] Um sítio de ligação de anticorpo - antígeno composto de um domínio VH e um domínio VL é formado por seis laços de polipeptídeo: três do domínio variável de cadeia leve (VL) e três do domínio variável de cadeia pesada (VH). Análise de anticorpos de estrutura atômica conhecida elucidou as relações entre a seqüência e a estrutura tri-dimensional de sítios de combinação de anticorpos (Chothia et al. 1992; Al-Lazikani, et al. 1997). Estas relações implicam que, exceto pela terceira região (laço) em domínios VH, os laços de sítio de ligação tem uma dentre um número pequeno de conformações de cadeia principal: estruturas canônicas. A estrutura canônica formada em um laço particular foi mostrada como sendo determinada por seu tamanho e a presença de alguns resíduos em sítios chaves tanto no laço como nas regiões de estrutura principal (Chothia et al. e Al-Lazikani et al., supra).

[00126] Este estudo de relação de seqüência- estrutura pode ser usado para a previsão dos resíduos em um anticorpo de seqüência conhecida, mas de uma estrutura tri-dimensional desconhecida, que são importantes na manutenção da estrutura tri-dimensional de seus laços CDR e assim manter a especificidade de ligação. Estas previsões podem ser reforçadas por comparação das previsões da saída dos experimentos de otimização das orientações. Em uma abordagem estrutural, um modelo pode ser criado da molécula de anticorpo (Chothia, et al. 1986) usando qualquer pacote livremente disponível ou comercial como WAM (Whitelegg & Rees, 2000). Um pacote de software de visualização e análises de proteínas como Insight II (Accelerys, Inc.) ou Deep View (Guex & Peitsch, 1997) pode ser então usado para avaliar as substituições possíveis em cada posição no CDR. Esta informação pode ser então usada para fazer as substituições de modo a ter um efeito mínimo ou benéfico sobre a atividade.

[00127] As técnicas requeridas para fazer as substituições dentro das seqüências de aminoácidos de CDRs, domínios VH ou VL de anticorpo e membros de ligação específicos geralmente são disponíveis na arte. As seqüências variantes podem ser feitas, com substituições que podem ser ou não previstas como tendo um efeito mínimo ou benéfico sobre a atividade, e testadas para a capacidade de ligar e/ou neutralizar NGF e/ou para qualquer outra propriedade desejada.

[00128] Variantes de seqüência de aminoácidos de domínio variável de qualquer um dentre os domínios VH e VL cujas seqüências são especificamente descritas aqui podem ser empregadas de acordo com a presente invenção, como discutido. Variantes particulares podem incluir uma ou mais alterações de seqüências de aminoácidos (adição, deleção, substituição e/ou inserção de um resíduo de aminoácido), podem ser menores do que cerca de 20 alterações, menores do que cerca de 15 alterações, menores do que cerca de 10 alterações ou menores do que cerca de 5 alterações, talvez 5, 4, 3, 2 ou 1. Alterações podem ser feitas em uma ou mais regiões de estrutura principal e/ou um ou mais CDRs.

[00129] Preferivelmente alterações não resultam em perda de função, assim um membro de ligação específico compreendendo uma seqüência de aminoácidos assim alterada, preferivelmente retém uma capacidade para ligar ou neutralizar NGF. Mais preferivelmente, ele retém a mesma capacidade quantitativa de ligação e/ou neutralização como um membro de ligação específico em que a alteração não é feita, por exemplo como medido em um teste descrito aqui. Mais preferivelmente, o membro de ligação específico compreendendo uma seqüência de aminoácidos assim alterada tem uma capacidade melhorar de ligar ou neutralizar NGF.

[00130] Alteração pode compreender substituir um ou mais resíduos de aminoácido com um aminoácido não de ocorrência natural ou não padrão, modificar um ou mais resíduos de aminoácido em uma forma não de ocorrência natural ou não padrão, ou inserir um ou mais aminoácidos não de ocorrência natural ou não padrão em uma seqüência. Os membros e locais de alterações preferidos em seqüências da invenção são descritos em alguns pontos aqui. Os aminoácidos de ocorrência natural incluem os 20 L-aminoácidos "padrões" identificados como G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E por seus códigos de letra única padrões. Os aminoácidos não padrões incluem qualquer outro resíduo que pode ser incorporado em uma estrutura dorsal de polipeptídeo ou resultar da modificação de um resíduo de aminoácido existente. Os aminoácidos não padrões podem ser de ocorrência natural ou não de ocorrência natural. Vários aminoácidos de ocorrência não padrões são bem conhecidos na arte, como 4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina, 3-metilhistidina, N-acetilserina etc. (Voet & Voet, 1995). Estes resíduos de aminoácidos que são derivados em sua posição N-alfa somente estarão localizados no N-término de uma seqüência de aminoácidos. Normalmente na presente invenção, um aminoácido é um L-aminoácido, mas em algumas formas de realização ele pode ser um D-aminoácido. Alteração pode assim compreender modificar um L-aminoácido em, ou substituindo o mesmo como, um D-aminoácido. As formas metiladas, acetidadas e/ou fosforiladas de aminoácidos são também conhecidas, e aminoácidos na presente invenção podem ser submetidos a esta modificação.

[00131] As seqüências de aminoácido em domínios de anticorpo e membros de ligação específicos da invenção pode compreender aminoácidos não naturais ou não padrões descritos acima. Em algumas formas de realização, os aminoácidos não padrões (por exemplo D-aminoácidos) podem ser incorporados em uma seqüência de aminoácidos durante a síntese, enquanto em outras formas de realização, os aminoácidos não padrões podem ser introduzidos por modificação ou substituição dos aminoácidos padrões "originais" após a síntese da seqüência de aminoácidos.

[00132] O uso de aminoácidos não padrão e/ou não de ocorrência natural aumenta a diversidade estrutural e funcional, e assim pode aumentar o potencial para obter as propriedades de neutralização e ligação de NGF desejadas em um membro de ligação específico da invenção. Adicionalmente, D-aminoácidos e análogos foram mostrados como tendo melhores perfis farmacocinéticos comparados com L-aminoácidos padrões, devido à degradação In vivo de polipeptídeos tendo L-aminoácidos após administração a um animal.

[00133] Como notado acima, a CDR aminoácido seqüência substancialmente como especificada aqui é preferivelmente transportada como um CDR em um domínio variável de anticorpo humano ou uma porção substancial do mesmo. As seqüências de HCDR3 substancialmente como especificado aqui representam formas de realização preferidos da presente invenção e prefere-se que cada uma destas seja transportada como um HCDR3 em a domínio variável de cadeia pesada humano ou uma porção substancial do mesmo. [00134] Domínios variáveis empregados na domínio variável humano invenção podem ser obtidos ou derivados de qualquer domínio variável humano de linhagem germinativa ou rearranjados, ou pode ser um domínio variável sintético com base em seqüências de consenso ou reais de domínios variáveis humanos conhecidos. Uma seqüência de CDR da invenção (por exemplo CDR3) pode ser introduzida em um repertório de domínios variáveis faltando um CDR (por exemplo CDR3), usando tecnologia de DNA recombinante.

[00135] Por exemplo, Marks et al. (1992) descrevem métodos de produzir repertórios de domínios variáveis de anticorpos em que iniciadores de consenso dirigidos a ou adjacentes a extremidade 5' da área de domínio variável são usados em conjunto com iniciadores de consenso para a terceira região de estrutura principal de genes VH humanos para prover a repertório de domínios variáveis VH faltando um CDR3. Marks et al. Ainda descrevem como este repertório pode ser combinado com um CDR3 de anticorpo particular. Usando técnicas análogas, as seqüências derivadas de CDR3 da presente invenção podem ser embaralhadas com repertórios de domínios VH ou VL faltando um CDR3, e os completos domínios VH ou VL embaralhados combinados com um domínio cognato VL ou VH para prover membros de ligação específicos da invenção. O repertório pode então ser exibido em um sistema hospedeiro apropriado como o sistema de exibição de fagos de WO92/01047 ou qualquer corpo subseqüente da literatura, incluindo Kay, Winter & McCafferty (1996), assim estes membros de ligação específicos apropriados podem ser selecionados. Um repertório pode consistir de algum dentre os 104 membros individuais e até mais, por exemplo de 106 a 108 ou 1010 membros. Outros sistemas hospedeiros apropriados incluem exibição de leveduras, exibição bacteriana, exibição de T7, exibição de ribossomas e exibição covalente.

[00136] As técnicas análogas de embaralhamento ou combinatorial são também descritas por Stemmer (1994), que descreve a técnica em relação a um gene β-lactamase, mas observa que a abordagem pode ser usada para a geração de anticorpos.

[00137] Uma outra alternativa consiste em gerar novas regiões de VH ou VL transportando as seqüências derivadas de CDR da invenção usando mutagenese aleatória de um ou mais genes VH e/ou VL selecionados para gerar mutações dentro do domínio variável completo. Esta técnica é descrita por Gram et al. (1992),que usaram PCR passível de erros. Em formas de realização preferidas, uma ou duas substituições de aminoácidos são feitas dentro de um conjunto de HCDRs e/ou LCDRs.

[00138] Outro método que pode ser usado é para dirigir mutagenese para as regiões de CDR de genes VH oçu VL. Estas técnicas são descritas por Barbas et al. (1994) e Schier et al. (1996). [00139] Todas as técnicas acima descritas são bem conhecidas na arte e os versados serão capazes de usar estas técnicas para prover membros de ligação específicos da invenção usando metodologia de rotina na arte.

[00140] Um outro aspecto da invenção provê um método para obter um sítio de ligação anticorpo - antígeno específico para antígeno NGF, o método compreendendo prover a título de adição, deleção, substituição ou inserção de um ou mais aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos de um domínio VH aqui especificado um domínio VH, que é uma variante da seqüência de aminoácidos do domínio VH, opcionalmente combinando o domínio VH assim provido com um ou mais domínios VL, e testar o domínio VH ou combinação VH/VL ou combinações para identificar um membro de ligação específico ou um sítio de ligação anticorpo - antígeno específico para antígeno NGF e opcionalmente com uma ou mais propriedades preferidas, preferivelmente a capacidade de neutralizar a atividade de NGF. Referido domínio VL pode ter uma seqüência de aminoácidos que é substancialmente como especificada aqui .

[00141] Um método análogo pode ser empregado em que uma ou mais variantes de seqüência de um domínio VL descrito aqui são combinadas com um ou mais domínios VH.

[00142] Em uma forma de realização preferida, domínio VH de 1252A5 (SEQ ID NO: 392) pode ser submetido à mutação para prover uma ou mais variantes da seqüência de aminoácidos de domínio VH, opcionalmente combinado com 1252A5 VL (SEQ ID NO: 397).

[00143] Um outro aspecto da invenção provê um método de preparar um membro de ligação específico, específico para antígeno NGF, cujo método compreende: (a) prover um repertório de partida de ácidos nucleicos codificando um domínio VH que ou inclui um CDR3 a ser substituído ou faltando uma região de codificação de CDR3; (b) combinar referido repertório com a ácido nucleico doador codificando uma seqüência de aminoácidos substancialmente como especificado aqui para um VH CDR3 de modo que referido ácido nucleico doador é inserido na região de CDR3 no repertório, de modo a prover um repertório de produto de ácidos nucleicos codificando um domínio VH; (c) expressar os ácidos nucleicos de referido repertório de produto; (d) selecionar um membro de ligação específico, específico para NGF; e (e) recuperar referido membro de ligação específico ou ácido nucleico codificando o mesmo.

[00144] Novamente, um método análogo pode ser empregado em que um VL CDR3 da invenção é combinado com um repertório de ácidos nucleicos codificando um domínio VL que ou inclui um CDR3 a ser substituído ou faltando uma região de codificando de CDR3. [00145] Similarmente, um ou mais, ou todos os três CDRs podem ser enxertados em um repertório de domínios VH ou VL que são então triados para um membro de ligação específico ou membros de ligação específicos, específicos para NGF.

[00146] Em uma forma de realização preferida, um ou mais de 1252A5 HCDR1 (SEQ ID NO: 393), HCDR2 (SEQ ID NO: 394) e HCDR3 (SEQ ID NO: 395), ou o conjunto 1252A5 de HCDRs, podem ser empregado, e/ou um ou mais de 1252A5 LCDR1 (SEQ ID NO: 398), LCDR2 (SEQ ID NO: 399) e LCDR3 (SEQ ID NO: 400) ou o conjunto 1252A5 de LCDRs podem ser empregados.

[00147] Em outras formas de realização análogas, 1152H5, 1165D4 ou 1230H7 é substituído por 1252A5.

[00148] Similarmente, outro domínios VH e VL, conjuntos de CDRs e conjuntos de HCDRs e/ou conjuntos de LCDRs descritos aqui podem ser empregados.

[00149] Uma porção substancial de um domínio variável de imunoglobulina irá compreender pelo menos as três regiões de CDR, junto suas regiões de estrutura principal intervenientes. Preferivelmente, a porção irá também incluir pelo menos cerca de 50% de uma ou de ambas dentre a primeira e quarta regiões de estrutura principal, os 50% sendo o e C-terminal 50% da primeira região de estrutura principal e o N-terminal 50% de quarta região de estrutura principal. Resíduos adicionais na extremidade N-terminal ou C-terminal da parte substancial do domínio variável podem ser os não normalmente associados com regiões de domínio variável de ocorrência natural. Por exemplo, construção de membros de ligação específicos da presente invenção feitos por técnicas de DNA recombinante podem resultar na introdução de resíduos N- ou C-terminais codificados por ligadores introduzidos para facilitar a clonagem ou outras etapas de manipulação. Outras etapas de manipulação incluem a introdução de ligadores para unir domínios variáveis da invenção a outras seqüências de proteína incluindo região constante de anticorpos, outro domínios variáveis (por exemplo na produção de diacorpos) ou rótulos detectáveis/ funcionais como discutido em maiores detalhes aqui.

[00150] Apesar de que em um aspecto da invenção preferido membros de ligação específicos compreendendo um par de domínios VH e VL serem preferidos, domínios de ligação únicos com base em seqüências de domínio VH ou VL formam outros aspectos da invenção. Sabe-se que domínios imunoglobulina únicos, especialmente domínios VH, são capazes de ligação de antígenos de marcação em um modo específico. Por exemplo, ver a discussão de dAbs acima.

[00151] No caso de ambos os domínios de ligação específicos únicos, estes domínios podem ser usados para triar domínios complementares capazes de formar um membro de ligação específico de dois domínios capaz de ligar NGF.

[00152] Isto pode ser obtido por métodos de triagem de exibição de fagos, usando a assim chamada abordagem combinatorial dual hierárquica, como descrito em WO92/01047, em que uma colônia individual contendo ou um clone de cadeia H ou L é usado para infectar uma biblioteca completa de clones codificando a outra cadeia (L ou H) e o membro de ligação específico de duas cadeias resultante é selecionado de acordo com as técnicas de exibição de s fago como descritos nesta referência. Esta técnica é também descrita em Marks et al, ibid.

[00153] Membros de ligação específicos da presente invenção podem ainda compreender regiões constantes de anticorpos ou suas partes, preferivelmente regiões constantes de anticorpos humanos ou suas partes. Por exemplo, um domínio VL pode ser fixado em sua extremidade C-terminal para os domínios constantes de cadeia leve de anticorpo incluindo cadeias humanas Ck ou Cl, preferivelmente cadeias Cl. Similarmente, um membro de ligação específico baseado em um domínio VH pode ser fixados em sua extremidade C-terminal em toda ou parte (por exemplo domínio CH1) de uma cadeia pesada de imunoglobulina derivada de um isotipo de anticorpo, por exemplo IgG, IgA, IgE e IgM e qualquer uma das sub-classes de isotipos, particularmente IgG1 e IgG4. IgG4 é preferido. IgG4 é preferido porque ele não liga complemento e não cria funções de efetuador. Qualquer variante sintético ou outra região constante que tem estas propriedades e estabiliza as regiões variáveis é também preferida para uso em formas de realização da presente invenção.

[00154] Membros de ligação específicos da invenção podem ser rotulados com um rótulo detectável ou funcional. Os rótulos detectáveis incluem radio-rótulos como 131I ou 99Tc, que podem ser fixados a anticorpos da invenção usando química convencional bem conhecida na arte de formação de imagens de anticorpo. Os rótulos também incluem rótulos de enzima como peroxidase de raiz forte. Os rótulos ainda incluem porções químicas como biotina que podem ser detectadas via ligação a uma porção detectável de cognato específica, por exemplo avidina rotulada.

[00155] Membros de ligação específicos da presente invenção são projetados para serem usados em métodos de diagnose ou tratamento em indivíduos humanos ou animais, preferivelmente humano.

[00156] Assim, outros aspectos da invenção provêem métodos de tratamento compreendendo administração de um membro de ligação específico como provido, composições farmacêuticas compreendendo este membro de ligação específico, e uso deste membro de ligação específico na fabricação de medicamento para administração, por exemplo em um método de fabricar um medicamento ou composição farmacêutica compreendendo formular o membro de ligação específico com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00157] As indicações clínicas em que um anticorpo anti-NGF pode ser usado para prover benefício terapêutico incluem dor, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose pulmonar, outras doenças de inflamação das vias aéreas, neuropatia diabética, artrite, psoríase, arritmias cardíacas, HIV e câncer. Como já explicado o tratamento anti-NGF é indicado para todas estas doenças.

[00158] O tratamento anti-NGF pode ser dado oralmente, por injeção (por exemplo, subcutaneamente, intravenosamente, intraperitoneal ou intramuscularmente), por inalação, pela via intravesicular (instilação na bexiga urinária), ou topicamente (por exemplo intraocular, intranasal, retal, em feridas, sobre a pele). A via de administração pode ser determinada pelas características físico químicas do tratamento, por considerações especiais para a doença ou por exigência de otimizar a eficácia ou minimizar os efeitos laterais. [00159] É visado que o tratamento anti-NGF não será limitado ao uso na clínica. Assim, a injeção subcutânea usando um dispositivo sem agulha é também preferido.

[00160] Os tratamentos de combinação podem ser usados para prover significantes efeitos sinergísticos, particularmente a combinação de um membro de ligação específico anti-NGF com um ou mais outros fármacos. Membro de ligação específico de acordo com a presente invenção pode ser provido em combinação ou adição a agentes analgésicos, anti-inflamatórios, anti-alérgicos, anti-asmáticos, anti-fibróticos, antivirais, quimioterapêuticos e agentes imunoterapêuticos de ação curta ou longa.

[00161] O tratamento de combinação com um ou mais agentes analgésicos e/ou agentes anti-inflamatórios, de ação curta ou longa, como opióides e fármacos esteróides anti-inflamatórios (NSAIDs), pode ser empregado para tratamento de condições caracterizadas por dor e/ou inflamação por exemplo artrite reumatóide ou dor pós-cirúrgica. Anticorpos da presente invenção podem também ser usados em combinação com terapias anti-asma, anti-alérgica, ou anti-fibrótica, como agonistas de beta adrenoceptor inalados, esteróides, antagonistas de citocinas ou outras novas abordagens terapêuticas para tratamento de asma, asma alérgica, outras condições alérgicas, ou qualquer condição caracterizada por fibrose anormal. Anticorpos da presente invenção também podem ser usados em combinação com agentes anti-infectivos, por exemplo agentes antivirais para o tratamento de infecção por HIV.

[00162] De acordo com a presente invenção, composições providas podem ser administradas a indivíduos. Administração é preferivelmente em uma "quantidade terapeuticamente efetiva", esta sendo suficiente para mostrar benefício ao paciente. Este beneficio pode ser pelo menos melhora de pelo menos um sintoma. A quantidade real administrada, e taxa e curso de tempo de administração irão depender da natureza e severidade do que está sendo tratado. A prescrição de tratamento, por exemplo decisões sobre a dosagem etc, está dentro da responsabilidade dos agentes encarregados gerais e outros doutores médicos, e pode depender da severidade dos sintomas e/ou progressão de uma doença sendo tratada. As doses apropriadas de anticorpo são bem conhecidas na arte, ver Ledermann et al. (1991) e Bagshawe (1991). As dosagens especificadas indicadas aqui, ou em Physician's Desk Reference (2003) como apropriado para o tipo de medicamento sendo administrado, podem ser usadas. Uma quantidade terapeuticamente efetiva ou dose apropriada de um membro de ligação específico da invenção pode ser determinada por comparação de sua atividade in vitro e atividade in vivo em um modelo animal. Métodos para extrapolação de dosagens efetivas em camundongos e outros animais de teste para humanos são bem conhecidos.

[00163] A dose precisa irá depender de vários fatores, incluindo se o anticorpo é para diagnóstico ou tratamento, o tamanho e local da área a ser tratada, a natureza precisa do anticorpo (por exemplo anticorpo completo, fragmento ou diacorpo), e a natureza de qualquer rótulo detectável ou outra molécula fixada no anticorpo. Uma dose de anticorpo típica estará na faixa de 100 pg a 1 g para aplicações sistêmicas, e 1 pg a 1 mg para aplicações tópicas. Tipicamente, o anticorpo será um anticorpo completo, preferivelmente o isotipo IgG4. Esta é uma dose para um tratamento único de um paciente adulto, que pode ser ajustada de modo proporcional para crianças e bebês, e também ajustada para outros formatos de anticorpos em proporção ao peso molecular. Os tratamentos podem ser repetidos em intervalos diários, duas vezes por semana, semanal ou mensalmente, de acordo com as instruções do médico. Em formas de realização preferidas da presente invenção, o tratamento é periódico e o período entre as administrações é cerca de duas semanas ou mais, preferivelmente cerca de três semanas ou mais, mais preferivelmente cerca de quatro semanas ou mais, ou cerca de uma vez por mês. Em outras formas de realização preferidas da invenção, tratamento pode ser dados antes e/ou após cirurgia, e mais preferivelmente, pode ser administrado ou aplicado diretamente ao sítio anatômico do tratamento cirúrgico.

[00164] Membros de ligação específicos da presente invenção serão geralmente administrados na forma da composição farmacêutica, que pode compreender pelo menos um componente em adição ao membro de ligação específico.

[00165] Assim composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, e para uso de acordo com a presente invenção, podem compreender, em adição a ingrediente ativo, um excipiente farmaceuticamente aceitável, carreador, tampão, estabilizador ou outros materiais bem conhecidos dos versados. Estes materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do veículo ou outro material irá depender da via de administração que pode ser oral, ou por injeção, por exemplo intravenosa [00166] As composições farmacêuticas para administração oral podem ser em comprimidos, cápsulas, pó, líquido, ou forma semi-sólida. Um comprimido pode compreender um veículo sólido como gelatina ou adjuvante. As composições líquidas farmacêuticas geralmente compreendem um veículo líquido, como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. A solução salina fisiológica, dextrose ou outra solução de sacarídeos ou glicóis, como etileno glicol, propileno glicol ou polietileno glicol pode ser incluída.

[00167] Para injeção intravenosa, ou injeção no sítio de aflição, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável, que é isenta de pirogênios e tem um pH apropriado, isotonicidade e estabilidade. Os versados na arte relevante são capazes de preparar soluções apropriadas usando, por exemplo, veículos como injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção de Ringer lactada. Conservantes, estabilizadores, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, como requerido.

[00168] Uma composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com outros tratamentos, seja simultaneamente ou seqüencialmente dependente da condição a ser tratada.

[00169] Membros de ligação específicos da presente invenção podem ser formulados em forma liquida, semi-sólida ou sólida, dependendo das propriedades fisicoquímicas da molécula e da via de distribuição. Formulações podem incluir excipientes, ou combinações de excipientes, por exemplo: açúcares, aminoácidos e tensoativos. As formulações líquidas podem incluir uma ampla faixa de concentrações de anticorpo e pH. As formulações sólidas podem ser produzidas por liofilização, secagem por pulverização, ou secagem por tecnologia de fluidos supercríticos, por exemplo. As formulações de anti-NGF irão depender da via pretendida de liberação: por exemplo, formulações para liberação pulmonar podem consistir de partículas com propriedades físicas que asseguram penetração no pulmão profundo quando da inalação, as formulações tópicas podem incluir agentes de modificação da viscosidade, que prolongam a vida que o fármaco é residente no sítio de ação. Em algumas formas de realização, o membro de ligação específico pode ser preparado com um veículo que irá proteger o membro de ligação específico contra a liberação rápida, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, curativos transdérmicos, e sistemas de distribuição microencapsulados. Os polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, podem ser usados, como etileno acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação destas formulações são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Robinson, 1978.

[00170] A presente invenção provê um método compreendendo causar ou permitir a ligação de um membro de ligação específico como provido aqui a NGF. Como notado, esta ligação pode ocorrer in vivo, por exemplo após administração de um membro de ligação específico, ou ácido nucleico codificando um membro de ligação específico, ou pode ocorrer in vitro, por exemplo em ELISA, Western blotting, imunocitoquímica, imuno-precipitação, cromatografia de afinidade, ou testes com base em células como um teste TF-1.

[00171] A quantidade de ligação de membro de ligação específico para NGF pode ser determinada. Quantificação pode estar relacionada com a quantidade do antígeno em uma amostra de teste, que pode ser de interesse diagnóstico.

[00172] Um kit compreendendo um membro de ligação específico ou molécula de anticorpo de acordo com qualquer aspecto ou forma de realização da presente invenção é também provido como um aspecto da presente invenção. Em um kit da invenção, o membro de ligação específico ou molécula de anticorpo pode ser rotulado para permitir que sua reatividade em uma amostra seja determinada, por exemplo como descrito ainda abaixo. Os componentes do kit são geralmente estéreis e em frasquinhos vedados ou outros recipientes. Kits podem ser empregados em análise diagnóstica ou outros métodos para os quais as moléculas de anticorpo são utilizáveis. Um kit pode conter instruções para uso dos componentes em um método, por exemplo um método de acordo com a presente invenção. Materiais auxiliares para ajustar ou permitir realizar este método podem ser incluídos dentro do kit da invenção.

[00173] A reatividade de anticorpos em uma amostra podem ser determinadas por qualquer meio apropriado. O radioimunoensaio (RIA) é uma possibilidade. O antígeno rotulado radioativo é misturado com antígeno não rotulado (a amostra de teste) e deixado ligar ao anticorpo. O antígeno ligado é fisicamente separado do antígeno não ligado e a quantidade de antígeno radioativo ligado ao anticorpo determinada. Quanto mais antígeno se tem na amostra de teste, menos antígeno radioativo irá se ligar ao anticorpo. Um teste de ligação competitiva pode também ser usado com um antígeno não radioativo, usando antígeno ou um análogo ligado a uma molécula repórter. A molécula repórter pode ser um fluorocromo, fósforo ou corante laser com absorção espectralmente isolada ou características de emissão. Os fluorocromos apropriados incluem fluoresceína, rodamina, ficoeritrina e Texas Red. Os corantes cromogênicos apropriados incluem diaminobenzidina.

[00174] Outros repórteres incluem partículas macromoleculares coloidais ou material particulado como contas de látex que são coloridas, magnéticas ou paramagnéticas, e agentes biologicamente ou quimicamente ativos, que podem diretamente ou indiretamente causar sinais detectáveis para serem visualmente observados, eletronicamente detectados ou de outra forma registrados. Estas moléculas podem ser enzimas, que catalisam reações que desenvolvem ou mudam as cores ou causam mudanças em propriedades elétricas, por exemplo. Elas podem ser molecularmente excitáveis de modo que transições eletrônicas entre estados de energia resultam em absorções espectrais características ou emissões. Elas podem incluir entidades químicas usadas em conjunto com biossensores. Sistemas de detecção de biotina/avidina ou biotina/estreptavidina e fosfatase alcalina podem ser empregados. [00175] Os sinais gerados por conjugados de anticorpo-repórter individual podem ser usados para derivar dados absolutos ou relativos quantificáveis da ligação de anticorpo relevante em amostras (normal e teste).

[00176] A presente invenção também provê o uso de um membro de ligação específico como acima para medir os níveis de antígeno em um teste de competição, isto é, um método de medida do nível de antígeno em uma amostra por emprego de um membro de ligação específico como provido pela presente invenção em um teste de competição. Isto pode ser onde a separação física de antígeno ligado a partir do não ligado não é requerida. A ligação de uma molécula repórter ao membro de ligação específico de modo que ocorre uma mudança física ou óptica na ligação é uma possibilidade. A molécula repórter pode gerar diretamente ou indiretamente sinais detectáveis, e preferivelmente mensuráveis. A ligação das moléculas repórteres pode ser diretamente ou indiretamente, covalentemente, por exemplo via uma ligação de peptídeo ou não covalentemente. A ligação via um peptídeo ligado pode ser como resultado de expressão recombinante de uma fusão de genes codificando anticorpo e molécula repórter. [00177] A presente invenção também provê níveis de medida de antígeno diretamente, por emprego de um membro de ligação específico de acordo com a invenção por exemplo em um sistema biossensor.

[00178] O modo de determinação da ligação não é um aspecto da presente invenção e os versados na arte são capazes de escolher um modo apropriado de acordo com sua preferência e conhecimento geral.

[00179] Como notado, em vários aspectos e formas de realização, a presente invenção estende-se a um membro de ligação específico que compete para ligação a NGF com qualquer membro de ligação específico definido aqui, por exemplo 1252A5 IgG4. Competição entre membros de ligação pode ser testada facilmente in vitro, por exemplo por etiquetagem de uma molécula repórter específica a um membro de ligação que pode ser detectado na presença de um outro membro (s) de ligação não etiquetado, para permitir a identificação de membros de ligação específicos que ligam o mesmo epítopo ou um epítopo sobrejacente.

[00180] Competição pode ser determinada por exemplo usando ELISA em que NGF é imobilizado em uma placa e um primeiro membro de ligação junto com um ou mais de outros membros de ligação não etiquetados é adicionado à placa. A presença de um membro de ligação não etiquetado que compete com um membro de ligação etiquetado é observada por uma diminuição no sinal emitido pelo membro de ligação etiquetado.

[00181] No teste para competição de um fragmento de peptídeo do antígeno podem ser empregados especialmente um peptídeo incluindo ou consistindo essencialmente de um epítopo de interesse. Um peptídeo tendo a seqüência de epítopo mais um ou mais aminoácidos em qualquer extremidade pode ser usado. Membros de ligação específicos de acordo com a presente invenção podem ser tais que sua ligação para antígeno é inibida por um peptídeo com ou incluindo uma seqüência dada. Em teste para isto, um peptídeo com qualquer seqüência mais um ou mais aminoácidos pode ser usado.

[00182] Membros de ligação específicos que ligam um peptídeo específico podem ser isolados por exemplo de uma biblioteca de exibição de fagos por bateia com o(s) peptídeo(s).

[00183] A presente invenção ainda provê um ácido nucleico isolado codificando um membro de ligação específico da presente invenção. Ácido nucléico pode incluir DNA e/ou RNA. Em um aspecto preferido, a presente invenção provê um ácido nucleico que codifica para um CDR ou conjunto de CDRs ou domínio VH ou domínio VL ou sítio de ligação de anticorpo - antígeno ou molécula de anticorpo, por exemplo scFv ou IgG4, da invenção como definido acima.

[00184] A presente invenção também provê construções na forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcripção ou expressão que compreendem pelo menos um polinucleotídeo como acima.

[00185] A presente invenção também provê uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções como acima. Um ácido nucleico codificando qualquer CDR ou conjunto de CDRs ou domínio VH ou domínio VL ou sítio de ligação de anticorpo - antígeno ou molécula de anticorpo, por exemplo scFv ou IgG4 como provido, forma, sozinho, um aspecto da presente invenção, assim como um método de produção do produto codificado, cujo método compreende expressão do ácido nucleico codificando para o mesmo. Expressão pode ser obtida de modo conveniente por cultivo sob condições apropriadas de células hospedeiras recombinantes contendo o ácido nucleico. Após produção por expressão de um domínio VH ou VL, membro de ligação específico pode ser isolado e/ou purificado usando qualquer técnica apropriada, então usado como apropriado.

[00186] Membros de ligação específicos, domínios VH e/ou VL, e codificando moléculas de ácido nucleico e vetores de acordo com a presente invenção podem ser providos isolados e/ou purificados, por exemplo de seu meio natural, em forma substancialmente pura ou homogêneo, ou no caso do ácido nucleico, livre ou substancialmente livre de ácido nucleico ou genes de origem diferentes de uma seqüência codificando um polipeptídeo com a função requerida. O ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode compreender DNA ou RNA e pode ser total ou parcialmente sintético. Referência a uma seqüência de nucleotídeos como especificados aqui engloba uma molécula de DNA com a seqüência especificada, e engloba uma molécula de RNA a seqüência especificada em que U é substituído por T, salvo se o contexto requerer de outra forma.

[00187] Sistemas para clonagem e expressão dos polipeptídeos em várias diferentes células hospedeiras são bem conhecidos. As apropriadas células hospedeiras incluem bactérias, células de mamíferos, células de plantas, leveduras e sistemas de baculovírus e animais e plantas transgênicas. A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpos em células procarióticas é bem conhecida na arte. Para um estudo, ver por exemplo Plückthun (1991). Um hospedeiro bacteriano preferido comum é E. coli.

[00188] Expressão em células eucarióticas em cultura é também disponível para os versados na arte como uma opção para produção de um membro de ligação específico por exemplo Chadd & Chamow (2001), Andersen & Krummen (2002), Larrick & Thomas (2001). As linhagens de células de mamíferos disponíveis na arte para expressão de polipeptídeo heterólogo incluem células de ovários de hamster chinês, (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebê, células de melanoma de camundongo NS0, células de mieloma de rato YB2/0, células de rim embriônico humanas, células de retina embriônica humana, e muitas outras.

[00189] Os vetores apropriados podem ser selecionados ou construídos, contendo seqüências regulatórias apropriadas, incluindo seqüências de promotor, seqüências de terminador, seqüências de poliadenilação, seqüências melhoradoras, genes marcadores e outras seqüências como apropriado. Os vetores podem ser plasmídeos, por exemplo fagomídeos, ou virais, por exemplo 'fago, como apropriado. Para outros detalhes ver, por exemplo, Sambrook & Russell (2001). Muitas técnicas e protocolos apropriados para manipulação de ácido nucleico, por exemplo em preparação de construções de ácido nucleico, mutagenese, seqüenciamento, introdução de DNA em células e expressão de genes, e análise de proteínas, são descritos em detalhes em Ausubel et al., 1988 e Ausubel et al., 1999.

[00190] Assim, um outro aspecto da presente invenção provê uma célula hospedeira contendo ácido nucleico como descrito aqui . Esta célula hospedeira pode estar in vitro e pode estar em cultura. Esta célula hospedeira pode estar in vivo. A presença In vivo da célula hospedeira pode permitir a expressão intracelular dos membros de ligação específico da presente invenção, como "intracorpos" ou anticorpos intracelulares. Intracorpos podem ser usados para terapia de genes.

[00191] Em ainda um outro aspecto, provê-se um método compreendendo introduzir este ácido nucléico em uma célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquer técnica disponível. Para células eucarióticas, as técnicas apropriadas podem incluir transfecção com fosfato de cálcio, DEAE-Dextrano, eletroporação, transfecção mediada por lipossomas e transdução usando retrovírus ou outro vírus, por exemplo vacínia ou, para células de insetos, baculovírus. A introdução do ácido nucleico na célula hospedeira, em particular uma célula eucariótica pode usar um sistema de base viral ou plasmídeo. O sistema plasmídeo pode ser mantido epissomalmente ou pode ser incorporado na célula hospedeira ou em um cromossomo artificial. Incorporação pode ser ou por integração aleatória ou marcada de uma ou mais cópias de um loci único ou múltiplo. Para células bacterianas , apropriadas técnicas podem incluir transformação de cloreto de cálcio, electroporação e transfecção usando bacteriófagos [00192] A introdução pode ser seguida causando ou permitindo a expressão do ácido nucleico, por exemplo por cultivo de células hospedeiras sob condições para expressão do gene.

[00193] Em uma forma de realização, o ácido nucleico da invenção é integrado no genoma (por exemplo cromossomo) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida por inclusão das seqüências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padrões.

[00194] A presente invenção também provê um método que compreende usar uma construção como descrito acima no sistema de expressão a fim de expressar um membro de ligação específico ou polipeptídeo como acima.

[00195] Aspectos e formas de realização da presente invenção serão agora ilustrados, a título de exemplo, com referência à seguinte experimentação e os desenhos anexos, em que: [00196] Figura 1 mostra curvas de inibição de concentração para a neutralização de anticorpos de NGF humano (Figura 1A) e rato (Figura 1B) no teste de mobilização de cálcio de receptor humano de TrkA. Anticorpos IgG4 de NGF humano foram comparados com os anticorpos de NGF comerciais G1131, Mab5260Z, e MAB256 para inibição de mobilização de cálcio intracelular evocada por 1nM NGF. Pontos de dados indicam resultados de um único experimento e são + desvio padrão médio de determinações em triplicata para cada concentração de anticorpo.

[00197] Figura 2 mostra inibição de mobilização de cálcio intracelular em células HEK-293 expressando recombinantemente o receptor de TrkA humano. Anticorpos IgG4 humanos otimizados em potência foram avaliados para inibição de respostas evocadas por 1nM de NGF humano (Figura 2A), rato (Figura 2B), e camundongo (Figura 2C). Pontos de dados indicam resultados de um único experimento e são + desvio padrão médio de determinações em triplicata para cada concentração de anticorpo.

[00198] Figura 3 mostra o efeito inibidor de anticorpos IgG4 de NGF humano no teste de sobrevivência celular PC12 . Sobrevivência celular foi mantida pela presença de 1nM NGF humano (Figura 3A) ou NGF de rato (Figura 3B). Dados indicam ± desvio padrão médio para determinações em triplicata de um único experimento.

[00199] Figura 4 mostra inibição de proliferação de células TF-1 mediada por NGF por anticorpos de NGF de IgG4 humanos de linhagem germinativa e não de linhagem germinativa, e o anticorpo de NGF de referência, MAB256. Células foram estimuladas com 200pM de NGF humano (Figura 4A), NGF de rato (Figura 4B), ou NGF de camundongo (Figura 4C). Dados representam o sem ± médio de determinações em triplicata de um único experimento.

[00200] Figura 5 mostra a falta de reatividade cruzada de anticorpo humano IgG4 de NGF 1252A5 com as neurotrofinas BDNF, NT-3 e NT-4. 100ng neurotrofina foram adsorvidos por cavidade. Cada ponto de dados representa o + desvio padrão médio de determinações em triplicata de um único experimento.

[00201] Figura 6 mostra as curvas de ligação de saturação para 125I- NGF humano ligando aos anticorpos humanos de NGF IgG4 1252A5 (Figura 6A) e G1152H5 (Figura 6B). Os valores Kd calculados são 0,35nM e 0,37nM, respectivamente, e são o resultado de um único experimento.

[00202] Figura 7 mostra curvas de ligação de saturação para 125I -NGF de rato ligando aos anticorpos de NGF IgG4 1252A5 (Figura 7A) e G1152H5 (Figura 7B). Os valores Kd calculados são 0,44nM e 0,50nM, respectivamente, e são o resultado de um único experimento. [00203] Figura 8 mostra inibição dependente de concentração de 125I- NGF humano (Figura 8A) ou rato (Figura 8B) ligando ao receptor de proteína de fusão TrkA, por anticorpos IgG4 humano ou de referência. Uma concentração de NGF radiorrotulado em cada cavidade de teste foi aproximadamente de 150pM. Dados indicam o resultado de um único experimento. Ver também Tabelas 6 e 7.

[00204] Figura 9 mostra inibição dependente de concentração de 125I- NGF humano (Figura 9A) ou rato (Figura 9B) ligando a proteína de fusão de receptor de p75, por anticorpos IgG4humanos ou referência. Uma concentração de NGF radiorrotulado em cada cavidade de teste foi aproximadamente de 150pM. Dados indicam o resultado de um único experimento. Ver também Tabelas 8 e 9.

[00205] Figura 10 mostra inibição relacionada com dose hiperalgesia térmica induzida por carragenano no camundongo, 48h após administração sistêmica de IgG4humano anti-NGF, 1252A5. EXEMPLO 1 Isolamento de anti-NGF scFv repertório de anticorpo ScFv [00206] Três bibliotecas de anticorpo humano de cadeia única, grandes, Fv (scFv) clonadas no vetor de fagemídeo, foram usadas para seleções. As bibliotecas foram derivadas de linfócitos de baço (A) (Hutchings, 2001), (B) uma combinação de linfócitos de sangue periférico, células de amídala B células e células de medula óssea B (Vaughan et al., 1996) e (C) as cadeias leves e regiões de CDR3 VH de A combinadas com a estrutura principal de cadeia pesada da linhagem germinativa DP47.

Seleção de scFv [00207] Os procedimentos de seleção de fagos usados foi essencialmente como descrito em Hutchings, supra. ScFv que reconheceu NGF foi isolado das bibliotecas de exibição de fagos em uma serie de ciclos de seleção em NGF humano e de rato. Em resumo, antígeno não modificado foi revestido em tubos Maxisorb Nunc. Fago foi incubado no antígeno em um volume total de 500pl durante 1h antes de lavar para remover o fago não ligado. O fago ligado foi então resgatado como descrito por Vaughan et al., supra e o processo de seleção repetido. Para auxiliar o isolamento de scFv reativo cruzado humano/roedor, ciclos alternados de seleção foram realizados nas respectivas isoformas de espécies de NGF. Um máximo de quadro ciclos de seleção foi realizado com qualquer biblioteca usando esta estratégia de seleção de isoformas alternantes. β - NGF humano ou de fato foi usado como o antígeno inicial para as seleções do primeiro ciclo.

[00208] As produções dos ciclos 2-4 foram priorizadas por triagem bioquímica com base na porcentagem de clones específicos para NGF isolados e a diversidade de seqüência destes clones. A porcentagem de clones específicos para NGF foi determinada em cada caso por ELISA de fagos. A diversidade de seqüência foi determinada por seqüenciamento de DNA.

Protocolo de ELISA de fagos [00209] Culturas de bactérias transduzidas em fagos foram preparadas em 1ml de meio 2xTY contendo 100pg/ml ampicilina e 50pg/ml canamicina com agitação a 30°C durante 16h. O sobrenadante de fago foi preparado por centrifugação da cultura (10 min a 3000rpm) e bloqueio com 3% peso/volume de leite em pó em PBS durante 1h. Os fagos bloqueados foram então adicionados a placas previamente revestidas com (1 mg/ml) antígeno ou antígeno irrelevante. As placas foram lavadas entre cada etapa com três enxágües em PBS-Tween 20 (0,1% volume/volume) seguido por três enxágües em PBS. Fagos ligados foram detectados por incubação com conjugado peroxidase de raiz-forte (HRP)/anti-M13 (Amersham UK) diluído 1:5000 em 3% peso/volume de leite em pó PBS durante 1h, e desenvolvidos por incubação com substrato de tetrametil benzidina (TMB) (Sigma). A reação colorimétrica foi parada após um período apropriado por adição de 0,5M ácido sulfúrico. As leituras de absorbância foram tomadas a 450nm. Clones que ligaram especificamente ao antígeno foram identificados como tendo um sinal no antígeno maior do que ou igual a 5x que no antígeno irrelevante.

Seqüenciamento de DNA

[00210] DNA gabarito de filamento duplo para seqüenciamento foi obtido por PCR de scFv usando os iniciadores FDTETSEQ24 (TTTGTCGTCTTTCCAGACGTTAGT - SEQ ID NO: 534) e PUCreverse (AGCGGATAACAATTTCACACAGG - SEQ ID NO: 535). Iniciador em excesso e dNTPs do PCR primário foram removidos usando placas PCR de 96 cavidades Macherey-Nagel Nucleofast (Millipore) de acordo com as instruções do fabricante. Genes VH foram seqüenciados com iniciador Lseq (GATTACGCCAAGCTTTGGAGC SEQ ID NO: 536). VL genes foram seqüenciados com iniciador MYC Seq 10 (CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG SEQ ID NO: 537). Cada mistura de reação continha 20-40ng DNA, 3 - 20pmol iniciador e 4μΊ Big Dye Terminator V3.0 (Applied Biosystems, UK) em volume de 20μΚ As reações de seqüenciamento consistiam de 25 ciclos de 96°C 10s; 50°C, 5s; 60°C, 4min. Amostras foram cicladas e analisadas em analisador de DNA 3700 DNA Analyser de Applied Biosystems. Áreas de ambigüidade foram analisadas manualmente usando software Continuity desenvolvido na empresa (Cambridge Antibody Technology, UK) e software de manipulação de seqüências SeqEd DNA (Applied Biosystems, UK).

Triagem bioquímica para scFv neutralizando NGF [00211] A produção do processo de seleção de fagos foi ainda triada para a identificação de clones que inibiram a ligação de NGF a uma proteína de fusão de domínio extracelular de receptor de TrKA. [00212] Amostras brutas de scFv foram preparadas a partir de lisados periplásmicos de bactérias TG-1 de E.coli transfectadas com fagos selecionados para avaliação no teste de ligação. As placas de 96 cavidades Nunc Maxisorb foram revestidas durante a noite com receptor humano de proteína de fusão de domínio extracelular de TrkA (R&D Systems; concentração de revestimento; teste de NGF humano, 0,25nM; teste de NGF de rato, 1nM). As placas de teste foram lavadas com PBS/Tween 20, bloqueadas durante 2h usando 1% albumina de soro bovino (BSA) em PBS, e lavadas novamente. As amostras de ScFv foram pré-incubadas durante 30min com 1nM β- NGF recombinante humano ou de rato (R&D Systems) em 1% BSA. Amostras foram transferidas em um volume de 100μl para placas de teste e incubadas durante 60min a temperatura ambiente. Placas foram lavadas e NGF que restou ligado às placas foi rotulado usando 0^g/ml de biotina humana anti-NGF (Peprotech) ou biotina de rato anti-NGF (R&D Systems) diluídos em 1% BSA, seguido por incubação durante 60min a temperatura ambiente. Anti- NGF rotulado a Biotina foi detectado usando o sistema de detecção de fluorescência resolvido no tempo DELFIA (Wallac). Brevemente, placas foram lavadas e 100μl de estreptavidina Eu3+ adicionados a cada cavidade, diluídos 1/1000 em tampão de teste DELFIA. Placas foram incubadas por mais 60 min a temperatura ambiente e lavadas com tampão de lavagem DELFIA, seguido por adição de 100μl de solução de melhora DELFIA a cada cavidade. Placas foram lidas usando a leitora de placa fluorimétrica Wallac Victor (comprimento de onda de excitação 314nm; comprimento de onda de emissão 615nm).

[00213] Clones que inibiram tanto a ligação de NGF humano como de rato em mais do que 70% como preparações de scFv de lisado periplásmico foram re-avaliadas como scFv purificado no teste de ligação. As preparações de scFv purificadas foram preparadas como descrito em Exemplo 3 de WO01/66754. As concentrações de proteína de preparações de scFv purificadas foram determinadas usando o método BCA (Pierce). Re- teste enfatizou os seguintes anticorpos de scFv que foram neutralizadores potentes de ligação de NGF humano e de rato para a proteína de fusão de domínio extracelular do receptor de TrkA : 1064F8 (VH SEQ ID NO: 2; VL SEQ ID NO: 7), 1022E3 (VH SEQ ID NO: 12; VL SEQ ID NO: 17), 1083H4 (VH SEQ ID NO: 22; VL SEQ ID NO: 27), 1021E5 (VH SEQ ID NO: 32; VL SEQ ID NO: 37), 1033G9 (VH SEQ ID NO: 42; VL SEQ ID NO: 47), 1016A8 (VH SEQ ID NO: 52; VL SEQ ID NO: 57), 1028F8 (VH SEQ ID NO: 62; VL SEQ ID NO: 67), 1033B2 (VH SEQ ID NO: 72; VL SEQ ID NO: 77), 1024C4 (VH SEQ ID NO: 82; VL SEQ ID NO: 87), e 1057F11 (VH SEQ ID NO: 92; VL SEQ ID NO: 97). EXEMPLO 2 Expressão de anticorpos IgG4 humano e avaliação funcional in vitro de potência neutralizante de NGF [00214] Os scFv 1064F8, 1022E3, 1083H4, 1021E5, 1033G9, 1016A8, 1028F8, 1033B2, 1024C4, e 1057F11 neutralizantes de NGF foram reformatados como anticorpos IgG4 humanos e testados para potência neutralizante de NGF como um sistema de teste de célula completa.

Conversão de IgG

[00215] Vetores foram construídos para os clones scFv mais potentes para permitir a re-expressão como anticorpo humano IgG4 completo, essencialmente como descrito por Persic et al. (1997). Células EBNA-293 mantidas em meio condicionado foram co-transfectadas com construções expressando domínios cadeia pesada e leve. Anticorpo completo foi purificado do meio usando cromatografia afinidade A de proteína (Amersham Pharmacia). As preparações de anticorpo purificadas foram filtradas de modo estéril e armazenadas a 4°C em solução tamponada com fosfato (PBS) antes da avaliação potência in vitro. Concentração da proteína foi determinada espetrofotometricamente de acordo com Mach et al. (1992).

Teste FLIPR de mobilização de cálcio intracelular [00216] A potência e eficácia de IgGs anti-humanos para neutralizar NGF foram determinadas em teste de mobilização de cálcio fluorescente à base de células. A potência de anticorpos humanos foi comparada com NGF anti-humano de camundongo (MAB256; R&D Systems), NGF anti-camundongo de rato (G1131; Promega), e NGF anti-camundongo de camundongo (MAB5260Z; Chemicon). IgGs anti-NGF foram co-incubadas com β-NGF humano recombinante (Calbiochem, 480275) ou β-NGF de rato recombinante (R&D Systems, 556-NG-100). O complexo foi então adicionado a células HEK293 expressando receptores de TrkA humano recombinante carregados com o corante sensível a cálcio, Fluo-4, e então fluorescência dependente de Ca2+ foi monitorada.

[00217] As células HEK (pico-S, Edge Biosystems) transfectadas com TrkA humano recombinante (obtidas de M. Chao, Skirball Institute, NY) foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (MEM, Cellgro, MT10-017-CV) suplementado com 10% soro bovino fetal (Hyclone, SH30071,03), 1,5 mg/ml puromicina (Edge Biosystems, 80018) e 1% penicilina-estreptomicina. Células confluentes foram coletadas por deslocamento das células com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS), e então carregadas com tampão de carga contendo 6 mM Fluo-4 (Molecular Probes) a 37°C durante 1,5h na presença de um inibidor de transporte de ânions (2,5 mM probenecid em 1% FBS/MEM). Após lavar as células uma vez com tampão de teste (2,5 mM probenecid em 0,1% BSA Hank's/HEPES), as células foram colocadas em placas de 96-cavidades de fundo transparente, revestidas com poli-D-lisina (Costar #3904) a aproximadamente 60.000 células /cavidade em 120 ml. As células foram incubadas no escuro durante 30 min a temperatura ambiente, e as placas foram então centrifugadas a 1,200 rpm (290 x g) durante 5min. Antes do teste, as placas foram pré-aquecidas a 35oC durante 20 min. IgGs de teste foram testados em 7 concentrações em cavidades em triplicata. Trinta e cinco microlitros de 10X IgG anti-NGF e quantidades iguais de 10 nM 2,5S NGF humano, rato ou camundongo foram pré-incubadas a temperatura ambiente durante aproximadamente 1h. Placas contendo os IgGs pré-complexados e placas contendo tampão de teste 100 pl/cavidade foram pré-aquecidas a 35oC durante 20min antes de testar na leitora de placa de formação de imagem fluorimétrica (FLIPR; Molecular Devices). Após a adição de 80pl/cavidade tampão de teste na placa de teste e incubação durante 5 min a 35°C, 50pl/cavidade de complexo IgG/NGF anti-humano diluído foram adicionados na placa de células no FLIPR com monitoração contínua da fluorescência dependente de Ca2+-. A fluorescência induzida por NGF foi calculada como a diferença entre a intensidade de fluorescência de linha de base logo antes de adição NGF e a maior intensidade de fluorescência atingida em 2 minutos após a adição de NGF. A média dos valores de fluorescência induzida por NGF em triplicata na ausência de anticorpo foi definida como 100% de mobilização de cálcio. Na presença de anticorpo, o + SD médio de valores de fluorescência induzida por NGF em triplicata foi calculado como uma porcentagem da mobilização de cálcio de controle. A porcentagem de valores de mobilização de cálcio de controle foi traçada em gráfico como uma função do log da concentração de IgG. Os valores de IC50 foram calculados por configuração da função da resposta- dose sigmoidal (curva variável) usando Prism (GraphPad).

[00218] Todos os anticorpos testados demonstraram uma inibição relacionada com concentração de mobilização de cálcio intracelular evocada por NGF humano. A ordem de classificação de potência parar neutralização de NGF humano foi 1064F8 > 1022E3 > 1083H4 > 1033G9 > 1016A8 > 1028F8 > 1021E5 > 1033B2 >> 1024C4 >> 1057F11 (Tabela 1). Cinco anticorpos foram ainda avaliados para neutralização funcional de NGF de rato, e estes foram aproximadamente equipotentes contra ambas as isoformas de espécies (Figuras 1A e 1B; Tabela 1). EXEMPLO 3 Isolamento de anticorpos de NGF IgG4 humano otimizados Otimização de potência de scFv de exibição de ribossomas [00219] As bibliotecas de exibição de ribossomas grandes foram criadas e selecionado para scFv que especificamente reconheceu NGF humano recombinante (R&D Systems), essencialmente como descrito em Hanes et al. (2000). Inicialmente, os clones 1064F8, 1022E3, 1083H4, 1021E5, 1033G9, 1016A8, 1028F8, 1033B2, e 1024C4 foram convertidos em formato de exibição de ribossomas, onde as os gabaritos foram subseqüentemente usados para criação da biblioteca. O clone 1057F11 não foi selecionado para otimização de potência, e assim um gabarito de exibição de ribossomas não foi feito para este anticorpo. No nível de DNA, um promotor de T7 foi adicionado na extremidade 5' para transcripção eficiente em mRNA. No nível de mRNA, a construção continha um sítio de liberação de ribossomas procarióticos (seqüência de Shine-Dalgarno). Na extremidade 3' da cadeia única, o códon de parada foi removido e a porção de gIII foi adicionada para atuar como um espaçador (Hanes et al., supra).

[00220] As bibliotecas de exibição de ribossomas derivadas de 1064F8, 1022E3, 1083H4, 1021E5, 1033G9, 1016A8, 1028F8, 1033B2, e 1024C4 foram criadas por mutagenese de scFv HCDR3. As reações de PCR foram realizadas com polimerase Taq não de leitura de prova. As seleções com base em afinidade foram realizadas, assim, seguindo a incubação com a biblioteca, NGF humano biotinilado foi copulado a contas paramagnéticas revestidas com estreptavidina (Dynal M280). Complexos terciários ligados (mRNA-ribossoma-scFv) foram recuperados por separação magnética enquanto os complexos não ligados foram lavados. O mRNA codificando o scFv ligado foi então resgatado por RT-PCR como descrito em Hanes et al., (supra) e o processo de seleção repetido com concentrações decrescentes (100 nM - 10 pM durante cinco ciclos) de NGF humano biotinilado presente durante a seleção.

[00221] PCR passível de erros foi também usado para ainda aumentar o tamanho da biblioteca. Uma taxa de erros de 7.2 mutações por 1,000 bp foi empregada (Diversify™, Clontech) durante o regime de seleção. As reações de PCR passível de erros foram realizadas antes das seleções começarem em ciclos três e quatro usando concentrações de NGF humano biotinilado de 1 nM e 0,1 nM, respectivamente.

[00222] Uma proporção representativa de scFv da produção dos ciclos de seleção três, quatro e cinco foi ligada no vetor pCantab6 (Vaughan et al., 1996) e clonada na cepa TG1 de E.coli. Uma amostra deste scFv foi seqüenciada em DNA como descrito em Exemplo 1 para confirmar a diversidade de seqüência da produção antes da triagem in vitro para atividade neutralizante de NGF. Os clones foram triados como scFv não purificado na proteína de fusão de domínio extracelular em NGF/receptor de TrkA, como descrito em Exemplo 1. A concentração das preparações de scFv de lisado periplásmico nos testes foi reduzida a 0,5% - 5% do volume de teste final, e clones que inibiram a ligação de NGF tanto humano como de rato em >95% foram isolados para outro estudo. Deste modo um painel neutralizadores de NGF reativos cruzados e otimizados em potência, foi isolado. De modo surpreendente, os neutralizados de NGF mais potentes foram derivados dos clones originais 1021E5 e 1083H4, que não foram os mais potentes dos anticorpos originais. Os clones otimizados foram seqüenciados e retestados como scFv purificado para confirmar a potência antes de reformar em IgG4 humano, como descrito em Exemplo 2.

[00223] Anticorpos derivados de clone originais 1021E5 (VH SEQ ID NO: 32; VL SEQ ID NO: 37) e convertidos em formato de IgG4 humano foram 1126F1 (VH SEQ ID NO: 102; VL SEQ ID NO: 107), 1126G5 (VH SEQ ID NO: 112; VL SEQ ID NO: 117), 1126H5 (VH SEQ ID NO: 122; VL SEQ ID NO: 127), 1127D9 (VH SEQ ID NO: 132; VL SEQ ID NO: 137), 1127F9 (VH SEQ ID NO: 142; VL SEQ ID NO: 147), 1131D7 (VH SEQ ID NO: 152; VL SEQ ID NO: 157), 1131H2 (VH SEQ ID NO: 162; VL SEQ ID NO: 167), 1132A9 (VH SEQ ID NO: 172; VL SEQ ID NO: 177), 1132H9 (VH SEQ ID NO: 182; VL SEQ ID NO: 187), 1133C11 (VH SEQ ID NO: 192; VL SEQ ID NO: 197), 1134D9 (VH SEQ ID NO: 202; VL SEQ ID NO: 207), 1145D1 (VH SEQ ID NO: 212; VL SEQ ID NO: 217), 1146D7 (VH SEQ ID NO: 222; VL SEQ ID NO: 227), 1147D2 (VH SEQ ID NO: 232; VL SEQ ID NO: 237), 1147G9 (VH SEQ ID NO: 242; VL SEQ ID NO: 247), 1150F1 (VH SEQ ID NO: 252; VL SEQ ID NO: 257), 1152H5 (VH SEQ ID NO: 262; VL SEQ ID NO: 267), 1155H1 (VH SEQ ID NO: 272; VL SEQ ID NO: 277), 1158A1 (VH SEQ ID NO: 282; VL SEQ ID NO: 287), 1160E3 (VH SEQ ID NO: 292; VL SEQ ID NO: 297), 1165D4 (VH SEQ ID NO: 302; VL SEQ ID NO: 307), 1175H8 (VH SEQ ID NO: 312; VL SEQ ID NO: 317), 1211G10 (VH SEQ ID NO: 322; VL SEQ ID NO: 327), 1214A1 (VH SEQ ID NO: 332; VL SEQ ID NO: 337), 1214D10 (VH SEQ ID NO: 342; VL SEQ ID NO: 347), 1218H5 (VH SEQ ID NO: 352; VL SEQ ID NO: 357), e 1230H7 (VH SEQ ID NO: 362; VL SEQ ID NO: 367). [00224] Anticorpos derivados de clone originais 1083H4 (VH SEQ ID NO: 22; VL SEQ ID NO: 27) e convertidos em formato IgG4 humano foram 1227H8 (VH SEQ ID NO: 372; VL SEQ ID NO: 377) e 1230D8 (VH SEQ ID NO: 382; VL SEQ ID NO: 387).

Regiões de estrutura principal de linhagem germinativa de 1133C11 para derivar 1252A5 e outras variantes 1021E5 [00225] O exame da informação de seqüência CDR VH e VL para clones otimizados derivados de 1021E5 enfatizou que a grande proporção destes anticorpos continha a seqüência de aminoácidos LNPSLTA (SEQ ID NO: 531) em VH CDR3 (isto é, aminoácidos 100A a 100G de acordo com um sistema de numeração de Kabat). Estes clones são mostrados em Tabela 2a, enfatizando como eles variam em seqüência de aminoácidos nas regiões CDR VH e VL, junto com uma estimativa de sua potência neutralizante de NGF quando testados como scFv purificado. Dentes estes clones, 1133C11 diferiu em regiões de CDR de 1021E5 somente pelos 7 aminoácidos consecutivos 100A a 100G como descrito. Assim, 1133C11 foi escolhido para a formação da linhagem germinativa, primeiro para confirmar que a potência foi retida com a estrutura principal modificada e segundo para permitir a introdução mutações de CDR subseqüentes, se desejado, a fim de gerar outros anticorpos de linhagem germinativa de interesse a partir da mesma linhagem.

[00226] As seqüências VH e VL de aminoácidos derivados de 1133C11 foram alinhadas nas seqüências de linhagem germinativa humanas conhecidas na base de dados VBASE dados base (Tomlinson [1997], MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) e a linhagem germinativa mais próxima identificada. A linhagem germinativa mais próxima para o VH de 1133C11 foi identificada como DP10, um membro da família VH1. O VH de 1133C11 tem 5 mudanças de aminoácidos da linhagem germinativa DP10 dentro de regiões de estrutura principal. A linhagem germinativa mais próxima para o VL de 1133C11 foi identificada como DPL5, um membro da família Vl1. O VL de 1133C11 tem somente 4 mudanças da linhagem germinativa dentro de regiões de estrutura principal. Regiões de estrutura principal de 1133C11 foram retornadas à linhagem germinativa por mutagenese dirigida ao sítio do scFv para derivar o scFv 1252A5 (VH SEQ ID NO: 392; VL SEQ ID NO: 397). Este foi convertido em IgG4 humano como descrito em Exemplo 2. A formação de linhagem germinativa de outras variantes de clones derivados de 1021E5 foi obtida por introdução de mutações CDR sobre a estrutura dorsal IgG4 de linhagem germinativa 1252A5. Este método resultou em geração de anticorpos de linhagem germinativa G1152H5 (VH SEQ ID NO: 402; VL SEQ ID NO: 407), G1165D4 (VH SEQ ID NO: 412; VL SEQ ID NO: 417) e G1230H7 (VH SEQ ID NO: 422; VL SEQ ID NO: 427). EXEMPLO 4 Avaliação de anticorpos IgG4 humanos otimizados no teste FLIPR de mobilização de cálcio intracelular [00227] Os anticorpos IgG4 de NGF humano otimizados foram avaliados em um teste de mobilização intracelular de cálcio evocada por NGF em células recombinantemente expressando o receptor humano de TrkA, como descrito em Exemplo 2. Anticorpos foram testados para atividade neutralizante contra NGF humano, rato, e camundongo (Figuras 2A, 2B, e 2C; Tabela 3).

[00228] A mobilização intracelular de cálcio evocada por 1nM NGF foi inibida por todos os anticorpos humanos otimizados testados. Anticorpos otimizados demonstraram valores IC50subnanomolares, em mais casos representando uma melhora de mais do que de cem vezes de potência neutralizante de NGF sobre os IgGs originais (Tabela 3). Potências neutralizantes (IC50) dos anticorpos IgG4 humanos de linhagem germinativa contra as isoformas de NGF humano, rato e camundongo foram, respectivamente: 1252A5 - 0,33nM, 0,29nM, e 0,26nM; G1152H5 - 0,22nM, 0,27nM, e 0,18nM; G1165D4 - 0,32nM, 0,33nM, e 0,27nM; G1230H7 - 0,31nM, 0,34nM, e 0,25nM.

[00229] Estes resultados enfatizam a eficácia e o valor da técnica de exibição de ribossomas para otimização de potência de anticorpos. Uma abordagem mais convencional para otimização de anticorpos no passado consistia em gerar as bibliotecas de exibição de fagos de anticorpos scFv variantes. Este processo é de uso intensivo de mão e obra e mais lento do que o método de exibição de ribossomas, o que com freqüência significa que somente um único scFv original é usado como o ponto de partida para a construção da biblioteca. A facilidade relativa de gerar bibliotecas de exibição de ribossomas permite que os originais múltiplos de scFv sejam otimizados simultaneamente e, como demonstrado no Exemplo 3, isto pode levar ao isolamento de anticorpos altamente potentes derivados de clones originais que seriam de omitidos para otimização. EXEMPLO 5 Avaliação de anticorpos IgG4 otimizado humano em um teste de sobrevivência celular PC12 [00230] No teste PC12, NGF mantém a sobrevivência de células PC12 de rato exauridas em soro expressando TrkA nativo e receptores de p75 durante dois dias. Os anticorpos de NGF neutralizantes reduzem a sobrevivência celular medida com AlamarBlue.

[00231] Células PC12 de feocromocitoma de rato foram cultivadas em RPMI 1640 (Cellgro, 18040181) suplementado com 5% soro bovino fetal (JRH,12103-78P), 10% soro de cavalo doador inativado por calor (JRH, 12446-77P), e 1% penicilina-estreptomicina. As células foram coletadas por trituração, e então lavadas duas vezes com RPMI 1640 isento de soro contendo 0,01% BSA (Sigma, A7030). Células foram colocadas em placas de 96 cavidade revestidas com colágeno de rabo de rato (Biological Technology Institute, BT-274)- a 50.000 células /cavidade em 120 pl meio isento de soro com 0,01% BSA. Diluições em série de 5X IgGs de NGF anti-humano foram feitas usando meio isento de soro e 40 pl/cavidade foram adicionados à placa de células. 40ml/cavidade 0,5 nM β-NGF humano (Calbiochem, 480275) ou NGF de rato recombinante (R&D Systems, 556-NG-100) foram adicionados à placa, e o total volume foi levado até 200 ml/cavidade com meio isento de soro. Morte máxima de células foi definida por 80 ml/cavidade de meio isento de soro em cavidades em triplicata. 100% sobrevivência foi definido por 40|ml/cavidade de meio isento de soro e 40|ml/cavidade 0,5nM NGF em cavidades em triplicata. As placas foram incubadas a 370C em 5% CO2 durante 48h. Para medir a viabilidade celular, 22 ml/cavidade AlamarBlue foram adicionados e as placas foram lidas imediatamente para determinar a fluorescência de fundo em cada cavidade com uma leitora de placa fluorimétrica (BMG) a um 530 nm a um comprimento de onda de excitação e 590 nm de comprimento de onda de emissão. Após uma incubação durante 6~7h a 370C, as placas foi re-lidas para determinar a fluorescência total. A fluorescência Alamar blue foi calculada como a diferença entre o fundo e as intensidades de fluorescência totais. Na presença de anticorpo, o + SD médio de valores de fluorescência em triplicata foi calculado como uma porcentagem da média de valores de fluorescência de 100% de sobrevivência em triplicata. A porcentagem de valores de sobrevivência de controle foi traçada em gráfico como uma função do log da concentração de IgG. Os valores de IC50 foram calculados por configuração da função dose-resposta sigmoidal (curva variável) usando Prism (GraphPad).

[00232] Resultados do teste de PC12 ainda confirmaram a aumentada potência de anticorpos IgG4 de NGF humano otimizados sobre seus IgGs originais. Anticorpos inibiram a sobrevivência de células PC12 mantidas em NGF humano e rato em um modo relacionado com a concentração (Figuras 3A e 3B; Tabela 3). A formação da linhagem germinativa pareceu reduzir a potência neutralizante de NGF dos anticorpos de teste, particularmente contra a isoforma de NGF de rato. Por exemplo, o IC50 médio do anticorpo de linhagem germinativa G1152H5 para inibição de sobrevivência celular mediada por 1nM NGF humano ou rato foi de 1,1nM e 7,3nM, respectivamente. Em contraste, o IC50 médio para neutralização de 1nM NGF humano ou rato por 1152H5 (isto é anticorpo não de linhagem germinativa) foi de 0,40nM e 0,38nM, respectivamente. EXEMPLO 6 Atividade neutralizante de NGF em um teste de proliferação de células TF-1 [00233] A linhagem TF-1 de células é uma linhagem premielóide humana de células que podem ser estimuladas para proliferar para fatores de crescimento exógenos e citocinas. As células TF-1 expressam o receptor humano de TrkA, e proliferam em resposta a ativação com NGF. O teste de proliferação células TF-1 foi usado para ainda caracterizar a potência neutralizante funcional in vitro de anticorpos IgG4 de NGF humano.

[00234] As células TF-1 foram obtidas do R&D Systems e mantidas de acordo com protocolos supridos. O meio de teste compreendia RPMI-1640 com GLUTAMAX I (Invitrogen) contendo 5% soro bovino fetal (Hyclone) e 1% piruvato de sódio (Sigma). Antes de cada teste, células TF-1 foram pelotizadas por centrifugação a 300 x g durante 5 minutos, o meio removido por aspiração e as células recolocados em suspensão em meio de teste. Este processo foi repetido três vezes com células recolocados em suspensão a uma concentração final de 105 /ml em meio de teste e 100pl foi adicionado a cada cavidade da placa de 96 cavidades de tecido de fundo plano de teste de cultura para dar uma densidade de células final a 1x104/cavidade. As soluções de teste de anticorpos (em triplicata) foram diluídas para dar uma concentração de teste final de 1 mg/ml em meio de teste e tituladas a 1:5 através da placa de teste. Um anticorpo irrelevante (CAT-001) não dirigido a NGF, foi usado como um controle negativo. Além disso, anticorpo monoclonal MAB256 de referência (R &D Systems) foi usado como um controle positivo. Cinqüenta microlitros de anticorpos de teste foram então adicionados a cada cavidade seguido por 50pl de NGF nativo purificado murino (forma 7S; Invitrogen), rato (Sigma) ou humano (Sigma) diluído para dar uma concentração de teste final de 200pM. As placas de teste foram incubadas durante 68h a 37oC em 5% CO2 em uma câmara umedecida. Vinte microlitros de timidina tritiada (5,0 mCi/ml, NEN) foram então adicionados a cada cavidade de teste e placas de teste foram retornadas ao incubador por mais 5h. Células foram coletadas sobre placas de filtro de vidro de 96 cavidades (Perkin Elmer) usando um coletor de células. MicroScint 20TM (50pl) foi então adicionado a cada cavidade da placa de filtro e a incorporação de [3H]-timidina quantificada usando um contador de cintilação líquido de microplaca Packard TopCount. Na presença de anticorpo, a incorporação de timidina (quantificada como contagens por minuto) foi calculada como a diferença entre as contagens de fundo médio (isto é, as células não expostas a NGF) e a média total (isto é, células estimuladas com NGF) por minuto e expressadas como uma porcentagem de proliferação máxima. A proliferação máxima percentual foi traçada em gráfico como uma função do log de concentração de IgG. Os valores de IC50 foram calculados por configuração da função de dose sigmoidal (curva variável usando prisma GraphPad.

[00235] Os anticorpos IgG4 de NGF humano foram inibidores potentes de proliferação de células TF-1 mediadas por isoformas de NGF humano, rato e de camundongo (Figuras 4A, 4B, e 4C). Estes resultados demonstram que anticorpos derivados da linhagem 1021E5 podem romper a sinalização de NGF mediada por ativação de receptores NGF nativo humano in vitro. De acordo com a atividade observada de anticorpos de NGF humano no teste de sobrevivência de células PC12 (Exemplo 5), anticorpos não de linhagem germinativa foram mais potentes do que suas contrapartes de linhagem germinativa no teste de proliferação de TF-1 (Tabela 3). Com base em dados de IC50 médios, a ordem de classificação de potência dos anticorpos testados para inibição de proliferação mediada por 200pM NGF humano foi 1133C11 > 1152H5 > 1252A5 = G1152H5 >> MAB256. EXEMPLO 7 Reatividade cruzada de IgGs anti-NGF com outras neurotrofinas [00236] ELISAs foram realizados para determinar a reatividade cruzada dos IgGs anti-NGF para outras neurotrofinas. Os ELISAs consistiam de placas de revestimento com 100 ng NGF humano /cavidade (R&D systems, 256-GF), fator neurotrófico derivado de cérebro (BDNF; R&D systems, 248-BD), neurotrofina-3 (NT-3; R&D systems, 257-N3), ou neurotrofina-4 (NT4; R&D systems, 257-N4) a temperatura ambiente durante 5-6 h, seguido por bloqueio das placas com 0,25% HSA a 4°C durante a noite. As crescentes concentrações de IgG anti-NGF, na faixa de 0,03 - 10 nM, foram incubadas a temperatura ambiente durante 2 h para permitir a ligação a cada neurotrofina. IgGs anti-NGF foram detectados com um anticorpo policlonal biotinilado anti-humano (1:300) (Rockland 609-1602), fosfatase alcalina ligada a estreptavidina (1:1000), e Substrato fluorescente A. Controles positivos demonstrando ligação de neurotrofina à placa utilizou anticorpos policlonais anti-humano biotinilado comercial (R&D Systems anti-NGF BAF 256, anti-BDNF BAM 648, anti-NT-3 BAF 267, anti-NT-4 BAF 268), que foram detectados diretamente usando fosfatase alcalina ligada a estreptavidina e subseqüente adição de Substrato A. ligação não específica foi determinada usando cavidades revestidas com BSA em vez de neurotrofina. O desenvolvimento do produto foi seguido com o tempo de 0 - 60 min após a adição de Substrato A. IgG anti-NGF 1064F8 foi usado para otimizar o teste. Para 1064F8, se tem um desenvolvimento de produto durante 15 min, que então foi nivelado com tempo, provavelmente devido à depleção do substrato. Reatividades cruzadas foram calculadas como uma porcentagem da ligação específica à neurotrofina relativa a NGF para todas as concentrações de IgG. Para os IgGs de alta afinidade como 1064F8, reatividades cruzadas percentuais foram calculadas usando dados de desenvolvimento de produto de 15 min. Para IgGs de baixa finidade como 1016A8, reatividades cruzadas percentuais foram calculadas usando dados de desenvolvimento de produto de 60 min.

[00237] As reatividades cruzadas de sete anticorpos IgG4 de NGF humano para BDNF, NT-3, e NT-4 relativo a NGF foram determinadas. Nas concentrações testadas, todos os sete anticorpos mostraram uma reatividade cruzada negligenciável (Tabela 4). Por exemplo, com 1252A5, os maiores níveis de reatividade cruzada observada com NT-3, NT-4 e BDNF foram 1,1%, 0,9% e 1,4%, respectivamente (Figura 5). EXEMPLO 8 Determinação da afinidade de ligação de NGF de anticorpos de NGF humanos [00238] As afinidades de ligação de NGF de anticorpos IgG4 de NGF humano foram determinadas usando um formato de teste de ligação a radioligando, realizado a temperatura ambiente. Brevemente, flashplates (Perkin Elmer SMP200) foram revestidas com 100pl/cavidade de 2, 2pg/ml IgG anti-humano de cabra (Sigma-Aldrich, UK) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 1h. Cavidades foram lavadas com PBS e então bloqueadas durante 1h com 200pl PBS /cavidade contendo 3% peso/volume albumina de soro bovino (BSA; Sigma-Aldrich, UK). Cavidades foram lavadas com PBS e 10 ng de anticorpo de NGF humano foram adicionados a cada cavidade em um volume de 0,1ml PBS contendo a 0,5% peso/volume BSA. Após incubação durante 1h, as placas foram lavadas com PBS. [00239] NGFs humano e de rato radio-iodado foram obtidos de Amersham UK (125I-NGF humano, Amersham cat. no. IM286; 125I NGF rato -, β -NGF rato recombinante rotulado por encomenda, adquirido do R&D Systems, cat. no. 556-GF-100). Cada isoforma de 125I-NGF foi diluída em série em tampão de teste (PBS contendo 0,5% peso/volume BSA e 0,05% volume/volume Tween 20) e amostras em duplicatas de 100pl foram adicionadas à placa de teste para dar uma medida de 'ligação total' sobre a faixa de concentração de 2pM-15nM. ligação não específica (NSB) foi determinado a cada concentração de 125I-NGF por medida da ligação na presença de um excesso grande de NGF não radiorrotulado. Cavidades de NSB continham 125I-NGF (2pM-15nM) junto com uma concentração final de 500 nM β -NGF humano não rotulado (R&D Systems Cat. No. 256-GF-100) ou β -NGF de rato (R&D Systems Cat. No. 556-GF-100), como apropriado. Placas foram incubadas durante a noite , e cavidades contadas durante 1min em um contador gama (TopCount NXT, Perkin Elmer). A ligação específica foi calculada de acordo com a fórmula ‘ligação específica = ligação total -ligação não específica. As curvas de ligação foram traçadas em gráfico e os parâmetros de ligação determinados de acordo com um modelo de ligação de saturação de um sítio usando software Prism (GraphPad Software Inc., USA).

[00240] 125I-NGF humano e rato demonstrou uma ligação de afinidade elevada, saturável para os anticorpos IgG4 de NGF humano, 1252A5 e G1152H5 (Figuras 6 e 7). Os valores calculados Kd para a interação de ligação com 125I-NGF humano foram 0,35nM para 1252A5, e 0,37nM para G1152H5. Os valores Kd para ligação de 125I- NGF de rato foram 0,44nM para 1252A5 e 0,50nM para G1152H5. EXEMPLO 9 Determinação de valores Ki para a inibição de ligação de NGF a TrkA humano e receptores de p75 [00241] Experimentos foram realizados para determinar se os anticorpos 1252A5 e G1152H5 demonstram uma inibição diferencial de ligação de NGF a receptores de TrkA e p75. Experimentos de ligação de competição foram projetados a fim de calcular os valores de constante de inibição de ligação (Ki). IC50s foram calculados para inibição mediada por anticorpos da ligação de NGF humano ou rato radiorrotulado à proteína de fusão de receptores de TrkA ou p75 humanos. Valores de Ki foram então derivados usando a equação de Cheng-Prusoff.

[00242] As proteínas de fusão de receptores de TrkA ou p75 humanos (R&D Systems) foram diluídas em PBS de Dulbecco (Gibco) a concentrações finais de 10nM e 0,6nM, respectivamente. As placas de microtitulação brancas de 96 cavidades Maxisorp Nunc (Nalge Nunc) foram revestidas durante a noite a 4°C com 100pl/cavidade de soluções diluídas de receptor TrkA ou p75. Placas foram lavadas 3 vezes com PBS Tween 20, e então bloqueadas com 200pl/cavidade 3% peso/volume albumina de soro bovino (BSA) em PBS. Placas foram lavadas após 1h incubação a temperatura ambiente. Anticorpos de teste foram diluídos na desejado concentração em tampão de teste (0,5% peso/volume BSA e 0,05% volume/volume Tween 20 em PBS). Um anticorpo irrelevante, não dirigido para NGF, foi usado como um controle negativo enquanto NGF não radiorrotulado foi usado como um inibidor de referência de ligação de radioligando. As cavidades em duplicata foram preparados para cada concentração de amostra de teste. 125I-NGF humano ou rato (Amersham Biosciences) foi diluído com tampão de teste de modo que a concentração final em cavidades de teste, quando misturados com amostra de teste, foi de 150pM em um volume de teste total volume de ΙΟΟμΙ. Placas de teste foram incubadas a temperatura ambiente durante 2h antes de lavar com PBS/Tween 20 para remover 125I-NGF não ligado. O radiorrótulo ligado foi quantificado por adição de 100μl/cavidade Microscint 20 (Perkin Elmer) seguido por contagem usando um contador de cintilação líquida de microplaca Packard TopCount. Dados foram traçados em gráfico e analisados usando software Graphpad Prism para calcular valores IC50 para cada experimento, e para derivar o Ki correspondente de acordo com uma equação de Cheng-Prusoff;

Ki = IC50/(1+ D/Kd) onde D = a concentração de NGF no teste (nominalmente 150pM, mas as concentrações de teste reais foram determinadas para cada experimento) Kd = a afinidade de NGF para o receptor TrkA ou p75 sob condições de teste idênticas. Isto foi determinado por análise da ligação de saturação de ligação de 125 I- NGF a receptores de TrkA e p75 em experimentos separados.

[00243] Todos os anticorpos avaliados, exceto o controle de IgG4 humano, inibiram a ligação de 125I- NGF humano e rato aos receptores de TrkA e p75 humanos (Figuras 8 e 9; Tabela 5). Tabela 6 mostra valores de IC50 e Ki calculados a partir dos dados mostrados em Figura 8A; Tabela 7 mostra valores IC50 e Ki calculados a partir dos dados mostrados em Figura 8B; Tabela 8 mostra valores IC50 e Ki calculados a partir dos dados mostrados em Figura 9A; Tabela 9 mostra valores IC50 e Ki calculados a partir dos dados mostrados em Figura 9B. Anticorpo 1252A5 consistentemente mostrou a maior potência de inibição da ligação de 125I-NGF. De modo interessante, os valores de constante de inibição de ligação determinados para a inibição mediada por 1252A5 de ligação de NGF a receptores de TrkA e p75 foram significantemente diferentes. Assim, o pKi médio calculado para inibição de ligação de NGF humano a TrkA e p75 foi 10,26 ± 0,08 e 9,85 ± 0,04, respectivamente (P<0,01, teste T de Student; ambos n=3). pKi médio calculado para inibição de NGF de rato aos receptores de TrkA e p75 foi 9,79 ± 0,04 e 9,55 ± 0,03, respectivamente (P<0,05, Teste T de Student; ambos n=3). Este resultado sugere que 1252A5 é um inibidor preferencial da interação entre NGF e o receptor de TrkA, e inesperadamente contrasta com os resultados obtidos com G1152H5 para os quais não se nota uma diferença significante entre os valores de pKi correspondentes (Tabela 5). EXEMPLO 10 Atividade Anti-hiperalgésica de anticorpos IgG4 de NGF humano [00244] A atividade anti-hiperalgésica de anticorpos de NGF foi avaliada em um modelo de camundongo de hipersensibilidade térmica induzida por carragenano. Os camundongos machos (20 - 25g peso corporal) foram inicialmente aclimatados ao aparelho de teste durante 2h. No dia seguinte, as medidas de linha de base mediram a responsividade ao estímulo térmico de ambas as patas de trás foram determinadas. Uma fonte de calor focalizada foi aplicada à superfície da pata de trás e a latência até a retirada foi registrada, de acordo com um método de Hargreaves et al. (1988). Os valores de linha de base foram calculados como a média de determinações em triplicata para cada pata, registrados com intervalo de 10 minutos. Os camundongos então receberam uma injeção intraperitoneal de anticorpo IgG4 neutralizante de NGF ou anticorpo nulo ajustado no isotipo de controle em veículo de solução salina tamponada com fosfato. (PBS). Vinte e quatro horas depois, a hiperalgesia inflamatório foi induzida por injeção subplantar de carragenano (2% peso/volume em PBS; 30μΙ volume de injeção). Após um outro período de 24h, as latências de retirada foram novamente determinadas para patas de trás inflamadas e não inflamadas.

[00245] A hiperalgesia térmica observada 24h após a injeção com carragenano inibida de modo dependente da dose por pré-tratamento de camundongos com o anticorpo IgG4 de NGF humano 1252A5 (Figura 10).

[00246] Todos os documentos citados são incorporados aqui por referência REFERÊNCIAS

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Tabela 1 Potência neutralizante de anticorpos IgG4 de NGF humano no teste de mobilização de cálcio Anticorpo NGF humano NGF rato IC50 (nM) IC50 (nM) Mab256 0,76 ± 0,15 a 0,79 ± 0,08 b 1064F8 2,5 ± 0,6 c 5,5 1022E3 18±6c 14 1083H4 30 61 e 1021E5 76 75 e 1033G9 55 ± 20 c 26 1016A8 65 ± 12 b 14 1028F8 73 ND

1033B2 85 ND 1024C4 410±120*c 565* 1057F11 3700* ND

[00339] Dados indicam a media de duas determinações separadas, exceto an=14, bn=12, cn=3, dn=4 (média ± sem) e en=1, *Valores determinados por extrapolação. ND = não determinado.

Tabela 2a CDRs de clones otimizados derivados de 1021E5 contendo a seqüência de HCDR3 LNPSLTA (SEQ ID NO: 531) I nnnRi I nr,nR? I nnnR3 I I i nnRi I i cdr? I i r.nR3 I 7777 7777 Colunas no lado à direita da tabela mostram uma estimativa das potências neutralizantes de NGF (IC50) para cada clone. Os scFv purificados foram testados em um teste de ligação de NGF como descrito no exemplo 3, Tabela 3 Potências neutralizantes de NGF de anticorpos IgG4 humanos otimizados em três testes de função de NGF em células completas. . G Mobilização de cálcio FLIPR PC12 Proliferação de células TF-1 8_________________________IC" (nM)___________________IC.o(nM)____________________|C.o <nM>____________ Clone Original NGF humano NGF rato NG.F NGF humano NGF rato . NGF NGF rato NG.F ____________________________________________camundongo__________________________humano______________camundongo 1021E. - 76 75 47 1300 a 1083H4 - 30a 61 54 1100 1126F1 1021E5 0,35 0,15 0,22 2,9 1126G. 1021E5 0,23 0,16 0,16 1,50 1126H. 1021E5 0,38 0,15 0,23 8.7 1127D9 1021E5 0,40 0,22 0,21 0,57 1127F9 1021E5 0,36 0,14 0,20 0,59 1131D7 1021E5 117 37 71 670 1131H2 1021E5 0,27 0,11 0,12 0,58 1132A9 1021E5 0,39 0,25 0,33 0,90 1132H9 1021E5 0,35 0,13 0,16 0,55 1133C11 1021E5 0,45a 0,30a 0,28a 0,53 ± 0,13b 0,42 ± 0,07b 0,10 ± 0,01d 0,12 ± 0,02d 0,10 ± 0,02d 1134D9 1021E5 0,31a 0,14a 0,16a 0,54 114.D1 1021E5 0,36 0,17 0,24 0,66 1146D7 1021E5 0,38 0,33 0,31 0,48 1147D2 1021E5 0,36 0,21 0,24 0,51 1147G9 1021E5 0,30 ± 0,04b 0,21 ± 0,02b 0,23 ± 0,02b 0,76 ± 0,06b 0,55 ± 0,02b 11.0F1 1021E5 0,32 0,15 0,19 0,47 Tabela 3 (cont) .. .... - . ., . Sobrevivência de células ... ... T1_ . , _ Mobilização de cálcio FLIPR Proliferação de células TF-1 IgG PC12 9________________________IC50 (nM)_____________________IC50(nM )___________________IC50 (nM)___________ Clone Original NGF humano NGF rato NG.F NGF humano NGF rato . NGF NGF rato NG.F 9 camundongo humano camundongo 1152H5 1021E5 0,22 ± 0,05b 0,21 ± 0,05b0,14 ± 0,01b 0,40 ± 0,04e 0,38 ± 0,04e0,26 ± 0,25d 0,08 ± 0,0d 0, 07 ± 0,0d 1155H1 1021E5 0,35 0,18 0,18 0,59 G1152H5 1152H5 0,22 0,27 0,18 1,1 ± 0,1b 7.3 ± 0,9b 0,44 ± 0,17d 1,44 ± 0,27d 0,99 ± 0,29d 1158A1 1021E5 0,34 0,12 0,11 0,48 1160E3 1021E5 0,33 0,13 0,12 0,40 1165D4 1021E5 0,26 ± 0,02b 0,15 ± 0,01b0,16 ± 0,04b 0,41 ± 0,08e 0,41 ± 0,06e G1165D4 1165D4 0,32a 0,33a 0,27a 0,86 ± 0,04b 2,63 ± 0,03b 1175H8 1021E5 0,37 0,15 0,16 1,1 1211G10 1021E5 0,37 0,16 0,15 0,58 1214A1 1021E5 0,26a 0,16a 0,14a 0,52 ± 0,07b 0,43 ± 0,07b 1214D10 1021E5 0,29 0,14 0,13 0,35 1218H5 1021E5 0,33 0,13 0,15 0,47 1227H8 1083H4 0,44a 0,43a 0,48a 0,70 ± 0,15b 35 ±10b 1230D8 1083H4 0,31a 0,29a 0,37a 0,71 ± 0,14b 37 ± 4b 1230H7 1021E5 0,27 ± 0,04b 0,18 ± 0,03b 0,15 ± 0,02b 0,42 ± 0,10c 0,32 ± 0,05c G1230H7 1230H7 0,31a 0,34a 0,25a 2,5 ± 0,2b 7,5 ± 0,4b 1252A5 1133C11 0,33 ± 0,03c 0,29 ± 0,06c 0,26 ± 0,01c 0,94 ± 0,13f 2,7 ± 0,6f 0,42 ± .15d 0,72 ± 0,40d 0,55 ± 0,32d Mab 256 - 0,76 + 0,15h 0,79 + 0,08g 1,4 + 0,2i 23 + 1______44 ± 7f 6 ± 4d 5 ± 3d 7 ± 3d Dados são n=1 exceto; an=2; bn=3; cn=4; dn=5; en=6; fn=7; gn=12; hn=14; 'n=15; jextrapolado Tabela 4 Reatividade cruzada de anticorpos IgG4 de NGF humano com outras neurotrofinas IgG BDNF, % NT-3, % NT-4, % 1133C11 0,7-3,1 0,9-1,8 0-1,7 1147G9 0-1,3 0,1-0,9 0-1,3 1152H5 0-1,5 0-0,5 0,2-1,2 1165D4 0-1,3 0-0,7 0-1,5 1214A1 0-1,4 0-1,0 0-1,0 1230H7 0-1,1 0-0,8 0-0,7 1252A5 0-1,4 0-1,1 0-0,9 [00340] Os dados nas colunas mostram a faixa de reatividades cruzadas de anticorpos calculadas. Os valores são calculados como a porcentagem do sinal observado contra cada neurotrofina, com relação ao sinal de ligação de NGF na mesma concentração do anticorpo de teste. As neurotrofinas foram revestidas nas placas de teste a uma concentração de 100 ng/ cavidade, e a ligação dos anticorpos de teste foi medida sobre a faixa de concentração de 0,03 -10 nM. Os dados representam o resultado de um experimento único. Tabela 5 Sumário das determinações de constante de inibição de ligação para 1252A5 e G1152H5. Os dados representam ± s.e.m. médio de três experimentos independentes IgG pKi versus NGF humano pKi versus NGF rato TrkA p75 TrkA p75 1252A5 10,26 ± 0,08* 9,85 ± 0,04 9,79 ± 0,04** 9,55 ± 0,03 G1152H5 9,59 ± 0,08§ 9,56 ± 0,04 9,18 ± 0,08§ 9,24 ± 0,05 * P<0,01 c.f. interação NGF hu/p75 ** P<0,05 c.f. interação NGF rato/p75 § N/S c.f. p75 Teste T de Student não aos pares Tabela 6 IgG IC50 (nM) Ki (nM) NGF 24 2,1 1252A5 0,068 0,061 G1152H5 0,204 0,184 MAB256 1,94 1,76 MAB5260Z 0,368 0,333 Tabela 7 igG IC50 (nM) Ki (nM) NGF 1,3 12 1252A5 0,151 0,140 G1152H5 0,538 0,499 MAB256 1,48 1,38 MAB5260Z 0,310 0,288 Tabela 8 IgG IC50 (nM) Ki (nM) NGF 0,686 0,568 1252A5 0,188 0,155 G1152H5 0,348 0,288 MAB256 0,304 0,252 MAB5260Z 0,570 0,472 Tabela 9 IgG IC50 (nM) Ki (nM) NGF 0,783 0,710 1252A5 0,302 0,274 G1152H5 0,781 0,708 MAB256 2,94 2,67 MAB5260Z 0,587 0,532 REIVINDICAÇÕES

Claims (28)

1. Membro de ligação específico isolado para fator de crescimento de nervos (NGF), caracterizado pelo fato de compreender um sítio de ligação anticorpo - antígeno que é composto de um domínio VH de anticorpo humano e um domínio VL de anticorpo humano e que compreende um conjunto de CDRs HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que o domínio VH compreende HCDR 1, HCDR2, HCDR3 e uma estrutura principal e o domínio VL compreende LCDR1, LCDR2, LCDR3 e uma estrutura principal, em que o conjunto de CDRs consiste de um conjunto de CDRs selecionados dentre o grupo consistindo de: a) o conjunto 1133C11 de CDRs, definido em que o HCDR1 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193, o HCDR2 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 194, o HCDR3 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 195, o LCDR1 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 198, o LCDR2 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 199, e o LCDR3 tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 200; b) um conjunto de CDRs que contém o conjunto 1133C11 de CDRs, em que o HCDR3 compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 533 ou a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 532 substituída para a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 531; e c) um conjunto de CDRs que contém uma ou duas substituições de aminoácidos comparadas com o conjunto 1133C11 de CDRs; em que a uma ou duas substituições estão em um ou dois dos seguintes resíduos dentro dos CDRs, usando a numeração padrão de Kabat: Posição de Resíduo substituto substituição selecionado dentre o grupo consistindo de 31 em HCDR1: A 34 em HCDR1: V 51 em HCDR2: V 55 em HCDR2: N 56 em HCDR2: A 57 em HCDR2: V 58 em HCDR2: S 65 em HCDR2: D 96 em HCDR3: N 26 em LCDR1: T 26 em LCDR1: G 27 em LCDR1: N 27 em LCDR1: R 27A em LCDR1: T 27A em LCDR1: P 27B em LCDR1: D 28 em LCDR1: T 29 em LCDR1: E 30 em LCDR1: D 56 em LCDR2: T 90 em LCDR3: A 94 em LCDR3: G.

2. Membro de ligação específico isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o resíduo 29 dentro de LCDR1 é E.

3. Membro de ligação específico isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender um conjunto de CDRs que contém o conjunto 1133C11 de CDRs, em que o HCDR3 compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 533 substituída para a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 531.

4. Membro de ligação específico isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender um conjunto de CDRs que contém o conjunto 1133C11 de CDRs, em que o HCDR3 compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 532 substituída para a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 531 dentro de HCDR3.

5. Membro de ligação específico isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender o conjunto 1133C11 de CDRs.

6. Membro de ligação específico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o estrutura principal de domínio VH é humano estrutura principal de linhagem germinativa de cadeia pesada e/ou a estrutura principal de domínio VL é estrutura principal de linhagem germinativa de cadeia leve humana.

7. Membro de ligação específico isolado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a estrutura principal de linhagem germinativa de cadeia pesada compreende VH1 DP10.

8. Membro de ligação específico isolado de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7 , caracterizado pelo fato de que a estrutura principal de linhagem germinativa de cadeia leve compreende VL Vl1.

9. Membro de ligação específico isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que ele liga NGF de rato ou camundongo.

10. Membro de ligação específico de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de compreender o domínio VH de 1252A5 com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 392.

11. Membro de ligação específico de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de compreender o domínio VL de 1252A5 com a sequencia de aminoácido de SEQ ID NO: 397.

12. Membro de ligação específico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que liga o NGF humano com afinidade igual ou melhor do que a afinidade de um sítio de ligação de antígeno para NGF humano formado pelo domínio VH de 1252A5 com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 392 e o domínio VL de 1252A5 com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 397, a afinidade do membro de ligação específico e a afinidade do sítio de ligação de antígeno sendo com determinadas sob as mesmas condições.

13. Membro de ligação específico de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de compreender o domínio VH de G1152H5 com a sequencia de aminoácido de SEQ ID NO: 402.

14. Membro de ligação específico de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9 ou reivindicação 13, caracterizado pelo fato de compreender o domínio VL de G1152H5 com a sequencia de aminoácido de SEQ ID NO: 407.

15. Membro de ligação específico de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de compreender o domínio VH de G1165D4 com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:412.

16. Membro de ligação específico de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9 ou reivindicação 15, caracterizado pelo fato de compreender o domínio VL de G1165D4 com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 417.

17. Membro de ligação específico de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de compreender o domínio VH de G1230H7 com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 422.

18. Membro de ligação específico de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9 ou reivindicação 17, caracterizado pelo fato de compreender o domínio VL de G1230H7 com a sequencia de aminoácido de SEQ ID NO: 427.

19. Membro de ligação específico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de compreender uma molécula de anticorpo scFv.

20. Membro de ligação específico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de compreender uma região constante de anticorpo.

21. Membro de ligação específico de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de compreender um anticorpo completo.

22. Membro de ligação específico de acordo com a reivindicação 21 caracterizado pelo fato de o anticorpo completo é IgG4.

23. Molécula de anticorpo isolado que se liga ao NGF humano, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio VH e um domínio VL, e em que a sequência de aminoácido do domínio VH é SEQ ID NO: 392 e a sequência de aminoácido do domínio VL é SEQ ID NO:397.

24. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que é IgG4.

25. Composição, caracterizada pelo fato de compreender um membro de ligação específico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22, ou uma molécula de anticorpo, como definida na reivindicação 23 ou 24, e pelo menos um componente adicional.

26. Composição de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de compreender um excipiente, veículo ou carreador farmaceuticamente aceitável.

27. Uso de um membro de ligação específico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, ou uma molécula de anticorpo como definida na reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratamento de uma condição em que NGF desempenha um papel, em que a condição é selecionada do grupo que consiste em dor, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose pulmonar, outras doenças de inflamação das vias aéreas, neuropatia diabética, arritmias cardíacas, HIV, artrite, psoríase e câncer.

28. Uso de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que referido tratamento é de dor.